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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf Zusammensetzungen und Verfahren zum Schutz von Säugerzellen
vor Schädigung
aufgrund von Lyse innerer Membranen, Oxidation und/oder Invasion
durch schädliche
Mittel. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf
Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung und/oder prophylaktischen
Inhibierung der Ursache der Schädigung.
Noch spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf bioaktive
Mittel und die Verwendung davon zur Behandlung oder prophylaktischen
Inhibierung einer Phospholipase-vermittelten Schädigung, von Schädigung aufgrund
von Oxidation und Entzündung.
In einem speziellen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Mittel
zur Verhinderung und/oder Behandlung einer Entzündung und Zeltschädigung in
Gewebe von Säugern
und zum Schutz und zur Erhaltung von biologischem Material, das
von Tieren, Menschen und Pflanzen abgeleitet ist, wie Nahrungsmittel-
und Gewebeproben, bereit. In einem sehr speziellen Aspekt stellt
diese Erfindung Zusammensetzungen, welche Inhibitoren von Phospholipase
sind, und Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzungen bereit.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die Basisstruktur aller lebenden
Organismen ist die Zelle, welche durch ihre Membranlipoproteinhülle strukturell
definiert ist. Das Membrannetzwerk, das die Zelle zusammenhält, behält das ionische
Gleichgewicht bei und liefert die Rezeptoren für Hormone und Neurotransmitter,
die es der Zelle ermöglichen,
mit ihrer Umgebung zu interagieren. Dies ist für eine Wechselwirkung mit benachbarten
Zellen relevant, wodurch isolierte Zellen, Gewebe oder ganze Organismen
sowohl als unabhängige
Einheiten als auch als Beteiligte an zellulären Wechselwirkungen in vitro
und in vivo überleben
können.
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Externe Faktoren, die die Zellfunktion,
Zellerneuerung, Zellreproduktion und den Zelltod bestimmen, agieren über ihre
Wirkungen auf die Phospholipiddoppelschicht und Proteine der Zellmembran.
Dadurch werden die Rezeptorvermittelten Signale und Ionenflüsse kontrolliert,
welche die Reaktionsfähigkeit
und das Überleben
der Zelle bestimmen. Eine Schädigung
der Zellmembran, besonders bezogen auf die Lipidperoxidation, Membranoxidation
und die Wirkung von Phospholipasen, beeinflusst die Widerstandsfähigkeit
gegenüber Schädigung,
Erneuerung und Wirtsreaktionen auf Umgebungsveränderungen und ionische und
osmotische Integrität.
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Pathologische Ereignisse in einem
Wirt unter klinischen Umständen
können
zu einer zellulären
Schädigung
führen,
was zum Verlust der Membranintegrität führt. Die Ereignisse werden
durch Faktoren vermittelt, die die Zellmembran abbauen und zerstören und
eine Schädigung
weitertragen, indem eine Kaskade von Zellmembranveränderungen
erzeugt wird. Indem mit der Kaskade externer und interner Ereignisse
interagiert wird, welche die Membranintegrität und toxische Veränderungen,
welche zum Zelltod führen,
betreffen, kann eine Schädigung
verhindert, verändert
oder rückgängig gemacht
werden. In der Vergangenheit war dies eine Hauptrolle von entzündungshemmenden
Mitteln.
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Die wichtigsten gegenwärtig verwendeten
klinisch wirksamen entzündungshemmenden
Wirkstoffe schließen
die Corticosteroide und die nicht steroiden entzündungshemmenden Wirkstoffe
ein (NSAIDs = non-steroidal antiinflammatory drugs). U. a. inhibieren
Corticosteroide die Aktivität
von Zellphospholipasen. NSAIDs inhibieren den Metabolismus durch
Cyclooxygenase von Arachidonsäure,
die von Phospholipasen freigesetzt wird. Diese Wirkstoffe wirken
so, dass die Entzündung
kontrolliert wird und eine Zeltschädigung durch die Regulierung
des Abbaus von Phospholipiden minimiert wird. Diese Wirkstoffe beeinflussen
auch die Wirkung der Produkte des Phospholipidabbaus, was zur Bildung
von Prostaglandinen und Leukotrienen führt, welche bei einer Entzündung in
erhöhten
Mengen produziert werden und die Zeltdysfunktion und -schädigung fördern.
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Außerdem können zelluläre und extrazelluläre Phospholipasen
durch die Erzeugung von Sauerstoffradikalen aktiviert werden. Dadurch
kann sich ein zerstörender
Zyklus bilden, da die Phospholipase-Aktivierung freie Radikale freisetzen
kann, welche wiederum mehr Phospholipasen aktivieren. In dieser
Hinsicht werden von den Fettsäuren,
welche durch die Wirkung von Phospholipasen freigesetzt werden und
dann durch Cyclooxygenase- und Lipoxygenaseenzyme zu Prostaglandinen
und Leukotrienen umgewandelt werden, Radikale gebildet, wobei die
Erzeugung von Sauerstoffradikalen ein Nebenprodukt ist. Es ist bekannt,
dass Fettsäuren
und Radikale wesentliche Vermittler in der Kaskade von Reaktionen
sind, welche zu einer Membranschädigung,
zu Zelltod und Entzündung
führen.
Phospholipase A2 (PLA2),
ein Schlüsselenzym
im Metabolismus von Phospholipid, kann die Freisetzung von Fettsäure fördern. PLA2 kann durch eine Vielzahl von Faktoren aktiviert
werden, wobei hormonelle, neurale, metabolische oder immunologische
Wege involviert sind.
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Eines der Kennzeichen von Entzündung und
Zeltschädigung
ist der Abbau von zellulärem
Membranphospholipid. Phospholipide stellen die hauptsächlichen
strukturellen Bausteine der Zellmembran dar; sie verursachen die
Barrierestrukturellen und funktionellen Eigenschaften von Membranen,
und ihre Integrität
ist kritisch für
eine normale Zeltreaktionsfähigkeit
und -funktion. Phospholipidveränderungen
in der Zellmembranintegrität,
insbesondere Veränderungen
bei den Fettsäuren
an der Position 2, verändern
die Fluidität
von Zellmembranen, die Zellrezeptorfunktion und die Zurverfügungstellung
von zellulären
Inhalten an die externe Umgebung. Der Abbau von Phospholipidmembranen
führt zur
Lyse von Zellen, erzeugt Löcher
in der Zellmembran, beeinflusst Ionenkanäle und Membranrezeptoren, was
zur Zerstörung
der zellulären
Integrität
und von funktionellen Reaktionen führt.
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Während
einer Entzündung
werden Phospholipasen von irgendeiner Quelle, welche normalerweise von
natürlichen
Suppressorsystemen kontrolliert werden, aktiviert, so dass sie Membranphospholipid
abbauen, was wiederum Sauerstoffradikale erzeugt. PLA2 ist
ein Schlüsselenzym,
welches bei einer Entzündung
aktiviert wird, wodurch Substratphospholipide metabolisiert werden
und freie Fettsäuren
freigesetzt werden. Diese Fettsäuren
(d. h. Arachidonate), die durch PLA2 freigesetzt
werden, werden zu wirksamen biologisch aktiven Metaboliten, Lysophospholipiden,
Prostaglandinen und Leukotrienen umgewandelt. Diese sind selbst
Substrate für
andere Enzyme, die zur Erzeugung von Thromboxanen, Plättchen-aktivierendem
Faktor und anderen Substanzen führen,
wobei damit einhergehend Sauerstoffradikale erzeugt werden.
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Phospholipasen, insbesondere PLA2, spielen als Membran-gerichtete Enzyme
eine wichtige Rolle, da die Expression ihrer Aktivität zu einer
weiteren Erzeugung von Entzündungsmediatoren
führt,
was eine Membranschädigung
zur Folge hat, welche die Schädigung
innerhalb der Zelle selbst oder in benachbartem Gewebe propagiert.
Somit kann durch die Aktivierung und/oder Freisetzung von PLA2 die Ausbreitung der Schädigung von der anfänglichen
Stelle zu angrenzenden oder entfernten Stellen gefördert werden.
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Zusätzlich zu dem wesentlichen
Membran-assoziierten Gewebeabbau über die Aktivierung von PLA2, sind Phospholipasen und insbesondere PLA2 Teil des normalen Abwehrsystems des Körpers. PLA2 wird in humanen weißen Blutzellen gefunden (WBC).
WBC spielen bei der Abwehr einer Infektion eine Rolle, aber wenn diese
Zellen mobilisiert werden, um eine Schädigung und Infektion abzuwehren,
wird PLA2 von adhärenten und zirkulierenden WBC
freigesetzt und erzeugt eine lokale Gewebeaktivierung, welche das
Ausmaß der anfänglichen
Schädigung
verstärken
kann. Außerdem
haften WBC an Blutgefäßwänden, wo
sie Enzyme wie PLA2 freisetzen. WBC bilden
auch in großen
Mengen Radikale wie Superoxid und fördern somit die Schädigung von
vaskulärem
Endothelium, Lungenalveolen oder von Gewebestellen, die in der Nähe der WBC-Infiltration
oder -Konzentration liegen. Wo sich eine Entzündung befindet, sind gewöhnlich WBC
im Überfluß vorhanden,
und die WBC haften an dem vaskulären
Endothelium, wobei anschließend
PLA2 freigesetzt und aktiviert wird, was
zur Zerstörung
der vaskulären
Integrität
während
eines Schocks und einer Ischämie
führt.
Somit können
WBC, obwohl sie ein wesentliches Abwehrsystem des Körpers gegen
Infektionen darstellen, den Körper
durch eine Ausbreitung der Schädigung
und Entzündung
auch schädigen.
