DE69033693T2 - Cytoprotektive substanzen mit ungesattigten kohlenwasserstoffresten von 16 bis 20 kohlenstoffatome - Google Patents

Cytoprotektive substanzen mit ungesattigten kohlenwasserstoffresten von 16 bis 20 kohlenstoffatome

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Description

    Hintergrund der Erfindung Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Methoden und Materialien zum Schutz von Säugetierzellen vor Verletzung aufgrund von intrinsischer Membranlyse, Oxidation und/oder Invasion durch destruktive Agenzien. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Materialien und Methoden zur Behandlung und/oder prophylaktischen Hemmung der Verletzungsursache. Ganz besonders befasst sich die Erfindung mit bioaktiven Agenzien und deren Verwendung zur Behandlung oder prophylaktischen Hemmung einer durch Phospholipase vermittelten Verletzung und/oder einer Verletzung aufgrund von Oxidation.
  • Im spezifischen Sinn stellt die Erfindung Wirkstoffe bereit zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Inflammation und Zellzerstörung in Säugetiergewebe und zum Schutz und zur Erhaltung von biologischem Material, wie beispielsweise Nahrung und Gewebeproben.
    • Stand der Technik
  • Die Basisstruktur aller lebenden Organismen stellt die Zelle dar, die strukturell definiert ist durch ihre membrane Lipoproteinhülle. Das membrane Netzwerk, das die Zelle zusammenhält, hält das Ionengleichgewicht aufrecht und stellt die Rezeptoren für Hormone und Neurotransmitter bereit, die eine Zelle dazu befähigen, mit ihrer Umgebung zu interagieren. Dies ist relevant zur Interaktion mit benachbarten Zellen, die es isolierten Zellen, Geweben oder ganzen Organismen ermöglichen zu überleben, sowohl als unabhängige Einheiten als auch als Teilnehmer zellulärer Interaktionen, in vitro und in vivo. Nahrungsmechanismen sowie kinetische, elektrophysiologische, exkretorische und reproduktive Mechanismen werden vermittelt durch die Selbsterneuerung von Lipoproteinmembranen, die die Zelle, ihren Kern und ihre Organellen zu einem funktionellen Ganzen verbinden.
  • Der Zelle ist es vorherbestimmt, ein ganz bestimmtes Leben zu leben in Übereinstimmung mit dem Gleichgewicht, das durch die Information des Kerns und der Umgebung auferlegt wird. Eine Zelle weist einen Entstehungstag und eine, durch den Umstand vermittelte oder vorherbestimmte, Zeit zu sterben auf. Die Vorschriften bestimmter Umstände, wie beispielsweise physiologischer Reize oder pathologischer Verletzung, schreiben die Art des Todes und den Zeitpunkt des Todes von Zellen vor. Zelltod und/oder Verletzung sind das Ergebnis sowohl von intrinsischen als auch von extrinsischen Faktoren und stellen den Schlüssel zum Schicksal eines größeren Organismus dar, von dem Zellen ein kritischer aber auch notwendiger Bestandteil sind.
  • Das, was für die Zelle gut ist, das was dafür sorgt, dass deren Fähigkeit, einerseits auf Änderungen des Ionenflusses, der das Membranpotential aufrecht erhält, zu reagieren, und andererseits eine Verletzung unter normalen Bedingungen zu reparieren, bestehen bleibt, sollte gut für seinen Wirt sein oder eine Unterstützung zur biologischen Produktion in vitro (zum Beispiel Gewebekultur, monoklonale Antikörper, Enzym- oder Endokrinproduktion von Relevanz für Biotechnologie) darstellen. Die Integrität von Zellmembranen, die den Ionenfluss und elektrophysiologische und/oder hormonelle oder Botenreaktionen aufrecht erhält, stellt den Schlüssel dar zum zellulären funktionellen Überleben und zur Langlebigkeit. Reparatur von und Resistenz gegen Verletzung sind eine Funktion der Aufrechterhaltung der Lipoproteinmembranintegrität.
  • Faktoren, die die Zellfunktion, die Erneuerung, die Reproduktion und den Tod regeln, werden kontrolliert durch ihre Effekte auf die Phospholipid-/Proteinhülle oder das Zytoskelett. Die Zellmembran kontrolliert die zellulären Uhren und die Ionenflüsse, die die Ansprechempfindlichkeit und das Überleben regeln. Der Schaden an Phospholipid/Proteinen, mit besonderem Schwerpunkt auf Lipidperoxidation, Membranoxidation und der Wirkung von Phospholipasen, bestimmt die Resistenz gegenüber Verletzungen, Reparaturreaktionen, die Reaktionen des Wirtes auf Veränderungen in der Umgebung und die ionische und osmotische Integrität.
  • Pathologische Ereignisse in einem Wirt unter klinischen Umständen resultieren in einem massiven zellulären Verletzungszustand, initiiert oder vermittelt durch einen Verlust der Membranintegrität. Diese Ereignisse werden vermittelt durch "Todesauslöser", die Zellmembranen verdauen und zerstören und die Verbreitung einer Verletzung durch die Produktion einer Kaskade von Zellmembranveränderungen bewirken. Ähnliche Ereignisse in Gewebekulturen sind lebensnotwendig für die biologische Verfügbarkeit von Zellen und Zellprodukten, während sie es den Zellen weiterhin erlauben, ihre Fähigkeit, auf ihre Umgebung oder einander zu reagieren, beizubehalten. Durch das Eingreifen in die Kaskade von externen und internen Ereignissen, die die Membranintegrität und die toxischen Veränderungen, die zum Zelltod führen, beeinflussen, kann eine Verletzung verhindert, modifiziert oder umgekehrt werden. Dies spielte in der Vergangenheit eine große Rolle bei antiinflammatorischen Agenzien.
  • Die wichtigsten, heutzutage verwendeten, klinisch effizienten, anti-inflammatorischen Wirkstoffe schließen die Kortikosteroide und die nichtsteroidalen antiinflammatorischen Agenzien (NSAIAs) ein. Diese Wirkstoffe bewirken eine Kontrolle der Inflammation und minimieren die Zellverletzung durch Regulierung des Zusammenbruches der Phospolipide oder durch Regulierung der Wirkung der Produkte solcher Zusammenbrüche, die zur Bildung von Prostaglandinen und Leukotrienen führen. Prostaglandine und Leukotriene werden in gesteigerten Mengen bei Entzündungen produziert und fördern die Zelldisfunktion und Verletzung.
  • Zudem haben neuere Studien gezeigt, dass zelluläre und extrazelluläre Phospholipasen durch die Generation von sauerstofffreien Radikalen aktiviert werden können. Dies kann einen "bösartigen Zyklus" initiieren, da die Aktivierung der Phospholipase freie Radikale freisetzt, die wiederum weitere Phospholipase aktivieren. So werden freie Radikale aus durch die Wirkung der Phospholipasen freigesetzten Fettsäuren produziert, die in Prostaglandine und Leukotriene umgewandelt werden. Fettsäuren und freie Radikale sind dafür bekannt, dass sie als wichtigste Mediatoren in der Kaskade von Reaktionen fungieren, die in Membranverletzung, Zelltod und Inflammation resultiert.
  • Zusätzlich zu den die freie Radikalbildungen beinhaltenden Effekten, spielen Phospholipasen, insbesondere Phospholipase A&sub2; (PLA&sub2;), dadurch eine besondere Rolle, dass durch ihre Wirkung, die Freisetzung von Fettsäuren zu fördern, sie beispielsweise Arachidonsäurederivate produzieren, die die Öffnung des Kalium (K&spplus;)-Ionenkanals unterstützen. Dieser Kanal regelt die elektrophysiologischen Reaktionen und die Second-Messenger-Reaktionen der Zelle. Daher können Phospholipaseinhibitoren die Zellreaktionen auf die Membranstimulation regulieren, die die Zellfunktion regeln.
  • Eines der Kennzeichen von Entzündung und Zellverletzung ist der Zusammenbruch des zellulären Membranphospholipids. Phospholipide stellen die bedeutenden strukturellen Bausteine der Zellmembranen dar; diese führen zu der Barrierenstruktur und den funktionellen Eigenschaften der Membranen, und ihre Integrität ist entscheidend für die normale Fähigkeit zur Zellantwort und die Zellfunktionen. Phospholipidänderungen in der Zellmembranintegrität, insbesondere Änderungen bei den Fettsäuren an Position 2, ändern die Fluidität der Zellmembranen, ihre Rezeptorverfügbarkeit und die Undichtigkeit oder Verfügbarkeit von zellulären Inhalten für die externe Umgebung. Der Zusammenbruch der Phospholipidmembranen resultiert in einem "Auftrennen" oder einer Lyse von Zellen, oder resultiert in Löchern in der Zellmembran, dem Zusammenbrechen oder Verstärken von Ionenkanälen, oder dem Verlust von an die Membran gebundenen Rezeptoren, der die Integrität und das funktionelle Überleben zerstört.
  • Während der Inflammation werden Phospholipasen, aus welcher Quelle auch immer, die normalerweise unter der Kontrolle von natürlichen Suppressorsystemen stehen, aktiviert, um Membranphospolipid, welches wiederum sauerstofffreie Radikale generiert, abzubauen. Ein Schlüsselenzym, das bei einer Entzündung aktiviert wird, stellt Phospholipase A&sub2; (PLA&sub2;) dar, welches auf Phospholipide als Ziele des Enzymes in der Form wirkt, dass freie Fettsäuren freigesetzt werden.
  • Diese durch PLA&sub2; freigesetzten Fettsäuren (z. B. Arachidonate), werden in potente, biologisch aktive Metaboliten, Prostaglandine und Leukotriene umgewandelt, bei gleichzeitiger Generierung von sauerstofffreien Radikalen. Diese PLA&sub2;-Produkte haben Einfluss auf Kaliumionenkanäle und G-Proteine, die an Second-Messenger-Zellreaktionen beteiligt sind, welche wiederum Auswirkungen auf die Zellmembranhomöostase haben. Diese Metaboliten, Fettsäuren und freien Radikale stellen einflussreiche Mediatoren der Pathophysiologie dar, die Verletzung und Zelltod propagieren oder die Einnistung, das Überleben und das Wachstum von pathogenen oder Tumorzellen erlauben.
  • Die Rolle von Phospholipasen, insbesondere PLA&sub2;, als, membrane Zielenzyme macht aus ihnen wahre "Todesauslöser", da die Expression ihrer Abbauaktivität in einer weiteren Produktion von inflammatorischen Mediatoren resultiert, welche zu einer weiteren Membranverletzung führt und damit einen Schaden innerhalb der Zelle selber oder in benachbartem Gewebe fördert. Daher kann die Ausbreitung der Verletzung vom Anfangspunkt zu benachbarten oder entfernten Stellen durch die Aktivierung und/oder Freisetzung von PLA&sub2; propagiert werden.
  • Zusätzlich zu dem intrinsischen, membranbezogenen Gewebezusammenbruch über die Aktivierung von PLA&sub2; stellen Phospholipasen und insbesondere PLA&sub2; einen Bestandteil des normalen Abwehrsystems des Körpers dar. Besonders hohe Werte von PLA&sub2; werden in menschlichen weißen Blutzellen (WBCs) gefunden: polymorphonukleare Leukozyten (PMNs) und phagozytische Zellen. WBCs spielen eine Rolle in der Widerstandsfähigkeit gegenüber Infektionen, aber wenn diese Zellen mobilisiert werden, um eine Verletzung oder Infektion abzuwehren, erfolgt aus anhaftenden und zirkulierenden WBCs eine Freisetzung des PLA&sub2;, so dass dieses eine lokale Gewebenekrose produziert, die zu einer Zunahme des Ausmaßes der anfänglichen Verletzung führt. Zudem heften sich WBCs an Blutgefäßwände, wo sie eine Freisetzung von Enzymen wie PLA&sub2; bewirken. WBCs generieren ebenfalls freie Radikale und fördern so den Schaden am vaskulären Endothel, den Lugenalveolen oder den Gewebestellen, die benachbart zu WBC- Infiltration oder- Konzentration liegen. Wo eine Entzündung zu finden ist, liegen WBCS normalerweise im Überfluss vor und heften sich an das vaskuläre Endothel, unter Freisetzung und Aktivierung von PLA&sub2;, die in einem Schaden der vaskulären Integrität während Schock und Ischemie resultiert. Obwohl sie das erste Abwehrsystem des Körpers gegen Infektionen darstellen, können WBCs den Körper daher durch die Förderung von Verletzung und Inflammation über ihre normale Abwehrrolle hinaus auch schädigen.
