FI84064C - Foerfarande foer framstaellning av farmakologiskt vaerdefulla silibininderivat. - Google Patents

Description

84064

Menetelmä valmistaa farmakologisesti arvokkaita silibinii-nijohdoksia - Förfarande för framställning av farmakolo-giskt värdefulla si 1ibininderivat.

5 Keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa farmakologisesti arvokkaita si 1ibiniinijohdoksia, joiden kaava I on \v/CH2_0-C0_CH2'~CH2~C00M1

Wr^r - OH O CO-CH2-CH2-COOM2 jossa 20 Mj ja M2 on toisistaan riippumatta vetyatomi tai alkalime-tal1 iätomi.

Marianohdake - Silybum marianum (L.) Gaertn. (Carduus marianus L.) - on jo muinaisajoista lähtien ollut tunnettu 25 lääkekasvi. R.Munster eristi yhden komponentin, silybiinin tämän kasvin hedelmissä esiintyvistä f 1avolignaaneista, vrt. väitöskirja R.Munster, Munchen 1966. A.Pelter ja R.Hänsel ovat selvittäneet tämän yhdisteen kemiallisen rakenteen, vrt. Tetrahedron Letters. London, nide 25, sivut 3Ό 2911 - 2916 (1968).

Silybiini, josta aikaisemmin käytettiin myös nimeä sily-mariini I, on tunnetusti arvokas maksalääke, vrt.

DE-AS 17 67 666. Esimerkiksi patenttijulkaisussa 35 DE-AS 19 23 082 on kuvattu silybiinin (silymariini I) teknillinen valmistusmenetelmä.

H.Wagner, P.Diesel ja M.Seitz, Arzneimittelforschung, nide 24 (4), sivut 466 - 471, olettivat jo 1974 silybiinille 40 kaksi rakenneisomeeriä, nimittäin silybiini ja isosilybii- 2 84064 ni. A.Arnone, L.Merlini ja A.Zanarotti, Journal Chemical Society Chem.comm., 1979, nide 16, sivut 696/97 tarkensivat ja vahvistivat kokeellisesti tämän olettamuksen. Tunnettu silybiini muodostuu siten kahdesta eri yhdisteestä, nimit-5 täin seuraavien rakennekaavojen A ja B mukaisista yhdisteistä: ch9oh

15 OH O

(A) Silibiniini 20 ffV^YX^OCH3 . '25 Nr''· ch2oh

.;:' OH O

:30 (B) Isosilybiini Näistä rakennekaavoista nähdään, että näillä yhdisteillä on kysymys asemaisomeereistä. Kaavan (A) mukainen yhdiste on 35 nykyään INN-nimistössä silibiniini. Tätä nimitystä käytetään kaavan (A) mukaisesta yhdisteestä tämän jälkeen esillä olevassa hakemuksessa.

Silybiinin terapeuttisen käytön vaikeutena on, että sily 40 biini ei käytännöllisesti katsoen liukene veteen, joten ei 84064 3 voida valmistaa silybiinipitoisia injektioliuoksia tai preparaatteja, jotka vaativat tietyn vesiliukoisuuden.

DE-PS 19 63 318 kuvaa tosin si 1ybiinijohdoksia, joilla on tietty liukoisuus veteen, mutta tällöin on kuitenkin kysy-5 mys meripihkahapon puoliestereiden erittäin monimutkaisesta seoksesta. Tämä seos on monimutkainen sen vuoksi, että silybiinissä on viisi esteröityvää hydroksyyliryhmää ja lisäksi si 1ybiniini 11ä on molemmat edellä mainitut asema-isomeerit, ja esteröintiin käytetty meripihkahappo on 10 dikarboksyylihappo, joka voi muodostaa sekä mono- että diesterin. Farmaseuttiseen tarkoitukseen ei ole mahdollista käyttää tuotetta, joka muodostuu ei-todettavasta määrästä mitä erilaisimpia, selvittämättömiä yhdisteitä.

15 Julkaisussa DE-PS 19 63 318 kuvataan meripihkahapon puo-liesterin erittäin monimutkaisia seoksia, mm. erilaisten si 1ibiinidihemisukkinaattien natriumsuolojen seoksia. Selitys tälle on seuraava: si 1ibiniini-perusrunko sisältää kolme fenolista ja kaksi alkoholista hydroksyyliryhmää 20 (ennen kutsuttu silybiiniksi). Puhtaan si 1ibiniini-C-2',-3-divetysukkinaatin dinatriumsuolan valmistamiseksi (joka monoyhdiste ensimmäisen kerran ja oikealla substituoinni11 a on esitetty esillä olevan keksinnön tuloksena) on keksinnön mukaan ensin esteröity kaikki silibiniinin hydroksyyliryh-'25 mät. Tämän jälkeen on aromaattisesti sidottujen hydroksyy-liryhmien (fenolisten hydroksyyliryhmien) esterit hydrolysoitu. Näin saavutetaan kaksi asiaa: a) Täydellinen esteröinti dikarboksyylihappoyhdisteel1ä ja keksinnön mukaisissa reaktio-olosuhteissa, saadaan aina 30 aikaan dikarboksyylihappoyhdisteen monosubstituointi tai monoesteröinti.

b) Aromaattisesti sidottujen hydroksyyliryhmien esterien erityishydrolyysi yksinkertaisella ja keksinnöllisellä menetelmällä johtaa puhtaan monoyhdisteen muodostumi- 35 seen, ennen kaikkea silibiniinin kahden alkoholisen hydroksyyliryhmän kohdalla, diesterin muodostumiseen.