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Eine klassische Beschreibung von
Entzündung
ist die Rötung
und das Anschwellen in Verbindung mit Hitze und Schmerz. Entzündung wurde
als die Reaktion gereizter und geschädigter Gewebe definiert, welche noch
ihre Lebensfähigkeit
besitzen. Entzündung
ist ein Prozess, welcher auf einer bestimmten Stufe zum Zelltod,
zur Gewebenekrose und Vernarbung führen kann. Auf einer anderen
Stufe kann sich eine Entzündung
mit Wiederherstellung des Normalzustandes und ohne sichtbare Schädigung oder
mit minimalen Veränderungen, d.
h. Pigmentierung, Fibrose oder Gewebeverdickung mit Kollagenbildung,
welche mit dem Heilprozess und der Vernarbung im Zusammenhang steht,
wieder auflösen.
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Mikroskopisch wurde eine Entzündung wie
folgt beschrieben: (1) Atonie der Muskelschicht der Blutgefäßwand; (2)
endotheliale Anhaftung von Entzündungszellen,
gefolgt von Migration dieser Zellen von dem vaskulären Raum
in das Gewebe.
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Die oben beschriebenen Ereignisse
werden oft durch Phospholipase-Aktivierung,
gefolgt von Fettsäure-Freisetzung
und der Bildung von Radikalen vermittelt. Cytokine, die von Immunzellen
abgesondert werden, induzieren durch ihre Wirkungen auf eine Vielfalt
von Zellen eine PLA2-Absonderung. Interleukin-6
stimuliert Hepatozyten, um auf mehrere Arten eine PLA2-Absonderung zu erhöhen. Interleukin-1
und Tumornekrosefaktor induzieren eine PLA2-Absonderung über Endothelialzellen
und über
Chondrozyten. Somit stimulieren Immunzellprodukte direkt die Hydrolyse
von Membranphospholipiden und die Produktion von Arachidonsäure-Metaboliten über eine
Vielfalt von Targetzellen, wobei die Entzündungsreaktion verstärkt wird.
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Alternativ kann eine erhöhte Phospholipase-Aktivität mit einem
exogenen Enzym im Zusammenhang stehen, welches von infektiösen pathologischen
Organismen wie Viren, Bakterien, Rickettsien, Protozoen und Pilzen
freigesetzt wird. Diese Krankheitserreger besitzen häufig Phospholipasen
als Faktoren, die für
ihre infektiöse
Aktivität
wesentlich sind. Im Fall von Naegleria fowleri, welche eine pathogene
Amöbe mit
einer Affinität
für das
Gehirn ist, kann eine Zerstörung
von Gehirnmembranen, die durch Phospholipasen, welche von Naegleria
abgesondert werden, induziert wird, an Stellen des Gehirns auftreten,
welche entfernt sind von der Stelle, wo der Organismus lokalisiert
ist. In einem anderen Beispiel kann Toxoplasma nicht in die Wirtszelle eindringen,
wenn das PLA2-Enzym davon durch einen spezifischen
Wirkstoff inhibiert wird. Was für
die Behandlung bestimmter Infektionen, insbesondere intrazellulärer Krankheitserreger
erforderlich ist, ist ein wirksamer PLA2-Inhibitor.
Solch ein wirksamer PLA2-Inhibitor ist insbesondere
in Fällen
von Protozoeninfektionen erforderlich, für welche es wenig wirksame
Antibiotika gibt.
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PLA2 ist
auch eine der hauptsächlichen
toxischen Komponenten von Schlangengift. Durch Bisse bestimmter
Schlangen wird ein Gift, das PLA2 enthält, in die
Wunde injiziert, was toxische und entzündliche Reaktionen verursacht,
welche tödlich
sein können.
Es besteht Bedarf für
Inhibitoren von PLA2, welche an Empfänger von
Schlangenbissen oder Bissen von anderen Tieren verabreicht werden
können.
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Pathologische Wirkungen von Phospholipasen
können
lokal, regional oder systemisch sein. Diese pathologischen Wirkungen
werden durch das freigesetzte Phospholipaseenzym, den Level von
Albumin, natürliche
Inhibitoren der Enzymwirkung und Faktoren der Diffusion, Zirkulierung
und Gewebeempfindlichkeit bestimmt, basierend auf intrinsischen
Inhibitoren oder auf der Empfänglichkeit
von zuvor geschädigter
oder oxidierter Membranen oder Proteine gegenüber einer Phospholipase-Wirkung.
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Eine Entzündung ist mit einer Wunde,
Infektion und mit Wirtsabwehrreaktionen verbunden, die mit einem
direkten bakteriellen oder viralen Abtöten durch die damit in Verbindung
stehende Immunantwort im Zusammenhang stehen. Im Allgemeinen können Immunantworten
sowohl nützlich,
schützend
als auch gewebeschädigend
sein, wie man es an ihrer Rolle, die Widerstandsfähigkeit
gegenüber
einer Infektion oder die Heilung einer Infektion zu fördern, erkennen
werden kann. Alternativ können
Immunantworten Autoimmunphänomene
erzeugen, die zu einer Allergie, d. h. Asthma, Urtikaria, zu einer
Transplantat-Wirt-Krankheit,
zu Glomerulonephritis, rheumatischem Fieber oder zu Lupus und rheumatoider
Arthritis führen.
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Hinsichtlich der gegenwärtigen Behandlung
von Entzündung
sind Corticosteroide wirksame entzündungshemmende Mittel, müssen aber
vorsichtig angewandt werden, da sie starke Immunsuppressiva und
Inhibitoren fibroblastischer Aktivität, die für eine Wundheilung und Knochenwiederherstellung
notwendig sind, darstellen. Außerdem
weisen Corticosteroide starke hormonelle Wirksamkeiten auf, und
ihre toxischen Nebenwirkungen involvieren eine Wechselwirkung mit
der Wundheilung und Knochenmatrixbildung, Natriumretention, dem
Kaliumverlust, der Knochendemineralisierung, der verminderten Resistenz
gegenüber
Infektion und mit Diabetes. Corticosteroide weisen auch Wirkungen
auf die Steroidbildung, Katarakte, den Blutdruck, die Proteinverwertung,
Fettverteilung, den Haarwuchs und den Körperbau auf. Alternativ wirken
die klinisch wirksamen NSAIDs, wie Aspirin, Indomethacin, Ibuprofen
etc., durch Inhibierung der Umwandlung von freien Fettsäuren zu
Prostaglandinen. Die Nebenwirkungen von NSAIDs schließen Magengeschwürbildung,
Nierendysfunktion und das Reye-Syndrom ein. Metabolite von Prostaglandin
können
entweder zerstörend
oder schützend
gegenüber
Zellen sein, abhängig
von der Struktur des Prostaglandins, das erzeugt wird oder pharmakologisch
verwertet wird, und der Verabreichungsroute, der Zelle oder dem
Gewebe, welche betroffen sind.
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Wie zuvor diskutiert, werden Leukotriene
zusammen mit der Fettsäure-Freisetzung als Teil
einer Phospholipidzellmembran-vermittelten Schädigung erzeugt, die durch eine
Phospholipase-Aktivierung gebildet wird. Diese Leukotriene, die
durch einen Membranphospholipidabbau erzeugt werden, schädigen Gewebe durch
eine direkte toxische Wirkung, Auswirkungen auf Ionenkanäle und durch
damit im Zusammenhang stehende Radikalbildung. Leukotriene schädigen Gewebe
auch durch indirekte Auswirkungen auf vaskuläres glattes Muskelgewebe oder
auf die vaskuläre
endotheliale Schicht über
Auswirkungen auf Plättchen,
WBC oder Endothelialzellen, oder sekundär durch Auswirkungen auf das
Zusammenziehen von glattem Muskelgewebe. Leukotriene sind verantwortlich
für das
Zusammenziehen von glattem Muskelgewebe, was zu Bronchospasmus und
Asthmaanfällen,
die bei einer Allergie oder infektiösem Asthma beobachtet werden,
führt.
Somit werden für
eine klinische Anwendung bei der Behandlung von Allergien, Asthma
und Gewebeschädigung und
Entzündung
Leukotrien-Inhibitoren anhaltend gesucht.
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Da der Phospholipase-aktivierte biochemische
Weg zur Bildung von Prostaglandinen und Leukotrienen, die von freien
Fettsäuren
abgeleitet sind, verzweigt ist, kann die Inhibierung eines Zweiges
dieses Weges, wie durch NSAIDs, zu einem Ungleichgewicht dieser
reaktiven Metaboliten führen.
Dieses Ungleichgewicht kann schließlich eine Entzündung verschlimmern
und eine Zeltschädigung
fördern,
wie es durch die Nebenwirkungen von Magengeschwüren, die sich durch NSAIDs
bilden können,
belegt wird.
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Aufgrund dieser nachteiligen Wirkungen
sowohl von Steroiden als auch von NSAIDs besteht ein großes klinisches
Interesse an der Identifizierung von Phospholipase-inhibierenden
Mitteln, die nicht die Nebenwirkungen von Steroiden oder NSAIDs
besitzen, aber die wie Corticosteroide den ersten Schritt, der zur
Erzeugung von schädlichen
Metaboliten, Fettsäuren
und Radikalen führt,
modulieren.
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Radikale, die von weißen Blutzellen,
durch eine Gewebeschädigung
oder durch Metabolismusprozesse erzeugt werden, sind hochreaktive
chemische Spezies, welche im Fall einer Gewebeschädigung meistens von
eingeatmetem Sauerstoff abgeleitet sind. Während er für die Energetik des Lebens
notwendig ist, ist Sauerstoff auch ein Gift, welches wie das chemisch
verwandte Superoxid oder wie Peroxide Gewebe zerstören kann,
anstatt es zu unterstützen.
Radikale, die von Sauerstoff abgeleitet sind, sind kritisch bezüglich der
Schädigung,
die durch Bestrahlung, Entzündung,
Reperfusionsgewebeschädigung
oder durch übermäßige Sauerstoffinhalierung
oder -aussetzung erzeugt wird. Radikale werden von weißen Blutzellen
verwendet, um infektiöse
Organismen zu zerstören,
können
aber unter Bedingungen des Schocks, der Infektion und der Ischämie, das
Gewebe, welches sie schützen
sollten, schädigen
oder zerstören.