  • Die klassische Beschreibung von Inflammation ist "Rötung und Schwellungen mit Hitze und Schmerz (Celsus, 100 AD)". Inflammation wird definiert als die Reaktion von irritierten und beschädigten Geweben, die immer noch ihre Vitalität beibehalten. Inflammation ist ein Prozess, der auf einer Stufe bis zum Zelltod, Gewebenekrose und Vernarbung weitergehen kann, und auf einer anderen Stufe kann die Inflammation gelöst werden durch eine Rückkehr zur Normalität und keiner offensichtlichen Verletzung oder mit nur geringfügigen Veränderungen, wie beispielsweise Pigmentierung, Fibrose oder Gewebeverdickung mit Kollagenbildung aufgrund von Heilung und Vernarbung. Der Prozess ist dynamisch, mit Zelltod als einer Konsequenz und Erholung, Heilung und Vernarbung als einer anderen. Damit eine Inflammation als Prozess auftritt, müssen Zellen ihre Vitalität beibehalten. Tote oder schwer kompromittierte Zellen antworten nicht auf inflammatorische Reaktionen. Eine Verletzung bei Inflammation kann sich auch auf die späten Ergebnisse von Fibrose und Vernarbung beziehen, mit dem Verlust von Blutgefäßen, der Gewebeelastizität und kosmetischer Qualität.
  • Während Inflammation einen normalen Prozess des Widerstandes des Körpers gegen Verletzung und Infektion darstellt, kann sie davon abweichend zu propagierter Verletzung führen, mit extensiver Vernarbung, Gewebetod und/oder dem Tod des Organismus. Innerhalb bestimmter Grenzen ist die inflammatorische Reaktion stereotyp und kann nicht unterscheiden zwischen den Fällen, in denen der Prozess den Wirt beschützt und denen, in denen dem Wirt Schaden zugefügt wird.
  • Vom mikroskopischen Standpunkt aus, ist Inflammation charakterisiert durch Vasodilatation, vaskuläre Undichtigkeit, verstärkten lymphatischen Fluss, vaskuläre Thrombozytenanheftung und -verklumpung, Infiltration und vaskuläre Anheftung von WBCs und Phagozytose, mit Verlangsamung des Blutflusses und Aggregation von Erythrozyten, die in der Formation von Blutgerinnseln resultiert. Klinisch können diese lokalen Phänomene in Verbindung mit Schmerz, Fieber und Schwellungen auftreten, die zu einer lokalen Gewebezerstörung (Granulierung, Kaseinbildung und Nekrose), Heilung oder Vernarbung oder zu systemischen Symptomen von Schmerz, Fieber, Schockhypotonie (Prostration) führen können, die schließlich den Tod oder die Erholung bewirken.
  • In mikroskopischer Hinsicht wird die Inflammation zurückgeführt auf:
  • 1. Erschlaffung der Muskelhülle der Blutgefäßwand;
  • 2. gesteigerten Widerstand gegenüber dem Blutfluss, bedingt durch Reibung und Anhaftung von Blutbestandteilen (z. B. Erythrozyten, Proteinen, Leukozyten, Thrombozyten) und
  • 3. verstärkte Durchlässigkeit, z. B. Verlust von Erythrozyten, Leukozyten und Blutplasma durch die vaskuläre Wand.
  • In physiologischen Ausdrücken werden diese als Hyperämie, Ödem, Blutstauung, Thrombose und Hämorrhagie bezeichnet. Die Vermittlung einer Inflammation kann über humorale Substanzen erfolgen, die durch Gewebeelemente, Infektionsagenzien oder durch Veränderungen der pH(Säure)- oder Sauerstoffkonzentration gebildet werden. Klinisch können Inflammationen, welcher Ursache auch immer, von Schmerz, Fieber, Unwohlsein, muskel-, arteriellem und viszeralem Krampf sowie von Kopfschmerzen und Verwirrungszuständen begleitet sein.
  • Die oben dargestellten Ereignisse treten oft durch Aktivierung der Phospholipase, gefolgt von Fettsäurefreisetzung und der Bildung von freien Radikalen auf. Diese Ereignisse können endogen zu der Körpermatrix, den unterstützenden Zellen und Geweben sein, die funktionell oder systemisch integriert sind oder sich auf spezialisierte, die Verteidigung des Wirtes vermittelnde, Zellen beziehen, z. B. durch Leukozyten- oder Thrombozytenaktivität induziert, die einen Bestandteil der Immunantwort des Körpers darstellen und im Rahmen ihrer Rolle beim Widerstand gegenüber Infektionen Phospholipasen oder freie Radikale freisetzen oder ihren Platz in der normalen Aufrechterhaltung der koagulativen oder vaskulären Integrität behaupten, zum Beispiel die Prävention von Hämorrhagie, Thrombose oder Ischemie.
  • Alternativ kann die Phospholipaseaktivität auf exogener Enzymaktivität basieren, aufgrund der Freisetzung aus infizierer den pathologischen Organismen, wie Viren, Bakterien, Rickettsia, Protozoen oder Pilzen, die Phospholipase als intrinsischen Faktor ihrer infektiösen Aktivität aufweisen. Diesbezüglich ist eine Stimulierung infizierter Zellen oder des endogenen Immunsystems zur Freisetzung von Phospholipasen, beispielsweise PLA&sub2;, die an lokalen oder entfernten Stellen einen Inflammations- oder Gewebeschaden produzieren können, durch infizierende Organismen wie Bakterien, Viren, Rickettsia, Protozoen oder ihren Toxinen möglich. Im Falle von Naegleria, einer pathogenen Amöbe mit Affinität für das Gehirn, tritt eine Zerstörung von Gehirnmembranen, induziert durch von Naegleria freigesetzten Phospholipasen, teilweise an Stellen im Gehirn auf, die entfernt sind von der Stelle, wo der Organismus lokalisiert ist.
  • Im Hinblick auf die intrinsischen Effekte von PLA&sub2; erfolgt deren Produktion in sehr hoher Konzentration durch entzündete kollagene, spinale Bandscheiben, bei denen die lokalisierte Wirkung verknüpft ist mit starkem Schmerz und Muskelkrampf als Bestandteil einer Bandverletzung des unteren Rückens und im Halsbereich, die in akutem oder chronischem Unbehagen resultiert.
  • Aus infizierenden Organismen oder als Ergebnis einer Gewebeverletzung freigesetzte Phospholipasen können die Koagulationen von Blutproteinen induzieren, die zu einer ischämischen Verletzung an Stellen benachbart oder entfernt zum ursprünglichen Krankheitsherd führen. Bei Berücksichtigung der Wirkung von Phospholipasen darf nicht außer Ach gelassen werden, dass ihre pathologischen Effekte sowohl lokal als auch regional oder systemisch sein können.
  • Die Regelung erfolgt über ein freigesetztes Phospholipaseenzym, den Albuminspiegel, natürliche Inhibitoren der Enzymwirkung und die Faktoren der Diffusion, Zirkulation und Gewebeverwundbarkeit, die auf intrinsischen Inhibitoren oder der Empfänglichkeit von zuvor beschädigten oder oxydierten Membranen oder Proteinen gegenüber Phospholipasewirkung beruht.
  • Inflammation ist assoziiert mit Trauma, Infektion und Immunreaktionen des Wirtes, zum Beispiel Fieber, Unwohlsein und Schock, die direkt auf die Tötung von Bakterien oder Viren oder assoziierte Immunantworten zurückzuführen sind. Immunantworten können sowohl gutartig schützende als auch gewebeschädigende Auswirkung aufweisen, wie daran gesehen werden kann, dass sie einerseits für die Resistenz gegen oder die Heilung von Infektionen verantwortlich sind, auf der anderen Seite aber auch in der Lage sind, autoimmune Phänomene zu produzieren, die in Allergien, z. B. Asthma, Urtikaria, Host-versus-graft-Disease, Glomerulonephritis, rheumatischem Fieber, Lupus und rheumatoider Arthritis resultieren.
  • Im Hinblick auf die aktuelle Behandlung einer Inflammation stellen Kortikosteroide effektive Entzündungshemmer dar, sollten aber klinisch mit Vorsicht eingesetzt werden, da sie starke Immunosuppressiva und Inhibitoren der Fibroblastenaktivität darstellen, die zur Wund- und Knochenreparatur notwendig sind. Zudem stellen Kortikosteroide diabetogene Arzneimittel dar, und ihre toxischen Nebenwirkungen beinhalten eine Störung der Wundreparatur und der Knochenmatrixbildung und resultieren in einer Natriumretention, einem Kaliumverlust und einer reduzierten Resistenz gegenüber Infektionen. Kortikosteroide haben ebenfalls Auswirkungen auf die Steroidbildung, den Blutdruck, die Proteinverwertung, die Fettverteilung, das Haarwachstum und den Habitus des Körpers. Alternativ wirken die klinisch aktiven NSAIAs wie Aspirin, Indomethazin, Ibuprofen, etc. durch Inhibierung der Umwandlung von freien Fettsäuren in Prostaglandine. Die Nebenwirkungen von NSAIAs schließen die Bildung von Magengeschwüren, Nierendisfunktionen und Reye's Syndrom ein, und die Metaboliten von Prostaglandin können entweder schädigend sein oder einen Schutz für die Zellen darstellen, in Abhängigkeit von der Struktur des produzierten und pharmakologisch verwendeten Prostaglandins und dem Weg der Verabreichung, Zelle oder Gewebe beeinflussend. Zusätzlich zu den Effekten auf die Inhibierung der Cyklooxygenase, hemmen einige der NSAIAs, einschließlich Ibuprofen, Indomethazin und Meclophenamat, direkt die PLA&sub2;-Aktivität in vitro.
  • Wie oben dargestellt, erfolgt in Verbindung mit der Freisetzung der Fettsäure als Bestandteil der durch die Phospholipidzellmembran vermittelten Verletzung, gebildet durch die Phospholipaseaktivierung, eine Generierung von Leukotrienen. Diese durch den Zusammenbruch der Phospholipidmembran erhaltenen Leukotriene schädigen das Gewebe einerseits durch direkte toxische Wirkung, Wirkung auf Ionenkanäle und damit verbundene freie Radikalbildung oder andererseits durch indirekte Wirkung auf den vaskulären glatten Muskel oder die vaskuläre Endothelauskleidung, über Wechselwirkungen zwischen Thrombozyten, WBCs oder sich zusammenziehenden endothelialen (Blutgefäßauskleidung) oder glatten Muskeln.
  • Leukotrieue sind verantwortlich für das Zusammenziehen glatter Muskeln, die zum bei Allergien oder infektiösem Asthma beobachteten Bronchiospasmus und zu asthmatischen Attacken führen. Daher gibt es eine andauernde aktive Suche nach Leukotrieninhibitoren zum Zwecke der klinischen Anwendung in der Behandlung von Allergien, Asthma und Gewebeverletzungen oder Entzündungen.
  • Da der Phospholipase-aktivierte biochemische Stoffwechselweg für die Bildung von Prostaglandinen und Leukotrienen, abgeleitet von freien Fettsäuren, verzweigt ist, kann die Inhibierung eines Zweiges dieses Stoffwechselweges, wie mit NSAIAs, ein Ungleichgewicht in diesen reaktiven Metaboliten hervorrufen. Dieses Ungleichgewicht ist in der Lage, die Entzündung zu verschlimmern und die Zellverletzung zu fördern, wie durch die Bildung von Magengeschwüren als Nebenwirkung der NSAIAs, die zusammen mit pH-Wertänderungen intraperitoneale, inflammatorische Effekte aufweisen, verdeutlicht ist.
