DE69723688T2

DE69723688T2 - Verbindungen mit zytoprotektiver wirkung

Info

Publication number: DE69723688T2
Application number: DE69723688T
Authority: DE
Inventors: C. Richard FRANSON; M. Raphael OTTENBRITE
Original assignee: Virginia Commonwealth University
Current assignee: Virginia Commonwealth University
Priority date: 1996-04-15
Filing date: 1997-04-15
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2017-04-16
Also published as: US6423855B2; WO1997038966A3; EP0898559A2; EP0898559B1; US5859271A; WO1997038966A2; AU2731097A; ATE245623T1; US6020510A; JP2000509372A; IL126542A0; DE69723688D1; US6600059B2; US20020002296A1; US20030078417A1; ES2206708T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen und Verfahren zum Schutz von Säugerzellen vor Schädigung aufgrund von Lyse innerer Membranen, Oxidation und/oder Invasion durch schädliche Mittel. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung und/oder prophylaktischen Inhibierung der Ursache der Schädigung. Noch spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf bioaktive Mittel und die Verwendung davon zur Behandlung oder prophylaktischen Inhibierung einer Phospholipase-vermittelten Schädigung, von Schädigung aufgrund von Oxidation und Entzündung. In einem speziellen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Mittel zur Verhinderung und/oder Behandlung einer Entzündung und Zeltschädigung in Gewebe von Säugern und zum Schutz und zur Erhaltung von biologischem Material, das von Tieren, Menschen und Pflanzen abgeleitet ist, wie Nahrungsmittel- und Gewebeproben, bereit. In einem sehr speziellen Aspekt stellt diese Erfindung Zusammensetzungen, welche Inhibitoren von Phospholipase sind, und Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzungen bereit.
Hintergrund der Erfindung
Die Basisstruktur aller lebenden Organismen ist die Zelle, welche durch ihre Membranlipoproteinhülle strukturell definiert ist. Das Membrannetzwerk, das die Zelle zusammenhält, behält das ionische Gleichgewicht bei und liefert die Rezeptoren für Hormone und Neurotransmitter, die es der Zelle ermöglichen, mit ihrer Umgebung zu interagieren. Dies ist für eine Wechselwirkung mit benachbarten Zellen relevant, wodurch isolierte Zellen, Gewebe oder ganze Organismen sowohl als unabhängige Einheiten als auch als Beteiligte an zellulären Wechselwirkungen in vitro und in vivo überleben können.
Externe Faktoren, die die Zellfunktion, Zellerneuerung, Zellreproduktion und den Zelltod bestimmen, agieren über ihre Wirkungen auf die Phospholipiddoppelschicht und Proteine der Zellmembran. Dadurch werden die Rezeptorvermittelten Signale und Ionenflüsse kontrolliert, welche die Reaktionsfähigkeit und das Überleben der Zelle bestimmen. Eine Schädigung der Zellmembran, besonders bezogen auf die Lipidperoxidation, Membranoxidation und die Wirkung von Phospholipasen, beeinflusst die Widerstandsfähigkeit gegenüber Schädigung, Erneuerung und Wirtsreaktionen auf Umgebungsveränderungen und ionische und osmotische Integrität.
Pathologische Ereignisse in einem Wirt unter klinischen Umständen können zu einer zellulären Schädigung führen, was zum Verlust der Membranintegrität führt. Die Ereignisse werden durch Faktoren vermittelt, die die Zellmembran abbauen und zerstören und eine Schädigung weitertragen, indem eine Kaskade von Zellmembranveränderungen erzeugt wird. Indem mit der Kaskade externer und interner Ereignisse interagiert wird, welche die Membranintegrität und toxische Veränderungen, welche zum Zelltod führen, betreffen, kann eine Schädigung verhindert, verändert oder rückgängig gemacht werden. In der Vergangenheit war dies eine Hauptrolle von entzündungshemmenden Mitteln.
Die wichtigsten gegenwärtig verwendeten klinisch wirksamen entzündungshemmenden Wirkstoffe schließen die Corticosteroide und die nicht steroiden entzündungshemmenden Wirkstoffe ein (NSAIDs = non-steroidal antiinflammatory drugs). U. a. inhibieren Corticosteroide die Aktivität von Zellphospholipasen. NSAIDs inhibieren den Metabolismus durch Cyclooxygenase von Arachidonsäure, die von Phospholipasen freigesetzt wird. Diese Wirkstoffe wirken so, dass die Entzündung kontrolliert wird und eine Zeltschädigung durch die Regulierung des Abbaus von Phospholipiden minimiert wird. Diese Wirkstoffe beeinflussen auch die Wirkung der Produkte des Phospholipidabbaus, was zur Bildung von Prostaglandinen und Leukotrienen führt, welche bei einer Entzündung in erhöhten Mengen produziert werden und die Zeltdysfunktion und -schädigung fördern.
Außerdem können zelluläre und extrazelluläre Phospholipasen durch die Erzeugung von Sauerstoffradikalen aktiviert werden. Dadurch kann sich ein zerstörender Zyklus bilden, da die Phospholipase-Aktivierung freie Radikale freisetzen kann, welche wiederum mehr Phospholipasen aktivieren. In dieser Hinsicht werden von den Fettsäuren, welche durch die Wirkung von Phospholipasen freigesetzt werden und dann durch Cyclooxygenase- und Lipoxygenaseenzyme zu Prostaglandinen und Leukotrienen umgewandelt werden, Radikale gebildet, wobei die Erzeugung von Sauerstoffradikalen ein Nebenprodukt ist. Es ist bekannt, dass Fettsäuren und Radikale wesentliche Vermittler in der Kaskade von Reaktionen sind, welche zu einer Membranschädigung, zu Zelltod und Entzündung führen. Phospholipase A₂ (PLA₂), ein Schlüsselenzym im Metabolismus von Phospholipid, kann die Freisetzung von Fettsäure fördern. PLA₂ kann durch eine Vielzahl von Faktoren aktiviert werden, wobei hormonelle, neurale, metabolische oder immunologische Wege involviert sind.
Eines der Kennzeichen von Entzündung und Zeltschädigung ist der Abbau von zellulärem Membranphospholipid. Phospholipide stellen die hauptsächlichen strukturellen Bausteine der Zellmembran dar; sie verursachen die Barrierestrukturellen und funktionellen Eigenschaften von Membranen, und ihre Integrität ist kritisch für eine normale Zeltreaktionsfähigkeit und -funktion. Phospholipidveränderungen in der Zellmembranintegrität, insbesondere Veränderungen bei den Fettsäuren an der Position 2, verändern die Fluidität von Zellmembranen, die Zellrezeptorfunktion und die Zurverfügungstellung von zellulären Inhalten an die externe Umgebung. Der Abbau von Phospholipidmembranen führt zur Lyse von Zellen, erzeugt Löcher in der Zellmembran, beeinflusst Ionenkanäle und Membranrezeptoren, was zur Zerstörung der zellulären Integrität und von funktionellen Reaktionen führt.
Während einer Entzündung werden Phospholipasen von irgendeiner Quelle, welche normalerweise von natürlichen Suppressorsystemen kontrolliert werden, aktiviert, so dass sie Membranphospholipid abbauen, was wiederum Sauerstoffradikale erzeugt. PLA₂ ist ein Schlüsselenzym, welches bei einer Entzündung aktiviert wird, wodurch Substratphospholipide metabolisiert werden und freie Fettsäuren freigesetzt werden. Diese Fettsäuren (d. h. Arachidonate), die durch PLA₂ freigesetzt werden, werden zu wirksamen biologisch aktiven Metaboliten, Lysophospholipiden, Prostaglandinen und Leukotrienen umgewandelt. Diese sind selbst Substrate für andere Enzyme, die zur Erzeugung von Thromboxanen, Plättchen-aktivierendem Faktor und anderen Substanzen führen, wobei damit einhergehend Sauerstoffradikale erzeugt werden.
Phospholipasen, insbesondere PLA₂, spielen als Membran-gerichtete Enzyme eine wichtige Rolle, da die Expression ihrer Aktivität zu einer weiteren Erzeugung von Entzündungsmediatoren führt, was eine Membranschädigung zur Folge hat, welche die Schädigung innerhalb der Zelle selbst oder in benachbartem Gewebe propagiert. Somit kann durch die Aktivierung und/oder Freisetzung von PLA₂ die Ausbreitung der Schädigung von der anfänglichen Stelle zu angrenzenden oder entfernten Stellen gefördert werden.
Zusätzlich zu dem wesentlichen Membran-assoziierten Gewebeabbau über die Aktivierung von PLA₂, sind Phospholipasen und insbesondere PLA₂ Teil des normalen Abwehrsystems des Körpers. PLA₂ wird in humanen weißen Blutzellen gefunden (WBC). WBC spielen bei der Abwehr einer Infektion eine Rolle, aber wenn diese Zellen mobilisiert werden, um eine Schädigung und Infektion abzuwehren, wird PLA₂ von adhärenten und zirkulierenden WBC freigesetzt und erzeugt eine lokale Gewebeaktivierung, welche das Ausmaß der anfänglichen Schädigung verstärken kann. Außerdem haften WBC an Blutgefäßwänden, wo sie Enzyme wie PLA₂ freisetzen. WBC bilden auch in großen Mengen Radikale wie Superoxid und fördern somit die Schädigung von vaskulärem Endothelium, Lungenalveolen oder von Gewebestellen, die in der Nähe der WBC-Infiltration oder -Konzentration liegen. Wo sich eine Entzündung befindet, sind gewöhnlich WBC im Überfluß vorhanden, und die WBC haften an dem vaskulären Endothelium, wobei anschließend PLA₂ freigesetzt und aktiviert wird, was zur Zerstörung der vaskulären Integrität während eines Schocks und einer Ischämie führt. Somit können WBC, obwohl sie ein wesentliches Abwehrsystem des Körpers gegen Infektionen darstellen, den Körper durch eine Ausbreitung der Schädigung und Entzündung auch schädigen.