Hakemuksessa kuvatut monoyhdisteet (si 1ibiniinin-diesterei-tä, joissa silibiniinin kaksi alkoholista hydroksyyliryhmää 4Ö on monosubstituoitu dikarboksyylihappoyhdisteel1ä esterinä) 4 84064 on ensimmäisen kerran kuvattu esillä olevassa hakemuksessamme. Samanaikaisesti on myöskin näiden uusien yhdisteiden edulliset farmakologiset ominaisuudet esitetty.

5 Keksinnön tavoitteena on siten valmistaa farmaseuttisiin tarkoituksiin sopivia vesiliukoisia si 1ibiniinijohdoksia, jotka on tarkalleen karakterisoitu yksilöllisinä kemiallisina yhdisteinä.

10 Keksinnölle on tunnusomaista se, että 1 paino-osa kaavan (A) mukaista silibiniiniä

n CH OH

·

I 11 OH

OH O

20 (A) Silibiniini liuotetaan 1-2 paino-osaan pyridiiniä ja saatetaan rea-25 goimaan samalla, kun sekoitetaan 1-3 paino-osan kanssa dikarboksyy1ihappoanhydridiä, jonka kaava on o=c-ch2-ch2-c=o \ /

O

minkä jälkeen lisätään etanolia, kunnes muodostuu homogeeninen seos, minkä jälkeen lisätään hitaasti vettä samal-35 la voimakkaasti sekoittaen, jolloin aromaattisesti sitoutuneiden OH-ryhmien läsnäolevat esterit hydrolysoituvat, heti tämän hydrolyysin tapahduttua täydellisesti lisätään etyyliasetaattia, pestään etyyliasetaatilla kyllästetyllä happamalla vedellä, etyyliasetaattifaasi haihdutetaan, 40 liuotetaan etanoliin ja muunnetaan mahdollisesti alkoholi- 5 84064 pitoisen aikaiihydroksidi1iuoksen avulla vapaan karbok-syy1ihappoesterin suolaksi.

Reaktio dikarboksyylihappoanhydridin kanssa tapahtuu par-5 haiten 40-50oC:ssa. Etyyliasetaatilla kyllästetyn happaman pesuveden pH pidetään edullisesti arvossa noin 1,5 - 2,4.

Parhaana pidettyjä kaavan (I) mukaisia yhdisteitä ovat ne yhdisteet, joissa ja M2 on kulloinkin toisistaan riippu-10 matta ai kaiimetal1iatomi. Ryhmillä ja M2 on kulloinkin parhaiten sama merkitys.

Erityisen hyvänä pidetty on silibiniini-C-2',3-divetysuk-kinaatti-dinatriumsuola.

15

Keksinnön mukaisissa yhdisteissä ovat bentseeniytimeen sitoutumattomat silibiniinin OH-ryhmät esteröity kokonaan meripihkahapol1 a.

20 Näillä yhdisteillä, erityisesti si 1ibiniini-C-2’,3-dive- tysukkinaatti-dinatriumsuolai la, on yllättäen selvä farmakologinen vaikutus hoidettaessa palovammoja. Kuvatusta derivatisoinnista huolimatta niillä on lisäksi tunnetun silybiinin täysi farmakologinen tehokkuus maksalääkkeenä.

25 Ne sopivat erityisen hyvin maksakirroosin ja myrkkymetabo-listen maksavaurioiden hoitoon. Keksinnön mukaiset yhdisteet ovat yllättäen osoittautuneet myös erittäin tehokkaiksi sienimyrkytysten, erityisesti kärpässienien (Amanita phalloides) aiheuttamien erittäin vaarallisten myrkytysten 30 hoidossa. Niillä voidaan yllättäen hoitaa hyvin myös halo-genoitujen orgaanisten liuottimien, kuten hii1itetraklori -din, triklooriety1eenin, kloroformin, jne. aiheuttamia myrkytyksiä. Ehkäisevässä käytössä keksinnön mukaiset yhdisteet estävät edellä kuvattuja vaurioita.

35

Kokeet si 1ibiniini-C-2',3-divetysukkinaatti-dinatrium-suolalla (Si 1i-suc-na).

