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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Verwendung bei
der Behandlung einer großen
Vielfalt von Malignitäten
in Säugern.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung
ist nicht-toxisch und zielt auf Krebszellen, im Gegensatz zu gesunden peripheren
Zellen.
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Pflanzen
können
Stresssituationen durchmachen, welche zur Aktivierung von komplexen
genetischen Stoffwechselwegen führen,
die physiologische Antworten, die für die Stressquelle angemessen sind,
mit sich bringen. Übliche
Stresssituationen, denen Pflanzen ausgesetzt sind, schließen extreme UV-Strahlung,
osmotischen Schock, Hitzeschock und Befall mit Krankheitserregern
ein. In Pflanzen haben sich Stresshormone entwickelt, welche in
derartigen Zeiten von Stress freigesetzt werden und verschiedene
Kaskaden in Gang bringen, welche in angemessenen Antworten enden.
Jasmonsäure
(JA) und Methyljasmonat (MJ) gehören
zu der Gruppe natürlicher
Phyto-Stresshormone, die „Jasmonate" heißen (Sembdner
und Parthier, Annu. Rev. Physiol. Plant Mol. Biol., 44, 569–589, 1993).
Jasmonsäure
ist entscheidend für
das intrazelluläre
Signalisieren als Antwort auf Verletzung und Methyljasmonat verursacht
die Induktion eines Proteinase-Inhibitors, der in niedrigen Konzentrationen
als Antwort auf Verwundung oder Befall mit Krankheitserregern akkumuliert (Farmer
und Ryan, Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 7713–7716, 1990). Jasmonate sind
für eine
Vielfalt von Verwendungen beim Pflanzenwachstum und der Verbesserung
des Ernteertrags patentiert worden. Die Anwendung von Jasmonaten
kann ein breites Spektrum an widersprüchlichen Wirkungen auf praktisch
alle Pflanzen haben. Diese Wirkungen reichen von Hemmung der Pflanzenentwicklung
bis zur Förderung
von Prozessen in Pflanzen. Das U.S.-Patent Nr. 6,114,284 offenbart
die Verwendung eines Jasmonsäureesters
und Giberellin, um Pflanzenwachstum und -Entwicklung synergistisch
zu steigern. Das U.S.-Patent Nr. 5,436,226 offenbart die Verwendung eines
Jasmonats, um des Keimen und Dunkel-werden bei Knollen, nachdem
sie gesammelt wurden, zu hemmen, und das U.S.-Patent Nr. 5,118,711
offenbart die Verwendung von Methyljasmonat um Insekten abzuwehren.
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Natriumsalicylat
(SA) ist ein Phyto-Stresshormon aus einer anderen Familie und ein
zentraler Vermittler der Verteidigungsantworten von Pflanzen auf
Krankheitserreger und Verletzung (Ryals et al., Plant Cell, 8, 1809–1819, 1996).
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Eine
typische Antwort, die Pflanzen bei Befall mit einem mikrobiellen
Krankheitserreger verwenden, kann zum Beispiel programmierter Zelltod,
hypersensitive Antwort (HR) genannt, sein, welcher zur Bildung einer
Zone von toten Zellen um die Infektionsstelle herum führt. Die
Schichten aus toten Zellen, die die Stelle des Eindringens des Krankheitserregers
umgeben, sollen als physikalische Barriere, die die weitere Proliferation
und Ausbreitung des Krankheitserregers hemmt, dienen. Ein nachfolgender Schritt
des Prozesses umfasst die Synthese des Phyto-Stresshormons Natriumsalicylat
und Akkumulation von antimikrobiellen Wirkstoffen, wie z.B. Proteine, die
im Zusammenhang mit der Pathogenese stehen und Phytoalexine (Dangl
et al., Plant Cell, 8, 1793–1807,
1996; Mitler und Larn, Trends Microbiol., 4, 10–15, 1996).
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Dieser
programmierte Zelltod als Antwort auf Befall mit Krankheitserregern
erinnert an den programmierten Zelltod, von dem bekannt ist, dass
er in Säugerzellen
vorkommt. Säugerzellen
können
durch „unplanmäßige" Nekrose sterben,
welche durch äußere Beschädigung verursacht
wird und zu Zellexplosion führt,
oder auf die organisiertere Weise der Apoptose, auch „programmierter
Zelltod" oder „zellulärer Selbstmord" genannt (Willingham,
J. Histochem. Cytochem., 47, 1101–1109, 1999). Bei der Apoptose sind
biochemische und morphologische Ereignisse gewöhnlich in einer Kaskade von
sehr spezifischen und kontrollierten Schritten organisiert, welche
die Zerlegung des Kerns und die Schrumpfung der Zelle einschließen und
mit der vollständigen
Aufspaltung des Zellinhalts zu apoptotischen Körpern enden (Stewart, J. Cancer
Inst., 86, 1286–1295,
1994).
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Der
Prozess der Apoptose ist langsamer als Nekrose und vollzieht sich
in ein paar Stunden oder Tagen, je nach Auslöser. Diese Art von Tod kann
als „Zell-Selbstmord" betrachtet werden
(Willingham, J. Histochem. Cytochem., 47, 1101–1109, 1999).
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Hinreichend überraschend,
war das Phyto-Stresshormon SA fähig,
intrazelluläre
biochemische Ereignisse auszulösen,
die ebenso für
eine Stressantwort in Säugerzellen
typisch sind (Schwenger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 4, 2869–2873, 1997;
Schwenger et al., J. Cell. Physiol., 179, 109–114, 1999), und war fähig, durch
Aktivierung der Caspase-3 (eine zytoplasmatische Säuger-Protease, die
für die
letzten Schritte der Apoptose unentbehrlich ist) in Zelllinien der
menschlichen myeloischen Leukämie
Apoptose (programmierten Zelltod) auszulösen (Klampfer et al., Blood,
93, 2386–2394,
1999; Willingham, J. Histochem. Cytochem., 47, 1101–1109, 1999;
Porter und Janicke, Cell Death Differ., 6, 99–104, 1999). SA war ebenfalls
fähig,
Apoptose in Säuger-FS-4-Fibroblasten
(Schwenger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 4, 2869–2873, 1997)
und in menschlichem Bauchspeicheldrüsenkrebs auszulösen (McDade
et al., J. Surg. Res., 83, 56–61,
1999). Die Arzneistofffamilie der nicht-steroidalen anti-inflammatorischen Arzneistoffe
(NSAID), von der Salicylsäure
ein Vertreter ist, weist wirksame chemopräventive Aktivität auf (Morgan,
Gut, 38, 646–648, 1996;
Peleg et al., Dig. Dis. Sci., 41, 1319–1326, 1996; Vainio et al.,
Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 6, 749–753, 1997).
