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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolation von antiprotozoalen
Saponinen aus Pflanzen, die zur Familie Myrsinaceae gehören, und
die Verwendung dieser Saponine zur Herstellung eines Arzneimittels
zur Behandlung von sowohl menschlichen als auch tierischen Wirten,
die mit Protozoen-Parasiten der Gattung Leishmania infiziert sind,
sowie für
die Linderung von klinischen Manifestationen von, bzw. Heilung von
Krankheiten, die unter der Bezeichnung Leishmaniasen bekannt sind,
bei diesen Wirten.
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Bei
den Leishmaniasen existieren verschiedenste Krankheitsanzeichen,
die sich in ihrer Schwere und ihrer Auswirkung auf die Gesundheit
stark unterscheiden. In erster Linie handelt es sich bei Leishmaniasen
um Leiden mit Erschöpfungszuständen, die
von verschiedenen Leishmania-Arten verursacht und von unterschiedlichen
Phlebotomine-Sandfliegen übertragen
werden. Leishmaniasen scheinen wesentlich öfter vorzukommen und von größerer Bedeutung
für die
Volksgesundheit zu sein, als bis jetzt angenommen wurde. Die Bekämpfung von
Leishmania-Infektionen ist deshalb kompliziert, weil viele Sandfliegenarten
als Vektoren in Frage kommen, weil viele Tierarten als Zwischenwirte
dienen können
und weil Diagnoseverfahren (klinische, serologische, parasitologische
Verfahren) nicht immer anwendbar sind bzw. diagnostisch nur von
beschränktem Wert
sind.
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Bei
den Manifestationen kann es sich um Manifestationen an den Eingeweiden,
an Haut und Schleimhaut sowie nur an der Haut handeln; der Stamm
des infizierenden Organismus sowie der immunologische Zustand des
Wirts können
die klinischen Manifestationen und das Endergebnis der parasitischen
Erkrankung beeinflussen. Die Behandlung von Leishmaniasen ist kompliziert,
und eine längere
systemische Behandlung unabdingbar. Die Behandlungsziele bestehen
darin, den menschlichen oder tierischen Patienten von einer intrazellulären parasitischen
Infektion zu heilen, Rückfälle zu vermeiden,
zu vermeiden, daß der
Patient nicht ansprechend wird und die Kosten für einen Krankenhausaufenthalt
und die Behandlung insgesamt so gering wie möglich zu halten. Um diese Ziele
zu erreichen, müssen
geeignete Arzneistoffe in entsprechenden Dosierungen und in einer
entsprechenden Häufigkeit
ausreichend lang verabreicht werden. Trotz intensiver Forschung bei
der Suche nach wirksamen, gut verträglichen Leishmanienmittel wurden
nur wenige Mittel entdeckt, die für den Patienten verfügbar sind.
Zur Zeit werden üblicherweise
als Arzneistoffe der ersten Wahl zwei fünfwertige Antimonverbindungen
verwendet, die tief in den Muskel injiziert werden müssen, nämlich Meglumin-Antimonat (GlucantimTM, Farmitalia) sowie Natriumstibogluconat
(PentostamTM, Wellcome). Arzneistoffe der
zweiten Wahl sind Amphothericin-B (insbesondere die Liposomenformulierungen),
Pentamidin und Allopurinol. Die zur Zeit verfügbaren Therapien sind nur ungenügend wirksam
und führen
zu toxischen Nebenwirkungen beim Patienten. Außerdem ist ihr Wirkungsspektrum
nicht breit genug. Deshalb besteht nach wie vor ein Bedarf an neuen Arzneistoffen.
Die vorliegende Identifikation von neuen Wirkstoffen wird bei der
Behandlung von Krankheiten, die von Protozoen-Parasiten der Gattung
Leishmania verursacht werden, Verwendung finden.
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In
Phytochemistry, 41 (1), 1996, S. 269-277 und Journal of Pharmaceutical
and Biomedical Analysis 18 (4,5), 1998, S. 737-743 werden Triterpenoidsaponine
beschrieben, die aus den Blättern
von Maesa lanceolata isoliert werden. In Journal of Natural products
61 (5), 1998, S. 585-590 wird die Auswertung von biologischen Wirksamkeiten
von Triterpenoidsaponinen aus Maesa lanceolata in Viruzid-Assays,
antimykotischen Assays und Molluskizid-Assays beschrieben.
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Unerwarteterweise
wurden Triterpensaponine mit einer sehr guten prophylaktischen und
therapeutischen Wirksamkeit gegen Leishmania aus der Pflanze Maesa
balansae, einer Art der Familie Myrsinaceae, Gattung Maesa, isoliert.
