LU86163A1 - Flavolignanderivate,verfahren zu deren herstellung und arzneimittel,die diese verbindungen enthalten - Google Patents

Description

-1- r i, 5 ·

Die Erfindung betrifft neue Fl avo1ignanderivate, Verfahren zu deren Herstellung und Arzneimittel, die diese Verbindungen enthalten.

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Die Mariendistel -Silybum marianum (L.) Gaertn.

(Carduus marianus L.) - ist eine seit dem Altertum bekannte Heilpflanze. Von den in den Früchten dieser Pflanze vorkommenden Flavolignanen wurde 15 eine Komponente, Silybin, von R.Münster isoliert, vgl. Dissertation R.Münster, München, 1966.

Die chemische Struktur dieser Verbindung wurde von ? A.Pelter und R.Hansel, vgl. ' Tetrahedron Letters.

London, Band 25, Seiten 2911-2916 (1968), aufgeklärt.

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Es ist bekannt, daß Silybin, früher auch Silymarin I genannt, ein wertvolles Lebertherapeutikum ist, vgl. DE-A5 17 67 666. Ein technisches Verfahren zur Herstellung von Silybin (Silymarin I) ist 25 z.B.. in der DE-AS 19 23 082 beschrieben.

Bereits 1974 hatten H.Wagner, P.Diesel und M.Seitz, Arzneimittelforschung,· Band 24 (4) , Seiten 466-471 , in bezug auf Silybin zwei Stellungsisomere vermutet, 30 näml ich ’ Silybin und Isosilybin. Diese Vermutung wurde von A.Arnone, L.Merlini und A.Zanarotti, Journal Chemical Society Chem.comm., 1979, Band 16, Seiten 696/97, präzisiert und experimentell bestätigt.

| Demnach besteht das bekannte Silÿbin aus zwei 33 verschiedenen Verbindungen, nämlich den Verbindungen der nachstehenden Strukturforme ln A und B: .L ' ä < * f f -2-

CHjOH

OE O - (A) Silibinin * ho^. jyi l j^v<'-''''^<rv'-cH2 oh

OH O

(B) Isosilybin

AuS diesen Strukturformeln ist ersichtlich, daß es sich bei diesen Verbindungen um Stellungsisomere handelt. Die Verbindung der Formel (A) hat neuerdings die INN-Bezeichnung Silibinin. Diese Bezeichnung wird von jetzt ab in der vorliegenden Anmeldung für die Verbindung der Formel (A) verwendet.

Der therapeutischen Verwendung von Silybin bereitete die Tatsache Schwierigkeit, daß Silybin in Wasser praktisch nicht löslich ist, so daß silybinhal ti.ge Injektionslösungen oder Präparate, bei denen eine gewisse Wasserlöslichkeit erforderlich ist, nicht herstellbar waren. Die DE-PS 19 63 318 / n . i -3- beschreibt zwar Silybinderivate, die eine gewisse Wasserlöslichkeit besitzen, es handelt sich dabei jedoch um ein sehr komplexes Gemisch von Halbestern der Bernsteinsäure. Dieses Gemisch ist deswegen so komplex, weil im Silybin fünf veresterbare Hydroxylgruppen vorliegen, das Silybin außerdem die beiden oben bezeichneten Stellungsisomeren enthält und die zur Veresterung verwendete Bernsteinsäure eine Dicarbonsäure ist, die sowohl Mono- als auch Diester bilden kann. Für pharmazeutische Zwecke ist ein Produkt, das aus einer nicht überschaubaren Zahl verschiedenster, ungeklärter Verbindungen besteht, nicht brauchbar.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, für pharmazeutische Zwecke geeignete wasserlösliche Silibininderivate bereitzustellen, die als chemische Individuen genau charakterisiert sind.

Es wurde nun gefunden, daß Silibininderivate bestimmter Alkan- und Alkylendicarbonsäuren diese Anforderungen erfüllen.

Gegenstand der Erfindung sind daher Silibininderivate der allgemeinen Formel I

-4- "f ; (Alk.) -COOM, - DE 0 CD-(Alk2VCOOM2 » worin η * a jeveils unabhängig voneinander für 0 oder 1 ' stehen,

Alk^ und Alk^ jeweils unabhängig voneinander einen Alkylenrest mit 1-4 Kohlenstoffatoaen oder einen Alkenylenrest ait 2-4 Kohlenstoffatoaen ^ bedeuten und · * | - und K2 jeveils unabhängig voneinander ein Wasser-stoffatoa oder ein Alkaliaeta11atoa bedeuten.

Bevorzugte Verbindungen der Formel (I) sind Verbindungen, bei denen n und m jeweils unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, Alk1 und Alk2 jeweils einen Alkylenrest mit 2 Kohlenstoffatomen bedeuten und und M2 jewei1s unabhängig voneinander ein Alkalimetallatom bedeuten. Vorzugsweise haben n und m» Alk1 und Alsowie und jeweils gleiche Bedeutungen.