Radikale, die durch Bestrahlung, Aussetzen an Sauerstoff, chemische
Mittel (d. h. alkylierende Mittel, Dioxin, Paraquat) oder Reaktionen
von weißen
Blutzellen induziert werden, können
Gewebe schädigen
oder an Mutationsveränderungen
beteiligt sein, die mit dem Altern, der Bestrahlungs- oder Chemotherapieschädigung,
der Entwicklung von Krebs und hyperimmuner proliferativer Krankheit
wie rheumatoider Arthritis im Zusammenhang stehen. Außerdem können diese
reaktiven chemischen Spezies über
eine Oxidation von Proteinen die Empfindlichkeit von Proteinen gegenüber einem
Proteaseverdau verstärken.
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Der genaue pathologische Mechanismus
vieler Hautentzündungen
wie atopischer Dermatitis sind nicht bekannt, sie involvieren aber
wahrscheinlich Entzündungszellen,
welche PLA2 absondern oder darauf reagieren
können.
Allergische Krankheiten involvieren Gewebemastzellen, welche durch
PLA2 geprimt oder zur Freisetzung ihrer
entzündlichen
Granuluminhalte wie Histamin getriggert sein können. Diese Zellen setzen auch
zusätzliches
PLA2 frei. Es werden Inhibitoren von PLA2 benötigt,
welche die Haut nach einer topischen Anwendung ausreichend durchdringen
und eine verlängerte
anti-PLA2-Aktivität besitzen.
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Zuvor veröffentlichte Untersuchungen
haben hohe Level an proentzündlicher
PLA2 bei Bandscheibenhernien bei Menschen
gezeigt. Das isolierte Enzym ist in Kultur und herausgeschnittenem
Ischiasnerv toxisch gegenüber
Spinalganglionzellen. Während
man nicht auf diese Aussage festgelegt werden möchte, wird angenommen, das
PLA2 eine Entzündung und eine Nervengewebeschädigung bei
einer Rückenmarksschädigung und
bei einer Ischiasnerventzündung
vermitteln kann, und dass es auch eine Vielzahl an neurologischen Entzündungsbedingungen
vermitteln kann. Kürzlich
haben Stephenson et al. (Neurobiology of Disease 3: 51–63 (1996)
eine erhöhte
zytosolische PLA2-Aktivität in Gehirnen
mit Alzheimer-Krankheit beobachtet.
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PLA2 weist
auch die Fähigkeit
auf, ein ernstes verzögertes
Neurotoxizitätssyndrom,
einschließlich
einer beträchtlichen
kortikalen und subkortikalen Schädigung
von Vorderhirnneuronen und Faserwegen, zu induzieren, wenn es intrazerebroventrikulär injiziert
wird, wie es von Clapp et al. (Brain Research 693: 101–111, 1995)
beschrieben wird, wovon die Gesamtheit hierin durch Bezugnahme darauf
enthalten ist. Wir haben auch beobachtet, dass Präparationen
von PLA2 und Diskus-Homogenate vom Menschen,
die Extrakte des Bandscheibenkerns (Nucleus Pulposus) enthalten,
entzündlich
sind, wenn sie in die Mauspfote injiziert werden und ein Ödem induzieren.
Ein Ödem,
das durch ein Diskus-Homogenat vom Menschen induziert ist, ist zwischen 1
und 3 h maximal und hält
für mindestens
6 h an. Diese Ergebnisse stützen
die Hypothese, dass ein Vortreten (leakage) des Bandscheibenkerns aufgrund
von Bandscheibenhernie eine Entzündung
bei Diskus-Erkrankung beim Menschen fördern kann. Demgemäß werden
Inhibitoren von PLA2-vermittelten entzündlichen Prozessen benötigt. Solche
Inhibitoren sollten die Entzündung
und den daraus folgenden Schmerz und die Unannehmlichkeiten lindern,
die mit der Diskus-Erkrankung und anderen neurologischen Entzündungsbedingungen
im Zusammenhang stehen.
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Gewebe, die von Tieren herausgeschnitten
werden, um anschließend
in Empfänger
transplantiert zu werden, zeigen häufig nach der Transplantation
während
der Reperfusion von ischämischen
Gewebe Schädigungen
auf. Sowohl Ischämie
als auch Reperfusion erhöhen
die PLA2-Aktivität und -Freisetzung, was zu
Entzündungsprozessen
mit einer beträchtlichen
Aktivierung des vaskulären
Endotheliums führt.
Diese Prozesse erniedrigen die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen
Transplantation, wobei das Auftreten einer Abstoßung und das Erfordernis für eine zusätzliche
immunosuppressive Therapie erhöht
werden. Solche Probleme erhöhen
die Morbidität
und Mortalität
in großem
Maße,
erhöhen
die Kosten der Behandlung und der Versicherung und führen zu
einem Zeitverlust. Es werden Wirkstoffe benötigt, die die PLA2-Aktivität inhibieren
und die Erhaltung des Gewebes vor einer Transplantation verbessern,
wobei eine Ischämie-Reperfusions-Schädigung verringert
wird.
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Infektionen, die durch Parasiten
verursacht sind, stellen ein Hauptproblem der öffentlichen Gesundheit für Menschen
und Tiere in der ganzen Welt dar, welches jährlich zu einem beträchtlichen
Auftreten von Krankheit, Leiden und Tod führt. Parasiten wie solche,
die Malaria verursachen, und andere Protozoen-Parasiten von Tieren
und Menschen, sind insbesondere problematisch. Wir haben gefunden,
dass der PLA2-Inhibitor, Chinacrin (Mepacrin)
die Häutung
von Larvenformen eines Tierfilarids beträchtlich verringert. Es werden
neue Verbindungen, die die PLA2-Aktivität wirksam
inhibieren, zur Anwendung bei Parasiten wie solchen, die Malaria verursachen, und
anderen Protozoen-Parasiten, die schädlich für Tiere und Menschen sind,
benötigt.
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In einer vorausgehenden Studie von
Clay et al. (Third International Congress: Eicosanoids & Other Bioactive
Lipids in Cancer, Inflammation & Radiation
Repair, Abstract #162) wurde berichtet, dass das Produkt der PLA2-Aktivierung, 1-Acyllysophospholipid, welches
die Membranfluidität
beeinflusst, sich in aufbewahrtem Blut ansammelt und durch weiße Blutzellen
(WBC) aufgenommen werden kann, und verwendet werden kann, um Plättchenaktivierenden
Faktor (PAF) herzustellen, wobei die WBC während der Aufbewahrung "geprimt" werden und die Schädigung während einer
anschließenden
Transfusion gefördert
wird. Es wurde vorgeschlagen, dass eine erhöhte PLA2-Aktivität die Zellen
während
der Aufbewahrung pertubieren kann. Es werden Verbindungen benötigt, die
Blutzellen und andere Zellen während
der Aufbewahrung schützen,
so dass diese Zellen, wenn sie verwendet werden, keine Probleme
verursachen.
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Demgemäß werden Verbindungen und Verfahren
zur Verwendung von Verbindungen benötigt, welche einen Schutz gegen
die schädlichen
Wirkungen von einer PLA2-Aktivierung bieten.
Diese Verbindungen sollten in der Lage sein, PLA2 zu
inhibieren, wobei die PLA2-Metabolite verringert
werden, welche Substrate für
die Cyclooxygenase, 5-Lipooxygenase, 12-Lipooxygenase und andere
enzymatische Wege sind, welche zur Bildung von zyklischen Endoperoxiden,
Prostaglandinen (wie Prostacyclin und Thromboxan), Leukotrienen
und Plättchen-aktivierendem
Faktor führen.
Diese Verbindungen sollten Entzündungsprozesse
und die Erzeugung von Radikalen in einer Vielzahl von Geweben und
Zellen verringern. Sie sollten in vivo (topisch, oral, durch Injektion
und über
andere Mittel), ex vivo und in vivo verabreicht werden können, und
sie sollten auch eine niedrige oder keine Toxizität aufweisen.
Diese Verbindungen sollten verschiedene Löslichkeiten in Lipidsystemen
und wäßrigen Systemen
zeigen, abhängig
von der Art der Verabreichung und dem gewünschten Target.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
beides, Lipid- und/oder wasserlösliche
Verbindungen bereit, welche PLA2-Inhibitoren
mit Antioxidans-Eigenschaften und/oder entzündungshemmenden Eigenschaften
sind. Diese Erfindung stellt bioaktive Verbindungen bereit, welche
Oligomere (Dimere, Trimere und Tetramere etc.) von Fettsäureeinheiten
sind, die die PLA2-Aktivität inhibieren.
Die Ausdrücke
Dimer, Trimer, Tetramer und Pentamer, wie sie durchweg in der vorliegenden
Beschreibung verwendet werden, definieren die Anzahl an Fettsäureeinheiten,
die in dem bestimmten Molekül
vorhanden sind. Das heißt,
dass ein Dimer zwei Fettsäureeinheiten
aufweist, ein Trimer drei aufweist, ein Tetramer vier aufweist,
ein Pentamer fünf
aufweist etc. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung besitzen
mindestens eine Doppelbindung, damit ihre entzündungshemmenden und zytoprotektiven
oder gewebeprotektiven Wirkungen verstärkt werden.
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Die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung können
zur Behandlung oder zur prophylaktischen Inhibierung Phospholipase-vermittelter
Schädigungen
und/oder von Schädigungen
aufgrund von Oxidation verwendet werden. In einem bestimmten Fall
stellt die vorliegende Erfindung Mittel zum Verhindern und/oder
Behandeln einer Entzündung
und Zeltzerstörung
in Säugergewebe
und zum Schutz und zum Bewahren von biologischem Material wie Zellen,
Gewebe, Organe und Fluide, die von Tieren und Menschen erhalten
werden, bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch Mittel zum
Schutz und zum Bewahren von Nahrungsmitteln, die von Tieren und
Pflanzen erhalten werden, und von Cellulose-Produkten und Holz-Produkten,
die von Pflanzen erhalten werden, bereit. Die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung schützen
Phospholipidzellmembranen und Proteine vor den Wirkungen einer oxidativen Schädigung oder
des Alterns. Diese Verbindungen der vorliegenden Erfindung inhibieren
auch Radikalreaktionen und stabilisieren dabei die Proteine zur
Beibehaltung der biologischen Halbwertszeit, Antikoagulanz-Wirkung
und Nahrungsmittelkonservierung.
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Insbesondere stellt die vorliegende
Erfindung pharmakologisch wirksame Antiphospholipase-Verbindungen
bereit. Diese Verbindungen sind in einem geeigneten Träger löslich und/oder
dispergierbar. Die Verbindungen können als Oligomere wie Dimere,
Trimere, Tetramere etc. oder als Kombinationen davon vorliegen.
Gemäß der vorliegenden
Erfindung weisen die Verbindungen mindestens zwei Fettsäureeinheiten
auf und enthalten mindestens eine ungesättigte Doppelbindung. Jede
Fettsäureeinheit
kann eine Vielzahl von Gestalten annehmen, kann die gleichen oder
verschiedene funktionelle Gruppen besitzen, kann verschieden lang sein.
In einer bevorzugten Form können
die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine Säuregruppe
oder jede beliebige Salzform davon enthalten. Die Verbindungen der
vorliegenden Erfindung können
auch in ionisierter Form vorliegen.
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Demgemäß ist ein Gegenstand der vorliegenden
Erfindung, Zusammensetzungen bereitzustellen, die die Aktivität des Enzyms
PLA2 inhibieren.
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Es ist ein damit im Zusammenhang
stehender Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verbindungen bereitzustellen,
die die Level an Produkten der Enzym-Wege von Cyclooxygenase, 5-Lipoxygenase,
12-Lipoxygenase, Prostacyclinoxycyclase, Thromboxansynthase und
Prostaglandinisomerase durch Inhibierung der Aktivität von PLA2 verringern.
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Es ist auch ein Gegenstand der vorliegenden
Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung von mit
der PLA2-Aktivität im Zusammenhang stehenden
Bedingungen bereitzustellen.
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Noch ein weiterer Gegenstand der
vorliegenden Erfindung ist, Verbindungen zur Behandlung oxidativer
und durch Radikale verursachter Schädigungen von Zellen, Geweben
und Organen in vitro und in vivo bereitzustellen.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung von
Entzündungen
bereitzustellen.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung entzündlicher
Prozesse bereitzustellen.
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Es ist auch ein Gegenstand der vorliegenden
Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der oralen und topischen
Behandlung von Arthritis bereitzustellen.
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Noch ein weiterer Gegenstand der
vorliegenden Erfindung ist, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung
von Schmerz bereitzustellen.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist, Verbindungen zur Verwendung bei der oralen und topischen
Behandlung von einer Vielzahl von Bedingungen bereitzustellen, wie
Bedingungen einschließlich
der folgenden, aber nicht beschränkt
darauf: Sudeck-Dystrophie; Entzündung
des zentralen und peripheren Nervensystems, Krankheiten, die mit
der Entzündung
des Nervensystems im Zusammenhang stehen, einschließlich aber
nicht beschränkt
auf Alzheimer-Krankheit, Entzündung
der Spinatnerven, Viszeralnerven und Hirnnerven; entzündliche
Radikulopathie; Rückenschmerz
einschließlich
des Schmerzes des unteren Rückens;
Myofazial-Schmerzsyndrome; Entzündung
der Bindegewebe einschließlich
Meninges, entzündete
und erkrankte Zwischenwirbelgelenke, Bandscheibenhernie, Diskus-Erkrankung,
gerissener und verletzter Faserring, Erkrankungen der Gelenke, Bänder, Knorpel
und Synovialmembranen; Mastozytose; Schock einschließlich septischer
Schock, anaphylaktischer Schock, anaphylaktischer Schock, der durch Radiokontrastmittel-Verabreichung
verursacht ist und Schock, der durch bakterielle Infektionen verursacht
ist; bakterielle Infektionen; Urämie;
Autoimmunkrankheiten; Parasiteninfektionen einschließlich aber
nicht beschränkt
auf Malaria; Entzündungen
einschließlich
allergischer Entzündung;
Hautentzündung,
Juckreiz und andere dermatologische Krankheiten aufgrund von allergischen
Reaktionen, trockener Haut, Erythem, Sonnen-, Nuklear- und anderen
Formen von Bestrahlung, Hauterythem durch scharfen Wind, Akne, Psoriasis,
Ekzeme, Reaktionen auf Chemikalien und Toxine, Kontaktdermatitis
und Reaktionen auf Pflanzen einschließlich aber nicht beschränkt auf
Giftefeu, Gifteiche, Giftsumach; Bisse von Insekten einschließlich aber
nicht beschränkt
auf Moskitos, Feuerameisen, Chigger, Zecken, Bienen, Spinnen, Flöhe und Fliegen;
Bisse von Reptilien, insbesondere giftigen Reptilien, Amphibien
und anderen Tieren; Kontakt mit verschiedenen Tieren mit Gift auf
ihrer Haut wie giftige Fröschen;
Pruritus, der mit lokaler dermatologischer oder systemischer Krankheit
im Zusammenhang steht; Verhinderung von Gewebeischämie einschließlich Gewebe
in vivo und Gewebe, welches zur Transplantation vorgesehen ist,
Verhindern von Ischämie-Reperfusions-Schädigung,
Verhindern von Ischämie-Repertusions-Schädigung beim
Durchführen
der Reanimation von hypovolämischem
Schock, renaler Ischämie,
Myokardinfarkt, Angina und Herzischämie; endotheliale Entzündung, Herztoxizität, die mit
der Verabreichung von Antikrebszusammensetzungen in Zusammenhang
steht, Inhibierung koronarer oder zerebraler Restenose, die auf
angioplastische oder andere vaskuläre Vorgehensweisen folgt, Inhibierung
der Plättchenaktivität, insbesondere
in Gefäßen nach
verschiedenen Vorgehensweisen wie der Angioplastik und nach dem
Einbringen von Kathetern, Bypässen
und anderen Vorrichtungen, Inhibierung von Thrombin-aktivierter
Plättchenaggregation; Lungenkrankheiten
einschließlich
aber nicht beschränkt
auf Asthma, zystische Fibrose, Entzündung der Lungen, die auf eine
Ischämie
des Gastrointestinalsystems folgt, Schocklunge und andere allergische
und entzündliche
Reaktionen des Lungensystems einschließlich der Entzündung von
Geweben des oberen Atmungssystems, allergische Rhinitis und Atemnotsyndrom
des Neugeborenen; Entzündung
des Gastrointestinalsystems einschließlich aber nicht beschränkt auf
Crohn-Krankheit, eosinophile Gastrointeritis, Peritonitis, Cholitis ulcerosa,
Geschwüre
des Dünndarms
und des Magens, Ösophagitis,
Magenentzündung,
entzündliche Darmerkrankung;
Okularentzündung;
Konservierung des Vollbluts; Konservierung von Geweben, Zellen und Organen
zur Transplantation und Schutz von Mitochondrien.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung von
Entzündungen,
die durch Bisse von Insekten, Reptilien, Amphibien und anderen Tieren,
insbesondere giftigen Tieren wie giftigen Schlangen verursacht sind,
bereitzustellen.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist, Verbindungen zur Verwendung bei der Inhibierung der
Plättchenfunktion
bereitzustellen.
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Es ist ein Gegenstand der vorliegenden
Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der Verhinderung und
Behandlung der akuten und chronischen Abstoßung von Transplantaten und
zur Behandlung der Transplantat-Wirt-Krankheit und Autoimmunkrankheiten bereitzustellen.
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Es ist ein weiterer Gegenstand der
vorliegenden Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung
von Tumorleiden bereitzustellen.
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Es ist ein weiterer Gegenstand der
vorliegenden Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der topischen
Behandlung verschiedener Formen von Arthritis und anderen entzündlichen
Krankheiten einschließlich
aber nicht beschränkt
auf rheumatoide Arthritis, entzündliche
Arthropathie, Osteoarthrose, Gicht und Lupus bereitzustellen.
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Es ist ein weiterer Gegenstand der
vorliegenden Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung
von Parasiteninfektionen, einschließlich aber nicht beschränkt auf
Toxoplasmose, Malaria, Naegleria fowleri, Dilofilaria immitis, Nematoden
und pathogene Protozoen wie Toxoplasma gondii, Falciparum-Malaria, Amöbiasis,
Amöben
und Kryptosporidia bereitzustellen.
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Es ist ein weiterer Gegenstand der
vorliegenden Erfindung, Verbindungen zur Verwendung bei der Verstärkung des
Bewegungsbereichs und der Verringerung des Schmerzes bei Patienten
mit Sudeck-Dystrophie bereitzustellen.
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Diese und weitere Gegenstände, Merkmale
und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach der folgenden
detaillierten Beschreibung offensichtlich sein.
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Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
-
Cis-ungesättigte, im Gegensatz zu gesättigten
Fettsäuren,
inhibieren in vitro PLA2-Aktivitäten, die
von humanen Plättchen
und humanen polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) abgeleitet
sind. Die PLA2-Aktivität wird durch Öl-, Linol-
und Arachidonsäuren
ungefähr
in gleichem Ausmaß inhibiert,
was anzeigt, dass das Vorhandensein einer einzelnen cis-Doppelbindung
so inhibitorisch ist wie mehrere cis-Doppelbindungen. Im Gegensatz
dazu sind Fettsäuren,
die trans-Doppelbindungen enthalten, oder Methylester von cis-ungesättigten
Fettsäuren
weniger inhibitorisch für
die PLA2-Aktivität. Somit wird angenommen, dass
die bevorzugten strukturellen Charakteristika zur Inhibierung der
in vitro-PLA2-Aktivität durch nicht veresterte Fettsäuren mindestens
eine Doppelbindung einschließen. Ölsäure inhibiert
die PLA2-Aktivität in vitro
aufgrund des Vorhandenseins einer einzelnen Doppelbindung an der
C-9-Position. Die Oxidation des sarkoplasmatischen Retikulums von
Muskel und von Phospholipidmembranen macht diese gegenüber einem
Phospholipase-Abbau anfällig.
