DE60117770T2

DE60117770T2 - Cholinderivate zur behandlung der alzheimerkrankheit

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Publication number: DE60117770T2
Application number: DE60117770T
Authority: DE
Inventors: Univ. Studi di Roma La Sapienza Vincenzo CARELLI; Univ. Studi Roma La Sapienza Felice LIBERATORE; Univ. Studi di Roma La Sapienza Luigi SCIPIONE; Univ. degli Studi di Camerino Mario CARDELLINI; Univ. Studi Cantazaro Magna Graecia D. ROTIROTI; Univ. Studi di Catanzaro Magna Graci V. RISPOLI
Original assignee: UNI DEGLI STUDI DI CATANZARO M; Universita degli Studi di Camerino; Universita degli Studi "Magna Graecia" di Catanzaro; Universita degli Studi di Roma La Sapienza
Current assignee: UNI DEGLI STUDI DI CATANZARO M; Universita degli Studi di Camerino; Universita degli Studi "Magna Graecia" di Catanzaro; Universita degli Studi di Roma La Sapienza
Priority date: 2000-04-21
Filing date: 2001-04-18
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2021-04-19
Also published as: ATE319677T1; WO2001081296A1; ES2260215T3; EP1274674B1; US20030166721A1; IT1318484B1; DE60117770D1; ITMI20000898A1; ITMI20000898A0; EP1274674A1; AU5255501A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Cholin-Derivaten für die Behandlung von Erkrankungen, die mit einem zentralen cholinergen Defizit zusammenhängen, wie die Alzheimer-Krankheit.
Genauer gesagt betrifft die Erfindung Cholin-Derivate mit einer pharmakologischen Aktivität in der Remission von zentralen cholinergen Defizitzuständen und bei der Wiederherstellung der normalen cerebralen elektrischen Aktivität.
Einführung
Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Demenz in der älteren Bevölkerung. Sie ist eine neurodegenerative Erkrankung mit progressiver Entwicklung und stellt 50 % aller irreversiblen Demenzformen dar. Das Auftreten der Erkrankung steigt bei Personen über 80 Jahren an.
Die Hauptsymptome beim Ausbruch der Erkrankung sind Gedächtnisstörungen mit fortschreitender kognitiver Beeinträchtigung und anschließend Veränderungen von Verhalten und Persönlichkeit sowie psychiatrische Veränderungen.
Die AD-Diagnose wird post mortem in etwa 80 bis 90 % der Fälle bestätigt. Post mortem-Studien an Gehirnen von AD-Patienten zeigten eine substantielle Degeneration der Subcortex-Bereiche, insbesondere des Nucleus basalis Meynert (NBM); die Degeneration wird von einer deutlichen Verminderung der in diesem Bereich vorhandenen cholinergen Neuronen begleitet. Das Gehirn zeigt reduzierte Spiegel von Acetylcholin (Ach) und seinen spezifischen Enzymmarker wie Cholinacetyltransferase (ChAT) und Acetylcholinesterase (AchE), (Whitehouse et al., 1982; Deeker, 1987).
NBM, gemeinsam mit den anderen ZNS-Neurotransmissionssystemen, spielt eine wesentliche Rolle beim kortikalen Aktivierungsmechanismus, welcher der bei Aufmerksamkeit und Lernen wesentliche involvierte elektrophysiologische Basismechanismus ist. Es existiert eine Beziehung zwischen der Degeneration von cholinergen NBM-Neuronen und den neurophysiologischen Defiziten, die bei AD und bei normalem Altern beobachtet werden (Whitehouse et al., 1981, 1982; Aremdt et al., 1984; Rinne et al., 1987), und mit der Schwere der Erkrankung (Perry et al., 1978).
Eine Anzahl von Studien hat bewiesen, dass das cholinerge System eine wichtige Rolle bei der cerebralen Kortexaktivierung spielt, wobei der Prozess im ZNS mit einem wachen und alerten Verhalten in Verbindung steht (Lo Conte et al., 1982; Longo, 1996; Miller et al., 1940; Stewart et al., 1984; Moruzzi, 1972). Die cholinergen kortikalen Projektionen von NBM können auch direkt die Aktivierung des Neokortex modulieren (Lo Conte et al., 1982).
Es ist wesentlich für das Auftreten normaler kognitiver Prozesse, dass die Aktivierung des Neokortex eintritt. Diese Aktivierung korreliert mit der Desynchronisierung des kortikalen Elektroenzephalogramms, d.h. mit der Anwesenheit von Wellen niedriger Amplitude, in Verbindung mit schneller Frequenz, im Elektroenzephalogramm (EEG).
Weiterhin ist die Aktivierung des cholinergen Systems auf dem basalen Niveau von überragender Bedeutung bei der Aufrechterhaltung einer alerten verhaltensmäßigen Aufmerksamkeits-Antwort. Die NBM-Stimulation bewirkt in der Tat nach einer kurzen Latenz eine Aktivierung der kortikalen Neuronen (Funanhashi, 1983; Stern und Pugh, 1984) und die ACh-Freisetzung im Neokortex (Casamenti et al., 1986). EEG-Veränderungen (Abnahme der Frequenzen mit schneller Aktivität, 12 bis 16 Hz) wurde bei Tieren beobachtet, die einer unilateralen Läsion des NBM unterzogen wurden.
Klinische Studien bei älteren Personen genauso wie bei AD-Patienten zeigte eine progressive morphologische Änderung des EEG, die durch eine langsamere cerebrale elektrische Aktivität charakterisiert ist; das Auftreten der langsamen Aktivität im EEG ist auf das überwiegende Auftreten von Wellen mit großer Amplitude zurückzuführen (EEG-Synchronisation). Darüber hinaus zeigte eine Anzahl von Studien die Beziehung zwischen der Topographie der charakteristischen EEG-Änderungen und der Schwere der Erkrankung (Soininen et al., 1991; Ono et al., 1992; Kuskowski et al., 1993; Schreiter-Gasser et al., 1993; d'Onofrio et al., 1996; Helkala et al., 1996; Stam et al., 1996; Chiaramonti et al., 1997; Lopez et al., 1997). Diese EEG-Änderungen hängen mit der Degeneration des basalen cholinergen Systems zusammen.
Die Untersuchung der cerebralen elektrischen Aktivität durch EEG kann ein wertvoller Weg bei der pharmakologischen Beurteilung neuer Verbindungen sein, dem AD-Verlauf entgegenzuwirken. Qualitative (Frequenzanalyse) und quantitative (spektrale Analyse) Analyse der cerebralen elektrischen Aktivität, ausgeführt mit Hilfe von computerisierten digitalen EEG-Geräten, ist eines der am weitesten fortgeschrittenen Hilfsmittel, die gegenwärtig verfügbar sind, und bietet große Möglichkeiten der klinischen Anwendung.
Die quantitative EEG-Analyse bei AD-Patienten zeigte einen deutlichen Anstieg der delta- und teta-Aktivität (Wellen) und eine Abnahme des alpha- und beta-Rhythmus (Wellen) (Cohen et al., 1985; 1990; Elmstahl et al., 1994).
Entsprechend der Theorie, die die Alzheimer-Krankheit mit cholinerger Dysfunktion verbindet, haben zahlreiche Untersuchungen und klinische Studien bewiesen, dass die Gabe von Acetylcholin-Vorläufern die mentale senile Beeinträchtigung umkehren und die kognitive Leistung bei AD-Patienten verbessern kann (Greenwald et al., 1985; Franco-Maside et al., 1994; de la Morena, 1991; Secades et al., 1995).
Der pharmakologische Eingriff, der auf die Umkehr des zentralen cholinergen Übertragungsdefizits durch Verwendung von Acetylcholin-Vorläufern zielt, ist gegenseitig eine der therapeutischen Anwendungen der Wahl. Sie kann zumindest anfänglich die kognitiven und verhaltensmäßigen Störungen bei AD-Patienten verbessern. Eine solche therapeutische Annährung hat zur Herstellung und Untersuchung einer Anzahl von Cholin-Derivaten geführt, wie 5'-Cytidin-diphosphocholin (CDP-Cholin) und verschiedenen substituierten Lecithinen, deren Gabe ziemlich günstige Wirkungen auf die kognitiven Funktionen hervorrief (Gatti et al., 1992; Ceda et al., 1992; Parnetti et al., 1993; Petkov et al., 1993; Cacabelos et al., 1993).
Stand der Technik
European Journal of Pharmacology (Molecular Pharmacology Section, 172 (1989), 165 bis 173) berichtet über eine in vitro-Studie der Beziehung zwischen der Struktur von 31 quaternären Ammonium-Verbindungen und ihren Wirkungen auf die Aktivität der Acetylcholinesterase.
Die meisten der getesteten Verbindungen wirkten als reversible, kompetitive Inhibitoren von AchE.
Offenbarung der Erfindung
Es wurde nun gefunden, dass die Verbindungen der Formel (I)
wobei X ein Iodid oder das Pivalinsäureanion ist,
bequem bei der Behandlung von Erkrankungen verwendet werden können, die mit einem zentralen cholinergen Defizit in Verbindung stehen, insbesondere der Alzheimer-Krankheit oder Krankheiten vom Alzheimer-Typ, wobei unter „Alzheimer-Krankheit" und „Krankheiten vom Alzheimer-Typ" beliebige Formen der senilen oder präsenilen Demenz verstanden werden.
Es wurde in der Tat gefunden, dass die Verbindungen der Formel (I) die normale cerebrale elektrische Aktivität bei Tiermodellen mit cholinergem Defizit mit cholinerger Transmissionsdefizienz wiederherstellen können.
Insbesondere wurde gefunden, dass die Gabe von Cholin-Pivalinsäureestern bei Ratten EEG-Desynchronisation und quantitative Änderungen in der Leistung und Architektur der EEG-Spuren induziert, und dass diese Verbindungen dazu fähig sind, die cerebrale elektrische Aktivität bei Ratten mit NBM-Läsionen wieder herzustellen.
Die Aktivität der erfindungsgemäßen Cholin-Derivate wurde unter Verwendung von CDP-Cholin als Kontrollwirkstoff untersucht. Es wurde gezeigt, dass Cholin-Pivalinsäureester eine signifikant kürzere Wirkungslatenz genauso wie eine länger andauernde Wirkung als CDP-Cholin aufweisen. Weiter wurde gezeigt, dass diese Verbindungen leicht die Blut-Hirn-Schranke überwinden und keine peripheren cholinergen Wirkungen haben. Darüber hinaus verursachte die Gabe von Pivaloylcholin in Gegenwart von Hemicholinium-3 (Hch3), einem potenten und selektiven Cholin-Aufnahmehemmer, bei Ratten keine EEG-Änderungen, die im Gegensatz dazu durch die Gabe der Verbindung allein hervorgerufen werden; sogar bei niedrigeren Hch3-Dosierungen verursachte Pivaloylcholin weder Wirkungsänderungen, die durch diesen Cholin-Aufnahmehemmer induziert werden (Verhaltenssedierung), noch signifikante Änderungen im EEG. Daher kann einer der Wirkungsmechanismen von Cholin-Derivaten den spezifischen Cholin-Transport auf dem Niveau der cholinergen Neuronen umfassen. Es wurde auch bewiesen, dass Cholin-Pivalinsäureester die physiologischen cerebrale Aktivität in experimentellen M Wiederherstellung die physiologische cerebrale elektrische Aktivität bei experimentellen Modellen der neurochemischen NBM-Lesion wiederherstellen kann, eine EEG-Desynchronisation hervorrufen und quantitative Änderungen sowohl der Leistung als auch der Architektur des EEG-Tracing bewirken kann, wobei die Aktivität der schnellen Frequenzen moduliert und die Anzahl der niedrigen Frequenzen signifikant vermindert wird. Die experimentellen Nachweise, die die mit den erfindungsgemäßen Cholin-Derivaten beobachteten Wirkungen untermauern, werden im Detail in den Beispielen angegeben.
Die erhaltenen Daten beweisen, dass die erfindungsgemäßen Cholin-Derivate eine zentrale Aktivität aufweisen und bei der Behandlung beliebiger Pathologien einsetzbar sind, die mit einem zentralen cholinergen Defizit in Verbindung stehen. Genauer gesagt ermöglichen die erhaltenen Daten, eine wichtige Bedeutung der getesteten Verbindungen bei der Therapie von kognitiven Störungen und bei der Verbesserung der Lebensqualität von AD-Patienten ins Auge zu fassen.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Verbindungen der Formel (I) bei der Behandlung von zentralen cholineregn Defiziterkankungen, insbesondere bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit oder von Krankheiten vom Alzheimer-Typ.
Für die Verwendung in der Therapie werden die Verbindungen der Formel (I) in geeigneter Weise entsprechend konventionellen Techniken formuliert.
Entsprechend einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Formel (I) gemeinsam mit pharmazeutisch verträglichen Trägern und Exzipienten enthalten. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auf dem oralen, parenteralen, inhalatorischen oder rektalen Weg gegeben werden. Geeignete Verabreichungsformen schließen Tabletten, Kapseln, Granulate, Pulver, Lösungen, Sirupe, Lösungen zur Injektion, Suppositorien, transdermale Pflaster oder andere Formen zur kontrollierten Freisetzung ein. Die pharmazeutischen Formulierungen können nach üblichen Verfahren unter Verwendung von in der Technik bekannten Exzipienten hergestellt werden, wie Füllstoffen, Bindern, Kompressionsmitteln, Sprengmitteln, Schmiermitteln, stabilisierenden Mitteln, Verdickungsmitteln, Dispersionsmitteln, Farbstoffen, Geschmacksstoffen und ähnlichem. Die Dosierung des aktiven Bestandteils variiert in Abhängigkeit von den Symptomen und dem Alter des Patienten, der Art und Schwere der Erkrankung und dem Verabreichungsweg. Im Prinzip bedeutet wirksame Menge eine Menge, die zur Bewirkung der gewünschten pharmakologischen Effekte in der Lage ist, d.h. eine Menge, die das Überqueren der Blut-Hirn-Schranke durch den aktiven Bestandteil und die Ausübung der spezifischen Aktivität auf dem cerebralen Niveau ohne systemische Wirkungen ermöglicht.
Im Fall der oralen Gabe an einen erwachsenen Patienten werden die Verbindungen im allgemeinen in einer täglichen Dosis von 1 bis 1000 mg, bevorzugt 5 bis 300 mg in einzelnen oder mehrfachen Dosen gegeben, beispielsweise ein- bis dreimal täglich; im Fall der parenteralen Gabe wird die Dosis im Bereich von 0,1 bis 500 mg, bevorzugt 0,5 bis 300 mg, ein- bis dreimal täglich liegen.
Beschreibung der Figuren
1 – Änderungen der EEG-Spektralleistung nach Gabe der Cholin-Derivate. A. Kontrolle; B. Wirkung nach Gabe von CDP-Cholin (5 mg i.p.); C. Wirkung nach Gabe von PC-1 (Pivaloylcholiniodid); D. Wirkung nach Gabe von PC-2 (Pivaloylcholintrimethylacetat). Die Zeit (Minuten) ist auf der Abszisse angegeben, die als μV²/s ausgedrückte EEG-Leistung ist auf der Ordinate angegeben. Die Graphik zeigt die EEG-Gesamtspektralleistung (0,25–16 Hz).
2 – Wirkung auf die EEG-Spektralleistung nach Behandlung mit Atropin (0,1 mg i.p.), gegeben 1 5 Minuten vor PC-1 (5 mg i.p.). Die Zeit (Minuten) ist auf der Abszisse angegeben, die als μV²/s angegebene EEG-Spektralleistung ist auf der Ordinate angegeben. Die Graphik gibt die EEG-Gesamtspektralleistung an (0,25 bis 16 Hz).
3 – Graphische Darstellung des EEG-Spektrums bei Ratten. Quantitative Analyse des Beitrags jeder EEG-Spektral-Komponente zur cerebralen elektrischen Aktivität nach Gabe der Cholin-Derivate. Die Abnahme der langsamen Komponenten (delta und theta) des Spektrums nach Gabe von PC-1 und PC-2 in Beziehung zur EEG-Desynchronisation ist bemerkenswert.
4A – Wirkung auf die EEG-Spektralleistung nach Behandlung mit PC-1 (0,5 mg i.p.).
4B – Wirkung auf die EEG-Spektralleistung nach Behandlung mit PC-1 (5 mg i.p.), gegeben 15 Minuten nach Mikroinfusion von Hch3 (0,1 ng (0,5 μl) in das III-Ventrikel. Wie in 4A ist die Zeit (Minuten) auf der Abszisse angegeben, die als μV²/s ausgedrückte EEG-Spektralleistung ist auf der Ordinate angegeben. Die Graphik gibt die EEG-Gesamtspektraleistung an (0,25 bis 16 Hz).
5 – Graphische Darstellung des neuronalen Verlustes im NBM nach AMPA-induzierter exzitotoxischer Läsion.
6 – Graphische Darstellung der durch Gabe von PC-1 (5 mg i.p.) induzierten Wirkungen auf die EEG-Gesamtspektralleistung bei Tieren, die einer unilateralen Läsion des NBM unterzogen wurden (Läsion durch AMPA bewirkt).
7 – Wirkung auf die EEG-Gesamtspektralleistung im Anschluss an eine exzitotoxische NBM-Läsion (AMPA 1,3 μg/0,5 μl). Vergleich zwischen der absoluten EEG-Spektralleistung in den ipsilateralen Hemisphären und einer Läsion bei verschiedenen Gruppen von Ratten (Kontrolle, Sham-behandelt, mit Läsion, und mit Läsion, PC-1 behandelt). Es sollte beachtet werden, dass die Gabe von PC-1 (5 mg i.p.) sowohl die normale Zusammensetzung des EEG-Spektrums als auch die Verteilung seiner Frequenzen wieder herstellt, Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung in größerem Detail.
Beispiele
Beispiel 1 – Herstellung von Verbindungen der Formel (I)
Die Herstellung von anorganischen Pivaloylcholin-Salzen ist in „Collection Czechoslovak Chem. Commun. Vol. 51, 1986, Seiten 206 bis 214" beschrieben. Zwei mögliche Synthesestrategien sind im folgenden angegeben.
1) Pivaloylcholiniodid
Eine Lösung von 2,00 g 2-Dimethylaminoethanol (0,022 Mol) und 3,1 ml Triethylamin (0,022 Mol) in 20 ml trockenem Ethylether, gekühlt im Eisbad, wird langsam mit 2,7 ml (0,022 Mol) Pivaloylchlorid, gelöst in 10 ml trockenem Ethylether, versetzt. Nach Ende der Zugabe wird die Lösung bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt, filtriert und eingedampft; der resultierende Rückstand wird direkt für die nachfolgende Reaktion verwendet. Die Iodmethylierung wird durch Verdünnung des Esters mit 20 ml Aceton und Zugabe von 2 ml Methyliodid durchgeführt. Nach Rühren während fünf Minuten fällt ein weißer Feststoff aus, der aus Ethanol kristallisiert. 2,8 g eines kristallinen weißen Produktes mit dem Schmelzpunkt 198 bis 200°C werden erhalten.
2) Pivaloylcholintrimethylacetat
Silbertrimethylacetat wird separat hergestellt, indem 3,9 g Natriumtrimethylacetatmonohydrat (0,031 Mol) in 10 ml Ethanol gelöst werden und langsam eine Lösung von 5,4 g AgNO₃ (0,031 Mol) in 10 ml einer Ethanol/Wasser 1:1-Mischung zugegeben wird. 6 g eines weißen Feststoffs werden erhalten, der filtriert, mit Ethanol gewaschen und getrocknet wird.
3,8 g Pivaloylcholiniodid (0,012 Mol) werden in 20 ml Wasser gelöst und mit 2,70 g Silbertrimethylacetat (0,012 Mol) versetzt. Das ausgefallene Agl wird abfiltriert und die wässrige Phase wird zur Trockne eingedampft. Der resultierende feste Rückstand ist hygroskopisch und kristallisiert aus trockenem EtOH/Et₂O (Schmelzpunkt 200 bis 202°C).
Beispiel 2 – Pharmakologische Tests
Methoden
Junge männliche Wistar-Ratten (200 bis 260) wurden bei den Experimenten verwendet, und unter Standart-Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen mit Futter und Wasser ad libitum gehalten.
1) Chirurgische Verfahren
Die mit Chloralhydrat (400 mg/kg) während des gesamten Experimentes betäubten Tiere wurden stereotaxisch mit kortikalen Elektroden (n = 4) (Kopf-Instrumente) auf der fronto-parietalen Region des Neokortex an beiden cerebralen Hemisphären implantiert, um das EEG aufzuzeichnen. Nach dem Eingriff wurden alle Tiere 48 Stunden im Käfig gehalten, um die vollständige Erholung zu ermöglichen.
2) Spektrale qualitative und quantitative EEG-Analyse
48 Stunden nach der Elektroden-Implantation wurden die Tiere, während sie sich in einer transparenten Box befanden und sich frei bewegten, mit einem Elektroenzephalographen verbunden, und die elektrokortikale Aktivität wurde kontinuierlich aufgezeichnet und überwacht. Nach einer 30minütigen Kontrollzeit wurden die Testverbindungen intraperitoneal gegeben und die EEG-Aufzeichnung wurde während 90 bis 120 Minuten fortgesetzt.
Das EEG wurde durch eine computerisierte 24-Kanal-Apparatur (Vega 24, Galileo-Typ, ESA-OTE Biomedica, Florenz, Italien) aufgezeichnet, während die spektrale Aktivität quantitativ mit einem Berg Fourier-Analysator (ESA-OTE Biomedica, Florenz, Italien) analysiert wurde. Die Gesamt-EEG-Leistung (0,25 bis 16 Hz Bereich) wurde in 5 variable Frequenzbänder aufgeteilt; δ 0,25–3 Hz, θ 3–6; α₁ 6–9; α₂ 9–12 und β 12–16 Hz.
Die qualitative und quantitativ Analyse der elektrokortikalen Aktivität in der EEG-Aufnahme wurde anschließend durchgeführt.
3) Cholin-spezifisches Transportsystem (HUCT) auf dem präsynaptischen Niveau
Den Tieren wurde intracerebroventrikulär (ICV) Hemicholinium-3 (Hch3) verabreicht, ein potenter und selektiver Cholinaufnahmehemmer, um einen der vorgeschlagenen Wirkungsmechanismen zu bestätigen.
4) Läsion des Meynert-Nucleus basalis (NBM)
Männliche Wistar-Ratten (200–250 g), betäubt mit Chloralhydrat (400 mg/kg), wurden durch intracerebrale Infusion von α-Amino-3-hydroxy-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) (1,3 μg/0,5 μl) einer unilateralen Läsion des Meynert-Nucleus basalis (NBM) unterzogen. Die Tiere wurden in vier Gruppen aufgeteilt, die ersten beiden wurden der NBM-Läsion unterzogen; die dritte war eine Sham-behandelte Gruppe und die letzte war die Kontrollgruppe. Zwei Wochen nach der Läsion wurden den Tieren unter Vollnarkose kortikale Elektroden (n = 4) auf die fronto-parietale Region implantiert, um so 24 Stunden später die Aufzeichnung der EEG-Aktivität der sich frei bewegenden Tiere zu ermöglichen. Die EEG-Aktivität wurde kontinuierlich überwacht und während 60 Minuten durch eine computerisierte EEG-Berg Fourier-Apparatur aufgezeichnet. Die spontane Aktivität der EEG-Spektralgesamtleistung (0,25 bis 1 6 Hz), genauso wie die der vorgewählten Frequenz-Bänder wurde während Zeiten von 5 Minuten aufgezeichnet und quantitativ bestimmt (μV).
5) Morphologische Untersuchung
Um den AMPA-induzierten neuronalen Verlust in NBM quantitativ zu bestimmen, wurden coronale serielle Schnitte des Rattengehirns hergestellt, dann mit Toluidin-Blau gefärbt, um die Injektionsstelle zu bestätigen, und durch ein immunohistochemisches Verfahren mit 192LR-NGF behandelt, um den neuronalen Verlust quantitativ zu bestimmen. Diese Schnitte wurden durch ein computerisiertes Bildanalyse-System analysiert (Axiophoy Zeis und Vidas Kintron). Die statistische Analyse der Daten aus der morphologischen Studie wurde durch ANOVA durchgeführt, gefolgt vom post-hoc Tuckey-Kramer-Test, falls sie signifikant waren.
6) Verwendete Verbindungen
Die Tiere wurden in 4 Gruppen aufgeteilt, die erste Gruppe diente als Kontrolle, die zweite erhielt Cytidin-5'-diphosphocholin (CDP-Cholin), die dritte und vierte erhielt jeweils PC-1 bzw. PC-2 (Pivaloylcholiniodid und Pivaloylcholintrimethylacetat). Die Kontrollgruppe erhielt nach demselben Verfahren ein gleiches Volumen Kochsalzlösung.
7) Statistische Analyse
Die Daten der EcoG-Aufzeichnung, die während Perioden von 5 Minuten durchgeführt wurde, wurden in eine 30 Minuten Kontrollperiode und, nach Verabreichung der Verbindungen, in jeweils Perioden von 15 Minuten aufgeteilt. Die statistische Analyse wurde durch Varianzanalyse (ANOVA) für multiple Messungen durchgeführt, gefolgt vom, falls signifikant, post-hoc Tuckey-Kramer-Test. Ein Vergleich zwischen den Gruppen wurde durchgeführt, um jede individuelle Variabilität auszuschließen.
Ergebnisse
Die intraperitoneale Gabe von PC-1 (5 mg i.p.) bei Ratten produzierte 15 Minuten später eine Verhaltensantwort alert, eine EEG-Desynchronisation und eine signifikante Abnahme (P < 0,05) der EEG-Spektralgesamtleistung, welche 15 Minuten andauerte (1C und 3; Tabelle 1 und 2); der Abfall der Gesamt-EEG-Leistung betraf die niedrigsten Frequenz-Bänder (0,25–3 und 3–6 Hz). Bei der Ratte induzierte die Gabe von PC-2 (5 mg i.p.) innerhalb von 15 Minuten eine Alert-Antwort; EEG-Desynchronisation und eine signifikante Abnahme (P < 0,01) der EcoG-Gesamtleistung genauso wie der in den niedrigen Frequenz-Bändern (0,25–3 Hz), die etwa 30 Minuten andauerte (1D und 3; Tabelle 1 und 2). Es sollte festgehalten werden, dass 60 Minuten nach der Gabe von PC-2 das EEG eine schnelle Frequenz-Aktivität (etwa 16 Hz) und einen signifikanten Anstieg (P < 0,01 ) der EcoG-Gesamtleistung zeigte (1D). Die anschließende quantitative Analyse des EEG-Spektrums zeigte, dass diese Änderung auf einen signifikanten Anstieg (P < 0,05) des β-Rhythmus zurückzuführen war (12–16 Hz). Die Gabe von CDP-Cholin (5 mg i.p.), verwendet als Kontrollwirkstoff, induzierte 60 Minuten nach der Gabe eine EEG-Desynchronisation und eine signifikante Abnahme (P < 0,05) der EcoG-Spektralgesamtleistung (1B und 3; Tabelle 1 und 2) genauso wie die der 0,25–3 und 3–6 Hz Frequenz-Bänder. Gabe von Atropin, 15 Minuten vor der Gabe von CDP-Cholin, PC-1 und PC-2 konnte diese durch die Gabe aller dieser Vorläufer der Acetylcholinsynthese hervorgerufenen Effekte antagonisieren (2). Als weitere Kontrolle induzierte die Gabe eines Vehikels mit demselben Verfahren und demselben Volumen in einer Gruppe von Tieren keine Änderungen im Verhalten und im EEG (1A, Tabelle 1 und 2).
Weiter zeigte die ANOVA-Analyse ein hochsignifikantes Ergebnis, d.h. Wirkstoff × Zeit-Wechselwirkung: F = 4,77 (4,112) P < 0,001 und Wirkstoff/Wirkstoff-Wechselwirkung: F = 16,4 (28, 112) P < 0,0001.
Die bei der Ratte nach Gabe der Cholin-Derivate und nach Gabe des Vehikels beobachteten EEG-Muster und Verhaltenseffekte sind in Tabelle 3 angegeben. Solche Effekte können den Änderungen der EEG-Spektralgesamtleistung zugeschrieben werden. Ein Anstieg der EEG-Gesamtleistung hängt mit dem Vorhandensein von niedrig-frequenten Wellen zusammen (Synchronisation), während der Anstieg davon mit der Anwesenheit schneller Frequenzwellen zusammenhängt (Desynchronisation).
Die ICV-Gabe von Hch3 (1 μg–0,1 ng) induzierte beim Tier Verhaltenssedierung und Schlaf, EEG-Synchronisation und einen Anstieg der EEG-Gesamtleistung (0,25–16 Hz).
Die intraperitoneale Gabe von PC-1 beim Tier in der aktiven Dosis, nach Hch3-Vorbehandlung, induzierte weder Alert-Antwort noch EEG-Desynchronisation, wobei diese Effekte im Gegensatz dazu als Folge der Gabe von PC-1 allein beobachtet wurden (4B).
In Tieren mit Läsionen (n = 16), mit ungefähr 45 % neuronalem Verlust auf dem NBM-Niveau (5), wurde eine EEG-Synchronisation beobachtet, begleitet von einem signifikanten Anstieg (P < 0,01) der Gesamtleistung (0,25–16 Hz), (170,4 ± 25,8) des EEG-Spektrums (μV), genauso wie bei den höheren Frequenz-Bändern (6–9, 9–12 und 12–16 Hz) (7; Tabelle 4). Die EEG-Aktivität der Hälfte der Tiere mit NBM-Läsionen wurde weiter aufgezeichnet, Nach Aufzeichnung der Basis-EEG-Aktivität wurde dieser Gruppe von Tieren intraperitoneal eine einzelne PC-1-Dosis gegeben.
Die intraperitoneale Gabe von PC-1 (5 mg i.p.) induzierte innerhalb von 15 Minuten eine Verhaltensantwort alert, eine EEG-Desynchronisation und eine signifikante Abnahme (P < 0,05) der EcoG-Spektralgesamtleistung, die während etwa 15 Minuten andauerte (150 ± 19,3; 96 ± 20,3). Eine anschließende quantitative Analyse des EEG-Spektrums zeigte, dass diese Änderung auf eine signifikante Abnahme (P < 0,05) des δ-Rhythmus (0,25–3 Hz) zurückzuführen war (6 und 7; Tabelle 4).
Die als Kontrolle verwendeten Tiere (n = 12), (101 ± 6,8) oder die Shambehandelten Tiere (n = 12), (106 ± 6,7) zeigten weder qualitative noch quantitative EEG-Änderungen im Verhalten und der cerebralen elektrischen Aktivität (7 und Tabelle 4).
Beispiel 3 – Synergistischer Effekt
Die Gabe von Tacrin (THA, 5 mg/kg i.p.) 30 Minuten vor der intraperitonealen Injektion von PC-1 und PC-2 (15 μmol i.p.) (n = 7 Tiere pro Test) erhöhte die EEG-Effekte von beiden Derivaten (Träger), indem eine langandauernde EEG-Desynchronisation und eine signifikante Abnahme der EEG-Spektralgesamtleistung (Tabelle 2) genau wie der nieder-frequenten Bänder (0,25–3 und 3–6 Hz) bewirkt wurde. Die EEG-Änderungen waren von einer Verhaltens-Alert-Antwort begleitet. Die in Tabelle 5 angegebenen Ergebnisse zeigen die synergistische Wirkung der Kombination von Tacrin mit den erfindungsgemäßen Cholin-Derivaten.
Tabellen
Tabelle 1 Quantitative Analyse der unterschiedlichen EEG-Frequenzen bei Ratten nach Gabe der verschiedenen Cholin-Derivate.

(*) = P < 0,05; (**) P < 0,01 vs Kontrolle. Die Ergebnisse sind als % ± SEM ausgedrückt.

Tabelle 3 Bei Ratten beobachtete Verhaltens- und EEG-Effekte nach Gabe von Vehikel (dasselbe Volumen Kochsalzlösung mit demselben Verfahren gegeben) und verschiedenen Cholin-Derivaten in unterschiedlichen Dosen. Die EEG-Effekte sind den Änderungen der Gesamtleistung (μV) im EEG-Spektrum zuzuschreiben. Ein Anstieg der EEG-Gesamtleistung hängt zusammen mit dem überwiegenden Vorkommen von niederfrequenten Wellen (Synchronisation), während ihre Abnahme mit dem Vorkommen von schnellen Frequenzwellen zusammenhängt (Desynchronisation). Die als Spikes angegebenen Elemente sind ein Index von Leiden und/oder neuronalen Schäden; unter dem Verhaltensaspekt stehen sie in der Tat mit konvulsiven Manifestationen im Zusammenhang.
Tabelle 4 Quantitative Analyse der EEG-Spektralgesamtleistung in unterschiedlichen Gruppen von Tieren mit und ohne unilaterale NBM-Läsion. Der Vergleich wurde mit der ipsilateralen Hemisphäre im Vergleich zur Läsion durchgeführt.

(*) = p < 0,05; (**) = P < 0,01 vs Kontrolle. Die Werte sind in % ausgedrückt.

Referenzen

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Claims

Verbindungen der Formel (I): (CH₃)₃C-COO-CH₂CH₂-N⁺(CH₃)₃X^-, worin X^- Jodid oder ein Pivalinsäureanion ist, zur Verwendung in der Behandlung von Erkrankungen, die im Zusammenhang mit einem zentralcholinergen Defizit stehen.
Verbindungen nach Anspruch 1, für die Behandlung der Alzheimer-Erkrankung oder von Erkrankungen des Alzheimertyps.
Eine Kombination einer Verbindung der Formel (1) mit Tacrin für die gleichzeitige, getrennte oder sequentielle Anwendung in der Behandlung von Erkrankungen, die im Zusammenhang mit einem zentralcholinergen Defizit stehen.
Eine Kombination nach Anspruch 4 für die Behandlung der Alzheimer-Erkrankung oder von Erkrankungen des Alzheimertyps.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine oder mehrere der Verbindungen der Formel (I), wahlweise in Kombination mit Tacrin, zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Vehikeln und Exzipienten.