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Viele
Pflanzengene, die auf Umgebungs- und Entwicklungsveränderungen
reagieren, werden durch Jasmonsäure,
die sich über
einen octadecanoiden Stoffwechselweg von Linolensäure ableitet,
reguliert. Pflanzenverteidigungsantworten auf bestimmte Wellenlängen von
ultravioletter Strahlung erfordern die Aktivierung des octadecanoiden
Verteidigungs-Signalwegs
(Conconi et al., Nature, 383, 826–829, 1996). Die Freisetzung
der Linolensäure aus
der Membran in die Zelle und ihre nachfolgende Umwandlung in JA
ist analog zu Signalwegen in Säugerzellen,
wo das Freisetzen von Arachidonsäure
aus der Membran zur Synthese von Eicosanoiden, wie z.B. Prostaglandinen,
führt (Needleman
et al., Ann. Rev. Biochem., 55, 69–102, 1986). Prostaglandine
der A- und J-Reihe, die eine Cyclopentanon-Ringstruktur enthalten, sind wirkstarke
Hemmstoffe der Zellproliferation in vitro und sind fähig, die Tumorgenizität in vivo
zu unterdrücken
(D'Onofrio et al.,
Int. J. Cancer, 51, 481–488,
1992; Gorospe et al., Mol. Cell. Biol., 16, 762–770, 1996). Die Fähigkeit
der Prostaglandine, das Wachstum in einem Spektrum von verschiedenartigen
Tumor-Zelllinien aufzuhalten, hat die Möglichkeit aufkommen lassen,
dass sie zur Behandlung von menschlichem Krebs nützlich sein könnten (Sasaki
und Fukushima, Anti-Cancer Drugs, 5, 131–138, 1994). Zwischen Jasmonaten und
Prostaglandinen besteht strukturelle Ähnlichkeit, da beide Cyclopentanone
sind, was nahe legt, dass JA und MJ gegen Krebszellen wirksam sein
können.
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JP-10
29 935 bezieht sich auf ein antiandrogenes Mittel, das mindestens
eine Verbindung, ausgewählt
aus cis-Jasmon, Methyldihydroisojasmonat, Methyldihydrojasmonat
und Dihydrojasmon, welches in Haartonika und Kosmetika verwendet
wird, umfasst, zur Behandlung und Verbesserung von vergrößerter Prostata,
Prostatatumoren, Akne vulgaris und Seborrhöe, sowie männlicher androgenetischer Alopezie.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart die Verwendung von Vertretern der
Phyto-Stresshormon-Familie, „Jasmonate" genannt, zum Unterdrücken und
Abtöten
von Säuger-Krebszellen,
die Haupttypen der menschlichen Malignitäten repräsentieren. Nach bestem Wissen
des Anmelders wurden Jasmonate nie als Antikrebsmittel untersucht.
Da chemotherapeutische Arzneistoffe zur Verwendung in Säugersystemen
gewöhnlich
durch Induktion der Apoptose in Krebszellen funktionieren (Bailly
et al., Leukemia, 11, 1523–1532,
1997) und Jasmonate an einer apoptotischen Antwort auf Pflanzenstress
beteiligt sein sollen, testeten die Anmelder die Fähigkeit der
Jasmonate, die Replikation von Säuger-Krebszelllinien
von klinischer Bedeutung zu unterdrücken. Die Cytotoxizität der Jasmonate
wurde mit der des Phyto-Stresshormons
Natriumsalicylat, von dem bekannt ist, dass es für Säuger-Krebszellen cytotoxisch ist,
verglichen.
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Chemotherapeutische
Arzneistoffe sind oft so hochtoxisch, dass sie den Patienten mit
zahlreichen Nebenwirkungen, die die Lebensqualität des Patienten ernsthaft vermindern
und seine Funktion beeinträchtigen,
zurücklassen.
Chemotherapieregime können
mehrere Monate dauern und können
im Fall von Rezidiven wiederholt durchgeführt werden, was sogar einen
ambulanten Patienten mit wiederholten Zeiträumen der teilweisen Funktionsbeeinträchtigung
zurücklässt. Deshalb
besteht der Bedarf für
chemotherapeutische Arzneistoffe mit unverminderter Wirkstärke, jedoch
mit einem höheren
Grad der Spezifität
für maligne
Zellen, und weniger Nebenwirkungen. Die vorliegende Erfindung offenbart
die Verwendung von Jasmonatverbindungen, um Malignitäten zu behandeln.
Jasmonate werden gewöhnlich in
winzigen Mengen in vielen essbaren Pflanzen, wie z.B. Tomate, Kartoffel
und Kürbiskernen,
gefunden (Sembdner und Parthier, Annu. Rev. Physiol. Plant Mol.
Biol., 44, 569–589,
1993) und sind folglich nicht-toxisch. Von den Anmeldern wird gezeigt,
dass Jasmonate hochspezifisch sind; dass sie bei klinisch bedeutenden
Krebszelltypen Apoptose auslösen, jedoch
nicht die Proliferation von normalen menschlichen Zellen, wie z.B.
gesunde Lymphozyten, bewirken. Von den Anmeldern wird zusätzlich gezeigt, dass
Jasmonate bei der Behandlung von Lymphom in einem Maus-Krebsmodell
wirksam sind.
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Jasmonatverbindungen
als einen wirkstarken chemotherapeutischen Arzneistoff, mit einem
hohen Grad der Spezifität
für maligne
Zellen, vorzuschlagen. Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung
werden aus der detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen,
die nachstehend folgt, offensichtlicher werden.