Palovammoissa esiintyvät oireet johtuvat erityisesti lämmön .40 aiheuttaman kudosnekroosin tuotteiden aiheuttamasta intok- 6 84064 sikaatiosta. Monella erilaisella tavalla on osoitettu, että tähän ovat syynä autointoksikatiiviset prosessit vaikeiden ihon palovammojen jälkeen. Erityisen vakuuttavia ovat palaneen ja palamattomat ihon ristisiirrosteet terveisiin 5 tai palaneisiin isäntäeläimiin, jolloin on osoittautunut, että palaneen ihon ei-palamattomat vastaanottajat menehtyvät, kun taas mitään vahingollisia vaikutuksia ei voida havaita terveen ihon palaneilla vastaanottajilla, kts.

K.H. Shmidt et .ai., Neuere Aspekte zur Autointoxikation 10 nach schweren Verbrennungen; Die Verbrennungskrankheit (F.W. Ahnefeld et ai., toim. L), Springer, Berlin 1982, sivut 45-52.

Ihon palovammoissa vapautuu tai muodostuu uudelleen lukui-15 siä kemiallisia yhdisteitä. Näiden lukuisuudesta huolimatta on onnistuttu selvittää eräiden näiden yhdisteiden rakenne.

Mm. on voitu osoittaa, että ihon palovammoissa muodostuvilla yhdisteillä on samankaltaisuutta sellaisten yhdisteiden 20 kanssa, joita syntyy lipidien peroksidaatiossa. Analogioita on olemassa myös näiden yhdisteiden toksisten vaikutusten välillä. Erityisen vaikuttava on toksisesti vaikuttavien tyydytettyjen ja tyydyttämättömien ketjunpituudeltaan erilaisten aldehydien muodostuminen lipidien peroksidaation .'.25 (Benedetti et ai., Identification of 4-hydroxynonenal as a cytotoxic product originating from the peroxidation of liver microsomal lipids, Biochim.Biophys.Acta 620, 281-296, 1980) ja lämmön aiheuttamien kudosvaurioiden (K.H. Schmidt et ai., Studies on the structure and biological effects of •30 pyrotoxins purified from burned skin, World J. Surg. 3, 361-365, 1979) seurauksena. Sen vuoksi oletetaan, että palovammat johtavat solurakenteiden oksidatiiviseen vaurioitumiseen .

35 Sen vuoksi tutkittiin autointoksikaatiosta johtuvia mem-braani1ipidien auto-oksidatiivisia muutoksia vaikeiden palovammojen jälkeen. Erityisesti tutkittiin muutoksia membraani1ipidien rasvahappokoostumuksessa. Edelleen tutkittiin, paljonko keksinnön mukaiset si 1ibiinijohdokset 7 84064 vaikuttavat muutoksiin membraani1ipidien rasvahappokoostu-muksessa.

Muutokset membraani1ipidien rasvahappokoostumnksessa vai-5 keiden palovammojen jälkeen

Wistar-koirasrottia, joiden keskimääräinen paino oli 360 g, pidettiin kolmen ryhmissä antamalla vettä ja kuivaravintoa vapaasti. Kokeen alkuun asti huoneen lämpötila oli 22oC.

10 Kokeen aloittamisen jälkeen eläimiä pidettiin 30oC:ssa.

Ihon palovammat aiheutettiin kupari 1eimasimel1 a, jonka pinta-ala oli 20 cm^, vakiopaineel1 a ja 250oc lämpötilassa. Syvemmällä olevien elinten vaurioituminen lämmön vaikutuk-15 sesta estettiin siten, että ihoa siveltiin ilman avulla jäähdytetyllä ontolla spaattelilla. Tällä eläinmallilla voitiin aiheuttaa erittäin täsmällisiä palamissaumoja, jotka antoivat vakiona pysyviä eloonjääntiaikoja.

20 Ennen kokeen alkua eläimet narkotisoitiin 50 mg/kg nembu-taalilla. Polton jälkeen injisoitiin shokin profylaksia-hoitoa varten 20 ml Ringer-1aktaatti1iuosta i.p.

Muodostettiin 5 koeryhmää: 25 a) Normaaliryhmä : Täysin vahingoittumattomat eläimet b) Kontrolliryhmä I: Vain si 1ibiniini-käsittely 6 päivän aikana antamalla 75,5 mg Sili-suc-na-yhdistettä.

30 c) Kontrolliryhmä II: Vaiekäsitellyt eläimet d) Ryhmä, jossa poltettuja eläimiä: 25 %, 250oC, 20 s, 0,5 at e) Testiryhmä: Eläimet, joille annettiin 75,5 mg

Sili-suc-na i.p. 6 päivän aikana alkaen 35 polttamista edeltävänä päivänä.

