DE69812679T2 - Lipophile diester von komplexbildnern - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft lipophile Diester eines Komplexbildners, Verfahren zur Synthese dieser Mittel, deren pharmazeutische Zusammensetzungen und deren Verwendung zur Behandlung eines Zustands bzw. einer Krankheit, die mit anomalen Konzentrationen von zweiwertigen Metallionen, insbesondere mit erhöhten Konzentrationen an intrazellulären Calciumionen verbunden ist. Die Erfindung betrifft insbesondere Diester von 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure, hier als BAPTA bezeichnet, bei denen es sich um stabile lipophile Derivate von zweiwertigen Metallionen-Komplexbildnern handelt.
  • Metallionen wie Calcium-, Mangan-, Magnesium-, Kupfer-, Zink- und Eisen(II)-Ionen spielen eine entscheidende Rolle in biologischen Systemen, indem sie Proteinstruktur, Enzymaktivität und zelluläre Signalvermittlung regulieren. Man nimmt an, daß verschiedene Krankheiten bzw. pathologische Zustände einschließlich Hirn- und Herzischämie, Schlaganfall, Herzinfarkt, Epilepsie, chronische neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und akute Entzündungen alle mit dem Phänomen von anomal erhöhten intrazellulären Calciumkonzentrationen in Zusammenhang stehen. Andere mit neuronaler und muskulärer Hyperaktivität assoziierte Krankheiten wie Harninkontinenz, Prostatavergrößerung, Muskelkrämpfe, arterieller Bluthochdruck, Asthma und Reizkolon sind alle mit erhöhten Spiegeln von intrazellulären zweiwertigen Ionen wie Calcium und Zink in Verbindung gebracht worden.
  • Intrazelluläres Calcium ist eine wichtige Determinante für den Zelltod, unabhängig von der ursprünglich durch die Zelle erfahrenen Verletzung. Es kann am Zelltod von durch Lymphozyten und Killerzellen vermitteltem Schaden an Zielzellen, an Organschädigungen während einer Transplantation und an anderen Arten von Gewebeschäden einschließlich ischämischen Verletzungen beteiligt sein. Als Schutz gegen Gewebeverletzungen bzw. zur Verminderung einer Gewebeschädigung wurden Calciumkanalblocker oder zellmembrangängige Formen von Calcium-Komplexbildnern vorgeschlagen.
  • Die bei Ischämie auftretende Zellschädigung kann eine Folge des Einstroms und/oder der intrazellulären Freisetzung von Ca++-Ionen sein (Choi, Trends Neurosci., 1988, 11, 465–469; Siesjo und Smith, Arzneimittelforschung, 1991, 41, 288–292). In ähnlicher Weise scheint der Einstrom von Calcium eine wichtige Rolle bei der Genese von epileptischen Anfällen zu spielen. Wenngleich ein beträchtlicher Anteil des intrazellulären Calciums aus intrazellulären Speichern stammt, legt die gegenwärtige Forschung nahe, daß Blocker des Eintritts von Calcium antikonvulsive Wirkung haben (siehe z. B. Meyer, 1989, Brain Res. Rev. 14, 227–243).
  • Demgemäß wurden bestimmte pharmakologische Strategien entwickelt, mit denen versucht werden soll, diese pathologische Akkumulation von intrazellulärem Calcium, die die Folge einer pathologischen Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern oder des schädigenden Calciumeinstroms in Zellen sein kann, zu verhindern bzw. zu behandeln.
  • Zu den Wirkstoffen, die von gegenwärtigem bzw. potentiellem Nutzen für die Behandlung von mit Calcium verbundenen Erkrankungen sind, gehören: (i) Calcium kanalblocker, (ii) Wirkstoffe, die das Calciumgleichgewicht durch Modifikation von intrazellulären Calciumspeichern beeinflussen, und (iii) Komplexbildner, die intrazelluläres Calcium komplexieren. Vertreter von in der klinischen Praxis verwendeten Calciumkanalblockern sind Verapamil, Nifedipin und Diltiazem. Zu den hauptsächlich mit der Verwendung solcher Verbindungen assoziierten Toxizitäten gehören eine übermäßige Gefäßerweiterung, negative Inotropie, Dämpfung des Sinusknotenrhythmus und Störungen der Erregungsleitung im A-V-Knoten. Wirkstoffe, die Mobilisierung und/oder Sequestrierung von Calcium beeinflussen, wie z. B. Calciumkanalblocker, zeigen eine etwas engere Spezifität.
  • Zu den Calcium-Komplexbildnern mit der höchsten Affinität und der größten Selektivität gehören verschiedene Derivate von 1,2-Bis(2-aminophenoxyethan)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (BAPTA), die ursprünglich von Tsien beschrieben wurde (Biochem. 19, 2396, 1980). Es wurden verschiedene fluoreszierende und andere reaktive Derivate von BAPTA offenbart, beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4,603,209, 4,849,362, 5,049,673 und 5,453,517. Bei keinem dieser offenbarten Derivate handelt es sich um einen stabilen Diester des Komplexbildners.
  • Die Verwendung von Calcium-Komplexbildnern zur Verminderung von Verletzungen in Säugetierzellen ist in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 94/08573 offenbart, in der die Verwendung von zellmembrangängigen Estern von Calcium-Komplexbildnern als Prodrugs für klinische Anforderungen beschrieben wird. Zu den zur Verfügung stehenden zellmembrangängigen Komplexbildnern von Ca++ und anderen zweiwertigen Metallionen gehören Acetoxymethylester wie z. B. Ethylenglykol-bis-2-aminoethylether-N,N,N',N'-tetraessigsäureacetoxymethylester (EDTA-AM), Ethylendiamintetraessigsäure-acetoxymethylester (EDTA-AM) und 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure-acetoxymethylester (BAPTA-AM). Diese bekannten komplexen Moleküle sind Prodrugs, die von allgegenwärtigen Esterasen verdaut werden, was infolge zu einer Aktivierung des Komplexbildners im intrazellulären Raum führt. Die Esteraseempfindlichkeit dieser Verbindungen führt somit unter physiologischen Bedingungen zu hohen Umlaufkonzentrationen an freiem BAPTA und einer geringen Wirksamkeit des Wirkstoffs an der Zielstelle. Demgemäß muß man beispielsweise BAPTA-AM in einer relativ hohen therapeutischen Dosierung verwenden, die mit Toxizität verbunden ist.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden neue stabile lipophile Diester von Komplexbildnern bereitgestellt. Die Erfindung stellt somit eine stabile, zweifach veresterte Carbonsäure (a) mit Hydroxyverbindung (b), wobei es sich bei (a) um einen pharmazeutisch unbedenklichen Komplexbildner für zweiwertige Metallionen handelt, der die Formel (HOOC-CH2-)2-N-A-N-(-CH2COOH)2 aufweist, in welcher A für ein gesättigtes oder ungesättigtes, aliphatisches, aromatisches oder heterocyclisches Brückenglied steht, das, in einer direkten Kettenverbindung zwischen den beiden gezeigten Stickstoffatomen, 2–8 Kohlenstoffatome in einer fortlaufenden Kette enthält, die durch 2–4 Sauerstoffatome unterbrochen ist, mit der Maßgabe, daß es sich bei den direkt mit den beiden gezeigten Stickstoffatomen verbundenen Kettengliedern nicht um Sauerstoffatome handelt, und wobei es sich bei (b) um einen pharmazeutisch unbedenklichen Alkohol, ausgewählt aus der Gruppe von geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Alkanolen, Aminoalkanolen und substituierten oder unsubstituierten Arylalkanolen handelt; und pharmazeutisch unbedenkliche Salze der zweifach veresterten Carbonsäuren, bereit.
  • Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Diester der Komplexbildner Ethylen-1,2-diol-bis(2-arninoethylester)-N,N,N',N'-tetraessigsäure und insbesondere Diester von 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure bereitgestellt.
  • Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Diester der allgemeinen Formel I bereitgestellt:
    Figure 00050001
    Formel I wobei sich die Substituenten an den aromatischen Ringen in der ortho-Position befinden;
    X aus der aus CnH2n+1 (n = 1–10) , (CnH2n +1)2N(CH2)m (n = 1–6, m = 1–6) und substituiertem oder unsubstituiertem ArCH2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist und M für ein beliebiges physiologisch unbedenkliches Kation steht.
  • Gegenwärtig bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind Verbindungen der allgemeinen Formel 2, in welchen X aus der aus C2H5, C3H7, i-C3H7, C4H9, C7H1 5, C8H17, CH2C6H5 und (CH3)2NCH2CH2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  • Besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, in welchen X aus der aus C2H5, C3H7, C4H9, C7H1 5, C8H17 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  • Für bestimmte pharmazeutische Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung am meisten bevorzugt ist eine Verbindung der oben gezeigten allgemeinen Formel I, in welcher X für C8H17 steht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Diester der allgemeinen Formel II bereit
    Figure 00060001
    Formel II wobei sich die Substituenten an den aromatischen Ringen in der ortho-Position befinden; Y für CnH2n+1 (OCH2CH2)m (n = 1–2 0, m = 1–6) steht und M für ein beliebiges physiologisch unbedenkliches Kation steht.
  • Gegenwärtig bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind Verbindungen der allgemeinen Formel II, in welchen Y aus der aus CH3OCH2CH2, C2H5OCH2CH2, C3H7OCH2CH2, C4H9OCH2CH2, C7H15OCH2CH2, C8H17OCH2CH2, C10H21OCH2CH2, C15H33OCH2CH2, C18H37OCH2CH2, CH3(OCH2CH2)2, C2H5(OCH2CH2)2, C4H9 (OCH2CH2)2, C6H13(OCH2CH2)2, C7H15(OCH2CH2)2, C8H17, OCH2CH2)2, C10H21 (OCH2CH2)2, CH3(OCH2CH2)3, C7H15(OCH2CH2)3 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  • Besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel II, in welchen Y aus der aus C8H17OCH2CH2, C10H21OCH2CH2, C16H33OCH2CH2, C18H37OCH2CH2, C8H17(OCH2CH2)2, C10H21(OCH2CH2)2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  • Für bestimmte pharmazeutische Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung am meisten bevorzugt ist eine Verbindung der oben gezeigten allgemeinen Formel II, in welcher Y für C8H17OCH2CH2 steht.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die als aktiven Bestandteil einen stabilen lipophilen Diester eines erfindungsgemäßen Komplexbildners und ein pharmazeutisch unbedenkliches Verdünnungsmittel oder einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff enthalten. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können als flüssige oder feste Verabreichungsformen vorliegen und oral, parenteral oder intranasal verabreicht werden.
  • Die erfindungsgemäßen lipophilen Diester von Komplexbildnern eignen sich zur Behandlung bzw. Prophylaxe von mit Metallionen assoziierten Erkrankungen, beispielsweise Erkrankungen, die mit anomalen Konzentrationen an Mangan-, Magnesium-, Kupfer-, Zink-, Eisen-, Cadmium-, Quecksilber-, Cobalt- und insbesondere Calciumionen assoziiert sind. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in noch einem weiteren Aspekt die Verwendung der erfindungsgemäßen lipophilen Diester von Komplexbildnern zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit bzw. Erkrankung, die mit einem Überschuß an zweiwertigen Metallionen verbunden ist, bereit. Bei der Behandlung verabreicht man einem dieser Behandlung bedürftigen Individuum eine therapeutisch wirksame Menge eines stabilen lipophilen Diesters eines pharmazeutisch unbedenklichen Komplexbildners für zweiwertige Metallionen. Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere die Verwendung der erfindungsgemäßen lipophilen Diester von Komplexbildnern zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit bzw. Erkrankung, die mit einem Überschuß an intrazellulären Ca++-Ionen verbunden ist, wie z. B. Hirn- und Herzischämie, Schlaganfall, Herzinfarkt, Epilepsie, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, akuter Entzündung, Harninkontinenz, Prostatavergrößerung, Muskelkrämpfen, arteriellem Bluthochdruck, Asthma und Reizkolon bereit. Bei der Behandlung verabreicht man einem dieser Behandlung bedürftigen Individuum eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen pharmazeutisch unbedenklichen Diesters eines Komplexbildners. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können sich weiterhin für medizinische Behandlungen wie offene Herzchirurgie eignen.
  • Die ausführliche Beschreibung unten ermöglicht zusammen mit den Zeichnungen ein besseres Verständnis und eine bessere Würdigung der Erfindung, wobei:
  • 1A–C die Konzentrationsveränderungen von drei zweiwertigen Metallionen (a) Fe++, (b) Zn++ und (c) Ca++ in wäßrigen Lösungen (offene Symbole) und Octanollösungen (ausgefüllte Symbole) in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen des Dioctylethylenglykolesters von BAPTA (DP-BAPTA-99; Quadrate) bzw. BAPTA (Dreiecke) zeigt.
  • 2 zeigt die Wirkung des Diethylesters von BAPTA (DP-BAPTA-23) auf die intrazelluläre Ca++-Konzentration in kultivierten Hippocampus-Neuronen, kontrolliert durch die Fluoreszenz des Farbstoffs Fluo-3/AM.
  • 3 zeigt eine graphische Darstellung der Veränderungen in der Fluoreszenz (Δ F/F) des Farbstoffs Fluo-3/AM als Mittelwert von Fünf kultivierten Hippocampus-Neuronen, was die Wirkung verschiedener Konzentrationen von DP-BAPTA-99 (0,1 μg/ml, 1 μg/ml und 10 μg/ml) auf die kaliuminduzierte Erhöhung der intrazellulären Ca++-Konzentration wiedergibt.
  • Sternchen (*) markieren K+-Pulse.
  • 4 zeigt die Na/K-ATPase-Aktivität (als % der Kontrolle ohne Wirkstoff), gemessen in Mäuse-Kortexhomogenaten in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des Diethylesters von BAPTA (DP-BAPTA-27).
  • 5 zeigt das Membranaktionspotential in stimulierten kultivierten Kardiomyozyten, die wie folgt präinkubiert wurden: 1-Kontrolle, keine Zusätze; 2-Ouabain 10–6 M, 6 min; 3-Ouabain. 10–6 M, 10 min; 4-Ouabain 10–6 M, 13 min; 5-Ouabain 10–6 M + DP-BAPTA-23 10–10 mg/ml, 35 min.
  • 6 zeigt den glutamatinduzierten Zelltod in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an DP-BAPTA-99, das 1 Stunde vor dem Glutamat-Insult zugegeben wurde.
  • 7 zeigt den glutamatinduzierten Zelltod in Gegenwart von DP-BAPTA-99, das wie angegeben zu verschiedenen Zeiten nach dem Glutamat-Insult zugegeben wurde.
  • 8 zeigt die Aktivität der neuronalen spezifischen Enolase (NSE), gemessen im Serum von mongolischen Wüstenspringmäusen, 24 Stunden nach globaler Vorderhirnischämie, als Funktion ihrer Behandlung. t = 0 und t = +3 h sind die Zeitpunkte in Stunden, bezogen auf das Einsetzen der Reperfusion, zu denen der Dioctylester von BAPTA (DP-BAPTA-60, graue Balken) und der Dioctylethylenglykolester von BAPTA (DP-BAPTA-99, dunkle Balken) i. p. verabreicht wurden.
  • 9A–8 zeigen die 24 und 72 Stunden nach globaler Vorderhirnischämie im Serum von mongolischen Wüstenspringmäusen gemessene Aktivität der neuronalen spezifischen Enolase (NSE). DP-BAPTA-99 (dunkle Balken) wurde in zwei Protokollen oral verabreicht: (A) eine 0,5 mg/kg Dosis 4 Stunden vor dem Einsetzen der Reperfusion und anschließend eine weitere 0,5 mg/kg Dosis zu Beginn der Reperfusion und (B) in den 3 Tagen nach der Ischämie jeweils 0,5 mg/kg pro Tag.
  • Die NSE-Aktivität in Kontrolltieren, die mit einer Lösung des Vehikels behandelt wurden, ist durch die hellen Balken wiedergegeben.
  • 10 zeigt die Überlebenszeit in Stunden von mongolischen Wüstenspringmäusen nach 20 min globaler Vorderhirnischämie. Die Tiere erhielten entweder eine Lösung des Vehikels (heller Balken) oder 10 μg/kg DP-BAPTA-60 (graue Balken) oder DP-BAPTA-99 (dunkle Balken), die jeweils als Einzeldosis zu Beginn der Reperfusion i.p. verabreicht wurden.
  • 11 zeigt eine histopathologische Analyse des ischämieinduzierten Hirnschadens (0 = normal; 1 = minimal; 2 = gering; 3 = mäßig; 4 = deutlich) in verschiedenen Hippocampus-Regionen (CA-1, CA-2, CA-3 und Gyros dentatus) in Wüstenspringmäusen, die mit DP-BAPTA-60 (graue Balken), DP-BAPTA-99 (dunkle Balken) bzw. Kochsalzlösung (Vehikel, helle Balken) behandelt wurden.
  • 12 zeigt die antiepileptische Schutzwirkung (%) verschiedener Konzentrationen an DP-BAPTA-99 im Tiermodell mit Wistar-Ratten, wobei die Epilepsie durch 400 mg/kg Pilocarpin induziert wurde. Die aufgezeichneten epileptischen Symptome waren: limbische epileptische Anfälle (weiß); allgemeine epileptische Anfälle (hellgrau); L-SE (dunkelgrau) und Überleben (schwarz).
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen bereitgestellt, bei denen es sich um stabile Diester von Komplexbildnern von zweiwertigen Metallionen handelt. Zu den zweiwertigen Metallionen gehören Mangan, Magnesium, Kupfer, Cobalt, Cadmium, Quecksilber und Blei, besonders bevorzugt Zink- und Eisen(II)-Ionen und ganz besonders bevorzugt Calciumionen; jedoch ist die Aufzählung nicht hierauf beschränkt.
  • In der Beschreibung und den Ansprüchen wird mit dem Ausdruck „Komplexbildner" ein beliebiges im Stand der Technik bekanntes Molekül bezeichnet, das fähig ist, zweiwertige Metallionen zu komplexieren.
  • Mit dem Ausdruck „stabil" wird ein beliebiges Molekül bezeichnet, das für eine Isolierung in im wesentlichen reiner Form ausreichend robust ist.
  • Bei den erfindungsgemäßen Diestern handelt es sich um lipophile Derivate von Komplexbildnern, was durch herkömmliche Methoden gemessen werden kann, beispielsweise ausgedrückt in ihren im Vergleich zu den nichtderivatisierten Ausgangsverbindungen erhöhten Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine stabile, zweifach veresterte Carbonsäure (a) mit Hydroxyverbindung (b), wobei es sich bei (a) um einen pharmazeutisch unbedenklichen Komplexbildner für zweiwertige Metallionen handelt, der die Formel (HOOC-CH2-)2-N-A-N-(-CH2OOH)2 aufweist, in welcher A für ein gesättigtes oder ungesättigtes, aliphatisches, aromatisches oder heterocyclisches Brückenglied steht, das, in einer direkten Kettenverbindung zwischen den beiden gezeigten Stickstoffatomen, 2–8 Kohlenstoffatome in einer fortlaufenden Kette enthält, die durch 2–4 Sauerstoffatome unterbrochen ist, mit der Maßgabe, daß es sich bei den direkt mit den beiden gezeigten Stickstoffatomen verbundenen Kettengliedern nicht um Sauerstoffatome handelt, und wobei es sich bei (b) um einen pharmazeutisch unbedenklichen Alkohol, ausgewählt aus der Gruppe von geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Alkanolen, Aminoalkanolen und substituierten oder unsubstituierten Arylalkanolen handelt; und pharmazeutisch unbedenkliche Salze der zweifach veresterten Carbonsäuren, bereitgestellt.
  • Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist das Brückenglied A aus der aus einer gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Kette, die durch 2-4 Sauerstoffatome unterbrochen ist, und -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'- bestehenden Gruppe ausgewählt, wobei die einzelnen Restepaare R-R und R'-R' zusammen mit der verbundenen -C=C-Einheit einen aromatischen oder heterocyclischen Ring mit fünf oder, sechs Ringatomen bilden, wobei der mit R-R gebildete Ring und der mit R'-R' gebildete Ring gleich oder verschieden sind.
  • Bei einer besonderen Ausführungsform kann es sich bei dem Brückenglied A um -CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- handeln oder um -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'- handeln, wobei die einzelnen Restepaare R-R und R'-R' zusammen mit der verbundenen -C=C-Einheit einen aromatischen oder heterocyclischen Ring bilden, der aus der aus Furan, Thiophen, Pyrrol, Pyrazol, Imidazol, 1,2,3-Triazol, Oxazol, Isoxazol, 1,2,3-Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, Thiazol, Isothiazol, 1,2,3-Thiadiazol, 1,2,5-Thiadiazol, Benzol, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, 1,2,3-Triazin, 1,2,4-Triazin und 1,2-, 1,3-und 1,4-Oxazin und -Thiazin bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei der mit R-R gebildete Ring und der mit R'-R' gebildete Ring gleich oder verschieden sind.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Brückenglied A um -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'-, wobei die einzelnen Restepaare R-R und R'-R' zusammen mit der verbundenen -C=C-Einheit gleiche oder verschiedene Ringe bilden, die aus unsubstituierten oder substituierten Benzolringen ausgewählt sind, wobei substituierte Benzolringe 1–4 Substituenten ausgewählt aus der aus gesättigtem oder ungesättigtem C1-4-Alkyl, gesättigtem oder ungesättigtem C1-4-Alkoxy, Fluor, Chlor, Brom, Iod und CF3 bestehenden Gruppe oder einem einzelnen zweiwertigen Substituenten, bei dem es sich um -O-(CH2)n-O- handelt, mit n = 1–3, enthalten.
  • Gegenwärtig wird der in dem Wirkstoff eingearbeitete Calcium-Komplexbildner vorzugsweise unter Ethylen-1,2-diol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure und 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure ausgewählt.
  • Die am meisten bevorzugten Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung weisen die allgemeine Formel I auf
    Figure 00130001
    Formel I/II wobei sich die Substituenten an den aromatischen Ringen in der ortho-Position befinden;
    X aus der aus CnH2n+1 (n = 1–10), (CnH2n+1)2N(CH2)m, (n = 1–6, m = 1–6) und substituiertem oder unsubstituiertem ArCH2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist und M für ein beliebiges physiologisch unbedenkliches Kation steht.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Diester um eine wie oben definierte Verbindung der allgemeinen Formel I, wobei X aus der aus C2H5, C3H7, i-C3H7, C4H9, C7H15, C8H17, CH2C6H5 und (CH3)2NCH2CH2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  • Besonders bevorzugt ist X aus der aus C2H5, C3H7, C4H9, C7H15 und C8H17 bestehenden Gruppe ausgewählt.
  • Am meisten bevorzugt steht X für C8H17.
  • Weitere am meisten bevorzugte Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung weisen die allgemeine Formel II auf,
    Figure 00140001
    Formel II wobei sich die Substituenten an den aromatischen Ringen in der ortho-Position befinden;
    Y für CnH2n+1(OCH2CH2)m (n = 1–20, m = 1–6) steht und M für ein beliebiges physiologisch unbedenkliches Kation steht.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Diester um eine wie oben definierte Verbindung der allgemeinen Formel II, wobei Y aus der aus CH3OCH2CH2, C2H5OCH2CH2, C3H7OCH2CH2, C4H9OCH2CH2, C7H15OCH2CH2, C8H17OCH2CH2, C10H21OCH2CH2, C16H33OCH2CH2 , C18H37OCH2CH2 , CH3(OCH2CH2)2, C2H5(OCH2CH2)2, C4H9 (OCH2CH2)2, C6H13(OCH2CH2)2, C7H1 5(OCH2CH2)2, C8H17(OCH2CH2)2, C10H21(OCH2CH2)2, CH3(OCH2CH2)3 und C7H15(OCH2CH2)3 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  • Besonders bevorzugt ist Y aus der aus C8H17OCH2CH2, C10H21OH2CH2, C16H33OCH2CH2, C18H37OCH2CH2, C8H17(OCH2CH2)2 und C10H21(OCH2CH2)2 bestehenden Gruppe ausgewählt.
  • Am meisten bevorzugt ist Y C8H17OCH2CH2.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ein Konjugat eines pharmazeutisch unbedenklichen Komplexbildners für zweiwertige Metallionen und einen Monoalkyl oder einen Monoalkylether von Ethylenglykolen. Zu den gegenwärtig bevorzugten Ethylenglykolen gehören Mono-, Di- und Triethylenglykol. Es ist auch möglich, Tetra-, Penta- oder Hexaethylenglykole zu verwenden, diese Verbindungen würden jedoch aufgrund ihrer hygroskopischen Eigenschaften besondere Reaktionsbedingungen erfordern.
  • Unerwarteterweise wurde jetzt gefunden, daß Diester von 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure (hier als BAPTA-Diester bzw. DP-BAPTA bezeichnet) verglichen mit anderen Derivaten dieses Calcium-Komplexbildners wesentlich verbesserte therapeutische Anwendungen haben.
  • Es leuchtet ein, daß die Lipophilizität der neuen BAPTA-Diester größer ist als die der Ausgangsverbindung und daß ihre verbesserte Wirkung möglicherweise darauf zurückzuführen ist, daß sie in der Plasmamembran der Zellen oder anderer Zellmembrankompartimente oder in deren Umgebung festgehalten werden und so ihre verbesserte Kapazität zur Modulierung zellulärer Funktionen wirkend machen. Es ist möglich, daß diese Diester von Komplexbildnern gezielt die Nähe der Zellmembran aufsuchen. Unabhängig vom genauen Wirkmechanismus sei offenbart, daß diese Diester ein verbessertes therapeutisches Profil aufweisen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, daß die 1ipophile Beschaffenheit der Diester von den an den Carboxylgruppen des BAPTA-Moleküls gebundenen Resten sowie den Gegenionen der nicht veresterten Carboxylgruppen (die in den oben abgebildeten Formeln I/II als X/Y bzw. M bezeichnet werden) abhängt.
  • In großem Ausmaß hängt die Lipophilizität einer Diesterverbindung von der Länge der aliphatischen Ketten in X/Y ab, wobei die Lipophilizität in dramatischer Weise zunimmt, wenn die Anzahl der Kohlenstoffe in X/Y auf bis zu 7 Atome anwächst. Bei aliphatischen Ketten, die länger als C7 sind, fällt der Zuwachs pro Kohlenstoff geringer aus. Im allgemeinen erhöhen Mono-, Di- oder Triethylenglykole in der Y-Stellung die Lipophilizität der Verbindung. Die Wahl der verschiedenen veresterten X/Y-Gruppen kann daher zur Feineinstellung der biologischen Aktivität der entwickelten erfindungsgemäßen Verbindungen dienen. Das gewählte Gegenion sollte ebenfalls unter dem Aspekt der Lipophilizität eines bestimmten Diesters gesehen werden. So wurde beispielsweise wie in Tabelle 1 gezeigt für Ca-Salze im Vergleich zu Na-Salzen eine höhere Octanolverteilung beobachtet.
  • Die Wahl des bevorzugten Alkohols und Gegenions, die für eine gegebene Zusammensetzung geeignet sind, richtet sich nach der beabsichtigten therapeutischen Verwendung des Konjugats und läßt sich vom Fachmann gemäß den Grundsätzen der Erfindung optimieren.
  • Es wird dem Fachmann bekannt sein, wie man das Konzept der Erfindung auf Zustände bzw. Krankheiten anwenden kann, die mit anomalen Konzentrationen zweiwertiger Metallionen, insbesondere Calciumionen, verbunden sind, so daß die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen einen Diester einer wirksamen Verbindung enthalten, bei der es sich um einen Metallionen-Komplexbildner handelt, der jedoch eine phamakologische Wirkung aufweist.
  • Viele Ereignisse (z. B. cytotoxische Chemikalien, physikalische Stimuli und infektiöse Mittel), die die Zellmembran schädigen, können eine Kaskade auslösen, die letztendlich zu einem Zustand führt, der einer ischämischen Schädigung ähnelt (Robbins et al., Pathological Basis for Disease, 1984, S. 120, W. B. Saunders Co.). Die vorliegende Erfindung wird unter diesen Umständen potentiell von Nutzen beim Schutz der Zellen sein, indem ein Komplexbildner für zweiwertige Metallionen entweder intrazellulär oder in die Plasmamembran oder deren Nähe eingeführt wird.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können für die offene Herzchirurgie und zur Behandlung von medizinischen Zuständen, die mit erhöhten Konzentrationen von zweiwertigen Metallionen, insbesondere Calcium, assoziiert sind, von Nutzen sein. Zu diesen Zuständen können Hirn- und Herzischämie, Schlaganfall, Herzinfarkt, Epilepsie, chronische neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und akute Entzündungen sowie mit neuronaler und muskulärer Hyperaktivität assoziierte Krankheiten wie Harninkontinenz, Prostatavergrößerung, Muskelkrämpfe, arterieller Bluthochdruck, Asthma und Reizkolon gehören, jedoch ist die Aufzählung nicht auf diese beschränkt.
  • Verschiedene Diester gemäß der vorliegenden Erfindung wurden in experimentellen Modellen von mit anomalen intrazellulären Calciumkonzentrationen assoziierten Krankheiten untersucht. Zu diesen experimentellen Modellen gehörten in-vitro- und in-vivo-Systemmodelle von Ischämie, Herzrhythmusstörungen und Epilepsie. Es wurde gezeigt, daß BAPTA-Diester in allen diesen Modellsystemen ausgeprägte Schutzwirkungen haben.
  • Die biologischen Schutzwirkungen der untersuchten erfindungsgemäßen BAPTA-Diester wurden in-vitro durch Aufzeichnung der Parameter von Zellfunktion, enzymatischen Aktivitäten und Überleben nach verschiedenen Insulten wie Glutamattoxizität und anoxieinduziertem neronalen Zelltod und ouabaininduzierter Toxizität in Kardiomyozyten verfolgt.
  • Die Tiermodellsysteme der in mongolischen Wüstenspringmäusen induzierten globalen Vorderhirnischämie und der in Wistar-Ratten induzierten Epilepsie stellen in-vivo-Modellsysteme dar.
  • Von verschiedenen in unserem Labor synthetisierten BAPTA-Diestern konnte nachgewiesen werden, daß sie besonders wirksame neuroprotektive, antiepileptische und kardioprotektive Verbindungen sind.
  • Neuroprotektive Wirkungen von BAPTA-Diestern
  • Erfindungsgemäße BAPTA-Diester schützten gegen Glutamattoxizität und Anoxie-induzierten Zelltod in kultivierten Kortex-Neuronen. Die protektive Wirkung des Wirkstoffs zeigte sich sowohl bei Zugabe von DP-BAPTA eine Stunde vor als auch bis zu wenigstens einer Stunde nach der Glutamat- bzw. Anoxie-Insultperiode.
  • Ischämiemodell
  • In mongolischen Wüstenspringmäusen wurde eine globale Vorderhirnischämie durch bilaterale Okklusion der Halsschlagadern induziert. Als Folge wurde eine Hirnschädigung beobachtet, wie aus mikroskopischen morphologischen Daten (histopathologische Analyse), veränderten Zellfunktionen (enzymatische NSE-Aktivität) und der gesamten Leistung der Tiere (Überlebensdaten) entnommen werden konnte.
  • Sowohl Dioctyl-BAPTA (DP-BAPTA-60) und Di(octylethylenglykol)-BAPTA (DP-BAPTA-99) wirkten präventiv in Hinsicht auf neuronale Schädigung. Die getesteten BAPTA-Diester verlängerten die Überlebenszeit der Tiere um einen Faktor von 2–3.
  • Es versteht sich, daß die vorteilhaften Schutzwirkungen von BAPTA-Diestern sowohl beim Schutz gegen fokale als auch globale ischämische Hirnschädigungen manifest werden.
  • Epilepsiemodell
  • Epilepsien sind eine Gruppe von Erkrankungen, die durch chronische, wiederkehrende, anfallsartige Veränderungen der neurologischen Funktion, verursacht durch Anomalien in der elektrischen Gehirnaktivität, gekennzeichnet sind. Die Episoden neurologischer Dysfunktion werden als epileptische Anfälle bezeichnet und in partielle bzw. fokale epileptische Anfälle, allgemeine epileptische Anfälle und Status epilepticus eingeteilt. Zu den Hauptursachen für Epilepsie in Menschen gehören genetische Prädisposition, Schädeltrauma, Gehirntumore, cerebrovaskuläre Unfälle und metabolische Störungen.
  • Im täglichen Leben des betroffenen Individuums führen epileptische Episoden zu großen Beschwerden und Unannehmlichkeiten, und in einigen Fällen können sie lebensbedrohlich und tödlich sein. Die am häufigsten verwendeten antiepileptischen Arzneimittel sind die letzten 20–30 Jahre verfügbar gewesen, und alle unterliegen ihren eigenen, mit Toxizitätsproblemen verbundenen Einschränkungen. Selbst wenn man alle gegenwärtig bekannten antiepileptischen Arzneimittel und Behandlungen einschließlich operativer Eingriffe anwendet, ist es bei einem großen Prozentsatz der Epilepsiepatienten nicht möglich, epileptische Anfälle vollständig zu verhindern. Bei Patienten mit Status epilepticus mit einer Mortalitätsrate von ungefähr 30% ist das Problem noch verschlimmert. Daher besteht ein großer Bedarf für eine sichere und wirksame Medizin mit minimalen Nebenwirkungen.
  • Bei dem in dieser Studie zur Untersuchung der protektiven Wirkungen von BAPTA-Diestern verwendeten Tiermodellsystem handelte es sich um die wohletablierte Pilocarpin-induzierte experimentelle Epilepsie in Ratten (Turski W. A., E. A. Cavalhiero, M. Schwarz, S. J. Czuczwar, Z. Kleinrok und L. Turski (1983), Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: Behavioral, Electroencephalographic and Neuropathological study. Behavioral Brain Research 9, 315–335).
  • Durch Di(octylethylenglykol)-BAPTA (DP-BAPTA-99) ließen sich allgemeine epileptische Anfälle und Status epilepticus im Tiermodell verhindern und die Mortalität senken.
  • Kardioprotektive Wirkungen
  • Kammerflimmern (KF) ist die gefährlichste Komplikation bei Herzinfarkt und operativen Eingriffen am Herzen. Es wird erfolgreich mit Hilfe des Defibrillators behandelt. Nichtsdestotrotz besteht während des elektrischen Schocks das Risiko, daß der Bypass oder andere Arten von Transplantaten geschädigt werden. Ein pharmakologischer Ansatz zur Lösung des Problems von KF auf dem Gebiet der Herzchirurgie ist daher entscheidend vorzuziehen. Die klinische Pharmakologie bietet jedoch für diesen Zweck kein zufriedenstellendes Arzneimittel, da die meisten der bekannten Antiarrhythmika die Energieanforderungen des Defibrillators erhöhen. Ein pharmakologischer Ansatz ist für die Behandlung des mit Ischämie verbundenen funktionellen atrioventrikulären Blocks vorzuziehen.
  • Es wurde gezeigt, daß Diethyl-BAPTA (DP-BAPTA-23) eine verzögerte Nachdepolarisation in kultivierten Kardiomyozyten, die eine Ouabain-Toxizitätsepisode durchlaufen hatten, verhinderte. Es könnte sich daher klinisch für: 1) die Prophylaxe von KF oder ventrikulären Tachyarrhythmien (VT) und 2) die Behandlung einer veränderten Erregungsleitung eignen.
  • Viele Antiarrhythmika sind erfolgreich für die obenerwähnten Zwecke eingesetzt worden. Alle jedoch haben ein oder mehrere unerwünschte Nebenwirkungen: proarrhythmische Wirkung, niedriger Blutdruck, negative inotrope Wirkung. Der Wirkmechanismus von BAPTA-Diestern ist gegenwärtig unbekannt. Es gibt jedoch keine phänomenologische Analogie zu herkömmlichen Antiarrhythmika. Keiner der bekannten antifibrillatorischen Wirkstoffe ist dazu in der Lage, die kardiale Erregungsleitung zu verbessern. Diese Nachteile der bekannten antifibrillatorischen Wirkstoffe weisen auf einen unerfüllten medizinischen Bedarf, was den Nutzen der BAPTA-Diester als neue Klasse antifibrillatorischer Wirkstoffe, die sich insbesondere bei der Thoraxchirurgie als nützlich erweisen können, zeigt.
  • Man sollte sich darüber bewußt sein, daß BAPTA-Diester in mehreren der untersuchten Modellsysteme ihre therapeutischen Wirkungen sowohl auf kurative als auch präventive Weise zeigten, so daß sie für prophylaktische und Heilungszwecke vor bzw. nach dem Insult verabreicht werden können.
  • Demgemäß können sich die BAPTA-Diester-Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung zur Behandlung bzw. Prophylaxe verschiedener pathologischer Vorgänge, die mit einem Überschuß an zweiwertigen Metallionen, insbesondere einem Überschuß an intrazellulären Calciumionen, verbunden sind, eignen. Bei diesen pathologischen Vorgängen handelt es sich z. B. um Vorgänge, die durch traumatische Ereignisse wie Hirnverletzungen, Schlaganfall, Ischämie und Infarkt oder bei chronischen Krankheiten wie Epilepsie, Parkinson-Krankheit und Alzheimer-Krankheit induziert werden. Zusätzlich kann bei anderen Krankheiten mit calciumabhängiger Hyperaktivität oder ionischem Ungleichgewicht wie z. B. akuter Entzündung, Harninkontinenz, Prostata vergrößerung, Muskelkrämpfen, arteriellem Bluthochdruck, Asthma und Reizkolon, jeweils eine Behandlung mit den BAPTA-Diester-Wirkstoffen von Nutzen sein. Die Wirkstoffe können auch dazu verwendet werden, während geplanter Eingriffe wie offener Herzchirurgie und Bypass-Operationen eine dem Normalzustand nahekommende Ionenhomöostase aufrechtzuerhalten.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Diester von Komplexbildnern als aktive Bestandteile enthalten, werden zusätzlich im Stand der Technik bekannte, pharmazeutisch unbedenkliche Verdünnungsmittel oder Trägerstoffe enthalten. Diese Zusammensetzungen können als beliebige geeignete Formulierung formuliert werden, einschließlich (jedoch nicht darauf beschränkt) Lösungen, Suspensionen, Aerosole, Micellen, Emulsionen, Mikroemulsionen, Tabletten und dergleichen, je nachdem, was für die entsprechende Verabreichungsroute erforderlich ist.
  • Die Erfindung beinhaltet alle geeigneten Verabreichungsrouten einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, oraler, intravenöser, intramuskulärer, subkutaner, inhalativer, intranasaler und rektaler Verabreichung sowie einer Verabreichung auf anderen bekannten Routen. In bevorzugten Ausführungsformen werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung intravenös, oral oder intramuskulär verabreicht.
  • Der Dosierungsspielraum für die Verabreichung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist so, daß die Dosen groß genug sind, um die gewünschte Schutzwirkung zu entfalten. Die verabreichte Dosierung hängt vom Alter, Geschlecht, Gesundheitszustand und Gewicht des Empfängers, der Art einer etwaigen Begleitbehandlung, der Behandlungshäufigkeit und der Art der gewünschten Wirkung ab. Dosierungsprotokoll und Verabreichungsweise werden durch den behandelnden Arzt oder einen anderen Fachmann bestimmt.
  • Von BAPTA-AM, einer bekannten Verbindung, wurde gezeigt, daß sie bei verschiedenen pathologischen Vorgängen, bei denen man annimmt, daß erhöhte Calciumspiegel eine Rolle spielen, eine effektive zellprotektive Wirkung haben (Tymianski et al., Neuron 11, 221–235, 1993; Tymianski et al., J. Cerebral Blood Flow and Metabolism, 14, 911–923, 1994; Abdel-Hamid und Tymianski, J. Neuroscience, 17, 3538–3553). Eine unkontrollierte Intervention in die Calciumhomöostase führt jedoch zu beträchtlichen Sicherheitsproblemen und schränkt die möglichen klinischen Anwendungen deutlich ein. Die Wirkung der hier offenbarten neuen Diester ist selektiver, da sie keinen Einfluß auf die intrazelluläre Calciumhomöostase auszuüben scheinen, und sie sind daher sicherer als die bereits bekannten BAPTA-Derivate.
  • A. CHEMISCHE BEISPIELE:
  • BEISPIEL 1: Synthese von BAPTA-Dialkylestern und deren Salzen
  • Die Synthese von Dinatrium- oder Calciumsalzen von Diestern von 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure (BAPTA) wurde wie folgt in drei Schritten ausgeführt:
  • Schritt 1. Darstellung eines Anhydrids von BAPTA:
    Figure 00230001
  • Schritt 2. Darstellung des BAPTA-Diesters:
    Figure 00240001
    X/Y = CnH2n+1 (n = 2–8), CnH2n+1(OCH2CH2)m (n = 1–7, m = 1–3), (CnH2n+1)2N(CH2)m, (n = 1–6, m = 1–6), ArCH2 Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen können X und Y vorteilhaft auch für CnH2n+1, wobei n = 1–10, und CnH2n+1(OCH2CH2) m, wobei n = 1–20 , m = 1–6 , stehen.
  • Schritt 3. Darstellung des Dinatrium- oder Calciumsalzes des Diesters von BAPTA:
    Figure 00240002
  • Schritt 1. Darstellung von BAPTA-Anhydrid
  • BAPTA (24 g, 0,05 mol), Pyridin (8 g, 0,1 mol) und Essigsäureanhydrid (95 ml, 1,0 mol) werden in einen mit einem Rückflußkühler (Wasserkühlung) und Magnetrührer ausgestatteten Einhalsrundkolben (500 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wird 5 Stunden lang unter kräftigem Rühren mit dem Magnetrührer auf 90°C erhitzt. Die Temperatur wird dann auf 50°C gesenkt, und es wird weitere 10 Stunden lang bei dieser Temperatur erhitzt. Nach Ende der 10 Stunden wird die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur gekühlt und der Niederschlag wird abfiltriert. Der Niederschlag wird dann viermal mit Essigsäureethylester (jeweils 50 ml) und zweimal mit Ether (jeweils 60 ml) gewaschen. Der Niederschlag wird 6–8 Stunden lang im Vakuum bei 50°C getrocknet. Bei dem Produkt handelt es sich um ein BAPTA-Anhydrid. Ausbeute 80% (17,6 g). Weißer Feststoff. Schmp. 148–149°C.
  • Analysen: DC. Die Verbindung zersetzte sich während der Analyse.
    1H-NMR (C6D5NO2), δ (ppm): 4,4 (s, 8H) , 4,47 (s, 4H) und 6,85–7,01 (m, 8H).
    IR: 1762,9 cm–1 (s), 1820,7 cm–1(s).
    Elementaranalyse. C22H20O8N2. Berechnet: C 60,00%, H 4,54%, N 6,36%. Gefunden: C 59,60%, H 4,66%, N 6,20%.
  • Schritt 2. Darstellung von Alkyl- oder Aryldiestern von BAPTA
  • Das BAPTA-Anhydrid von Schritt 1 (10 g, 0,023 mol) und der entsprechende absolute Alkohol (300 mll werden unter einer Argonatmosphäre in einen mit Rückflußkühler und Magnetrührer ausgestatteten Einhalsrundkolben gegeben. Die Mischung wird unter kräftigem Rühren in einem Ölbad auf 90°C (bei Methyl- und Ethyldiestern auf 70°C) erhitzt. Nach 6 Stunden wird ungefähr die Hälfte des Alkohols von der Reaktionsmischung abdestilliert (hochmolekulare Alkohole werden im Vakuum destilliert). Die so erhaltene Mischung wird auf 0°C abgekühlt und 5–8 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Der Niederschlag wird von der Lösung abgesaugt (Glasfilter N4) und 3–4mal mit etwa 40 ml Ethanol, anschließend dreimal mit Essigsäureethylester (jeweils 100 ml) und schliefllich dreimal mit Diethylether (jeweils 150 ml) gewaschen. Das Produkt wird 8 Stunden lang im Vakuum getrocknet.
  • Die chemischen/physikalischen Daten der synthetisierten BAPTA-Diester sind unten ausgeführt:
  • Ethyldiester von BAPTA. Ausbeute 90% (11 g). Weißes Pulver. Schmp. 161–162°C. DC-Analyse. Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie. Bei dem Laufmittel handelt es sich um eine Mischung aus Chloroform mit Methanol und Wasser (80 : 20 : 1,5 v/v). Zum Anfärben wird das Chromatogramm mit dem Anfärbespray eingesprüht und dann bei 350–400°C angekohlt. Die Zusammensetzung des Anfärbesprays ist 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), Ethanol (200 ml), 98%ige H2SO4 (10 ml) und Eisessig (2 ml). Ein Fleck. Rf 0,3.
    1H-NMR (CD3OD), δ (ppm): 1,05–1,11 (t, 6H), 3,91–4,00 (dd, 4H), 4,05 (s, 4H), 4,14 (s, 4H), 4,27 (s, 4H), 6,83–6,96 (m, 8H).
    Elementaranalyse. C26H32O10H2: Berechnet: C 58,64%, H 6,03%, N 5,26%. Gefunden: 58,00%, H 6,00%, N 5,09%.
  • Propyldiester von BAPTA. Ausbeute 90% (11 g). Weißes Pulver. Schmp. 187°C. DC-Analyse. Die Bedingungen für die Analysen von Diethyl- und Dipropylester von BAPTA entsprechen sich. Ein Fleck. Rf 0,35.
    1H-NMR [(CD3)2SO], δ (ppm): 0,71–0,77 (t, 6H), 1,38–1,47 (m, 4H), 3,80–3,85 (t, 4H), 4,00 (s, 4H), 4,13 (s, 4H), 4,20 (s, 4H), 6,70–6, 96 (m, 8H).
    Elementaranalyse. C28H30O10H2. Berechnet: C 60,00%, H 6,43%, N 5,00%. Gefunden: C 60,25%, H 6,77%, H 5,08%.
  • Isopropyldiester von BAPTA. Ausbeute 80% (10,2 g). Weißes Pulver. Schmp. 181–182°C. DC-Analyse. Kieselgel 60 F254 auf Aluminiumfolie. Laufmittel: Chloroform : Methanol (65 : 30 v/v). Zum Anfärben wird das Chromatogramm mit dem Anfärbespray eingesprüht und dann bei 350–400°C angekohlt. Die Zusammenset:aung des Anfärbesprays ist 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Ein Fleck. Rf 0,72.
    1H-NMR[(CD3)2SO], δ (ppm) : 1,07–1,09 (d, 12H), 4,00 (s, 4H), 4,08 (s, 4H), 4,22 (s, 4H), 4,78–4,85 (m, 2H), 6,71–6,98 (m, 8H).
    Elementaranalyse. C28H3 6O10N2. Berechnet: C 60,00%, H 6,43%, N 5,00%. Gefunden: 59,78%, H 6,50%, N 5,00%.
  • Butyldiester von BAPTA. Ausbeute 90% (12,1 g). Weißes Pulver. Schmp. 183°C. DC-Analyse. Die Bedingungen für die Analysen von Diethyl- und Dibutylester von BAPTA entsprechen sind. Ein Fleck. Rf 0,42.
    1H-NMR[(CD3)2SO). δ (ppm): 0,74–0, 80 (t, 6H), 1,09–1,18 (m, 4H), 1,33–1,39 (m, 4H), 3,80–3,86 (t, 4H), 3,98 (s, 4H), 4,10 (s, 4H), 4,17 (s, 4H), 6,69–6,92 (m, 8H).
    Elementaranalyse. C30H40O10N2. Berechnet: C 61,22%, H 6,80%, N 4,76%. Gefunden: C 61,54%, H 7,10%, N 5,03%.
  • Heptyldiester von BAPTA. Ausbeute 70% (10,8 g). Weißes Pulver. Schmp. 146–147°C. DC-Analyse. Die Bedingungen für die Analyse von Ethyl- und Heptyldiester von BAPTA entsprechen sich. Ein Fleck. Rf 0,50.
    1H-NMR[(CD3)2SO]. δ (ppm): 0,79–0,84 (t, 6H), 1,08–1,17 (breites s, 16H), 1,34–1,43 (m, 4H), 3,79–3,87 (t, 4H), 3,98 (s, 4H), 4,13 (s, 4H), 4,17 (s, 4H), 6,67–6,92 (m, 8H).
    Elementaranalyse: C36H52O10N2. Berechnet: C 64,29%, H 7,74%, N 4,16%. Gefunden: C 64,37%, H 7,82%, N 3,88%.
  • Octyldiester von BAPTA. Ausbeute 70% (11,3 g). Weißes Pulver. Schmp. 155°C. DC-Analyse. Die Bedingungen für die Analyse von Diethyl- und Dioctylester von BAPTA entsprechen sich. Ein Fleck. Rf 0,55.
    1H-NMR(CD3)2SO], 6 (ppm): 0,81–0,86 (t, 6H), 1,19–1,23 (breites s, 20H), 1,29–1,34 (m, 4H), 3,83–3,87 (m, 4H), 3,98 (s, 4H), 4,11 (s, 4H), 4,19 (s, 4H), 6,80–6,84 (m, 8H).
    Elementaranalyse : C38H56O10N2. Berechnet: C 65,14%, H 8,00%, N 4,00%. Gefunden: C 64,91%, H 8,20%, N 3,76%.
  • Benzyldiester von BAPTA. Ausbeute 70% (10,6 g). Weißes Pulver. Schmp. 161–163°C. DC-Analyse. Die Beέüngungen für die Analyse von Ethyl- und Benzyldiester von BAPTA entsprechen sich. Ein Fleck. Rf 0,64. (Der Benzyldiester wird gelöst in Dimethylformamid auf die DC-Platte aufgetragen).
    1H-NMR(CD3)2SO], δ (ppm): 4,02 (s, 4H), 4,18–4,19 (d, 8H), 4,97 (s, 4H), 6,73–6,94 (m, 8H), 7,22–7,32 (m, 10H).
    Elementaranalyse: C36H36O10N2. Berechnet: C 65,85%, H 5,49%, N 4,27%. Gefunden: C 65,56%, H 5,83%, N 4,12%.
  • 2-(Dimethylamino)ethyldiester von BAPTA. Ausbeute 70% (9,95 g). Weißes Pulver. Schmp. 126–127°C. DC-Analyse. Kieselgel 60 F254 auf Aluminiumfolie. Laufmittel: Chloroform : Methanol : Wasser 60 : 40 : 2 v/v. Ein Fleck. Rf 0,2.
    1H-NMR(CDCl3), δ (ppm): 2,57 (s, 12H), 2,60–2,63 (t, 4H), 3,60 (s, 4H), 3,75–3,78 (t, 4H), 4,06 (s, 4H), 0,11 (s, 4H), 6,68–6,85 (m, 8H).
    Elementaranalyse. C30H42O10N4. Berechnet: C 58,25%, H 6,80%, N 9,06%. Gefunden: C 57,94%, H 6,90%, N 8,97%.
  • Schritt 3a. Darstellung von Natriumsalzen von BAPTA-Diestern
  • Der entsprechende Alkyldiester von BAPTA (0,119 mol) wird in einen mit einem Magnetrührer ausgestatteten Erlenmeyerkolben (500 ml) gegeben. Etwa 250 ml einer Mischung von Methanol mit Wasser (1 : 1 v/v) werden zum Ester gegeben. Diese Mischung wird kräftig gerührt, da sich der Ester nicht in der Lösung löst. Zur gerührten Mischung wird dann eine konzentrierte Lösung von NaHCO3 (0,038 mol, 3,19 g) bzw. eine konzentrierte Lösung von McONa (0,038 mol) in Wasser gegeben, und nach 5–8 Stunden wird die Mischung klar. Dies zeigt an, daß der Alkyldiester in das Dinatriumsalz umgewandelt worden ist. Methanol und Wasser werden im Vakuum abgedampft. Das so erhaltene Salz wird durch azeotrope Destillation mit Ethanol und Diethylether getrocknet. Schließlich wird das Salz 8 Stunden lang im Vakuum (5–6 mmHg) getrocknet.
  • Ethyldiester von BAPTA, Dinatriumsalz. Weißes Pulver. Ausbeute 95% (10,4 g).
  • Elementaranalyse. C26H30O10N2Na2. Berechnet: C 54,16%, H 5,21%, N 4,86%, Na 7,98%. Gefunden: C 54,10%, H 5,27%, N 4,65%, Na 8,10%.
  • Propyldiester von BAPTA, Dinatriumsalz. Weißes Pulver. Ausbeute 95% (10,9 g).
  • Elementaranalyse. C28H36O10N2Na2 2. Berechnet: C 55,63%, H 5,63%, N 4,63%, Na 7,61%. Gefunden: C 54,76%, H 6,13%, N 4,46%, Na 6,73%.
  • Butyldiester von BAPTA, Dinatriumsalz. Weißer Pulver. Ausbeute 95% (11,2 g).
  • Elementaranalyse. C30Ha38O10N2Na2 2. Berechnet: C 56,96%, H 6,01%, N 4,43%, Na 7,28%. Gefunden: C 56,50%, H 6,00%, N 4,20%, Na 7,30%.
  • Heptyldiester von BAPTA, Dinatriumsalz. Weißes Pulver. Ausbeute 90% (10,3 g).
  • Elementaranalyse. C36H50O10N2Na2. Berechnet: C 60,33%, H 6,98%, N 3,91%, Na 6,42%. Gefunden: C 59,88%, H 7,49%, N 4,12%, Na 6,76%.
  • Octyldiester von BAPTA, Dinatriumsalz. Weifles Pulver. Ausbeute 90% (15,7 g).
  • Elementaranalyse. C38H54O10N2Na2. Berechnet: C 61,29%, H 7,26%, N 3,76%, Na 6,16%. Gefunden: C 60,90%, H 7,81%, N 3,26%, Na 6,52%.
  • Schritt 3b. Darstellung von Calciumsalzen von BAPTA-Diestern
  • Der entsprechende BAPTA-Diester (1 g) wird in a 1 einer Mischung von Ethanol mit Wasser (70 : 30 v/v) gelöst. Diese Lösung wird mit einem Moläquivalent Ca(OH)2 versetzt. Die so erhaltene Mischung wird mit einem Magnetrührer 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Bei den Salzen der Ethyl-, Propyl- und Butyldiester von BAPTA wird die Lösung dann durch Whatmann-Papier N1 filtriert und im Vakuum (20–30 mmHg) zur Trockne eingedampft. Der Niederschlag wird dreimal mit Diethylether (jeweils 100 ml) gewaschen und 6 Stunden lang bei Raumtemperatur im Vakuum (2–3 mmHg) getrocknet.
  • Bei den Calciumsalzen der Heptyl- und Octyldiester von BAPTA wird die Ethanollösung zur Trockne eingedampft. Der Niederschlag wird in 0,8 1 Ethanol gelöst. Die so erhaltene Mischung wird durch Whatmann-Papier N1 filtriert, und das Ethanol wird dann in Vakuum (20–25 mmHg) abgedampft. Der Niederschlag wird dreimal mit Diethylether (jeweils 100 ml) gewaschen und 6–7 Stunden lang bei Raumtemperatur im Vakuum (2–3 mmHg) getrocknet.
  • Diethyletter von BAPTA, Calciumsalz. Weies Pulver. Ausbeute 90% (0,96 g).
  • C26H30N2O10Ca. Berechnet: C 54,70%, H 5,26%, N 4,91%, Ca 7,01%. Gefunden: C 54,32%, H 5,40%, N 4,81%, Ca 6,81%. Propyldiester von BAPTA, Calciumsalz. Weißes Pulver. Ausbeute 90% (0,98 g).
  • C28H34N2O10Ca. Berechnet: C 56,19%, H 5,68%, N 4,68%, Ca 6,69%. Gefunden: C 56,22%, H 5,88%, N 4,51%, Ca 6,51%.
  • Butyldiester von BAPTA, Calciumsalz. Weißes Pulver. Ausbeute 90% (0,90 g).
  • C30H38N2O10Ca. Berechnet: C 57,50%, H 6,07%, N 4,47%, Ca 6,39%. Gefunden: C 57,18%, H 6,24%, N 4,28%, Ca 6,11%.
  • Heptyldiester von BAPTA, Calciumsalz. Weißes Pulver. Ausbeute 80% (0,85 g).
  • C36H50N2O10Ca. Berechnet: C 61,71%, H 7,14%, N 4,00%, Ca 5,71%. Gefunden: C 61,44%, H 7,24%, N 4,18%, Ca. 6,31%.
  • Octyldiester von BAPTA, Calciumsalz. Weißes Pulver. Ausbeute 80% (0,83 g).
  • C38H54N2O10Ca. Berechnet: C 61,79%, H 7,32%, N 3,79%, Ca 5,42%. Gefunden: C 61,94%, H 7,14%, N 4,00%, Ca. 5,31%.
  • BEISPIEL 2: Synthese von BAPTA-Diestern von Mono-, Di- und Triethylenglykolalkylethern und derea Salze
  • Die Vorschrift für die Synthese dieser Salze ist ein Vier-Schritt-Verfahren ähnlich der Vorschrift für die Darstellung der Salze der Alkyldiester von BAPTA.
  • Schritt 1. Darstellung von BAPTA-Anhydrid
  • Dieser erste Schritt für die Darstellung eines BAPTA-Anhydrids ist mit Schritt 1 in der Vorschrift zur Synthese der Alkyldiester von BAPTA, die oben in Beispiel 1 beschrieben wurde, identisch.
  • Schritt 2. Synthese von Mono-, Di- und Trielthylenglykolmonoalkylethern
  • Die Synthese von Mono-, Di- und Triethylenglykolmonoalkylethern wird gemäß dem folgenden Schema durchgeführt:
  • H(OCH2CH2)mOH + Na → H (OCH2CH2)mONa + 1/2H2 H(OCH2CH2)mONa + CnH2n + 1Br → H(OCH2CH2)mOCnH2n+1 + NaBr m = 1–3, n = 5–18
  • Etwa 0,8–0,9 g Natrium (in kleine Stücke mit einem Durchmesser von jeweils 5-8 mm geschnitten;) werden unter einer Argonatmosphäre in einen mit Rückflußkühler und Magnetrührer ausgestatteten Zweihalsrundkolben (250 ml) gegeben. Das Natrium wird ebenfalls unter Argon mit Ethylenglykol (35 ml, 0, 62 mol) versetzt, und der Kolben wird unter kräftigem Rühren in einem Ölbad auf 70°C erhitzt. Nachdem das Natrium weitgehend aufgelöst ist, wird das restliche Natrium (eine typische Natriummenge ist 3,9 g, 0,17 mol) Stückchen für Stückchen zur Reaktionsmischung gegeben. Es sollte angemerkt werden, daß das Auflösen des Natriums durch eine Erhöhung, der Temperatur der Reaktionsmischung mit einer erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit einhergeht. Um eine Explosion zu vermeiden, ist es erforderlich, das Natrium langsam zuzugeben, so daß die Reaktion unter guter Kontrolle ist. Nachdem sich das ganze Natrium aufgelöst hat, wird der Reaktionskolben mit einem Tropftrichter mit der Lösung des entsprechenden Alkylbromids (21,5 g, 0,12 mol) in Tetrahydrofuran (60 ml) versehen. Die Lösung aus dem Tropftrichter wird tropfenweise in den Reaktionskolben gegeben. Die Temperatur der Reaktionsmischung wird auf 70°C gehalten. Nahezu sofort fällt Natriumbromid aus, dessen Menge im Verlauf der Reaktion zunimmt. Nach 16 Stunden wird die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt, und etwa 150 ml Wasser werden zur organischen Lösung gegeben. Das Produkt wird mit zwei Portionen (jeweils 40 ml) Essigsäurethylester extrahiert. Die vereinigte Essigsäureethylesterlösung wird mit Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Die gelbe Lösung des Produkts in Essigsäureethylester wird durch Erhitzen mit Aktivkohle entfärbt. Die farblose Lösung wird von der Kohle abfiltriert, und das Lösungsmittel wird abgedampft. Das so erhaltene Produkt wird im Vakuum destilliert und auf physikalische und chemische Eigenschaften analysiert.
  • Ethylenglykolmonoheptylether. Farblose Flüssigkeit. Sdp. 95°C/1 mmHg. Ausbeute 70% (13,4 g).
  • DC-Analyse. Kieselgel 60 F254 auf Aluminiumfolie. Laufmittel: Essigsäureethylester : n-Hexan, 2 : 1 v/v. Anfärbereagens: 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Zur Anfärbung wird das Chromatogramm mit dem Anfärbespray eingesprüht und dann bei 350°C angekohlt. Ein Fleck. Rf 0,8.
  • 1H-NMR(CDCl3), δ (ppm): 0,84–0,90 (t, 3H), 1,27–1,33 (breites s, 8H), 1,55–1,61 (m, 2H), 2,25–2,30 (t, 1H, Signal für die OH-Gruppe, Position variabel), 3,43–3,54 (m, 4H), 3,69–3,75 (m, 2H).
  • Diethylenglykolheptylether. Farblose Flüssigkeit. Sdp. 100°C/1 mmHg. Ausbeute 70% (17,1 g).
  • DC-Analyse. Die Bedingungen für die Analysen der Heptylether von Mono- und Diethylenglykol entsprechen sich. Ein Fleck. Rf 0,4.