Eine klassische Beschreibung von Entzündung ist die Rötung und das Anschwellen in Verbindung mit Hitze und Schmerz. Entzündung wurde als die Reaktion gereizter und geschädigter Gewebe definiert, welche noch ihre Lebensfähigkeit besitzen. Entzündung ist ein Prozess, welcher auf einer bestimmten Stufe zum Zelltod, zur Gewebenekrose und Vernarbung führen kann. Auf einer anderen Stufe kann sich eine Entzündung mit Wiederherstellung des Normalzustandes und ohne sichtbare Schädigung oder mit minimalen Veränderungen, d. h. Pigmentierung, Fibrose oder Gewebeverdickung mit Kollagenbildung, welche mit dem Heilprozess und der Vernarbung im Zusammenhang steht, wieder auflösen.
Mikroskopisch wurde eine Entzündung wie folgt beschrieben: (1) Atonie der Muskelschicht der Blutgefäßwand; (2) endotheliale Anhaftung von Entzündungszellen, gefolgt von Migration dieser Zellen von dem vaskulären Raum in das Gewebe.
Die oben beschriebenen Ereignisse werden oft durch Phospholipase-Aktivierung, gefolgt von Fettsäure-Freisetzung und der Bildung von Radikalen vermittelt. Cytokine, die von Immunzellen abgesondert werden, induzieren durch ihre Wirkungen auf eine Vielfalt von Zellen eine PLA₂-Absonderung. Interleukin-6 stimuliert Hepatozyten, um auf mehrere Arten eine PLA₂-Absonderung zu erhöhen. Interleukin-1 und Tumornekrosefaktor induzieren eine PLA₂-Absonderung über Endothelialzellen und über Chondrozyten. Somit stimulieren Immunzellprodukte direkt die Hydrolyse von Membranphospholipiden und die Produktion von Arachidonsäure-Metaboliten über eine Vielfalt von Targetzellen, wobei die Entzündungsreaktion verstärkt wird.
Alternativ kann eine erhöhte Phospholipase-Aktivität mit einem exogenen Enzym im Zusammenhang stehen, welches von infektiösen pathologischen Organismen wie Viren, Bakterien, Rickettsien, Protozoen und Pilzen freigesetzt wird. Diese Krankheitserreger besitzen häufig Phospholipasen als Faktoren, die für ihre infektiöse Aktivität wesentlich sind. Im Fall von Naegleria fowleri, welche eine pathogene Amöbe mit einer Affinität für das Gehirn ist, kann eine Zerstörung von Gehirnmembranen, die durch Phospholipasen, welche von Naegleria abgesondert werden, induziert wird, an Stellen des Gehirns auftreten, welche entfernt sind von der Stelle, wo der Organismus lokalisiert ist. In einem anderen Beispiel kann Toxoplasma nicht in die Wirtszelle eindringen, wenn das PLA₂-Enzym davon durch einen spezifischen Wirkstoff inhibiert wird. Was für die Behandlung bestimmter Infektionen, insbesondere intrazellulärer Krankheitserreger erforderlich ist, ist ein wirksamer PLA₂-Inhibitor. Solch ein wirksamer PLA₂-Inhibitor ist insbesondere in Fällen von Protozoeninfektionen erforderlich, für welche es wenig wirksame Antibiotika gibt.
PLA₂ ist auch eine der hauptsächlichen toxischen Komponenten von Schlangengift. Durch Bisse bestimmter Schlangen wird ein Gift, das PLA₂ enthält, in die Wunde injiziert, was toxische und entzündliche Reaktionen verursacht, welche tödlich sein können. Es besteht Bedarf für Inhibitoren von PLA₂, welche an Empfänger von Schlangenbissen oder Bissen von anderen Tieren verabreicht werden können.
Pathologische Wirkungen von Phospholipasen können lokal, regional oder systemisch sein. Diese pathologischen Wirkungen werden durch das freigesetzte Phospholipaseenzym, den Level von Albumin, natürliche Inhibitoren der Enzymwirkung und Faktoren der Diffusion, Zirkulierung und Gewebeempfindlichkeit bestimmt, basierend auf intrinsischen Inhibitoren oder auf der Empfänglichkeit von zuvor geschädigter oder oxidierter Membranen oder Proteine gegenüber einer Phospholipase-Wirkung.
Eine Entzündung ist mit einer Wunde, Infektion und mit Wirtsabwehrreaktionen verbunden, die mit einem direkten bakteriellen oder viralen Abtöten durch die damit in Verbindung stehende Immunantwort im Zusammenhang stehen. Im Allgemeinen können Immunantworten sowohl nützlich, schützend als auch gewebeschädigend sein, wie man es an ihrer Rolle, die Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Infektion oder die Heilung einer Infektion zu fördern, erkennen werden kann. Alternativ können Immunantworten Autoimmunphänomene erzeugen, die zu einer Allergie, d. h. Asthma, Urtikaria, zu einer Transplantat-Wirt-Krankheit, zu Glomerulonephritis, rheumatischem Fieber oder zu Lupus und rheumatoider Arthritis führen.
Hinsichtlich der gegenwärtigen Behandlung von Entzündung sind Corticosteroide wirksame entzündungshemmende Mittel, müssen aber vorsichtig angewandt werden, da sie starke Immunsuppressiva und Inhibitoren fibroblastischer Aktivität, die für eine Wundheilung und Knochenwiederherstellung notwendig sind, darstellen. Außerdem weisen Corticosteroide starke hormonelle Wirksamkeiten auf, und ihre toxischen Nebenwirkungen involvieren eine Wechselwirkung mit der Wundheilung und Knochenmatrixbildung, Natriumretention, dem Kaliumverlust, der Knochendemineralisierung, der verminderten Resistenz gegenüber Infektion und mit Diabetes. Corticosteroide weisen auch Wirkungen auf die Steroidbildung, Katarakte, den Blutdruck, die Proteinverwertung, Fettverteilung, den Haarwuchs und den Körperbau auf. Alternativ wirken die klinisch wirksamen NSAIDs, wie Aspirin, Indomethacin, Ibuprofen etc., durch Inhibierung der Umwandlung von freien Fettsäuren zu Prostaglandinen. Die Nebenwirkungen von NSAIDs schließen Magengeschwürbildung, Nierendysfunktion und das Reye-Syndrom ein. Metabolite von Prostaglandin können entweder zerstörend oder schützend gegenüber Zellen sein, abhängig von der Struktur des Prostaglandins, das erzeugt wird oder pharmakologisch verwertet wird, und der Verabreichungsroute, der Zelle oder dem Gewebe, welche betroffen sind.
Wie zuvor diskutiert, werden Leukotriene zusammen mit der Fettsäure-Freisetzung als Teil einer Phospholipidzellmembran-vermittelten Schädigung erzeugt, die durch eine Phospholipase-Aktivierung gebildet wird. Diese Leukotriene, die durch einen Membranphospholipidabbau erzeugt werden, schädigen Gewebe durch eine direkte toxische Wirkung, Auswirkungen auf Ionenkanäle und durch damit im Zusammenhang stehende Radikalbildung. Leukotriene schädigen Gewebe auch durch indirekte Auswirkungen auf vaskuläres glattes Muskelgewebe oder auf die vaskuläre endotheliale Schicht über Auswirkungen auf Plättchen, WBC oder Endothelialzellen, oder sekundär durch Auswirkungen auf das Zusammenziehen von glattem Muskelgewebe. Leukotriene sind verantwortlich für das Zusammenziehen von glattem Muskelgewebe, was zu Bronchospasmus und Asthmaanfällen, die bei einer Allergie oder infektiösem Asthma beobachtet werden, führt. Somit werden für eine klinische Anwendung bei der Behandlung von Allergien, Asthma und Gewebeschädigung und Entzündung Leukotrien-Inhibitoren anhaltend gesucht.
Da der Phospholipase-aktivierte biochemische Weg zur Bildung von Prostaglandinen und Leukotrienen, die von freien Fettsäuren abgeleitet sind, verzweigt ist, kann die Inhibierung eines Zweiges dieses Weges, wie durch NSAIDs, zu einem Ungleichgewicht dieser reaktiven Metaboliten führen. Dieses Ungleichgewicht kann schließlich eine Entzündung verschlimmern und eine Zeltschädigung fördern, wie es durch die Nebenwirkungen von Magengeschwüren, die sich durch NSAIDs bilden können, belegt wird.
Aufgrund dieser nachteiligen Wirkungen sowohl von Steroiden als auch von NSAIDs besteht ein großes klinisches Interesse an der Identifizierung von Phospholipase-inhibierenden Mitteln, die nicht die Nebenwirkungen von Steroiden oder NSAIDs besitzen, aber die wie Corticosteroide den ersten Schritt, der zur Erzeugung von schädlichen Metaboliten, Fettsäuren und Radikalen führt, modulieren.
Radikale, die von weißen Blutzellen, durch eine Gewebeschädigung oder durch Metabolismusprozesse erzeugt werden, sind hochreaktive chemische Spezies, welche im Fall einer Gewebeschädigung meistens von eingeatmetem Sauerstoff abgeleitet sind. Während er für die Energetik des Lebens notwendig ist, ist Sauerstoff auch ein Gift, welches wie das chemisch verwandte Superoxid oder wie Peroxide Gewebe zerstören kann, anstatt es zu unterstützen. Radikale, die von Sauerstoff abgeleitet sind, sind kritisch bezüglich der Schädigung, die durch Bestrahlung, Entzündung, Reperfusionsgewebeschädigung oder durch übermäßige Sauerstoffinhalierung oder -aussetzung erzeugt wird. Radikale werden von weißen Blutzellen verwendet, um infektiöse Organismen zu zerstören, können aber unter Bedingungen des Schocks, der Infektion und der Ischämie, das Gewebe, welches sie schützen sollten, schädigen oder zerstören. Radikale, die durch Bestrahlung, Aussetzen an Sauerstoff, chemische Mittel (d. h. alkylierende Mittel, Dioxin, Paraquat) oder Reaktionen von weißen Blutzellen induziert werden, können Gewebe schädigen oder an Mutationsveränderungen beteiligt sein, die mit dem Altern, der Bestrahlungs- oder Chemotherapieschädigung, der Entwicklung von Krebs und hyperimmuner proliferativer Krankheit wie rheumatoider Arthritis im Zusammenhang stehen. Außerdem können diese reaktiven chemischen Spezies über eine Oxidation von Proteinen die Empfindlichkeit von Proteinen gegenüber einem Proteaseverdau verstärken.
