NL192387C - Zuivere silibininederivaten, werkwijze voor de bereiding daarvan en farmaceutisch preparaat dat een dergelijk derivaat bevat. - Google Patents

Description

^ “ m m m

Zuivere silibininederivaten, werkwijze voor de bereiding daarvan en farmaceutisch preparaat dat een dergelijk derivaat bevat

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op silibininederivaten, voorgesteld door formule 1 van het 5 formuleblad, waarin Alk1 en All^, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een alkyleengroep met 1-4 koolstofatomen of een alkenyleengroep met 2-4 koolstofatomen voorstellen, M, en M2, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een waterstofatoom of een alkalimetaalatoom voorstellen, en n en m, die gelijk of verschillend kunnen zijn, 0 of 1 zijn.

Het is bekend (Wagner, c.s., Arzneimittel Forschung, 24, 466-471 (1974) en Amone, c.s., J. Chem. Soc. 10 Chem. Comm. 16, 696-697 (1979)) dat silibinine (formule 3) één plaatsisomeer is van silybine, dat verder nog bestaat uit isosilybine (formule 4). Silybine is een waardevol levertherapeuticum. Gezien de slechte oplosbaarheid in water, wordt silybine zodanig gederivatiseerd dat de wateroplosbaarheid sterk toeneemt en de verbinding geschikt wordt voor, in het bijzonder parenterale, toediening.

Derivaten als in de aanhef genoemd, zijn beschreven door H.P. Koch et al. in Archiv der Pharmazie 316, 15 blz. 385-394 (1983). Dat artikel beschrijft de hydrolyse-kinetiek van silybinedihemisuccinaat, als voorbeeld van een half ester van silybine met een dicarfoonzuur, bij verschillende waarden voor de pH. Als structuurfor-mule voor silybine wordt de formule zoals formule 1 van het ondeihavige formuleblad gegeven, met dien verstande dat de onderhavige groepen -O-CO-fAlk,^),^ -COOM1/2 daar staan voor een bamsteengroep of een H-atoom (in het laatste geval is de verbinding ongesubstitueerd silybine). Hoewel in dat artikel de 20 structuurformule van al dan niet gederivatiseerde silibinine wordt getoond, betekent dat niet dat de onderzochte verbindingen ook werkelijk de zuivere verbindingen zijn. Dat blijkt uit de opmerkingen bovenaan bladzijde 386, waar gesteld wordt dat aangenomen wordt dat de onderzochte verbindingen voldoen aan de getoonde structuurformule.

De door Koch et al. onderzochte verbindingen zijn echter mengsels van derivaten van silibinine en 25 isosylibine. Dit blijkt duidelijk uit het feit dat de door hen onderzochte verbindingen zijn vervaardigd op 12 december 1975 (zie het chargenummer 75 1212/Fy halverwege bladzijde 393 van dat artikel). Toentertijd was het nog niet mogelijk om zuivere silibininederivaten te vervaardigen.

Gebleken is dat de verbinding silibinine en de daarvan afgeleide, hiervoor gedefinieerde, derivaten in zuivere vorm een verbeterde farmaceutische werking van die verbinding bevattende preparaten geven. Een 30 bereiding van zuiver silibinine en een farmaceutisch preparaat met isosylibine-vrij silibinine samen met een farmaceutisch aanvaardbare drager en/of hulpstof is onderwerp van de Nederlandse octooiaanvrage 8503136.

De onderhavige uitvinding verschaft nu silibininederivaten zoals in de aanhef genoemd, met het kenmerk, dat de silibininederivaten vrij van isosilybine of derivaten daarvan zijn en zich in zuivere vorm bevinden.

35 De voorkeur gaat uit naar een dergelijk zuiver silibininederivaat dat wordt gekenmerkt doordat Alk, en Ali<2 een alkyleengroep met 2 koolstofatomen voorstellen, M, en M2, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een alkalimetaalatoom voorstellen, en n en m, die gelijk of verschillend kunnen zijn, 0 of 1 zijn.

Verder gaat de voorkeur uit naar een dergelijk zuiver silibininederivaat, dat wordt gekenmerkt doordat Alk, en Alkg, M, en M2, en n en m in de formule 1 dezelfde betekenissen hebben.