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In
der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „Jasmonate" die natürlichen Phytohormone Jasmonsäure und
Methyljasmonat einschließen,
sowie jegliches natürliche
oder synthetische Derivat und jegliche Isomere der Jasmonsäure und
von Jasmon. Diese Derivate weisen:
- 1) eine
Niederacylseitenkette am C3 (freie Säure oder
Ester oder Konjugat)
- 2) eine Keto- oder Hydroxy-(freie Hydroxy- oder Ester-)Einheit
am C6-Kohlenstoff
- 3) eine n-Pentenyl- oder n-Pentylseitenkette am C7 auf.
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Eine
Vielfalt von Jasmonaten kann verwendet werden und schließt ein,
ist aber nicht beschränkt auf,
diejenigen mit der Formel:
wobei n 0, 1 oder 2 ist,
R
1 OH, Alkoxy, O-Glucosyl oder Imino ist,
R
2 OH, O, Alkoxy oder O-Glucosyl ist,
R
3, R
4 und R
5 H, OH, Alkoxy oder O-Glucosyl sind,
und/oder
wobei R
1 und R
2 oder
R
1 und R
4 zusammen ein
Lacton bilden, und ferner wobei die Bindungen zwischen C
3:C
7, C
4:C
5 und C
9:C
10 Doppel- oder Einfachbindungen sein können.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Jasmonatverbindung
der Formel I:
Formel
I
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oder
eines pharmazeutisch verträglichen Salzes
davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von menschlichem
Brustkrebs, Hautkrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs,
Lymphom, Leukämie,
Kopf- und Halskrebs, Nierenkrebs, Eierstockkrebs, Knochenkrebs, Leberkrebs
oder Schilddrüsenkrebs
bei Säugern,
wobei:
n
0, 1 oder 2 ist;
R1 OH, Alkoxy, O-Glucosyl
oder Imino ist,
R2 OH, O, Alkoxy oder
O-Glucosyl ist,
R3, R4 und
R5 H, OH, Alkoxy oder O-Glucosyl sind,
und/oder
wobei R1 und R2 oder
R1 und R4 zusammen ein
Lacton bilden, und ferner wobei die Bindungen zwischen C3:C7, C4:C5 und C9:C10 Doppel- oder Einfachbindungen sein können;
oder
eines Derivats der Formel, wobei das Derivat mindestens eines der
Folgenden aufweist:
eine Niederacylseitenkette am C3 (freie Säure oder Ester oder Konjugat),
eine Keto- oder Hydroxy-(freie Hydroxy- oder Ester-)Einheit am C6-Kohlenstoff oder eine n-Pentenyl- oder
n-Pentylseitenkette
am C7.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung wird das Jasmonat ausgewählt aus Methyljasmonat, Jasmonsäure, Jasmon, 7-iso-Jasmonsäure, 9,10-Dihydrojasmonsäure, 2,3-Didehydrojasmonsäure, 3,4-Didehydrojasmonsäure, 3,7-Didehydrojasmonsäure, 4,5-Didehydrojasmonsäure, 4,5-Didehydro-7-iso-jasmonsäure, Cucurbinsäure, 6-Epicucurbinsäure, 6-Epicucurbinsäurelacton,
12-Hydroxyjasmonsäure,
12-Hydroxyjasmonsäurelacton,
11-Hydroxyjasmonsäure,
8-Hydroxyjasmonsäure,
Homojasmonsäure,
Dihomojasmonsäure,
11-Hydroxydihomojasmonsäure,
8-Hydroxydihomojasmonsäure, Tuberonsäure, Tuberonsäure-O-β-glucopyranosid,
Cucurbinsäure-O-β-glucopyranosid,
5,6-Didehydrojasmonsäure,
6,7-Didehydrojasmonsäure, 7,8-Didehydrojasmonsäure, cis-Jasmon,
Methyldihydroisojasmonat, Dihydrojasmon, Aminosäurekonjugaten der Jasmonsäure und
den Niederalkylestern, den Träger-Ligand-Konjugaten und den
Sterioisomeren davon.
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Überdies
wird, gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, der Wirkstoff in einem verträglichen
Fettträger
gelöst.
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Noch
weiter umfasst, gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, die Zusammensetzung zusätzlich mindestens
ein anderes Chemotherapeutikum.
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Zusätzlich wird
gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung die Zusammensetzung zur oralen Verabreichung
hergestellt. In derartigen Ausführungsformen
liegt die Zusammensetzung in Form, ausgewählt aus einer Emulsion, einer
Lösung,
einer Kapsel, einer Tablette, vor.
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In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die Zusammensetzung zur Verabreichung
durch Injektion hergestellt. Die Zusammensetzung wird hergestellt,
sodass sie zur intramuskulären,
intraperitonealen oder intravenösen Injektion
geeignet ist.
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Noch
weiter wird, in bestimmten Ausführungsformen,
die Zusammensetzung zur topischen Verabreichung hergestellt. Gemäß diesen
Ausführungsformen
wird die Zusammensetzung in Form, ausgewählt aus einer Salbe, einem
Gel oder einer Creme, vorgelegt.
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Überdies
wird, in manchen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung, die Zusammensetzung zur Verabreichung
durch Inhalation hergestellt. In anderen Ausführungsformen wird die Zusammensetzung
zur Verabreichung über
ein Zäpfchen
hergestellt.
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Die
vorliegende Erfindung wird hier nur als Beispiel beschrieben, mit
Bezug auf die beigefügten Zeichnungen,
wobei:
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1 ein
Diagramm ist, das die Cytotoxizität der Phytohormone Methyljasmonat
und Jasmonsäure,
gegenüber
Salicylsäure,
als ein Maß ihrer
Konzentration veranschaulicht.
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Tabelle
1 ein Vergleich des durch Jasmonsäure, Methyljasmonat und Salicylsäure bewirkten Niveaus
der Toxizität
auf vier maligne Zelllinien ist.
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2 ein
Diagramm ist, das die Cytotoxizität des Phytohormons cis-Jasmon
als ein Maß seiner Konzentration
veranschaulicht.
