NL8503171A - Flavolignanderivaten, werkwijze voor het bereiden daarvan alsmede deze verbindingen bevattende farmaceutische preparaten. - Google Patents

Description

. -1- V - r

Flavolignanderivaten, werkwijze voor het bereiden daarvan alsmede deze verbindingen bevattende farmaceutische preparaten.

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe flavolignan-derivaten, werkwijzen voor het bereiden daarvan en deze verbindingen bevattende farmaceutische preparaten.

Het is van oudsher bekend dat de mariadistel 5 Silybum marianum Gaertn. (Carduus marianus), geneeskrachtige werking bezit. Door R.Münster is uit de in de vruchten van deze plant aanwezige flavolignanen een component, silybine, geïsoleerd. Zie het proefschrift van R.Münster uit 1966 (München). De chemische struktuur van deze verbinding is 10 door A.Pelter en R.Hansel (Tetrahedron Letters, London, band 25, blz. 2911-2916 (1968)) opgehelderd.

Uit DE-AS 1.767.666 is bekend dat silybine, vroeger ook wel silymarine I genoemd, een waardevol levertherapeuti-cum is. Een werkwijze voor het bereiden van silybine 15 (silymarine I) is onder andere in het DE-AS 1.923.082 be schreven.

In 1974 hebben H.Wagner, P.Diesel en M.Seitz in Arzneimittelforschung, band 24 (4), blz. 466-471 het vermoeden neergelegd dat silybine twee positie-isomeren, te 20 weten silybine en isosilybine, bezit. Dit vermoeden is door A.Amone, L.Merlini en A.Zanarotti (Journal Chemical Society Chem.somm., 1979, vol.16, blz. 696/697) experimenteel bevestigd.

Derhalve bestaat het bekende silybine uit twee ver-25 schillende verbindingen, te weten de verbindingen met de formules 3 en 4. Uit deze formules blijkt dat het om positie-isomeren gaat. De verbinding met de formule 3 heeft onlangs -2- de INN-benamingsilibinine gekregen. De verbinding met de formule 4 kan isosilybine worden genoemd. MetsilibiiiinewDrdt in het vervolg de verbinding met de formule 3 bedoeld.

De therapeutische toepassing van silybine stuit op het 5 praktische bezwaar dat het in water praktisch niet oplost zodat injectieoplossingen of preparaten waarvoor een zekere wateroplosbaarheid nodig is, niet konden worden bereid. In het Duitse octrooischrift 1.963.318 zijn weliswaar silybine-derivaten met een zekere mate van wateroplosbaarheid be-10 schreven, maar daarbij gaat het om zeer complexe mengsels van barnsteenzure halfesters. Dit mengsel is daarom zo complex omdat silybine vijf veresterbare hydroxylgroepen bevat, bovendien samen met isosilybine (formule 4) voorkomt, en barnsteenzuur zowel mono- als diesters kan vormen. Voor 15 farmaceutische toepassingen is een produkt dat uit een onoverzienbaar aantal van de meest uiteenlopende en bovendien onopgehelderde verbindingen bestaat, niet bruikbaar.

Gevonden is dat bepaalde alkaan- en alkyleendicarbon-zuurestersivansilibinine' waarvan de chemische struktuur tot in 20 de details is opgehelderd, water oplosbaar zijn.

Dejiiéuwe silibininederivaten hebben de formule 1 waarin Alk^ en Alk2, die gelijk of verschillend kunnen zijn, elk een alkyleengroep met 1 - 4 koolstofatomen of alkenyleen-groep met 2-4 koolstofatomen voorstellen, 25 M.| en M^, die gelijk of verschillend kunnen zijn, elk een waterstofatoom of alkalimetaalatoom voorstellen, en m en n, onafhankelijk van elkaar, 0 of 1 zijn. Voorkeursverbindingen met de formule 1 zijn die waarin Alk^ en Alk^, die gelijk of verschillend kunnen zijn, 30 elk een alkyleengroep met 2 koolstofatomen en en M2, die gelijk of verschillend kunnen zijn, elk een alkalimetaalatoom voorstellen, en m ên n onafhankelijk van elkaar 0 of 1 zijn.

Bij voorkeur hebben respectievelijk Alk^ en Alkg, M^ en M2 en m en n dezelfde betekenis.

