HU221678B1 - Szupranormál intracelluláris enzimaktivitással összefüggő betegségek kezelésére alkalmas prodrugok - Google Patents

Szupranormál intracelluláris enzimaktivitással összefüggő betegségek kezelésére alkalmas prodrugok Download PDF

Info

Publication number
HU221678B1
HU221678B1 HU9502866A HU9502866A HU221678B1 HU 221678 B1 HU221678 B1 HU 221678B1 HU 9502866 A HU9502866 A HU 9502866A HU 9502866 A HU9502866 A HU 9502866A HU 221678 B1 HU221678 B1 HU 221678B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
prodrug
acid
ester
intracellular
carboxylic acid
Prior art date
Application number
HU9502866A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9502866D0 (en
HUT73669A (en
Inventor
Alexander Kozak
Original Assignee
D-Pharm Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by D-Pharm Ltd. filed Critical D-Pharm Ltd.
Publication of HU9502866D0 publication Critical patent/HU9502866D0/hu
Publication of HUT73669A publication Critical patent/HUT73669A/hu
Publication of HU221678B1 publication Critical patent/HU221678B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/10—Phosphatides, e.g. lecithin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A61K47/544—Phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány tárgya gyógyszerészetileg elfogadható sejtmembrán-permeábilis prodrug, amely gyógyszerészetileg aktív karbonsav és egyhidroxilcsoportot vagy -csoportokat tartalmazó intracelluláristranszportáló adjuváns észtere, amelyben az említett karbonsavvalpronsav vagy annak sója, vagy egy (HOOC–CH2)2–N–A–N–(CH2–COOH)2képletű sav – a képletben A jelentése –CH2–CH2–, –CH2CH2–O–CH2–CH2–O–CH2–CH2– vagy –CR?CR–O–CH2–CH2–O–CR'?CR'– ahol az R–R és R'–R'szubsztituenspárok együttesen a hozzájuk kapcsolódó –C?C– csoporttalegy benzolgyűrűt alkotnak – vagy ezek sói, és az említettintracelluláris transzportáló adjuváns 7–32 szénatomos egyértékűalkohol vagy egy ROCH2–CH(OH)–CH2O–(PO2)–OCH2N+(CH3)2 általánosképletnek megfelelő foszfatidil-kolin-származék – a képletben Rjelentése 3–20 acilcsoport. ŕ

