WO2001095916A2 - Anticholestatisches arzneimittel - Google Patents

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WO2001095916A2
WO2001095916A2 PCT/EP2001/006656 EP0106656W WO0195916A2 WO 2001095916 A2 WO2001095916 A2 WO 2001095916A2 EP 0106656 W EP0106656 W EP 0106656W WO 0195916 A2 WO0195916 A2 WO 0195916A2
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glucuronide
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anticholestatic
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Jürgen EICH
Rolf Gebhardt
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SERTüRNER ARZNEIMITTEL GMBH
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a medicament for the treatment or prevention of intrahepatic cholestasis.
  • Cholestasis is a syndrome that occurs when the flow of bile is disturbed.
  • Extrahepatic cholestasis is usually caused by a bile duct stone or pancreatic carcinoma.
  • Intrahepatic cholestasis is a congestion in the bile ducts.
  • the most common intrahepatic causes are viral and other hepatitis, drugs, e.g. for cancer treatment, as well as alcohol-induced liver damage. Less common causes are primary cirrhosis of the cirrhosis, cholestasis in pregnancy, and other diseases.
  • Artichoke leaf extract (Cyanara scolymus L.) is known for its choleretic effects in dyspeptic complaints.
  • Real choleretic agents as an artichoke extract is considered, lead to an increase in the amount of bile acids, whereas false choleretic agents lead to an increase in the volume of bile.
  • an anticholestatic effect is also mentioned in the literature for artichoke extract ( ⁇ cht-Ztg., 1 5th year, 1 996, page 1 6). However, it was not previously known which active ingredient produces the anticholestatic effect.
  • the object of the present invention was therefore to provide a medicament which contains an active substance with anticholestatic activity with defined activity.
  • This object is achieved according to the invention by a medicament for the treatment or prevention of an intrahepatic cholestasis, which is characterized by a content of luteolin-7-O-glucuronide of the formula
  • R a glucuronic acid residue or on a physiologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the medicament preferably contains at least 0.1% by weight of this active ingredient, more preferably at least 1% by weight.
  • Luteolin-7-O-glucuronide has been found to have anticholestatic activity and is therefore suitable for the treatment of intrahepatic cholestasis.
  • An intrahepatic change in the bile ducts can be prevented or reversed with luteolin-7-O-glucuronide, so that prophylactic treatment to prevent intrahepatic cholestasis is also possible.
  • artichoke extracts especially artichoke leaf dry extracts, such as those commercially available from Sertner Medicines are available under the name HEPAR-SL ® forte, there are numerous compounds that could be possible active substances.
  • the anticholestatic activity has not yet been assigned to any of the numerous compounds present in the extract. It was therefore difficult to produce a standardized medicine from the artichoke extract.
  • luteolin-7-O-glucuronide has an anticholestatic activity and influences cholesterol synthesis. There is no indication in the prior art that luteolin-7-O-glucuronide in particular could have such an effect.
  • CMOS complementary metal-oxide-semiconductor
  • cynarin 1-di-O-caffeoyl-quinic acid
  • 1, 3-di-O-caffeoyl-quinic acid 1, 3-di-O-caffeoyl-quinic acid
  • scolymoside and cynaroside (luteolin-7-O-glucoside).
  • Cynaroside luteolin-7-O-glucoside
  • cynaroside can also be found in many other plants without an anticholestatic or / and cholesterol synthesis-influencing activity being reported.
  • luteolin-7-O-glucoside 3 ', 4'-hydroxyflavon, genistein and daidzein showed no anticholestatic activity. It is therefore surprising that luteolin-7-O-glucuronide has a pronounced effectiveness of this type.
  • Cholestasis which is often used as a model and is triggered by taurolithocholate, causes an easily detectable membrane change.
  • Known choleretic substances are generally unable to prevent or eliminate this membrane change (Layden et al., Gastroenterology 50 (1977), 2305 to 2312).
  • dehydrocholic acid known to be choleretically effective, showed in a cholestasis triggered by taurolithocholate no effectiveness, so the use of choleretically active compounds in cholestasis is generally not indicated.
  • a physiologically acceptable salt of luteolin-7-O-glucuronide is any salt-like compound which comprises this compound in ionic form together with a counter ion which is physiologically harmless.
  • Examples of such salts are, in particular, acid addition salts.
  • the active ingredient is preferably present in the medicament according to the invention in an amount of> 0.1% by weight, more preferably 1% by weight, particularly preferably> 10% by weight and most preferably> 20% by weight.
  • drugs which contain an even higher content of the active ingredient, in particular ⁇ 50% by weight, based on the total weight of the drug.
  • a patient is generally administered from 10 mg to 1000 mg of the active ingredient per day.
  • the medicament according to the invention can optionally be formulated with physiologically compatible auxiliaries and excipients.
  • auxiliaries must be physiologically harmless and must not adversely affect their effectiveness.
  • Suitable auxiliaries are known to the person skilled in the art and include, for example, fillers, binders and lubricants, such as microcrystalline cellulose, amylose, lactose, mannitol, talc, magnesium stearate, starch, highly disperse magnesium oxide, silicon dioxide, sodium carboxymethyl starch, polyvidone, macrogol and others.
  • the medicament according to the invention can be produced in all administrable medicament forms known to the person skilled in the art. It is preferably produced in a formulation which is suitable for oral administration, in particular in solid form. Examples of such solid drug forms include capsules, tablets, granules, dragees, film-coated tablets and the like. Formulations in which the active ingredient is only released in the gastrointestinal tract are preferred.
  • the medicament according to the invention can contain the active substance of the invention as the only active compound or together with other active substances.
  • Active substances of the same type of action and / or active substances which supplement the anticholestatic activity can be used for such a combined medicament. They can be isolated from plant extracts or be chemically synthesized compounds. The isolation of suitable flavone or flavanone derivatives, for example luteolin from plant extracts, has been described in detail in the literature (cf., for example, Pharmacia 21 (39) (1972) 37). It is also possible to use a plant extract, for example an artichoke extract.
  • a medicament according to the invention is produced by enriching a conventional extract with the active substance of the invention, so that it is> 0.1% by weight, preferably> 1% by weight, more preferably ⁇ 10% by weight .-% and most preferably> 20 wt .-% of the active ingredient, based on the total extract weight.
  • Such an enrichment can take place by selecting the extraction conditions so that the extract contains as high a content of the active substance of the invention as possible.
  • the invention further relates to a method for producing a medicament for the treatment or prevention of an intrahepatic cholestasis, which is characterized in that luteolin-7-O-glucuronide or a physiologically acceptable salt thereof as an active ingredient, optionally together with conventional pharmacological additives in a physiological deliverable formulation brings.
  • the invention further relates to the use of luteolin-7-O-glcucuronide as a medicament for the treatment or prevention of an intrahepatic cholestasis and a method for the treatment or prevention of an intrahepatic cholestasis, which is characterized in that luteolin-7-O-glucuronide or a Physiologically acceptable salt thereof as an active ingredient, optionally administered together with customary pharmacological additives in a dosage of 0.01 to 1 g / day.
  • the yields given for the individual isolation stages relate to the amount used in each case.
  • Semi-preparative HPLC The further cleaning was carried out in two steps by semi-preparative HPLC (SUPELCOSIL SPLC-18, 250 x 10 mm, 5 ⁇ m). Methanol (A) and water (B), to which 0.25% (v / v) acetic acid were mixed, were used as eluents. The column temperature was 30 ° C. The extract IM was dissolved in water (approx. 50 mg / ml), filtered and injected into 26 proteions at 1000 ⁇ l. The separation was isocratic with 25% A and a flow of 5 ml / min. The substance eluted between 1 2 and
  • Taurolitrocholate induces severe cholestasis in rats in vivo, which is associated with the conversion of the bile tubules into strangely structured, lamellar membrane formations.
  • the induction of intrahepatic cholestasis by lithocholic acid and sodium taurolithocholate in animal experiments has been described in detail (Javitt, NB, Nature 21 0, (1 966), 1 262-1 263; King. JE et al., J. Clin. Invest. 50, ( 1 971) 2305-231 2; Layden et al., Gastroenterology 73 (1 977), 1 20-1 28; Mockel et al., Am. J. Physiol., 269 (1995), G73-G84).
  • Liver parenchyma cells were isolated from male Sprague-Dawley rats (220 to 280 g) and cultured for 2 days in serum-free William medium E as described (Gebhardt et al., Cell Biol. Toxicol. 6 (1 990) 369-372; Gebhardt, Toxicol, Appl. Pharmacol. 144 (1 997), 270-286).
  • a 10 mM stock solution of this bile salt with ethanol was prepared, which was diluted with Williams medium E to give a final concentration of 0.1 mM.
  • the membrane changes in the area of the bile tubules were detected by means of electron microscopy on ultra-thin sections (see Gebärdt et al., Eur. J. Cell Biol. 29 (1982) 68-76).
  • cultured cells were fixed in situ for 30 to 45 minutes with 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M cacodylate buffer, pH 7.2 at 0 ° C.
  • cacodylate buffer pH 7.2 at 0 ° C.
  • the cells were placed in a 2% solution of agar at 46 ° C, which was cut into small pieces and post-fixed in 1% OsO 4 in a cacodylate buffer.
  • the blocks were embedded in Epon 812. Silver sections were examined with a Siemens la electron microscope after staining.
  • Bile tubules were classified as transformed when half or more of the canalicular area was covered with strange lamellar structures.
  • Luteolin-7-O-glucuronide is thus able to specifically prevent the taurolithocholate-induced conversion of the canalicular membranes and to have an anticholestatic effect.