35 Een verbinding met bijzondere voorkeur is het dinatrium- v v -3- zout van silibinine-C-2*, 3-diwatersto£succinaat.

De niet aan de benzeenkern gebonden hydroxygroepen in silibinine zijn bij de derivaten volgens de uitvinding geheel of gedeeltelijk veresterd, bijvoorbeeld door oxaal-5 zuur, malonzuur, barnsteenzuur, adipinezuur, maleïnezuur of fumaarzuur. Bij voorkeur zijn de beide niet-aromatisch gebonden hydroxygroepen in silibinine door een van voornoemde carbonzuren enkelvoudig veresterd.

De werkwijze voor het bereiden van de silibinine-10 derivaten,waarop de uitvinding verder betrekking heeft, heeft het kenmerk dat een oplossing van ongeveer 1 gew.dl silibinine met de formule 3 in pyridine onder roeren tot reaktie wordt gebracht met 1 - 3 gew.dln van een dicarbonzuur-anhydride met de formule 2 waarin Alk de boven voor Alk^ en 15 Alk2 aangegeven betekenis heeft, daarna ethanol wordt toegevoegd totdat zich een homogeen mengsel heeft gevormd, aansluitend onder intensief roeren langzaam water wordt toegevoegd om aromatische estergroepen te hydrolyseren, 20 zodra deze hydrolyse is voltooid, met ethylacetaat wordt verdund, met ethylacetaat verzadigde zuur reagerend water wordt gewassen, de ethylacetaatfase wordt geconcentreerd, en het concentraat in ethanol wordt opgenomen en met een alcoholische alkalimetaalhydroxydeoplossing in het 25 zout van de vrije, niet-veresterde carbonzuurrest wordt omge zet.

De reaktie met het dicarbonzuuranhydride met de formule 4 wordt bij voorkeur uitgevoerd bij 40 - 50°C.

De pH van het zuur reagerend water dat met ethyl-30 acetaat is verzadigd, wordt bij voorkeur op ongeveer 1,5 - 2,4 gehouden.

De verbindingen met de formule 1, in het bijzonder het dinatriunzoutjjvan silibinine-C-2 *, 3-diwaterstof succinaat, vertonen verrassenderwijs uitgesproken farmacologische wer-35 king bij het behandelen van brandwonden. Bovendien hebben i f -4- zij ondanks de derivatisering volgens de uitvinding het volle farmacologische werkingsspectrum van silybine als lever-therapeuticum behouden. Zij zijn in het bijzonder geschikt voor het behandelen van levercirrhose en toxisch-meta-5 bolische leverbeschadigingen.

Onverwacht is ook dat de verbindingen volgens de uitvinding buitengewoon werkzaam zijn bij het behandelen van paddestoelenvergiftiging, in het bijzonder de zeer gevaarlijke vergiftiging door amaniet (Amanita phalloides). Verder 10 was het niet te voorzien dat vergiftiging door gehalogenicer- de organische oplosmiddelen zoals tetrachloorkoolstof, trichloorethyleen, chloroform etc. met de verbindingen volgens de uitvinding verrassend goed behandeld kunnen worden. Behalve genezend werken de verbindingen volgens de uitvinding 15 ook profylactisch tegen voornoemde aandoeningen.

De uitvinding heeft derhalve verder betrekking op farmaceutische preparaten die de verbindingen met de formule 1 als werkzaam bestanddeel bevatten. De preparaten worden meestal systemisch toegepast, bijvoorbeeld als 20 pillen, capsules en oplossingen in gebruikelijke dragers en eventueel samen met gebruikelijke hulpstoffen. Voor volwassenen bedraagt de dosering ongeveer 50-500 mg per dag al naar gelang de toestand van de patiënt de ernst van de symptomen.

25 Farmacologische onderzoekingen met het dinatriumzout van silibinine-C-2T, 3-diwaterstofsuccinaat

De bij verbranding optredende symptomen worden in het bijzonder door intoxicatie door produkten van thermische weefselnecrose veroorzaakt. Het bewijs dat autointoxicatie 30 na zware huidverbranding daarvoor verantwoordelijk is, is op verschillende manieren geleverd. Bijzonder overtuigend zijn de resultaten van kruistransplantaties van verbrande en onverbrande huid op respectievelijk gezonde en verbrande gastheerdieren, waarbij gebleken is dat de onverbrande ont-35 vanger van verbrande huid ten gronde gaat terwijl de ver- *' - 1 * -5- % Λ brande ontvanger van gezonde huid geen enkele schadelijke werking ondervindt (zie K.H.Schmidt et al. , Neuere Aspekte zur Autointoxikation nach schweren Verbrennungen; Die Verbrennungskrankheit (uitgegeven bij F.W.Ahnefeld et al., L), 5 Springer, Berlin 1982, blz. 45-52.