Besonders bevorzugt ist Silibinin-C-21, 3-dihydrogen-succinat, Dinatriumsalz.

t .

r -5- ; Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen sind die nicht an einen Benzolkern gebundenen OH-Gruppen des Silibinins teilweise oder vollständig verestert, beispielsweise durch Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Maleinsäure oder Fumarsäure. Vorzugsweise sind die beiden nicht aromatisch gebundenen OH-Gruppen des Silibinins durch eine der genannten Carbonsäuren einfach verestert.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der beanspruchten Silibininderivate ist dadurch gekennzeichnet, daß man etwa 1 Gewichtsteil Silibinin der'Formel (A):

J| ^OH Nsy*/Ss>fcOB

OH 0 (A) Silibinin in· 1 bis 2 Gewichtsteilen Pyridin löst und mit 1 bis 3 Gewichtsteilen eines Dicarbonsäureanhydrids der Formel 0 -C - Alk - C = 0 \ / 0 i worin "Alk“ für einender oben definierten Al und Al kg -

Reste steht, unter Rühren umsetzt, j dann Äthanol zusetzt, bis sich eine homogene Mischung / gebildet hat, :> -6- • . r T anschließend unter intensivem Rühren langsam mit Wasser versetzt, wobei vorhandene Ester der aromatisch gebundenen OH-Gruppen hydrolisiert werden, sobald diese Hydrolyse vollständig ist, mit Äthyl acetat verdünnt, mit äthylacetatgesättigtem saurem Wasser wäscht, die Äthylacetatphase einengt, in Äthanol aufnimmt und mit einer alkoholischen Alkalihydroxidlösung in das Salz des freien, nicht veresterten Carbonsäurerestes überführt.

... Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung mit dem Di-carbonsäureanhydrid bei 40 bis 50° C.

Vorteilhaft wird der pH des äthylacetatgesättigten sauren Waschwassers bei etwa 1,5 bis 2,4 gehalten.

Λ

Diese .Verbindungen, insbesondere die Verbindung Si 1 ibinin-C-2 * ,3-dihydrogensuccinat, Dinatriumsalz. zeigen überraschenderweise eine ausgeprägte pharmakologische Wirkung bei der Behandlung von Verbrennungsschäden. Außerdem behalten sie trotz der beschriebenen Derivatisierung die volle pharmakologische Wirksamkeit des bekannten Silybins als Lebertherapeutikum bei. Sie sund besonders geeignet zur Behandlung von Leberzirrhose und toxisch-metabolischen Leberschäden.

überraschenderweise erwiesen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen auch als außerordentlich wirksam bei der Behandlung von Pilzvergiftungen, insbesondere der sehr gefährlichen Vergiftung durch Knollenblätterpilze (Amanita phal1oides). Auch Vergiftungen durch halogenisierte organische Lösungsmittel wie Tetrachlorkohlenstoff, Trichloräthylen, Chloroform etc.

? können damit Überraschend gut behandelt werden. Bei / * - 7 - ; (jer vorbeugenden Anwendung verhindern die erfin- dungsgemäßen Verbindungen die oben geschilderten 1 Schädigungen.

Gegenstand der Erfindung sind daher auch Arzneimittel, çtie diese Verbindungen enthalten. Sie werden meist systemisch angewandt, z.B. in Form von Pillen, Kapseln, Lösungen, in üblichen Trägern und gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfsstoffen. Die Tagesdosis für einen erwachsenen Menschen beträgt etwa 50 - 500 mg je nach Zustand des Patienten und der Schwere der Krankheitssymptôme.

Versuche mit Si 1 ibinin-C-2 1 ,3-dihydrogensuccinat-}

Dinatriumsalz (Sili-suc-na).

Die bei Verbrennungen auftretenden Symptome werden insbesondere ** durch eine Intoxikation durch Produkte der thermischen Gewebs- nekrose hervorgerufen. Der Nachweis, daß autointoxikative Prozesse nach schweren Hautverbrennungen dafür verantwortlich sind, ist in vielfältiger Weise geführt worden. Besonders •überzeugend sind Kreuztransplantationen verbrannter und unverbrennt er Haut auf gesunde bzv. verbrannte Empfanger-ciere, wobei sieb zeigt, daß die unverbrannten Empfänger verbrannter Haut zugrunde gehen, wahrend verbrannte Empfänger gesunder Baut keine schädigenden Wirkungen erkennen lassen, siehe K.H. Schmidt et al. Neuere

Aspekte zur Autointoxikation nach schweren Verbrennungen; • /

Die Verbrennungskrankheit (F.V. Ahnefeld et al., eds-L), Springer, Berlin 1982, Seiten 45-52.