Description

A találmány tárgya gyógyszerészetileg elfogadható sejtmembrán-penneábilis prodrug, amely gyógyszerészetileg aktív karbonsav és egy hidroxilcsoportot vagy -csoportokat tartalmazó intracelluláris transzportáló adjuváns észtere, amelyben az említett karbonsav valpronsav vagy annak sója, vagy egy (HOOC-CH2)2-N-A-N-(CH2-COOH)2 képletű sav - a képletben A jelentése -CH2-CH2-, -CH2CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2- vagy
-CR=CR-O-CH2-CH2-O-CR’=CR’- ahol az R-R és R’-R’ szubsztituenspárok együttesen a hozzájuk kapcsolódó C=C- csoporttal egy benzolgyűrűt alkotnak - vagy ezek sói, és az említett intracelluláris transzportáló adjuváns 7-32 szénatomos egyértékű alkohol vagy egy
ROCH2-CH(OH)-CH2O-(PO2)-OCH2N+(CH3)2 általános képletnek megfelelő foszfatidil-kolin-származék - a képletben R jelentése 3-20 acilcsoport.
A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 11 lap ábra)
HU 221 678 B1
HU 221 678 Β1
A találmány szupranormál intracelluláris enzimaktivitással kapcsolatos humán betegségek és állapotok kezelésére alkalmas prodrugokra vonatkozik.
Számos humán betegség, igy ischaemia, stroke, epilepszia, asztma és allergia kapcsolatban van a sejt túlin- 5 gerlésével (hyperexcitatio), ami a leírásunk értelmében bizonyos intracelluláris enzimek abnormálisán megnövekedett szintjét jelenti. így például az ezen állapotokkal kapcsolatos szupranormál intracelluláris foszfolipázok működése következtében a sejtmembránok össze- 10 roppannak. A jelen farmakológiai irányzatok ennek megfelelően ezen káros degradációs aktivitás gátlására irányulnak.
Hasznos lenne szelektíve megcélozni az enzimhiperaktivitás révén károsodott sejteket oly módon, hogy 15 a farmakológiailag hatásos molekulát egy prodrug formájában a sejtbe vezetik, igy a hiperaktivitás hatna a prodrugra, és a farmakológiailag hatásos molekula inkább a beteg sejtekben, mint az egészséges sejtekben akkumulálódik. 20
A farmakológiailag aktív molekulák közé tartoznak a korlátozás szándéka nélkül a kalciummegkötő szerek, amelyek számos előnnyel rendelkeznek a jelenleg a kalciummal Összefüggő betegségek kezelésére használatos hatóanyagokhoz viszonyítva. 25
Az intracelluláris kalcium egy fontos meghatározója a sejtpusztulásnak, függetlenül a sejtet éró kezdeti támadásoktól. Ennek szerepe lehet a limfociták és ólósejtek által közvetített célsejtkárosodásoknál a sejtpusztulásban, a transzplantáció során a szervkárosodásokban 30 és más egyéb típusú szövetkárosodásokban, beleértve az ischaemiás sérüléseket. A szövetkárosodásokkal szembeni védelemre vagy a szövetkárosodások csökkentésére kalciumcsatorna-blokkolókat vagy kalciumkelátorok sejtmembrán-permeábilis formáit java- 35 solták. így a jelen találmány szerinti megoldás potenciálisan felhasználható (a kalciumkelátorok esetében) az ilyen körülményekkel kapcsolatban.
Nyilvánvaló az is, hogy hasonló megfontolások alapján a találmány szerinti megoldás alkalmazható az 40 intracelluláris kalciumionszinttel kapcsolatos betegségektől eltérő állapotok és betegségek kezelésére is. Példaképpen említjük azt, ha a prodrugmolekula aktív része egy proteinkináz-inhibitor, a prodrug adagolása után az inhibitor az abnormális proliferációt mutató sejt- 45 ben akkumulálódik, és így egy potenciálisan fontos eszközt jelent a tumorellenes terápiában.
A gyógyszerfejlesztések területén a prodrugok alkalmazása, amelyek a kívánt jellemzőket biztosítják ismert hatóanyagoknak, igy például megnövekedett bio- 50 hozzáférhetőséget vagy megnövekedett helyspecificitást, egy ismert megoldás. A különböző lipidek alkalmazása meghatározott típusú prodrugok előállításánál szintén ismert a szakterületen. A prodrugok ezen területén azonban egyikre sem volt jellemző, hogy elsődlegesen 55 a hatóanyagot a szerv megbetegedett sejtjeiben akkumulálnák, az intracelluláris lipázok aktiválása révén. Ezeket a hatóanyagokat inkább specifikus helyekre szállítják vagy egy specifikus szervben biztosítják a felszabadulást. így például a WO 91/16920 számú szabadalmi 60 leírásban szalicilátok és nemszteroid gyulladásgátló szerek foszfolipidekkel alkotott prodrugjait ismertetik, amelyek orális adagolásnál védik a gyomornyálkahártyát, és a hatóanyag a belekben szabadul fel.
A WO 90/00555 és WO 93/00910 számú szabadalmi leírásokban vírusellenes hatóanyagokat tartalmazó foszfolipid-prodrugokat ismertetnek, amelyeket liposzómákba vagy más micellás sejtekbe építenek be, igy elősegítik azok felvételét, például makrofágok vagy májsejtek által.
Általában a vírusfertőzés nincs kapcsolatban szupranormál foszfolipázaktivitással, így például a WO 90/00555, WO 93/00910 számú szabadalmi leírásokban, valamint a következő irodalmi publikációban:
NTIS Technical Notes, no. 9, 630, Springfield, Virginia, US, 1984, ismertetett vírusellenes nukleotidokat vagy antiszenz oligonukleotidokat és foszfolipideket tartalmazó konjugátumokkal kapcsolatosan sem történik emlités, hogy azok megbetegedett sejtekben vagy fertőzött sejtekben aktiválódnának
Más típusú specifikus prodrugok is ismertek, ilyenek az US 5 149 794 számú szabadalmi leírás szerinti prodrugok, ezek a vírusellenes és daganatellenes nukleotidokat az intracelluláris organellekhez irányítják. Az EP A-325 160 számú szabadalmi leírásban ismertetett prodrugok lipideket és ACE-inhibitorok glicerin-észtereit tartalmazzák, ezek micellákat alkotnak, amelyek a belekből a limfatikus rendszerbe abszorbeálódnak, így? jelkerülik a májat, és megnő a központi idegrendszerhez !
való jutásuk, ezeket a prodrugokat magas vérnyomás és ? f észlelési zavarok kezelésére alkalmazzák. Az ACE- | inhibitorok enzimatikus hasításon mennek át, és terá- - ;
piás hatásukat extracellulárisan fejtik ki. |.
A szakterületen további lipofíl hordozók is ismertek,: t amelyek elősegítik az intracelluláris transzportot, ilyene- | két ismertetitek a CH A-679856 számú szabadalmi le- f írásban, ahol szaliciloil-kamitin alkalmazását ismertetik fájdalomcsillapításra, továbbá a WO 89/05358 számú szabadalmi leírásban, ahol módosított organonukleotid antiszenz hatóanyagokat ismertetnek, amelyeket apoláros csoportokhoz, így például fenil- vagy nafiilcsoporthoz kötve juttatnak be a sejtekbe.
A fentiek alapján a találmány célja prodrug biztosítása, amely szelektíven képes a hiperaktivált sejtekben farmakológiailag aktív anyag akkumulálására. A találmány célja továbbá farmakológiailag aktív vegyület biztosítása, amely a prodrugból a célsejtekben az enzimaktivitásra történő válaszképpen szabadul fel. A találmány további célja annak biztosítása, hogy a relatíve megnövekedett enzimaktivitású sejtben szelektíve akkumulálódott farmakológiailag aktív anyag befoglalódjon a sejtbe, és ily módon egy megnövekedett aktivitást fejtsen ki ott.
A fentiek alapján a találmány egy prodrugra vonatkozik, amely egy gyógyászatilag aktív anyag, és egy intracelluláris transzponálásra alkalmas adjuváns kovalens konjugátuma, és amelyre jellemző, hogy a kova- j lens kötés intracelluláris enzimaktivitással szemben |g hasításérzékeny.
A találmány szerinti megoldás alkalmas humán j~ egyedek kezelésére, akik szupranormál intracelluláris
HU 221 678 Bl enzimaktivitással kapcsolatos betegségben szenvednek, e kezelésnél a betegnek gyógyszerészetileg elfogadható sejtmembrán-permeábilis prodrugot adagolunk, amely egy sejtmembrán-impermeábilis gyógyászati hatóanyag, és egy intracelluláris vivőanyag (transzportáló adjuváns) kovalens kötésű konjugátuma, és jellemzője, hogy a kovalens kötés az intracelluláris enzimaktivitással szemben hasításra érzékeny, úgyhogy a kötés az ilyen aktivitás hatására bomlik, amikor is a gyógyhatású anyag a szupranormál intracelluláris enzimaktivitású sejten belül szelektíve akkumulálódik, és az említett prodrugot a kezelés során a szupranormál enzimaktivitás csökkentésére hatásos mennyiségben adagoljuk.
A találmány vonatkozik továbbá a gyógyászatilag elfogadható sejtmembrán-permeábilis prodrug alkalmazására szupranormál intracelluláris enzimaktivitással kapcsolatos humán betegségek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállításánál, amely prodrug egy gyógyászatilag aktív hatóanyag és egy intracelluláris transzportáló adjuváns kovalens konjugátuma, és jellemzője, hogy a kovalens kötés az intracelluláris enzimaktivitással szemben hasításra érzékeny, úgyhogy a kötés az ilyen aktivitás hatására bomlik.
Közelebbről, a találmány tárgya gyógyszerészetileg elfogadható sejtmembrán-permeábilis prodrug, amely gyógyszerészetileg aktív karbonsav és egy hidroxilcsoportot vagy -csoportokat tartalmazó intracelluláris transzportáló adjuváns észtere, amelyben az említett karbonsav valpronsav vagy annak sója, vagy egy (HOO€-CH2)2-N-A-N-(CH2-COOH)2 képletű sav - a képletben A jelentése -CH2-CH2-, -CH2CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2- vagy -CR=CR-O-CH2-CH2-O-CR’=CR’- ahol az R-R és R’-R’ szubsztituenspárok együttesen a hozzájuk kapcsolódó -C=C- csoporttal egy benzolgyűrűt alkotnak - vagy ezek sói, és az említett intracelluláris transzportáló adjuváns 7-32 szénatomos egyértékű alkohol vagy egy ROCH2-CH(OH)-CH2O-(PO2)-OCH2N+(CH3)2 általános képletnek megfelelő foszfatidil-kolin-származék - a képletben R jelentése 3-20 acilcsoport
A találmányt közelebbről a következő részletes leírással és ábrákkal illusztráljuk.
Az 1. ábra a találmány szerinti vegyület hatásának grafikus ábrázolása humán limfociták intracelluláris szabad Ca2+-szintjére.
A 2. ábrán a globális agyi ischaemiából való felépülést mutatjuk be a találmány szerinti vegyület jelenlétében vagy anélkül.
A 3. ábrán a pilocarpine-nal indukált epileptikus események különbözőségét mutatjuk be a dózis függvényében.
A 4. ábrán a pilocarpine-nal indukált epileptikus eseményekkel szembeni védelmet mutatjuk be, amelyet a találmány szerinti vegyülettel biztosítunk.
Az 5. és 6. ábrákon bemutatjuk a találmány szerinti vegyületek által biztosított védelmet bizonyos szívműködéseknél vagy a koronáriás edények tónusszabályozásának eltolódásában bekövetkező hosszú idejű elváltozásokkal szemben, amelyeket pilocarpine adagolása okoz.
A 7. ábrán a pilocarpine-károsított szív felépülését mutatjuk be egy ischaemiareperfúziós modellben a találmány szerinti vegyület adagolása esetén.
A 8. ábrán a metrazol minimumkárosodási tesztben a találmány szerinti vegyület védőhatását mutatjuk be.
A 9., 10. és 11. ábrákon a hipoxiareperfúziós kardiopatológiás kísérletek eredményeit mutatjuk be.
A farmakológiailag aktív vegyület tehát egy farmakológiailag aktív, valamely fentiek szerinti karbonsav, és az adjuváns egy farmakológiailag elfogadható, fentiek szerinti OH-csoportot tartalmazó vegyület.
Egy nem korlátozó kiviteli formánál a találmány szerinti prodrug egy kalcium kelátkötő szert tartalmaz, és így potenciálisan felhasználható a túlzottan magas intracelluláris Ca2+-ionokkal kapcsolatos betegségek és állapotok kezelésére. Egy különösen előnyös kiviteli formánál a prodrug legalább egy kovalens kötést tartalmaz a farmakológiailag aktív vegyület és az intracelluláris transzportáló adjuváns között, amely kovalens kötés az intracelluláris enzimaktivitásra hasitásérzékeny, és ennek következtében a prodrugmolekula nagyobbik része könnyen mozog ki-be a normálsejtekből az emlí* tett kötés hasítása nélkül, míg a szupranormál enzimek* tivitású sejtekben a sejtekbe belépő prodrugmolekulák nagy részében a hasításérzékeny kötés elhasad, és így az intracellulárisan akkumulálódik, és az abnormális sejtbe befoglalódik, mivel az sejtmembrán-impermeábilis. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldás alkalmazható más betegségeknél is, amelyek nem szükségszerűen a kalciumionok intracelluláris feleslegével kapcsolatosak, és ilyen más esetekben a prodrug egy másik hatóanyagot foglal magában, amely nem kalciumkelátor, de amely más egyéb, kívánt farmakológiai aktivitással rendelkezik.