Phospholipidmembranen, die an bestimmten Stellen oxidiert wurden,
können
intakt erscheinen und ihre funktionelle Aktivität beibehalten, aber ihre Oxidation
macht sie empfindlich gegenüber
einem Abbau und einer Zerstörung
durch PLA2 oder andere Phospolipasen von
endogenen oder exogenen Quellen.
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Die Beobachtungen veranschaulichen
die verstärkte
Empfindlichkeit von Phospholipidmembranen gegenüber Phospholipase, die durch
oxidative und Radikal-vermittelte Veränderungen in Zellmembranen
verursacht ist und/oder cis-ungesättigte Fettsäuren wurden
gemäß der vorliegenden
Erfindung bei der Gestaltung neuer entzündungshemmender und zytoprotektiver
Mittel verwendet. Die vorliegende Erfindung stellt somit einen biochemischen
und synthetisch-organischen Ansatz zur Bekämpfung der Expression von PLA2-Enzymen bereit,
welche für
die Beibehaltung der Membranstruktur essentiell ist.
-
Obwohl man nicht durch die folgende
Annahme festgelegt werden möchte,
wird angenommen, dass die Anzahl vorhandener Methylen-unterbrochener
ungesättigter
Doppelbindungen direkt mit der Empfindlichkeit von Fettsäuren gegenüber Oxidation
im Zusammenhang steht. Dies steuert die Fähigkeit von ungesättigten
Fettsäuren,
als Antioxidantien zu wirken. Diese Eigenschaft, zusammen mit der
anti-PLA2-Aktivität der Fettsäureeinheit-Verbindungen der
vorliegenden Erfindung, erweitert das Ausmaß der entzündungshemmenden und zytoprotektiven
Wirkung der hierin offenbarten Mittel beträchtlich. Es ist eine Eigenschaft
der Doppelwirkung dieser Verbindungen, d. h. ihrer Wirkung als PLA2-Inhibitoren mit variierender Antioxidans-Aktivität, durch die
das Spektrum entzündungshemmender
Aktivität
in Modellsystemen bereitstellt wird, welche eine direkte Anwendbarkeit
bei Zytoprotektion und der Kontrolle von Entzündung und Pathophysiologie
besitzen.
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Eine nicht funktionelle Alkylkette
oder Gruppe ist als Kohlenwasserstoffgruppe bekannt, da sie nur
C-C und C-H-Einzelbindungen enthält.
Eine nicht funktionelle Alkylkette enthält daher die maximal mögliche Anzahl an
Wasserstoffatomen pro Kohlenstoffatom, welche durch -CnH2n+1 dargestellt wird. Eine funktionalisierte
Alkylkette oder Gruppe weist für
ein oder mehrere Wasserstoffe an der Alkylkette substituierte ein
oder mehrere Atome oder Gruppen von Atomen auf, welche ein charakteristisches
chemisches Verhalten besitzen. Diese Atome oder Gruppen von Atomen,
welche ein charakteristisches chemisches Verhalten besitzen, sind
auch als funktionelle Gruppen bekannt. Bei diesen funktionellen
Gruppen sind C=C, OH, COOH, SO3H, PO3H, NH2, -O- und
Halogene eingeschlossen.
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Zusammenfassend ist eine einzelne
Doppelbindung in einer Fettsäureeinheit-Verbindung ausreichend,
um die PLA2-Aktivität in vitro und in situ zu inhibieren.
Mehrere Doppelbindungen liefern den zusätzlichen Vorteil einer Erhöhung der
potentiellen Antioxidans-Aktivität
zusammen mit der PLA2-inhibitorischen Wirkung.
Die vorliegende Erfindung stellt somit Verbindungen bereit, die
sowohl durch anti-PLA2 als auch variierende
Antioxidans-Aktivität
gekennzeichnet sind, um die entzündungshemmende
und zytoprotektive Wirkung zu maximieren, welche den Schlüssel für den klinischen
Wert der Verbindungen der vorliegenden Erfindung darstellt.
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Zusätzlich zu der Inhibierung der
PLA2-Aktivität schützt die Antioxidans-Wirkung
dieser Verbindungen Proteine, welche aufgrund von Oxidation zunehmend
empfindlich gegenüber
dem Angriff von Proteasen werden. Somit besitzen die zytoprotektiven
PLA2-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung,
welche auch eine Antioxidans-Aktivität besitzen, sowohl den Vorteil,
dass sie Membranphospholipid stabilisieren, als auch einen Proteinabbau
oder eine Denaturierung inhibieren oder verhindern. Dies legt nahe,
dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung so wirken, dass
eine Entzündung
bei Beginn minimiert wird und auch der entzündliche Prozess in seinem Verlauf
unterbrochen wird.
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Die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung blockieren die Arachidonsäure-Freisetzung von humanen polymorphkernigen
Zellen und Endothelialzellen, eine Reaktion, die durch eine zelluläre und sekretorische PLA2-Aktivität
vermittelt ist. Somit sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung
potente, reversible PLA2-Inhibitoren, und
somit inhibieren diese Mittel die proentzündliche Reaktion humaner PMN
und anderer Entzündungszellen
durch Inhibierung der zellulären
und sekretorischen PLA2-Aktivität. Außerdem inhibieren die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung in verschiedenem Ausmaß die Radikalaktivität in Zellen
und Geweben, die an dem Entzündungsprozess
beteiligt sind.
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In einem bestimmten Fall stellt die
vorliegende Erfindung pharmakologisch wirksame, anti-Phospholipase-Verbindungen
bereit. Vorzugsweise sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung
wasser- oder lipidlösliche
Antioxidantien. Die bevorzugten Verbindungen weisen mindestens zwei
Fettsäureeinheiten
auf und enthalten mindestens eine ungesättigte Doppelbindung. Die Fettsäureeinheiten
können
in mehreren Merkmalen unterschiedlich voneinander sein, einschließlich aber
nicht beschränkt
auf chemische Zusammensetzung, funktionelle Gruppen, Grad an Ungesättigtheit
und Länge
der Kohlenwasserstoffkette. Die Verbindungen können auch mindestens eine organische
Gruppe, eine Aktivsäuregruppe
oder jede beliebige Salzform oder ionisierte Form davon enthalten.
Die Erfindung umfasst eine Vielzahl an Konfigurationen, einschließlich Oligomere wie
Dimere, Trimere, Tetramere und Kombinationen davon. Mehrere dieser
Verbindungen, die gemäß der Prinzipien
und Konzepte der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, können wie
in den folgenden spezifischen Beispielen dargelegt hergestellt werden.
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Die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung werden nicht allgemein durch Pankreasenzyme hydrolysiert
und unterscheiden sich von Glycerin-basierenden Verbindungen in
ihrer Chemie und ihrem Metabolismus. Z. B. haben wir beobachtet,
dass eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, PX-18, in vitro
resistent gegenüber
dem Abbau durch die kommerziell erhältliche Pankreasenzympräparation,
Pankreatin, die von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhalten
wurde, ist. Die Beständigkeit
von PX-18 gegenüber
dem Metabolismus durch Pankreasenzyme stützt die Stabilität davon
nach der oralen Verabreichung.
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Die Oligomere (Dimere, Trimere, Tetramere,
Pentamere etc.) ungesättigter
Fettsäuren
und andere Verbindungen, die mindestens einen ungesättigten
geradkettigen Fettsäurerest
wie oben beschrieben besitzen, bewirken grundlegende Membranphospholipid-Reaktionen
des Phospholipaseinduzierten Abbaus und der Radikalperoxidation.
Die hierin dargelegten Daten bestätigen durch experimentelle
Ergebnisse, dass diese Verbindungen potente entzündungshemmende und zytoprotektive
Mittel sind.
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Die geeignete Dosis einer wirksamen
Menge der ungesättigten
Fettsäureeinheit-Verbindungen
der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Säugern einschließlich Menschen
gegen Phospholipase-vermittelte Schädigung und/oder Entzündung sollte
im Bereich von 1–75
mg pro kg (mg/kg) Körpergewicht
und vorzugsweise 2–50
mg/kg Körpergewicht
sein, wobei der Bereich von 10–40
mg/kg Körpergewicht
mehr bevorzugt ist, wenn die Verbindung oral oder intraperitoneal
(IP) verabreicht wird. Wenn sie intravenös verabreicht wird, sollte
die Dosierung 50% der oralen oder IP-Dosierung betragen, um den
gleichen Level an Wirkstoff im Blut zu erreichen. Die beschriebene
Dosierung ist auch zur Verhinderung der humanen Plättchenaggregation oder
der Blutgerinnung geeignet. Wie es dem Fachmann bekannt ist, können therapeutische
Dosen, die mittels der Menge pro kg Körpergewicht oder Oberflächenbereich
ausgedrückt
sind, von Säuger
zu Säuger,
einschließlich
Menschen, extrapoliert werden. Die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung können
auch als Aerosol verabreicht werden, wie durch Nasenspray, um eine
Entzündung
der Nasenhöhlen,
des Nasenrachenraums und benachbarter Bereiche zu behandeln, oder
als inhalierte Formulierungen, um eine Entzündung der oberen und unteren
Atemwege zu behandeln.
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Die Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung können
analog zu anderen topischen Zusammensetzungen, die zur Verwendung
bei Säugern
angepasst sind, auf jede zweckdienliche Weise zur Verabreichung
formuliert werden. Diese Zusammensetzungen können auf jede zweckdienliche
Weise mit Hilfe von jedem einer breiten Vielfalt pharmazeutischer
Träger
oder Vehikel verwendet werden. Die Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung, die oben beschrieben werden, können unter Verwendung von Formulierungsverfahren,
die dem Fachmann im Fachgebiet bekannt sind, als pharmazeutisch
annehmbare Formulierungen bereitgestellt werden. Diese Formulierungen
können
durch Standardverabreichungswege verabreicht werden. Im Allgemeinen
können
die Kombinationen über
den topischen, transdermalen (einschließlich elektrophonetischer Verabreichung),
bukkal, oral, rektal oder parenteral (z. B. intravenös, subkutan
oder intramuskulär)
verabreicht werden. Zusätzlich
können
die Kombinationen in bioabbaubare Polymere eingebaut werden, um
eine anhaltende Freisetzung der Verbindung zu erlauben, wobei die
Polymere in Nähe
der Stelle implantiert werden, an welcher die Wirkstoffverabreichung
erwünscht
ist, z. B. an der Stelle eines Tumors. Die bioabbaubaren Polymere
und ihre Verwendung sind z. B. detailliert in Brem et al., J. Neurosurg.