Bij huidverbranding treedt nieuw-vorming van een groot aantal verschillende verbindingen op of komen deze vrij. Ondanks hun grote aantal, is het gelukt enige daarvan op te helderen.

10 Zo kon onder andere worden aangetoond dat bij huid verbranding soortgelijke verbindingen ontstaan als bij lipideperoxydatie. Ook tussen de toxische werkingen bestaan analogieën. Bijzonder treffend is de vorming van toxische verzadigde en onverzadigde aldehyden met verschillende 15 ketenlengte tengevolge van lipideperoxydatie (Benedetti et al., Identification of 4-hydroxynonenal as a cytotoxic product originating from the peroxidation of liver microsomal lipids, Biochim. Biophys. Acta 620, 281-296 (1980)) en tengevolge van thermische weefselbeschadiging (K.H.Schmidt et al., 20 Studies on the structure and biological effects of pyrotoxins purified from burned skin, World J.Surg. _3, 361-365 (1979)). Derhalve wordt aangenomen dat verbranding tot een oxydatieve beschadiging van celstrukturen leidt.

Op grond van het voorgaande werden met het dinatrium-25 zout van silibinine-C-2*, 3-diwaterstofsuccinaat (Sili-suc- na) autooxydatieve veranderingen in membraanlipiden tengevolge van autointoxicatie na zware verbranding onderzocht.

In het bijzonder werden veranderingen in de vetzuursamen-stelling van membraanlipiden onderzocht. Ook werd onderzocht 30 in welke mate het silibininederivaat de veranderingen in de vetzuursamenstelling van membraanlipiden beïnvloedt.

-6-

Veranderingen in de vetzuursamenstelling van membraanlipiden na zware verbranding

Aan mannetjes Wistar-ratten met een gemiddeld gewicht van 360g, verdeeld in drie groepen, werden water en droog 5 voer ad libitum ter beschikking gesteld. De omgevings temperatuur bedroeg tot aan het begin van het onderzoek 22°C en na het begin 30°C.

Huidverbrandingen werden teweeggebracht met een 2 koperstempel met een oppervlak van 20 cm bij een tempera-10 tuur van 250°C en onder constante druk. Om thermische beschadiging van dieper gelegen organen te voorkomen, werd de huid over een luchtgekoelde, holle spatel getrokken. Aldus te werk gaande konden zeer nauwkeurige verbrandingswonden worden veroorzaakt zonder dat de ratten stierven.

15 Vóór het begin van het onderzoek werden de dieren verdoofd met 50 mg./kg nembutal. Na de verbranding werden voor shockprofylaxié 20 ml Ringer-lactaatoplossing intra-peritoneaal geïnjecteerd.

Er werden vijf testgroepen samengesteld: 20 a) normaalgroep: volkomen ongeschonden dieren b) controlegroep I: alleen silibininebehandeling gedurende 6 dagen met 75,5 mg Sili-suc-na c) controlegroep II: schijngeopereerde dieren

25 d) groep met verbrande dieren: 25 %, 250°C

20 sec, 0,5 at e) testgroep: dieren waaraan 75,5 mg Sili-suc-na i.p.

gedurende 6 dagen, beginnend één dag vóór de verbranding, werd toegediend.

30 Om de microsomen te isoleren werd van de dieren na afloop van het onderzoek onder narcose bloed afgetapt. Aansluitend werd de lever verwijderd, gewogen en meteen in ijskoud isoleermedium (0,25 mM saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM Tris.HCl, pH 7,2) gebracht. De lever werd in dunne laagjes 35 gesneden die in het medium werden gehomogeniseerd. Door » - Λ -7- differentieelcentrifugatie werden de microsoomfracties gepelleteerd. De microsotnen werden opnieuw gesuspendeerd en nogmaals gecentrifugeerd. Aansluitend werd een suspensie bereid waarvan 1 ml overeenkwam met 1 g leverweefsel.

5 De lipiden werden bepaald volgens de methode van J.Folch (A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, J.Biol.Chem. 226, 497-508 (1957)), gemodificeerd volgens Bligh en Dyer (A rapid method of total lipid extraction and purification, 10 Can. J.Biochem. Physiol. J7, 911-917 (1959)).

