DE60022327T2

DE60022327T2 - Lipoxinverbindungen und ihre anwendung

Info

Publication number: DE60022327T2
Application number: DE60022327T
Authority: DE
Inventors: N. Charles SERHAN
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date: 1999-03-18
Filing date: 2000-03-14
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2020-03-15
Also published as: US6433202B1; WO2000055109A1; EP1163204B1; PT1163204E; US20100048702A1; WO2000055109A9; ES2246230T3; AU3743100A; CA2675416A1; DE60022327D1; US20030069435A1; US20080064747A1; DK1163204T3; US6720354B2; EP1163204A1; US7615576B2; US6960674B2; US20030191332A1; AU2008207590B2; US20050192350A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Aspirin (Acetylsalicylsäure, ASA) ist als Analgetikum/Antipyretikum seit fast einem Jahrhundert in Verwendung, und es werden weiterhin neue therapeutische Anwendungen für dieses Arzneimittel aufgedeckt, beispielsweise zur Absenkung des Risikos eines Myocardinfarkts oder als Prophylaxe gegen Kolorektalkrebs (Weissmann, G. (1991) Sci. Am. 264, 84–90; Ridker, P. M., Cushman, M., Stampfer, M. J., Tracy, R. P. & Hennekens, C. H. (1997) N. Engl. J. Med. 336, 973–979; Marcus, A. J. (1995) N. Engl. J. Med. 333, 656–658). Die Acetylierung der Cyclooxygenasen I und II (COX I und II) und die anschließende irreversible Inhibierung von Prostaglandin(PG)- und der Thromboxanbiosynthesen sind gut verstandene Mechanismen einiger der pharmakologischen ASA-Wirkungen (Marcus, A. J. (1995) N. Engl. J. Med. 333, 656–658; Herschman, H. R. (1998) Trends Cardiovasc. Med. 8, 145–150). Vor kürzerer Zeit wurde gefunden, dass ASA eine Schaltung in der Eicosanoidbiosynthese verursacht, wenn die Acetylierung von COX II die Enzymaktivität zur Herstellung von 15R-Hydroxyeicosatetraensäure aus Agonist-freigesetzter Arachidonsäure verändert (Herschman, H. R. (1998) Trends Cardiovasc. Med. 8, 145–150). Humane Neutrophile, und andere 5-Lipoxygenase aufweisende Zellen verwerten dieses Substrat über transzelluläre Biosynthesewege zur Erzeugung von 15-epi-Lipoxin A₄ (15-epi-LXA₄) und 15-epi-Lipoxin B₄ (15-epi-LXB₄) (Serhan, C. N. (1997) Prostaglandins 53, 107–137; Chiang, N., Takano, T., Clish, C. B., Petasis, N. A., Tai, H.-H. & Serhan, C. N. (1998) J. Pharmacol. Exp. Ther. 287, 779–790). Diese Aspirin-ausgelösten Lipoxine (ATL) sind die endogenen 15R enantiomeren Gegenstücke von Lipoxin A₄ (LXA₄) und Lipoxin B₄ (LXB₄) und weisen die gleichen Bioaktivitäten auf (Serhan, C. N. (1997) Prostaglandins 53, 107–137(5)).
Ungleich anderen Eicosanoiden (z. B., Leukotrienen, PGs, etc.), die allgemein als lokale proentzündliche Mediatoren angesehen werden, zeigen Lipoxine (LX) starke inhibitorische Wirkungen in verschiedenen Schlüsselereignissen bei der Entzündung, wie beispielsweise der Polymorphonuklearzell (PMN)-Chemotaxie, der Transmigration über Endothel- und Epithelzellen und der Diapedese von post-kapillaren Venen (Serhan, C. N. (1997) Prostaglandins 53, 107–137(5)). LX werden in verschiedenen pathogenen Szenarien in vivo erzeugt, zum Beispiel: im Lungengewebe von Patienten mit einer schweren Lungenerkrankung; und durch PMN von Patienten mit Asthma oder rheumatoider Arthritis, wo deren Gegenwart mit einer klinischen Langzeitverbesserung in Verbindung gebracht wird (Lee, T. H., Crea, A. E., Gant, V., Spur, B. W., Marron, B. E., Nicolaou, K. C., Reardon, E., Brezinski, M. & Serhan, C. N. (1990) Am. Rev. Respir. Dis. 141, 1453–1458; Chavis, C., Chanez, P., Vachier, I., Bousquet, J., Michel, F. B. & Godard, P. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 207, 273–279; Chavis, C., Vachier, I., Chanez, P., Bousquet, J. & Godard, P. (1996) J. Exp. Med. 183, 1633–1643; Thomas, E., Leroux, J. L., Blotman, F. & Chavis, C. (1995) Inflamm. Res. 44, 121–124). Interessanterweise zeigten ATL einen noch größeren Inhibierungsgrad als natives LX bei der Verhinderung einer Neutrophilenadhäsion, wo diese zweimal so wirksam sind (Serhan, C. N. (1997) Prostaglandins 53, 107–137). ATL sind weiterhin stärkere Inhibitoren der mikrobiellen Induktion der Zytokinfreisetzung. Spezifisch zeigte 15-epi-LXA₄ eine größere Inhibierung als LXA₄ von S. Typhimurium-induzierter Sekretion und der Genregulation des starken chemischen Leukozytenfängers IL-8, erzeugt durch intestinale Epithelzellen (Gewirtz, A. T., McCormick, B., Neish, A. S., Petasis, N. A., Gronert, K., Serhan, C. N. & Madara, J. L. (1998) J. Clin. Invest. 101, 1860–1869). Es ist daher wahrscheinlich, dass zusätzlich zur Inhibierung der Prostaglandinbildung die Vorteile einer ASA-Therapie auch aus dem Auslösen neuer antientzündlicher Lipidmediatoren resultieren, die lokal eine Down-Regulierung von Leukozyten bewirken.
US 5,441,951 offenbart Lipoxin-Analoga, z. B. 15-epi-16-(para-fluor)-phenoxy-LXA₄, und deren Verwendung zur Behandlung oder Vorbeugung von Entzündungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von 15-epi-16-(para-fluor)-phenoxy-LXA₄ und eines pharmakologisch akzeptablen Trägers, vorausgesetzt der Träger ist kein Keton, zur Herstellung eines Arzneimittels in Form eines Shampoos oder eines Körperreinigungsprodukts zur Modulierung einer Erkrankung oder eines Zustands, die/der mit einer Polymorphoneutrophilen(PMN)-Entzündung zusammenhängt, in einem Subjekt an vivo.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung im Zusammenhang mit den anliegenden Abbildungen weitergehend verständlich, wobei: 1(A) einen anfänglichen Metabolisierungsschritt der LXA₄-Inaktivierung in Mäusevollblut und ein 15-Oxo-LXA₄ MS/MS-Spektrum zeigt. LXA₄ (21 μM) wurde ex vivo für 3 Stunden in Mäusevollblut inkubiert. Das MS/MS-Spektrum des hauptsächlichen Oxo-Produkts deutet auf 15-Oxo-LXA₄ hin mit diagnostischen Produktionen bei m/z: 349 (a = [M-H]^–), 331(α – H₂O), 313(α – 2H₂O), 305 (b = [M-H]^–– CO₂), 287(b – H₂O), 269 (b – 2H₂O), 233 (c), und 217 (c-O). (B) Die Biostabilität von LXA₄ und stabilen Analoga in Mäusevollblut. LXA₄, 15(R/S)-methyl-LXA₄ (ATLa₁, welches an C-15 eine racemische Methylgruppe trägt) und 15-epi-16-(para-fluor)-phenoxy-LXA₄ (ATLa₂, in welchem eine voluminöse (parafluor)-Phenoxygruppe, die ω-Kette an C-16 ersetzt) wurden zu heparinisiertem Mäusevollblut gegeben (siehe Verfahren) und bei 37°C für 0 und 3 h inkubiert. Im Anschluss an eine Zentrifugation bei 800 × g und 0°C wurden die Plasmaüberstände abgezogen und in zwei Volumina eiskaltem Methanol gestoppt. Die Lipoxine wurden durch Festphasenverfahren extrahiert und durch LC/MS/MS quantifiziert. Die Werte repräsentieren Mittelwerte ± SEM (n = 3 – 4).
2 zeigt, dass ATLa₂ eine TNF-α-induzierte PMN-Infiltrierung sowohl durch eine lokale Luftkammer (air pouch)- als i.v.-Verabreichung verhindert. Bei lokaler Injektion in die Luftkammer, gefolgt von einer Injektion eines Vehikels (900 μl PBS), induzierte Mäuse-TNF-α (20 ng/100 μl PBS) die Infiltrierung von 4,8 ± 1,1 × 10⁶ PMN in 4 h. Dexamethason (10 μg/Luftkammer), ASA (1 mg/Luftkammer) und ATLa₂ (10 μg/Luftkammer) wurden lokal in 900 μl PBS vor TNF-α verabreicht. Eine systemische Verabreichung von ATLa₂ wurde durch intravenöse Injektion in die Mäuseschwanzvene durchgeführt (10 μg/Maus). 4 h nach Injektion des Vehikels allein wurden 2,1 ± 0,7 x 10⁵ PMN in der Luftkammer (1 ml steriles PBS) gefunden. Die Werte bedeuten Mittelwerte ± SEM (n = 3 – 5). *P < 0,05,
P < 0,15 "two-tailed" t-Test nach Student.