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Die
Erfindung betrifft auch ein alternatives Verfahren zur Isolation
von Triterpensaponinen aus Pflanzen, die zur Familie Myrsinaceae
gehören,
dadurch gekennzeichnet, daß das
Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
- (a)
Extrahieren der getrockneten Pflanzenteile mit einem Alkohol und
Einengen des Extrakts,
- (b) Entfernen der unpolaren Fraktion aus dem Extrakt mittels
Flüssig-Flüssig-Extraktion
mit einem unpolaren Lösungsmittel,
- (c) weitere Aufreinigung der Saponine in dem Alkoholextrakt
mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion,
Filtration und Chromatographie.
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Der
Alkohol ist insbesondere Methanol, Ethanol, Isopropanol, Butanol,
jeweils gegebenenfalls in Abmischung mit Wasser, vorzugsweise eine
70:30-Mischung aus Ethanol und Wasser; das unpolare Lösungsmittel
ist ein Kohlenwasserstoff, z.B. Hexan.
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Werden
die Saponine aus der Pflanzengattung Maesa isoliert, kann die Chromatographie
eine Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie
mit einem Gradientenelutionssystem unter Verwendung von
A:
0,5% Ammoniumacetat in Wasser
B: Methanol
C: Acetonitril
wobei
zum Zeitpunkt t = 0 (A:B:C)=(60:20:20)
und zum Zeitpunkt t
= Ende (A:B:C)=(0:50:50), oder eine Direktphasen-Flüssigkeitschromatographie
an Silicagel umfassen.
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Bei
diesen Verfahren fällt
ein Gemisch an, das im wesentlichen aus Saponinen besteht. Dieses
Saponingemisch wurde in vielen pharmakologischen Versuchen, die
im Versuchsteil beschrieben sind, verwendet. Für die Strukturaufklärung wurde
dieses Gemisch wie im Versuchsteil beschrieben mittels HPLC in die
Einzelbestandteile aufgetrennt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein oder mehrere Triterpensaponine,
die nach den im vorliegenden Text beschriebenen Verfahren hergestellt
werden können,
egal, ob als Gemisch oder in Form der aufgereinigten Produkte.
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Insbesondere
betrifft die Erfindung Triterpensaponine, die von der Pflanzengattung
Maesa mittels Chromatographie umfassend eine Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie
mit einem Gradientenelutionssystem unter Verwendung von
A:
0,5% Ammoniumacetat in Wasser
B: Methanol
C: Acetonitril
wobei
zum Zeitpunkt t = 0 (A:B:C)=(60:20:20)
und zum Zeitpunkt t
= Ende (A:B:C)=(0:50:50) und
wobei das Saponin die folgenden
Kennwerte aufweist:
Verbindung 1: MG = 1532, λmax =
228,6 nm, λmax2 = 273,3 nm; tR =
8,97
Verbindung 2: MG = 1510, λmax =
223,9 nm, λmax2 = 274,5 nm; tR =
9,39
Verbindung 3: MG = 1532, λmax =
279,2 nm, λmax2 = 223,9 nm; tR =
9,68
Verbindung 4: MG = 1510, λmax =
280,4 nm, λmax2 = 222,7 nm; tR =
10,09
Verbindung 5: MG = 1574, λmax =
276,8 nm, λmax2 = 225,0 nm; tR =
10,87 bzw.
Verbindung 6: MG = 1552, λmax =
279,2 nm, λmax2 = 223,9 nm; tR =
11,37;
erhältlich
sind.
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Die
relative Retentionszeit tR ist der Mittelwert
von 10 Bestimmungen gegen die Retentionszeit von Uracil an einer
Hypersil BDS C-18 Säule,
3 μm, 100 × 4 mm.
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Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung Triterpensaponine der Formel
in der
R
2 -O(C=O)C
6H
5 oder -O(C=O)C(CH
3)=CHCH
3 bedeutet,
R
3 (E)-
oder (Z)-O(C=O)CH=CH-C
6H
5 bedeutet
und
R
4 Wasserstoff oder -(C=O)CH
3 bedeutet,
insbesondere diejenigen,
bei denen
in Verbindung 1 R
2 -O(C=O)C
6H
5 bedeutet,
R3
(Z)-O(C=O)CH=CH-C
6H
5 bedeutet,
R
4 Wasserstoff bedeutet;
in Verbindung
2 R
2 -O(C=O)C(CH
3)=CHCH
3 bedeutet,
R
3 (Z)-O(C=O)CH=CH-C
6H
5 bedeutet,
R
4 Wasserstoff bedeutet;
in Verbindung
3 R
2 -O(C=O)C
6H
5 bedeutet,
R
3 (E)
-O(C=O)CH=CH-C
6H
5 bedeutet,
R
9 Wasserstoff bedeutet;
in Verbindung
4 R
2-O(C=O)C(CH
3)=CHCH
3 bedeutet,
R
3 (E)-O(C=O)
CH=CH-C
6H
5 bedeutet,
R
4 Wasserstoff bedeutet;
in Verbindung
5 R
2 -O(C=O)C
6H
5 bedeutet,
R
3 (E)
-O(C=O)CH=CH-C
6H
5 bedeutet,
R
4 -(C=O)CH
3 bedeutet;
in
Verbindung 6 R
2 -O(C=O)C(CH
3)=CHCH
3 bedeutet,
R
3 (E)
-O(C=O)CH=CH-C
6H
5 bedeutet,
R
4 -(C=O)CH
3 bedeutet.