De geëxtraheerde microsoomlipiden werden met natriumhydroxyde verzeept. De vrije vetzuren werden met BF^/methanol veresterd. Na afdampen van de methanol en verwijderen van hydrofiele bijprodukten, werden de vetzuur-15 esters kwantitatief bepaald.

Bij de groep niet-verbrande dieren kon geen noemenswaardige verandering in de vetzuurmonsters worden vastgesteld. Dit betekent dat de narcose en de geringe operatieve ingreep niet tot een verandering van de microsomale 20 lipiden leiden.

Op grond hiervan werden voor verdere vergelijking de normaalgroep en de controlegroep tot één enkele controlegroep samengevoegd.

Uit vergelijking van de niet-verbrande dieren met de 25 verbrande dieren met betrekking tot hun microsomale vetzuur monsters bleek dat zich een ernstige verschuiving van onverzadigde naar verzadigde vetzuren had voorgedaan.

Ter toelichting hierop wordt verwezen naar fig. 1.

Daarin zijn de vetzuurverdeling in de microsomale lever-30 lipiden en de door thermische huidbeschadiging veroorzaakte veranderingen weergegeven. Het gehalte palmitinezuur (C16) stijgt na verbranding van 25,1 tot 34,4% van alle vetzuren gezamenlijk. Voor stearinezuur (C18) bedraagt het gehalte bij de verbrande dieren 46,3% tegen 13,2% bij de 35 controlegroep. Voor oliezuur (C18:1) is een lichte, niet t * -8- significante daling aanwijsbaar. Het gehalte linolzuur (C18:2) daalde na verbranding tot ongeveer 1/3 van de uitgangswaarde. Voor arachidonzuur (C20:4) tenslotte bedroeg het gehalte na verbranding nog maar 31% van de 5 uitgangswaarde.

Uit de onderstaande tabel A blijkt de invloed van Sili-suc-na op het quotum vetzuren bij verbrande en niet-verbrande dieren.

Tabel A

10 Vetzuurmonsters van microsomale lipiden uit rattelever na Sili-suc-na-therapie bij verbrande en niet-ver-brande dieren C16 C18 C18:1 C18:2 C20:4 15 Niet verbrand 29,8% 37,2% 8,9% 9,6% 16,2% (controlegroep I) ±6,2 ±12,3 ±1,1 ±3,3 ±4,9

Verbrand 25,4% 37,5% 7,8% 11,4% 18,0% ±6,0 ±8,6 ±1,0 ±5,3 ±9,1 20 Uit tabel A blijkt dat behandeling met een silibinine- derivaat volgens de uitvinding bij de niet-verbrande controledieren geen wezenlijke veranderingen ten opzichte van de onbehandelde dieren veroorzaakt. Bij de verbrande dieren wordt het verlies aan onverzadigde vetzuren door de therapie 25 volledig opgeheven.

Samenvattend kan dus worden vastgesteld:

Verbrandingen leiden tot veranderingen in vetzuurmonsters van microsomale lipiden. Aangenomen wordt, dat dit tot een oxydatieve beschadiging van de membranen is terug te 30 voeren. Dit blijkt in het bijzonder uit de sterke afname van de meervoudig onverzadigde vetzuren.

De silibininederivaten volgens de uitvinding bezitten dus het vermogen om oxydatieve celbeschadigingen te remmen. Derhalve lenen zij zich in het bijzonder voor het onder-35 breken van oxydatieve beschadigingsmechanismen na zware * Λ -9- verbrandingen.

Zoals reeds vermeld, wordt aangenomen dat auto-toxische reakties na zware verbrandingen in het bijzonder tot oxydatieve celbeschadigingen leiden. Op grond hiervan 5 werd onderzocht hoe de werking van een gestandaardiseerde verbrandingswond op de PHA-geïnduceerde blastogenese van T-lymfocvten uit de milt en uit perifeer bloed van ratten is. Verder werd onderzocht hoe de silibininederivaten volgens de uitvinding dergelijke lymfocytaire functiestoornissen na 10 zware verbrandingen beïnvloeden.

Werking van een gestandaardiseerde thermische wond op de PHA-geïnduceerde blastogenese van T-lymfocyten uit de milt en uit perifeer bloed van ratten Zoals boven beschreven werd de rughuid van Wistar-15 ratten met een koperstempel verbrand. Als controlegroep dienden schijnverbrande dieren waaraan alle operatieve ingrepen zonder verbranding werden uitgevoerd. Na 2, 4, 7 en 9 dagen werden bij de verbrande en controledieren onder ethernarcose bloed afgetapt en de milt verwijderd.

20 Om de lymfocyten te isoleren werd Ficoll-Hypaque- oplossing (dichtheid 1,077) belaagd met gehepariniseerd bloed. Aansluitend werd gecentrifugeerd en werden de verkregen lymfocyten met trypan-blauw op hun vitaliteit getest. Om de miltlymfocyten te isoleren werd het orgaan verkleind, door 25 een zeef gedwongen en door lysis-oplossen volgens Gay van begeleidende erythrocyten bevrijd.

Aansluitend werd het celmengsel in een houder 30 minuten geïncubeerd bij aanwezigheid van 5%fig hittegeïn-aktiveerd feutaal kalverserum om het aantal mononucleaire 30 cellen in de suspensie door adhesie aan de wand van de houder te verkleinen (5%). Eerst werden de cellen in de putjes van een microtiterplaat met vlakke bodem gebracht.

Daarna werd 20%’ig feutaal kalverserum toegevoegd. Vervolgens werd de spontane blastogenese door meting van in het 35 DNA van de cellen ingebouwd H-thymidine (2C i/mM) bepaald.

-10-

Uit eerdere onderzoekingen was al duidelijk geworden dat een optimale mitogens stimulatie bij een PHA-concentratie (mitogen-fythaemagglutine) van 5^ug/ml plaats vindt. Bij deze proeven om het cellulaire testsysteem te optimaliseren werd 5 verder vastgesteld dat de synthese van nieuw DNA maximaal wordt gestimuleerd na 72 uren. Bovendien werd bevonden dat de optimale concentratie aan feutaal kalverserum 20% moet bedragen om maximale stimulatie te bereiken.

Zoals boven beschreven werd de spontane blastogenese , 3 10 bepaald door m het DNA van de cellen opgenomen H- thymidine te meten. De cellen werden 18 uren na toevoegen van 3 H-thymidine geoogst waarbij het nulpunt voor die 18 uren met het tijdstip van maximale stimulatie samenviel.

Om de werking van de silibininederivaten volgens de 15 uitvinding te onderzoeken werd een groep ratten met zo 'n derivaat behandeld. Daartoe werd 75,5 mg Sili-suc-na eenmaal daags intraperitoneaal geïnjecteerd. Deze behandeling werd vanaf de verbrandingsdag tot aan de dag waarop de organen werden verwijderd (met de negende dag als uiterste) volge-20 houden.

Uit de met de controledieren, niet-verbrande dieren en met Sili-suc-na behandelde dieren verkregen resultaten werd de stiraulatieindex berekend. Deze is het quotiënt van de gemiddelde waarde uit de resultaten met de gestimuleerde 25 ratten en de gemiddelde waarde uit de resultaten met de controleratten. Uit de stimulatieindex werd voor elk proefdier een gemiddelde stimulatieindex per diergroep berekend. Deze gemiddelde stimulatieindex is aangegeven met SI.

Ter toelichting hierop wordt verwezen naar fig. 2.

30 Daarin is de invloed van Sili-suc-na op de blastogenese van lymfocyten weergegeven. Bij de verbrande dieren werd de verminderde stimuleerbaarheid van de cellen door silibinine duidelijk verhoogd.

Al op de tweede dag bleek dat bij de met Sili-suc-na 35 behandelde dieren de respons van de bloedlymfocyten op PHA

• -· w j , * -11- ongeveer 10 keer hoger was. Op de vierde dag na de verbranding was de stimulatieindex bij bloedlymfocyten voor behandelde dieren 8 tegen 1,5 voor de onbehandelde dieren.

Bij de miltcellen zijn de stimulatieindices van de 5 verbrande, onbehandelde dieren allen duidelijk lager dan 1.

Toediening van silibinine leidt tot een significante verbetering op alle onderzoeksdagen die maximaal is op de zevende dag na de verbranding.

Verder werden nog vergelijkingsproeven uitgevoerd 10 waaruit bleek dat Sili-suc-na alleen bij gezonde dieren geen significante veranderingen in de stimuleerbaarheid bij door PHA-geïnduceerde blastogenese van T-lymfocyten uit de milt en uit perifeer bloed geeft.

Zoals volgens de uitvinding toegepast stimuleert 15 silibinine dus de blastogenese van lymfocyten bij verbrande dieren significant.