  • Cholesterol biosynthesis can be determined in cultured rat hepatocytes by incorporating radioactively labeled acetate into cholesterol. Inhibiting influences can be seen in a lowering of the installation rates.
  • the rat hepatocytes were cultivated according to Gebhardt et al. (Cell Biol. Toxicol. (1 990), 6: 369-372) and Gebhardt R. (Toxicol. Appl. Pharmacol. (1 997), 144: 279-286).
  • the incorporation of radioactively labeled acetate in cholesterol or the fraction of non-saponifiable, neutral lipids was carried out according to the information from Gebhardt (Lipids (1 993), 28: 61 3- 61 9) and Gebhardt and Beck (Lipids (1 996 ), 31: 1 269-1 276). It can be seen from Table 1 that luteolin-7-O-glucuronide can inhibit cholesterol biosynthesis in a concentration-dependent manner, while caffeic acid is almost ineffective even in higher concentrations.
  • Luteolin-7-O-glucuronide or caffeic acid was added to the culture medium 2 hours after the cultures had been applied in the stated concentrations together with fresh culture medium. Cholesterol biosynthesis was determined by incorporating radioactively labeled acetate into cholesterol. The rate of incorporation in untreated rat hepatocytes was set as 100%. Caffeic acid was used as an ineffective control substance.
  • the rat hepatocytes were cultivated and treated with taurolithocholate according to Jung et al. (Supra).
  • the luteolin-7-O-glucuronide or the caffeic acid was added to the culture medium in the stated concentrations simultaneously with taurolithocholate (100 ⁇ M).
  • the structure of the bile canaliculi in the cultures was determined by means of electron microscopy, as in Jung et al. (supra) specified.
  • luteolin-7-O-glucuronide reduces the proportion of bile canaliculi with a deformed membrane. The effect depends on the concentration. In contrast, caffeic acid is ineffective at 100 ⁇ M.
  • Luteolin-7-O-glucuronide or caffeic acid were added to the culture medium 24 hours after the cultures had been applied in the stated concentrations together with 1 00 / M taurolithocholate.
  • the number of bile canaliculi in the presence of taurolithocholate alone was set as 100%.

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Abstract

Luteolin-7-O-glucuronid oder ein physiologisch annehmbares Salz davon eignet sich als Wirkstoff zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase und zur Beeinflussung der Cholesterinbildung.

Description

Anticholestatisches Arzneimittel
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase.
Bei Cholestase handelt es sich um ein Syndrom, das bei gestörtem Gallefluss entsteht. Man unterscheidet extrahepatische und intrahepatische Cholestase. Die extrahepatische Cholestase wird meist durch einen Gallengangstein oder ein Pankreaskarzinom hervorgerufen. Bei intrahepatischer Cholestase handelt es sich um eine Stauung in den Gallengängen. Die häufigsten intrahepatischen Ursachen sind virale und andere Hepatitiden, Medikamente, z.B. zur Krebsbehandlung, sowie die alkoholinduzierte Leberschädigung. Weniger häufige Ursachen sind die primäre billiäre Zirrhose, die Cholestase in der Schwangerschaft, und weitere Erkrankungen.
Extrakt aus Blättern der Artischocke (Cyanara scolymus L.) ist für seine choleretische Wirkung bei dyspeptischen Beschwerden bekannt. Echte choleretische Mittel, als welches ein Artischockenextrakt angesehen wird, führen zu einer Erhöhung der Menge an Gallensäuren, wohingegen unechte choleretische Mittel zu einer Erhöhung des Volumens an Gallenflüssigkeit führen. Neben der choleretischen Wirkung wird für Artischockenextrakt in der Literatur auch eine anticholestatische Wirkung genannt (Ärzte-Ztg., 1 5. Jahrgang, 1 996, Seite 1 6). Allerdings war bisher nicht bekannt, welcher Wirkstoff die anticholestatische Wirkung hervorruft.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein Arzneimittel bereitzustellen, das einen Wirkstoff mit anticholestatischer Wirkung mit definierter Wirksamkeit enthält. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Arzneimittel zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase, welches gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an Luteolin-7-O-glucuronid der Formel
(I)
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worin R, einen Glucuronsäurerest bedeutet oder an einem physiologisch annehmbaren Salz davon als Wirkstoff. Vorzugsweise enthält das Arzneimittel mindestens 0, 1 Gew.-% dieses Wirkstoffes, mehr bevorzugt mindestens 1 Gew.-%.
Es wurde gefunden, dass Luteolin-7-O-glucuronid eine anticholestatische Wirksamkeit aufweist und deshalb zur Behandlung einer intrahepatischen Cholestase geeignet ist. Eine intrahepatische Veränderung der Gallengänge kann mit Luteolin-7-O-glucuronid verhindert oder rückgängig gemacht werden, sodass auch eine prophylaktische Behandlung zur Prävention einer intrahepatischen Cholestase möglich ist.
Durch die Kenntnis, dass Luteolin-7-O-glucuronid eine anticholestatische Wirksamkeit aufweist, ist die Herstellung eines Arzneimittels mit vorbestimmter und definierter Wirkungsdosis und eine Standardisierung möglich. Weiterhin kann mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel eine schnelle und zielgerichtete Wirkung erreicht werden.
In Artischockenextrakten, insbesondere Artischockenblätter- Trockenextrakten, wie sie beispielsweise kommerziell von Sertürner Arzneimittel unter dem Namen HEPAR-SL® forte erhältlich sind, liegen zahlreiche Verbindungen vor, bei denen es sich um mögliche Wirkstoffe handeln könnte. Die anticholestatische Wirksamkeit konnte bisher keiner der zahlreichen im Extrakt vorliegenden Verbindungen zugeordnet werden. Es war somit schwierig, aus dem Artischockenextrakt ein standardisiertes Arzneimittel herzustellen.
Es wurde nun festgestellt, dass Luteolin-7-O-glucuronid eine anticholestatische Wirksamkeit aufweist und die Cholesterinsynthese beeinf lusst. Ein Hinweis, dass gerade Luteolin-7-O-glucuronid eine derartige Wirkung aufweisen könnte findet sich im Stand der Technik nicht.
Bekannte Bestandteile von Artischockenextrakt sind Kaffeesäure, Chlorogensäure, Cynarin (1 ,5-di-O-Caffeoyl-chinasäure), 1 ,3-di-O-Caffeoyl- Chinasäure, Scolymosid und Cynarosid (Luteolin-7-O-glucosid). Cynarosid (Luteolin-7-O-glucosid) wird im Magen-Darm-Trakt gespalten, wobei Luteolin freigesetzt wird. Allerdings findet sich Cynarosid auch in vielen anderen Pflanzen, ohne dass von solchen eine anticholestatische oder/und die Cholesterinsynthese beeinflussende Wirksamkeit berichtet worden ist. Die Verbindungen Luteolin-7-O-glucosid, 3',4'-Hydroxyflavon, Genistein und Daidzein zeigten keine anticholestatische Wirkung. Es ist daher überraschend, dass Luteolin-7-O-glucuronid eine ausgeprägte Wirksamkeit dieser Art besitzt.
Die Wirkmechanismen von anticholestatischen und choleretischen Mitteln sind grundsätzlich verschieden. Eine häufig als Modell verwendete Cholestase, die durch Taurolithocholat ausgelöst wird, bewirkt eine leicht detektierbare Membranveränderung. Bekannte choleretische Substanzen sind im allgemeinen nicht in der Lage, diese Membranveränderung zu verhindern oder zu beseitigen (Layden et al., Gastroenterology 50 (1977), 2305 bis 2312. Z.B. zeigte die als choleretisch wirksam bekannte Dehydrocholsäure bei einer durch Taurolithocholat ausgelösten Cholestase keine Wirksamkeit, sodass eine Verwendung von choleretisch wirksamen Verbindungen bei einer Cholestase im allgemeinen nicht angezeigt ist.
Ein physiologisch annehmbares Salz von Luteolin-7-O-glucuronid ist jede salzartige Verbindung, die diese Verbindung in ionischer Form zusammen mit einem Gegenion umfasst, welches physiologisch unbedenklich ist. Beispiele solcher Salze sind insbesondere Säureadditionssalze.
Der Wirkstoff liegt im erfindungsgemäßen Arzneimittel bevorzugt in einer Menge von > 0, 1 Gew.-%, mehr bevorzugt 1 Gew.-%, besonders bevorzugt > 10 Gew.-% und am meisten bevorzugt > 20 Gew.-% vor. Es ist aber auch möglich, Arzneimittel bereitzustellen, die einen noch höheren Gehalt an dem Wirkstoff enthalten, insbesondere ≥ 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Arzneimittels.
Für eine wirksame Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase werden einem Patienten im allgemeinen von 10 mg bis 1000 mg des Wirkstoffs pro Tag verabreicht. Bevorzugt werden mindestens 20 mg, insbesondere mindestens 50 mg und besonders bevorzugt mindestens 100 mg des Wirkstoffs pro Tag pro Person und höchstens bis zu 750 mg, bevorzugt bis zu 500 mg, besonders bevorzugt bis zu 300 mg pro Person und Tag verabreicht.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann gegebenenfalls mit physiologisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen formuliert werden. Solche Hilfsstoffe müssen physiologisch unbedenklich sein und dürfen die Wirksamkeit nicht nachteilig beeinflussen. Geeignete Hilfsstoffe sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise Füllstoffe, Bindemittel und Gleitmittel, wie etwa mikrokristalline Cellulose, Amylose, Lactose, Mannit, Talkum, Magnesiumstearat, Stärke, hochdisperses Magnesiumoxid, Siliciumdioxid, Natriumcarboxymethylstärke, Polyvidon, Macrogol und andere. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann in allen, dem Fachmann bekannten verabreichbaren Arzneimittelformen hergestellt werden. Bevorzugt wird es in einer Formulierung hergestellt, die zur oralen Verabreichung geeignet ist, insbesondere in fester Form. Beispiele solcher fester Arzneimittelformen umfassen Kapseln, Tabletten, Granulate, Dragees, Filmtabletten und ähnliches. Bevorzugt sind Formulierungen, bei denen der Wirkstoff erst im Magen-Darm-Trakt freigesetzt wird.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann den Wirkstoff der Erfindung als einzige wirksame Verbindung oder zusammen mit anderen Wirkstoffen enthalten. Für ein solches kombiniertes Arzneimittel können Wirkstoffe derselben Wirkungsart oder/und Wirkstoffe, welche die anticholestatische Wirksamkeit ergänzen, verwendet werden. Sie können aus pflanzlichen Extrakten isoliert oder chemisch synthetisierte Verbindungen sein. Die Isolierung von geeigneten Flavon- oder Flavanonderivaten, beispielsweise Luteolin aus pflanzlichen Extrakten ist in der Literatur ausführlich beschrieben (vgl. z.B. Pharmacia 21 (39) (1972) 37). Es ist auch möglich, einen Pflanzenextrakt mitzuverwenden, beispielsweise einen Artischockenextrakt. Im Fall der Verwendung eines natürlichen Extraktes wird ein erfindungsgemäßes Arzneimittel dadurch hergestellt, dass ein herkömmlicher Extrakt an dem Wirkstoff der Erfindung angereichert wird, sodass er > 0,1 Gew.-%, bevorzugt > 1 Gew.-%, mehr bevorzugt ≥ 10 Gew.-% und am meisten bevorzugt > 20 Gew.-% an dem Wirkstoff, bezogen auf das Extraktgesamtgewicht, aufweist. Eine solche Anreicherung kann dadurch erfolgen, dass die Extraktionsbedingungen so gewählt werden, dass im Extrakt ein möglichst höher Gehalt an dem Wirkstoff der Erfindung vorliegt. Es ist aber auch möglich, einem handelsüblichen Extrakt einen zusätzlichen Gehalt an diesem Wirkstoff zuzugeben, um auf diese Weise eine Erhöhung der Wirkstoffkonzentration zu erzielen. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man Luteolin-7-O- glucuronid oder ein physiologisch annehmbares Salz davon als Wirkstoff, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmakologischen Additiven in eine physiologisch verabreichbare Formulierung bringt.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von Luteolin-7-O- glcucuronid als Arzneimittel zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase sowie ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man Luteolin-7-O-glucuronid oder ein physiologisch annehmbares Salz davon als Wirkstoff, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmakologischen Additiven in einer Dosierung von 0,01 bis 1 g/Tag verabreicht.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1 Isolierung und Identifizierung von Luteolin-7-Q-/?-D-qlucuronid in Artischocke
Allgemeines
Extraktion und Isolierung wurden mit analytischer HPLC (Supelcosil LC-1 8, 1 50 x 4,6 mm mit Vorsäule 20 x 4,6 mm, 5 μm) begleitet. (Chromatografische Bedingungen: Die Proben wurden in 80 % Methanol gelöst und zur Injektion 1 : 1 mit Wasser verdünnt. Die Trennung erfolgte mit einem Gradientensystem Acetonitril (A) und Wasser mit 0,5 % Phosphorsäure (B). Gradient: 0 bis 1 min 8 % A, 6 min 1 2 %, 8 bis 1 8 min 18 %, 19 bis 29 min 32 %, 30 bis 35 min 100 %, 36 bis 50 min 8 % A, Flussrate: 1 ,0 ml/min, Säulentemperatur: 40 °C, Detektionswellenlänge: 330 nm). Extraktion und Isolierung
Die für die einzelnen Isolierungsstufen angegebenen Ausbeuten beziehen sich auf die jeweils eingesetzte Menge.
Extraktion: 1 00 g zerkleinerte Artischockenblätter-Droge (Sieb 6 mm) (Gehalt der zu isolierenden Substanz: 0,297 % ber. als Cynarosid) wurde fünfmal mit insgesamt 800 ml heißem Wasser perkoliert (Ausbeute: 570 ml Eluat I = 28,7 g Trockenmasse = 28,7 %).
Reinigung: Eluat I (Trockenmasse = 28,7 g) wurden mit dem vierfachen Volumen Methanol gemischt und über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Das Filtrat wurde auf ein Zehntel seines Volumens einrotiert und mit Wasser auf 570 ml verdünnt. Diese Lösung wurde zweimal mit 285 ml Ethylacetat/2-Butanol (60/40-V/V) im Scheidetrichter gewaschen und zur Trockene einrotiert. Es wurden 1 9,2 g Extrakt II erhalten (Ausbeute = 66,9 %) .
Festphasenreaktion : Je 100 mg des Extraktes II wurden in 1 ,0 ml Wasser gelöst und auf eine mit 2,5 ml Methanol und 5 ml Wasser konditionierte RP-1 8-Festphase (Merck Lichrolut 2023) aufgetragen. Es wurde mit 1 5 ml Wasser gespült und mit 2,0 ml wässrigem Methanol (35 %, V/V) eluiert. Insgesamt wurden 1 92 Portionen zu 100 mg des Extraktes II ( = 1 9,2 g) über RP-1 8-Festphasenextraktion bearbeitet. Die vereinigten Eluate wurden zur Trockene einrotiert, sodass 1 ,286 g des Extraktes III resultierten (Ausbeute = 6,7 %).
Semipräparative HPLC: Die weitere Reinigung erfolgte in zwei Schritten durch semipräparative HPLC (SUPELCOSIL SPLC-18, 250 x 10 mm, 5 μm) . Als Laufmittel wurde Methanol (A) und Wasser (B) verwendet, zu denen je 0,25 % (V/V) Essigsäure gemischt wurde. Die Säulentemperatur betrug 30 °C. Der Extrakt IM wurde in Wasser gelöst (ca. 50 mg/ml), filtriert und in 26 Proteionen zu 1000 μl injiziert. Die Trennung erfolgte isokratisch mit 25 % A und einem Fluss von 5 ml/min. Die Substanz eluierte zwischen 1 2 und
19 min und wurde manuell entsprechend dem DAD-Spektrum aufgefangen. Die zusammengefassten Fraktionen aus 26 HPLC-Läufen wurden zur
Trockene eingeengt. Die erste HPLC-Reinigung erag 233 mg Rohprodukt IV (Ausbeute = 18, 1 %) mit einer HPLC-Reinheit von etwa 70 % (Flächenprozente bei λ = 330 nm).
Das Rohprodukt IV wurde einer weiteren HPLC-Reinigung unterzogen. Je
20 mg Substanz wurden in 1 ,0 ml Methanol gelöst und mit Wasser 1 : 1 verdünnt. Nach Filtration wurde in 400 μ\ Portionen injiziert. Die Trennung erfolgte isokratisch mit 35 % A und einem Fluss von 5 ml/min. Die zusammengefassten Substanz-Fraktionen aus 60 HPLC-Läufen wurden zur Trockene eingeengt. Es wurden 132 mg Substanz V (Ausbeute = 56,6 %) mit einer HPLC-Reinheit von etwa 99 % erhalten.
Gesamtausbeute: Auf den Gehalt der Droge (0,296 %) bezogen ergibt sich eine Gesamtausbeute von 44,6 %.
Identifizierung
Die Identifizierung erfolgte durch positve und negative FABMS sowie durch 1H und 13C NMR-Spektroskopie. Die Substanz wurde als Luteolin-7-O-ß-D- glucuronid identifiziert (Romussi et al., 1996). Zusätzlich konnte Luteolin bzw. Glucuronsäure nach saurer Hydrolyse durch HPLC bzw. DC nachgewiesen werden. Beispiel 2
Verhinderung einer Taurolithcholat-induzierten Transformation kanilikulärer
Membranen durch Luteolin-7-O-glucuronid
Taurolithocholat induziert in Ratten in vivo eine schwere Cholestase, die mit der Umwandlung der Gallekanälchen in bizarr strukturierte, lamelläre Membranformationen verbunden ist. Die Induzierung einer intrahepatischen Cholestase durch Lithocholsäure und Natriumtaurolithocholat in Tierversuchen ist ausführlich beschrieben (Javitt, N.B., Nature 21 0, ( 1 966), 1 262-1 263; King. J.E. et al., J. Clin. Invest. 50, (1 971 ) 2305- 231 2; Layden et al., Gastroenterology 73 ( 1 977), 1 20-1 28; Mockel et al., Am. J. Physiol., 269 (1995), G73-G84). Neben einer kanalikulären Dilatation induzieren sie bizarre lamelläre Deformationen der Ultrastruktur der Gallekanälchen, die charakteristisch für diese Art von Cholestase sind (Miyai et al., Lab. Invest. 32 ( 1 975), 527-535; Kakis et al., Lab. Invest. 43, ( 1 980) 73-81 ). Kürzlich wurde gezeigt, dass Taurolithocholat, das den Primärkulturen von Rattenhepatozyten zugegeben wurde, ähnliche Deformationen in vitro bildet, die von den in vivo gebildeten nicht unterscheidbar sind (Jung et al., Eur. J. Cell Biol. 29, ( 1 982) 77-82; Thibault et al., J. Hepatol. 1 9 (1 993) 367-376). Für die Versuche wurde deshalb in Primärkulturen von Ratten hepatocyten die Transformation neu gebildeter Gallekanälchen durch Taurolithocholat wie beschrieben (Jung et al., Eur. J. Cell Biol. 29 (1 982) 77-82) in vitro ausgelöst.
Leberparenchymzellen wurden aus männlichen Sprague-Dawley-Ratten (220 bis 280 g) isoliert und für 2 Tage in einem serumfreien William- Medium E wie beschrieben kultiviert (Gebhardt et al., Cell Biol. Toxicol. 6 (1 990) 369-372; Gebhardt, Toxicol. Appl. Pharmacol. 144 (1 997), 270- 286). Für die Behandlung der kultivierten Hepatocyten mit Taurolithocholat wurde eine 10 mM Vorratslösung dieses Gallensalzes mit Ethanol hergestellt, die mit Williams-Medium E verdünnt wurde, um eine Endkonzentration von 0, 1 mM zu ergeben. Für 1 bis 2 Tage kultivierte Hepatocyten wurden mit dem Taurolithocholat enthaltenden Medium für 3 Stunden behandelt, um maximale Veränderungen der Gallekanälchen zu induzieren (Jung et al., Eur. J. Cell Biol. 29 (1982), 77-82). Taurolithocholat (0, 1 mM) induziert an primär kultivierten Rattenhepatocyten innerhalb von 3 Stunden eine ausgeprägte Transformation der kanalikulären Membranen zu bizarr strukturierten Formationen. Die normale kanalikuläre Membran, die mit zahlreichen Mikrovilli bedeckt ist, wird in bizarre lamillare Strukturen transformiert, die fast die gesamten Kanälchen ausfüllen. Dieser Vorgang scheint nach 2 bis 3 Stunden vollständig abgelaufen zu sein und betraf etwa 50 bis 70 % der Kanälchen am zweiten Tag der Kultivierung.
Die Membranveränderungen im Bereich der Gallekanälchen wurden mittels Elektronenmikroskopie an Ultradünnschnitten nachgewiesen (vgl. Gebärdt et al., Eur. J. Cell Biol. 29 (1982) 68-76). Dazu wurden kultivierte Zellen für 30 bis 45 Minuten in situ mit 2,5 % Glutaraldehyd in 0, 1 M Cacodylatpuffer, pH 7,2 bei 0 °C fixiert. Nach Waschen mit Cacodylatpuffer wurden die Zellen in eine 2 %-ige Lösung von Agar bei 46 °C gegeben, das in kleine Stücke geschnitten wurde und in 1 % OsO4 in einem Cacodylatpuffer nachfixiert wurde. Nach Dehydration wurden die Blöcke in Epon 812 eingebettet. Silberschnitte wurden mit einem Siemens la-Elektronenmikroskop nach Anfärben untersucht.
Für eine halbquantitative Abschätzung der Veränderung der kanalikulären Membranen wurde die Erscheinungsform von 100 Gallekanälchen aus zwei bis drei verschiedenen Experimenten untersucht. Gallekanälchen wurden als transformiert eingestuft, wenn die Hälfte oder mehr der kanalikulären Fläche mit bizarren lamellaren Strukturen bedeckt war.
Der oben beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei den Primärkulturen der Rattenhepatocyten gleichzeitig mit dem Taurolithocholat Luteolin-7-O-glucuronid zugegeben wurde. Die Zugabe von Luteolin-7-O- glucuronid in einer Menge von 20 mg gleichzeitig mit Taurolithocholat ergab eine vollständige Hemmung der lamellaren Transformation. Statt dessen behielten die Gallenkanälchen ihre Mikrovilli, wenn auch in etwas geringerer Anzahl und erschienen nur leicht dillatiert. Eine vergleichbare Wirkung konnte erzielt werden, wenn die Kulturen mit Luteolin-7-O- glucuronid vorinkubiert wurden. Dies zeigt, dass eine mögliche Adsorption von Taurolithocholat an andere Inhaltsstoffe keine Rolle spielt.
Weiterhin wurde gefunden, dass der Schutz gegen Taurolithocholat induzierte Transformation dosisabhängig war.
Luteolin-7-O-glucuronid ist somit in der Lage, die Taurolithocholat- induzierte Umwandlung der kanalikulären Membranen spezifisch zu verhindern und anticholestatisch zu wirken.
Beispiel 3
Hemmung der Cholesterin-Biosvnthese
Die Cholesterin-Biosynthese kann in kultivierten Rattenhepatocyten durch Einbau von radioaktiv-markiertem Acetat in Cholesterin ermittelt werden. Hemmende Einflüsse geben sich in einer Erniedrigung der Einbauraten zu erkennen.
Die Kultivierung der Rattenhepatocyten erfolgte nach Gebhardt et al. (Cell Biol. Toxicol. ( 1 990), 6: 369-372) und Gebhardt R. (Toxicol. Appl. Pharmacol. ( 1 997), 144: 279-286). Der Einbau von radioaktiv-markiertem Acetat in Cholesterin bzw. die Fraktion an nicht-verseifbaren, neutralen Lipiden wurde nach den Angaben von Gebhardt (Lipids ( 1 993), 28: 61 3- 61 9) und Gebhardt und Beck (Lipids (1 996), 31 : 1 269-1 276) bestimmt. Aus Tabelle 1 ist zu entnehmen, dass Luteolin-7-O-GIucuronid die Cholesterin-Biosynthese konzentrationsabhängig zu hemmen vermag, während Kaffeesäure selbst in höheren Konzentrationen fast unwirksam ist.
Figure imgf000013_0001
Tabelle 1
Hemmung der Cholesterin-Biosynthese durch Luteolin-7-O-Glucuronid in kultivierten Rattenhepatocyten
Luteolin-7-O-Glucuronid oder Kaffeesäure wurden dem Kulturmedium 2 h nach Anlegen der Kulturen in den angegebenen Konzentrationen zusammen mit frischem Kulturmedium zugegeben. Die Cholesterin-Biosynthese wurde durch Einbau von radioaktiv markiertem Acetat in Cholesterin bestimmt. Die Einbaurate in unbehandelten Rattenhepatocyten wurde als 100 % gesetzt. Kaffeesäure wurde als unwirksame Kontrollsubstanz eingesetzt.
Beispiel 4
Hemmung der Ausbildung von bizarren Deformationen der canaliculären
Membran in kultivierten Rattenhepatocyten
Der cholestatische Einfluss von Taurolithocholat auf die Leber kann modellhaft in kultivierten Rattenhepatocyten durch die Ausbildung bizarrer canaliculärer Membrandeformationen nachgewiesen werden (Jung et al., Eur. J. Cell Bio. (1982), 29: 77-82). Anti-cholestatische Einflüsse geben sich in einem erniedrigten Prozentsatz von betroffenen Galle-Canaliculi zu erkennen.
Die Kultivierung der Rattenhepatocyten und die Behandlung mit Taurolithocholat erfolgte nach Jung et al. (supra). In den vorliegenden Experimenten wurden das Luteolin-7-O-Glucuronid bzw. die Kaffeesäure dem Kulturmedium in den angegebenen Konzentrationen gleichzeitig mit Taurolithocholat (100 μM) zugegeben. Die Bestimmung der Struktur der Galle-Canaliculi in den Kulturen erfolgte mittels Elektronenmikroskopie, wie bei Jung et al. (supra) angegeben.
Wie aus Tabelle 2 zu ersehen, vermindert Luteolin-7-O-Glucuronid den Anteil von Galle-Canaliculi mit deformierter Membran. Der Effekt ist konzentrationsabhängig. Im Gegensatz hierzu ist Kaffeesäure bei 100 μM unwirksam.
Figure imgf000014_0001
Tabelle 2
Hemmung der Ausbildung von bizarren Deformationen der canaliculären
Membran durch Luteolin-7-O-Glucuronid in kultivierten Rattenhepatocyten
Luteolin-7-O-Glucuronid oder Kaffeesäure wurden dem Kulturmedium 24 h nach Anlegen der Kulturen in den angegebenen Konzentrationen zusammen mit 1 00 /M Taurolithocholat zugegeben. Die Anzahl der Galle-Canaliculi in Gegenwart von Taurolithocholat allein wurde als 100 % gesetzt.

Claims

Ansprüche
1. Arzneimittel zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase und zur Beeinflussung der Cholesterinbildung, g e ken n zei ch n et d u rch einen Gehalt an Luteolin-7-O-glucuronid oder an einem physiologisch annehmbaren Salz davon als Wirkstoff.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1, d ad u rc h geke n nzei ch n et, dass es einen Gehalt an Luteolin-7-O-glcucuronid von > 1 Gew.-% aufweist.
3. Arzneimittel nach Anspruch 1, d ad u rc h ge ke n nzei c h n et, dass es einen Gehalt an Luteolin-7-O-glucuronid von > 20 Gew.-% aufweist.
4. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder
Prävention einer intrahepatischen Cholestase und zur Beeinflussung der Cholesterinbildung, d ad u rc h g e ken n zei ch n et, dass man Luteolin-7-O-glucuronid oder ein physiologisch annehmbares Salz davon als Wirkstoff, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmakologischen Additiven in eine physiologisch verabreichbare Formulierung bringt.
5. Verwendung von Luteolin-7-O-glucuronid oder eines physiologisch annehmbaren Salzes davon als Wirkstoff zur Behandlung oder
Prävention einer intrahepatischen Cholestase und zur Beeinflussung der Cholesterinbildung. Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer intrahepatischen Cholestase und zur Beeinflussung der Cholesterinbildung, d a d u rc h g e k e n n ze i c h n et , dass man Luteolin-7-O-glucuronid oder ein physiologisch annehmbares Salz davon als Wirkstoff, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmakologischen Additiven in einer Dosierung von 0,01 bis 1 g/Tag verabreicht.
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