JP3900533B2 - 細胞への浸透増進プロドラッグ - Google Patents

Description

発明の分野及び背景
本発明は、ヒトにおける異常な細胞内の酵素活性に関する疾病や症状を治療する技術に関し、そのような技術において有用なプロドラッグに関する。
虚血、発作、てんかん、喘息及びアレルギーはヒトにおいて最もよく起こる疾病である。
先進国において、神経学的機能喪失の最も一般的な疾病として発現する脳血管性の疾病としては、例えば、脳の機能不全、脳梗塞、脳出血、又は動静脈の先天異常及び発作（虚血性疾病）が挙げられる。
てんかんは人口の約２％に発生する。全ての型の発作を治療する薬は無く、異なる患者には、異なる薬又は異なる薬の組み合わせが必要である。
気管喘息は可逆性の閉塞性の肺疾患である。喘息及びアレルギーは非常に患者の多い病気であり、特に先進国に多く見られる。
上記に述べた異なる疾病の明らかな違いにも関わらず、これらは、細胞膜が異常な酵素活性により破壊される細胞の過剰興奮現象に関連していると考えられている。最近の薬学的動向は、これらの分解活性を抑制することを目的としている。
虚血により生じる細胞のダメージは、Ｃａ²⁺の流入及び／又は細胞内における放出による二次的なものであると考えられる(Siesjo and Smith, Arzneimittelforschung, 1991, 41(3A): 288-292参照）。細胞内のカルシウムの大部分は細胞内の貯蔵に由来するものであるが、同様に、カルシウムの流入はてんかん性の発作の発生において重要な役割をする。最近の研究は、カルシウム流入遮断薬は、抗痙攣活性を有することを示唆している（Meyer, 1989, Brain Res. Rev. 14:227-243参照）。
カルシウム関連疾患の処置に一般的な或いは非常に有用な薬としては、（１）カルシウムチャンネル遮断薬、（２）カルシウムの細胞内貯蔵部位の修飾によるカルシウムの抑制薬、及び（３）細胞内カルシウムキレート化剤、が挙げられる。臨床上使用されているカルシウムチャンネル遮断薬としては、ベラパミル、ニフェジピン及びヂルチアゼムが代表的な薬である。このような化合物の使用に伴う主な毒性は、過剰の血管拡張、陰性筋変力（negative inotropy)、洞房結節率の低下、及びA-V結節誘導性障害が挙げられる。カルシウムチャンネル遮断薬のような、カルシウムの移動／分離に影響する薬剤は比較的狭い特異性を示す。臨床的な要求を満たす細胞内カルシウムキレート化剤は無い。ＥＧＴＡ−ＡＭ、ＥＤＴＡ−ＡＭ及びＢＡＰＴＡ−ＡＭのようなカルシウムキレート化剤は複合分子として得ることができ、その疎水性部分は細胞性非誘導エステラーゼにより摂取されることができ、細胞内の空間にキレート化剤の集積を起こすが、これはランダムでコントロールされていず、細胞活性に無関係である。
酵素の異常活性を特徴とする疾病細胞を選択的に攻撃することができるということは、薬学的に活性な分子をプロドラッグの形態で細胞内に導入するのに有用であり、そのような異常活性はプロドラッグに作用し、薬学的に活性な分子は、活性細胞よりもむしろ疾病細胞に集積する。そのような薬学的に活性な分子の非限定例としては、カルシウムキレート化剤が挙げられ、カルシウムに起因する疾病の治療に現在使用されている薬剤に比べ、多くの利点を有する。
細胞内のカルシウムは、移植用の器官低温保存における細胞死の重要な決定因子であり、器官の保護にも関連している（毒性学）。さらに、カルシウムの沈殿による細胞の崩壊は、リンパ球及びキラー細胞を媒介とした標的細胞の障害における主要な事象であるとされている。リンパ球と標的間の相互作用は細胞内のカルシウムレベルを持続的に上昇させ、破壊の連鎖を引き起こす。カルシウムの流入を防ぐことにより、ＵＷ溶液中の肝臓の冷却貯蔵を改良した（Rajab et al, Transplantation, 1991, 51(5): 965-7参照）。筋細胞の障害は、インビトロにおける感作細胞障害性Ｔリンパ球により引き起こされ、カルシウム依存性である（Woodley et al, Circulation, 1991, 83(4): 1410-8参照）。この研究は、カルシウムチャンネル遮断薬で処置を行った器官移植患者における拒絶率が低下していることを示している（Weir, Am. J. Med., 1991, 90(5A): 32S-36S参照）。このように本発明が、これらの状況に関して（カルシウムキレート化剤を使用した場合）有用であることは明らかである。
また、Ｃａ²⁺の細胞内レベルに関連した症状や疾病以外の治療にも同様の概念が適用できることは自明である。例えば、もし、プロドラッグ分子中の活性成分がプロテインキナーゼ抑制剤である場合、プロドラッグの投与後、抑制剤は異常な増殖を示す細胞に集積する。このように抗癌治療においても非常に重要な薬剤を与える。
発明の要約
本発明の目的は、異常な活性を示す細胞内に薬学的に活性な化合物を選択的に集積するプロドラッグを与えることである。他の目的は、標的細胞内で酵素活性に反応してプロドラッグから薬学的に活性な化合物を放出することである。さらに他の目的は、比較的上昇した酵素活性レベルを特徴とする細胞内に選択的に集積された薬学的に活性な化合物を、細胞内に補足して、そこで増強した目的の活性を示すようにすることである。
従って、本発明の一つの実施態様では、薬学的に活性は化合物と細胞内輸送補助剤との共有結合体であるプロドラッグを与え、これは、細胞内の酵素活性に対して切断感受性の共有結合が存在することを特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、異常な細胞内酵素活性に関連したヒトにおける症状及び疾病の治療技術を提供し、これは薬学的に許容される細胞膜浸透性プロドラッグをそのような症状及び疾病を有するヒトに投与することを含み、このプロドラッグは細胞膜に非浸透性の薬学的に許容される化合物及び細胞内の輸送補助剤との共有結合体であり、細胞内酵素活性に対する切断感受性の共有結合を有することを特徴とし、このような結合は、そのような活性によって切断され、その異常な細胞内酵素活性を有する細胞内に薬学的に活性な化合物が選択的に集積し、このプロドラッグは異常な酵素活性を低下するのに有効な量投与される。
他の実施態様では、本発明は、異常な細胞内酵素活性に関連するヒトにおける症状及び疾病を、薬学的に活性な細胞膜非浸透性化合物をそのような活性を有する細胞内に集積することにより、治療する薬剤の製造のための、薬学的に活性な化合物及び細胞内輸送補助剤の共有結合体である薬学的に許容される細胞膜浸透性プロドラッグの使用を提供する。
本発明の詳細な説明
本発明は、以下の詳細及び図との組み合わせにより理解しえる。
図１は、本発明の実施態様に従う化合物のヒトリンパ球の細胞内フリーＣａ²⁺レベルへの影響を図示したものである。
図２は、本発明の実施態様に従う化合物の存在下、又は非存在下における全体脳虚血の回復を比較したものを示している。
図３は、パイロカーピンの投与量を変化させた時のパイロカーピン誘導てんかん症を示している。
図４は、本発明の実施態様に従う化合物の投与によるパイロカーピン誘導てんかん症の阻止作用を示している。
図５及び６は、パイロカーピンにより引き起こされる長期間の心臓機能の変質化、又は環状血管状態の調節シフトに対する、本発明の実施態様に従う化合物の投与による阻止作用を示している。
図７は、本発明の実施態様に従う化合物を用いたときの、虚血−灌流モデルのパイロカーピン−障害心臓の回復を示したものである。
図８は、本発明の実施態様に従う化合物を投与による、メトラゾール最小発作試験での阻止作用を示したものである。
図９、１０及び１１は、低酸素−再灌流心臓病理学の実験結果を示したものである。
補助剤が（例えば）少なくとも一種の薬学的に許容される、グリセロール、Ｃ_3-20の脂肪酸モノグリセリド、Ｃ_3-20脂肪酸ジグリセリド、Ｃ_3-20脂肪酸のヒドロキシ−Ｃ_2-6−アルキルエステル、リゾホスファチド酸ヒドロキシ−Ｃ_2-6−アルキルエステル、リゾ−プラズマローゲン、リゾホスホリピッド、リゾホスファチド酸アミド、グリセロリン酸、リゾホスファチダル−エタノールアミン、リゾ−ホスファチジルエタノールアミン並びにこれらのアミンのＮ−モノ及びＮ，Ｎ−ジ−（Ｃ_1-4）−アルキル体、及び4級化アミン誘導体から選択されたアルコールを含有するとき、薬学的に活性な化合物は例えば薬学的に活性なカルボン酸であってもよい。薬学的に活性なカルボン酸としては、例えば、分岐鎖の脂肪族カルボン酸（例としてバルプロン酸）、サリチル酸（例、アセチルサリチル酸）、ステロイドカルボン酸（例、リセルグ酸及びイソリセルグ酸）、モノ複素環式カルボン酸（例、ニコチン酸）、及びポリ複素環式カルボン酸（例、ペニシリン及びセファロスポリン）が挙げられる。薬学的に活性なカルボン酸を特にここで、細胞内輸送補助剤と結合できる活性化合物として挙げたが、本発明はそれらに限定されるものではない。この様に、さらに例を挙げると、治療上活性な核酸（ＲＮＡ及びＤＮＡを含む）又はそのフラグメントと細胞内輸送補助剤とを結合することは本発明の概念に完全に含まれる。
非限定の実施態様において、本発明のプロドラッグはカルシウムキレート化剤を含み、細胞内の過剰な高レベルのＣａ²⁺イオンに関連した疾病又は症状の治療に効果的に使用してもよい。特に好ましい実施態様においては、プロドラッグは、薬学的に活性な化合物と細胞内輸送補助剤との間に少なくとも一つの共有結合を有し、この共有結合は分子内の酵素活性に対して切断感受性であり、プロドラッグ分子の大部分はそのような結合の切断無しに正常な細胞を自由に出入りできる。このとき異常な酵素活性のみを有する細胞内において、その細胞内に入ったプロドラッグ分子は高い割合で切断感受性の結合は切断され、このように異常細胞内に取り込まれて、細胞膜に非透過性であるため細胞内に薬学的に活性な化合物が集積される。当業者らは、細胞内の過剰なカルシウムイオンが関連している必要のない疾病及び症状に、本発明の概念がどのように適用されるかは理解するであろう。プロドラッグがカルシウムキレート化剤ではないが他の望ましい薬学的な活性を有する活性化合物を含むそのような他のケースにおいても同様である。
カルシウムキレート化剤を含むプロドラッグは、例えば部分的に又は全体的にエステル化されたカルボン酸であり、
（ａ）薬学的に許容される、分子式（ＨＯＯＣ−ＣＨ₂−）₂−Ｎ−Ａ−Ｎ−（−ＣＨ₂ＣＯＯＨ）₂を有するカルシウムキレート化剤。式中Ａは、二つの窒素原子間の直鎖結合に、２〜８炭素数の連続鎖（２〜４の酸素原子が間に挿入されていてもよい）を含む飽和又は不飽和の脂肪族、芳香族又は複素環結合基であり、二つの窒素原子に直接結合している結合基の原子は酸素原子ではなく、
（ｂ）１〜３の水酸基を有するＣ_3-32の薬学的に許容されるアルコール（例として、Ｃ_3-6アルコール又はＣ_7-32二級単水素アルコール）、
のエステル、及び部分的にエステル化されたカルボン酸のアルカリ金属塩、並びに一種以上の塩形成可能な窒素原子を有する、そのようなエステル化されたカルボン酸の酸付加塩である。
前段落のエステルは、結合基Ａが−（ＣＨ₂ＣＨ₂）_m−（式中、ｍは１〜４であり、このうち窒素に結合していない２〜４の炭素原子は酸素原子で置換可能である）、及び−ＣＲ＝ＣＲ−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＲ’＝ＣＲ’−（式中、各対のＲ−Ｒ及びＲ’−Ｒ’は、結合した−Ｃ＝Ｃ−基と共に、５又は６の環原子数を有する芳香族又は複素環を表し、Ｒ−Ｒにより表される環はＲ’−Ｒ’により表される環と同じでも異なっていてもよい。）からなる群から選択される基でもよい。
特別な実施態様においては、結合基Ａは、例えば−ＣＨ₂ＣＨ₂−及び−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−から選択されてもよく、又は例えば−ＣＲ＝ＣＲ−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＲ’＝ＣＲ’−（式中、各対のＲ−Ｒ及びＲ’−Ｒ’は、結合した−Ｃ＝Ｃ−基と共に、フラン、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、チアゾール、イソチアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，５−チアジアゾール、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、１，２，３−トリアジン、１，２，４−トリアジン並びに１，２−、１，３−及び１，４−オキサジン及びチアジンからなる群から選択された芳香族又は複素環を表し、Ｒ−Ｒにより表される環はＲ’−Ｒ’により表される環と同じでも異なっていてもよい。）であってもよい。特に好ましい実施態様においては、結合基Ａは、−ＣＲ＝ＣＲ−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＲ’＝ＣＲ’−（式中、各対のＲ−Ｒ及びＲ’−Ｒ’は、結合した−Ｃ＝Ｃ−基と共に、無置換及び置換ベンゼン環から選択された同じ又は異なる環を表し、置換ベンゼン環は、Ｃ_1-3−アルキル、Ｃ_1-3−アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＣＦ₃、からなる群からから選択される１〜４の置換基、又は−Ｏ−（ＣＨ₂）_n−Ｏ−（ｎ＝１−３）の単一の二価の置換基を含む。）である。
プロドラッグ中のカルシウムキレート化剤は、エチレン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、エチレン−１，２−ジオール−ビス−（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、及び１，２−ビス−（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸から選択されることが好ましい。
上記に述べたように、Ｃ_3-32、例えばＣ_3-6アルコールは１〜３のＯＨ基を含む。２個のＯＨ基を有するとき、そのうちの一つはエステル化されているか又は他の誘導体であり、３個のＯＨ基を有するとき、ＯＨ基の１又は２個はエステル化されているか又は他の誘導体である。エステル化又は他の誘導化された基の炭素原子は、薬学的に許容されるアルコール中の３〜６炭素数には含まれない。このようにこれらのアルコールは、例として、グリセロール、Ｃ_3-20脂肪酸モノグリセリド、Ｃ_3-20脂肪酸ジグリセリド、Ｃ_3-20脂肪酸のヒドロキシ−Ｃ_2-6−アルキルエステル、リゾホスファチド酸ヒドロキシ−Ｃ_2-6−アルキルエステル、リゾプラズマローゲン、リゾリン脂質、リゾホスファチド酸アミド、グリセロリン酸、リゾホスファチダルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン並びに前出のようなアミンのＮ−モノ−Ｃ_1-4−アルキル及びＮ，Ｎ−ジ−Ｃ_1-4−アルキル体及び４級化アンモニウム誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の基を含む。Ｃ_7-32の二級アルコールの例としては、１−ミリスチルミリスチルアルコールが挙げられる。
当業者らは、本発明のプロドラッグが次のような点において優れていることを認識できるであろう。すなわち、治療を行う疾病又は症状において異常活性を示す酵素源として知られている酵素の作用により、目的の薬学的に活性な成分が放出されるということである。例えば、膜付随、カルシウム非依存性プラズマローゲン選択的ＰＬＡ₂活性は、全体的な虚血の２分間に４００％を越えて上昇し（Ｐ＜０．０１）、虚血の５分後には１０倍を越え（ほぼ最大付近）、及び試験を行った全ての虚血間隔（最大６０分間）を通して活性は残存した（Ford et al., J. Clin. Invest., 1991, 88(1):331-5参照）。これらの事実は、グリセロリン酸誘導体の２位に薬学的活性成分があり、リゾプラズマローゲンの使用は、活性成分が共有結合的に結合した分子内輸送補助剤として、リゾリン脂質よりも有効である可能性があることを示している。