Der genaue pathologische Mechanismus vieler Hautentzündungen wie atopischer Dermatitis sind nicht bekannt, sie involvieren aber wahrscheinlich Entzündungszellen, welche PLA₂ absondern oder darauf reagieren können. Allergische Krankheiten involvieren Gewebemastzellen, welche durch PLA₂ geprimt oder zur Freisetzung ihrer entzündlichen Granuluminhalte wie Histamin getriggert sein können. Diese Zellen setzen auch zusätzliches PLA₂ frei. Es werden Inhibitoren von PLA₂ benötigt, welche die Haut nach einer topischen Anwendung ausreichend durchdringen und eine verlängerte anti-PLA₂-Aktivität besitzen.
Zuvor veröffentlichte Untersuchungen haben hohe Level an proentzündlicher PLA₂ bei Bandscheibenhernien bei Menschen gezeigt. Das isolierte Enzym ist in Kultur und herausgeschnittenem Ischiasnerv toxisch gegenüber Spinalganglionzellen. Während man nicht auf diese Aussage festgelegt werden möchte, wird angenommen, das PLA₂ eine Entzündung und eine Nervengewebeschädigung bei einer Rückenmarksschädigung und bei einer Ischiasnerventzündung vermitteln kann, und dass es auch eine Vielzahl an neurologischen Entzündungsbedingungen vermitteln kann. Kürzlich haben Stephenson et al. (Neurobiology of Disease 3: 51–63 (1996) eine erhöhte zytosolische PLA₂-Aktivität in Gehirnen mit Alzheimer-Krankheit beobachtet.
PLA₂ weist auch die Fähigkeit auf, ein ernstes verzögertes Neurotoxizitätssyndrom, einschließlich einer beträchtlichen kortikalen und subkortikalen Schädigung von Vorderhirnneuronen und Faserwegen, zu induzieren, wenn es intrazerebroventrikulär injiziert wird, wie es von Clapp et al. (Brain Research 693: 101–111, 1995) beschrieben wird, wovon die Gesamtheit hierin durch Bezugnahme darauf enthalten ist. Wir haben auch beobachtet, dass Präparationen von PLA₂ und Diskus-Homogenate vom Menschen, die Extrakte des Bandscheibenkerns (Nucleus Pulposus) enthalten, entzündlich sind, wenn sie in die Mauspfote injiziert werden und ein Ödem induzieren. Ein Ödem, das durch ein Diskus-Homogenat vom Menschen induziert ist, ist zwischen 1 und 3 h maximal und hält für mindestens 6 h an. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass ein Vortreten (leakage) des Bandscheibenkerns aufgrund von Bandscheibenhernie eine Entzündung bei Diskus-Erkrankung beim Menschen fördern kann. Demgemäß werden Inhibitoren von PLA₂-vermittelten entzündlichen Prozessen benötigt. Solche Inhibitoren sollten die Entzündung und den daraus folgenden Schmerz und die Unannehmlichkeiten lindern, die mit der Diskus-Erkrankung und anderen neurologischen Entzündungsbedingungen im Zusammenhang stehen.
Gewebe, die von Tieren herausgeschnitten werden, um anschließend in Empfänger transplantiert zu werden, zeigen häufig nach der Transplantation während der Reperfusion von ischämischen Gewebe Schädigungen auf. Sowohl Ischämie als auch Reperfusion erhöhen die PLA₂-Aktivität und -Freisetzung, was zu Entzündungsprozessen mit einer beträchtlichen Aktivierung des vaskulären Endotheliums führt. Diese Prozesse erniedrigen die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Transplantation, wobei das Auftreten einer Abstoßung und das Erfordernis für eine zusätzliche immunosuppressive Therapie erhöht werden. Solche Probleme erhöhen die Morbidität und Mortalität in großem Maße, erhöhen die Kosten der Behandlung und der Versicherung und führen zu einem Zeitverlust. Es werden Wirkstoffe benötigt, die die PLA₂-Aktivität inhibieren und die Erhaltung des Gewebes vor einer Transplantation verbessern, wobei eine Ischämie-Reperfusions-Schädigung verringert wird.
Infektionen, die durch Parasiten verursacht sind, stellen ein Hauptproblem der öffentlichen Gesundheit für Menschen und Tiere in der ganzen Welt dar, welches jährlich zu einem beträchtlichen Auftreten von Krankheit, Leiden und Tod führt. Parasiten wie solche, die Malaria verursachen, und andere Protozoen-Parasiten von Tieren und Menschen, sind insbesondere problematisch. Wir haben gefunden, dass der PLA₂-Inhibitor, Chinacrin (Mepacrin) die Häutung von Larvenformen eines Tierfilarids beträchtlich verringert. Es werden neue Verbindungen, die die PLA₂-Aktivität wirksam inhibieren, zur Anwendung bei Parasiten wie solchen, die Malaria verursachen, und anderen Protozoen-Parasiten, die schädlich für Tiere und Menschen sind, benötigt.
In einer vorausgehenden Studie von Clay et al. (Third International Congress: Eicosanoids & Other Bioactive Lipids in Cancer, Inflammation & Radiation Repair, Abstract #162) wurde berichtet, dass das Produkt der PLA₂-Aktivierung, 1-Acyllysophospholipid, welches die Membranfluidität beeinflusst, sich in aufbewahrtem Blut ansammelt und durch weiße Blutzellen (WBC) aufgenommen werden kann, und verwendet werden kann, um Plättchenaktivierenden Faktor (PAF) herzustellen, wobei die WBC während der Aufbewahrung "geprimt" werden und die Schädigung während einer anschließenden Transfusion gefördert wird. Es wurde vorgeschlagen, dass eine erhöhte PLA₂-Aktivität die Zellen während der Aufbewahrung pertubieren kann. Es werden Verbindungen benötigt, die Blutzellen und andere Zellen während der Aufbewahrung schützen, so dass diese Zellen, wenn sie verwendet werden, keine Probleme verursachen.
Demgemäß werden Verbindungen und Verfahren zur Verwendung von Verbindungen benötigt, welche einen Schutz gegen die schädlichen Wirkungen von einer PLA₂-Aktivierung bieten. Diese Verbindungen sollten in der Lage sein, PLA₂ zu inhibieren, wobei die PLA₂-Metabolite verringert werden, welche Substrate für die Cyclooxygenase, 5-Lipooxygenase, 12-Lipooxygenase und andere enzymatische Wege sind, welche zur Bildung von zyklischen Endoperoxiden, Prostaglandinen (wie Prostacyclin und Thromboxan), Leukotrienen und Plättchen-aktivierendem Faktor führen. Diese Verbindungen sollten Entzündungsprozesse und die Erzeugung von Radikalen in einer Vielzahl von Geweben und Zellen verringern. Sie sollten in vivo (topisch, oral, durch Injektion und über andere Mittel), ex vivo und in vivo verabreicht werden können, und sie sollten auch eine niedrige oder keine Toxizität aufweisen. Diese Verbindungen sollten verschiedene Löslichkeiten in Lipidsystemen und wäßrigen Systemen zeigen, abhängig von der Art der Verabreichung und dem gewünschten Target.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt beides, Lipid- und/oder wasserlösliche Verbindungen bereit, welche PLA₂-Inhibitoren mit Antioxidans-Eigenschaften und/oder entzündungshemmenden Eigenschaften sind. Diese Erfindung stellt bioaktive Verbindungen bereit, welche Oligomere (Dimere, Trimere und Tetramere etc.) von Fettsäureeinheiten sind, die die PLA₂-Aktivität inhibieren. Die Ausdrücke Dimer, Trimer, Tetramer und Pentamer, wie sie durchweg in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, definieren die Anzahl an Fettsäureeinheiten, die in dem bestimmten Molekül vorhanden sind. Das heißt, dass ein Dimer zwei Fettsäureeinheiten aufweist, ein Trimer drei aufweist, ein Tetramer vier aufweist, ein Pentamer fünf aufweist etc. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung besitzen mindestens eine Doppelbindung, damit ihre entzündungshemmenden und zytoprotektiven oder gewebeprotektiven Wirkungen verstärkt werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung oder zur prophylaktischen Inhibierung Phospholipase-vermittelter Schädigungen und/oder von Schädigungen aufgrund von Oxidation verwendet werden. In einem bestimmten Fall stellt die vorliegende Erfindung Mittel zum Verhindern und/oder Behandeln einer Entzündung und Zeltzerstörung in Säugergewebe und zum Schutz und zum Bewahren von biologischem Material wie Zellen, Gewebe, Organe und Fluide, die von Tieren und Menschen erhalten werden, bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch Mittel zum Schutz und zum Bewahren von Nahrungsmitteln, die von Tieren und Pflanzen erhalten werden, und von Cellulose-Produkten und Holz-Produkten, die von Pflanzen erhalten werden, bereit. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung schützen Phospholipidzellmembranen und Proteine vor den Wirkungen einer oxidativen Schädigung oder des Alterns. Diese Verbindungen der vorliegenden Erfindung inhibieren auch Radikalreaktionen und stabilisieren dabei die Proteine zur Beibehaltung der biologischen Halbwertszeit, Antikoagulanz-Wirkung und Nahrungsmittelkonservierung.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung pharmakologisch wirksame Antiphospholipase-Verbindungen bereit. Diese Verbindungen sind in einem geeigneten Träger löslich und/oder dispergierbar. Die Verbindungen können als Oligomere wie Dimere, Trimere, Tetramere etc. oder als Kombinationen davon vorliegen. Gemäß der vorliegenden Erfindung weisen die Verbindungen mindestens zwei Fettsäureeinheiten auf und enthalten mindestens eine ungesättigte Doppelbindung. Jede Fettsäureeinheit kann eine Vielzahl von Gestalten annehmen, kann die gleichen oder verschiedene funktionelle Gruppen besitzen, kann verschieden lang sein. In einer bevorzugten Form können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine Säuregruppe oder jede beliebige Salzform davon enthalten. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in ionisierter Form vorliegen.