  • Aufgrund dieser nachteiligen Effekte sowohl der Steroide als auch der NSAIAs besteht gegenwärtig ein großes klinisch medizinisches Interesse an der Identifizierung Phospholipase inhibierender Agenzien, die nicht diese steroidalen Nebenwirkungen aufweisen, aber wie Kortikosteroide den ersten Schritt, der zur Produktion von schädlichen Metaboliten, Fettsäuren und freien Radikalen führt, modulieren.
  • Die durch Leukozyten, Gewebeverletzungs- oder metabolische Prozesse produzierten freien Radikale stellen hoch reaktive chemische Spezies dar, die im Falle einer Gewebeverletzung meist aus dem Atemsauerstoff herrühren. Sauerstoff stellt, obwohl es notwendig für die Energetik des Lebens ist, ebenfalls ein Toxin dar, welches, wie das chemisch verwandte Superoxid oder wie Peroxyde, das Gewebe schädigen kann anstatt es zu unterstützen. Aus Sauerstoff entstandene freie Radikale sind kritisch in Bezug auf einen Schaden, der durch Strahlung, Entzündung, Ischämie (Verlust der Blutversorgung), im Überschuss eingeatmeten Sauerstoff oder durch ein dem Sauerstoff im Überschuss Ausgesetztsein hervorgerufen wird. Wie zuvor beschrieben, werden freie Radikale von Leukozyten verwendet, um infizierende Organismen zu zerstören, können aber unter Umständen von Schock, Infektionen und Ischämie dem Gewebe, das sie eigentlich beschützen sollen, Schaden zufügen oder es zerstören.
  • Freie Radikale, deren Induktion durch Strahlung, Sauerstoffexposition, chemische Substanzen (zum Beispiel alkylierende Substanzen, Dioxin, Paraquat) oder Reaktionen von Leukozyten erfolgt, können eine Schädigung des Gewebes bewirken oder von Bedeutung für Veränderungen des Genmaterials in Verbindung mit Alterung, strahlungs- oder chemotherapiebedingter Verletzung, der Entwicklung von Krebs und hyperimmuner poliferativer Erkrankung, wie rheumatoider Arthritis sein. Zudem besteht die Möglichkeit, dass diese reaktive chemische Spezies die Verwundbarkeit von Proteinen gegenüber Protease-Verdauung durch Oxidation von Proteinen verstärkt.
  • WO 88/06445 offenbart, dass PGBX, ein Fettsäurepolymer, einen spezifischen PLA&sub2;-Inhibitor darstellt und die Bildung freier Radikale verhindert. PGBX ist in der Lage, die durch PLA&sub2; induzierte Entzündung zu hemmen; die Arachidonatfreisetzung aus menschlichen PMNs und vaskulären Endothel- und Phospholipiden zu verhindern; die Synthese von Eikosanoid-Prostaglandin-Vorstufen zu blockien; Lipide vor Autooxidation zu schützen; und die Bildung endogener Lipidperoxide sowie die Oxidation von Gewebehomogenisaten zu verringern.
  • Die PGBX-Verbindungen verzögern die Alterung in Hausfliegen, verlängern das Überleben und verringern das altersbedingte Pigment in Kardiomyocyten, schützen das Pantoffeltierchen vor Benzpyren-Photoaktivierungslyse, hemmen die Produktion von Superoxid aus PMN WEOs schützen den Herzmuskel oder die Herzmuskelzellen vor Verletzung durch Anthracyclin oder eine hohe Sauerstoffspannung pro Oxidationsmittel, blockieren die durch Karragenin und Hilfsmittel induzierte Entzündung und Arthritis, hemmen die Thrombozytenaggregation und die Blutgerinnung und greifen in die zytotoxische Immunreaktion ein; blockieren die IL-3 leukokine Stimulierung der Mastzellproliferation in vitro und die spontane Gamma Interferon C2 Koplementfreisetzung. Diese Verbindungen sind in der Lage, zytotoxische ultraviolette Expositionen abzuschirmen und sind systematisch und oral aktiv sowie stabil gegenüber Autoklavieren und Filtrationssterilisation.
  • Die allgemeine chemische Struktur von PGBX und den anderen in der oben genannten '330-Anmeldung offenbarten Oligomeren ist hypothetisch; die vollständig definierte Chemie, die zur Zufriedenstellung der Aufsichtsbehörden, die mit der Wirkstoffentwicklung zu tun haben, erforderlich ist, bleiben daher unklar. Was somit immer noch gebraucht wird, sind pharmakologisch aktive Materialien, die keine Verbindungen enthalten mit isomeren und/oder strukturellen Variationen.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt lipid und/oder wasserlösliche, pharmakologisch aktive, strukturell definierte Verbindungen zur Verfügung, die PLA&sub2;-Inhibitoren mit antioxidativen Eigenschaften darstellen und relativ rein oder aufreinigbar sind. Somit liefert die Erfindung bestimmte relativ reine bioaktive Verbindungen, die aus PLA&sub2;-inhibierenden Polymeren und/oder Oligomeren mit fetthaltigen Anteilen bestehen und an das PLA&sub2;-Enzym binden. Die Verbindungen der Erfindungen besitzen mindestens zwei cis-Doppelbindungen, um die anti-inflammatorischen und zytoprotektiven oder gewebeprotektiven Wirkungen der Verbindungen zu verstärken, dadurch, dass sie mindestens eine zweifache Aktivität aufweisen.
  • Die Verbindungen der Erfindung können zur Behandlung oder prophylaktischen Inhibierung durch Phospholipase vermittelter Verletzung und/oder Verletzung aufgrund von Oxidation Verwendung finden. In einem speziellen Sinn liefert die Erfindung Substanzen zur Vermeidung und/oder Behandlung von Entzündung und Zellzerstörung in Säugetiergewebe und zum Schutz und zur Erhaltung von biologischem Material wie Nahrung, Gewebeproben und sogar aus Holz oder Zellulose gebildeten Produkten. Die Verbindungen der Erfindung schützen Phospholipidzellmembranen sowie Proteine vor den Effekten einer oxidativen Verletzung oder Alterung. Diese Verbindungen verhindern ebenfalls Reaktionen freier Radikale und stabilisieren damit Proteine für die Erhaltung der biologischen Halbwertszeit, Antigerinnungsaktivität und Nahrungskonservierung.
  • Ganz besonders liefert die Erfindung pharmakologisch aktive, relativ reine oder aufreinigbare Antioxidantien und Antiphospholipidverbindungen, die chemisch definiert sind. Diese Verbindungen sind löslich und/oder fein verteilbar in einem geeigneten Träger. In Übereinstimmung mit der Erfindung weisen die Verbindungen mindestens zwei fetthaltige Anteile auf und keine aktive Hydroxylgruppe. Jeder fetthaltige Anteil besitzt 16 bis 20 Kohlenstoffatome und mindesten eine cis-ungesättigte Doppelbindung. In einer bevorzugten Form können die Verbindungen der Erfindung eine Säuregruppe aufweisen.
  • Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine antioxydative, Antiphospholipase-Verbindung zur Verfügung, die keine aktive Hydroxygruppe aufweist, mit der folgenden Formel:
  • R1-Y1-X1-Y2-R2
  • wobei X1 einen divalenten organischen Anteil darstellt, der mindestens eine saure Gruppe enthält, Y1 und Y2 sind - O - oder - NH -, R1 und R2 werden unabhängig ausgewählt aus:
  • In bevorzugten Verbindungen ist X1:
  • Somit kann die Verbindung in Übereinstimmung mit der Erfindung ebenfalls die Formel
  • R - O - X - O - R
  • aufweisen, wobei X einen divalenten organischen Anteil darstellt, der eine aktive Säuregruppe beinhaltet und die R- Gruppen gleich oder unterschiedlich sein können, und jede den folgenden Formeln entsprechen kann
  • und X kann sein
  • Die Erfindung liefert ebenfalls eine Antiphospholipase- Verbindung ohne aktive Hydroxygruppe der Formel
  • wobei X2 einen divalenten organischen Anteil darstellt, der mindestens eine saure Gruppe beinhaltet und R3 und R4 unabhängig ausgewählt werden können aus
  • -Y'-(CH&sub2;)&sub8;-CH=CH-(CH&sub2;)&sub7;-CH&sub3;
  • -Y'-(CH&sub2;)&sub8;-CH=CH-CH&sub2;-CH=CH-(CH&sub2;)&sub4;-CH&sub3;
  • -Y'-(CH&sub2;)&sub8;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub3;-CH&sub3;
  • -Y'-(CH&sub2;)&sub4;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub4;-(CH&sub2;)&sub3;-CH&sub3;
  • -Y'-(CH&sub2;)&sub4;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub5;-CH&sub3;, or
  • und wobei Y' - O - oder - NH - ist.
  • In bevorzugten Ausführungen ist X2:
  • und wobei Z1 - O -, - S -, - CH&sub2; - oder - NH - darstellt.
  • Bei einer weiteren Alternative kann die erfindungsgemäße Verbindung folgende Formel aufweisen
  • wobei X ein divalentes organisches Radikal darstellt, das eine aktive Säuregruppe beinhaltet, die R-Gruppen gleich oder unterschiedlich sein können und jedes R
  • -Y'-(CH&sub2;)&sub8;-CH=CH-(CH&sub2;)&sub7;-CH&sub3;
  • -Y'-(CH&sub2;)&sub8;-CH=CH-CH&sub2;-CH=CH-(CH&sub2;)&sub4;-CH&sub3;
  • -Y'-(CH&sub2;)&sub8;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub3;-CH&sub3;
  • -Y'-(CH&sub2;)&sub4;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub4;-(CH&sub2;)&sub3;-CH&sub3;
  • -Y'-(CH&sub2;)&sub4;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub5;-CH&sub3;, or
  • sein kann, wobei Y - O - oder - NH - ist und X durch die Formeln
  • repräsentiert ist, und wobei Z - O -, - S -, - CH&sub2; - oder - NH - ist.
  • Die Erfindung stellt ferner eine antioxidative, Antiphospholipase-Verbindung zur Verfügung, ohne aktive Hydroxygruppe der Formel:
  • wobei A1 einen organischen oder anorganischen anionischen Anteil darstellt; wobei Q1 - CH&sub2; - O - R5, Wasserstoff oder eine aliphatische C&sub1; bis C&sub4;-Gruppe repräsentiert; und wobei R1, R2 und R5 gleich oder verschieden sein können und jede einen fetthaltigen Anteil von 16 bis 20 Kohlenstoffatomen und mindestens eine cis-ungesättigte Doppelbindung aufweist.
  • In bevorzugten Verbindungen werden R1, R2 und R5 unabhängig aus der folgenden Gruppe selektiert:
  • In anderen bevorzugten Verbindungen stellt Al ein Anion der p-Toluolsulfonsäure dar.
  • Die Erfindung liefert ebenfalls eine antioxidative, Antiphospholipase-Verbindung ohne aktive Hydroxygruppe der folgenden Formel
  • wobei jede der R1, R2 und R5-Reste einen fetthaltigen Anteil von 16 bis 20 Kohlenstoffatomen und mindestens eine cis- ungesättigte Doppelbindung darstellt, 22 ist ein C&sub1; bis C&sub5;aliphatisches organisches Radikal und A2 ist ein organischer Säureanteil.
  • In bevorzugten Verbindungen werden R1, R2 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt aus:
  • In anderen bevorzugten Verbindungen stellt Z - (CH&sub2;)n - dar, und n ist 1 bis 5, bevorzugt 2, optional ist A2 eine Carboxyl- oder Sulfonyl-, bevorzugt eine Carboxylgruppe. In einer bevorzugten Ausführung ist n = 2 und A2 eine Sulfonylgruppe.
  • Eine besonders bevorzugte Verbindung ist:
  • In anderen bevorzugten Ausführungen ist n = 2 und A2 eine Sulfonylgruppe, und wobei Z2
  • ist und A2 eine Carboxylgruppe.