A találmány szerinti prodrugban a kalciumkelátor lehet például egy részlegesen vagy teljesen észterezett karbonsav, például a következők észtere:
(a) (HOOC-CH2-)2-N-A-N-(-CH2COOH)2 általános képletű gyógyászatilag elfogadható kalciumkelátor, amely képletben -CH2-CH2~, -CH2CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2- vagy -CR=CR-O-CH2-CH2-O-CR’=CR’- ahol az R-R és R’-R’ szubsztituenspárok együttesen a hozzájuk kapcsolódó -C=C- csoporttal egy benzolgyűrűt alkotnak és (b) egy 7-32 szénatomos egyértékű alkohol vagy egy ROCH2-CH(OH)-CH2O-(PO2)-OCH2N+(CH3)2 általános képletnek megfelelő foszfatidil-kolin-származék - a képletben R jelentése 3-20 acilcsoport valamint a részlegesen észterezett karbonsavak alkálifémekkel alkotott sói, valamint az egy vagy több sóképzésre alkalmas nitrogénatomot tartalmazó észterezett karbonsavak savaddíciós sói.
HU 221 678 Bl
A fentiekben említett észter lehet egy olyan észter, amelyben az A csoport például egy -(CH2CH2)- képletű csoport; továbbá jelentbet
-CR=CR-O-CH2CH2-O-CR’=CR’ - csoportot, ahol mindegyik R-R és R’ -R’ pár a hozzájuk kapcsoló- 5 dó -C=C- csoporttal egy benzolgyűrűt képeznek.
Egy különösen előnyös kiviteli formánál az A csoport jelentése például -CH2CH2- vagy -CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-csoport; vagy a jelentése lehet például 10
-CR=CR-O-CH2CH2-O-CR’=CR’- csoport, ahol az R-R és R’-R’ párok együttesen a hozzájuk kapcsolódó —C—C— csoporttal egy benzolgyűrűt alkotnak.
A találmány szerinti prodrug kalciumkelátorként előnyösen például valamely következő vegyületet tartalmaz- 15 za: etilén-l^-diamin-N,N,N’,N’-tetraecetsav, etilén-1,2diol-bisz(2-amino-etil-éter)-N,N,N’,N’-tetraecetsav vagy l,2-bisz(2-amino-fenoxi)-etán-N,N,N’,N’-tetiaecetsav.
A 7-32 szénatomos szekunder alkoholok közül példaképpen említjük az 1-mirisztil-mirisztil-alkobolt. 20 A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti prodrugot oly módon lehet megválasztani, hogy a kívánt farmakológiailag aktív rész az enzim hatására szabaduljon fel, amelyről ismert, hogy a kezelendő betegségben az enzimhiperak- 25 tivitás forrása. így például azt találtuk, hogy a membránnal kapcsolatos kalciumfüggetlen plazmalogénszelektív PLA2-aktivitás több mint 400%-kal növekedett 2 perces globális ischaemia alatt (P<0,01), több mint tízszeresére nőtt (közel a maximumhoz) már 5 perccel 30 az ischaemiát követően, és aktivált állapotban maradt a teljes vizsgált ischaemiás intervallumban (max.
perc) (Ford és munkatársai, J. Clin. Invest., 88 (1): 331-5 (1991)]. Ez a tény sugallja, hogy az aktív molekularészt a glicerofoszforsav-szánnazék 2-helyzetében 35 kapcsoljuk, és hogy egy lizoplazmalogén alkalmazása valószínűleg hatásosabb lehet intracelluláris transzportáló adjuvánsként, amelyhez az aktív rész kovalens módon kapcsolódik, mint a lizofoszfolipid.
Minden, a sejtmembrán károsodását kiváltó ese- 40 mény (például citotoxikus kemikáliák, fizikai stimulusok és fertőző hatású szerek) kiválthat egy fokozatos és végül is az ischaemiás állapotokra jellemző folyamatokat [Robbins és munkatársai, Pathological Basis fór Disease, 10. oldal, W. B. Sanders Co. (1984)]. A talál- 45 mány szerinti prodrug potenciálisan alkalmazható ilyen körülmények között a sejtek védelmére azáltal, hogy intracellulárisan egy kalciumkelátort vezetünk be. Ezzel kapcsolatban megjegyezzük, hogy a tumorellenes hatású adriamicin, amelyről leírták, hogy gátolja az 50 Na-Ca cserét, és túlterheli a saicoplazmát kalciummal, kontraktilis szívelégtelenséget okozhat, ez konzisztens azzal a hipotézissel, hogy a kalcium-túlterhelés, ischaemia nélkül, egy hosszan tartó kontraktikus diszfunkciót válthat ki [Kusuoka és munkatársai, J. Cardiovasc. 55 Pharmacol., 18 (3): 437-44(1991)].
Mint azt már a fentiekben emlitettük, a találmány szerinti megoldás nem korlátozódik az intramolekuláris Ca2+-ionok szintjével kapcsolatos állapotok vagy betegségek kezelésére, ily módon a találmány értelmében fel- 60 használásra kerülő anyagok nem korlátozódnak a kalciumkelátorokra. így például a gyógyászatilag aktív anyag lehet egy antiepileptikus anyag, igy például egy vaipronsav. Ezzel kapcsolatban feltételezhető, hogy a találmány szerinti megoldás alkalmazásával lehetővé válik egy sokkal alacsonyabb hatásos valpronsavdózist alkalmazni, mint amilyet más esetben alkalmaznának, és így potenciálisan csökkenteni a nemkívánatos mellékhatások előfordulását. Elvileg bármelyik alkoholtípus vagy azok példái, amelyeket például a kalciumkelátorok észterezésével kapcsolatban említettünk, alkalmazhatók a vaipronsav észterezéséhez is a találmány értelmében. A korlátozás szándéka nélkül említjük például, hogy a vaipronsav észterezhető például l-heptanoil-5/i-glicero-3-foszforil-kolinnal.
A következő példákban bemutatott és alkalmazott prodrugok fizikai jellemzőit az alábbiakban adjuk meg:
1. vegyület: l-sztearoil-2-[l’,2’-bisz(2”-amino-fenoxi)etán-N,N ’ ,N ’-triecetsav-n-acetil]-sn-glicero-3foszfatidil-kolin-trinátrium-só számított: C 49,87%, P 2,68%, mért: C 49,70%,
P 2,39%, számított: C 58,15%, P 4,06%, mért: C 58,41%,
P 3,87%, ‘H-, 3*P- és 23Na-NMR-spektrum:
‘H-NMR, δ ppm (CD3OD): 0,88-0,94 (t, 3H), 1,30 (széles s, 28H), 1,56-1,63 ((m, 2H), 2,28-2,34 (t,
3H), 3,18 (s, 9H), 3,58-3,74 (2m+2s, 6H),
3,82-4,00 (2s, +m, 7H), 4,06-4,20 (m, 3H),
4,33-4,52 (m, 5H), 5,06 (m, 1H), 6,92-7,12 (számos m, 8H).
3*P-NMR, δ ppm (CDC13): 0,48 (s).
23Na-NMR, δ ppm (CD3OD): 5,0-5,9 (széles s). UV-spektrum:
UV-Vis (CH3OH), (nm): 255,289.
Elemanalízis a C48H73N3O16PNa3.6H2O összegképletü vegyületre:
H 7,36%, N 3,64%,
Na 5,97%
H 7,09%, N 3,80%,
Na 5,41%.
2. vegyület: l,2-bisz(2-amino-fenoxi)etán-N,N’ecetsav-N,N’-di{L-a-[2-trimetil-ammonio)etil-foszforil-fi-gliceril-Y-sztearoil]acetát}-N,N’-nátrium-só. ‘H-NMR, δ ppm (CD3OD): 0,87-0,91 (t, 6H), 1,27 (s, 56H), 1,54-1,56 (m, 4H), 2,24-2,29 (t, 4H),
3,15 (s, 18H), 3,53-3,56 (m, 4H), 3,97-4,01 (m+s,
9H), 4,08-4,19 (m, 9H), 4,33-4,37 (m+s, 6H),
5,12-5,18 (m, 2H), 6,89-7,03 (m, 8H).
3*P-NMR, δ ppm (CD3OD): 2,09 (s).
23Na-NMR, δ ppm (CD3OD): -12-+3 (s).
UV-vis (CH3OH), (nm): 255, 289.
MS (FAB); C^H^O^, MH+ 1488,2, (M-H)1486,3, MNa+ 1510,2 (MNa-H)- 1509,3 Elemanalízis a C74H,27N4O22P2Na.H2O összegképletü vegyületre·.
H 8,45%, N 3,67%,
Na 1,50%
H 8,79%, N 3,60%,
Na 1,23%.
3. vegyület: l-hexadekanoil-2-valproil-sn-glicero3-foszfatidil-kolin (=TVA16) ‘H-NMR (CDC13), δ (ppm): 0,84-0,89 (m, 9H), 1,24 (széles s, 28H), 1,28-1,40 (m, 2H), 1,52-1,57 (m,
HU 221 678 Bl
4H), 2,22-2,26 (t, 2H), 2,32-2,36 (m, IH), 3,34 (s,
9H), 3,77 (széles s, 2H), 3,84-4,00 (két m, 2H),
4,06-4,11 (m, IH), 4,18 (széles s, 2H), 4,40-4,44 (d, IH), 5,17-5,19 (m, IH).
3'P-NMR (CDC13), δ (ppm): 0,30 (s). 5
UV-Vis-spektrum, λ„,Μ (nm): 211,4.
MS (APCI): CjjH^NOgP, (MH)+ 622,5.
LogD (oktanol/sóoldat) 1,17
Elemanalizis a C32H64NO8P.H2O ősszegképletű vegyületre: 10 számított: C 60,00%, H 10,31%, N2,18%,
P4,48% mért: C 59,95%, H 10,34%, N2,01%,
P4,78%.
1. példa
Prodrug-1 és prodrug-2 előállítása
Bevezetés
A „prodrug-1” elnevezés az l,2-bisz(2-amino-fenoxi)-etán-N,N,N’,N’-tetraecetsav (BAPTA) és az 20 ROCH2-CH(OH)-CH2O + -(PO2)-OCH2N(CH3)2 kolinszánnazék - a képletben R jelentése heptanoil csoport -1:1 arányú (mono-) észtere. A BAPTA egy kalciumkelátor, amellyel szemben a humán sejtmembrán normálesetben impermeábilis, mig a sejtmembrán- 25 permeábilis a prodrug-l-re nézve, amely önmagában nem kalciumkelátor. A prodrug-l-ben lévő karbonsavészter-kötés PLA2-vel emészthető, így az aktivált sejtek, így például az IgE-limfociták szelektíve intracellulárisan akkumuláljuk a BAPTA-t, viszonyítva az aktivá- 30 lattan sejtekhez, ennek az az eredménye, hogy a (Ca2+)j-szint az aktivált sejtekben csökken az aktiválatlan sejtekhez viszonyítva. A prodrug-2 a BAPTA és az említett kolinszármazék 1:2 arányú (di)észtere.
Eljárás (a) Diheptanoil-L-a-lecitin
Egy 500 ml-es száraz háromnyakú, olajzárású keverővei, CaCl2-csővel és csöpögtetőtölcsérrel ellátott lombikba bemérünk 100 ml 5 mm átmérőjű üveggyöngyöt 40 és 11,0 g, 0,01 mól szintetikus L-a-glicerofoszforil-kolin CdCl2-adduktumot. A lombikot jeges vízfürdőbe merítjük, majd a gyorsan kevert keverékhez vékony sugárban 29,7 g, 0,2 mól frissen előállított heptanoil-kloridot adagolunk 60 ml kloroformban* oldva, majd 11 ml, 45 0,14 mól vízmentes piridint 100 ml kloroformban* oldva (*vízmentes, alkoholmentes). 30 perc elteltével a hőmérsékletet 25 °C-ra emeljük, és a keverést 2 órán át folytatjuk. A reakciókeveréket egy szűrő nélküli Buchner-tölcséren keresztülöntjük, az üveggyöngyöket 50 átmossuk 3x50 ml kloroformmal, majd a szűrleteket egyesítjük, és centrifugáljuk. A felülúszót csökkentett nyomáson betöményítjük, a visszamaradó anyagot néhány órán át 0,1 mm-es vákuumban tartjuk 30-35 °C hőmérsékletű fürdőn, a feleslegben lévő piridin eltávolí- 55 tása érdekében, majd elkeverjük 500 ml vízmentes acetonnal 10 percig, majd centrifugáljuk. A kiváló csapadékot hasonlóképpen kezeljük 2 χ 100 ml vízmentes acetonnal és 2 x 100 ml vízmentes éterrel. A visszamaradó szilárd anyagot ezután csökkentett nyomáson szárítjuk, 60 a kadmium-klorid- és piridin-hidroklorid-nyomoktól megszabadítjuk úgy, hogy 200 ml mennyiségű
5:4:1 térfogatarányú kloroform/metanol/víz elegyben feloldjuk. A kapott oldatot egy 120 cm hosszú, 2,5 cm átmérőjű oszlopon átengedjük, amely azonos térfogatú
Amberlite IR-45 és IRC-50 gyanták keverékét tartalmazza. Az oszlopot 500 ml említett kloroform/metanol/víz eleggyel átmossuk, a lejövő eluátumokat szárazra pároljuk csökkentett nyomáson 40-45 °C hőmérsékleten, majd a visszamaradó anyagot 0,1 mm vákuumban 45 °C hőmérsékleten tartjuk. A kapott nyersterméket tisztítjuk, úgy, hogy 50 ml kloroform és 150 ml aceton elegyében kicsapjuk, centrifugáljuk, a csapadékot kloroformból és éterből átkristályosítjuk, így 2,3 g,
47,6% terméket nyerünk (a dioktanoil-L-a-lecitint hasonlóképpen állítjuk elő).
(b) l-Heptanoil-sn-3-glicerqfoszforil-kolin
1,2 mmol, előző (a) pont szerinti terméket feloldunk 196 ml éter és 12 ml metanol keverékében, és erőteljesen keverjük 50 ml, 0,1 mólos, pH=8,7 (HOCH^C-NH^HCl jelenlétében, amely 0,72 mmol CaCl2-t és 5 mg nyers, csörgőkigyóméiget (Crotalus adamenteus) tartalmaz mint foszfolipáz-A2-forrást, °C hőmérsékleten 3 órán át A reakció lefutását TLCvel követjük (70:25:4=kloroform/metanol/víz). A reakció végbemenetele után a szerves fázist elválasztjuk, a vizes fázist éterrel átmossuk, majd liofilizáljuk. A visszamaradó anyagot 2:1 térfogatarányú klorofonn/metanol eleggyel extraháljuk, majd centrifugáljuk. A tiszta fe- t lülúszót elpárologtatjuk, így nyeljük a cim szerinti ve- f gyületet 90%-os kihozatallal. A vékonyréteg-kromatográfia kimutatja (70:25:4 tf=klorofbnn/metanol/víz), hogy az anyagmentes a kiindulási anyagoktól és heptánsavtól. Bármilyen zsírsavat a termékből azonban eltá- ί, volithatunk etanol/éterből végzett kristályosítással. Meg- | jegyzés: ez egy általános módszer a glicerin-2-észter- | kötés hasítására. (Az oktanoil-sn-3-glicero-foszfo- T ril-kolint hasonlóképpen állítjuk elő.) (c) Prodrug-1 és prodrug-2
