CH681779A5 - - Google Patents

Description

  
 



  Die Erfindung bezieht sich auf einen spezifischen Inhibitor der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen in Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase in Säugetier-Tumorzellen, wodurch eine Anreicherung von Protoporphyrin IX in diesen Zellen bewirkt wird, als Therapeutikum, der sich für die photodynamische Behandlung von Säugetier-Tumorzellen, wie die photodynamische Behandlung von Krebs,eignet, und auf die Verwendung desselben zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zum Töten von festen Säugetier-Tumorzellen, wobei dieses Präparat auch einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Die Erfindung ist in den Ansprüchen 1 und 9 definiert. 



  Es ist mittlerweile wohlbekannt, Säugetier-Tumorzellen mit Hämatoporphyrinderivaten oder einer Mischung von Porphyrinen, die sich davon ableiten, (z.B. Photofrin II< TM >), zu versorgen und dann diese Zellen Licht geeigneter Wellenlänge auszusetzen, um eine Zellzerstörung zu bewirken. Eine solche photodynamische Therapie ist Gegenstand einer Reihe von Artikeln, die eine spezielle Ausgabe von Photochemistry and Photobiology, Bd. 46, Nr. 5, November 1987, (im folgenden "P&P 46-5") bilden. Wie in diesen Artikeln gezeigt, wurde eine solche photodynamische Therapie zur Behandlung einer grossen Vielzahl von Krebsarten verwendet (einschliesslich Krebs der Bronchialröhren, der Blase, des \sophagus, der Lunge, der Haut, des Kopfes und Halses, des Gehirns und Darm- und Intraokular- und gynäkologischer Krebsarten).

  Es wurde festgestellt, dass die biochemischen Wirkungen einer solchen Porphyrin-Photosensibilisierung das Vernetzen von Membranproteinen, die Peroxidation von Lipiden, die Hemmung des Transports einiger wesentlicher Metaboliten, die Lyse von lysosomalen und MitochondrienMembranen, die Inaktivierung verschiedener Enzyme und  eine vermehrte Zellaufnahme von Porphyrinen bewirken (P&P 46-5, S. 695). Das Porphyrinmaterial wird im allgemeinen injiziert, (z.B. intravenös oder intraperitoneal), wobei eine typische Dosis etwa 2 mg Photofrin II/kg Körpergewicht ist. 



  Das Porphyrinmaterial kann auch in ein Liposom eingebracht werden und injiziert werden (z.B. intraperitoneal) wie z.B. bei Spikes et. al "Photodynamic Behavior of Porphyrins in Model Cell, Tissue and Tumor Systems"; in Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases (herausgegeben von G. Jori und C. A. Perria); S. 45-53; Libreria Progetto, Padua, (1985) und den darin zitierten Referenzen offenbart ist. 



  Die technische Literatur zeigt, dass die Einführung von Protoporphyrin in Zellen wie menschliche Erythrozyten (Dubbelman et al., Biochemica et Biophysica Acta, 511 (1978) 141-151) oder Mäuseleukämiezellen (Kessel, Cancer Research 42, 1703-1706, Mai 1982) einen deutlichen photosensibilisierenden Effekt hat. Der Kessel-Artikel gibt an, dass es das stärkste photosensibilisierende Mittel von den getesteten ist. Jedoch fanden Kessel und andere (z.B. Berenbaum et al., Br. J. Cancer (1982) 45, 571-581), wenn sie Protoporphyrin in Tiere injizierten, kein nachweisbares Protoporphyrin in den Tumoren, was anzeigt, dass als solches in den Körper eingeführtes Protoporphyrin leicht im Kreislauf verlorengeht. 



  Es ist auch wohlbekannt, Hämatoporphyrinderivate und ähnliche Materialien für den Nachweis und die Lokalisierung von Tumoren, wie Krebs der Blase oder der Lungen, anzuwenden (P&P 46-5, S. 759 z.B.). 



  Gemäss der Erfindung eignet sich zur photodynamischen Behandlung der Zellen oder für die bekannten Methoden zum Nachweis und zur Lokalisierung von Tumoren statt eines Porphyrins oder eines Porphyrins allein auch ein Inhibitor, das heisst, ein Enzymhemmstoff, der die enzymatische Umwandlung von Protoporphyrinogen in Häm in diesen Zellen hemmt,  wodurch eine Anreicherung endogenen Protoporphyrins IX in diesen Zellen bewirkt wird. Es wurde festgestellt, dass Mittel wie bestimmte Arten von Herbizidverbindungen, die die enzymatische Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Chlorophyll in Pflanzenzellen hemmen, auch die enzymatische Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Häm in Säugetierzellen hemmen.

  Es wird angenommen, dass die Hemmung durch diese Mittel wahrscheinlich den Schritt der Umwandlung von Protoporphyrinogen zu Protoporphyrin IX durch ein Enzym (Protoporphyrinogen-Oxidase E.C. 1.3.3.4) beeinflusst, so dass das Protoporphyrinogen nicht dem normalen enzymatischen Abbauweg zu Protoporphyrin IX folgen kann, sondern stattdessen in der Zelle oxidiert wird (z.B. im Plasma), aber ausserhalb des normalen enzymatischen Stoffwechselwegs (z.B. ausserhalb der Organellen-Membran) und dass das Ergebnis eine Akkumulation von Protoporphyrin IX an Stellen ist, wo es unerreichbar für die normale Umwandlung zu Häm ist, mit dem Ergebnis, dass dieses akkumulierte Protoporphyrin IX, wenn die Zellen Licht ausgesetzt werden, eine zellzerstörende Wirkung hat, wie die, die bei der oben beschriebenen photodynamischen Behandlung gezeigt wird. 



  Die Inhibitoren dieser Erfindung sind spezifische Inhibitoren der Protoporphyrinogen-Oxidase in dem Sinn, dass sie nicht als allgemeines Enzymgift wirken, wie denaturierende oder vernetzende Mittel (z.B. Sulfhydryl-Reagenzien), vorzugsweise sind es nicht Materialien, die die Oxidationsbedingungen wie Elektronenakzeptoren beeinflussen; daher haben die bevorzugten Inhibitoren dieser Erfindung Redoxpotentiale, die negativer als etwa -500 mV sind, wie z.B. negativer als -800 mV (gemessen z.B. in üblicher Weise in einem aprotischen Lösungsmittel für das Mittel wie durch zyklische Voltametrie polarographisch). Es ist auch bevorzugt, dass  der Inhibitor nicht  ein Tetrapyrrol ist und dass sein I50 für Protoporphyrinogen-Oxidase geringer als etwa 1  mu M wie geringer als etwa 0,3  mu M ist, z.B. ein I50 von etwa 0,1 oder 0,03 oder 0,01  mu M oder weniger. 



  Der Inhibitor ist vorzugsweise einer, der eine hohe Kapazität für das Aufbrechen des Plasmalemmas von Pflanzenmaterial hat. Ein Test für diese Kapazität ist das Efflux-Experiment, das in dem Artikel von Halling und Peters in Plant Physiology, 84, 1114-5 (1987) beschrieben wird. In einem solchen Test (im einzelnen in Appendix A unten beschrieben) zeigen die bevorzugten Mittel einen Gesamtefflux von mindestens 50% bei einer Behandlungsrate von 100  mu M, vorzugsweise einer Behandlungsrate von 1  mu M oder weniger wie 100 nM; hochaktive Materialien wie 1-(4-Chlor-2-fluor-5-propargyloxyphenyl)-3-methyl-4-difluormethyl- DELTA <2>-1,2,4-triazolin-5-on oder Lactophen (unten beschrieben) ergeben Gesamtefflux-Prozentwerte von mehr als 90% bei 100 nM Konzentration. 



   Ein weiterer Test der Kapazität eines Materials zum Aufbrechen des Plasmalemmas von Pflanzenmaterial ist der lichtinduzierte Ergrünungshemmungstest, der genauer in Appendix B unten beschrieben ist. Dieser Test misst die Kapazität, das im Licht Ergrünen von im Dunkeln gebleichter Chlamydomonas Reinhardi Mutante y-1 zu hemmen (einer Algenart, die, wenn sie im Dunkeln wächst, kein Chlorophyll bildet, so dass die Algenmasse wegen der Gegenwart neuer nicht grüner Zellen bleicht, und die Chlorophyll wieder produziert, wenn sie Licht ausgesetzt wird) zu hemmen. Viele der bevorzugten Inhibitoren (Mittel), die erfindungsgemäss verwendet werden, haben die Fähigkeit, das im Licht Ergrünen um mindestens 50% zu hemmen, wenn die Verbindung mit einer Konzentration von 10<-><5> M, bevorzugter einer Konzentration von 10<-><6> M  oder weniger, z.B. 10<-><7> M verwendet wird.

  Zusätzlich sollte die Verbindung eine sein, die, wenn sie bei dieser Konzentration im Lichtergrünungshemmungstest verwendet wird, einen Überstand ergibt, der einen Lichtabsorptionspeak bei 405 nm zeigt, der höher ist als der Chlorophyllpeak (der Peak bei 668 nm in diesem System), z.B. zeigt der Überstand einen 405 nm Peak, dessen Höhe 2, 3 oder 4 mal höher ist, als die Höhe des 668 nm Peaks. 



  Unter den Inhibitoren, die gemäss der Erfindung in Frage kommen, sind Herbizidverbindungen der folgenden Klassen (A-D): 



  A Heterocyclische Arylherbizide der allgemeinen Formel 



  Ph-NHet, 



  worin "Ph" ein substituierter Phenylrest, vorzugsweise 2,4-disubstituierter Phenylrest, bevorzugter ein 2,4,5-trisubstituierter Phenylrest ist und NHet ein 5- oder 6-gliedriger heterocyclischer Ring mit ein bis vier Ringstickstoffatomen und mit der Formel 
EMI5.1
 



  ist, worin Q den Ausgleich des heterocyclischen Rings darstellt und R Wasserstoff oder eine Substituentengruppe ist. Diese Klasse von Verbindungen schliesst solche Materialien ein, wie die, die als "die cyclische Imidklasse der Herbizide" in einem Artikel von Wakabayashi et al., J. Pesticide Sci., 11, 635-460 (1986) bezeichnet ist, die folgende Verbindungen in Fig. 1 zeigt: 
EMI6.1
 



  Verbindung I ist ein Aryloxadiazolherbizid, nämlich 2-tert.-Butyl-4-(2,4-dichlor-5-isopropoxyphenyl)- DELTA <2>-1,3,4-oxadiazolin-5-on. Andere 2-Alkyl-4-(2,4,5-trisubstierte phenyl)- DELTA <2>-1,3,4-oxadiazolin-5-one, die als Inhibitoren gemäss der Erfindung in Frage kommen, sind z.B. in den US-Patenten 3 385 862; 3 836 539 und 3 876 413 offenbart. 



  Die Verbindung II ist ein Aryltetrahydroindazol-Herbizid, nämlich 3-Chlor-2-(4-chlor-2-fluor-5-isopropoxy-phenyl)-4,5,6,7-tetrahydro-2H-indazol. Andere 3-substituierte 2-(2,4,5-trisubstierte Phenyl)-tetrahydroindazole, die als Inhibitoren gemäss der Erfindung in Frage kommen, sind z.B. in dem US-Patent 4 670 043 offenbart. 



  Die Verbindungen III, IV und V sind Aryltetrahydrophthalimid-Herbizide. Andere Aryltetrahydrophthalimide, die als Inhibitoren gemäss der Erfindung in Frage kommen, sind z.B. in den US-Patenten 4 431 822; 4 670 046; 4 670 042 und 4 439 229 und der veröffentlichten Internationalen Anmeldung (PCT) WO 87/07 602 offenbart. Die letzteren zwei Literaturstellen offenbaren auch andere  NHet-Ringe, die in den Inhibitoren vorhanden sein können, wie die Ringe, die z.B. in Spalte 4, Zeile 25 bis Spalte 5, Zeile 20 von US-Patent 4 439 229 und auf den Seiten 12-14 von WO 87/07 602 dargestellt sind. 



  Andere geeignete Herbizide des PhNHet-Typs sind: Aryltriazolinone wie die, die in den US-Patenten 4 318 731; 4 398 943; 4 404 019; 4 702 945; 4 705 557; 4 702 763; 4 761 174 und den Internationalen Anmeldungen (PCT) WO 85/01 637; WO 85/04 307; WO 87/00 730; WO 87/03 782; WO 86/04 481 und WO 88/01 133; Aryltetrazolinone wie die, die in den US-Patenten 4 734 124 und den Internationalen Anmeldungen (PCT) WO 85/01 939 und WO 87/03 873 offenbart sind; Aryltriazindione, wie die, die in den US-Patenten 4 755 217 und 4 766 233, der Internationalen Anmeldung (PCT) WO 86/00 072 offenbart sind; Arylhydantoine wie die, die in US-Patent 4 427 438 offenbart sind; Arylurazole, wie die, die in US-Patent 4 452 981 offenbart sind und Arylhexahydropyridazine, wie die, die in US-Patent 4 619 687 offenbart sind. 



  B. Heterocyclische Arylurethane, wie die, die in US-Patent 4 521 242 offenbart sind. 



  C. Phenylether-Herbizide, wie die, die eine p-Halogen- oder p-Nitrophenoxyphenylstruktur haben, wie die folgenden im Handel erhältlichen Materialien: 
EMI8.1
 



  Andere geeignete im Handel erhältliche Diphenyl-Herbizide sind
 Lactophen: 1-(Carboethoxy)-ethyl-5-(2-chlor-4-trifluormethylphenoxy)-2-nitrobenzoat,
 Fluoroglycofen: (Carboethoxy)-methyl-5-(2-chlor-4-trifluormethylphenoxy)-2-nitrobenzoat,
 Fromesofen: 5-(2-Chlor-4-(trifluormethyl)phenoxy)-N-methylsulfonyl-2-nitrobenzamid,
 Chloronitrofen: 2,4,6-Trichlor-(4-nitrophenoxy)-benzol,
 Fluorodifen: 2-Nitro-1-(4-nitrophenoxy)-4-trifluormethylbenzol,
 Nitrofen: 2,4-Dichlor-1-(4-nitrophenoxy)-benzol,
 Chlomethoxifen: 4-(2,4-Dichlorphenoxy)-2-methoxy-1-nitrobenzol. 



  Ein weiteres geeignetes Diphenylether-Herbizid ist Methyl-5-(2-chlor-4-trifluormethylphenoxy)-2-nitroacetophenonoxim-O-acetat. 



  D. Arylpyrazol-Herbizide, wie die in den US-Patenten 4 563 210; 4 496 390 und 4 459 150 und der deutschen Offenlegungsschrift 3 520 327 A1 offenbarten. 



  E. Verbindungen der Formel 
EMI9.1
 



  worin X<b> O oder S ist und "Ph" die oben beschriebene Bedeutung hat, wie Verbindungen, die in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 273 417 oder dem Derwent Abstract Nr. 87-040749 offenbart sind. 



  Die Inhibitoren der Erfindung können durch intravenöse oder intraperitoneale Injektion verabreicht werden. Sie können als sterile Zusammensetzung verwendet werden, die den Inhibitor in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, z.B. einer wässrigen isotonischen Lösung wie wässriger Kochsalzlösung (z.B. 0,9% NaCl) oder Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), mit einer Konzentration von z.B. 2,5 mg ml<-><1> gelöst oder dispergiert enthält oder den Inhibitor in einem Liposomensystem enthält, wie einem, das mit einem Phospholipidvesikel in einer auf den Seiten 1659-1660 von Remington's Pharmaceutical Sciences 1985 (17. Ausgabe), veröffentlicht von Mack Publishing Company, beschriebenen Art hergestellt wurde. Zum Beispiel können analog zu der bei Jori et al., Br. J.

   Cancer (1983), 48 auf Seite 307 beschriebenen Formulierung 51,4 mg Dipalmitoyldiphosphatidyl-cholin in 10 ml einer 1 mM Lösung des Inhibitors in Chloroform-Methanol (9:1, V/V) gelöst werden, und nach sorgfältigem Mischen kann das Lösungsmittel unter Vakuum bei 30 DEG C entfernt werden, was einen Feststoff ergibt, der in 10 ml eines 0,01 M Phosphatpuffers, pH 7,4, enthaltend 150 mM NaCl, resuspendiert werden kann, und die trübe Lösung dann bei 50 DEG C 30 Minuten beschallt werden. 



  Die Inhibitoren können an geeignete tumorspezifische monoklonale Antikörper (Mab's) konjugiert oder gebunden sein unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten Bindungstechnologie als Mittel, um den Inhibitor zu der speziellen Tumorstelle hinzusteuern. 



  Die Inhibitoren können auch durch einfache orale Einnahme, vorzugsweise in verdünnter Form zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, verwendet werden, z.B. indem sie der Nahrung beigegeben werden, wie in Beispiel 3, unten dargestellt. 



  Es kann wünschenswert sein, insbesondere für die orale Verabreichung, Inhibitoren zu verwenden, die wasserlösliche Salze sind oder die sauer sind und wasserlösliche Natrium- oder Kaliumsalze bilden, wie ein saures Sulfonamid der Art, wie sie in den Internationalen Anmeldungen (PCT) WO 87/03 782 (z.B. Verbindung 6c in Beispiel 3 unten) oder WO 85/01 939 und WO 87/03 873 offenbart sind, oder ein wasserlösliches Salz davon oder eine Carbonsäure oder ein wasserlösliches Salz davon, wie das als Natriumsalz bekannte Acifluorfen. 



  Die Inhibitoren können in übliche pharmazeutische Formulierungen wie Tabletten (wie z.B. komprimierte Tabletten, die beschichtet sein können, z.B. mit Zuckerpaste und/oder Syrup), Zäpfchen, Kapseln (z.B. Hartgelatinekapseln), Suspensionen, Lösungen, Pulver oder Ampullen eingebracht werden. In solchen Formulierungen kann der Inhibitor in Mischung mit einem pharmakologisch annehmbaren festen und/oder flüssigen Träger vorhanden sein, der, wenn gewünscht, ein Nahrungsmittel sein kann; z.B. kann er ein Feststoff sein wie Maisstärke oder ein flüssiges Verdünnungsmittel wie Wasser oder ein essbares \l oder Mineralöl oder ein Lösungsmittel z.B. Dimethylsulfoxid. Mischungen der Inhibitoren können verwendet werden, z.B. eine Mischung von Verbindug 6c von Beispiel 3 unten und Acifluorfen, z.B. in annähernd gleichen Anteilen. 



  Die Dosierung, die angewendet wird, kann durch Routineversuche, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, bestimmt werden, z.B. Versuche der Art, wie sie für Photofrin II in dem Artikel von Dougherty in "Photodynamic Therapy (PDT) of Malignant Tumors" in CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology, Vol. 2, Issue 2, (1984), S. 83-116 beschrieben sind. 



  Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. 


 Beispiel 1 
 



  HeLa-Zellen (eine menschliche Tumorzellinie, die allgemein in der Tumorforschung angewendet wird und von der American Type Culture Collection erhalten wurde), die in der logarithmischen Wachstumsphase waren (die bei 37 DEG C 5 Tage in 1 l-Falcon-Gewebekulturkolben kultiviert worden waren) wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Eine 0,25%ige Lösung von Trypsin in PBS (2 ml) wurde zugegeben,und nach mehreren Minuten wurden die Zellen vorsichtig aus dem Kolben entfernt und in 110 ml einer 25 mM Lösung von Hepes in Minimum Essential Medium (MEM), das mit 10% V/V inaktiviertem Kälberserum, 1,1 ml einer 200 mM Lösung von Glutamin in 0,85% Kochsalzlösung und 11 000 Einheiten Penicillin/11 000 mcg Streptomycin angereichert war, eingebracht. 



  Dann wurden 5,0 ml Aliquots der entstehenden resuspendierten Zellkultur jeweils in einen 50 ml Falcon Gewebekulturkolben gebracht und (mit Ausnahme der Kontrolle) mit einem Inhibitor gemischt. Die Aliquots wurden dann in der Dunkelheit bei 37 DEG C drei Tage inkubiert. Die Zellen wurden dann entfernt und unter grünem Licht in der folgenden Weise extrahiert: Die Zellen wurden vom Boden des Kolbens durch Zugabe von 0,8 ml einer 0,25%igen Lösung von Trypsin in PBS entfernt. Nach einer  Stunde Inkubation im Dunkeln wurden Zellen und Medium aus den Kolben entfernt, in Rundzentrifugenröhrchen gebracht und dann zwei Zyklen Einfrier-Auftau-Bedingungen unterworfen, um die Zellen aufzubrechen und die Extraktion zu ermöglichen. 



  Die Untersuchung der Zellsuspensionen nach diesem Aufbrechsystem zeigte keine intakten Zellen mehr. 10 ml basisches Aceton (90% Aceton: 10% 0,1 N NH4OH) wurden dann zu jedem Röhrchen zugegeben und die Röhrchen wurden zentrifugiert, um Protein und Zellbruchstücke zu entfernen. 5 ml Wasser wurden zu dem Überstand zugegeben, anschliessend 0,5 ml einer gesättigten wässrigen Lösung von NaCl. Der pH wurde dann auf 6,8 eingestellt durch tropfenweise Zugabe von 2 M KH2PO4. Der wässrige Acetonextrakt wurde dann auf eine C8-Baker-Prep-Säule geladen. Die Säulen wurden getrocknet und dann mit 2 ml Wasser gewaschen. Die Tetrapyrrole wurden mit 2 x 1,5 ml Volumen von 90/10 CH3OH/H2O eluiert. Die Extrakte wurden dann in einem Spektrofluorometer quantitativ bestimmt. 



  Die Inhibitoren, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, waren: 



  A. 5-Amino-laevulinsäure, die als Vorläufer von Tetrapyrrolen bekannt ist. 



  B. Acifluorfen-methyl mit der Formel: 
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  C. ein Herbizid der Formel: 
EMI14.1
 



  D. ein Herbizid der Formel: 
EMI14.2
 



  E. ein Herbizid der Formel: 
EMI14.3
 



  Der Inhibitor A wurde als Filter sterilisierte 250 mM Lösung in Wasser, pH 6,5 angewendet. Die  Inhibitoren B, C, D und E wurden als 50 mM Lösungen in Aceton geliefert. 



  Aceton wurde auch zu der Kontrolle zugegeben, um eine Konzentration von 0,2% V/V darin zu liefern. Die zu den Zellkulturen zugegebenen Mengen der Inhibitoren waren so, dass  sich die in Tabelle 1 unten angegebenen Konzentrationen ergaben. Die Mengen des Tetrapyrrols Protoporphyrin IX ("Proto IX"), die produziert wurden, sind in dieser Tabelle gezeigt. 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Title: Tabelle 1
Tetrapyrrol-Akkumulierung in behandelten HeLa-Zellen 
<tb>Head Col 01 AL=L: Inhibitor 
<tb>Head Col 02 AL=L: Konzentration
des Inhibitors
( mu M) 
<tb>Head Col 03 AL=L: Fluoreszenz
emission
cps(400/630) 
<tb>Head Col 04 AL=L:

   Menge
an Proto IX
(pMol) 
<tb> <SEP>A <SEP>5000 <SEP>41842 <SEP>4.2 
<tb> <SEP>B <SEP>100 <SEP>12921 <SEP>1.3 
<tb> <SEP>C <SEP>100 <SEP>33477 <SEP>3.5 
<tb> <SEP>D <SEP>100 <SEP>10551 <SEP>1.1 
<tb> <SEP>E <SEP>100 <SEP>8997 <SEP>0.9 
<tb> <SEP>Kontrolle <SEP>2795 <SEP>0.3 
<tb></TABLE> 


 Beispiel 2 
 



  HeLa-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase, die sechs Tage in 6 1 l Falcon-Gewebekulturkolben bei 37 DEG C gezogen worden waren, wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Eine 0,25%ige Lösung von Trypsin in PBS wurde zugegeben, und nach mehreren Minuten wurden die Zellen sanft entfernt und in 110 ml einer 25 mM Lösung von Hepes in Minimum Essential Medium (MEM), das mit 10% V/V inaktiviertem Kälberserum, 1,1 ml einer 200 mM Lösung von Glutamin in 0,85% Kochsalzlösung und 11 000 Einheiten Penicillin/11 000 mcg Streptomycin angereichert war, gebracht. 



  Aliquots (jeweils 5,0 ml) der resuspendierten Zellkultur wurden in 50 ml Falcon Gewebekulturkolben gebracht, mit oder ohne Inhibitor und im Dunkeln 4 Tage bei 37 DEG C inkubiert, wobei der Inhibitor in verdünnter Acetonlösung wie in Beispiel 1 zugegeben wurde. Aceton wurde auch zu den Kontrollen zugegeben, was eine Konzentration an Aceton von 0,2% V/V darin lieferte. Die Menge an Inhibitor war so, dass die in Tabelle 2 unten angegebenen Konzentrationen erreicht wurden. 



  Die Inhibitoren waren:
 
 B. wie in Beispiel 1
 C. wie in Beispiel 1 
 F. ein Herbizid der Formel: 
EMI16.1
 


 Extraktion: 
 



  Die Medien aus jedem der Kolben wurden in Glasrundbodenröhrchen gebracht, während die Zellen, die an den Böden der Kolben hafteten, durch Zugabe von 0,5 ml einer 0,25%igen Lösung von Trypsin in PBS gelockert wurden und nach mehreren Minuten bei 37 DEG C dann aus den Kolben gewaschen und mit ihren Medien wiedervereinigt wurden. Aliquots von 100  mu l wurden dann aus jeder Zellsuspension entfernt, um die Zelldichte zu bestimmen. Die verbleibenden 5,4 ml Zellsuspension wurden dann 30 Minuten beschallt, um die Zellen aufzubrechen. 



  10 ml basisches Aceton (90% Aceton: 10% 0,1 N NH4OH) wurden dann zu jedem Röhrchen zugegeben, und die Röhrchen wurden zentrifugiert, um Protein und Zellbruchstücke zu  entfernen. 5 ml Wasser wurden zu dem Überstand zugegeben, anschliessend 0,5 ml einer gesättigten, wässrigen Lösung von NaCl. Der pH wurde dann auf 6,8 eingestellt durch tropfenweise Zugabe von 2 M KH2PO4. Der wässrige Acetonextrakt wurde dann auf C8-Baker-Prep-Säulen geladen. Die Säulen wurden getrocknet und dann mit 2 ml Wasser gewaschen. Die Tetrapyrrole wurden mit 3 ml 90/10 CH3OH/H2O eluiert. Wie in Beispiel 1 wurden alle diese Extraktionsverfahren im wesentlichen vollständig unter Protoporphyrin IX nicht anregendem Licht (z.B. Grünlicht) oder im Dunkeln (z.B. in lichtundurchlässig beschichteten Behältern) durchgeführt. Die Fluoreszenz der Extrakte wurde dann bestimmt an einem SPEX-Spektralfluorometer.

  Die Protoporphyrin IX-("Proto IX")-Akkumulation wurde quantitativ bestimmt unter Verwendung vorbestimmter Extinktionskoeffizienten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten angegeben. 
<tb><TABLE> Columns=5 
<tb>Title: Tabelle 2
Durchschnittliche Wachstumshemmung und Proto IX-Akkumulation 
<tb>Head Col 01 AL=L: Inhibitor 
<tb>Head Col 02 AL=L: Konzentration
des Inhibitors
( mu M) 
<tb>Head Col 03 AL=L: % 
Wachstums-
hemmung 
<tb>Head Col 04 AL=L:

  Menge
an Proto IX
(pMol)** 
<tb>Head Col 05 AL=L: rel. %
Proto IX*** 
<tb> <SEP>B <SEP>100 <SEP>99 <SEP>5.20 <SEP>2364 
<tb> <SEP>F <SEP>100 <SEP>106 <SEP>2.71 <SEP>1232 
<tb> <SEP>C <SEP>100 <SEP>52 <SEP>4.41 <SEP>2005 
<tb> <SEP>C <SEP>10 <SEP>-15* <SEP>0.57 <SEP>259 
<tb> <SEP>C <SEP>1 <SEP>-26* <SEP>0.19 <SEP>86 
 * negative Werte für "Wachstumshemmung" zeigen an, dass Wachstum auftrat.
** durchschnittliche Menge pro 10<6> Zellen
*** % Kontrolle
  
<tb></TABLE> 


 Bestimmung von I50 
 


 Protoporphyrinogen IX ("Protogen IX") 
 



  Proto IX wurde von Porphyrin Products, Logan UT. erworben und wie bei T. P. Fuesler et al., Plant Physiol., 67 246-249 (1981) ausgeführt, gereinigt. Protogen IX wurde frisch hergestellt durch Reduktion von Proto IX mit Na/Hg-Amalgam, wie bei N. J. Jacobs und J. M. Jacobs, Enzyme, 28, 206-219 (1982) beschrieben, unter Verwendung des gereinigten Proto IX bei einer Konzentration von 300  mu M. 


 Pflanzenmaterial 
 



  Gurke (Cucumis sativus L, cultivar Wisconsin SMR 18") wurde in einer dunklen Wachstumskammer gezogen auf Vermiculit, der mit einem handelsüblichen (9-45-15) Dünger berieselt worden war. Die Keimlinge wurden bei 25 DEG C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 80-90% gezogen. Zwischenzeitliche Belichtung, 1 Minute Licht pro 60-Minuten-Zyklus mit einer gemessenen Intensität von 25  mu E/m<-><2> 50zsec<-><1> (PAR), wurde durch eine General Electric "Bright Stick"-Vorrichtung, die durch eine elektronische Zeitschaltuhr kontrolliert wurde, geliefert. Dies lieferte Gewebe, das zu einer schnellen Chlorophyllsynthese fähig war, wobei die Stärkereserven und Anfangschlorophyllgehalte minimal waren. 


 Chloroplast-Isolierung 
 



  Sich entwickelnde Chloroplasten wurden isoliert, wie von T. P. Fuesler et al., Plant Physiol., 75, 662-664 (1984) beschrieben, mit der Ausnahme, dass im Endreinigungsschritt die Plastide durch ein 40% statt 45% (V/V) Percoll Kissen zentrifugiert wurden. Die Chloroplasten wurden in einem Testpuffer, der 0,5 M Mannit, 20 mM TES, 10 mM Hepes, pH 7,7, 1 mM EDTA, 1mM MgCl2, 1% (G/V) Rinderserumalbumin und 1 mM Dithioerythritol enthielt, auf eine Endkonzentration von 2 mg Protein pro ml resuspendiert. 


 Test auf Protoporphyrinogen-Oxidase 
 



  Tests wurden durchgeführt, wie von J. M. Jacobs und N. J. Jacobs, Arch. Biochem. Biophys. 229, 312-319 (1984) ausgeführt. Proben (0,2 ml) der Chloroplastensuspension wurden 15 Minuten im Dunkeln vorinkubiert mit verschiedenen Konzentrationen von Acifluorfenmethyl ("AFM") oder mit 0,2% (V/V) Aceton (als "Kontrolle"). Dann wurden 50  mu l frisch hergestelltes Protogen (etwa 15 nM) zu der Suspension zugegeben, um die Reaktion zu initiieren. Die Tests wurden durch die Zugabe von 2,75 ml des fluorimetrischen Mediums von N. J. Jacobs und J. M. Jacobs, Enzyme, 28, 206-219 (1982) beendet, das aus 1% (V/V) Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat), 50 mM Tris HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA bestand; 1 mM Dithioerythritol ersetzte 5 mM Glutathion.

   Die Suspensionen wurden dann direkt an einem SPEX-Fluorolog-2-Spektralfluorometer, das mit einem Frontfluoreszenzzusatz für trübe biologische Proben ausgestattet war, abgelesen. Die Menge an produziertem Proto IX wurde aus einer Standardkurve quantitativ bestimmt (Menge an Proto IX gegen Emission bei 630 nm, bei Anregung mit 400 nm), die mit gereinigtem Proto IX in fluorometrischem Medium erstellt wurde. 



  Um die Menge der nichtenzymatischen Oxidation zu Proto IX im obigen Test zu bestimmen, wurde derselbe Test durchgeführt mit der Ausnahme, dass statt der Suspension aktiver Chloroplasten eine Suspension verwendet wurde, in der die Chloroplasten durch 15minütige Erhitzung auf 85 DEG C inaktiviert worden waren. Das Subtrahieren der Menge an so produziertem Proto IX von der Menge, die in Gegenwart der aktiven Chloroplasten produziert wurde, ergab die Menge an enzymatisch gebildetem Proto IX. Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 1 gezeigt (worin LSD die geringstwertige Differenz angibt, wie es üblich ist). Fig. 1 zeigt, dass der I50-Wert (die Konzentration, die 50% Hemmung liefert) geringer ist, als 0,1  mu M, d.h. etwa 0,03  mu M. 



  Tests der Wirkung von 10  mu M AFM auf die enzymatische Umwandlung von Proto IX zu Magnesium-Proto IX in der Chloroplastensuspension (in Gegenwart von ATP) zeigten, dass AFM keine Hemmwirkung auf die Umwandlung hatte. 


 Beispiel 3 
 



  In diesem Beispiel wurden die Inhibitoren dem Futter für tumortragende Mäuse beigegeben; bei einigen der Mäuse, die als Kontrolle verwendet wurden, wurde dem Futter kein Inhibitor zugegeben. Die Mäuse werden dann getötet, und ihre Nieren, Darm, Nebennieren, Leber und Tumor wurden entfernt und auf ihren Gehalt an Proto IX analysiert. Die folgenden Inhibitoren wurden angewendet: 
EMI21.1
 



  Im einzelnen waren die Mäuse DBA/2 Ha-Mäuse, denen SMTF-subkutane Tumoren am Tag 0 in die rechte Schulter injiziert worden waren. Die Mäuse, die einzeln untergebracht waren, erhielten unbehandeltes Purina Nagetierfutter 5001-(Purina Rodent Chow 5001)-Brei am Tag 1, danach vom Tag 2 bis 10 erhielten die Mäuse denselben Brei, der mit 2000 ppm des zu testenden Inhibitors (oder bei den Kontrollen desselben unbehandelten Breis) behandelt war. Die Behandlung des Breis wurde bewirkt, indem er mit einer geringen Menge einer Acetonlösung des zu untersuchenden Stoffes gemischt wurde. Die Mäuse wurden dann am Tag 10 getötet, mit Ausnahme der mit dem als 6j bezeichneten Mittel behandelten Maus; letztere wurde am Tag 7 getötet. Die Gewebe wurden über Nacht bei 4 DEG C gekühlt, dann trocken-geblottet, und das Frischgewicht jeder Gewebeprobe wurde aufgezeichnet.

  Die Gewebe wurden dann in 5 ml oder 10 ml, im Fall des Darms und der Leber, Aceton-0,1 N NH4OH (9:1, V/V) homogenisiert. Die Homogenate wurden dann bei 1500 g zentrifugiert und die Überstände wurden auf einem SPEX-FA 112 Spektralfluorometer analysiert; Anregung 400 nm, Emission 630 nm Wellenlänge, die Optima für Proto IX. Die Proto IX-Akkumulation wurde bestimmt als cps (Fluoreszenzzählimpulse pro Sekunde emittiert) pro Gramm Gewebe.

  Die Ergebnisse sind unten aufgelistet (die Ergebnisse sind Durchschnittswerte für zwei Mäuse pro Behandlung mit Ausnahme der Behandlungen mit den Inhibitoren 6f, 6h, 6i und 6j, bei denen nur eine Maus behandelt wurde): 
<tb><TABLE> Columns=7 
<tb>Title: Proto IX Durchschnitts cps pro Gramm x 10<3*> 
<tb>Head Col 01 AL=L: Inhibitor 
<tb>Head Col 02 AL=L: Tumor 
<tb>Head Col 03 AL=L: Leber 
<tb>Head Col 04 AL=L: Nieren 
<tb>Head Col 05 AL=L: Nebennieren 
<tb>Head Col 06 AL=L: Darm 
<tb>Head Col 07 AL=L:

  Gewicht Tumor wie excidiert
(mg) 
<tb> <SEP>6a <SEP>1203 <SEP>4291 <SEP>10817 <SEP>6572 <SEP>5870** <SEP>143 
<tb> <SEP>6b <SEP>1520 <SEP>1261 <SEP>2441 <SEP>2529 <SEP>5577** <SEP>90 
<tb> <SEP>6c <SEP>14336 <SEP>2739 <SEP>16186 <SEP>13790 <SEP>9937** <SEP>157 
<tb> <SEP>6d <SEP>2006 <SEP>1581 <SEP>12865 <SEP>443 <SEP>5565** <SEP>294 
<tb> <SEP>6e <SEP>837 <SEP>876 <SEP>915 <SEP>1331 <SEP>2069** <SEP>165 
<tb> <SEP>6f <SEP>449 <SEP>1170 <SEP>661 <SEP>5611 <SEP>1157 <SEP>69 
<tb> <SEP>6g <SEP>166 <SEP>803 <SEP>606 <SEP>1984 <SEP>466 <SEP>250 
<tb> <SEP>6h <SEP>298 <SEP>914 <SEP>585 <SEP>2259 <SEP>584 <SEP>192 
<tb> <SEP>6i <SEP>932 <SEP>1510 <SEP>4014 <SEP>36940 <SEP>3454 <SEP>20 
<tb> <SEP>6j <SEP>1251 <SEP>538 <SEP>315 <SEP>491 <SEP>572 <SEP>11 
<tb> <SEP>Kontrolle <SEP>239 <SEP>536 <SEP>494 <SEP>1504 <SEP>233 <SEP>200 
<tb> <SEP>424** 
 * Die Zahlen in der Tabelle sind gleich den 

   Originaldaten mal 10<-3>
** Messungen wurden gemacht mit Proben, die verdünnt waren mit 3 Teilen basischem Aceton zu
einem Teil Probe
  
<tb></TABLE> 



  Diese Zahlen entsprechen den folgenden Konzentrationen an Proto IX in den jeweiligen Geweben, ausgedrückt als  mu g Proto IX pro Gramm Gewebe: 
<tb><TABLE> Columns=6 
<tb>Head Col 01 AL=L: Inhibitor 
<tb>Head Col 02 AL=L: Tumor 
<tb>Head Col 03 AL=L: Leber 
<tb>Head Col 04 AL=L: Nieren 
<tb>Head Col 05 AL=L: Nebennieren 
<tb>Head Col 06 AL=L:

  Darm 
<tb> <SEP>6a <SEP>11 <SEP>39 <SEP>99 <SEP>60 <SEP>54 
<tb> <SEP>6b <SEP>14 <SEP>12 <SEP>22 <SEP>23 <SEP>51 
<tb> <SEP>6c <SEP>131 <SEP>25 <SEP>148 <SEP>126 <SEP>91 
<tb> <SEP>6d <SEP>18 <SEP>14 <SEP>117 <SEP>4 <SEP>51 
<tb> <SEP>6e <SEP>8 <SEP>8 <SEP>8 <SEP>12 <SEP>19 
<tb> <SEP>6f <SEP>4 <SEP>11 <SEP>6 <SEP>51 <SEP>11 
<tb> <SEP>6g <SEP>2 <SEP>7 <SEP>6 <SEP>18 <SEP>4 
<tb> <SEP>6h <SEP>3 <SEP>8 <SEP>5 <SEP>21 <SEP>5 
<tb> <SEP>6i <SEP>9 <SEP>14 <SEP>37 <SEP>337 <SEP>32 
<tb> <SEP>6j <SEP>11 <SEP>5 <SEP>3 <SEP>4 <SEP>5 
<tb> <SEP>Kontrolle <SEP>2 <SEP>5 <SEP>5 <SEP>14 <SEP>2 
<tb> <SEP>4 
<tb></TABLE> 



  Der oben zitierte Artikel von Dougherty gibt eine Zahl von 3,6  mu g/g für die Konzentration des Porphyrins bei derselben Art (SMT-F) Tumor nach Injektion von 10 mg/kg Hämatoporphyrinderivat in dieselbe Art (DBA/2 Ha) Maus an. Andere technische Literatur (Moan et al. P&P 46-5, Seiten 713-721; beachte Fig. 2 auf Seite 716) deuten an, dass eine Konzentration von etwa 12  mu g/g des Porphyrins in Tumoren erreicht wird (C3H/Tif Mammakarzinom) in DBA/H2-Mäusen nach intraperitonealer Injektion von 25 mg/kg Photofrin II, dem weitverbreiteten Sensibilisierungsmittel für photodynamische Behandlung und Nachweis von Krebs. 



   Die Gesamtmengen der von den Mäusen verbrauchten, den Inhibitor enthaltenden Nahrung waren wie folgt: 6a, 22 und 35 g; 6b 37 und 35 g; 6c 25 und 22 g; 6d 41 und 32 g; 6e 40 und 44 g; 6f 27 g; 6g 33 und 40 g; 6h 36 g; 6i 10 g; 6j 20 g. 



  Bei der Vorbereitung der in diesem Beispiel 3 beschriebenen Untersuchungen wurden die folgenden Routineschritte durchgeführt, unter Verwendung (wenn nicht anders angegeben) des Inhibitors, der in diesem Beispiel als 6c bezeichnet wird, bei nicht tumortragenden Tieren: 
 
   a. Die LD50 des Inhibitors wurde bestimmt als über 2600 mg/kg liegend (d.h. mg des Inhibitors pro kg Körpergewicht) für Ratten (bestimmt während eines 14tägigen Zeitraumes anschliessend an eine einzelne orale Dosis, die Maisöl enthaltend 15% des Mittels umfasste) und mehr als 700 mg/kg für Mäuse (bestimmt während eines 14tägigen Zeitraumes folgend auf eine einzelne orale Dosis, die Maisöl und 5% des Mittels umfasste). 
   b.

  Bei Tests für die Trägermittel für die intraperitoneale Injektion, ohne den Inhibitor, wurde bestimmt, dass die Mäuse eine Injektion einer 0,5 ml Dosis einer Mischung von gleichen Teilen DMSO (Dimethylsulfoxid) und Wasser tolerieren konnten. 
   c. In Tests des in einer Mischung von 60% Maisöl und 40% DMSO intraperitoneal injizierten, Inhibitors wurde bestimmt, dass die Mäuse eine Dosis von 100 mg/kg tolerieren konnten. 
   d.

  Die folgenden Versuche wurden mit Mäusen durchgeführt: 
 
   i) tägliche orale Gabe von 50 mg/kg (unter Verwendung einer 1%igen Lösung des Inhibitors in Aceton) 8 Tage lang 
   ii) tägliche i.p.-Injektion von 50 mg/kg (unter Verwendung einer 1%igen Dispersion des Inhibitors in Mineralöl, hergestellt durch Auflösen  des Inhibitors in einem Tropfen DMSO und Mischen der entstehenden Lösung mit dem Mineralöl) 8 Tage lang; 
   ii) tägliche topische Anwendung auf die Haut mit 50 mg/kg (unter Verwendung einer 1%igen Lösung in DMSO) 8 Tage lang; 
   iv) Füttern 8 Tage lang mit einer Standardnahrung, in die 2000 ppm des Inhibitors, bezogen auf das Gewicht der Nahrung eingebracht worden waren; 
   v) tägliche i.v.-Injektion von 50 mg/kg (unter Verwendung einer 2%igen Lösung in DMSO) 4 Tage lang. 
 
 



  Die in diesen Versuchen verwendeten Mäuse wurden dann getötet und ihre Gewebe auf Proto IX-Akkumulation untersucht. 



  In einem anderen Test wurde eine männliche Fisher 344-Ratte 27 Tage mit einem Futter, das 5000 ppm des Inhibitors 6c enthielt, gefüttert und dann getötet. Die Gewebe dieser Ratte zeigten erhöhte Gehalte an Proto IX verglichen mit einer Kontrolle, mit deutlichen Anstiegen der Gehalte in der Niere, dem Darm, dem Magen und dem Gehirn und nur einem geringen Anstieg des Gehalts in Muskelgewebe. 



  In den vorhergehenden Tests mit Ratten und Mäusen wurden die Tiere in einem Standard-12-Stunden-Dunkel-12-Stunden- Licht-Zyklus gehalten. 


 Beispiel 4 
 



  In einer Reihe von Versuchen gemäss den Beispielen 1 und 2 wurden Kulturen von HeLa-Zellen in Gegenwart von 100  mu M verschiedener unten aufgeführter Inhibitoren inkubiert. Die aufgeführten %-Angaben neben jedem  Inhibitor zeigen das Ansteigen der Menge an Proto IX, das in Gegenwart dieses Inhibitors produziert wurde, bezogen auf die von den Kontrollen im selben Experiment produzierten Mengen. 



  In Beispiel 3 verwendete Inhibitoren:
 6a) 337%; 6b) 366%; 6c) 297%; 6d) 1200%; 6e) 1210%; 6f) 280 ; 6g) 326%; 6h) 431%; 6i) 544%; 6j) 469%. 



  Andere  Inhibitoren: 
EMI28.1
 


 Beispiel 5 
 



  In diesem Beispiel wurde der Inhibitor 6c von Beispiel 3 an Ratten verfüttert, Tumore wurden in Ratten implantiert und die tumortragende Zone wurde mit Licht bestrahlt, was eine Regression des Tumors bewirkte. 



  Genauer wurden 3 Sprague-Dawley-Ratten mit Durchschnittsgewicht 120 g 6 Tage auf eine Diät mit einer Nahrung, die 2000 ppm des Inhibitors enthielt, gesetzt. Am Tag 3 wurden Chondrosarkoma in den rechten hinteren Schenkel jeder Ratte implantiert, indem 0,3 ml einer Suspension der Tumorzellen (1 Million Tumorzellen) injiziert wurden. Am Tag 6 wurde der rechte hintere Schenkel jeder Ratte rasiert und enthaart, die Grösse jedes Tumors gemessen, und die Tumorfläche und die umgebende Haut wurden dann mit nicht-thermischen Dosen von 630 nm Licht mit insgesamt 270 J/cm<2> bestrahlt. Am nächsten Tag wurde gefunden, dass zwei Ratten offensichtlich frei von Tumoren waren (d.h. keine tastbare Tumormasse), und die dritte Ratte zeigte eine fast vollständige Regression des Tumors.

  Die umgebende Haut und das Muskelgewebe der Ratten waren leicht gebleicht und zeigten eine geringe Schwellung, deutlich weniger als mit der Photofrin II vermittelten photodynamischen Therapie einhergeht. 


 Appendix A 
 


 % Efflux-Test 
 



  Der % Efflux-Test verwendet Kotyledonen, die von etiolierten Gurkenkeimlingen geernet wurden. In einem Anfangsschritt wird eine Masse von Kotyledonen im Dunkeln mit einer wässrigen gepufferten Lösung, die einen radioaktiv markierten Zucker enthält, behandelt. Die  Menge des von den Kotyledonen aufgenommenen Zuckers wird dann gemessen (durch Auszählen, wie unten beschrieben). Die Kotyledonenmasse wird dann in zwei Teile geteilt; ein Teil der Kotyledonen wird im Dunkeln mit einer wässrigen gepufferten Lösung, die die zu testende Verbindung enthält, behandelt, während der andere Teil auf dieselbe Weise im Dunkeln behandelt wird, mit einer ansonsten identischen Lösung, ohne die Testverbindung, als Kontrolle.

  Die Kotyledonen im Kontakt mit der wässrigen Lösungen werden dann 16 Stunden mit Licht bestrahlt und dann aus den wässrigen Lösungen getrennt; letztere werden dann gemessen (durch Zählen), um ihre Gehalte an radioaktiv markiertem Material zu bestimmen. Die Ergebnisse werden als % Efflux ausgedrückt, der wie folgt berechnet wird, worin S die Zählung des radioaktiv markierten Materials (pro Kotyledone), das durch die Kotyledonen in der Anfangsbehandlung aufgenommen wird, ist, ST die Zählung des radioaktiv markierten Materials (pro Kotyledone) in der wässrigen Lösung, die die zu testende Verbindung enthält, nach Bestrahlung mit Licht und SC die Zählung des radioaktiv markierten Materials (pro Kotyledone) in der wässrigen Lösung der Kontrolle nach Bestrahlung mit Licht ist: 
EMI30.1
 



   Genauer werden die folgenden Materialien und Bedingungen in dem % Efflux-Test angewendet: 


 Pflanzenmaterial: 
 



  Gurkensaat (Cucumis sativus L. cultivar "Wisconsin SMR 18") wurde gekeimt und in Vermiculit, der mit einem üblichen (9-45-15) Dünger berieselt worden war, gezüchtet. Die Keimlinge wurden bei 25 DEG C und 80-90% relativer Luftfeuchtigkeit in einer dunklen Inkubationskammer  gezogen. Die Kotyledonen wurden von den etiolierten Keimlingen 5 Tage nach Pflanzen geerntet und in 1,0 mM CaCl2 gespült, alles unter grünem Licht. 


 Gepufferte Lösung: 
 



  1 mM KCl, 1 mM CaCl2 und 2,0 mM Kaliumphosphat, eingestellt auf pH 6,5 (z.B. mit NaOH) 


 Radioaktiv markierter Zucker: 
 



  3-O-Methyl-3-[U-14C]-glucose der spezifischen Aktivität 10,9 GBq/mmol (Amersham Corp., Arlington Heights IL). 


 Anfangsbehandlung: 
 



  Gewaschene Kotyledonen (180-230) werden in einen 250 ml Weithals-Erlenmeyerkolben mit Schaumstoffstopfen, der 50 ml der gepufferten Lösung enthält, gegeben, und der radioaktiv markierte Zucker wird in einer Menge zugegeben, die eine Konzentration von 600 nM in der Lösung ergibt. Der Kolben wird 24 Stunden mit 125 UpM auf einem Kreisschüttler im Dunkeln geschüttelt. Die Kotyledonen werden dann auf einem Nylonnetz gewonnen und dreimal mit 20 ml Volumina 1 mM CaCl2 gespült.

  Die Aufnahme des radioaktiv markierten Zuckers wird gemessen, indem 3 Proben von 5 Kotyledonen jeweils in NCS Gewebesolubilisierungsmittel (Amersham Corp.) aufgeschlossen werden und das entstehende Mazerat in einem Flüssigszintillationsspektrometer gezählt wird. (Die Ergebnisse dieser Aufschlüsse erwiesen sich als äquivalent mit derselben Bestimmung, die gemacht wurde, indem Probekotyledonen in einer Autooxidationsvorrichtung verbrannt wurden). 


 Behandlung mit der zu testenden Verbindung (und Kontrollbehandlung): 
 



  5 Kotyledonen werden mit der abaxialen Seite nach oben auf 3 ml der gepufferten Lösung in einer zugedeckten Kunststoff-Petrischale mit 35 mm Durchmesser schwimmen  gelassen. Die Testverbindung wird dann zugegeben (als Lösung in Aceton) in einer solchen Menge, dass sich eine vorbestimmte Konzentration (unten diskutiert) der Testverbindung in der gepufferten Lösung ergibt; die Acetonkonzentration in der gepufferten Lösung ist dann 0,1% (V/V), in der Kontrolle ebenso wie in der Lösung, die die Testverbindung enthält. Die schwimmenden Kotyledonen werden dann herumgewirbelt durch Schütteln der Schalen 16 Stunden lang bei 90 UpM auf der Oberfläche eines Kreisschüttlers. 


 Bestrahlung mit Licht: 
 



  Die Schalen, die die Kotyledonen, die auf den Lösungen schwimmen, enthalten, werden 16 Stunden einer Beleuchtung ausgesetzt, die durch 4 GE F20T12-CW-Fluoreszenzlampen geliefert wird, mit einer gemessenen Intensität von 150  mu E m<-><2> sec<-><1> in der photosynthetisch aktiven Region des Spektrums (PAR) (gemessen an der Oberfläche der Kotyledonen), während die Schalen geschüttelt werden. 


 Messung der Menge an radioaktiv markiertem Material in der Flüssigkeit: 
 



  Die gesamte Flüssigkeit wird von den Kotyledonen getrennt und dann in einem Flüssigszintillationsspektrometer ausgezählt. 


 Dunkelheit: 
 



  Alle Behandlungen vor dem Beleuchtungsschritt werden im Dunkeln oder unter grün fluoreszierendem Licht (d.h. Licht, das durch ein grünes Kunststoff-Kantenfilter gefiltert wird, das Licht von 450-600 nm durchlässt) durchgeführt. 


 Appendix B 
 


 Kulturmedien 
 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Title: Medium M 
<tb>Head Col 01 AL=L: Salze 
<tb>Head Col 02 AL=L: Molarität 
<tb>Head Col 03 AL=L:

  Stammlösung 
<tb>Head Col 04 AL=L: ml Stammlösung/l 
<tb> <SEP>Na Citrat . 6H2O <SEP>1.7 x 10<. 3>M <SEP>10% <SEP>5 
<tb> <SEP>Spurenmetalle <SEP>wie unten <SEP>wie unten <SEP>10 
<tb> <SEP>FeCl3 . 6H2O <SEP>0.37 x 10<. 3>M <SEP>1% <SEP>1 
<tb> <SEP>CaCl2 . 2H2O <SEP>0.36 x 10<. 3>M <SEP>5.3% <SEP>1 
<tb> <SEP>MgSO4 . 7H2O <SEP>1.2 x 10<. 3>M <SEP>10% <SEP>3 
<tb> <SEP>NH4NO3 <SEP>3.7 x 10<. 3>M <SEP>10% <SEP>3 
<tb> <SEP>KH2PO4 <SEP>2.2 x 10<. 3>M <SEP>10% <SEP>3 
<tb> <SEP>K2HPO4 <SEP>1.7 x 10<. 3>M <SEP>10% <SEP>3 
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Title: Stammlösung  der Spurenmetallmischung 
<tb> <SEP>H3BO3 <SEP>100 mg/L 
<tb> <SEP>ZnSO4 . 7H2O <SEP>100 mg/L 
<tb> <SEP>MnSO4 . 4H2O <SEP>40 mg/L 
<tb> <SEP>COCl2 . 6H2O <SEP>20 mg/L 
<tb> <SEP>NaMoO4 . 2H2O <SEP>20 mg/L 
<tb> <SEP>CuSO4 <SEP>4 mg/L 
<tb></TABLE> 



  Kulturmedium A wird hergestellt, indem 10 ml pro l einer wässrigen 10%igen Natriumacetatlösung (7,5 x 10<-><3> M) zu Medium M zugegeben werden. 



  Die Komponenten werden zu destilliertem Wasser in der oben angegebenen Reihenfolge zugegeben und bei 15 psi 15 Minuten autoklaviert. 


 Stammkulturen gezüchtet in Gegenwart von Licht 
 



  Stammkulturen von y-1-Zellen werden axenisch in Flüssigkultur aus Medium A oder M, vorzugsweise Medium M mit einem 14/10 Stunden Licht/Dunkel-Zyklus bei 25 DEG C in Erlenmeyerkolben, die mit Polyurethanstopfen versehen sind, gehalten. Die Stammkulturen werden ohne zusätzliche Belüftung auf rotierenden Schüttlern mit 125 UpM inkubiert. Die Lichtintensität am Kulturlevel ist 120  mu E m<-><2> sec<-><1> (PAR). Unter diesen Bedingungen werden die Kulturen in einer halbsynchronen Wachstumsart gezogen, bis sie die stationäre Phase von 2-4 x 10<6> Zellen/ml erreichen. 


 Kulturen, die ohne Licht gewachsen sind (im Dunkeln gewachsene Kulturen) 
 



  Zellen der stationären Phase aus den Stammkulturen, die in Gegenwart von Licht gewachsen sind (7,5 ml) werden in 750 ml Medium A in einen Erlenmeyerkolben transferiert. Die Zellen werden 3-4 Tage bei 25 DEG C im Dunkeln inkubiert, unter Belüftung mit einem submersen Belüftungsrohr. Während dieses Zeitraumes durchläuft diese Kultur von y-1-Zellen 7-8 Zellteilungen, wobei sie alles sichtbare Chlorophyll verliert und die Konzentration sollte 2-3 x 10<6> Zellen pro ml sein. 


 Herstellung von Zellen zur Verwendung im Test 
 



  Zellen werden von einer frisch hergestellten, im Dunkeln gewachsenen Kultur (750 ml) durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit, d.h. etwa 2000 UpM, ungefähr 5 Minuten bei etwa 20 DEG C geerntet. Die Zellen werden leicht resuspendiert in 50 ml Medium A. Eine Probe dieser  Suspension (ungefähr 0,25 ml) sollte auf Motilität getestet werden, und nach Fixierung mit einer wässrigen 1%igen Glutaraldehydlösung sollte eine Zellzählung gemacht werden, um die Anzahl der Zellen pro ml zu bestimmen. Eine normale Zellzählung ist etwa 5 x 10<7> Zellen pro ml. Aliquots von 1 ml (10<7> Zellen pro ml ) werden in die Testgefässe gebracht (z.B. Falcon< TM > 24-Napf-Gewebekulturplatten). An diesem Punkt sind die Zellen sehr motil und haben eine gelbe Farbe. 



   Die Testverbindung wird in einem Lösungsmittel (Aceton, Ethanol, Dimethylsulfoxid oder Wasser, vorzugsweise Aceton) gelöst, um eine Konzentration zu schaffen, die dem 1000fachen der Endkonzentration entspricht. 1  mu l dieser Testlösung wird zu jedem von 2 Näpfen mit einer 5 oder 10  mu l Mikrospritze zugegeben. 4 Kontrollnäpfe pro Gewebekulturplatte werden auf die oben beschriebene Weise hergestellt, ohne dass die Testverbindung vorhanden ist. Die Gewebekulturplatten werden mit einem transparenten Kunststoffdeckel bedeckt und in eine Wachstumskammer mit einer Lichtintensität von 70-90  mu E m<-><2> sec<-><1> 13 bis 16 Stunden bei 25 DEG C gebracht. Wenn der Inhalt der Testnäpfe gelb erscheint, werden sie extrahiert, wie in der Sektion für die Auswertung der Ergebnisse unten beschrieben.

  Wenn der Inhalt der Testnäpfe transparent erscheint oder eine fahlgrüne Farbe hat, werden sie in einen Rotationsschüttler mit ungefähr 125 UpM gebracht und 2 Stunden mit einer Lichtintensität von etwa 600  mu E m<-><2> sec<-><1> bestrahlt, bevor sie extrahiert werden. 


 Auswertung der Ergebnisse 
 



   Eine wässrige, 10%ige Natriumdodecylsulfatlösung (250  mu l) und Methanol (1ml) werden zu jedem Testnapf zugegeben und sorgfältig gemischt. Die Mischungen werden im Dunkeln 3-4 Stunden stehen gelassen. Die Gewebekulturplatten werden bei Raumtemperatur mit niedriger  Geschwindigkeit (ca. 2000 UpM) 5 Minuten zentrifugiert. Die Überstände werden entfernt und in einem Beckman Spektralphotometer Modell 35 zwischen 350 nm und 500 nm auf die Anwesenheit von Protoporphyrin IX, bei 668 nm, dem Absorptionspeak von Chlorophyll in diesem Lösungsmittelsystem und bei 720 nm, um einen Hintergrundtrübungswert zu verwenden, analysiert. 


 Analyse der Daten 
 



  Für jeden Napf wird ein Grünwert erhalten, indem der 720 nm-Wert von dem 668 nm-Wert abgezogen wird. Diese Werte werden für jede Konzentration der zu testenden Verbindung und für die Kontrolle im Durchschnitt gebildet. Die % Hemmung ist 
EMI36.1
 

Claims (17)

1. Spezifischer Inhibitor der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen in Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase in Säugetier-Tumorzellen, wodurch eine Anreicherung von Protoporphyrin IX in diesen Zellen bewirkt wird, als Therapeutikum.

2. Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor einen I50 für Protoporphyrinogen-Oxidase von weniger als 1 mu M hat.

3. Inhibitor nach Anspruch 2 als Mittel zur photodynamischen Behandlung von festen Tumoren.

4. Inhibitor nach Anspruch 1 als Therapeutikum, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor kein Tetrapyrrol ist und ein Redoxpotential hat, das negativer als -500 mV ist.

5. Spezifischer Inhibitor nach Anspruch 4 als Mittel zur photodynamischen Behandlung von festen Tumoren.

6.

Inhibitor nach Anspruch 4 als Therapeutikum, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor 1-(4-Chlor-2-fluor-5-propargyloxyphenyl)-3-methyl-4-difluormethyl- DELTA -<2>-1,2,4-triazolin-5-on ist.

7. Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass er der Formel: EMI37.1 entspricht.

8. Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, als oral verabreichbares Therapeutikum, insbesondere ein saures Sulfonamid oder ein wasserlösliches Salz davon.

9. Verwendung eines spezifischen Inhibitors der enzymatischen Umwandlung von Protoporphyrinogen in Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase in Säugetierzellen, wodurch eine Anreicherung von Protoporphyrin IX in diesen Zellen bewirkt wird, zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zum Töten von festen Säugetier-Tumorzellen, wobei dieses Präparat auch einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.

10.

Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor einen I50 für Protoporphyrinogen-Oxidase von weniger als 1 mu M hat.

11. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor kein Tetrapyrrol ist und ein Redoxpotential hat, das negativer als -500 mV ist.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor 1-(4-Chlor-2-fluor-5-propargyloxyphenyl)-3-methyl-4-difluormethyl- DELTA -<2>-1,2,4-triazolin-5-on ist.

13.

Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor ein Aryltriazolinon, ein Aryltetrazolinon, ein Aryltriazindion, ein Aryloxadiazol, ein Aryltetrahydroindazol, ein Aryltetrahydrophthalimid, ein Arylhydantoin, ein Arylurazol, ein Arylhexahydropyridazin, ein heterocyclisches Arylurethan, eine Phenoxyphenylverbindung, ein Arylpyrazol oder eine Verbindung der Formel: EMI38.1 worin X<b> für O oder S steht und "Ph" substituiertes Phenyl bedeutet, ist.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Arylgruppe einen Substituenten hat, der eine saure Sulfonamidgruppe oder ein wasserlösliches Salz davon ist.

15. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor ein Aryltriazolinon ist.

16.

Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 oder nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor der Formel: EMI39.1 entspricht.

17. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor, insbesondere ein saures Sulfonamid oder ein wasserlösliches Salz davon, zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates, das zur oralen Verabreichung bestimmt ist, verwendet wird.