74: 441–446
(1991) beschrieben.
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Ein pharmazeutisch annehmbares Lösungsmittel
ist eines, welches unter den verwendeten Bedingungen nicht toxisch
und nicht reizend ist, und welches leicht in eine beliebige der
klassischen Wirkstoffformulierungen wie Pulver, Cremes, Salben,
Lotions, Gels, Schäume,
Aerosole, Lösungen
und dgl. formuliert werden kann. Insbesondere geeignete Lösungsmittel
schließen
Wasser, Ethanol, Aceton, Glycerin, Propylencarbonat, Dimethylsulfoxid
(DMSO) und Glykole wie 1,2-Propylendiol, d. h. Propylenglykol, 1,3-Propylendiol,
Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 100 bis 10000,
Dipropylenglykol etc. und Mischungen der zuvor erwähnten Lösungsmittel
miteinander ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
-
Eine topische Creme kann als halbfeste
Emulsion von Öl
in Wasser oder Wasser in Öl
hergestellt werden. Eine Creme-Basisformulierung ist per Definition
eine Emulsion, welche ein Zweiphasensystem ist, in welchem eine
Flüssigkeit
(z. B. Fette oder Öle)
als kleine Tröpfchen
in einer anderen Substanz (z. B. einer Glykol-Wasser-Lösungsmittelphase)
dispergiert ist, welche als Primärlösungsmittel
verwendet werden kann. Eine Creme-Formulierung kann Fettalkohole,
oberflächenaktive
Mittel, Mineralöl
oder Petrolatum und andere typische pharmazeutische Hilfsmittel
wie Antioxidantien, antiseptische Mittel oder kompatible Hilfsmittel
enthalten. Eine typische Creme-Basisformulierung ist wie folgt:
-
Eine "klassische" Salbe ist eine halbfeste wasserfreie
Zusammensetzung, welche Mineralöl,
weißes Petrolatum,
ein geeignetes Lösungsmittel
wie Glykol enthalten kann, und welche Propylencarbonat und andere
pharmazeutisch geeignete Additive wie oberflächenaktive Mittel z. B. Span
und Tween oder Wollfett (Lanolin) zusammen mit Stabilisierungsmitteln
und anderen Hilfsmitteln wie oben erwähnt enthalten kann. Das folgende
ist ein Beispiel einer typischen "klassischen" Salbenbasis:
-
Zusätzlich können die Zusammensetzungen
als orale, parenterale, subkutane, intravenöse, intraartikuläre, intramuskuläre, intraperitoneale,
in die Wunde verabreichte und andere systemische Zusammensetzungen
formuliert werden. Abhängig
von der beabsichtigten Weise können
die Zusammensetzungen in Form fester, halbfester oder flüssiger Dosierungsformen
wie z. B. Tabletten, Zäpfchen,
Pillen, Kapseln, Pulver, Flüssigkeiten,
Suspensionen oder dgl., vorzugsweise in Dosiseinheitsformen, die
für eine
Einzelverabreichung genauer Dosierungen geeignet sind, vorliegen.
-
Die Zusammensetzungen werden einen üblichen
pharmazeutischen Träger
oder Hilfsstoff und eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung
der vorliegenden Erfindung enthalten, und zusätzlich können sie andere medizinische
Mittel, pharmazeutische Mittel, Träger, Hilfsmittel etc. enthalten.
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Die Menge an verabreichtem Wirkstoff
wird natürlich
von dem behandelten Menschen oder Tier, der Schwere der Beschwerden,
der Art der Verabreichung und der Beurteilung des behandelnden Arztes
abhängen.
-
Typische Zusammensetzungen enthalten
0,01 bis 95 Gew.% Wirkstoff, wobei der Rest ein oder mehrere annehmbare,
nicht toxische Träger
darstellt. Der prozentuale Anteil an Wirkstoff wird natürlich von
der Dosierungsform und der Art der Verabreichung abhängen.
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Für
feste Zusammensetzungen können
konventionelle, nicht toxische feste Träger verwendet werden, z. B.
Mannitol, Lactose, Stärke,
Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glycose, Saccharose, Magnesiumcarbonat
in pharmazeutischer Qualität
eingeschlossen. Der wie oben definierte Wirkstoff kann unter Verwendung
von z. B. Polyalkylenglykolen und Propylenglykol als Träger zu Zäpfchen formuliert
werden. Flüssige
pharmazeutisch verabreichbare Zusammensetzungen können z.
B. durch Auflösen,
Dispergieren etc. eines Wirkstoffes wie oben definiert und optionaler
pharmazeutischer Hilfsmittel in einem Träger wie Wasser, Salzlösung, wäßriger Dextrose,
Glycerin, Ethanol und dgl. hergestellt werden, um eine Lösung oder
Suspension zu bilden. Wenn erwünscht,
kann die zu verabreichende pharmazeutische Zusammensetzung auch
kleinere Mengen nicht toxischer Hilfssubstanzen wie Benetzungs-
oder Emulgiermittel, pH-pufternder Mittel und dgl., z. B. Natriumacetat,
Sorbitanmonolaurat, Triethanolamin, Natriumacetat, Triethanolaminoleat
etc. enthalten. Gegenwärtige
Verfahren zur Herstellung solcher Dosierungsformen sind bekannt
oder werden dem Fachmann offensichtlich sein, siehe z. B. Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 15. Ausgabe, 1975.
Die zu verabreichende Zusammensetzung oder Formulierung wird in
jedem Fall eine Quantität
des/der Wirkstoffe) in einer solchen Menge enthalten, die wirksam
ist, um die Symptome des zu behandelnden Patienten zu lindern.
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Für
die orale Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung
wird eine pharmazeutisch annehmbare, nicht toxische Zusammensetzung
gebildet, indem beliebige der normalenrweise verwendeten Hilfsmittel
verwendet werden, wie Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin,
Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat pharmazeutischer
Qualität
und dgl. Solche Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen,
Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Formulierungen zur
anhaltenden Freisetzung und dgl. an. Solche Zusammensetzungen können 2%
bis 95% Wirkstoff, vorzugsweise 5% bis 90% enthalten.
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Die parenterale Verabreichung ist
im Allgemeinen durch Injektion, entweder subkutan, intramuskulär oder intravenös, gekennzeichnet.
Injektionsmittel können
in konventionelle Formen gebracht werden, entweder als flüssige Lösungen oder
Suspensionen, feste Formen, die geeignet sind, um vor der Injektion
in Lösung oder
Suspension gebracht zu werden, oder als Emulsionen. Geeignete Hilfsmittel
sind z. B. Wasser, Salzlösung,
Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dgl. Zusätzlich können die zu verabreichenden
pharmazeutischen Zusammensetzungen, wenn erwünscht, auch kleinere Mengen
nicht toxischer Hilfssubstanzen wie Benetzungs- oder Emulgationsmittel,
pH-puffernde Mittel und dgl. wie z. B. Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat,
Triethanolaminoleat etc. enthalten.
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Salben für eine topische Anwendung können hergestellt
werden, indem 0,1 bis 10% der Verbindung als Öl oder Salzform in eine Salbenbasis
eingebracht werden, die Emulgationsmittel wie Stearinsäure, Triethanolamin
und/oder Cetylalkohol enthält.
Die Formulierung kann auch Bestandteile wie Glycerin, Petrolatum, Wasser
und Konservierungsstoffe enthalten, wenn es erforderlich ist.
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Wasser-basierende Lotionen können die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung als Öl oder Feststoff in Mengen
im Bereich von 0,1 Vol.% bis 5,0 Vol.% enthalten. Solche Lotionen
können
Glycerin und/oder Bentonit als Suspensionsmittel enthalten, wie
es im Fachgebiet wohlbekannt ist. Die vorliegende Erfindung kann
auch in Cremes eingebracht werden.
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Die Verbindungen können auch
in klassische (Ein- oder Zweiphasen) oder nicht klassische (wäßrige Emulsion)
Aerosolformulierungen eingebracht erden. Solche Formulierungen schließen die
Verbindungen und einen gegneten Treibmittelträger ein, in welchem die Verbindungen
gelöst
oder verteilt erden. In der klassischen Form werden die Wirkstoffe
im Allgemeinen als Öldiwersion
oder in Lösung
in einem organischen Lösungsmittel
wie Ethanol verwendet. In der nicht klassischen Form wird der Wirkstoff
in Wasser gelöst.
In jedem Fall kann die Konzentration des Wirkstoffes im Träger ungefähr 0,1 bis
10 Gew.% oder Vol.% sein.
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Von besonderem Vorteil ist die Tatsache,
dass die Verbindungen mit ungesättigter
geradkettiger Fettsäureeinheit,
die oben beschrieben werden, am Ort der inhbitorischen Wirkung der
Arachidonatkaskade wirken und vorzugsweise die Stimulus-induzierte
Mobilisierung von Arachidonat beeinflussen. Die Inhibierung von
PLA2 schwächt die Produktion von sowohl
Prostaglandinen als auch Leukotrienen in stimulierten oder entzündeten Zellen.
Es ist wesentlich, dass die oben beschriebenen Verbindungen eine
viel größere Wirkung
auf die Stimulus-induzierte als auf die kontrollierte Freisetzung
von Arachidonat besitzen, was eine selektive Wirkung auf die Erstere
anzeigt. Darüber
hinaus sind die oben beschriebenen Polymerverbindungen, wenn Phospholipide
peroxidiert werden, in der Lage, den Abbau solcher Lipide durch
lysosomale Phospholipase C zu inhibieren, was anzeigt, dass diese
Verbindungen bereits beschädigte
(oxidierte) Membranen schützen
können.
