AT393268B - Verfahren zur herstellung neuer flavolignanderivate - Google Patents

Description

AT 393 268 B

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Flavolignanderivate.

Die Mariendistel - Silybum marianum (L.) Gaertn. (Carduus marianus L.) - ist eine seit dem Altertum bekannte Heilpflanze. Von den in den Früchten dieser Pflanze vorkommenden Flavolignanen wurde eine Komponente, Silybin, von R. Münster isoliert, vgl. Dissertation R. Münster, München, 1966. Die chemische Struktur dieser Verbindung wurde von A. Pelter und R. Hansel, vgl. Tetrahedron Letters, London, Band 25, Seiten 2911-2916 (1968), aufgeklärt.

Es ist bekannt, daß Silybin, früher auch Silymarin I genannt, ein wertvolles Lebertherapeutikum ist, vgl. DE-AS 17 67 666. Ein technisches Verfahren zur Herstellung von Silybin (Silymarin 1) ist z. B. in der DE-AS 19 23 082 beschrieben.

Bereits 1974 hatten H. Wagner, P. Diesel und M. Seitz, Aizneimittelforschung, Band 24 (4), Seiten 466-471, in bezug auf Silybin zwei Stellungsisomere vermutet, nämlich Silybin und Isosilybin. Diese Vermutung wurde von A. Amone, L. Merlini und A. Zanarotti, Journal Chemical Society Chem. comm., 1979, Band 16, Seiten 696/97, präzisiert und experimentell bestätigt. Demnach besteht das bekannte Silybin aus zwei verschiedenen Verbindungen, nämlich den Verbindungen der nachstehenden Strukturformeln A und B:

(B) Isosilybin -2-

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Aus diesen Strukturformeln ist »sichtlich, daß es sich bei diesen Verbindungen um Stellungsisomere handelt. Die Verbindung der Formel (A) hat neuerdings die international normierte Bezeichnung Silibinin. Diese Bezeichnung wird von jetzt ab in der vorliegenden Anmeldung für die Verbindung der Formel (A) verwendet.

Der therapeutischen Verwendung von Silybin bereitete die Tatsache Schwierigkeit, daß Silybin in Wasser praktisch nicht löslich ist, so daß silybinhalüge Injektionslösungen oder Präparate, bei denen eine gewisse Wasserlöslichkeit erforderlich ist, nicht herstellbar waren. Die DE-PS1963 318 beschreibt zwar Silybinderivate, die eine gewisse Wasserlöslichkeit besitzen, es handelt sich dabei jedoch um ein sehr komplexes Gemisch von Haibestem der Bemsteinsäure. Dieses Gemisch ist deswegen so komplex, weil im Silybin fünf veresterbare Hydroxylgruppen vorliegen, das Silybin außerdem die beiden oben bezeichneten Stellungsisomeren enthält und die zur Veresterung verwendete Bemsteinsäure eine Dicarbonsäure ist, die sowohl Mono- als auch Diester bilden kann. Für pharmazeutische Zwecke ist ein Produkt, das aus einer nicht überschaubaren Zahl verschiedenster, ungeklärter Verbindungen besteht, nicht brauchbar.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, für pharmazeutische Zwecke geeignete wasserlösliche Silibininderivate bereitzustellen, die als chemische Individuen genau charakterisiert sind.

Es wurde nun gefunden, daß Silibininderivate bestimmter Alkan- und Alkylendicarbonsäurcn diese Anforderungen erfüllen.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Silibininderivaten der allgemeinen Formel I

n 0) worin n + m jeweils unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen,

Alk jeweils einen Alkylenrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder einen Alkenylenrest mit 2-4 Kohlenstoffatomen bedeutet und und jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetallatom bedeuten.

Bevorzugt ist die Herstellung von Verbindungen der Formel (I), bei denen n und m jeweils unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, Alk jeweils einen Alkylenrest mit 2 Kohlenstoffatomen bedeutet und und M2 jeweils unabhängig voneinander ein Alkalimetallatom bedeuten. Vorzugsweise haben n und m sowie Mj und M2 jeweils gleiche Bedeutungen.

Besonders bevorzugt ist Silibinin-C-2',3-dihydrogensuccinat, Dinatriumsalz.