  • Die Erfindung liefert weiterhin eine antioxidative, Antiphospholipase-Verbindung ohne aktive Hydroxygruppe der Formel:
  • wobei jede der R1, R2 und R5-Gruppen einen fetthaltigen Anteil darstellt und 22 ein C&sub1; bis C&sub5; aliphatisches organisches Radikal ist.
  • In bevorzugten Verbindungen werden R1, R2 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt aus:
  • Die Erfindung stellt ebenfalls eine antioxidative, Antiphospholipase-Verbindung ohne aktive Hydroxylgruppe der folgenden Formel zur Verfügung:
  • wobei jede der R1, R2 und R5-Reste einen fetthaltigen Anteil darstellt und Z2 ein C&sub1; bis C&sub5; aliphatisches organisches Radikal ist.
  • Bevorzugt werden R1, R2 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt aus:
  • Die Erfindung stellt weiterhin eine antioxidative, Antiphospholipase-Verbindung bereit, ohne aktive Hydroxygruppe der Formel:
  • wobei A3 eine C&sub1; bis C&sub7;, aliphatische Gruppe darstellt, Q2 ist Z' - R6, eine C&sub1; bis C&sub4; Alkylgruppe, eine Nitrogruppe, eine Aminogruppe, eine Carboxylsäuregruppe, eine Sulfonsäuregruppe oder Wasserstoff. Z3, Z4, Z5 und Z' sind gleich oder verschieden und jeder ist - O - oder - NH - und jeder von R1, R2, R5 und R6 stellt einen fetthaltigen Anteil dar mit 16 bis 20 Kohlenstoffatomen und mindestens einer cis-ungesättigen Doppelbindung.
  • Bevorzugt weist die Verbindung die folgende Formel auf:
  • R1, R2, R5 und R6 können unabhängig voneinander ausgewählt werden aus:
  • Die Erfindung beinhaltet ebenfalls eine Verbindung wie zuvor definiert für die Verwendung als Pharmazeutikum.
  • Die Erfindung liefert eine therapeutische Formulierung, enthaltend eine Verbindung, wie zuvor definiert, zur Verwendung bei der Behandlung einer Phospholipase vermittelten Verletzung und/oder Entzündung.
  • Die Erfindung stellt des weiteren eine Formulierung zur Verfügung enthaltend eine Verbindung, wie zuvor definiert, und einen Träger, bevorzugt liegt genannte Formulierung in Form einer Salbe, Lotion oder eines Aerosols vor.
  • Die Erfindung schließt ebenfalls einen Prozess zur Herstellung einer Formulierung zur Behandlung von Phospholipase vermittelter Verletzung und/oder Entzündung ein, enthaltend die Formulierung einer Verbindung, wie zuvor definiert, um deren Dosierung von etwa 5 bis etwa 100 mg/kg zur Verfügung zu stellen.
  • Die Erfindung liefert eine Verwendung der Verbindungen, wie zuvor definiert, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Phospholipase vermittelter Verletzung und/oder Entzündung.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Fig. 4 bis 7 veranschaulichen strukturelle Konfigurationen und Reaktionsschemata zur Herstellung verschiedener Ausführungen der neuen zytoprotektiven, pharmakologisch antioxidativen, Antiphospholipase-aktiven Verbindungen der Erfindung.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungen
  • In einer vorhergegangenen Arbeit von Ballou und Cheng (Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 5203-5207, 1983, IBID 82: 371-375, 1985) und Marki und Franson (Biochem. Biophys. Acta 879: 149-156, 1986) wurde darüber berichtet, dass cisungesättigte, nicht jedoch gesättigte Fettsäuren, die aus menschlichen Thrombozyten und menschlichen polymorphonuklearen Leukozyten (PMNs) stammenden in vitro PLA&sub2;-Aktivitäten hemmen. Es wurde gezeigt, dass die PLA&sub2;- Aktivität durch Olein-, Linol- und Arachidonsäuren in annähernd dem gleichen Ausmaß gehemmt wird, indizierend dass das Vorliegen einer einzelnen cis-Doppelbindung die gleiche Hemmwirkung aufweist wie mehrere cis-Doppelbindungen. Im Gegensatz dazu weisen weder fetthaltige Säuren mit trans- Doppelbindungen noch Methylester von cis-ungesättigten Fettsäuren eine Hemmung der PLA&sub2;-Aktivität auf. Daher wurde angenommen, dass, die bevorzugten strukturellen Charakteristika zur Hemmung der in vitro PLA&sub2;-Aktivität bei nicht veresterten Fettsäuren mindestens eine cis- Doppelbindung beinhalten. Wie oben dargestellt, ist die hemmende Wirkung der Oleinsäure auf die in vitro PLA&sub2;- Aktivität auf die Gegenwart einer einzelnen cis- Doppelbindung an der C-9-Position zurückzuführen. Anhand neuerer Studien ist jedoch ersichtlich, dass die Hydroxylierung am C-12 Kohlenstoffatom, die eine 12- Hydroxyoleinsäure (Rizinolsäure) liefert, die hemmende Wirkung beseitigt. Trotz der Tatsache, dass die cis- Doppelbindung intakt ist, wandelt diese Hydroxylierungssubstitution daher eine hemmende Fettsäure in eine nicht hemmende Fettsäure um. Tatsächlich stellt Rizinolsäure ein wirksames inflammatorisches Agens dar und wird als solches in experimentellen Modellen oder als ein effektiver Bestandteil der abführenden Wirkung von Rizinusöl verwendet.
  • Dies unterstützend tritt eine ähnliche Änderung bei Arachidonsäure, einer Fettsäure mit 20 Kohlenstoffatomen und 4 cis-Doppelbindungen auf. Diese Verbindung stellt eine hemmende cis-polyungesättigte Fettsäure dar, die über den Cyclooxygenase-Stoffwechselweg in Prostaglandin B&sub1; (PGB&sub1;) umgewandelt wird. Das Produkt PGB&sub1; weist merklich weniger hemmende Wirkung auf als der Vorläufer Arachidonsäure (um mindestens zwei Größenordnungen), vermutlich weil es eine Hydroxylgruppe erworben hat.
  • Basierend auf dem oben Dargestellten ist es offensichtlich, dass oxidative Reaktionen den PLA&sub2;-hemmenden Effekt von cisungesättigten Fettsäuren neutralisieren können. Von physiologischer und pharmakologischer Bedeutung dazu zeigten die in der oben erwähnten Anmeldung '330 präsentierten Daten, dass die Prooxidation des muskulären sarkoplasmatischen Reticulums das Gewebe anfällig macht gegenüber Phospholipase-Abbau. Die Oxidation der Phospholipidmembranen verstärkt die Verwundbarkeit der Zellmembranen gegenüber Phospholipase-Abbau. Phospholipidmembranen, die an bestimmten Stellen eine Oxidation erfahren haben, können intakt erscheinen und ihre funktionelle Aktivität beibehalten, aber ihre Oxidation macht sie verwundbar gegenüber Abbau und Zerstörung durch PLA&sub2; oder andere Phospholipasen, aus endogenen oder exogenen Quellen.
  • Die Umkehrung der PLAT-Hemmung durch radikalisch-vermittelte Oxidation von cis-ungesättigten Fettsäuren kann ein bedeutendes Mittel darstellen, mit dem in situ PLA&sub2;s aktiviert werden, Gewebeentzündung, Differentiation und Zelltod zu vermitteln. Dies unterstützend hat sich gezeigt, dass Arachidonsäure direkt an aufgereinigte PLA&sub2; aus Schlangengift bindet. Darüber hinaus bleibt Arachidonsäure an die isolierte PLA&sub2; gebunden, ohne jedoch länger die Hemmung der in vitro PLA&sub2; Aktivität aufzuweisen, wenn die Arachidonsäure durch Aussetzung der Luft bei 37ºC peroxidiert wurde. Diese Ergebnisse stellen den Focus der Entdeckung der Tatsache dar, dass zelluläre PLA&sub2;s Fettsäurebindende Proteine darstellen, und dass, wenn die gebundene Fettsäure cis- ungesättigt ist, PLA&sub2; gehemmt wird. Zudem ist die PLA&sub2; enzymatische Aktivität wieder hergestellt und damit der Gehalt an "effektivem" Enzym gesteigert, wenn die cisungesättigten Fettsäuren oxidiert sind. Das Nettoergebnis bei Oxidation von Fettsäuren stellt eine offensichtliche Aktivierung von PLA&sub2; zur Induktion von Membranverletzung, Entzündung, Zytotoxizität und Zelltod dar. Diese Verschiebung von der inaktiven in die aktive Form der PLA&sub2; signalisiert den Beginn des Verlustes der Phospholipidmembranstruktur.
  • In damit zusammenhängenden Studien zeigten Jung et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 130: 559-566, 1985), dass die spezifische Hydroxylierung des Kohlenstoffs 15, nicht jedoch der Kohlenstoffe 5 oder 12, von an 2-Position mit Phosphatidylcholin veresterter Arachidonsäure eine Zunahme der PLA&sub2; aus Pankreas vermittelten Hydrolyse von Phospholipid um 170% bewirkte. Somit "aktivieren" oxidative Reaktionen von cis-ungesättigten Fettsäuren nicht nur die PLA&sub2; Enzymfunktion durch Veränderung der inhibitorischen Fettsäuren, sondern sind auch in der Lage, die Anfälligkeit des Substrates Phospholipid gegenüber Enzym-induzierter Hydrolyse zu verstärken.
  • Die Beobachtungen, die die verstärkte Verwundbarkeit von Phospholipidmembranen gegenüber aus oxidativ und radikalisch vermittelten Veränderungen in Zellmembranen und/oder Fettsäuren folgender Phospholipase veranschaulichten, haben in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zu dem Design neuer anti-inflammatorischer und zytoprotektiver Agenzien geführt. Die Erfindung liefert somit eine biochemische und synthetische organische Annäherung zur Kontrolle der Expression von PLA&sub2; Enzymen und ist wesentlich zur Aufrechterhaltung der Membranstruktur.
  • Es ist von Bedeutung zum Verständnis der vorliegenden Offenbarung zu erkennen, dass die Anzahl der verfügbaren, durch Methylen unterbrochenen, cis-ungesättigten Doppelbindungen sich direkt auf die Anfälligkeit von Fettsäuren gegenüber Oxidation bezieht. Dies regelt die Fähigkeit der cis-ungesättigten Fettsäuren als Antioxidantien zu agieren. Diese Eigenschaft, in Verbindung mit der Anti-PLA&sub2;-Aktivität der fetthaltigen Verbindungen der Erfindung, erweitert merklich den Umfang der antiinflammatorischen und zytoprotektiven Aktivität der neuen, hier beschriebenen, Agenzien. Es ist die Eigenschaft der doppelten Wirkung dieser Verbindungen, zum Beispiel ihrer Wirkung als PLA&sub2;-Hemmer und ihrer kombinierten antioxidativen Wirkung, die das Spektrum der antiinflammatorischen Aktivität in Modellsystemen liefert, welche direkte Anwendbarkeit auf Zytoprotektion und die Kontrolle von Entzündung und Pathophysiologie ermöglichen.
  • Zusammenfassend ist eine einzige cis-Doppelbindung in einer fetthaltigen Verbindung ausreichend zur Hemmung der PLA&sub2;- Aktivität in vitro und in situ. Die Addition weiterer Doppelbindungen liefert den zusätzlichen Wert einer Steigerung der leistungsfähigen antioxidativen Aktivität zusammen mit der PLA&sub2; hemmenden Wirkung. Die vorliegende Erfindung stellt somit Verbindungen zur Verfügung, die charakterisiert sind sowohl durch anti-PLA&sub2; als auch durch antioxidazive Aktivität, um dadurch die antiinflammatorische und zytoprotektive Wirkung, die den Schlüssel zum klinischen Wert der Verbindungen der Erfindung darstellt, zu maximieren.
  • Zusätzlich zur hemmenden PLA&sub2;-Aktivität stellt die antioxidative Wirkung dieser Verbindungen einen Schutz für die Proteine dar, die aufgrund von Oxidation in zunehmendem Maße verwundbar gegenüber einem Angriff durch Protease werden. Somit sind die zytoprotektiven PLA&sub2;-Hemmer der Erfindung, die ebenfalls eine antioxidative Wirkung aufweisen, sowohl bei der Stabilisierung des Membranphospholipids als auch bei der Hemmung oder Vermeidung von Proteinabbau oder -denaturierung von Wert.