3 zeigt repräsentative Gewebebiopsien von Luftkammerauskleidungen: Inhibierung einer TNF-α-induzierten PMN-Akkumulation. (A) Auskleidungsschnitt, entnommen 4 h nach Behandlung mit TNF-α (20 ng/Maus), der eine erhöhte Neutrophilenzahl zeigt, niedrig vergrößertes Feld eingesetzt. (B) 4 h im Anschluss an eine TNF-α (20 ng/Maus)-Behandlung entnommener Schnitt mit vorheriger lokaler Verabreichung von ATLa₂ (10 μg/Maus). (C) 4 h im Anschluss an eine TNF-α-Behandlung (20 ng/Maus) entnommener Schnitt bei vorheriger intravenöser Verabreichung von ATLa₂ (10 μg/Maus). (D) Schnitt einer unteren 6-Tages-Luftkammerauskleidung, entnommen einer Maus 4 h im Anschluss an lediglich eine Vehikelbehandlung. Die Pfeile bezeichnen Neutrophile. Die Abschnitte wurden wie unter "Verfahren" hergestellt und mit Hematoxylin-Eosin angefärbt.
4 zeigt, dass ATLa₂ eine PMN-Rekrutierung an einen Entzündungsort durch Regulierung der Vasodilatation nicht inhibiert. Der Mäusearteriendruck wurde mit einem Druck-Messfühler über die kanülisierte Herzschlagader beobachtet. Eine Schwanzveneninjektion von Vehikel (100 μl; 0,9% Kochsalz) zeigte keine Veränderungen des Arteriendrucks, während 10 μg Iloprost eine maximale mittlere Abnahme von ~28 mmHg ~50 s nach Injektion auslöste, wobei der Druck nach 500 s zur Grundlinie zurückkehrte. 10 μg ATLa₂ wurden in 3 Mäuse ohne eine Änderung des durchschnittlichen Arteriendrucks injiziert. Die Werte bedeuten Durchschnitt ± SEM (n = 3).
5 zeigt, dass ATLa₂ sowohl eine PMA- als auch eine LTB₄-induzierte PMN-Infiltrierung durch topische Anwendung und nicht intravenöse Injektion inhibiert. ATLa₂ wurde topisch (20 μg in 10 μl Aceton) auf das linke Mäuseohr aufgebracht oder intravenös (10 μg in 100 μl 0,9% sterilem Kochsalz) durch die Schwanzvene verabreicht. Eine Entzündung wurde im linken und rechten Ohr durch topische Anwendung von entweder LTB₄ (1 μg) oder PMA (100 ng) in Aceton (10 μl) induziert. Stanzbiopsien wurden nach 24 h gewonnen und die MPO-Aktivität wurde als Index für die PMN-Zahl im Ohr gemessen. Die Werte bedeuten Durchschnitt ± SEM (n = 3). *P < 0,05 "two-tailed" t-Test nach Student.
6 zeigt eine ATLa₂ Schwanzvenen-Bolusinjektion: Zeitverlauf im Plasma. BALB/c-Mäuse (6–8 Wochen) erhielten intravenöse Schwanzveneninjektionen von ATLa₂ (2 μg/Maus) in 100 μl sterilem 0,9% Kochsalz. Blut wurde durch Herzpunktion erhalten, und ATLa₂ wurde durch Festphasenextraktion aus dem Plasma extrahiert. Die verbleibenden ATLa₂-Mengen wurden durch LC/MS/MS quantifiziert. Die Werte bedeuten Durchschnitt ± SEM (n = 3).
In 7 bedeutet eine Methylesterhydrolyse von ATLa₂ zur freien Säure in ex vivo-Mäusevollblut. ATLa₂ wurde ex vivo in Mäusevollblut inkubiert (2,8 μM) für 0, 2, 5, 10, 15 oder 180 Minuten. Die Inkubationen wurden durch Kühlen des Blutes auf Eis für eine Minute, gefolgt von einer Zentrifugation (800 × g) bei 0°C, gestoppt. Die Plasmaüberstände wurden in 2 Vol. eiskaltem Methanol gestoppt. Die Proben wurden durch Festphasenextraktion für die Analyse zubereitet, und die Menge an freier Säure in der Probe wurde durch LC/MS/MS quantifiziert. Innerhalb von 10–15 Minuten wird 100% des ATLa₂-Methylesters zur freien Säure ohne Verlust an Verbindung hydrolysiert. Die Werte bedeuten Durchschnitt ± SEM (n = 3).
8 zeigt, dass ATL-Analoga eine Vasodilatation in isolierten Rattenaorten induzieren: Relaxation relativ zu Iloprost. Die Ratten wurden mit Pentobarbital-Überdosierungen euthanisiert. Die Aorta wurde isoliert, und es wurde eine Vorbelastung von 300–400 mg gegeben. Die Gefäße wurden mit U46619 (25 ng/ml) präkontrahiert. Eine Relaxation wurde mit Zugabe von Iloprost, 5(R/S)-Methyl-LXB₄, ATLa₁ oder ATLa₂ bis auf eine Endkonzentration von μM induziert. Die Relaxation glatter Aortamuskeln wurde mit einem Kraft-Messfühler gemessen, und die Daten wurden auf einem PC digitalisiert und gespeichert. 5(R/S)-Methyl-LXB₄, ATLa₁ und ATLa₂ bewirkten eine Relaxation der glatten Muskeln von 42,8%, 37,0%, 38,1% und 40,0%. Die Werte bedeuten ± SEM (n = 4 – 6).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Merkmale und andere Details der Erfindung werden nun besonders beschrieben und sind in den Ansprüchen hervorgehoben. Es versteht sich, dass die bestimmten Ausführungsformen der Erfindung nur beispielhaft gezeigt sind und nicht als Einschränkungen der Erfindung. Die Hauptmerkmale dieser Erfindung können in verschiedenen Ausführungsformen eingesetzt werden, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Alle Erläuterungen in dieser Beschreibung, die sich auf nicht von den Ansprüchen abgedeckte Ausführungsformen beziehen, dienen nur illustrativen oder Vergleichszwecken.
Aspirin (ASA) löst durch die Acetylierung von Cyclooxygenase II eine Umschaltung in der Biosynthese von Lipidmediatoren aus, was die Prostanoidproduktion inhibiert und eine 15-epi-Lipoxinerzeugung initiiert. Diese Aspirin-ausgelösten Lipoxine (ATL) können einige der vorteilhaften Wirkungen von ASA vermitteln und sind daher bei der Suche nach neuen Antientzündungsmitteln, die weniger unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen könnten, von Interesse. Strukturmodifikationen an der nativen ATL-Struktur verlängert deren Biostabilität in vivo. In Mäusevollblut waren ATL-Analoga, die am Kohlenstoff 15 (ATLa₁) und am Omegaende (ATLa₂) geschützt sind, nach 3 Stunden jeweils bis ~90 und 100% rückgewinnbar, im Vergleich mit einem ~40% Verlust von nativem Lipoxin A₄ (LXA₄). ATLa₂ behält die Bioaktivität und inhibierte bei so geringen Werten wie ~24 nmol/Maus wirksam eine TNF-α-induzierte Leukozytenrekrutierung in die dorsalen Luftkammer. Eine Inhibierung zeigte sich entweder durch lokale Verabreichung in die Luftkammer (~77% Inhibierung) oder über systemische Verabreichung durch intravenöse Injektion (~85% Inhibition) und erwies sich als wirksamer als eine lokale Verabreichung von ASA oder Dexamethason. Die Reihenfolge der Inhibierung einer PMN-Infiltrierung war: ATLa₂ (10 μg, i. v.) ≈ ATLa₂ (10 μg, lokal) > ASA (1,0 mg, lokal) ≈ Dexamethason (10 ug, lokal). Bei topischer Anwendung auf die Mäuseohrhaut inhibierte ATLa₂ auch eine durch Leukotrien B₄ induzierte PMN-Infiltrierung (~78% Inhibierung), oder eine durch Phorbolester, welcher eine endogene Chemokinproduktion initiiert (~49% Inhibierung). Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass dieses fluorierte Analogon eines natürlichen Aspirin-ausgelösten LXA₄ entweder durch lokale oder systemische Verabreichungswege bioerhältlich ist und ein wirksamerer und präziserer Inhibitor einer Neutrophilenanhäufung als ASA ist.
Abkürzungen: ASA, Aspirin, Acetylsalicylsäure; ATL, Aspirin-ausgelöste Lipoxine; ATLa₁, 15(R/S)-Methyl-Lipoxin A₄; ATLa₂, 15-epi-16-(para-fluor)-phenoxy-Lipoxin A₄; COX I und II, Cyclooxygenase I und II; 15-epi-LXA₄, 15-epi-Lipoxin A₄, 5S,6R,15R-Trihydroxyeicosa-7E,9E,11Z,13E-tetraensäure; 15-epi-LXB₄, 15-epi-Lipoxin B₄, 5S,14R,15R-Trihydroxyeicosa-6E,8Z,10E,12E-tetraensäure; i. v., intravenös; LC/MS/MS, Flüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie; LTB₄, Leukotrien B₄, 5S,12R-Dihydroxyeicosa-6E,8Z,10Z,14E-eicosatetraensäure; LX, Lipoxine; LXA₄, Lipoxin A₄, 5S,6R,15S-Trihydroxyeicosa-7E,9E,11Z,13E-Tetraensäure; LXB₄, Lipoxin B₄, 5S,14R,15S-Trihydroxyeicosa-6E,8Z,10E,12E-tetraensäure; PG, Prostaglandin; PMA, Phorbol-l2-myristat-13-acetat; PMN, polymorphonukleare Leukozyten; TNF-α, Tumornecrosefaktor α.
Die PMN-Akkumulierung und -Aktivierung spielen zentrale Rollen bei der Pathogenese eines breiten Bereichs von Erkrankungszuständen wie rheumatoider Arthritis, Arteriosklerose, Colitis ulcerosa und Psoriasis (Pillinger, M. H. & Abramson, S. B. (1995) Rheum.
Dis. Clin. North Am. 21, 691–714; Hagihara, H., Nomoto, A., Mutoh, S., Yamaguchi, I. & Ono, T. (1991) Atherosclerosis 91, 107–116; McLaughlan, J. M., Seth, R., Vautier, G., Robins, R. A., Scott, B. B., Hawkey, C. J. & Jenkins, D. (1997) J. Pathol. 181, 87–92; Anezaki, K., Asakura, H., Honma, T., Ishizuka, K., Funakoshi, K., Tsukada, Y. & Narisawa, R. (1998) Intern. Med. 37, 253–258; Iverson, L. & Kragballe, K. (1997) in Skin Immune System (SIS), ed. Bos, J. D. (CRC Press, Boca Raton), S. 227–237). Daher ist die Aufklärung endogener regulatorischer Mechanismen, die die neutrophilen Funktionen steuern können, von beträchtlichem therapeutischen Interesse. Da es sich hierbei um kleine lipophile Verbindungen handelt, die einer organischen Gesamtsynthese zugänglich sind, sind die natürlichen Lipoxine und insbesondere deren endogene Isoform-ATL sehr gut als potenzielle Leadverbindungen für die Therapeutik mit neuen kleinen Molekülen sowie als pharmakologische Werkzeuge zur Aufklärung endogener gegenregulatorischer und/oder antientzündlicher Signalwege geeignet.
Strukturmodifikationen, welche die Biostabilität verstärken, sind vorteilhaft, da Lipoxine Autacoide sind, die in Reaktion auf Stimulanzien schnell biosynthetisiert werden und wiederum gegenregulatorische Reaktionen hervorrufen und dann schnell enzymatisch inaktiviert werden (Serhan, C. N. (1997) Prostaglandins 53, 107–137). 15-Hydroxy-prostaglandindehydrogenase (15-PGDH), welche die reversible Oxidation der Alkoholgruppe an der Kohlenstoff-15-Position von Prostaglandinen und verschiedenen anderen ω-6-hydroxylierten Fettsäuren katalytisiert, katalysiert auch den ersten Schritt der Lipoxininaktivierung (1A) (Ensor, C. M. & Tai, H.-H. (1991) in Prostaglandins, Leukotrienes, Lipoxins, and PAF, ed. Bailey, J. M. (Plenum Press, New York), S. 39–52; Serhan, C. N., Fiore, S., Brezinski, D. A. & Lynch, S. (1993) Biochemistry 32, 6313–6319; Maddox, J. F., Colgan, S. P., Clish, C. B., Petasis, N. A., Fokin, V. V. & Serhan, C. N. (1998) FASEB J. 12, 487–494). Im Hinblick auf diese Befunde wurden verschiedene stabile Analoga von ATL und LXA₄ konstruiert, die einer Oxidation am Kohlenstoff-15 durch rekombinante Dehydrogenase in vitro widerstehen (Serhan, C. N., Maddox, J. F., Petasis, N. A., Akritopoulou-Zanze, I., Papayianni, A., Brady, H. R., Colgan, S. P. & Madara, J. L. (1995) Biochemistry 34, 14609–14615). Diese LX wirken als LXA₄-Rezeptoren auf Leukozyten und sind im nanomolaren Bereich wirksam: Inhibierung der PMN-Haftung, Transmigration und Diapedese (Takano, T., Clish, C. B., Gronert, K., Petasis, N. & Serhan, C. N. (1998) J. Clin. Invest. 101, 819–826). Strukturmodifikationen and nativem ATL biostabilisieren diese Mediatoren im Vollblut, sodass sie einer schnellen Inaktivierung widerstehen. Überdies ist das fluorierte ATL-Analogon, das heißt 15-epi-16-(para-fluor)-phenoxy-LXA₄ (ATLa₂), bei Verabreichung sowohl über lokale als auch systemische Wege ein starker Inhibitor der PMN-Rekrutierung in Mäuse-in vivo-Modellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von 15-epi-16-(para-fluor)-phenoxy-LXA₄, d. h. von:
und eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers, vorausgesetzt der pharmazeutische Träger ist nicht ein Keton, z. B. Aceton, zur Herstellung eines Medikaments in Form eines Shampoos oder eines Körperreinigungsprodukts, z. B. Seife, zur Reinigung der Kopfhaut und/oder des Körpers, zur Modulierung einer Krankheit oder eines Zustands, die/der mit einer Polymorphoneutrophilen(PMN)-Entzündung in einem Subjekt einhergeht, in vivo. Die Verwendung dieser Verbindungen in einem Shampoo oder einem Seifenprodukt kann zur Behandlung von Psoriasis, Dermatitis seborrhoeica, pustulöser Dermatosis und Schuppen verwendet werden. Die Verbindungen sind daher zur Modulierung einer PMN-Entzündung, die mit solchen Zuständen einhergeht, geeignet.
Ein "Lipoxin-Analogon" soll eine Verbindung bedeuten, die einen "aktiven Bereich" aufweist, der wie der aktive Bereich eines "natürlichen Lipoxins" wirkt, der jedoch einen "metabolischen Transformationsbereich" aufweist, der von natürlichem Lipoxin verschieden ist. Zu den Lipoxin-Analoga gehören Verbindungen, die strukturell ähnlich zu einem natürlichen Lipoxin sind, Verbindungen, welche die gleiche Rezeptorerkennungsstelle aufweisen, Verbindungen, welche den gleichen oder einen ähnlichen Lipoxin-Stoffwechseltransformationsbereich wie Lipoxin aufweisen, sowie Verbindungen, die im Stand der Technik als Lipoxin-Analoga anerkannt sind. Zu den Lipoxin-Analoga gehören Lipoxin-Analogametabolite. Die hier offenbarten Verbindungen können ein oder mehrere asymmetrische Zentren aufweisen. Wenn asymmetrische Kohlenstoffatome vorliegen, ist mehr als ein Stereoisomer möglich, wobei alle möglichen isomeren Formen in den gezeigten strukturellen Darstellungen beinhaltet sein sollen. Optisch aktive (R)- und (S)-Isomere können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, aufgelöst beziehungsweise getrennt werden.
Die Begriffe "entsprechendes Lipoxin" und "natürliches Lipoxin" betreffen natürlich vorkommendes Lipoxin oder Lipoxinmetabolite. Wenn ein Analogon eine Aktivität für einen Lipoxin-spezifischen Rezeptor aufweist, ist das entsprechende oder natürliche Lipoxin der normale Ligand für diesen Rezeptor. Wenn beispielsweise das Analogon ein LXA₄-spezifischer Rezeptor auf differenzierten HL-60-Zellen ist, ist das entsprechende Lipoxin LXA₄. Wenn ein Analogon eine Aktivität als Antagonist zu einer anderen Verbindung aufweist (wie beispielsweise einem Leukotrien), die durch ein natürlich vorkommendes Lipoxin antagonisiert wird, ist dieses natürliche Lipoxin das entsprechende Lipoxin.
"Aktiver Bereich" bedeutet den Bereich eines natürlichen Lipoxins oder Lipoxin-Analogons, der mit zellulären in vivo-Wechselwirkungen zusammenhängt. Der aktive Bereich kann an den "Erkennungsort" eines zellulären Lipoxinrezeptors oder ein Makromolekül oder einen Komplex von Makromolekülen einschließlich eines Enzyms und dessen Cofaktor binden. Bevorzugte Lipoxin A₄-Analoga weisen einen aktiven Bereich auf, der C₅-C₁₅ von natürlichem Lipoxin A₄ umfasst. Bevorzugte Lipoxin B₄-Analoga weisen einen aktiven Bereich auf, der C₅-C₁₄ von natürlichem Lipoxin B₄ umfasst.
Der Begriff "Erkennungsort" oder Rezeptor ist im Stand der Technik anerkannt und soll sich allgemein auf ein funktionales Makromolekül oder einen Komplex von Makromolekülen beziehen, mit welchem bestimmte Gruppen zellulärer Boten, wie beispielsweise Hormone, Leukotriene und Lipoxine, zunächst wechselwirken müssen, bevor die biochemische und physiologischen Antworten auf diese Boten initiiert werden. Gemäß der Verwendung in dieser Anmeldung kann ein Rezeptor isoliert sein, auf einer intakten oder permeabilisierten Zelle oder in Gewebe, einschließlich einem Organ, vorliegen. Ein Rezeptor kann von einem Subjekt sein oder in einem lebenden Subjekt sein oder kann kloniert sein. Ein Rezeptor kann normal existieren oder kann durch einen Krankheitszustand, durch eine Verletzung oder ein künstliches Mittel induziert sein. Die in dieser Erfindung verwendete Verbindung kann reversibel, irreversibel, kompetitiv, nicht-kompetitiv, oder unkompetitiv bezüglich des natürlichen Substrats eines Erkennungsortes binden.
Der Begriff "metabolischer Transformationsbereich" soll sich allgemein auf den Teil eines Lipoxins, eines Lipoxinmetaboliten oder Lipoxin-Analogon beziehen, einschließlich eines Lipoxin-Analogametaboliten, auf welchen ein Enzym oder ein Enzym und dessen Cofaktor versucht, ein oder mehrere metabolische Umwandlungen auszuüben, welche das Enzym oder das Enzym und der Cofaktor normalerweise mit Lipoxinen durchführt. Der metabolische Transformationsbereich kann für die Transformation empfänglich sein oder nicht. Ein nicht-einschränkendes Beispiel eines metabolischen Transformationsbereichs eines Lipoxins ist ein Teil von LXA₄, welcher die C-13,14-Doppelbindung oder die C-15-Hydroxygruppe oder beide enthält.
Der Begriff "detektierbares Markermolekül" soll fluoreszierende, phosphoreszierende und radiomarkierte Moleküle beinhalten, die zum Aufspüren, Verfolgen oder Identifizieren der Verbindung oder des Rezeptorerkennungsortes, an welchen das detektierbare Marker molekül gebunden ist, verwendet werden. Das Markermolekül kann durch eines der mehreren bekannten Verfahren nachgewiesen werden.
Der Begriff "markiertes Lipoxin-Analogon" wird weiterhin so verstanden, dass dieser Verbindungen umfasst, die mit radioaktiven Isotopen markiert sind, wie beispielsweise Tritium (³H), Deuterium (²H), Kohlenstoff (¹⁴C) oder anders markiert (z. B. fluoreszierend), ist jedoch nicht hierauf eingeschränkt. Die in dieser Erfindung verwendete Verbindung kann markiert oder derivatisiert sein, zum Beispiel für kinetische Bindungsversuche, um die Stoffwechselwege und enzymatischen Mechanismen weiter aufzuklären, oder zur Charakterisierung durch in der Technik bekannte Verfahren der analytischen Chemie.
Der Begriff "inhibiert den Stoffwechsel" bedeutet das Blockieren oder die Verminderung der Aktivität eines Enzyms, welches ein natives Lipoxin metabolisiert. Das Blockieren oder die Verminderung kann durch kovalente Bindung, irreversible Bindung, durch reversible Bindung mit der praktischen Wirkung einer irreversiblen Bindung oder durch irgendeine andere Maßnahme stattfinden, die das Enzym davon abhält, auf seine übliche Weise auf ein anderes Lipoxin-Analogon, einschließlich eines Lipoxin-Analogonmetaboliten, eines Lipoxins oder eines Lipoxinmetaboliten, einzuwirken.
Der Begriff "widersteht einem Stoffwechsel" ist so gemeint, dass damit das Ausfallen einer oder mehrerer abbauender Stoffwechselumwandlungen durch mindestens eines der Enzyme, welche Lipoxine metabolisieren, beinhaltet ist. Zwei nicht-einschränkende Beispiele von LXA₄-Analoga, welche einem Stoffwechsel widerstehen, sind 1) eine Struktur, die nicht zur 15-Oxo-Form oxidiert werden kann, und 2) eine Struktur, die zu 15-Oxo-Form oxidierbar ist, jedoch nicht einer enzymatischen Reduktion zur 13,14-Dihydroform zugänglich ist.
Der Begriff "durchläuft den Stoffwechsel langsamer" bedeutet, dass langsamere Reaktionskinetiken gegeben sind oder mehr Zeit zur Beendigung der Abfolge von Stoffwechselumwandlungen durch ein oder mehrere der Enzyme, die Lipoxin metabolisieren, benötigt wird. Ein nicht-einschränkendes Beispiel eines LXA₄-Analogons, welches den Stoffwechsel langsamer durchläuft, ist eine Struktur, die eine höhere Übergangszustandsenergie für die C-15-Dehydrogenierung aufweist, als LXA₄, da das Analogon an C-16 sterisch gehindert ist.
Der Begriff "Gewebe" soll intakte Zellen, Blut, Blutzubereitungen wie Plasma und Serum, Knochen, Gelenke, Muskeln, glatte Muskeln und Organe beinhalten.
Der Begriff "Halogen" soll Fluor, Chlor, Brom und Iod oder Fluoro, Chloro, Bromo und Iodo beinhalten.
Der Begriff "Subjekt" soll lebende Organismen beinhalten, die für Zustände oder Krankheiten empfänglich sind, die durch eine Entzündung, Entzündungsreaktionen, Vasokonstriktion und Myeloidsuppression verursacht werden oder wozu diese beitragen. Beispiele für Subjekte sind Menschen, Hunde, Katzen, Kühe, Ziegen und Mäuse. Der Begriff Subjekt soll weiterhin transgene Arten umfassen.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung wird zur Herstellung eines Medikaments oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet, die beispielsweise 0,1 bis 99,5% (bevorzugter 0,5 bis 90%) des aktiven Bestandteils in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, welcher kein Keton ist, enthält.
Der Begriff "pharmazeutisch akzeptabler Träger" bedeutet, so wie hier verwendet, ein pharmazeutisch akzeptables Material, eine pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung oder ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel, wie beispielsweise ein flüssiger oder fester Füllstoff, ein Verdünnungsmittel, ein Exzipient, Lösungsmittel oder Umhüllungsmaterial, der/die/das zum Tragen oder Transportieren einer Verbindung der vorliegenden Erfindung in oder zu einem Subjekt beteiligt ist, derart, dass es seine beabsichtigte Wirkung ausüben kann. Typischerweise werden solche Verbindungen von einem Organ oder einem Teil des Körpers zu einem anderen Organ oder Teil des Körpers übertragen oder transportiert. Jeder Träger muss in dem Sinne "akzeptabel" sein, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist und beim Patienten keine Verletzungen hervorruft. Einige Beispiel von Materialien, die als pharmazeutisch akzeptable Träger dienen können, sind: Zucker, wie beispielsweise Lactose, Glucose und Saccharose; Stärken, wie beispielsweise Maisstärke und Kartoffelstärke; Cellulose und deren Derivate, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; pulverförmiges Tragacanth; Malz; Gelatine; Talk; Exzipienten, wie beispielsweise Kakaobutter und Zäpfchenwachse; Öle, wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Distelöl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojabohnenöl; Glykole, wie beispielsweise Propylenglykol; Polyole, wie beispielsweise Glycerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglykol; Ester, wie beispielsweise Ethyloleat und Ethyllaurat; Agar; Puffersubstanzen, wie beispielsweise Magnesiumhydroxid und Aluminumhydroxid; Alginsäure; pyrogenfreies Wasser; isotonisches Kochsalz; Ringer'sche Lösung; Ethylalkohol; Phosphatpufferlösungen; und andere nicht-toxische kompatible Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen eingesetzt werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann die in der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung eine saure funktionale Gruppe enthalten und ist somit in der Lage, pharmazeutisch akzeptable Salze mit pharmazeutisch akzeptablen Basen zu bilden. Der Begriff "pharmazeutisch akzeptable Salze" bezieht sich in diesen Fällen auf die vergleichsweise nicht-toxischen Additionssalze anorganischer und organischer Basen von Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Diese Salze können ebenso in situ während der endgültigen Isolierung und Reinigung der Verbindungen hergestellt werden, oder indem die gereinigte Verbindung separat in ihrer freien Säureform mit einer geeigneten Base umgesetzt wird, wie beispielsweise dem Hydroxid, Carbonat oder Bicarbonat eines pharmazeutisch akzeptablen Metallkations, mit Ammoniak oder mit einem pharmazeutisch akzeptablen organischen primären, sekundären oder tertiären Amin. Repräsentative Alkali- oder Erdalkalisalze sind die Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium- und Aluminiumsalze und dergleichen. Repräsentative organische Amine, die zur Bildung der Basenadditionssalze geeignet sind, sind Ethylamin, Diethylamin, Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Piperazin und dergleichen.
Der Begriff "pharmazeutisch akzeptable Ester" bezieht sich auf die relativ nicht-toxischen veresterten Produkte der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindung. Diese Ester können an situ während der endgültigen Isolierung und Reinigung der Verbindungen oder durch separate Umsetzung der gereinigten Verbindung in ihrer freien Säureform oder Hydroxyl mit einem geeigneten Veresterungsmittel hergestellt werden. Carbonsäuren können in Ester über eine Behandlung mit einem Alkohol in Gegenwart eines Katalysators umgewandelt werden. Der Begriff soll weiterhin niedrige Kohlenwasserstoffgruppen beinhalten, die dazu in der Lage sind, unter physiologischen Bedingungen solvatisiert zu werden, z. B. Alkylester, Methyl-, Ethyl- und Propylester. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Ester nicht ein Methylester (siehe zum Beispiel Berge et al., supra).
Benetzungsmittel, Emulgatoren und Schmiermittel, wie beispielsweise Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat, sowie Farbstoffe, Trennmittel, Beschichtungsmittel, Süßmittel, Geschmacks- und Duftstoffe, Konservierungsmittel und Antioxidationsmittel, können ebenfalls in den Zusammensetzungen vorliegen.
Beispiele pharmazeutisch akzeptabler Antioxidationsmittel sind: wasserlösliche Antioxidationsmittel, wie beispielsweise Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid, Natriumbisulfat, Natriummetabisulfit, Natriumsulfit und dergleichen; öllösliche Antioxidationsmittel, wie beispielsweise Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Lecithin, Propylgallat, α-Tocopherol, und dergleichen; sowie Metallkomplexiermittel, wie beispielsweise Citronensäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sorbitol, Weinsäure, Phosphorsäure und dergleichen.
Dosierungsformen für die topische oder transdermale Verabreichung einer Verbindung dieser Erfindung sind beispielsweise Pulver, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele und Lösungen. Die aktive Verbindung kann unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger sowie mit irgendwelchen Konservierungsstoffen, Puffern oder Treibmitteln, die erforderlich sein können, vermischt werden.
Die Salben, Pasten, Cremes und Gele können zusätzlich zu einer aktiven Verbindung dieser Erfindung Exzipienten enthalten, wie beispielsweise tierische und pflanzliche Fette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragacanth, Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talk und Zinkoxid oder Gemische davon.
Pulver und Sprays können zusätzlich zu einer Verbindung dieser Erfindung Exzipienten enthalten, wie beispielsweise Lactose, Talk, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilicate und Polyamidpulver oder Gemische dieser Substanzen. Sprays können zusätzlich übliche Treibmittel enthalten, wie beispielsweise Chlorfluorkohlenwasserstoffe und flüchtige unsubstituierte Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Butan und Propan.
Beispiele geeigneter wässriger und nicht-wässriger Träger, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden können, sind Wasser, Ethanol, Polyole (wie beispielsweise Glycerol, Propylenglykol, Polyethylenglykol und dergleichen) und geeignete Mischungen davon, pflanzliche Öle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester, wie beispielsweise Ethyloleat. Eine geeignete Fluidität kann beispielsweise durch Verwendung der Beschichtungsmaterialien wie Lecithin, durch Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Fall von Dispersionen und durch Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln aufrechterhalten werden.
Diese Zusammensetzungen können auch Hilfsmittel wie Konservierungsstoffe, Benetzungsmittel, Emulgiermittel und Dispergiermittel enthalten. Eine Verhinderung der Einwirkung von Mikroorganismen kann durch Einbeziehung verschiedener antibakterieller Mittel und antifungizider Mittel gewährleistet werden, beispielsweise Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen. Es kann auch vorteilhaft sein, isotonische Mittel, wie Zucker, Natriumchlorid und dergleichen, in die Zusammensetzungen einzubeziehen. Weiterhin kann eine verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form durch Einbeziehung von Mitteln erreicht werden, welche die Absorption verzögern, wie beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine.
Die Zubereitungen der vorliegenden Erfindung können topisch verabreicht werden. Sie werden selbstverständlich durch Formen verabreicht, die für diesen Verabreichungsweg geeignet sind. Beispielsweise werden sie durch eine Lotion oder eine Salbe verabreicht.
Unabhängig vom gewählten Verabreichungsweg werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die einer geeigneten hydratisierten Form vorliegen können, und/oder die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch den Fachmann bekannte, herkömmliche Verfahren zu pharmazeutisch akzeptablen Dosierungsformen formuliert.
Die tatsächlichen Dosierungswerte der aktiven Bestandteile in der pharmazeutischen Zusammensetzung dieser Erfindung können variiert werden, sodass eine Menge des aktiven Bestandteils erhalten wird, die zur Erzielung der gewünschten therapeutischen Reaktion für einen bestimmten Patienten, Zusammensetzung und Verabreichungsweg wirksam sind, ohne für den Patienten toxisch zu sein.
Der gewählte Dosierungsgrad hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich der Aktivität der jeweiligen verwendeten Verbindung der vorliegenden Erfindung, oder dem Ester, Salz oder Amid davon, dem Verabreichungsweg, der Dauer der Verabreichung, der Ausscheidungsrate der bestimmten verwendeten Verbindung, der Behandlungsdauer, anderen Arzneimitteln, Verbindungen und/oder Materialien, die in Kombination mit der bestimmten eingesetzten Verbindung verwendet werden, dem Alter, Geschlecht, Gewicht, dem Zustand, der allgemeinen Gesundheit und medizinischen Vorgeschichte des behandelten Patienten und ähnlichen Faktoren, die auf dem Gebiet der Medizin gut bekannt sind.
Ein Arzt oder Tierarzt mit normalem Fachwissen kann die wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung leicht einstellen und vorschreiben. Beispielsweise könnte der Arzt oder Tierarzt Dosierungen der Verbindungen der Erfindung, die in der pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzt werden, mit niedrigeren Werten als zur Erzielung der gewünschten therapeutischen Wirkung erforderlich ist, beginnen, und die Dosierung langsam erhöhen, bis die gewünschte Wirkung erreicht wird.
Im Allgemeinen ist eine geeignete tägliche Dosierung einer Verbindung der Erfindung diejenige Menge der Verbindung, welches die niedrigste wirksame Dosis zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung ist. Eine solche wirksame Dosis hängt allgemein von den oben beschriebenen Faktoren ab. Allgemein reichen intravenöse und subkutane Dosierungen der Verbindungen dieser Erfindung für einen Patienten bei Verwendung für die angezeigten analgetischen Wirkungen von etwa 0,0001 bis etwa 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag, bevorzugter etwa 0,01 bis etwa 50 mg pro kg pro Tag und noch bevorzugte von etwa 0,1 bis etwa 40 mg pro kg pro Tag. Beispielsweise werden zwischen etwa 0,01 μg und 20 μg, zwischen etwa 20 μg und 100 μg und zwischen etwa 10 μg und 200 μg der Verbindungen der Erfindung pro 20 g des Subjektgewichts verabreicht.
Wenn erwünscht, kann die wirksame tägliche Dosis der aktiven Verbindung als zwei, drei, vier, fünf sechs oder mehr Subdosierungen verabreicht werden, die separat in geeigneten Abständen über den Tag verabreicht werden, wahlweise in Einheitsdosierungsformen.
Die in der Erfindung verwendete Verbindung wird als eine pharmazeutische Zusammensetzung in Form eines Shampoos oder Körperreinigungsmittels verabreicht.
MATERIALIEN UND METHODEN
Die folgende Beschreibung enthält zu illustrativen und Vergleichszwecken Ausführungsformen, die nicht unter die Ansprüche fallen.
Biostabilität von LX-Analoga in Mäusevollblut. Die Analoga ATLa₁ und ATLa₂ wurden durch eine organische Gesamtsynthese hergestellt, und deren Strukturen wurden mittels NMR bestätigt (Serhan, C. N., Maddox, J. F., Petasis, N. A., Akritopoulou-Zanze, I., Papayianni, A., Brady, H. R., Colgan, S. P. & Madara, J. L. (1995) Biochemistry 34, 14609–14615) (siehe auch US-Patente Nrn. 5,441,951, 5,648,512, 5,650,435 und 5,750,354, die hier durch Bezugnahme aufgenommen werden, bezüglich geeigneter Synthesebeispiele). Männliche BALB/c-Mäuse (6–8 Wochen) (Harlan Sprague Dawley, Inc.) wurden mit Pentobarbital (70 mg/kg) anästhesiert, und Vollblut wurde über eine Herzpunktur in Heparin (500 U/ml) entnommen. LXA₄, ATLa₁ und ATLa₂ (2,4 μM) wurden in 250 μl Blut (37°C) entweder für 0 oder 3 h inkubiert. Für die Zeit Null (T = 0) wurden Aliquots des Bluts für 1 min in ein Eisbad überführt, und sofort nach Zugabe von LXA₄ oder ATLa wurde bei 800 × g bei 0°C für 20 min zentrifugiert. Die Plasmaüberstände wurden gesammelt, in 400 μl eiskaltem Methanol gestoppt und vor Festphasenextraktion bei –20°C aufbewahrt. Für T = 3 h wurden die Blutaliquots mit ATLa inkubiert und durch Schütteln bei 37°C sanft vermischt. Nach jedem Inkubationszeitraum wurde das Plasma gesammelt und wie oben gestoppt. Prostaglandin B₂ (Oxford Biomedical Research, Inc., Oxford, MI) wurde direkt vor Zentrifugation als interner Standard für die Extraktionsrückgewinnung zugegeben. Denaturierte Proteinausfällungen wurden aus den gestoppten Plasmaproben pelletiert und zweimal mit 200 μl Methanol gewaschen. Die Plasmaüberstände und Waschungen wurden vereinigt und mit Extract-Clean Festphasenextraktionskartuschen (500 mg C₁₈, Alltech Associates Inc., Deerfield, IL) extrahiert. Die Methylformiatfraktionen wurden mit einem sanften Stickstoffstrom zur Trockene gebracht und in Methanol zur Injektion und für quantitative Analysen mittels UV-Spektrophotometrie und LC/MS/MS suspendiert.
LC/MS/MS-Analysen. LC/MS/MS wurde unter Verwendung eines LCQ (Finnigan MAT, San Jose, CA) Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometersystems durchgeführt, das mit einer Elektrospray-Atmosphärendruck-Ionisationssonde ausgestattet war. Proben wurden in Methanol suspendiert und in die HPLC-Komponente injiziert, die aus einer Spectra-SYSTEM P4000 (Thermo Separation Products, San Jose, CA) quaternären Gradientenpumpe, einer Prodigy Octadecylsilan-3 (100 × 2 mm, 5 μm)-Säule (Phenomenex, Torrance, CA) oder einer LUNA C18-2 (150 × 2 mm, 5 μm)-Säule und einem schnellen Spektren-scannenden SpectraSYSTEM UV2000 UV/VIS-Absorptionsdetektor (Thermo Separation Products, San Jose, CA) bestand. Die Säule wurde isokratisch mit Methanol/Wasser/Essigsäure (65:35:0,01, V/V/V) bei 0,2 ml/min in die Elektrospraysonde eluiert. Die Sprühspannung wurde auf 5–6 kV und die erhitzte Kapillare auf 250°C eingestellt. LXA₄ und das ATLa wurden durch selektierte Ionenbeobachtung (SIM) nach molekularen Analyt-Anionen (z. B. [M-H]^– = m/z 351,5 für LXA₄, m/z 365,5 für ATLa₁ und m/z 405,5 für die freie ATLa₂-Säure) oder durch UV-Absorption bei 300 nm quantifiziert. Produktionenmassenspektren (MS/MS) wurden zur definitiven Identifizierung der Verbindungen ebenfalls aufgenommen.
PMN-Infiltrierung in Maus-Luftkammern (air pouch). Während männliche BALB/c-Mäuse (6–8 Wochen) mit Isofluran anästhesiert wurden, wurden dorsale Luftkammern (air pouches) durch Injizieren von 3 ml steriler Luft subkutan an den Tagen 0 und 3 hergestellt (wie in Ref.) (Sin, Y. M., Sedgwick, A. D., Chea, E. P. & Willoughby, D. A. (1986) Ann. Rheum. Dis. 45, 873–877). An Tag 6 und unter Anästhesierung der Mäuse mit Isofluran wurden 10 μg ATLa₂ als Bolusinjektion entweder in die Schwanzvene in 100 μl sterilem 0,9% Kochsalz oder lokal in die Luftkammer in 900 μl PBS-/- verabreicht (Dulbecco Phosphat-gepuffertes Kochsalz ohne Magnesium- oder Calciumionen, Bio Whittaker, Walkersville, MD). Dexamethason und ASA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden lokal als 10 μg- und 1,0 mg-Dosierungen jeweils in 900 μl PBS-/- verabreicht. Eine Entzündung in der Luftkammer wurde durch lokale Injektion von rekombinantem Mäuse-TNF-α (20 ng) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), gelöst in 100 μl sterilem PBS, induziert. Während die Mäuse mit Isofluran anästhesiert wurden, wurden die Luftkammern zweimal mit 3 ml sterilem PBS 4 h nach der anfänglichen TNF-α-Injektion gespült. Die abgezogenen Proben wurden bei 2000 UpM für 15 min bei 23°C zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt, und die Zellen wurden in 500 μl PBS suspendiert. Aliquots der Zellsuspension wurden mit Trypan Blue angefärbt und mittels Lichtmikroskopie gezählt. 50 μl der resuspendierten abgesaugten Zellen wurden zu 150 μl 30% BSA gegeben und auf Mikroskopobjektträgern bei 2200 UpM 4 min unter Verwendung einer Cytofuge (StatSpin, Norwood, MA) zentrifugiert. Die Objektträger wurden an der Luft trocknen gelassen und mit Wright Giemsa-Färbung angefärbt (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), um die differenzielle Leukozytenzahl zu bestimmen. Zur mikroskopischen Analyse wurden Gewebe mit einer 6 mm Gewebebiopsieausstanzung (Acu-Punch, Acuderm, Inc., Ft. Lauderdale, FL) erhalten und in 10% gepuffertem Formaldehyd fixiert. Proben wurden dann in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hematoxylin-Eosin angefärbt.
Arteriendruck. Männliche BALB/c-Mäuse (6–8 Wochen, 20 g) wurden mit Pentobarbital (80 mg/kg) anästhesiert. Die Luftröhre wurde isoliert, und ein kleines Polyethylenkatheter (PE50) wurde eingeführt, um einen offenen Luftweg aufrechtzuerhalten. Die rechte Arteria carotis wurde isoliert und mit einem PE10-Röhrchen, das mit heparinisiertem (10 Einheiten/ml) normalem Kochsalz gefüllt war, kanülisiert. Das Arterienkatheter wurde an einen Druck-Messfühler angeschlossen (World Precision Instruments, Sarasota, FA), und die Aufzeichnung des Arteriendrucks wurde kontinuierlich aufgenommen (Astromed MT95K2, West Warwick, RI). Alle chirurgischen Handgriffe wurden unter Verwendung eines chirurgischen Mikroskops (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY) durchgeführt.
PMN-Infiltrierung in Ohrenhaut. Das Mäuseohr-Entzündungsmodell wurde verwendet, um die Einflüsse intravenöser und topischer Verabreichungen von ATLa₂ auf eine LTB₄- und PMA-induzierte PMN-Infiltrierung zu bewerten (Takano, T., Clish, C. B., Gronert, K., Petasis, N. & Serhan, C. N. (1998) J. Clin. Invest. 101, 819–826). Kurz wurde ATLa₂ entweder topisch (20 μg in 10 μl Aceton) auf die Innenseite des linken Mäuseohrs aufgebracht, wobei Vehikel kontralateral zugeführt wurde, oder als Bolusinjektion (10 μg in 100 μl 0,9% sterilem Kochsalz) durch die Schwanzvene verabreicht. 5–7 min später wurde eine Entzündung im linken und rechten Ohr der Mäuse, die ATLa₂ topisch empfingen (nur das linke Ohr bei den Mäusen, die eine intravenöse Verabreichung von ATLa₂ erhielten) durch topische Anwendung von entweder LTB₄ (1 μg) oder PMA (100 mg) in Aceton (10 μl) induziert. Nach 24 h wurden Gewebestanzbiopsien mit 6 mm Durchmesser (Acu-Punch, Acuderm, Inc., Ft. Lauderdale, FL) aus den Ohren entnommen und durch das Verfahren von Bradley et al. auf Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität als Index für die PMN-Zahl untersucht. Isolierte Mäuse-PMN wurden durch Lichtmikroskopie gezählt und auf die gleiche Weise verarbeitet, um eine Kalibrierkurve zu erhalten (Bradley, P. P., Priebat, D. A., Christensen, R. D. & Rothstein, G. (1982) J. Invest. Dermatol. 78, 206–209).
Plasma-Clearance. Der Zeitverlauf für die Clearance (Entfernung) von ATLa₂ aus Plasma im Anschluss an eine Schwanzveneninjektion wurde über 50 min bestimmt. Männliche BALB/c-Mäuse (6–8 Wochen, 20 g) wurden mit Pentobarbital (70 mg/kg) anästhesiert und erhielten Schwanzvenen-Bolusinjektionen von 27 μM ATLa₂ (0,1 mg/kg) in 100 μl sterilem 0,9% Kochsalz. Blut wurde den Mäusen durch Herzpunktur 2, 5, 10, 15 und 50 min nach Injektion entnommen. Das Plasma wurde wie oben erhalten und extrahiert, wobei die Methylformiatfraktionen der Festphasenextraktion für die LC/MS/MS-Analyse getrocknet wurden. Die im Plasma quantifizierten Werte für ATLa₂ werden in Einheiten von ng/ml der Maus entnommenem Plasma ausgedrückt, wobei für jeden Zeitpunkt n = 3.
ERGEBNISSE
Biostabilität von LX-stabilen Analoga. Im Anschluss an Inkubationen von 3 h von LXA₄ in Mäusevollblut ex vivo wies der vorherrschende Metabolitpeak im LC/MS-Chromatogramm der extrahierten Probe eine Retentionszeit und ein MS/MS-Spektrum auf, das mit dem von 15-Oxo-LXA₄, erzeugt durch rekombinante 15-PGDH aus synthetischem LXA₄ (1A) übereinstimmte. Um zu bestimmen, ob das Anfügen voluminöser Substituenten an die native LX-Struktur die Biostabilität erhöht, wurden zwei stabile Aspirin-ausgelöste Lipoxin-Analoga, 15(R/S)-Methyl-LXA₄ (ATLa₁) und 15-epi-16-(para-fluor)-phenoxy-LXA₄ (ATLa₂) in Mäusevollblut inkubiert und mit LXA₄ verglichen. Eine Methylgruppe wurde am Kohlenstoff-15 als Racemat angeordnet, um sowohl LXA₄ als auch 15-epi-LXA₄ in ATLa₁ zu schützen, und ein Fluorid wurde an der para-Position des Phenoxyrings von 15-epi-16- phenoxy-LXA₄ in ATLa₂ angeordnet (1B). LC/MS/MS-Analysen der Vollblutinkubationen zeigten, dass ~40% von LXA₄ verloren ging, während sowohl ATLa₁ als auch ATLa₂ eine größere Stabilität aufwiesen, wobei ~90% und 100% verblieben (1B). In menschlichem Vollblut wurden quantitativ ähnliche Ergebnisse mit ATLa₁ erhalten.
Intravenöse und lokale Verabreichung von ATLa₂ inhibiert eine TNF-α-induzierte PMN-Infiltrierung in der dorsalen Luftkammer. Die Sechstages-dorsale Mausluftkammer ist gekennzeichnet durch die Gegenwart einer entstehenden Auskleidung, welche die Lufthöhle umgibt und ist sowohl aus Fibroblasten-ähnlichen Zellen aufgebaut, die von B-Typ-Zellen von Mäusesynovialmembranen des Knies nicht unterscheidbar sind, sowie aus Makrophagen-ähnlichen Zellen, welche die gleiche Morphologie wie Synovialmembranzellen vom Typ A aufweisen (Edwards, J. C. W., Sedgwick, A. D. & Willoughby, D. A. (1981) J. Pathol. 134, 147–156). Die Luftkammer dient daher als ein in vivo-Modell für die rheumatoide Synovialmembran/Synovialhaut, und wurde hier verwendet, um den Einfluss intravenöser und lokaler Verabreichungen von ATLa₂ auf die Inhibierung einer Zytokinvermittelten Entzündung zu bewerten, sowie für einen direkten Vergleich mit den Wirkungen von ASA und Dexamethason (Sin, Y. M., Sedgwick, A. D., Chea, E. P. & Willoughby, D. A. (1986) Ann. Rheum. Dis. 45, 873–877; Edwards, J. C. W., Sedgwick, A. D. & Willoughby, D. A. (1981) J. Pathol. 134, 147–156). Der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) induziert eine Leukozyteninfiltrierung, vornehmlich Neutrophile (> 75%), in die Kammer, wobei eine maximale Zellanhäufung 2–4 h nach Injektion auftritt (Tessier, P. A., Naccache, P. H., Clark-Lewis, I., Gladue, R. P., Neote, K. S. & McColl, S. R. (1997) J. Immunol. 159, 3595–3602). ATLa₂, Dexamethason und ASA wurden jeweils direkt vor Verabreichung lokal in die Luftkammer einzelner Mäuse von Mäuse-TNF-α injiziert. Für eine systemische Verabreichung von ATLa₂ wurden vor einer lokalen Luftkammerinjektion von Mäuse-TNF-α Injektionen über die Mäuseschwanzvene verabreicht. Hierbei induzierte die lokale Verabreichung von TNF-α alleine (20 ng/Maus) die Rekrutierung von 4,8 ± 1,1 × 10⁶ PMN in die Luftkammer bei 4 h (2). Wenn ATLa₂ lokal in die Luftkammer verabreicht wurde (10 μg/Maus), waren nur 1,1 ± 0,3 × 10⁶ PMN im Kammerexsudat enthalten, was einer ~77%- Inhibierung der TNF-α-induzierten PMN-Infiltrierung entspricht. Die Verabreichung von ATLa₂ (10 μg/Maus) durch intravenöse Injektion erwies sich als ein sogar noch besseres Verfahren zur Inhibierung einer TNF-α-verursachten PMN-Infiltrierung. Die PMN-Rekrutierungswerte fielen auf einen Durchschnitt von 7,9 ± 2,9 × 10⁵ PMN/Luftkammer, was einer Inhibierung von ~85% entsprach. Überdies wurde keine offensichtliche Toxizität von ATLa₂ auf Mäuse beobachtet. Lokale Verabreichung entweder von ASA oder Dexamethason inhibierte ebenfalls die PMN-Rekrutierung, jedoch in einem geringeren Ausmaß als ATLa₂ durch entweder lokale oder i.v. Verabreichung. Eine äquivalente Dosis von Dexamethason (10 μg/Maus) führte zu einer 61% Inhibierung der PMN-Rekrutierung (Infiltrierung von 1,7 ± 0,5 × 10⁶ PMN), wohingegen eine 100-fach höhere Dosis von ASA (1,0 mg/Maus) erforderlich war, um eine PMN-Infiltrierung in einem ähnlichen Ausmaß wie ATLa₂ zu inhibieren. Die Gegenwart von 1,5 ± 0,6 × 10⁶ Zellen mit 1,0 mg ASA entspricht einer 69% Inhibierung im Vergleich mit einer TNF-α-Verabreichung allein, bei paralleler Verabreichung an Mäuse.
Histologische Analysen der den Luftkammerhohlraum umgebenden Gewebeauskleidung zeigten, dass die Zugabe von TNF-α zu einer merklich erhöhten Anzahl von Neutrophilen führte (3A), was vermindert war, wenn ATLa₂ vor einer TNF-α-Verabreichung entweder durch Injektion in die Kammer verabreicht wurde (3B) oder i.v. über die Schwanzvene (3C). Überdies waren mikroskopische Analysen des Hautgewebes von Mäusen, die eine ATLa₂-Behandlung empfingen, von denjenigen nicht unterscheidbar, die nur mit Vehikel behandelt wurden (3D), was ebenfalls eine milde neutrophile Infiltrierung zeigte, die dieses Wundmodell begleitete.
ATLa₂ inhibiert nicht eine PMN-Rekrutierung durch Regulierung der Vasoaktivität. LXA₄ weist sowohl konzentrationsabhängige als auch Vaskularbett-abhängige vasoaktive Eigenschaften auf. Beispielsweise induziert eine topische Verabreichung von LXA₄ (1 μM) eine arterioläre Dilation in der Hamsterbacke ohne eine Veränderung der Venendurchmesser, während eine systemische Verabreichung an Ratten eine vasokonstriktorische Reaktion im Mesenteritisbett erzeugt (26). Weiterhin induziert eine 20 min Infusion von 1 oder 2 μg/kg LXA₄ eine renale Vasorelaxation in Ratten ohne eine Veränderung des durchschnittlichen Arteriendrucks (27). Um zu bestimmen, ob die erhöhte Stabilität von ATLa₂ eine potenzielle Vasoreaktivität bei der therapeutischen Dosis verstärkt, bei der in den 2 und 5 eine Inhibierung der PMN-Infiltrierung gefunden wurde, wurden vaskuläre Änderungen in Reaktion auf ATLa₂ direkt mit denen von Iloprost verglichen, einem stabilen Prostacyclin-Analogon, das die arterielle Vasodilatation schnell stimuliert (Grant, S. M. & Goa, K. L. (1992) Drugs 43, 899–924). Bei Zugabe zu Organbädern relaxierte ATLa₂ eine präkontrahierte isolierte Rattenaorta auf ~40% des Relaxationswerts, der durch eine äquimolare Behandlung (1 μM) mit Iloprost verursacht wurde (nicht gezeigt). Wenn jedoch 10 μg oder ~24 nmol/Maus ATLa₂ in die Schwanzvene injiziert wurden wie in 2, wurden keine offensichtlichen Änderungen des durchschnittlichen Arteriendrucks beobachtet (4). In scharfem Gegensatz dazu rief eine Injektion äquimolarer Mengen von Iloprost eine maximal durchschnittliche Abnahme von ~28 mmHg ~50 s nach Injektion auf, wobei der Druck nach ~8 min zur Grundlinie zurückkehrte.
ATLa₂ inhibiert die PMN-Infiltrierung in Mäuseohrhaut gegenüber sowohl exogen als auch endogen chemisch anziehend wirkenden Substanzen. Eine topische Anwendung eines racemischen Analogons mit Eigenschaften von sowohl 15-epi-LXA₄ als auch nativem LXA₄ und 16-Phenoxy-LXA₄ (ein Analogon von LXA₄) auf Mäusehautepidermis inhibiert eine LTB₄-induzierte PMN-Einströmung sowie Veränderungen der vaskulären Permeabilität (Takano, T., Clish, C. B., Gronert, K., Petasis, N. & Serhan, C. N. (1998) J. Clin. Invest. 101, 819–826). Hierbei wurde das Ohrhaut-Entzündungsmodell verwendet, um zu bestimmen, ob i.v. oder topische Verabreichung des Vollblut-stabilen ATLa₂ auch eine PMN-Einströmung inhibieren könnte, die 24 h nach topischer Anwendung von entweder LTB₄ oder Phorbolmyristatacetat (PMA) auf die Haut maximal ist. Die topische Anwendung von ATLa₂ inhibiert sowohl eine LTB₄- als auch PMA-induzierte Entzündung um ~78% und ~49% (5). Eine einzelne i.v. Bolusinjektion von ATLa₂ (10 μg) inhibierte eine PMN-Einströmung, gemessen bei 24 h, gegenüber beiden Agonisten, die topisch auf die Ohrhaut aufgebracht wurden, nicht (5), im Gegensatz zu einer i.v. und dorsalen Verabreichung in die Luftkammer (2). Wenn die i.v. Injektion dieses Analogons jedoch 20 h (4 h vor PMN-Messung) wiederholt wurde, war eine LTB₄-induzierte PMN-Rekrutierung um ~22% inhibiert (nicht gezeigt).
ATLa₂ wird aus dem Plasma im Anschluss an eine i.v. Injektion schnell entfernt. Da eine i.v. Verabreichung von ATLa₂ in die Schwanzvene eine starke antientzündliche Reaktion bewirkte, womit die PMN-Infiltrierung innerhalb eines Zeitraums von 4 h in die dorsale Luftkammer blockiert wurde (2), jedoch nicht nach 24 h in der Ohrhaut (5), taucht die Frage auf, in welchem Ausmaß ATLa₂ eine erhöhte Biostabilität beim Zirkulieren im Anschluss an Schwanzvenen-Bolusinjektionen besaß. Um dies anzugehen wurde ATLa₂ aus Mäuseplasma extrahiert, das zu verschiedenen Zeitintervallen im Anschluss an Schwanzveneninjektionen gesammelt wurde, und die gewonnenen Materialien wurden mittels LC/MS/MS quantifiziert. 2 min nach Injektion wurden ~34 ng/ml Plasma nachgewiesen. Die Werte des Analogons nahmen mit der Zeit ab und wurden nach 15 min nicht detektiert. Diese Ergebnisse weisen auf eine schnelle Entfernung aus dem Blut und daher eine schnelle Verteilung und/oder Eliminierung hin (6).