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Bevorzugte
Verbindungen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen
und Behandlungsverfahren sind die Verbindungen 3 und 4, insbesondere
Verbindung 3.
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Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von einem oder
mehreren Triterpensaponinen für
die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung
von Leishmaniasen in Wirten, die mit Leishmania-Arten infiziert
sind, dadurch gekennzeichnet, daß das Saponin die Formel (I)
oder eine ihrer stereoisomeren
Formen oder eines ihrer pharmazeutisch unbedenklichen Additionssalze
aufweist, in der
R
1 Wasserstoff, -(C=O)C
1-5-Alkyl, -(C=O)C
2-5-Alkenyl,
phenylsubstituiertes -(C=O)C
2-5-Alkenyl,
eine Monosaccharidgruppe oder eine Oligosaccharidgruppe bedeutet;
R
2 Wasserstoff, Hydroxy, -O(C=O)C
1-5-Alkyl,
-O(C=O)C
2-5-Alkenyl, -O(C=O)C
6H
5 oder phenylsubstituiertes -O(C=O)C
2-5-Alkenyl bedeutet;
R
3 Wasserstoff,
Hydroxy, -O(C=O)C
1-5-Alkyl, -O(C=O)C
2-5-Alkenyl, -O(C=O)C
6H
5 oder phenylsubstituiertes -O(C=O)C
2-5-Alkenyl bedeutet;
R
4 Wasserstoff,
C
1-6-Alkyl, -(C=O) C
1-5Alkyl,
-(C=O)C
2-5-Alkenyl, -(C=O)C
6H
5 oder phenylsubstituiertes -(C=O)C
2-5-Alkenyl bedeutet;
R
5 CH
3, CH
2OH, CH
2OCH
3, CH
2O-C(=O)CH
3, CHO,
COOH bedeutet; oder
R
5 und R
2 einen zweiwertigen Rest der Formel -C(=O)-O-
bilden;
R
6 und R
7 Wasserstoff
bedeuten oder gemeinsam eine Bindung bilden; oder
R
5 und R
6 einen zweiwertigen
Rest der Formel
-CH2-O- (a), -CH(OR13)-O- (b), -C(=O)-O- (c)in
der R
13 Wasserstoff, C
1-6-Alkyl
oder -(C=O)C
1-5-Alkyl bedeutet,
bilden;
R
8α und
R
8β jeweils
unabhängig
voneinander CH
3, CH
2OH,
CH
2OCH
3, CH
2O-C(=O)C
1-5-Alkyl,
CHO, CH (OCH
3)
2,
CH=NOH, COOH bedeuten; oder
R
8β und
R
3 einen zweiwertigen Rest der Formel -C(=O)-O-
bilden; oder
R
8β und R
5 einen
zweiwertigen Rest der Formel -CH
2O-CHOH-
bilden;
R
9 CH
3,
CH
2OH, CH
2OCH
3, CH
2O-C(=O)C
1-5-Alkyl, CHO, COOH bedeutet;
R
10 CH
3, CH
2OH, CH
2OCH
3, CH
2O-C(=O)C
1-5-Alkyl, CHO, COOH bedeutet;
R
11 Wasserstoff, Hydroxy oder O-C(=O)C
1-5-Alkyl bedeutet, oder R
10 und
R
11 einen zweiwertigen Rest der Formel -CH
2O- bilden; und
R
12 CH
3, CH
2OH, CH
2OCH
3, CH
2O-C(=O)CH
3, CHO,
CH=NOH oder COOH bedeutet.
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Bevorzugte
Verbindungen der Formel (I) sind diejenigen, in denen
R1 Wasserstoff, -(C=O)C1-5-Alkyl
oder eine Oligosaccharidgruppe bedeutet;
R3 Wasserstoff,
Hydroxy, -O(C=O)C1-5-Alkyl, -O(C=O)C2-5-Alkenyl, phenylsubstituiertes -O(C=O)C2-5-Alkenyl bedeutet;
R4 Wasserstoff,
C1-6-Alkyl, -(C=O)C1-5-Alkyl,
-(C=O)C2-5-Alkenyl bedeutet;
R5 CH2OH, CH2O-C(=O)CH3, CHO
bedeutet; und
R6 und R7 gemeinsam
eine Bindung bilden; oder
R5 und R6 einen zweiwertigen Rest der Formel -CH2-O- (a), -CH(OR13)-O- (b), -C(=O)-O- (c)in
der R13 Wasserstoff, C1-6-Alkyl
oder -(C=O)C1-5-Alkyl bedeutet,
bilden;
und
R7 Wasserstoff bedeutet;
R8α CH3 bedeutet;
R8β CH3, CH2OH, CHO, CH
(OCH3)2, CH=NOH,
COOH bedeutet; oder
R8β und R3 einen
zweiwertigen Rest der Formel -C(=O)-O- bilden; oder
R8β und
R5 einen zweiwertigen Rest der Formel -CH2O-CHOH- bilden;
R10 CH3, CH2OH bedeutet;
R11 Wasserstoff, Hydroxy oder O-C(=O)C1-5-Alkyl bedeutet; oder
R10 und
R11 einen zweiwertigen Rest der Formel -CH2O- bilden; und
R12 CH3, CH2OH, CH2O-C(=O)CH3, CHO
oder CH=NOH bedeutet.
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Besonders
bevorzugte Verbindungen der Formel (I) sind diejenigen, in denen
R1 Wasserstoff oder eine Oligosaccharidgruppe
bedeutet;
R2 Wasserstoff, Hydroxy,
-O(C=O)C1-5-Alkyl, -O(C=O)C2-5-Alkenyl,
-O(C=O)C6H5 oder
phenylsubstituiertes -O (C=O) C2-5-Alkenyl
bedeutet;
R3 Wasserstoff, Hydroxy,
-O (C=O) C1-5-Alkyl, -O(C=O)C2-5-Alkenyl
oder phenylsubstituiertes -O (C=O) C2-5-Alkenyl
bedeutet;
R9 Wasserstoff, C1-6-Alkyl, -(C=O)C1-5-Alkyl,
-(C=O)C2-5-Alkenyl oder phenylsubstituiertes -(C=O)C2-5-Alkenyl bedeutet;
R5 CH2OH, CH2OCH3, CH2O-C(=O)CH3, CHO, COOH bedeutet; und
R6 und R7 gemeinsam
eine Bindung bilden; oder
R5 und R6 einen zweiwertigen Rest der Formel -CH2-O- (a), -CH(OR13)-O- (b), -C(=O)-O- (c),in
der R13 Wasserstoff bedeutet, bilden; und
R7 Wasserstoff bedeutet;
R8α und
R8β beide
CH3 bedeuten;
R9 CH3 bedeutet;
R10 CH3 bedeutet;
R11 Wasserstoff
bedeutet; und
R12 CH bedeutet.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können
nach fachbekannten Verfahren ineinander überführt werden. Besonders interessante
Verfahren sind die Verseifung in basischen Medien, die Umesterung
in sauren Medien, sowie der enzymatische Abbau des Oligosaccharidrests
zu Aglyconen, d.h. Verbindungen der Formel (I), in denen R1 Wasserstoff bedeutet.
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Für die Behandlung
von Leishmaniasen können
die Verbindungen der Formel (I) oral, topisch, parenteral, mittels
Inhalationsspray oder rektal in Einzeldosisformen, die traditionelle
nichttoxische pharmazeutisch annehmbare Träger, Hilfsstoffe und Grundstoffe
enthalten, verabreicht werden. Im vorliegenden Zusammenhang beinhaltet
der Ausdruck parenteral die subkutane Injektion, die intravenöse, intramuskuläre, intrasternale Injektion,
die intraartikuläre
Injektion oder Infusionstechniken bei Patienten, die von Infektion
mit Leishmanien bedroht sind.
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Die
den Wirkstoff enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können in
einer Form vorliegen, die sich für
die orale Verwendung eignet, z. B. in Form von Tabletten, Trochisci,
Pastillen, wäßrigen oder öligen Lösungen oder
Suspensionen, dispergierbaren Pulvern oder Granulaten, Emulsionen,
Steckkapseln, Weichkapseln, Sirupen oder Elixiren. Zusammensetzungen,
die für
die orale Verwendung bestimmt sind, können nach einem beliebigen
galenischen Verfahren hergestellt werden, und diese Zusammensetzungen
können einen
oder mehrere Mittel aus der Reihe Süßungsmittel, Geschmacksstoffe,
Farbstoffe und Konservierungsmittel enthalten, um zu einem pharmazeutisch
eleganten und schmackhaften Präparat
zu gelangen. Tabletten enthalten den Wirkstoff in Abmischung mit
nichttoxischen pharmazeutisch annehmbaren Grundstoffen, die sich
für die
Tablettenherstellung eignen, darunter inerte Streckmittel, Granulierhilfsmittel,
Sprengmittel und Gleitmittel, was jedoch keine Einschränkung darstellen
soll. Die Tabletten können
unbeschichtet oder auf bekannte Weise beschichtet sein, um das Zerfallen
und die Resorption im Magen-Darm-Trakt zu verzögern, wodurch man zu einer
Arzneiform mit hinhaltender Wirkstofffreigabe über einen längeren Zeitraum gelangt, um einen
unangenehmen Geschmack bzw. ein unangenehmes Mundgefühl zu maskieren,
oder um das Aussehen und die Erkenntlichkeit zu verbessern.
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Wäßrige Suspensionen
enthalten die Wirkstoffe in Abmischung mit Grundstoffen, die sich
für die
Herstellung von wäßrigen Suspensionen
eignen. Solche Grundstoffe sind Suspendiermittel, Dispergiermittel
oder Netzmittel. Diese wäßrigen Suspensionen
können
auch ein oder mehrere Konservierungsmittel enthalten, und ölige Suspensionen
können
dadurch formuliert werden, daß man
den Wirkstoff in einem geeigneten pflanzlichen Öl oder in einem Mineralöl, wie Paraffinöl, suspendiert.
Die öligen
Suspensionen können
Verdickungsmittel, Süßmittel
und Geschmacksstoffe enthalten, um zu einem schmackhaften Oralpräparat zu
gelangen. Diese Zusammensetzungen können durch Zusatz eines annehmbaren
Antioxidans konserviert werden.
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Dispergierbare
Pulver und Granulate, die sich für
die Herstellung von wäßrigen Suspensionen
durch Zugabe von Wasser eignen, stellen den Wirkstoff in Abmischung
mit einem Dispergiermittel oder Netzmittel, Suspendiermittel und
einem oder mehreren Konservierungsmitteln bereit.
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Die
erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen können
auch in Form von Öl-in-Wasser-
(o/w) oder Wasser-in-Öl-
(w/o) Emulsionen vorliegen. Bei der Ölphase kann es sich um ein
pharmazeutisch geeignetes pflanzliches Öl, Erdnußöle, oder ein Mineralöl handeln,
das geeignete Emulgatoren und Antioxidantien enthält. Die
wäßrige Phase
kann Emulgatoren, Verdickungsmittel und Konservierungsmittel enthalten.
Die Emulsionen können
auch Süßmittel,
Farbstoffe und Geschmacksstoffe enthalten.
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Sirupe
und Elixiere können
mit Süßmitteln
formuliert werden. Solche Formulierungen können auch ein reizstillendes
Mittel, ein Konservierungsmittel sowie Geschmacks- und Farbstoffe
enthalten.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form eines sterilen
Injektionspräparats,
z.B. als sterile wäßrige oder ölige Injektionslösung oder
-suspension in einem nichttoxischen parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel
oder Lösungsmittel,
vorliegen. Zu den annehmbaren Konstituentien und Lösungsmitteln,
die verwendet werden können,
zählen
Wasser, Ringersche Lösung
sowie isotonische Natriumchloridlösungen. Zusätzlich werden sterile fixierte Öle traditionell
als Lösungsmittel
oder Suspendiermittel verwendet. Für diesen Zweck kann jedes neutrale
fixierte Öl
verwendet werden, darunter synthetische Mono- oder Diglyceride,
Fettsäuren
und andere geeignete Zusatzstoffe für Iniectabilia. Suspensionen
können
gemäß bekannten
Techniken unter Verwendung von geeigneten Dispergier- oder Netzmitteln
und Suspendiermitteln hergestellt werden.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können
auch in Form von Suppositorien oder anderen Formulierungen, wie
Lösungen
oder Suspensionen für
die rektale Verabreichung des Arzneistoffs, verabreicht werden. Suppositorien
können
dadurch hergestellt werden, daß man
den Arzneistoff mit einem geeigneten nichtreizenden Grundstoff,
der bei Normaltemperaturen fest, bei der Rektaltemperatur jedoch
flüssig
ist und so den Arzneistoff abgibt, vermischt.
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Die
Tagesdosis der Verbindungen der Formel (I) können in einem weiten Bereich
schwanken, z.B. von 1,0 bis 2000 mg. Vorzugsweise wird die Verbindung
der Formel (I) in Form einer pharmazeutischen Zusammenstellung gemeinsam
mit einem Träger
für eine
geeignete Dosierung für
den zu behandelnden Patienten in unterteilten Dosen, die 5, 10,
25, 50, 100, 150, 250 oder 500 mg Wirkstoff enthalten, verabreicht.
Eine wirksame Menge des Arzneistoffs wird normalerweise in einem
Dosierbereich von ungefähr
0,01 mg bis ungefähr
50 mg/kg Körpergewicht
bereitgestellt. Vorzugsweise beträgt der Bereich ungefähr 0,1 mg
bis ungefähr
7 mg/kg Körpergewicht.
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Es
ist natürlich
klar, daß das
spezifische Dosisniveau für
einen bestimmten Patienten von verschiedenen Faktoren, darunter
der Wirksamkeit der jeweiligen verwendeten Verbindung, dem Alter,
dem Körpergewicht,
dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht, der Ernährung, der
Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsgeschwindigkeit,
der Arzneistoffkombination sowie der Schwere und den betroffenen
Organsystemen, denen die Therapie gelten soll, abhängt.
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VERSUCHSTEIL
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AUFREINIGUNG
VON TRITERPENSAPONINEN AUS MAESA BALANSAE
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Die
luftgetrockneten pulverisierten Blätter (3 kg) von Maesa balansae
wurden zur Entfernung von unpolaren Substanzen mit Chloroform und
anschließend
mit Methanol:Wasser (9:1) extrahiert. Der alkoholische Extrakt wurde
unter verringertem Druck eingedampft und der Rückstand zwischen n-Butanol
(wassergesättigt) und
Wasser verteilt. Die organische Schicht wurde zur Trockne abgedampft
und der Rückstand
wurde mit Aceton gewaschen und filtriert. Der acetonunlösliche Teil,
der die Saponine enthält
(10 g), wurde mittels Umkehrphasen-HPLC (stationäre Phase: RP-18 HS BDS Hyperprep
100 Å,
8 μm; 200
g, Ø der
Säule:
5 cm) mit einem gradientenelutionsmittelsystem unter Verwendung
von:
A: 0,5% Ammoniumacetat in Wasser,
B: Methanol sowie
C:
Acetonitril
bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 80 ml/min
und UV-Detektion bei 235 nm gereinigt. Mit dem Gradientenelutionssystem
von A:B:C (60:20:20) zum Zeitpunkt t = 0 min nach A:B:C (0:50:50)
zum Zeitpunkt t = 50 min erhält
man ein reines Saponingemisch (5 g), das sechs Verbindungen umfaßt.
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Jedes
dieser sechs Saponine wurde an der gleichen Säule unter den gleichen Bedingungen
unter Verwendung des oben beschriebenen Lösungsmittelgradientsystems
aufgereinigt. Es eluierten der Reihe nach die folgenden Verbindungen:
Verbindung
1: MG = 1532, λmax = 223,3 nm, wurde weiter mit dem isokratischen
Lösungsmittelsystem
A:B:C (33:64:03) gereinigt; Ausbeute 230 mg.
Verbindung 2:
MG = 1510, λmax = 209,2 nm; Gradientenelutionssystem:
von A:B:C (42:29:29) zum Zeitpunkt t = 0 min bis A:B:C (24:38:38)
zum Zeitpunkt t = Ende; Ausbeute 110 mg.
Verbindung 3: MG =
1532, λmax = 222,1 nm; isokratisches Lösungsmittelsystem
A:B:C (40:30:30); Ausbeute 1000 mg.
Verbindung 4: MG = 1510, λmax =
202,2 nm; isokratisches Lösungsmittelsystem
A:B:C (59:00:41); Ausbeute 1000 mg.
Verbindung 5: MG = 1574, λmax =
203,4 nm; isokratisches Lösungsmittelsystem
A:B:C (32:34:34); Ausbeute 220 mg.
Verbindung 6: MG = 1552, λmax =
216,3 nm; isokratisches Lösungsmittelsystem
A:B:C (32:34:34) unter 4maliger Wiederverwendung; Ausbeute 230 mg.
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AUSWERTUNG
DER WIRKSAMKEIT GEGEN LEISHMANIEN
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Der
in den folgenden Beispielen verwendete Testarzneistoff PX umfaßt das aus
Maesa balansae aufgereinigte Saponingemisch.
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1. Wirksamkeit
gegen Leishmanien in vitro
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In
der internationalen Literatur finden sich zahlreiche Beschreibungen
von Verfahren für
die in-vitro-Züchtung
von Leishmania-Organismen und die Durchmusterungstechnik. Die Testprotokolle
sind flexibel und können
an die jeweiligen Ziele und Eigenschaften der Prüfverbindungen angepaßt werden.
Kurz gefaßt wurde
die folgende in-vitro-Technik verwendet:
Von Labornagetieren
oder von Makrophagenzelllinien stammende primäre peritoneale Makrophagen
wurden in Multiwell-Gewebekulturgefäße überimpft und ungefähr 24 Stunden
lang anheften gelassen. Amastigoten der Leishmania-Arten (die von
Zielgeweben eines infizierten Donatortiers oder von mit Amastigoten
infizierten Gewebekulturen stammten) oder Promastigoten der Leishmania-Arten
wurden in einem geeigneten Infektionsverhältnis gemeinsam mit unterschiedlich
reihenverdünnten
Konzentrationen des Arzneistoffs bzw. der Prüfverbindung gegeben. Der Prüfarzneistoff
wurde in einem geeigneten Lösungsmittel,
das mit dem in-vitro-Testsystem
verträglich
war (DMSO; Wasser, Alkohole und dergleichen funktionieren auch gut)
vorgelöst
und zu dem Gewebekulturmedium gegeben. Die Kulturen wurden 5-15
Tage bei 37°C
in 5% CO
2 inkubiert. Um einen Selektivitätsindex
zu bestimmen, wurde auch eine Behandlung von nichtinfizierten Kontrollkulturen
mitgeführt. Außerdem wurden
mit Referenzarzneistoffen behandelte Kulturen mitgeführt, um
die relative Wirksamkeit des Prüfarzneistoffs
zu bestimmen. Die Wirksamkeit des Arzneistoffs wurde in gefärbten Präparaten
als prozentuale Verringerung der Gesamtparasitenbelastung bzw. Anzahl
infizierter Makrophagen im Vergleich mit den unbehandelten Kontrollkulturen
bestimmt. Die Auswertung wurde mikroskopisch durchgeführt, und
es wurden die EC
50-Werte (wirksame Konzentration
für eine
50%ige Hemmung) bestimmt. Die prozentuale Verringerung und der EC
50-Wert dienen als Anhaltspunkt für die Wirksamkeit
gegen Leishmaniasen in vitro und dienen als wichtige Hinweise auf
klinisch nützliche
Mittel. Tabelle
I: Wirksamkeit gegen Leishmanien in vitro bei primären Maus-Makrophagen
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2. Wirksamkeit gegen Leishmanien
in vivo
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In
der internationalen Literatur finden sich zahlreiche Beschreibungen
von Verfahren für
die Erhaltung von Leishmania-Organismen in vivo und Tiermodellen.
Die bevorzugte Labortierart für
die Primärisolation,
Erhaltung und Verwendung in künstlichen
Infektionsmodellen sind Balb-C-Mäuse
und Goldhamster. Die Testprotokolle sind flexibel und können an
die jeweiligen Ziele und Eigenschaften der Prüfverbindungen angepaßt werden.
Kurz gefaßt
wurde die folgende in-vivo-Technik verwendet:
Für den Darm
befallende Leishmania-Arten: Balb-C-Mäuse oder junge Hamster wurden
intravenös
mit ungefähr
10
6-10
7 Amastigoten,
die von den Zielorganen (im allgemeinen der Milz) eines infizierten
Donatortiers oder von einer in-vitro-Kultur der Parasitenformen
stammten, infiziert. Die Tiere wurden mit unterschiedlichen Dosismengen
der Prüfverbindung
behandelt (Dosisbereich: 0,1 bis 80 mg/kg in 100% DMSO oder einem
beliebigen anderen verträglichen
Konstituens), wobei unterschiedliche Verabreichungswege und Behandlungsschemata
verwendet wurden. Mit der Behandlung wurde entweder zu unterschiedlichen
Zeitpunkten nach der Infektion (kurativ), zugleich mit der Infektion
(prophylaktisch) oder vor der Infektion (Residualwirkung) begonnen. In
der Anlage der prophylaktischen Studie wird die erste Verabreichung
des Prüfarzneistoffs
unmittelbar vor oder zusammen mit der künstlichen Infektion mit der
Leishmania-Art gegeben. In der Anlage der kurativen Studie wird
die erste Verabreichung des Prüfarzneistoffs
mehrere Wochen nach der künstlichen
Infektion mit der Leishmania-Art gegeben (früh-kurativ = wenn die ersten
klinischen Symptome in Erscheinung treten; spät-kurativ = wenn die klinischen
Symptome gut etabliert sind bzw. chronisch werden). Die Wirksamkeit
des Arzneistoffs wurde durch Bestimmung der Gesamtparasitenbelastung
in der Leber oder einem beliebigen anderen relevanten Zielgewebe/Organ
im Vergleich mit der Belastung des Gewebes/Organs bei unbehandelten
Kontrolltieren ausgewertet. Die mittlere Amastigotenzahl wird quantitativ
oder semiquantitativ anhand von gefärbten Abdruck-Ausstrichpräparaten
oder Objektträgern
ausgezählt.
Die prozentuale Verringerung dient als Anhaltspunkt für die Wirksamkeit
gegen Leishmaniasen und gibt wichtige Hinweise auf klinisch nützliche
Mittel. Die minimale Wirkdosis (Lowest Active Dose; LAD) wird als
niedrigste Dosis definiert, bei der die Parasitenbelastung in dem
Primärzielorgan/Gewebe
um mindestens 80% verringert wird. Tabelle
II: Wirksamkeit gegen Leishmanien in vivo bei der Maus und beim
Hamster gegen Leishmania-Arten, die den Darm befallen
Tabelle
III: In-vitro- und in-vivo-Wirkung gegen die den Darm befallende
Art Leishmania infantum
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Für die Haut
bzw. die Haut/Schleimhaut befallende Leishmania-Arten: Balb-C-Mäuse oder
junge Hamster wurden intradermal oder subkutan mit ungefähr 106 bis 107 Amastigoten,
die von den Zielorganen (im allgemeinen Hautläsionen) eines infizierten Donatortiers
oder von einer in-vitro-Kultur der Parasitenformen stammten, infiziert.
Die Tiere wurden mit unterschiedlichen Dosismengen der Prüfverbindung
behandelt mg/kg in 100 DMSO oder einem beliebigen anderen verträglichen
Konstituens), wobei unterschiedliche Verabreichungswege und Behandlungsschemata
verwendet wurden. Mit der Behandlung wurde entweder vor der Infektion
(prophylaktisch) oder zu unterschiedlichen Zeiten nach der Infektion
(kurativ) begonnen. In der Anlage der prophylaktischen Studie wird
die erste Verabreichung des Prüfarzneistoffs
unmittelbar vor oder zusammen mit der künstlichen Infektion mit der
Leishmania-Art gegeben. In der Anlage der kurativen Studie wird
die erste Verabreichung des Prüfarzneistoffs
mehrere Wochen nach der künstlichen
Infektion mit der Leishmania-Art gegeben (früh-kurativ = wenn die ersten
Hautläsionen
in Erscheinung treten; spät-kurativ
= wenn die Hautläsionen
gut etabliert sind bzw. chronisch werden). Die Aktivität des Arzneistoffs
wurde entweder durch Bestimmung der Schwere der Läsion in
dem entsprechenden Zielgewebe/Organ (primärer Parameter) oder der Parasitenbelastung
in dem entsprechenden Zielgewebe/Organ (sekundärer Parameter) im Vergleich
zu unbehandelten Kontrolltieren bestimmt. Die Läsionsgröße wurde quantitativ nach dem
Verfahren von J. El-On. und A. D. Hamburger [Trans. Roy. Soc. Trop.
Med. Hyg., 81, 734-737 (1987)] beurteilt. Die prozentuale Verringerung
dient als Anhaltspunkt für
die Wirksamkeit gegen Leishmaniasen und gibt wichtige Hinweise auf
klinisch nützliche
Mittel. Die minimale Wirkdosis (Lowest Active Dose; LAD) wird als
niedrigste Dosis definiert, die die Entwicklung von Läsionen verhindert,
ein weiteres Fortschreiten der Läsionen
aufhält
oder eine klinische Heilung der Läsionen in dem primären Zielorgan
oder -gewebe induziert.
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Tabelle IV: in-vivo-Wirkung
gegen Leishmanien bei Mäusen
und Hamstern gegen die Haut bzw. die Haut/Schleimhaut befallende
Leishmania-Arten
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A. Prophylaktische Behandlung
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Bei
der Anlage der prophylaktischen Studie wird die erste Verabreichung
des Prüfarzneistoffs
unmittelbar vor der künstlichen
Infektion mit der Leishmania-Art gegeben
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B. Kurative Behandlung
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Bei
der Anlage der kurativen Studie wird die erste Verabreichung des
Prüfarzneistoffs
mehrere Wochen nach der künstlichen
Infektion mit der Leishmania-Art gegeben (im allgemeinen dann, wenn
die ersten klinischen Anzeichen auftreten).
Tabelle
V: in-vivo-Antileishmanien-Wirkung der PX-Mischung gegen unterschiedliche
Leishmania-Arten
Tabelle V: in-vivo-Antileishmanien-Wirkung der PX-Mischung gegen unterschiedliche Leishmania-Arten
