DE60224276T2

DE60224276T2 - Krebsmetastasen-hemmer mit carbacyclischen phosphatidinsäurederivaten

Info

Publication number: DE60224276T2
Application number: DE60224276T
Authority: DE
Inventors: Mutsuko Koube-shi MUKAI; Susumu Meguro-ku KOBAYASHI; Hiromu Saitama-shi MUROFUSHI; Kimiko Saitama-shi MUROFUSHI
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-05-21
Filing date: 2002-05-20
Publication date: 2008-12-18
Anticipated expiration: 2022-05-21
Also published as: JP4163007B2; EP1402894A4; US20040214799A1; DE60224276D1; WO2002094286A1; ATE381934T1; JPWO2002094286A1; EP1402894A1; EP1402894B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Suppression der Metastasierung von Krebs, welches ein carbacyclisches Phosphatidsäurederivat als Wirkstoff enthält.
Hintergrund der Erfindung
Lysophosphatidsäure (LPA) hat unter den Phospholipiden, welche die biologische Membran aufbauen, die einfachste Struktur, wobei eine der beiden Fettsäuren an der sn-1- oder sn-2-Position des Glycerins in der Phosphatidsäure (PA) deacyliert ist (1). In einer normalen Zelle ist der Anteil der LPA an der Gesamtheit der Phospholipide extrem gering – 0,5% oder weniger. Bis in die 1980er Jahre wurde angenommen, dass LPA nur ein Zwischenprodukt oder ein Abbauprodukt der Phospholipid-Biosynthese wäre. Jedoch sind kürzlich verschiedene physiologische Aktivitäten von LPA aufgezeigt worden (Moolenaar, W. H.: Exp. Cell Res. 253, 230–238 (1999)). Ferner ist außerdem die Existenz mehrerer Rezeptoren auf der Zellmembran entdeckt worden (Guo, Z. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14367–14372 (1996); Hecht, J. H. et al., J. Cell Biol. 135, 1071–1083; An, S. et al., J. Biol. Chem. 273, 7906–7910 (1998); Bandoh, K. et al., J. Biol. Chem. 274, 27776–27785 (1999); und Im, D-S. et al., Mol. Pharmacol. 57, 753–759 (2000)). LPA zieht nun als funktionales Phospholipid die Aufmerksamkeit auf sich.
Von LPA ist bekannt, dass es verschiedene Vorgänge in Abhängigkeit vom Zelltyp induziert. Zusätzlich zur Förderung der Zellproliferation (van Corven, E. J. et al., Cell 59, 45–54 (1989)) und der Suppression des Zelltods (Umansky, S. R. et al., Cell Death Diff. 4, 608–616 (1997)), leitet LPA Veränderungen im Zytoskelett ein, indem es das Signaltransduktionssystem über Rho, einem niedermolekularen G-Protein, aktiviert und die Stressfaser-Bildung in Fibroblasten induziert (Gohla, A. et al., J. Biol. Chem. 273, 4653–4659 (1998)), den Abbau von Neuriten in Nervenzellen (Tigyi, G. et al., J. Biol. Chem. 267, 21360–21367 (1992); Jalink, K. et al., Cell Growth & Differ. 4, 247–255 (1993); Jalink, K. et al., J. Cell Biol. 126, 801–810 (1994); und Tigyi, G. et al., J. Neurochem. 66, 537–548 (1996)), die Invasion von Krebszellen (Imamura, F. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 497–503 (1993); O'Connor, K. L. et al., J. Cell Biol. 143, 1749–1760 (1998); und Star, J. C. et al., EMBO J. 17, 4066–4074 (1998)) und ähnliches
Im Jahre 1992 wurde eine fettlösliche Substanz, welche die Aktivität von DNA-Polymerase α unterdrückt, einem DNA-Replikationsenzym eukariotischer Zellen, und welche die Proliferation tierischer Kulturzellen supprimiert, entdeckt, isoliert und gereinigt aus einer Myxamöbe, dem Haplonten des Schleimpilzes Physarum polycephalum (Murakami-Murofushi, K. et al., J. Biol. Chem. 267, 21512–21517 (1992)). Es wurde gezeigt, dass bei dieser Substanz Hexadecansäure, welche Cyclopropan enthält, an der sn-1-Position des Glycerin-Rückgrats gebunden ist, und dass Phosphorsäure über eine cyclische Esterbindung an die sn-2 und sn-3-Positionen des Glycerin-Rückgrats gebunden ist (1). Diese Substanz heißt PHYLPA, da sie eine von Physarum stammende LPA-ähnliche Substanz ist.
Da PHYLPA an der sn-1-Position eine charakteristische Fettsäure aufweist, wurde auf chemischem Wege ein Derivat synthetisiert, indem die Fettsäure durch eine allgemeine Fettsäure substituiert wurde, und dessen Aktivität wurde untersucht. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass zwar alle Substanzen die Zellproliferation supprimieren, sie sich allerdings in ihrem Ausmaß der Suppression unterscheiden. Auf diese Weise wurde aufgedeckt, dass die anti-proliferative Wirkung von PHYLPA von der cyclischen Phosphatgruppe an den sn-2- und sn-3-Positionen herrührt. Gegenwärtig werden die LPA-Analoga mit derartigen cyclischen Phosphatgruppen allgemein als cPA bezeichnet, cyclische Phosphatidsäure (1). cPA ist kürzlich in der Form entdeckt worden, welche in einem humanen Serum an Albumin gebunden ist (Kobayashi, T. et al., Life Sciences 65, 2185–2191 (1999)), was aufdeckt, dass cPA in der belebten Welt weit verbreitet ist. Darüber hinaus besteht cPA in einer flüssigen Fraktion, welche zu dieser Zeit abgetrennt wurde, hauptsächlich aus Pal-cPA, mit Palmitinsäure als Fettsäure. Das Vorkommen von cPA wurde außerdem in Ratten- und Schweinehirnen bestätigt, zusätzlich zum Vorkommen in Seren. Tigyi et al. haben außerdem eine Gruppe von LPA-Analoga erfasst, welche cPA in der wässrigen Körper- oder Tränendrüsenflüssigkeit eines Kaninchenmodells mit Hornhautschädigung enthält (Liliom, K. et al, Am. J. Physiol. 274, C1065–C1074 (1998)).
Von cPA wurde entdeckt, dass es verschiedene physiologische Wirkungen, ähnlich oder gegensätzlich zu denen des LPA, aufweist. Während LPA die Proliferation von Kulturzellen fördert, zeigt cPA eine suppressive Wirkung (Murakami-Murofushi, K. et al, Cell Struct. Funct. 18, 363–370 (1993)). Diese Wirkung ist reversibel. Wenn cPA aus einem Medium entfernt wird, beginnen die Zellen erneut zu proliferieren. Zwei Möglichkeiten wurden als Mechanismus für die anti-proliferative Wirkung vorgeschlagen.
In Maus-Fibroblasten (NIH3T3) wurde gefunden, dass cPA einen Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration innerhalb mehrerer Minuten verursacht. Dieses Phänomen verschwindet durch Blockieren des Anstiegs der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration (Murakami-Murofushi, K. et al, Cell Struct. Funct. 18, 363–370 (1993)), was auf die Möglichkeit hinweist, dass cPA die Ca²⁺-abhängige Adenylatcyclase über Rezeptoren auf der Zellmembran aktiviert könnte. Es ist gezeigt worden, dass ein Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration die Aktivierung von MAP-Kinase unterdrückt (Hordijk, P. L. et al, J. Biol. Chem. 269, 3534–3538 (1994); und Howe, L. R. et al, J. Biol. Chem. 268, 20717–20720 (1993)), was darauf hinweist, dass dieses zur Hemmung der Proliferation führen kann. Andererseits wird angenommen, dass cPA aufgrund seiner Struktur leicht von Zellen aufgenommen wird. Mit Hinblick darauf wurde eine cPA synthetisiert, bei welcher die sn-1-Position fluoreszenzmarkiert war, und zu Zellen gegeben, und deren Verhalten wurde anschließend beobachtet. Infolgedessen wurde entdeckt, das cPA schnell in die Zellen eindringt und im peripheren Bereich des Zellkerns im Zytoplasma lokalisiert ist. Darüber hinaus wurde außerdem gefunden, dass cPA in vitro die cdc25-Phosphatase-Aktivität hemmt, welche den Zellzyklus steuert (Tetsuyuki Kobayashi und Kimiko Murofushi: Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 44, 1118–1125 (1999)). Dementsprechend ist es ebenso möglich, dass cPA die Zellproliferation hemmt, indem es direkt die Aktivierung des cdk2-Kinasekomplexes im Zytoplasma unterdrückt, ohne Beteiligung der Rezeptoren auf der Zellmembran.
Darüber hinaus induzieren sowohl LPA als auch cPA in Fibroblasten, welche in einem Medium mit begrenzter Serum-Konzentration kultiviert werden, die Stressfaser-Bildung durch Actin-Moleküle innerhalb der Zellen (Tetsuyuki Kobayashi und Kimiko Murofushi: Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 44, 1118–1125 (1999)). In diesem Fall, ähnlich wie bei LPA, wird angenommen, dass cPA seine Wirkung initiiert, indem es Rho über die Bindung an einen Zellmembran-Rezeptor aktiviert.
Des Weiteren zeigt cPA bezüglich der Invasion von Krebszellen eine starke suppressive Wirkung, im Gegensatz zu der fördernden Wirkung von LPA (Mukai, M. et al, Int. J. Cancer 81, 918–922 (1999)).
Krebsmetastasierung ist das signifikanteste Phänomen, welches die Bösartigkeit eines Tumors anzeigt, und diese verläuft über komplexe Schritte. Insbesondere die Invasion ist ein charakteristischer Schritt. Krebszellen, welche von der primären Läsion in vivo freigesetzt werden, dringen in Stroms und Blutgefäße ein. Die Zellen werden anschließend vom Blutstrom transportiert, verlassen die Blutgefäße und dringen im Weiteren in entfernte Organe ein, in welchen die Zellen dann beginnen, zu proliferieren, um eine metastatische Läsion auszubilden. Um dieses Phänomen in vivo zu analysieren, haben Akedo et al. eine peritoneale Invasion modelliert, welche entwickelt wurde, als Ratten-Aszites-Hepatomzellen (AH- 130) in die Bauchhöhle von Ratten implantiert wurden, und somit ein experimentelles System entwickelt haben, mit welchem die Migration von Krebszellen über die normale Wirtszellschicht quantitativ ausgewertet werden kann (Akedo, H. et al., Cancer Res. 46, 2416–2422 (1986)). Normalerweise wird ein experimentelles System zur Beobachtung von Krebszellen, welche durch die Membran, die mit extrazellulären Substraten beschichtet ist, hindurch gehen, verwendet, um die Invasion zu untersuchen. Im Gegensatz zu einem derartigen Verfahren wird von diesem System angenommen, dass es einen in-vivo-Zustand gut abbildet. Einige der für dieses experimentelle System zu verwendenden Krebszellen benötigen Serum, jedoch benötigen einige von diesen für ihre Invasion kein Serum. Ein hochinvasiver Klon (MM1) von AH-130-Zellen benötigt Serum für seine Invasion. Infolge der Suche nach einer die Invasion fördernden Substanz im Serum wurde entdeckt, dass LPA zumindest eine dieser invasionsfördernden Substanzen ist (Imamura, F. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 497–503 (1993)). Dementsprechend wurde die Wirkung von cPA, einem strukturellen Analogon von LPA, auf die Invasion untersucht. Als Ergebnis wurde gefunden, dass cPA die Invasion supprimiert, völlig gegensätzlich zum Fall des LPA. Einige Derivate, welche unterschiedliche Fettsäuren, gebunden an die sn-1-Position, aufweisen, wurden synthetisiert, und ihre invasionshemmenden Wirkungen wurden untersucht. Demzufolge zeigte Pal-cPA die stärkste invasionssupprimierende Wirkung. Darüber hinaus supprimierte Pal-cPA im selben Assay-System auf signifikante Weise die Invasion von humanen Fibrosarkomzellen (HT-1080), welche für ihre Invasion weder Serum noch LPA benötigen (Mukai, M. et al., Int. J. Cancer 81, 918–922 (1999)).
Außerdem wurde in MM1-Zellen die intrazelluläre cAMP-Konzentration innerhalb mehrerer Minuten durch die Zugabe von Pal-cPA gesteigert, und dieser Effekt verschwand nicht, als sogar gleichzeitig LPA vorlag (Mukai, M. et al., Int. J. Cancer 81, 918–922 (1999)). Wenn ein Reagenz, welches die intrazelluläre cAMP-Konzentration steigern kann, zugegeben wurde, wurde die LPA-induzierte Invasion supprimiert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die LPA-vermittelte Rho- Aktivierung durch Zugabe dieser Reagenzien oder von Pal-cPA gehemmt wurde (Mukai, M. et al., FEBS Letters 484, 69–73 (2000)). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass auch in dieser Krebszelle (MM1) cPA die Rho-Aktivität über die Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase A (A-Kinase) hemmen kann, indem die intrazelluläre cAMP-Konzentration gesteigert wird, um so die Invasion zu supprimieren. Jedoch ist bisher nicht berichtet worden, ob ein carbacyclisches Phosphatidsäure-Derivat eine supprimierende Wirkung auf die Invasion von Krebszellen besitzt.
Offenbarung der Erfindung
Ein von der vorliegenden Erfindung zu erreichendes Ziel besteht darin, ein neuartiges Mittel zur Suppression der Metastasierung von Krebs bereitzustellen durch Untersuchung der suppressiven Wirkung von carbacyclischen Phosphatidsäurederivaten auf die Invasion von Krebszellen.
Die vorlegenden Erfinder haben auf chemischem Wege 11 Typen von cPA-Derivaten synthetisiert, entsprechend dem Verfahren, welches begründet wurde durch Kobayashi et al. (Kobayashi, S. et al., Tetrahedron Letters 34, 4047–4050 (1993)), und haben anschließend die Wirkung dieser Derivate auf die Serum/LPA-abhängige Invasion in einem in-vitro-Invasionsassay-System untersucht (Beispiel 1 unten). Als Ergebnis wurden cPA-Derivate identifiziert, welche eine invasionssupprimierende Aktivität zeigten, die 10 bis 100 mal größer ist als die von Pal-cPA, und anschließend wurden die Wirkungen derselben auf die LPA-abhängige Invasion untersucht (Beispiel 2 unten). Schließlich wurden die Wirkung und der Mechanismus der invasionssupprimierenden Aktivität des CPA-Derivats untersucht (Beispiel 3 unten). Als Ergebnis wurde gezeigt, dass das carbacyclische Phosphatidsäurederivat eine invasionssupprimierende Wirkung auf Krebszellen besitzt, und somit wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Somit stellt die vorlegende Erfindung ein Mittel bereit zur Suppression der Metastasierung von Krebs, welches als Wirkstoff eine Verbindung enthält, die durch die folgende Formel (I) repräsentiert wird:
wobei R eine lineare oder verzweigte C_1-30-Alkylgruppe ist, eine lineare oder verzweigte C_2-30-Alkenylgruppe oder eine lineare oder verzweigte C_2-30-Alkinylgruppe, wobei diese Gruppen einen Cycloalkanring oder einen aromatischen Ring enthalten können; und M ein Wasserstoffatom oder ein Gegenkation ist.
Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung repräsentiert R in der Formel (I) -C₁₅H₃₁, -(CH₂)₇CH=CHC₆H₁₃ oder -(CH₂)₇-CH=C₈H₁₇
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Mittel zur Suppression der Krebsmetastasierung bereit, welches die Krebsmetastasierung supprimiert durch Suppression der Invasion von Krebszellen.
Nach ferner einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Suppression der Metastasierung von Krebs, welches das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Dosis der Verbindung, repräsentiert durch die obige Formel (I), an ein Säugetier, einschließlich des Menschen, umfasst.
Nach ferner einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Anwendung der durch die obige Formel (I) repräsentierte Verbindung zur Herstellung eines Mittels zur Suppression der Metastasierung von Krebs bereitgestellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Strukturen von LPA, PHYLPA und cPA.
2 zeigt die Struktur eines chemisch synthetisierten cPA-Derivats.
3 zeigt ein in-vitro-Assaysystem