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3 ein
Diagramm ist, das die Aktivitätsniveaus
des apoptotischen Markerproteins Caspase-3 in mit Jasmonsäure und
Methyljasmonat behandelten Molt-4-Zellen veranschaulicht.
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4 Fluoreszenzmikroskopie-Bilder
veranschaulicht, die apoptotische Veränderungen der Morphologie der
Molt-4-Zellen, nach Behandlung mit Jasmonsäure und Methyljasmonat, abbilden.
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5 ein
Diagramm ist, das die Spezifität der
cytotoxischen Wirkung, die Jasmonate auf maligne Zellen ausüben, versus
keine Wirkung auf normale Lymphozyten von gesunden Spendern, veranschaulicht.
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6 ein
Diagramm ist, das den kumulativen Prozentsatz des Überlebens
von Mäusen,
die mit Jasmonaten behandelt wurden, um die Bildung von Lymphomen
zu verhindern, versus unbehandelte Mäuse, veranschaulicht.
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Es
ist selbstverständlich,
dass die detaillierte Beschreibung, die folgt, nur bestimmte bevorzugte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung veranschaulichen soll. Sie soll auf keinen
Fall den Umfang der Erfindung, wie in den Ansprüchen dargestellt, einschränken.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von Jasmonaten,
um Proliferation zu verhindern und den Tod von malignen Zellen auszulösen.
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Besonders
bevorzugte Jasmonate schließen Jasmonsäure [(–)-JA und/oder
(+)-7-iso-JA], Methyljasmonat, Jasmon und 9,10-Dihydrojasmonsäure und
ihre Niederalkylester ein. Andere bevorzugte Jasmonate schließen 4,5-Didehydro-7-iso-JA, 3,7-Didehydro-JA,
Cucurbinsäure
(CA), 6-Epi-CA, 6-Epi-CA-lacton, 12-Hydroxy-JA, 12-Hydroxy-JA-lacton, 11-Hydroxy-JA,
8-Hydroxy-JA, Homo-JA, Dihomo-JA, 11-Hydroxy-dihomo-JA, 8-Hydroxy-dihomo-JA, Tuberonsäure (TA),
TA-O-β-glucopyranosid, CA-O-β-glucopyranosid,
Aminosäurekonjugate
von JA, sowie die korrespondierenden Niederalkylester von jeder
dieser Säuren,
ein.
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Die
Anmelder haben nachstehend bewiesen, dass zwei Jasmonate, Methyljasmonat
und Jasmonsäure,
eine positive therapeutische Wirkung auf maligne Zellen aufweisen,
jedoch normale Zellen, wie z.B. normale zirkulierende Lymphozyten,
nicht schädigen.
Die folgenden Beispiele weisen nach, dass Jasmonate in Kultur für vier unterschiedliche
Typen von malignen Zellen cytotoxisch sind, in Dosen, die als sicher
und in Säugern
erreichbar betrachtet würden,
und dass sie das Wachstum von gesunden Lymphozyten nicht hemmen.
Die Anmelder haben zusätzlich
bewiesen, in Beispiel 7, dass Jasmonate beim Verlängern der
Lebenszeit von Mäusen,
denen Lymphomzellen injiziert worden waren, wirksam sind, was zu
einer Überlebensrate
führt,
die signifikant höher
ist als die von unbehandelten Mäusen
(die 2,25fache Anzahl an Überlebenden
gegenüber
der unbehandelten Gruppe).
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Beispiel 1 – Phyto-Stresshormone
sind cytotogisch für
vier menschliche transformierte Zelllinien
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Vier
transformierte Zelllinien aus unterschiedlichen histologischen Entwicklungslinien
wurden einem von drei Phyto-Stresshormonen ausgesetzt. Die gewählten Zelllinien
repräsentieren
vier Typen von Krebs mit weit verbreiteter klinischer Bedeutung.
Molt-4 ist eine menschliche T-Lymphoblastenleukämie-Zelllinie, SK-28 sind menschliche
Melanomzellen. LNCaP ist eine, auf Androgene ansprechende, menschliche
Prostata-Adenokarzinom-Zelllinie und MCF7 ist eine menschliche Brustkarzinom-Zelllinie.
Alle Zelllinien wurden von ATCC (Rockville, MD) erworben. Alle Reagenzien
wurden von Sigma Chemicals (St. Louis, MO) erworben, sofern nicht
anders angegeben. JA und MJ wurden in Ethanol gelöst. Alle
Zellkulturen wurden in RPMI-1640 mit 10% fötalem Kälberserum (Biological Industries,
Beit-Haemek, Israel) durchgeführt
und man ließ die
Zellen (außer
Molt-4 und Lymphozyten aus dem peripheren Blut) vor jeder nachstehend
erwähnten
Behandlung anhaften.
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LNCaP-,
MCF7- und SK-28-Zellen (mit 4 × 103/Vertiefung) und Molt-4-Zellen (mit 1,5 × 104/Vertiefung) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen
ausgebracht und über
Nacht inkubiert. Das Phyto-Stresshormon wurde in steigenden Konzentrationen
zugegeben, wie nachstehend angegeben, und die Toxizität wurde
nach 24 Stunden gemessen, unter Verwendung des wässrigen, nicht-radioaktiven
Zellproliferationstests CellTiter 96 (Promega, Madison, WI); ein Test,
in welchem lebensfähige
Zellen ein gefärbtes Produkt
produzieren (für
Einzelheiten des Protokolls für
diesen Test, siehe nachstehend). Dieser Test ist quantitativ, da
die Menge der produzierten Farbe unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts gelesen wird.
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Die
höchste,
bei Menschen verwendete, nicht-toxische, pharmakologische Konzentration
des nicht-steroidalen anti-inflammatorischen Arzneistoffs SA beträgt annähernd 3
mM (Katzung, Lange Medical Book, Stamford, 1998). Um die zusätzlichen
Phyto-Stresshormone JA (Jasmonsäure)
und MJ (Methyljasmonat) mit SA zu vergleichen, wurde der gleiche
Bereich der Konzentrationen (0,5–3 mM) gewählt. Diese Verbindungen in
den oben erwähnten Konzentrationen
sind für
Mäuse nicht
toxisch. Jede Zelllinie wurde mit jedem dieser Hormone in einer Konzentration
im Bereich von 0,5–3
mM für
24 Stunden inkubiert, wonach die Cytotoxizität gemessen wurde. Die statistische
Signifikanz der Ergebnisse wurde (wo angemessen) mit dem zweiseitigen
Studentschen t-Test, n = 3, bestimmt. Die Ergebnisse werden als
Mittelwerte ± Standardabweichung
vorgelegt.
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Bei
Bezug auf 1 wird die Cytotoxizität jedes
einzelnen der drei Phytohormone als ein Maß seiner Konzentration aufgetragen.
- Rauten = Molt-4-Lymphoblastenleukämiezellen,
- Quadrate = SK28-Melanomzellen,
- Dreiecke = LNCaP-Prostata-Adenokarzinomzellen, die auf Androgene
ansprechen,
- Kreise = MCF7-Brustkarzinomzellen.
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Was 1A betrifft, reagierten alle Zelllinien in
dosisabhängiger
Art und Weise auf SA. Die Cytotoxizität der SA war bei Molt-4-Lymphoblastenleukämiezellen,
SK28-Melanomzellen und MCF7-Brustkarzinomzellen bei allen Konzentrationen
signifikant, P < 0,05,
und bei LNCaP-menschliche-Prostata-Adenokarzinomzellen ab 1 mM und
höher.
Von SA wurde hier gezeigt, dass sie die Zellproliferation von unterschiedlichen
Krebszellen von 20 bis 40% hemmt, je nach Zelllinie. Diese Feststellung
stimmt mit ähnlichen
berichteten Beobachtungen, wobei SA das Wachstum von Brustkrebszelllinien-,
Rattenhepatom- und menschliche Fibroblastenkulturen hemmte, überein (Sotiriou
et al., Anticancer Res., 19, 2997–3006, 1999; Hial et al., J.
Pharmacol. Exp. Ther., 202, 446–454,
1977). Eine mögliche
Interpretation dieser Daten ist, dass SA in Krebszellen Stress verursacht,
was zur Unterdrückung
der Proliferation bei jenen Zellen führt.
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JA
und MJ wurden im Vergleich zu SA untersucht, um zu bestimmen, ob
die Wirkungen von SA auf Krebszellen den Phyto-Stresshormonen gemeinsam
sind, und ob Jasmonate beim Zielen auf und Hemmen des Wachstums
von malignen Zellen für wirksamer
erachtet würden
als Salicylsäure.
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Was 1B betrifft, war die Ansprechbarkeit auf
JA dosisabhängig.
Die Cytotoxizität
von JA war bei Molt-4-Zellen ab 1 mM und höher, bei LNCaP- und SK28-Zellen
ab 2 mM und höher
und bei MCF7-Zellen bei 3 mM signifikant, P < 0,05. Die Reihenfolge der Sensibilität gegen
JA war Molt-4 > SK-28 > LNCaP > MCF7.
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Was 1C betrifft,
war die Cytotoxizität
von MJ bei Molt-4-Zellen bei allen Konzentrationen und bei MCF7-Zellen
bei 3 mM signifikant, P < 0,01;
und mit P < 0,05
bei LNCaP- und SK28-Zellen ab 2 mM und höher.
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Die
hier vorgelegten Ergebnisse zeigen, dass MJ das höchste Niveau
der Cytotoxizität
verursachte. Zum Beispiel lösten
0,5 mM MJ bei Molt-4-Zellen 87,52% Cytotoxizität aus. Die anderen Zelllinien
reagierten auf MJ auf dosisabhängige
Weise. Die Reihenfolge der Sensibilität war Molt-4 > LNCaP > SK28 > MCF7.
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Angemessene
Kontrollen bewiesen, dass Ethanol (worin JA und MJ gelöst wurden)
selbst keine Cytotoxizität
auslöste.
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Beispiel
1 weist nach, dass, obwohl Krebszellen von verschiedener Herkunft
auf Phyto-Stresshormone
reagierten, ihre Antwort unterschiedlich war. Unter den untersuchten
Zelllinien reagierte Molt-4 stark auf JA (90% Cytotoxizität bei 3
mM) und MJ (90% Cytotoxizität
bei 0,5 mM).
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In den Beispielen
verwendeter Cytotoxizitätstest
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Die
Hemmung der Zellproliferation wurde mit dem wässrigen, nicht-radioaktiven
Zellproliferationstests CellTiter 96 (Promega, Madison,WI) bestimmt: Auf
Vollendung eines gegebenen Versuchs hin, wurden MTS (eine Tetrazoliumverbindung)
mit 333 μg/ml +
Phenazinmethosulfat (mit 25 μM)
zu jeder Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen für 1 Stunde
bei 37°C
zugegeben. Dies ließ die
Entwicklung einer Farbreaktion, bei der Dehydrogenasen in metabolisch aktiven
Zellen das MTS reduzieren zu. Da die Zellen vor der Zugabe von MTS
nicht gewaschen wurden, gab es keine möglicherweise lose anhaftenden
oder nicht-anhaftenden Zellen, die problematisch hätten sein
können.
Das lösliche
MTS-Formazanprodukt wurde
bei einer Wellenlänge
von 490 nm mit einem CERES 900 HDI ELISA-Lesegerät (Bio-Tek Instruments, Inc,
Highland Park, VT) gemessen. Die optische Dichte ist direkt proportional
zu der Anzahl an lebenden Zellen in der Kultur. Die Cytotoxizität (%) wurde
auf folgende Weise berechnet: [(OD der Kontrollzellen – OD der
Arzneistoff-behandelten Zellen)/OD der Kontrollzellen] × 100.
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Beispiel 2 – Cis-Jasmon,
eine zusätzliche
Jasmonatverbindung, ist für
drei menschliche transformierte Zelllinien cytotoxisch
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Drei
transformierte Zelllinien, aus jenen in Beispiel 1 beschriebenen,
wurden cis-Jasmon, das eine zusätzliche
Jasmonatverbindung ist (neben JA und MJ), ausgesetzt, um seine Cytotoxizität auf Krebszelllinien
zu untersuchen. Der Versuch wurde durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
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Was 2 betrifft,
ist cis-Jasmon ein wirkstarkes cytotoxisches Mittel, das die Zellen
dosisabhängig
beeinflusst. Die Wirkung von cis-Jasmon auf jede Zelllinie war bei
jeder verwendeten Konzentration signifikant (wobei die statistische
Signifikanz P < 0,01
betrug, wie mit dem t-Test bestimmt). Das einzige Ergebnis, das
nicht für
signifikant erachtet wurde, war das, das gemessen wurde, wenn die
niedrigste verwendete Dosierung von cis-Jasmon, 0,5 mM, auf LNCaP-Zellen
angewandt wurde. Die Cytotoxizität überstieg
50% der Zellen in allen untersuchten Zelllinien, wenn cis-Jasmon
mit Konzentrationen von 2 mM und darüber angewandt wurde. Bei der
höchsten verwendeten
Konzentration war cis-Jasmon für 75–85% der
transformierten Zellen auf jeder Platte cytotoxisch.
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Beispiel 3 – Charakterisierung
der durch Jasmonate ausgelösten
Schädigung
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Da
anfänglich
die gleiche Anzahl an Zellen in jede Vertiefung in Aliquoten aufgeteilt
wurde, spiegelt verringerte Extinktion, wie in Vertiefungen gemessen, die
behandelte Zellen enthalten (vorstehend), Zelltod und/oder Abnahme
in der Proliferationsrate wider. Um zwischen diesen zwei Möglichkeiten
zu unterscheiden, setzten wir einen zusätzlichen Cytotoxizitätstest ein,
der den Zelltod durch fehlenden Trypanblau-Ausschluss ermittelt.
Zellen wurden mit 0,1% Trypanblau für 2–5 Minuten inkubiert und der
Prozentsatz an toten Zellen (jene, die den Farbstoff nicht ausschlossen)
wurde mikroskopisch bestimmt.
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Was
Tabelle 1 betrifft, löste,
unter den getesteten Phytohormonen, MJ den Tod am wirksamsten in
jeder Zelllinie aus. MJ ist stärker
wirksam beim Abtöten
menschlicher transformierter Zelllinien, als seine nicht-methylierte
Form JA (1B, 1C und
Tabelle 1). SA unterdrückte
die Proliferation in allen Zelllinien, während JA bei Lymphoblastenleukämiezellen Tod
und bei den anderen Zellen Unterdrückung der Proliferation auslöste. Was
die relative Empfindlichkeit betrifft, werden Molt-4-Zellen von
SK28-, LNCaP- und MCF7-Zellen, in dieser Reihenfolge, gefolgt. Unterschiedliche
Empfindlichkeit der unterschiedlichen Zelllinien für die Phyto-Stresshormone
legt eine Spezifität
des Einflusses jener Verbindungen auf die Zellen nahe.
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Es
ist wichtig, den Unterschied zwischen SA und Jasmonaten in ihrem
Einfluss auf Krebszelllinien zu beachten. SA verursacht Hemmung
der Zellproliferation bei den getesteten Zelllinien, JA verursacht Zelltod
bei Molt-4-Zellen und Hemmung der Zellproliferation bei SK28-, LNCaP-
und MCF7-Zellen, wohingegen MJ bei allen Zelllinien Tod verursacht.
Diese Unterschiede könnten
mit den unterschiedlichen Strukturen der Phyto-Stresshormone erklärt werden und/oder
mit dem Unterschied zwischen den biochemischen Ereignissen, die
jene Verbindungen in den Zellen auslösen.
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Beispiel 4 – Jasmonate
lösen in
Molt-4-Zellen Apoptose aus
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Erhöhte Caspase-3-Spiegel
sind ein spezifischer Marker für
den Apoptoseprozess (Porter und Janicke, Cell Death Differ., 6,
99–104,
1999). Um endgültig
zu bestimmen, dass die Ursache für
den Zelltod Apoptose war, wurde das Niveau der Caspase-3-Aktivität in den
Zellen nach Behandlung mit JA und MJ gemessen.
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Molt-4-Zellen
wurden mit JA und MJ für
2, 4 und 14 Stunden inkubiert und die Aktivitätsniveaus der Apoptose-vermittelnden
Protease, Caspase-3, wurden unter Verwendung des Caspase-3(CPP32)-Protease-Testkits
(PharMingen, San Diego, CA) bestimmt, wie vom Hersteller vorgeschlagen.
Kurz, 2 × 106 Zellen wurden aufgelöst und in 100 μL Reaktionspuffer,
der ein fluorogenes Caspase-3(CPP32)-Substrat, Ac-DEVD-AMC enthielt,
resuspendiert. Die Reaktionen wurden bei 37°C für 2 Stunden inkubiert und Proben
wurden bei einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von
460 nm in dem FL600 Mikroplatten-Fluoreszenz-Lesegerät (Bio-Tek
Instruments, Winooski, Vermont, USA) getestet.
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Was 3 betrifft,
wurde dosisabhängige Erhöhung der
Caspase-3-Aktivität
beobachtet:
- (Rauten = 2 Stunden,
Quadrate = 4 Stunden,
Dreiecke
= 14 Stunden.)
- Wie in 3 gesehen werden kann, steigerten
JA und MJ bei allen Konzentrationen und Zeitpunkten die Caspase-3-Aktivität signifikant,
P < 0,05.
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Was 3A betrifft, löste Inkubation mit JA für 2 Stunden
keine Erhöhung
des Spiegels der Caspase-3 aus.
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Was 3B betrifft, war, nach 14 Stunden des
Aussetzens unter MJ, das Ausmaß des
Tods bei 1 mM und darüber
derart, dass die Caspase-3-Aktivität nicht bestimmt werden konnte.
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Diese
Ergebnisse legten nahe, dass JA und MJ apoptotischen Tod bei Molt-4-Zellen
auslösten. Um
diese Tatsache zu bestätigen,
wurden Molt-4-Zellen mit JA (2 mM) und MJ (0,5 mM) für 14 Stunden
behandelt und mit Fluoreszenzmikroskopie analysiert, um entscheidende
morphologische Kennzeichen der Apoptose, wie z.B. Kondensation und Fragmentierung
von Chromatin, zu ermitteln.
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Was 4 betrifft,
werden Fluoreszenzmikroskopiebilder gezeigt, die Veränderungen
der zellulären
Morphologie in den Zellkernen der Molt-4-Zellen, nach Behandlung
mit den Phyto-Stresshormonen
JA oder MJ, abbilden. 5 × 105 Zellen/Probe wurden geerntet, dann durch
Zugabe einer Lösung
von phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), die [3% Paraformaldehyd
und 0,1% Triton X-100] enthielt, für eine Stunde fixiert. Die
Zellen wurden für
10 Minuten mit DAPI (1 μg/ml)
gefärbt.
Die Zellkerne wurden mit Fluoreszenzmikroskopie (mit einem Fluoreszenzmikroskop,
Modell Ax70 TRF, hergestellt von Olympus Optical, Japan) bei einer
Vergrößerung von
1:400 analysiert. Charakteristische apoptotische Zellkerne sind
mit Pfeilen markiert.
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Was 4A betrifft, werden unbehandelte Molt-4-Zellen
gezeigt.
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Was 4B betrifft, wurden Molt-4-Zellen mit
JA bei 2 mM für
14 Stunden behandelt. Behandlung mit JA löste Kondensation und Fragmentierung von
Chromatin aus.
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Was 4C betrifft, wurden Molt-4-Zellen mit
MJ bei 0,5 mM für
14 Stunden behandelt. Behandlung mit MJ zerstörte die Zellkernmorphologie
in fast allen Zellen vollständig.
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Diese
Ergebnisse bestätigen,
dass JA und MJ apoptotischen Tod bei Molt-4-Zellen verursachten,
basierend auf dem Anstieg der Caspase-3-Aktivität, die eines der Kennzeichen
der Apoptose ist, und auf charakteristischen morphologischen Veränderungen.
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Von
SA wurde berichtet, dass es bei myeloische-Leukämie-Zelllinien und bei chronisch
lymphozytischen Leukämie-B-Zellen
Apoptose und Aktivierung von Caspasen auslöst. Es gibt auch Hinweise, dass
SA Apoptose steigert und bei FS-4-Zellen über p38 Apoptose verursacht
(Schwenger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 4, 2869–2873, 1997).
In jenen Untersuchungen machen, auf Inkubation mit Salicylatkonzentrationen,
die höher
sind als diejenigen, die im Plasma von Patienten erzielt werden,
die auf entzündliche
Erkrankungen behandelt werden, unterschiedliche Zelllinien Apoptose
durch. In der vorliegenden Erfindung wurden Salicylatkonzentrationen verwendet,
die mit denjenigen vergleichbar sind, die im Plasma erzielt wurden.
Dies kann den Unterschied zwischen Untersuchungen, wobei SA Apoptose
auslöste,
und unseren Ergebnissen erklären.
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Beispiel 5 – Jasmonate
sind für
normale Lymphozyten nicht schädlich
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Die
vorstehend gezeigten Ergebnisse beweisen, dass Phyto-Stresshormone
die Fähigkeit
besitzen, Krebszellen nachteilig zu beeinflussen. Die Wirkung dieser
Pflanzenprodukte wurde an normalen Zellen getestet, um zu bestimmen,
ob Jasmonate ebenso auf nicht-kanzeröse Zellen eine nachteilige cytotoxische
Wirkung aufweisen.
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Normale
Lymphozyten wurden folgendermaßen
von peripherem Blut getrennt: Mononukleäre Zellen (MNC) aus venösem Blut
von gesunden Spendern wurden mit Ficoll-Hypaque(Phamacia Fine Chemicals,
Uppsala, Schweden)-Dichtegradientenzentrifugation gesammelt. Die
resultierende mononukleäre Zellzubereitung
ließ man
an Plastikschalen anhaften, um verunreinigende Makrophagen zu entfernen.
Die nicht-anhaftenden peripheren Blutlymphozyten wurden zur Verwendung
ausgewählt.
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Vor
der Behandlung mit JA und MJ wurden die normalen Lymphozyten mit
TPA (5 ng/ml) und PHA (0,8 μg/ml)
für 48
Stunden stimuliert, um die Lymphozyten zu veranlassen zu proliferieren
(und so mit unsterblichen malignen Zellen vergleichbar zu sein).
Normale Lymphozyten und Molt-4-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen
ausgebracht (mit 1,5 × 104/Vertiefung).
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Jasmonate
oder Salicylsäure
wurden mit einer Konzentration von 1 mM oder 3 mM zugegeben und
die Zellen wurden für
24 Stunden inkubiert. Die optische Dichte, die lebensfähige Zellen
repräsentiert,
wurde mit dem wässrigen,
nicht-radioaktiven Zellproliferationstests CellTiter 96 bestimmt.
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Jedes
Phyto-Stresshormon löste
bei Molt-4-Zellen signifikante Cytotoxizität aus, P < 0,05, während keines der Hormone bei
normalen Lymphozyten eine signifikante Cytotoxizität auslöste.
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Was 5 betrifft,
wurden normale Blutlymphozyten (dargestellt durch ausgefüllte Balken)
praktisch nicht von Phyto-Stresshormonen beeinflusst, im Gegensatz
zu den transformierten Molt-4-Lymphoblastenleukämiezellen (dargestellt durch
leere Balken).
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5A zeigt Behandlung mit SA bei Konzentrationen
von 1 mM und 3 mM.
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5B zeigt Behandlung mit JA bei Konzentrationen
von 1 mM und 3 mM und 5C zeigt Behandlung
mit MJ bei Konzentrationen von 1 mM und 3 mM.
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Siehe
ebenso Tabelle 1, die die Selektivität der Jasmonate für maligne
Zellen versus gesunde Zellen veranschaulicht.
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In
diesem Beispiel wurde der Einfluss der Phyto-Stresshormone auf transformierte
Lymphozyten (Molt-4-Zellen) verglichen, versus ihren Einfluss auf
normale, aus peripherem Blut extrahierten Lymphozyten. Normale Lymphozyten
(die mit TPA/PHA stimuliert worden waren, um Proliferation auszulösen) wurden
von SA und Jasmonaten nicht beeinflusst, im Gegensatz zu den transformierten
Lymphozyten. Diese Daten unterstützen
die mögliche
Verwendung von Phyto-Stresshormonen als selektive Antikrebsmittel.