0,5 g, 1,04 mól előző (b) pont szerinti terméket feloldunk 15 ml kloroformban (frissen desztillálva P2OS felett), és a kapott oldatot BAPTA-t (0,495 g, 1,03 mmol prodrug-1 monoészterhez, vagy 0,248 g, 0,51 mmol prodrug-2 diészterhez) 0,214 g, 1,03 mmol N,N’-diciklohexil-karbodiimidet és 0,025 g, 0,202 mmol 4dimetil-amino-piridint és 20 ml HCONMe2-t (frissen desztillálva CaH2 felett) tartalmazó oldathoz adagoljuk nitrogénatmoszférában, majd a kapott keveréket szobahőmérsékleten 2 napon át keveijük. A reakció végbeme- inetelét TLC-vel követjük (65:35:5 tf=klorofonn/metanol/víz). A kiváló csapadékot szűréssel elválasztjuk, a szűrletet vákuumban betöményítjük 35 °C-on, és a visszamaradó anyagot kloroform/izopropanol/víz 2:1:2 térfogatarányú elegyében feloldjuk. A szerves fázist elválasztjuk, Na2SO4 felett szárítjuk, majd 20 cm hosszú, és 1,8 cm átmérőjű szilikagélt tartalmazó oszlopon (Bio-Sil-Ha) átengedjük Az oszlopot kloroform- (= mai addig mossuk, amíg TLC-re BAPTA-tól mentes, majd gradienseluálást végzünk (kloroform/meta- rz nol=1:1 -> tiszta metanol), az eluálást TLC-vel követ5
HU 221 678 Bl jük. Az eluált frakciókat egyesítjük, majd bepároljuk. A kivánt cím szerinti terméket (azaz prodrug-1 vagy prodrug-2, függően a BAPTA mólekvivalens mennyiségétől) éterből átkristályosítjuk, vákuumban P2O5 felett 30 °C-on szárítjuk, így 0,3 g, 30% terméket nyerünk. Nyilvánvaló, hogy a megfelelő triésztert vagy tetraésztert állíthatjuk elő a BAPTA mólekvivalensének változtatásával (az analóg oktanoil-észtereket hasonló módon állítjuk elő).
2. példa
Prodrug-1 alkalmazása hiperaktivált sejtekben az intracelluláris kalciumszint csökkentésére Módszer
Az intracelluláris szabad (Ca2+)rtartalmat áramlóvérsejt-számlálással mutatjuk ki Ca2+-szenzitív fluo3/AM festék (Molecular Probe Intracelluláris, Or.) alkalmazásával [Minta és munkatársai (1989), Kao és munkatársai, (1989)]. A véradóktól származó vért, valamint asztmás betegtől származó vért kétszer DMEM alkalmazásával mostunk, majd 107 sejt/ml koncentrációra reszuszpendáltuk. A fluo-3/ΑΜ (1 mmol) festéket DMSO-oldatban állítottuk elő, amelyet Pluronic F-127 (Wyandotte Corp., MI) nemionos felületaktív anyaggal kiegészítettünk. A fluo-3/ΑΜ törzsoldatból aliquot részt adagoltunk a DMEM/HEPES sejtszuszpenziókhoz 3 pmol végső koncentrációnak megfelelően (terhelőpuffer). A terhelést 30 percig végeztük 37 °C hőmérsékleten, majd 23 °C hőmérsékleten 1 órán át folytattuk enyhe keverés mellett A sejteket ezután a kívánt koncentrációértékekre állítottuk be friss DMEM/HEPES alkalmazásával, amelyet 2% lószérummal kiegészítettünk. Az autofluoreszcenciát úgy elimináltuk, hogy a küszöbszenzitivitás értékét a fölé az érték fölé állítottuk be, amelyet festék nélkül kaptunk. A fluoreszcens intenzitás! adatokat 5000 egyes sejt alapján határoztuk meg, és az értékeket mint önkényes fluoreszcens egységeket fejeztük ki. A prodrug-11 mmol-os oldatát állítottuk elő dimetilszulfoxidban, és 3 pmol végső koncentrációban adagoltuk a sejtekhez a kalciumkezelést megelőzően.
Eredmények
A véradóktól és az asztmás betegektől származó vér limfocitáit prodrug-l-gyel kezeltük. A sejteken belül a felszabadult BAPTA-kelátor akkumulációját a (Ca2+)r koncentráció meghatározásával becsültük, ezt áramlóvérsejt-számlálással végeztük fluo-3/ΑΜ festék alkalmazásával a fentiekben leírtak szerint. A kapott eredményeket az 1. ábrán mutatjuk be, ahol a (Ca2+)j-szinteket a következőkben határoztuk meg:
normállimfociták (A panel);
normállimfociták prodrug-l-gyel kezelve (B panel);
asztmás betegből származó limfociták (C panel);
asztmás betegből származó limfociták
IgE-vel stimulálva (D panel);
asztmás betegből származó limfociták prodrug-l-gyel kezelve (C’ panel); és asztmás betegből származó limfociták
IgE-vel stimulálva} prodrug-l-gyel kezelve (D’ panel).
Megjegyezzük, hogy az asztmás betegből származó limfociták kettős megoszlásúak a (Ca2+)rszint szerint (C panel). A sejtek kb. 50%-a mutat magas (Ca2+)jszintet, jelezve a sejthiperaktivációt, míg a populáció másik része hasonló a normálhoz (összehasonlítva az A panellel). A C’ és D’ panelek esetén, ahol a sejteket prodrug-l-gyel kezeltük, a hiperaktivált sejtek populációja visszatér a normálértékre, míg a nem aktivált sejtek populációja intakt marad (összehasonlítva a C panellel). A kapott adatokból kitűnik, hogy a prodrug-1 a kelátorszelektív.
3. példa
DP16 előállítása és biológiai tulajdonságai
A DPI6 jelű vegyület BAPTA és egy ROCH2-CH(OH)-CH2O + -OCH2N(CH3)2 általános képletű kolinszármazék 1:1 arányú (mono-) észtere, az említett képletben R jelentése hexadekanoilcsoport. A DP16 vegyületet az 1. példában leírtak szerint állítjuk elő.
DP16 értékelése ischaentiával kapcsolatban
Bevezetés
A nyaki verőerek (karotid artériák) kétoldali elzáródása a legegyszerűbb és a legközvetlenebb lehetőség a globális ischaemia kiváltására. Patkányok esetében 24 órán belül legalább 64%-os a mortalitás. A halál oka túlnyomórészt agyduzzadás (ödéma) és fokális elváltozások (infarktus). A globális ischaemiát a nyaki verőér izolálásával és a nyak ventrális felületének bemetszésével éljük el. Eltávolítjuk a szaliváris nyálmirigyeket, és megnyitjuk a karotidhüvelyt. Mind a vagust, mind a szimpatikus idegeket elválasztjuk a nyaki verőéitől, és azt ezután állandóra elkötjük. 250-300 g tömegű Sprague-Dawleypatkányokat elaltatunk, az altatást halathánnal vagy 0,1 ml Ketamin (0,1 g/ml, Park Davis, UK) és 0,1 ml Rompun (2%, Bayer, FRG) per 300 mg testtömeg, intramuszkuláris injekció formájában történő adagolásával végezzük. A DP16-ot ip. adagoljuk (0,001-0,1 mg/kg), amiken* szükséges, az artériás elkötést követően. Minden kísérleti és kontrollcsoport 14 hím patkányból állt. Statisztikai analízist is végeztünk.
Kísérletek leírása, és az ischaemiateszt vizsgálati eredményei
Embóliás síroké
300 g tömegű Sprague-Dawley-patkányokat halathánnal elaltattunk. A jobb nyaki verőeret feltártuk, és a külső verőeret és pterygopalatinus artériákat No. 0 selyemfonallal elkötöttük. A nyaki verőeret ezután kanülöztűk egy műanyag csővel, amelyet előzőleg heparinizált sóoldattal töltöttünk meg. A kanült ezután megtöltöttük gömböcskeszuszpenzióval (0,5 ml gáztömítésű Hamilton-fecskendő), majd beadagoltunk 0,5 ml sóoldatot. A nyaki verőeret ezután tartósan elkötöttük. A polisztirol 15 pm gömböcskéket 0,05%-os Tween-80 tartalmú normál sóoldattal állítottuk elő, majd ezután 5 percen át sterilizáltuk. 100 μΐ-es aliquot részt vettünk, és azonnal a fecskendőbe adagoltuk.
lsehémia magzati agymodell
A kísérlethez 20 napos terhességű Sprague-Dawley-patkányokat alkalmaztunk. Az állatokat 0,1 ml
HU 221 678 BI
Ketamin (0,1 g/ml, Park Davis, UK) és 0,1 ml Rompun (2%, Bayer, FRG) per 300 g testtömeg intramuszkuláris injekció adagolásával elaltattuk. Abdominális vágást végeztünk, és a két méhszarvat feltártuk, és nedvesen tartottuk a beavatkozás ideje alatt. Ezután az embriókba 5 intracerebrális injekció formájában 1-2 mCi/2 ml [3H]arachidonsavat (Na+, 240 mCi/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) és/vagy 1,5 mCi/2 ml (14C) palmitinsavat (Na+, 819 mCi/mmol, Amersham, Searle, UK) adagoltunk izotóniás sóoldatban, amely 10 NaHCO3-t tartalmazott (1,32 g%), az injekciót a méhfalon keresztül a fontanellába adagoltuk. Rendelésre készített injekciós tűket (33 méret, 0,375” hosszúság, Hamilton, Reno, NV) alkalmaztunk az agyi ödéma csökkentésére. Az injekciók után a magzatokat visszahelyez- 15 tűk az abdominális üregbe a fiziológiai hőmérséklet fenntartása érdekében. 1 óra elteltével véráram-restrikciót végeztünk 20 percen át (restrikciós szakasz) a véredényeknek a placentában való többszörös elkötésével.
Ha szükséges volt, a cirkulációt 30 percre visszaállitot- 20 tűk a csipeszek eltávolításával (reperfüziós szakasz). Minden esetben mind a korlátozott, mind a kontrollművelettel kezelt magzatokat az abdominális üregben tartottuk a sebészi szülést megelőzően. A szülés után, amelyet a méh transzverzális vágásával végeztünk, az élő 25 magzatokat, amelyeknél ödéma nem jelentkezett, leöltük azonnal, majd a magzati agyat kivágtuk, azonnal homogenizáltuk alkalmas szerves oldószerben a további kezeléshez.
Magzati agyféltekés modell 30
A magzatokat eltávolítottuk a méhszarvakból élő állapotban, és az agyféltekéket kipreparáltuk 15 másodpercen belül a lefejezésük után. Az agyféltekéket a vértől megszabadítottuk, az agyburkokat elválasztottuk (50±2,5 mg), és egy 24 lyukú Falcon tenyészlemez lyu- 35 kaiba helyeztük. A szövetet gyorsan kétszer hideg Dulbecco’s Modified Eagle Médium (DMEM, Grand Island Bioi. Co) alkalmazásával átmostuk, majd 37 °Con 0,6-1,2 ml DMEM-ben inkubáltuk, amelyet oxigénnel öblítettünk, és különböző adalékokkal kiegészítet- 40 tűnk. Az inkubációs közegből aliquot részeket vettünk ki (0,1 ml), az eikozanoidmeghatározásra, amelyet radioimmunvizsgálattal (RIA) végeztünk. A mintákat 5 ml hangyasavval megsavanyítottunk, majd 0,1 ml izopropanolt és 0,5 ml dietil-étert adagoltunk, a minta- 45 kát elkevertük, és kis sebességű centrifugálással (2500 xg, 5 perc) a szerves réteget elválasztottuk és nitrogénáramban szárítottuk. A visszamaradó anyagot 0,1 ml nátrium-foszfát-pufferban (pH=7,4), amely még 0,1% szarvasmarha-szérumalbumint is tártál- 50 mázott, feloldottuk, majd egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk a megfelelő pofiidon antiszérum és ^-jelzőanyag (4000 cpm/cső) jelenlétében, 0,3 ml végső térfogatban. A nem megkötött anyagot 0,3 ml dextránbevonatú csontszénnel (Pharmacia, Svédország) kicsap- 55 tűk, majd centrifugáltuk 4 °C-on, és a felülúszó aliquot részét (0,4 ml) eltávolítottuk egy fiolába, szcintillációs folyadékot adtunk hozzá, és Packard Tricarb szcintillációs számlálóval számláltuk. Az embrióagyakba a méhfalon és a fontanellán keresztül [3H]arachidonsavat 60 (240 Ci/mmol) (New England Nuclear, Boston, MA) injektáltunk, amelyet izotóniás NaHCO3-ban oldottunk (1,32 t/tf%). Az injekció után a magzatokat visszahelyeztük az abdominális üregbe a fiziológiai körülmények fenntartása érdekében. 1 óra elteltével a magzatok művi úton megszülettek, és ezután azonnal leöltük őket. Az agyi féltekéket gyorsan kivágtuk, az ezt követő ex vivő inkubáció vagy lipid extrakció céljára.
Eredmények: A kétoldalú globális agyi ischaemia az állatok fokozatos pusztulását eredményezte a műtét után max. 6-7 napon belül. Mint az a 2. ábrán látható, a
DPI 6 fokozta az ischaemia utáni felépülést 250%-kal, viszonyítva a kontrollként alkalmazott nem védett patkányokhoz (p<0,01). Ezekből az adatokból kitűnik a
DP16 potenciális alkalmassága az egyébként végzetes ischaemiás állapotok kezelésére.
Szívischaemia - perfúziós szívmodell
Fehér patkányokat nyaki diszlokációval leöltünk, és a szivüket gyorsan eltávolítottuk, és 60 Hgmm nyomáson módosított Krebs-Henselleit-puffer alkalmazásával reperfüziónak vetettük alá a Langendorff perfúziós szívmodell alkalmazásával. A szívek perfuzióját 10 percen át végeztük, majd azt követően vagy globális ischaemiát váltottunk ki (nulla áramlás), vagy folyamatosan végeztük a perfüziót a megadott ideig. A perfuziót a ventrikuláris szövet gyors kivágásával fejeztük be, és közvetlenül hideg homogenizációs pufferbe j [10 mmol imidazol, 10 mmol KCI, 0,25 mól szacharóz f (1 minőség), pH 7,8] merítettük. Mind a foszfofipáz- í