40 Tenslotte heeft het zuivere dinatriumzout van silibinine-C-2',3-diwaterstofsuccinaat met de formule 6 de voorkeur. Deze verbinding toont een goede farmacologische werking bij de behandeling van brandwonden.

De werking van de zuivere silibininederivaten is beter dan die van de silibynederivaten welke eveneens isosilybinederivaten bevatten. Zij zijn in het bijzonder geschikt voor de behandeling van leverei rrose en toxisch-metabolische leverbeschadigingen.

45 De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor het bereiden van zuivere silibininederivaten volgens één der conclusies 1 tot en met 4, waarbij 1 gewichtsdeel silibinine volgens formule 3 wordt opgelost in pyridine; onder roeren wordt omgezet met 1-3 gewichtsdelen dicaibonzuuranhydride met formule 2, waarin Alk de in conclusie 1 aangegeven betekenis voor Alk, of Alks heeft; ethanol wordt toegevoegd totdat zich een homogeen mengsel heeft gevormd; het verkregen product wordt gewassen met 50 water dat met ethylacetaat is verzadigd en dat zuur reageert; het gewassen product dat zich in de ethylacetaatfase bevindt in ethanol wordt opgenomen en met een alcoholisch alkalimetaalhydroxide-oplossing tot het zout van het vrije carbonzuur wordt omgezet, gekenmerkt doordat aan het homogene mengsel onder intensief roeren langzaam water wordt toegevoegd om aromatische estergroepen te hydrolyseren, na voltooiing van de hydrolyse met ethylacetaat wordt verdund, en alvorens het gewassen 55 product in ethanol wordt opgenomen de ethylacetaatfase wordt geconcentreerd.

Bij voorkeur wordt de reactie met het dicarbonzuur uitgevoerd bij een temperatuur van 40-50°C.

Verder heeft het de voorkeur dat het zuur-reagerende en met ethylacetaat verzadigde waswater op een pH van 1,5-2,4 wordt gehouden.

Tenslotte heeft de uitvinding betrekking op een farmaceutisch preparaat, welk preparaat ten minste een verbinding bevat volgens één der conclusies 1 tot en met 4, samen met een farmaceutisch aanvaardbare drager of hulpstof.

5 Behalve tegen leveraandoeningen hebben de zuivere verbindingen volgens de uitvinding een goede werking bij het behandelen van paddestoelenvergiftiging, in het bijzonder de zeer gevaarlijke vergiftiging door amaniet (Amanita phalloides). Verder was het niet te voorzien dat vergiftiging door gehalogeneerde organische oplosmiddelen zoals tetrachloorkoolstof, trichloorethyleen, chloroform etc. met de verbindingen volgens de uitvinding verrassend goed behandeld kunnen worden. Behalve genezend werken de verbindin-10 gen volgens de uitvinding ook profylactisch tegen voomoemde aandoeningen.

De preparaten volgens de uitvinding worden meestal systemisch toegepast, bijvoorbeeld als pillen, capsules en oplossingen in gebruikelijke dragers en eventueel samen met gebruikelijke hulpstoffen. Voor volwassenen bedraagt de dosering 50-500 mg per dag al naar gelang de toestand van de patiënt en de ernst van de symptomen.

15

Farmacologische onderzoekingen met het dinatriumzout van silibinine-C-Z, 3-diwaterstofsuccinaat De bij verbranding optredende symptomen worden in het bijzonder door intoxicatie door producten van thermische weefselnecrose veroorzaakt. Het bewijs dat autointoxicatie na zware huidverbranding daarvoor verantwoordelijk is, is op verschillende manieren geleverd. Bijzonder overtuigend zijn de resultaten van 20 kruistransplantaties van verbrande of onverbrande huid op respectievelijk gezonde en verbrande gastheer-dieren, waarbij gebleken is dat de onverbrande ontvanger van verbrande huid ten gronde gaat terwijl de verbrande ontvanger van gezonde huid geen enkele schadelijke werking ondervindt (zie K.H. Schmidt et al., Neuere Aspekte zur Autointoxikation nach schweren Verbrennungen; Die Verbrennungskrankheid (uitgegeven bij F.W. Ahnefeld et al., L), Springer, Berlin 1982, blz. 45-52.

25 Bij huidvetbranding treedt nieuw-vorming van een groot aantal verschillende verbindingen op of komen deze vrij. Ondanks hun grote aantal, is het gelukt enige daarvan op te helderen.

Zo kon onder andere worden aangetoond dat bij huidverbranding soortgelijke verbindingen ontstaan als bij lipideperoxidatie. Ook tussen de toxische werkingen bestaan analogieën. Bijzonder treffend is de vorming van toxische verzadigde en onverzadigde aldehyden met verschillende ketenlengte tengevolge van 30 lipideperoxidatie (Benedetti et al., Identification of 4-hydroxynoneal as a cytotoxic product originating from the peroxidation of liver microsomal lipids, Biochim. Biophys. Acta 620, 281-296 (1980)) en tengevolge van thermische weefselbeschadiging (K.H. Schmidt er al., Studies on the structure and biological effects of pyrotoxins purified from burned skin, Worid J. Surg. 3, 361-365 (1979)). Derhalve wordt aangenomen dat verbranding tot een oxidatieve beschadiging van celstructuren leidt.

35 Op grond van het voorgaande werden met het dinatriumzout van silibinine-C-2', 3-diwaterstofsuccinaat volgens de uitvinding, (Sili-sucna) autooxidatieve veranderingen in membraanlipiden tengevolge van autointoxicatie na zware verbranding onderzocht. In het bijzonder werden veranderingen in de vetzuur-samenstelling van membraanlipiden onderzocht. Ook werd onderzocht in welke mate het silibininederivaat de veranderingen in de vetzuursamenstelling van membraanlipiden beïnvloedt.

40

Veranderingen in de vetzuursamenstelling van membraanlipiden na zware verbranding Aan mannetjes Wistar-ratten met een gemiddeld gewicht van 360g, verdeeld in drie groepen, werden water en droog voer ad libitum ter beschikking gesteld. De omgevingstemperatuur bedroeg tot aan het begin van het onderzoek 22°C en na het begin 30°C.

45 Huidverbrandingen werden teweeggebracht met een koperstempel met een oppervlak van 20 cm2 bij een temperatuur van 250°C en onder constante druk. Om thermische beschadiging van dieper gelegen organen te voorkomen, werd de huid over een luchtgekoelde, holle spatel getrokken. Aldus te werk gaande konden zeer nauwkeurige verbrandingswonden worden veroorzaakt zonder dat de ratten stierven.

Vóór het begin van het onderzoek werden de dieren verdoofd met 50 mg/kg nembutal. Na de verbran-50 ding werden voor shockprofylaxie 20 ml Ringer-lactaatoplossing intraperitoneaal geïnjecteerd.

Er werden vijf testgroepen samengesteld: a) normaalgroep: volkomen ongeschonden dieren b) controlegroep I: alleen silibininebehandeling gedurende 6 dagen met 75,5 mg Sili-suc-na c) controlegroep II: schijngeopereerde dieren 55 d) groep met verbrande dieren: 25%, 250°C 20 sec, 0,5 at e) testgroep: dieren waarvan 75,5 mg Sili-suc-na i.p. gedurende 6 dagen, beginnend één dag vóór de verbranding, werd toegediend.

O IMOOf

Om de microsomen te isoleren werd van de dieren na afloop van het onderzoek onder narcose bloed afgetapt. Aansluitend werd de lever verwijderd, gewogen en meteen in ijskoud isoleermedium (0,25 mM saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM Tris.HCI, pH 7,2) gebracht. De lever werd in dunne laagjes gesneden die in het medium werden gehomogeniseerd. Door differentieelcentrifugatie werden de microsoomfracties 5 gepelleteerd. De microsomen werden opnieuw gesuspendeerd en nogmaals gecentrifugeerd. Aansluitend werd een suspensie bereid waarvan 1 ml overeenkwam met 1 g leverweefsel.

De lipiden werden bepaald volgens de methode van J. Folch (A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, J. Biol. Chem. 226, 497-508 (1957)), gemodificeerd volgens Bligh en Dyer (A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol. 37, 10 911-917(1959)).

De geëxtraheerde microsoomlipiden werden met natriumhydroxide verzeept. De vrije vetzuren werden met BF-j/methanol veresterd. Na afdampen van de methanol en verwijderen van hydrofiele bijproducten, werden de vetzuuresters kwantitatief bepaald.

Bij de groep niet-veibrande dieren kon geen noemenswaardige verandering in de vetzuurmonsters 15 worden vastgesteld. Dit betekent dat de narcose en de geringe operatieve ingreep niet tot een verandering van de microsomale lipiden leiden.

Op grond hiervan werden voor verdere vergelijking de normaalgroep en de controlegroep tot één enkele controlegroep samengevoegd.

Uit vergelijking van de niet-verbrande dieren met de verbrande dieren met betrekking tot hun microso-20 male vetzuurmonsters bleek dat zich een ernstige verschuiving van onverzadigde naar verzadigde vetzuren had voorgedaan.

Ter toelichting hierop wordt verwezen naar figuur 1. Daarin zijn de vetzuurverdeling in de microsomale leveriipiden en de door thermische huidbeschadiging veroorzaakte veranderingen weergegeven. Het gehalte palmitinezuur (C16) stijgt na verbranding van 25,1 tot 34,4% van alle vetzuren gezamenlijk. Voor stearine-25 zuur (C18) bedraagt het gehalte bij de verbrande dieren 46,3% tegen 13,2% bij de controlegroep. Voor oliezuur (C18:1) is een lichte, niet significante daling aanwijsbaar. Het gehalte linolzuur (C18:2) daalde na verbranding tot 1/3 van de uitgangswaarde. Voor arachidonzuur (C20:4) tenslotte bedroeg het gehalte na verbranding nog maar 31% van de uitgangswaarde.

Uit de onderstaande tabel A blijkt de invloed van Sili-suc-na op het quotum vetzuren bij verbrande en 30 niet-verbrande dieren.

TABEL A

Vetzuurmonsters van microsomale lipiden uit rattenlever na Sili-suc-na-therapie bij verbrande en niet- verbrande dieren 35 - C16 C18 C18:1 C18:2 C20:4

Niet-verbrand 29,8% 37,2% 8,9% 9,6% 16,2% (controlegroep!) ±6,2 ±12,3 ±1,1 ±3,3 ±4,9 40 Verbrand 25,4% 37,5% 7,8% 11,4% 18,0% ±6,0 ±8,6 ±1,0 ±5,3 ±9,1

Uit tabel A blijkt dat behandeling met een silibininederivaat volgens de uitvinding bij de niet-verbrande 45 controledieren geen wezenlijke veranderingen ten opzichte van de onbehandelde dieren veroorzaakt. Bij de verbrande dieren wordt het verlies aan onverzadigde vetzuren door de therapie volledig opgeheven.

Samenvattend kan dus worden vastgesteld:

Verbrandingen leiden tot veranderingen in vetzuurmonsters van microsomale lipiden. Aangenomen wordt, dat dit tot een oxidatieve beschadiging van de membranen is terug te voeren. Dit blijkt in het bijzonder uit 50 de sterke afname van de meervoudig onverzadigde vetzuren.

De silibininederivaten volgens de uitvinding bezitten dus het vermogen om oxidatieve celbeschadigingen te remmen. Derhalve lenen zij zich in het bijzonder voor het onderbreken van oxidatieve beschadigings-mechanismen na zware verbrandingen.

Zoals reeds vermeld, wordt aangenomen dat autotoxische reacties na zware verbrandingen in het 55 bijzonder tot oxidatieve celbeschadigingen leiden. Op grond hiervan werd onderzocht hoe de werking van een gestandaardiseerde verbrandingswond op de PHA-geïnduceerde blastogenese van T-lymfocyten uit de milt en uit perifeer bloed van ratten is. Verder werd onderzocht hoe de silibininederivaten volgens de uitvinding dergelijke lymfocytaire functiestoornissen na zware vetbrandingen beïnvloeden.

Werking van een gestandaardiseerde thermische wond op de PHA-geïnduceerde blastogenese van T-lymfocyten uit de milt en uit perifeer bloed van ratten 5 Zoals boven beschreven werd de rughuid van Wistarratten met een koperstempel verbrand. Als controlegroep dienden schijnverbrande dieren waaraan alle operatieve ingrepen zonder verbranding werden uitgevoerd. Na 2, 4, 7 en 9 dagen werden bij de verbrande en controledieren onder ethemarcose bloed afgetapt en de milt verwijdend.

Om de lymfocyten te isoleren werd Ficoil-Hypaque-oplossing (dichtheid 1,077) belaagd met geheparini-10 seerd bloed. Aansluitend werd gecentrifugeerd en werden de verkregen lymfocyten met trypan-blauw op hun vitaliteit getest. Om de miltlymfocyten te isoleren werd het orgaan verkleind, door een zeef gedwongen en door lysis-oplossen volgens Gay van begeleidende erythrocyten bevrijd.

Aansluitend werd het celmengsel in een houder 30 minuten geïncubeerd bij aanwezigheid van 5%1g hittegeïnactiveerd feutaal kalverserum om het aantal mononudeaire cellen in de suspensie door adhesie 15 aan de wand van de houder te verkleinen (5%). Eerst werden de cellen in de putjes van een microtiterplaat met vlakke bodem gebracht. Daarna werd 20%'ig feutaal kalverserum toegevoegd. Vervolgens werd de spontane blastogenese door meting van in het DNA van de cellen ingebouwd 3H-thymidine (2C i/mM) bepaald.

Uit eerdere onderzoekingen was al duidelijk geworden dat een optimale mitogensstimulatie bij een 20 PHA-concentratie (mitogen-fythaemagglutine) van 5 pg/ml plaatsvindt. Bij deze proeven om het cellulaire testsysteem te optimaliseren werd verder vastgesteld dat de synthese van nieuw DNA maximaal wordt gestimuleerd na 72 uren. Bovendien werd bevonden dat de optimale concentratie aan feutaal kalverserum 20% moet bedragen om maximale stimulatie te bereiken.

Zoals boven beschreven werd de spontane blastogenese bepaald door in het DNA van de cellen 25 opgenomen 3H-thymidine te meten. De cellen werden 18 uren na toevoegen van 3H-thymidine geoogst waarbij het nulpunt voor die 18 uren met het tijdstip van maximale stimulatie samenviel.

Om de werking van de silibininederivaten volgens de uitvinding te onderzoeken werd een groep ratten met zo’n derivaat behandeld. Daartoe werd 75,5 mg Sili-suc-na eenmaal daags intraperitoneaal geïnjecteerd. Deze behandeling weid vanaf de verbrandingsdag tot aan de dag waarop de organen werden 30 verwijderd (met de negende dag als uiterste) volgehouden.

Uit de met de controledieren, niet-verbrande dieren en met Sili-suc-na behandelde dieren verkregen resultaten werd de stimulatie-index berekend. Deze is het quotiënt van de gemiddelde waarde uit de resultaten met de gestimuleerde ratten en de gemiddelde waarde uit de resultaten met de controleratten. Uit de stimulatie-index werd voor elk proefdier een gemiddelde stimulatie-index per diergroep berekend. Deze 35 gemiddelde stimulatie-index is aangegeven met SI.

Ter toelichting hierop wordt verwezen naar figuur 2. Daarin is de invloed van Sili-suc-na op de blastogenese van lymfocyten weergegeven. Bij de verbrande dieren werd de verminderde stimuleerbaarheid van de cellen door silibinine duidelijk verhoogd.

Al op de tweede dag bleek dat bij de met Sili-suc-na behandelde dieren de respons van de bloed-40 lymfocyten op PHA ongeveer 10 keer hoger was. Op de vierde dag na de verbranding was de stimulatie-index bij bloedlymfocyten voor behandelde dieren 8 tegen 1,5 voor de onbehandelde dieren.

Bij de miltcellen zijn de stimulatie-indices van de verbrande, onbehandelde dieren alle duidelijk lager dan 1. Toediening van silibinine leidt tot een significante verbetering op alle onderzoeksdagen die maximaal is op de zevende dag na de verbranding.

45 Verder werden nog vergelijkingsproeven uitgevoerd waaruit bleek dat Sili-suc-na alleen bij gezonde dieren geen significante veranderingen in de stimuleerbaarheid bij door PHA-geïnduceerde blastogenese van T-lymfocyten uit de milt en uit perifeer bloed geeft.

Silibinine stimuleert dus de blastogenese van lymfocyten bij verbrande dieren significant.

Verder werd vastgesteld dat de algehele katabolie van de met de silibininederivaten behandelde dieren 50 minder was omdat het gewicht van de dieren na de verbranding snel toenam.

Paddestoelvergiftiging

Van alle vergiftigingen waarmee de medicus te maken krijgt, is die door de amaniet wel de ergste. Hoewel vergiftiging door de groene amaniet slechts 10-30% van alle paddestoelvergiftigingen vomit, bestaat er in 55 medische kringen grote belangstelling voor omdat hij zo gevaarlijk is.

Volgens oudere publicaties bedraagt de lethaliteit 30-50%. Dank zij de moderne medische wetenschap is na een groepsonderzoek van Floersheim et al. bij 205 patiënten, de lethaliteit met gemiddeld 22,4% verminderd.

Het gif uit de amaniet, amanitine, kan ai in een dosis van 7 mg voor volwassenen dodelijk zijn. Deze hoeveelheid gif kan uit ongeveer 50 g van een verse amaniet worden gewonnen.

Na een aantal succesvolle dierproeven weid Sili-suc-na getest op zijn wertdng tegen amanietvergiftiging 5 bij mensen.

28 Patiënten met amanietvergiftiging werden behalve met de gebruikelijke therapieën ook nog met Sili-suc-na behandeld. Daaivan stierf er slechts één, maar dat was omdat deze patiënt wel erg veel amanietgif had ingenomen met het oog op autoeuthanasie. Dit resultaat betekent een grote therapeutische vooruitgang op dit gebied.

10

Bereiding van isosilybinevrij silibinine

Een suspensie van 500 g product volgens DE-AS 1.923.082 kolom 8, regels 14-19 met een silymarinege-halte van ongeveer 70% bij een isomerenverhouding silybine/silidianine/silicristine van ongeveer 3:1:1, waarbij het silybine ongeveer 1/3 isosilybine bevat, en 2 kg methanol (2,53 liter) wordt 15 minuten onder 15 roeren gekookt. Uit de gevormde oplossing kan daarna al een weinig silibinine precipiteren. Aansluitend wordt onder vacuüm 0,75-1,25 kg (0,96-1,58 liter) methanol afgezogen waarna men het residu 10-28 dagen bij omgevingstemperatuur laat staan. Het geprecipiteerde silibinine wordt gefiltreerd en twee keer met telkens 50 ml koude methanol nagewassen. Na drogen bij 40°C in vacuo wordt het geïsoleerde, ruwe silibinine als volgt verder gezuiverd: 20 60g Ruw silibinine wordt in 3 liter technisch ethylacetaat onder veiwarmen opgelost. Aansluitend wordt 20 g geactiveerde kool toegevoegd waarna nog 2 uren onder terugvloeikoeling wordt geroerd. Na afloop wordt opgehelderd door filtreren waarna de oplossing bij 50°C onder verminderde druk wordt geconcentreerd tot ongeveer 250 ml. Het concentraat wordt 15 minuten met een Ultra-Turraxapparaat geroerd onder toevoegen van 25 ml methanol. Aansluitend laat men het mengsel een nacht bij omgevingstemperatuur 25 overstaan. Alvorens het geprecipiteerde silybine onder afzuiging te filtreren wordt nogmaals 5 minuten wederom met een Ultra-Turraxapparaat opgeroerd. Het afgezogen neerslag wordt twee keer met 50 ml ethylacetaat nagewassen en in een vacuümdroogkast ’s nachts bij 40°C gedroogd. Aansluitend wordt het product gemalen en onder dezelfde omstandigheden 48 uren nagedroogd.

30 Voorbeeld 1

Bereiding van silibinine-C-2-',3-diwaterstofsuccinaat (formule 5) 50g Silibinine wordt bij 45°C opgelost in 70 ml pyridine. Aan de oplossing wordt 50 g bamsteenzuuranhy-dride toegevoegd waarna het mengsel ongeveer 8 uren bij 45°C wordt geroerd. Hierna wordt 30 ml ethanol toegevoegd en wordt het roeren voortgezet totdat zich een homogeen mengsel heeft gevormd. Aansluitend 35 wordt onder krachtig roeren 60 ml water in 30 minuten toegevoegd om fenylesters te verzepen. Na 1 uur roeren bij 30°C zijn de fenylesters blijkens hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) kwantitatief gehydroly-seerd. De hydrolyse wordt beëindigd door snel 1,7 liter ethylacetaat aan het reactiemengsel toe te voegen.

Om overmaat bamsteenzuur en pyridine af te scheiden wordt het met ethylacetaat verdunde reactiemengsel twee keer in tegenstroom geëxtraheerd met telkens 5 liter water dat met ethylacetaat is verzadigd 40 en een pH 1,85 heeft (ingesteld met verdund zoutzuur). Daarbij wordt het met ethylacetaat verzadigde, aangezuurde waswater met een pomp in tegenstroom met de verdunde reactieoplossing rondgevoerd en wordt aansluitend de pH met verdund zoutzuur net zolang op 1,85 gehouden totdat deze pH na de ethylacetaatpassage constant blijft.

Aansluitend wordt om overmaat zoutzuur uit te wassen, de ethylacetaatfase twee keer in tegenstroom 45 geextraheeid met telkens 3,4 liter water dat met ethylacetaat is verzadigd. Zodra de pH van het waswater hoger dan 4,5 is geworden, wordt de organische fase kwantitatief afgescheiden, bij 40-50°C in vacuo geconcentreerd tot 1/12 van het beginvolume (2 liter) en met 125 ml ethanol verdund.

De titelverbinding wordt verkregen door opnieuw oplossen in en precipiteren uit ethanol/water en 15 uren drogen bij 50°C in vacuo.

50 Om een monster voor elementair analyse te verkrijgen wordt de titelverbinding drie keer opgelost in en geprecipiteerd uit ethanol/water en daarna 15 uren bij 50°C in vacuo gedroogd.

Het FD-massaspectrum vertoont de moleculepiek bij het verwachte moleculairgewicht van 682.

Het IR-spectrum vertoont in het gebied van de CO-valentiefrequentie twee overlappende banden, waarvan de een, net zoals bij silibinine, aan de carbonylfunctie in de pyronring bij een golflengte 1635 cm'1 55 toegeschreven kan worden. De andere band ligt bij een golflengte 1730 cm'1 en komt voort uit de beide estercarbonylfuncties.

Dat een tweevoudige verstering heeft plaats gevonden, wordt bevestigd door het 1H-NMR spectrum. Zo

Claims (8)

10 Gev.: 58,05 4,57 37,31 Voorbeeld 2 Bereiding van het dinatriumzout van silibinine-C-2',3-diwaterstof$uccinaat (formule 6) Aan de in voorbeeld 1 gevormde ethanolische oplossing wordt onder roeren en uitwendig koelen bij -5 tot 15 9°C een 6%’ige ethanolische natriumhydroxideoplossing toegedruppeld in een voldoende hoeveelheid om het bepaalde gehalte vaste stof in de ethanolische oplossing te suspenderen. De suspensie wordt nog 1 uur bij omgevingstemperatuur geroerd waarna de geprecipiteerde, beige vaste stof wordt afgezogen. Deze wordt twee keer telkens 5-10 minuten met een Turrax in 150 ml ethanol gesuspenseerd en opnieuw afgezogen. Om achtergebleven ethylacetaat te verwijderen wordt het product aansluitend 14 uren in 280 ml 20 ethanol bij omgevingstemperatuur geroerd waarna de suspensie opnieuw wordt afgezogen, het residu met 70 ml ethanol wordt gewassen en 15 uren bij 40-45°C wordt gedroogd in een vacuümdroogkast. Aansluitend wordt het voorgedroogde product verkleind, gezeefd op een deeltjesgrootte kleiner dan 0,2 mm en nog 48 uren gedroogd bij 40-45°C in vacuo. Aldus wordt 52 g titelverbinding (69% opbrengst) verkregen. De titelverbinding heeft geen scherp smeltpunt en begint bij ongeveer 80°C te sinteren om bij ongeveer 25 100°C te smelten onder blaasjesvorming. UV-spectrum in methanol: = 288 nm, E = 1,73.104. Het moleculairgewicht van de titelverbinding bedraagt 726,56. De verbinding is een lichtbeige, micro-kristallijn poeder zonder specifieke geur en smaakt zoutachtig. De titelverbinding is makkelijk oplosbaar in water, moeilijk oplosbaar in ethanol en praktisch onoplosbaar 30 in aceton, ether en chloroform. Voorbeeld 3 Bereiding van lyofylisaten voor i.v. toediening Dinatriumzout van silibinine-C-2',3-diwaterstof-succinaat 75,0 mg 35 Manniet 10,0 mg Water voor injectie ad 1,5 ml Spitse ampullen van 5 ml inhoud worden met 1,5 ml oplossing afgevuld en daarna op bekende wijze gevriesdroogd. Om de ampullen met het gerede lyofylisaat te bewaren, worden zij op gebruikelijke wijze gesloten. 40 Voor toepassing wordt het lyofylisaat in 5 ml steriele, fysiologische natriumchlorideoplossing opgelost tot helder. 45

1. Silibininederivaten, voorgesteld door formule 1 van het formuleblad, waarin Alk., en All^, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een alkyleengroep met 1-4 koolstofatomen of een alkenyleengroep met 2-4 koolstofatomen voorstellen, M1 en M2, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een waterstofatoom of een alkalimetaalatoom voorstellen, en n en m, die gelijk of verschillend kunnen zijn, 0 of 1 zijn, met het kenmerk, 50 dat de silibininederivaten vrij zijn van isosilybine of derivaten daarvan en zich in zuivere vorm bevinden.

2. Silibininederivaten volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat Alk., en All^ een alkyleengroep met 2 koolstofatomen voorstellen, M1 en M2, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een alkalimetaalatoom voorstellen, en n en m, die gelijk of verschillend kunnen zijn, 0 of 1 zijn.

3. Silibininederivaten volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat Alk1 en All^, M, en M2, en n en m in de 55 formule 1 dezelfde betekenissen hebben.

4. Dinatriumzout van isosilybine vrij silibinine-C-2',3-diwaterstofsuccinaat met de formule 6 van het formuleblad.

5. Werkwijze voor het bereiden van zuivere silibininederivaten volgens één der conclusies 1 tot en met 4, waarbij 1 gewichtsdeel silibinine volgens formule 3 van het formuleblad wordt opgelost in pyridine; onder roeren wordt omgezet met 1-3 gewichtsdelen dicarbonzuuranhydride met formule 2 van het formuleblad, waarin Alk de in conclusie 1 aangegeven betekenis voor Al^ of Alk2 heeft; ethanol wordt toegevoegd totdat 5 zich een homogeen mengsel heeft gevormd; het veikregen product wordt gewassen met water dat met ethylacetaat is verzadigd en dat zuur reageert; het gewassen product dat zich in de ethylacetaatfase bevindt in ethanol wordt opgenomen en met een alcoholisch alkalimetaalhydroxide-oplossing tot het zout van het vrije carbonzuur wordt omgezet, met het kenmerk, dat aan het homogene mengsel onder intensief roeren langzaam water wordt toegevoegd om aromatische estergroepen te hydrolyseren, na voltooiing van de 10 hydrolyse met ethylacetaat wordt verdund, en alvorens het gewassen product in ethanol wordt opgenomen de ethylacetaatfase wordt geconcentreerd.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de reactie met het dicaibonzuuranhydride wordt uitgevoerd bij een temperatuur van 40-50°C.

7. Werkwijze volgens conclusie 5 of 6, met het kenmerk, dat het zuur-reagerende en met ethylacetaat 15 verzadigde waswater op een pH van ongeveer 1,5-2,4 wordt gehouden.

8. Farmaceutisch preparaat geschikt als levertherapeuticum, met het kenmerk, dat het preparaat ten minste een veifoinding bevat volgens één der conclusies 1 tot en met 4, samen met een farmaceutisch aanvaardbare drager of hulpstof. Hierbij 3 bladen tekening