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Beispiel 6 – Jasmonate
sind für
normale Erythrozyten nicht schädlich
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Die
Wirkung von Jasmonsäure,
Methyljasmonat und cis-Jasmon wurde an normalen menschlichen Erythrozyten
untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein Test eingeführt, welcher
Beschädigung
an Erythrozyten über
die Freisetzung von Hämoglobin
beurteilt. Letzteres wurde spektrophotometrisch bei 412 nm gemessen.
Als positive Kontrolle wurde destilliertes Wasser verwendet, um
völlige
Hämolyse
auszulösen
und die Freisetzung von Hämoglobin
zu generieren. Keines der Jasmonate verursachte Hämoglobinfreisetzung
aus normalen menschlichen Erythrozyten von drei unterschiedlichen
Spendern. Und das, wenn Jasmonate in Konzentrationen angewandt wurden,
in denen sie cytotoxische Wirkungen bei Krebszellen (0,5–3 mM) verursachen.
Somit sind Jasmonate, neben ihrer Unschädlichkeit für normale menschliche Lymphozyten
(wie in Beispiel 5 gezeigt), nicht schädlich für Erythrozyten, wodurch sie
ihre selektive Wirkung gegen Krebszellen weiter zeigen.
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Beispiel 7 – In-Vivo-Versuche
bei Mäusen
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Syngene
Lymphomzellen wurden einer Testgruppe und einer Kontrollgruppe von
Mäusen (Stamm
C57BL) injiziert. Die Injektionen wurden entweder subkutan verabreicht
oder intraperitoneal. Methyljasmonat wurde oral, durch Injektion
direkt in den resultierenden Tumor oder in das Bauchfell verabreicht
und die Wirkung auf die Tumorprogression und auf die Überlebensrate
wurde analysiert.
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400.000
EL-4 Lymphomzellen wurden 20 Testmäusen, oder 19 Kontrollmäusen, des C57BL-Stamms intraperitoneal
injiziert.
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Vorversuche
hatten gezeigt, dass Methyljasmonat bei einer Dosierung von 236–472 mg/kg
Körpergewicht
für die
Verhinderung des Tumorwachstums geeignet war. Deshalb wurde Methyljasmonat in
einem Fettträger
(0,4% Lipofundin, hergestellt von B. Brown, Melsungen, Deutschland)
gelöst
und oral bei einer Dosierung von 236 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Die
Verabreichung erfolgte täglich, über das
Trinkwasser, beginnend mit dem Tag der Injektion der Lymphomzellen.
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19
Kontrollmäuse
erhielten nur den Fettträger
(0,4% Lipofundin), ohne darin gelöstes Methyljasmonat.
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Die Überlebenszeit
von jeder Gruppe der Mäuse
wurde gemessen (in Tagen) und analysiert.
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Was 6 betrifft,
wird ein Kaplan & Meier Survivorship-Funktionsdiagramm
gezeigt, das den kumulativen Prozentsatz des Überlebens in jeder Gruppe im
Laufe des Versuchs veranschaulicht. Die Überlebensraten waren signifikant
höher für die behandelte
Gruppe (dargestellt durch Kreuze und durch den Buchstaben „T"), versus der Kontrollgruppe
(dargestellt durch Kreise und durch den Buchstaben „C"); wie gesehen werden
kann, wurde beispielsweise das Plateau von 50% Überleben von der behandelten Gruppe
am 33sten Tag erreicht, im Gegensatz zu dem von der Kontrollgruppe
erreichten Plateau von 20% Überleben.
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Die
Signifikanz dieser Ergebnisse wurde statistisch analysiert, unter
Verwendung von zwei hoch-stringenten statistischen Mitteln der Analyse, dem
Log-Rank-Test und dem Cox-Mantel-Test.
Jeder dieser Tests gewichtet numerisch die Bedeutung eines Tods
innerhalb einer der zwei Gruppen von Mäusen, an einem gegebenen Tag,
verglichen mit der Anzahl an überlebenden
Mäusen
im Ganzen.
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Die
Signifikanz der Ergebnisse wurde für hoch erachtet, p = 0,01492
für den
Log-Rank-Test und p = 0,00953 für
den Cox-Mantel-Test (wobei ein Ergebnis als signifikant betrachtet
wird, falls p < 0,05).
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Schließlich erläutern Beispiele
1–7 die
Wirkung der strukturell verschiedenartigen Phyto-Stresshormone, Jasmonate und Salicylat,
auf Zellproliferation und Lebensfähigkeit bei mehreren verschiedenartigen
Krebszelllinien. Es gab vier Haupt-Feststellungen. Erstens, alle
untersuchten Stresshormone teilen die Fähigkeit, die Proliferation von
Krebszellen nachteilig zu beeinflussen. Jasmonsäure (JA) löste Tod bei Lymphoblastenleukämiezellen
aus und verursachte die Unterdrückung
der Zellproliferation bei den anderen vorstehend erwähnten menschlichen
Krebszellen. Methyljasmonat (MJ) löste Tod bei jeder der Zelllinien
aus. Die Phytohormone agierten dosisabhängig in der folgenden Reihenfolge der
Sensibilität:
Lymphoblastenleukämie > Prostatakrebs > Melanom > Brustkrebs. Zweitens,
der durch Jasmonate bei Molt-4-Zellen verursachte Tod wurde als
apoptotisch bestimmt, ähnlich
dem Mechanismus, den die meisten chemotherapeutischen Arzneistoffe
auf der zellulären
Ebene einsetzen. Drittens, Jasmonate verursachen keine Beschädigung an
normalen Lymphozyten oder Erythrozyten. Viertens, Jasmonate sind
nicht nur in vitro wirksam, sondern auch in einem Tiermodell für Lymphom,
wobei sie die Überlebensrate
signifikant steigern (um das 2,25fache) unter Verwendung einer Dosierung,
die bei Mäusen
für sicher
erachtet wird.