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Die
Erfindung betrifft die Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen
Cholestase. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die
Verwendung von Luteolin-7-O-glucuronid oder einem physiologisch
annehmbaren Salz davon als Wirkstoff zur Behandlung oder Prävention
einer intrahepatischen Cholestase.
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Bei
Cholestase handelt es sich um ein Syndrom, das bei gestörtem Gallefluss
entsteht. Man unterscheidet extrahepatische und intrahepatische
Cholestase. Die extrahepatische Cholestase wird meist durch einen
Gallengangstein oder ein Pankreaskarzinom hervorgerufen. Bei intrahepatischer
Cholestase handelt es sich um eine Stauung in den Gallengängen. Die
häufigsten
intrahepatischen Ursachen sind virale und andere Hepatitiden, Medikamente,
z. B. zur Krebsbehandlung, sowie die alkoholinduzierte Leberschädigung.
Weniger häufige
Ursachen sind die primäre
billiäre
Zirrhose, die Cholestase in der Schwangerschaft, und weitere Erkrankungen.
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Extrakt
aus Blättern
der Artischocke (Cyanara scolymus L.) ist für seine choleretische Wirkung
bei dyspeptischen Beschwerden bekannt. Echte choleretische Mittel,
als welches ein Artischockenextrakt angesehen wird, führen zu
einer Erhöhung
der Menge an Gallensäuren,
wohingegen unechte choleretische Mittel zu einer Erhöhung des
Volumens an Gallenflüssigkeit
führen.
Neben der choleretischen Wirkung wird für Artischockenextrakt in der
Literatur auch eine anticholestatische Wirkung genannt (Ärzte-Ztg.,
15. Jahrgang, 1996, Seite 16). Allerdings war bisher nicht bekannt,
welcher Wirkstoff die anticholestatische Wirkung hervorruft.
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Die
EP 0 807 435 A2 betrifft
die Verwendung von Luteolin, seiner Derivate und verwandter Verbindungen
zur Herstellung eines Arzneimittels zur indirekten Hemmung der Hydroxymethylglutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase)
zu Zwecken der Prophylaxe und Behandlung von Dyslipoproteinämien, insbesondere Hyperlipoproteinämien, bei
denen eine Absenkung des Cholesterins unter die Normgrenze (Hypocholesterinämie) vermieden
werden muß.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein Arzneimittel bereitzustellen,
das einen Wirkstoff mit anticholestatischer Wirkung mit definierter
Wirksamkeit enthält.
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Zur
Lösung
der vorgenannten Aufgabe schlägt
die vorliegende Erfindung die Verwendung gemäß Anspruch 1 vor. Weitere,
vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der diesbezüglichen
Unteransprüche.
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Diese
Aufgabe wird somit erfindungsgemäß gelöst durch
die Verwendung von Luteolin-7-O-glucuronid der Formel (I)
worin
R einen Glucuronsäurerest
bedeutet, oder einem physiologisch annehmbaren Salz davon als Wirkstoff in
einem Arzneimittel zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen
Cholestase. Vorzugsweise enthält
das Arzneimittel mindestens 0,1 Gew.-% dieses Wirkstoffes, mehr
bevorzugt mindestens 1 Gew.-%.
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Es
wurde gefunden, dass Luteolin-7-O-glucuronid eine anticholestatische
Wirksamkeit aufweist und deshalb zur Behandlung einer intrahepatischen
Cholestase geeignet ist. Eine intrahepatische Veränderung
der Gallengänge
kann mit Luteolin-7-O-glucuronid verhindert oder rückgängig gemacht
werden, sodass auch eine prophylaktische Behandlung zur Prävention
einer intrahepatischen Cholestase möglich ist.
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Durch
die Kenntnis, dass Luteolin-7-O-Glucuronid eine anticholestatische
Wirksamkeit aufweist, ist die Herstellung eines Arzneimittels mit
vorbestimmter und definierter Wirkungsdosis und eine Standardisierung möglich. Weiterhin
kann mit dem erfindungsgemässen
Arzneimittel eine schnelle und zielgerichtete Wirkung erreicht werden.