細胞膜に障害を与えるもの（例として、毒性化学物質、物理的刺激剤及び感染剤）は、最終的に虚血に似た症状を起こす連鎖の引きがねと成りえる（Robbins et al, Pathological Basis for Disease, 1984, p.10, W.B. Sanders Co.参照）。本発明は、分子内にカルシウムキレート化剤を導入することにより、これらの状況における細胞の保護に有効に用いることが可能である。これに関連して、Ｎａ−Ｃａ変換を阻害し、カルシウムと共に筋形質に負荷を与えることが報告されている抗ガン剤のアドリアマイシンは、収縮性心臓疾患を誘導し得るものである。これは、虚血の無い場合、カルシウム負荷が、長期間連続する収縮性の機能障害を後に残すという仮説と矛盾しない（Kusuoka et al, J. Cardiovasc. Pharmacol., 1991, 18(3): 437-44)。
上記に述べたように、本発明の概念は、Ｃａ²⁺イオンの分子内レベルに関連した疾病又は症状の治療に限定されるものではなく、従って、本発明の例に使用される物質はカルシウムキレート化剤に限定されない。例として、薬学的に活性な化合物は、例えば、バルプロン酸のような抗てんかん剤でもよい。これに関連して、この実施態様における本発明の適用は、バルプロン酸の有効量使用を他のケースにおけるよりもかなり低くする事が可能であり、従って、望ましくない副作用の発生を実質的に抑制することができる。一般的に、カルシウムキレート化剤のエステル化に関連して上記に述べた、アルコールの範囲及びその例は、本発明の概念に従ってバルプロン酸のエステル化にも適用してもよい。非限定の実施例において、バルプロン酸は、例えば１−ヘプタノイル−sn−グリセロ−３−ホスホリルクロリドによりエステル化してもよい。
他の実施態様では、本発明のプロドラッグに含まれる薬学的に活性な化合物は、プロテインキナーゼ阻害剤である。プロテインキナーゼ阻害剤がカルボン酸であるとき、プロドラッグは例えば、グリセロール、Ｃ_3-20脂肪酸モノグリセリド、Ｃ_3-20脂肪酸ジグリセリド、Ｃ_3-20脂肪酸のヒドロキシ−Ｃ_2-6−アルキルエステル、リゾホスファチド酸ヒドロキシ−Ｃ_2-6−アルキルエステル、リゾプラズマローゲン、リゾリン脂質、リゾホスファチド酸アミド、グリセロリン酸、リゾホスファチダルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン並びにこれらのアミンのＮ−モノ−（Ｃ_1-4）−アルキル及びＮ，Ｎ−ジ−（Ｃ_1-4）−アルキル体及び４級化誘導体のような薬学的に許容されるアルコールのエステルである。そのようなカルボン酸は、例として、ノカルジオシス種（Nocardiopsis sp.）から得られたプロテインキナーゼ阻害剤Ｋ２５２ｂである。
プロテインキナーゼ阻害剤が、置換可能な窒素に結合した水素原子を有するアミノ基であるとき、プロドラッグは例えば、グリセロリン酸、Ｏ−アシル化又はエーテル化グリセロリン酸、及びモノアシル化モノエーテル化されたグリセロリン酸から選択されたリン酸誘導体のアミド化合物である。そのようなプロテイン阻害剤は、例えば、ＮＨＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨＣＨ₃及び２−メチルピペラジン−１−イルのような非環式又は複素環式アミノアルキル基によりＮ−置換されたイソキノリン−５−スルホンアミドが挙げられる。プロテインキナーゼ阻害剤が少なくとも一種のフェノール性水酸基を含有するとき、プロドラッグは、例えば、グリセロリン酸、Ｏ−アシル化グリセロリン酸、エーテル化グリセロリン酸、及びモノアシル化モノエーテル化されたグリセロリン酸から選択されたリン酸誘導体のエステル化合物である。そのようなプロテイン阻害剤には、例えば４’，５，７−トリヒドロキシイソフラボンが挙げられる。
本発明の分子内輸送補助剤を選択するとき、当業者らは、当然次のような補助剤を避けることを考えるであろう。すなわち、プロテインキナーゼＣの活性化剤である、ある種の１，２−ジアシルグリセロール（Lapetina et al, J. Biol. Chem., 1985, 260: 1358及びBoynton et al, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1983, 115: 383参照）、又は細胞内においてこれらの望ましくない生産物を与えるような細胞内輸送補助剤である。
本発明の好ましい実施態様の詳細な説明
実施例１
プロドラッグ−１及びプロドラッグ−２の合成
“プロドラッグ−１”は、１，２−ビス−（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）と下記のコリン誘導体の１：１エステルを示す。
ＲＯＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂Ｏ−（ＰＯ₂）−ＯＣＨ₂Ｎ⁺（ＣＨ₃）₂式中、Ｒはヘプタノイルを表す。ＢＡＰＴＡはカルシウムキレート化剤であり、ヒトの細胞膜は通常浸透しないが、カルシウムキレート化剤ではないプロドラッグ−１には細胞膜は浸透する。プロドラッグ−１のカルボン酸エステル結合はＰＬＡ₂により切断され、ＩｇＥリンパ球のような活性化された細胞は、不活性な細胞と比較して選択的に細胞内にＢＡＰＴＡの集積を行い、その結果活性化された細胞内の〔Ｃａ²⁺〕_iレベルは、不活性な細胞と比較して低下する。“プロドラッグ−２”は、ＢＡＰＴＡと図示したコリン誘導体との１：２エステルを示す。
（ａ）ジヘプタノイル−Ｌ−α−レシチン
油でシールをした攪拌機、ＣａＣｌ₂管及び滴下管を付けた５００ｍｌの三つ口フラスコ内に、１００ｍｌの直径５ｍｍのガラスビーズと１１．０ｇ（０．０１ｍｏｌ）の合成Ｌ−α−グリセロホスホリル−コリンのＣｄＣｌ₂付加物を加えた。フラスコを氷浴に漬け、迅速な攪拌下の混合物に、６０ｍｌのクロロホルム^*に溶解した調製したばかりのヘプタノイルクロライド２９．７ｇ（０．２ｍｏｌ）を滴下し、続いて１００ｍｌのクロロホルム^*（^*無水、アルコールを含有しない）に溶解した無水ピリジンを１１ｍｌ（０．１４ｍｏｌ）加えた。３０分後、浴の温度を２５℃に上昇させ、さらに２時間攪拌した。反応混合物をフィルター無しのブフナーにあけ、ガラスビーズを３×５０ｍｌのクロロホルムで洗浄し、混合した濾液を遠心分離にかけ不純物を取り除いた。上澄み液を減圧下濃縮し、残渣から過剰のピリジンを除くため、３０〜３５℃の浴に漬けて数時間０．１ｍｍの減圧下においた。次に５００ｍｌの無水アセトンを加えて１０分間攪拌を行い、遠心分離を行った。沈殿物を同様に２×１００ｍｌの無水アセトン及び２×１００ｍｌの無水エーテルで処理した。残渣の固体を減圧下乾燥し、２００ｍｌのクロロホルム／メタノール／水混合物（体積比が５：４：１）に溶解し、アンバーライトＩＲ−４５とＩＲＣ−５０の同体積混合物が充填された長さ１２０ｃｍ×直径２．５ｃｍのカラムを通して、最終的に微量のカドミウムクロライド及びピリジン塩酸塩を除いた。カラムを５００ｍｌの同じクロロホルム／メタノール／水混合物で洗浄し、集めた流出液を濃縮し、４０〜４５℃の浴に漬けて減圧下乾燥した。残渣を４５℃で０．１ｍｍの減圧下で乾燥した。粗製生成物を５０ｍｌクロロホルムと１５０ｍｌのアセトンから沈殿させ、沈殿物を遠沈をし、クロロホルムとエーテルから再結晶を行って精製して２，３ｇ（４７．６％）を得た。（ジオクタノイル−Ｌ−α−レシチンも同様に合成することができる。）
（ｂ）１−ヘプタノイル−ｓｎ−３−グリセロホスホリルコリン
