KR20010015634A - 킬레이트제의 친유성 디에스테르 - Google Patents

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Abstract

본 발명에는 이가 금속 이온의 킬레이트제의 안정한 디에스테르, 이의 제조방법 및 이의 약제학적 조성물이 기술되어 있다. 본 발명에 따라서 가장 바람직한 화합물은 BAPTA 및 약제학적으로 허용되는 알콜의 공유 공액물을 포함하는 안정한 친유성 디에스테르이다. 디에스테르는 과량의 이가 금속 이온과 관련된 상태 또는 질환의 치료방법에, 특히 뇌 또는 심장 허혈, 발작, 간질, 알쯔하이머병 또는 심장 부정맥 및 개방 심장 수술에서와 같이 상승된 수준의 세포내 칼슘 이온과 관련된 상태 또는 질환의 치료방법에 유용하다.

Description

킬레이트제의 친유성 디에스테르{LIPOPHILIC DIESTERS OF CHELATING AGENTS}
금속 이온(예: 칼슘, 망간, 마그네슘, 구리, 아연 및 제1철 이온)은 생물계에서 단백질 구조, 효소 활성 및 세포 신호화를 조절함으로써 중요한 역할을 한다. 뇌 및 심장 허혈, 발작, 심근 경색, 간질, 만성 신경변성 질환, 예를 들어, 알쯔하이머병, 파킨슨병 및 급성 염증을 포함하는 많은 질병 또는 병리학적 상태는 모두 비정상적으로 상승된 세포내 칼슘 수준의 현상과 관련된다고 믿어진다. 뉴론 및 근육 기능항진과 연관된 다른 질환(예: 요실금, 전립선 비대, 근육 경련, 동맥 고혈압, 천식, 과민성 장 증후군)은 모두 세포내 이가 이온(예: 칼슘 및 아연)의 상승된 수준과 관련되어 있다.
세포내 칼슘은 세포에 의해 유지되는 최초 상해와 무관하게 세포사멸에 중요한 결정인자이다. 이는 표적 세포의 손상을 매개하는 임파구 및 킬러 세포에서의 세포사멸, 이식하는 동안의 기관 손상 및 허혈 상해를 포함하는 다른 종류의 조직 손상에 포함될 수 있다. 조직 상해에 대해 보호하거나 조직 손상을 감소시키는 칼슘 채널 차단제 또는 칼슘 킬레이트제의 세포막 투과성 형태가 제안되었다.
허혈시에 발생하는 세포 손상은 Ca2+이온의 유입 및/또는 세포내 방출에 이차적일 수 있다[참조: Choi, Trends Neurosci, 1988, 11, 465-469; Siesjo and Smith, Arzneimittelforschung, 1991, 41, 288-292]. 유사하게, 칼슘 유입은 간질 발작의 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 나타난다. 세포내 칼슘의 중요한 부분은 세포내 저장물로부터 출발하지만, 현재의 연구는 칼슘 유입 차단제가 항경련성 활성을 가질 수 있다고 제안한다[참조: Meyer, 1989, Brain Res.Rev. 14, 227-243].
따라서, 특정한 약리학적 방법이 이러한 세포내 칼슘의 병리학적 축적을 예방 또는 치료하기 위한 목적으로 개발되었고, 이는 세포내 침전물로부터 칼슘의 병리학적 방출로부터 또는 세포로 유해한 칼슘 유입에 의해 초래될 수 있다.
현재 또는 잠재적으로 칼슘 관련 질환의 치료에 유용한 약물에는 다음이 포함된다: (i) 칼슘 채널 차단제, (ii) 세포내 칼슘 저장 부위의 변화에 의한 칼슘 평형에 영향을 주는 약물, (iii) 세포내 칼슘 킬레이트제. 임상 수행에 사용되는 칼슘 채널 차단제는 대표적으로 베라파밀, 니페디핀 및 딜티아젬이다. 이러한 화합물의 사용과 관련된 주요 독성은 과도한 혈관확장, 음성 근수축성, 도관 결절 속도의 억제 및 A-V 결절 전도 방해를 포함한다. 칼슘 이동 및/또는 부골형성에 영향을 주는 약물, 유사한 칼슘 채널 차단제는 더욱 좁은 특이성을 나타낸다.
최고의 친화성을 갖고 가장 많이 선택되는 칼슘 킬레이트제중에는 원래 찌엔(Tsien)에 의해 기술된 1,2-비스-(2-아미노페녹시에탄)-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA)의 많은 유도체가 있다[참조: Biochem. 19, 2396, 1980]. BAPTA의 많은 형광성 및 다른 반응성 유도체가, 예를 들어, 미국 특허 제4,603,209호, 제4,849,362호, 제5,049,673호 및 제5,453,517호에 기술되어 있다. 이들 기술된 유도체중에 킬레이트제의 안정한 디에스테르는 없다.
포유류 세포에 대한 상해를 감소시키기 위한 칼슘 킬레이트제의 사용이 국제 공보 제WO 94/08573호에 개시되어 있고, 이에는 임상 요건을 위한 약물로서 칼슘 킬레이트제의 세포막 투과성 에스테르의 사용이 기술되어 있다. Ca++및 다른 이가 금속 이온의 유용한 세포막 투과성 킬레이트제에는 아세톡시메틸 에스테르[예: 에틸렌글리콜 비스 2-아미노에틸 에테르 N,N,N',N'-테트라아세트산 아세톡시메틸 에스테르(EGTA-AM), 에틸렌 디아민 테트라아세트산 아세톡시메틸 에스테르(EDTA-AM) 및 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'테트라아세트산 아세톡시메틸 에스테르(BAPTA-AM)]가 포함된다. 이들 공지된 착체 분자는 편재하는 에스테라제에 의해 흡수되고, 결국 세포내 공간에서 킬레이트제의 활성화를 일으키는 약물이다. 따라서, 이들 화합물의 에스테라제-감수성은, 생리학적 조건하에, 표적 부위에서 유리 BAPTA의 높은 순환 수준 및 약물의 낮은 효능을 일으킨다. 따라서, BAPTA-AM은, 예를 들어, 독성과 연관된 비교적 높은 치료 용량으로 사용해야 한다.
발명의 개요
본 발명의 한 양태에 따라서, 킬레이트제의 신규한 안정성 친유성 디에스테르가 제공된다. 따라서, 본 발명은 하이드록시 화합물(b)과의 안정한 디에스테르화 카복실산(a)[여기에서, (a)는 (HOOC-CH2-)2-N-A-N-(-CH2COOH)2의 이가 금속 이온에 대한 약제학적으로 허용되는 킬레이트제(여기에서, A는 두개의 기술된 질소 원자 사이의 직접 쇄 결합에, 2 내지 4개의 산소 원자에 의해 방해받을 수 있는 연속 쇄의 2 내지 8개의 탄소 원자를 함유하는 포화 또는 불포화, 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 결합 라디칼이고, 단 두개의 기술된 질소 원자에 직접 연결된 쇄 구성원은 산소 원자가 아니다)이고, (b)는 직쇄 또는 분지, 포화 또는 불포화 알킬, 아미노알킬 및 치환 또는 비치환 아릴알킬 라디칼로 이루어진 군으로부터 선택된 약제학적으로 허용되는 알콜이다]; 및 디에스테르화 카복실산의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 킬레이트제 에틸렌-1,2-디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산, 에틸렌-1,2-디올-비스-(2-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산의 디에스테르 및 특히 1,2-비스-(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산의 디에스테르가 제공된다.
본 발명의 더욱 바람직한 양태에 따라서, 화학식 I의 디에스테르가 제공된다:
상기식에서,
방향족 환에 대한 치환체는 오르토 위치에 존재하며,
R은 CnH2n+1(n=1-10), CnH2n+1(OCH2CH2)m(n=1-20, m=1-6), (CnH2n+1)2N(CH2)m(n=1-6, m=1-6) 및 치환 또는 비치환 ArCH2로 이루어진 군으로부터 선택되고,
M은 생리학적으로 허용되는 양이온이다.
본 발명에 따라서 현재 바람직한 화합물은 R이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식 I의 화합물이다:
R이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식 I의 화합물이 더욱 바람직하다:
본 발명에 따르는 특정한 약제학적 양태에 대해 R이 C8H17또는 C8H17OCH2CH2인 상기 도시된 화학식 I의 화합물이 가장 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 활성 성분으로서 본 발명에 따르는 킬레이트제의 안정한 친유성 디에스테르 및 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물은 액체 또는 고체 투여 형태일 수 있고, 경구, 비경구 또는 비내 투여할 수 있다.
본 발명에 따르는 킬레이트제의 친유성 디에스테르는 금속 이온 관련 질환, 예를 들어, 비정상적 수준의 망간, 마그네슘, 구리, 아연, 철, 카드뮴, 수은, 코발트, 특히 칼슘 이온과 관련된 질환의 치료 또는 예방에 유용하다. 따라서, 또다른 양태에서, 본 발명은 필요한 개인에게 치료학적 유효량의, 이가 금속 이온에 대한 약제학적으로 허용되는 킬레이트제의 안정한 친유성 디에스테르를 투여함을 특징으로 하여, 과량의 이가 금속 이온과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 과량의 세포내 Ca++ 이온과 관련된 질환 또는 장애(예: 뇌 및 심장 허혈, 발작, 심근 경색, 간질, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 급성 염증, 요실금, 전립선 비대, 근육 경련, 동맥 고혈압, 천식 및 과민성 장 증후군)를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 필요한 개인에게 치료학적 유효량의, 본 발명에 따르는 킬레이트제의 약제학적으로 허용되는 디에스테르를 투여함을 특징으로 한다. 본 발명의 화합물은 또한 의학적 치료(예: 개방 심장 수술)에 유용할 수 있다.
본 발명은 킬레이트제의 친유성 디에스테르, 이들 제제의 합성방법, 이의 약제학적 조성물 및 비정상적 수준의 이가 금속 이온, 특히 상승된 수준의 세포내 칼슘 이온과 관련된 상태 또는 질환의 치료에서 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이가 금속 이온 킬레이트제의 안정한 친유성 유도체인, 본원에서 BAPTA로 표시되는 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산의 디에스테르에 관한 것이다.
본 발명은 도면과 함께 다음 상세한 설명으로부터 더욱 상세히 이해되고 인지된다.
도 1A-C는 상이한 농도의, BAPTA의 디옥틸-에틸렌 글리콜 에스테르(DP-BAPTA-99; 정방형) 또는 BAPTA(삼각형)의 존재하에, 수용액중의(속이 빈 기호) 및 옥탄올 용액중의(채워진 기호) 세가지 이가 금속 이온 (a) Fe++, (b) Zn++및 (c) Ca++의 농도 변화를 도시한다.
도 2는 염료 Fluo-3/AM의 형광에 의해 모니터되는 바와 같이, 배양된 해마 뉴론중의 세포내 Ca++농도에 대한 BAPTA의 디에틸 에스테르(DP-BAPTA-23)의 효과를 도시한다.
도 3은 5가지 배양된 해마 뉴론으로부터 평균한 염료 Fluo-3/AM의 형광 변화(△F/F) 그래프를 도시하며, 이는 세포내 Ca++농도의 칼륨-유도된 증가에 대한 상이한 농도의 DP-BAPTA-99(0.1μg/ml, 1μg/ml 및 10μg/ml)의 효과를 나타낸다. 별표(*)는 K+펄스를 나타낸다.
도 4는 상이한 농도의 BAPTA의 디에틸 에스테르(DP-BAPTA-27)의 존재하에 마우스 피질 균등액중에 측정된 Na/K-ATP아제 활성을(약물이 부재하는 대조표준의 %로서) 도시한다.
도 5는 다음과 같이 예비배양된 자극된 배양 심근세포에서의 막 활동 전위를 도시한다: 1-대조표준, 비첨가; 2-우아바인 10-6M, 6분; 3-우아바인 10-6M, 10분; 4-우아바인 10-6M, 13분; 5-우아바인 10-6M + DP-BAPTA-23 10-10mg/ml, 35분.
도 6은 글루타메이트 상해 1시간 전에 첨가된 상이한 농도의 DP-BAPTA-99의 존재하에 글루타메이트-유발된 세포사멸을 도시한다.
도 7은 글루타메이트 상해 후에 지시된 바와 같은 상이한 시점에서 첨가된 DP-BAPTA-99의 존재하에 글루타메이트-유발된 세포사멸을 도시한다.
도 8은 구형 전뇌 허혈 24시간 후에 몽고 게르빌루스쥐의 혈청에서 측정된 뉴론 특이적 에놀라제(NSE) 활성을 이의 치료의 함수로서 도시한다. t=0 및 t=+3h는 BAPTA의 디옥틸 에스테르(DP-BAPTA-60, 회색 막대) 및 BAPTA의 디옥틸-에틸렌 글리콜 에스테르(DP-BAPTA-99, 검정 막대)를 복강내 투여하는 경우, 재환류의 개시에 대한 시점(시간으로)을 나타낸다.
도 9A-B는 구형 전뇌 허혈된 지 24시간 및 72시간 후에 몽고 게르빌루스쥐의 혈청에서 측정된 뉴론 특이적 에놀라제(NSE) 활성을 도시한다. DP-BAPTA-99(검정 막대)를 다음 두가지 방식으로 경구 투여한다: (A) 재환류가 개시되기 4시간 전에 0.5mg/kg 투여한 후, 재환류의 개시시에 추가로 0.5mg/kg 투여, 및 (B) 허혈된 지 3일 후 매일 0.5mg/kg. 비히클 용액으로 처리된 대조표준 동물에서 NSE 활성은 백색 막대로 나타낸다.
도 10은 구형 전뇌 허혈된 지 20분 후 몽고 게르빌루스쥐의 생존 기간(시간으로)을 도시한다. 동물은 재환류의 개시시에 1회 용량으로 복강내 투여된 비히클 용액(백색 막대) 또는 10μg/kg의 DP-BAPTA-60(회색 막대) 또는 DP-BAPTA-99(검정 막대)를 수용한다.
도 11은 DP-BAPTA-60(회색 막대), DP-BAPTA-99(검정 막대) 또는 식염수 용액(비히클, 백색 막대)으로 처리된 게르빌루스쥐의 해마의 여러 영역(CA-1, CA-2, CA-3 및 치상회)에서 허혈-유발된 뇌 손상의 조직병리학적 분석을 도시한다(0 = 정상; 1 = 최소; 2 = 약간; 3 = 보통; 4 = 현저).
도 12는 필로카르핀 400mg/kg에 의해 간질이 유발된 위스타르 래트의 동물 모델에서 상이한 농도의 DP-BAPTA-99의 항간질 보호 효과(%)를 도시한다. 모니터되는 간질 증상은 다음과 같다: 사지 발작(백색); 일반적 발작(연회색); L-SE(진회색) 및 생존(검정).
본 발명에 따라서, 이가 금속 이온의 킬레이트제의 안정한 디에스테르인 화합물이 제공된다. 이가 금속 이온에는 망간, 마그네슘, 구리, 코발트, 카드뮴, 수은 및 납이 포함되지만, 이로써 제한되지 않으며, 더욱 바람직하게는 아연 및 제1철 이온이고, 가장 바람직하게는 칼슘 이온이다.
명세서 및 청구범위에서 "킬레이트제"라는 용어는 당해 분야에 공지된 이가 금속 이온을 킬레이팅할 수 있는 분자를 나타낸다. "안정한"이란 용어는 실질적으로 순수한 형태로 분리되기에 충분히 튼튼한 분자를 나타낸다.
본 발명의 디에스테르는 비유도체화 모 화합물에 비해서 증가된 옥탄올/물 분배 계수에 의한 것을 포함하여 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있는 킬레이트제의 친유성 유도체이다.
본 발명의 한 양태에 따라서, 하이드록시 화합물(b)과의 안정한 디에스테르화 카복실산(a)[여기에서, (a)는 (HOOC-CH2-)2-N-A-N-(-CH2COOH)2의 이가 금속 이온에 대한 약제학적으로 허용되는 킬레이트제(여기에서, A는 두개의 기술된 질소 원자 사이의 직접 쇄 결합에, 2 내지 4개의 산소 원자에 의해 방해받을 수 있는 연속 쇄의 2 내지 8개의 탄소 원자를 함유하는 포화 또는 불포화, 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 결합 라디칼이고, 단 두개의 기술된 질소 원자에 직접 연결된 쇄 구성원은 산소 원자가 아니다)이고, (b)는 직쇄 또는 분지, 포화 또는 불포화 알킬, 아미노알킬 및 치환 또는 비치환 아릴알킬 라디칼로 이루어진 군으로부터 선택된 약제학적으로 허용되는 알콜이다]; 및 디에스테르화 카복실산의 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다.
본 발명의 한 양태에 있어서, 결합 라디칼 A는 -(CH2CH2)m-(여기에서, m은 1 내지 4이고, 질소에 결합되지 않은 2 내지 4개의 탄소 원자는 산소 원자로 치환될 수 있다) 및 -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'-(여기에서, 각각의 라디칼쌍 R-R 및 R'-R'는 결합된 -C=C- 부분과 함께 5 또는 6개의 환 원자를 함유하는 방향족 또는 헤테로사이클릭 환을 완성하고, R-R에 의해 완성된 환은 R'-R'에 의해 완성된 환과 동일하거나 상이하다)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 양태에 있어서, 결합 라디칼 A는 -CH2CH2- 및 -CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-로부터 선택될 수 있거나; 또는 -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'-(여기에서, 각각의 라디칼쌍 R-R 및 R'-R'는 결합된 -C=C- 부분과 함께, 푸란, 티오펜, 피롤, 피라졸, 이미다졸, 1,2,3-트리아졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 1,2,3-옥사디아졸, 1,2,5-옥사디아졸, 티아졸, 이소티아졸, 1,2,3-티아디아졸, 1,2,5-티아디아졸, 벤젠, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 1,2,3-트리아진, 1,2,4-트리아진, 및 1,2-, 1,3- 및 1,4-옥사진 및 -티아진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방향족 또는 헤테로사이클릭 환을 완성하고, R-R에 의해 완성된 환은 R'-R'에 의해 완성된 환과 동일하거나 상이하다)일 수 있다.
바람직한 양태에 있어서, 결합 라디칼 A는 -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'-[여기에서, 각각의 라디칼쌍 R-R 및 R'-R'는 결합된 -C=C- 부분과 함께, 비치환 및 치환된 벤젠 환으로부터 선택된 동일하거나 상이한 환을 완성하고, 여기에서 치환된 벤젠 환은, 포화 또는 불포화 C1-4알킬, 포화 또는 불포화 C1-4알콕시, 불소, 염소, 브롬, 요드 및 CF3로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 치환체, 또는 -O-(CH2)n-O-의 이가 치환체(여기에서, n은 1 내지 3이다) 하나를 함유한다]이다.
현재 바람직하게는 약물에 혼입된 칼슘 킬레이트제는 에틸렌-1,2-디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산, 에틸렌-1,2-디올-비스-(2-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 및 1,2-비스-(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산으로부터 선택된다.
본 발명에 따라서 가장 바람직한 화합물은 화학식 I의 것이다:
화학식 I
상기식에서,
방향족 환상의 치환체는 오르토 위치에 존재하고,
R은 CnH2n+1(n=1 내지 10), CnH2n+1(OCH2CH2)m(n=1 내지 20, m=1 내지 6), (CnH2n+1)2N(CH2)m(n=1 내지 6, m=1 내지 6) 및 치환 또는 비치환 ArCH2로 이루어진 군으로부터 선택되고,
M은 생리학적으로 허용되는 양이온이다.
특히 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 디에스테르는 상기 정의된 화학식 I의 화합물이고, 여기에서 R은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
더욱 바람직하게는 R은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
가장 바람직하게는 R은 C8H17또는 C8H17OCH2CH2이다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명에 따르는 조성물은 이가 금속 이온의 약제학적으로 허용되는 킬레이트제 및 에틸렌 글리콜의 모노알킬 또는 모노알킬 에테르의 공액물을 포함한다. 현재 바람직한 에틸렌 글리콜에는 모노-, 디- 및 트리-에틸렌 글리콜이 포함된다. 또한, 테트라-, 펜타- 또는 헥사-에틸렌 글리콜을 사용할 수 있지만, 이들 화합물은 이의 흡습성에 기인하여 특별한 반응 조건을 필요로 한다.
예상외로, 본 발명에 이르러 1,2-비스-(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산의 디에스테르(본원에서 BAPTA-디에스테르 또는 DP-BAPTA로 지시된다)는 이러한 칼슘 킬레이트제의 다른 유도체에 비해서 상당히 개선된 치료학적 용도를 나타냄이 밝혀졌다.
명백히 신규한 BAPTA-디에스테르의 친유성은 모 화합물의 것보다 크고, 이의 증진된 활성은 이들이 세포의 혈장막 또는 다른 세포막 구획내에 또는 이의 부근에 보유되고, 이에 의해 세포 기능을 조절하는 이의 증가된 용량을 나타낸다는 사실에 기인할 수 있다. 이러한 킬레이트제의 디에스테르는 세포막의 부근에 표적시킬 수 있다. 정확한 작용 메커니즘과 무관하게, 이들 디에스테르는 증진된 치료학적 프로필을 갖는다고 기술되어 있다.
본 발명에 따라서, 디에스테르의 친유성은 BAPTA 분자의 카복실기에 결합된 잔기 뿐만 아니라 (상기 도시된 화학식 I에서 R 및 M에 의해 각각 나타낸) 비에스테르화 카복실기상의 반대 이온에 따라 다르다.
디에스테르 화합물의 친유성은 R에서 지방족 쇄의 길이에 따라 상당히 다르고, R에서 탄소 원자 수가 7개까지 증가하면서 현저하게 증가한다. C7보다 긴 지방족 쇄에 대해서, 부가된 각각의 탄소에 대해 적게 증가한다. 일반적으로, R 위치에서 모노-, 디- 또는 트리-에틸렌 글리콜은 화합물의 친유성을 증가시킨다. 따라서, 상이한 에스테르화 R기의 선택은 본 발명에 따라서 고안된 화합물의 생물학적 활성을 미세하게 조절하기 위해 소용될 수 있다. 선택된 반대 이온은 또한 특정한 디에스테르의 친유성에 대해 고려될 수 있다. 예를 들어, 표 1에 나타난 바와 같이, 더욱 증가된 옥탄올 분배가 Ca염 대 Na염에 대해 관찰된다.
제공된 조성물에 적합한 바람직한 알콜 및 반대 이온의 선택은 공액물의 예정된 치료 용도에 따라 다르고, 전문가에 의해 본 발명의 원리에 따라서 최적화할 수 있다.
당해 분야의 전문가는, 본 발명에 따르는 조성물이 금속 이온 킬레이트제이지만 최적화된 약리학적 활성을 갖는 활성 화합물의 디에스테르를 포함하도록, 본 발명의 개념을 이가 금속 이온, 특히 칼슘 이온의 비정상적 수준에 관련된 상태 및 질환에 적용할 수 있는 방법을 이해한다.
세포막의 손상을 야기하는 많은 사건(예: 세포독성 화학물질, 물리적 자극 및 감염성 제제)은 다단계를 유발하여 최종적으로 허혈성 손상과 흡사한 상태를 초래할 수 있다[참조: Robbins et al., Pathological Basis for Disease, 1984, p. 10, W.B. Saunders Co.]. 본 발명은 잠재적으로 세포를 이들 환경에서 이가 금속 이온 킬레이트제의 세포내 또는 혈장막 또는 이의 부근으로의 도입에 의해 보호하기 위해 사용된다.
본 발명의 화합물은 개방 심장 수술 및 증가된 수준의 이가 금속 이온, 특히 칼슘과 관련된 의학적 상태의 치료에 유용할 수 있다. 이들 상태는 뇌 및 심장 허혈, 발작, 심근 경색, 간질, 만성 신경변성 질환, 예를 들어, 알쯔하이머병, 파킨슨병 및 급성 염증 뿐만 아니라 뉴론 및 근육 기능항진과 관련된 질환, 예를 들어, 요실금, 전립선 비대, 근육 경련, 동맥 고혈압, 천식 및 과민성 장 증후군을 포함할 수 있지만, 이로써 제한되지는 않는다.
본 발명에 따르는 많은 디에스테르를 비정상적 세포내 칼슘 수준과 관련된 장애의 실험 모델로 시험한다. 이들 실험 모델은 허혈, 심장 부정맥 및 간질의 시험관내 및 생체내 시스템 모델을 포함한다. BAPTA-디에스테르는 이들 모델 시스템 모두에서 현저한 보호 활성을 갖는다고 나타난다.
본 발명의 시험된 BAPTA-디에스테르의 생물학적 보호 효과는 시험관내에서, 세포 기능, 효소 활성 및 각종 상해(예: 심근세포에서의 글루타메이트 독성 및 산소결핍-유발된 뉴론 세포사멸 및 우아바인-유도된 독성) 후의 생존의 파라미터를 모니터하여 추정한다.
몽고 게르빌루스쥐에서 유발된 구형 전뇌 허혈 및 위스타르 래트에서 유발된 간질의 동물 모델 시스템은 생체내 모델 시스템을 나타낸다.
본 발명자들의 실험실에서 합성된 BAPTA의 상이한 디에스테르는 신경보호, 항간질 및 심장보호 화합물로서 특히 유효하다고 판명되었다.
BAPTA-디에스테르의 신경보호 효과
본 발명에 따르는 BAPTA-디에스테르는 배양된 피질 뉴론에서 글루타메이트 독성 및 산소결핍-유발된 세포사멸에 대해 보호성이다. 약물의 보호 효과는, DP-BAPTA가 글루타메이트 또는 산소결핍 상해되기 1시간 전에 첨가되는 경우 및 이렇게 상해된 지 1시간 이상 후까지 첨가되는 경우에 명백하다.
허혈 모델
구형 전뇌 허혈은 몽고 게르빌루스쥐에서 측면의 통상적 경동맥 폐색에 의해 유발된다. 결과로서 뇌 손상은 현미경 형태학적 데이터(조직 병리학 분석), 변화된 세포 기능(NSE 효소 활성) 및 전체 동물 성능(생존 데이터)으로부터 판단되는 바와 같이 명백하다. 디옥틸-BAPTA(DP-BAPTA-60) 및 디(옥틸-에틸렌 글리콜)-BAPTA(DP-BAPTA-99)는 뉴론 손상 방지에 유효하다. 시험된 BAPTA-디에스테르는 동물 생존 기간을 2 내지 3배로 연장시킨다.
BAPTA-디에스테르의 유리한 보호 효과는 국소 및 구형 뇌 허혈성 손상 둘다에 대한 보호에 발현될 수 있음을 이해해야 한다.
간질 모델
간질은 뇌의 전기 활성에서의 비정상에 의해 야기되는 신경학적 기능의 만성, 재발성, 발작성 변화를 특징으로 하는 장애의 군이다. 신경학적 기능부전 에피소드는 발작이라 칭하며, 부분 또는 국소 발작, 일반화된 발작 및 간질지속상태로 분류된다. 사람에 있어서 간질의 주요 원인중에는 유전적 소질, 머리 외상, 뇌 종양, 뇌혈관성 사건 및 대사 장애가 있다.
간질 에피소드는 병에 걸린 개인의 매일의 생활에서 상당한 불편과 악화를 일으키고, 많은 경우에 생명을 위협하고 치명적일 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 항간질 약물은 지난 20 내지 30년동안 시판되었으며 모두 독성 문제와 관련된 그 자신의 제한이 있다. 이후에도 현재 공지된 항간질 약물 및 수술을 포함하는 치료는 모두 많은 비율의 간질 환자에 있어서 발작을 완전히 방지하지 못한다. 이 문제는 간질지속상태를 나타내는 환자에 있어서 악화되며, 약 30%의 사망률을 나타낸다. 따라서, 부작용이 최소인 안전하고 유효한 약제가 많이 요구된다.
이 연구에서 BAPTA-디에스테르의 보호 효과를 평가하기 위해 사용되는 동물 모델 시스템은 필로카르핀에 의해 유도된 래트의 잘 설정된 실험 간질이다[참조: Turski W.A., E.A. Cavalhiero, M. Schwarz, S.J. Czuczwar, Z. Kleinrok and L. Turski(1983), Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: Behavioral, Electroencephalographic and Neuropathological study. Behavioral Brain Research 9, 315-335].
디(옥틸-에틸렌 글리콜)-BAPTA(DP-BAPTA-99)는 동물 모델 시스템에서 일반화된 발작 및 간질지속상태를 방지할 수 있을 뿐 아니라, 사망률을 감소시킬 수 있다.
심장보호 효과
심실 세동(VF)은 심근 경색 및 심장 수술에서 가장 위험한 합병증이다. 이는 전기적 제세동-세동제거기의 도움으로 성공적으로 치료된다. 그럼에도 불구하고, 전기 쇼크 동안에 바이패스 및 다른 종류의 이식에 대한 손상의 위험이 있다. 따라서, 심장 수술 분야에서 VF 문제를 해결하는 약리학적 방법이 선호된다. 그러나 임상 약리학에는 이러한 목적에 만족스러운 약물이 부재하며, 이는 대부분의 공지된 항부정맥 약물이 세동제거기 에너지 요건을 증가시키기 때문이다. 약리학적 방법은 허혈과 관련된 기능적 심방-심실 블록의 치료에 바람직하다.
디에틸-BAPTA(DP-BAPTA-23)은 우아바인 독성 에피소드를 거친 배양된 심근세포에서 감극 후의 지체를 제거하는 것으로 나타난다. 따라서, 이는 임상학에서 다음에 유용할 수 있다: 1) VF 또는 심실 부정속맥(VT)의 예방 및 2) 변화된 전도성의 치료. 많은 항부정맥 약물이 상기 목적으로 성공적으로 사용되었다. 그러나 이들은 각각 몇가지 바람직하지 않은 부작용(들)을 갖는다: 전부정맥 작용, 저혈압, 음성 근수축성 효과. BAPTA의 디에스테르의 작용 메커니즘은 현재 공지되지 않았다. 그러나 이는 통상적인 부정맥 약물중에서 현상학적 유사성을 갖지 않는다. 어떠한 공지된 항세동 약물도 심장 전도성을 개선시키지 못한다. 공지된 항세동 약물의 이러한 단점은 부적당한 의학적 필요를 지시하며, 이는 BAPTA의 디에스테르의 유용성을, 흉곽 수술에 특히 유용할 수 있는 신규한 종류의 항세동 약물로서 나타낸다.
여러 시험된 모델 시스템에서 BAPTA 디에스테르는 치료 및 예방 양식 둘다에서 이의 치료학적 효과를 발휘한다고 나타나므로, 상해 전후에 예방 및 치료 목적으로 투여할 수 있음을 이해해야 한다.
따라서, 본 발명의 BAPTA-디에스테르 약물은 과량의 이가 금속 이온, 특히 과량의 세포내 칼슘 이온과 관련된 많은 병리학적 경과의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 이러한 병리학적 경과는, 예를 들어, 외상 사건(예: 뇌 손상, 발작, 허혈 및 경색)으로 또는 만성 질환(예: 간질, 파킨슨병 및 알쯔하이머병)으로 유발된 것이 있다. 또한, 칼슘 의존성 기능항진 또는 이온 불균형을 포함하는 다른 질환(예: 급성 염증, 요실금, 전립선 비대, 근육 경련, 동맥 고혈압, 천식 및 과민성 장 증후군)은 BAPTA-디에스테르 약물을 사용하는 치료로 모두 이익을 볼 수 있다. 약물은 또한 개방 심장 및 바이패스 수술과 같은 계획 수술 동안에 정상에 가깝게 이온 항상성의 유지를 지속시키는 데에 적용할 수 있다.
활성 성분으로서 킬레이트제의 디에스테르를 포함하는 약제학적 조성물은 또한 당해 분야에 공지된 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 함유한다. 이들 조성물은 적합한 제형으로 제형화될 수 있으며, 이는 적합한 투여 경로에 필요한, 액제, 현탁제, 에어로졸, 미셀, 유제, 마이크로유제, 정제 등을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
적합한 투여 경로가 본 발명에 포함되며, 이는 경구, 정맥내, 근육내, 피하, 흡입, 비내, 직장 또는 다른 공지된 경로를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내, 경구 또는 근육내 투여된다. 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 용량 범위는 목적하는 보호 효과를 산출하기에 충분히 다량이다. 투여되는 용량은 연령, 성별, 건강, 수용체의 중량, 있는 경우, 동시 치료의 종류, 치료의 빈도 및 목적하는 효과의 특성에 따라 다르다. 용량 섭생법 및 투여 수단은 주치의 또는 당해 분야의 다른 전문가에 의해 결정된다.
공지된 화합물인 BAPTA-AM은 상승된 칼슘 수준이 포함되는 많은 병리학적 방법에서 유효한 세포 보호 활성을 갖는 것으로 나타났다[참고: Tymianski et al., Neuron 11, 221-235, 1993; Tymianski et al., J. Cerebral Blood Flow and Metabolism, 14, 911-923, 1994; Abdel-Hamid and Tymianski, J.Neuroscience, 17, 3538-3553]. 그러나 칼슘 항상성에 조절되지 않은 간섭은 중요한 안전 문제를 일으키고 잠재적 임상 적용을 명백히 제한한다. 본원에 기술된 신규한 디에스테르는 이의 작용에 있어서, 이들이 세포내 칼슘 항상성에 영향을 주지 않는 것으로 나타나므로, 앞서 공지된 BAPTA의 유도체보다 안전하다는 점에서 더욱 많이 선택된다.
A. 화학적 실시예
실시예 1: 알킬의 BAPTA 디에스테르 및 이의 염의 합성
1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA)의 디에스테르의 이나트륨 또는 칼슘염의 합성은 다음과 같이 세단계로 수행된다:
단계 1. BAPTA의 무수물의 제조
단계 2. BAPTA 디에스테르의 제조
추가의 바람직한 양태에 따라서, 유리하게는 R은 또한 CnH2n+1(여기에서, n은 1 내지 10이다) 및 CnH2n+1(OCH2CH2)m(여기에서, n은 1 내지 20이고, m은 1 내지 6이다) 일 수 있다.
단계 3. BAPTA의 디에스테르의 이나트륨 또는 칼슘염의 제조
단계 1. BAPTA 무수물의 제조
BAPTA(24g, 0.05mol), 피리딘(8g, 0.1mol) 및 아세트산 무수물(95ml, 1.0mol)을 역냉각기(물로 냉각) 및 자기 교반기가 장치된 둥근 바닥 1구 플라스크 (500ml)에 도입한다. 반응 혼합물은 90℃에서 5시간동안, 자기 교반기로 격렬하게 교반하면서 가열한다. 다음에, 온도를 50℃로 감소시키고, 이 온도에서 10시간 이상 계속 가열한다. 10시간의 끝무렵에 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 침전물을 여과시켜 추출한다. 다음에, 침전물을 에틸 아세테이트로 4회(각각 50ml로 세척) 및 에테르로 2회(각각 60ml로 세척) 세척한다. 침전물을 진공하에 50℃에서 6 내지 8시간 건조시킨다. 생성물은 BAPTA 무수물이다. 수율 80%(17.6g). 백색 고체. 융점 148 내지 149℃.
분석: TLC. 분석 과정에서 분해된 화합물.
1H NMR(C6D5NO2), δ(ppm): 4.40(s,8H), 4.47(s,4H) 및 6.85-7.01(m,8H).
IR: 1762.9cm-1(s), 1820.7cm-1(s)
C22H20O8N2에 대한 원소분석. 계산치: C 60.00%, H 4.54%, N 6.36%. 실측치: C 59.60%, H 4.66%, N 6.20%.
단계 2. BAPTA의 알킬 또는 아릴 디에스테르의 제조
단계 1의 BAPTA 무수물(10g, 0.023Mol) 및 상응하는 무수 알콜(300ml)를 아르곤 대기하에 역냉각기 및 자기 교반기가 장치된 둥근 바닥 1구 플라스크에 도입한다. 혼합물을 유욕중에 90℃에서(메틸 및 에틸 디에스테르에 대해 70℃에서) 격렬하게 교반하면서 가열한다. 6시간 후 알콜의 약 반을 반응 혼합물로부터 증류시킨다(고분자량 알콜은 진공하에 증류시킨다). 수득된 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 이 온도에서 5 내지 8시간 유지한다. 침전물을 용액으로부터 여과에 의해(유리 여과기 N4) 진공하에 분리하고, 약 40ml의 에탄올로 3 내지 4회 세척한 다음에, 에틸 아세테이트로 3회 세척하고(각 100ml), 최종적으로 디에틸 에테르로 3회 세척한다(각 150ml). 생성물을 진공하에 8시간 건조시킨다.
BAPTA의 합성된 디에스테르의 화학적/물리적 명세는 다음에 나타난다:
BAPTA의 에틸 디에스테르. 수율 90%(11g). 백색 분말. 융점 161 내지 162℃. TLC 분석. 알루미늄 시트상에서 실리카 겔 60. 용출제는 클로로포름과 메탄올 및 물의 혼합물이다(80:20:1.5 v/v). 지시하기 위해서 크로마토그램을 지시제 스프레이로 분무한 다음에, 350 내지 400℃에서 탄화시킨다. 지시제 스프레이의 조성물은 4-메톡시벤즈알데히드(10ml), 에탄올(200ml), 98% H2SO4(10ml) 및 빙초산(2ml). 하나의 반점. Rf0.3.
1H NMR(CD3OD): δ(ppm): 1.05-1.11(t, 6H), 3.91-4.00(dd, 4H), 4.05(s, 4H), 4.14(s, 4H), 4.27(s, 4H), 6.83-6.96(m, 8H).
C26H32O10N2에 대한 원소분석. 계산치: C 58.64%, H 6.03%, N 5.26%. 실측치: C 58.00%, H 6.00%, N 5.09%.
BAPTA의 프로필 디에스테르. 수율 90%(11.5g). 백색 분말. 융점 187℃. TLC 분석. BAPTA의 디에틸 및 디프로필 에스테르의 분석 조건은 유사하다. 하나의 반점. Rf0.35.
1H NMR[(CD3)2SO], δ(ppm): 0.71-0.77(t, 6H), 1.38-1.47(m, 4H), 3.80-3.85(t, 4H), 4.00(s, 4H), 4.13(s, 4H), 4.20(s, 4H), 6.70-6.96(m, 8H).
C28H36O10N2에 대한 원소분석. 계산치: C 60.00%, H 6.43%, N 5.00%. 실측치: C 60.25%, H 6.77%, N 5.08%.
BAPTA의 이소-프로필 디에스테르. 수율 80%(10.2g). 백색 분말. 융점 181 내지 182℃. TLC 분석. 알루미늄 시트상에서 실리카 겔 60 F254. 용출제: 클로로포름:메탄올(65:30, v/v). 지시하기 위해서 크로마토그램을 지시제 스프레이로 분무한 다음에, 350 내지 400℃에서 탄화시킨다. 지시제 스프레이의 조성물은 4-메톡시벤즈알데히드(10ml), 에탄올(200ml), 98% 황산(10ml) 및 빙초산(2ml). 하나의 반점. Rf0.72.
1H NMR[(CD3)2SO], δ(ppm): 1.07-1.09(d, 12H), 4.00(s, 4H), 4.08(s, 4H), 4.22(s, 4H), 4.78-4.85(m, 2H), 6.71-6.98(m, 8H).
C28H36O10N2에 대한 원소분석. 계산치: C 60.00%, H 6.43%, N 5.00%. 실측치: C 59.78%, H 6.50%, N 5.00%.
BAPTA의 부틸 디에스테르. 수율 90%(12.1g). 백색 분말. 융점 183℃. TLC 분석. BAPTA의 디에틸 및 디부틸 디에스테르의 분석 조건은 유사하다. 하나의 반점. Rf0.42.
1H NMR[(CD3)2SO], δ(ppm): 0.74-0.80(t, 6H),1.09-1.18(m, 4H), 1.33-1.39(m, 4H), 3.80-3.86(t, 4H), 3.98(t, 4H), 4.10(s, 4H), 4.17(s, 4H), 6.69-6.92(m, 8H).
C30H40O10N2에 대한 원소분석. 계산치: C 61.22%, H 6.80%, N 4.76%. 실측치: C 61.54%, H 7.10%, N 5.03%.
BAPTA의 헵틸 디에스테르. 수율 70%(10.8g). 백색 분말. 융점 146 내지 147℃. TLC 분석. BAPTA의 에틸 및 헵틸 디에스테르의 분석 조건은 유사하다. 하나의 반점. Rf0.50.
1H NMR[(CD3)2SO], δ(ppm): 0.79-0.84(t, 6H), 1.08-1.17(광역 s, 16H), 134-1.43(m, 4H), 3.79-3.87(t, 4H), 3.98(s, 4H), 4.13(s, 4H), 4.17(s, 4H), 6.67-6.92(m, 8H).
C36H52O10N2에 대한 원소분석. 계산치: C %, H %, N %. 실측치: C %, H %, N %.
BAPTA의 옥틸 디에스테르. 수율 70%(11.3g). 백색 분말. 융점 155℃. TLC 분석. BAPTA의 디에틸 및 디옥틸 디에스테르의 분석 조건은 유사하다. 하나의 반점. Rf0.55.
1H NMR[(CD3)2SO], δ(ppm): 0.81-0.86(t, 6H), 1.19-1.23(광역 s, 20H), 1.29-1.34(m, 4H), 3.83-3.87(m, 4H), 3.98(s, 4H), 4.11(s, 4H), 4.19(s, 4H), 6.80-6.84(m, 8H).
C38H56O10N2에 대한 원소분석. 계산치: C %, H %, N %. 실측치: C %, H %, N %.
BAPTA의 벤질 디에스테르. 수율 70%(10.6g). 백색 분말. 융점 161 내지 163℃. TLC 분석. BAPTA의 에틸 및 벤질 디에스테르의 분석 조건은 유사하다. 하나의 반점. Rf0.64(벤질 디에스테르는 판상에서 디메틸포름아미드중의 용액중에 플롯한다).
1H NMR[(CD3)2SO], δ(ppm): 4.02(s, 4H), 4.18-4.19(d, 8H), 4.97(s, 4H), 6.73-6.94(m, 8H), 7.22-7.32(m, 10H).
C36H36O10N2에 대한 원소분석. 계산치: C 65.85%, H 5.49%, N 4.27%. 실측치: C 65.56%, H 5.83%, N 4.12%.
BAPTA의 2-(디메틸아미노)에틸 디에스테르. 수율 70%(9.95g). 백색 분말. 융점 126 내지 127℃. TLC 분석. 알루미늄 시트상에서 실리카 겔 60 F254. 용출제: 클로로포름:메탄올:물=60:40:2 v/v. 하나의 반점. Rf0.2.
1H NMR[(CD3)2SO], δ(ppm): 2.57(s, 12H), 2.60-2.63(t, 4H), 3.60(s, 4H), 3.75-3.78(t, 4H), 4.06(s, 4H), 0.11(s, 4H), 6.68-6.85(m, 8H).
C30H42O10N4에 대한 원소분석. 계산치: C 58.25%, H 6.80%, N 9.06%. 실측치: C 57.94%, H 6.90%, N 8.97%.
단계 3a. BAPTA의 디에스테르의 나트륨의 제조
상응하는 BAPTA의 알킬 디에스테르(0.019Mol)을 자기 교반기가 장치된 에렌메이어 플라스크(500ml)에 도입한다. 메탄올과 물의 혼합물(1:1 v/v) 약 250ml를 에스테르에 가한다. 이 혼합물을 격렬하게 교반하는데, 이는 에스테르가 용액에 용해되지 않기 때문이다. 수중의 진한 NaHCO3용액(0.038mol, 3.19g) 또는 진한 MeONa 용액(0.038mol)을 교반 혼합물에 가하고, 5 내지 8시간 후에 혼합물은 투명해진다. 이는 알킬 디에스테르가 이나트륨염으로 전환됨을 지시한다. 메탄올 및 물을 진공하에 증발시킨다. 수득된 염을 에탄올 및 디에틸 에테르로 공비 증류에 의해 건조시킨다. 최종적으로, 염을 진공하에(5 내지 6mmHg) 8시간 건조시킨다.
BAPTA의 에틸 디에스테르, 이나트륨염. 백색 분말. 수율 95%(10.4g).
C26H30O10N2Na2에 대한 원소분석. 계산치: C 54.16%, H 5.21%, N 4.86%, Na 7.98%. 실측치: C 54.10%, H 5.27%, N 4.65%, Na 8.10%.
BAPTA의 프로필 디에스테르, 이나트륨염. 백색 분말. 수율 95%(10.9g).
C28H36O10N2Na2에 대한 원소분석. 계산치: C 55.63%, H 5.63%, N 4.63%, Na 7.61%. 실측치: C 54.76%, H 6.13%, N 4.46%, Na 6.73%.
BAPTA의 부틸 디에스테르, 이나트륨염. 백색 분말. 수율 95%(11.2g).
C30H38O10N2Na2에 대한 원소분석. 계산치: C 56.96%, H 6.01%, N 4.43%, Na 7.28%. 실측치: C 56.50%, H 6.00%, N 4.20%, Na 7.30%.
BAPTA의 헵틸 디에스테르, 이나트륨염. 백색 분말. 수율 90%(10.3g).
C36H50O10N2Na2에 대한 원소분석. 계산치: C 60.33%, H 6.98%, N 3.91%, Na 6.42%. 실측치: C 59.88%, H 7.49%, N 4.12%, Na 6.76%.
BAPTA의 옥틸 디에스테르, 이나트륨염. 백색 분말. 수율 90%(15.7g).
C38H54O10N2Na2에 대한 원소분석. 계산치: C 61.29%, H 7.26%, N 3.76%, Na 6.16%. 실측치: C 60.90%, H 7.81%, N 3.26%, Na 6.52%.
단계 3b. BAPTA의 디에스테르의 칼슘염의 제조
상응하는 BAPTA의 디에스테르(1g)을 에탄올과 물의 혼합물(70:30 v/v) 1L에 용해시킨다. 동일한 몰수의 Ca(OH)2을 이 용액에 가한다. 수득된 혼합물을 자기 교반기에 의해 실온에서 24시간 교반한다. 다음에, BAPTA의 에틸, 프로필 및 부틸 디에스테르의 염에 대해서, 용액을 와트만 페이퍼 N1을 통해 여과시키고, 진공하에(20 내지 30mmHg) 증발시켜 건조시킨다. 침전물을 디에틸 에테르로 3회(각 분량은 100ml이다) 세척하고, 진공하에(2 내지 3mmHg) 실온에서 6시간 건조시킨다.
BAPTA의 헵틸 및 옥틸 디에스테르의 칼슘염에 대해서, 에탄올 용액을 증발시켜 건조시킨다. 침전물을 에탄올 0.8L에 용해시킨다. 수득된 혼합물을 와트만 페이퍼 N1을 통해 여과시킨 다음에, 에탄올을 진공하에(20 내지 25mmHg) 증발시킨다. 침전물을 디에틸 에테르로 3회(각 분량은 100ml이다) 세척하고, 진공하에(2 내지 3mmHg) 실온에서 6 내지 7시간 건조시킨다.
BAPTA의 에틸 디에스테르, 칼슘염. 백색 분말. 수율 90%(0.96g).
C26H30N2O10Ca에 대한 원소분석. 계산치: C 54.70%, H 5.26%, N 4.91%, Ca 7.01%. 실측치: C 54.32%, H 5.40%, N 4.81%, Ca 6.81%.
BAPTA의 프로필 디에스테르, 칼슘염. 백색 분말. 수율 90%(0.98g).
C28H34N2O10Ca에 대한 원소분석. 계산치: C 56.19%, H 5.68%, N 4.68%, Ca 6.69%. 실측치: C 56.22%, H 5.88%, N 4.51%, Ca 6.51%.
BAPTA의 부틸 디에스테르, 칼슘염. 백색 분말. 수율 90%(0.90g).
C30H38N2O10Ca에 대한 원소분석. 계산치: C 57.50%, H 6.07%, N 4.47%, Ca 6.39%. 실측치: C 57.18%, H 6.24%, N 4.28%, Ca 6.11%.
BAPTA의 헵틸 디에스테르, 칼슘염. 백색 분말. 수율 80%(0.85g).
C36H50N2O10Ca에 대한 원소분석. 계산치: C 61.71%, H 7.14%, N 4.00%, Ca 5.71%. 실측치: C 61.44%, H 7.24%, N 4.18%, Ca 6.31%.
BAPTA의 옥틸 디에스테르, 칼슘염. 백색 분말. 수율 80%(0.83g).
C35H54N2O10Ca에 대한 원소분석. 계산치: C 61.79%, H 7.32%, N 3.79%, Ca 5.42%. 실측치: C 61.94%, H 7.14%, N 4.00%, Ca 5.31%.
실시예 2: 모노-, 디- 및 트리에틸렌 글리콜의 알킬 에테르의 BAPTA의 디에스테르 및 이의 염의 합성
이들 염의 제조방법은 BAPTA의 알킬 디에스테르의 염의 제조방법과 유사한 4단계 방법이다.
단계 1. BAPTA 무수물의 제조
BAPTA 무수물을 수득하는 본 제1 단계는 실시예 1에서 상기한 바와 같이 BAPTA의 알킬 디에스테르의 합성방법에서의 단계 1과 동일하다.
단계 2. 모노-, 디- 및 트리에틸렌 글리콜의 모노알킬 에테르의 합성
모노-, 디- 및 트리에틸렌 글리콜의 모노알킬 에테르의 합성은 다음 반응식에 따라서 수행한다:
(각 조각의 직경이 5 내지 8mm인 작은 조각으로 절단된) 나트륨 약 0.8 내지 0.9g을 아르곤 대기하에, 역냉각기 및 자기 교반기가 장치된 2구 둥근 바닥 플라스크(250ml)에 도입한다. 에틸렌 글리콜(35ml, 0.62Mol)을 나트륨에 아르곤 대기하에 가하고, 플라스크를 유욕중에 70℃에서 격렬하게 교반하면서 가열한다. 대부분의 나트륨이 용해된 경우, 나머지 나트륨(나트륨의 대표적 양은 3.9g, 0.17Mol이다)을 한조각씩 반응 혼합물에 가한다. 나트륨 용해는 반응 혼합물의 온도 증가와 함께 반응 속도 증가에 수반됨을 주의해야 한다. 폭발을 방지하기 위해서, 나트륨을, 반응이 잘 조절되도록 서서히 가하는 것이 필수적이다. 나트륨 전량이 용해된 후, 테트라하이드로푸란(60ml)중의 상응하는 알킬 브롬화물(21.5g, 0.12Mol)의 용액을 함유하는 적하 깔때기를 반응 플라스크에 부가한다. 적하 깔때기로부터의 용액을 한방울씩 반응 플라스크에 가한다. 반응 혼합물의 온도는 70℃에서 유지한다. 거의 한번에 브롬화나트륨의 침전물이 나타나고 반응 과정에서 양이 증가한다. 16시간 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 약 150ml의 물을 유기 용액에 가한다. 생성물을 에틸 아세테이트 2분량으로(각 40ml) 추출한다. 에틸 아세테이트 용액을 합쳐서 수세척하고 황산나트륨으로 건조시킨다. 에틸 아세테이트중의 생성물의 황색 용액은 활성탄을 사용하여 가열함으로써 탈색된다. 무색 용액을 탄소로부터 여과시켜 분리하고, 용매를 증발시킨다. 수득된 생성물을 진공하에 증류시키고, 이의 물리적 및 화학적 특성에 대해 분석한다.
에틸렌 글리콜의 모노헵틸 에테르. 무색 액체. 비점 95℃/1mmHg. 수율 70%(13.4g).
TLC 분석. 알루미늄 시트상에서 실리카 겔 60 F254. 용출제: 에틸 아세테이트:n-헥산, 2:1 v/v. 지시제: 4-메톡시벤즈알데히드(10ml), 에탄올(200ml), 98% 황산(10ml) 및 빙초산(2ml). 지시하기 위해서 크로마토그램을 지시제 스프레이로 분무한 다음에, 350℃에서 탄화시킨다. 하나의 반점. Rf0.8
1H NMR(CDCl3), δ(ppm): 0.84-0.90(t, 3H), 1.27-1.33(광역 s, 8H), 1.55-1.61(m, 2H), 2.25-2.30(t, 1H, OH기의 신호, 이의 가변성 위치), 3.43-3.54(m, 4H), 3.69-3.75(m, 2H).
디에틸렌 글리콜의 헵틸 에테르. 무색 액체. 비점 100℃/1mmHg. 수율 70%(17.1g).
TLC 분석. 모노- 및 디에틸렌 글리콜의 헵틸 에테르의 분석 조건은 유사하다. 하나의 반점. Rf0.4
1H NMR(CDCl3), δ(ppm): 0.84-0.90(t, 3H), 1.27-1.33(광역 s, 8H), 1.55-1.61(m, 2H), 2.71(t, 1H, OH기의 신호), 3.45-3.75(t, 2H), 3.58-3.75(m, 8H).
트리에틸렌 글리콜의 헵틸 에테르. 무색 액체. 비점 107℃/1mmHg. 수율 70%(20.8g).
TLC 분석. 모노- 및 트리에틸렌 글리콜의 모노헵틸 에테르의 분석 조건은 유사하다. 하나의 반점. Rf0.3
1H NMR(CDCl3), δ(ppm): 0.84-0.90(t, 3H), 1.26-1.29(광역 s, 8H), 1.54-1.57(m, 2H), 2.72(t, 1H, OH기의 신호), 3.41-3.47(t, 2H), 3.58-3.74(m, 12H).
옥틸 모노에틸렌 글리콜. 무색 액체. 비점 60℃/1mmHg. 수율 85%.
TLC 분석. 에틸렌 글리콜의 디옥틸 에테르의 분석 조건은 유사하다. 하나의 반점. Rf0.7
1H NMR(CDCl3), δ(ppm): 0.83-0.89(t, 3H), 1.25-1.27(광역 s, 10H), 1.54-1.57(m, 2H), 2.39(t, 1H), 3.41-3.52(m, 4H), 3.67-3.73(m, 4H).
단계 3. 모노-, 디- 및 트리에틸렌 글리콜의 모노알킬 에테르의 BAPTA 디에스테르의 합성
단계 1의 BAPTA 무수물(1.5g, 0.0034Mol) 및 단계 2의 모노-, 디- 또는 트리에틸렌 글리콜의 상응하는 모노알킬 에테르(10 내지 12ml)를 아르곤 대기하에, 역냉각기 및 자기 교반기가 장치된 둥근 바닥 1구 플라스크(50ml)에 도입한다. 혼합물을 유욕중에 115 내지 120℃에서 격렬하게 교반하면서 가열한다. 1 내지 1.5시간 후, 혼합물이 투명해진다. 반응이 완결될 때까지 추가로 1.5시간동안 계속 가열한다. 다음에, 플라스크를 실온으로 냉각시키고, 약 100ml의 석유 에테르(비점 60 내지 80℃)를 가한다. 형성된 침전물을 원심분리하여 추출하고, 석유 에테르로 3회 세척한다(각각 40ml로 세척). 고형 생성물을 진공하에 5시간 건조시키고, 분석하여 다음 화합물에 대해 예시된 바와 같이 생성물의 특성을 입증한다.
메틸에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르. 백색 고체. 융점 151 내지 152℃. 수율 90%(1.81g).
TLC 분석. 알루미늄 시트상에서 실리카 겔 60 F254. 용출제는 클로로포름:메탄올이다(1:1 v/v). 지시하기 위해서 크로마토그램을 지시제 스프레이로 분무한 다음에, 100 내지 150℃에서 탄화시킨다. 지시제 스프레이의 조성은 4-메톡시벤즈알데히드(10ml), 에탄올(200ml), 98% 황산(10ml) 및 빙초산(2ml)이다. 하나의 반점. Rf0.14.
1H NMR(CD3OD), δ(ppm): 3.33(s, 6H), 3.47-3.51(t, 4H), 3.66(s, 4H), 3.85(s, 4H), 4.02-4.06(t, 4H), 4.35(s, 4H), 7.02-7.11(m, 8H).
C28H36O12N2에 대한 원소분석. 계산치: C 56.76%, H 6.08%, N 4.73%. 실측치: C 56.38%, H 6.39%, N 4.72%.
헵틸에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르. 백색 고체. 융점 111 내지 112℃. 수율 90%(2.32g).
TLC 분석. 메틸에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르 및 헵틸에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르의 TLC 분석 조건은 동일하다. 하나의 반점. Rf0.4.
1H NMR[(CD3)2SO], δ(ppm): 0.81-0.86(t, 6H), 1.22(광역 s, 16H), 1.42(m, 4H), 3.27-3.32(m, 4H), 3.37-3.40(m, 4H), 3.96-3.99(m, 8H), 4.12(s, 2H), 4.19(s, 2H), 6.73-6.92(m, 8H).
C40H60O12N2에 대한 원소분석. 계산치: C 63.16%, H 7.90%, N 3.68%. 실측치: C 63.30%, H 8.44%, N 3.76%.
옥틸에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르. 백색 고체. 융점 121 내지 122℃. 수율 80%(1.4g).
TLC 분석. 알루미늄 시트상에서 실리카 겔 60. 용출제는 클로로포름:메탄올이다(1:1 v/v). 지시하기 위해서 크로마토그램을 지시제 스프레이로 분무한 다음에, 100 내지 150℃에서 탄화시킨다. 지시제 스프레이의 조성은 4-메톡시벤즈알데히드(10ml), 에탄올(200ml), 98% 황산(10ml) 및 빙초산(2ml). 하나의 반점. Rf0.45.
1H NMR(CDCl3), δ(ppm): 0.84-0.89(t, 6H), 1.26(광역 s, 20H), 1.51-1.57(m, 4H), 3.37-3.42(t, 4H), 3.53-3.56(m, 4H), 3.96(s, 4H), 4.03(s, 4H), 4.17-4.21(m, 4H), 4.37(s, 4H), 6.87-6.94(m, 4H), 7.03-7.09(m, 4H).
C42H64O12N2에 대한 원소분석. 계산치: C 63.96%, H 8.12%, N 3.55%. 실측치: C 63.57%, H 8.11%, N 3.53%.
헵틸디에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르. 백색 고체. 융점 95 내지 96℃. 수율 85%(2.5g).
TLC 분석. 메틸에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르 및 헵틸디에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르의 분석 조건은 동일하다. 하나의 반점. Rf0.40.
1H NMR[(CD3)2SO], δ(ppm): 0.81-0.86(t, 6H), 1.23(광역 s, 16H), 1.45(m, 4H), 3.30-3.35(m, 8H), 3.40-3.46(m, 12H), 3.97-3.99(m, 8H), 4.13(s, 4H), 4.19(s, 4H), 6.74-6.92(m, 8H), 12.37(s, 2H).
C44H68O14N2에 대한 원소분석. 계산치: C 62.26%, H 8.02%, N 3.30%. 실측치: C 6.47%, H 8.42%, N 3.40%.
헵틸트리에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르. 백색 고체. 융점 63 내지 65℃. 수율 85%(2.7g).
TLC 분석. 메틸에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르 및 헵틸트리에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르의 분석 조건은 동일하다. 하나의 반점. Rf0.40.
1H NMR[(CD3)2SO], δ(ppm): 0.81-0.87(t, 6H), 1.23(광역 s, 16H), 1.45(m, 4H), 3.31-3.36(m, 4H), 3.42-3.48(m, 20H), 3.97-3.99(m, 8H), 4.13(s, 4H), 4.19(s, 4H), 6.74-6.92(m, 8H), 12.38(s, 2H).
단계 4a. 모노-, 디- 또는 트리에틸렌 글리콜의 모노알킬 에테르의 BAPTA 디에스테르의 이나트륨염의 제조
모노-, 디- 및 트리에틸렌 글리콜의 모노알킬 에테르의 상응하는 BAPTA 디에스테르(0.0025Mol)을 메탄올에 용해시키고(약 10ml의 알콜이 BAPTA 디에스테르 1.0g을 용해시키기 위해서 필수적이다), 수득된 용액을 자기 교반기가 장치된 에렌메이어 플라스크(50ml)에 도입한다. 중탄산나트륨의 수용액(2ml중의 0.005Mol)을 BAPTA 디에스테르의 메탄올 용액에 가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 교반한다. 다음에, 용매를 진공하에(30mmHg) 증발시킨다. 수득된 침전물은 공비 증류에 의해 에탄올로 3회 및 디에틸 에테르로 2회 건조시킨다. 최종적으로, 수득된 생성물을 헥산으로 세척하고, 진공하에 건조시킨다.
메틸모노에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르, 이나트륨염. 백색 고체. 흡습성. 수율 95%(1.5g).
C28H34O12N2Na2에 대한 원소분석. 계산치: C 52.80%, H 5.35%, N 4.40%, Na 7.23%. 실측치: C 52.20%, H 5.59%, N 4.49%, Na 7.30%.
헵틸모노에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르, 이나트륨염. 백색 고체. 흡습성. 수율 95%(1.9g).
C40H58O12N2Na2에 대한 원소분석. 계산치: C 59.70%, H 7.21%, N 3.48%, Na 5.72%. 실측치: C 59.60%, H 7.75%, N 3.51%, Na 5.51%.
헵틸디에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르, 이나트륨염. 백색 고체. 흡습성. 수율 95%(2.1g).
C44H66O12N2Na2에 대한 원소분석. 계산치: C 59.19%, H 7.40%, N 3.14%, Na 5.16%. 실측치: C 58.55%, H 7.43%, N 3.46%, Na 5.49%.
헵틸트리에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르, 이나트륨염. 백색 왁스. 매우 흡습성. 수율 90%(2.2g).
C48H74O16N2Na2에 대한 원소분석. 계산치: C 58.77%, H 7.55%, N 2.86%, Na 4.69%. 실측치: C 57.98%, H 8.03%, N 2.94%, Na 4.64%.
옥틸에틸렌 글리콜의 BAPTA 디에스테르, 이나트륨염. 백색 고체. 수율 80%.
TLC 분석. 알루미늄 시트상에서 실리카 겔 60 . 용출제는 클로로포름:메탄올이다(1:1 v/v). 지시하기 위해서 크로마토그램을 지시제 스프레이로 분무한 다음에, 100 내지 150℃에서 탄화시킨다. 지시제 스프레이의 조성은 4-메톡시벤즈알데히드(10ml), 에탄올(200ml), 98% 황산(10ml) 및 빙초산(2ml). 하나의 반점. Rf0.45.
1H NMR(CDCl3), δ(ppm): 0.84-0.89(t, 6H), 1.26(광역 s, 20H), 1.51-1.57(m, 4H), 3.37-3.42(t, 4H), 3.53-3.56(m, 4H), 3.96(s, 4H), 4.03(s, 4H), 4.17-4.21(m, 4H), 4.37(s, 4H), 6.87-6.94(m, 4H), 7.03-7.09(m, 4H).
C42H64N2O12에 대한 원소분석. 계산치: C 63.96%, H 8.12%, N 3.55%. 실측치: C 63.57%, H 8.11%, N 3.53%.
단계 4b. 모노-, 디- 및 트리에틸렌 글리콜의 모노알킬 에테르의 BAPTA 디에스테르의 칼슘염의 제조
BAPTA의 모노-, 디- 또는 트리에틸렌 글리콜 디에스테르의 상응하는 모노알킬 에테르(0.0025Mol)을 메탄올 250ml에 용해시킨다. 약 3 내지 5ml의 물을 이 용액에 가한다. 수득된 용액을 자기 교반기가 장치된 에렌메이어 플라스크(300ml)에 도입한다. CaH2(0.0025Mol) 분말을 이 용액에 격렬하게 교반하면서 가한다. 실온에서 3시간 계속 교반한다. 3시간 후, 혼합물을 여과지(와트만 N1)를 통해 여과시키고, 수득된 용액을 진공하에(10 내지 15mmHg) 증발시킨다. 침전물을 공비 증류에 의해 에탄올로 3회(각 분량은 25 내지 30ml이다) 및 디에틸 에테르로 2회 건조시킨다. 최종적으로, 생성물을 헥산으로 세척하고, 진공하에(5mmHg) 실온에서 5시간 건조시킨다.
BAPTA의 메틸모노에틸렌 글리콜 디에스테르, 칼슘염. 백색 분말. 수율 90%(1.42g).
C28H34N2O12Ca에 대한 원소분석. 계산치: C 53.33%, H 5.40%, N 4.44%, Ca 6.35%. 실측치: C 53.74%, H 5.78%, N 4.43%, Ca 5.90%.
BAPTA의 헵틸모노에틸렌 글리콜 디에스테르, 칼슘염. 백색 분말. 수율 90%(1.79g).
C40H58N2O12Ca에 대한 원소분석. 계산치: C 60.15%, H 7.27%, N 3.51%, Ca 5.01%. 실측치: C 60.32%, H 7.63%, N 3.54%, Ca 4.59%.
BAPTA의 옥틸모노에틸렌 글리콜 디에스테르, 칼슘염. 백색 분말. 수율 90%(1.81g).
C42H62N2O12Ca에 대한 원소분석. 계산치: C 61.01%, H 7.50%, N 3.38%, Ca 4.84%. 실측치: C 61.00%, H 7.82%, N 3.54%, Ca 4.88%.
BAPTA의 헵틸디에틸렌 글리콜 디에스테르, 칼슘염. 백색 분말. 수율 80%(1.77g).
C44H66N2O14Ca에 대한 원소분석. 계산치: C 59.59%, H 7.44%, N 3.16%, Ca 4.51%. 실측치: C 59.61%, H 7.79%, N 3.15%, Ca 4.04%.
BAPTA의 메틸트리에틸렌 글리콜 디에스테르, 칼슘염. 백색 분말. 수율 80%(1.61g).
C36H50N2O16Ca에 대한 원소분석. 계산치: C 53.60%, H 6.20%, N 3.47%, Ca 4.96%. 실측치: C 53.95%, H 6.33%, N 3.20%, Ca 4.73%.
실시예 3: BAPTA 디에스테르염의 시험관내 친유성 측정
본 발명의 여러 BAPTA 디에스테르염의 친유성 값은 이들 화합물의 유기 용액 대 수용액중의 용해도를 비교하여 연구한다. 옥탄올 및 생리학적 식염수를 각각 유기 용액 및 수용액으로 사용한다. 분배 계수(Pc), 즉 유기 상 및 수성 상 사이의 분배 비는 화학식 I의 다수의 특정한 BAPTA 디에스테르염에 대해 측정한다.
화학식 I
상기식에서,
방향족 환에 대한 치환체는 오르토 위치에 존재하며,
R은 CnH2n+1(n=2 내지 8) 또는 CnH2n+1(OCH2CH2)m(m=1 내지 3, n=1 내지 18)이고,
M은 지시된 바와 같이 Na+또는 Ca++이다.
계산된 LogPc로 표시되는 결과는 표 1에 나타낸다.
대부분의 신규한 BAPTA 디에스테르는 천연 BAPTA보다 상당히 더 친유성임을 이해한다. 흥미롭게는, 분배 계수는 또한 반대 이온의 선택에 의해 영향을 받는다. 일반적으로, BAPTA 디에스테르의 칼슘염은 이의 상응하는 나트륨염보다 더 친유성이다.
실시예 4: Ca++, Fe++및 Zn++이온의 물/옥탄올 분배에 대한 BAPTA 디에스테르의 시험관내 효과
본 발명의 신규한 BAPTA 디에스테르의 수성 및 소수성 환경에서의 킬레이팅 활성이 시험되고, 이는 세가지 상이한 이가 금속 이온: Fe++, Zn++및 Ca++에 대한 BAPTA의 디옥틸-에틸렌 글리콜 에스테르(DP-BAPTA 99, 이나트륨염)의 효과에 의해 입증된다.
본 실험 세트에서 사용된 친유성/소수성 시스템은 옥탄올 15ml 및 식염수 15ml로 이루어진다(pH=6.5). DP-BAPTA 99를 옥탄올 용액에 용해시킨 후, 이 상을 식염수와 혼합한다. 상이한 실험에서 DP-BAPTA 농도는, 도 1A-C에서 각 지점에 대해 지시된 바와 같이, Ca2+를 사용하는 실험에서 2.1x10-6내지 5.5x10-4M/L로 및 Zn2+또는 Fe2+를 사용하는 실험에서 5.4x10-6내지 1.4x10-3M/L로 변한다. 상응하는 금속 이온을 수용액에 염화물로서 다음 농도에서 가한다: FeCl22X10-3M/L, ZnCl210-4M/L, CaCl22x10-3M/L.
옥탄올 및 완충제 상을 혼합하고, 실온에서 1시간 와동시킨 후, 혼합물을 2상으로 분리시키기 위해서 4000rpm에서 10분동안 원심분리한다.
상이한 분석 방법이 물 및 옥탄올 샘플에 대해 사용된다:
i) 물은 Merk로부터의 ICP 표준에 대해 분석한다. Ca 및 Zn은 시험 용액에서 유도 커플링된 플라스마 원자 방출 분광 분석법으로 측정한다. ICP-AES, 모델 "Spectroflame Modula E"(제조원: 독일 클레베 소재의 Spectro)를 표준 교차 유동 분무기와 함께 사용하고, EOP 토치를 고정시킨다. 전력 수준은 1.2kW이고, 냉매 유속은 15 l/분, 보조 유속은 0.5 l/분 및 분무기 유속은 0.5 l/분이다.
ii) 유리 튜브에서 각 2ml의 옥탄올 샘플을 가열 블록으로 옮긴다. 옥탄올 증발은 150℃에서의 가열 및 질소를 사용하는 연속 플러싱을 병용하여 달성한다. 잔사를 진한 질산 2ml에 용해시키고, 120℃에서 1시간 가열한다. 다음에, 튜브를 실온으로 냉각시킨 후, 탈이온수를 10ml의 최종 용량에 가한다.
BAPTA의 디옥틸-에틸렌 글리콜 에스테르는 모 분자 BAPTA의 나트륨염보다 10,000배 더 친유성이며, 옥탄올로 대표되는 유기 용매에 우선적으로 용해된다고 나타난다.
또한, 도 1A-C에 나타난 바와 같이, BAPTA 디에스테르는 금속 이온의 물로부터 옥탄올로의 이동 및 유기 상에서의 이들 이온의 축적을 매개하는 반면, BAPTA는 그렇지 않다. BAPTA 디에스테르의 이러한 선택적 킬레이팅 효과는 10μM의 낮은 약물 농도에서 Zn++이온의 물로부터 옥탄올로의 이동에서 및 Ca++및 Fe++이온의 상응하는 이동에 대해 250 내지 500μM 약물에서 명백하다.
B. BAPTA 디에스테르의 생물학적 평가
본 발명에 따르는 킬레이팅제의 신규한 디에스테르를 많은 생물학적 모델 시스템에서 비정상적 칼슘 수준을 포함하는 상해를 거친 배양물중의 세포 또는 기관에 대한 보호 효과에 대해 시험한다. 시험관내(조직 배양물 세포; 뇌 균등액) 및 생체내(몽고 게르빌루스쥐 및 위스타르 래트) 유도된 실험의 결과가 다음에 나타난다.
실시예 5: 세포내 Ca++농도에 대한 BAPTA 디에스테르의 효과(시험관내 연구)
세포내 Ca++농도에 대한 두가지 상이한 BAPTA 디에스테르의 킬레이팅 효과는 시험관내에서 래트 해마의 배양된 뉴론 세포로 시험하고, 다음에 형광 기록한다.
세포 배양. 래트 해마의 1차 해리된 배양물은 E19 태아로부터 준비하고, 13mm 커버 글래스상에서 104주간 성장시킨다. 간단히, 세포를 10% 말 혈청 및 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 DMEM중에 플레이팅하고, 이를 1주 후에 10% 말 혈청을 함유하는 DMEM으로 대체한다. 신경교 증식은 플레이팅 후 5 d에서 출발하여 3 d에 대해 5-플루오로-2'-데옥시유리딘을 사용하여 배양함으로써 차단한다. Ca2+ j조영하기 위해서, 커버 글래스를 기록 매질로 세척하고, 0.2%(w/v) 플루론산(F127)의 존재하에 1 내지 1.5시간동안 3μm Fluo-3/AM(제조원: Molecular probes)을 사용하여 실온에서 교반하면서 배양한다. 다음에, 배양물을 기록 매질중에 1시간 이상 세척하고, 다음 1 내지 3시간 동안에 사용한다.
용액 및 약물. 기록 매질은 다음을 함유한다: 129mM NaCl, 4mM KCl, 1mM MgCl2, 2mM CaCl2, 4.2mM 글루코스 및 10mM HEPES. pH는 NaOH를 사용하여 7.4로 및 오스몰 농도는 수크로스를 가하여 320mOsm로 조정한다. BAPTA 디에스테르 디에틸-BAPTA(DP-BAPTA 23) 또는 디옥틸-에틸렌 글리콜-BAPTA(DP-BAPTA 99)(둘다 이나트륨염)는 기록 매질중에서 사용 전에 냉동 원액으로부터 제조한다. 각 실험에서 지시된 바와 같이, BAPTA 디에스테르를 0.1mM의 최종 농도로 세포로부터 약 50μm되는 곳에 놓인, 선단 직경이 2μm인 압력 피펫으로 부하시킨다. 약물은 피펫을 통해 0.5 내지 5초 기간의 압력 펄스로 적용된다.
조영. 염료, Fluo-3/AM(Molecular probes)을 놓은 후, 커버 글래스를 초점이 같은 레이저 주사 현미경(제조원: 독일 하이델베르크 소재의 Leica)에 놓고, 1μM 테트로도톡신(TTX)을 포함하는 기록 매질을 3 내지 5ml/분의 속도로 실온에서 사용하여 과융시킨다. 초점이 같은 레이저 주사 현미경에는 488nm의 파장에서 여기시키기 위한 아르곤-이온 레이저가 장치되어 있다. 레이저 광은 1 내지 3%의 명목 강도로 감소되어 광역학적 손상을 방지한다. 256x256 픽셀의 화상은 63x 수 침지 목적물을 사용하여 얻는다. 세포의 완전한 입체 재구성물은, 필요한 경우, 세포로부터 취해진 15 내지 20개의 연속 0.5 내지 1.0μm 광학 단편으로부터 제조된다. 형광 강도는 Leica 분석 소프트웨어 및 Adobe Photoshop(제조원: Adobe Systems)을 사용하여 정량화한다. Fluo-3 형광의 변화는 네트 형광을 예비처리된 형광으로 나누어 표준화한다(△F/F).
2.4mM Ca++을 함유하는 DMEM 매질에서 성장한 해마 뉴론 세포를 비히클, 즉 기록 매질로 처리하거나(도 2, 프레임 1,2), DP-BAPTA 23으로 처리한다(도 2, 프레임 3 내지 11). 약물의 첨가(9초 펄스로 1mM)에 의해 세포내 칼슘 수준이 감소하고, 이는 처리된 세포에 기록된 형광의 감소에 의해 영향을 받는다. Ca++농도의 이러한 일시적 감소는 약물이 세포에서 세척제거된 후 7 내지 8초내에 완전히 회복된다(도 2, 프레임 12 내지 20 참고). 동량의 약물을 단기간 적용하면 동일한 세포에서 형광이 더 짧게, 더 적게 감소한다(데이터는 도시되지 않음).
중요하게는, 동일한 농도의, 세포막 비투과성 약물인 모 약물의 사나트륨염, BAPTA-Na4를 래트 해마의 배양된 뉴론의 표면에 적용하는 동안, 세포내 Ca2+를 중요하지 않게만 촉진시킴을 주의한다(데이터는 도시되지 않음).
도 3에서 세포내 Ca2+농도의 칼륨-유도된 증가에 대한 BAPTA 디에스테르의 효과가 입증된다.
해마 뉴론 세포는 상기한 바와 같이 성장하고, 별표(*)로 지시된 시점에서 (100mM KCl을 함유하는 피펫으로부터 적용된) 40밀리초 K+펄스에 노출시킨다. 대조표준 조건하에, 이러한 각 K+펄스는 세포내 Ca2+농도의 3 내지 4배 증가를 유발하고, 이는 형광 신호의 일시적 증가로 기록된다.
다음에, 세포를 0.1, 1.0 또는 10.0μg/ml의 디옥틸-에틸렌 글리콜-BAPTA(DP-BAPTA 99)를 5분동안 사용하여 환류시킨 후, 각각 기록한다. 도 3에 도시된 결과는 5개의 개별적 해마 뉴론 세포로부터 평균한 형광 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3에 도시된 바와 같이, BAPTA 디에스테르는 세포내 칼슘 이온 농도의 칼륨-유도된 증가를 감쇠시키고, 이 효과를 농도-의존 방식으로 수행한다.
실시예 6: Na/K-ATP아제 활성에 대한 BAPTA 디에스테르의 효과
페르난데스(Fernandes) 등은[참조: Neurochem Int. 28:497-500, 1996] 필로카르핀 주사에 의해 유발된 실험적 간질 동안에 래트 해마에서 효소 Na/K-ATP아제의 활성을 연구했다. 이 연구에 따라서, 효소 활성은 간질의 급성 및 침묵기 동안에 감소하고, 간질의 만성 상 동안에는 증가한다(비정상적 수준으로는 아니다)는 사실을 밝혀냈다. 이들 결과로부터 가능한 결론은 Na/K-ATP아제 활성의 변화가 필로카르핀 주사에 의해 유발된 뇌 손상 후에 자발적 및 재발성 발작의 출현에 포함될 수 있다는 것이다.
필로카르핀-유발된 발작은 사람 간질의 여러 유형 및 이의 발현에 대한 모델로 간주된다. 세포외 K+수준을 증가시키는 효소 Na/K-ATP아제의 감소된 활성은 간질 상태 및 이의 발현에 공헌하는 인자일 수 있음이 제안되어 있다.
따라서, Na/K-ATP아제 활성에 대한 BAPTA 디에스테르의 효과는 상이한 농도의 디에틸-BAPTA(DP-BAPTA 27, 이나트륨염)으로 처리된 마우스 뇌 균등액중에 시험한다. BAPTA 디에스테르 시험된 농도는 10-7내지 102μg/ml의 범위이다.
마우스 뇌 균등액의 제조. (10 내지 21일 된) 수컷 CD-1 마우스를 재빨리 목을 쳐서 죽인다. 두개골을 개방하고, 뇌를 제거하고, 둘로 절단한다. 피질을 분리하고, 나트륨 링거 완충액에 놓고, 빙냉 PBS로 3회 세척하고, 얼음 위에 유지시킨다. 뇌 조직을 Polytron을 사용하여 14000rpm에서 4X30초동안 얼음 위에서 균질화한다. 균질화 완충액은 다음을 함유한다: 250mM 수크로스; 1mM EGTA; 20mM HEPES-Tris, pH 7.4 및 프로테아제 억제제 PMSF.
균등액을 Sorval 냉동 원심분리기에 27000g으로 30분동안 내려 놓는다. 막 분획을 수집하고, 균질화 완충액에 재현탁시킨다. 신선한 DP-BAPTA 27을 각 실험에 대해 1mg/ml 원액으로부터 희석시키고, ATP아제 반응 매질로 지시된 최종 농도에서 가한다.
Na/K-ATP아제 분석. Na/K-ATP아제는 이전에 기술된 바와 같이[참조: Norby J, G. Coupled(1988) Assay of the Na+K+ATPase Activity. Methods in Enzymology. 156: 116-119] Na/K-ATP아제 억제제, 우아바인(3mM)의 부재하에 및 존재하에 측정한다. 단백질 함량은 이전에 기술된 바와 같은 Bio Rad-Bradford 분석을 사용하여 측정한다[참조: Bradford, M. (1978) Protein assay. Ann. Biochem. 72: 248-257].
도 4에 도시된 바와 같이, DP-BAPTA 27은 마우스 뇌 피질에서 Na/K-ATP아제 활성의 용량 의존성 증가를 유발하고, 따라서 생리학적 조건하에 세포외 K+의 낮은 수준을 초래한다고 생각된다.
실시예 7: 세포 심장 기능에 대한 BAPTA 디에스테르의 효과
디에틸-BAPTA(DP-BAPTA-23)의 심장보호 효능은 배양된 심근세포에서 막 활동전위에 대한 이러한 약물의 효과를 조사하여 평가한다.
심실 근세포는 다큰 기니 피그로부터(350 내지 400g) 효소 해리 방법에 의해 수득한다[참조: Isenberg G. and Klockner U. (1982) Pflugers Arch: 395, 6-18]. 세포를 도립 현미경(일본 도쿄 소재의 Nikon, DIAPHOT-TMD)의 스테이지 위에 0.5ml 기록 욕중에 놓는다. 이 욕을 Tyrode 용액(140mM NaCl, 4mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1mM MgCl2, 10mM 글루코스 및 5mM HEPES, pH 7.4)를 사용하여 1 내지 2ml/분의 속도로 과융시킨다. 근세포를 0.2Hz에서 자극하고, 실온(24 내지 25℃)에서 연구한다. 팻치 전극은 유리 마이크로피펫으로부터 제조하고, 다음을 함유하는 피펫 용액을 사용하여 충전하는 경우, 선단 저항은 2 내지 4MΩ이다: 120mM K-아스파르테이트, 20mM KCl, 3.5mM MgCl2, 20mM KH2PO4, 3mM Na2ATP, 10mM 글루코스 및 1mM EGTA pH 7.4. 활동전위는 기니 피그 심실 근세포로부터 Axon 200A(제조원: 미국 캘리포니아 포스터 시티 소재의 Axon Instruments, Inc.)에 의해 기록한다[참조: Felzen et al. 1995, Pflugers Arch: 427, 422-431; Felzen et al. 1996, Circ. Res. 78, 253-261].
10-11내지 10-14mol/L DP-BAPTA 23은 배양된 심근세포의 휴지 전위를 감소시키고(8mV) 이의 활동 전위 기간을 단축시킴으로써 과분극을 유발한다는 사실이 밝혀졌다(결과는 도시되지 않음).
도 5에는 10-6M 우아바인의 부재하에 또는 존재하에 6분동안(자국 2), 10분동안(자국 3) 및 13분동안(자국 4) 배양시킨 자극된 근세포로부터의 막 전위 측정치를 우아바인 및 10-10mg/ml DP-BAPTA 23을 사용하여 35분동안 배양시킨 자극된 근세포로부터 측정된 막 전위(자국 5)와 비교해서 나타낸다.
도 5에서 알 수 있는 바와 같이, Na/K-ATP아제 억제제, 우아바인을 사용하여 13분동안 배양시킴으로써 심근세포에서 감극 후의 지체(DAD)를 유발한다(자국 4상에 화살표로 표시됨). 우아바인 독성을 규정짓는 이 반응은 DP-BAPTA 23에 의해 없어진다(자국 5).
실시예 8: 글루타메이트 유발된 뉴론 세포사멸에 대한 BAPTA 디에스테르의 효과
본 발명의 BAPTA 디에스테르의 신경보호 전위는 글루타메이트 독성의 시험관내 모델 시스템으로 평가한다.
래트로부터의 신생아 피질 뉴론을 24 웰 플레이트에서 플레이팅하고, 조직 배양물중에 문헌에 기술된 바와 같이 성장시킨다[참조: Satter et al., J. Cereb Blood Flow Metab, 17, 456(1997)].
세포를 0.5ml/웰의 대조표준 용액으로 1회 세척하여 혈청 단백질을 제거한다. 대조표준 용액은 다음을 함유한다: 121mM NaCl, 5mM KCl, 10mM HEPES산, 7mM HEPES-Na염, 1mM Na-피루베이트, 1.8mM CaCl3, 3mM NaHCO3, 0.01mM 글리신, 20mM D-글루코스, pH 7.4(Sigma). DP-BAPTA-23을 먼저 DMSO에 용해시키고, 다음에 대조표준 용액에 300, 100, 10 및 3μM의 농도로 희석시킨다. 세포에 첨가되는 DMSO의 양은 1%를 초과하지 않아야 한다. 배양된 뉴론 세포를 시험된 DP-BAPTA-23(0.5ml/웰)을 사용하여 부하시키고, 37℃ 가습실에서 1시간 배양한다. 다음에, 플레이트의 매질을 흡인하고, 신선한 대조표준 용액으로 대체하고, 37℃에서 추가로 30분동안 배양한다. 1mg/ml 원액으로부터의 요드화프로피듐(PI)(제조원: Molecular Probes Inc., Cat # P-1304)을 각 웰에 50μg/ml의 최종 농도에서 가하고, 기선 형광을 기록한다. 다음에, 세포를 300mM의 L-글루타메이트(Sigma)로 1시간동안 실온에서, 각 실험에 지시된 바와 같이 여러 농도의 DP-BAPTA-23의 부재하에 또는 존재하에 처리한다.
세포를 글루타메이트 상해되기 전에 BAPTA 디에스테르로 처리한 프로토콜마다, 약물은 매질중에 상해 기간 전체에 걸쳐 존재한다(도 6). 다른 경우에, DP-BAPTA를 글루타메이트 상해 후에만, 지시된 시점에서 가한다(도 7 참조). 글루타메이트를 함유하지 않는 대조표준 용액을, 화합물 단독으로 유발되는 독성 수준을 체크하기 위해서, 시험된 BAPTA 디에스테르를 함유하는 대조표준 웰에 가한다.
상해 후에, 글루타메이트를 함유하는 매질을 제거하고, 글루타메이트를 함유하지 않지만, PI(50μg/ml)를 함유하는 동일한 매질로 바꾼다. PI 형광 측정치는 24시간동안 1시간 간격으로 취한다.
배경 제외된 형광 측정치를 1mM NMDA에 1시간 노출된 동일한 배양물로부터 얻은 PI 형광 측정치에 대해 규정화한다. 세포사멸은 Cytoflour II Multi-웰 플레이트 주사기(제조원: PerSeptive Biosystems)에서의 형광 기록치에 의해 모니터한다. 글루타메이트 상해는 100%에 가깝게 뉴론 세포사멸을 24시간내에 유발한다.
죽은 세포의 분획은 다음과 같이 계산된다:
죽은 분획 = (Ft-Fo)/FNMDA
상기식에서,
Ft는 t 시점에서의 PI 형광이고,
Fo는 0 시점에서의 최초 PI 형광이고,
FNMDA는 1mM N-메틸-D아스파르테이트(NMDA)에 60분 노출된 지 24시간 후, 동일한 절개 및 플레이팅으로부터의 동일한 배양물의 배경 제외된 PI 형광이다.
도 6에 도시된 바와 같이, DP-BAPTA-23은 글루타메이트-유발된 뉴론 세포사멸을 용량 의존성 방식으로 감소시킨다. 이러한 보호 효과는 30μM의 낮은 BAPTA 디에스테르 농도에서 명백하다.
또한, 이러한 신경보호 효과는, DP-BAPTA(100μM)이 글루타메이트 상해되기 1시간 전에(도 6) 또는 글루타메이트 상해된 지 60분 후까지(도 7 참고) Glu와 함께 가하는 경우에, 입증된다.
실시예 9: BAPTA 디에스테르의 신경보호 효과-구형 전뇌 허혈 모델
본 발명의 BAPTA 디에스테르의 신경보호 효능은 또한 몽고 게르빌루스쥐에서 구형 전뇌 허혈 모델 시스템으로 시험한다.
동물. 60 내지 70g의 수컷 몽고 게르빌루스쥐(제조원: 미국의 Charles River Laboratories)를 연구에 사용한다.
허혈의 유발. 게르빌루스쥐를 할로탄(4%)으로 마취실(30% 산소, 70% 아산화질소)에서 마취시키고, 30% 산소 및 70% 아산화질소중의 1% 할로탄으로 안면 마스크를 사용하여 유지시킨다. 허혈을 유발하기 위해서, 통상의 경동맥을 둘다 목 중간선 절개로 분리하고, 지시된 바와 같이, 10분 또는 20분동안 동맥 클립을 사용하여 일시적으로 폐색시킨다. 전체 뇌 허혈 기간 동안에, 클립을 적소에 놓는 경우, 할로탄의 부재하에 30% 산소 및 70% 아산화질소만을 사용하여 마취를 유지한다. 직장 탐침으로 모니터된 직장 온도는 허혈 전반에 걸쳐 37 내지 37.5℃에서 가온 램프 및 가열 패드를 사용하여 유지시킨다. 적용시마다, 시험된 BAPTA 디에스테르를 동물에게 복강내를 통한 비경구 또는 경구로 각각의 특정 실험에서 지시된 바와 같은 시점에 및 용량으로 투여한다. 대조표준 동물을 BAPTA 디에스테르 화합물 대신에 비히클 단독으로, 즉 0.9% NaCl 용액을 사용하여 처리한다.
생존가능성 연구. 20분의 구형 전뇌 허혈 후에 동물 생존을 허혈 10일 후까지 모니터한다.
통계학. 통계학적 분석은 스튜던트 t 시험을 사용하여 Bonferroni 보정 및 유의성의 수준으로서 p<0.05로 수행한다.
뉴론-특이적 에놀라제(NSE) 분석. 혈액 샘플은 10분의 뇌 허혈 후에 24 및 72시간에 게르빌루스쥐의 안와동으로부터 취한다. 혈액 샘플을 5분동안 3000rpm에서 원심분리하여 혈청을 수득한다(상등액 분획). 혈청중의 NSE 활성은 방사선면역분석에 의해 NSE 키트(제조원: 이스라엘의 Pharmatope Ltd.)를 사용하여 측정한다.
혈청중의 뉴론-특이적 에놀라제(NSE)의 효소 활성은 뉴론 손상의 방지에서 시험된 BAPTA 디에스테르의 효능을 평가하기 위해 사용된다. 실험적 구형 허혈에서, NSE 수준은 혈청중에, 이들 실험적 조건하에 일어나는 지체된 뉴론 세포사멸에 상응하는 허혈에 이어서, 2 내지 192시간동안 증가한다는 사실이 밝혀졌다. 따라서, NSE는 뉴론 손상의 정도에 대한 정량적 표시로서 소용될 수 있다.
도 8, 9 및 10에는 본 발명의 두가지 BAPTA 디에스테르, 디옥틸-BAPTA(DP-BAPTA-60, 이나트륨염) 및 디옥틸-에틸렌 글리콜-BAPTA(DP-BAPTA-99, 이나트륨염)을 이의 뉴론 보호 효과에 대해 시험한 실험 결과가 요약되어 있다. 약물의 상이한 섭생법 및 투여 경로는 몽고 게르빌루스쥐의 구형 전뇌 허혈의 모델 시스템으로 시험한다. 후속 파라미터는 (i) 동물의 혈청에서 뉴론 세포사멸에 대한 지시제로서 뉴론-특이적 에놀라제의 활성(도 8 및 9) 및 (ii) 동물 생존(도 10)이다.
도 8에 도시된 바와 같이, 재환류의 개시시에 즉시(t=0) 또는 재환류가 개시된 지 3시간 후에(t=3) 허혈 게르빌루스쥐에게 복강내 투여된 1회 용량, 5μg/kg의 DP-BAPTA-60(회색 막대) 또는 DP-BAPTA-99(검정 막대)는 뉴론 손상을 방지한다. 이들 결과는 DP-BAPTA 약물이 치료 및 예방 양식 둘다에서 작용함을 지시한다.
도 9에는 두가지 방식으로 경구 투여된 DP-BAPTA-99의 신경보호 효과가 도시되어 있다: a) 재환류를 개시하기 4시간 전에 0.5mg/kg 투여한 다음에, 재환류의 개시시에 추가로 0.5mg/kg 투여, 및 b) 허혈 후 3일동안 매일 0.5mg/kg. 양쪽 섭생법에서, DP-BAPTA 99는 구형 뇌 허혈 후 24시간 및 72시간에 측정되는, 혈청중의 NSE 활성의 상당한 감소로 입증되는 확실한 보호 효과를 나타낸다.
다른 실험에서, BAPTA 디에스테르의 보호 효과는 상기한 바와 같이, 20분의 구형 전뇌 허혈이 적용된 게르빌루스쥐의 생존 기간을 모니터하여 평가한다. 시험된 동물(각 그룹에서 N=15)은 재환류의 개시시에 1회 용량으로 복강내 투여된 10μg/kg의 DP-BAPTA-60 또는 DP-BAPTA-99를 수용한다. 대조표준 동물(N=30)은 비히클 용액을 수용한다.
도 10에 도시된 바와 같이, DP-BAPTA-60 및 DP-BAPTA-99는 둘다 동물의 생존을 각각 2배 및 3배로 연장한다.
결론적으로, BAPTA 디에스테르는 허혈에 의해 야기된 뉴론 손상에 대한 보호에 있어서 치료 및 예방 양식 둘다에 유효하고, 약물의 비경구 및 경구 투여 경로가 실제적임이 입증된다.
중요하게는, 디옥틸-BAPTA의 이나트륨염 및 칼슘염은 둘다 이의 신경보호 용량에서 동일하게 유효함을 주의한다. 한편, 이러한 모델 시스템에서, 디옥틸-에틸렌 글리콜-BAPTA(DP-BAPTA-99)의 나트륨염은 분자의 칼슘염에 비해서 훨씬 현저한 신경보호 활성을 나타낸다.
실시예 10: BAPTA 디에스테르의 신경보호 효과의 조직병리학적 분석
BAPTA 디에스테르의 신경보호 활성을 추가로 설정하기 위해서, 상세한 반-정량적 현미경 병리학 분석을 구형 전뇌 허혈이 유발된 동물의 뇌 샘플에 대해 BAPTA 디에스테르의 부재하에 또는 존재하에 수행한다.
현재 가장 신경보호적으로 유효한 본 발명의 두가지 BAPTA 디에스테르, 즉 디옥틸-BAPTA(DP-BAPTA 60) 및 디옥틸-에틸렌 글리콜-BAPTA(DP-BAPTA 99)(둘다 이나트륨염)을 시험한다.
39마리의 몽고 게르빌루스쥐를 실시예 9에 기술된 방법에 따라서 유발된 10분의 구형 전뇌 허혈에 노출시킨다. 동물을 다음과 같이 시험되는 세 군으로 나눈다:
I군: 게르빌루스쥐 13마리; 허혈 직후의 체중 kg당 1회 용량, 5μg의 DP-BAPTA 60으로 복강내 주사.
II군: 게르빌루스쥐 11마리; 허혈 직후의 체중 kg당 1회 용량, 5μg의 DP-BAPTA 99로 복강내 주사.
III군: 게르빌루스쥐; 비히클, 즉 식염수 용액으로 주사한 대조표준 동물.
허혈 3일 후, 동물을 케타민 및 크실라진으로 재마취시키고, 이의 뇌를 외과수술로 제거하고, PBS중의 4% 포르말린에 7일동안 저장한다. 7μm 두께의 슬라이드를 해마 배면 영역으로부터 취하고, 현미경 시험하기 위해서 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한다.
해마의 CA-1, CA-2, CA-3 및 해마의 치상회 아-영역은 내측, 중간 및 외측의 세가지 소영역으로 나누어 평가한다. 다음에, 각 단편으로부터 생존 세포의 총수를 계수하고, 뉴론 손상을 평가한다. 뇌 손상 평가에 사용되는 임의 스케일은 다음 5단계를 포함한다: 0은 정상 조직, 비손상을 나타내고; 1은 최소 손상, 약 25% 미만의 뉴론 괴사를 나타내고; 2는 약간의 손상, 약 40% 미만의 뉴론 괴사를 나타내고; 3은 보통의 손상, 약 60% 미만의 뉴론 괴사를 나타내고; 4는 뉴론의 80% 이상이 죽은 현저한 손상을 나타낸다.
도 11에서 알 수 있는 바와 같이, DP-BAPTA 99는 해마의 CA-2, CA-3 및 치상회 영역에서 상당한 신경보호 효과를 입증한다. DP-BAPTA 60은 또한 동일한 영역에서 허혈-유발된 뉴론 손상의 감소에 유효하지만, DP-BAPTA 99보다는 적은 정도임이 밝혀졌다.
실시예 11: BAPTA 디에스테르의 항간질 효과(생체내 모델)
DP-BAPTA 99의 항간질 활성은 위스타르 래트의 동물 모델에서 수행되며, 여기에서 발작은 필로카르핀에 의해 유발된다(400mg/kg).
체중이 약 350g인 위스타르 래트를 이 실험에 사용한다. DP-BAPTA-99를 도 12A-B에 지시된 상이한 농도로 필로카르핀을 주사하기 1시간 전에 복강내 주사한다. 메틸 스코폴아민(1mg/kg)을, 필로카르핀의 말초 근육 효과를 감소시키기 위해서, 필로카르핀(400mg/kg, 복강내)보다 30분 전에 피하 주사한다.
필로카르핀을 주사한 후, 수분내에 동물은 눈 주위로부터 포르핀의 방출, 만성 저작, 결절화, 간대성근경련 반사 및 젖은 개의 오한을 나타낸다. 이들은 Racine 스케일의 1 내지 2단계에 상당하는 사지 발작의 모든 단계이다. 다음에, 동물은 일반적으로 단계 3으로 움직이고, 이는 앞다리를 구르는 활동을 포함한다. 일반적으로 20분내에, 동물은 발작 일반화의 징후를 나타낸다. 이는 포효, 또는 동시에 일어나는 앞다리 간대성경련 활동 및 일반화된 간대성 발작과 함께 포효 및 쓰러짐을 포함한다. 일반적으로 30분내에, 래트는 간질지속상태로 된다. 지속상태는 본래 사지에 일어나며, 간대성 발작의 짧은 에피소드에 의해 중단된다. 간질지속상태는 자발적으로 멈추지 못하는 발작이다. 래트 모델에서, 이는 5분 넘게 계속됨을 의미한다. 동물이 3시간동안 간질지속상태로 있은 후(및 지속상태의 동물만), 발작은 10mg/kg 디아제판 및 페니토인(60mg/kg)을 복강내 투여하여 중단된다. 다량의 필로카르핀 모델을 사용하는 지속상태 동안에 사멸률은 일반적으로 약 30 내지 50%이다.
도 12에 도시된 바와 같이, DP-BAPTA-99는 사지 발작에 대한 효과가 없지만, 일반화된 발작을 예방할 수 있고, 집단의 대략 반에서 간질지속상태를 방지한다. 또한, 약물은 3시간의 간질지속상태 동안에 일어나는 사멸률을 감소시킨다.
따라서, DP-BAPTA-99는 발작의 확산(일반화)를 예방할 수 있다.
본 발명은 특정하게 기술되었지만, 당해 분야의 전문가는 많은 변화 및 변형이 이루어질 수 있음을 이해한다. 따라서, 본 발명은 특정하게 기술된 양태로 제한하는 것으로 추정해서는 안되며, 차라리 본 발명의 범위, 정신 및 개념은 뒤따르는 청구범위를 참고하여 더욱 쉽게 이해된다.

Claims (41)

  1. 하이드록시 화합물(b)과의 안정한 디에스테르화 카복실산(a)[여기에서, (a)는 (HOOC-CH2-)2-N-A-N-(-CH2COOH)2의 이가 금속 이온에 대한 약제학적으로 허용되는 킬레이트제(여기에서, A는 두개의 기술된 질소 원자 사이의 직접 쇄 결합에, 2 내지 4개의 산소 원자에 의해 방해받을 수 있는 연속 쇄의 2 내지 8개의 탄소 원자를 함유하는 포화 또는 불포화, 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 결합 라디칼이고, 단, 두개의 기술된 질소 원자에 직접 연결된 쇄 구성원은 산소 원자가 아니다)이고, (b)는 직쇄 또는 분지, 포화 또는 불포화 알킬, 아미노알킬 및 치환 또는 비치환 아릴알킬 라디칼로 이루어진 군으로부터 선택된 약제학적으로 허용되는 알콜이다]; 및 상기 디에스테르화 카복실산의 약제학적으로 허용되는 염.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 결합 라디칼 A가 -(CH2CH2)m-(여기에서, m은 1 내지 4이고, 질소에 결합되지 않은 2 내지 4개의 탄소 원자는 산소 원자로 치환될 수 있다) 및 -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'-(여기에서, 각각의 라디칼쌍 R-R 및 R'-R'는 결합된 -C=C- 부분과 함께, 5 또는 6개의 환 원자를 함유하는 방향족 또는 헤테로사이클릭 환을 완성하고, R-R에 의해 완성된 환은 R'-R'에 의해 완성된 환과 동일하거나 상이하다)로 이루어진 군으로부터 선택된 디에스테르.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 결합 라디칼 A가 -CH2CH2- 및 -CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-로 이루어진 군으로부터 선택되는 디에스테르.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 결합 라디칼이 -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'-(여기에서, 각각의 라디칼쌍 R-R 및 R'-R'는 결합된 -C=C- 부분과 함께, 푸란, 티오펜, 피롤, 피라졸, 이미다졸, 1,2,3-트리아졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 1,2,3-옥사디아졸, 1,2,5-옥사디아졸, 티아졸, 이소티아졸, 1,2,3-티아디아졸, 1,2,5-티아디아졸, 벤젠, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 1,2,3-트리아진, 1,2,4-트리아진, 및 1,2-, 1,3- 및 1,4-옥사진 및 -티아진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방향족 또는 헤테로사이클릭 환을 완성하고, R-R에 의해 완성된 환은 R'-R'에 의해 완성된 환과 동일하거나 상이하다)인 디에스테르.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 결합 라디칼 A가 -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'-[여기에서, 각각의 라디칼쌍 R-R 및 R'-R'는 결합된 -C=C- 부분과 함께, 비치환 및 치환 벤젠 환으로부터 선택된 동일하거나 상이한 환을 완성하고, 여기에서 치환 벤젠 환은 포화 또는 불포화 C1-4알킬, 포화 또는 불포화 C1-4알콕시, 불소, 염소, 브롬, 요드 및 CF3로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 치환체, 또는 -O-(CH2)n-O-의 이가 치환체(여기에서, n은 1 내지 3이다) 하나를 함유한다]인 디에스테르.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 킬레이트제가 에틸렌-1,2-디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산, 에틸렌-1,2-디올-비스-(2-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 및 1,2-비스-(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산으로부터 선택되는 디에스테르.
  7. 화학식 I의 화합물:
    화학식 I
    상기식에서,
    방향족 환상의 치환체는 오르토 위치에 존재하고,
    R은 CnH2n+1(n=1 내지 10), CnH2n+1(OCH2CH2)m(n=1 내지 20, m=1 내지 6), (CnH2n+1)2N(CH2)m(n=1 내지 6, m=1 내지 6) 및 치환 또는 비치환 ArCH2로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    M은 생리학적으로 허용되는 양이온이다.
  8. 제 7 항에 있어서, R이 모노-, 디- 또는 트리에틸렌 글리콜의 모노알킬 에테르인 화합물.
  9. 제 7 항에 있어서, R이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물:
  10. 제 9 항에 있어서, R이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물:
  11. 제 9 항에 있어서, R이 C8H17인 화합물.
  12. 제 9 항에 있어서, R이 C8H17OCH2CH2인 화합물.
  13. 활성 성분으로서 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 킬레이트제의 안정한 친유성 디에스테르, 및 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 활성 성분으로서 화학식 I의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물:
    화학식 I
    상기식에서,
    방향족 환상의 치환체는 오르토 위치에 존재하고,
    R은 CnH2n+1(n=1 내지 10), CnH2n+1(OCH2CH2)m(n=1 내지 20, m=1 내지 6), (CnH2n+1)2N(CH2)m(n=1 내지 6, m=1 내지 6) 및 치환 또는 비치환 ArCH2로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    M은 생리학적으로 허용되는 양이온이다.
  15. 제 14 항에 있어서, R이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물:
  16. 제 14 항에 있어서, R이 C8H17인 약제학적 조성물.
  17. 제 14 항에 있어서, R이 C8H17OCH2CH2인 약제학적 조성물.
  18. 과량의 이가 금속 이온과 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 제 15 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 따르는 약제학적 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, 비경구 투여하기 위한 약제학적 조성물.
  20. 제 18 항에 있어서, 경구 투여하기 위한 약제학적 조성물.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 이가 금속 이온이 Ca++, Cd++, Co++, Cu++, Fe++, Hg++, Mg++, Mn++, Pb++및 Zn++이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  22. 제 18 항에 있어서, 질환 또는 장애가 상승된 수준의 세포내 Ca++이온과 관련된 약제학적 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서, 과량의 세포내 Ca++이온과 관련된 질환 또는 장애가 뇌 및 심장 허혈, 발작, 심근 경색, 간질, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 급성 염증, 요실금, 전립선 비대, 근육 경련, 동맥 고혈압, 천식 및 과민성 장 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서, 과량의 세포내 Ca++이온과 관련된 질환 또는 장애가 뇌 또는 심장 허혈, 발작, 간질, 알쯔하이머병 또는 심장 부정맥인 약제학적 조성물.
  25. 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 정의된 디에스테르의 용도.
  26. 필요한 개인에게 치료학적으로 유효한 양의, 이가 금속 이온에 대한 약제학적으로 허용되는 킬레이트제의 안정한 친유성 디에스테르를 투여함을 특징으로 하여, 과량의 이가 금속 이온과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  27. 필요한 개인에게 치료학적으로 유효한 양의, 약제학적으로 허용되는 칼슘 킬레이트제의 안정한 친유성 디에스테르를 투여함을 특징으로 하여, 과량의 세포내 Ca++이온과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 친유성 디에스테르가 알콜(b)과의 킬레이트제(a)[여기에서, (a)는 (HOOC-CH2-)2-N-A-N-(-CH2COOH)2의 이가 금속 이온에 대한 약제학적으로 허용되는 킬레이트제(여기에서, A는 두개의 기술된 질소 원자 사이에 직접 쇄 결합을, 2 내지 4개의 산소 원자에 의해 방해받을 수 있는 연속 쇄에 2 내지 8개의 탄소 원자를 함유하는 포화 또는 불포화, 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 결합 라디칼이고, 단 두개의 기술된 질소 원자에 직접 연결된 쇄 구성원은 산소 원자가 아니다)이고, (b)는 직쇄 또는 분지, 포화 또는 불포화 알킬, 아미노알킬 및 치환 또는 비치환 아릴알킬 라디칼로 이루어진 군으로부터 선택된 약제학적으로 허용되는 알콜이다]; 및 상기 디에스테르화 카복실산의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 결합 라디칼 A가 -(CH2CH2)m-(여기에서, m은 1 내지 4이고, 질소에 결합되지 않은 2 내지 4개의 탄소 원자는 산소 원자로 치환될 수 있다) 및 -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'-(여기에서, 각각의 라디칼쌍 R-R 및 R'-R'는 결합된 -C=C- 부분과 함께, 5 또는 6개의 환 원자를 함유하는 방향족 또는 헤테로사이클릭 환을 완성하고, R-R에 의해 완성된 환은 R'-R'에 의해 완성된 환과 동일하거나 상이하다)로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원인 방법.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 결합 라디칼 A가 -CH2CH2- 및 -CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  31. 제 28 항에 있어서, 상기 결합 라디칼이 -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'-(여기에서, 각각의 라디칼쌍 R-R 및 R'-R'는 결합된 -C=C- 부분과 함께, 푸란, 티오펜, 피롤, 피라졸, 이미다졸, 1,2,3-트리아졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 1,2,3-옥사디아졸, 1,2,5-옥사디아졸, 티아졸, 이소티아졸, 1,2,3-티아디아졸, 1,2,5-티아디아졸, 벤젠, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 1,2,3-트리아진, 1,2,4-트리아진, 및 1,2-, 1,3- 및 1,4-옥사진 및 -티아진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방향족 또는 헤테로사이클릭 환을 완성하고, R-R에 의해 완성된 환은 R'-R'에 의해 완성된 환과 동일하거나 상이하다)인 방법.
  32. 제 28 항에 있어서, 상기 결합 라디칼 A가 -CR=CR-O-CH2CH2-O-CR'=CR'-[여기에서, 각각의 라디칼쌍 R-R 및 R'-R'는 결합된 -C=C- 부분과 함께, 비치환 및 치환 벤젠 환으로부터 선택된 동일하거나 상이한 환을 완성하고, 여기에서 치환 벤젠 환은, 포화 또는 불포화 C1-4알킬, 포화 또는 불포화 C1-4알콕시, 불소, 염소, 브롬, 요드 및 CF3로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 치환체, 또는 -O-(CH2)n-O-의 이가 치환체(여기에서, n은 1 내지 3이다) 하나를 함유한다]인 방법.
  33. 제 28 항에 있어서, 상기 킬레이트제가 에틸렌-1,2-디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산, 에틸렌-1,2-디올-비스-(2-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 및 1,2-비스-(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산으로부터 선택되는 방법.
  34. 제 28 항에 있어서, 킬레이트제의 디에스테르가 화학식 I의 화합물인 방법:
    화학식 I
    상기식에서,
    방향족 환상의 치환체는 오르토 위치에 존재하고,
    R은 CnH2n+1(n=1 내지 10), CnH2n+1(OCH2CH2)m(n=1 내지 20, m=1 내지 6), (CnH2n+1)2N(CH2)m(n=1 내지 6, m=1 내지 6) 및 치환 또는 비치환 ArCH2로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    M은 생리학적으로 허용되는 양이온이다.
  35. 제 34 항에 있어서, R이 모노-, 디- 또는 트리에틸렌 글리콜의 모노알킬 에테르인 방법.
  36. 제 34 항에 있어서, R이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법:
  37. 제 34 항에 있어서, R이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법:
  38. 제 37 항에 있어서, R이 C8H17인 방법.
  39. 제 37 항에 있어서, R이 C8H17OCH2CH2인 방법.
  40. 제 27 항 내지 제 39 항 중의 어느 한 항에 있어서, 과량의 세포내 Ca++이온과 관련된 질환 또는 장애가 뇌 및 심장 허혈, 발작, 심근 경색, 간질, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 급성 염증, 요실금, 전립선 비대, 근육 경련, 동맥 고혈압, 천식 및 과민성 장 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  41. 제 27 항 내지 제 39 항 중의 어느 한 항에 있어서, 과량의 세포내 Ca++이온과 관련된 질환 또는 장애가 뇌 또는 심장 허혈, 발작, 간질, 알쯔하이머병 또는 심장 부정맥인 방법.
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