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Somit sind verschiedene Wirkungen
für die
entzündungshemmende
Aktivität
der Verbindungen mit Fettsäureeinheit
der vorliegenden Erfindung verantwortlich, und auf Basis von Entzündungsmodellen
wird offensichtlich, dass diese Verbindungen mit gegenwärtig erhältlichen
Steroiden und NSAIDs bei der Behandlung von Entzündung wirksam konkurrieren
oder diese ersetzen, wodurch die Verbindungen mit Fettsäureeinheit der
vorliegenden Erfindung Kandidaten für die klinische Anwendung und
Nützlichkeit
bei lokalisierter und systemischer Schädigung und Krankheit darstellen.
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Die oben beschriebenen Verbindungen
mit Fettsäureeinheit
sind, indem sie Lipidmembranen schützen und Antioxidans-Aktivität besitzen,
potente Antioxidantien zum Schutz von nicht nur lebenden Zellen
und Geweben, sondern ihre Wirkung macht sie als Konservierungsmittel
von biologischen Materialien mit tierischem, humanem oder pflanzlichem
Ursprung und als Konservierungsmittel von chemischen Mitteln, die
einer oxidativen Schädigung
ausgesetzt sind, wirksam. Um biologische Materialien, die einer
oxidativen Schädigung
ausgesetzt sind, zu schützen
und zu bewahren, können
die Verbindungen mit Fettsäureeinheit
in der vorliegenden Erfindung in Konzentrationen von 0,1 bis 100 μM verwendet
werden. Diese Molaritäten
werden als die Molarität berechnet,
die man erhalten würde,
wenn der Wirkstoff in einem Gewichtsteil von Wasser gelöst werden
würde,
welcher der gleiche ist wie der Gewichtsteil des biologischen Materials,
das bewahrt werden soll. Z. B. sollten für in vitro-Antioxidans- und/oder
anti-Phospholipase-Anwendungen Konzentrationen von ungefähr 0,1 bis ungefähr 500 μM wirksam
sein.
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BEISPIEL 1
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1,3-Bis(oleoylamino)-2-propylsuccinsäuremonoester
-
Diese Verbindung wird durch die folgende
Strukturformel dargestellt:
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Zu einer Lösung von 505 mg (0,817 mmol)
von 1,3-Bis(oleoylamino)-2-hydroxypropan
und 140 mg (1,40 mmol) Succinsäureanhydrid
in 20 ml Acetonitril und 20 ml THF wurden 5 ml Triethylamin zugegeben.
Die Suspension wurde bei 35°C
gerührt.
Nach 15 min war das Succinsäureanhydrid vollständig gelöst. Die
Lösung wurde
nach 48 h unter verringertem Druck entfernt. Das gelbe Öl wurde
in Wasser suspendiert und dreimal mit Ether extrahiert. Das Lösungsmittel
wurde unter verringertem Druck entfernt und das gelbe Öl 1,3-Bis(oleoylamino)-2-propylsuccinsäuremonoester
wurde im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 380 mg (65%).
-
BEISPIEL 2
-
Generische Formel für PX-18-verwandte
Verbindungen
-
Diese Verbindungen werden durch die
folgende Strukturformel dargestellt:
-
A umfasst umfasst N, OH, eine Zuckereinheit,
einen Ether, einen Ester, ein Amid oder NH2 oder
eine Säuregruppe
oder ein Salz davon. Manche der bevorzugten Säuren schließen COOH, SO3H
und PO3H ein.
-
B ist N, NR, P, P=O, CH oder CR,
wobei R eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, welche funktionalisiert
oder nicht funktionalisiert sein kann.
-
C1, C2 und C3 sind Verknüpfungsgruppen,
die ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus -(CH2)n-, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 24
ist und die -(CH2)n-Kette
funktionalisiert oder nicht funktionalisiert sein kann. C1, C2 und C3 können
auch ausgewählt
sein aus der Gruppe bestehend aus Poly(ethylenoxid) der Formel (CH2CH2-O)y,
wobei y eine ganze Zahl von 1 bis 12 ist. C1,
C2 und C3 können gleich
oder verschieden sein.
-
D1 und D2 sind Fettsäureketten, die aus Fettsäureestern
der Form CH3(CH2)nCOO oder Fettsäureamiden der Form CH3(CH2)nCONH
bestehen, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 32 ist. Mindestens eine
der Fettsäureketten
ist an einer oder mehren Positionen ungesättigt und D1 und
D2 können
hinsichtlich der Länge
und des Grades der Ungesättigtheit
gleich oder verschieden sein.
-
In der oben angegebenen generischen
Formel können
die Fettsäureketten
des Moleküls
aus (CH2)n zusammengesetzt
sein, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 32 ist. Diese Fettsäureketten
können
jeweils an einer oder mehreren Stellen ungesättigt sein und können verschiedene
Längen
von 1 bis 32 Kohlenstoffatomen aufweisen.
-
BEISPIEL 3
-
BES-Dioleat, auch PX-18
oder 2-(N,N-Bis(2-oleoyloxyethyl)amino]-1-ethansulfonsäure genannt
-
Eine bevorzugte Ausführungsform
der im vorhergehenden Beispiel angegebenen generischen Struktur
wird durch die folgende Strukturformel dargestellt:
-
In der Formel für PX-18, die oben gezeigt ist,
kann die SO3H-Säuregruppe auch in Salzform
oder in einer ionisierten Form vorliegen.
-
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure wurde
(gemäß Izumi,
1954) hergestellt, indem eine wäßrige Lösung von
Natrium-2-bromethansulfonat mit zwei Äquivalenten Diethanolamin für 2 h unter
Rückfluss
gehalten wurde. Die abgekühlte
Reaktionsmischung wurde über
ein Sulfonsäureharz
(Dowex 50) in Säureform
geleitet. Das Eluat, das Produkt und HBr enthält, wurde bei verringertem
Druck zur Trockne eingedampft, und das Produkt wurde aus wäßrigem Alkohol
umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 52% und die Verbindung wies
einen Schmelzpunkt von 153 bis 155°C auf.
-
In einem 1 l-Rundkolben wurden 16,2
g (0,076 Mol) von N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure in einer
Lösung
von 60 ml DMF und 36 ml Triethylamin gelöst. Zu dieser Lösung wurden
langsam unter N2-Atmosphäre unter Rühren 72 g (0,239 Mol) Oleoylchlorid
(65% Aldrich) zugegeben. (Während
der Zugabe des Oleoylchlorids bildete sich ein Niederschlag). Nachdem
das gesamte Oleoylchlorid zugegeben war, wurden zu der Mischung
300 ml Aceton oder THF zugegeben. Man ließ die Reaktionsmischung für 12 h unter N2-Atmosphäre
rühren.
Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und dann aus CHCl3/CH3CN umkristallisiert.
Es wurde ein gelbliches Produkt (43,6 g) in 77%-iger Ausbeute erhalten.
Das Produkt wurde mit Holzkohle in CH3Cl
entfärbt,
aus CHCl3/CH3CN
umkristallisiert und wies einen Schmelzpunkt von 133 bis 136°C auf.
-
BEISPIEL 4
-
Bedingungen neurologischer
Entzündung
-
Das wasserlösliche (PX-18)
inhibiert den aufgereinigten humanen Diskustyp II, PLA2
-
PX-18 inhibiert den aufgereinigten
humanen Diskustyp II, PLA2. Die PLA2-Aktivität wurde
wie in Franson et al., Prostaglandins, Leukotrienes and Essential
Fatty Acids, 43: 63–70,
1991 beschrieben, gemessen, welches hierin durch Bezugnahme darauf
vollständig
enthalten ist. Die wasserlösliche
Verbindung PX-18 zeigte einen IC50 von 0,3 μM.
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BEISPIEL 5
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Parasiteninfektion: Protozoen-Parasiten
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Malaria: Wasserlösliches
PX-18 inhibiert die in vitro-Replikation von Plasmodium falciparum
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Die wasserlösliche Verbindung PX-18 inhibierte
die gleichen Wirkstoffresistenten P. falciparum-Stämme wie
oben beschrieben. Der IC50 für PX-18
betrug 1,3 und 2,4 μg/ml.
Somit scheint die wasserlösliche PX-18-Verbindung
zehnmal wirksamer zu sein als die lipidlösliche Verbindung PX-13.
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Die inhibitorischen Wirkungen von
wasserlöslichem
PX-18 auf das Wachstum Wirkstoff-empfindlicher und Wirkstoff-resistenter
Spezies von Plasmodium falciparum zeigen, dass diese PX-Verbindung
und möglicherweise
verwandte PX-Verbindungen wirksame anti-parasitäre Wirkstoffe sein können.
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BEISPIEL 6
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Behandlung bei Schlangenbiss
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Tiere oder Menschen, die Bisse von
einer giftigen Schlange erhalten haben, benötigen eine schnelle Behandlung,
um die toxischen entzündlichen
Reaktionen, die tödlich
sein können,
zu lindern. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind
in leicht injizierbarer Form zur Verabreichung an den Patienten durch
intramuskuläre
Injektion erhältlich.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind über Zeiträume bis
zu 3 Monaten bei Raumtemperatur stabil.
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PLA2 mit
niedrigem Molekulargewicht ist eine wesentliche toxische Komponente
von Schlangengiften. In Giften mit neurotoxischen Wirkungen (d.
h. Kobragift) ist dies durch PLA2 vermittelt,
welches an neuronale Zellen bindet. Schlangengift-Schädigungen
weisen drei Komponenten auf: 1) peripherale und zentrale Neurotoxizität (bestimmte
Gifte), 2) systemische Entzündung,
einschließlich
Komplimentaktivierung und 3) extensive lokale Gewebeschädigung,
einschließlich
Muskelnekrose und Schwellung, welche eine spätere vaskuläre Beeinträchtigung verursachen kann (Kompartmentsyndrom).