A2-aktiválást, mind annak reverzibilitását a reperfuzió í alatt időszakosan a myocytikus anaerob metaboüzmus- | bán és az elektronmikroszkóppal végzett analízisben bekövetkező változásokhoz viszonyítottuk.
Koronáriás elzáródás által kiváltott ventrikulárisfibrilláció-modell
11,6-20,7 kg tömegű kutyákat elaltattunk^ és műszereztük a bal körives koronáriás véráram, a bal ventrikulá- f ris nyomás és a ventrikuláris elektrogram meghatározása érdekében. A bal elülső leszállóartériát elkötöttük, és artériás fali myokardiális infarktust idéztünk elő. Minden, a kardiovaszkuláris műszerekhez vezető vezetéket a bőr alatt vezettünk, és a nyak hátsó részénél vezettünk ki.
A műtét utáni fájdalmak, és a gyulladás megelőzése érdekében megfelelő gyógyszereket adagoltunk. Az ischaemiás vizsgálatot 3-4 héten át végeztük.
DP16 tulajdonságai az epileptikus elváltozások kezelésével kapcsolatosan
Kísérleti epilepszia pilocarpinen alapuló modellje Az acetil-kolin, acetil-kolin-észteráz-gátlók és ace- r til-kolin-analógok hatásos epileptogén szerek intracerebrális vagy szisztémás adagolás esetén [Leite és mun- ?
katársai, Neurosci. & Biobeh. Rév., 14: 511-17 (1990)]. Különböző esetekben kimutattuk, hogy muszkarinkolinergiás agonisták szisztémás adagolása elektroenkefalográfiás (EEG) és magatartási limbicus rohamot váltott ki, amelyet egy széles körű agyi károsodás 1 kísért, amely topográfiásan hasonlít a kaininsav és a fa folátok által kiváltottakhoz, amelyeket igen gyakran megfigyeltek boncolt epileptikus humán egyedek esetén. A pilocarpine-injekció formájában történő sziszté7
HU 221 678 Bl más adagolása, amely anyag egy hatásos muszkarinkolinergiás agonista, elő lehet idézni egymást követő magatartásbeli változásokat, beleértve a zavaros beszédet (stirring spells), arci tudattalan működést és motoros limbicus rohamokat, ezek 1 -2 óra alatt fejlődnek ki, és 5 fokozatosan egy limbicus állapottá alakulnak, amelyet általános epileptikus állapot követ.
Eredmények
Közvetlenül a pilocarpine-injekció után az állatok magatartását akinesia, ataxikus tántorgás, arci tudatta- 10 lan működés és szivremegés határozza meg. Az epileptikus jelenségek további kifejlődése dózisföggő (3. ábra).
A pilocarpine 300-350 mg/kg dózisban való adagolása limbicus rohamot (limbic seizures with rearing), mellsőlábi rángást, nyálfolyást, az állkapocs intenzív rágá- 15 sós mozgását és elvágódást vált ki. A motoros limbicus rohamok 20-30 perc elteltével kezdődnek, 2-8 percenként fordulnak elő, és epileptikus állapothoz vezetnek A pilocarpine-dózis 400 mg/kg álékre való emelésekor véget ér a limbicus roham, és 15-25 perccel a magatar- 20 tási változások megindulása után végzetes (generális) tonusos-clonusos rángatódzás következik be. Ezt a dózist tekintjük LD100-dózisnak.
A DP16 adagolása a pilocarpine adagolását megelőzően megakadályozza az állatok elpusztulását, és csők- 25 kenti epileptikus állapotok kifejlett megjelenését. Mint az a 4. ábrából kitűnik, a DP1610~8-10-5 mg/kg dózisban fejti ki terápiás hatását. Erre az adott epilepsziás modellre (pilocarpine 400 mg/kg; patkányok) a becsült terápiás index (ET) a DP16-ra nézve 0,5 mg/kg/5 χ 10-7 30 mg/kg=l χ 106. A kapott adatokból úgy tűnik, hogy a DP16 egy különlegesen ígéretes prodrug az epileptikus elváltozások kezeléséhez.
Pilocarpine és kardiotoxicitás
A pilocarpine-nal kezelt patkányok esetében két ti- 35 pusü pusztulást találtunk, először a végzetes rángatódzás következtében, másodszor egy retardált halál nem közvetlenül az epileptikus jelenségek következtében. Igyekeztünk megérteni a tényleges okát a patkányok késleltetett pusztulásának a pilocarpine-indukált ránga- 40 tódzások után. Ezen állatok makroszkopikus boncolása után kardiopulmonáris károsodások jelét tapasztaltuk: tüdőödéma és hemorrhage, diktált és ugyanakkor deformálódott szív. A szíveket 0,1% Trypan blue-val megfestve a túlélő állatok esetében foltos képletű myokar- 45 diát fedeztünk fel intenzív festékabszorpciós területekkel, azaz károsodott részeket és elmosódott területeket, azaz infarktusokat. így, úgy gondoljuk, hogy a pilocarpine-adagolás után szívkárosodás fejlődik ki, amelyet posztpilocarpine-roham-kardiopátiának (post-pilo- 50 carpineseizure-cardiopathy, PSCP) neveztünk el. PSCP-tanulmányozásokat végeztünk a DP16-tal kapcsolatban in vivő és in vitro patkányoknál, amelyek túlélték az ilyen konvulzív hatású és az alatti pilocarpinedózisokat. 55
PSCP-kísérletek
Kifejlett (2-3 hónapos) hím Sprague-Dawleypatkányokat alkalmaztunk a kísérletekhez. Az állatokat standardtáppal tápláltuk, korlátozás nélkül vizet kaptak, és standard műanyag ketrecekben tartottuk őket (4- 60 egyed mindegyik ketrecben), természetes megvilágításnál. Pilocarpine-skopolamin epileptikus állapotmodellt (pilocarpine) végeztünk a fentiekben leírtak szerint. Egy 23 patkányból álló csoportnak pilocarpine-t adagoltunk ip. különböző dózisokban 100-400 mg/kg testtömeg mennyiségben (B/W), különböző időpontokban, egy második, 17 állatból álló csoportot DP16tal kezeltünk a pilocarpine adagolását megelőzően, amikor is a DP16-ot 30 perccel a pilocarpine adagolása előtt injekcióztuk be, és vizsgáltuk a hatását a következő periódusban.
In vivő EKG-felvételt készítettünk három standardvezetéken (Birthcer-Cardio-Tracer, model 375, USA)
Ketaminaltatás alatt (3,3 mg/kg Imaigene 100, Rhone Merieux, Francé és 7 mg/kg Rompun, Bayer Leverkusen, Németország, im.). Az EKG-felvételeket a pilocarpine-injekciót megelőzően (kontroll), 24 órával a pilocarpine adagolása után (akut periódus), és a kardiális funkciók relatív stabilizációja után, a 3-14. napon a pilocarpine-adagolást követően végeztük. Az EKG-felvételek egy részét nembutalaltatás alatt vettük fel (35 mg/kg ip.), a Langendorff-féle perfúziós izolált szívpreparációt megelőző periódusban. Perfúzióshypoxia-reperfüziós izolált szívmodell (PHR)-vizsgálatot végeztünk a szokásos Langendorff-eljárás szerint j (nem recirkuláló perfúziós rendszer), 37 °C hőmérsékleten, a következő két módosítással: 1. a vizsgálatot kons- j tans perfúziós nyomáson (PP)-60 Hgmm végeztük, J vagy 2. konstans áramlás alatt, az első 10-15 perces í fenti PP-perfúzió után végeztük, az áramlást perisztalti- } kus szivattyú segítségével (Ismatec SA, laboratórium- | stechnic, Svájc) beállítva. Konstans PP esetén az elfő- | lyó áram térfogatát elektronegyensúly (Precisa t
1000C-3000D, Svájc) segítségével mértük. Konstans | áramlás esetén, amelyet a kontrollperiódus alatt határoz- | tünk meg, az áramlás nem változott azt követő kísérleti 1 periódus alatt, és a PP értékét állandóan feljegyeztük. f perccel a kontrollperiódus után a perfuziót 30 percre leállítottuk, és az ezt követő reperfúziós periódus 30 percig tartott. Közvetlenül EKG-felvételt készítettünk a ventrikuláris csúcsról (1 vezeték), a pitvarból (2 vezeték) és a kettő közötti részről (3 vezeték).
A koronáriás véredény-perfuziós ellenállást (CVPR) önkényes egységben állapítottuk meg a következők szerint: PP/áramlás/szív tömeg. A fenti kísérleti eljárás szerint eljárva a szíveket perföziónak vetettük alá Trypan blue festékkel (0,1%), a sejtkárosodás, valamint az infarktus értékelésére.
Eredmények és értékelésük ;
Az EKG in vivő eredményeket az 5. ábrán mutatjuk be, ahol néhány EKG-eseményt ábrázolunk az egyes EKG-k átlagai SE értékben kifejezve a kontrollperiódusban. Az első csoportban látható az EKG-változás a pilocarpine-injekció adagolása után a PSCP akut állapotában: az R-csűcs statisztikusan szignifikáns depressziója látható az 1 és 2 vezetéknél (47% és 16% a } kontrolihoz viszonyítva). A PSCP DP16-tal való kezeié- g se normalizálta az elektrikus aktivitást az akut állapotban 7 kezelt patkány közül 5 esetében. Ismert, hogy az h
EKG-esemény amplitúdója részlegesen kapcsolatban
HU 221 678 BI van a megfelelő fiziológiai folyamat intenzitásával. így az R hullám pilocarpine-indukált változása, és annak DP16-tal való normalizálása tükrözheti a DP16 azon képességét, hogy a ventrikuláris gyengeségre hat legalább PSCP alatt. A kontrollpatkányok esetén az R hullám re- 5 latív normalizálódása 3-14 nappal a pilocarpine adagolása után következett be. Azonban az R-normalizáció valamilyen mértékben korellál a drasztikusan lecsökkent S hullám mélységével a 3 vezetéknél (36%) és a 2 vezetéknél (61%). (Ez utóbbi statisztikusan nem szig- 10 nifikáns a nagy különbségek miatt.) Az S hullám mélységének növekedése tükrözi a myokardiális ischaemiát és esetleges infarktusra utal a pilocarpine-kezelt kontrollállatoknál. Ugyanúgy, mint a PSCP akut állapotában a stabilizációs fázisban, a DP16 gátolja az EKG- 15 változások megjelenését, amelyeket a kontrollpatkányoknál tapasztaltunk. A DP16-tal védett, és a DP16tal nem védett állatok közötti különbség statisztikusan szignifikáns (p<0,01). A PSCP ezen periódusában a pulzus jelentős emelkedése vehető észre, mind a 20 kontrollpilocarpine esetén, mind a DP16-kezelt állatok esetén. Ez a tachykardia esetlegesen kapcsolatban van hemodinamikus elégtelenséggel, ami jellemzője az inkfarktusos patofiziológiának. így az in vivő EKGvizsgálatoknál a pilocarpine-injekciót követő hosszú 25 időtartam alatt határozott kardiális funkcióváltozások (PSCP) voltak megállapíthatók, amely bizonyos állatoknál DP16-kezeléssel javítható.
Langendorff-féle szívmodell
A 6. ábrán bemutatjuk a koronáriás véredény-per- 30 fúzió ellenállásértékeket (Coronary Vessels Perfúsion Resistance (CVPR)) izolált Langendorff-szíveken.
A kontroll esetén az első 30 percben az izolált Langendorff-szivek CVPR-értéke állandóan növekszik, és ez a növekedés statisztikusan szignifikáns 20 perc után. 35 Minden szív esetén, amelyet a pilocarpine-adagolás után perfúziónak vetettünk alá, a kezdeti perfúziós áramlás nagyobb volt, mint a kontroll esetén, és az ezt követő CVPR szignifikáns mértékben csökkent (alsó vonal). A koronáriás véredénytónus ezen csökkenése 40 feltehetően kapcsolatban van az intrakardiális noradrenalinhiánnyal vagy paralízissel, amelyet hipoxia vált ki. A patkányok DP16-tal való kezelése a pilocarpineadagolást megelőzően meggátolja CVPR-szabályozás károsodását mind a kezdeti, mind a végső perfúziós pe- 45 riódusban, és ez bizonyítja a DP16 azon képességét, hogy normalizálja a koronáriás véredényműködést hipoxiás körülmények között. A perfúzió 30 percre való megszüntetése, és az ezt követő reperfúziót jellemzik a jól ismert kardiális károsodási események, amelyeket 50 egy önkényes skála szerint értékeltünk, ez látható a
7. ábrán. A nem kezelt patkányokból álló kontrollszivek túlnyomórészt felépülnek a perfúzió leállítása után, és az elváltozások egy elkülöníthető sorával (myokardiális ingerlékenység, vezetőképesség és összehúzódá- 55 si képesség). A kontrollcsoportoknál a felépülés átlagos száma 6,3±0,6 (n=7). A pilocarpine-nal kezelt patkányok szive esetén a PSCP különböző állapotaiban a patológiás események spektrumában és komolyságában egy növekedés volt kimutatható, a felépülés átla- 60 gos pontértéke 3,3±0,8, n=7, p<0,05. A felépülést gyakran követte ventrikuláris fibrilláció. A szívek közül néhány nem épült fel teljesen, vagy csak az atriális aktivitását nyerte vissza. A pilocarpine-adagolást megelőző DP16-kezelés fokozta a károsodott sziveknek a felépülésre való képességét a reperfúzió megszüntetése után: az átlagos pontérték 6,4±0,6 (n=9). A patkányok ezen csoportjánál gyakran tapasztaltuk a teljes felépülést. így a DP16-kezelés a pilocarpine-nal indukált szívkárosodásnál (PSCP) jelentős mértékben javítja a szívműködést.