Mikrosomien eristämistä varten narkoosissa olevista eläimistä laskettiin veri koeajan jälkeen. Tämän jälkeen maksat poistettiin, punnittiin ja siirrettiin heti jääkylmään 40 eristys 1luokseen (0,25 mm sakkaroosi, 1 mM EDTA 10 mMol 8 84064

Tris . HCl, pH 7,2). Maksat leikattiin ja homogenisoitiin mediumiin. Mikrosomijae pelletoitiin differentiaalisentri-fugoimalla. Mikrosomit suspentoiti in uudelleen ja sentrifu-goitiin uudelleen. Tämän jälkeen valmistettiin suspensio, 5 jossa 1 ml suspensiota vastasi 1 g maksakudosta.

Lipidit määritettiin J. Folch'in menetelmällä (A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, J.biol.Chem. 226, 497-508 (1957)), 10 Bligh’in ja Dyer'in muunnelma (A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959)).

Uutetut mikrosomi1ipidit saippuoitiin natriumhydroksidi11a. 15 Vapaat rasvahapot esteröitiin lisäämällä BF3-metanolia.

Metanolin haihduttamisen ja hydrofii1isten sivutuotteiden poistamisen jälkeen määritettiin rasvahappoesterit kvantitatiivisesti .

20 Palamattomissa eläinryhmissä ei voitu todeta mitään mainittavia muutoksia rasvahappokuviossa. Narkoosi ja vähäiset leikkaustoimenpiteet eivät siten aiheuta mikrosomaalisten lipidien muutosta. Tästä syystä yhdistettiin myöhemmissä vertailuissa normaaliryhmä ja kontrolliryhmä yhdeksi kont-: .25 rol 1 i ryhmäksi .

Palamattomien ja palaneiden eläinten vertailu niiden mikrosomaal isten rasvahappokuvioiden suhteen osoitti tyydytty-mättömien rasvahappojen selvän siirtymisen tyydyttyneiksi.

::30

Kuvio 1 esittää rasvahappojakautumaa mikrosomaalisissä maksalipideissä ja ihon lämpövaurion aiheuttamia muutoksia. Palmitiinihapon (C16) osuus rasvahappojen kokonaismäärästä nousee palamisen jälkeen 35 25,1- %:sta 34,4 %:iin. Steariinihapon (C18) osuus palaneilla eläimillä on 46,3 % verrattuna kontrol-lieläimillä saatuun 13,2 % määrään. Ö1jyhapossa (C18-:l) on osoitettavissa pienempi, ei-merkittävä lasku. Linolihapon (C18:2) laski palamisen jälkeen 9 84064 noin 1/3 alkuarvosta. Palamisen jälkeen arakidoni-happoa (C20:4) oli vain 31 % 1ähtöpitoisuudesta.

Seuraava taulukko 1 osoittaa Si 1i-suc-na-yhdisteen vaiku-5 tuksen palaneiden ja palamattomien eläinten rasvahappojen määriin.

TAULUKKO 1 10 Rotan maksan mikrosomaalisten lipidien rasvahappokuvio Sili-suc-na-hoidon jälkeen palaneilla ia palamattomilla eläimi11ä _C16_C18_C18 :1 C18 : 2 C20:4 15 PALAMATTOMAT 29,8% 37,2% 8,9% 9,6% 16,2% (kontrol1i- ryhmä I >_±6.2_±12,3_±1.1_±3,3_±4,9 PALANEET 25,4% 37,5% 7,8% 11,4% 18,0% 20 _±6.0_±8,6_±1,0_±5,3_±9,1

Keksinnön mukainen käsittely si 1ibiniinijohdoksella ei osoita aiheuttavan mitään oleellisia muutoksia palamattomilla kontrollieläimillä verrattuna käsittelemättömiin : '25 eläimiin. Palaneilla eläimillä hoito kumoaa täydellisesti tyydyttymättömien rasvahappojen häviämisen.

Yhteenvetona voidaan todeta seuraavaa: Palovammat aiheuttavat muutoksia mikrosomaalisten lipidien rasvahappokuviossa. 20 Tämän oletetaan johtuvan membraanien oksidatiivisesta vaurioitumisesta. Tämä näkyy erityisesti monityydyttymättömien rasvahappojen voimakkaana vähenemisenä.

Keksinnön mukaisesti käytetyt si 1ibiniinijohdokset kykene-35 vät inhiboimaan oksidatiiviset solun vaurioitumiset. Ne sopivat sen vuoksi erityisesti estämään oksidatiiviset vaurioitumismekanismit vaikeiden palovammojen jälkeen.

Edellä jo kuvattiin, että autotoksisten reaktioiden usko-; 40 taan vaikeiden palovammojen jälkeen johtavan erityisesti oksidatiivisiin solun vaurioihin. Sen vuoksi tutkittiin, 10 84064 mikä vaikutus on standardisoidulla lämmön aiheuttamalla traumalla rottien pernasta ja periteriaverestä saatujen T-1ymfosyyttien PHA-indusoituun blastogeneesiin. Lisäksi tutkittiin, kuinka keksinnön mukaisesti käytetyt sili-5 biinijohdokset vaikuttavat tällaisiin lymfosyyttisiin toimintahäiriöihin vaikeiden palovammojen jälkeen.

Standardisoidun lämmön aiheuttaman trauman vaikutus pernasta ia peri f erisestä verestä saatujen T-1 vmf osyvtt-i 10 PHA-indusoituun blastogeneesiin

Wistar-rottien selkänahka poltettiin edellä kuvatulla tavalla kupari 1eimasimel1 a. Kontrolliryhmänä käytettiin vaiepoltettuja eläimiä, joille suoritettiin kaikki leik-15 kauskäsittelyt ilman polttamisia. 2, 4, 7 ja 9 päivän kuluttua veri ja perna poistettiin eetterinarkoosissa olevilta poltetuilta eläimiltä tai kontrol1ieläimi1tä.

Hepariinikäsitelty veri päällystettiin lymfosyyttien eris-20 tämiseksi Ficol1-Hypaque-1iuoksel1 a (tiheys 1,077). Sen jälkeen sentrifugoitiin ja saatujen lymfosyyttien elävyys testattiin Trypan-Blau-väri11ä. Pernan lymfosyyttien eristämiseksi elin hienonnettiin, johdettiin seulan läpi ja mukana kulkeutuneet erytrosyytit poistettiin Gay’n mukai-' ' 25 sesti Lyse-1 iuoksel 1 a .

j Sen jälkeen soluseosta inkuboitiin 30 minuuttia astiassa, kun mukana oli 5 % lämmöllä inaktivoitua vasikansikiöseeru-mia, jotta pienennettäisiin yksitumaisten solujen määrää 3Ό suspensiossa kiinnittämällä astia seinämään (5 %). Viljelyä varten solut laitettiin "f 1at-bottom"-mikrotiitteri1evyi1“ le. Sen jälkeen lisättiin 20 % vasikansikiöseerumia. Tällä tavoin määritettiin spontaani blastogeneesi mittaamalla tymidiinin-(2Ci/mM) liittyminen solujen DNAran.

35

Esikokeissa oli selvitetty, että optimaalinen mitogeenin stimuloituminen tapahtuu 5 pg/ml PHA-konsentraatiossa (mitogeeni-fythemagglutiniini). Sei 1 uiaarisen testi järjestelmän näissä optimointikokeissa todettiin edelleen, että •40 DNA:n uussynteesi aktivoituu maksimaalisesti 72 tunnin 11 84064 jälkeen. Edelleen todettiin, että vasikansikiöseerumin optimaalinen konsentraatio on 20 % suuremman stimuloitumi-sen aikaansaamiseksi.

5 Edellä jo kuvattiin, että spontaani blastogeneesi määritettiin mittaamalla 3H-tymidiinin liittyminen solujen DNA:an. Soluista poistettiin tumat 18 tunnin kuluttua 3H-tymidiinin lisäämisen jälkeen, jolloin 18 tunnin nollapiste osui yhteen maksimaalisen stimuloitumisen ajankohdan kanssa.

10

Keksinnön mukaisesti käyttökelpoisten si 1ibiinijohdosten vaikutuksen tutkimista varten käsiteltiin yksi rottaryhmä si 1ibiniinijohdoksel1 a. Tätä varten injisoitiin intraperi-toneaalisesti 75,5 mg Si 1i-suc-na-yhdistettä kerran päiväs-15 sä. Tämä hoito suoritettiin palamispäivästä alkaen elimen poistopäivään asti (enintään 9. päivään asti).

Kontrol1ieläimillä ja palamattomilla eläimillä ja Sili-suc-na-käsitel 1yi11ä eläimillä saatujen tulosten arvioimista 20 varten laskettiin stimulaatioindeksi. Tämä luku on stimuloidun näytteen keskiarvon ja kontrol1inäytteen keskiarvon osamäärä. Tällä tavoin saadusta jokaisen koe-eläimen stimu-1aatioindeksistä laskettiin keskimääräinen stimulaatioindeksi eläinryhmää kohti. Saadut tulokset on ilmaistu tämän :.:25 indeksin SI avulla.

Kuvio 2 esittää käytetyn Si 1i-suc-na-yhdisteen vaikutusta lymfosyyttien blastogeneesiin. Palaneilla eläimillä silibiniini selvästi suurensi solujen alentunutta -.’30 stimul oitavuutta .

Jo toisena päivänä Si 1i-suc-na-käsitel 1yi11ä eläimillä osoittautui veren lymfosyyttien reaktiivisuus PHA:ta vastaan noin 10 kertaa korkeammaksi. Neljäntenä jä1kitraumaat-35 tisena päivänä oli stimulaatioindeksin arvo 8 käsiteltyjen eläinten veren lymfosyyteillä, kun taas vastaava arvo käsittelemättömillä eläimillä oli 1,5.

Palaneiden, käsittelemättömien eläinten stimulaatioindeksit ; -40 pernasoluilla ovat kaikki selvästi alle 1. Silibiniinin 12 84064 antaminen johtaa merkittävään paranemiseen kaikkina tutkittuina päivinä, jolloin maksimi saavutetaan 7. jälkitrau-maattisena päivänä.

5 Lisäksi suoritettiin vielä vertailukokeita, jotka osoittivat, että Sili-suc-na ei yksinään terveillä eläimillä aiheuttanut mitään merkittäviä muutoksia pernasta ja peri-ferisestä verestä saatujen T-lymfosyyttien PHA-indusoidun blastogeneesin stimuloitavuudesta.

10

Keksinnön mukaisesti käytetty silibiniini stimuloi siten merkittävällä tavalla palaneiden eläinten lymfosyyttien blastogeneesiä.

15 Edelleen todettiin, että si 1ibiniinjohdoksi 11 a käsitellyillä eläimillä oli yleinen katabolia vähäisempää, koska lämpötrauman jälkeen eläimet nopeasti lisäsivät jälleen kasvua.

20 Sienimyrkytykset: Kärpässienien aiheuttamat myrkytykset lasketaan vaikeimpiin, joita esiintyy lääketieteessä. Vaikka kaikissa sieni-myrkytyksistä vain 10 - 30 % on vihreän kärpässienen aihe-: :25 uttamia, tämän sienen myrkytys on lääketieteellisesti mitä mielenkiintoisinta sen vaarallisuuden vuoksi. Vanhemmissa julkaisuissa on kuolleisuudeksi annettu 30 - 50 %. Nykyai-kaisen intensiivislääketieteen ansiosta on FLOERSHEIM el ai. keräämän tutkimuksen perusteella tämä luku pienentynyt : ;3O keskimäärin 22,4 %:iin 205 potilaalla.

Kärpässienen myrkky, amanitiini, voi olla tappava aikuiselle ihmiselle jo 7 mg annoksena. Tämä myrkkymäärä on noin 50 g:ssa tuoretta näytettä.

35

Menestyksellisen eläinkoesarjän jälkeen käytettiin Sili-suc-na- tehoainetta kärpässienimyrkytysten hoidossa. 20 :T; potilasta, joilla oli kärpässienimyrkytys, hoidettiin tavanomaisten hoitotoimenpiteiden lisäksi vielä Sili-suc-:.:40 na-yhdisteel 1 ä. Näistä 28 potilaasta kuoli vain yksi, joka 13 84064 oli ottanut suuremman määrän myrkkysientä itsemurhatarkoi-tuksessa. Tämän tulos on osoitus valtavasta terapeuttisesta tämän alan edistysaskeleesta.

5 Isosi 1ybiiniä sisältämättömän silibiniinin valmistus:

Suspensiota, joka sisältää 500 g patenttijulkaisun DE-AS 19 23 082 (pystyrivi 8, rivit 14-19) mukaisesti valmistettua tuotetta, jonka si 1ymariinipitoisuus on noin 70 % ja 10 si 1ybiini/si1idianiini/si1ikristiini-isomeerisuhde 3:1:1, jolloin silybiini sisältää noin 1/3 isosi1ybiiniä, ja 2 kg metanolia * 2,53 1, kuumennetaan kiehuttaen 15 minuuttia samalla sekoittaen. Näin saadusta liuoksesta voi tämän ajan kuluttua jo saostua hieman silibiiniä Tämän jälkeen poiste-15 taan tyhjössä 0,75 - 1,25 (a 0,96 - 1,58 1) metanolia ja jäännöksen annetaan seistä 10 - 28 päivää huoneen lämpötilassa. Saostunut silibiini suodatetaan ja pestään kaksi kertaa 50 ml :11a kylmää metanolia. Kuivataan 40oC:ssa tyhjössä, minkä jälkeen eristetty puhdistamaton silibiini 20 puhdistetaan seuraavalla tavalla: 60 g puhdistamatonta silibiniiniä liuotetaan kuumentaen 3 litraan teknillistä etikkahappoesteriä; tämän jälkeen lisätään 20 g aktiivihiiltä ja sekoitetaan vielä 2 tuntia 25 refluksoiden. Tämän jälkeen suodatetaan kirkkaaksi ja liuos haihdutetaan 50oC:ssa alipaineessa noin 250 ml:ksi. Kon-sentraattia sekoitetaan 15 minuuttia käyttämällä Ultra-Turrax-1 aitetta ja samalla sekoittaen lisätään 25 ml metanolia. Sen jälkeen seoksen annetaan seistä yön yli huo-30 neen lämpötilassa. Ennen tällöin saostuvan silibiinin suodattamista sekoitetaan vielä 5 minuuttia myös Ultra-Turrax-1aitteen avulla. Eroon suodatettu sakka pestään kaksi kertaa 50 ml :11a etikkahappoesteriä ja kuivataan tyhjökuivauskaapissa yön yli 40oC:ssa. Tämän jälkeen tuote 35 jauhetaan ja kuivataan samoissa olosuhteissa 48 tuntia.

Esimerkki 1

Silibiniini-C-21,3-divetvsukkinaatin valmistus .40 i4 84064

^-0-. CH0-0-CO-CH,-CH,-COOH

V^UQC 7 ! ^O^ner”· I π °v OH O \ ^-711

CO-CH2-CH2-COOH

10 50 g si 1ibiniiniä liuotetaan 45oC:ssa 70 ml : aan pyridiiniä, lisätään 50 g meripihkahappoanhydridiä, sekoitetaan noin 8 tuntia 45oC:ssa, lisätään 30 ml etanolia ja sekoitetaan, kunnes muodostuu homogeeninen seos. Sen jälkeen lisätään 15 voimakkaasti sekoittaen 60 ml vettä noin 30 minuutin kuluessa fenyyliestereiden saippuoimiseksi. Noin 1 tunnin sekoittamisen jälkeen 30oC:ssa ovat fenyyliesterit hydrolysoituneet kvantitatiivisesti. Hydrolyysin täydellisyys tutkitaan HPLC:n avulla. Hydrolyysi lopetetaan siten, että 20 saatuun reaktioseokseen lisätään nopeasti 1,7 1 etikkahap-poetyyliesteriä.

Ylimääräinen meripihkahappo ja pyridiini erotetaan siten, että etikkahappoetyy1iesteri11ä laimennettu reaktioliuos 25 uutetaan vastavirtaan kaksi kertaa 5 litralla vettä, joka on kyllästetty etikkahappoetyy1iesteri1lä ja jonka pH on 1,85 (säädetty laimealla vesipitoisella suolahapolla). Tällöin pumpataan etikkahappoetyyliesteri11ä kyllästettyä, happamaksi tehtyä pesuvettä kierrättäen vasten laimeaa 30 reaktioliuosta ja pidetään sen jälkeen laimeaa suolahappoa lisäämällä pH niin kauan arvossa 1,85, kun tämä pH-arvo pysyy vakiona etikkahappoetyyliesterikierron jälkeen.

Sen jälkeen ylimääräinen suolahappo pestään pois uuttamalla 35 etikkahappoetyy1iesterifaasi kaksi kertaa vastavirtaan 3,4 litralla vettä, joka on kyllästetty etikkahappoetyy-liesterillä. Heti, kun pesuveden pH-arvo on suurempi kuin 4,5, erotetaan orgaaninen faasi kvantitatiivisesti, haihdutetaan 40 - 50oC:ssa tyhjössä 1/12 osaan 1ähtöti1avuudesta ' 40 (noin 0,2 1) ja laimennetaan 125 ml:11 a etanolia.

84064 15

Otsikkoyhdiste saadaan seostamalla etanoli/vedestä ja kuivaamalla tyhjössä 50oC:ssa 15 tunnin ajan.

Analyysinäytteen valmistamista varten saostetaan otsikkoyh-5 diste kolme kertaa uudelleen etanoli/vedestä ja kuivataan sen jälkeen 15 tuntia 50oC:ssa tyhjössä.

FD-massaspektrissä on molekyy1ipiikki odotetun moolimassan 682 kohdalla.

10 IR-spektrissä on CO-valenssitaajuuden alueella kaksi päällekkäistä piikkiä, jolloin toinen johtuu, kuten sili-biniini11äkin, pyronirenkaan karbonyylifunktiosta aallonpituudella 1635 cm~l. Toinen piikki on aallonpituudella 15 1730 cm~l ja on peräisin kummastakin esterikarbonyylifunk- ti osta.

^H-NMR-spektri vahvistaa kaksinkertaisen esteröitymisen tapahtuneen. Integroimalla saatu aromaattisten protonien 20 suhde meripihkahapporyhmän metyyliprotoneihin on 8:8 (ppm-alue 5,9 - 7,1). Näiden metyleeniprotonien (ppm 2,6) suhde metoksiryhmän metyyliprotoneihin (ppm 3,8) on 8:3 ja sopii siten tämän kanssa yhteen.

:-'25 Myös kemialliset siirtymät ^C-tutkimuksissa osoittavat, että esteröityminen on tapahtunut kumpaankin alkoholi-OH-ryhmään, sillä kemialliset siirtymät muuttuvat voimakkaimmin hiilessä Cu ja viereisissä hiiliatomeissa C±2 “ c14 sekä C2 - C4.

;.3o

Ai ukaineanal yysi 11 e C33H30O15 (682,60)

C H H

Laskettu: 58,07 4,43 37,50 35 Saatu: 58,05 4,57 37,31

Esimerkki 2

Silibiniini-C-21,3-divetysukkinaatti-dinatriumsuola valmis-• ;40 tus ie 84064 CH2-0-C0-CH2-CH2-C0Na

OH

OH 0 CO-CH2_CH2_CONa 10

Esimerkin 1 mukaisesti saatu etanoliliuos tiputetaan sekoittaen ja ulkoapäin -5 - 9oC:ssa jäähdyttäen tämän liuoksen kuiva-ainepitoisuuden määrittämisen avulla saatuun 15 määrään 6-prosenttista etanolipitoista natriumhydroksidia, suspensiota sekoitetaan vielä tunti huoneen lämpötilassa, saostunut beigenvärinen kiinteä aine erotetaan imulla, suspentoidaan se kaksi kertaa 5-10 minuutin aikana Tur-rax-sekoittimen avulla 150 ml:aan etanolia ja erotetaan 20 uudelleen imulla. Jäljelle jääneen etikkahappoetyyliesterin poistamista varten suspentoidaan tämän jälkeen tuote 14 tunniksi huoneen lämpötilassa 280 ml Taan etanolia, erotetaan uudelleen imulla, pestään 70 ml :11a etanolia ja kuivataan 15 tuntia 40 - 45oC:ssa tyhjökuivauskaapissa. Tämän 25 jälkeen esikuivattu tuote jauhetaan, seulotaan raekokoon alle 0,2 mm ja kuivataan vielä 48 tuntia 40 - 45oC:ssa : tyhjössä. Näin saadaan 52 g otsikkoyhdistettä (saanto 69 %).

'?0 Otsikkoyhdisteel 1 ä ei ole mitään terävää sulamispistettä.

Se alkaa sintrautua noin 80oC:ssa ja sulaa noin 100oC:ssa muodostamalla rakkuloita.

UV-spektri metanolissa: max = 288 nm, = 1,73 10^.

35

Otsikkoyhdisteen moolipaino on 726,56. Yhdiste on hieman beigenvärinen, mikrokiteinen jauhe, jolla ei ole mitään erityistä hajua ja suolamainen maku. Se liukenee helposti veteen, liukenee vaikeasti etanoliin eikä käytännöllisesti • 40 katsoen liukene asetoniin, eetteriin ja kloroformiin.

Claims (4)

1. 84064 17 Patenttivaatimus Menetelmä valmistaa farmakologisesti arvokkaita silibinii-5 nijohdoksia, joiden kaava I on Ns^/CH2-0-C0-CH2-CH2-C00M1
2. 10 H0\ OCH, (I)
3. 15 OH o Nco-ch2-ch2-coom2 c jossa 20 ja M2 on toisistaan riippumatta vetyatomi tai alkalime- talliatomi, tunnettu siitä, että 1 paino-osa kaavan (A) mukaista silibiniiniä ; 25 n CH OH OH O 35 (A) Silibiniini liuotetaan 1-2 piano-osaan pyridiiniä ja saatetaan reagoimaan samalla, kun sekoitetaan 1-3 paino-osan kanssa dikarboksyy1ihappoanhydridiä, jonka kaava on :; .40 18 84064 O = C - ch2 - ch2 - C = O 5 / N o minkä jälkeen lisätään etanolia, kunnes muodostuu homogeeninen seos, 10 minkä jälkeen lisätään hitaasti vettä samalla voimakkaasti sekoittaen, jolloin aromaattisesti sitoutuneiden OH-ryhmien läsnäolevat esterit hydrolysoituvat, heti tämän hydrolyysin tapahduttua täydellisesti, lisätään etyyliasetaattia, pestään etyyliasetaatilla kyllästetyllä 15 happamalla vedellä, etyy1iasetaatti faasi haihdutetaan ja liuotetaan haluttaessa alkalisuolan valmistamiseksi etanoliin ja muunnetaan alkoholipitoisen aikaiihydroksidi1iuok-sen avulla vapaan karboksyy1ihappoesterin suolaksi. 20 84064 19 Förfarande för framstä11ning av farmakologiskt värdefulla 5 si 1ibininderivat med formeln I v>CH2-0-C0-CH2-CH2-C00M1 10 HO lOl I 15 ” \ OH O CO-CH2-CH2-COOM2 där 20 och M2 är oberoende av varandra en väteatom eller alka- limetal1 atom, kännetecknat därav, att 1 vikt-del silibinin med formeln (A) or CH-OH
4. 30 OH OH O 35 (A) Silibinin loses i 1 - 2 viktdelar pyridin och bringas att reagera under samtidig omröring med 1-3 viktdelar dikarboxyl-syraanhydrid med formeln : 40 20 84064 O = C - ch2 - CH2 - C = O 5 ^ / O varefter etanol tillsätts, tills en homogen blandning uppstär, varefter vatten längsamt tillsätts under samtidig 10 kraftig omröring, varvid de aromatiskt bundna OH-gruppernas närvarande estrar hydrolyseras, omedelbart efter det denna hydrolys fullbordats, tillsättes etylacetat, tvättas med etylacetat mättat surt vatten, etylacetatfasen avdunstas, för eventuell framställning av 15 alkalisalt loses i etanol och överföres med hjälp av en alkoholhaltig aikaiihydroxidlösning tili ett sait av en fri karboxy1syraester.