Bei Kautverbrennungen kommt es zur Freisetzung oder Keu-entstehung einer Vielzahl chemischer Verbindungen. Trotz deren Vielzahl gelang es, die Struktur einiger dieser J Verbindungen aufzuklaren.

/ Λ—-

-V

- 8 - i w v. «. Es konnte unter anderem gezeigt werden, daß die bei Eaut- verbrennungen entstehenden Verbindungen Ähnlichkeit mit solchen Verbindungen besitzen, die bei der Lipidperoxida- -tion entstehen. Es bestehen auch Analogien hinsichtlich der toxischen Wirkungen dieser Substanzen. Besonders eindrucksvoll ist- die Entstehung toxisch wirkender gesättigter und ungesättigter Aldehyde verschiedener Ketten-lSnge als Eolge der Lipidperoxidation (Benedetti et al., Identification of 4-hydroxynonenal as a cytotoxic product originating from the peroxidation of liver microsomal lipids, Biochim.Biophys.Acta 620, 281-296, Ί980) und der * thermischen Gevebeschädigung (K.H. Schaidt et al.,

Studies on the structure and biological effects of pyrotoxins purified from burned skin, World J. Surg. 3, .. 361-365, 1979). Es wird daher angenommen, daß-. Verbren- > » }* nungen zu einer oxidativen Schädigung von Zellstrukturen • führen.'

Es wurden daher autooxidative Veränderungen an Membranlipiden als Folge einer Autointoxikation nach .schweren Verbrennungen untersucht. Es wurden insbesondere Veränderungen in der FettsSurezusammensetzung der Membranl'ipide untersucht. Ferner wurde getestet, inwieweit die erfin-- dungsge’mSßen Silibininderivate die Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung der Membranlipide beeinflussen.

Veränderungen in der Fettssurezusammensetzung von Herobranlipiden nach schweren Verbrennungen Männliche Vistar-Ratten mit einem durchschnittlichen Gewicht von 360 g wurden in Dreiergruppen bei freien Zugang zu Wasser und Trockennahrung gehalten. Bis zum Versuchsbeginn betrug die Raumtemperatur 22*C, nach Versuchsbe-· ’ ginn wurden die Tiere bei 30*C gehalten.

/ i - 9 - / ψ *

Die Hautverbrennungen vurden mit. einem KupferStempel " 2 - von 20 cm Fläche bei konstantem Druck uno einer Temperatur von 25D*C gesetzt. Um eine thermische Schädigung tieferliegender Orga'ne auszuschließen, wurde die Haut ' über einen luftgekühlten Hohlspatel gezogen. Hit diesem Tiermodell können sehr exakte Verbrennungstraumen gesetzt werden, die konstante Überlebensraten liefern.

Vor Versuchsbeginn erhielten die Tiere eine Karkose mit 50 mg/kg .//embutal. Hach der Verbrennung vurden zur Schockprophylaxe 20 ml Kinger-Lactat Lösung i.p. injiziert.*

Es Wurden 5 Versuchsgruppen gebildet: a) Normal gruppe : völlig unversehrte Tiere b) Kontrollgruppe I: Nur Silibinin-Behandlung über 6 Tage mit 75,5 mg Sili-suc-na.

c) Kontrollgruppe II: Scheinoperierte Tiere d) Gruppe mit verbrannten Tieren: 25 X, 250°C, 20 sec, 0*5 at e) Testgruppe: Tiere, denen 75,5 mg Sili-suc-na i.p.

über 6 Tage, beginnend einen Tag vor der Verbrennung, verabreicht wurde

Zur Isolierung der Mikrosomen-wurden die Tiere nach Ende des Versuchszeitraums in Narkose entblutet. Anschließend wurde die Leber entnommen,‘gewogen und sofort in eiskaltes Isolierungsmedium überführt (0,25 m Saccharose, 1 mM EDTA 10 mMol Tris · HCl, pH 7,2). Die Leber wurde zerschnitten und im Medium homogenisiert. Durch Differentialzentrifugation wurde die Kikrosomenfraktion pelet-tiert. Die Mikrosomen wurden resuspendiert und erneut zentrifugiert. Anschließend wurde eine Suspension her-gestellt, bei der 1 ml Suspension 1 g Lebergewebe entsprach.

Die Lipide vurden nach der Methode von J. Folch (A simple /i method for the isolation and purification of total lipiös "> i

/ i / i ! I

P

f* - 10 - from animal tissues, J.biol.Chem. 226, 497-508 (1957)), Modifikation von Bligh und Dyer (A rapid method of total ~V lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Phy- siol. 37, 911-917 (1959)).bestimmt.

Die extrahierten Mikrosomenlipide wurden mit Natrvnlauge verseift. Die freien Fettsäuren vurden durch Zugabe von BF^-Methanol verestert. Nach Abdampfen des Methanols und ' Entfernen hydrophiler Nebenprodukte vurden die Fettsaure- ester quantitativ bestimmt.