Das fluorierte Analogon von 15-epi-LXA₄, ATLa₂, ist ein neuer stabiler Analogoninhibitor von sowohl direkt (LTB₄) als auch indirekt (TNF-α, PMA) wirkenden chemisch anziehenden Stoffen. Diese in vivo-Beobachtungen stützen weiter die Rolle des Aspirinausgelösten Lipoxinkreises als einen neuen und zusätzlichen Mechanismus, der dem antientzündlichen therapeutischen Einfluss von Aspirin unterliegt, und gibt Nachweise für endogene antientzündliche Signalwege.
Die vorliegenden Ergebnisse deuten daraufhin, dass spezifische strukturelle Modifikationen der nativen LXA₄-Struktur, wie beispielsweise die Hinzufügung einer C-15-Methylgruppe (ATLa₁) oder einer voluminösen ω-Kette (para-fluor)-Phenoxygruppe (ATLa₂) die Lebensdauer im Blut dieser Verbindungen verlängert und damit potenziell auch deren Bioverfügbarkeiten. Derartige Modifikationen hindern die Umwandlung der Analoga im Verhältnis zu einer schnellen Bioinaktivierung der nativen Struktur durch rekombinante 15-PGDH in vitro sterisch (Serhan, C. N. (1997) Prostaglandins 53, 107–137). Wie durch LC/MS/MS-Analysen nachgewiesen wurde, ist das Hauptprodukt dieser humanen Dehydrogenase bei Inkubation mit LXA₄ 15-Oxo-LXA₄. LC/MS/MS-Analysen zeigten, dass 15-Oxo-LXA₄ auch aus LXA₄ in Mäusevollblut erzeugt wurde (1A), was darauf hindeutete, dass Mäuse und Menschen einen gleichen Weg der LXA₄-Inaktivierung aufweisen.
Es zeigte sich, dass ATLa₂ ein wirksamer Inhibitor einer TNF-α-induzierten PMN-Infiltrierung in die Luftkammerhöhle ist, da so geringe Dosierungen wie 24 nmol/Maus, lokal in die Luftkammer verabreicht oder durch systemische intravenöse Injektion über die Schwanzvene, zu Inhibierungen von ~77% und ~85% führten. Histologisch wird angenommen, dass dieses Wundmodell der rheumatoiden Synovialmembran ähnelt und eine TNF-α-Injektion die PMN-Rekrutierung zu dem Hohlraum initiiert (2) (Edwards, J. C. W., Sedgwick, A. D. & Willoughby, D. A. (1981) J. Pathol. 134, 147–156). Die Injektion von TNF-α in die Luftkammer erhöht innerhalb des umgebenden Gewebes die C-C-Chemokin- (Mäuse-monozytenchemotaktisches Peptid-1 und Makrophagen-Entzündungsprotein-1-α) und die C-X-C-Chemokin- (Makrophagen-Entzündungsprotein-2)-Produktion und erhöht die Messenger RNA-Werte für die zuvor genannten Chemokine sowie des wachstumsbezogenen Oncogenproteins-α von Mäusen, die alle für eine Neutrophilenrekrutierung benötigt werden (Tessier, P. A., Naccache, P. H., Clark-Lewis, I., Gladue, R. P., Neote, K. S. & McColl, S. R. (1997) J. Immunol. 159, 3595–3602). Da ATLa₂ die TNF-α-induzierte PMN-Infiltrierung blockierte (2), unterbricht ATL dieses Chemokinnetzwerk in vivo. Dieser Befund kann therapeutische Auswirkungen haben, da eine Vielzahl pathologischer Zustände, einschließlich rheumatoide Arthritis, Psoriasis und die Crohn'sche Krankheit mit einer Überproduktion von TNF-α einhergehen und die Steuerung dieser Zytokinwirkungen daher stark erwünscht ist (Marriott, J. B., Westby, M. & Dalgleish, A. G. (1997) Drug Discovery Today 2, 273–282).
Es wurde weiterhin gefunden, dass ATLa₂ wirksamer als ASA war, da eine 100-fach größere Dosierung von ASA bei lokaler Verabreichung in die Luftkammer zu einem Inhibierungsgrad der durch TNF-α bewirkten PMN-Rekrutierung führte, der geringer als der von ATLa₂ war. Weiterhin erwies sich eine lokal verabreichte äquivalente Dosis von Dexamethason weniger wirksam als Inhibitor einer PMN-Rekrutierung als ATLa₂ in diesem Modell. Bei den unerwünschten Nebenwirkungen, die den Strukturen von sowohl ASA (Azidität, die zu einer Ulceration führen kann) und Dexamethason (Steroidstruktur, die physiologische Steroidfunktionen beeinflussen kann) zugeschrieben wird, können sich strukturell verschiedene Verbindungen wie ATL-Analoga, die auf Basis endogener Regulatoren der Leukozytenfunktion konstruiert sind, als bevorzugte therapeutische Alternativen erweisen.
Bei topischer Anwendung auf das Ohr inhibierte ATLa₂ sowohl eine LTB₄- als auch PMA-induzierte PMN-Rekrutierung um ~78% und ~49% (5). LXA₄ und ATLa₁ wiesen ähnliche IC₅₀ in vitro bei der Inhibierung der PMN-Transmigration über polarisierte Epithelmonoschichten oder der PMN-Haftung an vaskuläre Endothelzellen auf (Takano, T., Clish, C. B., Gronert, K., Petasis, N. & Serhan, C. N. (1998) J. Clin. Invest. 101, 819–826). Die topische Verabreichung von ATLa₁ in vivo inhibiert eine LTB₄-induzierte PMN-Rekrutierung, interessanterweise war aber der durch natives LXA₄ erreichte Inhibierungsgrad bei topischer Gabe weniger als 25% im Vergleich zu dem von entweder ATLa₁ oder ATLa₂ (Takano, T., Clish, C. B., Gronert, K., Petasis, N. & Serhan, C. N. (1998) J. Clin. Invest. 101, 819–826). Diese Beobachtungen bezüglich der in vitro- gegenüber in vivo-Wirksamkeiten zwischen den Analoga und der nativen Struktur deuten daraufhin, dass die ATL-Analoga eine verbesserte Bioverfügbarkeit in vivo aufweisen. Zusätzlich zum Schutz vor einer enzymatischen Inaktivierung verbesserten daher die strukturellen Modifikationen an der nativen LXA₄-Struktur, die in ATLa₁ und ATLa₂ eingefügt wurden, auch deren topische Verabreichung und trugen zu ihrer schnellen Verteilung ins Gewebe bei (2).
Aus dem Luftkammermodell erhaltene Ergebnisse, 4 h nach Verabreichung des Analogons, zeigen, dass eine i.v. Verabreichung von ATLa₂ an einen entfernten Entzündungsort überraschenderweise sogar noch wirksamer als eine topische Verabreichung war. In scharfem Gegensatz dazu stehen die Befunde mit Ohrenhaut, wo eine topische Anwendung von ATLa₂ eine wesentliche Inhibierung topisch angewandter proinflammatorischer Mediatoren hervor rief; eine i.v. Verabreichung des Analogons zeigte keine offensichtliche Inhibierung einer LTB₄-induzierten PMN-Rekrutierung. Es wurde weiterhin gefunden, dass das ATL-Analogon sowohl ex vivo in Vollblutsuspensionen stabil war, wobei im Wesentlichen eine vollständige quantitative Rückgewinnung nach 3 h möglich war, und schnell aus dem Plasma im Anschluss an eine i.v. Injektion in die Schwanzvene entfernt wurde (zwischen 15–50 min). Zusammen deuten diese Ergebnisse daraufhin, dass ATLa₂ von intravenösen Injektionen schnell zu Geweben verteilt wird, anstelle entfernt zu werden, und in einer aktiven Form für einige Stunden verbleiben konnte, z. B. während des Zeitverlaufs einer TNF-α-hervorgerufenen PMN-Rekrutierung zu der Dorsalkammerwunde (2). Weiterhin deutet die Abwesenheit der PMN-Inhibierung durch systemische Verabreichung in dem Mäuseohrmodell daraufhin, dass ATLa₂ eine ortsselektive Bioaktivierung aus der Zirkulation zeigt, wie beispielsweise eher zu der Dorsalkammer als zur Ohrhaut.
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die inhibitorischen Wirkungen Aspirin-ausgelöster Lipoxine sowohl Gewebe als auch Verabreichungsort-abhängig sind und es wurde zum ersten Mal gezeigt, dass stabile Analoga von ATL eine akute Entzündung an entfernten Orten des Verabreichungspunkts inhibieren. Da ATL-stabile Analoga als Mimetika konstruiert wurden, um die nativen Aspirin-ausgelösten Strukturmerkmale einzubeziehen, liefern die vorliegenden Befunde insgesamt neue Werkzeuge, um endogene antientzündliche Wege zu untersuchen, sowie Möglichkeiten, die Entwicklung sowohl topischer als intravenöser Anti-PMN-Therapien zu entwickeln.
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Ein Fachmann wird basierend auf den oben beschriebenen Ausführungsformen weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung erkennen. Demgemäß ist die Erfindung nicht durch das eingeschränkt, was speziell gezeigt und beschrieben wurde, ausgenommen durch die anliegenden Ansprüche.

Claims

Verwendung von 15-epi-16-(para-fluor)-phenoxy-LXA₄ und eines pharmakologisch akzeptablen Trägers, vorausgesetzt der Träger ist kein Keton, zur Herstellung eines Arzneimittels in Form eines Shampoos oder eines Körperreinigungsprodukts zur Modulierung einer Erkrankung oder eines Zustands, die/der mit einer Polymorphoneutrophilen(PMN)-Entzündung zusammenhängt, in einem Subjekt in vivo.