Verder werd vastgesteld dat de algehele katabolie van de met de silibininederivaten behandelde dieren minder was omdat het gewicht van de dieren na de verbranding snel toenam. 20 Paddestoelvergiftiging

Van alle vergiftigingen waarmee de medicus te maken krijgt, is die door de amaniet wel de ergste. Hoewel vergiftiging door de groene amaniet slechts 10-30% van alle paddestoelvergiftigingen vormt, bestaat er in medische 25 kringen grote belangstelling voor omdat hij zo gevaarlijk is.

Volgens oudere publikaties bedraagt de lethaliteit 30 - 50%. Dank zij de moderne medische wetenschap is na een groepsonderzoek van Floersheim et al. bij 205 patiënten^de lethaliteit met gemiddeld 22,4% verminderd.

30 Het gif uit de amaniet, amanitine, kan al in een dosis van 7 mg voor volwassenen dodelijk zijn. Deze hoeveelheid gif kan uit ongeveer 50g van een verse amaniet worden gewonnen.

Na een aantal succesvolle dierproeven werd Sili-suc-na 35 getest op zijn werking tegen amanietvergiftiging bij mensen.

5 -12- 28 Patiënten met amanietvergiftiging werden behalve met de gebruikelijke therapieën ook nog met Sili-suc-na behandeld. Daarvan stierf er slechts één, maar dat was omdat deze patiënt wel erg veel amanietgif had ingenomen met het oog 5 op autoeuthanasie. Dit resultaat betekent een grote therapeutische vooruitgang op dit gebied.

Bereiding van isosilybinevrij silibinine

Een suspensie van 500g produkt volgens DE-AS 1.923.082 kolom 8, regels 14 - 19 met een silymarinegehalte van onge-10 veer 70% bij een isomerenverhouding silybine/silidianine/ silicristine van ongeveer 3:1:1, waarbij het silybine ongeveer 1/3 isosilybine bevat, en 2 kg methanol (2,53 liter) wordt 15 minuten onder roeren gekookt. Uit de gevormde oplossing kan daarna al een weinig silibinine precipiteren. Aan-15 sluitend wordt onder vacuum 0,75 - 1,25 kg (0,96 - 1,58 liter) methanol afgezogen waarna men het residu 10-28 dagen bij omgevingstemperatuur laat staan. Het geprecipiteerde silibinine wordt gefiltreerd en twee keer met telkens 50 ml koude methanol nagewassen. Na drogen bij 40°C in vacuo 20 wordt het geïsoleerde, ruwe silibinine als volgt verder gezuiverd: 60g Ruw silibinine wordt in 3 liter technisch ethyl-acetaat onder verwarmen opgelost. Aansluitend wordt 20g geaktiveerde kool toegevoegd waarna nog 2 uren onder terug-25 vloeikoeling wordt geroerd. Na afloop wordt opgehelderd door filtreren waarna de oplossing bij 50°C onder verminderde druk wordt geconcentreerd tot ongeveer 250 ml. Het concentraat wordt 15 minuten met een Ultra-Turraxapparaat geroerd onder toevoegen van 25 ml methanol. Aansluitend laat men het 30 mengsel een nacht bij omgevingstemperatuur overstaan. Al vorens het geprecipiteerde silybine onder afzuiging te filtreren wordt nogmaals 5 minuten wederom met een Ultra-Turraxapparaat opgeroerd. Het afgezogen neerslag wordt twee keer met 50 ml ethylacetaat nagewassen en in een vacuum-35 droogkast 's nachts bij 40°C gedroogd. Aansluitend wordt het : , j -13- pro dukt gemalen, en onder dezelfde omstandigheden 48 uren nagedroogd.

Voorbeeld 1

Bereiding van silibinine-C-21,3-diwaterstofsuccinaat 5 (formule 5) 50g Silibinine wordt bij 45°C opgelost in 70 ml pyridine. Aan de oplossing wordt 50g barnsteenzuur-snhydride toegevoegd waarna het mengsel ongeveer 8 uren bij 45°C wordt geroerd. Hierna wordt 30 ml ethanol toegevoegd en 10 wordt het roeren voortgezet totdat zich een homogeen mengsel heeft gevormd. Aansluitend wordt onder krachtig roeren 60 ml water in ongeveer 30 minuten toegevoegd om fenyl-esters te verzepen. Na ongeveer 1 uur roeren bij 30°C zijn de fenylesters blijkens hogedrukvloeistofchromatografie 15 (HPLC) kwantitatief gehydrolyseerd. De hydrolyse wordt beëindigd door snel 1,7 liter ethylacetaat aan het reaktie-mengsel toe te voegen.