(a) Verfahren eines in-vitro-Invasionsassays: Krebszellen wurden als Multischicht auf einer normalen Zell-Monoschicht kultiviert, welche kultiviert worden ist, um einen konfluenten Zustand zu erreichen. Nach einer bestimmten Zeitdauer wurden die Zellen fixiert und anschließend unter einem Phasenkontrast-Mikroskop beobachtet.
(b) Abbilder invadierender Zellen, welche unter dem Phasenkontrast-Mikroskop beobachtet wurden. Invadierende Krebszellen (MM1) sind durch Pfeile angezeigt.

4 zeigt die Wirkung von cPA-Derivaten auf eine FBS-induzierte Invasion. 25 μM cPA-Derivat wurden zu 1 × 10⁵ Zellen/ml an MM1-Zellen in der Gegenwart von FBS gegeben, und anschließend wurde das in-vitro-Invasionsassay durchgeführt. Die invasionssupprimierende Wirkung von cPA ist abgebildet im Verhältnis (%) zu der Wirkung einer Kontrolle.
5 zeigt die Wirkung von cPA-Derivaten auf eine LPA-induzierte Invasion. 25 μM cPA-Derivat wurden zu 1,5 × 10⁵ Zellen/ml an MM1-Zellen in der Gegenwart von 25 μM LPA gegeben, und anschließend wurde das in-vitro-Invasionsas say durchgeführt. Die invasionssupprimierende Wirkung durch cPA ist abgebildet im Verhältnis (%) zur Wirkung einer Kontrolle.
6 zeigt den chemischen Syntheseweg von carba-cPA. Zahlen in dieser Figur korrespondieren zu den Zahlen in der Erläuterung zur Synthese in Beispiel 1 (1–2).
7 zeigt die Wirkung von carba-cPA auf eine LPA-induzierte Invasion. 0,5 μM, 1 μM oder 10 μM an carba-cPA wurden zu 1,5 × 10⁵ Zellen/ml an MM1-Zellen in der Gegenwart von 25 μM LPA gegeben, und anschließend wurde ein in-vitro-Invasionsassay durchgeführt. Die invasionssupprimierende Wirkung durch carba-cPA ist abgebildet im Verhältnis (%) zu der Wirkung einer Kontrolle.
8 zeigt die Wirkung von cPA auf die Proliferation von MM1-Zellen. 12,5 μM oder 25 μM an cPA wurden zu 1 × 10⁴ Zellen/ml an MM1-Zellen in der Gegenwart von 10% FBS gegeben, und anschließend wurden die Zellen kultiviert. Die Anzahl der Zellen wurden bei 24 Stunden und 72 Stunden nach Kultivierung gezählt.
9 zeigt die Wirkung von cPA auf die Invasion von HT-1080-Zellen. 10 μM an cPA wurden zu 2 × 10⁵ Zellen/ml an HT-1080-Zellen in Abwesenheit von Serum/LPA gegeben, und anschließend wurde ein in-vitro-Invasionsassay durchgeführt. Die invasionssupprimierende Wirkung durch cPA ist abgebildet im Verhältnis (%) zu der Wirkung einer Kontrolle.
10 zeigt die Wirkung eines Reagenz zur Steigerung von cAMP auf die LPA-induzierte Invasion.
Das Reagenz zur Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration wurde in den in der Figur gezeigten Konzentrationen zu 1,5 × 10⁵ Zellen/ml an MM1-Zellen in der Gegenwart von 25 μM an LPA gegeben, und anschließend wurde ein in- vitro-Invasionsassay durchgeführt. Deren invasionssupprimierenden Wirkungen sind abgebildet im Verhältnis (%) zu der Wirkung einer Kontrolle.
11 zeigt die Wirkung von cPA auf intrazelluläres cyclisches AMP. 25 μM an cPA wurde zu MM1-Zellen gegeben, die Reaktion wurde nach einer bestimmten Zeitdauer gestoppt, und anschließend wurde die cAMP-Konzentration gemessen.
12 zeigt Veränderungen des Körpergewichtes in der jeweiligen Testgruppe bei einem Experiment, bei welchem die supprimierenden Wirkungen von cPA-19 und cPA-20, der cyclischen Phosphatidsäure-Derivate, auf die Lungen-Metastasierung von B16-Melanomen untersucht wurden unter Verwendung eines Modells zur hämatogenen Lungen-Metastasierung von B16-Melanomen.
13 zeigt die Anzahl der gebildeten Knötchen, welche sich infolge der Lungen-Metastasierung bildeten, bei einem Experiment, bei welchem die supprimierenden Wirkungen von cPA-19 und cPA-20, der cyclischen Phosphatidsäure-Derivate, auf die Lungen-Metastasierung von B16-Melanomen untersucht wurden unter Verwendung des Modells zur hämatogenen Lungen-Metastasierung von B16-Melanomen.
14 zeigt die Ergebnisse einer histopathologischen Untersuchung bei einem Experiment, bei welchem die supprimierenden Wirkungen von cPA-19 und cPA-20, der cyclischen Phosphatidsäure-Derivate, auf die Lungen-Metastasierung von B16-Melanomen untersucht wurden unter Verwendung des Modells zur hämatogenen Lungen-Metastasierung von B16-Melanomen.
Bester Weg zur Ausführung der Erfindung
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden im Detail beschrieben. Allgemeine, in dieser Beschreibung verwendete Bezeichnungen, werden unten erläutert.

Ara-: Arachinsäure, 20:0
BSA: Bovines Serumalbumin
Bt2cAMP: Dibutyryl-cyclisches-AMP
cAMP: cyclisches Adenosin-3',5'-phosphat
CBM: Carbamoyl
cPA: cyclische Phosphatidsäure
CTX: Choleratoxin
DHA: Docosahexansäure
EPA: Eicosapentansäure
FBS: fötales bovines Serum
IBMX: 3-Isobutyl-1-methylxanthin
Lau-: Laurinsäure, 12:0
LPA: Lysophosphatidsäure
MEM: minimales essentielles Medium
Ole-: Ölsäure, 18:1
Pal-: Palmitinsäure, 16:0
ΔPal-: Palmitoleinsäure, 16:1
PBS: phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
TCA: Trichloressigsäure