Demgemäß ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen bereitzustellen, die die Aktivität des Enzyms PLA₂ inhibieren.
Es ist ein damit im Zusammenhang stehender Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verbindungen bereitzustellen, die die Level an Produkten der Enzym-Wege von Cyclooxygenase, 5-Lipoxygenase, 12-Lipoxygenase, Prostacyclinoxycyclase, Thromboxansynthase und Prostaglandinisomerase durch Inhibierung der Aktivität von PLA₂ verringern.
Es ist auch ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung von mit der PLA₂-Aktivität im Zusammenhang stehenden Bedingungen bereitzustellen.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, Verbindungen zur Behandlung oxidativer und durch Radikale verursachter Schädigungen von Zellen, Geweben und Organen in vitro und in vivo bereitzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung von Entzündungen bereitzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung entzündlicher Prozesse bereitzustellen.
Es ist auch ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der oralen und topischen Behandlung von Arthritis bereitzustellen.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung von Schmerz bereitzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, Verbindungen zur Verwendung bei der oralen und topischen Behandlung von einer Vielzahl von Bedingungen bereitzustellen, wie Bedingungen einschließlich der folgenden, aber nicht beschränkt darauf: Sudeck-Dystrophie; Entzündung des zentralen und peripheren Nervensystems, Krankheiten, die mit der Entzündung des Nervensystems im Zusammenhang stehen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Alzheimer-Krankheit, Entzündung der Spinatnerven, Viszeralnerven und Hirnnerven; entzündliche Radikulopathie; Rückenschmerz einschließlich des Schmerzes des unteren Rückens; Myofazial-Schmerzsyndrome; Entzündung der Bindegewebe einschließlich Meninges, entzündete und erkrankte Zwischenwirbelgelenke, Bandscheibenhernie, Diskus-Erkrankung, gerissener und verletzter Faserring, Erkrankungen der Gelenke, Bänder, Knorpel und Synovialmembranen; Mastozytose; Schock einschließlich septischer Schock, anaphylaktischer Schock, anaphylaktischer Schock, der durch Radiokontrastmittel-Verabreichung verursacht ist und Schock, der durch bakterielle Infektionen verursacht ist; bakterielle Infektionen; Urämie; Autoimmunkrankheiten; Parasiteninfektionen einschließlich aber nicht beschränkt auf Malaria; Entzündungen einschließlich allergischer Entzündung; Hautentzündung, Juckreiz und andere dermatologische Krankheiten aufgrund von allergischen Reaktionen, trockener Haut, Erythem, Sonnen-, Nuklear- und anderen Formen von Bestrahlung, Hauterythem durch scharfen Wind, Akne, Psoriasis, Ekzeme, Reaktionen auf Chemikalien und Toxine, Kontaktdermatitis und Reaktionen auf Pflanzen einschließlich aber nicht beschränkt auf Giftefeu, Gifteiche, Giftsumach; Bisse von Insekten einschließlich aber nicht beschränkt auf Moskitos, Feuerameisen, Chigger, Zecken, Bienen, Spinnen, Flöhe und Fliegen; Bisse von Reptilien, insbesondere giftigen Reptilien, Amphibien und anderen Tieren; Kontakt mit verschiedenen Tieren mit Gift auf ihrer Haut wie giftige Fröschen; Pruritus, der mit lokaler dermatologischer oder systemischer Krankheit im Zusammenhang steht; Verhinderung von Gewebeischämie einschließlich Gewebe in vivo und Gewebe, welches zur Transplantation vorgesehen ist, Verhindern von Ischämie-Reperfusions-Schädigung, Verhindern von Ischämie-Repertusions-Schädigung beim Durchführen der Reanimation von hypovolämischem Schock, renaler Ischämie, Myokardinfarkt, Angina und Herzischämie; endotheliale Entzündung, Herztoxizität, die mit der Verabreichung von Antikrebszusammensetzungen in Zusammenhang steht, Inhibierung koronarer oder zerebraler Restenose, die auf angioplastische oder andere vaskuläre Vorgehensweisen folgt, Inhibierung der Plättchenaktivität, insbesondere in Gefäßen nach verschiedenen Vorgehensweisen wie der Angioplastik und nach dem Einbringen von Kathetern, Bypässen und anderen Vorrichtungen, Inhibierung von Thrombin-aktivierter Plättchenaggregation; Lungenkrankheiten einschließlich aber nicht beschränkt auf Asthma, zystische Fibrose, Entzündung der Lungen, die auf eine Ischämie des Gastrointestinalsystems folgt, Schocklunge und andere allergische und entzündliche Reaktionen des Lungensystems einschließlich der Entzündung von Geweben des oberen Atmungssystems, allergische Rhinitis und Atemnotsyndrom des Neugeborenen; Entzündung des Gastrointestinalsystems einschließlich aber nicht beschränkt auf Crohn-Krankheit, eosinophile Gastrointeritis, Peritonitis, Cholitis ulcerosa, Geschwüre des Dünndarms und des Magens, Ösophagitis, Magenentzündung, entzündliche Darmerkrankung; Okularentzündung; Konservierung des Vollbluts; Konservierung von Geweben, Zellen und Organen zur Transplantation und Schutz von Mitochondrien.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung von Entzündungen, die durch Bisse von Insekten, Reptilien, Amphibien und anderen Tieren, insbesondere giftigen Tieren wie giftigen Schlangen verursacht sind, bereitzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, Verbindungen zur Verwendung bei der Inhibierung der Plättchenfunktion bereitzustellen.
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der Verhinderung und Behandlung der akuten und chronischen Abstoßung von Transplantaten und zur Behandlung der Transplantat-Wirt-Krankheit und Autoimmunkrankheiten bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung von Tumorleiden bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der topischen Behandlung verschiedener Formen von Arthritis und anderen entzündlichen Krankheiten einschließlich aber nicht beschränkt auf rheumatoide Arthritis, entzündliche Arthropathie, Osteoarthrose, Gicht und Lupus bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung von Parasiteninfektionen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Toxoplasmose, Malaria, Naegleria fowleri, Dilofilaria immitis, Nematoden und pathogene Protozoen wie Toxoplasma gondii, Falciparum-Malaria, Amöbiasis, Amöben und Kryptosporidia bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der Verstärkung des Bewegungsbereichs und der Verringerung des Schmerzes bei Patienten mit Sudeck-Dystrophie bereitzustellen.
Diese und weitere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach der folgenden detaillierten Beschreibung offensichtlich sein.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Cis-ungesättigte, im Gegensatz zu gesättigten Fettsäuren, inhibieren in vitro PLA₂-Aktivitäten, die von humanen Plättchen und humanen polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) abgeleitet sind. Die PLA₂-Aktivität wird durch Öl-, Linol- und Arachidonsäuren ungefähr in gleichem Ausmaß inhibiert, was anzeigt, dass das Vorhandensein einer einzelnen cis-Doppelbindung so inhibitorisch ist wie mehrere cis-Doppelbindungen. Im Gegensatz dazu sind Fettsäuren, die trans-Doppelbindungen enthalten, oder Methylester von cis-ungesättigten Fettsäuren weniger inhibitorisch für die PLA₂-Aktivität. Somit wird angenommen, dass die bevorzugten strukturellen Charakteristika zur Inhibierung der in vitro-PLA₂-Aktivität durch nicht veresterte Fettsäuren mindestens eine Doppelbindung einschließen. Ölsäure inhibiert die PLA₂-Aktivität in vitro aufgrund des Vorhandenseins einer einzelnen Doppelbindung an der C-9-Position. Die Oxidation des sarkoplasmatischen Retikulums von Muskel und von Phospholipidmembranen macht diese gegenüber einem Phospholipase-Abbau anfällig. Phospholipidmembranen, die an bestimmten Stellen oxidiert wurden, können intakt erscheinen und ihre funktionelle Aktivität beibehalten, aber ihre Oxidation macht sie empfindlich gegenüber einem Abbau und einer Zerstörung durch PLA₂ oder andere Phospolipasen von endogenen oder exogenen Quellen.
Die Beobachtungen veranschaulichen die verstärkte Empfindlichkeit von Phospholipidmembranen gegenüber Phospholipase, die durch oxidative und Radikal-vermittelte Veränderungen in Zellmembranen verursacht ist und/oder cis-ungesättigte Fettsäuren wurden gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Gestaltung neuer entzündungshemmender und zytoprotektiver Mittel verwendet. Die vorliegende Erfindung stellt somit einen biochemischen und synthetisch-organischen Ansatz zur Bekämpfung der Expression von PLA₂-Enzymen bereit, welche für die Beibehaltung der Membranstruktur essentiell ist.
Obwohl man nicht durch die folgende Annahme festgelegt werden möchte, wird angenommen, dass die Anzahl vorhandener Methylen-unterbrochener ungesättigter Doppelbindungen direkt mit der Empfindlichkeit von Fettsäuren gegenüber Oxidation im Zusammenhang steht. Dies steuert die Fähigkeit von ungesättigten Fettsäuren, als Antioxidantien zu wirken. Diese Eigenschaft, zusammen mit der anti-PLA₂-Aktivität der Fettsäureeinheit-Verbindungen der vorliegenden Erfindung, erweitert das Ausmaß der entzündungshemmenden und zytoprotektiven Wirkung der hierin offenbarten Mittel beträchtlich. Es ist eine Eigenschaft der Doppelwirkung dieser Verbindungen, d. h. ihrer Wirkung als PLA₂-Inhibitoren mit variierender Antioxidans-Aktivität, durch die das Spektrum entzündungshemmender Aktivität in Modellsystemen bereitstellt wird, welche eine direkte Anwendbarkeit bei Zytoprotektion und der Kontrolle von Entzündung und Pathophysiologie besitzen.