Bei den unverbrannten Tiergruppen konnte keine nennenswerte Veränderung der Fettsauremuster festgestellt werden. Die Karkose und der geringfügige operative Eingriff führen. -somit nicht zu einer Veränderung der mikrosomalen Lipide. Aus diesem Grunde vurden für die weiteren Vergleiche ,·*χ die Normalgruppe und die Kontrollgruppe zu einer Kontroll- y gruppe zusaamengefaßt.

Ein. Vergleich der* unverbrannten und der verbrannten Tiere hinsichtlich ihres mikrosomalen Fettsauremusters zeigte gravierende Verschiebungen- von ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren.

Figur 1 zeigt die FettsSureverteilung·in den mikroso-- malen Leberlipiden und die durch thermische Bautschadigüng verursachten Veränderungen.

Der Anteil an Palmitinsäure (C16) steigt nach Verbrennung von 25,1 auf 34,4 2 der Gesamt-fettsauren. Bei der Stearinsäure (C1B) liegt der Anteil bei den verbrannten Tieren mit 46,3 2 um 13,2 2 über dem mit den Kontroll-tieren erhaltenen Vert. Bei der OlsSure CC18:1) ist ein leichter, nicht signifikanter Abfall nachweisbar. Der Anteil der Linolsäure (C1B:2) - ging nach Verbrennung auf ca. 1/3 des Ausgangs- vertes zurück. Bei der Arachidonsäure (C20:4) 7 schlieBlich f_nden sich nach Verbrennung nur ; noch'31 2 des Ausgangsgehalts.

- 11 - »

Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt den Einfluß von Sili-suc-na auf die Fettsäureanteile der verbrannten und unverbrannten Tiere.

T a b e 1 1 e 1 »

Fettsauremuster der mikrosomalen Lipide der Rattenleber nach Sili-suc-na-Therapie bei verbrannten und unverbrannten Tieren Π6 ' C1B C1B:1 C18:2 C2o:4 •UNVERBRANKT 25.B % 37.2 » 8.9 i 5.6 %' 16.2 % (Kontro11 gruppe I) 6.2 -12.3 Î1,1 ±3.3 ±4.5 VERBRANNT 25.4 % 37.5 5 7.8 Î 11.4 S 18.0 l '6.0 ± B.6 -1 .d ±5.3' ±5.1

Es zeigt sich, daß die erf indungsgemSße..Behandlung mit eine® Silibininderivat bei den unverbrannten Kontroll-tieren keine wesentlichen Veränderungen im Vergleich zu den unbehandelten· Tieren verursacht. .Fei den verbrannten Tieren .führt die Therapie zu einer völligen Aufhebung des -Verlustes an ungesättigten Fettsäuren.

Zusammenfassend kann folgendes festgestellt werden: Verbrennungen führen zu Veränderungen im Fettsauremuster mikrosomaler Lipide. Es wird angenommen, daß dies auf eine oxidative Schädigung der Membranen zurockzufehren ist. Lies zeigt sich insbesondere in der starken-Abnahme der mehrfach ungesättigten Fettsäuren.

/ fi Ï \__ / ' i 12 “ Die erfindungsgem2ß verwendeten Silibininderivate sind nun in der Lage, oxidative ZellschSdigungen zu inhibie-; ren. Sie sind daher besonders geeignet, oxidative Schädi gungsmechanismen nach schweren Verbrennungen zu durchbrechen .

Vie bereits geschildert, nimmt man an, daß autotoxische Reaktionen nach schweren Verbrennungen insbesondere zu oxidativen ZellschSdigungen führen. Es wurde daher untersucht, welche Auswirkung ein standardisiertes thermisches Trauma auf die PHA-induzierte Blastogenese von T-Lympho-cyten aus der'Milz und dem peripheren Blut von Retten besitzt. Es wurde ferner untersucht, wie die erfindungs-- gem£j3 einsetzbaren Silibininderivate derartige lymphocyta- ren Funktionsstörungen nach schweren Verbrennungen beein- y - flussen.

Wirkung eines standardisierten thermischen Traumas auf die PHA-induzierte Blastogenese von T-Lymphocyten aus der Milz und dem peripheren Blut von Ratten

Wie zuyor beschrieben, wurde die Rflckenhaut von Vistar-• Ratten mit einem Kupferstempel verbrannt. Als Kontroll-gruppe dienten scheinverbrannte Tier, denen alle operativen Manipulationen ohne Verbrennungen durchgeführt wurden. Nach 2, 4, 7 und 9 Tagen wurde den verbrannten bzw. den Kontrolltieren in Ethernarkose Blut und Milï entnommen.

Beparinisiertes Blut, wurde zur Isolierung der Lymphocyten auf Ficoll-Hypaque-Lösung (Lichte 1,077). geschichtet.

Anschließend wurde zentrifugiert und die erhaltenen

Lymphocyten mit Trypan-Blau auf ihre VitalitSt getestet, zur Isolierung der Milzlympbocyten wurde das Organ zer- fl · # . * Ί kleinert, durch ein Sieb passiert und durch Lyse-Lösung • j «· - 13 - nach Gay von den begleitenden Erydtocyten befreit.

; Anschließend vurde die Zellmischung in einem GefSß in * Gegenwart von 5 Ï hitzeinaktiviertem fötalem KSlber- serum 30 Minuten inkubiert, um den Anteil mononukle2rer Zellen in der Suspension durch Adhäsion an die Gefäßwand zu verringern (5 *). Zur Kultivierung wurden die Zellen in "flat-bottom" Mikrotiterplatten eingebracht. Dann . wurde 20 % fötales Kslberserun hinzugeftigt. Auf diese "Weise wurde die spontane Blastogenese durch Messung des 3

Einbaus von B-Thymidin-(2Ci/mM) in die DNA der Zellen bestimmt.

'•In Vorversuchen war geklsrt worden, daß eine· optimale

Mit ogenstimulation*bei einer PHA-Konzentration (Mitogen-Phythaemagglutinin) von 5ug/ml stattfindet. Bei diesen Experimenten zur Optimierung des zellularen Testsystems wurde ferner festgestellt, daß die maximale Stimulation dur Neusynthese von DNA nach 72 Stunden erfolgt. Ferner wurde festgestellt, daß die optimale Konzentration an fötalem Kclberserum bei -20 51 liegt, um die höchste Stimulation zu erzielen.

Vie oben beschrieben, wurde die spontane Blastogenese durch Messung des Einbaus von ^B-Thymidin in die DNA der Zellen bestimmt. Die Zellen wurden 18 Stunden nach der Zugabe von H-Thymidin geerntet, wobei der Null-Punkt für die 18 Stunden mit dem Zeitpunkt der maximalen Stimulation Zusammenfall t.

Zur Untersuchung der Wirkung der erfindungsgemäE verwendbaren Silibininderivate wurde eine Gruppe von Ratten mit einem Silibininderivat behandelt. Dazu wurden 75,5 mg Sili-suc-na einmal pro Tag intraperitoneal injiziert. Diese Therapie wurde vom Verbrennungstag bis zum Tag der Organentnahme / · (maximal bis zum 9. Tag) durchgeführt.

/1 '[ « - 14 - Λ ύ : Zur Auswertung der bpi den Kontrolltieren und den unver brannten Tieren und den mit Sili-suc-ria behandelten Tieren erhaltenen Ergebnisse wurde der S'timulationsindex berech-· net. Dieser Zahlenwert stellt den Quotienten aus dem Mittelwert der stimulierten Probe und dem Mittelwert der Kontrollprobe dar. Aus dem so erhaltenen Stimulationsindex bei jedem Versuchstier wurde ein mittlerer Stimulationsindex pro Tiergruppe berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind durch diesen Index Sl ausgedrückt.

Figur-2 zeigt den Einfluß des verwendeten Sili-suc-na auf die Blastogenese von Lymphocyten. Bei den ' verbrannten Tieren wurde die reduzierte Stimulierbarkeit der Zellen -durch Silibinin deutlich erhöht.

Bereits am 2.· Tag zeigte sich bei den mit Sili-su'c-na behandelten Tieren eine etwa 10 mal höhere Responsivritat der Blutlymphocyten gegen PBA.

Am 4. posttraumatischen Tag betrug der.Wert für-den Stimulationsindex bei Blutlymphocyten für behandelte Tiere 8, während der entsprechende Wert bei den unbehandelten Tieren bei 1,5 liegt.

Bei den Milzzellen liegen die Stimulationsindizes der verbrannten, unbehandelten Tiere alle deutlich unter 1. Die Verabreichung von Silibinin führt zu einer signifikanten Besserung an allen untersuchten Tagen, wobei sich am /· 7. posttraumatischen Tag ein Maximum einstellt.

h r - 15 -

Es wurden auch noch Vergleichsversuche durchgeführt, die zeigten, daß Sili-suc-na alleine bei gesunden * Tieren zu keinen signifikanten Veränderungen in der Stimulierbarkeit bei der PHA-induzierten Blasto-genese von T-Lymphocyten aus der Milz und aus dem periphären Blut führt.

Somit stimuliert das erfindungsgemäß verwendete Silibinin die Blastogenese von Lympbocyten verbrannter Tiere in signifikanter Weise.

Es wurde ferner festgestellt, daß bei den mit Silibinin» derivaten behandelten Tieren die allgemeine Kat'abolie geringer war, da die Tiere rasch nach dem thermischen -

Trauma wieder an Gewicht Zunahmen.

* Pilzvergiftungen:

Vergiftungen durch den Knollenblätterpilz zählen zu den schwersten, die es ln der Medizin gibt. Obwohl nur 10 bis 30 Σ aller Pilzvergiftungen durch den grünen Knollenblätterpilz verursacht werden, gilt der Vergiftung mit diesem Pilz aufgrund ihrer Gefährlichkeit seit jeher größtes medizinisches Interesse.

In Eiteren Veröffentlichungen wurde die Letalität mit 30 bis 50 Z angegeben. Bank der modernen Intensivmedizin hat sich nach einer Sammelstudie von FLOEkSHEIM et al. an 205 Patienten diese Zahl auf durchschnittlich 22,4 2 reduziert.

Bas Gift des Knollenblätterpilzes, das Amanitin, kann bereits in einer Dosis von 7 mg für einen erwachsenen Menschen tödlich sein. Biese Giftmenge ist in etwa 50 g eines frischen Exemp lares enthalten.

v f,z - l\ i ~ t - 16 - ^ Nach einer Reihe erfolgversprechender Tier- experimente wurde der Wirkstoff Sili-suc-na i in die Therapie der Knollenblätterpilzver giftung einbezogen.

Es wurden 28 Patienten mit Knol1enblätter-pilzvergiftungen neben den üblichen Therapiemaßnahmen zusätzlich mit Sili-suc-na behandelt. Von diesen 28 Patienten verstarb nur einer, der größere Mengen des Giftpilzes in selbstmörderischer Absicht zu sich genommen hatte. Dieses Ergebnis demonstriert einen enormen therapeutischen Fortschritt auf diesem Gebiet.

*

Herstellung von isosilybinfreiem Silibinin:

Eine Suspension aus 500 g des Produktes/ gemäß DE-AS 19 23 082 Spalte 8, Zeilen 14 - 197 mit einem Silymaringehalt von ca. 70 % bei einem Isomerenver-hältnis Silybin/Si1idianin/Si 1 icristin von~ 3:1:1 -, .wobei das Silybin ca 1/3 Isosilybin enthält, und 2 kg'Methanol = 2,53 1 erhitzt man unter Rühren 15 Minuten zum Sieden. Aus der so erhaltenen Lösung kann nach dieser Zeit bereits etwas Silibinin ausfallen. Anschließend zieht man im Vakuum 0,75 bis 1,25 kg = o,96 - 1,58 1 Methanol ab und läßt den Rück-\ stand lo - 28 Tage, bei Raumtemperatur stehen.

Das ausgefallene Silibinin wird filtriert und ' f, zweimal mit je j! - ' 50 ml kaltem Methanol nachgewaschen. Nach Trocknen X.

- 17 - bei 40°C im Vakuum wird das isolierte Rohsilibinin wie folgt weitergereinigt: ; * 60 g Rohsilibinin werden In 3 .1 techn. Essigester untBr Erhitzen gelost; anschließend mit 20 g

Aktivkohle versetzt und weitere 2 Stunden unter Rückfluß- bedingungen gerührt. Danach wird klerfiltriBrt und die Losung 0 bei 5o C unter vermindertem Druck auf ca. 250 ml eingeengt,

Das Konzentrat wird 15 min untBr Verwendung eines Ultra»

Turraxgerits aufgerührt und untBr Rühren mit 25 ml

Rethanol versetzt. Anschließend wird die flischung über

Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Vor dem Abnutschen des dabei ausgefallenen Silybins wird nochmals 5 min ebenfalls mit Hilfe eines Ultra-Turraxgerates aufgerührt.

Dbt abgenutschte Niederschlag wird 2mal mit 50 ml

Essigester nachgewaschen und im Vakuumtrockenschrank über 0

Nacht bei 4o C getrocknet·. Anschließend wird das Produkt vermahlen und unter den gleichen Bedingungen AB Stunden nachgetrocknet.

\ Î * 18 > · E * 1 s n -i . i 1

Herstellung von Silibinin-C-2 " t 3-dihydrogensuccipzt ^V^O^CEj-CI-CC-CSj-CSj-COOH .

0—r^=r^t^5ï^OC:S

OS T 0^0-CH2-CE2-coohDS

» 50 g Silibinin löst man bei 45 *C in 70 ml Pyridin, gibt 50 g Bernsteinsfiureanhydrid zu, rührt die Mischung ca.

S Stunden bei 45/0, gibt 30 ml Ethanol zu und rührt, bis sich eine homogene Mischung bildet. Anschließend gibt man unter intensivem Rühren zur .Verseifung von Phenylestern innerhalb von ca. 30 Minuten 60 ml "Wasser zu. Nach ca.

1 Stunde Rühren bei 30*C sind die Phenylester quantitativ hydrolysiert. Pie Vollständigkeit der Hydrolyse überprüft man mittels HPLC. Pie Hydrolyse stoppt man, indem man 1,7 1 Essigssureethylester Tasch zu der so erhaltenen - Reaktionsmischung gibt.

fl 1 i < 2um Abtrennen von überschüssiger Bernsteinsaure und ?y-v- xidin extrahiert man die mit Essigsäureethylester ver- dünnte Reaktionslösung 2 aal mit je 5 1 Wasser, das mit Essigsaureethylester gesättigt ist und einen pH 1,B5 aufueist (eingestellt mit verdünnter wäßriger Salzsäure), im Gegenstrom. Dabei pumpt man das mit Essigsäureethyl-ester gesättigte, angesäuerte Waschwasser im Kreislauf gegen die verdünnte Reaktionslösung und hält anschließend durch Zugabe verdünnter Salzsäure den pH so lange bei 1,85, bis dieser pH-Wert nach der Essigsäureethylesterpassage konstant bleibt.

Anschließend extrahiert man die Essigsäureethylesterphase zum Auswaschen überschüssiger Salzsäure zweimal im > Gegenstrom mit je '3,4 1 Wasser, das mit Essigsäureetbyl- ester gesättigt ist. Sobald der pH-Wert des Waschwassers größer als 4,5 ist, trennt man die organische Phase quantitativ ab, engt sie bei -40 - 50*C im Vakuum auf 1/12 des Ausgangsvolumens (-0,2 1) ein und verdünnt sie mit 125ml Ethanol.

Die Titelverbindung erhält men durch Umfallen aus Ethanol/ Wasser und Trocknen bei 50*C im Vakuum während 15 Stunden.

Zur Herstellung einer Analysenprobe fällt men die Titelverbindung dreimal aus Ethanol/Wasser um und trocknet anschließend 15 Stunden bei 50*C im Vakuum.

Im FD-Kassenspektrum erscheint der Molekülpeak bei der erwarteten Molmasse von 6B2.

/ \ Das IR-5pektrum zeigt im Bereich der CG-Valenzfrequenz zwei überlappte Banden, wobei eine, vie das auch beim · Silibinin der Fall ist, der Carbonylfunktion des Fyron-f ringes bei der Wellenlänge 1635 cm ^ zuzuordnen ist.

* ' Î 4 · V»_...

«* ’ί - 20 - ig — ^ ÿ Die zweite Bande liegt bei 1730 cm und stammt von den u beiden Estercarbonylfunktionen.

Das ^H-RKR-Spektrum best2tigt, daß eine zweifache Veresterung stattgefunden hat. So betragt das durch Integration ermittelte Verhältnis von aromatischen Protonen zu Methylenprotonen der Bernsteinsaurereste ß:6 (ppm-Bereich 5,9 - 7,1). Das Verhältnis dieser Methylenprotonen (ppm 2,6) zu den Methylprotonen der Methoxygruppe (ppm 3,B) betragt B:3 und steht somit im Einklang damit.

13

Auch die chemischen Verschiebungen bei den C-Onter-suchungen zeigen, daß die Veresterung an den beiden alko-'v holischen OH-Gruppen erfolgt ist, denn die chemischen /·' Verschiebungen ändern sich am stärksten bei und den * anliegenden Kohlenstoffatomen C^2 - sowie bei - C^.

Elementaranalyse für C^B^O^ (682,60)

C BO

Ber.: 56,07 1,43 37,50

Gef.:- 58,05 4,57 37,31

Beispiel 2

Herstellung von Silibinin-C-2',3-dihydrogensuccinat, _Dinatriumsalz_ . . .

Z> ? X .

- 21 - * t - l « j^ZXr^°V/CH2 “ 0 “ co - ch2 “ C£2 “ c°Râ ΙΟΙ ^ζΧ^η^Γ' OH 0 ^00 “ C“2 “ CH2 ~ COHa t ”

Zu der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Ethanollösung tropft man unter Rühren und Kühlen von außen bei -5 bis 9*C eine‘aufgrund einer Bestimmung des Feststoffgehaltes dieser Lösung ermittelte Menge 6%iger ethanolischer Natronlauge, rührt die Suspension eine weitere Stunde bei " Raumtemperatur, saugt den ausgefallenen beigen Feststoff * ab, suspendiert ihn zweimal je 5 bis 10 Minuten mit Hilfe eines Turrax in 150 ml Ethanol und saugt erneut ab. Zur Entfernung restlichen EssigsSureethylesters suspendiert man anschließend das Produkt 14 Stunden bei Raumtemperatur in 280 ml Ethanol, saugt erneut ab, wascht mit 70 ml Λ

Ethanol nach und trocknet 15 Stunden bei 40-45'C im Vakuum-trockenschrank. Anschließend vermahlt man das vorgetrocknete Produkt, siebt auf eine Korngröße kleiner als Q.,2..mm und trocknet weitere 4B Stunden bei 40 - 45*C im Vakuum..

Man erhëlt so 52 g der Titelverbindung (69 X Ausbeute).