Ein Mittel zur Suppression der Metastasierung von Krebs gemäß der vorliegenden Erfindung enthält als Wirkstoff ein cyclisches Phosphatidsäurederivat, repräsentiert durch die Formel (I):
wobei R eine lineare oder verzweigte C_1-30-Alkylgruppe ist, eine lineare oder verzweigte C_2-30-Alkenylgruppe oder eine lineare oder verzweigte C_2-30-Alkinylgruppe, wobei diese Gruppen einen Cycloalkanring oder einen aromatischen Ring enthalten können; und M ein Wasserstoffatom oder ein Gegenkation ist.
Beispiele der linearen oder verzweigten C_1-30-Alkylgruppe, repräsentiert durch den Substituenten R in der Formel (I), schließen ein: eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine Propylgruppe, eine Butylgruppe, eine Pentylgruppe, eine Hexylgruppe, eine Heptylgruppe, eine Octylgruppe, eine Nonylgruppe, eine Decylgruppe, eine Undecylgruppe, eine Dodecylgruppe, eine Tridecylgruppe, eine Tetradecylgruppe, eine Pentadecylgruppe, eine Hexadecylgruppe, eine Heptadecylgruppe, eine Octadecylgruppe, eine Nonadecylgruppe und eine Eicosylgruppe.
Beispiele der linearen oder verzweigten C_2-30-Alkenylgruppe, repräsentiert durch den Substituenten R, schließen ein: eine Allylgruppe, eine Butenylgruppe, eine Octenylgruppe, eine Decenylgruppe, eine Dodecadienylgruppe und eine Hexadecatrienylgruppe. Insbesondere schließen die Beispiele ein: 8-Decenylgruppe, 8-Undecenylgruppe, 8-Dodecenylgruppe, 8-Tridecenylgruppe, 8-Tetradecenylgruppe, 8-Pentadecenylgruppe, 8-Hexadecenylgruppe, 8-Heptadecenylgruppe, 8-Octadecenylgruppe, 8-Icocenylgruppe, 8-Dococenylgruppe, Heptadeca-8,11-dienylgruppe, Heptadeca-8,11,14-trienylgruppe, Nonadeca-4,7,10,13-tetraenylgruppe, Nonadeca-4,7,10,13,16-pentaenylgruppe und Henicosa-3,6,9,12,15,18-hexaenylgruppe.
Die Beispiele der linearen oder verzweigten C_2-30-Alkinylgruppe, repräsentiert durch den Substituenten R, schließen ein: 8-Decinylgruppe, 8-Undecinylgruppe, 8-Dodecinylgruppe, 8-Tridecinylgruppe, 8-Tetradecinylgruppe, 8-Pentadecinylgruppe, 8-Hexadecinylgruppe, 8-Heptadecynylgruppe, 8-Octadecinylgruppe, 8-Icocinylgruppe, 8-Dococinylgruppe und Heptadeca-8,11-diinylgruppe.
Die Beispiele für den Cycloalkanring, welcher in der oben beschriebenen Alkylgruppe, Alkenylgruppe oder Alkinylgruppe enthalten sein kann, schließen beispielsweise ein: einen Cyclopropanring, einen Cyclobutanring, einen Cyclopentanring, einen Cyclohexanring und einen Cyclooctanring. Der Cycloalkanring kann ein oder mehrere Heteroatome enthalten, und Beispiele dafür schließen ein: einen Oxiranring, einen Oxetanring, einen Tetrahydrofuranring und einen N-Methylprolidin-Ring.
Die Beispiele für einen aromatischen Ring, welcher enthalten sein kann in der oben beschriebenen Alkylgruppe, Alkenylgruppe oder Alkinylgruppe schließen beispielsweise ein: einen Benzolring, einen Naphthalinring, einen Pyridinring, einen Furanring und einen Thiophenring.
Dementsprechend, in dem Fall, bei dem der Substituent R eine Alkylgruppe ist, substituiert mit einem Cycloalkanring, schließen die Beispiele eine Cyclopropylmethyl-Gruppe, eine Cyclohexylethyl-Gruppe und eine 8,9-Methanopentadecyl-Gruppe ein.
In dem Fall, bei dem der Substituent R eine Alkylgruppe ist, substituiert mit einem aromatischen Ring, schließen die Beispiele eine Benzylgruppe, eine Phenethylgruppe und eine p-Pentylphenyloctyl-Gruppe ein.
M in dem cyclischen Phosphatidsäurederivat, repräsentiert durch die Formel (I), ist ein Wasserstoffatom oder ein Gegenkation. In dem Fall, bei dem M ein Gegenkation ist, schließen Beispiele dafür ein: ein Alkalimetallatom, ein Erdalkalimetallatom und eine substituierte oder unsubstituierte Ammoniumgruppe. Zu den Alkalimetallatomen zählen beispielsweise Lithium, Natrium und Kalium. Zu den Erdalkalimetallatomen zählen beispielsweise Magnesium und Calcium. Zu der substituierten Ammoniumgruppe zählt beispielsweise eine Butylammoniumgruppe, eine Triethylammoniumgruppe und eine Tetraethylammoniumgruppe.
Eine Verbindung, repräsentiert durch die Formel (I), welche als Wirkstoff in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann synthetisiert werden entsprechend der in Veröffentlichungen beschriebenen Verfahren (Kobayashi S. et al., Tetrahedron Letters 34, 4047–4050 (1993); The 23rd Symposium an Progression Organic Reactions in Life Science, 17. und 18. November 1997, Japanische Pharmazeutische Gesellschaft (Verwaltungszentrum von Kumamoto), Synthesis and physiological action of cyclic phosphatidic acid and carba derivative, Sammlung von Zusammenfassungen, Seite 101–104). Ein Beispiel für einen speziellen Syntheseweg ist in 6 abgebildet.
In 6 wird der kommerziell erhältliche (R)-Benzylglycidylether (1) aktiviert mit BF₃·Et₂O, und anschließend lässt man ein lithiiertes Produkt, welches erhalten wird, indem man n-BuLi auf Methylphosphonsäuredimethylester wirken lässt, mit dem aktivierten Produkt reagieren, wodurch der Alkohol (2) erhalten wird.
Den erhaltenen Alkohol lässt man bei 80°C reagieren unter Verwendung eines Überschusses eines Pyridiniumsalzes der p-Toluolsulfonsäure in Toluol, wodurch ein cyclisiertes Produkt (3) erhalten wird. Das cyclisierte Produkt wird hydrolysiert unter Verwendung von 20% Pd(OH)₂-C in einer Wasserstoffatmosphäre, gefolgt von Debenzylierung (4). 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-Hydrochlorid wird als Kondensationsmittel verwendet, und man lässt dieses mit Fettsäure reagieren, wodurch ein Kupplungsprodukt (5) erhalten wird. Als nächstes wird Bromtrimethylsilan als Nukleophil verwendet, gefolgt von einer positionsselektiven Abspaltung von allein der Methylgruppen, wodurch die Phosphatidsäure (6) erhalten wird. Dieses Produkt wird in einen Schütteltrichter überführt unter Verwendung von Ether, und anschließend wird eine kleine Menge von 0,02 N Natriumhydroxid-Lösung tropfenweise zugesetzt, um eine Trennung durchzuführen, und die interessierende Verbindung wird als Natriumsalz (7) extrahiert und gereinigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Mittel zur Suppression der Krebsmetastasierung.
Die Krebsmetastasierung umfasst einen Prozess mit vielen Schritten, welcher beginnt mit der Ablösung von Krebszellen von der primären Läsion, Aufbrechen der extrazellulären Matrix, Invasion in Blutgefäße, Invasion durch die vaskulären Endothelzellschichten, Anlagerung an das entfernte Organ und Proliferation. Verschiedene Faktoren sind an diesen Schritten beteiligt, und Inhibitoren dieser ziehen nun als ein neues Mittel zur Suppression der Krebsmetastasierung die Aufmerksamkeit auf sich. Vor allem die Invasion ist der charakteristischste Schritt beim Phänomen der Metastasierung. Es wird angenommen, dass ein überlegenes Antikrebsmittel sehr wahrscheinlich aus den Substanzen entwickelt wird, welche die Invasion von Krebszellen supprimieren. Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges Mittel bereit zur Suppression der Krebsmetastasierung, welches als Mittel zur Suppression der Invasion von Krebszellen angewendet werden kann.
„Krebsmetastasierung" in der vorliegenden Erfindung bedeutet die Verlagerung und die Proliferation von Krebszellen von einem Teil des Körpers zu einem anderen Organ, Organsystem oder dergleichen. Insbesondere bedeutet dies, dass sich Krebszellen zu einem Ort verlagern, welcher sich entfernt von der primären Läsion befindet, um so Krebs auszubilden, und schließt sowohl hämatogene als auch lymphogene Metastasierung ein.
Die Arten von Krebs, deren Metastasen durch das Mittel zur Suppression von Krebsmetastasierung der vorliegenden Erfindung supprimiert werden sollten, sind nicht besonders beschränkt, und schließen alle Formen gutartiger oder bösartiger Tumoren ein. Spezielle Beispiele von Krebs, dessen Metastasen supprimiert werden sollten, schließen ein, jedoch nicht auf diese beschränkt: malignes Melanom, malignes Lymphom, Krebs des Verdauungssystems, Lungenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Magenkrebs, Dickdarmkrebs, Rektalkrebs, Darm krebs, Harnleiterkrebs, Gallenblasenkrebs, Gallengangskrebs, Gallenwegskrebs, Brustkrebs, Leberkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Hodentumor, Kieferkrebs, Zungenkrebs, Lippenkrebs, Mundhöhlenkrebs, Rachenkrebs, Kehlkopfkrebs, Eierstockkrebs, Gebärmutterkrebs, Prostatakrebs, Schilddrüsenkrebs, Gehirntumor, Kaposi-Sarkom, Hämangiom, Leukämie, Polyzythämie, Ganglioneuroblastom, Retinoblastom, Myelom, Blasentumor, Sarkom, Osteosarkom, Myosarkom, Hautkrebs, Basalzellenkarzinom, Karzinom der Hautanhangsgebilde, kutanes metastatisches Karzinom und malignes Hautmelanom.
Organe, auf welche sich Krebs durch Metastasierung leicht ausbreitet, unterscheiden sich leicht in der Abhängigkeit vom Typ des Krebses. Beispielsweise ist bekannt, dass Brustkrebs sich mit höherer Geschwindigkeit auf die Lunge, Leber, Knochen und Lymphdrüsen ausbreitet; Magenkrebs auf die Leber, Lunge, Knochen und Nebenniere; und Dickdarmkrebs auf die Leber, Lunge, Nebenniere und so weiter. Zu den Beispielen von metastatischem Krebs zählen metastatischer Leberkrebs, metastatisches Jejunalkarzinom, metastatischer Knochenkrebs, metastatischer Hirntumor, metastatischer Lungentumor, kutanes metastatisches Karzinom, metastatischer Rippentumor, metastatischer Eierstockkrebs und so weiter. Daher kann das Mittel zur Suppression der Krebsmetastasierung der vorliegenden Erfindung angewendet werden, um eine derartige Krebsmetastasierung zu supprimieren, und ist insbesondere anwendbar als ein Mittel zur Suppression von postoperativer Metastasierung. Darüber hinaus ist das Mittel zur Suppression der Krebsmetastasierung der vorliegenden Erfindung klinisch ein Mittel zur Suppression des Wiederauftretens von Krebs, und man erwartet davon, den Überlebenszeitraum von Patienten zu verlängern und die Überlebensrate zu steigern.