Eine nicht funktionelle Alkylkette oder Gruppe ist als Kohlenwasserstoffgruppe bekannt, da sie nur C-C und C-H-Einzelbindungen enthält. Eine nicht funktionelle Alkylkette enthält daher die maximal mögliche Anzahl an Wasserstoffatomen pro Kohlenstoffatom, welche durch -C_nH_2n+1 dargestellt wird. Eine funktionalisierte Alkylkette oder Gruppe weist für ein oder mehrere Wasserstoffe an der Alkylkette substituierte ein oder mehrere Atome oder Gruppen von Atomen auf, welche ein charakteristisches chemisches Verhalten besitzen. Diese Atome oder Gruppen von Atomen, welche ein charakteristisches chemisches Verhalten besitzen, sind auch als funktionelle Gruppen bekannt. Bei diesen funktionellen Gruppen sind C=C, OH, COOH, SO₃H, PO₃H, NH₂, -O- und Halogene eingeschlossen.
Zusammenfassend ist eine einzelne Doppelbindung in einer Fettsäureeinheit-Verbindung ausreichend, um die PLA₂-Aktivität in vitro und in situ zu inhibieren. Mehrere Doppelbindungen liefern den zusätzlichen Vorteil einer Erhöhung der potentiellen Antioxidans-Aktivität zusammen mit der PLA₂-inhibitorischen Wirkung. Die vorliegende Erfindung stellt somit Verbindungen bereit, die sowohl durch anti-PLA₂ als auch variierende Antioxidans-Aktivität gekennzeichnet sind, um die entzündungshemmende und zytoprotektive Wirkung zu maximieren, welche den Schlüssel für den klinischen Wert der Verbindungen der vorliegenden Erfindung darstellt.
Zusätzlich zu der Inhibierung der PLA₂-Aktivität schützt die Antioxidans-Wirkung dieser Verbindungen Proteine, welche aufgrund von Oxidation zunehmend empfindlich gegenüber dem Angriff von Proteasen werden. Somit besitzen die zytoprotektiven PLA₂-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung, welche auch eine Antioxidans-Aktivität besitzen, sowohl den Vorteil, dass sie Membranphospholipid stabilisieren, als auch einen Proteinabbau oder eine Denaturierung inhibieren oder verhindern. Dies legt nahe, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung so wirken, dass eine Entzündung bei Beginn minimiert wird und auch der entzündliche Prozess in seinem Verlauf unterbrochen wird.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung blockieren die Arachidonsäure-Freisetzung von humanen polymorphkernigen Zellen und Endothelialzellen, eine Reaktion, die durch eine zelluläre und sekretorische PLA₂-Aktivität vermittelt ist. Somit sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung potente, reversible PLA₂-Inhibitoren, und somit inhibieren diese Mittel die proentzündliche Reaktion humaner PMN und anderer Entzündungszellen durch Inhibierung der zellulären und sekretorischen PLA₂-Aktivität. Außerdem inhibieren die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in verschiedenem Ausmaß die Radikalaktivität in Zellen und Geweben, die an dem Entzündungsprozess beteiligt sind.
In einem bestimmten Fall stellt die vorliegende Erfindung pharmakologisch wirksame, anti-Phospholipase-Verbindungen bereit. Vorzugsweise sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung wasser- oder lipidlösliche Antioxidantien. Die bevorzugten Verbindungen weisen mindestens zwei Fettsäureeinheiten auf und enthalten mindestens eine ungesättigte Doppelbindung. Die Fettsäureeinheiten können in mehreren Merkmalen unterschiedlich voneinander sein, einschließlich aber nicht beschränkt auf chemische Zusammensetzung, funktionelle Gruppen, Grad an Ungesättigtheit und Länge der Kohlenwasserstoffkette. Die Verbindungen können auch mindestens eine organische Gruppe, eine Aktivsäuregruppe oder jede beliebige Salzform oder ionisierte Form davon enthalten. Die Erfindung umfasst eine Vielzahl an Konfigurationen, einschließlich Oligomere wie Dimere, Trimere, Tetramere und Kombinationen davon. Mehrere dieser Verbindungen, die gemäß der Prinzipien und Konzepte der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, können wie in den folgenden spezifischen Beispielen dargelegt hergestellt werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden nicht allgemein durch Pankreasenzyme hydrolysiert und unterscheiden sich von Glycerin-basierenden Verbindungen in ihrer Chemie und ihrem Metabolismus. Z. B. haben wir beobachtet, dass eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, PX-18, in vitro resistent gegenüber dem Abbau durch die kommerziell erhältliche Pankreasenzympräparation, Pankreatin, die von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhalten wurde, ist. Die Beständigkeit von PX-18 gegenüber dem Metabolismus durch Pankreasenzyme stützt die Stabilität davon nach der oralen Verabreichung.
Die Oligomere (Dimere, Trimere, Tetramere, Pentamere etc.) ungesättigter Fettsäuren und andere Verbindungen, die mindestens einen ungesättigten geradkettigen Fettsäurerest wie oben beschrieben besitzen, bewirken grundlegende Membranphospholipid-Reaktionen des Phospholipaseinduzierten Abbaus und der Radikalperoxidation. Die hierin dargelegten Daten bestätigen durch experimentelle Ergebnisse, dass diese Verbindungen potente entzündungshemmende und zytoprotektive Mittel sind.
Die geeignete Dosis einer wirksamen Menge der ungesättigten Fettsäureeinheit-Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Säugern einschließlich Menschen gegen Phospholipase-vermittelte Schädigung und/oder Entzündung sollte im Bereich von 1–75 mg pro kg (mg/kg) Körpergewicht und vorzugsweise 2–50 mg/kg Körpergewicht sein, wobei der Bereich von 10–40 mg/kg Körpergewicht mehr bevorzugt ist, wenn die Verbindung oral oder intraperitoneal (IP) verabreicht wird. Wenn sie intravenös verabreicht wird, sollte die Dosierung 50% der oralen oder IP-Dosierung betragen, um den gleichen Level an Wirkstoff im Blut zu erreichen. Die beschriebene Dosierung ist auch zur Verhinderung der humanen Plättchenaggregation oder der Blutgerinnung geeignet. Wie es dem Fachmann bekannt ist, können therapeutische Dosen, die mittels der Menge pro kg Körpergewicht oder Oberflächenbereich ausgedrückt sind, von Säuger zu Säuger, einschließlich Menschen, extrapoliert werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch als Aerosol verabreicht werden, wie durch Nasenspray, um eine Entzündung der Nasenhöhlen, des Nasenrachenraums und benachbarter Bereiche zu behandeln, oder als inhalierte Formulierungen, um eine Entzündung der oberen und unteren Atemwege zu behandeln.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können analog zu anderen topischen Zusammensetzungen, die zur Verwendung bei Säugern angepasst sind, auf jede zweckdienliche Weise zur Verabreichung formuliert werden. Diese Zusammensetzungen können auf jede zweckdienliche Weise mit Hilfe von jedem einer breiten Vielfalt pharmazeutischer Träger oder Vehikel verwendet werden. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die oben beschrieben werden, können unter Verwendung von Formulierungsverfahren, die dem Fachmann im Fachgebiet bekannt sind, als pharmazeutisch annehmbare Formulierungen bereitgestellt werden. Diese Formulierungen können durch Standardverabreichungswege verabreicht werden. Im Allgemeinen können die Kombinationen über den topischen, transdermalen (einschließlich elektrophonetischer Verabreichung), bukkal, oral, rektal oder parenteral (z. B. intravenös, subkutan oder intramuskulär) verabreicht werden. Zusätzlich können die Kombinationen in bioabbaubare Polymere eingebaut werden, um eine anhaltende Freisetzung der Verbindung zu erlauben, wobei die Polymere in Nähe der Stelle implantiert werden, an welcher die Wirkstoffverabreichung erwünscht ist, z. B. an der Stelle eines Tumors. Die bioabbaubaren Polymere und ihre Verwendung sind z. B. detailliert in Brem et al., J. Neurosurg. 74: 441–446 (1991) beschrieben.
Ein pharmazeutisch annehmbares Lösungsmittel ist eines, welches unter den verwendeten Bedingungen nicht toxisch und nicht reizend ist, und welches leicht in eine beliebige der klassischen Wirkstoffformulierungen wie Pulver, Cremes, Salben, Lotions, Gels, Schäume, Aerosole, Lösungen und dgl. formuliert werden kann. Insbesondere geeignete Lösungsmittel schließen Wasser, Ethanol, Aceton, Glycerin, Propylencarbonat, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Glykole wie 1,2-Propylendiol, d. h. Propylenglykol, 1,3-Propylendiol, Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 100 bis 10000, Dipropylenglykol etc. und Mischungen der zuvor erwähnten Lösungsmittel miteinander ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Eine topische Creme kann als halbfeste Emulsion von Öl in Wasser oder Wasser in Öl hergestellt werden. Eine Creme-Basisformulierung ist per Definition eine Emulsion, welche ein Zweiphasensystem ist, in welchem eine Flüssigkeit (z. B. Fette oder Öle) als kleine Tröpfchen in einer anderen Substanz (z. B. einer Glykol-Wasser-Lösungsmittelphase) dispergiert ist, welche als Primärlösungsmittel verwendet werden kann. Eine Creme-Formulierung kann Fettalkohole, oberflächenaktive Mittel, Mineralöl oder Petrolatum und andere typische pharmazeutische Hilfsmittel wie Antioxidantien, antiseptische Mittel oder kompatible Hilfsmittel enthalten. Eine typische Creme-Basisformulierung ist wie folgt:
Eine "klassische" Salbe ist eine halbfeste wasserfreie Zusammensetzung, welche Mineralöl, weißes Petrolatum, ein geeignetes Lösungsmittel wie Glykol enthalten kann, und welche Propylencarbonat und andere pharmazeutisch geeignete Additive wie oberflächenaktive Mittel z. B. Span und Tween oder Wollfett (Lanolin) zusammen mit Stabilisierungsmitteln und anderen Hilfsmitteln wie oben erwähnt enthalten kann. Das folgende ist ein Beispiel einer typischen "klassischen" Salbenbasis:
Zusätzlich können die Zusammensetzungen als orale, parenterale, subkutane, intravenöse, intraartikuläre, intramuskuläre, intraperitoneale, in die Wunde verabreichte und andere systemische Zusammensetzungen formuliert werden. Abhängig von der beabsichtigten Weise können die Zusammensetzungen in Form fester, halbfester oder flüssiger Dosierungsformen wie z. B. Tabletten, Zäpfchen, Pillen, Kapseln, Pulver, Flüssigkeiten, Suspensionen oder dgl., vorzugsweise in Dosiseinheitsformen, die für eine Einzelverabreichung genauer Dosierungen geeignet sind, vorliegen.
Die Zusammensetzungen werden einen üblichen pharmazeutischen Träger oder Hilfsstoff und eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung enthalten, und zusätzlich können sie andere medizinische Mittel, pharmazeutische Mittel, Träger, Hilfsmittel etc. enthalten.
Die Menge an verabreichtem Wirkstoff wird natürlich von dem behandelten Menschen oder Tier, der Schwere der Beschwerden, der Art der Verabreichung und der Beurteilung des behandelnden Arztes abhängen.
Typische Zusammensetzungen enthalten 0,01 bis 95 Gew.% Wirkstoff, wobei der Rest ein oder mehrere annehmbare, nicht toxische Träger darstellt. Der prozentuale Anteil an Wirkstoff wird natürlich von der Dosierungsform und der Art der Verabreichung abhängen.
Für feste Zusammensetzungen können konventionelle, nicht toxische feste Träger verwendet werden, z. B. Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glycose, Saccharose, Magnesiumcarbonat in pharmazeutischer Qualität eingeschlossen. Der wie oben definierte Wirkstoff kann unter Verwendung von z. B. Polyalkylenglykolen und Propylenglykol als Träger zu Zäpfchen formuliert werden. Flüssige pharmazeutisch verabreichbare Zusammensetzungen können z. B. durch Auflösen, Dispergieren etc. eines Wirkstoffes wie oben definiert und optionaler pharmazeutischer Hilfsmittel in einem Träger wie Wasser, Salzlösung, wäßriger Dextrose, Glycerin, Ethanol und dgl. hergestellt werden, um eine Lösung oder Suspension zu bilden. Wenn erwünscht, kann die zu verabreichende pharmazeutische Zusammensetzung auch kleinere Mengen nicht toxischer Hilfssubstanzen wie Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-pufternder Mittel und dgl., z. B. Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolamin, Natriumacetat, Triethanolaminoleat etc. enthalten. Gegenwärtige Verfahren zur Herstellung solcher Dosierungsformen sind bekannt oder werden dem Fachmann offensichtlich sein, siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 15. Ausgabe, 1975. Die zu verabreichende Zusammensetzung oder Formulierung wird in jedem Fall eine Quantität des/der Wirkstoffe) in einer solchen Menge enthalten, die wirksam ist, um die Symptome des zu behandelnden Patienten zu lindern.
Für die orale Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutisch annehmbare, nicht toxische Zusammensetzung gebildet, indem beliebige der normalenrweise verwendeten Hilfsmittel verwendet werden, wie Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat pharmazeutischer Qualität und dgl. Solche Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Formulierungen zur anhaltenden Freisetzung und dgl. an. Solche Zusammensetzungen können 2% bis 95% Wirkstoff, vorzugsweise 5% bis 90% enthalten.
Die parenterale Verabreichung ist im Allgemeinen durch Injektion, entweder subkutan, intramuskulär oder intravenös, gekennzeichnet. Injektionsmittel können in konventionelle Formen gebracht werden, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste Formen, die geeignet sind, um vor der Injektion in Lösung oder Suspension gebracht zu werden, oder als Emulsionen. Geeignete Hilfsmittel sind z. B. Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dgl. Zusätzlich können die zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzungen, wenn erwünscht, auch kleinere Mengen nicht toxischer Hilfssubstanzen wie Benetzungs- oder Emulgationsmittel, pH-puffernde Mittel und dgl. wie z. B. Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat etc. enthalten.
Salben für eine topische Anwendung können hergestellt werden, indem 0,1 bis 10% der Verbindung als Öl oder Salzform in eine Salbenbasis eingebracht werden, die Emulgationsmittel wie Stearinsäure, Triethanolamin und/oder Cetylalkohol enthält. Die Formulierung kann auch Bestandteile wie Glycerin, Petrolatum, Wasser und Konservierungsstoffe enthalten, wenn es erforderlich ist.
Wasser-basierende Lotionen können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als Öl oder Feststoff in Mengen im Bereich von 0,1 Vol.% bis 5,0 Vol.% enthalten. Solche Lotionen können Glycerin und/oder Bentonit als Suspensionsmittel enthalten, wie es im Fachgebiet wohlbekannt ist. Die vorliegende Erfindung kann auch in Cremes eingebracht werden.
Die Verbindungen können auch in klassische (Ein- oder Zweiphasen) oder nicht klassische (wäßrige Emulsion) Aerosolformulierungen eingebracht erden. Solche Formulierungen schließen die Verbindungen und einen gegneten Treibmittelträger ein, in welchem die Verbindungen gelöst oder verteilt erden. In der klassischen Form werden die Wirkstoffe im Allgemeinen als Öldiwersion oder in Lösung in einem organischen Lösungsmittel wie Ethanol verwendet. In der nicht klassischen Form wird der Wirkstoff in Wasser gelöst. In jedem Fall kann die Konzentration des Wirkstoffes im Träger ungefähr 0,1 bis 10 Gew.% oder Vol.% sein.
Von besonderem Vorteil ist die Tatsache, dass die Verbindungen mit ungesättigter geradkettiger Fettsäureeinheit, die oben beschrieben werden, am Ort der inhbitorischen Wirkung der Arachidonatkaskade wirken und vorzugsweise die Stimulus-induzierte Mobilisierung von Arachidonat beeinflussen. Die Inhibierung von PLA₂ schwächt die Produktion von sowohl Prostaglandinen als auch Leukotrienen in stimulierten oder entzündeten Zellen. Es ist wesentlich, dass die oben beschriebenen Verbindungen eine viel größere Wirkung auf die Stimulus-induzierte als auf die kontrollierte Freisetzung von Arachidonat besitzen, was eine selektive Wirkung auf die Erstere anzeigt. Darüber hinaus sind die oben beschriebenen Polymerverbindungen, wenn Phospholipide peroxidiert werden, in der Lage, den Abbau solcher Lipide durch lysosomale Phospholipase C zu inhibieren, was anzeigt, dass diese Verbindungen bereits beschädigte (oxidierte) Membranen schützen können.
Somit sind verschiedene Wirkungen für die entzündungshemmende Aktivität der Verbindungen mit Fettsäureeinheit der vorliegenden Erfindung verantwortlich, und auf Basis von Entzündungsmodellen wird offensichtlich, dass diese Verbindungen mit gegenwärtig erhältlichen Steroiden und NSAIDs bei der Behandlung von Entzündung wirksam konkurrieren oder diese ersetzen, wodurch die Verbindungen mit Fettsäureeinheit der vorliegenden Erfindung Kandidaten für die klinische Anwendung und Nützlichkeit bei lokalisierter und systemischer Schädigung und Krankheit darstellen.
Die oben beschriebenen Verbindungen mit Fettsäureeinheit sind, indem sie Lipidmembranen schützen und Antioxidans-Aktivität besitzen, potente Antioxidantien zum Schutz von nicht nur lebenden Zellen und Geweben, sondern ihre Wirkung macht sie als Konservierungsmittel von biologischen Materialien mit tierischem, humanem oder pflanzlichem Ursprung und als Konservierungsmittel von chemischen Mitteln, die einer oxidativen Schädigung ausgesetzt sind, wirksam. Um biologische Materialien, die einer oxidativen Schädigung ausgesetzt sind, zu schützen und zu bewahren, können die Verbindungen mit Fettsäureeinheit in der vorliegenden Erfindung in Konzentrationen von 0,1 bis 100 μM verwendet werden. Diese Molaritäten werden als die Molarität berechnet, die man erhalten würde, wenn der Wirkstoff in einem Gewichtsteil von Wasser gelöst werden würde, welcher der gleiche ist wie der Gewichtsteil des biologischen Materials, das bewahrt werden soll. Z. B. sollten für in vitro-Antioxidans- und/oder anti-Phospholipase-Anwendungen Konzentrationen von ungefähr 0,1 bis ungefähr 500 μM wirksam sein.
BEISPIEL 1
1,3-Bis(oleoylamino)-2-propylsuccinsäuremonoester
Diese Verbindung wird durch die folgende Strukturformel dargestellt:
Zu einer Lösung von 505 mg (0,817 mmol) von 1,3-Bis(oleoylamino)-2-hydroxypropan und 140 mg (1,40 mmol) Succinsäureanhydrid in 20 ml Acetonitril und 20 ml THF wurden 5 ml Triethylamin zugegeben. Die Suspension wurde bei 35°C gerührt. Nach 15 min war das Succinsäureanhydrid vollständig gelöst. Die Lösung wurde nach 48 h unter verringertem Druck entfernt. Das gelbe Öl wurde in Wasser suspendiert und dreimal mit Ether extrahiert. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt und das gelbe Öl 1,3-Bis(oleoylamino)-2-propylsuccinsäuremonoester wurde im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 380 mg (65%).
BEISPIEL 2
Generische Formel für PX-18-verwandte Verbindungen
Diese Verbindungen werden durch die folgende Strukturformel dargestellt:
A umfasst umfasst N, OH, eine Zuckereinheit, einen Ether, einen Ester, ein Amid oder NH₂ oder eine Säuregruppe oder ein Salz davon. Manche der bevorzugten Säuren schließen COOH, SO₃H und PO₃H ein.
B ist N, NR, P, P=O, CH oder CR, wobei R eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, welche funktionalisiert oder nicht funktionalisiert sein kann.
C₁, C₂ und C₃ sind Verknüpfungsgruppen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -(CH₂)_n-, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 24 ist und die -(CH₂)_n-Kette funktionalisiert oder nicht funktionalisiert sein kann. C₁, C₂ und C₃ können auch ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Poly(ethylenoxid) der Formel (CH₂CH₂-O)_y, wobei y eine ganze Zahl von 1 bis 12 ist. C₁, C₂ und C₃ können gleich oder verschieden sein.
D₁ und D₂ sind Fettsäureketten, die aus Fettsäureestern der Form CH₃(CH₂)_nCOO oder Fettsäureamiden der Form CH₃(CH₂)_nCONH bestehen, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 32 ist. Mindestens eine der Fettsäureketten ist an einer oder mehren Positionen ungesättigt und D₁ und D₂ können hinsichtlich der Länge und des Grades der Ungesättigtheit gleich oder verschieden sein.
In der oben angegebenen generischen Formel können die Fettsäureketten des Moleküls aus (CH₂)_n zusammengesetzt sein, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 32 ist. Diese Fettsäureketten können jeweils an einer oder mehreren Stellen ungesättigt sein und können verschiedene Längen von 1 bis 32 Kohlenstoffatomen aufweisen.
BEISPIEL 3
BES-Dioleat, auch PX-18 oder 2-(N,N-Bis(2-oleoyloxyethyl)amino]-1-ethansulfonsäure genannt
Eine bevorzugte Ausführungsform der im vorhergehenden Beispiel angegebenen generischen Struktur wird durch die folgende Strukturformel dargestellt:
In der Formel für PX-18, die oben gezeigt ist, kann die SO₃H-Säuregruppe auch in Salzform oder in einer ionisierten Form vorliegen.
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure wurde (gemäß Izumi, 1954) hergestellt, indem eine wäßrige Lösung von Natrium-2-bromethansulfonat mit zwei Äquivalenten Diethanolamin für 2 h unter Rückfluss gehalten wurde. Die abgekühlte Reaktionsmischung wurde über ein Sulfonsäureharz (Dowex 50) in Säureform geleitet. Das Eluat, das Produkt und HBr enthält, wurde bei verringertem Druck zur Trockne eingedampft, und das Produkt wurde aus wäßrigem Alkohol umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 52% und die Verbindung wies einen Schmelzpunkt von 153 bis 155°C auf.
In einem 1 l-Rundkolben wurden 16,2 g (0,076 Mol) von N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure in einer Lösung von 60 ml DMF und 36 ml Triethylamin gelöst. Zu dieser Lösung wurden langsam unter N₂-Atmosphäre unter Rühren 72 g (0,239 Mol) Oleoylchlorid (65% Aldrich) zugegeben. (Während der Zugabe des Oleoylchlorids bildete sich ein Niederschlag). Nachdem das gesamte Oleoylchlorid zugegeben war, wurden zu der Mischung 300 ml Aceton oder THF zugegeben. Man ließ die Reaktionsmischung für 12 h unter N₂-Atmosphäre rühren. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und dann aus CHCl₃/CH₃CN umkristallisiert. Es wurde ein gelbliches Produkt (43,6 g) in 77%-iger Ausbeute erhalten. Das Produkt wurde mit Holzkohle in CH₃Cl entfärbt, aus CHCl₃/CH₃CN umkristallisiert und wies einen Schmelzpunkt von 133 bis 136°C auf.
BEISPIEL 4
Bedingungen neurologischer Entzündung
Das wasserlösliche (PX-18) inhibiert den aufgereinigten humanen Diskustyp II, PLA₂
PX-18 inhibiert den aufgereinigten humanen Diskustyp II, PLA₂. Die PLA₂-Aktivität wurde wie in Franson et al., Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 43: 63–70, 1991 beschrieben, gemessen, welches hierin durch Bezugnahme darauf vollständig enthalten ist. Die wasserlösliche Verbindung PX-18 zeigte einen IC₅₀ von 0,3 μM.
BEISPIEL 5
Parasiteninfektion: Protozoen-Parasiten
Malaria: Wasserlösliches PX-18 inhibiert die in vitro-Replikation von Plasmodium falciparum
Die wasserlösliche Verbindung PX-18 inhibierte die gleichen Wirkstoffresistenten P. falciparum-Stämme wie oben beschrieben. Der IC₅₀ für PX-18 betrug 1,3 und 2,4 μg/ml. Somit scheint die wasserlösliche PX-18-Verbindung zehnmal wirksamer zu sein als die lipidlösliche Verbindung PX-13.
Die inhibitorischen Wirkungen von wasserlöslichem PX-18 auf das Wachstum Wirkstoff-empfindlicher und Wirkstoff-resistenter Spezies von Plasmodium falciparum zeigen, dass diese PX-Verbindung und möglicherweise verwandte PX-Verbindungen wirksame anti-parasitäre Wirkstoffe sein können.
BEISPIEL 6
Behandlung bei Schlangenbiss
Tiere oder Menschen, die Bisse von einer giftigen Schlange erhalten haben, benötigen eine schnelle Behandlung, um die toxischen entzündlichen Reaktionen, die tödlich sein können, zu lindern. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind in leicht injizierbarer Form zur Verabreichung an den Patienten durch intramuskuläre Injektion erhältlich. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind über Zeiträume bis zu 3 Monaten bei Raumtemperatur stabil.
PLA₂ mit niedrigem Molekulargewicht ist eine wesentliche toxische Komponente von Schlangengiften. In Giften mit neurotoxischen Wirkungen (d. h. Kobragift) ist dies durch PLA₂ vermittelt, welches an neuronale Zellen bindet. Schlangengift-Schädigungen weisen drei Komponenten auf: 1) peripherale und zentrale Neurotoxizität (bestimmte Gifte), 2) systemische Entzündung, einschließlich Komplimentaktivierung und 3) extensive lokale Gewebeschädigung, einschließlich Muskelnekrose und Schwellung, welche eine spätere vaskuläre Beeinträchtigung verursachen kann (Kompartmentsyndrom). Das folgende hypothetische Beispiel beschreibt die Behandlung eines Klapperschlangenbisses, mit einem Notfall-Schlangenbiss-Kit, der einen wasserlöslichen PLA₂-Antagonisten, PX-18 in injizierbarer Form enthält, welche mehrere Stunden vor der üblichen medizinischen Behandlung durchgeführt wird.
Ein Patient wird während des Wanderns oberhalb der Baumgrenze in Colorado an der oberen Wade durch eine Klapperschlange gebissen. Er verwendet seinen Schlangenbiss-Kit, um ein lokales Aussaugen des Giftes an der Bissstelle zu erreichen. Er wendet nahe des Bisses ein Tourniquet an. Dann nimmt er die 2 ml-Spritze mit einer 22er Nadel, welche mit 200 mg PX-18 in steriler Lösung gefüllt ist, heraus, welche in dem Kit enthalten ist. Gemäß den Kit-Instruktionen injiziert er für eine systemische Absorption intramuskulär (im) 1 ml PX-18 in den vorderen Oberschenkel. Dann injiziert er den verbleibenden 1 ml tief subkutan an der Bissstelle, um eine Neutralisation der lokalen Konzentration von PLA₂-Gift zu erreichen. Nach 30 min löst er den Tourniquet und sucht medizinische Hilfe auf.
BEISPIEL 7
Wirkungen von PX-18 auf die Histamin-Freisetzung von Basophilen
Das Protokoll zur Untersuchung der Wirkungen von PX-18 auf die Histamin-Freisetzung ist unten beschrieben. Frisch abgenommenes, mit Heparin versetztes Blut von Spendern, die für 3 Tage nicht medikamentös behandelt wurden, wird 1 : 5 mit PBS, enthaltend 1% Humanserumalbumin (Verdünnungsmittel) verdünnt. Die Testwirkstoffe werden für die Endkonzentration zehnmal mit Verdünnungsmittel verdünnt und es werden 25 μl pro Well zugegeben, um Wells von Mikrotiterplatten mit rundem Boden gleich anzusetzen. Im Allgemeinen werden dreifache Verdünnungen des Wirkstoffes vier- oder fünfmal untersucht. Dann werden zu jedem Well 200 μl verdünnten Blutes zugegeben. 5 min später werden 25 μl anti-humanes IgE von Kaninchen (erhalten von Dako) pro Well zugegeben, um Endkonzentrationen von 1/400 und 1/1200 des Antikörpers zu erhalten. Unstimulierten (Hintergrund-Freisetzungs-Wells) wurden 25 μl Verdünnungsmittel zugegeben. Die Platten wurden zum Mischen vorsichtig geklopft, dann für 30 min inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten auf Eis gekühlt, in einer gekühlten Zentrifuge abzentrifugiert und auf Eis gelegt. Von jedem Well wurden 100 μl Plasma für den Assay entfernt und in eine 1,5 ml Eppendorf-Pipette, enthaltend Acetylierungsreagenz, eingebracht.
Nach der Acetylierung wird das Histamin-Addukt durch einen empfindlichen und spezifischen kommerziell erhältlichen kompetitiven Assay quantitativ bestimmt, wobei die kompetitive Bindung an einen spezifischen Antikörper an der Festphase von Enzym-konjugiertem Acetyl-Histamin verglichen mit Probenanalyten bestimmt wurde. Es wird auch eine Blutprobe durch wiederholtes Einfrieren/Auftauen lysiert, um das Gesamtbluthistamin zu bestimmen. Die Ergebnisse werden als prozentualer Anteil der Gesamtblut-Histaminfreisetzung ausgedrückt. In einem annehmbaren Assay beträgt die maximale Freisetzung mehr als 45% und die Hintergrund-Freisetzung ist kleiner als 15%. Die Experimente werden zwei- oder dreifach unter Verwendung verschiedener Blutspender durchgeführt.
Diese Experimente zeigen, dass PX-18 die Degranulation von Basophilen (und vermutliche Mastzellen) als Reaktion auf Stimuli wie das Antikörperoberflächengebundenes IgE inhibiert. PX-18 ist genauso wirksam wie Epinephrin, welches ein potenter anti-anaphylaktischer Wirkstoff ist, und wirksamer als Cromolyn, welches ein prototypischer "Mastzellen-Stabilisieren" ist. Diese Ergebnisse stützen die Verwendung von PX-18 und verwandten Verbindungen als Verbindungen zur Behandlung allergischer Krankheiten.
BEISPIEL 8
Wirkungen von PX-18 auf die Produktion von Leukotrienen und Prostaglandinen durch Blut unter basalen und stimulierten Bedingungen
Das folgende Protokoll wurde verwendet, um die Wirkungen von PX-18 auf die Produktion von Leukotrienen und Prostaglandinen durch Blutzellen unter basalen Bedingungen, bei Ionophor-Stimulierung von Cyclooxygenase Typ 1 und bei Lipopolysaccharid (LPS)-Induktion von Cyclooxygenase Typ II zu untersuchen. Frisch erhaltenes, mit Heparin versetztes Blut von Spendern ohne medizinische Behandlung wird 1 : 1 mit RPMI verdünnt und in 0,6 ml-Mengen in sterilen 12 × 75 ml-Polypropylenröhrchen aufgeteilt. Die Testwirkstoffe wurden bei geeigneten Konzentrationen hinzugefügt und in Salzlösung mit 1% Humanserumalbumin verdünnt. Den Kontrollröhrchen wurde nur Verdünnungsmittel oder Wirkstoffvehikel zugegeben. Die Wirkstoffe wurden 5 min vor der Zugabe des Stimulus mit 100-fachen Konzentrationen (6 μl Volumina) zugegeben. Dies wurde bei 3 Röhrchenständern A bis C wiederholt. Bei A wurde kein Stimulus zugegeben und er weist für jede Wirkstoftkonzentration ein 30-min- und 6-h-Röhrchen auf. B wurden 20 μM des Calciumionophors A 23187 zugegeben, und es wurde für 30 min bei 37°C inkubiert. C wurden 5 μg/ml E. coli-Stamm Bort LPS zugegeben, und es wurde für 6 h bei 37°C inkubiert. Am Ende jeder Zeitspanne wurden die geeigneten Röhrchen auf Eis gebracht, zentrifugiert und 0,4 ml Plasma wurden vorsichtig in ein Röhrchen dekantiert, das Ameisensäure und BHT enthielt, um alle Reaktionen zu stoppen und die Eicosanoid-Produkte zu erhalten. Diese Röhrchen wurden dann bei –70°C für bis zu 1 Woche gefroren, dann Sep-pac-Minisäulen zugeführt und in Methanol extrahiert. Das Methanolextrakt wurde in drei Röhrchen aufgeteilt und verdampft, dann bei –70°C bis zum Eicosanoid-Assay aufbewahrt. Die Messungen schließen Thromboxan (durch einen empfindlichen fluorometrischen Plattenassay) und entweder 15 HETE oder LTB4 ein, um Lipoxygenase-Produkte zu messen.
Die Eicosanoid-Freisetzungs-Experimente des Gesamtbluts zeigen, dass PX-18 die Cytokin-induzierbare Cyclooxygenase II stark zu inhibieren scheint, wobei das konstitutive Cyclooxygenase 1-Enzym, das durch ein Ionophor stimuliert wurde, weniger inhibiert wird und die basale Produktion von Prostaglandinen sogar noch weniger oder gar nicht inhibiert wird. Dies stellt ein ausgezeichnetes entzündungshemmendes Profil dar, da die meisten mit NSAIDs in Verbindung stehenden Toxizitäten (d. h. gastral, renal, Flüssigkeitsretention, möglicherweise Asthma) auf die Inhibierung der konstitutiven Cyclooxygenase I-Prostaglandinproduktion zurückzuführen sind, welche eine notwendige physiologische Rolle spielt. Cyclooxygenase II ist an der pathologischen Entzündung beteiligt.
Diese Studien zeigen auch, dass die Produktion von Lipooxygenaseprodukten wie LTC4 durch PX-18 inhibiert wird. Der Vergleich wird mit MK 592, einem selektiven Lipooxygenase-Inhibitor, durchgeführt. PX-18 inhibiert weder die Lipoxygenase noch die Cyclooxygenaseenzyme, sondern vielmehr PLA₂, welches freie Arachidonsäure erzeugt, so dass der Pool dieses Enzymsubstrates für die Lipoxygenase- und Cyclooxygenase-Wege vermindert wird. Unsere gegenwärtigen Experimente demonstrieren, dass die Zugabe von PX-18, wenn exogene Arachidonsäure zugegeben wird und Lipoxygenase- und Cyclooxygenase-Metaboliten gemessen werden, im Gegensatz zu Indocin oder MK 592 ihre Produktion nicht inhibiert. Diese Ergebnisse stützen die Annahme, dass PX-18 PLA₂ und keine stromabwärts liegenden Enzyme wie Lipoxygenase und Cyclooxygenase inhibiert.
Außerdem nimmt durch die Blockade der sekretorischen (s) PLA₂-Aktivität die Produktion von Lysophospholipid ab, welches der unmittelbare und Ratenlimitierende Vorläufer für den Plättchen-aktivierenden Faktor (PAF) ist. Im Gegensatz zu zytosolischer perinukleärer Membran-lokalisierter PLA₂ scheint sekretorische PLA₂ das Schlüsselenzym zu sein, das ein Substrat bereitstellt, welches acetyliert wird, um PAF zu bilden. PAF ist ein potenter entzündlicher Mediator, eine potente neutrophile chemotaktische Substanz und ein Schlüsselfaktor bei der Gewebeschädigung in Situationen wie Ischämie. PAF ist an Entzündungskrankheiten wie Cholitis ulcerosa beteiligt und wird durch die Therapie mit NSAIDs nicht beeinflusst.

Claims

Verbindung der Formel (I):
wobei A H, OH, eine Zucker-Einheit, einen Ether, einen Ester, ein Amid, NH₂, oder eine Säure oder ein Salz davon umfasst; B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus P, P=O und CH, C₁, C₂ und C₃ Verknüpfungsgruppen darstellen, die verschieden sein können und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -(CH₂)_n- und (CH₂CH₂-O)_y, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 24 ist, -(CH₂)_n- funktionalisiert oder nicht funktionalisiert sein kann, und y eine ganze Zahl von 1 bis 12 ist; und D₁ und D₂ Fettsäureketten sind, die verschieden sein können und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Fettsäureestern, einschließlich CH₃(CH₂)_nCOO, und Fettsäureamiden der Form CH₃(CH₂)_nCONH, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 32 ist, mindestens eine der Fettsäureketten an einer oder mehreren Positionen ungesättigt ist und die Fettsäureketten verschiedene Längen aufweisen können und an verschiedenen Positionen ungesättigt sein können.
Verbindung der Formel (I):
wobei A H, OH, eine Zucker-Einheit, einen Ether, einen Ester, ein Amid, NH₂, oder eine Säure oder ein Salz davon umfasst; B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N, NR, P, P=O, CH und CR, wobei R eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist und die Kette funktionalisiert oder nicht funktionalisiert sein kann; C₁, C₂ und C₃ Verknüpfungsgruppen darstellen, die verschieden sein können und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -(CH₂)_n- und (CH₂CH₂-O)_y, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 24 ist, -(CH₂)_n- funktionalisiert oder nicht funktionalisiert sein kann, und y eine ganze Zahl von 1 bis 12 ist; und D₁ und D₂ Fettsäureketten sind, die verschieden sein können und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Fettsäureestern, einschließlich CH₃(CH₂)_nCOO, und Fettsäureamiden der Form CH₃(CH₂)_nCONH, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 32 ist, mindestens eine der Fettsäureketten an einer oder mehreren Positionen ungesättigt ist und die Fettsäureketten verschiedene Längen aufweisen können und an verschiedenen Positionen ungesättigt sein können, mit der Maßgabe, dass die Verbindung nicht

ist, wobei X und Y ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus gesättigten Fettsäureestern mit 5 bis 18 oder 22 Kohlenstoffatomen in der Säurekette und Ölsäureester.
Verbindung der Formel (I):
wobei A eine Zucker-Einheit, einen Ether, einen Ester, ein Amid, NH₂, oder eine Säure oder ein Salz davon umfasst; B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N, NR, P, P=O, CH und CR, wobei R eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist und die Kette funktionalisiert oder nicht funktionalisiert sein kann; C₁, C₂ und C₃ Verknüpfungsgruppen darstellen, die verschieden sein können und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -(CH₂)_n- und (CH₂CH₂- O)_y, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 24 ist, -(CH₂)_n- funktionalisiert oder nicht funktionalisiert sein kann, und y eine ganze Zahl von 1 bis 12 ist; und D₁ und D₂ Fettsäureketten sind, die verschieden sein können und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Fettsäureestern, einschließlich CH₃(CH₂)_nCOO, und Fettsäureamiden der Form CH₃(CH₂)_nCONH, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 32 ist, mindestens eine der Fettsäureketten an einer oder mehreren Positionen ungesättigt ist und die Fettsäureketten verschiedene Längen aufweisen können und an verschiedenen Positionen ungesättigt sein können.
Verbindung nach Anspruch 2 oder 3 der Formel
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 5 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 bei der Herstellung eines Medikaments zum Schutz von Zellen vor Verletzung.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 bei der Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Aktivitäten des Enzyms PLA₂.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündungen.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 bei der Herstellung eines Medikaments zur oralen oder topischen Behandlung von Arthritis.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 bei der Herstellung eines Medikaments zur Schmerzbehandlung.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung parasitärer Infektionen.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung allergischer Krankheiten.
Verfahren zum ex vivo Schutz von Zellen vor Verletzung umfassend die Behandlung der Zellen mit einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 5.