（ａ）の生成物（１．２ｍｍｏｌ）のエーテル（１９６ｍｌ）及びメタノール（１２ｍｌ）溶液を、ＣａＣｌ₂（０．７２ｍＭ）及びホスホリパーゼＡ₂源として５ｍｇの粗製のガラガラヘビの毒（Crotalus adamanteus)を含有した（ＨＯＣＨ₂）₃Ｃ−ＮＨ₂．ＨＣｌ（５０ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ８．７）の存在下に、３７℃で３時間激しく攪拌した。反応は、ＴＬＣ（クロロホルム／メタノール／水、体積比７０：２５：４）で確認した。反応終了後、有機層を分離し、水層をエーテルで洗浄し、凍結乾燥を行った。残渣をクロロホルム／メタノール、２：１で抽出し、遠沈を行った。透明な上澄み液を濃縮し、表題の生成物を９０％の収率で得た。クロロホルム／メタノール／水（７０：２５：４）を用いた薄層クロマトグラフィーは、原料及びヘプタン酸が混入していないことを示した。しかし、生成物中の脂肪酸は、エタノールからの再結晶で除去することが可能である。注意：これは、グリセロール−２−エステル結合を切断する一般的な方法である。（オクタノイル−ｓｎ−３−グリセロホスホリル−コリンも同様に合成することができる。）
（ｃ）プロドラッグ−１及びプロドラッグ−２
（ｂ）の生成物（０．５ｇ、１．０４ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１５ｍｌ、Ｐ₂Ｏ₅から新しく蒸留したもの）溶液を、ＢＡＰＴＡ（プロドラッグ−１のモノエステルには０．４９５ｇ、１．０３ｍｍｏｌ、又はプロドラッグ−２のジエステルには０．２４８ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．２１４ｇ、１．０３ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．０２５ｇ、０．２０２ｍｍｏｌ）及びＨＣＯＮＭｅ₂（２０ｍｌ、ＣａＨ₂から新しく蒸留したもの）の溶液に、窒素雰囲気下加え、混合物を室温で２日間攪拌した。）反応は、ＴＬＣ（クロロホルム／メタノール／水、体積比６５：３５：５）で確認した。沈殿物を濾過により除去し、濾液を３５℃で減圧下濃縮し、残渣を、クロロホルム／イソプロパノール／水、体積比２：１：２に溶解した。有機層を分離し乾燥を行い（ＮａＳＯ₄）、次に長さ２０ｃｍ×直径１．８ｃｍのケイ酸（Ｂｉｏ−Ｓｉｌ−ＨＡ）カラムを通した。カラムをＢＡＰＴＡ（ＴＬＣ）が無くなるまで完全に洗浄し、次にクロロホルム／メタノール（体積比１：１）から純粋なメタノールに勾配をかけた溶媒で流出し、流出液を集め、濃縮を行った。目的の生成物（すなわち用いたＢＡＰＴＡのモル等量によりプロドラッグ−１又はプロドラッグ−２が得られる。）をエーテルから結晶化し、３０℃でＰ₂Ｏ₅存在下減圧乾燥した。（収率０．３ｇ、３０％）。相当するトリエステル又はテトラエステルは、ＢＡＰＴＡのモル等量数を変化することにより得られることは明らかである。（オクタノイルエステル類似体も同様に合成する。）
実施例２
プロドラッグ−１の適用による、異常酵素活性を有する細胞の細胞内カルシウムレベルの低下。
方法
細胞内のフリーの〔Ｃａ²⁺〕_iの含有量をＣａ²⁺−感受性色素fluo-3/AM(Molecular Probe Inc., Or）を使用した流速血球計算法により測定した(Minta et al, 1989;Kao et al, 1989参照）。供給血からの細胞及び喘息患者の血液からの細胞をＤＭＥＭ中で２回洗浄し、１０⁷細胞／ｍｌの濃度になるように再懸濁を行った。fluo-3/AM（１ｍＭ）を、非イオン性の表面活性剤（Pluronic F-127; Wyandotte Corp., MI）を加えたＤＭＳＯ中で調製した。fluo-3/AMストック溶液の一部をＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ中の細胞懸濁液に加え、最終濃度が３μＭ（loading buffer）となるようにした。負荷（loading)は、３７℃で３０分間行い、さらに２３℃で１時間穏やかに攪拌しながら行った。細胞を次に２％の馬の血清を加えた新鮮なＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳを使用して、目的の濃度となるように調製した。自己蛍光は、色素の無い状態で得られるレベルより上に感受性の域値を設定することにより、除くことができる。蛍光強度のデータは、５０００個の単細胞から得られ、値は任意の蛍光単位として表されている。プロドラッグ−１（１ｍＭ）をＤＭＳＯ中で調製し、最終濃度３μＭににおいて、カルシウム処理の５分前に細胞に加えた。
結果
供給血及び喘息患者の血液からのリンパ球をプロドラッグ−１で処理した。離生したＢＡＰＴＡキレート化剤の細胞内への集積は、〔Ｃａ²⁺〕_iを、上記に述べたfluo-3/AMを使用した流速血球計算法で測定して評価した。結果を図１に示した。図中、〔Ｃａ²⁺〕_iレベルは次の様に表されている。
正常リンパ球（パネルＡ）；
プロドラッグ−１で処理した正常リンパ球（パネルＢ）；
喘息患者からの正常リンパ球（パネルＣ）；
ＩｇＥで刺激を行った喘息患者からの正常リンパ球（パネルＤ）；
プロドラッグ−１で処理した喘息患者からの正常リンパ球（パネルＣ’）；
及び
プロドラッグ−１で処理した、ＩｇＥで刺激を行った喘息患者からの正常リンパ球（パネルＤ’）。
喘息患者からのリンパ球は、〔Ｃａ²⁺〕_iレベルによって二重に区分される（パネルＣ）。細胞の約５０％が細胞異常活性を示す高〔Ｃａ²⁺〕_iレベルを示し、一方、残りの割合のものは正常なものと同様である（パネルＡと比較）。細胞がプロドラッグ−１で処理されたパネルＣ’及びＤ’の場合は、異常活性を示す細胞の割合は正常に戻り、非活性化細胞の割合は変化しない（パネルＣと比較）。データは、プロドラッグ−１が、活性化された細胞内ではキレート化剤の選択的集積を起こすが、非活性化細胞では起こさないことを示している。
実施例３
ガン治療におけるプロドラッグの効果的な適用
この実施例において、プロテインキナーゼ阻害剤に関するプロドラッグを含む本発明の様々な具体的な実施例が示されている。プロドラッグの投与後、阻害剤は、異常な増殖を示す細胞内に集積し、抗がん治療において重要な役割を行うものを与える。
（ｉ）化合物

は、ｃＡＭＰ依存生プロテインキナーゼの選択的阻害剤である(Hidaka et al, Biochemistry., 1984, 23:5036,及びTash et al, J. Cell Biol., 1986, 103:649参照）。同様に化合物ＱＳＯ₂Ｎ（式中、Ｑ＝５−イソキノリル、Ｎ＝２−メチルピペラジン−１−イルを表す。）は、環状ヌクレオチド依存生プロテインキナーゼ及びプロテインキナーゼＣに有効な阻害剤である(Hidaka et al, loc cit, and Kikuchi et al, Nucl. Acid Res., 1988, 16:10171参照）。これらの化合物は、細胞内輸送補助剤と、下図に示すように当業者に知られた方法により、共有結合的に結合することができる。

スキーム（ｂ）において、Ｒはプラズマローゲンで見出されるような脂肪族炭化水素基であり（又はこれは従来の合成方法に挿入されてもよい）、及びＡはラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアリル及びオレイルのような脂肪族アシル基である。
化合物ＱＳＯ₂Ｎ（式中、Ｑ＝５−イソキノリル、及びＮ＝２−メチルピペラジン−１−イルを表す。）は同様の方法でピペラジンのＮ⁴原子を経て結合を行ってもよい。
上図に示したプロドラッグ（Ａ）及びプロドラッグ（Ｂ）のＰ−Ｎ結合は、酵素ＰＬＤに対して切断感受性であるため、細胞内に前記のプロテインキナーゼ阻害剤を放出し、異常なレベルのＰＬＤを有する細胞内にこれらの阻害剤を集積する。
（ii）４’，５，７−トリヒドロキシフラボンは、チロシン特異生プロテインキナーゼである(Akiyama et al, J. Biol. Chem., 1987, 262:5592参照）。この化合物は、（ｉ）で述べた方法（ａ）及び（ｂ）により細胞内輸送補助剤と結合することができる。結合体の構造を下図（Ｃ）及び（Ｄ）に示した。

式中、Ｒ’及びＡは上記の定義通りであり、Ｑ’は４’，５，７−トリヒドロキシイソフラボンの一つのフェノール性水酸基の水素を除去した残基であり、これは酸素原子を介して残りの分子と結合し、Ｐ−Ｏ結合を形成している。上図のプロドラッグ（Ｃ）及び（Ｄ）のＰ−Ｏ結合は、酵素ＰＬＤに対して切断感受性であると考えられ、細胞内に前記のプロテインキナーゼ阻害剤を放出し、異常なレベルのＰＬＤを有する細胞内にこれらの阻害剤を集積する。
（iii）ノカルジオシス種（Nocardiopsis sp.）から得られたプロテインキナーゼ阻害剤Ｋ２５２ｂは、次の構造を有すると考えられるカルボン酸である。

この化合物は、例えば実施例１で述べた方法により細胞内輸送補助剤と結合させることが可能である。例として、結合は、上図のカルボキシル基のヘプタノイル−ｓｎ−３−グリセロホスホリルコリン又はオクタノイル−ｓｎ−３−グリセロホスホリルコリンとのエステル結合である。
実施例４
ＤＰ１６の作製及び生物学的性質
“ＤＰ１６”は、ここではＢＡＰＴＡとコリン誘導体ＲＯＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂Ｏ−ＯＣＨ₂Ｎ⁺（ＣＨ₃）₂との１：１のエステルを表し、Ｒはヘキサデカノイルを表す。ＤＰ１６は実施例１に記載した方法に従い作製した。
虚血状態におけるＤＰ１６の評価
総頸動脈の両側閉塞は、最も簡単で直接的な、全体虚血を引き起こす方法である。ラットでは、２４時間後に約６４％が死亡する。死亡を引き起こすのは、多くは脳の膨潤（浮腫）と病巣の病変（梗塞）によるものである。総頸動脈の分離及び首の腹面の切開により、全体虚血を起こすことができる。唾液腺を側方に移動し、頸動脈鞘を露出させる。迷走神経及び交感神経を総頸動脈から分離し、これらを永久的に結ぶ。Sprague-Dawleyラット（２５０−３００ｇ）をハラサン(halathane)、又は体重３００ｇ当たり、０．１ｍｌのケタミン（０．１ｇ／ｍｌ、パークデービス（Park Davis）、ＵＫ）及び０．１ｍｌのロンプン（Rompun)（２％、バイエル(Bayer）、ＦＲＧ）を筋内注射して麻酔を行った。ＤＰ１６は適当な動脈の結紮の後に、ｉ．ｐ．投与（腹腔内投与）（０．００１−０．１ｍｇ／ｋｇ）を行った。全ての試験及び比較群には、それぞれ雄のラットを１４匹づつ用いた。ｔ分類に従い、統計分析を行った。
虚血試験の実験の詳細及び結果
塞栓症発作:Sprague-Dawleyラット（３００ｇ）をハラサンで麻酔をかける。右総頸動脈を露出させ、外側の頸動脈と翼口蓋動脈をＮｏ．０の絹糸で結ぶ。総頸動脈に、ヘパリン化した血清を予め充填したプラスチック管を挿入する。カニューレに球体の懸濁液を（０．５ｍｌのガス−タイト（gas-tight)ハミルトンシリンジにより）挿入し、続いて０．５ｍｌの血清を入れた。総頸動脈を永久的に結紮した。ポリスチレンの１５μｍの球体を０．０５％の通常の血清中のツウィーン（Tween）−８０の中で調製し、５分間全出力でsanitationを行った。その一部の１００μｌを取り、すぐにシリンジに移した。
胎児脳虚血モデル：妊娠２０日のSprague-Dawley妊娠ラットを用いた。体重３００ｇ当たり、０．１ｍｌのケタミン（０．１ｇ／ｍｌ、パークデービス、ＵＫ）及び０．１ｍｌのロンプン（２％、バイエル、ＦＲＧ）の筋内注射により麻酔を行った。腹部の切開を行い、二つの子宮角（uterine horsn）を露出させ、手術の間湿度を保つようにしておいた。炭酸水素ナトリウム（１．３２ｇ％）を含む、１−２ｍＣｉ／２ｍｌの〔³Ｈ〕アラキドン酸（Ｎａ⁺、２４０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、New England Nuclear, Boston,ＭＡ）及び／又は１．５ｍＣｉ／２ｍｌの〔¹⁴Ｃ〕パルミチン酸（Ｎａ⁺、８１９ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、Amersham, Searle, ＵＫ）の等張塩溶液の脳内注射は、子宮壁を通して胎芽の頭蓋泉門に行われた。注文製造のシリンジ（３３ゴーグ、長さ０．３７５″、ハミルトン、Reno, ＮＶ）を脳浮腫を減少させるために使用した。注射後、胎児は腹腔に生理的温度に置くために戻した。１時間後に、胎盤マニホールド（manifold）の血管をクランプで挟んで２０分間の血流制限を行った（制限期間）。望むときに、クランプを取り除き、３０分間流れを復帰させた（復帰期間）。外科的出産前まで、制限及び擬似手術を行ったどちらの胎児も全期間を通して胎児は腹腔内に置いた。子宮の横断切開による出産後、明らかに浮腫の無い生存可能な胎児はすぐに殺して、切除した胎児の脳をさらに処置を行うために素早く適当な有機溶媒中で均質化した。
胎児脳半球モデル： 胎児を生存可能な段階で子宮角より取り出し、斬首後、１５秒以内に脳半球を切開した。その脳半球から血を除き、脳膜を分離し、各々（５０±２．５ｍｇ）を２４穴のファルコン（Falcon）培養皿の穴に入れた。組織を素早く、冷却した媒体(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM, Grand Island Biol. Co)で二回洗浄を行い、酸素を満たし、種々の添加剤を加えた０．６−１．２ｍｌのＤＭＥＭ中で３７℃で培養を行った。培養媒体の一部（０．１ｍｌ）を放射性同位体元素標識免疫測定法（RIA)によりエイコサノイド（eicosanoid)の定量を行うために取り出した。５ｍｌの蟻酸で酸性にした後、０．１ｍｌのイソプロパノール及び０．５ｍｌのジエチルエーテルを加えた。混合し、低速で遠心分離（２５００×ｇ、５分間）を行った後、有機層を集め、窒素気流下乾燥した。得られた残渣を０．１％のウシ血清アルブミンを含有するｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液０．１ｍｌに溶解した。試料を、最終体積が０．３ｍｌとなるようにして、適当なポリクローナル抗血清及び³Ｈ−ラベルを行ったトレーサー（４０００ｃｐｍ／チューブ）と共に４℃で一晩培養を行った。結合しなかった物質は、０．３ｍｌのデキストラン被膜化チャコール（ファルマシア、スウェーデン）で固体とした。４℃で遠心分離を行った後、上澄み液の一部（０．４ｍｌ）をバイアル瓶に移し、シンチレーション液体試料を、パッカードトリカルブ（Packard Tricarb）シンチレーション計測計で計測を行った。等張NaHCO₃液（１．３２％ｗ／ｖ）に溶解した[³Ｈ］アラキドン酸（２４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（New England Nuclear, Boston, MA)を、子宮壁と頭蓋泉門を通して胎芽の脳に注射した。注射後、胎児を腹腔に生理的温度に置くために戻した。１時間後に、胎児を出産させ、すぐに殺した。脳の半球をすぐに、体外での培養又は脂質の抽出のために切除した。
結果 両側の全体的な脳の虚血により、手術後、２−７日目までに実験動物は次第に死亡してゆく。図２に示す通り、非保護ラットを使用したコントロール（ｐ＜０．０１）と比較して、ＤＰ１６は虚血後の回復を２５０％にまで高めた。このデータは、ＤＰ１６の致命的な虚血状態を処置する能力を示している。
心臓虚血−灌流心臓モデル：白色ラットを頸部を脱臼させて殺し、心臓をすぐに除去し、ランゲンドルフ（Langendorff)灌流心臓モデルを用いて、改良したクレブス−ハンセレイト（Krebs-Henselleit）緩衝液と共に６０ｍｍＨｇで再灌流を行った。心臓は、１０分間の前平衡間隔の間灌流を行い、次に全体虚血（流量０）を行うか又は所定の時間連続して灌流を行った。灌流は、心室の組織を素早く切除することにより終了し、冷却した均質緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭＫＣｌ、０．２５Ｍシュークロース〔グレード１〕、ｐＨ７．８）中に直接浸した。再灌流の間のホスホリパーゼＡ₂の活性化及びその可逆性は、時間的に筋細胞の嫌気性的代謝の変化及び電子ミクロ的分析に関連している。
冠状血管閉塞による心室のフィブリル化モデル
犬(１１．６−２０．７ｋｇ）に麻酔をかけ、左回旋環状血流、左心室圧、及び心室の電位を器械で測定した。左前方の下行動脈を結紮し、前方壁の心筋梗塞を起こした。全ての心臓血管に通じる器械は、動物の首の後ろの皮膚の下を通して出した。手術後の痛みを最小にするための適当な薬を与え、感染を防いだ。虚血試験は３−４週間後に行った。
てんかんの処置におけるＤＰ１６の性質
実験的てんかんのパイロカーピンベースモデル
アセチルコリンエステラーゼの阻害剤であるアセチルコリン及びアセチルコリン誘導体は、脳内又は全身に投与すると効果的なてんかん剤となる（Leite et al., Neurosci. and Biobeh Rev., 1990, 14:511-17参照）。異なる種において、ムスカリン様コリンアゴニストの全身投与は、カイニン酸及び葉酸により引き起こされ、ヒトのてんかんの検死解剖においてよく見られるものに局所解剖学的に類似した、広範囲は脳障害を伴う、脳波記録装置上、かつ行動上の四肢の（limbic）発作を引き起こす。活性なムスカリン様コリンアゴニストであるパイロカーピンの全身投与は、興奮性発作、顔面自動運動、及び運動性四肢の発作を含む行動上の一連の変化を与え、１−２時間に渡って進行し、徐々に四肢の症状を示し、次にてんかんの一般的な症状を示す。
パイロカーピンの注射後すぐに運動喪失、運動失調、顔面自動運動及び心臓の震え発作が動物の行動に表れる。さらに、てんかんの進行は投与量依存性である（図３）。パイロカーピンを３００−３５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与すると、硬直（rearing)を伴う四肢発作、前肢の間代性けいれん、唾液分泌、極度の咀嚼顎の動き及び転倒(falling）が見られる。運動性四肢の発作は、２０−３０分後に始まり、２−８分毎に繰り返し起こり、てんかん状態へ移行する。パイロカーピンの投与量を４００ｍｇ／ｋｇにまで増加すると、四肢の発作は見られなくなり、１５−２５分後の最初の行動変化において、致命的な一般的な強直−間代性痙攣が起こる。我々はこの投与量をＬＤ₁₀₀と考えている。
パイロカーピンの投与前のＤＰ１６の投与は、動物の死を阻止し、てんかんの発現を減少させた。図４に示したように、ＤＰ１６は１０^-8〜１０^-5ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で治療効果を示す。この特別なてんかんモデル（パイロカーピン、４００ｍｇ／ｋｇ：ラット）に対するＤＰ１６の治療指数（ＥＴ）は０．５ｍｇ／ｋｇ／５×１０^-7ｍｇ／ｋｇ＝１×１０⁶である。得られたデータは、ＤＰ１６がてんかんに対する非常に有望なプロドラッグであることを示している。
パイロカーピン及び心臓毒性
パイロカーピンを投与したとき、ラットにおいて二つの型の死が観察された。一つは、致命的な痙攣によるものであり、もう一つはてんかん直後の死でない遅延死である。我々は、パイロカーピン誘導痙攣後のラットの遅延死の実際の理由を解明する試みを行った。これらの動物の肉眼による検死では、心肺の機能障害の兆候が観察された。すなわち、肺浮腫及び出血、膨張し、あるケースでは変形した心臓が見られた。生存している動物の心臓を０．１％のトリパンブルーで染色すると、障害を受けた部分の濃い染色吸収を示す領域と、梗塞した薄い染色域との心筋の斑点図を示した。従って、我々はパイロカーピン投与後に、我々がパイロカーピン投与後の心疾患（post-pilocarpine-seizure-cardiopathy)(PSCP)と呼ぶ心臓疾患が進行すると考えることができる。ＤＰ１６の評価に関連したＰＳＣＰの研究は、インビボ及びインビトロでラットを用いて行い、これらは痙攣及び準痙攣を与えるパイロカーピンの投与後も生存した。
ＰＳＣＰ実験
成体（２−３か月）の雄のSparague-Dawleyラットを全ての実験に用いた。これらに標準の練炭状の食物を水と共に自由に与え、標準のプラスチックの檻（各檻に４〜５匹づつ）に入れ自然光の下に置いた。パイロカーピン−スコポラミンによるてんかん状態モデル（パイロカーピン）を前述のように行った。ラット群のうち２３匹には、パイロカーピンをｉ．ｐ．で体重当たり１００−４００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ／Ｗ）の範囲の異なる投与量を異なる期間与えた。１７匹のラットの第２群は、パイロカーピン投与前にＤＰ１６の投与を行った。すなわち、パイロカーピンの次の投与の３０分前にＤＰ１６を注射を行うという処置を行い、期間中続いてその効果を研究した。
インビボで、３種類の標準誘導におけるＥＣＧ(Birtcher-Cardio-Tracer, model 375, USA）を、ケタミン麻酔下(3.3mg/kg Imalgene 100, Rhone Merieux, France及び7mg/kg Rompun, Bayer Leverkusen, Germant, i.m.）記録した。ＥＣＧの記録は、パイロカーピンの注射前（コントロール）、パイロカーピンの投与２４時間後（急性期間）、及びパイロカーピン投与３〜１４日後の、心臓機能が比較的落ち着いた時に行った。ランゲドルフの灌流分離心臓の作製が確立される前は、ＥＣＧの記録の一部はネムプタールの麻酔下（35mg/kg, i.p.)で行った。灌流−低酸素−再灌流分離心臓モデル（ＰＨＲ）を従来のランゲドルフ法（非再循環灌流系）を３７℃にして以下の二つの点を改良して行った。改良１、標準灌流圧（ＰＰ）：６０ｍｍＨｇ、又は２、１０−１５分間上記のＰＰで灌流を確立した後、蠕動ポンプ（IsmaticSA, Laboratoriumstechnic, Switzerland）を用いて速度を調節しながら一定の流量で行う。一定のＰＰで行う場合には、流出量体積は電子天秤（Precisa 1000C-3000D, Switzerland）で測定した。コントロール期間、一定の流量で行った場合には次の実験期間流量は変化させず、ＰＰをしばしば測定した。コントロール期間の３０分後、灌流を３０分停止し、次の再灌流を３０分間続けた。ＥＣＧを直接、心室尖（誘導１）、心耳（誘導２）、及び中間（誘導３）から測定した。冠状血管の灌流抵抗性（ＣＶＰＲ）を次の特別な単位を使用して計算した。ＰＰ／流量／心臓の重量。上記のプロトコールに従い、心臓の細胞障害及び梗塞を調べるため、０．１％のトリパンブルー染色剤と共に灌流した。
結果
ＥＣＧのインビボにおける結果を図５に示す。棒グラフは、ＥＣＧを表し、コントロール期間の各ＥＣＧの平均±ＳＥで表されている。グラフの最初の群はＰＳＣＰの急性段階におけるパイロカーピンの注射後のＥＣＧ変化を表している。すなわち、誘導１及び２では、Ｒ−ピークの統計的に著しい降下を記録した（コントロールのそれぞれ４７％及び１６％）。ＰＳＣＰのＤＰ１６による処置では急性段階において、７匹のうち５匹の電気的な活性を正常に戻した。ＥＣＧの電圧は、相当する生理学的プロセスの強度に部分的に関連していることが知られている。従って、Ｒ波のパイロカーピン−誘導変化及びＤＰ１６によるその正常化は、少なくともＰＳＣＰ下の心室の虚弱化を治療するＤＰ１６の活性を反映していると考えられる。パイロカーピンの投与３−１４日後、コントロールラットにおいて、Ｒ波が比較的正常化するのが見られた。しかし、誘導３（３６％）及び誘導２（６１％）において、Ｒ正常化は、著しく増加したＳ波の深さに幾分関連している（しかし、後者は多様な観点から統計的に顕著ではない）。Ｓ波の深さの増加は、パイロカーピン処置を行ったコントロール動物の心筋虚血及び梗塞を示唆する障害を反映したものである。安定化相でのＰＳＣＰの急性段階における場合と同様に、ＤＰ１６はコントロールラットで認められたＥＣＧの変化の出現を防いだ。ＤＰ１６により保護された動物と、保護されなかった動物の間の相違は、統計学的にも明らかである（ｐ＜０．０１）。この期間ＰＳＣＰは、パイロカーピンコントロール、ＤＰ１６処置動物と同様に心拍数が著しく上昇した。このような頻脈は、血流不全に関連している可能性があり、梗塞病体生理学に特徴がある。このように、パイロカーピン投与後の長期に渡るインビボにおけるＥＣＧの研究から、心臓機能の明らかな変質（ＰＳＣＰ）が解明され、これは数種の動物でＤＰ１６による処置により治療される。
ランゲドルフの心臓モデル
図６は、分離したランゲドルフの心臓の冠状血管灌流抵抗性（ＣＶＲＰ）を示している。コントロールの初期の３０分間に分離したランゲドルフの心臓のＣＶＲＰは、徐々に増加し、この上昇は２０分後統計的に明確なものとなった。パイロカーピンの投与後灌流を行った全ての心臓において、初期の灌流流量はコントロールにおけるよりも大きく、次のＣＶＲＰは著しく下降（基底線）した。この冠状血管のトーンの下降は、心臓内の低酸素症により誘発されたノルアドレナリン欠乏又は完全麻酔に関連していると考えられる。パイロカーピンの投与前にラットをＤＰ１６により予め処置しておくと灌流の初期及び最終の両期間においてＣＶＰＲ調節の障害は阻止されるが、これは、低酸素状態における冠状血管の機能をＤＰ１６が正常化することができることの証拠を与えるものである。灌流の３０分間の停止及び次の再灌流を行うと、図７に示す任意のスケールに分類される周知の広範囲の心臓障害が起こる。非処置ラットのコントロール心臓は、灌流を停止した後、変質（心筋の興奮性、伝導性及び収縮性が損なわれる）の明確な範囲でほとんど回復した。コントロール群の回復の平均値は６．３±０．６（ｎ＝７）であった。ＰＳＣＰの異なる段階におけるパイロカーピン処置ラットは、スペクトル増加及び病理学的重症度の増加を示し、平均回復値は３．３±０．８、ｎ＝７、ｐ＜０．０５であった。回復はしばしば心室のフィブリル化を伴った。幾つかの心臓は、完全に回復しないか、又は心房の機能のみ回復した。パイロカーピン投与前のＤＰ１６による処置は、再灌流停止後障害を受けた心臓の回復能力を増加させた。すなわち、平均値は、６．４±０．６（ｎ＝９）であった。このラット群で、完全な回復のケースがしばしば見られた。このように、パイロカーピン誘導心臓障害（ＰＳＣＰ）のＤＰ１６による処置は心臓機能の明確な回復を与えた。
ＤＰ１６の抗てんかん効果の研究：
メトラゾール最小発作試験
方法
ＤＰ１６を抗てんかん剤として使用する試みは生後３−４週間の雄のＢＡＬＢ／ｃマウス（１８−２７ｇ）を用いて行った。動物は、適する食餌を与え、試験期間の短期間を除いて自由に餌及び水を摂取できるようにした。動物は、試験期間及び処置前に、一時間別々に透明なプラスチックの檻に入れた。薬剤は通常の血清に溶解し、注射体積は体重に対して０．０１ｍｌ／ｇとなるように調節した。ＤＰ１６は、０．１〜３００μｇ／ｋｇの投与量範囲でｉ．ｐ．投与を行った（０．１μｇ／ｋｇ：ｎ＝１０、５μｇ／ｋｇ：ｎ＝１０、２５μｇ／ｋｇ：ｎ＝２０、７５μｇ／ｋｇ：ｎ＝２０、１５０μｇ／ｋｇ：ｎ＝２０、及び３００μｇ／ｋｇ：ｎ＝１０をそれぞれ試験した。）。コントロール動物には、通常の血清をｉ．ｐ．投与した。ＤＰ１６又は血清投与３０分後、メトラゾール（５０μｇ／ｋｇ，ｓ．ｃ．）を投与した。次の３０分間、てんかんの兆候を観察した。試験群の間代性の単収縮（myoclonic jerks, MJ)の欠如又は著しい遅延を、抗てんかん活性を示すものとした。コンピューター統計ソフト“StaViewII”を用いてｃ２（chi-square）法に従い、データを分析した。
結果及び結論
メトラゾールを５０μｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．で投与すると、間代性の単収縮(MJ)は、全てのコントロールマウスに最大期間１０１１分（Ｎ＝１１）で表れた。ＤＰ１６の、最小メトラゾール誘導発作効果を図８に示す。０．１μｇ／ｋｇのＤＰ１６で処置を行ったマウスは、メトラゾールに対して、コントロール（非処置）動物と同様の反応を示した。５〜３００μｇ／ｋｇのＤＰ１６は、顕著な阻止効果（ｐ＜０．００１）を示した。試験の結果は、メトラゾール誘導発作において、ＤＰ１６が著しい投与量依存性の抗けいれん効果を有することを示している。
ＤＰ１６の心臓保護効果の研究：
１．体外におけるラットの心臓低流再灌流モデルの試み
方法及び結果
広範囲に使用されている体外におけるランゲドルフの心臓再灌流停止及び低流モデル（Neely及びRovetto、1975）は、薬理学的な試みに従来から使われている。ＤＰ１６の心臓保護効果は、通常の流量の灌流の次に低流灌流を行い、さらにラット心臓の体外での再灌流（ＬＦＲ）を行う実験的なパラダイムを組み合わせて評価を行った。ＥＣＧ及び再灌流圧（ＰＰ）の変化は薬剤評価の基準となると考えられる。ＤＰ１６存在下の実験のデータを、薬剤の追加をしなかったもの（コントロールＮｏ．１）と比較した。実験の追加試験（コントロールＮｏ．２）をＤＰ１６を含む成分の混合物（ＢＡＰＴＡ及びリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ））を用いて行った。ＤＰ１６（１−１００μｇ／Ｌ）を標準灌流緩衝液に溶解した。コントロールＮｏ．２のＢＡＰＴＡ及びＬＰＣの混合物をＤＭＳＯに溶解し、ストック溶液とした。ＢＡＰＴＡ、ＬＰＣ及びＤＭＳＯの灌流緩衝液中の最終濃度をそれぞれ１００μｇ／Ｌとした。
２０ｍｍＨｇより低くなる灌流圧（ＰＰ）の著しい低下（低流期間）は、しばしば心室不整脈を伴う安定なＡＶブロック（図９．２、通常の流れは図９．１を参照）により最高点に達する洞徐脈を起こす（９実施例、コントロール１）。長時間（＞０．５時間）の低流状態は通常発作性頻拍不整脈及び心室のフィブリル化で（ＶＦ）で終止する。ＶＦが一時的に洞調律を回復する前に再灌流を始めた。しかし、ほとんどのコントロール実験の再灌流は、冠状血管のトーンの上昇及び非可逆性のＶＦを伴う不整脈を引き起こした（図９．３）。低流期間におけるＡＶブロックを確立した後、灌流媒体に薬剤を追加した。ＢＡＰＴＡ及びＬＰＣの混合物を用いた実験ではＡＶＢへの治療効果は見られなかった（図１０．３及び１０．４、ＢＡＰＴＡ及びＬＰＣを使用しない通常の流れは図１０．１を、また低流灌流は図１０．２を参照）。一方ＤＰ１６の添加は、房室同調性の完全な又は一時の軽減を与えた（４及び１ケース）。さらに、ＤＰ１６は、灌流期間において著しい心臓保護効果を示した。すなわち、５実験例中、４例において洞調律の完全な回復が見られた（図１１．４、ＤＰ１６を使用しない通常の流れに関しては図１１．１を、低流灌流については図１１．２を参照。）。ＥＣＧ分析は、ＤＰ作用の代謝型に関して主に示している。すなわち、心房性（心拍数の明確な上昇）及び血管性（規則的な洞調律の回復）興奮を増幅する。しかし、ＡＶ伝導性の残存した遅延（増加したＰＱ間隔）が観察された。
結論
この実験で得られたデータは、虚血−再灌流の病理学上のＤＰ１６の顕著な心臓保護作用を示している。
ＤＰ１６の心臓保護効果の研究
２．心筋障害のインビボモデル
方法及び結果
活性なβ−アドレナリン作動性レセプターアゴニストであるイソプロテレノール（ＩＳＯ）は通常実験的な心筋病理学モデルとして使われている。ＤＰ１６の心臓保護効果を８２匹の体重２５０−３５０ｇのSprague-Dawley雌ラットを用いて試験した。心筋障害はＩＳＯ（８５μｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）を連続して二回注射することによりラットに誘導した。場合により、ＩＳＯの注射後、３０分及び１８０分後にＤＰ１６（０．０１μｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を注射した。ＤＰ１６の効果は、ＥＣＧ分析と、血清のグルタミン−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）及びラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の定量して評価を行った。コントロールラットのＩＳＯ投与後の死亡は、１７．１±５．９％（４１例中７例）であった。生存動物は、誘導１及び２のＥＣＧにおいて激症異常ＳＴセグメントを示した。ＥＣＧの病理学的兆候は実験期間において悪化した。第２のＩＳＯの注射後４８時間内に全ての処置を行った動物はＳＴセグメントの病理学的変異を示した。ＤＰ１６の投与は２例の死亡を減少させた（３０例中２例）。ＤＰ１６を投与された動物ではＥＣＧの変質がほとんど見られなかった（ｐ＜０．０５）。ＳＴセグメントの病理学的変位はＥＣＧの２８及び４０％のみで見られた（ＩＳＯ投与後、２４及び４８時間後）。生物化学的定量は、ＩＳＯ処理コントロールラットにおいてＳＧＯＴ及びＬＤＨが１．７−１．９倍増加したことを示した。ＤＰ１６の処置によりＳＧＯＴ及びＬＤＨ活性の異常レベルを示す実験動物の比率が実質的に減少した。
結論
上記のデータは、インビボの心筋病理学モデルにおけるＤＰ１６の著しい心臓保護効果を示している。
一般的結論 ＤＰ１６で表されるプロドラッグは、実験的な卒中及び虚血モデル並びにてんかんモデルにおいて顕著な治療及び保護効果を示し、これは、従来の形態の相当する薬剤を、本発明のプロドラッグの形態で使用する量の１０⁵〜１０⁶倍量用いた時と同じ結果である。
実施例５：プロドラッグ−３の作製
“プロドラッグ−３”は、ここでは１，２−ビス−（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）の１−ミリスチルミリスチルアルコールとの１：１エステルを表し、次のように作製する。ＢＡＰＴＡ（０．５ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（２５ｍｌ、ＣａＨ₂から新しく蒸留したもの）溶液、１−ミリスチルミリスチルアルコール（０．４５１ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．２１６ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、及び４−ジメチルアミノピリジン（０．０２５ｇ、０．２０２ｍｍｏｌ）を５０ｍｌの磁気攪拌子をいれたフラスコ内でアルゴン下、室温で２日間攪拌した。２時間後、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルウレアが沈殿を始めた。反応をＴＬＣ（９０：１０ｖ／ｖクロロホルム：メタノール）でモニターした。生成物のＲ_f値は０．６２である。沈殿物は濾過により除き、濾液を３５℃で減圧濃縮した。残渣を２５ｍｌのクロロホルム：イソプロパノール：水の２：１：２ｖ／ｖ混合物で抽出した。有機層を分離し、１％のＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。これを濃縮し、残渣を１６０×３０ｍｍのキーゼルゲル６０（kieselgel 60, 230-400メッシュASTM）カラムを通し、目的の生成物をクロロホルム：メタノール（９０：１０）で流出した。１−ミリスチルミリスチルアルコールは、Molotkovski, V.G.及びBergelson, L.D. (Biologicheska Chimia, 1982, 8(9): 1256-1262)の方法に従い合成した。プロドラッグ−３のＢＡＰＴＡ−１−ミリスチルミリスチルアルコールエステル結合は、エステラーゼによる分解に感受性である。
実施例６：ＴＶＡ１６の合成及び生物学的性質
“ＴＶＡ１６”は、ここでは、バルプロ酸とコリン誘導体のＲＯＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂Ｏ−Ｐ（Ｏ）₂−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｎ⁺（ＣＨ₃）₂（Ｒはヘキサデカノイルを表す）との１：１エステルを表し、次のように作製する。１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（１．０４ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２５ｍｌ、Ｐ₂Ｏ₅から新しく蒸留したもの）溶液、バルプロ酸（０．１５９ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．２１６ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、及び４−ジメチルアミノピリジン（０．０２５ｇ、０．２０２ｍｍｏｌ）を５０ｍｌの磁気攪拌子及びガラスビーズ（１０ｇ、直径５ｍｍ）をいれたフラスコ内でアルゴン下、室温で２日間攪拌した。２時間後、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルウレアが沈殿を始めた。反応をＴＬＣ（６５：２５：４ｖ／ｖクロロホルム：メタノール：水）でモニターした。生成物のＲ_f値は０．４１である。沈殿物及びガラスビーズは濾過により除き、濾液を３５℃で減圧濃縮した。残渣を２５ｍｌのクロロホルム：イソプロパノール：水の２：１：２ｖ／ｖ混合物で抽出した。有機層を分離し、１％のＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。これを濃縮し、残渣を１６０×３０ｍｍのキーゼルゲル６０（kieselgel 60, 230-400メッシュASTM）カラムを通し、目的の生成物をクロロホルム：メタノール：水（６５：２５：４）で流出した（Ｒ_f＝０．４）。
ＴＶＡ１６の試験試料を、メトラゾール（８０ｍｇ／ｋｇ）のｓ．ｃ．投与１時間前にｉ．ｐ．（０．０１−１００ｍｇ／ｋｇ）で３匹のマウス群に投与した。効果的な量とは、次の３０分間における痙攣（動物一匹につきスコア２ポイント）及び／又は死亡（動物一匹につきスコア１ポイント）の阻止量である。これを基に、ＥＤ₁₀₀を計算することができ、次の表の既知の抗痙攣剤と比較する。既知の薬剤及びＴＶＡ１６の抗痙攣活性（ＥＤ ₁₀₀ 、ｍｇ／ｋｇ）

上記のデータから、ＴＶＡ１６が顕著な抗痙攣作用を示し、バルプロン酸ナトリウムの５００倍以上も活性があることがわかる。
本発明は特別な例を挙げたが、当業者らは、種々の変化及び修飾を行うことが可能であると認めるであろう。従って、本発明は、特別な実施態様に限定されるものではなく、本発明の観点、精神及び概念は次の請求の範囲を参照することにより簡単に理解されうる。

Claims (3)

1. 細胞内輸送補助剤にエステル結合した抗てんかん剤を含む薬学的に許容される細胞膜浸透性プロドラッグであり、該抗てんかん剤がてんかんの治療に有効であるバルプロ酸であり、該細胞内輸送補助剤が、リゾホスファチド酸のヒドロキシ−Ｃ _2-6 −アルキルエステル、リゾプラズマローゲン、リゾホスホリピッド、リゾホスファチド酸アミド、グリセロリン酸、リゾ−ホスファチダルエタノールアミン、リゾ−ホスファチジルエタノールアミン並びに上記アミンのＮ−モノ−及びＮ，Ｎ−ジ−（Ｃ _1-4 ）−アルキル体及び４級化誘導体から選択される少なくとも一種の薬学的に許容されるアルコールであり、及び該エステル結合が疾病細胞内の異常酵素活性により切断されることを特徴とする上記プロドラッグ。
2. 該抗てんかん剤が１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グロセロ−３−ホスホリルコリンに共有結合している、請求の範囲第１項に記載のプロドラッグ。
3. 治療学的に有効量の、請求の範囲第１または２項に記載のプロドラッグと薬学的に許容される希釈剤または担体を含む、てんかんを治療するための医薬組成物。

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