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In
Artischockenextrakten, insbesondere Artischockenblätter-Trockenextrakten,
wie sie beispielsweise kommerziell von Sertürner Arzneimittel unter dem
Namen HEPAR-SL® forte
erhältlich
sind, liegen zahlreiche Verbindungen vor, bei denen es sich um mögliche Wirkstoffe
handeln könnte.
Die anticholestatische Wirksamkeit konnte bisher keiner der zahlreichen
im Extrakt vorliegenden Verbindungen zugeordnet werden. Es war somit
schwierig, aus dem Artischockenextrakt ein standardisiertes Arzneimittel
herzustellen.
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Es
wurde nun festgestellt, dass Luteolin-7-O-glucuronid eine anticholestatische
Wirksamkeit aufweist und die Cholesterinsynthese beeinflusst. Ein
Hinweis, dass gerade Luteolin-7-O-glucuronid eine derartige Wirkung
aufweisen könnte
findet sich im Stand der Technik nicht.
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Bekannte
Bestandteile von Artischockenextrakt sind Kaffeesäure, Chlorogensäure, Cynarin (1,5-di-O-Caffeoyl-chinasäure), 1,3-di-O-Caffeoyl-chinasäure, Scolymosid
und Cynarosid (Luteolin-7-O-glucosid). Cynarosid (Luteolin-7-O-glucosid) wird im
Magen-Darm-Trakt gespalten, wobei Luteolin freigesetzt wird. Allerdings
findet sich Cynarosid auch in vielen anderen Pflanzen, ohne dass
von solchen eine anticholestatische oder/und die Cholesterinsynthese
beeinflussende Wirksamkeit berichtet worden ist. Die Verbindungen Luteolin-7-O-glucosid,
3',4'-Hydroxyflavon, Genistein
und Daidzein zeigten keine anticholestatische Wirkung. Es ist daher überraschend,
dass Luteolin-7-O-glucuronid eine ausgeprägte Wirksamkeit dieser Art
besitzt.
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Die
Wirkmechanismen von anticholestatischen und choleretischen Mitteln
sind grundsätzlich
verschieden. Eine häufig
als Modell verwendete Cholestase, die durch Taurolithocholat ausgelöst wird,
bewirkt eine leicht detektierbare Membranveränderung. Bekannte choleretische
Substanzen sind im allgemeinen nicht in der Lage, diese Membranveränderung
zu verhindern oder zu beseitigen (Layden et al., Gastroenterology
50 (1977), 2305 bis 2312. Z. B. zeigte die als chole retisch wirksam
bekannte Dehydrocholsäure
bei einer durch Taurolithocholat ausgelösten Cholestase keine Wirksamkeit,
sodass eine Verwendung von choleretisch wirksamen Verbindungen bei
einer Cholestase im allgemeinen nicht angezeigt ist.
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Ein
physiologisch annehmbares Salz von Luteolin-7-O-glucuronid ist jede
salzartige Verbindung, die diese Verbindung in ionischer Form zusammen
mit einem Gegenion umfasst, welches physiologisch unbedenklich ist.
Beispiele solcher Salze sind insbesondere Säureadditionssalze.
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Der
Wirkstoff liegt im anticholestatischen Arzneimittel bevorzugt in
einer Menge von ≥ 0,1
Gew.-%, mehr bevorzugt ≥ 1
Gew.-%, besonders bevorzugt ≥ 10
Gew.-% und am meisten bevorzugt ≥ 20
Gew.-% vor. Es ist aber auch möglich,
Arzneimittel bereitzustellen, die einen noch höheren Gehalt an dem Wirkstoff
enthalten, insbesondere ≥ 50
Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Arzneimittels.
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Für eine wirksame
Behandlung oder Prävention
einer intrahepatischen Cholestase werden einem Patienten im allgemeinen
von 10 mg bis 1000 mg des Wirkstoffs pro Tag verabreicht. Bevorzugt
werden mindestens 20 mg, insbesondere mindestens 50 mg und besonders
bevorzugt mindestens 100 mg des Wirkstoffs pro Tag pro Person und
höchstens
bis zu 750 mg, bevorzugt bis zu 500 mg, besonders bevorzugt bis
zu 300 mg pro Person und Tag verabreicht.
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Das
anticholestatische Arzneimittel kann gegebenenfalls mit physiologisch
verträglichen
Hilfs- und Trägerstoffen
formuliert werden. Solche Hilfsstoffe müssen physiologisch unbedenklich
sein und dürfen
die Wirksamkeit nicht nachteilig beeinflussen. Geeignete Hilfsstoffe
sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise Füllstoffe,
Bindemittel und Gleitmittel, wie etwa mikrokristalline Cellulose,
Amylose, Lactose, Mannit, Talkum, Magnesiumstearat, Stärke, hochdisperses
Magnesiumoxid, Siliciumdioxid, Natriumcarboxymethylstärke, Polyvidon,
Macrogol und andere.
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Das
anticholestatische Arzneimittel kann in allen, dem Fachmann bekannten
verabreichbaren Arzneimittelformen hergestellt werden. Bevorzugt
wird es in einer Formulierung hergestellt, die zur oralen Verabreichung
geeignet ist, insbesondere in fester Form. Beispiele solcher fester
Arzneimittelformen umfassen Kapseln, Tabletten, Granulate, Dragees,
Filmtabletten und ähnliches.
Bevorzugt sind Formulierungen, bei denen der Wirkstoff erst im Magen-Darm-Trakt
freigesetzt wird.
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Das
anticholestatische Arzneimittel kann den Wirkstoff Luteolin-7-O-glucuronid
als einzige wirksame Verbindung oder zusammen mit anderen Wirkstoffen
enthalten. Für
ein solches kombiniertes Arzneimittel können Wirkstoffe derselben Wirkungsart
oder/und Wirkstoffe, welche die anticholestatische Wirksamkeit ergänzen, verwendet
werden. Sie können
aus pflanzlichen Extrakten isoliert oder chemisch synthetisierte
Verbindungen sein. Die Isolierung von geeigneten Flavon- oder Flavanonderivaten,
beispielsweise Luteolin aus pflanzlichen Extrakten, ist in der Literatur
ausführlich
beschrieben (vgl. z. B. Pharmacia 21 (39) (1972) 37). Es ist auch
möglich,
einen Pflanzenextrakt mitzuverwenden, beispielsweise einen Artischockenextrakt.
Im Fall der Verwendung eines natürlichen
Extraktes wird ein erfindungsgemäßes Arzneimittel
dadurch hergestellt, dass ein herkömmlicher Extrakt an dem Wirkstoff
Luteolin-7-O-glucuronid angereichert wird, sodass er ≥ 0,1 Gew.-%,
bevorzugt ≥ 1
Gew.-%, mehr bevorzugt ≥ 10
Gew.-% und am meisten bevorzugt ≥ 20
Gew.-% an dem Wirkstoff, bezogen auf das Extraktgesamtgewicht, aufweist.
Eine solche Anreicherung kann dadurch erfolgen, dass die Extraktionsbedingungen
so gewählt
werden, dass im Extrakt ein möglichst
höher Gehalt
an dem Wirkstoff Luteolin-7-O-glucuronid vorliegt. Es ist aber auch
möglich,
einem handelsüblichen
Extrakt einen zusätzlichen
Gehalt an diesem Wirkstoff zuzugeben, um auf diese Weise eine Erhöhung der
Wirkstoffkonzentration zu erzielen.
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Der
Wirkstoff Luteolin-7-O-glucuronid wird im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung,
gegebenenfalls zusammen mit üblichen
pharmakologischen Additiven, in eine physiologisch verabreichbare
Formulierung gebracht.
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Zur
Behandlung oder Prävention
einer intrahepatischen Cholestase wird Luteolin-7-O-glucuronid oder ein
physiologisch annehmbares Salz davon als Wirkstoff, gegebenenfalls
zusammen mit üblichen
pharmakologischen Additiven, in einer Dosierung von 0,01 bis 1 g/Tag
verabreicht.
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Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
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Beispiel 1
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Isolierung und Identifizierung von Luteolin-7-O-β-D-glucuronid
in Artischocke
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Allgemeines
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Extraktion
und Isolierung wurden mit analytischer HPLC (Supelcosil LC-18, 150 × 4,6 mm
mit Vorsäule 20 × 4,6 mm,
5 μm) begleitet.
(Chromatografische Bedingungen: Die Proben wurden in 80% Methanol
gelöst und
zur Injektion 1:1 mit Wasser verdünnt. Die Trennung erfolgte
mit einem Gradientensystem Acetonitril (A) und Wasser mit 0,5% Phosphorsäure (B).
Gradient: 0 bis 1 min 8% A, 6 min 12%, 8 bis 18 min 18%, 19 bis
29 min 32%, 30 bis 35 min 100%, 36 bis 50 min 8% A, Flussrate: 1,0
ml/min. Säulentemperatur:
40°C, Detektionswellenlänge: 330
nm).
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Extraktion und Isolierung
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Die
für die
einzelnen Isolierungsstufen angegebenen Ausbeuten beziehen sich
auf die jeweils eingesetzte Menge.
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Extraktion:
100 g zerkleinerte Artischockenblätter-Droge (Sieb 6 mm) (Gehalt
der zu isolierenden Substanz: 0,297% bar. als Cynarosid) wurde fünfmal mit
insgesamt 800 ml heißem
Wasser perkoliert (Ausbeute: 570 ml Eluat I = 28,7 g Trockenmasse
= 28,7%).
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Reinigung:
Eluat I (Trockenmasse = 28,7 g) wurden mit dem vierfachen Volumen
Methanol gemischt und über
Nacht im Kühlschrank
aufbewahrt. Das Filtrat wurde auf ein Zehntel seines Volumens einrotiert
und mit Wasser auf 570 ml verdünnt.
Diese Lösung
wurde zweimal mit 285 ml Ethylacetat/2-Butanol (60/40-V/V) im Scheidetrichter
gewaschen und zur Trockene einrotiert. Es wurden 19,2 g Extrakt
II erhalten (Ausbeute = 66,9 %).
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Festphasenreaktion:
Je 100 mg des Extraktes II wurden in 1,0 ml Wasser gelöst und auf
eine mit 2,5 ml Methanol und 5 ml Wasser konditionierte RP-18-Festphase (Merck
Lichrolut 2023) aufgetragen. Es wurde mit 15 ml Wasser gespült und mit
2,0 ml wässrigem
Methanol (35%, V/V) eluiert. Insgesamt wurden 192 Portionen zu 100
mg des Extraktes II (= 19,2 g) über
RP-18-Festphasenextraktion bearbeitet. Die vereinigten Eluate wurden
zur Trockene einrotiert, sodass 1,286 g des Extraktes III resultierten
(Ausbeute = 6,7%).
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Semipräparative
HPLC: Die weitere Reinigung erfolgte in zwei Schritten durch semipräparative
HPLC (SUPELCOSIL SPLC-18, 250 × 10
mm, 5 μm).
Als Laufmittel wurde Methanol (A) und Wasser (B) verwendet, zu denen
je 0,25% (V/V) Essigsäure
gemischt wurde. Die Säulentemperatur
betrug 30°C.
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Der
Extrakt III wurde in Wasser gelöst
(ca. 50 mg/ml), filtriert und in 26 Proteionen zu 1000 μl injiziert. Die
Trennung erfolgte isokratisch mit 25% A und einem Fluss von 5 ml/min.
Die Substanz eluierte zwischen 12 und 19 min und wurde manuell entsprechend
dem DAD-Spektrum aufgefangen. Die zusammengefassten Fraktionen aus
26 HPLC-Läufen
wurden zur Trockene eingeengt. Die erste HPLC-Reinigung erag 233
mg Rohprodukt IV (Ausbeute = 18,1%) mit einer HPLC-Reinheit von
etwa 70% (Flächenprozente
bei λ =
330 nm).
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Das
Rohprodukt IV wurde einer weiteren HPLC-Reinigung unterzogen. Je
20 mg Substanz wurden in 1,0 ml Methanol gelöst und mit Wasser 1:1 verdünnt. Nach
Filtration wurde in 400 μl
Portionen injiziert. Die Trennung erfolgte isokratisch mit 35% A
und einem Fluss von 5 ml/min. Die zusammengefassten Substanz-Fraktionen
aus 60 HPLC-Läufen
wurden zur Trockene eingeengt. Es wurden 132 mg Substanz V (Ausbeute
= 56,6%) mit einer HPLC-Reinheit von etwa 99% erhalten.
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Gesamtausbeute:
Auf den Gehalt der Droge (0,296%) bezogen ergibt sich eine Gesamtausbeute
von 44,6%.
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Identifizierung
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Die
Identifizierung erfolgte durch positve und negative FABMS sowie
durch 1H und 13C
NMR-Spektroskopie. Die Substanz wurde als Luteolin-7-O-β-D-glucuronid identifiziert
(Romussi et al., 1996). Zusätzlich konnte
Luteolin bzw. Glucuronsäure
nach saurer Hydrolyse durch HPLC bzw. DC nachgewiesen werden.
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Beispiel 2
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Verhinderung einer Taurolithcholat-induzierten
Transformation kanilikulärer
Membranen durch Luteolin-7-O-glucuronid
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Taurolithocholat
induziert in Ratten in vivo eine schwere Cholestase, die mit der
Umwandlung der Gallekanälchen
in bizarr strukturierte, lamelläre
Membranformationen verbunden ist. Die Induzierung einer intrahepatischen
Cholestase durch Lithocholsäure
und Natriumtaurolithocholat in Tierversuchen ist ausführlich beschrieben
(Javitt, N. B., Nature 210, (1966), 1262–1263; King. J. E. et al.,
J. Clin. Invest. 50, (1971) 2305–2312; Layden et al., Gastroenterology
73 (1977), 120–128;
Mockel et al., Am. J. Physiol., 269 (1995), G73–G84). Neben einer kanalikulären Dilatation
induzieren sie bizarre lamellare Deformationen der Ultrastruktur
der Gallekanälchen,
die charakteristisch für
diese Art von Cholestase sind (Miyai et al., Lab. Invest. 32 (1975),
527–535; Kakis
et al., Lab. Invest. 43, (1980) 73–81). Kürzlich wurde gezeigt, dass
Taurolithocholat, das den Primärkulturen
von Rattenhepatozyten zugegeben wurde, ähnliche Deformationen in vitro
bildet, die von den in vivo gebildeten nicht unterscheidbar sind
(Jung et al., Eur. J. Cell Biol. 29, (1982) 77–82; Thibault et al., J. Hepatol.
19 (1993) 367–376).
Für die
Versuche wurde deshalb in Primärkulturen
von Rattenhepatocyten die Transformation neu gebildeter Gallekanälchen durch
Taurolithocholat wie beschrieben (Jung et al., Eur. J. Cell Biol.
29 (1982) 77–82)
in vitro ausgelöst.
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Leberparenchymzellen
wurden aus männlichen
Sprague-Dawley-Ratten (220 bis 280 g) isoliert und für 2 Tage
in einem serumfreien William-Medium E wie beschrieben kultiviert
(Gebhardt et al., Cell Biol. Toxicol. 6 (1990) 369–372; Gebhardt,
Toxicol. Appl. Pharmacol. 144 (1997), 270–286). Für die Behandlung der kultivierten
Hepatocyten mit Taurolithocholat wurde eine 10 mM Vorratslösung dieses
Gallensalzes mit Ethanol hergestellt, die mit Williams-Medium E
verdünnt
wurde, um eine Endkonzentration von 0,1 mM zu ergeben. Für 1 bis
2 Tage kultivierte Hepatocyten wurden mit dem Taurolithocholat enthaltenden
Medium für
3 Stunden behandelt, um maximale Veränderungen der Gallekanälchen zu
induzieren (Jung et al., Eur. J. Cell Biol. 29 (1982), 77–82). Taurolithocholat
(0,1 mM) induziert an primär
kultivierten Rattenhepatocyten innerhalb von 3 Stunden eine ausgeprägte Transformation
der kanalikulären
Membranen zu bizarr strukturierten Formationen. Die normale kanalikuläre Membran,
die mit zahlreichen Mikrovilli bedeckt ist, wird in bizarre lamillare
Strukturen transformiert, die fast die gesamten Kanälchen ausfüllen. Dieser
Vorgang scheint nach 2 bis 3 Stunden vollständig abgelaufen zu sein und
betraf etwa 50 bis 70% der Kanälchen
am zweiten Tag der Kultivierung.
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Die
Membranveränderungen
im Bereich der Gallekanälchen
wurden mittels Elektronenmikroskopie an Ultradünnschnitten nachgewiesen (vgl.
Gebardt et al., Eur. J. Cell Biol. 29(1982) 68–76). Dazu wurden kultivierte
Zellen für
30 bis 45 Minuten in situ mit 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer,
pH 7,2 bei 0°C
fixiert. Nach Waschen mit Cacodylatpuffer wurden die Zellen in eine
2%-ige Lösung
von Agar bei 46°C
gegeben, das in kleine Stücke
geschnitten wurde und in 1% OsO4 in einem
Cacodylatpuffer nachfixiert wurde. Nach Dehydration wurden die Blöcke in Epon
812 eingebettet. Silberschnitte wurden mit einem Siemens Ia-Elektronenmikroskop
nach Anfärben
untersucht.
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Für eine halbquantitative
Abschätzung
der Veränderung
der kanalikulären
Membranen wurde die Erscheinungsform von 100 Gallekanälchen aus
zwei bis drei verschiedenen Experimenten untersucht. Gallekanälchen wurden
als transformiert eingestuft, wenn die Hälfte oder mehr der kanalikulären Fläche mit
bizarren lamellaren Strukturen bedeckt war.
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Der
oben beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei den Primärkulturen
der Rattenhepatocyten gleichzeitig mit dem Taurolithocholat Luteolin-7-O-glucuronid
zugegeben wurde. Die Zugabe von Luteolin-7-O-glucuronid in einer Menge von 20 mg
gleichzeitig mit Taurolithocholat ergab eine vollständige Hemmung
der lamellaren Transformation. Statt dessen behielten die Gallenkanälchen ihre
Mikrovilli, wenn auch in etwas geringerer Anzahl und erschienen
nur leicht dillatiert. Eine vergleichbare Wirkung konnte erzielt
werden, wenn die Kulturen mit Luteolin-7-O-glucuronid vorinkubiert
wurden. Dies zeigt, dass eine mögliche
Adsorption von Taurolithocholat an andere Inhaltsstoffe keine Rolle
spielt.
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Weiterhin
wurde gefunden, dass der Schutz gegen Taurolithocholat induzierte
Transformation dosisabhängig
war.
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Luteolin-7-O-glucuronid
ist somit in der Lage, die Taurolithocholat-induzierte Umwandlung
der kanalikulären
Membranen spezifisch zu verhindern und anticholestatisch zu wirken.