Das Mittel zur Suppression der Krebsmetastasierung der vorliegenden Erfindung kann angewendet werden in Kombination mit einer bekannten Chemotherapie, mit einem chirurgischen Behandlungsverfahren, Strahlentherapie, Hyperthermie, Immuntherapie oder dergleichen. Insbesondere kann die Wirkung der Suppres sion der Krebsmetastasierung des Mittels zur Suppression von Krebsmetastasierung der vorliegenden Erfindung verbessert werden durch kombinierte Anwendung mit einem bekannten Antitumormittel und/oder einer Substanz, welche die Krebsmetastasierung supprimiert. Durch kombinierte Anwendung mit dem Mittel zur Suppression von Krebsmetastasierung der vorliegenden Erfindung kann die Dosis eines zu verabreichenden bekannten Antitumormittels und/oder einer Krebs supprimierenden Substanz verringert werden. Somit können Nebenwirkungen, welche durch diese Mittel verursacht werden (z. B. Leukozytopenie, Thrombozytopenie, Blutung, Anämie, Anorexie, Brechreiz, Erbrechen, Stomatitis, Effloreszenz, Haarausfall, Hautpigmentation, Fieberanfälle, Mattheit, Cephalalgie, Leberfunktionsstörungen, Proteinurie, Ödeme und Anaphylaxie), verringert werden.
Das Mittel zur Suppression von Krebsmetastasierung der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt, welche ein oder mehrere pharmazeutisch zulässige Additive und die Verbindung der Formel (I) als Wirkstoff umfasst.
Das Mittel zur Suppression von Krebsmetastasierung der vorliegenden Erfindung kann in verschiedenen Formen verabreicht werden, und die Dosierungsformen können peroral oder parenteral sein (beispielsweise intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intrakutane Injektion, rektale Dosierung und permukosale Dosierung). Beispiele für die pharmazeutische Zusammensetzung, welche zur peroralen Dosierung geeignet ist, schließen ein: eine Tablette, eine Granalie, ein Pulver, eine Lösung, eine Suspension und einen Sirup. Beispiele für die pharmazeutische Zusammensetzungen, welche zur parenteralen Dosierung geeignet ist, schließen ein: eine Injektion, eine Infusion, ein Suppositorium und ein perkutanes Absorptionsmittel. Die Dosierungsformen des Medikaments der vorliegenden Erfindung sind nicht auf diese beschränkt. Ferner kann das Mittel der vorliegenden Erfindung außerdem als Formulierung mit verzögerter Freisetzung durch öffentlich bekannte Verfahren hergestellt werden.
Die Art der zur Herstellung des Mittels der vorliegenden Erfindung verwendeten Additive ist nicht besonders beschränkt und kann auf geeignete Weise durch einen Fachmann ausgewählt werden. Beispielsweise können verwendet werden: ein Arzneiträger, ein Zerfallsmittel oder ein den Zerfall unterstützendes Mittel, ein Bindemittel, ein Gleitmittel, ein Überzugsmittel, eine Grundlage, ein Lösungsmittel oder ein Lösungsvermittler, ein Dispergiermittel, ein Suspendiermittel, ein Emulgator, ein Puffer, ein Antioxidans, ein Antiseptikum, ein isotonisches Mittel, ein pH-Regulator, ein Lösemittel und ein Stabilisator. Einzelne Inhaltsstoffe, welche für die obigen Zwecke verwendet werden, sind dem Fachmann wohlbekannt.
Zu den Beispielen für die pharmazeutischen Additive, welche für eine perorale Zubereitung verwendbar sind, zählen ein Arzneiträger wie Glucose, Lactose, D-Mannit, Stärke und kristalline Cellulose; ein Zerfallsmittel oder ein den Zerfall unterstützendes Mittel wie Carboxymethylcellulose, Stärke und Carboxymethylcellulose-Calcium; ein Bindemittel wie Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon und Gelatine; ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat und Talkum; ein Überzugsmittel wie Hydroxypropylmethylcellulose, Weißzucker, Polyethylenglykol und Titandioxid; eine Grundlage wie Vaseline, flüssiges Paraffin, Polyethylenglykol, Gelatine, Kaolin, Glycerin, gereinigtes Wasser und Hartfett.
Zu den Beispielen für die pharmazeutischen Additive, welche verwendet werden können zur Zubereitung einer Injektions- oder Infusionszubereitung, zählen ein Lösungsmittel oder ein Lösungsvermittler, welche verwendet werden können für eine wässrige Injektion oder eine Injektion von der Art, welche zum Zeitpunkt der Anwendung aufgelöst wird, wie beispielsweise destilliertes Wasser zur Injektion, physiologische Kochsalzlösung und Propylenglykol; ein isotonisches Mittel wie Glucose, Natriumchlorid, D-Mannit und Glycerin; und ein ph-Regulator wie bei spielsweise eine anorganische Säure, eine organische Säure, eine anorganische Base und eine organische Base.
Das Mittel der vorliegenden Erfindung kann an Säugetiere, einschließlich des Menschen, verabreicht werden.
Die Dosis des Mittels der vorliegenden Erfindung sollte gesteigert oder verringert werden in Abhängigkeit von Bedingungen wie Alter, Geschlecht, Körpergewicht, Symptome des Patienten und Verabreichungsweg. Die Tagesdosis an Wirkstoff für einen Erwachsenen beträgt im Allgemeinen 1 μg/kg bis 1.000 mg/kg, und vorzugsweise 10 μg/kg bis 100 μg/kg. Das Mittel der Dosis wie oben erwähnt kann einmal pro Tag verabreicht werden, oder kann verteilt über wenige Male verabreicht werden (beispielsweise etwa 2–4 Mal) pro Tag.
Die vorliegende Erfindung wird im Detail beschrieben, mit Bezug auf die folgenden Beispiele, jedoch ist die vorliegende Erfindung durch die Beispiele nicht beschränkt.
Beispiel
Beispiel 1: Synthese von cPA-Derivaten und Suppression der Invasion von Krebszellen durch diese.
(1-1) Suppression der Invasion von Krebszellen durch verschiedene synthetische cPA-Derivate-
(A) Materialien und Methoden
Chemische Synthese von cPA-Derivaten
11 Typen synthetischer cPA-Derivate wurden synthetisiert gemäß dem Verfahren, welches beschrieben wurde von S. Kobayashi et al. in Tetrahedron Letters 24, 4047–4050 (1993). Gegenwärtig sind 20 Typen von cPA-Derivaten synthetisiert worden. Die invasionssupprimierende Aktivität von cPA-Derivaten, welche in dieser Studie nicht verwendet wurden, ist bereit von Mukai et al. untersucht worden. Demzufolge supprimierten Pal-cPA und Ole-cPA die LPA-induzierte Invasion um ungefähr 85% beziehungsweise um ungefähr 60%. PHYLPA, ΔPal-cPA, Lau-cPA und Ara-cPA supprimierten die LPA-induzierte Invasion um etwa 50% (Mukai M. et al., Int. J. Cancer 81, 918–922 (1999)). Die Strukturen von hier verwendeten cPA-Derivaten sind in 2 abgebildet.
Zellkultur
Das Abdomen einer männlichen Donryu-Ratte (30 g, Nippon Bio-Supp. Center) wurde aseptisch geöffnet. Das so erhaltene Mesenterium wurde mit 0,25% Trypsin bei 25°C für 15 Minuten behandelt, filtriert mit einem rostfreien 150-μm-Netz und anschließend zentrifugiert, um die Mesothelzellen zu sammeln. Die Zellen wurden kultiviert unter den Bedingungen von 37°C und 5% CO₂ in einem Medium, welches erhalten wurde durch Zugabe von 10% FBS zu Eagles MEM1-Medium (Nissui), ergänzt mit Eagles MEM-Aminosäure-Vitamin-Medium (Nissui) in einem Volumen, welches das Zweifache des MEM1 ausmachte. Eine Mesothelzellen-Monoschicht, welche eine konfluente Dichte nach 1 Woche Kultur erreicht hatte, wurde für das Invasionsassay verwendet.
Die MM1-Zellen, welche hochinvasive Klone von Ratten-Aszites-Hepatomzellen (AH-130) sind, wurden von Mukai et al. eingeführt (Int. J. Cancer: 81, 918–922 (1999)), und wurden unter den gleichen Bedingungen wie die Mesothelzellen kultiviert.
In-vitro-Invasionsassay
Das in-vitro-Invasionsassay wurde entwickelt von Akedo et al. (Akedo, H. et al., Cancer Res. 46, 2416–2422 (1986)). MM1-Zellen wurden als Multischicht-Kultur auf der Mesothelzellschicht kultiviert, welche gewachsen war, um eine konfluente Dichte zu erreichen, in der Gegenwart von 10% FBS oder 25 μM LPA (Sigma). 25 μM cPA wurde anschließend zugegeben. Die Zellen wurden kultiviert unter den Bedingungen von 37°C und 5% CO₂ für 20 Stunden, und anschlie ßend mit 10% Formalin fixiert. Die Anzahl der Kolonien von MM1-Zellen, welche invadiert waren, wurde unter einem Phasenkontrast-Mikroskop gezählt (3).
cPA und LPA wurden unter Eiskühlung in PBS, welches 0,1% Fettsäure-freies BSA (Sigma) enthielt, mit Ultraschall behandelt, emulgiert, bei –20°C gelagert und dann verwendet.
(B) Ergebnisse und Diskussion
Suppression der Krebszellinvasion durch 11 Arten von cPA-Derivaten
Von einigen cPA-Derivaten wurde bei Pal-cPA gezeigt, dass dieses auch sowohl die FBS-induzierte Invasion als auch die LPA-induzierte Invasion stark supprimierte (Mukai et al., Int. J. Cancer 81, 919–922 (1999)). Um die Beziehung zwischen der cPA-Struktur und der Intensität der Suppression der Invasion zu untersuchen, wurden die Wirkungen von 11 Typen von cPA-Derivaten, einschließlich Pal-cPA, welche chemisch synthetisiert wurden, auf die Invasion von Krebszellen untersucht.
Die Zellen wurden 20 Stunden nach Beginn des Invasionsassays in Gegenwart von 10% FBS fixiert, und anschließend wurde die Anzahl der Kolonien, welche invadiert waren, gezählt. Auf diese Weise wurde für 5 Typen von 25 μM cPA-Derivaten, welche kein Pal-cPA waren, eine Suppression der Invasion von mehr als 50% beobachtet (4). Für diese 5 Typen wurde die Wirkung auf eine LPA-induzierte Invasion weiter untersucht (5). Als Ergebnis wurden Unterschiede beobachtet in Bezug auf die invasionssupprimierende Wirkung in Abhängigkeit von den Unterschieden im Typ der Fettsäure, welche an der Position 1 des Glycerin-Rückgrats bindet. Die FBS-induzierte Invasion wurde durch cPA-12, welches EPA an der sn-1-Position aufweist, um ungefähr 70% supprimiert, die LPA-induzierte Invasion jedoch wurde nicht supprimiert. Dementsprechend wird angenommen, dass FBS einen die Invasion fördernden Faktor enthält, welcher nicht LPA ist, und dass cPA-12 die Invasion supprimieren kann, welche durch diesen Faktor induziert wird. Dieses stimmt außerdem überein mit der Tatsache, dass die Invasion von MM1-Zellen durch 10% FBS oder 25 μM LPA in gleichem Maße induziert wird, wobei die LPA-Konzentration in einem Medium, welches 10% FBS enthält, ungefähr ein Zehntel davon beträgt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Spezifität der invasionssupprimierenden Wirkung von cPA bereitgestellt wird durch den Typ der Fettsäure. Weitere Untersuchungen zur Korrelation von Struktur und Wirkung sind erforderlich. Überdies wurde bei carba-cPA eine starke invasionssupprimierende Wirkung beobachtet, welches gestaltet wurde, um ein Öffnen des Rings der cyclischen Phosphatgruppe zu verhindern, indem O an der sn-3-Position durch C ersetzt worden ist.
Ferner ging die invasionssupprimierende Wirkung auch dann nicht verloren, wenn nur MM1-Zellen mit cPA vorbehandelt, mit einem Medium gewaschen und anschließend in Gegenwart von LPA auf Mesothelzellen geschichtet wurden. Wenn nur Mesothelzellen mit cPA vorbehandelt, gewaschen und anschließend mit MM1-Zellen in der Gegenwart von LPA überschichtet wurden, wurde eine klare Invasion beobachtet. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass cPA seine Wirkung nicht auf Mesothelzellen sondern auf MM1-Zellen ausübt.
(1-2) Suppression der Invasion von Krebszellen durch carba-cPA
(A) Materialien und Methoden
Synthese von Carba-cPA
Das Syntheseverfahren für carba-cPA ist entwickelt worden von Susumu Kobayashi, Fakultät für pharmazeutische Wissenschaften, Wissenschaftliche Universität Tokio. Die Zahlen in der folgenden Erläuterung korrespondieren zu den Zahlen in 6.
Kommerziell erhältlicher (R)-Benzylglycidylether (1) wird mit BF₃·Et₂O aktiviert, und anschließend lässt man ein lithiiertes Produkt, welches erhalten werden kann, indem man n-BuLi auf Methylphosphonsäuredimethylester wirken lässt, mit dem aktivierten Produkt reagieren, wodurch der Alkohol (2) erhalten wird. Den erhaltenen Alkohol lässt man bei 80°C unter Verwendung eines Überschus ses an einem Pyridiniumsalz von p-Toluolsulfonsäure in Toluol reagieren, wodurch ein cyclisiertes Produkt (3) erhalten wird. Das cyclisierte Produkt wurde hydrolysiert unter Verwendung von 20% Pd(OH)₂-C in einer Wasserstoffatmosphäre, gefolgt von Debenzylierung (4). 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-Hydrochlorid wurde als Kondensationsmittel verwendet, und dieses wurde mit Fettsäure umgesetzt, wodurch ein Kupplungsprodukt (5) erhalten wurde. Als nächstes wurde Bromtrimethylsilan als Nukleophil verwendet, gefolgt von einer positionsselektiven Abspaltung von allein der Methylgruppen, sodass eine cyclische Phosphonsäure (6) erhalten wurde. Dieses Produkt wurde unter Verwendung von Ether in einen Schütteltrichter überführt und anschließend wurde eine kleine Menge von 0,02 N wässriger Natriumhydroxid-Lösung tropfenweise zugegeben, um eine Trennung durchzuführen. Anschließend wurde das interessierende Produkt als Natriumsalz (7) extrahiert und gereinigt.
In-vitro-Invasionsassay unter Verwendung von carba-cPA bei geringer Konzentration
0,5 μM, 1 μM und 10 μM carba-cPA wurden zu MM1-Zellen gegeben und anschließend wurde ein in-vitro-Invasionsassay durchgeführt, ähnlich wie bei (1-1) in der Gegenwart von 25 μM LPA.
Wirkung von carba-cPA auf die Proliferation von MM1-Zellen
12,5 μM und 25 μM cPA wurden einem Medium zugegeben, welches 10% FBS enthielt, und anschließend wurden die Zellen unter den Bedingungen von 37°C und 5% CO₂ für 24 Stunden und 72 Stunden kultiviert. Die Zahl der MM1-Zellen wurde unter Verwendung eines Hämozytometers ermittelt.
(B) Ergebnisse und Diskussion
Suppression der Invasion von Krebszellen durch carba-cPA mit geringer Konzentration
Um die Unterschiede bei der supprimierenden Wirkung, herrührend von unterschiedlichen Typen von Fettsäure, zu untersuchen, wurde carba-cPA in einer geringen Konzentration zugegeben, und anschließend wurde ein Invasionsassay durchgeführt (7).
Unter den natürlichen cPA supprimierte eines, welches Palmitinsäure an der sn-1-Position gebunden hatte, die Invasion am stärksten. Unter den carba-cPA zeigten cPA-19 mit daran gebundener Ölsäure und cPA-20 mit daran gebundener Palmitoleinsäure eine stärkere invasionssupprimierende Wirkung als cPA-18, welches eine daran gebundene Palmitinsäure aufwies.
Wirkung von carba-cPA auf die Proliferation von MM1-Zellen
Wie in 8 gezeigt, hatte cPA mit einer an der sn-1-Position gebundenen Palmitinsäure, das heißt sowohl natürliches cPA (cPA-5) als auch das carba-Derivat (cPA-18), keine Wirkung auf die Proliferation der MM1-Zellen. Ferner zeigten carba-Ole-cPA (cPA-19) und carba-ΔPal-cPA (cPA-20), welche sogar eine stärkere invasionssupprimierende Aktivität aufwiesen, ebenso eine die Proliferation supprimierende Aktivität. Sogar von Formen des natürlichen cPA, das heißt sowohl Ole-cPA als auch ΔPal-cPA, wurde gezeigt, dass diese eine die Proliferation supprimierende Wirkung besitzen. Jedoch haben Mukai et al. berichtet, dass die invasionssupprimierende Wirkung dieser molekularen Typen schwach ist (Mukai et al., Int. J. Cancer 81, 918–922 (1999)). Daher wird angenommen, dass die Wirkungen verschiedener Typen von Fettsäuren auf die Proliferation von Zellen ein Phänomen sein kann, welches unabhängig ist von der invasionssupprimierenden Wirkung.
Beispiel 2: Wirkung von cPA auf Serum/LPA-unabhängige Invasion von Krebszellen
(A) Materialien und Methoden
Zellkultur
HT-1080-Zellen, welche humane Fibrosarkomzellen sind, wurden von Mukai et al. eingeführt (Int. J. Cancer 81, 918–922 (1999)). HT-1080-Zellen wurden unter den Bedingungen von 37°C und 5% CO₂ in Eagles MEM1 (Nissui) kultiviert, er gänzt mit einem Hundertstel Volumen an nicht-essentieller Aminosäure-Lösung (GIBCO BRL) und 10% FBS.
In-vitro-Invasionsassay
HT-1080-Zellen wurden gesammelt durch eine Behandlung mit 0,05% Trypsin, gewaschen mit einem serumfreien Medium und anschließend einem Assay unterworfen, ähnlich jenem, welches in Kapitel 1 gezeigt wurde, in Abwesenheit von Serum/LPA. 4 Stunden später wurden die Zellen fixiert und anschließend wurden die Zellen, welche invadiert waren, gezählt.
In-vitro-Invasionsassay von MM1-Zellen unter Verwendung des Überstands der Kultur der HT-1080-Zellen
Das Medium der HT-1080-Zellen wurde ausgetauscht gegen ein serumfreies Medium, und anschließend wurden die Zellen unter den Bedingungen von 37°C und 5% CO₂ für 20 Stunden kultiviert. Das Medium wurde gesammelt und zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde als Kulturüberstand verwendet. MM1-Zellen, welche einmal gewaschen worden waren, wurden in diesem Überstand suspendiert, und anschließend wurde ein Invasionsassay durchgeführt, ähnlich dem, welches in Abschnitt 0043 beschrieben wurde.
(B) Ergebnisse und Diskussion
Wirkung von carba-cPA auf die Serum/LPA-unabhängige Invasion von Krebszellen
Bei dem in-vitro-Invasionsassay-System erfolgt die Invasion der HT-1080-Zellen auf eine Serum/LPA-unabhängige Weise. Von diesem Phänomen ist auch gezeigt worden, dass es durch Pal-cPA supprimiert wird (Mukai et al., Int. J. Cancer 81, 918–922 (1999)). Auf Grundlage dieses Befundes wurde die Wirkung von carba-cPA auf die Invasion von HT-1080-Zellen unter Verwendung von cPA-18 (carba-Pal-cPA) untersucht, welches die gleiche Fettsäure aufweist. Wie in 9 gezeigt, zeigt carba-cPA ebenso eine invasionssupprimierende Wirkung auf die Zellen, mit gleicher Stärke oder um eine Stufe stärker als jene Wirkung, welche natürliches cPA aufweist.
Wirkung des Kulturüberstands von HT-1080-Zellen auf die MM1-Zellinvasion
HT-1080-Zellen können selber LPA synthetisieren, und die Invasion kann durch das LPA induziert werden. Unter Berücksichtigung dieser Möglichkeit wurden MM1-Zellen, welche LPA-abhängig invadieren, im Kulturüberstand von HT-1080-Zellen suspendiert und anschließend auf Mesothelzellen geschichtet, und das Auftreten der Invasion wurde untersucht. MM1-Zellen (1,5 × 10⁵ Zellen/ml) wurden im serumfreien Kulturüberstand von HT-1080-Zellen suspendiert und anschließend einem in-vitro-Invasionsassay unterworfen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Demzufolge wurde die Invasion der MM1-Zellen nicht gefördert (Tabelle 1). Darüber hinaus, sogar wenn 25 μM LPA zu dem in-vitro-Invasionsassay-System unter Verwendung von HT-1080-Zellen zugegeben wurden, wurde die Invasion nicht länger gefördert. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der die Invasion fördernde Faktor von HT-1080-Zellen sich vom LPA unterscheidet. Tabelle 1

Zugegebenes Medium Zahl invadierender Zellen/cm²

unbehandeltes Medium 97,7 ± 38,4

aufbereitetes Medium 72,2 ± 18,4
Beispiel 3: Analyse des Signaltransduktionssystems für die Suppression der Invasion durch cPA
(A) Materialien und Methoden
Wirkung eines Reagenz zur Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration bei Invasion
Die folgenden Reagenzien wurden einem in-vitro-Invasionsassay-System entsprechend zugegeben, um so ihre Wirkungen auf die Invasion von MM1-Zellen in Gegenwart von 25 μM LPA:Forskolin (Wako) zu untersuchen, welches unmit telbar Adenylatcyclase (cAMP-Cyclase) aktiviert, Cholera-Toxin (CTX) (GIBCO BRL), welches die Deaktivierung von G-Protein (Gs) verhindert, welches Adenylatcyclase aktiviert; Bt₂cAMP (Nacalai Tesque), welches durch die Membran hindurch gehen kann und auf eine Weise ähnlich der des cAMP wirkt, wenn es in die Zelle eindringt; oder Isobutylmethylxanthin (IBMX, 3-Isobutyl-1-methylxanthin) (SIGMA), welches Phosphodiesterase hemmt (cAMP-abbauendes Enzym).
Messung des intrazellulären cAMP
Die MM1-Zellen in einem serumfreien Medium wurden mit 1 mM IBMX für 10 Minuten vorbehandelt, und anschließend wurden 25 μM LPA oder cPA oder 10 μM Forskolin, welche erwiesenermaßen die Invasion supprimieren, als Positivkontrolle zugegeben. Nach einer bestimmten Zeitdauer wurde 10% eisgekühltes TCA zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Der zentrifugierte Überstand wurde 4 Mal mit Wasser-gesättigtem Diethylether gewaschen, um die TCA zu entfernen, und anschließend unter einen Strom von Stickstoffgas bei 60°C gesetzt, um das Lösungsmitte vollständig zu entfernen. Das cAMP in der resultierenden Probe wurde gemessen unter Verwendung eines cyclisches-AMP-[³H]-Assay-Systems (Amersham).
(B) Ergebnisse und Diskussion
Wirkung von gesteigerter intrazellulärer cAMP-Konzentration auf die Invasion von Krebszellen
Es ist bekannt, dass eine gesteigerte intrazelluläre cAMP-Konzentration die Aktivität von Rho hemmt, welches eines der niedermolekularen G-Proteine ist, indem die cAMP-abhängige Proteinkinase A aktiviert wird (Laudanna, C. et al., J. Biol. Chem. 272, 24141–24144 (1997) und Dong, J-M. et al., J. Biol. Chem. 273, 22554–22562 (1998)). Zusätzlich ist berichtet worden, dass Pal-cPA zu einer Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration von MM1-Zellen führt (Mukai, M. et al., Int. J. Cancer 81, 918–922 (1999)). Dementsprechend wurde die Wirkung von cAMP auf die LPA-induzierte Invasion untersucht, von welcher gezeigt worden ist, dass sie durch Rho vermittelt wird.
Wie in 10 gezeigt, supprimierte jedes Mittel die Invasion der Krebszellen. Dementsprechend wurden unter Verwendung von Forskolin, einem dieser Reagenzien, als Positivkontrolle die Veränderungen bei der intrazellulären cAMP-Konzentration gemessen, welche herrühren von der Zugabe von carba-cPA, und die Beteiligung bei der die Invasion supprimierenden Wirkung wurde untersucht.
Wirkung von carba-cPA auf die intrazelluläre cAMP-Konzentration
Wie in 11 gezeigt, obwohl eine Steigerung der cAMP-Konzentration, welche herrührt von der Gegenwart von Forskolin, gemessen werden konnte, konnte eine zuvor berichtete schnelle Steigerung der cAMP-Konzentration, welche von der Zugabe von Pal-cPA herrührt, nicht bestätigt werden. Sogar wenn carba-cPA zugegeben wurde, wurde ein ähnliches Ergebnis erhalten. Jedoch wurde die Invasion der gleichen Zellen durch LPA induziert, und die Invasion wurde supprimiert durch Pal-cPA, was auf die Existenz eines weiteren invasionssupprimierenden Mechanismus hinweist, welcher nicht durch cAMP vermittelt wird.
Schlussfolgerung aus den Beispielen 1 bis 3
In Beispiel 3 wurde ein in-vitro-Invasionsassay durchgeführt unter Verwendung verschiedener cPA-Derivate. Zuerst wurden, als die Wirkung von cPA auf die Serum-induzierte Invasion untersucht wurde, Unterschiede bei der invasionssupprimierenden Wirkung beobachtet aufgrund eines strukturellen Unterschieds, wie in 4 gezeigt. Von diesen Derivaten wurden 6 Typen von cPA-Derivaten, einschließlich Pal-cPA, welches eine invasionssupprimierende Aktivität von mehr 50% aufweist, wenn zu 25 μM zugegeben, auf ihre Wirkungen auf LPA-induzierte Invasion untersucht (5). cPA-12 mit EPA an der sn-1-Position, welches die Serum-induzierte Invasion um ungefähr 70% supprimiert hatte, supprimierte nicht die die LPA-induzierte Invasion. Dieses Ergebnis wies auf die Möglichkeit der Gegenwart einer anderen Substanz im Serum als LPA hin, welche die Invasion fördert. Ferner wurde eine invasionssupprimierende Aktivität bei carba-cPA gefunden, welches dazu geschaffen wurde, das Öffnen des Rings der cyclischen Phosphatgruppen zu verhindern, indem O an der sn-3-Position durch C substituiert worden war. Diese Aktivität war in signifikanter Weise stark, in einem Ausmaß, welches 10 bis 100 Mal größer ist als jene, welche natürliches cPA aufweist (7).
In Beispiel 2 wurde sich auf das carba-cPA konzentriert. Die Wirkung von carba-cPA auf die Invasion von Krebszellen, welche für ihre Invasion kein Serum/LPA benötigen, wurde untersucht. Wie in 9 gezeigt, wurde bei carba-cPA beobachtet, dass es eine starke invasionssupprimierende Aktivität auf die LPA-abhängige Invasion aufweist, verglichen mit dem Fall des natürlichen cPA.
Ferner wurden die Wirkung und der Mechanismus der Invasionssuppression durch carba-cPA in Beispiel 3 analysiert. LPA fördert die Invasion durch die Aktivierung von Rho, welches eines der Proteine mit geringem Molekulargewicht ist. Darüber hinaus wird die intrazelluläre cAMP-Konzentration durch Zugabe von Pal-cPA erhöht, sodass die Rho-Aktivität unterdrückt wird. Unter Berücksichtigung der daher angenommenen Möglichkeit, dass carba-cPA außerdem einen Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration verursachen kann, um so die Invasion zu supprimieren, wurde die intrazelluläre cAMP-Konzentration gemessen (11). Jedoch konnte, obwohl eine erhöhte cAMP-Konzentration durch Forskolin gemessen wurde, welches eine Positivkontrolle ist, der vom Pal-cPA herrührende Anstieg der cAMP-Konzentration nicht bestätigt werden. Sogar im Falle des carba-Pal-cPA wurde die Änderung der cAMP-Konzentration nicht beobachtet. Die Tatsache, dass für Pal-cPA eine Reproduzierbarkeit nicht beobachtet wurde, kann begründet sein in einer Veränderung der MM1-Zellen. Jedoch wurden die Serum/LPA-induzierte Invasion und die Suppression der Invasion durch Pal-cPA auch bei dieser Zelle beobachtet, was auf die Gegenwart eines anderen, die Invasion supprimierenden Systems hinweist, welches nicht durch cAMP vermittelt wird.
Beispiel 4: Supprimierende Wirkung der cyclischen Phosphatidsäurederivate cPA-19 und cPA-20 auf die Lungenmetastasen von B16-Melanomen unter Verwendung eines Modells zur hämatogenen Lungen-Metastasierung bei B16-Melanomen.
Testmaterialien und Methoden
1. Testsubstanz, Medium und Substanz zur Positivkontrolle
cPA-19 und cPA-20 wurden als Testsubstanzen verwendet. Als Medium wurde 0,1% (g/v) BSA/PBS verwendet, welches hergestellt wurde durch Lösen von bovinem Albumin [im Wesentlichen frei von Fettsäuren] (BSA, Chargennummer 89H7604, Sigma Chemical Company) in PBS (pH 7,2), welches frei war von Ca²⁺ und Mg²⁺. Nach der Zubereitung wurde die Lösung sterilisiert durch Filtration unter Verwendung eines Filters (0,22 μm, Millipore). Die Zubereitung erfolgte bei Anwendung. cPA-5 wurde als Substanz zur Positivkontrolle verwendet.
2. Herstellungsverfahren für Mischung und Häufigkeit
Ein Medium wurde zugegeben in einem Volumen, welches für eine Testsubstanz oder eine Substanz als Positivkontrolle erforderlich war. Das Auflösen erfolgte durch Anwendung von Ultraschall, wodurch eine Lösung von 0,16 mg/ml hergestellt wurde. Die 0,16 mg/ml-Lösung, enthaltend eine Testsubstanz, wurde mit einem Medium verdünnt, wodurch Lösungen mit 0,08 und 0,02 mg/ml hergestellt wurden. Alle Mischungen wurden zubereitet, wenn angewendet.
3. Testsystem und die Milieubedingungen dafür
Mäuse wurden erworben von CHARLES RIVER JAPAN INC. Die hier eingesetzte Linie war C57BL/6NCrj (Geschlecht: weiblich). Die Zahl der vorgehaltenen Tiere betrug 60, und das Alter dieser vorgehaltenen Tiere betrug 4 Wochen. Das Körpergewicht reichte von 10,2 bis 14,0 g. Die Milieubedingungen für das Testsystem waren wie folgt:
Temperatur: 23 bis 26°C
Luftfeuchtigkeit: 54 bis 60%
Häufigkeit der Belüftung: 13 Mal/Stunde
Beleuchtung: 12 Stunden (von 07:00 Uhr bis 19:00 Uhr)
Futter: CRF-1-Diät in Würfelform ad lib (Oriental Yeast Co., Ltd.), einer Hochdruckdampf-Sterilisation unterworfen.
Trinkwasser: Quellwasser, ergänzt mit Natriumhypochlorit (verbleibende Chlor-
Konzentration: ungefähr 2 ppm), ad lib durch einen Topf zur Wasserversorgung.
Streu: weiße Flocken (CHARLES RIVER JAPAN INC.), einer Hochdruckdampf-Sterilisation unterworfen, wurden verwendet.
Zuchtkäfig und Häufigkeit des Austauschens: Käfige aus Polycarbonat, einer Hochdruckdampf-Sterilisation unterworfen, wurden verwendet (B 215 × H 140 × T 320 mm). Die Käfige wurden zweimal die Woche ausgetauscht, zusammen mit der Streu.
Zahl der Tiere, die je Käfig gehalten wurden: während des Quarantäne- und Akklimatisierungszeitraums wurden 5 Mäuse je Käfig gehalten. Während des Testzeitraums wurden 3 Mäuse je Käfig gehalten.
Waschen und Sterilisation: Der Zuchtraum wurde jeden Tag gereinigt, und der Boden wurde mit einer antiseptischen Lösung gespült.
4. Testverfahren
4.1 Name der Tumorzellen
Das maligne Mäuse-Melanom B16-F0 wurde als Tumorzelle verwendet. Die Zelle wurde erworben von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
4.2 Kultur
Das modifizierte Eagle-Medium von Dulbecco, enthaltend 10% fötales bovines Serum und Kanamycin, wurde für die Kultur verwendet. Die Zellen wurden statisch kultiviert in einem CO₂-Inkubator bei 37°C und 5% CO₂ unter den Bedingungen einer Luftfeuchtigkeit von 95%. Nachdem die Tumorzellen einen semi-konfluenten Zustand erreicht hatten, wurden die Zellen geerntet unter Verwendung einer Mischung aus 0,25% Trysin und 0,02% EDTA. Ein Medium wurde zugegeben, um die Wirkung von Trypsin während des Pipettierens zu stoppen, wodurch eine Zellsuspension hergestellt wurde. Die Suspension wurde mit einem Medium zum Kultivieren auf ein Zehntel verdünnt, gefolgt von einer Subkultivierung, bis diese ein Volumen erreichte, welches zur Verpflanzung ausreichte.
4.3 Vorbereitung der Tumorzellen-Suspension für die Verpflanzung
Eine Zellsuspension wurde mit der gleichen Technik hergestellt wie beim Subkultur-Verfahren. Insbesondere wurden die Zellen mit Phosphatpuffer gewaschen, welcher frei war von Ca²⁺ und Mg²⁺ [PBS(–)], und anschließend geerntet. Die geernteten Zellen wurden in 10 ml PBS(–) suspendiert, wodurch eine Zellsuspension hergestellt wurde. Die Anzahl der Zellen in der Zellsuspension wurde gemessen, um die Gesamtzahl der Zellen zu erhalten. 50 μl der Zellsuspension, 100 μl an Trypanblau-Lösung und 100 μl an PBS(–) wurden gemischt und anschließend die Zahl der lebenden Zellen ermittelt. Die Überlebensrate der Zellen wurde errechnet aus der Zahl der lebenden Zellen und der Gesamtzahl der Zellen. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde die Zahl der lebenden Zellen auf 1 × 10⁷ Zellen/ml eingestellt, wodurch eine Tumorzellen-Suspension für das Verpflanzen hergestellt wurde.
4.4 Verabreichung

Basierend auf dem Körpergewicht am Tag der Verabreichung der Testsubstanz wurden die Mäuse in 8 Testgruppen eingeteilt, entsprechend dem geschichteten kontinuierlichen Zufallsverfahren, wie in Tabelle 2 unten gezeigt. Tabelle 2

Testgruppe	Dosis (mg/Körper)	Konzentration der verabreichten Substanz (mg/0,05 ml)	Tumorzellen-Suspension (Zellen/0,05 ml)	Volumen der Dosis (ml/Körper)	Weg der Verabreichung	Anzahl der verwendeten Tiere
Medium	-	-	5 × 10⁵	0,1	intravenös	6
cPA-19	0,001	0,001				6
	0,004	0,004				6
	0,008	0,008				6
cPA-20	0,001	0,001				6
	0,004	0,004				6
	0,008	0,008				6
cPA-5	0,008	0,008				6

Vorherige Testergebnisse zeigten, dass weder die Testsubstanz noch die Positivkontrolle die Wirkung einer Suppression der Proliferation auf maligne B16-Mausmelanome ausübten. Daher wurde die Testsubstanz oder die Positivkontrolle mit einer B16-F0-Zellsuspension in einem Verhältnis von 1:1 gemischt. Die Mischung wurde über die Schwanzvene verabreicht. Die Anzahl der verpflanzten Zellen betrug 5 × 10⁵ Zellen/Körper. Die Dosis der Testsubstanz betrug 0,001, 0,004 oder 0,008 mg/Körper, und die Dosis an Substanz der Positivkontrolle betrug 0,008 mg/Körper.
4.5 Beobachtung des Allgemeinzustands und Messung des Körpergewichtes
Die Beobachtungsdauer reichte von Tag 0 bis Tag 14 nach Verabreichung der Testsubstanz. Leben und Tod wurden während dieses Zeitraums jeden Tag festgehalten, und der Allgemeinzustand wurde beobachtet. Messungen des Körpergewichtes erfolgten zweimal die Woche.
4.6 Autopsie
An Tag 14 nach Verabreichung der Testsubstanz wurde Blut aus dem hinteren Bereich der abdominalen Hohlvene unter Isofluran-Anästhesie gesammelt. Nachdem die Mäuse durch den Blutverlust gestorben waren, wurde die Gegenwart oder Abwesenheit intrapleuraler und intraperitonealer metastatischer Knötchen festgehalten. Die Lungen wurden herausgenommen und mit 10% neutraler gepufferter Formalinlösung fixiert. Die Anzahl der Knötchen, welche von der Lungenmetastasierung herrührten, wurde unter einem Stereomikroskop gemessen (Vergrößerung: 10-fach).
4.7 Histopathologische Untersuchung
Nach der Messung der Anzahl der Knötchen, welche von der Lungen-Metastasierung herrührten, wurden die Proben in Paraffin eingelegt und anschließend dünne Schnitte präpariert. Von diesen Schnitten wurden Hämatoxylin-Eosin-gefärbte Proben präpariert. Die Anzahl metastatischer Läsionen in bestimmten Bereichen des linken Lappens und des hinteren Lappens wurde gemessen, und anschließend wurden die Läsionen nach Größe sortiert. Auf Grundlage des Durchmessers (0,65 mm) eines Objektivs (×40), wurden metastatische Läsionen mit hauptsächlichen Durchmessern von weniger als 0,65 mm als klein klassifiziert, und jene mit hauptsächlichen Durchmessern zwischen 0,65 mm oder mehr und weniger als 1,30 mm wurde als groß klassifiziert. Ferner wurde der Grad der Invasion von Lymphozyten in die metastatischen Läsionen qualitativ bestimmt.
5. Statistisches Analyseverfahren
Der repräsentative Wert jeder Testgruppe wurde als Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD) angegeben. Unterschiede im Mittelwert wurden wie folgt untersucht. Die Anzahl metastatischer Knötchen wurde untersucht mittels des Multiple-Vergleiche-Tests nach Dunnett zwischen der Medium-Gruppe und der cPA-19-Gruppe, und zwischen der Medium-Gruppe und der cPA-20-Gruppe. Das gleiche wurde untersucht mittels der Studentschen t-Tests zwischen der Medium-Gruppe und der cPA-5-Gruppe. Die Anzahl metastatischer Läsionen wurde untersucht mit dem Wilcoxon-Test unter Verwendung der Medium-Gruppe als Kontrolle. Die Anzahl der Tiere mit metastatischen Knötchen oder metastatischen Läsionen wurde untersucht mittels des Tests der Auswahlwahrscheinlichkeit nach Fisher unter Verwendung der Medium-Gruppe als Kontrolle. Die Signifikanzniveaus betrugen 1% und 5%.
Ergebnisse
1. Allgemeinzustand
In allen Testgruppen wurden während des Beobachtungszeitraums keine Todesfälle beobachtet. Zusätzlich wurden keine Abweichungen beim Allgemeinzustand beobachtet.
2. Veränderungen des Körpergewichtes (12 und Tabelle 3)
Veränderungen des Körpergewichtes in der jeweiligen Testgruppe sind in 12 und Tabelle 3 gezeigt.
Am Tag der Verabreichung der Testsubstanz betrug das mittlere Körpergewicht in der Medium-Gruppe 16,0 ± 0,5 g. Die mittleren Körpergewichte in den Gruppen, welchen cPA-19 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, betrugen 15,9 ± 0,6, 15,9 ± 0,6 beziehungsweise 15,9 ± 0,6 g. Die mittleren Körpergewichte in den Gruppen, welchen cPA-20 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, betrugen 15,9 ± 0,6, 16,0 ± 0,6 beziehungsweise 15,9 ± 0,5 g. Das mittlere Körpergewicht in der cPA-5-Gruppe betrug 15,9 ± 0,6 g. Am Tag 4 nach Verabreichung der Testsubstanz betrug das mittlere Körpergewicht in der Medium-Gruppe 15,7 ± 0,8 g. Die mittleren Körpergewichte in den Gruppen, welchen cPA-19 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, betrugen 15,5 ± 0,5, 16,0 ± 0,5 beziehungsweise 15,4 ± 0,5 g. Die mittleren Körpergewichte in den Gruppen, welchen cPA-20 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, betrugen 15,5 ± 0,3, 16,0 ± 0,7 beziehungsweise 16,1 ± 0,8 g. Das mittlere Körpergewicht in der cPA-5-Gruppe betrug 15,8 ± 0,9 g. An Tag 7 nach Verabreichung der Testsubstanz betrug das mittlere Körpergewicht in der Medium-Gruppe 16,1 ± 1,1 g. Die mittleren Körpergewichte in den Gruppen, welchen cPA-19 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, betrugen 15,8 ± 0,7, 16,1 ± 0,6 beziehungsweise 15,9 ± 0,5 g. Die mittleren Körpergewichte in den Gruppen, welchen cPA-20 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, betrugen 16,1 ± 0,6, 16,2 ± 0,6 beziehungsweise 16,3 ± 0,8 g. Das mittlere Körpergewicht in der cPA-5-Gruppe betrug 16,2 ± 1,0 g. An Tag 11 nach Verabreichung der Testsubstanz betrug das mittlere Körpergewicht in der Medium-Gruppe 16,9 ± 1,2 g. Die mittleren Körpergewichte in den Gruppen, welchen cPA-19 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, betrugen 16,5 ± 1,0, 16,7 ± 0,6 beziehungsweise 16,8 ± 0,5 g. Die mittleren Körpergewichte in den Gruppen, welchen cPA-20 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, betrugen 16,8 ± 0,4, 16,9 ± 0,7 beziehungsweise 17,0 ± 0,9 g. Das mittlere Körpergewicht in der cPA-5-Gruppe betrug 17,0 ± 0,8 g. An Tag 14 nach Verabreichung der Testsubstanz betrug das mittlere Körpergewicht in der Medium-Gruppe 17,3 ± 1,2 g. Die mittleren Körpergewichte in den Gruppen, welchen cPA-19 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verab reicht wurde, betrugen 17,1 ± 1,2, 17,6 ± 0,9 beziehungsweise 17,0 ± 0,4 g. Die mittleren Körpergewichte in den Gruppen, welchen cPA-20 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, betrugen 17,4 ± 0,6, 17,5 ± 0,8 beziehungsweise 17,7 ± 0,8 g. Das mittlere Körpergewicht in der cPA-5-Gruppe betrug 17,4 ± 1,0 g. Zum Zeitpunkt jeder Messung wurde der Wert für das Körpergewicht der jeweiligen Gruppe verglichen mit dem der Medium-Gruppe. Demnach wurde kein signifikanter Unterschied gefunden zwischen der cPA-19-, cPA-20- oder der cPA-5-Gruppe im Vergleich zur Medium-Gruppe. Ferner wurde der Wert für das Körpergewicht bei jedem Zeitpunkt der Messung verglichen mit dem am Tag der Verabreichung der Testsubstanz. Demnach wurden an Tag 4 nach Verabreichung der Testsubstanz zeitweilige Abnahmen des Körpergewichtes in der Medium-Gruppe, den Gruppen, welchen cPA-19 bei 0,001 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, den Gruppen, welchen cPA-20 bei 0,001 mg/Körper verabreicht wurden, sowie der cPA-5-Gruppe, beobachtet.
3. Knötchen, welche von der Lungenmetastasierung herrühren (13 und Tabelle 4)
Die Ergebnisse der Untersuchung der Anzahl metastatischer Knötchen in den Lungen (herausgenommen an Tag 14 nach Verabreichung der Testsubstanz) sind in 14 und Tabelle 4 gezeigt.
Die Anzahl der Mäuse mit metastatischen Knötchen betrug in der Medium-Gruppe 6. 6, 6 und 0 Mäuse in den Gruppen, welchen cPA-19 bei 0,001, 0,004 beziehungsweise 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, hatten metastatische Knötchen. 6, 2 und 1 Mäuse in den Gruppen, welchen cPA-20 bei 0,001, 0,004 beziehungsweise 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, hatten metastatische Knötchen. 6 Mäuse in der cPA-5-Gruppe hatten metastatische Knötchen. Verglichen mit der Medium-Gruppe hat sich die Anzahl der Mäuse mit metastatischen Knötchen in den Gruppen signifikant verringert, welchen cPA-19 bei 0,008 mg/Körper und cPA-20 bei 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden.
Die Anzahl metastatischer Knötchen in der Medium-Gruppe betrug 49 ± 20 (Minimum-Maximum: 28–84; gleiches gilt für die folgende Erläuterung). In den Gruppen, welchen cPA-19 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, traten 54 ± 12 (37–66), 4 ± 2 (2–6) beziehungsweise 0 ± 0 (0) Knötchen auf. In den Gruppen, welchen cPA-20 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, traten 58 ± 40 (17–112), 1 ± 2 (0–4) beziehungsweise 0 ± 0 (0–1) Knötchen auf. In der cPA-5-Gruppe traten 21 ± 13 (5–38) Knötchen auf. Verglichen mit der Medium-Gruppe verringerte sich die Anzahl der Knötchen, welche von der Lungenmetastasierung herrührten, in den Gruppen, welchen cPA-19 bei 0,004 und 0,008 mg/Körper und cPA-20 bei 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, sowie in der cPA-5-Gruppe, signifikant.
4. Autopsie (Tabelle 5)

Die Ergebnisse der Autopsie sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5: Wirkung von cPA-19 oder cPA-20 auf intrapleurale und intraperitoneale metastatische Knötchen

Bauchhöhle
Gruppe	^Dosis (mg/Körper)	Tier Nr.	Brust höhle	Zwerch fell	Milz	Neben niere	Niere	Eierstöcke	Fettgewebe	Gewebe um die Klitorisdrüse
Lösungsmittel	-	301	-	-	+	-	-	+	+	-
		302	-	-	+	-	-	-	-	-
		303	-	-	-	-	-	+	-	-
		304	-	-	+	-	-	-	-	-
		305	-	-	+	-	-	-	+	-
		306	+	-	+	-	-	-	-	-
	0,001	307	-	-	-	+	+	+	+	-
		308	-	-	-	-	+	+	-	-
		309	+	-	+	-	-	-	-	-
		310	-	-	-	-	-	-	-	-
		311	-	-	-	-	-	-	-	-
		312	-	-	-	-	-	-	-	-
cPA-19	0,004	313	-	-	+	-	-	-	-	-
		314	-	-	-	-	-	-	-	-
		315	-	-	-	-	-	-	-	-
		316	-	-	-	-	-	-	-	-
		317	-	-	-	-	-	-	-	-
		318	-	-	-	+	-	-	+	-
	0,008	319	-	-	-	-	-	-	-	-
		320	-	-	-	-	-	-	-	-
		321	-	-	-	-	-	-	-	-
		322	-	-	-	-	-	-	-	-
		323	-	-	+	-	-	-	-	-
		324	-	-	-	-	-	-	-	-
cPA-20	0,001	325	-	-	-	-	-	-	-	-
		326	-	-	+	-	-	-	-	-
		327	+	+	-	-	-	-	-	+
		328	-	-	-	-	-	+	-	-
		329	-	-	-	-	-	-	-	-
		330	-	-	-	-	-	-	-	-
	0,004	331	-	-	-	-	-	-	-	-
		332	-	-	-	-	-	-	-	-
		333	-	-	-	-	-	-	-	-
		334	-	-	-	-	-	-	-	-
		335	-	-	-	-	-	-	-	-
		336	-	-	+	-	-	-	-	-
	0,008	337	-	-	-	-	-	-	-	-
	0,008	338	-	-	-	-	-	-	-	-
		339	-	-	-	-	-	-	-	-
		340	-	-	-	-	-	-	-	-
		341	-	-	-	-	-	-	-	-
		342	-	-	+	-	-	-	-	-
cPA-5	0,008	343	-	-	+	-	-	-	-	-
		344	-	-	+	-	-	-	-	-
		345	-	-	+	-	-	-	-	-
		346	-	-	-	-	-	-	-	-
		347	-	-	-	-	-	-	-	-
		348	-	-	-	-	-	-	-	-

-: nicht vorhanden
+: vorhanden

In der Medium-Gruppe wurden metastatische Knötchen beobachtet in der Brusthöhle (1 Fall) und in der Bauchhöhle: Milz (5 Fälle), Eierstöcke (2 Fälle) und Fettgewebe (2 Fälle). In der Gruppe, welcher cPA-19 bei 0,001 mg/Körper verabreicht wurde, wurden metastatische Knötchen beobachtet in der Brusthöhle (1 Fall) und in der Bauchhöhle: Milz (1 Fall), Eierstöcke (2 Fälle), Nebenniere (1 Fall), Niere (2 Fälle) und Fettgewebe (1 Fall). In der Gruppe, welcher cPA-19 bei 0,004 mg/Körper verabreicht wurde, wurden in der Brusthöhle keine metastatischen Knötchen beobachtet, jedoch in der Bauchhöhle: Milz (1 Fall), Nebenniere (1 Fall) und Fettgewebe (1 Fall). In der Gruppe, welcher cPA-19 bei 0,008 mg/Körper verabreicht wurde, wurden in der Brusthöhle keine metastatischen Knötchen beobachtet, jedoch in der Bauchhöhle: Milz (1 Fall). In der Gruppe, welcher cPA-20 bei 0,001 mg/Körper verabreicht wurde, wurden in der Brusthöhle metastatische Knötchen beobachtet (1 Fall) sowie in der Bauchhöhle: Zwerchfell (1 Fall), Milz (1 Fall), Eierstöcke (1 Fall) und Gewebe um die Klitorisdrüse (1 Fall). In der Gruppe, welcher cPA-20 bei 0,004 mg/Körper verabreicht wurde, wurden in der Brusthöhle keine metastatischen Knötchen beobachtet, jedoch in der Bauchhöhle: Milz (1 Fall). In der Gruppe, welcher cPA-20 bei 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, wurden in der Brusthöhle keine metastatischen Knötchen beobachtet, jedoch in der Bauchhöhle: Milz (1 Fall). In der cPA-5-Gruppe wurden keine metastatischen Knötchen in der Brusthöhle beobachtet, jedoch in der Bauchhöhle: Milz (3 Fälle). In den cPA-19- und den cPA-20-Gruppen verringerte sich die Anzahl der Mäuse, welche intrapleurale oder intra peritoneale metastatische Knötchen aufwiesen, wenn die Dosis erhöht wurde.
5. Histopathologische Untersuchung (14, Tabelle 6 und Tabelle 7)

Die Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung sind in 14, Tabelle 6 und Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7: Histopathologische Befunde der Lunge von Mäusen mit B16-F0-Melanom

Gruppe	Dosis (mg/Körper)	Tier Nr.	Befunde
Gruppe	Dosis (mg/Körper)	Tier Nr.	Invasion von Lymphozyten in die metastastischen Läsionen der Melanome
Lösungsmittel	-	301	-
		302	-
		303	-
		304	+
		305	-
		306	-
	0,001	307	-
		308	+
		309	-
		310	-
		311	-
		312	-
cPA-19	0,004	313	*
		314	*
		315	-
		316	-
		317	*
		318	*
	0,008	319	*
		320	*
		321	*
		322	*
		323	*
		324	*
cPA-20	0,001	325	-
		326	-
		327	*
		328	++
		329	-
		330	*
	0,004	331	-
		332	*
		333	*
		334	*
		335	*
		336	*
	0,008	337	*
		338	*
		339	*
		340	*
		341	*
		342	*
cPA-5	0,008	343	-
		344	++
		345	-
		346	+
		347	*
		348	-

Grade: -, keine; +, geringe Menge; ++, mäßig; +++, große Menge; *: nicht getestete (keine metastatische Läsion) Schicht

Die Anzahl von Mäusen mit metastatischen Läsionen betrug in der Medium-Gruppe 6. In den Gruppen, welchen cPA-19 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, betrugen die Zahlen 6, 2 beziehungsweise 0. In den Gruppen, welchen cPA-20 bei 0,001, 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden, betrugen die Zahlen 4, 1 beziehungsweise 0. 5 Mäuse wiesen metastatische Läsionen in der cPA-5-Gruppe auf. Verglichen mit der Medium-Gruppe verringerte die die Zahl der Mäuse mit metastatischen Läsionen signifikant in den Gruppen, welchen cPA-19 bei 0,004 und 0,008 mg/Körper und cPA-20 bei 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden.
Bezüglich der Zahl metastatischer Läsionen in der Lunge gab es 1,3 ± 1,5 kleine, 1,3 ± 1,0 große und insgesamt 2,7 ± 2,4 metastatische Läsionen in der Medium-Gruppe. In der Gruppe, welcher cPA-19 bei 0,001 mg/Körper verabreicht wurde, gab es 3,0 ± 1,3 kleine, 0,7 ± 0,8 große und insgesamt 3,7 ± 1,8 metastatische Läsionen. In der Gruppe, welcher cPA-19 bei 0,004 mg/Körper verabreicht wurde, gab es 0,3 ± 0,5 kleine metastatische Läsionen, jedoch wurden keine großen metastatischen Läsionen beobachtet. In der Gruppe, welcher cPA-19 bei 0,008 mg/Körper verabreicht wurde, wurden keine metastatischen Läsionen beobachtet. In der Gruppe, welcher cPA-20 bei 0,001 mg/Körper verabreicht wur de, gab es 3,2 ± 3,5 kleine, 1,2 ± 1,3 große und insgesamt 4,3 ± 4,6 metastatische Läsionen. In der Gruppe, welcher cPA-20 bei 0,004 mg/Körper verabreicht wurde, gab es 0,2 ± 0,4 kleine metastatische Läsionen, jedoch wurden keine großen metastatischen Läsionen beobachtet. In der Gruppe, welcher cPA-20 bei 0,008 mg/Körper verabreicht wurde, wurden keine metastatischen Läsionen beobachtet. In der cPA-5-Gruppe gab es 1,2 ± 0,8 kleine, 0,8 ± 0,8 große und insgesamt 2,0 ± 1,3 metastatische Läsionen. Verglichen mit der Medium-Gruppe verringerte sich die Zahl metastatischer Läsionen signifikant in der Gruppe, welcher cPA-19 bei 0,008 mg/Körper und cPA-20 bei 0,008 mg/Körper verabreicht wurde; die Zahl der großen metastatischen Läsionen verringerte sich signifikant in den Gruppen, welchen cPA-19 bei 0,004 und 0,008 mg/Körper und cPA-20 bei 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden; und die Gesamtzahl der metastatischen Läsionen verringerte sich signifikant in der Gruppe, welcher cPA-19 bei 0,004 und 0,008 mg/Körper und cPA-20 bei 0,004 und 0,008 mg/Körper verabreicht wurde.
Die Invasion von Lymphozyten in metastatische Läsionen wurde in der Medium-Gruppe in 1 von 6 Fällen beobachtet. In der Gruppe, welcher cPA-19 bei 0,001 mg/Körper verabreicht wurde, wurde die Invasion von Lymphozyten in metastatische Läsionen in 1 von 6 Fällen beobachtet, jedoch wurden in 2 Fällen keine Invasionen in der Gruppe beobachtet, welcher dasselbe bei 0,004 mg/Körper verabreicht wurde. In der Gruppe, welcher cPA-20 bei 0,001 mg/Körper verabreicht wurde, wurde eine Invasion von Lymphozyten in metastatische Läsionen in 1 von 4 Fällen beobachtet, jedoch wurden in 1 Fall in der Gruppe, welcher dasselbe bei 0,004 mg/Körper verabreicht wurde, keine Invasionen beobachtet. In der cPA-5-Gruppe wurde eine Invasion von Lymphozyten in metastatische Läsionen in 2 von 5 Fällen beobachtet. Es gab bei keiner der Testgruppen Unterschiede im Ausmaß der Invasion der Lymphozyten in die metastatischen Läsionen.
Diskussion
Die hämatogene Metastasierung, welche ein Hauptpfad der Krebsmetastasierung ist, besteht aus einer komplexen Reaktionskaskade, welche beginnt mit der Ablösung von Krebszellen von der primären Läsion in das umgebende Gewebe, dann Invasion in den Lymphgang und die Gefäße, Anhaftung an die Wände der Blutkapillaren verschiedener Organe und schließlich endend bei der Bildung von metastatischen Läsionen durch Proliferation an entfernten Orten. Unter Verwendung des Modells zur hämatogenen Lungen-Metastasierung bei B16-Melanomen, welches in diesem Experiment verwendet wurde, können die Vorgänge, welche der Ablösung von Krebszellen von der primären Läsion und der Invasion in die Gefäße folgen, untersucht werden (Poste G. und Fidler I. J.: The pathogenesis of cancer metastasis. Nature 283: 139–146 (1980); und Cancer Invasion/Metastasis Research Manual, Hrsg. Japanische Gesellschaft für Metastasenforschung [ausführende Herausgeberin] Tatsuro Irimuda, Kinpode, S. 7–11, Kyoto (1994)). Lysophosphatidsäure (LPA) ist eine der Lysophosphatid-Mediatoren (Tetsuyuki Kobayashi und Kimiko Murofushi: The presence, metabolism and physiological functions of lysophosphatidic acid as a lysophospholipid mediator and cyclic phosphatidic acid, Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 44, 1118–1126 (1999)). Von LPA ist bekannt, dass es in starkem Maße eine Invasion in einem in-vitro-Invasions-Experimentalsystem induziert (Mutsuko Mukai, Hitoshi Akedo: Induction of cancer cell invasion by lysophosphatidic acid and suppression of invasion by cyclic phosphatidic acid, Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 44: 1126–1131 (1999); Mukai M., Imamura F., Ayaki M., Shinkai K., Iwasaki T., Murakami-Murofushi K., Murofushi H., Kobayashi S., Yamamoto T., Nakamura H. und Akedo H.: Suppression of tumor invasion and metastasis by a novel lysophospharidie acid (cyclic LPA). Int., J. Cancer 81: 918–922 (1999)). Im Gegensatz zu LPA ist von cyclischer Phosphatidsäure (cPA), welche ein strukturelles Analogon von LPA ist, bekannt, dass diese eine Invasion in einem in-vitro-Invasions-Experimentalsystem stark supprimiert (Tetsuyuki Kobayashi und Kimiko Murofushi: The presence, metabolism and physiological functions of lysophosphatidic acid as a lysophospholipid mediator and cyclic phosphatidic acid, Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 44: 1118–1126 (1999)). Daher wurde die supprimierende Wirkung von cPA-19 und cPA-20, welche cPA-Derivate sind, auf die Lungenmetastasierung des malignen B16-F0-Melanoms der Maus untersucht unter Verwendung des Modells zur hämatogenen Lungen-Metastasierung bei B16-Melanomen.
Bezüglich zeitlicher Veränderungen des Körpergewichtes wurden zeitweilige Abnahmen des Körpergewichtes in den Gruppen beobachtet, welchen cPA-19 bei 0,001 und 0,008 mg/Körper und cPA-20 bei 0,001 mg/Körper verabreicht wurden. Derartige Abnahmen des Körpergewichtes wurden außerdem in der Medium-Gruppe und der cPA-5-Gruppe beobachtet, jedoch nicht in den Gruppen, welchen cPA-19 bei 0,004 mg/Körper und cPA-20 bei 0,004 mg/Körper und 0,008 mg/Körper verabreicht wurden. Somit kann dieses nicht durch die Wirkung der Testsubstanzen verursacht worden sein. Darüber hinaus wird angenommen, da hinterher ein günstiger Zugewinn an Körpergewicht beobachtet wurde, dass cPA-19 und cPA-20 keine Wirkung auf Veränderungen des Körpergewichtes haben. Ferner wurde bezüglich der Anzahl metastatischer Knötchen von B16-F0 in den Lungen eine ausreichende Zahl von Knötchen in der Medium-Gruppe beobachtet. Somit wird angenommen, dass es kein Problem mit dem hier eingesetzten Testsystem gab. In beiden Testgruppen von cPA-19 und cPA-20 verursachte die Verabreichung bei 0,004 mg/Körper eine signifikante Verringerung der Anzahl metastatischer Knötchen, und die Verabreichung bei 0,008i mg/Körper supprimierte fast vollständig die Metastasierung. Des Weiteren wurden für die metastatischen Läsionen innerhalb des Lungengewebes oder der Metastasen in anderen Organen als der Lunge ähnliche Ergebnisse erhalten. Dies kann daran liegen, dass cPA-19 und cPA-20 die Metastasierung von B16-F0 supprimierten, jedoch wurde keine Wirkung beobachtet, welche die Zahl der metastatischen Läsionen verringerte.
Von den obigen Ergebnissen zeigten cPA-19 und cPA-20 mit einer Dosis von 0,004 und 0,008 mg/Körper die Wirkung einer Suppression der Lungenmetasta sierung von B16-F0 in diesem experimentellen Modell, und von dieser Wirkung wurde gezeigt, dass sie stärker war als jene von cPA-5.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Krebsmetastasierung ist das signifikanteste Phänomen, welches die maligne Veränderung von Tumoren zeigt, und wird über komplexe Vorgänge abgeschlossen. Vor allem ist die Invasion von Krebszellen ein charakteristischer Schritt davon. Die vorliegende Erfindung offenbart, dass carba-cPA eine starke, die Invasion supprimierende Aktivität aufweist und die Bereitstellung eines neuartigen Mittels zur Suppression der Krebsmetastasierung ermöglicht. Die Verwendung des Mittels zur Suppression der Krebsmetastasierung der vorliegenden Erfindung trägt in hohem Maße zu Krebstherapie bei.

Claims

Mittel zur Hemmung von Krebsmetastasen, welches eine durch die Formel (I) repräsentierte Verbindung als einen Wirkstoff enthält:
wobei R eine lineare oder verzweigte C_1-30-Alkylgruppe, eine lineare oder verzweigte C_2-30-Alkenylgruppe oder eine C_2-30-Alkinylgruppe ist, wobei diese Gruppen einen Cycloalkanring oder einen aromatischen Ring enthalten können; und M ein Wasserstoffatom oder ein Gegenkation ist.
Mittel zur Hemmung von Krebsmetastasen nach Anspruch 1, wobei R in der Formel (I) -C₁₅H₃₁, -(CH₂)₇CH=CHC₆H₁₃ oder -(CH₂)₇CH=CHC₈H₁₇ repräsentiert.