  • In Übereinstimmung mit der Erfindung:
  • (1) binden die zytoprotektiven, antiinflammatorischen Verbindungen an das PLA&sub2; Enzym;
  • (2) sind die zytoprotektiven, anti-inflammatorischen Verbindungen in der Lage, zur Beseitigung der inhibitorischen Wirkungen und zur Aktivierung des Enzyms ohne Entfernung der Komponente von seiner PLA&sub2; Bindungsstelle kontinuierlich hydroxyliert zu werden;
  • (3) stellen die zytoprotektiven, anti-inflammatorischen Verbindungen fetthaltige Anteile enthaltende Verbindungen dar, die eine freie Säurefunktion aufweisen können oder zumindest bevorzugt zur Wasserlöslichkeit und verstärkten PLA&sub2; Hemmung ionisierbar sind;
  • (4) beinhalten die zytoprotektiven, anti-inflammatorischen Verbindungen cis-Doppelbindungen im Fettanteil, um die beste PLA&sub2;-Hemmung zu erhalten; und
  • (5) besitzen die zytoprotektiven, anti-inflammatorischen Verbindungen anti-inflammatorische Aktivität als Ergebnis einer Hemmung der freien Radikalaktivität.
  • Wie in den zuvor genannten querverwiesenen Patentanmeldungen dargestellt wird, haben vorangegangene Studien gezeigt, dass Polymere des PGB&sub1;, jedoch nicht das Monomer PGB&sub1; selber, einen breiten Schutz in einem großen Bereich von Modellen der Zell- und Gewebeverletzung zur Verfügung stellen. Im Gegensatz zur vorliegenden Offenbarung gab es bisher keinen grundlegenden Mechanismus, der diesem allgemeinen Schutzeffekt unterlag. Aber es war aufgrund dieser vorangehenden Studien klar, dass Polymere oder Oligomere eine größere Effektivität als Monomere aufweisen sollten, und dass eine freie Carboxylfunktion im Polymer wünschenswert für eine optimale protektive Aktivität sein könnte.
  • In aktuellen Studien hat sich gezeigt, dass Polymere von PGB&sub1; eine große Anzahl von Ca&spplus;&spplus;-abhängigen PLA&sub2;s, einschließlich Schlangen-, Bienen- und Skorpiongift, und menschlichen PLA&sub2;s, erhalten aus Gelenkflüssigkeit, PMNs, Thrombozyten, Plasma, Sperma, Endometrium und Bandscheibenvorfällen hemmen. Bei Konzentrationen von 10 uM wies PGB&sub1; (Monomer) keine hemmenden Eigenschaften auf, während beim Dimer die halbe maximale hemmende Aktivität vorlag. Die inhibitorische Aktivität des Trimeren ist geringer als die des Tetrameren, während die Aktivität des letztgenannten gleich zu der von PGBX ist. Somit generiert die Polymerisation von Prostaglandin B&sub1;, einem Metaboliten der cis-polyungesättigten Fettsäure Arachidonat, Inhibitoren von PLA&sub2;s.
  • Ähnlich wie in den querverwiesenen Anmeldungen berichtet, weisen Polymere von PGB&sub1; die gleiche Effektivität bei der Hemmung der Freisetzung von Arachidonsäure und Thrombozyten aktivierendem Faktor aus vormarkierten humanen PMNs und endothelialen Zellen auf, die im Hinblick auf die inflammatorische Reizantwort dieser Zellen kritische Reaktionen darstellen und die durch endogene PLA&sub2;-Aktivität vermittelt werden.
  • Von besonderer Bedeutung für die vorliegende Offenbarung ist die Tatsache, dass Polymere von PGB&sub1; ebenfalls eine leistungsstarke antioxidative Aktivität aufweisen. Wie oben erwähnt, enthält Arachidonsäure 4 cis-ungesättigte, durch Methylen unterbrochene Doppelbindungen, die besonders anfällig gegenüber Oxidation sind. Bei der Umwandlung von Arachidonsäure zu Prostaglandin B&sub1; durch Cyklooxygenasen, eine enzymvermittelte Oxygenierung, bleiben 2 der 4 ursprünglichen cis-Doppelbindungen erhalten. Diese Bindungen weisen weiterhin eine durch Methylen unterbrochene Konfiguration auf, die eine optimale Orientierung für deren Oxidation darstellt.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung blockieren die Arachidonsäurefreisetzung aus humanen PMNs und endothelialen Zellen, eine durch die zelluläre PLA&sub2;-Aktivität vermittelte Reaktion. Daher stellen die Verbindungen der Erfindung leistungsstarke, reversible, enzymgerichtete PLA&sub2;- Inhibitoren dar und als solche hemmen diese Agenzien die proinflammatorische Reizantwort auf das humane PMN und andere inflammatorische Zellen durch Hemmung der zellulären PLA&sub2;-Aktivität. Des weiteren hemmen die Verbindungen der Erfindung die, in den inflammatorischen Prozess verwickelte, Radikalaktivität in Zellen und Gewebe.
  • Die Verbindungen der Erfindung repräsentieren ebenfalls effektive Antioxidantien. Die Hemmung der Oxidation von Phospholipid und Arachidonsäure erfolgt in einer dosisabhängigen Weise. Diese Eigenschaft schützt Membranen nicht nur vor radikalisch bewirkter Verletzung der Stabiliserungsfunktion, sondern verhindert zudem die bevorzugte Hydrolyse des oxidierten Phospholipides durch zelluläre Phospholipasen. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Verbindungen der Erfindung eine Minimierung der Entzündung bei ihrem Ausgangspunkt bewirken und ebenfalls den fortschreitenden Prozess unterbrechen.
  • Die Fähigkeit von cis-ungesättigten, fetthaltigen Verbindungen zur Vermeidung der Oxidation von Proteinen bewirkt ebenfalls eine Unterdrückung der Expression von Zellproteasen durch Aufrechterhaltung der Spiegel von edogenen Proteaseinhibitoren. Diese Inhibitoren wie α-1- Antitrypsin, bilden wesentliche Komponenten des Plasmas, und die Aufhebung ihrer inhibitorischen Aktivität erfolgt durch Oxidation der -SH-Gruppen- über freie Radikale. Die antioxidative Aktivität der cis-ungesättigten, fetthaltigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung stabilisiert α-1- Antitrypsin über eine antioxidative Wirkung. Daher reguliert die antioxidative Aktivtät der cis-ungesättigten, fetthaltigen Verbindungen sowohl die Expression der lipolytischen als auch der proteolytischen Enzyme (z. B. Elastase) durch Vermeidung der Oxidation des Substrates ebenso wie des endogenen Inhibitors.
  • Die 12-Hydroxylierung der Olein-Säure ergibt Rizinolsäure. Somit erfolgt eine Umwandlung einer hemmenden Fettsäure in ein nicht-hemmendes, hydroxyliertes Derivat. Der -OH-Anteil kann jedoch zur Generierung hemmender Verbindungen verwendet werden. Die hydroxylierten Derivate liefern somit Vorläufer- Bausteine für die Synthese von aktiven, zytoprotektiven Agenzien mit PLA&sub2;-hemmender Aktivität. Bei der Polymerisierung von Rizinoleat durch Hitze in Schwefelsäure, hemmt das rohe, unfraktionierte Produkt bereits die PLA&sub2;-Aktivität in vitro und in situ.
  • Tatsächlich erfolgt eine Umwandlung der inaktiven, nichthemmenden Monomere in extrem aktive PLA&sub2;-Inhibitoren. Darüber hinaus werden die aktiven proinflammatorischen Mediatoren strukturell umgewandelt, um anti-inflammatorische Verbindungen zu liefern.
  • PLA&sub2;-Inhibitoren, wie Derivate der Rizinolsäure, die keine signifikante antioxidative Wirkung aufweisen, besitzen begrenzte anti-inflammatorische Wirkung. Die Gegenwart der ungesättigten Bindungen von den cis-ungesättigten fetthaltigen Anteilen der Verbindungen verstärkt die antiinflammatorische Aktivität. Dies indiziert, dass inflammatorische Reaktionen in ihren besonderen Merkmalen variieren können, wobei einige inflammtorische Reaktionen allein durch die Hemmung von PLA&sub2; eine Inhibition oder Abschwächung erfahren können, während einige andere Reaktionen eine antioxidative Aktivität zusammen mit PLA&sub2;- Hemmung benötigen. In Übereinstimmung mit der Erfindung ist daher, um ein breites Spektrum anti-inflammatorischer Wirkung zu erhalten, die zweifache Wirkung von anti-PLA&sub2;- und antioxidativer Wirkung bevorzugt. Aus ungesättigten Fettsäuren und anderen ungesättigten, fetthaltigen Verbindungen gebildete polyungesättigte Verbindungen stellen genauso leistungsstarke antioxidative Aktiviät wie anti- PLA&sub2;-Wirkung zur Verfügung.
  • Im allgemeinen Sinne stellt die Erfindung pharmakologisch aktive, Antiphospholipase-Verbindungen zur Verfügung, die chemisch definiert und rein sind. Bevorzugt handelt es sich bei den Verbindungen der Erfindung um wasserlösliche Antioxidantien. Vom funktionellen Gesichtspunkt aus weisen die bevorzugten Verbindungen mindestens zwei fetthaltige Anteile und keine aktive Hydroxygruppe auf. Jeder fetthaltige Anteil sollte vorzugsweise 16 bis 20 Kohlenstoffatome und mindestens eine cis-ungesättigte Doppelbindung aufweisen. Die Verbindungen können ebenfalls mindestens eine aktive Säuregruppe enthalten. In einer bevorzugten Form handelt es sich bei der Verbindung um ein Derivat der Rizinolsäure mit einer strukturellen Konfiguration wie in Fig. 1 der Zeichnungen dargestellt, wobei R&sub1; eine Alkoxy-Gruppe repräsentiert, die eine aktive Säuregruppe beinhaltet, und R&sub2; eine Alkoxy-Gruppe ist, die einen der fetthaltigen Anteile beinhaltet. In einem Fall kann der R&sub1;-Anteil durch Veresterung der Hydroxygruppe an 12-Position der Rizinolsäure mit einer Säuregruppe einer divalenten Säure wie Sebacin-Säure, Fumarsäure, Maleinsäure, Oxalsäure oder Bernsteinsäure und der R&sub2;-Anteil durch Veresterung der Carboxygruppe von Rizinolsäure an 1-Position mit der Hydroxylgruppe eines anderen Rizinolsäure-Moleküls oder eines anderen cis-ungesättigten, fetthaltigen Alkohols wie beispielsweise Oleylalkohol, Linoleylalkohol, Linolenylalkohol, Arachidonylalkohol oder cis-5, 8, 11, 14, 17-Eicosapentaenoylalkohol erhalten werden. Alternativ ist der R&sub2;-Anteil erhältlich durch Amidifizierung der Carboxygruppe von Rizinolsäure an 1-Position mit der Amingruppe eines cis-ungesättigten fetthaltigen Amins, wie Oleylamin, Linoleylamin, Linolenylamin, Arachidonylamin oder cis-5, 8, 11, 14, 17-Eicosapentaenoylamin. Somit kann R&sub2; einen Anteil mit einer der folgenden Konfigurationen aufweisen:
  • -Y-(CH&sub2;)&sub8;-CH=CH-(CH&sub2;)&sub7;-CH&sub3;
  • -Y-(CH&sub2;)&sub8;-CH=CH-CH&sub2;-CH=CH-(CH&sub2;)&sub4;-CH&sub3;
  • -Y-(CH&sub2;)&sub8;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub3;-CH&sub3;
  • -Y-(CH&sub2;)&sub4;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub4;-(CH&sub2;)&sub3;-CH&sub3;
  • -Y-(CH&sub2;)&sub4;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub5;-CH&sub3;, or
  • wobei Y -O- oder -NH- sein kann.
  • In Übereinstimmung mit einer anderen Ausführung der Erfindung kann die strukturelle Konfiguration der Verbindung folgendermaßen sein:
  • R&sub1;-O-X-O-R&sub2;
  • wobei X einen divalenten, organischen Anteil darstellt, der zumindest eine aktive Säuregruppe beinhaltet, und die Gruppen R&sub1; und R&sub2; gleich oder verschieden und jede beispielsweise eine der folgenden Gruppen sein können:
  • In dieser Form der Erfindung ist X erhältlich durch Veresterung der Hydroxygruppe von Weinsäure, wobei X die folgende strukturelle Konfiguration aufweist:
  • Ein geeignetes Reaktionsschema für diese Verfahrensweise ist in Fig. 5 veranschaulicht. Jeder
  • Anteil in der Verbindung der Fig. 5 ist repräsentiert durch eine R&sub1;-Gruppe in der Verbindung
  • R&sub3;-O-X-O-R&sub4;
  • In einer anderen alternativen Form können die Verbindungen der Erfindung die Struktur aufweisen
  • wobei X einen divalenten, organischen Anteil darstellt, der eine aktive Säuregruppe beinhalten kann, und die R&sub1;-Gruppen gleich oder unterschiedlich und beispielsweise eine der folgenden Gruppen sein können:
  • -Y-(CH&sub2;)&sub8;-CH=CH-(CH&sub2;)&sub7;-CH&sub3;
  • -Y-(CH&sub2;)&sub8;-CH=CH-CH&sub2;-CH=CH-(CH&sub2;)&sub4;-CH&sub3;
  • -Y-(CH&sub2;)&sub8;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub3;-CH&sub3;
  • -Y-(CH&sub2;)&sub4;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub4;-(CH&sub2;)&sub3;-CH&sub3;
  • -Y-(CH&sub2;)&sub4;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub5;-CH&sub3;,
  • wobei Y -O- oder -NH- ist.
  • In dieser Ausführung steht X für
  • wobei Z -O-, -S-, -CH&sub2;- oder -NH- repräsentiert. Die Herstellung der Verbindungen dieser Ausführung erfolgt nach dem in Fig. 4 veranschaulichten Reaktionsschema, wobei die produzierte Verbindung Carboxylgruppen an den 2- und 3- Positionen des Ringes aufweist. Auch ein entsprechender Fachmann würde es jedoch so einschätzen, dass das Reaktionsschema der Fig. 4 so geführt werden kann, dass sich eine von verschiedenen isomeren Verbindungen, beispielsweise mit der Carboxylgruppe an den Positionen 2 und 3 wie gezeigt oder alternativ mit den Carboxylgruppen an den 1- und 2-Positionen, an den 1- und 3-Positionen oder an den 1- und 4-Positionen ergibt. Jeder R-Y-Anteil in der Verbindung von Fig. 4 wird repräsentiert durch eine R&sub1;- Gruppe in der Verbindung
  • Die Erfindung beabsichtigt eine Vielzahl von Konfigurationen, einschließlich beispielsweise Dimere, Trimere und Tetramere. Dimere sind in den Fig. 1, 2, 4 und 5 veranschaulicht, Trimere in den Fig. 1 und 3 und Tetramere in den Fig. 6 und 7.
  • Mit Verweis auf Fig. 6 können die, in Übereinstimmung mit Fig. 5 produzierten, Verbindungen über Veresterung an einer der freien Säuregruppen miteinander verbunden sein. Somit können die Säuregruppen in Säurechloridgruppen umgewandelt und mit Hydroxy- oder Amingruppen einer divalenten Verbindung der folgenden Form zur Reaktion gebracht werden:
  • H-Y-R&sub1;-Y-H,
  • wobei Y -O- oder -NH- und R&sub1; eine divalente, bevorzugt aliphatische, organische Gruppe ist. Wie zuvor stellen die R-Gruppen der gebildeten Verbindung, wie in Fig. 6 veranschaulicht, gleiche oder verschiedene Gruppen dar und beinhalten bevorzugt cis-ungesättigte, fetthaltige Anteile.
  • Das in Fig. 7 verdeutlichte Reaktionsschema ermöglicht die Verwendung jeder der isomeren Verbindungen, die in Übereinstimmung mit dem Rekationsschema der Fig. 4, wie oben diskutiert, erhalten werden können. Somit erfolgt eine Umwandlung der freien Säuregruppen von einer der isomeren Verbindungen der Fig. 4 in ein Säurechlorid oder -anhydrid und Veresterung mit den Hydroxy- oder Aminogruppen eines bivalenten organischen Anteils.
  • In jedem Fall schließen die Verbindungen der Erfindung mindestens zwei cis-ungesättigte, geradkettige, fetthaltige C&sub1;&sub8;- bis C&sub2;&sub0;-Anteile ein und weisen keine aktive Hydroxygruppen auf. Wünschenswerterweise beinhaltet jede Verbindung ebenfalls mindestens eine aktive Säuregruppe. Die in Übereinstimmung mit den Prinzipien und Konzepten der Erfindung gelieferten neuen, wasserlöslichen und/oder lipidlöslichen, pharmakologisch aktiven, reinen oder aufreinigbaren antioxydativen Antiphospholipase-Verbindungen können anhand der Darstellung der folgenden spezifischen Beispiele hergestellt werden.
  • Zusätzlich zu den zuvor genannten Verbindungen sind weitere Verbindungen in den breiten Umfang der Erfindung mit eingeschlossen. Einige dieser Verbindungen sind strukturell durch die folgende allgemeine Formel definiert:
  • wobei A1 einen organischen oder anorganischen, anionischen Anteil darstellt; wobei Q&sub1; -CH&sub2;-O-R&sub5;, ein Wasserstoffmolekül oder eine aliphatische C&sub1;-C&sub4;-Gruppe ist; und wobei die Gruppen R&sub1;, R&sub2; und R&sub5; gleich oder verschieden sein können und jede einen fetthaltigen Anteil aufweist.
  • In dieser Form der Erfindung können die R-Gruppen eine der folgenden strukturellen Formulierungen besitzen:
  • Eine Methode zur Herstellung einer besonders bevorzugten Verbindung der zuvor genannten strukturellen Konfiguration wird in Beispiel 1 beschrieben.
    • Beispiel 1 P-Toluolsulfonat-Salz von Tris-Trioleat
  • 0,54 g (4,4 mmol) Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris, Aldrich), 5,0 g (17.7 mmol) Oleinsäure (Aldrich) und 1,26 g (6,6 mmol) p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat (Sigma) werden in 50 ml Toluol gemischt und in einen 100 ml Einhals- Rundkolben, ausgerüstet mit einem Dean-Stark-Abscheider und einem Teflon-ummantelten, magnetischen Rührfisch gegeben. Nach Durchspülen der Reaktionsmischung mit N&sub2;-Gas für 10 Minuten erfolgt das Erhitzen der Reaktionsmischung unter Rückflussbedingungen. Die Reaktion wird fortgesetzt bis sich eine stoichiometrische Wassermenge gebildet hat (0,38 ml). Nach Entfernung einer kleinen Menge des unlöslichen Materials durch Filtration erfolgt eine Rotationsverdampfung zu Entfernung des Toluols, und man erhält ein weißes, wachsartiges Produkt. Dieses Produkt wird aufgereinigt mit Hilfe einer Silicagel-Säule (Aldrich 230-400 mesh, 2,0 · 55 cm) mit 8 : 2 Petrolether (Sdp. 60-90ºC) - Ethylacetat als Laufmittel. Nach Eluierung mit dem Laufmittel wird die obere farblose Schicht vorsichtig entfernt und das Produkt mit Ethylacetat vom Silicagel extrahiert. Die Entfernung des Lösungsmittels erfolgt durch Rotationsverdampfung, und das Produkt ist erhältlich als ein p-Toluolsulfonsäuresalz von Tris-Trioleat mit der folgenden strukturellen Konfiguration:
  • Bei diesem Verfahren ist die Aminogruppe des Tris vor einer Reaktion mit der Fettsäure geschützt, da es in Form des p- Toluolsulfonatsalzes vorliegt. Zudem fungiert die p- Toluolsulfonsäure als Katalysator bei der Veresterung zwischen den Alkoholfunktionen des Tris und der Fettsäure.
  • Eine weitere Klasse von Verbindungen im allgemeinen Anwendungsbereich der Erfindung weist die folgende generelle strukturelle Formulierung auf:
  • wobei jeder von R&sub1;, R&sub2; und R&sub5; einen fetthaltigen Anteil darstellt, wobei 22 ein divalentes, aliphatisches, organisches C&sub1; bis C&sub5;-Radikal sein kann, und wobei A&sub2; einen organischen Säureanteil repräsentiert. In diesem Fall können die R-Gruppen auch die strukturellen Formulierungen wie im vorhergehenden Paragraphen enthalten.
  • Z&sub2; stellt bevorzugt -(CH&sub2;)n-, (wobei n = 1 bis 5 ist), dar
  • und A entspricht einer Carboxyl- oder einer Sulfonyl-Gruppe. Die Methoden zur Herstellung der Verbindungen innerhalb dieser Gruppe von Verbindungen werden fortgesetzt in den unten aufgeführten Beispielen 2 und 3.
    • Beispiel 2 TES-Trioleat
  • In einen 250 ml Einhals-Rundkolben werden 1,0 g (4,36 mmol) 2-[Tris(hydroxylmethyl)-methylamino]-1-ethansulfonsäure (TES; Aldrich; 99% Reinheit) und 25,0 ml wasserfreies Dimethylformamid (DMF) gegeben. Es folgt Kühlung des Kolbeninhaltes auf 0ºC in einem Eiswasserbad. Anschließend erfolgt die tropfenweise Zugabe von 5,25 g (17,45 mmol) Oleylchlorid (Aldrich, technische Qualität) in einem Zeitraum von 5 Minuten. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur 4 Tage gerührt. DMF wird durch Destillation bei 40-45ºC unter reduziertem Druck destilliert. Beim Rückstand handelt es sich um ein viskoses Öl, das in einen 200 ml Aceton enthaltenden Kolben transferiert und, bis sich eine leicht trübe Lösung bildet, energisch gerührt wird. Diese Lösung wird über Nacht eingefroren. Der ausgefallene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und fünfmal mit destilliertem Aceton (20 ml) gewaschen. Das Produkt wird im Vakuum bei Raumtemperatur für 24 Stunden getrocknet (2,32 g, 52%) und hat folgende strukturelle Konfiguration:
    • Beispiel 3: Tris-Trioleat-Maleinsäureamid
  • 2,0 g (1,96 mmol) Tris-Trioleat werden in einem 50 ml Einhals-Rundkolben in 10 ml wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. Es folgt Kühlung der Lösung bei 0ºC in einem Eiswasserbad und tropfenweise Zugabe von 0,42 g (1,96 mmol) CH&sub3;ONa (Aldrich, 25 Gew.-% in CH&sub3;OH) unter energischem Rühren. Nach 30 Minuten werden die Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt und der Rückstand im Vakuum bei Raumtemperatur für 24 Stunden getrocknet. Zu diesem Material werden 10 ml frisch destilliertes CH&sub2;Cl&sub2; und 0,37 g (3,90 mmol) rekristallisiertes Maleinsäureanhydrid gegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Das Methylenchlorid wird durch Rotationsverdampfung entfernt und das erhaltene viskose Öl in ein 250 ml Becherglas mit 100 ml Aceton und 5 ml H&sub2;O gegeben. Dieses wird energisch gerührt, bis sich eine klare Lösung bildet. Die Lösung wird über Nacht tiefgekühlt und bis sich ein viskoses Material am Boden des Becherglases bildet. Die obere Schicht wird abgetrennt und daraus das Aceton rotationsverdampft. Der Rückstand wird für 15 Minuten mit 10 ml CHCl&sub3; gerührt, und das unlösliche Material durch Filtration entfernt. Das CHCl&sub3; wird durch Rotationsverdampfung entfernt und das verbleibende Öl dann analog zur weiteren Entfernung von Verunreinigungen mit Benzol behandelt. Das Endprodukt stellt ein wachsgleiches Material dar (0,82 mg, 37%), das die folgende strukturelle Konfiguration aufweist:
  • Eine weitere Gruppe von Verbindungen im allgemeinen Anwendungsbereich der Erfindung kann durch die folgende allgemeine strukturelle Konfiguration beschrieben werden:
  • wobei jedes R&sub1;, R&sub2; und R&sub5; einen fetthaltigen Anteil darstellt und Z&sub2; ein aliphatisches, organisches C&sub1; bis C&sub5;-Radikal. In dieser Form der Erfindung werden die Gruppen R&sub1;, R&sub2; und R&sub5; ausgewählt aus
  • Eine Methode zur Herstellung der Verbindungen innerhalb dieser Gruppe von Verbindungen wird unten in Beispiel 4 aufgeführt.
    • Beispiel 4 Tricinyltrioleate
  • 0,67 g (3,75 mmol) N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycin (Tricin; Aldrich) wird in 15 ml wasserfreiem DMF suspendiert und in einen 100 ml Einhals-Rundkolben, versehen mit einem Teflon-ummantelten magnetischen Rührfisch gegeben. Die Suspension wird mit einem Eiswasserbad auf 0ºC abgekühlt und 5,6 g (18,75 mmol) Oleylchlorid tropfenweise zugegeben. Die Reaktionsmischung wird mit einer Lösung aus 15 ml wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; und 2,7 g (22,5 mmol) 4- Dimethylaminopyridin versetzt, die resultierende Beimischung auf Raumtemperatur erwärmt und für 22 Stunden gerührt. Die Mischung wird filtriert und die Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. 200 ml Ethylacetat werden zum Rückstand gegeben und das unlösliche Material durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird dreimal mit 100 ml- Portionen 5%iger wässriger NaHCO&sub3;-Lösung (gesättigt mit NaCl) gewaschen. Die Ethylacetatschicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet, und anschließend wird das Ethylacetat rotationsverdampft, um ein Rohprodukt zu erhalten, das dann mittels Chromatographie aufgereinigt wird, unter Verwendung einer Silicagelsäule (Aldrich, 230- 400 mesh, 2,0 · 55 cm) und Petrolether (Sdp. 60- 90ºC) : Ethylacetat = 8 : 2 als Laufmittel. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden zusammengegeben und das Lösungsmittel verdampft. Das Produkt, das als Amiddiesterlacton bezeichnet werden kann, zeigt nur einen Fleck in der DSC, Rf 0,44 (Aldrich vorumhüllte Silicagel DC- Platten; Petrolether : Ethylacetat = 8 : 2) und weist folgende strukturelle Konfiguration auf:
  • Wenn das zuvor genannte Produkt der Probenpräparation in Kontakt mit NaOH gelangt, öffnet sich der Ring, um eine Amiddiesterhydroxysäure-Verbindung zu liefern, die folgende strukturelle Konfiguration aufweist:
  • Eine weitere Gruppe von Verbindungen, die die Konzepte und Prinzipien der Erfindung verkörpert, kann durch die folgende allgemeine Formel beschrieben werden:
  • wobei A3 eine aliphatische C&sub1;- bis C&sub7;-Gruppe darstellt, Q&sub2; -Z'-R&sub6;, eine C&sub1;-bis C&sub4;-Alkylgruppe, eine Nitrogruppe, eine Aminogruppe, eine Carboxylsäuregruppe, eine Sulfonsäuregruppe oder ein Wasserstoffatom sein kann, die Gruppen Z&sub3;, Z&sub4;, Z&sub5; und Z', die gleich oder verschieden sein können, - O - oder - NH - repräsentieren und jeder von R&sub1;, R&sub2;, R&sub5; und R&sub6; fetthaltige Anteile, wie oben beschrieben, darstellen.
  • Andere Verbindungen der zuvor genannten Klasse von Verbindungen können durch die folgenden subtypischen strukturellen Formeln repräsentiert werden:
  • Schätzenswerterweise können die Verbindungen in dieser Klasse aus multivalenten Hydroxiden und Amiden durch Veresterung und/oder Amidierung unter Verwendung einer entsprechenden Fettsäureverbindung hergestellt werden. Geeignete Ausgangsmaterialien schließen 2-Amino-2- hydroxymethyl-1-hydroxybutan; 1,3-Diamino-2-hydroxypropan; 1,3-Dihydroxy-2-amino-2-hydroxymethylpropan und 1,3- Dihydroxy-2,2-dihydroxymethylpropan ein. Ein Mangel der Verbindungen dieser Klasse stellt ihr relativer Mangel an Löslichkeit in Wasser dar. Geeignete Dosierungsformen sind jedoch erhältlich unter Verwendung von DMSO als Lösungsmittel.
  • Ein Verfahren zur Herstellung einer spezifischen Verbindung in dieser Klasse ist in Beispiel 5 aufgeführt.
    • Beispiel 5 1,3-Diamino-2-hydroxypropanoleyldiamidester
  • In einem 1-Liter Reaktionskolben werden 20 g (0,22 mol) 1,3- Diamino-2-hydroxypropan in 500 ml CH&sub2;Cl&sub2;, enthaltend 88,1 g (0,72 mol) Dimethylaminopyridin, gelöst. Die Lösung wird in einem Eisbad gekühlt, während 213,6 g (0,71 mol) Oleylchlorid (70%, Aldrich) unter Rühren in einem Zeitraum von 2 Sunden zugefügt werden. Die Reaktionsmischung wird anschließend bei Raumtemperatur für 70 Stunden gerührt. Die ausgefallenen Salze werden durch Filtration und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt. Das zurückbleibende Öl wird in 600 ml Ethylacetat gelöst und die unlöslichen Bestandteile durch Filtration entfernt. Das Ethylacetat wird mit gesättigter NaCl/H&sub2;O-Lösung gewaschen (dreimal). Die nicht-wässrige Lösung wird über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt. Das erhaltene Öl wird mit 250 ml Methanol gewaschen (viermal). Der Rückstand wird in 800 ml Ethylacetat, das mit 15 g Aktivkohle behandelt und gefiltert wurde, aufgenommen. Die Lösung wird durch eine Silicagelsäule (3,0 · 10 cm) geleitet, und die aufgefangene Lösung konzentriert, um ein viskoses, hellgelbes Öl zu erhalten (141,6 g). DSC ergab einen Fleck und die Struktur wurde durch IR, H- und ¹³C-NMR verifiziert. Die strukturelle Konfiguration ist wie folgt:
  • Die relativen Fähigkeiten einiger der oben beschriebenen Verbindungen, als Antioxidantien und als anti-PLA&sub2;-Agenzien zu fungieren, ist in der nachfolgenden Tabelle 6 veranschaulicht, wobei die Polymere folgendermaßen verglichen wurden:
  • PX-1 (PGBX)
  • PX-9 (Tartrat/Linoleat/Linoleatdimer)
  • PX-10 (Tartrat/Oleat/Oleatdimer)
  • PX-11 (Beispiel 4-Trimer)
  • PX-12 (Beispiel 1-Trimer)
  • PX-13 (Beispiel 2-Trimer)
  • PX-14 (Tris-Trilinoleat-Trimer)
  • PX-15 (Tricin-Trilinoleat-Trimer)
  • Die Ausdrücke Monomer, Dimer und Trimer der vorangegangenen Liste und wie sie in der vorliegenden Beschreibung verwendet wurden, definieren die Anzahl der in dem entsprechenden Molekül vorliegenden C&sub1;&sub8;- bis C&sub2;&sub0;-fetthaltigen Anteile. Sozusagen weist ein Monomer einen solchen fetthaltigen Anteil, ein Dimer zwei und ein Trimer drei auf usw. Tabelle 6
  • nn* = nicht nachweisbar bei ≤ 500 uM
  • ** höchs: effektiv vs PLA&sub2;-induziertes Ödem der Mauspfote; verabreicht in einer einzigen, oralen Dosis: IC50 etwa 15 mg/kg.
  • Die Polymere (Dimere, Trimere, Tetramere, etc.) der cisungesättigten Fettsäuren und die anderen Verbindungen mit mindestes zwei cis-ungesättigten, geradkettigen, fetthaltigen Radikalen, wie oben beschrieben, beeinflussen die fundamentalen Membran-Phospholipid-Raktionen des Phospholipase-induzierten Abbaus und der freien Radikalperoxydierung. Die Entdeckung dieser zweifachen Eigenschaften, Antiphospholipase- und antioxidative Wirkungen, dieser Verbindungen begründet eine wissenschaftliche Basis für deren molekulare Wirkung beim Schutz der Zelle und ihrer Membran vor Verletzung. Die oben aufgeführten Daten bestätigen, mit experimentellen Ergebnissen, dass diese Verbindungen leistungsstarke antiinflammmatorische und cytoprotektive Agenzien darstellen.
  • Die geeignete Dosierung der cis-ungesättigten, fetthaltigen Verbindungen der Erfindung für die Behandlung von Säugetieren, einschließlich Menschen, gegen Phospholipasevermittelte Verletzung und/oder Entzündung sollte in einem Bereich von etwa 10 bis etwa 100 mg pro kg (mg/kg) des Körpergewichtes liegen, wenn die Verabreichung der Verbindung oral oder intraperitoneal (IP) erfolgt. Bei intravenöser Verabreichung, sollte die Dosierung ungefähr 50% der oralen oder IP-Dosierung betragen, um einen genauso hohen Spiegel des Wirkstoffes im Blutstrom zu erhalten. Diesbezüglich sollte berücksichtigt werden, dass die letale Dosis bei kleinen Säugetieren in einem Bereich von etwa 100 bis etwa 400 mg/kg liegt, und die verabreichte Dosis daher deutlich unterhalb dieses Bereiches liegen sollte. Die beschriebene Dosis sollte ebenfalls geeignet sein zur Vermeidung menschlicher Thrombozytenaggregation oder Blutverdünnung. Wie dem Fachmann bekannt ist, können die therapeutischen Dosierungen, die in Ausdrücken von Menge pro Kilogramm des Körpergewichtes oder der Körperoberfläche vorliegen, von Säugetier zu Säugetier, einschließlich zum Menschen, extrapoliert werden.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich, wenn sie topisch auf eine Wunde appliziert werden. Diesbezüglich ist es möglich, die Verbindungen in einer konventionellen Salbe, Lotion oder einer Aerosolformulierung aufzunehmen. Die Herstellung von Salben kann durch Aufnahme Von 0,1 bis 10% der Verbindung als Öl oder Natriumsalz in eine Salbenbasis, enthaltend emulgierende Agenzien wie Stearinsäure, Triethanolamin und/oder Cetylalkohol, erfolgen, die Formulierung kann ebenfalls, je nach Bedarf, Inhaltsstoffe wie Glycerol, Wasser und Konservierungsstoffe beinhalten.
  • Auf Wasser basierende Lotionen können die Verbindungen der Erfindung als Öl oder als Natriumsalz in Mengen von 0,1 bis 5 Vol% enthalten. Solche Lotionen können suspendierende Agenzien wie Glycerin und/oder Bentonit, wie im Stand der Technik bekannt ist, enthalten.
  • Es ist auch möglich, die Verbindungen in klassische (ein- oder, zweiphasig) oder nicht-klassische (wässrige Emulsionen) Aerosolformulierungen aufzunehmen. Solche Formulierungen enthalten die Verbindungen und ein geeignetes Treibmittel, in dem die Verbindungen gelöst oder zubereitet sind. In der klassischen Form erfolgt die Verwendung der aktiven Bestandteile allgemein in Form einer Öldispersion oder einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel, wie Ethanol. In der nich-klassischen Form ist der aktive Bestandteil in Wasser gelöst. In jedem Fall liegt die Konzentration des aktiven Bestandteils im Treibmittel bei etwa 0,1 bis 10 Gew.- oder Vol.%.
  • Die Verbindungen der Erfindung können ebenfalls sehr nützlich in Form von Mullbinden Verwendung finden, die mit einer Lösung oder Dispersion des aktiven Materials bedeckt oder imprägniert wurden.
  • Von besonderem Vorteil ist die Tatsache, dass die oben beschriebenen cis-ungesättigten, geradkettigen, fetthaltigen Verbindungen pharmakologisch an der Stelle der inhibitorischen Wirkung für die Arachidonatkaskade angreifen und bevorzugt die reizinduzierte Mobilisierung von Arachidonat beeinflussen. Die Hemmung von PLA&sub2; unterdrückt die Produktion sowohl der Prostaglandine als auch der Leukotriene in stimulierten oder entzündeten Zellen. Bedeutsamerweise weisen die oben beschriebenen Polymere einen deutlich ausgeprägteren Effekt auf die reizinduzierte als auf die kontrollierte Freisetzung von Arachidonat auf und indizieren dadurch einen selektiven Effekt für diese. Darüber hinaus sind die oben beschriebenen Polymervexbindungen bei peroxydierten Phospholipiden in der Lage, den Abbau solcher Lipide durch lysosomale Phospholipase C zu inhibieren, indizierend, dass diese Verbindungen bereits geschädigte (oxidierte) Membranen schützen.
  • Somit sind vielfältige Wirkungen verantwortlich für die anti-inflammatorische Aktivität der fetthaltigen Verbindungen der Erfindung, und auf Basis der inflammatorischen Modelle ist es offensichtlich, dass diese Verbindungen eine wirksame Konkurrenz oder einen wirksamen Ersatz sowohl der aktuell verfügbaren Steroide als auch der NSAIAs bei der Behandlung einer Entzündung darstellen und somit aus den polymerisierten, cis-ungesättigten, geradkettigen, fetthaltigen Verbindungen der Erfindung Kandidaten zur klinischen Anwendung und Nützlichkeit bei lokalisierter und systemischer Verletzung und Krankheit machen.
  • Die Tatsache, dass die Produktion des Prostaglandins Thromboxan aus freier Arachidonsäure erforderlich ist für die Thrombozytenfunktion, weist darauf hin, dass die oben beschriebenen, ungesättigten, fetthaltigen Polymere einen Einfluss auf die Freisetzungsreaktion der Thrombozytenaggregation ausüben sollte.
  • PLA&sub2; liegt in einer Vielzahl von untersuchten menschlichen Zellen und Flüssigkeiten in verschiedenen Mengen vor. Eine Entzündung ist assoziiert mit einem signifikanten Anstieg der extrazellulären Phospholipasen, und die Polymere der oben beschriebenen cis-ungesättigten, fetthaltigen Anteile weisen die Fähigkeit auf, diese Enzyme zu inhibieren.
  • Phospholicasen werden durch pathogen eindringende Organismen freigesetzt und die oben beschriebenen Polymere wirken durch Hemmung der Wirkung dieser Membran-zerstörenden, durch Pathogene von bakterieller, protozoaler, viraler, Rickettsialer, helmintischer und fungaler Herkunft produzierten Enzyme. Die Wirkung der Verbindungen der Erfindung bei der Vermeidung der Entzündung oder Gewebeverletzung ist manifestiert durch die Hemmung von PLA&sub2; an ihrer Quelle aus infizierenden Organismen oder durch Hemmung in Form von Blockierung der Wirtreaktionen auf Infektion oder Verletzung.
  • Des weiteren ist bewiesen, dass Tumormetastasen oder eine Tumorinvasion assoziiert ist mit einer endogenen Aktivität auf den Teil der malignen Zellen, und die Expression von Phospholipasen und ihre Inhibition kann eine Rolle spielen in der Kontrolle der Differentiation und der funktionellen Integrität, sowie für die Prozesse der Karzinogenese und Alterung. Im letzteren Fall verlängern die oben beschriebenen Polymere der ungesättigten, fetthaltigen Anteile das Leben in Tiermodellen und minimieren die, durch Karzinogene (Mutagene) und Photooxidantien, die eine ähnliche zellzerstörende Aktivität wie Strahlung aufweisen, produzierten Membranveränderungen in lebenden Organismen.
  • Indem sie Lipidmembranen schützen und antioxidative Aktivität besitzen, stellen die oben beschriebenen Polymere der ungesättigten, fetthaltigen Anteile leistungsstarke Antioxidantien zur Erhaltung nicht nur lebender Zellen und Gewebe dar, sondern ihre Wirkung macht sie ebenfalls effizient als Konservierungsstoffe für Nahrung, Gewebe und chemische Agentien, die oxidativer Verletzung unterliegen. Zum Zwecke des Schutzes und der Konservierung von, oxidativer Verletzung unterliegender, Nahrung können die fetthaltigen Verbindungen der Erfindung in Konzentrationen von etwa 0,1 bis 100 uM Verwendung finden. Diese Molaritäten werden berechnet als die Molaritäten, die man erhalten würde, wenn der Wirkstoff in einem Gewichtsteil von Wasser gelöst wäre, das dem Gewicht der zu Konservierenden Nahrungsstoffe entspricht. Beispielsweise für antioxidative und/oder antiphospholipase Anwendungen in-vitro sollten Konzentrationen von etwa 0,1 bis etwa 500 uM effizient sein.
  • Die Essenz der Wirkung der oben beschriebenen Polymere von cis-ungesättigten, geradkettigen, fetthaltigen Anteilen ist die Rolle, die sie spielen bei der Resistenz gegenüber Verletzung und dem Ermöglichen einer Reparatur der Phospholipid-/Proteinmembranen. Sie spielen ebenfalls eine schützende Rolle bei der Stabilisierung von Proteinen. Diese Verbindungen stellen eindeutig zytoprotektive Agentien dar, die die Zellmembran vor toxischen, pathogenen oder altersbedingten Ereignissen in der zellulären oder stützenden Umgebung schützen. Bei abschließender Analyse hängt die minimale Dosis der ungesättigten, fetthaltigen Verbindung der Erfindung von empirischen Betrachtungen zur Erleichterung der Phospholipase-vermittelten Verletzung und/oder Entzündung oder zur Erfüllung der gewünschten zytoprotektiven Funktionen ab. Die maximale Dosis ist prinzipiell abhängig von der Notwendigkeit, ungewünschte Nebenwirkungen und letale Dosen zu vermeiden.

Claims (25)

  1. Eine antioxidierende, Antiphospholipase-Verbindung ohne eine aktive Hydroxygruppe der Formel:
    R1-Y1-X1-Y2-R2
    worin X1 ein bivalenter organischer Rest ist, der wenigstens eine saure Gruppe einschließt. Y1 und Y2 - O - oder - NH - sind und R1 und R2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus:
  2. 2. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei X1
    ist.
  3. 3. Eine antioxidierende, Antiphospholipase-Verbindung ohne eine aktive Hydroxygruppe der Formel:
    wobei X2 ein bivalenter organischer Rest ist, der wenigstens eine saure Gruppe umfaßt und R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus:
    -Y'-(CH&sub2;)&sub8;-CH=CH-(CH&sub2;)&sub7;-CH&sub3;
    -Y'-(CH&sub2;)&sub8;-CH=CH-CH&sub2;-CH=CH-(CH&sub2;)&sub4;-CH&sub3;
    -Y'-(CH&sub2;)&sub8;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub3;-CH&sub3;
    -Y'-(CH&sub2;)&sub4;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub4;-(CH&sub2;)&sub3;-CH&sub3;
    -Y'-(CH&sub2;)&sub4;-(CH=CH-CH&sub2;)&sub5;-CH&sub3;,
    und wobei Y' - O - oder - NH - ist.
  4. 4. Eine Verbindung gemäß Anspruch 3, worin X2
    ist und wobei Z1 - O -, - S -, - CH&sub2; - oder - NH - ist.
    Eine antioxidierende, Antiphospholipase-Verbindung ohne aktive Hydroxygruppe der Formel:
    wobei A1 eine organische oder anorganische anionische Gruppe ist, wobei Q1 -CH&sub2;-O-R
  5. 5, Wasserstoff oder eine C&sub1; bis C&sub4; aliphatische Gruppe ist, und wobei R1, R2 und R5 gleich oder verschieden sind und jede ein Fettrest von 16 bis 20 Kohlenstoffatomen ist und wenigstens eine cis-ungesättigte Doppelbindung enthält.
  6. 6. Line Verbindung gemäß Anspruch 5, wobei R1, R2 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus:
  7. 7. Eine antioxidierende, Antiphospholipase-Verbindung gemäß Anspruch 6, wobei A1 ein Anion der p-Toluolsulfonsäure ist.
  8. 8. Eine antioxidierende, Antiphospholipase-Verbindung ohne aktive Hydroxygruppe der Formel:
    wobei jede der Gruppen R1, R2 und R5 ein Fettrest von 16 bis 20 Kohlenstoffatomen ist und mindestens eine ungesättigte cis-Doppelbindung enthält, 22 ein C&sub1; bis C&sub5; aliphatisches organisches Radikal ist und A2 ein organischer Säurerest.
  9. 9. Verbindung gemäß Anspruch 8, wobei R1, R2 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus:
  10. 10. Verbindung gemäß Anspruch 9, wobei Z-(CH&sub2;)n- ist und n gleich 1 bis 5, vorzugsweise 2, ist.
  11. 11. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei A2 eine Carboxyl-, oder Sulfonyl-, und vorzugsweise eine Carboxylgruppe ist.
  12. 12. Verbindung gemäß Anspruch 10, wobei n gleich 2 ist und A eine Sulfonylgruppe.
  13. 13. Verbindung nach Anspruch 12 gemäß der Formel:
  14. 14. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei n gleich 2 ist und A2 eine Sulfonylgruppe oder
    wenn Z2
    ist, A2 eine Carboxylgruppe ist.
  15. 15. Eine antioxidierende, Antiphospholipase-Verbindung ohne aktive Hydroxygruppen der Formel:
    wobei jede der Gruppen R1,R2 und R5 ein Fettrest ist und Z2 ein C&sub1; bis C&sub5; aliphatisches organisches Radikal ist.
  16. 16. Verbindung gemäß Anspruch 15, wobei R1, R2 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus:
  17. 17. Eine antioxidierende, Antiphospholipase-Verbindung ohne aktive Hydroxygruppe der Formel:
    worin jede der Gruppe R1, R2 und R5 ein Fettrest ist und Z2 ein C&sub1; bis C&sub5; aliphatisches organisches Radikal ist.
  18. 18. Eine Verbindung gemäß Anspruch 17, wobei R1, R2 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus:
  19. 19. Eine antioxidierende, Antiphospholipase-Verbindung ohne aktive Hydroxygruppe der Formel:
    worin A3 eine C&sub1; bis C&sub7; aliphatische Gruppe, Q2 Z-R6, eine C&sub1; bis C&sub4; Alkylgruppe, eine Nitrogruppe, eine Aminogruppe, eine Carbonsäuregruppe, eine Sulfonsäuregruppe oder Wasserstoff ist, Z3, Z4, Z5 und Z' gleich oder verschieden sind und jeweils -O- oder - NH- sind und jede der Gruppen R1, R2, R5 und R6 eine Fettgruppe ist mit 16 bis 20 Kohlenstoffatomen und wenigstens einer cis-ungesättigten Doppelbindung.
  20. 20. Verbindung gemäß Anspruch 19 der Formel
  21. Verbindung gemäß Anspruch 19 oder 20, wobei R1, R2, R5 und R6 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus:
  22. 22. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Verwendung als Medikament.
  23. 23. Therapeutische Formulierung umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Verwendung für die Behandlung von Phospholipaseverursachten Verletzungen oder Entzündungen.
  24. 24. Eine Formulierung umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 und einen Träger, wobei die Formulierung vorzugsweise in Form einer Salbe, einer Lotion oder eines Aerosols vorliegt.
  25. 25. Verfahren zur Herstellung einer Formulierung zur Behandlung von Phospholipaseverursachten Verletzungen und/oder Entzündungen umfassend die Formulierung einer Verbindung gemäß einem der Anspruche 1 bis 21, um eine Dosis von 5 bis 100 mg/kg zur Verfügung zu stellen.
    Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Phospholipaseverursachten Verletzungen und/oder Entzündungen.
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