Das folgende hypothetische Beispiel beschreibt die Behandlung eines
Klapperschlangenbisses, mit einem Notfall-Schlangenbiss-Kit, der
einen wasserlöslichen PLA2-Antagonisten, PX-18 in injizierbarer Form
enthält,
welche mehrere Stunden vor der üblichen
medizinischen Behandlung durchgeführt wird.
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Ein Patient wird während des
Wanderns oberhalb der Baumgrenze in Colorado an der oberen Wade durch
eine Klapperschlange gebissen. Er verwendet seinen Schlangenbiss-Kit,
um ein lokales Aussaugen des Giftes an der Bissstelle zu erreichen.
Er wendet nahe des Bisses ein Tourniquet an. Dann nimmt er die 2 ml-Spritze
mit einer 22er Nadel, welche mit 200 mg PX-18 in steriler Lösung gefüllt ist,
heraus, welche in dem Kit enthalten ist. Gemäß den Kit-Instruktionen injiziert
er für
eine systemische Absorption intramuskulär (im) 1 ml PX-18 in den vorderen
Oberschenkel. Dann injiziert er den verbleibenden 1 ml tief subkutan
an der Bissstelle, um eine Neutralisation der lokalen Konzentration
von PLA2-Gift zu erreichen. Nach 30 min
löst er
den Tourniquet und sucht medizinische Hilfe auf.
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BEISPIEL 7
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Wirkungen von PX-18 auf
die Histamin-Freisetzung von Basophilen
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Das Protokoll zur Untersuchung der
Wirkungen von PX-18 auf die Histamin-Freisetzung ist unten beschrieben. Frisch
abgenommenes, mit Heparin versetztes Blut von Spendern, die für 3 Tage
nicht medikamentös
behandelt wurden, wird 1 : 5 mit PBS, enthaltend 1% Humanserumalbumin
(Verdünnungsmittel)
verdünnt. Die
Testwirkstoffe werden für
die Endkonzentration zehnmal mit Verdünnungsmittel verdünnt und
es werden 25 μl
pro Well zugegeben, um Wells von Mikrotiterplatten mit rundem Boden
gleich anzusetzen. Im Allgemeinen werden dreifache Verdünnungen
des Wirkstoffes vier- oder fünfmal
untersucht. Dann werden zu jedem Well 200 μl verdünnten Blutes zugegeben. 5 min
später
werden 25 μl
anti-humanes IgE von Kaninchen (erhalten von Dako) pro Well zugegeben,
um Endkonzentrationen von 1/400 und 1/1200 des Antikörpers zu
erhalten. Unstimulierten (Hintergrund-Freisetzungs-Wells) wurden 25 μl Verdünnungsmittel
zugegeben. Die Platten wurden zum Mischen vorsichtig geklopft, dann
für 30
min inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten auf Eis gekühlt, in
einer gekühlten
Zentrifuge abzentrifugiert und auf Eis gelegt. Von jedem Well wurden
100 μl Plasma
für den
Assay entfernt und in eine 1,5 ml Eppendorf-Pipette, enthaltend
Acetylierungsreagenz, eingebracht.
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Nach der Acetylierung wird das Histamin-Addukt
durch einen empfindlichen und spezifischen kommerziell erhältlichen
kompetitiven Assay quantitativ bestimmt, wobei die kompetitive Bindung
an einen spezifischen Antikörper
an der Festphase von Enzym-konjugiertem Acetyl-Histamin verglichen
mit Probenanalyten bestimmt wurde. Es wird auch eine Blutprobe durch
wiederholtes Einfrieren/Auftauen lysiert, um das Gesamtbluthistamin
zu bestimmen. Die Ergebnisse werden als prozentualer Anteil der
Gesamtblut-Histaminfreisetzung
ausgedrückt.
In einem annehmbaren Assay beträgt
die maximale Freisetzung mehr als 45% und die Hintergrund-Freisetzung
ist kleiner als 15%. Die Experimente werden zwei- oder dreifach
unter Verwendung verschiedener Blutspender durchgeführt.
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Diese Experimente zeigen, dass PX-18
die Degranulation von Basophilen (und vermutliche Mastzellen) als
Reaktion auf Stimuli wie das Antikörperoberflächengebundenes IgE inhibiert.
PX-18 ist genauso wirksam wie Epinephrin, welches ein potenter anti-anaphylaktischer
Wirkstoff ist, und wirksamer als Cromolyn, welches ein prototypischer "Mastzellen-Stabilisieren" ist. Diese Ergebnisse
stützen
die Verwendung von PX-18 und verwandten Verbindungen als Verbindungen
zur Behandlung allergischer Krankheiten.
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BEISPIEL 8
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Wirkungen von PX-18 auf
die Produktion von Leukotrienen und Prostaglandinen durch Blut unter
basalen und stimulierten Bedingungen
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Das folgende Protokoll wurde verwendet,
um die Wirkungen von PX-18 auf die Produktion von Leukotrienen und
Prostaglandinen durch Blutzellen unter basalen Bedingungen, bei
Ionophor-Stimulierung von Cyclooxygenase Typ 1 und bei Lipopolysaccharid
(LPS)-Induktion von Cyclooxygenase Typ II zu untersuchen. Frisch
erhaltenes, mit Heparin versetztes Blut von Spendern ohne medizinische
Behandlung wird 1 : 1 mit RPMI verdünnt und in 0,6 ml-Mengen in
sterilen 12 × 75
ml-Polypropylenröhrchen
aufgeteilt. Die Testwirkstoffe wurden bei geeigneten Konzentrationen
hinzugefügt
und in Salzlösung
mit 1% Humanserumalbumin verdünnt. Den
Kontrollröhrchen
wurde nur Verdünnungsmittel
oder Wirkstoffvehikel zugegeben. Die Wirkstoffe wurden 5 min vor
der Zugabe des Stimulus mit 100-fachen Konzentrationen (6 μl Volumina)
zugegeben. Dies wurde bei 3 Röhrchenständern A
bis C wiederholt. Bei A wurde kein Stimulus zugegeben und er weist
für jede
Wirkstoftkonzentration ein 30-min- und 6-h-Röhrchen auf. B wurden 20 μM des Calciumionophors
A 23187 zugegeben, und es wurde für 30 min bei 37°C inkubiert.
C wurden 5 μg/ml
E. coli-Stamm Bort LPS zugegeben, und es wurde für 6 h bei 37°C inkubiert.
Am Ende jeder Zeitspanne wurden die geeigneten Röhrchen auf Eis gebracht, zentrifugiert
und 0,4 ml Plasma wurden vorsichtig in ein Röhrchen dekantiert, das Ameisensäure und BHT
enthielt, um alle Reaktionen zu stoppen und die Eicosanoid-Produkte
zu erhalten. Diese Röhrchen
wurden dann bei –70°C für bis zu
1 Woche gefroren, dann Sep-pac-Minisäulen zugeführt und
in Methanol extrahiert. Das Methanolextrakt wurde in drei Röhrchen aufgeteilt
und verdampft, dann bei –70°C bis zum
Eicosanoid-Assay
aufbewahrt. Die Messungen schließen Thromboxan (durch einen
empfindlichen fluorometrischen Plattenassay) und entweder 15 HETE
oder LTB4 ein, um Lipoxygenase-Produkte zu messen.
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Die Eicosanoid-Freisetzungs-Experimente
des Gesamtbluts zeigen, dass PX-18 die Cytokin-induzierbare Cyclooxygenase
II stark zu inhibieren scheint, wobei das konstitutive Cyclooxygenase
1-Enzym, das durch ein Ionophor stimuliert wurde, weniger inhibiert
wird und die basale Produktion von Prostaglandinen sogar noch weniger
oder gar nicht inhibiert wird. Dies stellt ein ausgezeichnetes entzündungshemmendes
Profil dar, da die meisten mit NSAIDs in Verbindung stehenden Toxizitäten (d.
h. gastral, renal, Flüssigkeitsretention, möglicherweise
Asthma) auf die Inhibierung der konstitutiven Cyclooxygenase I-Prostaglandinproduktion
zurückzuführen sind,
welche eine notwendige physiologische Rolle spielt. Cyclooxygenase
II ist an der pathologischen Entzündung beteiligt.
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Diese Studien zeigen auch, dass die
Produktion von Lipooxygenaseprodukten wie LTC4 durch PX-18 inhibiert
wird. Der Vergleich wird mit MK 592, einem selektiven Lipooxygenase-Inhibitor,
durchgeführt.
PX-18 inhibiert weder die Lipoxygenase noch die Cyclooxygenaseenzyme,
sondern vielmehr PLA2, welches freie Arachidonsäure erzeugt,
so dass der Pool dieses Enzymsubstrates für die Lipoxygenase- und Cyclooxygenase-Wege
vermindert wird. Unsere gegenwärtigen
Experimente demonstrieren, dass die Zugabe von PX-18, wenn exogene
Arachidonsäure
zugegeben wird und Lipoxygenase- und Cyclooxygenase-Metaboliten
gemessen werden, im Gegensatz zu Indocin oder MK 592 ihre Produktion
nicht inhibiert. Diese Ergebnisse stützen die Annahme, dass PX-18
PLA2 und keine stromabwärts liegenden Enzyme wie Lipoxygenase
und Cyclooxygenase inhibiert.
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Außerdem nimmt durch die Blockade
der sekretorischen (s) PLA2-Aktivität die Produktion
von Lysophospholipid ab, welches der unmittelbare und Ratenlimitierende
Vorläufer
für den
Plättchen-aktivierenden Faktor
(PAF) ist. Im Gegensatz zu zytosolischer perinukleärer Membran-lokalisierter
PLA2 scheint sekretorische PLA2 das
Schlüsselenzym
zu sein, das ein Substrat bereitstellt, welches acetyliert wird,
um PAF zu bilden. PAF ist ein potenter entzündlicher Mediator, eine potente
neutrophile chemotaktische Substanz und ein Schlüsselfaktor bei der Gewebeschädigung in
Situationen wie Ischämie.
PAF ist an Entzündungskrankheiten wie
Cholitis ulcerosa beteiligt und wird durch die Therapie mit NSAIDs
nicht beeinflusst.