Bei den erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen sind die nicht an einen Benzolkem gebundenen OH-Gruppen des Silibinins teilweise oder vollständig verestert, beispielsweise durch Oxalsäure, Malonsäure, Bemsteinsäure, Adipinsäure, Maleinsäure oder Fumarsäure. Vorzugsweise sind die beiden nicht aromatisch gebunden»! OH-Gruppen des Silibinins durch eine der genannten Carbonsäuren einfach verestert. -3-

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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der beanspruchten Silibininderivate ist dadurch gekennzeichnet, daß man etwa 1 Masseteil Silibinin der Formel (A):

in 1 bis 2 Masseteilen Pyridin löst und mit 1 bis 3 Masseteilen eines Dicarbonsäureanhydrids der allgemeinen Formel 25 worin "Alk“ für einen der oben definierten Reste steht, unter Rühren umsetzt, dann Ethanol zusetzt, bis sich eine homogene Mischung gebildet hat, anschließend unter intensivem Rühren langsam mit Wasser versetzt, wobei vorhandene Ester der aromatisch gebundenen OH-Gruppen hydrolisiert werden, sobald diese Hydrolyse vollständig ist, mit Ethylacetat verdünnt, mit ethylacetatgesättigtem saurem Wasser wäscht, die Ethylacetatphase einengt, in Ethanol aufnimmt und mit einer alkoholischen Alkalihydroxidlösung in das Salz des freien, nicht veresterten 4q Carbonsäurerestes überführt.

Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung mit dem Dicarbonsäureanhydrid bei 40 bis 50 °C. Vorteilhaft wird der pH des ethylacetatgesättigten sauren Waschwassers bei etwa 1,5 bis 2,4 gehalten.

Bei diesem neuen Verfahren wird nicht, wie gemäß DE-PS 1 963 318, ein sehr komplexes Gemisch von Haibestem der Bemsteinsäure, beispielsweise eine Mischung der Natriumsalze von allen möglichen verschiedenen Silybinsuccinaten, erhalten oder wie gemäß Beispiel 1 dieser PS beispielsweise ein Gemisch aus der einbasischen und der zweibasischen Bemsteinsäurehalbestersäure. Vielmehr hat sich unerwarteterweise gezeigt, daß man mit dem bekannten, unspezifisch arbeitenden Verfahren bei Einsatz eines reinen Ausgangsproduktes reine, ganz gezielt substituierte Produkte «halten kann.

Das Silibinin-Grundgerüst trägt drei phenolische und zwei alkoholische Hydroxylgruppen. Um z. B. die reine 50 Verbindung Silibinin-C-2',3-dihydrogensuccmat-Dinatriurnsalz hersteilen zu können - erstmalig als Monosubstanz mit der richtigen Substitution wie oben und in den folgenden Beispielen angegeben hergestellt - wird erfindungsgemäß zunächst eine Veresterung aller Hydroxylgruppen des Silibinins vorgenommen. Dann werden - ebenfalls gezielt - die vorhandenen Ester der aromatisch gebundenen Hydroxylgruppen hydrolysiert, wodurch zweierlei erreicht wird; 55 a) Bei der vollständigen Veresterung mit einer Dicarbonsäure-Verbindung kommt bei den erfindungsgemäßen

Reaktionsbedingungen jeweils eine Monosubstitution bzw. Monoveresterung der Dicarbonsäure-Verbindung zustande. -4-

AT 393 268 B b) Die spezifische Hydrolyse der Ester der aromatisch gebundenen Hydroxylgruppen durch eine besonders einfache Verfahrensmaßnahme erlaubt die Bildung einer reinen Monosubstanz, nämlich eines Diesters an den zwei alkoholischen Hydroxylgruppen von Silibinin.

Es ist festzuhalten, daß bisher nie reines Silibinin hergestellt wurde. Das bisher bekannte Silybin bestand, wie 5 oben erwähnt, aus den zwei Verbindungen Silibinin und Isosilybin, und es wurde für jede Weiterbearbeitung tatsächlich immer diese Mischung von Silibinin und Isosilybin eingesetzt, wenn von "Silybin" die Rede war. Reines isosilybinfreies Silibinin konnte erstmals erst nach einem eigenen unter Schutz gestellten Verfahren erhalten werden, und solches wird im gegenständlichen Verfahren eingesetzt Die Monosubstanzen, nämlich Silibinindiester an den zwei alkoholischen Hydroxylgruppen des Silibinins mit Dicarbonsänreverbindungen, als Ester monosubstituiert, 10 und deren Herstellungsverfahren ist hiererstmaligbeschrieben. Nichtzuletzt sind die überlegenen pharmakologischen

Eigenschaften der neuen reinen Verbindungen eineFolge davon, daß sie eben nicht so wiedie Substanzen des S tandes der Technik unübersichtliche Multimischungen aus folgenden Faktoren waren: - Die Zahl der veresterten Hydroxylgruppen von Silibinin konnte zwischen 1 und S liegen. 15 - Es lagen verschiedene Arten der Veresterung an Silibinin, je nach Hydroxylgruppenarten, vor. a) aromatisch gebunden und/oder b) Hydroxylgruppen mit reinem Alkoholcharakter. - Es erfolgte Mono- oder Diveresterung mit den Dicarbonsäureverbindungen. - Silybin lag immer als Mischung von Silibinin undlsosylibin vor, mit der Folge, daß Veresterungen mit beiden 20 Verbindungen wiederum Mischungen in einer Vielzahl von mathematischen Kombinationen mit einer unübersehbaren Zahl von Komponenten ergäben.

Die wie oben beschrieben erhältlichen Verbindungen, insbesondere Silibinin-C-2'3-dihydrogensuccinat-Dinatriumsalz, zeigen überraschenderweise eine ausgeprägte pharmakologische Wirkung bei der Behandlung von 25 Verbrennungsschäden. Außerdem behalten sie trotz der beschriebenen Derivatisierung die volle pharmakologische

Wirksamkeit des bekannten Silybins als Lebertherapeutikum bei. Sie sind besonders geeignet zur Behandlung von Leberzirrhose und toxisch-metabolischen Leberschäden. Überraschenderweise erwiesen sich die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen auch als außerordentlich wirksam bei der Behandlung von Pilzvergiftungen, insbesondere der sehr gefährlichen Vergiftung durch Knollen-30 blätterpilze (Amanita phalloides). Auch Vergiftungen durch halogenierte organische Lösungsmittel wie Tetrachlorkohlenstoff, Trichloräthylen, Chloroform etc. können damit überraschend gut behandelt werden. Bei der vorbeugenden Anwendung verhindern die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen die oben geschilderten Schädigungen.

Es können Arzneimittel hergestellt werden, die diese Verbindungen enthalten. Sie werden meist systemisch 35 angewandt, z. B. in Form von Pillen, Kapseln, Lösungen, in üblichen Trägem und gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfsstoffen. Die Tagesdosis für einen erwachsenen Menschen beträgt etwa 50 - 500 mg, je nach Zustand des Patienten und der Schwere der Krankheitssymptome.

Versuche mit Silibinin-C-2’.3-dihvdrogensuccinat. Dinatriumsalz fSili-suc-na). hergestellt gemäß nachfoleen-40 dem Beispiel 2:

Die bei Verbrennungen auf tretenden Symptome werden insbesondere durch eine Intoxikation durch Produkte der thermischen Gewebsnekrose hervorgerufen. Der Nachweis, daß autointoxikative Prozesse nach schweren Hautverbrennungen dafür verantwortlich sind, ist in vielfältiger Weise geführt worden. Besonders überzeugend sind Kreuz transplan tationen verbrannter und unverbrannter Haut auf gesunde bzw. verbrannte Empfängertiere, wobei 45 sich zeigt, daß die unverbrannten Empfänger verbrannter Haut zugrunde gehen, während verbrannte Empfänger gesunder Haut keine schädigenden Wirkungen erkennen lassen, siehe K. H. Schmidt et al. "Neuere Aspekte zur Autointoxikation nach schweren Verbrennungen"; "Die Verbrennungskrankheit" (F. W. Ahnefeld et al., eds. L), Springer, Berlin 1982, Seiten 45-52.

Bei Hautverbrennungen kommt es zur Freisetzung oder Neuentstehung einer Vielzahl chemischer Verbindun-50 gen. Trotz deren Vielzahl gelang es, die Struktur einiger dieser Verbindungen aufzuklären.

Eskonnte unter anderem gezeigtwerden, daß diebei Hautverbrennungen entstehendenVerbindungenÄhnlichkeit mit solchen Verbindungen besitzen, die bei der Lipidperoxidation entstehen. Es bestehen auch Analogien hinsichtlich der toxischen Wirkungen dieser Substanzen. Besonders eindrucksvoll ist die Entstehung toxisch wirkender gesättigter und ungesättigter Aldehyde verschiedener Kettenlänge als Folge der Lipidperoxidation (Benedetti et al., 55 Identification of 4-hydroxynonenal as a cytotoxic product originating from the peroxidation of liver microsomal lipids, Biochim. Biophys. Acta620,281-296, (1980) und der thermischen Gewebeschädigung (K. H. Schmidt et al., Studies on the structure and biological effects of pyrotoxins purified from bumed skin, World J. Surg. 3,361-365, -5-

AT393268B 1979). Es wird daher angenommen, daß Verbrennungen zu einer oxidativen Schädigung von Zellstrukturen führen.

Es wurden daher autooxidative Veränderungen an Membranlipiden als Folge einer Autointoxikation nach schweren Verbrennungen untersucht. Es wurden insbesondere Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung der Membranlipide untersucht Ferner wurde getestet, inwieweit die erfindungsgemäßen Silibininderivate die 5 Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung der Membranlipide beeinflussen.

Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung von Membranlipiden nach schweren Verbrennungen Männliche Wistar-Ratten mit einem durchschnittlichen Gewicht von 360 g wurden in Dreiergruppen bei freiem Zugang zu Wasser und Trockennahrung gehalten. Bis zum Versuchsbeginn betrug die Raumtemperatur 22 °C, nach 10 Versuchsbeginn wurden die Tiere bei 30 °C gehalten.

Die Hautverbrennungen wurden mit einem Kupferstempel von 20 cm2 Räche bei konstantem Druck und einer Temperatur von 250 °C gesetzt Um eine thermische Schädigung tieferliegender Organe auszuschließen, wurde die Haut über einen luftgekühlten Hohlspatel gezogen. Mit diesem Tiermodell können sehr exakte Verbrennungstraumen gesetzt werden, die konstante Überlebensraten liefern. 15 Vor Versuchsbeginn erhielten die Tiere eine Narkose mit 50 mg/kg Nembutal. Nach der Veibrennung wurden zur Schockprophylaxe 20 ml Ringer-Lactat Lösung i. p. injiziert

Es wurden 5 Versuchsgruppen gebildet: a) Normalgruppe: völlig unversehrte Tiere 20 b) Kontrollgruppe I: Nur Silibinin-Behandlung über 6 Tage mit 75,5 mg Sili-suc-na. c) Kontrollgruppe Π: Scheinoperierte Tiere d) Gruppe mit verbrannten Tieren: 25 %, 250 °C, 20 sec, 0,5 at e) Testgruppe: Tiere, denen 75,5 mg Sili-suc-na i. p. über 6 Tage, beginnend einen Tag vor der Verbrennung, verabreicht wurde 25

Zur Isolierung der Mikrosomen wurden die Tiere nach Ende des Versuchszeitraums in Narkose entblutet Anschließend wurde die Leber entnommen, gewogen und sofort in eiskaltes Isolierungsmedium überführt (0,25 m Saccharose, 1 mM EDTA10 mMol Tris. HG, pH 7,2). Die Leber wurde zerschnitten und im Medium homogenisiert DurchDifferentialzentrifugationwurdedieMikrosomenfraktionpelettierL Die Mikrosomen wurden 30 resuspendiert und erneut zentrifugiert Anschließend wurde eine Suspension hergestellt bei der 1 ml Suspension 1 g Lebergewebe entsprach.

Die Lipide wurden nach der Methode von J. Folch (A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, J. biol. Giern. 226,497-508 (1957)), Modifikation von Bligh und Dyer (A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol. 37,911-917 (1959)) bestimmt 35 Die extrahierten Mikrosomenlipide wurden mitNatronlauge verseift Die freien Fettsäuren wurden durchZugabe von BFj-Methanol verestert Nach Abdampfen des Methanols und Entfernen hydrophiler Nebenprodukte wurden die Fettsäureester quantitativ bestimmt.

Bei den unverbrannten Tiergruppen konnte keine nennenswerte Veränderung der Fettsäuremuster festgestellt werden. Die Narkose und der geringfügige operative Eingriff führen somit nicht zu einer Veränderung der 40 mikrosomalen Lipide. Aus diesem Grunde wurden für die weiteren Vergleiche die Normalgruppe und die Kontrollgruppe zu einer Kontrollgruppe zusammengefaßt.

Ein Vergleich der unverbrannten und der verbrannten Tiere hinsichtlich ihres mikrosomalen Fettsäuremusters zeigte gravierende Verschiebungen von ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren.

Figur 1 zeigt die Fettsäureverteilung in den mikrosomalenLeberlipiden und die durch thermische Hautschädigung 45 verursachten Veränderungen. Der Anteil von Palmitinsäure (C16) steigt nach Verbrennung von 25,1 auf 34,4 % der

Gesamtfettsäuren. Bei der Stearinsäure (C18) liegt der Anteil bei den verbrannten Tieren mit 46,3 % um 13,2 % über dem mit den Kontrolltieren erhaltenen Wert Bei der Ölsäure (08:1) ist ein leichter, nicht signifikanter Abfall nachweisbar. Der Anteil der Linolsäure (08:2) ging nach Verbrennung auf ca. 1/3 des Ausgangswertes zurück. Bei der Arachidonsäure (C20:4) schließlich fanden sich nach Verbrennung nur noch 31 % des Ausgangsgehalts. 50 Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt den Einfluß von Sili-suc-na auf die Fettsäureanteile der verbrannten und unverbrannten Tiere. -6- 55

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Tafelte 1

Fettsäuremuster der mikrosomalen Lipide der Rattenleber nach Sili-suc-na-Therapie bei 5 verbrannten und unverbrannten Tieren. C16 C18 C18:l C18:2 C20:4 UNVERBRANNT 29.8% 37.2% 8.9% 9.6% 16.2% (Kontrollgruppe I) ±6.2 ±12.3 ±1.1 ±3.3 ±4.9 VERBRANNT 25.4 % 37.5% 7.8% 11.4% 18.0% ±6.0 ±8.6 ±1.0 ±5.3 ±9.1

Es zeigt sich, daß die erfindungsgemäße Behandlung mit einem Silibininderivat bei den unverbrannten 20 Kontrolltieren keine wesentlichen Veränderungen im Vergleich zu den unbehandelten Tieren verursacht. Bei den verbrannten Tieren führt die Therapie zu einer völligen Aufhebung des Verlustes an ungesättigten Fettsäuren.

Zusammenfassend kann folgendes festgestellt werden: Verbrennungen führen zu Veränderungen im Fettsäuremuster mikrosomaler Lipide. Es wird angenommen, daß dies auf eine oxidative Schädigung der Membranen zurückzuführen ist Dies zeigt sich insbesondere in der starken Abnahme der mehrfach ungsättigten Fettsäuren. 25 Die erfindungsgemäß verwendeten Silibininderivate sind nun in der Lage, oxidative Zellschädigungen zu inhibieren. Sie sind daher besonders geeignet oxidative Schädigungsmechanismen nach schweren Verbrennungen zu durchbrechen.

Wiebereits geschildert, nimmt man an, daß autotoxischeReaktionen nach schweren Verbrennungen insbesondere zu oxidativen Zellschädigungen führen. Es wurde daher untersucht welche Auswirkungen eine standardisiertes 30 thermisches Trauma auf die PHA-induzierte Blastogenese von T-Lymphocyten ans der Milz und dem peripheren Blut von Ratten besitzt Es wurde ferner untersucht wie die erfindungsgemäß ersetzbaren Silibininderivate derartige lymphocytäre Funktionsstörungen nach schweren Verbrennungen beeinflussen. 35 40 45 50

Wirkung eines standardisierten thermischen Traumas auf die PHA-induzierte Blastogenese von T-Lvmphocvten aus der Milz und dem peripheren Blut von Ratten

Wie zuvor beschrieben, wurde die Rückenhaut von Wistar-Ratten mit einem Kupferstempel verbrannt Als Kontrollgruppe dienten scheinverbrannte Tiere, denen alle operativen Manipulationen ohne Verbrennungen durchgeführt wurden. Nach 2,4,7 und 9 Tagen wurden den verbrannten bzw. den Kontrolltieren in Ethemarkose Blut und Milz entnommen.

HeparinisiertesBlutwurdezur Isolierung derLymphocytenaufFicoll-Hypaque-Lösung(Dichte 1,077) geschichtet Anschließend wurde zentrifugiert und die erhaltenen Lymphocyten mit Trypan-Blau auf ihre Vitalität getestet Zur Isolierung der Milzlymphocyten wurde das Organ zerkleinert durch ein Sieb passiert und durch Lyse-Lösung nach Gay von den begleitenden Erythrocyten befreit

Anschließend wurde die Zellmischung in einem Gefäß in Gegenwart von 5 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum 30 Minuten inkubiert um den Anteil mononukleärer Zellen in dar Suspension durch Adhäsion an die Gefäßwand zuverringern (5 %). Zur Kultivierung wurden die Zellen in "flat-bottom" Mikrotiterplatteneingebracht Dann wurde 20 % fötales Kälberserum hinzugefügt Auf diese Weise wurde die spontane Blastogenese durch Messung des Einbaus von 3H-Thymidin-(2Ci/mM) in die DNA der Zellen bestimmt

In Vorversuchen war geklärt worden, daß eine optimale Mitogenstimulation bei einer PHA-Konzentration (Mitogen-Phythaemagglutinin) von 5 μg/ml stattfindet Bei diesen Experimenten zur Optimierung des zellulären Testsystems wurde ferner festgestellt daß die maximale Stimulation der Neusynthese von DNA nach 72 Stunden erfolgt Ferner wurde festgestellt, daß die optimale Konzentration an fötalem Kälbersaum bei 20 % liegt um die höchste Stimulation zu erzielen.

Wie oben beschrieben, wurde die spontane Blastogenese durch Messung des Einbaus von %-Thymidin in die DNA der Zellen bestimmt Die Zellen wurden 18 Stunden nach der Zugabe von 3H-Thymidin geerntet wobei der Null-Punkt für die 18 Stunden mit dem Zeitpunkt der maximalen Stimulation zusammenfällt

Zur Untersuchung der Wirkung der erfindungsgemäß verwendeten Silibininderivate wurde eine Gruppe von -7- 55

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Ratten mit einem Silibininderivat behandelt Dazu wurden 75,5 mg Sili-suc-na einmal pro Tag intraperitoneal injiziert Diese Therapie wurde vom Verbrennungstag bis zum Tag der Organentnahme (maximal bis zum 9. Tag) durchgeführt

Zur Auswertung der bei den KontroOtieren und den unverbrannten Tieren und den mit Sili-suc-na behandelten 5 Tieren erhaltenen Ergebnisse wurde der Stimulationsindex berechnet Dieser Zahlenwert stellt den Quotienten aus dem Mittelwert der stimulierten Probe und dem Mittelwert dar Kontrollprobe dar. Aus dem so erhaltenen Stimulationsindex bei jedem Versuchstier wurde ein mittlerer Stimulationsindex pro Tiergruppe berechnet Die erhaltenen Ergebnisse sind durch diesen Index SI ausgedrückt

Figur 2 zeigt den Einfluß des verwendeten Sili-suc-na auf die Blastogenese von Lymphocyten. Bei den 10 verbrannten Tieren wurde die reduzierte Stimulierbarkeit der Zellen durch Silibinin deutlich erhöht

Bereits am 2. Tag zeigte sich bei den mit Sili-suc-na behandelten Tieren eine etwa 10 mal höhere Responsivität der Blutlymphocyten gegen PHA. Am 4. posttraumatischen Tag betrag der Wert für den Stimulationsindex bei Blutlymphocytenfiir behandelteTiere 8, währendderentsprechende Wert beiden unbehandeltenTieren bei 1,5liegt

Bei den Milzzellen liegen die S timulationsindizes der verbrannten, unbehandelten Tiere alle deutlich unter 1. Die 15 Verabreichung von Silibinin fuhrt zu einer signifikanten Besserung an allen untersuchten Tagen, wobei sich am 7. posttraumatischen Tag ein Maximum einstellt

Es wurden auch noch Vergleichsversuche durchgeführt, die zeigten, daß Sili-suc-na alleine bei gesunden Tieren zu keinen signifikanten Veränderungen in der Stimulierbarkeit bei der PHA-induzierten Blastogenese von T-Lymphocyten aus der Milz und aus dem peripheren Blut führt 20 Somit stimuliert das erfindungsgemäß verwendete Silibinin die Blastogenese von Lymphocyten verbrannter

Tiere in signifikanter Weise.

Es wurde ferner festgestellt daß bei den mit Silibininderivaten behandelten Tieren die allgemeine Katabolie geringer war, da die Tiere rasch nach dem thermischen Trauma wieder an Gewicht Zunahmen. 25 Pilzvergiftungen:

Vergiftungen durch den Knollenblätterpilz zählen zu den schwersten, die es in der Medizin gibt Obwohl nur 10 bis 30 % allerPilzvergiftungen durch den grünen Knollenblätterpilz verursacht werden, gilt der Vergiftung mit diesem Pilz aufgrund ihrer Gefährlichkeit seit jeher größtes medizinisches Interesse.

In älteren Veröffentlichungen wurdedieLetalitätmit30 bis 50% angegeben. Dank der modernen Intensivmedizin 30 hat sich nach einer Sammelstudie von FLOERSHEIM et al. an 205 Patienten diese Zahl auf durchschnittlich 22,4 % reduziert

Das Gift des Knollenblätterpilzes, das Amanitin, kann bereits in einer Dosis von 7 mg für einen erwachsenen Menschen tödlich sein. Diese Giftmenge ist in etwa 50 g eines frischen Exemplares enthalten.

Nach einer Reihe erfolgversprechender Tierexperimente wurde der Wirkstoff Sili-suc-na in die Therapie der 35 Knollenblätteipilzveigiftung einbezogen. Es wurden 28 Patienten mit Knollenblätterpilzvergiftungen neben den üblichen Therapiemaßnahmen zusätzlich mit Sili-suc-na behandelt Von diesen 28 Patienten verstarb nur einer, der größere Mengen des Giftpilzes in selbstmörderischer Absicht zu sich genommen hatte. Dieses Ergebnis demonstriert einen enormen therapeutischen Fortschritt auf diesem Gebiet 40 Herstellung von isosilvbinfreiem Silibinin:

Eine Suspension aus 500 g des Produktes, gemäß DE-AS 19 23 082 Spalte 8, Zeilen 14 -19, mit einem Silymaringehalt von ca. 70 % bei einem Isomerenverhältnis Silybin/Silidianin/Silicristin von ~ 3:1:1 -, wobei das Silybinca. 1/3 Isosilybin enthält, und 2 kg Methanol=2,531 erhitzt man unter Rühren 15 Minuten zum Sieden. Aus der so erhaltenen Lösung kann nach dieser Zeit bereits etwas Silibinin ausfallen. Anschließend zieht man im Vakuum 45 0,75 bis l,25kg = 0,96 -1,581 Methanol ab und läßt den Rückstand 10-28 Tage bei Raumtemperatur stehen. Das ausgefallene Silibinin wird filtriert und zweimal mit je 50 ml kaltem Methanol nachgewaschen. Nach Trocknen bei 40 °C im Vakuum wird das isolierte Rohsilibinin wie folgt weitergereinigt: 60 g Rohsilibinin werden in 31 techn. Essigester unter Erhitzen gelöst; anschließend mit20 g Aktivkohle versetzt und weitere 2 Stunden unter Rückflußbedingungen gerührt. Danach wird klarfiltriert und die Lösung bei 50 °C unter 50 vermindertem Druck auf ca. 250 ml eingeengt Das Konzentrat wird 15 min unter Verwendung eines Ultra-Turraxgeräts aufgerührt und unter Rühren mit 25 ml Methanol versetzt Anschließend wird die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Vor dem Abnutschen des dabei ausgefallenen Silybins wird nochmals 5 min ebenfalls mit Hilfe eines Ultra-Turraxgerätes aufgeriihrt. Der abgenutschte Niederschlag wird 2mal mit 50 ml Essigester nachgewaschen und im Väkuumtrockenschrank über Nacht bei 40 °C getrocknet. Anschließend wird das 55 Produkt vermahlen und unter den gleichen Bedingungen 48 Stunden nachgetrocknet. -8-

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Beispiel 1

Herstellung von Silibinin-C-2'.3-dihvdrogensuccinat

C00H 50 g Silibinin löst man bei 45 °C in 70 ml Pyridin, gibt 50 g Bemsteinsäureanhydrid zu, rührt die Mischung ca 8 Stunden bei 45 °C, gibt 30 ml Ethanol zu und rührt, bis sich eine homogene Mischung bildet. Anschließend gibt man unter intensivem Rühren zur Verseifung von Phenylestern innerhalb von ca. 30 Minuten 60 ml Wasser zu. Nach ca 1 Stunde Rühren bei 30 °C sind die Phenylester quantitativ hydrolysiert Die Vollständigkeit der Hydrolyse überprüft man mittels HPLC. Die Hydrolyse stoppt man, indem man 1,71 Essigsäureethylester rasch zu der so e±altenen Reaktionsmischung gibt

Zum Abtrennen von überschüssiger Bemsteinsäure und Pyridin extrahiert man die mit Essigsäureethylester verdünnte Reaktionslösung 2 mal mit je 51 Wasser, das mit Essigsäureethylester gesättigt ist und einen pH 1,85 aufweist(eingestelltmitverdünnterwäßriger Salzsäure),im Gegenstrom.Däbeipumptman das mitEssigsäureethylester gesättigte, angesäuerte Waschwasser im Kreislauf gegen die verdünnteReaktionslösung und hältanschließenddurch Zugabe verdünnter Salzsäure den pH so lange bei 1,85, bis dieser pH-Wert nach der Essigsäureethylesterpassage konstant bleibt

Anschließend exrahiert man die Essigsäureethylesterphase zum Auswaschen überschüssiger Salzsäure zweimal im Gegenstrom mit je 3,41 Wasser, das mit Essigsäureethylester gesättigt ist Sobald der pH-Wert des Waschwassers größer als 4,5 ist trennt man die organische Phase quantitativ ab, engt sie bei 40 - 50 °C im Vakuum auf 1/12 des Ausgangsvolumens (~ 0,21) ein und verdünnt sie mit 125 ml Ethanol.

Die Titelverbindung erhält man durch Umfällen aus Ethanol/Wasser und Trocknen bei 50 °C im Vakuum während 15 Stunden.

Zur Herstellung einer Analysenprobe fällt man die Titelverbindung dreimal aus Ethanol/Wasser um und trocknet anschließend 15 Stunden bei 50 °C im Vakuum.

Im FD-Massenspektrum erscheint der Molekülpeak bei der erwarteten Molmasse von 682.

Das IR-Spektrum zeigt im Bereich da* CO-Valenzfrequenz zwei überlappte Banden, wobei eine, wie das auch beim Silibinin der Fall ist, der Carbonylfunktion des Pyronringes bei der Wellenlänge 1635 cm'1 zuzuordnen ist

Die zweite Bande liegt bei 1730 cm'1 und stammt von den beiden Estercarbonylfunktionen.

Das ^-NMR-Spektrum bestätigt daß eine zweifache Veresterung stattgefunden hat So beträgt das durch Integration ermittelte Verhältnis von aromatischen Protonen zu Methylenprotonen der Bemsteinsäurereste 8:8 (ppm-Bereich 5,9 - 7,1). Das Verhältnis dieser Methylenprotonen (ppm 2,6) zu den Methylprotonen der Methoxygruppe (ppm 3,8) beträgt 8:3 und steht somit im Einklang|damit

Auch die chemischen Verschiebungen bei den13C-Untersuchungen zeigen, daß die Veresterung an den beiden alkoholischen OH-Gruppen erfolgt ist denn die chemischen Verschiebungen ändern sich am stärksten bei Cj j und den anliegenden Kohlenstoftatomen sowie bei - C4.

Elementaranalyse für CjjH^QOjg (682,60) C H O Ber.: 58,07 4,43 37,50 Gef.: 58,05 4,57 3731 -9-

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Beispiel 2

Herstellung von Silibinin-C-2,.3-dihvdrogensuccinat. Dinatriumsalz

“COHa

Zu der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Ethanollösung tropft man unter Rühren und Kühlen von außen bei -5 bis 9 °C eine aufgrund einer Bestimmung des Feststoffgehaltes dieser Lösung ermittelte Menge 6%iger ethanolischer Natronlauge, rührt die Suspension eine weitere Stunde bei Raumtemperatur, saugt den ausgefallenen beigen Feststoff ab, suspendiert ihn zweimal je 5 bis 10 Minuten mit Hilfe eines Turrax in 150 ml Ethanol und saugt erneut ab. Zur Entfernung restlichen Essigsäureethylesters suspendiert man anschließend das Produkt 14 Stunden bei Raumtemperatur in 280 ml Ethanol, saugt erneut ab, wäscht mit 70 ml Ethanol nach und trocknet 15 Stunden bei 40 - 45 °C im Vakuumtrockenschrank. Anschließend vermahlt man das vorgetrocknete Produkt, siebt auf eine Korngröße kleiner als 0,2 mm und trocknet weitere 48 Stunden bei 40 - 45 °C im Vakuum. Man erhält so 52 g der Titelverbindung (69 % Ausbeute).

Die Titelverbindung besitzt keinen scharfen Schmelzpunkt Sie beginnt bei ca. 80 °C zu sintern und schmilzt unter Blasenbildung bei ca. 100 °C.

Das UV-Spektrum in Methanol zeigt = 288 nm, ε = 1,73.10 .

Das Molgewicht der Titelverbindung ist 726,56. Die Verbindung ist ein leicht beiges, mikrokristallines Pulver ohne spezifischen Geruch und mit salzartigem Geschmack. Sie ist in Wasser leicht löslich, in Ethanol schwer löslich und in Aceton, Ether und Chloroform praktisch unlöslich.

Anwendungsbeispiel

Herstellung von Lyophilisaten zur i. v. Verabreichung

Silibinin-C-2',3-dihydrogensuccinat, Dinatriumsalz 75,0 mg

Mannit 10,0 mg

Wasser für Injektionszwecke ad 1,5 ml 1,5 mlLösung werden in Spießampullen von 5 ml Fassungsvermögen abgefüllt und danach inbekannterTechnik gefriergetrocknet DieAmpullemitdemfertigenLyophilisat wird zur Aufbewahrungin üblicherweise verschlossen.

Zur Verwendung wird das Lyophilisat in 5 ml steriler, physiologischer Kochsalzlösung klar gelöst -10-

Claims (3)

1. AT 393 268 B PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Silibininderivaten der allgemeinen Formel I

   ) -COOH, 'η 1 ,0) worin n und m jeweils unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, Alk jeweils einen Alkylenrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Alkylenrest mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet und Mj und M2 jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetallatom bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man 1 Masseteil Silibinin der Formel (A):

   (A) Silibinin -11- AT 393 268 B in 1 bis 2 Masseteilen Pyridin löst und mit 1 bis 3 Masseteilen eines Dicarbonsäureanhydrids der allgemeinen Formel : - AlK - ( \/ 0 worin "Alk" die oben genannten Bedeutungen hat, unter Rühren umsetzt, dann Ethanol zusetzt, bis sich eine homogene Mischung gebildet hat, anschließend unter intensivem Rühren langsam mit Wasser versetzt, wobei vorhandene Ester der aromatisch gebundenen OH-Gruppen hydrolysiert werden, sobald diese Hydrolyse vollständig ist, mit Ethylacetat verdünnt, mit ethylacetatgesättigtem saurem Wasser wäscht, die Ethylacetatphase einengt, mit Ethanol aufnimmt und mit einer alkoholischen Alkalihydroxidlösung in das Salz des freien Carbonsäurerestes überführt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung mit dem Dicarbonsäureanhydrid bei etwa 40 bis 50 °C durchgeführt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das elhylacetatgesättigte saure Waschwasser bei einem pH-Wert von etwa 1,5 bis 2,4 gehalten wird. Hiezu 2 Blatt Zeichnungen -12-