DE2347576C2 - Bruceantin und diese Verbindung enthaltende antileukämische Mittel - Google Patents

Description

CH₃

HO

2. Antileukamische Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Verbindung gemäß Anspruch 1 neben üblichen Trägerstoffen.

Die Erfindung betrifft Bruceantin und diese Verbindung enthaltende antileukamische Mittel. .

Die botanische Literatur berichtet, daß die Blätter und Wurzeln der Brucea Antidysenterica zur Herstellung einer Salbe in Pulverform gebraucht wurden und daß diese Salbe gegen krebsartige Tumore in den Wachstumsgebieten der Pflanze verwendet wird, nämlich in Eritrea und in Äthiopien (Cortesi, Rass. Econ. d?lle Colonie (Rom) 24. 71-126 (1936)). Es ist ferner berichtet worden, daß das Pulver des Holzes in Äthiopien für die Heilung von Krebs-Tumoren verkauft worden ist (Baldrati. Piate Officinali dell' Africa Orientale, 131 (1946)). Diese Quellen werden in Lloydia. 34,204 (1971), auf Seiten 221 bis 222 genannt.

Bisher ist jedoch noch kein aktiver Faktor mit unzweifelhafter antileukämischer Aktivität aus Brucea Antidysenterica Mill isoliert worden.

Die jetzt gefundene Anti-Tumor-Aktivität des Bruceantin wurde durch Dr. Jonathan L Hartwell, den Direktor des Nationalen Krebsinstituts und des Nationalen Gesundheitsinstituts der USA, nach Durchführung ausführlicher Testreihen in vitro und in vivo, nämlich in Tierversuchen, bestätigt. Insbesondere die Versuche an Testmäusen mit intraperitoneal appliziertem Tumor ergaben bei Injektionen von 0,06 mg/kg Bruceantin pro Körpergewicht eine Verbesserung von 43 — 51% gegenüber den Kontrolltieren. Das Gutachten kommt zu dem Schluß, daß Bruceantin eindeutig eine Anti-Tumor-Aktivität bei gleichzeitig niedriger Toxizität bei niedriger Dosierung im Standard-Tierversuch

ίο besitzt.

Um das Bruceantin in reiner Form zu gewinnen, wurden Äthanol-Extrakte von Brucea Antidysenterica einer Reihe von Extraktions-, Chromatographie- und Reinigungsschritten unterzogen, um unter anderem

is Bruceantin zu ergeben. Die allgemeine Formel dieser Substanz ist nachstehend angegeben:

OH
HO i CO₂CH₃

VSr'H ^CHj

O H₃C T o'V

HO

if I

O CH₃

H₃C

Zur Isolierung wird die Stammrinde von Brucea Antidysenterica Mill mit 95%igem Äthanol extrahiert und einer Reihe von Extraktionen, Trennungen und Säulenfraktionierungen unterzogen, die in F i g. I bis III gezeigt und umrissen sind und nachstehend im einzelnen erörtert sind. Der Extrakt wurde auf Anti-Tumor-Aktivität in vitro gegen Zellen getestet, die von menschli-

J5 ehern Krebs des Nasopharynx (KB) abgeleitet wurden, sowie gegen zwei normal Tier-Tumorsysteme, die im Testwesen allgemein bekannt sind. Bruceantin zeigt eine erhebliche anti-leukämische Aktivität im Mikrogrammzu Kilogrammwert, dem Wert, bei dem die Toxizität gegen das System des Menschen oder des Säugetiers selbst kein nennenswerter Faktor ist.
Die Extraktion geschieht wie folgt:

"Β''-Chloroform-Extrakt

"D" Petroläther-Extrakt

Fig. I
Stufe I

Brucea Antidysenterica Äthanol

"A"-Athanol-Extrakt

Chloroform/Wasser

10% wässeriges MethanoI/Pet.Äther

10% wässeriger Methanol-Extrakt

Watser/Tetrachlorkohlenstoff

20% wässeriger | Methanol-Extrakt j

"E" Tetrachlorkohlenstoff-Extrakt

Wasser/Chlorofonn

"F" Chloroform-Extrakt

"G" 40% wässeriges Methanol "C-Wasser-Extrakt

Fig. II Stufe II

(Chromatographie auf SilicAR* CC-7) CHCI₃

► weg 0,5% Methanol/Chloroform (~5 S.V.) ► weg 1% Methanol/Chloroform (-5 S.V.) ► weg 1% Methanol/Chloroform (-5 S.V.) ► Bruceantin + Dehydrobruceantin

1% Methanol/Chloroform (-1 -2 S.V.) ► Bruceantin + Bruccantarin 1% Methanol/Chloroform (-1-2 S.V.)

Fig. III

Stufe III (a)

(Chromatographie durch SilicAR* CC-7) 3 -» 20% Ätherbenzol -* weg

30% Ätherbenzol (-4-5 S.V.) Spur (e)

30% Ätherbenzol (-8-10 S.V.) Bruceantin (0

Zur Gewinnung des Bruceantins wurde getrocknete, eemahlene Stammrinde von Brucea Antidysenterica Will, mit 95%igem Äthanol extrahiert. Die Extrakte wurden kombiniert und das Lösungsmittel durch Verdampfung entfernt. Der Rückstand (A) wurde dann zwischen Chloroform und Wasser verteilt. Der Chloroform-Extrakt (B) wurde zurückbehalten und das Lösungsmittel durch Verdampfung entfernt.

Der Rückstand (B) wurde dann zwischen !O°/oigem wässerigen Methanol und Petroläther verteilt (d. h. einer Wasser-/Methanol-Mischung,die IO Volumenprozent Wasser und 90 Volumenprozent Methanol enthielt). Der Petrolätherteil wurde weggeschüttet und ausreichend Wasser zugesetzt, um die Verdünnung des Methanols auf 2O°/oiges wässeriges Methanol zu erhöhen. Die 20%ige wässerige Methanol-Lösung wurde dann mit Tetrachlorkohlenstoff extrahiert und der Tetrachlorkohlenstoff ex trakt (E) weggegossen.

Der 20%ige wässerige Methanolextrakt wurde dann weiter mit Wasser verdünnt und die entstehende 40°/oige wässerige Methanollösung mit Chloroform extrahiert.

Der Chloroformextrakt wurde abgetrennt und das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand (F) wurde dann durch Säulenchromatographie gereinigt. Die Säule, eine Kieselgelsäule (SilicAR* CC-7), wurde in Chloroform hergestellt. Die in Chloroform anfallenden Fraktionen, in fünf Säulenvolumina von 1% Methanol in Chloroform, wurden weggegossen und die nächsten 1 bis 2 Säulen volumina mit 1% Methanol in Chloroform wurden als Fraktion H zurückbehalten. Die folgenden 1 -2 Säulenvolumina mit 1% Methanol in Chloroform wurden als Fraktion I zurückbehalten. Eine weitere Eluierung mit dem gleichen Lösungsmittel (1—2 S.V.) ließ die Fraktion J entstehen.

Bei Verdampfung des Lösungsmittels war der Rückstand H reich an Bruceantin und enthielt auch etwas Dehydrobruceantin, während die folgende Fraktion I nur etwas Bruceantin enthielt und reich an ßruceantarin war.

Die Fraktion H wurde dann rechromatographiert. und zwar mit einer Kieselgelsäule (SilicAR* CC-7). Die Säule wurde mit zunehmenden Anteilen von Äther in Benzol eluiert. Eine Eluierung mit bis zu 20% Äther in Benzol ließ keine gewünschten Fraktionen entstehen. Eine Elukrung mit 30% Äther in Benzol (ca. 4 bis 5 Säulenvolumina) ließ ein Eluat entstehen, das bei Verdampfung einen Rückstand (e) gab, der etwas Bruceantin enthielt. Eine weitere Eluierung mit dem gleichen Lösungsmitte! (8 bis 10 Säulenvolumina) ließ die Friktion (f) entstehen, die bei Verdampfung einen Rückstand mit im wesentlichen reinen Bruceantin ergab. Bruceantin selbst kristallisiert nicht ohne weiteres. Ein kristallines Derivat, das Triacetat, wurde in der üblichen Weise hergestellt. Der alkoholische Extrakt A zeigte eine Aktivität gegen die P388-Leukämie bei Mäusen und den Walker 256-Krebs bei Ratten..

Bruceantin zeigte eine erhebliche Aktivität gegen die P388-Leukämie in einem Bereich von 1!5 bis 2000 μg/kg. In vitro wurde beim Testen gegen Zellen aus dem menschlichen Krebs des Nasopharynx (KB-Zellen) eine C'ytotoxi/.ität (ED50) bei einem Wert von etwa 10 ' ng/ml festgestellt.

Lösungen des aktiven Bestandteils können in Wasser (ider in Mischungen hergestellt werden, die Wasser mit Älhanol, Glycerin, verträglichen l'olyolen (beispielsweise Glycerin. Polyäthylrnglykol. Propylcnglykol) enthalten. Dispersionen werden in Glycerin, flüssigem Polyäthylenglykol und Mischungen derselben sowie in ölen hergestellt.

Für normale Bedingungen der Lagerung i'nd Verwendung wurde diesen Präparaten ein Konservierungsmittel zugesetzt, um ein Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.

Wie vorstehend erwähnt, können die pharmazeutischen Substanzen in Formen vorgesehen sein, die sich für eine Injizierung eignen; dazu gehören sterile wässerige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die Herstellung von sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen ex tempore. In allen Fälien muß die Substanz steril und in einem solchen Maße flüssig sein, daß eine einfache Injizierbarkeit besteht Sie muß unter den Herstellungsbedingungen stabil sein und bei Lagerung muß ein Schutz gegen Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien und Pilze, gegeben sein. Das Grundlösungsmittel oder das Dispersionsmedium können Wasser, Äthanol, Polyole (z. B. Glycerin, Propylen, Glykol, nüssiges Polyäthylenglykol), geeignete Mischungen davon und pflanzliche Öle enthalten. Die

. geeignete Fluidität kann beispielsweise, durch Verwendung eines Zusatzes erzielt werden, beispielsweise Lecithin, indem die erforderliche Partikelgröße im Falle von Dispersionen aufrechterhalten wird, und indem Surfa-iants verwendet werden (beispielsweise ein Kondensationsprodukt von Äthylenoxid mit Fettsäuren oder Fettalkoholen, Teilestern von Fettsäuren, ein Hexitol-Anhydrid und Polyoxäthylen-Kondensationsprodukte der Ester). Eine Verhinderung des Wachstums von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle bzw. antifungale Mittel herbeigeführt werden, beispielsweise Methylparaben (Methyl-4-hydroxybenzoesäure), Chlorbutanol, Benzylalkohol, Phenol, Sorbinsäure oder Thimerosal (Thiomersal). In vielen Fällen werden vorzugsweise isotonische Mittel mit aufgenommen, beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid. Eine längere Absorption der injizierbaren Substanzen kann durch Verwendung von Mitteln in den Substanzen herbeigeführt werden, die die Absorption verzögern, beispielsweise Aluminium-Monostearat und Gelatine.

Sterile injizierbare Lösungen werden durch Einbringen des aktiven Hauptbestandteils in ein Lösungsmittel, je nach Bedarf, mit verschiedenen anderen Bestandteilen hergestellt, die vorstehend aufgezählt worden sind, woran sich eine Filtersterilisierung anschließt. Allgemein werden Dispersionen durch Einschluß des zuvor sterilisierten aktiven Bestandteils in ein steriles Vehikel hergestellt, das das Grunddispersionsmedium und die anderen vorstehend aufgezählten Bestandteile enthält.

Sterile Pulver zur späteren Herstellung steriler

injizierbarer Lösungen werden bevorzugt nach der Gei.iertrocknungsmethode hergestellt, bei der der aktive Bestandteil n!s Pulver und irgendwelche Zusätze aus einer zuvor steril gefilterten Lösung anfallen. Die Pulver können auch durch ein Gas, beispielsweise Äthylenoxid, sterilisiert werden, und können anschließend mit den erforderlichen Zusätzen und in der richtigen Partikelgröße in das Grundpulver zur späteren Wiederauflösiing mit der gewünschten Suspensionsfliis= sigkcit eingebr.'icht werden, die natürlich selbst ebenfalls steril sein muß.

Zu den vorgenannten Substanzen können auch noch

i'"> weite, v. /i'sät/c hinzugefügt werden, bciv.tici^v, ..ίμ· Mcchloräthamin-I lydrochlorid. >his-(2 Chloriithyl)-Amino-Uracil, Triäthylcn-Melamin. Aetinomycin C und Cycloheximid.

Fs ist besonders vorteilhaft, dl·· erfindungsgemäße Substanz in Dosicningseinheiten /u formulieren, um die Verabreichung zu erleichtern und die Dosierung gleichförmig zu gestalten. Die Dosiertingseinheitsform, wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die als Finheitsdosicrungen für Tiere und Menschen geeignet sind, die jeweils zu behandeln sind, wobei jede Einheit eine bestimmte Menge aktiven Materials enthält, die so berechnet ist, daß der gewünschte therapeutische Effekt m in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger erzeugt wird. Die Spezifikationen für die erfindungsgemäßen Dosierungseinheitsformen bestimmen sich durch und sind direkt abhängig von (a) der spezifischen Charakteristik des aktiven Materials und ι ·. dem betreffenden therapeutischen Effekt, der erreicht werden soll, und (b) den Begrenzungen, clic bei der Herstellung solchen aktiven Materials für die Behandlung von Seuchen bei lebenden Wesen naturbedingt auftreten, die einen verseuchten Zustand haben, bei dem jn die körperliche Gesundheit beeinträchtigt ist, wie nachstehend im einzelnen beschrieben wird, wobei es sich dabei um die erfindungsgemäßen Merkmale handelt.

Die Dosierung des aktiven Flauptbestandteils zur :. Behandlung des angezeigten Zustands hängt vom Alter. Gewicht und Zustand des Tieres oder des Menschen ab. das bzw. der behandelt wird, ebenso vom betreffenden Zustand und seiner Bedeutung, von der besonderen Form des aktiven Bestandteils und vom Weg der ι Verabreichung. Eine Dosierung von etwa lOOug/kg oder eine tägliche Gesamtdosierung von etwa 5 bis 20 mg. einzeln oder in einzelnen kleineren Dosen verabreicht, w ird als geeignet angesehen.

Der aktive Hauptbestandteil wird zur bequemen und s effektiven Verabreichung in effektiven Mengen zusammengesetzt, und zwar mit einem pharmazeutisch akzeptablen "Träger in Dosierungseinheitsform. wie nachstehend beschrieben. Eine Einheitsdosierungsform kann den aktiven Hauptbestandteil in Mengen von etwa ·· ' 1 bis 5 mg pro Einheit enthalten. Ausgedrückt in Anteilen ist der aktive Bestandteil von etwa 0.01 bis etwa 0.1 Gewichtsprozent pro Volumen der flüssigen Stoffe vorhanden.

Beispiel I Isolierung von Bruceantin-Konzentrat

Der konzentrierte alkoholische Extrakt aus 10 kg getrockneter, gemahlener Stammrinde (A. 1180 g) 5" wurde zwischen Wasser (61) und Chloroform (6 I) verteilt. Die Wasserschicht wurde mit Chloroform (6 I) ausgewaschen und die kombinierten Chloroformschichten verdampft, wobei ein brauner Teer (B. 385 g) entstand. Die Verdampfung der Wasserschicht ergab ebenfalls einen braunen Teer (C, 630 g). Die Fraktion B wurde zwischen 15% wässerigen Methanol (6 I) und Petroläther (4x41) verteilt. Die Petrolätherschicht ergab nach Konzentrierung einen dunkelgrünen Teer (D. 189 g). Die 10%ige wässerige Methanoischicht wurde mit Wasser verdünnt wobei 20% wässeriges Methanol entstand; es folgte dann eine Extraktion mit Tetrachlorkohlenstoff (4x3.81). Die kombinierte Tetrachlorkohlenstoffschicht wurde verdampft, wobei ein grüner Teer (E, 70 g) entstand. Die 20%ige wässerige Methanolschicht wurde mit Wasser verdünnt, wobei 40° wässeriges Methanol entstand. Es folgte dann eine Extraktion mit Chloroform (5x2,4 1). Die kombinierte Chloroformschicht wurde verdampft und es entstand brauner Teer (F. 90 g). Die 40°'..ige wässerige Methanol schicht wurde verdampft und es vcblieb ein braunes Pulver (G, 10 g). Auf diese Weise wurde die gesamte -. Aktivität (KR in d I'. !88) effekti\ in der letzten Chlornformsrhiihi konzenlrierl (Fraktion F).

Beispiel Π
Vorläufige Chromatograph ι sehe Reinigung

Die Fraktion F wurde auf einer SilicAR' (.'("-7-Sanle (5.4 kg. Säulcnlösungsi lielvolumen: -9 1) Chromatographien und erst mit Chloroform und dann mit zunehmenden Mengen von Methanol u> Chloroform

r. eluicrt (45 1 Methanol/Chloroform. 5 : <W5; 60 1 Methano|/Chloroform, 1 : W), Fraktionen wurden auf der B. isis der Gleichheit auf Chromar' 7GF-Platten (20 χ 20 cm. 0.25 mm) kombiniert, mit 2:5 Äther in Benzol entwickelt und mit Fisen(lll)chlond und

jo Vanillinbesprühungcn sichtbar gemacht. Das Bruceantin wurde aus der Säule eluiert und durch Besprühen der Platten mit F.iscn(III)chlorid sichtbar gemacht Fine fortgesetzte Elu'erung mit Methanol/Chloroform (15 1. I : W) ergab eit.e Fraktion (M. 8.Ig). in der das

:. Bruceantin angereichert war.

Beispiel III
Isolierung von Bruceantin

ι Fine sorgfaltige Sätilenchromatographie der Fraktion H auf SilicAR' CC-7 (f>Of) g, Säulenlösungsmittclvolumen - I I) mit Benzol als F.luierungsmittel. gefolgt von Benzol, das zunehmende Mengen von Äther enthielt (2 I. Äther-'Benzo! 3 : 97 4 1 Äther/Benzol. 3 :47; 4 I Äther'

j- Benzol 1 : 4: 20 I Äther'Bcnzol 1 : 4) ergab Fraktionen, die nicht von Interesse waren und deshalb verworfen wurden. Fine weitere Eluicrung mit Äther/Benzol (4.4 I. 3 : 7) ergab die Fraktion E. die etwas Bruceantin enthielt. Eine weitere Fluierung mit dem gleichen Lösungsmittel

• - (S I. 3 : 7) ergab reines Bruceantin (|, 2.0 g. ' .02 ^vn) als einen farblosen Schaum Versuche zur Kristallisierung von Bruceantin aus vielen Lösungsmitteln scheiterten und alle Spektren wurden an Proben bestimmt, die durch vorbereitende Dünnschichtchromatographie new

■>"ϊ zubereitet worden waren (dieselben Bedingungen wie bei der analytischen Dünnschichtchromatographie) und sie zeigten:

(a]ii -27.7° (c 3.0, Pyridin);

uv/™ 280 (f 6.450) und 221 nm (r 14,100);

uv / !,';;·' -^S"'^H 328 (r 4.26Ο) und 221 nm (ε 15,500);

ir;. ™; 2,90 5,76. 6,05. 6.13. 8,70 und 9,45 μ;

Massenspektrum m/<>548 (M"), 438, 420, 402, 297,

151, 111,0819(CaICd-TUrC-H_nO. 111,0809);

nmr (CDCU) γ 8,88 (6 H. d, J = 6,5 Hz, CH(CHj)₂).

8.56 (3 H, s, 10-CH₃), 8,11 (3 H, br.s, 4-CH₃).

7.82 (3 H. s. - CH = C(CH₃)-), 7,29 (1 H, br.rn, OH), 6,47 (1 H. br.m. OH), 6,24 (3 H, s, OCH₃),

4,39 (1 H, br.s, OCOCH = C(CH₃)-),

3,87 (1 H, br.s, OH), und 3,79 (1 H, d, J_{15 M} = 13 Hz, 15-H).

Analyse Massenspektrum hoher Auflösung berechnet für O₈H₃₆O,,: M - = 548,225; ermittelt 548.222.

308 109/60

Beispiel IV

ftruccantin-Triacetal

liruceanlin '.[, 50 mg) wurde in einer Mischung von I'ssigsäure-Anhydrid (0.9 ml) und trockenem l'yriclin (0.9 ml) aufgelöst, und die entstehende I /lsiing wurde 40 Stunden lang bei Zimmertemperatur umgerührt. Nach dieser Zeit wurde das Rcaktionsgemisch in eine Mischung aus Kis und verdünnter Salzsäure gegossen und ι Minuten lang umgerührt, dann mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformsehicht wurde mit gesättigtem Natriumhydrogcncarbonat. Wasser und gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, dann über Magnesiumsulfat getrocknet und verdampft, um 70 mg eines blassen gelben Glases /u ergeben. Dieses Material wurde auf drei C'hromar* 7C)F-Plattcn (20 χ 20 cm χ 0,25 mm) aufgelrar^n und mit I : I Äther/ Benzol cluiert, um in der llauptbandc Bruceantintriacctat (b, 44 mg. 72%) als ein amorphes Pulver /u ergeben, das aus Methanol· Wasser kristallisiert wurde und feine, farblose Kristalle von 6ergab:

uv/I_n';:" 250 nm (r 11,200);

ir/ ^; 5,74, 5,95. 6,13, 8,20 8,66 und 9,50 μ; Massenspektrum m/p674 (M*), 632, 590, 572, 530, 480.438,434,420,402,297. 151, 111 und 95; nmr (CDCI,) y 8.95 (6 H. d, J = 7HZ, CH(CHO₂).

8.55 (3 H, s. 10-CHj), 8,24 (3 H. s, 4-CH,) 8,03 (311, br.s. -CH = C(CH,)-). 7,79, 7.89 (911, 2 s, OCOCH₃), 6,34 (3 H, s, OCH.,), und 4,46 (I H, br.s., OCOCH = C(CH,)-).

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Bruceantin der Formel
OH

HO

CO₂CH₃

CH₃