Om overmaat barnsteenzuur en pyridine af te scheiden wordt het met ethylacetaat verdunde reaktiemengsel twee keer 20 in tegenstroom geëxtraheerd met telkens 5 liter water dat met ethylacetaat is verzadigd en een pH 1,85 heeft (ingesteld met verdund zoutzuur). Daarbij wordt het met ethylacetaat verzadigde, aangezuurde waswater met een pomp in tegenstroom met de verdunde reaktieoplossing rondgevoerd 25 en wordt aansluitend de pH met verdund zoutzuur net zolang op 1,85 gehouden totdat deze pH na de ethylacetaatpassage constant blijft.

Aansluitend wordt om overmaat zoutzuur uit te wassen, de ethylacetaatfase twee keer in tegenstroom ge-30 extraheerd met telkens 3,4 liter water dat met ethyl acetaat is verzadigd. Zodra de pH van het waswater hoger dan 4,5 is geworden, wordt de organische fase kwantitatief afgescheiden, bij 40 - 50°C in vacuo geconcentreerd tot 1/12 van het beginvolume (ongeveer 2 liter) en met 125 ml 35 ethanol verdund.

,· J

4 V

-14-

De titelverbinding wordt verkregen door opnieuw oplossen in en precipiteren uit ethanol/water en 15 uren drogen bij 50°C in vacuo.

Om een monster voor elementair analyse te verkrijgen 5 wordt de titelverbinding drie keer opgelost in en geprecipi teerd uit ethanol/water en daarna 15 uren bij 50°C in vacuo gedroogd.

Het FD-massaspectrum vertoont de molecuulpiek bij het verwachte moleculairgewicht van 682.

10 Het IR-spectrum vertoont in het gebied van de C0- valentiefrequentie twee overlappende banden, waarvan de een, net zoals bij silibinine, aan de carbonylfunctie in de -1 pyronrmg bij een golflengte 1635 cm toegeschreven kan -1 worden. De andere band ligt bij een golflengte 1730 cm en 15 komt voort uit de beide estercarbonylfuncties.

Dat een tweevoudige verestering heeft plaats gevonden, , 1 wordt bevestigd door het H-NMR spectrum. Zo bedraagt de door integratie berekende verhouding aromatische protonen en methyleenprotonen van de barnsteenzuurrest 8:8 (ppm-bereik: 20 5,9 - 7,1). De verhouding van deze methyleenprotonen (ppm: 2,6) en methylprotonen van de methoxygroep (ppm: 3,8) bedraagt 8:3 en is daarmee dus in overeenstemming.

. . . . . . 13

Ook uit de chemische verschuivingen bij C-onder- zoekingen blijkt dat beide alcoholische OH-groepen zijn 25 veresterd; de chemische verschuivingen veranderen namelijk het sterkst bij en de naburige kool stof atomen ^2^14 alsook bij C2 - C^.

Elementair analyse voor C„oHor.0., (682,60) --JJ JU 1 o

C HO

30 Ber.: 58,07 4,43 37,50

Gev.: 58,05 4,57 37,31

Voorbeeld 2

Bereiding van het dinatriumzout van silibinine-C-21,3-diwaterstofsuccinaat (formule 6) 35 Aan de in voorbeeld 1 gevormde ethanolische oplossing ï ' j -15- wordt onder roeren en uitwendig koelen bij -5 tot 9°C een 6%’ige ethanolische natriumhydroxydeoplossing toegedruppeld in een voldoende hoeveelheid om het bepaalde gehalte vaste stof in de ethanolische oplossing te suspenderen. De suspen-5 sie wordt nog 1 uur bij omgevingstemperatuur geroerd waarna de geprecipiteerde, beige vaste stof wordt afgezogen. Deze wordt twee keer telkens 5-10 minuten met een Turrax in 150ml ethanol gesuspenseerd en opnieuw afgezogen. Om achtergebleven ethylacetaat te verwijderen wordt het produkt aansluitend 10 14 uren in 280 ml ethanol bij omgevingstemperatuur geroerd waarna de suspensie opnieuw wordt afgezogen, het residu met 70 ml ethanol wordt gewassen en 15 uren bij 40 - 45°C wordt gedroogd in een vacuumdroogkast. Aansluitend wordt het voorgedroogde produkt verkleind, gezeefd op een deeltjes-15 grootte kleiner dan 0,2 mm en nog 48 uren gedroogd bij 40 - 45°C in vacuo. Aldus wordt 52g titelverbinding (69% opbrengst) verkregen.

De titelverbinding heeft geen scherp smeltpunt en begint bij ongeveer 80°C te sinteren om bij ongeveer 100°C 20 te smelten onder blaasjesvorming.

• Λ 4 UV-spectrum in methanol: ^ =288 nm, £=1,73.10 .

Het moleculairgewicht van de titelverbinding bedraagt 726,56. De verbinding is een lichtbeige, microkristallijn poeder zonder specifieke geur en smaakt zoutachtig.

25 De titelverbinding is makkelijk oplosbaar in water, moeilijk oplosbaar in ethanol en praktisch onoplosbaar in aceton, ether en chloroform.

Voorbeeld 3

Bereiding van lyofylisaten voor i.v. toediening 30 Dinatriumzout van silibinine-C-2’,3-diwaterstof- succinaat 75,0mg

Manniet 10,0mg

Water voor injectie ad 1,5 ml

Spitse ampullen van 5 ml inhoud worden met 1,5 ml 35 oplossing afgevuld en daarna op bekende wijze gevriesdroogd.

·< V

-16-

Om de ampullen met het gerede lyofylisaat te bewaren, worden zij op gebruikelijke wijze gesloten.

Voor toepassing wordt het lyofylisaat in 5 ml steriele, fysiologische natriumchlorideoplossing opgelost 5 tot helder.

Claims (10)

1. Silifaininederivaten gekenmerkt door de formule 1 op het formuleblad waarin Alk^ en Alk2> die gelijk of verschillend kunnen zijn, een alkyleengroep met 1 - 4 koolstof- 5 atomen of alkenyleengroep met 2-4 koolstofatomen voor stellen, M^ en M2, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een waterstofatoom of alkalimetaalatoom voorstellen, en n en m, die gelijk of verschillend kunnen zijn, 0 of 1 zijn.

2. Silibininederivaten volgens conclusie 1, gekenmerkt 10 door de formule 1 waarin Alk^ en Alk2 een alkyleengroep met 2 koolstofatomen voorstellen, en M2, die gelijk of verschillend kunnen zijn, een alkalimetaalatoom voorstellen, en n en m, die gelijk of verschillend kunnen zijn, 0 of 1 zijn.

3. Silibininederivaten volgens conclusie 1 en 2, 15 met het kenmerk, dat, Alk^ en Alk2? M^ en M2, en n en m in de formule 1 dezelfde betekenis hebben.

4. Dinatriumzout van silibinine-C-2’,3-diwaterstof-. succinaat met de formule 6.

5. Werkwijze voor het bereiden van silibininederivaten 20 volgens conclusies 1-4, met het kenmerk, dat, 1 gewichts- deel silibinine met de formule 3,opgelost in 1 - 2 gewichts-delen pyridine, onder roeren wordt omgezet met 1 - 3 gewichts-delen dicarbonzuuranhydride met de formule 2 waarin Alk de in conclusie 1 voor Alk^ of Alk2 aangegeven betekenis heeft, 25 daarna ethanol wordt toegevoegd totdat zich een homogeen mengsel heeft gevormd, aansluitend onder intensief roeren langzaam water wordt toegevoegd om aromatische estergroepen te hydrolyseren, na voltooiing van de hydrolyse met ethyl-acetaat wordt verdund, met water,dat met ethylacetaat is 30 verzadigd en zuur reageert,wordt gewassen, de ethylacetaat- fase wordt geconcentreerd, en het concentraat in ethanol wordt opgenomen en met een alcoholische alkalimetaalhydroxyde-oplossing tot het zout van het vrije carbonzuur wordt omgezet.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, 35 dat, de reaktie met het dicarbonzuuranhydride wordt uitge- J -4 v -18- voerd bij ongeveer 40 - 50°C.

7. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat, het zuurreagerende en met ethylacetaat verzadigde waswater op een pH van ongeveer 1,5 - 2,4 wordt gehouden.

8. Farmaceutisch preparaat, met het kenmerk, dat, het preparaat tenminste een verbinding volgens een der conclusies 1-4, eventueel samen met een farmaceutisch aanvaardbare drager of hulpstof, bevat.

9. Toepassing van verbindingen volgens een der 10 conclusies .1-4 voor het behandelen van brandwonden, levercirrhose, toxisch-metabolische leveraantasting en paddestoelenvergiftiging.

10. Verbindingen, werkwijzen en farmaceutische preparaten zoals beschreven in de beschrijving en voorbeelden. - j Ί