  • 1H-NMR(CDCl3), δ (ppm): 0,84–0,90 (t, 3H), 1,27–1,32 (breites s, 8H), 1,55–1,61 (m, 2H), 2,71 (t, 1H, Signal für die OH-Gruppe), 3,45–3,48 (t, 2H), 3,58–3,75 (m, 8H).
  • Triethylenglykolheptylether. Farblose Flüssigkeit. Sdp. 107°C/1 mmHg. Ausbeute 70% (20,8 g).
  • DC-Analyse. Die Bedingungen für die Analysen der Monoheptylether von Mono- und Triethylenglykol entsprechen sich. Ein Fleck. Rf 0,3.
  • 1H-NMR(CDCl3), δ (ppm): 0,84–0,90 (t, 3H), 1,26–1,29 (breites s, 8H), 1,54–1,57 (m, 2H), 2,72 (t, 1H, Signal für die OH-Gruppe), 3,41–3,47 (t, 2H), 3,58–3,74 (m, 12H).
  • Monoethylenglykoloctylether. Farblose Flüssigkeit. Sdp. 60°C/0,5 mmHg. Ausbeute 85%.
  • DC-Analyse. Die Bedingungen für die Analysen von Ethylenglykoldioctylether sind die gleichen wie oben. Ein Fleck. Rf 0,7.
  • 1H-NMR(CDCl3), δ (ppm): 0,83–0,89 (t, 3H), 1,25–1,27 (breites s, 10H), 1,54–1,57 (m, 2H), 2,39 (t, 1H), 3,41–3,52 (m, 4H), 3,67–3,73 (m, 4H).
  • Schritt 3. Synthese von BAPTA-Diestern von Mono-, Di- und Triethylenglykolmonoalkylethern
  • Das BAPTA-Anhydrid von Schritt 1 (1,5 g, 0,0034 mol) und der entsprechende Mono-, Di- oder Triethylenglykolmonoalkylether von Schritt 2 (10–12 ml) werden unter einer Argonatmosphäre in einen mit Rückflußkühler und Magnetrührer ausgestatteten Einhalsrundkolben (50 ml) gegeben. Die Mischung wird unter kräftigem Rühren in einem Ölbad auf 115–120°C erhitzt. Nach 1–1,5 Stunden wird die Mischung klar. Es wird weitere 1,5 Stunden lang erhitzt, bis die Reaktion beendet ist. Der Kolben wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt, und etwa 100 ml Petrolether (Sdp. 60–80°C) werden zugegeben. Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert und dreimal mit Petrolether (jeweils 40 ml) gewaschen. Das feste Produkt wird 5 Stunden lang im Vakuum getrocknet und zur Überprüfung der Produkteigenschaften analysiert, wie beispielhaft für die folgenden Verbindungen angegeben:
    BAPTA-Diester von Ethylenglykolmethylether. Weißer Feststoff. Schmp. 151–152°C. Ausbeute 90% (1,81 g).
  • DC-Analyse. Kieselgel 60 F254 auf Aluminiumfolie. Laufmittel Chloroform : Methanol (1 : 1 v/v). Zur Anfärbung wird das Chromatogramm mit dem Anfärbespray besprüht und dann bei 100–150°C angekohlt. Die Zusammensetzung des Anfärbesprays ist 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Ein Fleck. Rf 0,14.
  • 1H-NMR (CD3OD), δ (ppm): 3,33 (s, 6H), 3,47–3,51 (t, 4H), 3,85 (s, 4H), 4,02–4,06 (t, 4H), 4,35 (s, 4H), 7,02–7,11 (m, 8H).
  • Elementaranalyse: C28H36O12N2. Berechnet: C 56,76%, H 6,08%, N 4,73%. Gefunden: C 56,38%, H 6,39%, N 4,72%.
  • BAPTA-Diester von Ethylenglykolheptylether. Weißer Feststoff. Schmp. 111–112°C. Ausbeute 90% (2,32 g).
  • DC-Analyse. Die Bedingungen für die DC-Analyse des, BAPTA-Diesters von Ethylenglykolhethylether und des BAPTA-Diesters von Ethylenglykolheptylether sind gleich. Ein Fleck. Rf 0,4.
  • 1H-NMR(CD3)2SO], δ (ppm): 0,81–0,86 (t, 6H), 1,22 (breites s, 16H), 1.42 (m, 4H), 3,27–3,32 (m, 4H), 3,37–3,40 (m, 4H), 3,96–3,99 (m, 8H), 4,12 (s, 2H), 4,19 (s, 2H), 6,73–6,92 (m, 8H).
  • Elementaranalysen. C40H40O12N2. Berechnet: C 63,16%, H 7,90%, N 3,68%. Gefunden: C 63,30%, H 8,44%, N 3,76%.
  • BAPTA-Diester von Ethylenglykoloctylether. Weißer Feststoff. Schmp. 121–122°C. Ausbeute 80% (1,4 g).
  • DC-Analyse. Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie. Laufmittel Chloroform : Methanol (1 : 1 v/v). Zur Anfärbung wird das Chromatogramm mit dem Anfärbespray besprüht und dann bei 100–150°C angekohlt. Die Zusammensetzung des Anfärbesprays ist 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Ein Fleck. Rf 0,45.
    1H-NMR(CDCl3), δ (ppm): 0,84–0,89 (t, 6H), 1,26 (breites s, 20H), 1,51–1,57 (m, 4H), 3,37–3,42 (t, 4H), 3,53–3,56 (m, 4H), 3,96 (s, 4H), 4,03 (s, 4H), 4,17–4,21 (m, 4H), 4,37 (s, 4H), 6,87–6,94 (m, 4H), 7,03–7,09 (m, 4H).
    Elementaranalyse. C42H64N2O12. Berechnet: C 63,96%, H 8,12%, N 3,55%. Gefunden: C 63,57%, H 8,11%, N 3,53%.
  • BAPTA-Diester von Diethylenglykolheptylether. Weißer Feststoff. Schmp. 95–96°C. Ausbeute 85% (2,5 g).
  • DC-Analyse. Die Bedingungen für die Analyse des BAPTA-Diesters von Ethylenglykolmethylether und des BAPTA-Diesters von Diethylenglykolheptylether sind die gleichen. Ein Fleck. Rf 0,40.
  • 1H-NMR(CD3)2SO], δ (ppm): 0,81–0,86 (t, 6H), 1,23 (breites s, 16H), 1.45 (m, 4H), 3,30–3,35 (m, 8H), 3,40–3,46 (m, 12H), 3,97–3,99 (m, 8H), 4,13 (s, 4H), 4,19 (s, 4H), 6,74–6,92 (m, 8H), 12,37 (s, 2H).
  • Elementaranalysen. C44H68O12N2. Berechnet: C 62,26%, H 8,02%, N 3,30%. Gefunden: C 6,47%, H 8,42%, N 3,40%.
  • BAPTA-Ester von Triethylenglykolheptylether. Weißer Feststoff. Schmp. 63–65°C. Ausbeute 85% (2,7 g).
  • DC-Analyse. Die Bedingungen für die Analyse des BAPTA-Diesters von Triethylenglykolheptylether und des BAPTA-Diesters von Ethylenglykolmethylether sind die gleichen. Ein Fleck. Rf 0,40.
  • 1H-NMR(CD3)2SO], δ (ppm): 0,81–0,87 (t, 6H), 1,23 (breites s, 16H), 1.45 (m, 4H), 3,31–3,36 (m, 4H), 3,42–3,48 (m, 20H), 3,97–3,99 (m, 8H), 4,13 (s, 4H), 4,19 (s, 4H), 6,74–6,92 (m, 8H), 12,38 (s, 2H).
  • Schritt 4a. Darstellung des Dinatriumsalzes von BAPTA-Diestern von Mono-, Di- oder Triethylenglykolmonoalkylethern.
  • Der entsprechende BAPTA-Diester des Monoalkylethers von Mono-, Di- bzw. Triethylenglykol (0,0025 mol) wird in Methanol gelöst (zum Lösen von 1,0 g BAPTA-Diester sind ungefähr 10 ml Alkohol erforderlich), und die so erhaltene Lösung wird in einen mit einem Magnetrührer ausgestatteten Erlenmeyerkolben (50 ml) gegeben. Eine Lösung von Natriumhydrogencarbonat in Wasser (0,005 mol in 2 ml) wird zu einer Methanollösung des BAPTA-Diesters gegeben, und die Mischung wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird dann im Vakuum (30 mmHg) abgedampft. Der so erhaltene Niederschlag wird dreimal durch azeotrope Destillation mit Ethanol und zweimal mit Diethylether getrocknet. Schließlich wird das so erhaltene Produkt mit Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet.
  • BAPTA-Diester von Monoethylenglykolmethylether, Dinatriumsalz. Weifler Feststoff. Hygroskopisch. Ausbeute 95% (1,5 g).
  • Elementaranalyse. C28H34O12N2Na2. Berechnet: C 52,80%, H 5,35%, N 4,40%, Na 7,23%. Gefunden: C 52,20%, H 5,59%, N 4,49%, Na 7,30%.
  • BAPTA-Diester von Monoethylenglykolheptylether, Dinatriumsalz. Weißer Feststoff. Hygroskopisch. Ausbeute 95% (1,9 g).
  • Elementaranalyse. C40H58O12N2Na2. Berechnet: C 59,70%, H 7,21%, N 3,48%, Na 5,72%. Gefunden: C 59,60%, N 7,75%, N 3,51%, Na 5,51%.
  • BAPTA-Diester von Diethylenglykolheptylether, Dinatriumsalz. Weißer Feststoff. Hygroskopisch. Ausbeute 95% (2,1 g).
  • Elementaranalyse. C44H66O14N2Na2. Berechnet: C 59,19%, H 7,40%, N 3,14%, Na 5,16%. Gefunden: C 58,55%, H 7,43%, N 3,46%, Na 5,49%.
  • BAPTA-Diester von Triethylenglykolheptylether, Dinatriumsalz. Weißes Wachs. Sehr hygroskopisch. Ausbeute 90% (2,2 g).
  • Elementaranalyse. C48H74O16N2Na2. Berechnet: C 58,77%, H 7,55%, N 2,86%, Na 4,69%. Gefunden: C 57,98%, H 8,03%, N 2,94%, Na 4,64%.
  • BAPTA-Diester von Ethylenglykoloctylether, Dinatriumsalz. Weißer Feststoff. Ausbeute 80%.
  • DC-Analyse. Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie. Laufmittel Chloroform : Methanol (1 : 1 v/v). Zur Anfärbung wird das Chromatogramm mit dem Anfärbespray besprüht und dann bei 100–150°C angekohlt. Die Zusammensetzung des Anfärbesprays ist 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Ein Fleck. Rf 0, 45.
    1H-NMR(CDCl3), δ (ppm): 0,84–0,89 (t, 6H), 1,26 (breites s, 20H), 1,51–1,57 (m, 4H), 3,37–3,42 (t, 4H), 3,53–3,56 (m, 4H), 3,96 (s, 4H), 4,03 (s, 4H), 4,17–4,21 (m, 4H), 4,37 (s, 4H), 6,87–6,94 (m, 4H), 7,03–7,09 (m, 4H).
    Elementaranalyse. C42H64N2O12. Berechnet: C 63,96%, H 8,12%, N 3,55%. Gefunden: C 63,57%, H 8,11%, N 3,53%.
  • Schritt 4b. Darstellung des Calciumsalzes von BAPTA-Diestern von Mono-, Di- oder Triethylenglykolmonoalkylethern.
  • Der entsprechende Monoalkylether des Mono-, Di- bzw. Triethylenglykoldiesters von BAPTA (0,0025 mol) wird in 250 ml Methanol gelöst. Diese Lösung wird mit etwa 3–5 ml Wasser versetzt. Die so erhaltene Lösung wird in einen mit einem Magnetrührer ausgestatteten Erlenmeyerkolben (300 ml) gegeben. Unter kräftigem Rühren wird dieser Lösung CaH2-Pulver (0,0025 mol) zugesetzt. Es wird 3 weitere Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach 3 Stunden wird die Mischung durch einen Papierfilter (Whatman N1) filtriert, und die so erhaltene Lösung wird im Vakuum (10–15 mmHg) eingedampft. Der Niederschlag wird dreimal durch azeotrope Destillation mit Ethanol (jeweils 25–30 ml) und zweimal mit Diethylether getrocknet. Schließlich wird das Produkt mit Hexan gewaschen und 5 Stunden lang bei Raumtemperatur im Vakuum (5 mmHg) getrocknet.
  • Monoethylenglykolmethyletherdiester von BAPTA, Calciumsalz. Weißes Pulver. Ausbeute 90% (1,42 g).
  • C28H34N2O12Ca. Berechnet: C 53,33%, H 5,40%, N 4,44%, Ca 6,35%. Gefunden: C 53,74%, H 5,78%, N 4,43%, Na 5,90%.
  • Monoethylenglykolheptyletherdiester von BAPTA, Calciumsalz. Weißes Pulver. Ausbeute 90% (1,79 g).
  • C40H58N2O12Ca. Berechnet: C 60,15%, H 7,27%, N 3,51%, Ca 5,01%. Gefunden: C 60,32%, N 7,63%, N 3,54%, Ca 4,59%.
  • Monoethylenglykoloctyletherdiester von BAPTA, Calciumsalz. Weißes Pulver. Ausbeute 90% (1.81 g).
  • C42H62N2O12Ca. Berechnet: C 61,01%, H 7,50%, N 3,38%, Ca 4,84%. Gefunden: C 61,00%, N 7,82%, N 3,54%, Ca 4,88%.
  • Diethylenglykolheptyletherdiester von BAPTA, Calciumsalz. Weißer Feststoff. Ausbeute 80% (1.77 g).
  • C44H66N2O14Ca. Berechnet: C 59,59%, H 7,44%, N 3,16%, Ca 4,51%. Gefunden: C 59,61%, N 7,79%, N 3,15%, Ca 4,04%.
  • Triethylenglykolmethyletherdiester von BAPTA, Calciumsalz. Weißer Feststoff. Ausbeute 80% (1.61 g).
  • C36H50N2O16Ca. Berechnet: C 53,60%, H 6,20%, N 3,47%, Ca 4,96%. Gefunden: C 53,95%, N 6,33%, N 3,20%, Ca 4,73%.
  • BEISPIEL 3: in-vitro-Lipophilizitätsmessungen von BAPTA-Diester-Salzen
  • Die Lipophilizitätswerte mehrerer erfindungsgemäßer BAPTA-Diester-Salze wurden durch Vergleich der Löslichkeit dieser Verbindungen in organischen bzw. wäßrigen Lösungen untersucht. Als organische und wäßrige Lösungen wurden Octanol bzw. physiologische Kochsalzlösung verwendet. Der Verteilungskoeffizient („Partition Coefficient" Pc), d. h. das Verteilungsverhältnis zwischen organischer und wäßriger Phase, wurde für mehrere bestimmte BAPTA-Diester-Salze der allgemeinen Formeln I und II bestimmt:
    Figure 00410001
    Formel I/II wobei sich die Substituenten an den aromatischen Ringen in der ortho-Stellung befinden;
    X/Y für CnH2n+ 1 (n = 2–8) oder CnH2n+1(OCH2CH2)m, (m = 1–3, n = 1–18) stehen und M für Na+ oder Ca++ steht, wie angegeben.
  • Die Ergebnisse, wiedergegeben als der berechnete logPc, sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1. Octanol-Kochsalzlösung-Verteilungskoeffizienten (Pc) von BAPTA-Diestern
    Figure 00420001
  • Es ist zu ersehen, daß die Mehrzahl der neuen BAPTA-Diester im wesentlich lipophiler sind als die BAPTA-Ausgangsverbindung. Interessanterweise werden die Verteilungskoeffizienten. auch durch die Wahl des Gegenions beeinflußt. Im allgemeinen. sind die Calciumsalze von BAPTA-Diestern lipophiler als die ihnen entsprechenden Natriumsalze.
  • BEISPIEL 4: in-vitro-Wirkung von BAPTA-Diestern auf die Wasser/Octnaol-Verteilung von Ca++-, Fe++- und Zn++-Ionen
  • Die komplexbildenden Eigenschaften der neuen erfindungsgemäßen BAPTA-Diester wurden in wäßriger und hydrophober Umgebung untersucht und werden hier durch die Wirkung des Dioctylethylenglykol-BAPTA (DP-BAPTA-99, Dinatriumsalz) auf drei verschiedene zweiwertige Metallionen (Fe++, Zn++ und Ca++) gezeigt.
  • Das für diese Gruppe von Experimenten verwendete hydrophile/hydrophobe System bestand aus 15 ml Octanol und 15 ml Kochsalzlösung, pH = 6,5. DP-BAPTA-99 wurde in der Octanollösung gelöst, und diese Phase wurde dann mit der Kochsalzlösung gemischt. Die DP-BAPTA-Konzentration in den verschiedenen Experimenten betrug von 2,1 × 10–6 bis 5,5 × 10–4 M in den Experimenten mit Ca2+ und von 5,4 × 10–6 bis 1,4 × 10–3 M in den Experimenten mit Zn2+ bzw. Fe2+, wie jeweils für die einzelnen Punkte in den 1A–C angegeben. Die entsprechenden Metallionen wurden den wäßrigen Lösungen als Chloride in folgenden Konzentrationen zugesetzt: FeCl2 2 × 10–3 M, ZnCl2 10–4 M, CaCl2 2 × 10–3 M.
  • Octanol- und Pufferphasen wurden gemischt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gevortext und anschließend 10 min bei 4000 U/min zentrifugiert, um die Mischung in die zwei Phasen zu trennen.
  • Für Wasser- und Octanolproben wurden unterschiedliche Analysevorschriften angewendet:
    • i) Die Wasserproben wurden gegen ICP-Standards von Merck analysiert. In den untersuchten Lösungen wurden Ca und Zn durch induktiv gekoppelte Plasmaatomemissionsspektrometrie bestimmt. Hierzu wurde ein ICP-AES, Modell „Spectroflame Modula E" von Spectro, Kleve, Deutschland, mit Standard-Querstromzerstäuber und fester EOP-Flamme verwendet. Das Leistungsniveau betrug 1,2 kW, der Kühlmittelstrom 15 l/min, der Hilfsstrom 0,5 l/min und der Zerstäuberstrom 0,5 l/min.
    • ii) Octanolproben von jeweils 2 ml wurden in einem Glasröhrchen in einen Heizblock gestellt. Das Octanol wurde durch eine Kombination von Erhitzen auf 150°C und kontinuierliches Spülen mit Stickstoff verdampft. Der Rückstand wurde in 2 ml konzentrierter Salpetersäure gelöst und eine Stunde lang auf 120°C erhitzt. Die Röhrchen wurden dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, und anschließend wurde entionisiertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 10 ml zugegeben.
  • Es wurde gezeigt, daß der Dioctylethylenglykol-BAPTA um einen Faktor von 10000 lipophiler ist als das Natriumsalz des Ausgangsmoleküls BAPTA und sich vorzugsweise im organischen Lösungsmittel, hier durch Octanol wiedergegeben, löst.
  • Weiterhin vermittelt, wie aus 1A–C hervorgeht, der BAPTA-Diester den Übergang von Metallionen vom Wasser nach Octanol und reichert diese Ionen in der organischen Phase an, während dies bei BAPTA nicht der Fall ist. Diese bevorzugte komplexierende Wirkung des BAPTA-Diesters wird dadurch augenscheinlich, daß Zn++-Ionen bei einer Wirkstoffkonzentration von lediglich 10 μM vom Wasser nach Octanol überführt werden, wobei die Wirkstoffkonzentration für den entsprechenden Transfer von Ca++- und Fe++-Ionen 250–500 μM beträgt.
  • B. BIOLOGISCHE BEWERTUNG VON BAPTA-DIESTERN
  • Die neuen Diester von erfindungsgemäßen Komplexbildnern wurden in verschiedenen biologischen Modellsystemen auf ihre Schutzwirkung auf Zellen bzw. Organe in Kultur, die einem Insult mit anomalen Calciumspiegeln ausgesetzt. wurden, getestet. Die Ergebnisse der in-vitro (Gewebekulturzellen; Hirnhomogenisate) und in-vivo (mongolische Wüstenspringmäuse und Wistar-Ratten) durchgeführten Experimente sind im folgenden wiedergegeben:
  • BEISPIEL 5: Wirkungen von BAPTA-Diestern auf die intrazelluläre Ca++-Konzentration (in-vitro-Studien)
  • Die komplexierende Wirkung zweier verschiedener BAPTA-Diester auf die intrazelluläre Ca++-Konzentration wurde in-vitro in kultivierten Hippocampus-Nervenzellen von Ratten untersucht und durch Aufzeichnung der Fluoreszenz verfolgt.
  • Zellkultur. Primäre dissoziierte Hippocampuskulturen von Ratten wurden von E19-Föten hergestellt und 104 Wochen lang auf 13-mm-Deckgläsern kultiviert. Kurz gesagt wurden die Zellen in DMEM mit 10% Pferdeserum und 10% fötalem Kälberserum ausplattiert, und das DMEM wurde nach einer Woche durch DMEM mit 10% Pferdeserum ersetzt. Die Gliaproliferation wurde durch 3 d Inkubieren mit 5-Fluor-2'-desoxyuridin, beginnend 5 d nach dem Ausplattieren, blockiert. Zur Abbildung von Ca2+i wurden die Deckgläser mit Aufzeichnungsmedium gewaschen und in Gegenwart von 0,2% (w/v) bei Raumtemperatur unter Schütteln 1–1,5 Stunden lang mit 3 μM Fluo-3/AM (Molecular Probes) inkubiert. Die Kulturen wurden dann wenigstens 1 Stunde lang im Aufzeichnungsmedium gewaschen und innerhalb der nächsten 1–3 Stunden verwendet.
  • Lösungen und Wirkstoffe. Das Aufzeichnungsmedium enthielt: 129 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 4,2 mM Glucose und 10 mM HEPES. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,4 und die Osmolarität durch Zugabe von Saccharose auf 320 mOsm eingestellt. Vor der Verwendung wurden die BAPTA-Diester Diethyl-BAPTA (DP-BAPTA-23) und Dioctylethylenglykol-BAPTA (DP-BAPTA-99) jeweils als Dinatriumsalze im Aufzeichnungsmedium aus eingefrorenen Stammlösungen zubereitet. Wie bei den einzelnen Experimenten angegeben, wurde der BAPTA-Diester in einer Endkonzentration von 0, 1 mM mit einer Druckpipette mit einem Durchmesser an der Spitze von 2 μm etwa 50 μm von der Zelle entfernt plaziert. Die Wirkstoffe wurde mittels der Pipette mit einem Druckimpuls von 0,5–5 sec Dauer appliziert.
  • Abbildung. Nach dem Auftragen des Farbstoffs Fluo-3/AM (Molecular Probes) wurden die gläsernen Deckplättchen in ein konfokales Laser-Scanningmikroskop (Leica, Heidelberg, Deutschland) gegeben und mit dem Aufzeichnungsmedium einschließlich 1 μM Tetrodotoxin (TTX) bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 3–5 ml/min superfundiert. Das konfokale Laser-Scanningmikroskop ist mit einem Argonionenlaser für eine Anregung bei einer Wellenlänge von 488 nm ausgestattet. Das Laserlicht wurde, um photodynamische Schäden zu vermeiden, auf 1–3% der nominalen Intensität reduziert. Es wurden Aufnahmen von 256 × 256 Pixel mit einem 63 × Wasserimmersionsobjektiv aufgenommen. Bei Bedarf wurde eine vollständige dreidimensionale Rekonstruktion der Zelle aus 15–20 aufeinanderfolgenden optischen 0,5–1,0-μm-Schnitten durch die Zelle vorgenommen. Die Intensität der Fluoreszenz wurde mit Leica-Analysesoftware und Adobe Photoshop (Adobe Systems) quantifiziert. Veränderungen in der Fluo-3- Fluoreszenz wurden durch Teilen der Netto-Fluoreszenz durch die Fluoreszenz vor der Behandlung (ΔF/F) standardisiert.
  • Die in DMEM-Medium mit 2,4 mM Ca++ kultivierten Hippocampus-Nervenzellen wurden entweder mit dem Vehikel, d. h. dem Aufnahmemedium (2, Rahmen 1,2) oder mit DP-BAPTA 23 (2, Rahmen 3 bis 11) behandelt. Die Zugabe des Wirkstoffs (1 mM in einem 9-Sekunden-Puls) induzierte eine Absenkung der intrazellulären Calciumkonzentrationen, was sich in einer Verminderung der in den behandelten Zellen aufgenommenen Fluoreszenz widerspiegelte. Dieser temporären Abnahme der Ca++-Konzentration folgte innerhalb von 7–8 Sekunden nach dem Abwaschen des Wirkstoffs von den Zellen eine vollständige Erholung (siehe 2, Rahmen 12 bis 20). Durch kürzere Anwendungen der gleichen Wirkstoffmenge wurden kürzere und kleinere Absenkungen der Fluoreszenz in der gleichen Zelle induziert (Daten nicht gezeigt).
  • Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, daß die gleichen Konzentrationen des Tetranatriumsalzes des Ausgangswirkstoffes, d. h. BAPTA-Na4, bei dem es sich um einen nichtzellmembrangängigen Wirkstoff handelt, lediglich eine unbeträchtliche Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration bewirkten, wenn sie auf die Oberfläche der kultivierten Hippocampusneuronen von Ratten aufgetragen wurden (Daten nicht gezeigt).
  • In 3 ist die Wirkung von BAPTA-Diestern auf die. kaliuminduzierte Erhöhung intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen gezeigt.
  • Hippocampus-Nervenzellen wurden wie oben beschrieben kultiviert und zu den mit Sternchen (*) markierten Zeitpunkten 40 Millisekunden langen K+-Pulsen (die aus einer Pipette mit 100 mM KCl verabreicht wurden) ausgesetzt. Unter den Kontrollbedingungen bewirkte ein jeder solcher K+-Puls eine 3-4fache Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration, die als eine vorübergehende Zunahme des Fluoreszenzsignals aufgezeichnet wurde.
  • Die Zellen wurden dann vor jeder Aufzeichnungsperiode 5 Minuten lang mit 0,1, 1,0 bzw. 10,0 μg/ml Dioctylethylenglykol-BAPTA (DP-BAPTA 99) perfundiert. Bei den in 3 gezeigten Ergebnissen handelt es sich um die graphischen Darstellungen der von fünf einzelnen Hippocampus-Nervenzellen gemittelten Fluoreszenzveränderungen.
  • Wie aus 3 zu ersehen ist, schwächt der BAPTA-Diester die kaliuminduzierte Erhöhung der intrazellulären Kalziumionenkonzentration ab, wobei diese Wirkung konzentrationsabhängig ist.
  • BEISPIEL 6: Wirkung von BAPTA-Diestern auf die Na/R-ATPase-Aktivität
  • Fernandes et al. (Neurochem Int. 28: 497–500, 1996) untersuchten die Aktivität des Enzyms Na/K-ATPase in Ratten-Hippocampus, während einer durch eine Pilocarpin-Injektion induzierten experimentellen Epilepsie. Gemäß dieser Studie wurde gefunden, daß die Enzymaktivität während der akuten und der Ruheperioden vermindert und während der chronischen Phase der Epilepsie erhöht (jedoch nicht auf ein normales Niveau) war. Eine mögliche Schlußfolgerung aus diesen Ergebnissen ist, daß Änderungen in der Na/K-ATPase-Aktivität nach durch Pilocarpin-Injektion induziertem Hirnschaden am Auftreten von spontanen und wiederkehrenden epileptischen Anfällen beteiligt sein könnten.
  • Pilocarpin-induzierte epileptische Anfälle werden. als Modell für mehrere Arten menschlicher Epilepsien und deren Entwicklung angesehen. Es wird vorgeschlagen, daß die verminderte Aktivität des Enzyms Na/K-ATPase, die zu erhöhten extrazellulären K+-Konzentrationen führt, mit zum epileptischen Zustand und seiner Entwicklung beitragen kann.
  • Die Wirkungen von BAPTA-Diestern auf Na/K-ATPase-Aktivität wurden daher in Homogenaten aus Mäusehirn, die mit verschiedenen Konzentrationen von Diethyl-BAPTA (DP-BAPTA 27, Dinatriumsalz) behandelt worden waren, untersucht. Die getesteten BAPTA-Diester-Konzentrationen lagen im Bereich von 10–7 bis 102 μg/ml.
  • Herstellung des Homogenats aus Mäusehirn. Männliche CD-1-Mäuse (10 bis 21 Tage alt) wurden durch schnelles Enthaupten getötet. Der Schädel wurde geöffnet und die Hirne wurden entnommen und zweigeteilt. Der Kortex wurde isoliert, in Ringers Natriumpuffer gegeben, dreimal mit eiskalter PBS gewaschen und auf Eis aufbewahrt. Das Hirngewebe wurde unter Verwendung eines Polytrons bei 14000 U/min 4 × 30 Sekunden lang auf Eis homogenisiert. Der Homogenisierungspuffer enthielt: 250 mM Saccharose; 1 mM EGTA; 20 mM HEPES-Tris, pH-Wert 7,4 und den Proteaseinhibitor PMSF.
  • Das Homogenat wurde in einer gekühlten Sorval-Zentrifuge 30 Minuten lang bei 27000 g zentrifugiert. Die Membranfraktion wurde abgenommen und im Homogenisierungspuffer resuspendiert. Dem ATPase-Reaktionsmedium wurde frisches DP-BAPTA-27, das für jedes Experiment aus einer 1 mg/ml-Stammlösung verdünnt wurde, zu den angegebenen Endkonzentrationen zugesetzt.
  • Na/K-ATPase-Assay. Die Na/K-ATPase wurde wie bereits beschrieben (Norby J, G. Coupled (1988) Assay of the Na+-K+ ATPase Activity. Methods in Enzymology. 156: 166–119) in Abwesenheit und Gegenwart des Na/K-ATPase- Inhibitors Ouabain (3 mM) gemessen. Der Proteingehalt wurde mit dem Bio Rad-Bradford-Assay wie bereits beschrieben (Bradford, M. (1978) Protein assay. Ann. Biochem. 72: 248–257) bestimmt.
  • Wie aus 4 hervorgeht, induziert DP-BAPTA-27 eine dosisabhängige Erhöhung der Na/K-ATPase-Aktivität im cerebralen Kortex von Mäusen, und es ist daher vorstellbar, daß dies unter physiologischen Bedingungen zu niedrigeren Konzentrationen an extrazellulärem K+ führt.
  • BEISPIEL 7: Wirkungen von BAPTA-Diestern auf die zelluläre Herzfunktion
  • Die kardioprotektive Wirksamkeit von Diethyl-BAPTA (DP-BAPTA-23) wurde durch eine Untersuchung der Wirkung dieses Wirkstoffs auf das Membranaktionspotential in kultivierten Kardiomyozyten bewertet.
  • Ventrikuläre Myozyten wurden durch einen enzymatischen Dissoziationsvorgang (Isenberg G. und Klockner U. (1982) Pflugers Arch: 395, 6–18) aus erwachsenen Meerschweinchen (350–400 g) erhalten. Die Zellen wurden in 0,5 ml Aufnahmebad auf den Tisch eines invertierten Mikroskops (Nikon, DIAPHOT-TMD, Tokio, Japan) gegeben. Das Bad wurde mit Tyrode-Lösung (140 mM NaCl, 4 mM KCl, 1, 8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM Glucose und 5 mM HEPES, pH-Wert 7,4) bei einer Geschwindigkeit von 1–2 ml/min superfundiert. Die Myozyten wurden mit 0,2 Hz stimuliert und bei Raumtemperatur (24–25°C) untersucht. Aus gläsernen Mikropipetten wurden Patch-Elektroden angefertigt, die an der Spitze einen Widerstand von 2–4 MΩ aufwiesen, wenn die Pipette mit einer Lösung mit 120 mM K-Aspartat, 20 mM KCl, 3,5 mM MgCl2, 20 mM KHP2O4, 3 mM NaATP2, 10 mM Glucose und 1 mM EGTA, pH-Wert 7,4, gefüllt wurde.
  • Die Aktionspotentiale der ventrikulären Meerschwein chenmyozyten würden mit einem Axon 200A (Axon Instruments, Inc. Foster City, CA, USA) aufgezeichnet, wie bereits beschrieben (Felzen et al. 1995, Pflugers Arch: 427, 422–431; Felzen et al. 1996, Circ. Res. 78, 253–261).
  • Es wurde gefunden, daß 10–11–10–14 mol/1 DP-BAPTA-23 eine Hyperpolarisation induziert, indem es die Ruhepotentiale der kultivierten Kardiomyozyten herabsetzt (8 mV) und die Länge ihres Aktionspotentials verkürzt (Ergebnisse nicht gezeigt).
  • In 5 sind die gemessenen Membranpotentiale von stimulierten Myozyten gezeigt, die in Abwesenheit (Spur 1, Kontrollzellen) bzw. in 6minütiger (Spur 2), 10minütiger (Spur 3) und 13minütiger (Spur 4) Gegenwart von 10–6 M Ouabain inkubiert worden waren, im Vergleich zu stimulierten Myozyten, die mit Ouabain und 10–6 mg/ml DP-BAPTA-23 35 min lang inkubiert worden waren (Spur 5), gemessen wurden.
  • Wie aus 5 ersichtlich ist, führte eine 13minütige Inkubation mit dem Na/K-ATPase-Inhibitor Ouabain zu einer verzögerten Nach-Depolarisation („Delayed After-Depolarisation", DAD) in den Kardiomyozyten (in Spur 4 mit einem Pfeil gekennzeichnet). Diese Reaktion, die für die Ouabain-Toxizität charakteristisch ist, wurde durch DP-BAPTA-23 abgestellt (Spur 5).
  • BEISPIEL 8: Wirkungen von BAPTA-Diestern auf den glutamatinduzierten Tod von Nervenzellen
  • Das neuroprotektive Potential von erfindungsgemäßen BAPTA-Diestern wurde im in-vitro-Modellsystem der Glutamattoxizität untersucht.
  • Neonatale Kortex-Neuronen von Ratten wurden in Platten mit 24 Vertiefungen plattiert und wie von Sattler et al. (J. Cereb Blood Flow Metab, 17, 456 (1997)) beschrieben in einer Gewebekultur kultiviert.
  • Zum Entfernen von etwaig vorhandenen Serumproteinen wurden die Zellen einmal mit 0,5 ml/Vertiefung Kontrollösung gewaschen. Die Kontrollösung enthielt: 121 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES-Säure, 7 mM HEPES-Na-Salz, 1 mM Na-Pyruvat, 1,8 mM CaCli, 3 mM NaHCO3, 0,01 Glycin, 20 mM D-Glucose, pH-Wert 7,4 (Sigma).
  • DP-BAPTA-23 wurde zunächst in DMSO gelöst und dann mit der Kontrollösung weiter auf Konzentrationen von 300, 100, 30, 10 und 3 μM verdünnt. Die zu den Zellen zugesetzte Menge an DMSO sollte 1% nicht überschreiten. Die kultivierten Nervenzellen wurden mit dem getesteten DP-BAPTA-23 beladen (0,5 ml/Vertiefung) und in einer feucht gehaltenen Kammer 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Das Medium in den Platten wurden dann abgesaugt und durch frische Kontrollösung ersetzt, und es wurde weitere 30 min bei 37°C inkubiert. Dann wurde zu jeder Vertiefung Propidiumiodid (PI) aus einer 1-mg/ml-Stammlösung (Molecular Probes Inc., Kat.-Nr. P-1304) zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml gegeben, und der Fluoreszenz-Ausgangswert wurde abgelesen. Die Zellen wurden dann bei Raumtemperatur 1 Stunde lang in Abwesenheit bzw. Gegenwart verschiedener Konzentrationen von DP-BAPTA-23 (wie bei den jeweiligen Experimenten angegeben) mit 300 mM L-Glutamat (Sigma) behandelt.
  • Bei den Protokollen war, immer wenn die Zellen vor dem Glutamat-Insult mit dem BAPTA-Diester behandelt wurden, der Wirkstoff während der gesamten Insultperiode im Medium vorhanden (6). In den anderen Fällen wurde DP-BAPTA erst nach dem Glutamat-Insult zugegeben, zu. den angegebenen Zeitpunkten (siehe 7).
  • Den Kontrollvertiefungen, die den getesteten BAPTA-Diester enthielten, wurde zur Überprüfung des durch die Verbindung alleine verursachten Toxizitätsniveaus Kontrollösung ohne jegliches Glutamat zugesetzt.
  • Nach dem Insult wurde das Medium mit dem Glutamat entfernt und gegen das gleiche Medium ohne Glutamat, jedoch mit PI (50 μg/ml) ausgetauscht. Die PI-Fluoreszenzmessungen erfolgten über 24 Stunden im Abstand von jeweils 1 Stunde.
  • Nach dem Abziehen der Hintergrundfluoreszenz wurden die gemessenen Fluoreszenzen gegen PI-Fluoreszenzmessungen von identischen Kulturen, die 1 Stunde lang 1 mM NMDA exponiert worden waren, normalisiert. Der Zelltod wurde durch die in einem Cytofluor-II-Multi-Well-Plattenscanner (PerSeptive Biosystems) verfolgt. Der Glutamat-Insult führte innerhalb von 24 Stunden zum Tod von nahezu 100% der Nervenzellen.
  • Die Fraktion an toten Zellen wurde wie folgt berechnet:
    Fraktion toter Zellen = (Ft-F0) /FNMDA
    wobei Ft = PI-Fluorzeszenz zum Zeitpunkt t, F0 = PI-Ausgangsfluoreszenz zum Zeitpunkt Null und FNMDA = PI-Fluo- reszenz identischer Kulturen, die in gleicher Weise präpariert und plattiert wurden, nach Abziehen der Hintergrundfluoreszenz, 24 Stunden nach 60minütiger Behandlung mit 1 mM N-Methyl-D-aspartat (NMDA).
  • Wie in 6 gezeigt verringerte DP-BAPTA-23 den durch Glutamat induzierten Tod von Nervenzellen in einer dosisabhängigen Weise. Diese Schutzwirkung wird sogar schon bei BAPTA-Diester-Konzentrationen von 30 μM augenscheinlich.
  • Diese neuroprotektive Wirkung ließ sich weiterhin zeigen, wenn man das DP-BAPTA (100 μM) entweder eine Stunde vorher (6) mit Glu oder bis zu 60 min nach dem Glutamat-Insult (siehe 7) zusetzte.
  • BEISPIEL 9: Neuroprotektive Wirkungen von BAPTA-Diestern – Modell einer globalen Vorderhirnischämie
  • Die neuroprotektive Wirksamkeit von erfindungsgemäßen BAPTA-Diestern wurde weiterhin im Modellsystem einer globalen Vorderhirnischämie in mongolischen Wüstenspringmäusen untersucht.
  • Tiere. Für die Studie wurden männliche mongolische Wüstenspringmäuse mit einem Gewicht von 60–70 g (Charles River Laboratories, USA) verwendet.
  • Induktion der Ischämie. Die Wüstenspringmäuse wurden mit Halothan (4%) in einer Anästhesiekammer (30% Sauerstoff, 70% Distickstoffoxid) betäubt, und die Betäubung wurde mit 1% Halothan in 30% Sauerstoff und 70% Distickstoffoxid unter Verwendung von Gesichtsmasken aufrechterhalten. Zur Induktion der Ischämie wurden die beiden Halsschlagadern durch einen Schnitt in der Mitte des Halses isoliert und temporär für 10 oder 20 Minuten (wie angegeben) unter Verwendung von Arterienklips okkludiert. Während der gesamten Zeitspanne der cerebralen Ischämie wurde, während sich die Klips an ihrem Platz befanden, die Betäubung lediglich mit 30% Sauerstoff und 70% Distickstoffoxid aufrechterhalten, ohne Halothan. Während der Ischämie wurde die Rektaltemperatur, die mit einem Rektalthermometer verfolgt wurde, mit einer Wärmelampe und einem Heizkissen auf 37–37,5°C gehalten. Bei der Verabreichung wurden die getesteten BAPTA-Diester den Tieren entweder parenteral (i. p.) oder oral verabreicht, zu den beim jeweiligen Experiment angegebenen Zeitpunkten und Dosierungen. Die Kontrolltiere wurden lediglich mit dem Vehikel behandelt, d. h. mit einer 0,9%igen NaCl-Lösung anstelle der BAPTA-Diesterverbindung.
  • Überlebensstudien. Das Überleben der Tiere nach einer 20minütigen globalen Vorderhirnischämie wurde bis zu 10 Tage nach der Ischämie verfolgt.
  • Statistiken. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung des Student's t-test mit Bonferroni-Korrekturen und p < 0,05 als Signifikanzniveau.
  • Assay auf neuronenspezifische Enolase (NSE). 24 und 72 Stunden nach einer 10minütigen cerebralen Ischämie wurden Blutproben aus den Augenhöhlen von Wüstenspringmäusen entnommen. Die Blutproben wurden 5 min lang bei 3000 U/min zentrifugiert, wodurch man das Serum (den Überstand) erhielt. Die NSE-Aktivität im Serum wurde durch einen Radioimmunassay unter Verwendung eines NSE-Kits (Pharmatope Ltd., Israel) bestimmt.
  • Die enzymatische Aktivität der neuronenspezifischen Enolase (NSE) im Serum wurde zur Bewertung der Wirksamkeit der getesteten BAPTA-Diester bei der Prävention von neuronalen Schädigungen verwendet. Es wurde gefunden, daß bei einer experimentellen globalen Ischämie nach der Ischämie die NSE-Konzentrationen 2 bis 192 Stunden lang erhöht sind, was dem verzögerten Tod von Nervenzellen, der unter diesen experimentellen Bedingungen stattfand, entsprach. NSE kann somit als quantitativer Marker für das Ausmaß der neuronalen Schädigung dienen.
  • In 8, 9 und 10 sind die Ergebnisse von Experimenten zusammengefaßt, in denen zwei erfindungsgemäße BAPTA-Diester, Dioctyl-BAPTA (DP-BAPTA-60, Dinatriumsalz) und Dioctylethylenglykol-BAPTA (DP-BAPTA-99, Dinatriumsalz) auf ihre neuronale Schutzwirkung untersucht wurden. Im Modellsystem der globalen Vorderhirnischämie in mongolischen Wüstenspringmäusen wurden verschiedene Verabreichungsprotokolle und -routen des Wirkstoffs untersucht. Dabei wurden die folgenden Parameter aufgezeichnet: (i) die Aktivität der neuronenspezifischen Enolase im Serum des Tieres als Indikator für den Tod von Nervenzellen (8 & 9) und (ii) das Überleben der Tiere (10).
  • Wie in 8 gezeigt verhinderte eine den unmittelbar beim Einsetzen der Reperfusion (t = 0) bzw. 3 Stunden nach dem Beginn der Reperfusion (t = 3) den ischämischen Wüstenspringmäusen i. p. verabreichte einzelne Dosis von entweder 5 μg/kg DP-BAPTA-60 (graue Balken) oder von 5 μg/kg DP-BAPTA-99 (schwarze Balken) eine Schädigung der Nervenzellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß DP-BAPTA-Wirkstoffe sowohl kurativ als auch präventiv wirken.
  • In 9 ist die neuroprotektive Wirkung von DP-BAPTA-99 gezeigt, das oral nach zwei Protokollen verabreicht wurde: a) eine 0,5 mg/kg Dosis 4 Stunden vor Einsetzen der Reperfusion, gefolgt von einer weiteren 0,5 mg/kg Dosis zu Beginn der Reperfusion, und b) 0,5 mg/kg täglich in den 3 Tagen nach der Ischämie. Bei beiden Protokollen zeigt DP-BAPTA-99 eine starke protektive Wirkung, wie durch die signifikante Abnahme der NSE-Aktivität im Serum, gemessen 24 h und 72 h nach der globalen cerebralen Ischämie, bewiesen wird.
  • Bei einem anderen Experiment wurde die protektive Wirkung von BAPTA-Diestern untersucht, indem man die Überlebenszeit von Wüstenspringmäusen verfolgte, die wie oben beschrieben einer 20minütigen globalen Vorderhirnischämie unterzogen wurden. Die getesteten Tiere (N = 15 in jeder Gruppe) erhielten entweder 10 μg/kg DP-BAPTA-60 oder DP-BAPTA-99, die beim Einsetzen der Reperfusion i. p. als einzelne Dosis verabreicht wurden. Die Kontrolltiere (N = 30) erhielten die Vehikellösung.
  • Wie in 10 gezeigt ist, verlängerten sowohl DP-BAPTA-60 als auch DP-BAPTA-99 die Überlebenszeit der Tiere, um einen Faktor von 2 bzw. 3.
  • Zusammenfassend wurde gezeigt, daß BAPTA-Diester sowohl kurativ als auch präventiv gegen durch Ischämie verursachte Nervenschädigungen wirken; und daß sich für die Verabreichung des Wirkstoffs sowohl parenterale als auch orale Routen eignen.
  • Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, daß in Hinsicht auf ihre neuroprotektiven Eigenschaften die Dinatrium- und die Calciumsalze von Dioctyl-BAPTA gleichermaßen wirksam waren. Andererseits zeigte das Natriumsalz von Dioctylethylenglykol-BAPTA (DP-BAPTA-99) in diesem Modellsystem verglichen mit dem Calciumsalz des Moleküls eine wesentlich ausgeprägtere neuroprotektive Wirkung.
  • BEISPIEL 10: Histopathologische Analyse der neuroprotektiven Wirkungen von BAPTA-Diestern
  • Als weiterer Beleg für die neuroprotektive Wirkung von BAPTA-Diestern wurden Hirnproben von Tieren, bei denen eine globale Vorderhirnischämie entweder in Abwesenheit oder in Gegenwart eines BAPTA-Diesters induziert worden war, einer eingehenden halbquantitativen pathologischen Analyse mittels Mikroskop unterzogen.
  • Es wurden zwei erfindungsgemäße BAPTA-Diester mit der gegenwärtig besten neuroprotektiven Wirkung getestet, d. h. Dioctyl-BAPTA (DP-BAPTA-60) und Dioctylethylenglykol-BAPTA (DP-BAPTA-99), jeweils als Dinatriumsalze.
  • Neununddreißig mongolische Wüstenspringmäuse wurden einer 10minütigen globalen Vorderhirnischämie unterzogen, die gemäß der in Beispiel 9 beschriebenen Vorgehensweise induziert wurde. Die Tiere wurden in drei Gruppen aufgeteilt, die wie folgt behandelt wurden:
    Gruppe I: 13 Wüstenspringmäuse; i. p. injiziert mit einer einzelnen Dosis von 5 μg DP-BAPTA-60/kg Körpergewicht unmittelbar nach der Ischämie.
    Gruppe II: 11 Wüstenspringmäuse; i. p. injiziert mit einer einzelnen Dosis von 5 μg DP-BAPTA-99/kg Körpergewicht unmittelbar nach der Ischämie.
    Gruppe III: 15 Wüstenspringmäuse; Kontrolltiere, denen das Vehikel, d. h. Kochsalzlösung, injiziert wurde.
  • Drei Tage nach der Ischämie wurden die Tiere abermals betäubt, mit Ketamin und Ksilazyn, und ihre Hirne wurden operativ entfernt und 7 Tage lang in 4%iger Formalinlösung in PBS aufbewahrt. Von der dorsalen Hippocampusregion wurden 7 μm dicke Schnitte angefertigt, die für die mikroskopische Untersuchung mit Hematoxylin und Eosin angefärbt wurden.
  • Bei der Aufteilung in drei Unterregionen (medial, mittig und lateral) wurden die CA-1-, CA-2-, CA-3- und Gyrus-dentatus-Unterfelder des Hippocampus ausgewertet. Dann wurde die Gesamtanzahl lebender Zellen der einzelnen Sektionen gezählt, und die neuronale Schädigung wurde beurteilt. Die für die Beurteilung der Hirnschäden verwendete, freigewählte Skala umfaßte fünf Stufen: 0 – steht für normales Gewebe, keine Schädigung; 1 – steht für eine minimale Schädigung, weniger als etwa 20% Nekrose von Neuronen; 2 – steht für eine geringe Schädigung, weniger als etwa 40% Nekrose von Neuronen; 3 – steht für eine mäßige Schädigung, weniger als etwa 60% Nekrose von Neuronen; und 4 – steht für eine deutliche Schädigung, mehr als 80% der Neuronen sind tot.
  • Wie aus 11 ersichtlich ist, zeigt DP-BAPTA-99 in den CA-2-, CA-3- und Gyrus-dentatus-Regionen des Hippocampus eine signifikante neuroprotektive Wirkung. Von DP-BAPTA-60 wurde gleichfalls gefunden, daß es die durch Ischämie induzierten neuronalen Schädigungen in den gleichen Regionen wirksam vermindert, jedoch in einem geringeren Ausmaße als DP-BAPTA-99.
  • BEISPIEL 11: Antiepileptische Wirkung von BAPTA-Diestern (in-vivo-Modell)
  • Die antiepileptische Wirkung von DP-BAPTA-99 wurde im Tiermodell mit Wistar-Ratten untersucht, wobei epileptische Anfälle durch Pilocarpin (400 mg/kg) induziert wurden.
  • Für dieses Experiment wurden Wistar-Ratten mit einem Gewicht von ungefähr 350 g verwendet. Eine Stunde vor der Injektion von Pilocarpin wurden verschiedene Konzentrationen von DP-BAPTA-99 wie in 12A–B angegeben i. p. injiziert. 30 min vor der Gabe von Pilocarpin (400 mg/kg, i. p.) wurde Methylscopolamin (1 mg/kg) s. c: injiziert, um die peripheren muskarinischen Wirkungen von Pilocarpin zu reduzieren.
  • Innerhalb von Minuten nach der Injektion von Pilocarpin zeigen die Tiere eine Porphinabsonderung aus der Gegend um die Augen, chronisches Kauen, Nicken und myoklonische Zuckungen und schütteln sich wie nasse Hunde. Dies sind alles Stadien von limbischen epileptischen Anfällen, vergleichbar mit den Stadien 1-2 der Racine-Skala. Die Tiere schreiten dann gewöhnlich fort zum Stadium 3, bei dem mit den Vorderpfoten getrommelt wird. Innerhalb von 20 min zeigen die Tiere normalerweise Anzeichen einer Generalisierung des epileptischen Anfalls. Hierzu gehört ein Aufrichten, bzw. ein Aufrichten und Fallen, mit einhergehender Klonusaktivität der vorderen Gliedmaßen und allgemeinen klonischen Anfällen. Innerhalb von 30 Minuten sind die Ratten gewöhnlich im Status epilepticus. Der Status ist limbischer Natur, unterbrochen von kurzen Episoden klonischer Anfälle. Beim Status epilepticus handelt es sich um einen Anfall, der nicht spontan aufhört. Im Rattenmodell bedeutet dies, daß er über 5 min lang anhält. Nachdem die Tiere 3 Stunden lang im Status epilepticus waren, wurde (nur bei den Tieren, die sich im Status befanden) die Anfälle durch i. p.-Verabreichung von 10 mg/kg Diazepam und Phenytoin (60 mg/kg) gestoppt. Die Mortalität während der Status-Periode im Modell mit hochdosiertem Pilocarpin beträgt gewöhnlich etwa 30–50%.
  • Wie aus 12 hervorgeht, hat DP-BAPTA-99 keinerlei Wirkung auf limbische epileptische Anfälle, ist jedoch dazu in der Lage, generalisierte epileptische Anfälle zu verhindern, und verhindert bei etwa der Hälfte der Population den Status epilepticus. Darüber hinaus reduziert der Wirkstoff die Mortalität, die innerhalb der 3stündigen Status-epilepticus-Periode eintritt.
  • Es kann daher geschlußfolgert werden, daß man mit DP-BAPTA-99 das Fortschreiten (eine Generalisierung) von epileptischen Anfällen verhindern kann.

Claims (19)

  1. Stabile, zweifach veresterte Carbonsäure (a) mit Hydroxyverbindung (b), wobei es sich bei (a) um einen pharmazeutisch unbedenklichen Komplexbildner für zweiwertige Metallionen handelt, der die Formel (HOOC-CH2-)2-N-A-N-(-CH2COOH)2 aufweist, in welcher A für ein gesättigtes oder ungesättigtes, aliphatisches, aromatisches oder heterocyclisches Brückenglied steht, das, in einer direkten Kettenverbindung zwischen den beiden gezeigten Stickstoffatomen, 2–8 Kohlenstoffatome in einer fortlaufenden Kette enthält, die durch 2–4 Sauerstoffatome unterbrochen ist, mit der Maßgabe, daß es sich bei den direkt mit den beiden gezeigten Stickstoffatomen verbundenen Kettengliedern nicht um Sauerstoffatome handelt, und wobei es sich bei (b) um einen pharmazeutisch unbedenklichen Alkohol, ausgewählt aus der Gruppe von geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Alkanolen, Aminoalkanolen und substituierten oder unsubstituierten Arylalkanolen, handelt; und pharmazeutisch unbedenkliche Salze der zweifach veresterten Carbonsäuren.
  2. Diester nach Anspruch 1, wobei das Brückenglied A aus der aus einer gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Kette, die durch 2-4 Sauerstoffatome unterbrochen ist, und -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'- bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei die einzelnen Restepaare R-R und R'-R' zusammen mit der verbundenen -C=C-Einheit einen aromatischen oder heterocyclischen Ring mit fünf oder sechs Ringatomen bilden, wobei der mit R-R gebildete Ring und der mit R'-R' gebildete Ring gleich oder verschieden sind.
  3. Diester nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Brückenglied A um -CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- handelt.
  4. Diester nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Brückenglied A um -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'- handelt, wobei die einzelnen Restepaare R-R und R'-R' zusammen mit der verbundenen -C=C-Einheit einen aromatischen oder heterocyclischen Ring bilden, der aus der aus Furan, Thiophen, Pyrrol, Pyrazol, Imidazol, 1,2,3-Triazol, Oxazol, Isoxazol, 1,2,3-Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, Thiazol, Isothiazol, 1,2,3-Thiadiazol, 1,2,5-Thiadiazol, Benzol, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, 1,2,3-Triazin, 1,2,4-Triazin und 1,2-, 1,3- und 1,4-Oxazin und -Thiazin bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei der mit R-R gebildete Ring und der mit R'-R' gebildete Ring gleich oder verschieden sind.
  5. Diester nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem Brückenglied A um -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'- handelt, wobei die einzelnen Restepaare R-R und R'-R' zusammen mit der verbundenen -C=C-Einheit gleiche oder verschiedene Ringe bilden, die aus unsubstituierten oder substituierten Benzolringen ausgewählt sind, wobei substituierte Benzolringe 1–4 Substituenten ausgewählt aus der aus gesättigtem oder ungesättigtem C1- 4-Alkyl, gesättigtem oder ungesättigtem C1-4-Alkoxy, Fluor, Chlor, Brom, Iod und CF3 bestehenden Gruppe oder einem einzelnen zweiwertigen Substituenten, bei dem es sich um -O-(CH2)n-O- handelt, mit n = 1–3, enthalten.
  6. Diester nach Anspruch 2, wobei der Komplexbildner ausgewählt ist aus Ethylen-1,2,-diol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure und 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure.
  7. Diester nach Anspruch 1, wobei es sich um eine Verbindung der allgemeinen Formel I handelt:
    Figure 00630001
    Formel I wobei sich die Substituenten an den aromatischen Ringen in der ortho-Position befinden; X aus der aus CnH2n+1 (n = 1–10), (CnH2n+1)2N(CH2)m (n = 1–6, m = 1–6) und substituiertem oder unsubstituiertem ArCH2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist und m für ein beliebiges physiologisch unbedenkliches Kation steht.
  8. Verbindungen nach Anspruch 7, wobei X aus der aus C2H5, C3H7, i-C3H7, C4H9, C-7H15, C8H17, CH2C6H5 und (CH3)2NCH2CH2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  9. Verbindungen der allgemeinen Formel II
    Figure 00630002
    Formel II wobei sich die Substituenten an den aromatischen Ringen in der ortho-Position befinden; Y für CnH2n+1(OCH2CH2)m (n = 1–20, m = 1–6) steht und M für ein beliebiges physiologisch unbedenkliches Kation steht.
  10. Verbindungen nach Anspruch 9, wobei Y für einen Monoalkylether von Mono-, Di- oder Triethylenglykol steht.
  11. Verbindungen nach Anspruch 9, wobei Y aus der aus CH3OCH2CH2, C2H5OCH2CH2, C3H7OCH2CH2, C4H9OCH2CH2, C7H15OCH2CH2, C8H17OCH2CH2, C10H21OCH2CH2, C16H33OCH2CH2, C18H37OCH2CH2, CH3(OCH2CH2)2, C2H5(OCH2CH2)2, C4H9(OCH2CH2)2, C6H13(OCH2CH2)2, C7H15(OCH2CH2)2, C7H15(OCH2CH2)2 C10H21(OCH2CH2)2, CH3(OCH2CH2)3 und C7H15 (OCH2CH2)3 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  12. Verbindungen nach Anspruch 11, wobei Y für C8H17OCH2CH2 steht.
  13. Verbindungen nach Anspruch 11, wobei Y für C18H37OCH2CH2 steht.
  14. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als aktiven Bestandteil einen stabilen lipophilen Diester eines Komplexbildners nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und ein pharmazeutisch unbedenkliches Verdünnungsmittel oder einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14 zur parenteralen oder oralen Verabreichung.
  16. Verwendung eines wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definierten Diesters zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Krankheit bzw. Erkrankung, die mit einem Überschuß an zweiwertigen Metallionen verbunden ist.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die zweiwertigen Metallionen aus der aus Ca++-, Cd++-, Co++-, Cu++-, Fe++- Hg++-, Mg++-, Mn++-, Pb++- und Zn++-Ionen bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei es sich bei den zweiwertigen Metallionen um intrazelluläre Ca++-Ionen handelt.
  19. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Krankheit bzw. Erkrankung aus der aus Hirn- und Herzischämie, Schlaganfall; Herzinfarkt, Epilepsie, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, akuter Entzündung, Harninkontinenz, Prostatavergrößerung, Muskelkrämpfen, arteriellem Bluthochdruck, Asthma, Reizkolon und Herzrhythmusstörungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6350780B1 (en) * 1995-07-28 2002-02-26 Allergan Sales, Inc. Methods and compositions for drug delivery
US6462066B2 (en) 1999-12-02 2002-10-08 University Of South Florida Method and composition for treatment of ischemic neuronal reperfusion injury
AUPS255402A0 (en) * 2002-05-27 2002-06-13 Monash University Agents and methods for the treatment of disorders associated with oxidative stress
IL151921A0 (en) 2002-09-25 2003-04-10 Pharma Ltd D Liphopilic diesters of chelating agent for inhibition of enzyme activity
IL157396A0 (en) * 2003-08-14 2004-02-19 Dpharm Ltd Use of lipophilic diesters of chelating agent for the treatment of amyloidosis and atherosclerosis
JP2010518064A (ja) 2007-02-12 2010-05-27 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション Ａｄおよび関連状態の治療のためのピペラジン誘導体
GB0708507D0 (en) 2007-05-02 2007-06-13 Queen Mary & Westfield College Substituted phosphonates and their use
CN102093234B (zh) * 2009-11-26 2014-06-18 福州乾正药业有限公司 一种二元酯酸的氨丁三醇盐化合物及其制备方法和药物应用
WO2013052787A2 (en) * 2011-10-05 2013-04-11 The Johns Hopkins University Membrane activated chelators and use in the prevention and treatment of parasitic infection
CN103373957A (zh) * 2012-04-12 2013-10-30 成都苑东药业有限公司 一种具有神经细胞保护作用的螯合物
WO2015092789A1 (en) * 2013-12-17 2015-06-25 D-Pharm Ltd. Onium salts of lipophilic diesters of chelating agents
CN107315915A (zh) * 2017-06-28 2017-11-03 上海联影医疗科技有限公司 一种医疗手术模拟方法及系统

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3479535A (en) * 1966-11-23 1969-11-18 Us Army Symmetrical pulse generator controlled by self-resetting snap diodes
US3497535A (en) 1967-07-25 1970-02-24 Geigy Chem Corp Stabilization of fats and oils with esters of edta and related compounds
US3751440A (en) * 1971-08-30 1973-08-07 Ciba Geigy Corp Metal complexes of n,n-dialkylesters of ethylenedinitrilotetraacetic acid and and compositions stabilized thereby
JPS5867652A (ja) * 1981-10-16 1983-04-22 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd エチレンジアミン四酢酸−ｎ，ｎ′−ジ（２−エチルヘキシル）エステル
JPS59168442A (ja) * 1983-03-16 1984-09-22 Fuji Photo Film Co Ltd 画像形成方法
US4603161A (en) * 1985-06-14 1986-07-29 Olin Corporation Selected oxyalkylated 2,6-dialkylphenol compounds and their use as stabilizers of organic materials against oxidative degradation
US4849362A (en) 1988-05-19 1989-07-18 Smithkline Beckman Corporation Fluorescent intracellular calcium indicators
US5453517A (en) * 1992-02-25 1995-09-26 Molecular Probes, Inc. Reactive derivatives of bapta used to make ion-selective chelators
US6015834A (en) * 1992-10-20 2000-01-18 Toronto Neuroprotection Group In vivo treatment of mammalian cells with a cell membrane permeant calcium buffer
US5618513A (en) * 1995-06-07 1997-04-08 Mallinckrodt Medical, Inc. Method for preparing radiolabeled peptides

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Publication number Publication date
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