DP16 epilepsziaellenes hatásának vizsgálata:
Metrózol minimális károsodási teszt
Eljárás
A DP16 vizsgálatát mint lehetséges epilepszia elleni hatóanyagot 3-4-hetes hím BALB/c egereken végeztük (18-27 g). Az egereket megfelelő diétán tartottuk, és korlátozás nélkül ehettek és ihattak, kivéve röviddel a kísérletet megelőző periódus alatt. Az egereket külön-külön helyeztük el 1 órára egy áttetsző műanyag ketrecbe a kezelést megelőzően, és a kísérleti periódus alatt. A hatóanyagokat injekciónak megfelelő térfogatú normál sóoldatban feloldottuk, és a koncentrációt 0,01 mg/testtömeg-g értékre beállítottuk. A DP16-ot ip. adagoltuk, 0,1-300 pg/kg dózisban: 0,1 (pg/kg: n=10,5 pg/kg: n=10; 25 pg/kg: n=20; 75 pg/kg: n=20, 150 pg/kg: n=20 és 300 pg/kg: n=10 állat. j
A kontrollállatoknak normál sóoldatot adagoltunk ip. jinjekció formájában. A DP16 vagy sóoldat adagolását í követően 30 perccel metrazolt adagoltunk (50 pg/kg f se.). Ezután a következő 30 percben figyeltük az epileptikus jeleket. A myocloniás reflexek (MJ) hiányát vagy relatív késését a kísérleti csoportnál az esetleges antiepileptikus aktivitás jelének tekintettük. Az adatokat |; c2 (chi-square)-módszer szerint analizáltuk számítógépes statisztikus módszer szerint („StatViewll”).
Eredmények és következtetések *~
A metrazol 50 pg/kg se. dózisban myocloniás reflexeket (MJ) idézett elő a kontrollegereknél egy 1011 perces latens periódussal (n= 11). A DP16 hatását a minimális metrazolindukált roham megjelenésére a 8. ábrán mutatjuk be. A 0,1 pg/kg DPlő-tal kezelt egereknél ugyanaz a válasz mutatkozik a metrazolra, mint a kontrolinál (a kezeletlen állatoknál). A DP16 5-300 pg/kg dózisban egy szignifikáns védőhatást mutat (p<0,001).
A teszt eredményei alapján úgy tűnik, hogy a DP16 egy szignifikáns dózisfiiggő epilepszia elleni hatást mutat metrazolindukált rohamok esetén.
A DP16 kardioprotektív hatásának vizsgálata r
1. Ex vivő vizsgálat patkányszíveken, kis áramlású
- reperfúziós modell ;
Eljárás és eredmények
A széles körben alkalmazott ex vivő Langendorffféle szív stop-áramlási-reperfúziós és kis áramlási modellek (Neely and Rovetto, 1975) a szokásosak farmakológiai vizsgálatokhoz. A DP16 kardioprotektív hatását a normál áramlási perfúziós kísérleti paradigma sze- β rint, majd ezt követően a kis áramlású, majd a reperfúziós (LFR) vizsgálat szerint végeztük ex vivő patkány szíveken. Az EKG és a perfúziós nyomás (PP) kialaku9
HU 221 678 Bl lását tekintettük a hatóanyag értékelése kritériumainak.
A kísérlet ideje alatt a DP16 jelenlétében kapott adatokat összehasonlítottuk a hatóanyag-adagolás nélküli adatokkal (kontroll No. 1). Egy további kísérletet (kontroll No. 2) végeztünk egy keverékkel, amely DPI 6: 5 BAPTA és lizofoszfatidil-kolin (LPC) keverékét tartalmazta. A DP16-ot (1-100 pg/1) szokásos perfúziós pufferban feloldottuk. A BAPTA és LPC keverékét DMSO-ban feloldottuk, így törzsoldatot készítettünk.
A BAPTA, LPC és DMSO végső koncentrációja a 10 perfúziós pufferben a No. 2 kontroll esetén 100 pg/l volt mindegyik komponensre nézve.
A perfúziós nyomás (PP) komoly mértékű csökkenése 20 Hgmm érték alá (kis áramlási periódus) szinuszos bradycardiát okozott, amely egy stabil AV-blokk- 15 bán kulminált (9.2 ábra, normál áramlás a 9.1 ábrán), gyakran ventrikuláris arrythmiával (9.1 kísérlet, kontroll 1). A hosszú időtartamú (>0,5 óra) kis áramlású körülmények általában paroxizmális tachyarrhythmiában és ventrikuláris fibrillációban (VF) végződtek. A reper- 20 fúzió, amelyet a VF előtt indítottunk, átmenetileg visszaállítja a szinuszos ritmust. Azonban a reperfúzió a kontrollkísérletek legtöbbjénél a koronáriás vaszkuláris tónus és arrythmia növekedését okozta, és ezt irreverzíbilis VF követte (9.3 ábra). Az AV-blokk megálla- 25 pítása után a kis áramlású periódusban a perfúziós közeget kiegészítettük a hatóanyaggal. Az AVB-re terápiás hatást nem figyeltünk meg a BAPTA & LPC keverék esetén (10.3 és 10.4 ábra., BAPTA és LPC nélkül - normáláramlás a 10.1 ábrán és kis áramlásos perfúzió a 30 10.2 ábrán). Míg a DPI 6 adagolása teljes vagy átmeneti enyhülést mutatott az atreoventrikuláris szinkronizmusra (4, illetve 1 eset) (11.3 ábra). Továbbá, a DP16 egy észrevehető kardioprotektív hatást fejtett ki a reperfúziós periódusban: a szinuszos ritmus teljes 35 visszaállása volt megfigyelhető öt kísérlet közül négy esetén (11.4 ábra, DP16 nélkül - normáláramlás a 11.1 ábrán, és kis áramlási perfúzió a 11.2 ábrán). Az EKG-vizsgálatok főleg metabolikus típusú DPműködést mutattak: fokozták az atriális (a pulzus hatá- 40 rozott növekedése) és ventrikuláris (a szabályos szinuszritmus visszaállása) ingerlékenységet. Azonban, az AV-konduktivitásban maradék késést (növekvő PQ intervallum) figyeltünk meg.
Következtetések 45
A kísérlet során kapott adatok alapján a DP16 szignifikáns kardioprotektív hatást mutat ischaemiás reperfúziós patológia esetén.
DPI 6 kardioprotektív hatásának vizsgálata
2. In vivő vizsgálat miokardiális károsodást modell 50 esetén
Eljárás és eredmények
A hatásos β-adrenoreceptor-agonista izoproterenol (ISO) adagolása általában egy elfogadott modell az experimentális myokardiális patológia esetén. A DP16 kardio- 55 protektiv hatását 82 Sprague-Dawley nőstény patkány esetén vizsgáltuk (250-350 g). A myokardiális károsodást a páfrányoknál két egymást követő ISO-injekcióval váltottuk ki (85 (pg/kg, se.). A megfelelő esetekben az ISO-injekciókat 30, illetve 180 perccel követően DP16- 60 ot adagoltunk (0,01 pg/kg, ip.). A DP16 Íratását EKGanalízissel és a szérum glutamin-oxaloacetát-transzamináz (SGOT)-, valamint a laktát-dehidrogenáz (LDH)aktivitás meghatározásával követtük. Az ISO-adagolást követően a kontrollpatkányoknál a mortalitás mértéke
17,1 ±5,9% volt (41 közül 7). A túlélő állatoknál feltűnően hyperacute elhajlású ST-szegmensek voltak láthatók az EKG 1 és 2 vezetékénél. Az EKG-n a patológiás jelek a kísérleti periódus alatt súlyosbodtak. 48 órával a második ISO-injekció után mindegyik kezelt állatnál az STszegmens patológiás eltolódása volt látható. A DP16 adagolása két esetben csökkentette a halált (2 30 közül).
Azon állatok esetében, amelyeket DP16-tal kezeltünk, az
EKG-n szignifikáns mértékben (p<0,05) kevesebb elváltozást tapasztaltunk. Az ST-szegmens patológiás eltolódását csak az EKG 28 és 40%-ánál tapasztaltuk (24 és órával az ISO adagolást követően). A biokémiai meghatározás 1,7-1,9-szeres SGOT- és LDH-növekedést mutatott az ISO-val kezelt kontrollpatkányoknál (p<0,05). A DP16-tal végzett kezelés jelentős mértékben csökkentette azon kísérleti állatok százalékos mennyiségét, amelyek abnormális szintű SGOT- és
LDH-aktivitást mutattak.
Következtetések
A fenti adatok alapján feltételezhető, hogy a DP16 szignifikáns kardioprotektív hatású myokardiális patológiás in vivő modellek esetén.
ÁLTALÁNOS KÖVETKEZTETÉSEK f
A DP16 jelű találmány szerinti prodrug szignifi- t káns terápiát és védőhatást mutat stroke- és ischae- i miakísérleti modellekben, valamint epilepsziás model- | lekben, ez a hatás ugyanaz, mintha a megfelelő ható- f anyagot a szokásos formában alkalmazzuk H^-IO6- J.
szór nagyobb mennyiségben, viszonyítva a találmány | szerinti prodrug mennyiségéhez. | í
4. példa '
Prodrug-3 előállítása
Prodrug-3-ként jelöljük az l,2-bisz(2-amino-fenoxi)-etán-N,N,N’,N’-tetraecetsav (BAPTA) 1-mirisztil-mirisztil-alkohollal alkotott 1:1 arányú (mono-) észterét, és ezt a következőképpen állítjuk elő. 0,5 g,
1,05 mmol BAPTA-t, 25 ml dimetil-formamidot (frissen desztillálva CaH2 felett), 0,451 g, 1,1 mmol 1-mirisztil-mirisztil-alkoholt, 0,215 g, 1,1 mmol N,N’-diciklohexil-karbodiimidet és 0,025 g, 0,202 mmol 4dimetil-amino-piridint tartalmazó oldatot 2 napon át szobahőmérsékleten argonatmoszférában keverünk egy 50 ml-es, mágneses keverővei ellátott lombikban. 2 óra elteltével az Ν,Ν’-diciklohexil-karbamid kezd kiválni.
A reakció végbemenetelét TLC-vel követjük r (90:10 tf/tf kloroform:metanol); a termék Rf-értéke 0,62. A csapadékot szűréssel eltávolítjuk, és a szűrletet 35 °C hőmérsékleten vákuumban betöményítjük.
A visszamaradó anyagot 25 ml 2:1:2 tf/tf kloroform :izopropanol: víz eleggyel extraháljuk, a szerves \ fázist elválasztjuk, 1%-os vizes NaCl-oldattal mossuk, j-j és Na2SO4 felett szárítjuk, majd betöményítjük, és a visszamaradó anyagot kromatografáljuk (160 χ 30 mm- c es Kieselgel 60 (230-400 mesh ASTM) töltetű oszlop,
HU 221 678 Bl a kívánt terméket 90:10 tf/tf kloroform/metanol eleggyel eluáljuk). Az 1-mirisztil-mirisztil-alkoholt Molotkovski V. G. és Bergelson, L. D. módszere szerint állítottuk elő [Biologicheska Chimia, 8 (9): 1256-1261 (1982)]. A BAPTA-l-mirisztil-mirisztil-al- 5 kohol-észter kötés a prodrug-3-ban érzékeny észterázokkal végzett emésztésre.
5. példa
TVA16 előállítása és biológiai tulajdonságai 10
A „TVA16” nevű prodrug valproinsav és az ROCH2-CH(OH) + -CH2O-OCH2N(CH3)2 általános képletű kolinszármazék - a képletben R jelentése hexadekanoilcsoport -1:1 arányú észtere, ezt az észtert a következőképpen állítjuk elő: 1,04 mmol 1- 15 hexadekanoil-sn-glicero-3-foszforil-kolint, 25 ml kloroformot (frissen desztillálva P2O5 felett), 0,159 g,
1,1 mmol valproinsavat, 0,216 g N,N’-diciklohexil-karbodiimidet és 0,025 g, 0,202 mmol 4-dimetil-amino-piridint tartalmazó oldatot 2 napon át szobahőmérsékle- 20 ten argonatmoszférában keverünk egy mágneses keverővei, és üveggyöngyökkel (10 g, 5 mm átmérőjű) ellátott lombikban. 2 óra elteltével az N,N’-diciklohexilkarbamid kezd kiválni. A reakció lefutását TLC-vel követjük (65:25:4 tf/tf arányú kloroform:metanol:víz 25 elegy), a tennék Rf-értéke 0,41. A csapadékot és az üveggyöngyöket szűréssel elválasztjuk, a szűrletet 35 öC-on vákuumban betöményítjük, a visszamaradó anyagot 25 ml 2:1:2 tf/tf arányú kloroform :izopropanol: víz eleggyel extraháljuk, a szerves fázist elválaszt- 30 juk, 1%-os vizes NaCl-oldattal mossuk és Na2SO4 felett szárítjuk, majd betöményítjük. A visszamaradó anyagot kromatografáljuk (160 χ 30 mm-es oszlop, Kieselgel 60 (230-400 mesh ASTM) töltetű oszlop. A kívánt terméket 65:25:4 tf/tf arányú kloroform:méta- 35 nol: víz eleggyel eluáljuk, Rf=0,4).
A TVA16 vizsgálati mintáját ip. adagoljuk (0,01-100 mg/kg), három egérből álló csoportnak 1 órával a metrazol adagolását megelőzően (80 mg/kg se.). Hatásos dózisnak tekintettük azt a mennyiséget, amely 40 meggátolta a görcsös állapotokat (2 pont állatonként), és/vagy a halált (1 pont állatonként), a vizsgálatot követő 30 percen belül. Ezen az alapon számoltuk az ED100értéket, és összehasonlítottuk az ismert görcs elleni szerekkel a következő táblázatban. 45
Ismert hatóanyagok és TVA16 antikonvulzáns aktivitása (ED l00 mg/kg)
Chlordiazepoxide 25
Diazepam 2,5
Difenil-hidantoin >100
Flunarizin >300
Glutethimide 150
Meprobamate 200
MK-801 0,5
Muscimol (ip.) 2,5
Nifedipin >100
Nimodipine >300
Fenobarbitál 50
Nátrium-valproát 500
Verapamil >100
TVA16 0,6
A fenti adatokból kitűnik, hogy a TVA16 szignifikáns antikonvulzáns hatású, és ez a hatás 500-szor nagyobb, mint a nátrium-valproát hatása.
Bár a találmány szerinti megoldást adott esetekre ismertettük, a szakember számára nyilvánvaló, hogy azoknak számos módosítása és változtatása lehetséges. Ily módon a találmány nem korlátozódik a bemutatott kiviteli formákra, az oltalmi kört pontosabban a következő igénypontokkal írjuk le.

Claims (10)

1. Gyógyszerészetileg elfogadható sejtmembránpermeábilis prodrug, amely gyógyszerészetileg aktív karbonsav és egy hidroxilcsoportot vagy -csoportokat tartalmazó intracelluláris transzportáló adjuváns észtere, amelyben az említett karbonsav valpronsav vagy annak sója, vagy egy (HOOC-CH2)2-N-A-N-(CH2-COOH)2 képletű sav
- a képletben A jelentése -CH2-CH2~, -CH2CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2- vagy -CR=CR-O-CH2-CH2-O-CR’=CR’- ahol az R-R és R’-R’ szubsztituenspárok együttesen a hozzájuk kapcsolódó -C=C- csoporttal egy benzolgyűrűt alkotnak
- vagy ezek sói, és az említett intracelluláris transzportáló adjuváns 7-32 szénatomos egyértékű alkohol vagy egy ROCH2-CH(OH)-CH2O-(PO2)-OCH2N+(CH3)2 általános képletnek megfelelő foszfatidil-kolin-származék - a képletben R jelentése 3-20 acilcsoport.
2. Az 1. igénypont szerinti prodrug, amelyben a gyógyszerészetileg hatásos karbonsav etilén-l,2-diamin-N,N,N’,N’-tetraecetsav, etilén-l,2-diol-bisz(2amino-etil-éter)-N,N,N’,N’-tetraecetsav vagy 1,2bisz(2-amino-fenoxi)etán-N,N,N’,N’-tetraecetsav.
3. Az 1. igénypont szerinti prodrug, amelyben a gyógyszerészetileg aktív karbonsav BAPTA.
4. Az 1. igénypont szerinti prodrug, amelyben az észter l,2-bisz(2-amino-fenoxi)etán-N,N-N’,N’-tetraecetsav heptanoil-sn-3-glicero-foszforil-kolinnal vagy oktanoil-sn-3-glicero-foszforil-kolinnal alkotott mono-, di-, tri- vagy tetraésztere.
5. Az 1. igénypont szerinti prodrug, amelyben a gyógyszerészetileg aktív karbonsav valpronsav vagy valamely gyógyszerészetileg elfogadható sója.
6. Az 5. igénypont szerinti prodrug, amely valpronsav és l-heptanoil-sn-glicero-3-foszforil-kolin vagy l-oktanoil-sn-glicero-3-foszforil-kolin észtere.
7. Az 5. igénypont szerinti prodrug, amely valpronsav és l-hexadekanoil-sn-glicero-3-foszforil-kolin észtere.
8. Az 1. igénypont szerinti prodrug, amely BAPTA és 1-mirisztil-mirisztil-alkohol észtere.
Ha
11. A 10. igénypont szerinti alkalmazás a szupranormál intracelluláris enzimaktivitással összefüggő betegségek körébe tartozó lokalizált szövetischaemia, stroke, epilepszia, asztma és allergia kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.
HU 221 678 Bl
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti prodrug alkalmazása gyógyszer előállítására.
10. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti prodrug alkalmazása embereknél szupranormál intracelluláris enzimaktivitással összefüggő betegségek kezelésé- 5 re szolgáló gyógyszer előállítására.
HU9502866A 1993-03-31 1994-03-30 Szupranormál intracelluláris enzimaktivitással összefüggő betegségek kezelésére alkalmas prodrugok HU221678B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL10524493A IL105244A (en) 1993-03-31 1993-03-31 Prodrugs with enhanced penetration into cells
PCT/GB1994/000669 WO1994022483A2 (en) 1993-03-31 1994-03-30 Prodrugs with enhanced penetration into cells

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9502866D0 HU9502866D0 (en) 1995-11-28
HUT73669A HUT73669A (en) 1996-09-30
HU221678B1 true HU221678B1 (hu) 2002-12-28

Family

ID=11064681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9502866A HU221678B1 (hu) 1993-03-31 1994-03-30 Szupranormál intracelluláris enzimaktivitással összefüggő betegségek kezelésére alkalmas prodrugok

Country Status (13)

Country Link
US (2) US5985854A (hu)
EP (1) EP0691852B1 (hu)
JP (1) JP3900533B2 (hu)
KR (1) KR100400075B1 (hu)
AT (1) ATE259661T1 (hu)
AU (1) AU682029B2 (hu)
CA (1) CA2159610C (hu)
DE (1) DE69433560T2 (hu)
HU (1) HU221678B1 (hu)
IL (1) IL105244A (hu)
NZ (1) NZ263208A (hu)
SG (1) SG81890A1 (hu)
WO (1) WO1994022483A2 (hu)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5714167A (en) * 1992-06-15 1998-02-03 Emisphere Technologies, Inc. Active agent transport systems
US5827819A (en) * 1990-11-01 1998-10-27 Oregon Health Sciences University Covalent polar lipid conjugates with neurologically active compounds for targeting
US7135584B2 (en) * 1995-08-07 2006-11-14 Wake Forest University Lipid analogs for treating viral infections
AU3216695A (en) * 1994-08-29 1996-03-22 University Of North Carolina At Chapel Hill, The Lipid analogs for treating viral infections
US6313106B1 (en) 1995-06-07 2001-11-06 D-Pharm Ltd. Phospholipid derivatives of valproic acid and mixtures thereof
CA2227013A1 (en) * 1995-07-14 1997-02-06 Glycotech Corp. Compounds and methods for treatment of egf receptor associated cancers and purification of the egf receptor
US6350780B1 (en) * 1995-07-28 2002-02-26 Allergan Sales, Inc. Methods and compositions for drug delivery
US6576636B2 (en) 1996-05-22 2003-06-10 Protarga, Inc. Method of treating a liver disorder with fatty acid-antiviral agent conjugates
US5795909A (en) 1996-05-22 1998-08-18 Neuromedica, Inc. DHA-pharmaceutical agent conjugates of taxanes
JP2001512425A (ja) 1997-02-11 2001-08-21 セラマーク・リミテッド 薬物ターゲティング
AU751876B2 (en) * 1997-03-19 2002-08-29 Sky High, Llc Compositions containing lysophosphotidic acids which inhibit apoptosis and uses thereof
JP2001512830A (ja) 1997-08-08 2001-08-28 ニューバイオティックス インコーポレイテッド 生物療法耐性および化学療法耐性を克服するための方法および組成物
EP1240922B1 (en) * 1997-08-08 2008-11-12 Celmed Oncology (USA), Inc. Methods and compositions for overcoming resistance to biologic and chemotherapy
CA2317505C (en) * 1998-01-23 2011-01-04 Newbiotics, Inc. Enzyme catalyzed therapeutic agents
US7462605B2 (en) 1998-01-23 2008-12-09 Celmed Oncology (Usa), Inc. Phosphoramidate compounds and methods of use
US7235583B1 (en) 1999-03-09 2007-06-26 Luitpold Pharmaceuticals, Inc., Fatty acid-anticancer conjugates and uses thereof
CA2378187C (en) * 1999-07-22 2011-09-13 Newbiotics, Inc. Methods for treating therapy-resistant tumors
US6683061B1 (en) 1999-07-22 2004-01-27 Newbiotics, Inc. Enzyme catalyzed therapeutic activation
IL131887A0 (en) 1999-09-14 2001-03-19 Dpharm Ltd Phospholipid prodrugs of anti-proliferative drugs
US6670341B1 (en) 1999-10-28 2003-12-30 Wake Forest University Health Sciences Compositions and methods for double-targeting virus infections and targeting cancer cells
US7026469B2 (en) * 2000-10-19 2006-04-11 Wake Forest University School Of Medicine Compositions and methods of double-targeting virus infections and cancer cells
CZ20022507A3 (cs) * 2000-01-20 2003-01-15 Omegatech, Inc. Způsob chování králíků
US20020115642A1 (en) * 2000-05-02 2002-08-22 Chan Ming Fai Beta-lactam antibiotics
US7309696B2 (en) 2000-10-19 2007-12-18 Wake Forest University Compositions and methods for targeting cancer cells
CA2441350A1 (en) 2001-01-19 2002-07-25 Newbiotics, Inc. Methods to treat autoimmune and inflammatory conditions
AU2002303164A1 (en) 2001-03-23 2002-10-08 Protarga, Inc. Fatty amine drug conjugates
ES2387562T3 (es) 2001-03-23 2012-09-26 Luitpold Pharmaceuticals, Inc. Conjugados alcohol graso-medicamento
US7410956B2 (en) 2002-02-11 2008-08-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Caspase inhibitor prodrugs
US20050187191A1 (en) * 2004-02-20 2005-08-25 Kucera Louis S. Methods and compositions for the treatment of respiratory syncytial virus
USD692565S1 (en) * 2010-06-03 2013-10-29 Smith & Nephew, Inc. Organ protection layer
CA140188S (en) 2010-10-15 2011-11-07 Smith & Nephew Medical dressing
CA140189S (en) 2010-10-15 2011-11-07 Smith & Nephew Medical dressing
EP2948139B1 (en) * 2013-01-28 2019-06-12 Lopez, Hector, L. Methods of improving tolerability, pharmacodynamics, and efficacy of b-alanine and use therefor
CN108659038B (zh) * 2017-03-31 2022-01-11 江苏恩华药业股份有限公司 1-硬脂酰-2-丙戊酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱的多晶型物及制备方法
CN110407867A (zh) * 2018-04-28 2019-11-05 江苏恩华药业股份有限公司 丙戊酸磷脂衍生物的新晶型及其制备方法
CN111334369B (zh) * 2020-03-11 2022-10-21 陕西科技大学 一种酶法制备卵磷脂型pufa的方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR244F (hu) * 1900-01-01
EP0032516B1 (en) * 1980-01-16 1984-05-02 Lacer, S.A. New 2-halo-pyridines, their production and pharmaceutical compositions
US5223263A (en) * 1988-07-07 1993-06-29 Vical, Inc. Liponucleotide-containing liposomes
IT1201151B (it) * 1987-01-14 1989-01-27 Indena Spa Complessi fosfolipidici con estratti da vitis vinifera,procedimento per la loro preparazione e composizioni che li cntengono
IT1201149B (it) * 1987-01-14 1989-01-27 Indena Spa Complessi di bioflavonoidi con fosfolipidi,loro preparazione,uso e composizioni farmaceutici e cosmetiche
WO1989005358A1 (en) * 1987-11-30 1989-06-15 University Of Iowa Research Foundation Dna and rna molecules stabilized by modifications of the 3'-terminal phosphodiester linkage and their use as nucleic acid probes and as therapeutic agents to block the expression of specifically targeted genes
DE3801587A1 (de) * 1988-01-21 1989-08-03 Hoechst Ag Neue aminosaeureglyceride, verfahren zu ihrer herstellung, sie enthaltende arzneimittel und deren verwendung
WO1990010448A2 (en) * 1989-03-07 1990-09-20 Genentech, Inc. Covalent conjugates of lipid and oligonucleotide
JPH03133987A (ja) * 1989-10-18 1991-06-07 Kowa Yakuhin Kogyo Kk ２‐マイトマイシンｃ‐スクシニル‐１，３‐ジパルミトイルグリセロールおよびその製造法
JPH03275625A (ja) * 1990-03-23 1991-12-06 Nippon Oil & Fats Co Ltd 制癌剤およびその製造法
AU7872491A (en) * 1990-05-07 1991-11-27 Vical, Inc. Lipid prodrugs of salicylate and nonsteroidal anti-inflammatory drugs
CH679856A5 (hu) * 1990-07-04 1992-04-30 Lonza Ag
US5149794A (en) * 1990-11-01 1992-09-22 State Of Oregon Covalent lipid-drug conjugates for drug targeting
WO1992017185A1 (en) * 1991-03-29 1992-10-15 University Of Florida Targeted drug delivery via mixed phosphate derivatives
EP0594677A4 (en) * 1991-07-12 1997-09-17 Vical Inc Antiviral liponucleosides: treatment of hepatitis b
US6015834A (en) * 1992-10-20 2000-01-18 Toronto Neuroprotection Group In vivo treatment of mammalian cells with a cell membrane permeant calcium buffer

Also Published As

Publication number Publication date
ATE259661T1 (de) 2004-03-15
US5985854A (en) 1999-11-16
DE69433560T2 (de) 2004-12-16
AU682029B2 (en) 1997-09-18
US6136796A (en) 2000-10-24
WO1994022483A2 (en) 1994-10-13
SG81890A1 (en) 2001-07-24
AU6380894A (en) 1994-10-24
JPH08508295A (ja) 1996-09-03
HU9502866D0 (en) 1995-11-28
CA2159610C (en) 2008-05-20
WO1994022483A3 (en) 1994-12-22
HUT73669A (en) 1996-09-30
JP3900533B2 (ja) 2007-04-04
EP0691852A1 (en) 1996-01-17
EP0691852B1 (en) 2004-02-18
IL105244A (en) 2003-07-31
NZ263208A (en) 1997-06-24
DE69433560D1 (de) 2004-03-25
CA2159610A1 (en) 1994-10-01
IL105244A0 (en) 1993-07-08
KR100400075B1 (ko) 2004-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU221678B1 (hu) Szupranormál intracelluláris enzimaktivitással összefüggő betegségek kezelésére alkalmas prodrugok
US6077837A (en) Prodrugs with enhanced penetration into cells
EP0765160B1 (en) Dexanabinol derivatives and their use as neuroprotective pharmaceutical compositions
KR101397510B1 (ko) 플라보노이드 화합물 및 그 용도
DE69532642T2 (de) Antivirale prodrugs
JP6280094B2 (ja) リポイル化合物および虚血性傷害を治療するためのその使用
US4372974A (en) Anticonvulsive compositions and method of treating convulsive disorders
KR100545487B1 (ko) 킬레이트제의 친유성 디에스테르
US4322440A (en) Anticonvulsive compositions and method of treating convulsive disorders
FR2791891A1 (fr) Utilisation de la tianeptine pour l&#39;obtention de medicaments destines au traitement des pathologies de la neurodegenerescence
EP0215319A2 (en) Gem-dihalo-1,8-diamino-4-aza-octanes
JP4490536B2 (ja) 脳血管障害に基づく疾患の予防又は治療薬
US20070244076A1 (en) Site and Rate Selective Prodrug Formulations of D609 with Antioxidant and Anticancer Activity
US4914240A (en) Gem-dihalo-1, 8-diamino-4-aza-octanes
JPH10203976A (ja) イソフラボン類またはキサントン類からなる医薬
FR2700113A1 (fr) Utilisation de l&#39;Idazoxan et ses dérivés pour la fabrication de médicaments destinés au traitement des maladies neurodégénératives et en particulier l&#39;évolution de la maladie d&#39;Alzheimer.
FR2666509A1 (fr) Utilisation de n-(1-hexahydroazepinylalkyl) acetamides dans la preparation des medicaments destines au traitement des troubles de la transmission cholinergique.
JP2000136137A (ja) 虚血再潅流性脳障害軽減剤

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees