DE69433560T2

DE69433560T2 - Valproinsäure kovalent gebunden an einem lysophospholipid

Info

Publication number: DE69433560T2
Application number: DE69433560T
Authority: DE
Inventors: Alexander Kozak
Original assignee: DPHARM Ltd; D Pharm Ltd
Current assignee: D Pharm Ltd
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1994-03-30
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2014-03-31
Also published as: HU9502866D0; ATE259661T1; CA2159610A1; IL105244A0; CA2159610C; HU221678B1; AU6380894A; SG81890A1; US6136796A; HUT73669A; EP0691852B1; EP0691852A1; WO1994022483A2; DE69433560D1; AU682029B2; US5985854A; KR100400075B1; NZ263208A; JPH08508295A; WO1994022483A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Valproinsäure oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat davon, kovalent gebunden an ein Lysophospholipid.
Hintergrund der Erfindung
Man nimmt an, daß viele ernste Erkrankungen bei Menschen, einschließlich Ischämie, Schlaganfall, Epilepsie, Asthma und Allergie, mit dem Phänomen der Zellübererregung im Zusammenhang stehen. Dieser Begriff wird hierin verwendet, um abnorm erhöhte Spiegel bestimmter intrazellulärer Enzyme zu bezeichnen. Zum Beispiel werden als Ergebnis von supranormalen intrazellulären Phospholipasen, welche mit diesen Erkrankungszuständen assoziiert sind, Zellmembranen zerstört. Gegenwärtige pharmakologische Strategien zielen daher auf die Hemmung dieser nachteiligen abbauenden Aktivität ab.
Es wäre nützlich, wenn man erkrankte Zellen, die durch eine Enzymhyperaktivität gekennzeichnet sind, selektiv angehen könnte, um ein pharmakologisch aktives Molekül in Form eines Prodrugs in eine Zelle einzuschleusen, wodurch eine solche Hyperaktivität auf das Prodrug einwirken würde, so daß sich das pharmakologisch aktive Molekül in den erkrankten Zellen anstatt in den gesunden Zellen anreichert.
Ein nichtbegrenzendes Beispiel für ein solches pharmakologisch aktives Molekül ist ein Calcium komplexierendes Mittel, das viele Vorteile gegenüber Arzneistoffen aufweisen würde, die gegenwärtig zur Behandlung von mit Calcium in Zusammenhang stehenden Erkrankungen verwendet werden.
Intrazelluläres Calcium ist ein wichtiger ausschlaggebender Faktor für den Zelltod, ungeachtet der anfänglichen Verletzung, die die Zelle erlitten hat. Es kann am Zelltod bei einer durch Lymphocyten und Killerzellen vermittelten Schädigung von Zielzellen, bei einer Organschädigung während der Transplantation oder bei anderen Arten einer Gewebeschädigung, einschließlich ischämischen Verletzungen, beteiligt sein. Calciumkanal-Blocker oder Zellmembran-permeable Formen von Calcium-Chelatoren sind vorgeschlagen worden, um vor einer Gewebsverletzung zu schützen oder eine Gewebeschädigung zu verringern. Somit wird deutlich, daß die vorliegende Erfindung eine mögliche Anwendung (in der Ausführungsform unter Verwendung eines Calcium-Chelators) im Zusammenhang mit diesen Umständen findet.
Es ist auch selbstverständlich, daß ein ähnliches Konzept auf die Behandlung von Zuständen oder Erkrankungen, die nicht mit dem intrazellulären Spiegel an Calciumionen verbunden sind, angewendet werden kann. Zum Beispiel, falls die aktive Einheit, welche in das Prodrugmolekül eingebaut wird, ein Proteinkinase-Hemmstoff ist, würde sich nach Verabreichung des Prodrugs der Hemmstoff in einer Zelle anreichern, die ein abnormale Proliferation zeigt, wodurch möglicherweise ein wichtiges Hilfsmittel zur Verwendung in der Antitumortherapie bereitgestellt wird.
Die Verwendung von Prodrugs, um erwünschte Eigenschaften wie eine erhöhte Bioverfügbarkeit oder eine erhöhte Ortsspezifität auf bekannte Arzneistoffe zu übertragen, ist ein anerkanntes Konzept gemäß dem Stand der Technik bei der Arzneimittelentwicklung. Die Verwendung verschiedener Lipide bei der Herstellung von bestimmten Arten von Prodrugs ist im Fachgebiet auch bekannt. In keinem dieser Fälle sind die Prodrugs dadurch gekennzeichnet, daß sie eine bevorzugte Anreicherung des Arzneistoffes innerhalb der erkrankten Zellen des Organs durch die Aktivierung mit intrazellulären Lipasen erreichen. Vielmehr sorgen sie dafür, daß der Arzneistoff zu einer bestimmten Stelle transportiert wird oder innerhalb eines bestimmten Organs freigesetzt wird. Dieser Ansatz wird durch Phospholipid-Prodrugs von Salicylaten und nicht-steroidalen, entzündungshemmenden Arzneistoffen veranschaulicht, offenbart in WO 91/16920, die bei oraler Einnahme die Magenschleimhaut schützen und den Wirkstoff im Darm freisetzen.
In anderen Beispielen für Phospholipid-Prodrugs ist die Formulierung der Prodrugs in Liposomen oder anderen mizellaren Strukturen das Merkmal, welches ihre bevorzugte Aufnahme ermöglicht, zum Beispiel durch Makrophagen oder durch Leberzellen, wie im Falle der Phospholipid-Konjugate von antiviralen Arzneistoffen, offenbart in WO 90/00555 und WO 93/00910.
Im allgemeinen ist eine Virusinfektion nicht mit einer supranormalen Phospholipase-Aktivität assoziiert, und es wird nicht gelehrt oder vorgeschlagen, daß antivirale Phospholipid-Konjugate den Arzneistoff bevorzugt in den erkrankten Zellen oder in den infizierten Zellen aktivieren, wie im Falle der Phospholipid-Konjugate von antiviralen Nucleotiden und Antisense-Oligonucleotiden, wie solchen, die in WO 90/00555, in WO 90/10448 und in NTIS Technical Notes, Nr. 9, Seite 630, Springfield, Virginia, US, 1984, offenbart sind.
In anderen Fällen werden bestimmte Arten von polaren Lipiden verwendet, um die Prodrugs zu intrazellulären Organellen hinzuleiten, wie im Falle der antiviralen und antineoplastischen Nucleoside, die in US 5,149,794 offenbart sind. Weitere Lipidarten sind auch in bestimmten Typen von Prodrugs verwendet worden, wie EP-A-325160, die Mizellen bildende Glycerinester von ACE-Hemmstoffen, welche aus dem Darm in das Lymphsystem aufgenommen werden, wodurch die Leber umgangen wird und ein verstärkter Zugang zum Zentralnervensystem erhalten wird, zur Verwendung bei der Behandlung von Bluthochdruck oder kognitiver Dysfunktion offenbart. Die ACE-Hemmstoffe machen eine enzymatische Spaltung durch und üben ihre therapeutischen Wirkungen extrazellulär aus.
Andere Arten von lipophilen Trägern, die den intrazellulären Transport erleichtern, sind auf dem Fachgebiet bekannt, wie in CH-A-679856, welche die Verwendung von Salicyloyl-Carnitin für die Behandlung von Schmerzen offenbart, und in WO 89/05358, die modifizierte Oligonucleotid-Antisense-Arzneistoffe offenbart, die durch Anlagerung apolarer Gruppen wie Phenyl- oder Naphthylgruppen in Zellen transportiert werden.
Zusammenfassung der Erfindung
In Übereinstimmung mit der Erfindung werden Prodrugs bereitgestellt, bestehend aus Valproinsäure oder einem pharmazeutisch verträglichen Derivat davon, kovalent gebunden an ein Lysophospholipid, welche selektiv pharmakologisch aktive Verbindungen in hyperaktivierten Zellen anreichern. Im Einklang mit einem anderen Gegenstand der Erfindung wird die pharmakologisch aktive Verbindung aus dem Prodrug als Antwort auf die Enzymaktivität innerhalb der Zielzellen freigesetzt. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die pharmakologisch aktive Verbindung, welche sich selektiv in einer Zelle anreichert, die durch einen relativ erhöhten Spiegel der Enzymaktivität darin gekennzeichnet ist, in der Zelle eingeschlossen und zeigt daher eine erhöhte gewünschte Aktivität darin.
Die vorliegende Erfindung stellt demgemäß unter einem Aspekt ein Prodrug bereit, wie vorstehend definiert, das ein kovalentes Konjugat einer pharmakologisch aktiven Verbindung und eines intrazellulären Transporthilfsmittels ist, gekennzeichnet durch das Vorhandensein einer kovalenten Bindung, die für eine Spaltung durch die intrazelluläre Enzymaktivität empfindlich ist.
Unter einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel zur Behandlung eines Zustandes oder einer Erkrankung bei einem Menschen bereit, der/die mit einer supranormalen intrazellulären Enzymaktivität in Beziehung steht, wobei die Verabreichung an einen Menschen mit einem solchen Zustand oder einer solchen Erkrankung eines pharmazeutisch verträglichen, Zellmembran-impermeablen Prodrugs, wie nachstehend definiert, umfaßt ist, wobei das Prodrug ein kovalentes Konjugat einer Zellmembran-permeablen, pharmakologisch aktiven Verbindung und eines intrazellulären Transporthilfsmittels ist, gekennzeichnet durch das Vorhandensein einer kovalenten Bindung, die für eine Spaltung durch die intrazelluläre Enzymaktivität empfindlich ist, so daß die Bindung als Antwort auf eine solche Aktivität gespalten wird, wodurch sich die pharmakologisch aktive Verbindung selektiv innerhalb von Zellen mit einer supranormalen intrazellulären Enzymaktivität anreichert und wobei das Prodrug in einer wirksamen Menge verabreicht wird, um die supranormale Enzymaktivität zu verringern.
Unter einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines pharmazeutisch verträglichen, Zellmembran-permeablen Prodrugs, wie vorstehend definiert, das ein kovalentes Konjugat der pharmakologisch aktiven Verbindung und eines intrazellulären Transporthilfsmittels ist und gekennzeichnet ist durch das Vorhandensein einer kovalenten Bindung, die für eine Spaltung durch die intrazelluläre Enzymaktivität empfindlich ist, so daß die Bindung als Antwort auf eine solche Aktivität gespalten wird, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Zustandes oder einer Erkrankung in einem Menschen, der/die mit einer supranormalen intrazellulären Enzymaktivität in Beziehung steht, durch selektive Anreicherung einer Zellmembran-impermeablen, pharmakologisch aktiven Verbindung innerhalb von Zellen mit einer solchen Aktivität bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen verständlicher und deutlicher.
1 ist eine graphische Darstellung der Wirkungen einer Verbindung, welche erfindungsgemäß nicht eingeschlossen ist, auf den intrazellulären Spiegel an freiem Ca²⁺ in menschlichen Lymphocyten.
2 vergleicht die Erholung bei einer globalen, cerebralen Ischämie in Anwesenheit oder Abwesenheit einer Verbindung, welche erfindungsgemäß nicht eingeschlossen ist.
3 veranschaulicht die Variation bezüglich der Dosierung von Pilocarpin-induzierten epileptischen Anfällen.
4 veranschaulicht den Schutz gegen Pilocarpin induzierte epileptische Anfälle, bewirkt durch eine Verbindung, welche erfindungsgemäß nicht eingeschlossen ist.
Die 5 und 6 veranschaulichen den Schutz gegen eine langfristige Veränderung von bestimmten Herzfunktionen oder eine Verschiebung der Tonusregulation der Herzkranzgefäße, verursacht durch Pilocarpin, wobei der Schutz durch eine Verbindung bewirkt wird, welche erfindungsgemäß nicht eingeschlossen ist.
7 veranschaulicht die Erholung von Pilocarpin geschädigten Herzen in einem Ischämie-Reperfusion-Modell unter Verwendung einer Verbindung, welche erfindungsgemäß nicht eingeschlossen ist.
8 veranschaulicht die schützende Wirkung in einem Metrazol-Minimal-Epilepsieanfall-Test, bewirkt durch eine Verbindung, welche erfindungsgemäß nicht eingeschlossen ist.
Die 9, 10 und 11 veranschaulichen Ergebnisse von Experimenten bei einer Hypoxie-Reperfusion-Kardiopathologie.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die pharmakologisch aktive Verbindung ist Valproinsäure oder ein pharmazeutisch aktives Derivat davon und das Hilfsmittel ist Lysophospholipid. Andere Hilfsmittel, die erfindungsgemäß nicht eingeschlossen sind, können (z. B.) mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Alkohol umfassen, der ausgewählt ist aus Glycerin, C_3-20-Fettsäuremonoglyceriden, C_3-20-Fettsäurediglyceriden, Hydroxy-C_2-6-alkylestern von C_3-20-Fettsäuren, Hydroxy-C_2-6-alkylestern von Lysophosphatidsäuren, Lysoplasmalogenen, Lysophosphatidsäureamiden, Glycerophosphorsäuren, Lysophosphatidalethanolamin, Lysophosphatidylethanolamin und N-Mono- und N,N-Di-(C_1-4)-alkyl- und quaternären Derivaten der Amine davon. Andere pharmakologisch aktive Carbonsäuren, erfindungsgemäß nicht eingeschlossen, sind verzweigtkettige aliphatische Carbonsäuren, Salicylsäuren (z. B. Acetylsalicylsäure), steroidale Carbonsäuren (z. B. Lyserg- und Isolysergsäuren), monoheterocyclische Carbonsäuren (z. B. Nicotinsäure) und polyheterocyclische Carbonsäuren (z. B. Penicilline und Cephalosporine).
Ein anderes Prodrug, welches erfindungsgemäß nicht eingeschlossen ist, schließt einen Calcium-Chelator ein und kann folglich von möglichem Nutzen zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen sein, die mit einem übermäßig hohen Spiegel an intrazellulären Ca²⁺-Ionen in Beziehung stehen. Dieses Prodrug enthält mindestens eine kovalente Bindung zwischen der pharmakologisch aktiven Verbindung und dem intrazellulären Transporthilfsmittel, wobei die kovalente Bindung für eine Spaltung durch die intrazelluläre Enzymaktivität empfindlich ist, mit der Folge, daß sich der größere Teil der Prodrugmoleküle ohne die Spaltung einer solchen Bindung frei in und aus normalen Zellen heraus bewegt, während in den Zellen, welche nur die supranormale Enzymaktivität besitzen, die für eine Spaltung empfindliche Bindung in einem hohen Anteil der Prodrugmoleküle, welche in die Zellen eindringen, gebrochen wird, wodurch sich die pharmakologisch aktive Verbindung innerhalb der abnormalen Zelle intrazellulär anreichert und darin eingeschlossen wird, da diese Verbindung Zellmembran-impermeable ist.
Das Prodrug, welches einen Calcium-Chelator einschließt, ist z. B. eine teilweise oder vollständig veresterte Carbonsäure, die ein Ester ist, bestehend aus:

(a) einem pharmazeutisch verträglichen Chelator für Calcium mit der Formel (HOOCCH₂)₂-N-A-N-(CH₂COOH)₂, worin A eine gesättigte oder ungesättigte, aliphatische, aromatische oder heterocyclische Verbindungsgruppe ist, enthaltend in einer direkten Kettenverbindung zwischen den zwei dargestellten Stickstoffatomen 2–8 Kohlenstoffatome in einer zusammenhängenden Kette, die durch 2–4 Sauerstoffatome unterbrochen sein kann, mit der Maßgabe, daß die Kettenmitglieder, welche direkt an die zwei dargestellten Stickstoffatome gebunden sind, keine Sauerstoffatome sind, und
(b) einem pharmazeutisch verträglichen C_3-32-Alkohol, enthaltend 1 bis 3 OH-Gruppen (z. B. wie ein C_3-6-Alkohol oder z. B. ein sekundärer einwertiger C_7-32-Alkohol);

Der Ester aus dem vorherigen Abschnitt kann auch einer sein, worin die Verbindungsgruppe A ein Vertreter ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH₂CH₂)_m-, wobei m = 1–4, worin 2 bis 4 der Kohlenstoffatome, die nicht an den Stickstoff gebunden sind, durch Sauerstoffatome ersetzt sein können; und -CR=CR-O-CH₂CH₂-O-CR'=CR'-, worin jedes der Paare aus den Resten R-R und R'-R' zusammen mit der gebundenen -C=C-Einheit einen aromatischen oder heterocyclischen Ring, enthaltend 5 oder 6 Ringatome, vervollständigen, wobei der durch R-R vervollständigte Ring gleich oder verschieden ist von dem Ring, der durch R'-R' vervollständigt wird.
In besonderen Ausführungsformen kann die Verbindungsgruppe A zum Beispiel aus -CH₂CH₂- und -CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂- gewählt sein; oder kann zum Beispiel -CR=CR-O-CH₂CH₂-O-CR'-CR'- sein, worin jedes der Paare aus den Resten R-R und R'-R' zusammen mit der gebundenen -C=C-Einheit einen aromatischen oder heterocyclischen Ring vervollständigt, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Furan, Thiophen, Pyrrol, Pyrazol, Imidazol, 1,2,3-Triazol, Oxazol, Isoxazol, 1,2,3-Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, Thiazol, Isothiazol, 1,2,3-Thiadiazol, 1,2,5-Thiadiazol, Benzol, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, 1,2,3-Triazin, 1,2,4-Triazin und 1,2-, 1,3- und 1,4-Oxazinen und -Thiazinen; wobei der durch R-R vervollständigte Ring gleich oder verschieden ist von dem Ring, der durch R'-R' vervollständigt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindungsgruppe A -CR=CR-O-CH₂CH₂-O-CR'=CR'-, worin jedes der Paare aus den Resten R-R und R'-R' zusammen mit der gebundenen -C=C-Einheit die gleichen oder verschiedene Ringe vervollständigt, gewählt aus unsubstituierten und substituierten Benzolringen, wobei die substituierten Benzolringe 1 bis 4 Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem C_1-3-Alkylrest, einem C_1-3-Alkoxyrest, F, Cl, Br, I und CF₃, oder einen einzigen zweiwertigen Substituenen, der -O-(CH₂)_n-O- ist, worin n = 1–3, enthalten.
Gegenwärtig wird bevorzugt, daß der Calcium-Chelator, welcher in das Prodrug eingebaut wird, aus Ethylen-1,2-diamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure, Ethylen-1,2-diol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure und 1,2-Bis-(2-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure ausgewählt ist.
Wie vorstehend erwähnt, enthält der C_3-32-Alkohol, z. B. ein C_3-6-Alkohol, auf den vorstehend Bezug genommen wurde, 1 bis 3 OH-Gruppen. Wenn zwei OH-Gruppen vorhanden sind, kann eine davon verestert oder in anderer Weise derivatisiert sein; und wenn drei OH-Gruppen vorhanden sind, können entweder eine oder zwei der OH-Gruppen verestert oder in anderer Weise derivatisiert sein. Irgendwelche Kohlenstoffatome in der/den veresternden oder in anderer Weise derivatisierenden Gruppe(n) werden nicht zu den beispielsweise 3 bis 6 Kohlenstoffatomen gezählt, die in dem pharmazeutisch verträglichen Alkoholen enthalten sein können. Folglich können diese Alkohole zum Beispiel mindestens einen Vertreter aus der Gruppe umfassen, bestehend aus Glycerin, C_3-20-Fettsäuremonoglyceriden, C_3-20-Fettsäurediglyceriden, Hydroxy-C_2-6-alkylestern von C_3-20-Fettsäuren, Hydroxy-C_2-6-alkylestern von Lysophosphatidsäuren, Lysoplasmalogenen, Lysophospholipiden, Lysophosphatidsäureamiden, Glycerophosphorsäuren, Lysophosphatidalethanolamin, Lysophosphatidylethanolamin und den N-Mono-C_1-4-alkyl-, N,N-Di-C_1-4-alkyl- und quaternären Ammonium derivaten, falls die vorstehenden Verbindungen Amine sind. Ein Beispiel für einen sekundären C_7-32-Alkohol ist 1-Myristylmyristylalkohol.
Dem Fachmann ist bewußt, daß das Prodrug in einer solchen Weise angepaßt werden kann, daß die gewünschte pharmakologisch aktive Einheit durch die Einwirkung des Enzyms, das bekanntermaßen die Quelle der Enzymhyperaktivität bei dem/der zu behandelnden Zustand oder Erkrankung ist, freigesetzt wird. Zum Beispiel war für die Membran-assoziierte, Calcium-unabhängige, Plasmalogen-selektive PLA₂-Aktivität festgestellt worden, daß sie sich um über 400% während 2 Minuten einer globalen Ischämie erhöhte (p < 0,01), nach nur 5 Minuten einer Ischämie um das 10fache größer war (nahe dem Maximum) und während des gesamten untersuchten ischämischen Zeitraums (bis zu 60 Minuten) aktiviert blieb; vgl. Ford et al., J. Clin. Invest. 88(1) (1991), 331–335. Diese Tatsachen legen nahe, daß die Bindung der pharmakologisch aktiven Einheit in der 2-Position in einem Glycerophosphorsäurederivat und die Verwendung eines Lysoplasmalogens möglicherweise als das intrazelluläre Transporthilfsmittel, an welches die aktive Einheit kovalent gebunden ist, wirksamer sein kann als ein Lysophospholipid.
Bei der vorliegenden Erfindung ist die pharmakologisch aktive Verbindung die antiepileptische Verbindung Valproinsäure. In diesem Zusammenhang wird in Betracht gezogen, daß die Anwendung der vorliegenden Erfindung in dieser Ausführungsform die Verwendung einer viel geringeren wirksamen Dosis von Valproinsäure ermöglicht, als es sonst der Fall ist, wodurch das Auftreten von unerwünschten Nebenwirkungen möglicherweise wesentlich verringert wird. In einer nichtbegrenzenden Ausführungsform kann die Valproinsäure zum Beispiel mit 1-Heptanoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholin verestert sein.
Beim Auswählen des intrazellulären Transporthilfsmittels für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Fachmann natürlich die Notwendigkeit berücksichtigen, solche Hilfsmittel, z. B. bestimmte 1,2-Diacylglycerole, die Aktivatoren von Proteinkinase C sind (vgl. Lapetina et al., J. Biol. Chem. 260 (1985), 1358; und Boynton et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 115 (1983), 383), oder intrazelluläre Transporthilfsmittel, die wahrscheinlich unerwünschte Produkte hervorbringen, wie die in der Zelle, zu vermeiden.
Die vorliegende Erfindung betrifft:

(1) Valproinsäure oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat davon, kovalent gebunden an ein Lysophospholipid.
(2) Valproinsäure, wie in Anspruch 1 definiert, kovalent gebunden an 1-Hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholin.
(3) Arzneimittel, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1 oder 2.
(4) Verwendung einer Verbindung, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Epilepsie.

Referenzbeispiel 1: Herstellung von Prodrug-1 und Prodrug-2
Einführung
Der Begriff "Prodrug-1" wird hierin verwendet, um einen 1 : 1-Ester von 1,2-Bis-(2-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure (BAPTA) mit dem Cholinderivat ROCH₂-CH(OH)-CH₂O-(PO₂)-OCH₂N⁺(CH₃)₂, worin R eine Heptanoylgruppe ist, zu bezeichnen. BAPTA ist ein Calcium-Chelator, für den die menschliche Zellmembran normalerweise undurchlässig ist, während die Zellmembran für das Prodrug-1, welches kein Calcium-Chelator per se ist, durchlässig ist. Die Carbonsäureesterbindungen im Prodrug-1 sind durch PLA₂ spaltbar, so daß aktivierte Zellen wie IgE-Lymphocyten eine selektive intrazelluläre Anreicherung von BAPTA zeigen sollten, verglichen mit den nicht-aktiverten Zellen, mit dem Ergebnis, daß sich der [Ca²⁺]-Spiegel in den aktivierten Zellen im Vergleich zu den nicht-aktiverten Zellen verringern sollte. Das "Prodrug-2" ist der 1 : 2-Ester von BAPTA mit dem dargestellten Cholinderivat.
Verfahren
a) Diheptanoyl-L-α-lecithin
In einen trockenen 500 ml-Dreihalskolben, ausgestattet mit einem öldichten Rührwerk, einem CaCl₂-Röhrchen und einem Tropftrichter, wurden 100 ml Glaskügelchen mit einem Durchmesser von 5 mm und 11,0 g (0,01 Mol) eines CdCl₂-Addukts von synthetischem L-α-Glycerophosphorylcholin eingebracht. Der Kolben wurde in ein Eiswasserbad getaucht, und zu dem schnell gerührten Gemisch wurde ein dünner Strahl von 29,7 g (0,2 Mol) Heptanoylchlorid, frisch hergestellt und gelöst in 60 ml Chloroform*, gefolgt von 11 ml (0,14 Mol) wasserfreiem Pyridin, gelöst in 100 ml Chloroform* (* wasserfrei, alkoholfrei), zugegeben. Nach 30 Minuten wurde die Badtemperatur auf 25°C erhöht, und das Rühren wurde für 2 Stunden fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch einen filterlosen Büchner-Trichter gegossen. Die Glaskügelchen wurden mit 3 × 50 ml Chloroform gewaschen, und die vereinigten Filtrate wurden mittels Zentrifugation geklärt. Der Überstand wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde für mehrere Stunden bei einem Vakuum von 0,1 mm und einer Badtemperatur von 30–35°C gehalten, um den größten Teil des überschüssigen Pyridins zu entfernen, und dann mit 500 ml wasserfreiem Aceton für 10 Minuten gerührt und zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in ähnlicher Weise mit 2 × 100 ml wasserfreiem Aceton und 2 × 100 ml wasserfreiem Ether behandelt. Das zurückbleibende feste Material wurde unter vermindertem Druck getrocknet und von den letzten Spuren an Cadmiumchlorid und Pyridinhydrochlorid dadurch befreit, daß es in 200 ml eines 5 : 4 : 1-Gemisches, bezogen auf das Volumen, von Chloroform/Methanol/Wasser gelöst wurde, und die Lösung über eine 120 cm lange Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm, enthaltend ein gleiches Volumen an einem Gemisch aus Amberlit IR-45 und IRC-50, geleitet wurde. Die Säule wurde mit 500 ml des gleichen Chloroform/Methanol/Wasser-Gemisches gewaschen, und die vereinigten ausgeströmten Flüssigkeiten wurden unter vermindertem Druck aus einem Bad bei 40–45°C bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde bei einem Vakuum von 0,1 mm und 45°C getrocknet. Das Rohprodukt wurde durch Ausfällen aus einer Lösung in 50 ml Chloroform mit 150 ml Aceton, Zentrifugation und Umkristallisation des Niederschlags, 2,3 g (47,6%), aus Chloroform und Ether gereinigt. (Dioctanoyl-L-α-lecithin kann in ähnlicher Weise hergestellt werden.)
b) 1-Heptanoyl-sn-3-glycerophosphorylcholin
Eine Lösung des Produkts aus Teil (a) (1,2 mMol) in einem Gemisch aus Ether (196 ml) und Methanol (12 ml) wurde in Gegenwart von (HOCH₂)₃-C-NH₂·HCl (50 ml, 0,1 M, pH 8,7), enthaltend CaCl₂ (0,72 mM) und 5 mg rohes Klapperschlangengift (Crotalus adamanteus) als Quelle für Phospholipase A₂, bei 37°C für 3 Stunden stark gerührt. Die Umsetzung wurde mittels DC überwacht (70 : 25 : 4, bezogen auf das Volumen, Chloroform/Methanol/Wasser). Nach Beendigung der Umsetzung wurde die organische Schicht abgetrennt, und die wäßrige Schicht wurde mit Ether gewaschen und dann gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde mit 2 : 1, bezogen auf das Volumen, Chloroform/Methanol extrahiert und zentrifugiert. Beim Verdampfen des klaren Überstands wurde das Titelprodukt in einer Ausbeute von 90% erhalten. Eine Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von 70 : 25 : 4, bezogen auf das Volumen, Chloroform/Methanol/Wasser zeigte, daß es frei von dem Ausgangsmaterial und von Heptansäure war. Irgendeine Fettsäure in dem Produkt kann jedoch durch Kristallisation aus Ethanol-Ether entfernt werden. Anmerkung: Dies ist ein allgemeines Verfahren zur Spaltung der Glycerol-2-Esterbindung. (Octanoyl-sn-3-glycerophosphorylcholin kann in ähnlicher Weise hergestellt werden.)
c) Prodrug-1 und Prodrug-2
Eine Lösung des Produkts aus Teil (b) (0,5 g, 1,04 mMol) in Chloroform (15 ml, frisch destilliert über P₂O₅) wurde zu einer Lösung von BAPTA (0,495 g, 1,03 mMol, für den Monoester von Prodrug-1, oder 0,248 g, 0,51 mMol, für den Diester von Prodrug-2), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (0,214 g, 1,03 mMol) und 4-Dimethylaminopyridin (0,025 g, 0,202 mMol) und HCONMe₂ (20 ml, frisch destilliert über CaH₂) unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für zwei Tage gerührt. Die Umsetzung wurde mittels DC überwacht (65 : 35 : 5, bezogen auf das Volumen, Chloroform/Methanol/Wasser). Der Niederschlag wurde mittels Filtration entfernt, und das Filtrat wurde durch Verdampfen unter vermindertem Druck bei 35°C eingeengt. Der Rückstand wurde in 2 : 1 : 2, bezogen auf das Volumen, Chloroform/Isopropanol/Wasser gelöst. Die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (Na₂SO₄) und dann über eine 20 cm lange Säule von Kieselsäure (Bio-Sil-HA) mit einem Durchmesser von 1,8 cm geleitet. Die Säule wurde mit Chloroform gründlich gewaschen, bis sie frei von BAPTA war (DC), und dann mit einem Gradienten von Chloroform/Methanol (1 : 1, bezogen auf das Volumen) zu reinem Methanol eluiert, wobei die Elution mittels DC überwacht wurde. Die eluierten Fraktionen wurden vereinigt und durch Verdampfen eingeengt. Das gewünschte Zielprodukt (d. h. Prodrug-1 oder Prodrug-2, abhängig von der Anzahl der verwendeten Moläquivalente an BAPTA) wurde aus Ether auskristallisiert und unter vermindertem Druck über P₂O₅ bei 30°C getrocknet; Ausbeute 0,3 g (30%). Es ist offensichtlich, daß der entsprechende Triester oder Tetraester durch Variieren der geeigneten Anzahl von Moläquivalenten an BAPTA erhalten werden kann. (Die analogen Octanoylester werden in ähnlicher Weise hergestellt).
Referenzbeispiel 2: Anwendung von Prodrug-1 zur Verringerung des intrazellulären Calciumspiegels in hyperaktivierten Zellen
Methode
Der intrazelluläre, freie [Ca²⁺]_i-Gehalt wurde mittels Durchflußcytometrie unter Verwendung des Ca²⁺-sensitiven Farbstoffes Fluo-3/AM (Molecular Probe Inc., OR) (vgl. Minta et al., 1989; Kao et al., 1989) überwacht. Aus Spenderblut erhaltene Zellen und solche aus dem Blut eines Asthmapatienten wurden weiter zweimal in DMEM gewaschen und in einer Konzentration von 10⁷ Zellen/ml resuspendiert. Fluo-3/AM (1 mM) wurde in DMSO, ergänzt mit dem nichtionischen grenzflächenaktiven Pluronic F-127 (Wyandotte Corp., MI), zubereitet. Aliquots der Fluo-3/AM-Stammlösung wurden zu Zellsuspensionen in DMEM/HEPES in einer Endkonzentration von 3 μM zugegeben (Sättigungspuffer). Die Sättigung konnte für 30 min bei 37°C voranschreiten und wurde für 1 Stunde bei 23°C unter vorsichtigem Bewegen fortgesetzt. Die Zellen wurden dann unter Verwendung von frischem DMEM/HEPES, supplementiert mit 2% Pferdeserum, auf die gewünschten Konzentrationen eingestellt. Die Autofluoreszenz wurde eliminiert, indem die Schwellenempfindlichkeit oberhalb der Werte eingestellt wurde, die in Abwesenheit eines Farbstoffes erhalten worden waren. Die Fluoreszenzintensitätsdaten wurden von 5000 Einzelzellen gesammelt, und die Werte wurden als willkürliche Fluoreszenzeinheiten ausgedrückt. Prodrug-1 (1 mM) wurde in DMSO zubereitet und, falls geeignet, in einer Endkonzentration von 3 μM vor der Calciumbehandlung zu den Zellen für 5 min zugegeben.
Lymphocyten aus Spenderblut und aus dem Blut eines Asthmapatienten wurden Prodrug-1 ausgesetzt. Die Anreicherung des freigesetzten BAPTA-Chelators innerhalb der Zelle wurde durch Messung von [Ca²⁺]_i mittels Durchflußcytometrie unter Verwendung von Fluo-3/AM, wie oben beschrieben, abgeschätzt. Die Ergebnisse sind in 1 dokumentiert, worin die [Ca²⁺]_i-Werte dargestellt sind für normale Lymphocyten (Tafel A); normale Lymphocyten, behandelt mit Prodrug-1 (Tafel B); Lymphocyten aus dem Asthmapatienten (Tafel C); Lymphocyten aus dem Asthmapatienten, stimuliert mit IgE (Tafel D); Lymphocyten aus dem Asthmapatienten, behandelt mit Prodrug-1 (Tafel C'); und Lymphocyten aus dem Asthmapatienten, stimuliert mit IgE und behandelt mit Prodrug-1 (Tafel D').
Es wird beobachtet, daß Lymphocyten aus einem Asthmapatienten eine zweifache Doppelverteilung bezüglich des [Ca²⁺]_i-Spiegels zeigen (Tafel C). Etwa 50% der Zellen zeigen einen hohen [Ca²⁺]_i-Spiegel, was auf eine Zellhyperaktivierung hinweist, während der zweite Teil der Population ein ähnliches Verhalten wie die normale Population zeigt (vergleiche Tafel A). Im Fall der Tafeln C' und D', wobei die Zellen mit dem Prodrug-1 behandelt worden sind, ist die Population der hyperaktivierten Zellen wieder auf einen Normalwert zurückgekehrt, während die Population der nicht-aktivierten Zellen intakt bleibt (vergleiche Tafel C). Die Daten zeigen, daß Prodrug-1 eine selektive Anreicherung des Chelators innerhalb von aktivierten, aber nicht in nicht-aktivierten Zellen vorsieht.
Referenzbeispiel 3: Prodrugs zur möglichen Anwendung bei der Behandlung von Tumoren
Einführung
In diesem Beispiel wird eine Reihe von veranschaulichenden Ausführungsformen vorgestellt, wobei ein Prodrug einen Proteinkinase-Hemmstoff einschließt. Nach Verabreichung des Prodrugs würde sich der Hemmstoff in einer Zelle anreichern, die eine abnormale Proliferation zeigt, wodurch möglicherweise ein wichtiges Hilfsmittel zur Verwendung bei der Antitumortherapie bereitstellt wird.
(i) Die Verbindung QSO₂N, worin Q = 5-Isochinolyl und N = NHCH₂CH₂NHCH₃, ist ein selektiver Hemmstoff der cAMP-abhängigen Proteinkinase; Hidaka et al., Biochemistry 23 (1984), 5036; und Tash et al., J. Cell Biol. 103 (1986), 649. In ähnlicher Weise ist die Verbindung QSO₂N, worin Q = 5-Isochinolyl und N = 2-Methylpiperazin-1-yl, ein wirksamer Hemmstoff der cyclischen, Nucleotid-abhängigen Proteinkinase und der Proteinkinase C; Hidaka et al., vorstehend erwähnt; und Kikuchi et al., Nucl. Acids Res. 16 (1988), 10171. Diese Verbindungen können durch Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, kovalent an ein intrazelluläres Transporthilfsmittel konjugiert werden, z. B. veranschaulicht durch:
In Schema (b) ist R eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, wie sie in Plasmalogenen zu finden ist (oder kann in einem herkömmlichen Syntheseverfahren eingeführt werden), und ist A ein aliphatischer Acylrest, z. B. eine Lauroyl-, Myristoyl-, Palmitoyl-, Stearyl- oder Oleylgruppe.
Die Verbindung QSO₂N, worin Q = 5-Isochinolyl und N = 2-Methylpiperazin-1-yl, kann in ähnlicher Weise mit Hilfe des N⁴-Atoms von Piperazin gebunden werden.
Es wird erwartet, daß die P-N-Bindung in den vorstehend dargestellten Prodrugs (A) und (B) für eine Spaltung durch das Enzym PLD empfindlich sind, wodurch die beschriebenen Proteinkinase-Hemmstoffe intrazellulär freigesetzt werden und sich diese Hemmstoffe in Zellen mit einem supranormalen PLD-Spiegel anreichern.
(ii) 4',5,7-Trihydroxyflavon ist ein Hemmstoff der Tyrosin-spezifischen Proteinkinase; Akiyama et al., J. Biol. Chem. 262 (1987), 5592. Diese Verbindung kann an ein intrazelluläres Transporthilfsmittel durch die vorstehend in Teil (i) beschriebenen Verfahren (a) und (b) konjugiert werden. Diese veranschaulichenden Konjugate würden die Strukturen (C) und (D) aufweisen:
worin R' und A die gleichen Bedeutungen haben, wie vorstehend angegeben, und Q' der Molekülrest von 4',5,7-Trihydroxyisoflavon ist, aus dem ein phenolisches Wasserstoffatom entfernt worden ist und der auf diese Weise an den Rest des Moleküls durch ein O-Atom unter Bildung einer P-O-Bindung gebunden ist. Es wird erwartet, daß diese P-O-Bindung in den vorstehend dargestellten Prodrugs (C) und (D) für eine Spaltung durch das Enzym PLD empfindlich ist, wodurch die beschriebenen Proteinkinase-Hemmstoffe intrazellulär freigesetzt werden und sich diese Hemmstoffe in Zellen mit einem supranormalen PLD-Spiegel anreichern.
(ii) Der Proteinkinase-Hemmstoff K252b aus Nocardiopsis sp. ist eine Carbonsäure mit der folgenden angenommen Formel:
Diese Verbindung kann an ein intrazelluläres Transporthilfsmittel konjugiert werden, z. B. durch das vorstehend in Referenzbeispiel 1 beschriebene Verfahren. Beispielhafte Konjugate sind Ester der Carbonsäurefunktion in der vorstehenden Formel mit zum Beispiel Heptanoyl-sn-3-glycerophosphorylcholin oder Octanoyl-sn-3-glycerophosphorylcholin.
Referenzbeispiel 4: Herstellung und biologische Eigenschaften von DP16
"DP16" bezeichnet hierin einen 1 : 1-Ester von BAPTA mit dem Cholinderivat ROCH₂-CH(OH)-CH₂O-OCH₂N⁺(CH₃)₂, worin R eine Hexadecanoylgruppe ist. DP16 wurde gemäß dem in Referenzbeispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Einführung in die Beurteilung von DP16 im Zusammenhang mit einer Ischämie
Der beidseitige Verschluß der gemeinsamen Kopfschlagader ist der einfachste und direkteste Ansatz zur Induktion einer globalen Ischämie. Bei Ratten tritt 24 Stunden später eine Mortalität von praktisch 64% auf. Die Ursachen der Mortalität sind größtenteils eine Hirnschwellung (Ödem) und fokale Läsionen (Infarkte). Die globale Ischämie wird durch Isolierung der gemeinsamen Kopfschlagader durch einen Einschnitt auf der ventralen Seite des Halses erreicht. Die Speicheldrüsen werden lateral verschoben, und die Karotisscheide wird freigelegt. Sowohl der Hirnnerv als auch sympathische Nerven werden von der gemeinsamen Kopfschlagader getrennt, die dann dauerhaft abgebunden wird. Sprague-Dawley-Ratten (250–300 g) wurden mit Halathan oder durch intramuskuläre Injektion von 0,1 ml Ketamin (0,1 g/ml, Park Davis, GB) und 0,1 ml Rompun (2%, Bayer, BRD) pro 300 g Körpergewicht betäubt. DP16 wurde ggf. i. p. nach der Arterienligatur verabreicht (0,001–0,1 mg/kg). Jede Versuchs- und Kontrollgruppe schloß 14 männliche Ratten ein. Die statistische Analyse wurde gemäß den Kriterien durchgeführt.
Versuchseinzelheiten und Ergebnisse des Ischämietests
Embolischer Infarkt
Sprague-Dawley-Ratten (300 g) werden mit Halathan betäubt. Die rechte gemeinsame Kopfschlagader wird freigelegt, und die äußeren Karotis- und Pterygopalatinumarterien werden mit Seidenfaden Nr. 0 unterbunden. In die gemeinsame Kopfschlagader wird eine Kunststoffkanüle eingeführt, die vorher mit heparinisierter Salzlösung gefüllt wurde. In die Kanüle wird dann eine Suspension von Kügelchen injiziert (eine gasdichte 0,5 ml-Hamilton-Spritze), gefolgt durch einen Stoß von 0,5 ml Salzlösung. Die gemeinsame Kopfschlagader wird dann dauerhaft unterbunden. Die 15 μm-Polystyrolkügelchen werden in 0,05% Tween-80 in normaler Salzlösung zubereitet, gefolgt durch eine vollständige Desinfektion für 5 Minuten. Ein 100 μl-Aliquot wird entnommen und sofort in die Spritze überführt.
Ischämie-Fötalhirn-Modell
Trächtige Sprague-Dawley-Ratten mit einer Tragzeit von 20 Tagen wurden verwendet. Die Tiere wurde durch intramuskuläre Injektion von 0,1 ml Ketamin (0,1 g/ml, Park Davis, GB) und 0,1 ml Rompun (2%, Bayer, BRD) pro 300 g Körpergewicht betäubt. Ein Bauchdeckenschnitt wurde durchgeführt, und die zwei Gebärmutterhörner wurden freigelegt und während des chirurgischen Eingriffs feucht gehalten. Die intracerebrale Injektion von 1–2 mCi/2 ml [³H]-Arachidonsäure (Na⁺, 240 mCi/mMol; von New England Nuclear, Boston, MA) und/oder 1,5 mCi/2 ml [¹⁴C]-Palmitinsäure (Na⁺, 819 mCi/mMol; von Amersham, Searle, GB) in isotonischer Salzlösung, enthaltend NaHCO₃ (1,32 Gew.-%), in die Embryos erfolgte über die Gebärmutterwand in die Fontanellen. Auf Bestellung angefertigte Spritzen (33 Gauge, 0,375'' Länge; von Hamilton, Reno, NV) wurden verwendet, um ein Hirnödem zu verringern. Nach der Injektion wurden die Föten zur Aufrechterhaltung bei einer physiologischen Temperatur in die Bauchhöhle zurückgegeben. Nach 1 h wurden sie für 20 min einer Blutflußeinschränkung unterzogen (Restriktionssitzung), indem die Blutgefäße in der Plazenta mehrfach abgeklemmt wurden. Wann immer gewünscht, wurde die Blutzirkulation durch Entfernung der Klammern für 30 min wiederhergestellt (Reperfusionssitzung). Die ganze Zeit über wurden sowohl die einer Restriktion unterzogenen als auch die scheinoperierten Föten in der Bauchhöhle vor der künstlichen Geburt aufrechterhalten. Nach der Geburt durch einen Querschnitt in den Uterus wurden lebensfähige Föten ohne ein offensichtliches Ödem unver züglich getötet, und die herausgetrennten Fötalhirne wurden sofort in geeigneten organischen Lösungsmitteln zur weiteren Behandlung homogenisiert.
Föten-Großhirnhemisphären-Modell
Die Föten wurden aus den Gebärmutterhörnern in einem lebensfähigen Zustand entnommen, und ihre Großhirnhemisphären wurden innerhalb von 15 sec nach der Enthauptung herauspräpariert. Die von Blut und Gehirnhäuten befreiten Großhirnhemisphären wurden getrennt, und jede (50 ± 2,5 mg) wurde in eine Vertiefung einer Falcon-Kulturschale mit 24 Vertiefungen gelegt. Das Gewebe wurde schnell zweimal in kaltem Dulbecco's modifizierten Eagle-Medium (DMEM, Grand Island Biol. Co.) gewaschen und dann bei 37°C in 0,6–1,2 ml DMEM, durchspült mit Sauerstoff und supplementiert mit verschiedenen Zusätzen, inkubiert. Aliquots des Inkubationsmediums (0,1 ml) wurden zur Eicosanoid-Bestimmung mittels einer Radioimmuntest (RIA)-Technik entnommen. Nach Ansäuerung mit 5 ml Ameisensäure wurden 0,1 ml Isopropanol und 0,5 ml Diethylether zugegeben. Nach Mischen und Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit (2500 × g, 5 min) wurde die organische Schicht gesammelt und unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Der erhaltene Rückstand wurde in 0,1 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin, gelöst. Die Proben wurden über Nacht bei 4°C mit dem geeigneten polyclonalen Antiserum und einem ³H-markierten Tracer (4000 CpM/Röhrchen) in einem Endvolumen von 0,3 ml inkubiert. Ungebundenes Material wurde mit 0,3 ml Dextran beschichteter Holzkohle (Pharmacia, Schweden) gefällt. Nach Zentrifugation bei 4°C wurden Aliquots des Überstands (0,4 ml) in Fläschchen überführt, und nach Zugabe einer Szintillationsflüssigkeit wurden die Proben in einem Packard-Tricarb-Szintillationszähler gezählt. [³H]-Arachidonsäure (240 Ci/mMol) (New England Nuclear, Boston, MA), gelöst in isotonischem NaHCO₃ (1,32%, Gew./Vol.), wurde durch die Gebärmutterwand und die Fontanellen in das Embryogehirn injiziert. Nach der Injektion wurden die Föten zur Aufrechterhaltung unter physiologischen Bedingungen in die Bauchhöhle zurückgegeben. Nach 1 h wurden die Föten entbunden und sofort getötet. Die Großhirnhemisphären wurden zur nachfolgenden ex vivo-Inkubation oder zur Lipidextraktion schnell entfernt.
Ergebnisse
Die Beidseitige Globale Gehirnischämie bewirkt einen zunehmenden Verlust der Versuchstiere bis zu 6–7 Tagen nach dem chirurgischen Eingriff. Wie in 2 veranschaulicht, erhöht DP16 die post-ischämische Erholung um 250% im Vergleich zur Kontrolle unter Verwendung von nicht geschützten Ratten (p < 0,01). Diese Daten zeigen die mögliche Fähigkeit von DP16, ischämische Zustände zu behandeln, die sonst tödlich sind.
Herzischämie – perfundiertes Herz-Modell
Weiße Ratten wurden durch zervikale Dislokation getötet, und ihre Herzen wurden schnell entnommen und bei 60 mmHg mit modifiziertem Krebs-Henselleit-Puffer unter Verwendung des Modells eines perfundierten Herzens nach Langendorff reperfundiert. Die Herzen wurden für ein Prääquilibierungsintervall von 10 min perfundiert und anschließend entweder global ischämisch gemacht (kein Durchfluß) oder kontinuierlich für den angegebenen Zeitraum perfundiert. Die Perfusion wurde durch schnelle Exzision des Ventrikelgewebes und direktes Eintauchen in kalten Homogenisierungspuffer (10 mM Imidazol, 10 mM KCl, 0,25 M Saccharose [Grad 1], pH 7,8) beendet. Sowohl die Aktivierung von Phospholipase A2 als auch deren Umkehrbarkeit während der Reperfusion korrelierten zeitlich mit Veränderungen des anaeroben Stoffwechsels in den Muskelzellen und den elektronenmikroskopischen Untersuchungen.
Modell des Kammerflimmerns, verursacht durch einen Koronarverschluß
Hunde (11,6–20,7 kg) wurden betäubt und an Instrumente angeschlossen, um den Blutfluß der linken Kranzarterie, den linken Ventrikeldruck und das Ventrikelelektrogramm zu messen. Die linke vordere, absteigende Arterie wurde unterbunden, und anschließend wurde ein Vorderwandinfarkt erzeugt. Alle Leitungen zu der kardiovaskulären Instrumentierung wurden derart unter der Haut verlegt, daß sie auf der Rückseite des Nacken des Tieres austraten. Ein geeignetes Arzneimittel wurde verabreicht, um die postoperativen Schmerzen zu minimieren und eine Entzündung zu verhindern. Der Ischämietest wurde nach 3–4 Wochen durchgeführt.
Eigenschaften von DP16 im Zusammenhang mit der Behandlung von epileptischen Erkrankungen
Auf Pilocarpin basierendes Modell einer experimentellen Epilepsie
Acetylcholin, Acetylcholinesterase-Hemmstoffe und Acetylcholin-Analoge sind wirksame Mittel für die Auslösung epileptischer Krämpfe, wenn sie intracerebral oder systematisch verabreicht werden (vgl. Ref. bei Leite et al., Neurosci. & Biobeh. Rev. 14 (1990), 511–517). Bei verschiedenen Arten wurde gezeigt, daß die systemische Verabreichung von muscarinartigen, cholinergen Agonisten elektroenzephalographische und das Verhalten betreffende, limbische Anfälle hervorruft, begleitet von einer ausgedehnten Hirnschädigung, welche topographisch derjenigen ähnlich ist, die durch Kainsäure und Folate verursacht wird, und häufig bei obduzierten menschlichen Epileptikern beobachtet wird. Systemische Injektionen von Pilocarpin, einem wirksamen muscarinartigen, cholinergen Agonisten, sind in der Lage, eine Reihe von Verhaltensänderungen einschließlich Blickkrämpfen ("stirring spells"), Fazialautomatismen und motorischen, limbischen Anfällen hervorzurufen, die sich über 1–2 Stunden entwickeln und sich zunehmend zu einem limbischen Status aufbauen, dem ein genereller Status epilepticus folgt.
Ergebnisse
Unmittelbar nach der Injektion von Pilocarpin wurde das Verhalten des Tieres durch Akinesie, unkoordinierte taumelnde Bewegungen, Fazialautomatismen und Herzflattern dominiert. Die weitere Entwicklung von epileptischen Ereignissen ist dosisabhängig (3). Die Verabreichung von Pilocarpin in Dosen von 300–350 mg/kg bewirkt das Auftreten von limbischen Anfällen mit Aufbäumen, Oberarmklonus, Speichelfluß, intensiven mastikatorischen Kieferbewegungen und Fallen. Die motorischen, limbischen Anfälle begannen nach 20–30 min, kehrten alle 2–8 min wieder und führten zu einem Status epilepticus. Eine Erhöhung der Dosis von Pilocarpin auf bis zu 400 mg/kg beseitigte die limbischen Anfälle, und nach 15 bis 25 min riefen anfängliche Verhaltensänderungen letale, allgemeine, tonische-klonische Krämpfe hervor. Die Anmelder betrachten diese Dosis als LD₁₀₀.
Die Verabreichung von DP16 vor Pilocarpin verhinderte den Tod bei den Tieren und verminderte epilepsieartige Manifestationen. Wie in 4 gezeigt, zeigte DP16 eine therapeutische Wirkung in Dosen im Bereich von 10^–8 bis 10^–5 mg/kg. Für dieses besondere Modell einer Epilepsie (400 mg/kg Pilocarpin; Ratten) beträgt der abgeschätzte therapeutische Index (ET) von DP16 0,5 mg/kg/5 × 10^–7 mg/kg = 1 × 10⁶. Die erhaltenen Daten legen nahe, daß DP16 eine sehr vielversprechendes Prodrug für die Behandlung von epileptischen Erkrankungen ist.
Pilocarpin und Kardiotoxizität
Bei mit Pilocarpin behandelten Ratten wurden zwei Todesarten festgestellt, erstens infolge letaler Krämpfe und zweitens ein verspäteter Tod, der nicht unmittelbar auf epileptische Ereignisse zurückzuführen ist. Die Anmelder versuchten, den tatsächlichen Grund für den verspäteten Tod der Ratten nach Pilocarpin induzierten Krämpfen zu ver stehen. Bei einer makroskopischen Obduktion dieser Tiere wurden Anzeichen von kardiopulmonalen Schädigungen beobachtet: Lungenödeme und Blutungen, vergrößerte und, in einigen Fällen, deformierte Herzen. Die Färbung der Herzen mit 0,1% Trypanblau bei überlebenden Tieren ergab das fleckige Bild einer Myokardie mit Bereichen einer intensiven Farbaufnahme, d. h. geschädigten Teilen, und hellen Bereichen, d. h. Infarkten. Folglich nehmen die Anmelder an, daß sich nach der Pilocarpin-Verabreichung eine Herzschädigung entwickelte, welche die Anmelder als post-Pilocarpin-Krampfanfall-Kardiopathie (PSCP) bezeichnen. PSCP-Studien im Zusammenhang mit einer DP16-Beurteilung wurden in vivo und in vitro mit Ratten durchgeführt, die nach konvulsiven und subkonvulsiven Dosen von Pilocarpin überlebten.
PSCP-Experimente
Erwachsene (2–3 Monate), männliche Sprague-Dawley-Ratten wurde für sämtliche Experimente verwendet. Sie wurden mit üblichem Brikettfutter und mit Wasser nach Belieben gefüttert und in üblichen Kunststoffkäfigen (4–5 Individuen in jedem Käfig) unter natürlicher Beleuchtung gehalten. Ein Pilocarpin-Scopolamin-Epilepsiestatus-Modell (Pilocarpin) wurde ausgeführt, wie früher beschrieben. In einer Gruppe von 23 Ratten wurde Pilocarpin i. p. in unterschiedlichen Dosen, die von 100 bis 400 mg/kg Körpergewicht (B/W) reichten, während verschiedener Zeiträume verabreicht. Eine zweite Gruppe von 17 Ratten wurde vor der Pilocarpin-Verabreichung mit DP16 behandelt, wobei das DP16 30 min vor dem Pilocarpin im nächsten Dosisbereich injiziert wurde und seine Wirkung in den darauf folgenden Zeiträumen untersucht wurde.
In vivo-ECGs (Birtcher-Cardio-Tracer, Modell 375, USA) in drei Standardableitungen wurden unter Ketamin-Betäubung (3,3 mg/kg Imalgen 100, Rhone Merieux, Frankreich, und 7 mg/kg Rompun, Bayer Leverkusen, Deutschland; i. m.) aufgezeichnet. Die ECG-Aufzeichnungen wurden in dem Zeitraum vor den Pilocarpin-Injektionen (Kontrolle), 24 h nach der Pilocarpin-Verabreichung (akuter Zeitraum) und nach der relativen Stabilisierung der Herzfunktion am 3.–14. Tag nach der Pilocarpin-Verabreichung gemacht. Teile der ECG-Aufzeichnungen wurden unter Nembutal-Betäubung (35 mg/kg; i. p.) in dem Zeitraum vor der Aufnahme einer Perfusion an dem isolierten, präparierten Herzen nach Langendorff gemacht. Das Perfusion-Hypoxie-Reperfusion-Modell am isolierten Herzen (PHR) wurde mit der herkömmlichen Langendorff-Technik (nicht rezirkulierendes Perfusionssystem), eingestellt auf 37°C, in zwei Modifikationen ausgeführt: 1. Unter konstantem Perfusionsdruck (PP) – Perfusion mit dem vorstehenden PP, durch Anpassen des Durchflusses mit Hilfe einer Schlauchpumpe (Isamtec SA, Laboratoriumstechnik, Schweiz). Im Falle eines konstanten PP's wurde das Volumen des Ausflusses mit einer Stromwaage (Precisa 1000C-3000D, Schweiz) gemessen. Im Falle eines konstanten Durchflusses, aufgenommen in dem Kontrollzeitraum, veränderte sich der Durchfluß während der nachfolgenden Versuchszeiträume nicht, und der PP wurde regelmäßig aufgezeichnet. Nach 30 min des Kontrollzeitraums wurde die Perfusion für 30 min gestoppt, und der nachfolgende Reperfusionszeitraum dauerte 30 min. Direkte ECGs wurden vom ventrikulären Apex (Ableitung 1), Aurikel (Ableitung 2) und dazwischen (Ableitung 3) aufgezeichnet. Der Perfusionswiderstand der Herzkranzgefäße (CVPR) wurde in willkürlichen Einheiten wie folgt berechnet: PP/Durchfluß/Herzgewicht. Unter Befolgen des vorstehenden Protokolls wurden die Herzen einer Perfusion mit dem Farbstoff Trypanblau (0,1%) unterzogen, um die Zellschädigung und Infarktbildung zu beurteilen.
Ergebnisse und Diskussion
Die ECG-Ergebnisse in vivo sind in 5 dargestellt, worin die nicht ausgefüllte Balken einige ECG-Ereignisse, ausgedrückt als Mittelwert ± SE, einzelner ECGs im Kontrollzeitraum zeigen. Die erste Gruppe von Balken zeigt ECG-Veränderungen nach Pilocarpin-Injektionen in einem akuten Stadium der PSCP: unter den Ableitungen 1 und 2 werden statistisch signifikante Abschwächungen des R-Peaks beobachtet (47% bzw. 16% von Kontrolle 1). Die DP16-Behandlung der PSCP normalisierte die elektrische Aktivität im akuten Stadium bei 5 von 7 behandelten Ratten. Es ist bekannt, daß die Amplitude von ECG-Ereignissen zum Teil mit der Intensität der entsprechenden physiologischen Prozesse im Zusammenhang steht. Folglich kann die Pilocarpin induzierte Veränderung der R-Welle und deren Normalisierung durch DP16 die Fähigkeit von DP16 zeigen, eine Ventrikelschwäche, zumindest bei einer PSCP, zu heilen. Kontrollratten zeigen eine relative Normalisierung der R-Welle innerhalb von 3–14 Tagen nach der Pilocarpin-Verabreichung. Jedoch korrelierte die R-Normalisierung auf irgendeine Weise mit einer drastisch erhöhten S-Wellentiefe unter Ableitung 3 (36%) und Ableitung 2 (61%) (wobei der letztere Wert im Hinblick auf eine große Variabilität noch nicht statistisch signifikant ist). Die Erhöhung der S-Wellentiefe spiegelt die Schädigung einer Herzmuskelischämie wieder und weist möglicherweise auf einen Infarkt in den mit Pilocarpin behandelten Kontrolltieren hin. Wie beim akuten Stadium der PSCP verhindert DP16 in der Phase der Stabilisierung das Auftreten von ECG-Ver der PSCP verhindert DP16 in der Phase der Stabilisierung das Auftreten von ECG-Veränderungen, die bei Kontrollratten beobachtet werden. Der Unterschied zwischen mit DP16 geschützten Tieren und solchen, die nicht geschützt sind, ist statistisch signifikant (p < 0,01). In diesem Zeitraum der PSCP ist eine deutliche Erhöhung der Herzfrequenz sowohl bei der Pilocarpin-Kontrolle als auch bei den mit DP16 behandelten Tieren vorhanden. Eine solche Tachykardie ist möglicherweise mit einer hämodynamischen Insuffizienz verbunden, die für die Infarktpathophysiologie charakteristisch ist. So zeigte die in vivo-ECG-Untersuchung während eines langen Zeitraums nach den Pilocarpin-Injektionen eine eindeutige Veränderung der Herzfunktionen auf (PSCP), die bei einigen Tieren durch die DP16-Behandlung geheilt werden kann.
Langendorff-Herzmodell
6 zeigt den Perfusionswiderstand in den Herzkranzgefäßen (CVPR) in isolierten Langendorff-Herzen. In den ersten 30 nun des Kontrollzeitraums erhöhte sich der CVPR in den isolierten Langendorff-Herzen ständig, und diese Erhöhung ist nach 20 min statistisch signifikant. In allen Herzen, die nach den Pilocarpin-Verabreichungen perfundiert wurden, war der anfängliche Perfusionsfluß größer als bei der Kontrolle, und anschließend nahm der CVPR wesentlich ab (untere Linie). Diese Verringerung des Tonus der Herzkranzgefäße ist möglicherweise mit einem intrakardialen Noradrenalin-Mangel oder einer Paralyse, hervorgerufen durch einen Sauerstoffmangel, verbunden. Die Behandlung von Ratten mit DP16 vor der Pilocarpin-Applikation beugt einer Beeinträchtigung der CVPR-Regulation in sowohl dem anfänglichen als auch dem letzten Zeitraum der Perfusion vor, wodurch ein Beweis für die Fähigkeit von DP16 erhalten wird, die Funktion der Herzkranzgefäße unter hypoxischen Bedingungen zu normalisieren. Der Perfusionsstillstand während 30 min und die nachfolgende Reperfusion sind durch die hinreichend bekannte, breite Gruppe von Ereignissen einer Herzschädigung gekennzeichnet, welche die Anmelder auf einer willkürlichen Skala einteilten, wie in 7 gezeigt ist. Kontrollherzen aus unbehandelten Ratten erholten sich meistens nach dem Stoppen der Perfusion mit einem ausgeprägten Bereich von Veränderungen (wie eine gestörte myokardiale Erregbarkeit, Konduktivität und Kontraktilität). Der Mittelwert für die Erholung in der Kontrollgruppe beträgt 6,3 ± 0,6 (n = 7). Herzen aus mit Pilocarpin behandelten Ratten mit unterschiedlichen Stadien einer PSCP zeigten eine Vergrößerung des Spektrums und eine Erhöhung der Schwere der pathologischen Ereignisse, wobei der Mittelwert für die Erholung nur 3,3 ± 0,8, n = 7, p < 0,05, betrug. Die Erholung war häufig von Kammerflimmern begleitet. Einige der Herzen erholten sich nicht vollständig oder stellten nur wieder die Vorhofaktivität her. Die DP16-Behandlung vor den Pilocarpin-Verabreichungen erhöhte die Fähigkeit von geschädigten Herzen, sich nach dem Reperfusionsstillstand zu erholen; der Mittelwert betrug 6,4 ± 0,6 (n = 9). In dieser Gruppe von Ratten trafen die Anmelder öfters auf Fälle einer vollständigen Erholung. Folglich rief die DP16-Behandlung einer Pilocarpin-induzierten Herzschädigung (PSCP) eine eindeutige Verbesserung der Herzfunktion hervor.
Untersuchung der antiepileptischen Wirkungen von DP16: Metrazol-Minimalepilepsieanfall-Test
Methode
Die Erprobung von DP16 als ein möglicher antiepileptischer Arzneistoff wurde mit 3–4 Wochen alten, männlichen BALB/c-Mäusen (18–27 g) durchgeführt. Die Tiere wurden bei ausreichender Kost gehalten und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser, außer kurz während des Versuchszeitraums. Die Tiere wurden getrennt für eine Stunde in durchsichtigen Kunststoffkäfigen vor der Behandlung und während des Versuchszeitraums untergebracht. Die Arzneistoffe wurden in normaler Salzlösung gelöst, wobei das Injektionsvolumen auf 0,01 ml/g Körpergewicht eingestellt wurde. DP16 wurde i. p. in Dosen im Bereich von 0,1 bis 300 μg/kg verabreicht (0,1 μg/kg: n = 10; 5 μg/kg: n = 10; 25 μg/kg: n = 20; 75 μg/kg: n = 20; 150 μg/kg: n = 20; bzw. 300 μg/kg: n = 10 Tiere). Kontrolltiere erhielten i. p.-Injektionen von normaler Salzlösung. Auf die Verabreichung von DP16 oder der Salzlösung folgte nach 30 Minuten eine Metrazol-Verabreichung (50 μg/kg, s. c.). Anschließend wurden die epileptischen Symptome während der nächsten 30 Minuten beobachtet. Das Fehlen oder die relative Verzögerung von myoklonischen Zuckungen (MJ) in der Versuchsgruppe wurde als Hinweis auf eine mögliche antiepileptische Aktivität angesehen. Die Daten wurden gemäß der χ2 (Chi-Quadrat)-Methode mit dem Computer-Statistikpaket "StatViewII" analysiert.
Ergebnisse und Schlußfolgerungen
Metrazol in einer Dosis von 50 μg/kg, s. c., rief myoklonische Zuckungen (MJ) in allen Kontrollmäusen mit einer Latenzzeit von 1011 min hervor (n = 11). Die Wirkung von DP16 auf das Auftreten von minimalen Metrazol-induzierten Epilepsieanfällen ist in 8 gezeigt. Mäuse, die mit 0,1 μg/kg DP16 behandelt wurden, zeigten die gleiche Antwort auf Metrazol wie die Kontrolltiere (nicht behandelt). DP16 in Dosen im Bereich von 5 bis 300 μg/kg zeigte eine signifikante schützende Wirkung (p < 0,001). Die Ergebnisse des Tests deuten auf eine signifikante, dosisabhängige antiepileptische Wirkung von DP16 auf die Metrazol-induzierten Epilepsieanfälle hin.
Untersuchung der kardioprotektiven Wirkung von DP16
1. Erprobung an einem ex vivo-Rattenherz-Niederfluß-Reperfusion-Modell
Methode und Ergebnisse
Es wurden die allgemein verwendeten ex vivo Langendorff-Herz-Durchflußstopp-Reperfusion- und -Niederfluß-Modelle verwendet (Neely und Rovetto, 1975), die für pharmakologische Prüfungen weiterhin üblich sind. Die kardioprotektive Wirkung von DP16 wurde in einem kombinierten experimentellen Musterbeispiel einer Normalflußperfusion, gefolgt durch einen Niederfluß und dann eine Reperfusion (LFR) eines ex vivo-Rattenherzes beurteilt. Die Entwicklung des ECG's und des Perfusionsdrucks (PP) wurde als ein Kriterium für die Arzneistoffbeurteilung angesehen. Daten, die in Experimenten in Gegenwart von DP16 gesammelt worden waren, wurden mit denjenigen ohne eine Arzneistoffergänzung (Kontrolle Nr. 1) verglichen. Eine weitere Reihe von Experimenten (Kontrolle Nr. 2) wurde mit einem Gemisch, umfassend DP16, aus den Komponenten BAPTA und Lysophosphatidylcholin (LPC) durchgeführt. DP16 (1–100 μg/l) wurde in einem normalen Perfusionspuffer gelöst. Das Gemisch aus BAPTA und LPC wurde in DMSO als eine Stammlösung gelöst. Die Endkonzentration von BAPTA, LPC und DMSO in dem Perfusionspuffer für die Kontrolle Nr. 2 betrug 100 μg/l jeder Komponente.
Ein starke Abnahme des Perfusionsdrucks (PP) unter 20 mmHg (Niederflußzeitraum) rief eine Sinusbradykardie hervor, die in einem stabilen AV-Block gipfelte (9.2, vgl. Normalfluß in 9.1), häufig in Verbindung mit einer ventrikulären Arrhythmie (9 Experimente, Kontrolle 1). Anhaltende (> 0,5 h) Niederflußbedingungen endeten üblicherweise in einer paroxysmalen Tachyrhytmie und Kammerflimmern (VF). Die Reperfusion setzte ein, bevor das VF vorübergehend den Sinusrhythmus wiederherstellen konnte. Jedoch rief die Reperfusion in den meisten der Kontrollexperimente eine Erhöhung des Herkranzgefäßtonus und eine Arrhythmie, gefolgt durch ein irreversibles VF, hervor (9.3). Nach Feststellung eines AV-Blocks in dem Niederflußzeitraum wurde das Perfusionsmedium mit den Arzneistoffen supplementiert. Es wurde kein therapeutischer Effekt auf den AVB in den Experimenten mit dem Gemisch aus BAPTA und LPC beobachtet (10.3 und 10.4, vgl. ohne BAPTA und LPC – Normalfluß in 10.1 und Niederflußperfusion in 10.2), während die Zugabe von DP16 eine vollständige oder vorübergehende Linderung des atreoventrikulären Synchronismus bewirkte (4 Fälle bzw. 1 Fall) (11.3). Außerdem zeigte DP16 eine bedeutende kardioprotektive Wirkung in dem Reperfusionszeitraum, wobei eine vollständige Wiederherstellung des Sinusrhythmus in 4 von 5 Experimenten beobachtet wurde (11.4; vgl. ohne DP16 – Normalfluß in 11.1 und Niederflußperfusion in 11.2). Eine ECG-Analyse zeigte eine DP-Wirkung vom vorwiegend metabolischen Typ auf, die eine Erhöhung der aurikulären (eindeutige Erhöhung der Herzfrequenz) und ventrikulären (Wiederherstellung eines regelmäßigen Sinusrhythmus) Erregbarkeit umfaßte. Jedoch wurde noch vorhandene Verzögerung der AV-Konduktivität (erhöhtes PQ-Intervall) beobachtet.
Schlußfolgerungen
Die in diesem Experiment erhaltenen Daten deuten auf eine signifikante kardioprotektive Aktivität von DP16 bei einer Ischämie-Reperfusion-Pathologie hin.
Untersuchung der kardioprotektiven Wirkung von DP16
2. Erprobung in einem in vivo-Modell einer Myokardschädigung
Methode und Ergebnisse
Die Verabreichung des wirksamen β-Adrenorezeptor-Agonisten Isoproterenol (ISO) ist ein allgemein anerkanntes Modell einer experimentellen myokardialen Pathologie. Die kardioprotektive Wirkung von DP16 wurde bei 82 weiblichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250–350 g getestet. Die Myokardschädigung wurde in den Ratten durch zwei aufeinanderfolgende Injektionen von ISO (85 μg/kg, s. c.) hervorgerufen. Falls geeignet, folgte den Injektionen von ISO nach 30 und 180 Minuten eine DP16-Verabreichung (0,01 μg/kg, i. p.). Die Wirkung von DP16 wurde durch eine ECG-Analyse und die Bestimmung der Serum-Glutaminsäure-Oxalacetattransaminase (SGOT)- und Lactatdehydrogenase (LDH)-Aktivität beurteilt. Die Mortalität der Kontrollratten nach der ISO-Maßnahme betrug 17,1 ± 5,9% (7 von 41). Die überlebenden Tiere zeigten eine auffallende hyperakute Verschiebung des ST-Segments in Ableitung 1 und 2 des ECG's. Pathologische Symptome auf dem ECG wurden während des Versuchszeitraums verschlimmert. 48 Stunden nach der zweiten ISO-Injektion zeigten alle behandelten Tiere eine pathologische Verlagerung des ST-Segments. Die Verabreichung von DP16 verringerte die Mortalität in 2 Fällen (2 von 30). Tiere, die pathologische Verlagerung des ST-Segments wurde nur bei 28% und 40% der ECGs (24 Stunden bzw. 48 Stunden nach der ISO-Injektion) gefunden. Die biochemische Bestimmung ergab eine 1,7–1,9fache Erhöhung für SGOT und LDH in mit ISO behandelten Kontrollratten (p < 0,05). Die Behandlung mit DP16 verringerte den Prozentsatz der Versuchstiere wesentlich, die einen abnormen Spiegel einer SGOT- und LDH-Aktivität zeigten.
Schlußfolgerungen
Die vorstehenden Daten deuten auf eine signifikante kardioprotektive Wirkung von DP16 in einem in vivo-Modell einer myokardialen Pathologie hin.
Allgemeine Schlußfolgerungen
Das mit DP16 bezeichnete Prodrug zeigte signifikante therapeutische und protektive Wirkungen in experimentellen Modellen eines Schlaganfalls und einer Ischämie sowie in Modellen einer Epilepsie, was vergleichbar ist mit der Verwendung des entsprechenden Arzneistoffes in herkömmlicher Form in einer Menge, die dem 10⁵–10⁶-fachen der Menge entspricht, wenn sie in Form des Prodrugs verwendet wird.
Referenzbeispiel 5: Herstellung von Prodrug-3
Der Begriff "Prodrug-3" wird hierin verwendet, um einen 1 : 1-Ester von 1,2-Bis-(2-aminophenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure (BAPTA) mit 1-Myristylmyristylalkohol zu bezeichnen, und wird wie folgt hergestellt. Eine Lösung von BAPTA (0,5 g, 1,05 mMol) in Dimethylformamid (25 ml, frisch destilliert über CaH₂), 1-Myristylmyristylalkohol (0,451 g, 1,1 mMol), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (0,216 g, 1,1 mMol) und 4-Dimethylaminopyridin (0,025 g, 0,202 mMol) wurden zusammen für zwei Tage bei Raumtemperatur unter Argon in einem 50 ml-Kolben, ausgestattet mit einem Magnetrührer, gerührt. Nach zwei Stunden begann N,N'-Dicyclohexylharnstoff auszufallen. Die Umsetzung wurde mittels DC überwacht (90 : 10, Vol./Vol., Chloroform : Methanol); R_f des Produkts = 0,62. Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde bei 35°C unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit 25 ml eines 2 : 1 : 2 Vol.Vol.-Gemisches aus Chloroform : Isopropanol : Wasser extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit einer 1%igen wäßrigen NaCl-Lösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Anschließend wurde sie eingedampft, und der Rückstand wurde über eine 160 mm × 30 mm-Säule von Kieselgel 60 (230–400 Mesh, ASTM) geleitet. Das gewünschte Produkt wurde mit einem 90 : 10 Vol./Vol.-Chloroform : Methanol-Gemisch eluiert. Der 1-Myristylmyristylalkohol wurde nach der Methode von Molotkovski V. G. und Bergelson L. D. (Biologicheska Chimia 8(9) (1982), 1256–1262) hergestellt. Die BAPTA-1-Myristylmyristylalkohol-Esterbindung in Prodrug-3 ist gegen eine Spaltung durch Esterasen empfindlich.
Beispiel I: Herstellung und biologische Eigenschaften von TVA16
Der Begriff "TVA16" wird hierin verwendet, um einen 1 : 1-Ester von Valproinsäure mit dem Cholinderivat ROCH₂-CH(OH)-CH₂O-P(O)₂-O-CH₂-CH₂N⁺(CH₃)₃, worin R eine Hexadecanoylgruppe ist, zu bezeichnen, und wurde wie folgt hergestellt. Eine Lösung von 1-Hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholin (1,04 mMol) in Chloroform (25 ml, frisch destilliert über P₂O₅), Valproinsäure (0,159 g, 1,1 mMol), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (0,216 g, 1,1 mMol) und 4-Dimethylaminopyridin (0,025 g, 0,202 mMol) wurden zusammen für zwei Tage bei Raumtemperatur unter Argon in einem 50 ml-Kolben, ausgestattet mit einem Magnetrührer und Glaskügelchen (10 g, 5 mm Durchmesser), gerührt. Nach zwei Stunden begann N,N'-Dicyclohexylharnstoff auszufallen. Die Umsetzung wurde mittels DC überwacht (65 : 25 : 4 Vol./Vol.-Chloroform : Methanol : Wasser); R_f des Produkts = 0,41. Der Niederschlag und die Glaskügelchen wurden durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde bei 35°C unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit 25 ml eines 2 : 1 : 2 Vo1.Vol.-Gemisches aus Chloroform : Isopropanol : Wasser extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit einer 1%igen wäßrigen NaCl-Lösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Anschließend wurde sie eingedampft, und der Rückstand wurde über eine 160 mm × 30 mm-Säule von Kieselgel 60 (230–400 Mesh, ASTM) geleitet. Das gewünschte Produkt wurde mit einem 65 : 25 : 4 Vol./Vol.-Chloroform : Methanol : Wasser-Gemisch eluiert; R_f = 0,4.
Eine Testprobe von TVA16 wurde eine Stunde vor einer s. c.-Dosis von Metrazol (80 mg/kg) an eine Gruppe von drei Mäusen i. p. verabreicht (0,01 bis 100 mg/kg). Eine wirksame Dosis entsprach der Menge, welche Krämpfe (beurteilt mit 2 Punkten pro Tier) und/oder den Tod (beurteilt mit 1 Punkt pro Tier) in den folgenden 30 Minuten verhinderte. Auf dieser Grundlage konnte der ED₁₀₀-Wert berechnet werden, der in der folgenden Tabelle mit bekannten krampflösenden Mitteln verglichen wird.
Krampflösende Aktivität (ED₁₀₀, mg/kg) von bekannten Arzneistoffen und TVA16
Aus der vorstehenden Daten ist ersichtlich, daß TVA16 eine signifikante krampflösende Aktivität besitzt und anscheinend um mehr als das 500fache wirksamer als Natriumvalproat ist.

Claims

Valproinsäure oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat davon, kovalent gebunden an ein Lysophospholipid.
Valproinsäure wie in Anspruch 1 definiert, kovalent gebunden an 1-Hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholin.
Arzneimittel, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1 oder 2.
Verwendung einer Verbindung wie in Anspruch 1 oder 2 definiert für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Epilepsie.