Eie Titelverbindung besitzt keinen scharfen Schmelzpunkt. Sie beginnt bei ca. 80* zu sintern und schmilzt unter Blasenbildung bei ca. 100*C.

Eas UV-Spektrum in Methanol zeigt: λ “2B8 nm, f *1,73 10^.

1uo.jC

\ .

Eas Molgewicht der Titelverbindung ist 726,56. Eie Ver-bindung ist ein leicht beiges, mikrokristallines ‘Pulver / * - 22 - k » % s= ohne spezifischen Geruch und mit salrartigem Geschmack.

Sie ist in "Wasser leicht löslich, in Ethanol schver löslich und in Aceton, Ether und Chloroform praktisch unlöslich.

Anwendunqs beispiel

Herstellung von Lyophilisaten zur i.v. Verabreichung *

Silibinin-C-2', 3-dihydrogensuccinat, Dinatriumsalz 75,0 mg

Haanit 10,0 mg - -

Yasser für Injektionssveoke ad 1,5 *1 1,5 ml Losung werden in EpieEaapnllen τοη 5 VassungerermBgen abgefüllt und danach in bekannter Technik gefriergetrocknet. Lie Ampulle mit dem fertigen Lyophilisat wird sur Aufbewahrung in üblicher Veise rereehloeeen.

Zur Verwendung wird das Lyophilisat in 5 *1 steriler, physiologischer t rochealilösung klar gel&st.

v · . >.

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Claims (9)

1. Silibininderivate der allgemeinen Formel I 15 - /\ .CH -O-CO- (Alk.)-CDDM. 20 1n*s-^^Vn‘Os ^ DH 0 ''CO - Ulk2 ^-COOKj worin n + b jeweils unabhëngig voneinander für 0 oder 1 25 stehen, Alk^ und Alk2 jeweils unabhängig voneinander einen Alkylenrest. Bit 1-4 Kohlenstoffatomen oder einen Alkenylenrest Bit 2-4 Kohlenstoffatomen bedeuten und 30 und K2 jeweils unabhängig voneinander ein Uasser-stoffatoB oder ein AlkaliBetallatob bedeuten, 35 / /: i 2 t * * |Λ

2. Silibininderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , - daß n und π jeweils unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, Alk., und Alk^ jeweile einen Alhylenrest.mit 2 Kohlenstoffatomen bedeuten und und jeweils unabhängig voneinander ein Alkali-metallatoiD bedeuten.

3. Silibininderivate nach Anspruch 1, t dadurch gekennzeichnet, daß n und b, Alk^ und Alh^ sowie und gleiche Bedeutungen besitzen.

4. Silibinin-C-2',3-dihydrogensuccinat, Binatriunsalz der Formel: — O — CD — CH2 - CH2 - CDDKa I Π ^CD - G. - CE- - CDONa. . DH 0 2 2 \ fr * I » • 3

5. Verfahren zur Herstellung der Silibininderivate nach den Ansprüchen 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß man 1 Gewichtsteil Silibinin der Formel (A) : L 5 H OB O (A) S ili b i ni n 1. in 1 - 2 Gewichtsteilen Pyridin löst und mit 1-3 Gewichtsteilen eines Dicarbonsäureanhydrids der Formel:

0. C - Alk - C = 0 - \/ 0 worin "Alk" für einen Alk^ oder Alk2-Rest nach Anspruch 1 steht, unter Rühren umsetzt, dann Äthanol zusetzt bis sich eine homogene Mischung gebildet hat, anschließend unter intensivem Rühren langsam mit Wasser versetzt, wobei vorhandene Ester der aromatisch gebun-denen OH-Gruppenhydrolysiert werden, sobald diese Hydrolyse vollständig ist, mit Athvlacetat verdünnt, mit äthvlacstatgesättigtem saurem Wasser wäscht, die Athylacetat-phase einengt, mit Äthanol aufnimmt und mit einer ^ alkoholischen Alkalihydroxidlösung in das Salz des freien __ Carbonsäurerestes überführt. ;z 3 o r /[_ . « » • r . > J é 4 ^ 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, U daß die Umsetzung mit dem Dicarbonsäureanhydrid bei g etwa 40 - 50°C durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das äthylacetatgesättigte saure Waschwasser bei einem pH von etwa 1,5 - 2,4 gehalten wird. 10

8. Pharmazeutische Mittel, enthaltend mindestens eine Ver-, bindung nach einem der Ansprüche 1-4, gegebenenfalls in einerpharmazeutischen Träger oder Hilfsstoff.

9. Verwendung der Verbindungen'nach den Ansprüchen 1 - 4 1 b - zur Behandlung von VerbrennungsSchäden, Leber- Zirrhosen·, toxisch-metabolischen Leberschäden und Pilzvergiftungen. ” V_, V 'V\ 'V\ ;\ 25 SO 35 203/Z. V