DE60317111T2 - Isolierung des hepatoprotektiven wirkstoffes acteosid aus colerbrookea oppositifolia - Google Patents

Isolierung des hepatoprotektiven wirkstoffes acteosid aus colerbrookea oppositifolia Download PDF

Info

Publication number
DE60317111T2
DE60317111T2 DE60317111T DE60317111T DE60317111T2 DE 60317111 T2 DE60317111 T2 DE 60317111T2 DE 60317111 T DE60317111 T DE 60317111T DE 60317111 T DE60317111 T DE 60317111T DE 60317111 T2 DE60317111 T2 DE 60317111T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
acteoside
extract
fractions
oppositifolia
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60317111T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60317111D1 (de
Inventor
Ghulam Nabi Qazi
Om Parkash Suri
Kasturi Lal Bedi
Krishan Avtar Suri
Bishan Datta Gupta
Bupinder Singh Jaggi
Bal Krishan Kapahi
Naresh Kumar Satti
Musarat Amina
Bal Krishan Chandan
Neelam Sharma
Gurdarshan Singh
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Original Assignee
Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Council of Scientific and Industrial Research CSIR filed Critical Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Application granted granted Critical
Publication of DE60317111D1 publication Critical patent/DE60317111D1/de
Publication of DE60317111T2 publication Critical patent/DE60317111T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/53—Lamiaceae or Labiatae (Mint family), e.g. thyme, rosemary or lavender
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

  • Gebiet der vorliegenden Erfindung
  • Ein Verfahren zur Isolierung von reinem Acteosid mit hoher Hepatoprotektion aus der Pflanze Colerbrookea oppositifolia, wobei das Verfahren die Schritte des Trocknens der oberirdischen Teile der Pflanze, das Mahlen der getrockneten Teile zu Pulver, das drei- bis viermalige Durchsickern lassen von Wasser oder Ethanol durch das Pulver, um einen Extrakt zu erhalten, das Filtrieren des Extrakts zum Entfernen von suspendierten Teilchen, um einen Überstand zu erhalten, das Trocknen des Überstands bei etwa 45°C bis 55°C, um einen Rückstand zu erhalten, das aufeinanderfolgende Fraktionieren des Rückstands mit Chloroform, Ethylacetat und Butanol, das Unterziehen der Butanolfraktion einer Adsorptionschromatographie mit SiO2 nach Zugeben vom Methanol zur Fraktion, das Aufbringen der adsorbierten Fraktion auf eine Glassäule, das Eluieren der Säule mit Lösungsmitteln steigender Polarität aus Methanol:Chloroform, um weitere Fraktionen zu erhalten, und Wiederholen des Verfahrens ein weiteres Mal, das Unterziehen der Fraktionen einer Säulenchromatographie, um Fraktionen zu erhalten, Konzentrieren der Fraktionen unter vermindertem Druck, um Acteosid als Rückstand zu erhalten, umfasst; ebenfalls offenbart ist ein Verfahren des wirksamen Hepatoprotektierens eines Patienten unter Verwendung von reinem Acteosid aus der Pflanze Colerbrookea oppositifolia, wobei das Verfahren die Schritte des Verabreichens von geeignetem niedrig dosiertem Acteosid an den Patienten umfasst.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Phenylethanoide sind eine Klasse von Verbindungen, von denen berichtet wird, dass sie in Pflanzen wie Cistanche deserticola und Buddleja species vorkommen (Quanbo Xing, Koji Hase et al., Planta Medica, 64, 120–125 (1998); Peter J. Houghton und Hiroshi Hikino, Planta Medica, Bd. 55, 123–126 (1989).
  • Es ist das erste Mal, dass ein Phenylethanoid-Verbascosid (auch Acteosid oder Kusaginin genannt) von den Autoren von Colebrookea oppositifolia isoliert worden ist und man entdeckt hat, dass es eine sehr starke antihepatotoxische/hepatoprotektive Wirksamkeit bei ungewöhnlich geringen Dosen (zwischen 1,25 und 2,5 mg/kg) bei Ratten und Mäusen besitzt.
  • Von dem Vorhandensein einer Reihe von Flavonoiden und Glycoflavonoiden in Colebrookea oppositifolia ist bereits in der Literatur berichtet worden [S. Aziz Ahmed, S. A. Siddiqui und Asif Zaman, Indian J. Chemistry 12, 1327–28 (1974); S. A. Patwardhan und A. S. Gupta, Indian J. Chemistry, 20 B, 627 (1981); Fan Yank, Xing-Li, HAN-Qing Wang und Chong-Ren Yang, Phytochemistry 42, 867–69 (1996)]. Jedoch wird vom Vorhandensein von Acteosid in dieser Pflanze zum ersten Mal berichtet.
  • Es ist früher von einer kontrazeptiven Wirksamkeit dieser Pflanze bei männlichen Ratten mit besonderem Verweis auf die Populationsdynamik der testikulären Zellen berichtet worden (R. S. Gupta, R. J. Yadav, V. P. Dixit und M. P. Dobhal, Fitoterapia, 72, 236–45 (2001). Allerdings ist über die hepatoprotektive/antihepatotoxische Wirksamkeit von Acteosid (Verbascosid) isoliert aus zwei anderen Pflanzen, nämlich Cistanche-Spezies und Buddleja-Spezies, berichtet worden (Quanbo Xing, Koji Hase et al., Planta Medica, 64, 120–125 (1998); Peter J. Houghton und Hiroshi Hikino, Planta Medica, Bd. 55, 123–126 (1989), die vorliegende Erfindung berichtet jedoch nicht nur von einer unterschiedlichen Quelle, nämlich Colebrookea oppositifolia, sondern die gewünschte Wirksamkeit wird bei ungewöhnlich geringer Dosierung zwischen 1,5 bis 2,5 mg/kg bei Ratten erreicht.
  • Wie bereits vorstehend angegeben, ist von der hepatoprotektiven/antihepatotoxischen Wirksamkeit von Acteosid sowohl in vitro als auch in vivo berichtet worden (Quanbo Xing, Koji Hase et al., Planta Medica, 64, 120–125 (1998). Jedoch beschreibt die vorliegende Erfindung die Isolierung von Acteosid aus einer bisher unentdeckten Quelle auf eine Weise, dass die Verbindung antihepatotoxische/hepatoprotektive Wirksamkeit bei Dosen zeigt, die etwa 12 bis 25 Mal geringer sind als jene, von denen im Stand der Technik bereits berichtet wurde (Quanbo Xing, Koji Hase et al., Planta Medica, 64, 120–125 (1998); Peter J. Houghton und Hiroshi Hikino, Planta Medica, Bd. 55, 123–126 (1989). Darüber hinaus sind die in den früheren Berichten untersuchten Parameter auf ALT (in vivo) und AST & MDA (in vitro) beschränkt, wohingegen die vorliegende Erfindung den Einfluss von Acteosid auf praktisch alle wichtigen Parameter beschreibt, was zu einem klaren Urteil über die Wirksamkeit eines hepatoprotektiven oder antihepatotoxischen Produkts führt.
  • Die Ursache für die Wirksamkeit von Acteosid bei derart geringen Dosen verglichen mit jener, von der im Stand der Technik berichtet wurde, kann dem speziellen Verfahren seiner Isolierung zugeschrieben werden, das unterschiedlich ist, um ein Produkt von höherer Reinheit zu ergeben. Es ist gut dokumentiert, dass Verunreinigungen in Phytochemika die Wirksamkeit der reinen wirksamen Verbindung ernsthaft gefährden, jedoch könnte es auch eine synergistische Wirkung geben, von der es jedoch im Stand der Technik keine Erwähnung oder keinen Hinweis gibt.
  • Aufgaben der vorliegenden Erfindung
  • Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein hepatoprotektives Mittel aus der Pflanze Colerbrookea oppositifolia zu isolieren.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Isolierung von Acteosid aus der Pflanze Colerbrookea oppositifolia zu entwickeln.
  • Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zum Hepatoschutz eines Patienten unter Verwendung von Colerbrookea oppositifolia zu entwickeln.
  • Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung
  • Ein Verfahren zur Isolierung von reinem Acteosid mit hohem Hepatoschutz aus der Pflanze Colerbrookea oppositifolia, wobei das Verfahren die Schritte des Trocknens der oberirdischen Teile der Pflanze, das Mahlen der getrockneten Teile zu Pulver, das drei- bis viermalige Durchsickern lassen von Wasser oder Ethanol durch das Pulver, um einen Extrakt zu erhalten, das Filtrieren des Extrakts zum Entfernen von suspendierten Teilchen, um den Überstand zu erhalten, das Trocknen des Überstands bei etwa 45 bis 55°C, um einen Rückstand zu erhalten, das aufeinanderfolgende Fraktionieren des Rückstands mit Chloroform, Ethylacetat und Butanol, das Unterziehen der Butanolfraktion einer Adsorptionschromatographie mit SiO2 nach dem Zugeben von Methanol zur Fraktion, das Aufbringen der adsorbierten Fraktion auf eine Glassäule, das Eluieren der Säule mit Lösungsmitteln steigender Polarität aus Methanol:Chloroform, um weitere Fraktionen zu erhalten und Wiederholen des Verfahrens ein weiteres Mal, das Unterziehen der Fraktionen einer Säulenchromatographie, um Fraktionen zu erhalten, das Konzentrieren der Fraktionen unter vermindertem Druck, um Acteosid als Rückstand zu erhalten, umfasst; und der Hepatoschutz eines Patienten unter Verwendung von reinem Acteosid aus der Pflanze Colerbrookea oppositifolia, umfassend die Schritte des Verabreichens von geeignetem, niedrig dosiertem Acteosid an den Patienten.
  • Detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung
  • Ein Verfahren zur Isolierung von reinem Acteosid mit hohem Hepatoschutz aus der Pflanze Colerbrookea oppositifolia, wobei das Verfahren die Schritte des Trocknens der oberirdischen Teile der Pflanze, das Mahlen der getrockneten Teile zu Pulver, das drei- bis viermalige Durchsickern lassen von Wasser oder Ethanol durch das Pulver, um einen Extrakt zu erhalten, das Filtrieren des Extrakts zum Entfernen von suspendierten Teilchen, um den Überstand zu erhalten, das Trocknen des Überstands bei etwa 45 bis 55°C, um einen Rückstand zu erhalten, das aufeinanderfolgende Fraktionieren des Rückstands mit Chloroform, Ethylacetat und Butanol, das Unterziehen der Butanolfraktion einer Adsorptionschromatographie mit SiO2 nach dem Zugeben von Methanol zur Fraktion, das Aufbringen der adsorbierten Fraktion auf eine Glassäule, das Eluieren der Säule mit Lösungsmitteln steigender Polarität aus Methanol:Chloroform, um weitere Fraktionen zu erhalten und Wiederholen des Verfahrens ein weiteres Mal, das Unterziehen der Fraktionen einer Säulenchromatographie, um Fraktionen zu erhalten, das Konzentrieren der Fraktionen unter vermindertem Druck, um Acteosid als Rückstand zu erhalten; und der Hepatoschutz eines Patienten unter Verwendung von reinem Acteosid aus der Pflanze Colerbrookea oppositifolia, umfassend die Schritte des Verabreichens von geeignetem, niedrig dosiertem Acteosid an den Patienten.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der ein Verfahren zur Isolierung von reinem Acteosid mit hohem Hepatoschutz aus der Pflanze Colerbrookea oppositifolia, wobei das Verfahren die Schritte umfasst von:
    • • Trocknen der oberirdischen Teile der Pflanze,
    • • Mahlen der getrockneten Teile zu Pulver,
    • • drei- bis viermaliges Durchsickern lassen von Wasser oder Ethanol durch das Pulver, um einen Extrakt zu erhalten,
    • • Filtrieren des Extrakts zum Entfernen von suspendierten Teilchen, um den Überstand zu erhalten,
    • • Trocknen des Überstands bei etwa 45°C bis 55°C, um einen Rückstand zu erhalten,
    • • aufeinanderfolgendes Fraktionieren des Rückstands mit Chloroform, Ethylacetat und Butanol,
    • • Unterziehen der Butanolfraktion einer Adsorptionschromatographie mit SiO2 nach Zugeben von Methanol zur Fraktion,
    • • Aufbringen der adsorbierten Fraktion auf eine Glassäule,
    • • Eluieren der Säule mit Lösungsmitteln steigender Polarität aus Methanol:Chloroform, um weitere Fraktionen zu erhalten, und Wiederholen des Verfahrens ein weiteres Mal,
    • • Unterziehen der Fraktionen einer Säulenchromatographie, um Fraktionen zu erhalten,
    • • Konzentrieren der Fraktionen unter vermindertem Druck, um Acteosid als Rückstand zu erhalten.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt das durch dieses Verfahren erhaltene Acteosid eine hepatoprotektive Wirksamkeit bei 12 bis 25 Mal geringerer Dosierung wie jenes, das aus anderen Quellen erhalten wurde.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Extrakte wässrige und alkoholische Extrakte.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt das Acteosid etwa 1,0% (Gew.) des gesamten Extrakts.
  • Ebenfalls offenbart ist ein Verfahren eines wirksamen Hepatoschutzes eines Patienten unter Verwendung von reinem Acteosid aus der Pflanze Colerbrookea oppositifolia, wobei das Verfahren die Schritte des Verabreichens von geeignetem niedrig dosiertem Acteosid an den Patienten umfasst.
  • Die Dosierung kann im Bereich zwischen 0,5 bis 10,0 mg/kg Körpergewicht liegen.
  • Das Acteosid kann über den oralen Weg verabreicht werden.
  • Das Acteosid kann die abnorm erhöhten Spiegel der Serum Glutamintransferase (GPT) verringern.
  • Das Acteosid kann die abnorm erhöhten Spiegel der Serum Glutamintransferase (GOT) verringern.
  • Das Acteosid kann die abnorm erhöhten Spiegel der Serum alkalische Phosphatase (ALP) verringern.
  • Das Acteosid kann die abnorm erhöhten Spiegel des Serum Bilirubins verringern.
  • Das Acteosid kann die abnorm erhöhten Spiegel der Serumtriglyceride (TG) verringern.
  • Das Acteosid kann die abnorm erhöhten Spiegel der Lipidperoxidase (LP) verringern.
  • Das Acteosid kann die abnorm verringerten Spiegel des Albumins erhöhen.
  • Das Acteosid kann die abnorm gesenkten Spiegel des reduzierten Glutathions erhöhen.
  • Das Acteosid kann etwa 10 bis 20 Mal wirksamer sein verglichen mit im Handel erhältlichen Hepatoprotektanten.
  • Das Acteosid kann etwa 40% bis 85% Schutz vor Hepatotoxizität bereitstellen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die antihepatotoxische/hepatoprotektive Wirksamkeit eines Phenylethanoids, das Verbascosid genannt, auch als Acteosid oder Kusaginin bezeichnet wird, bei ungewöhnlich geringer Dosierung, welches aus einer Pflanze namens Colerbrookea oppositifolia zum ersten Mal isoliert und von welchem zum ersten Mal berichtet wurde. Die Erfindung beschreibt die Isolierung von Verbascosid auf eine spezielle Weise und zeigt die antihepatotoxische/hepatoprotektive Wirksamkeit gegen verschiedene Toxine bei sehr geringen Dosen.
  • Von der wirksamen Verbindung Acteosid (Verbascosid) aus der Pflanze Colerbrookea oppositifolia ist zum ersten Mal von den Autoren der Erfindung berichtet worden. Die Authentizität des von den Autoren isolierten Acteosids ist durch 1H- und 13C-NMR-Daten bestätigt worden, die denen in der Literatur gleichen (Phytochemistry 21, 1123–1127 (1982)).
  • Kurze Beschreibung der beigefügten Zeichnungen
  • 1 zeigt die HPLC-Grafik, welche die Reinheit bestätigt.
  • 2 zeigt die vergleichende hepatoprotektive Wirksamkeit (%) von Acteosid, Silymarin und Glycyrrhizia.
  • Das Verfahren zur Isolierung von Acteosid aus unterschiedlichen Extrakten (95% Alk., 50% Alk. und wässrig) der Pflanze wird in den Beispielen, die hiermit als Anhang-1 angehängt werden, beschrieben. Die HPLC-Grafik, welche die Reinheit bestätigt, ist als 1 eingeschlossen.
  • Die Verbindung wurde biologisch ausgewertet auf hepatoprotektive/antihepatotoxische Wirksamkeit unter Verwendung eines umfassenden Studiendesigns, welches hiermit als Anhang-2 angehängt wird. Die während der biologischen Auswertung untersuchten Parameter, um die biologische Wirksamkeit und die optimale Dosis zu ermitteln, waren bevorzugt unter Verwendung der Kits (Clonital, Italien und Accurex Biomedical Pvt. Ltd. Thane). Die Liste der Parameter wird im hiermit anhängenden Anhang-2 gegeben. Die Dosis-Reaktions-Grafiken hinsichtlich der unterschiedlichen Parameter im Vergleich mit den Standard-Arzneistoffen Silymarin und Glycyrrhizin werden hiermit im anhängenden Anhang-3 gegeben.
  • Die biologische Auswertung der Daten für jede Dosis von Acteosid verglichen mit den Referenzmaterialien, nämlich Silymarin, Glycyrrhizin, und die erforderlichen Kontrollen werden in der Tabelle-1 angegeben, welche hiermit der Erfindung angehängt ist. Wie aus 2 und Tabelle-1 ersichtlich ist, weisen alle Parameter, welche nach der Verabreichung des Hepatotoxins CCl4 beeinträchtigt wurden, ab einer Dosis von 1,25 mg/kg bis zu 5 mg/kg Acteosid eine sehr gute Tendenz auf, auf die normalen Werte zurückzukehren. Der gesamte prozentuale Schutz, welcher durch Acteosid mit Bezugnahme auf alle untersuchten Parameter in dieser Erfindung bereitgestellt wird, beträgt im Allgemeinen 40%–80% und ist besser als jene, die durch Silymarin sogar bei einer 10- bis 20-fach höheren Dosierung als der von Acteosid erbracht wird.
  • Die optimale Dosis, um diesen Schutz mit dem Acteosid dieser Erfindung zu erreichen, liegt zwischen 1,25 mg/kg und 2,5 mg/kg. Statistisch wurde keine Signifikanz zwischen den drei Dosen, nämlich 1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg und 5 mg/kg, beobachtet, außer wenn die 1,25 mg/kg Dosisdaten mit denen der 5 mg/kg Dosis verglichen werden (Tabelle-2). Jedoch ist keine statistische Signifikanz zwischen höheren Dosen beobachtbar, d. h. 2,5 mg/kg und 5 mg/kg. Gleichzeitig gilt eine ähnliche Beobachtung exakt für die Dosiswirkung zwischen 1,25 mg/kg und 2,5 mg/kg.
  • Die vorstehende angegebene Erfindung wird in Form von Beispielen ausgeführt und sollte nicht so ausgelegt werden, dass sie den Umfang der Erfindung begrenzt.
  • Beispiel 1:
  • Die getrockneten oberirdischen Teile des Pflanzenmaterials Colebrookea oppositifolia (500 g) wurden zu einem groben Pulver vermahlen. Man ließ 95% Ethanol für vierzehn Stunden durch das Pulver durchsickern. Das Extraktionsverfahren wurde vier Mal wiederholt unter Verwendung von insgesamt 9 Litern 95% Ethanol (3,0 + 2,0 + 2,0 + 2,0 Liter, vier Extraktionen). Alle der vier Extrakte wurden gesammelt und filtriert, um suspendierte Teilchen zu entfernen. Der Überstand wurde bis zur Trockenheit auf einem Wischfilmverdampfer bei 50 ± 5°C eingedampft. Der so erhaltene Rückstand betrug 60,0 g (kodiert als RJM/0862/P08/A001), Extraktionswert 12%.
  • Der Extrakt wurde mit CHCl3, EtOAc und n-BuOH (2 × jeweils 1 Liter) aufeinanderfolgend fraktioniert. 15,0 g n-BuOH-Extrakt wurden nach dem Lösen in einer minimalen Menge MeOH und dem Adsorbieren auf SiO2-Gel, 100–200 mesh (100 g), einer Adsorptionschromatographie unterzogen. Das Lösungsmittel wurde vollständig entfernt, um frei fließendes Material zu erhalten. Der adsorbierte Extrakt wurde in eine Glassäule mit 37 mm Durchmesser geladen. Die Säule wurde mit Lösungsmitteln durch stufenweises Erhöhen des prozentualen Anteils von MeOH in CHCl3 eluiert. Es wurden 105 Fraktionen von jeweils 100 ml gesammelt und vereinigt, auf der Grundlage von DC-Mustern geprüft unter Verwendung von EtOAc:HCOOH:H2O::8:1:1 als mobiler Phase. Die Punkte wurde durch Sprühen mit frisch hergestellter Borinat-PEG-4000-Lösung [1% Lösung von 2-Aminoethyldiphenylborinat in MeOH und 5% Lösung Polyethylenglykol 4000 in EtOH (1:1 Vol/Vol. vor dem Sprühen gemischt)] visualisiert.
  • Sieben der Fraktionen, welche das gleiche DC-Muster zeigten, wurden vereinigt, getrocknet und einer Rechromatographie unter Verwendung einer 100–200 mesh SiO2-Gel-Säule (Verhältnis 1:20) unterzogen und mit CHCl3:MeOH-Gemischen steigender Polarität eluiert. Im Ganzen wurden 60 Fraktionen von jeweils 200 ml gesammelt. Acht der Fraktionen auf der Grundlage von DC wurden vereinigt, getrocknet und wieder einer Säulenchromatographie unterzogen. Es wurden 30 Fraktionen von jeweils 100 ml gesammelt. Sechs Fraktionen wurden unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde aus MeOH/CHCl3 als farbloses, amorphes, in MeOH lösliches Pulver auskristallisiert. Die bei Rf 0,42 (Lösungsmittelsystem EtOAc:HCOOH:H2O::8:1:1) gefundene Verbindung wurde als 862-II codiert. Die Reinheit von 862-II wurde auf der Grundlage von HPLC unter Verwendung der folgenden Betriebsbedingungen ermittelt.
    Säule: RP-18e (E-Merck, 5 μm, 4,6 × 250 mm), atm
    Mobile Phase: Acetonitril (B): 1,5% Essigsäure in Wasser (A)
    Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
    λmax: 335 nm
  • Die Verbindung wurde auf der Grundlage von NMR (1H und 13C) und der FABMS-Daten als Verbascosid ermittelt.
  • Beispiel 2
  • Die getrockneten oberirdischen Teile (500 g) von Colerbrookea oppositifolia wurden vermahlen und man ließ viermal 50% wässriges Ethanol (50% EtOH, 4 × 2,5 Liter) für jeweils 14 h durchsickern. Alle vier Extrakte wurden vereinigt. Die vereinigten wässrigen Extrakte wurden zentrifugiert, der klare Überstand wurde bis zur Trockenheit auf einem Wischfilmverdampfer bei 50°C ± 5°C eingedampft. Der Rückstand (90 g) wurde als RJM/0862/P08/A002 (Extraktionswert 18%) kodiert und aufeinanderfolgend mit CHCl3, EtOAc und n-BuOH fraktioniert. Der n-BuOH-Extr. wurde auf einer Säule aus Silicagel (60–120 mesh) mit einem Gradienten von MeOH in CHCl3 chromatographiert, wobei mit einem Gradienten aus MeOH in CHCl3 eluiert wurde. Das CHCl3:MEOH (5:1) Eluat wurde auf einer Silicagelsäule (100–200 mesh) unter Verwendung von CHCl3-MeOH:H2O (6:1:0,1) als Lösungsmittel rechromatographiert. Die nach DC homogenen Fraktionen wurden gesammelt, getrocknet und auf eine Sephadex-LH-20-Säule geladen, mit MeOH eluiert, um zwei Fraktionen von jeweils 500 ml herzustellen. Die zweite Fraktion, die hauptsächlich die Zielverbindung (862-II) enthielt, wurde einer weiteren Reinigung über eine Sephadex-LH-20-Säule unterzogen. Die Säule wurde mit MeOH:H2O (3:2) eluiert, um eine Fraktion zu liefern, welche bei Kristallisation aus MeOH/CHCl3 ein farbloses, amorphes, in MeOH lösliches Pulver ergab, Rf 0,42 (Lösungsmittelsystem EtOAc:HCOOH:H2O::8:1:1). Die Standardisierung des Extrakts RJM/0862/P08/A002 wurde auf der Grundlage von 862-II durch HPLC unter Verwendung der folgenden Betriebsbedingungen durchgeführt:
    Säule: RP-18e (E-Merck, 5 μm, 4,6 × 250 mm), atm
    Mobile Phase: Acetonitril (B): 1,5% Essigsäure in Wasser (A)
    Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
    λmax: 335 nm
  • Die Verbindung wurde auf der Grundlage von NMR (1H und 13C) und der FABMS-Daten als Verbascosid ermittelt. Es wurde gefunden, dass der prozentuale Anteil von 862-II im Extrakt RJM/0862/P08/A002 0,86 betrug.
  • Beispiel 3
  • Es wurden oberirdische Teile von Colebrookea oppositifolia (500 g) zu einem groben Pulver vermahlen und dann mit deionisiertem Wasser bei 98 ± 1°C für 2 h extrahiert. Das Extraktionsverfahren wurde viermal unter Verwendung einer Gesamtwassermenge (1 + 3 × 0,7 Liter, vier Extraktionen) wiederholt. Alle vier Extrakte wurden vereinigt. Der vereinigte Extrakt wurde zentrifugiert, das klare Filtrat wurde lyophilisiert, um ein hellgelbes amorphes Pulver (Ausbeute 95 g) zu ergeben. Der wässrige und als RJM/0862/P08/A003 kodierte Extrakt-Rückstand (Extraktionswert 19%) wurde aufeinanderfolgend mit CHCl3, EtOAc und n-BuOH fraktioniert.
  • Der n-BuOH-Extrakt wurde einer Adsorptionschromatographie auf SiO2-Gel, 60–120 mesh (150 g), unterzogen. Das Lösungsmittel wurde vollständig entfernt, um frei fließendes Material zu erhalten. Eine Glassäule mit 1,5 Inch Durchmesser wurde mit 100 g SiO2-Gel, 60–120 mesh in EtOAc, bepackt. Das adsorbierte Material wurde in die Säule geladen. Die Säule wurde mit EtOAc eluiert und durch stufenweises Erhöhen des prozentualen Anteils von MeOH eluiert. Im Ganzen wurden 120 Fraktionen von jeweils 100 ml gesammelt und auf der Grundlage von DC- Mustern (EtOAc:HCOOH:H2O::8:1:1 als mobiles Lösungsmittel) vereinigt. Die Punkte wurden durch Sprühen von frisch hergestellter Borinat-PEG-4000-Lösung [1% Lösung von 2-Aminoethyldiphenylborinat in MeOH und 5% Lösung von Polyethylenglykol 4000 in EtOH (1:1 Vol./Vol. vor dem Sprühen gemischt)] visualisiert.
  • Die in EtOAc und 10% MeOH eluierten Fraktionen zeigten das gleiche DC-Muster. Diese Fraktionen wurden vereinigt, getrocknet und dann in einer miminalen Menge MeOH gelöst. Die Kristallisation wurde durch Zugabe von CHCl3 in kleinen Portionen zur Methanollösung durchgeführt, was ein farbloses amorphes Pulver ergab, welches als 862-II charakterisiert wurde.
  • Die Standardisierung des Extrakts RJM/0862/P08/A003 wurde auf der Grundlage von 862-II durch HPLC unter Verwendung der folgenden Arbeitsbedingungen durchgeführt:
    Säule: RP-18e (E-Merck, 5 μm, 4,6 × 250 mm), atm
    Mobile Phase: Acetonitril (B): 1,5% Essigsäure in Wasser (A)
    Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
    λmax: 335 nm
  • Die Verbindung wurde auf der Grundlage von NMR (1H und 13C) und FABMS-Daten als Verbascosid ermittelt.
  • Es wurde gefunden, dass der prozentuale Anteil von 862-II im Extrakt RJM/0862/P08/A003 0,22 beträgt. Es wurde gefunden, dass 862-II, ein amorphes Pulver, Smp. 145–146°C, [α]21 –85,6 [C 0,5% MeOH], MS: FABMS, [M + Na]+ m/z 647, ein bekanntes Phenylpropanoid ist, d. h. Verbascosid (Acetosid); [β-(3',4'-Dihydroxyphenyl)ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→3)-β-D-(4-O-caffeoyl)glucopyranosid]. Die Struktur wurde schließlich durch 1H- und 13CNMR-Daten ähnlich denen, von denen in der Literatur berichtet wird (Andary C., Wylde, R., Laffite, C., Privat, G. und Winternitz, F.; Laboratie de Botanique et Cryptogamie, Faculte de Pharmacie. 34000 Montpellier. France; Phytochemistry, 21 (5), 1123–1127 (1982), bestätigt. STUDIENDESIGN
    1. Tiere: Albinoratten (Wistar, 150–180 g), beiderlei Geschlechts Albinomäuse (Swiss, 25–30 g), beiderlei Geschlechts
    2. Hepatotoxin: Kohlenstofftetrachlorid (CCl4)
    3. Studie: Prophylaktisch
    4. Behandlungsplan: 48 h, 24 h, 02 h vor und 06 h nach Toxin; Blut- & Leberprobensammlung 18 h nach der letzten Behandlung mit Testmaterial/Referenzstandard.
    5. Dosen:
    Acteosid: 0,625, 1,25, 2,5 & 5,0 mg/kg, p. o.
    Silymarin: 50 mg/kg, p. o.
    Glycyrrhizin: 100 mg/kg, p. o.
    CCl4: 1 ml/kg p. o. in flüssigem Paraffin (1:1)
    6. Parameter
    Serum
    Bilirubin: Jendrassik-Verfahren durch Verwenden des von Clonital gelieferten Kits 24030-Carvico (BG)-Italien
    Triglyceride: Enzymatisches GPO-POD-Verfahren durch das von Accurex Biomedical Pvt. Ltd., Thane, gelieferte Kit
    Albumin: Kolorimetrisches B.C.G.-Verfahren durch das von Accurex BiomedicalPvt. Ltd., Thane, gelieferte Kit
    Transaminasen (ALT & AST): Das durch Transaminasenreaktion gebildete Pyruvat wurde spektrophotometrisch nach der Umsetzung mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin (Reitman und Frankel, 1957) bestimmt.
    ALP: Das im alkalischen Medium gebildete p-Nitrophenol wurde spektrophotometrisch unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als Substrat (Waler und Schutt, 1974) gemessen.
    Leberhomogenat:
    GSH: Es wurde nach der Deproteinierung durch Umsetzung mit DTNB (Ellman 1959 wie durch David 1987 modifiziert) bestimmt.
    Lipid-Peroxidation: Mit Thiobarbitursäure reagierende Stoffe wurden spektrophotometrisch bei 535 nm bestimmt. Durch das Verfahren von Buege und Aust (1978).
  • Hepatoprotektive Wirksamkeit:
  • Die hepatoprotektive Wirksamkeit (H) wurde nach der folgenden Gleichung berechnet: H = [1 – (TC – V/VC – V)] × 100
  • Wobei TC, VC und V mit Arzneistoff + Toxin, mit Vehikel + Toxin beziehungsweise mit Vehikel behandelte Tiergruppen sind.
  • Figure 00140001
  • Figure 00150001
  • Figure 00160001

Claims (9)

  1. Verfahren zur Herstellung von Acteosid, wobei das Verfahren Extrahieren von Acteosid aus der Pflanze Colerbrookea oppositifolia umfasst.
  2. Verfahren zur Isolierung von reinem Acteosid mit hoher Hepatoprotektion aus der Pflanze Colerbrookea oppositifolia, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a. Trocknen von oberirdischen Teilen der Pflanze, b. Mahlen der getrockneten Teile zu Pulver, c. drei- bis viermaliges Durchsickern lassen von Wasser oder Ethanol durch das Pulver, um einen Extrakt zu erhalten, d. Filtrieren des Extrakts zum Entfernen von suspendierten Teilchen, um den Überstand zu erhalten, e. Trocknen des Überstands bei etwa 45°C bis 55°C, um einen Rückstand zu erhalten, f. aufeinanderfolgendes Fraktionieren des Rückstands mit Chloroform, Ethylacetat und Butanol, g. Unterziehen der Butanolfraktion einer Adsorptionschromatographie mit SiO2 nach Zugeben von Methanol zur Fraktion, h. Beladen der adsorbierten Fraktion auf eine Glassäule, i. Eluieren der Säule mit Lösungsmitteln steigender Polarität aus Methanol:Chloroform, um weitere Fraktionen zu erhalten, und Wiederholen des Verfahrens ein weiteres Mal, j. Unterziehen der Fraktionen einer Säulenchromatographie, um Fraktionen zu erhalten, k. Konzentrieren der Fraktionen unter vermindertem Druck, um Acteosid als Rückstand zu erhalten.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Extrakte wässrige und alkoholische Extrakte sind.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei Acteosid etwa 1,0 Gew.-% des gesamten Extrakts ausmacht.
  5. Extrakt aus Colerbrookea oppositifolia, umfassend Acteosid, erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2.
  6. Verwendung eines Extrakts gemäß Anspruch 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zum Schutz eines Patienten gegen Hepatotoxizität.
  7. Verwendung eines Extrakts gemäß Anspruch 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zum Schutz eines Patienten gegen Hepatotoxizität, wobei der Extrakt dem Patienten mit Acteosid in einer Dosierung im Bereich von 0,5 bis 10,0 mg/kg Körpergewicht zu verabreichen ist.
  8. Verwendung eines Extrakts gemäß Anspruch 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zum Reduzieren abnormal erhöhter Spiegel von Serumglutamintransferase (GPT), Serumglutamintransferase (GOT), Serum alkalische Phosphatase (ALP), Bilirubin, Serumtriglyceriden (TG), Lipidperoxidase (LP), Albumin und/oder reduziertem Glutathion in einem Patienten, wobei der Extrakt dem Patienten mit Acteosid in einer Menge im Bereich von 0,5 bis 10,0 mg/kg Körpergewicht zu verabreichen ist.
  9. Verwendung gemäß einem der Ansprache 6 bis 8, wobei Acteosid auf oralem Weg zu verabreichen ist.
DE60317111T 2003-03-31 2003-03-31 Isolierung des hepatoprotektiven wirkstoffes acteosid aus colerbrookea oppositifolia Expired - Lifetime DE60317111T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2003/001180 WO2004087184A1 (en) 2003-03-31 2003-03-31 Isolation of the hepatoprotective agent acteoside from colerbrokea oppositifolia

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60317111D1 DE60317111D1 (de) 2007-12-06
DE60317111T2 true DE60317111T2 (de) 2008-07-31

Family

ID=33104924

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60317111T Expired - Lifetime DE60317111T2 (de) 2003-03-31 2003-03-31 Isolierung des hepatoprotektiven wirkstoffes acteosid aus colerbrookea oppositifolia

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1617853B1 (de)
JP (1) JP4486508B2 (de)
CN (1) CN100467033C (de)
AT (1) ATE376426T1 (de)
AU (1) AU2003215819A1 (de)
DE (1) DE60317111T2 (de)
WO (1) WO2004087184A1 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109776631A (zh) * 2019-01-30 2019-05-21 中国人民解放军联勤保障部队第九二八医院 一种毛蕊花糖苷的制备方法
CN117205131B (zh) * 2023-11-09 2024-01-26 云南雅赫生物科技有限公司 具有美白和抗氧化作用的羽萼叶碱性水提物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03271227A (ja) * 1990-03-20 1991-12-03 Tsumura & Co 糖尿病治療剤
US5719129A (en) * 1991-03-21 1998-02-17 Parfums Christian Dior Derivative of caffeic acid, oraposide, and cosmetic or pharmaceutical compositions, in particular dermatological compositions, containing it

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003215819A1 (en) 2004-10-25
CN100467033C (zh) 2009-03-11
JP4486508B2 (ja) 2010-06-23
CN1771048A (zh) 2006-05-10
JP2006514675A (ja) 2006-05-11
EP1617853B1 (de) 2007-10-24
ATE376426T1 (de) 2007-11-15
DE60317111D1 (de) 2007-12-06
WO2004087184A1 (en) 2004-10-14
EP1617853A1 (de) 2006-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60202603T2 (de) 8-(c-beta-d-glucopyranosyl)-7,3',4'-trihydroxyflavone, verfahren zur isolation aus pterocarpus marsupium und pharmazeutische zusammensetzung zur behandlung von diabetes
DE60316578T2 (de) Echinacea angustifolia extrakte
EP0553658B2 (de) Pharmazeutisch wirksame Zusammensetzung aus Tanacetum parthenium sowie Verfahren zu deren Extraktion und mit der pharmazeutisch wirksamen Zusammensetzung hergestelltes Arzneimittel
DE60207878T2 (de) Lösungsmittelextraktionsverfahren
DE69928131T2 (de) Verfahren zur extraktion organischer salze aus pflanzen, das salz und ähnliche salze
CN113826646B (zh) 一种银杏酚酸溶液剂及制备方法
CH650931A5 (de) Extrakt von zedrach borken mit geschwulsthemmender wirkung und verfahren zu dessen herstellung.
EP1852105B1 (de) Verfahren zur Herstellung einer triterpensäurehaltigen wässrigen Lösung, triterpensäurehaltige wässrige Lösung und deren Verwendung
DE69634530T2 (de) Antivirales mittel und verfahren zu dessen herstellung
EP0711172B1 (de) Präparate aus crataegus-arten, arzneimittel und ihre verwendung zur verhinderung des plötzlichen herztodes sowie von reperfusions-bedingten cardiovaskulären schädigungen
DE60317111T2 (de) Isolierung des hepatoprotektiven wirkstoffes acteosid aus colerbrookea oppositifolia
DE2347576C2 (de) Bruceantin und diese Verbindung enthaltende antileukämische Mittel
DE3878169T2 (de) Medizinische zusammensetzungen, gegruendet auf flavonoiden und saponinen, gewonnen aus chrysanthellum, verfahren zu ihrer herstellung und therapeutische anwendungen.
WO2007029263A1 (en) Pharmaceutically active extracts of vitex leucoxylon, a process of extracting the same and a method of treating diabetes and inflammatory diseases therewith
EP0757055B1 (de) Glykoside, deren zuckerfreie Abbauprodukte und Derivate derselben
DE2652380A1 (de) Verfahren zur isolation von uteroevakuierenden substanzen aus der zoapatlepflanze
DE60214046T2 (de) Ein einfaches verfahren zur gewinnung von beta-aescin aus der indischen rosskastanie (aesculus indica)
DE1923082C3 (de) Verfahren zur Gewinnung von Polyhydroxyphenylchromanonen (Silymarin I-IV) und Arzneimittel enthaltend das Polyhydroxyphenylchromanon (Silymarin I-IV = Silymarin I-IV-Gruppe)Gemisch
CH644133A5 (de) Oxydierte sterylglycosid-derivate und sie enthaltende pharmazeutische praeparate.
DE4021428A1 (de) Verfahren zur herstellung eines anthelminthikums
DE69915290T2 (de) Verfahren zur extraktion eines bestandteiles von pflanzenmaterial
DE2241418A1 (de) Antileukaemische ansamakrolide
EP1648916B1 (de) Verfahren zur gewinnung eines natürlichen gemisches konjugierter equin esrtrogene
US6989162B2 (en) Hepatoprotective agent of plant origin and a process thereof
DE10029047B4 (de) Verwendung von Luteolin-7-O-glucuronid als Wirkstoff in einem anticholestatischen Arzneimittel

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition