EA034552B1 - Способ лечения или предотвращения прогрессирования онкологических заболеваний - Google Patents

Способ лечения или предотвращения прогрессирования онкологических заболеваний Download PDF

Info

Publication number
EA034552B1
EA034552B1 EA201101521A EA201101521A EA034552B1 EA 034552 B1 EA034552 B1 EA 034552B1 EA 201101521 A EA201101521 A EA 201101521A EA 201101521 A EA201101521 A EA 201101521A EA 034552 B1 EA034552 B1 EA 034552B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cancer
cells
cell
coq10
carcinoma
Prior art date
Application number
EA201101521A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201101521A1 (ru
Inventor
Найвен Раджин Нэрейн
Джон Патрик Маккук
Рангапрасад Сарангараджан
Original Assignee
БЕРГ ЭлЭлСи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by БЕРГ ЭлЭлСи filed Critical БЕРГ ЭлЭлСи
Publication of EA201101521A1 publication Critical patent/EA201101521A1/ru
Publication of EA034552B1 publication Critical patent/EA034552B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/194—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having two or more carboxyl groups, e.g. succinic, maleic or phthalic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G01N33/5735—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу и композиции для лечения или предотвращения прогрессирования онкологических заболеваний у млекопитающих. Способ включает введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, которая содержит комбинацию, выбранную из группы: (a) комбинации 4-гидроксибензоата и 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинона; (b) комбинации фенилацетата и 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинона и (c) комбинации L-фенилаланина и 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинона.

Description

Родственные заявки
Настоящая заявка заявляет о приоритете согласно предварительной заявке на патент США № 61/177241, поданной 11 мая 2009 г., озаглавленной Способы лечения онкологических заболеваний, использующие эпиметаболический переключатель (Коэнзим Q10) (Attorney Docket No.: 117732-00601), предварительной заявки на патент США № 61/177243, поданной 11 мая 2009 г., озаглавленной Способы лечения онкологических заболеваний, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспектные внутриклеточные молекулы или факторы влияния (Attorney Docket No.: 117732-00701), предварительной заявки на патент США № 61/177244, поданной 11 мая 2009 г., озаглавленной Способы диагностики онкологических заболеваний, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспектные внутриклеточные молекулы или факторы влияния (Attorney Docket No.: 117732-00801), предварительной заявки на патент США № 61/177245, поданной 11 мая 2009 г., озаглавленной Способы лечения метаболических расстройств, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспектные внутриклеточные молекулы или факторы влияния (Attorney Docket No.: 117732-00901), и предварительной заявки на патент США № 61/177246, поданной 11 мая 2009 г., озаглавленной Способы диагностики метаболических расстройств, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспектные внутриклеточные молекулы или факторы влияния (Attorney Docket No.: 117732-01001). Полное содержание каждой из вышеперечисленных заявок включено в настоящую заявку путем ссылки.
Уровень техники
Рак в настоящее время - одна из лидирующих причин смертности в развитых странах и серьезная угроза современному обществу. Рак может развиться в любой ткани любого органа в любом возрасте. Во всем мире более чем у 10 млн человек каждый год диагностируется рак, и по оценке это число к 2020 г. вырастет до 15 млн. Полагают, что рак является причиной 6 млн смертей каждый год или 12% смертей в мире.
Этиология рака понятна не до конца. Рак за многие годы непрерывных исследований связывался со многими факторами, включая генетическую предрасположенность, нарушения, связанные с повреждением хромосом, вирусы, факторы окружающей среды и иммунологические нарушения. Рак включает в себя большую группу медицинских заболеваний. Раковые клетки могут появиться почти в любом органе и/или ткани тела. Рак развивается, когда клетки в определенной части тела начинают бесконтрольно расти или дифференцироваться.
Хотя недавние исследования чрезвычайно расширили наше понимание многих молекулярных механизмов онкогенеза и дали множество новых подходов к лечению рака, стандартным лечением для большинства злокачественных новообразований остается обширная резекция, химиотерапия и лучевая терапия. Хотя есть значительные улучшения, каждый из этих видов лечения может вызывать многочисленные нежелательные побочные эффекты. Например, хирургия может приводить к боли, травматическому повреждению здоровой ткани и рубцеванию. Лучевая терапия убивает преимущественно раковые клетки, но в то же время наносит ущерб нераковым тканям. Химиотерапия включает введение пациенту различных противораковых препаратов. Эти стандартные виды лечения часто сопровождаются неблагоприятными побочными эффектами, например тошнотой, подавлением иммунитета, изъязвлением кишечника и вторичными онкогенезами.
В течение многих лет многие отдельные исследователи и компании проводили обширные исследования в поиске улучшенных способов лечения различных видов рака. Компании разрабатывали биоактивные агенты, включая химические частицы, например маленькие молекулы, и биологические, например антитела, стремясь разработать более благотворные способы терапии рака. Некоторые из тестируемых биоактивных агентов работают и дают благотворные терапевтические эффекты для определенных людей или типов рака, другие же оказались неудачными или показывали минимальный терапевтический эффект в протоколах исследования. Другие биоактивные агенты исследовали, чтобы определить не полностью понятные механизмы действия.
Коэнзим Q10, также называемый здесь CoQ10, Q10, убихинон или убидекаренон, является популярной пищевой добавкой, и в капсульной форме может продаваться в продуктовых магазинах, магазинах здоровой пищи, аптеках и тому подобных магазинах, в качестве витаминоподобной добавки, помогающей защитить иммунную систему благодаря антиоксидантным свойствам убихинона, восстановленной формы CoQ10. CoQ10 известен специалистам и описан в международной публикации № WO 2005/069916, включенной в данное описание в полном объеме путем ссылки.
CoQ10 обнаруживается в большинстве тканей человеческого тела и тканях других млекопитающих. Тканевое распределение и окислительно-восстановительный потенциал CoQ10 у людей рассмотрены в обзорной статье Bhagavan H.N., et al., Коэнзим Q10: Абсорбция, поглощение в тканях, метаболизм и фармакокинетика, Free Radical Research 40(5), 445-453 (2006) (в дальнейшем, Bhagavan, et al). Авторы сообщают, что как общее правило, ткани с высокими энергетическими требованиями или метаболической активностью, такие как сердце, почки, легкие и мускулы, содержат сравнительно большие концентрации CoQ10. Авторы в дальнейшем сообщают, что [а] основное количество CoQ10 в тканях находится в восстановленной форме в виде гидрохинона или унихинона, исключение составляют мозг и легкие, что видимо, отражает повышенный окислительный стресс в этих двух тканях. В частности, Bhagavan et
- 1 034552 al. сообщает, что в сердце, почках, легких, мускулах, кишечнике и крови (плазма) около 61, 75, 95, 65, 95 и 96%, соответственно CoQ10 находится в восстановленной форме. Подобным образом, Ruiz-Jiminez, et al., Определение убихинола-10 и убихинона-10 (коэнзим Q10) в сыворотке человека методом жидкостной хроматографии и масс-смектрометрии для оценки окислительного стресса, J. Chroma A 1175(2), 242248 (2007) (в дальнейшем Ruiz-Jiminez, et al) сообщает, что при оценке количества Q10 и восстановленной формы Q10 (Q10H2) в плазме человека большинство (90%) молекул было обнаружено в восстановленной форме.
CoQ10 очень липофилен и практически нерастворим в воде. Вследествие его нерастворимости в воде, ограниченной растворимости в жирах и сравнительно большого молекулярного веса эффективность перорального приема CoQ10 является низкой. Bhagavan, et al. сообщает, что в одном исследовании на крысах сообщалось, что было усвоено только около 2-3% орально введенного CoQ10. Bhagavan, et al. также сообщает, что данные исследований на крысах показывают, что CoQ10 восстанавливается до убихинола или во время, или сразу же после абсорбции в кишечнике.
CoQ10 в литературе связывается с раком в течение многих лет. Ниже описаны некоторые показательные, но не все включающие примеры упоминаний о CoQ10 в литературе. Karl Folkers, et al., Выживание пациентов, страдающих раком, в терапии с коэнзимом Q10, Biochemical и Biophysical Research Communication 192, 241-245 (1993) (здесь после Folkers, et al) описывает восемь историй болезней раковых пациентов, подвергавшихся терапии CoQ10 и их истории выживания в течение 5-15 лет. CoQ10 орально вводился восьми пациентам, имевшим различные типы рака, включая карциному поджелудочной железы, аденокарциному, карциному гортани, рак груди, толстой кишки, легких и простаты. Folkers, et al. далее утверждает, что эти результаты сейчас подтверждены системными протоколами. Lockwood, et al., Прогресс при терапии рака груди витамином Q10 и регрессия метастазов, Biochemical и Biophysical Research Communication 212, 172-177 (1995) (в дальнейшем Lockwood, et al) в другой обзорной статье сообщает о прогрессе в терапии рака груди с витамином Q10. Lockwood, et al. ссылается на Folkers, et al., который охватывает 35 лет международных исследований на животных и людях, которые обнаруживают различные уровни витамина Q10 в неопухолевых и опухолевых тканях и включают данные по витамину Q10, которые характерны для системы иммунной защиты, основываясь на повышенном выживании подвергнутых лечению мышей с опухолями. Lockwood, et al. далее утверждает, что потенциал терапии витамином Q10 рака у человека стал очевиден в 1961, основываясь на исследовании, в котором определялся уровень CoQ10 в крови у 199 шведских и американских страдающих раком пациентов, которое показало различные уровни недостаточности в случаях рака молочной железы. Патент США № 6417233, опубликованный 9 июля 2002 года (в дальнейшем Sears, et al) описывает композиции, содержащие жирорастворимые безнохиноны, например коэнзим Q10, для профилактики и/или лечения митохондриопатий. Sears, et al. далее утверждает, что как сообщается, лечение CoQ10 дает определенную пользу пациентам с раком (см. колонку 2, строки 30-31).
На дату подачи настоящей заявки Национальный Институт Рака сообщает, что хорошо спланированные клинические исследования CoQ10 в лечении рака, включающие большое число пациентов, не проводились с тех пор, как было проведено огромное число исследований, и объем сообщаемой информации не прояснил, является ли причиной полезных эффектов коэнзим Q10 или что-то еще; см. публикацию Национального Института Рака (NCI), доступную по адресу www.cancer.gov/cancertopics/pdq/cam/coenzymeQ10/patient/allpages (29 сентября 2008 г.). В частности, NCI ссылается на три небольших исследования использования CoQ10 во вспомогательной терапии после стандартного лечения пациентов с раком груди, в которых некоторым пациентам, по видимости, лечение помогало, и повторяет, что недостатки в разработке плана исследования и представлении данных, однако, не дают ясности, является ли причиной полезных эффектов коэнзим Q10 или что-то еще. The NCI отмечает, что эти исследования имеют следующие недостатки: исследования не были рандомизированными или контролируемыми; пациенты использовали другие добавки в дополнение к коэнзиму Q10; пациенты получали стандартное лечение до или во время терапии Q10; и не сообщаются детали обо всех пациентах исследования. NCI далее сообщает об анекдотических сообщениях, что коэнзим Q10 помог некоторым пациентам с раком прожить дольше, включая пациентов с раками поджелудочной железы, легких, ободочной кишки, прямой кишки и простаты, но утверждает, что 'пациенты, описанные в этих исследованиях, однако, получали также лечение, отличное от коэнзима Q10, включая химиотерапию, лучевую терапию и хирургию.
Публикация заявки на патент США 2006/0035981, опубликованная 16 февраля 2006 г. (в дальнейшем Mazzio 2006) описывает способы и композиции для лечения или предупреждения раков у людей и животных, с применением композиций, которые используют уязвимость раков, связанную с их анаэробной потребностью в неокислительном фосфорилировании глюкозы для получения энергии, что противоположно организму хозяина. Формулы Mazzio 2006 содержат один или более компонентов, которые синергетически стимулируют окислительный метаболизм и/или мешают дегидрогеназе молочной кислоты или анаэробному метаболизму глюкозы и более детально описаны как содержащие 2,3-диметокси-5метил-1,4-бензохинон (здесь также называемый DMBQ) (хиноидное основание) и варианты всего убихинонового ряда, включая соответствующие гидрохиноны, убихроменолы, убихроманолы или синтези
- 2 034552 рованные/природные производные и аналоги; см. Mazzio 2006, с. 3, параграф 0010. В публикации Mazzio 2006 утверждается, что короткая цепь убихинона (CoQ<3) является антираковым агентом и далее утверждается, что 2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинон (DMBQ) в 1000 раз сильнее, чем CoQ10, как антираковый агент. См. Mazzio 2006, с. 3, параграф ООП. В публикации Mazzio 2006 далее говорится, что исследования не обнаружили, что CoQ10 так летален, как ожидалось, предыдущие исследования, где CoQ10 применялся против рака, были несколько противоречивыми; см. Mazzio 2006, с. 3-4, где можно найти расширенный список цитат, подтверждающих это утверждение.
Публикация заявки на патент США 2007/0248693, опубликованная 25 октября 2007 г. (далее здесь Mazzio 2007), также описывает композиции пищевых добавок и их использование для лечения или предотвращения рака. Эта опубликованная заявка на патент опять сосредоточена на короткой цепи убихинонов и специально подчеркивает, что CoQ10 не является ключевым компонентом этого изобретения. В соответствии с публикацией Mazzio 2007, если CoQ10 может повышать Vmax активности митохондриального комплекса II в раковых клетках (Mazzio и Soliman, Biochem Pharmacol. 67:1167-84, 2004), он не контролирует степень митохондриального дыхания или потребления 02 благодаря комплексу IV. И CoQ10 не оказывал такого летального действия, как ожидалось. Более того, результаты CoQ10 против рака были противоречивыми; см. Mazzio 2007, с. 5, параграф 0019.
Сущность изобретения
Заявители ранее описывали местные формулы CoQ10 и способы уменьшения скорости роста опухолей у животных (Hsia et al., WO 2005/069916, опубликована 4 августа 2005 г.). В экспериментах, описанных в Hsia et al., показано, что CoQ10 увеличивает скорость апоптозов у культуры клеток рака кожи, но не у нормальных клеток. Более того, лечение животных с опухолями лекарственными формами CoQ10 для наружного применения показало резкое уменьшение скорости роста опухоли у животных.
Настоящее исследование основано, по меньшей мере частично, на более полном понимании роли CoQ10 у людей и/или клеток. В частности, способы и композиции настоящего исследования основаны, по меньшей мере частично, на знании терапевтической активности CoQ10 для онкологических заболеваний, основанном на спланированных и выполненных клинических исследований человека и/или на введении CoQ10 отдельным людям и наблюдении неожиданных результатов, имевших место во время этих исследований и/или режимов лечения. Способы и рецептуры настоящего исследования в дальнейшем основывались, по меньшей мере частично, на понимании терапевтического механизма CoQ10, полученном на основе обширных исследований влияния CoQ10 на клетки in vitro.
Более точно, по меньшей мере в одном воплощении изобретения способы и композиции настоящего исследования основывались, по меньшей мере частично, на неожиданном открытии, что применение Коэнзима Q10 (также называемого здесь CoQ10 или Q10) к клеткам приводит к избирательному вызову апоптозной реакции в раковых клетках и не оказывает эффекта или в некоторых случаях оказывает позитивный эффект на рост нормальных клеток. Более того, по меньшей мере в одном дополнительном воплощении изобретения, было неожиданно обнаружено, что клеточные линии, берущие начало от агрессивных раков, были более чувствительны к CoQ10 (например, требовалось более низкая концентрация и/или время воздействия CoQ10 для цитотоксичности и/или вызова апоптозов) по сравнению с клеточными линиями, берущими начало от менее агрессивных или неагрессивных раков. Наблюдался время- и дозозависимый эффект уровней митохондриального Q10, где через 48 ч уровень в митохондриях клеток возрос в шесть раз. По меньшей мере в одном дополнительном воплощении настоящего изобретения, оно дополнительно основано на неожиданном открытии, что Q10 сохраняется в замещенной окисленной форме (про-оксидантной) и не превращается в восстановленную (антиоксидантную) форму Q10H2 в каком-либо значительном количестве. В другом воплощении изобретение основывалось также на открытии, что экспрессия значительного числа генов модулируется в клетках, подвергавшихся воздействию окисленной формы Q10. Было обнаружено, что эти модулированные белки группируются в несколько клеточных путей метаболизма, включая апоптозы, биологию рака и рост клеток, гликолиз и метаболизм, молекулярный транспорт и клеточный сигналинг.
Взятые вместе, результаты, описанные здесь, дают новый взгляд на терапевтический механизм Q10. Например, не имея намерения ограничиваться теорией, открытия заявителей показывают, что Q10 и в особенности описанная форма Q10 вызывает метаболический сдвиг в микроокружении клеток. Известно, что у раковых клеток особый метаболизм (эффект Варбурга), вследствие чего большинство раковых клеток вырабатывают энергию преимущественно путем гликолиза с последующей ферментацией молочной кислоты в цитозоле, а не путем окислительного фосфорилирования (окисления пирувата) в митохондриях. Открытия заявителей показывают, что Q10 способен переключать метаболический статус раковых клеток с анаэробного использования глюкозы на митохондриальное окислительное фосфорилирование.
Основываясь на данных заявителей, представленных здесь, Q10 идентифицируется как многоаспектная внутриклеточная молекула (МВМ) и как эпиметаболический переключатель (эпипереключатель). В настоящем изобретеним предложены способы идентификации других МВМ и/или эпи-переключателей. Кроме того, в настоящем изобретении предложены МВМ, эпи-переключатели и способы для лечения онкологических заболеваний с их использованием.
Соответственно в изобретении предложен в первом аспекте способ лечения или предотвращения
- 3 034552 прогрессирования онкологических заболеваний у людей, способ, включающий введение человеку фармацевтической композиции в количестве, достаточном для лечения или профилактики онкологических заболеваний, где фармацевтическая композиция содержит комбинацию, выбранную из группы, состоящей из: (а) комбинации 4-гидроксибензоата и 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинона; (b) комбинации фенилацетата и 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинона и (с) комбинации L-фенилаланина и 2,3диметокси-5-метил-п-бензохинона, посредством этого леча или предотвращая онкологические заболевания у человека.
В связанном аспекте в изобретении предложен способ лечения, облегчения симптомов, подавления прогрессирования или предотвращения онкологических заболеваний у млекопитающих, способ включает введение при необходимости млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один компонент - фактор влияния (фактор-В), где фактор влияния избирательно вызывает в раковых клетках млекопитающих переключение клеточного энергетического метаболизма с гликолиза на митохондриальное окислительное фосфорилирование, на уровни, наблюдаемые в нормальных клетках млекопитающих при нормальных физиологических условиях.
При использовании здесь термин гликолиз необязательно включает связанный биосинтез лактата, при котором лактат образуется из пирувата.
В некоторых воплощениях изобретения фактор влияния, по большей части, не вызывает переключения клеточного энергетического метаболизма с гликолиза на митохондриальное окислительное фосфорилирование в нераковых клетках млекопитающих.
В некоторых воплощениях изобретения млекопитающим является человек или не являющееся человеком млекопитающее.
В некоторых воплощениях изобретения, фактор влияния не является коэнзимом Q10 или его метаболитом или аналогом (включая аналоги, не имеющие или имеющие по меньшей мере один изопреновый повтор).
В некоторых воплощениях изобретения онкологическое заболевание реагирует или чувствительно к лечению коэнзимом Q10 или его метаболитами или аналогами.
В некоторых изобретения фактор влияния вызывает апоптозы или механизм смерти клетки в раковой клетке.
В некоторых изобретения фактор влияния ингибирует ангиогенез в раковых клетках.
В некоторых воплощениях изобретения фактор влияния вызывает модуляцию связанных с иммунитетом элементов внутри микроокружения раковых клеток.
В некоторых воплощениях изобретения фактор влияния вызывает изменение контроля клеточного цикла в раковых клетках.
В некоторых воплощениях изобретения фактор влияния включает в себя: (а) бензохинон или по меньшей мере одну молекулу, которая способствует биосинтезу бензохинонового кольца, и (b) по меньшей мере одну молекулу, которая способствует синтезу и/или присоединению изопреноидных частиц к бензохиноновому кольцу.
При этом молекула, которая способствует биосинтезу бензохинонового кольца, может быть выбрана из группы, включающей L-фенилаланин, DL-фенилаланин, D-фенилаланин, L-тирозин, DL-тирозин, D-тирозин, 4-гидроксифенилпируват, 3-метокси-4-гидроксиманделат (манделат ванилина или VMA), ванилиновую кислоту, пироксин или пантенол.
При этом молекула, которая способствует синтезу и/или прикреплению изопреноидных единиц к бензохиноновому кольцу, может быть выбрана из группы, включающей фенилацетат, 4-гидроксибензоат, мевалоновую кислоту, ацетилглицин, ацетил-СоА или фарнезил.
В некоторых воплощениях изобретения композиция представляет собой: (а) комбинацию 4гидроксибензоата и 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинона; (b) комбинацию фенилацетата и 2,3диметокси-5-метил-п-бензохинона и (с) комбинацию L-фенилаланина и 2,3-диметокси-5-метил-пбензохинона.
При этом фактор влияния может: (а) ингибировать экспрессию Bcl-2 и/или стимулировать экспрессию каспазы-3 и/или (b) ингибировать клеточную пролиферацию.
Фактор-В может быть многоаспектной внутриклеточной молекулой (МВМ). В некоторых воплощениях изобретения МВМ представляет собой L-фенилаланин.
В одном воплощении изобретения фактор-В является эпиметаболическим переключателем (эпипереключателем). Эпиметаболический переключатель может быть выбран из трансалдолазы, транскетолазы, сукцинил СоА синтазы, пируваткарбоксилазы или рибофлавина или из группы, состоящей из витамина D3 и компонентов ЕСМ, где ЕСМ компоненты выбираются из группы, состоящей из фибронектина, иммуномодуляторов (например, TNFa или любого интерлейкина, например IL-5, IL-12, IL-23), ангиогенных факторов и факторов апоптоза.
В одном воплощении изобретения лечение получила выборка людей, и по меньшей мере 25% выборки имели системный уровень фактора влияния (например, коэнзима Q10), который был терапевтическим для болезни, на которую было направлено лечение. В других воплощениях лечение получила вы
- 4 034552 борка людей, и по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или более из выборки имели системный уровень фактора влияния (например, коэнзима Q10), который был терапевтическим для болезни, на которую было направлено лечение. Следует понимать, что диапазоны значений, в которых границами является любая из этих величин, также следует считать частью этого изобретения, например от 10 до 25%, от 15 до 35%, от 25 до 50%, от 35 до 60%, от 40 до 70%, от 50 до 75%, от 60 до 85% или от 70 до 90%.
В одном воплощении изобретения лечение получила выборка людей, и по меньшей мере у 25% из выборки наблюдалось уменьшение симптомов, что оценивалось по известным специалистам критериям, включая патологию тканей, клинические наблюдения, фотографические анализы, компьютерную томографию, МРТ-сканирование, маркеры рака в крови, сыворотке или плазме.
В одном воплощении изобретения лечение получила выборка людей, и по меньшей мере у 50% наблюдалось уменьшение симптомов, что оценивалось по известным специалистам критериям, включая патологию тканей, клинические наблюдения, фотографические анализы, компьютерную томографию, МРТ-сканирование, маркеры рака в крови, сыворотке или плазме.
В других воплощениях изобретения лечение получила выборка людей, и по меньшей мере у 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98% или более из выборки наблюдалось уменьшение симптомов, что оценивалось по известным специалистам критериям, включая патологию тканей, клинические наблюдения, фотографические анализы, компьютерную томографию, МРТсканирование, маркеры рака в крови, сыворотке или плазме. Следует понимать, что диапазоны значений, в которых границами является любая из этих величин, также следует считать частью этого изобретения, например от 10 до 25%, от 15 до 35%, от 25 до 50%, от 35 до 60%, от 40 до 70%, от 50 до 75%, от 60 до 85% или от 70 до 90%.
В различных воплощениях изобретения выборка людей, получивших лечение, могла составлять около 3, около 5, около 10, около 15, около 20, около 25, около 30, около 35, около 40, около 50, около 60, около 70, около 80, около 90, около 100, около 125, около 150, около 160, около 175, около 200, около 250, около 300, около 400 пациентов или более. Следует понимать, что диапазоны значений, в которых границами является любая из этих величин, также следует считать частью этого изобретения, например от около 10 до около 25, от около 15 до около 35, от около 25 до около 50 или от около 20 до около 160 пациентов.
Следует понимать, что специалист в данной области техники сможет, после изучения одного или более известных специалистам критериев, распознать, что у пациента наличествует улучшение симптомов, основываясь на общих знаниях в данной области. Например, специалист в данной области сможет изучить и сравнить фотографии раковых поражений кожи, таких как in situ кожная плоскоклеточная карцинома, до и после лечения (например, такие как фотографии, предоставленные здесь в качестве примеров) и сможет распознать улучшение симптомов, основываясь, например, на улучшении в размере поражения, цвете поражения или любых других видимых признаков поражения, обычно присущих раку. В другом примере специалист в данной области сможет изучить и сравнить тканевую патологию, например рака кожи, до и после воздействия и сможет распознать улучшение симптомов, основываясь на изменении в тканевой патологии, указывающем, например, на улучшение в онкогенности или тяжести рака. В другом примере специалист в данной области сможет изучить и сравнить изображение компьютерной томографии или изображения МРТ-сканирования опухоли или областей метастазных поражений до и после воздействия, сможет распознать улучшение симптомов, основываясь, например, на улучшении в размере первичной опухоли или улучшении в размере или числе метастазных повреждений.
В одном воплощении изобретения эффективное количество композиции, достаточное для лечения онкологических заболеваний у человека, подавляет анаэробное использование глюкозы (и/или биосинтез лактата) и активирует митохондриальное окислительное фосфорилирование.
В одном воплощении изобретения онкологическое заболевание, которое лечат, не является онкологическим заболеванием, которое обычно лечат путем местного воздействия, например раком молочной железы или простаты, с ожиданием системной доставки активного агента на терапевтически эффективных уровнях.
В одном воплощении изобретения концентрация фактора-В в тканях человека, подвергающегося лечению, отличается от концентрации в контрольном стандарте ткани человека, находящейся в здоровом или нормальном состоянии.
В одном воплощении изобретения форма фактора-В, введенного человеку, отличается от преобладающей формы, находящейся в общей системе циркуляции у человека.
В одном воплощении изобретения воздействие проявляется вследствие взаимодействия фактора-В с геном, выбранным из группы генов, перечисленных в табл. 1-28 (например, табл. 2-4, 6-28; особенно тех генов, активация или подавление которых показаны соответственно в тех же типах клеток с использованием различных методов оценки, или тех генов, активация или подавление которых соответственно показаны в различных типах клеток, теми же или отличными методами оценки; предпочтительно величина активации или подавления идентична или подобна (например, максимальная степень увеличения или уменьшения не более чем 10, 25, 50, 75, 100%, 2-, 3-, 4- или 5-кратно от минимальной степени увеличе
- 5 034552 ния или уменьшения).
В одном воплощении изобретения воздействие проявляется вследствие взаимодействия фактора-В с белком, выбранным из группы, состоящей из ИЫЕ4-альфа, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11 (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, сМус, трансалдотазы 1, COQ1, COQ3, COQ6, пренилтрансферазы, 4-гидробензоата, нейтрофильного цитозольного фактора 2, оксида азота синтазы 2А, супероксид дисмутазы 2, VDAC, Вах канала, ANT, Цитохрома с, комплекса 1, комплекса II, комплекса III, комплекса IV, Foxo 3а, DJ-1, IDH-1, Cpt1C, Cam киназы II, и/или любого из генов, перечисленных в табл. 1-28 (например, табл. 2-4, 6-28).
В одном воплощении изобретения онкологическое заболевание выбирается из группы, состоящей из лейкемии, лимфомы, меланомы, карциномы и саркомы.
В одном воплощении изобретения способ включает также введение дополнительного терапевтического агента или терапевтического режима.
В другом аспекте изобретения предоставлен способ лечения или профилактики агрессивного онкологического заболевания у людей, включающий введение фактора влияния (фактора-В) людям в выбранной более низкой дозе, чем дозовый режим, используемый или выбранный для менее агрессивных или неагрессивных онкологических заболеваний, тем самым леча или предотвращая агрессивное онкологическое заболевание.
В связанном аспекте изобретения предоставлен способ лечения или профилактики неагрессивного онкологического заболевания у людей, включающий введение фактора влияния (фактора-В) людям в выбранной более высокой дозе, чем дозовый режим, используемый или выбранный для агрессивных онкологических заболеваний, тем самым леча или предотвращая неагрессивное онкологическое заболевание.
В одном воплощении изобретения онкологическое заболевание выбирается из группы, состоящей из лейкемии, лимфомы, меланомы, карциномы и саркомы.
В одном воплощении изобретения агрессивное онкологическое заболевание выбирается из группы, состоящей из карциномы поджелудочной железы, гепатоцеллюлярной карциномы, саркомы Юинга, метастазирующего рака молочной железы, метастазирующей меланомы, рака мозга (астроцитома, глиобластома), нейроэндокринного рака, рака толстой кишки, рака легких, остеосаркомы, андрогеннезависимого рака простаты, рака яичников и неходжкинской лимфомы.
В одном воплощении изобретения неагрессивное онкологическое заболевание выбирается из группы, состоящей из неметастазируемого рака молочной железы, андроген-зависимого рака простаты, мелкоклеточного рака легких, острой лимфоцитной лейкемии.
В одном воплощении изобретения способ также включает режим лечения, выбранный из группы, состоящей из хирургии, радиации, гормональной терапии, терапии антителами, терапии факторами роста, цитокинами, и химиотерапии.
В еще одном аспекте изобретения предоставлен способ для (избирательного) блокирования в раковых клетках млекопитающих, нуждающихся в лечении онкологического заболевания, анаэробного использования глюкозы (гликолиза) и усиления митохондриального окислительного фосфорилирования, способ включает: введение млекопитающему терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного фактора-В для избирательного блокирования анаэробного использования глюкозы и для усиления митохондриального окислительного фосфорилирования в раковых клетках млекопитающего, по сравнению с уровнями, наблюдаемыми в нормальных клетках млекопитающего при нормальных физиологических условиях.
В одном воплощении изобретения способ также включает (1) активацию экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из набора генов, представленных в табл. 1-28 (например, 2-4 и 6-28), имеющих позитивное кратное изменение; и/или (2) подавления экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из набора генов, представленных в табл. 1-28 (например, 2-4 и 6-28) имеющих негативное кратное изменение.
В одном воплощении изобретения способ также включает модуляцию экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из HNF-альфа, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11 (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, сМус, трансалдолазы 1, COQ1, COQ3, COQ6, пренилтрансферазы, 4-гидробензоата, нейтрофильного цитозольного фактора 2, оксида азота синтазы 2А, супероксида дисмутазы 2, VDAC, Вах канала, ANT, Цитохрома с, комплекса 1, комплекса II, комплекса III, комплекса IV, Foxo 3а, DJ-1, IDH-1, CptlC и Cam киназы II.
В одном воплощении изобретения онкологическое расстройство выбирается из группы, состоящей из лейкемии, лимфомы, меланомы, карциномы и саркомы.
В одном воплощении изобретения способ также включает режим лечения, выбирающийся из группы, состоящей из хирургии, радиации, гормональной терапии, терапии антителами, терапии факторами роста, цитокинами и химиотерапии.
В еще одном аспекте изобретения предоставлен способ идентификации эффективного фактора влияния для лечения, облегчения симптомов, подавления прогрессирования или профилактики онкологического заболевания у млекопитающего, способ включает: (1) получение болезненного биологического
- 6 034552 образца, содержащего раковые клетки онкологического заболевания, и нормального биологического образца, не содержащего раковых клеток; (2) контакт болезненных и нормальных биологических образцов с потенциальным фактором влияния; (3) определение уровня экспрессии одного или более маркеров, представленных в болезненных и нормальных биологических образцах, где маркер выбирается из группы, состоящей из маркеров, перечисленных в табл. 1-28 (например, табл. 2-4 и 6-28), имеющих позитивное кратное изменение и/или имеющих негативное кратное изменение; (4) сравнение уровня экспрессии одного или более маркеров в болезненном и нормальном биологических образцах; где эффективный фактор влияния идентифицируется как потенциальный фактор влияния, который увеличивает уровень экспрессии одного или более маркеров, имеющих позитивное кратное изменение и/или снижает уровень экспрессии одного или более маркеров, имеющих кратное изменение, в болезненном биологическом образце, но по большей части не в нормальном биологическом образце.
В связанном аспекте изобретения предоставлен способ для лечения, облегчения симптомов, подавления прогрессирования или профилактики онкологического заболевания у млекопитающего, способ включает: (1) получение болезненного биологического образца, содержащего раковые клетки онкологического заболевания, и нормального биологического образца, не содержащего раковых клеток; (2) контакт болезненных и нормальных биологических образцов с потенциальным фактором влияния; (3) определение уровня экспрессии одного или более маркеров, представленных в болезненном и нормальном биологических образцах, где маркер выбирается из группы, состоящей из маркеров, перечисленных в табл. 1-28, имеющих позитивное кратное изменение и/или негативное кратное изменение; (4) сравнение уровня экспрессии одного или более маркеров в болезненном и нормальном биологических образцах; где эффективный фактор влияния идентифицируется как потенциальный фактор влияния, который увеличивает уровень экспрессии одного или более маркеров, имеющих позитивное кратное изменение и/или снижает уровень экспрессии одного или более маркеров, имеющих негативное кратное изменение, в болезненном биологическом образце, но по большей части не в нормальном биологическом образце; (5) введение млекопитающему эффективного фактора влияния; посредством этого лечится онкологическое заболевание у млекопитающих.
В еще одном связанном воплощении изобретения предоставлен способ идентификации эффективного фактора влияния для лечения, облегчения симптомов, подавления прогрессирования или профилактики онкологического заболевания у млекопитающего, способ включает: (1) получение болезненного биологического образца, содержащего раковые клетки онкологического заболевания, и нормального биологического образца, не содержащего раковых клеток; (2) контакт болезненных и нормальных биологических образцов с потенциальным фактором влияния; (3) определение уровня гликолиза и митохондриального окислительного фосфорилирования в болезненном и нормальном биологических образцах, до и после контакта с потенциальным фактором влияния, где эффективный фактор влияния идентифицируется как потенциальный фактор влияния, который повышает уровень митохондриального окислительного фосфорилирования и/или уменьшает уровень гликолиза, в болезненном биологическом образце, но по большей части не в нормальном биологическом образце.
В еще одном связанном воплощении изобретения предоставлен способ идентификации эффективного фактора влияния для лечения, облегчения симптомов, подавления прогрессирования или профилактики онкологического заболевания у млекопитающего, способ включает: (1) получение болезненного биологического образца, содержащего раковые клетки онкологического заболевания, и нормального биологического образца, не содержащего раковых клеток; (2) контакт болезненных и нормальных биологических образцов с потенциальным фактором влияния; (3) определение уровня гликолиза и митохондриального окислительного фосфорилирования в болезненном и нормальном биологических образцах, до и после контакта с потенциальным фактором влияния, где эффективный фактор влияния идентифицируется как потенциальный фактор влияния, который повышает уровень митохондриального окислительного фосфорилирования и/или уменьшает уровень гликолиза, в болезненном биологическом образце, но по большей части не в нормальном биологическом образце и (4) введение млекопитающему эффективного фактора влияния; посредством чего лечится онкологическое заболевание у млекопитающих.
В некоторых воплощениях изобретения уровень гликолиза оценивается как ECAR, и/или где уровень митохондриального окислительного фосфорилирования оценивается как OCR.
В одном воплощении изобретения фактор-В не является коэнзимом Q10.
В дальнейшем аспекте изобретения предоставлен способ идентификации многоаспектной внутриклеточной молекулы (МВМ), включающий в себя: (а) контакт клетки с эндогенной молекулой; (b) мониторинг действия эндогенной молекулы на профиль клеточного микроокружения и (с) идентификацию эндогенной молекулы, которая вызывает изменение профиля клеточной микросреды, таким образом идентифицируется МВМ.
В одном воплощении изобретения способ также включает в себя сравнение влияния эндогенной молекулы на профиль клеточного микроокружения больной клетки и нормальной контрольной клетки; идентификацию эндогенной молекулы, которая вызывает различные изменения в профиле клеточной микросреды больной клетки и нормальной контрольной клетки; таким образом идентифицируется МВМ.
В одном воплощении изобретения действие на профиль клеточного микроокружения определяется
- 7 034552 путем оценки изменения уровня или активности клеточной молекулы, выбранной из группы, состоящей из мРНК, белков, липидов и метаболитов.
В другом аспекте изобретения предоставлен способ идентификации эпиметаболического переключателя (эпи-переключателя), включающий в себя: (а) сравнение молекулярных профилей двух или более клеток или тканей, где две или более клеток или тканей находятся на различных стадиях заболевания; (b) идентификация молекулы из молекулярных профилей, для которых изменение уровня коррелирует со стадией заболевания; (с) введение молекулы в клетку и (d) оценка возможности молекулы переключить метаболический статус клетки; где молекула, способная переключить метаболический статус клетки, идентифицируется как эпи-переключатель.
В одном воплощении изобретения молекулярный профиль выбирается из группы, состоящей из профиля метаболитов, профиля липидов, профиля белков или профиля РНК.
В одном воплощении изобретения молекула не оказывает негативного воздействия на здоровье или рост нормальных клеток.
В еще одном аспекте изобретения предоставлен способ идентификации агента, эффективного для лечения онкологического заболевания, который включает в себя: (1) предоставление потенциального фактора влияния; (2) определение способности фактора влияния переключать метаболический статус клетки и (3) определение того, является ли потенциальный фактор влияния эффективным для лечения онкологического заболевания; где потенциальный фактор влияния, способный переключать метаболический статус клетки и эффективный для лечения онкологического заболевания идентифицируется как агент, эффективный для лечения онкологического заболевания.
В одном воплощении изобретения фактор-В идентифицируется как способный переключать метаболический статус клетки путем оценки изменений экспрессии одной или более мРНК, уровней липидов, уровней метаболитов, уровней биоэнергетических молекул, клеточной энергетики, функции митохондрий и числа митохондрий.
В еще одном аспекте изобретения предоставлена композиция, включающая агент, идентифицированный в соответствии с вышеописанными способами изобретения.
В другом аспекте изобретения предоставлен способ лечения, облегчения симптомов, профилактики прогрессирования или предупреждения поддающегося воздействию CoQ10 нарушения или состояния у млекопитающих, способ включает: введение нуждающемуся в соответствующем лечении млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей по меньшей мере один фактор влияния (фактор-В), где фактор влияния избирательно вызывает в больных клетках млекопитающего переключение клеточного энергетического метаболизма уровней гликолиза и митохондриального окислительного фосфорилирования на наблюдаемые в нормальных клетках млекопитающих при нормальных физиологических условиях.
В некоторых воплощениях изобретения поддающееся влиянию CoQ10 заболевание является онкологическим заболеванием.
Ожидается, что, если это приемлемо или специально не отрицается, любое из воплощений, описанных здесь, можно комбинировать с любым другим или более воплощениями, даже если воплощения описаны в различных аспектах изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - чувствительность SK-MEL-28 к 24 ч воздействия Q10, оцененная по количеству ранних и поздних апоптозных клеток.
Фиг. 2 - чувствительность SKBR3 к 24 ч воздействия Q10, оцененная по количеству ранних и поздних апоптозных клеток.
Фиг. 3 - чувствительность РаСа2 к 24 ч воздействия Q10, оцененная по количеству ранних и поздних апоптозных клеток.
Фиг. 4 - чувствительность РС-3 к 24 ч воздействия Q10, оцененная по количеству ранних и поздних апоптозных клеток.
Фиг. 5 - чувствительность HepG2 к 24 ч воздействия Q10, оцененная по количеству ранних и поздних апоптозных клеток.
Фиг. 6 - чувствительность MCF-7 к 24 ч воздействия Q10, оцененная по количеству ранних и поздних апоптозных клеток.
Фиг. 7 - оценка апоптозных клеток после 24 ч воздействия Q10, оцененная по методу Apostrand ELISA.
Фиг. 8 - пример гель-анализа на 2-D гель-электрофорезе. Отмечены точки, выбранные для идентификации.
Фиг. 9 - сеть взаимодействий между белками, идентифицированными в 2-D гель электрофорезе, модулированными Q10 в SK-MEL-28 клетках.
Фиг. 10 - пентозофосфатный путь, адаптированный по Verhoeven et al. (Am. J. Hum. Genet. 2001 68(5): 1086-1092).
Фиг. 11 - 2-D гель богатого митохондриями материала SK-MEL-28 клеток. Отмечены точки, исключенные и идентифицированные путем масс-спектроскопии.
- 8 034552
Фиг. 12 - сравнительный график относительных количеств Q10, присутствующего в митохондриях
SK-MEL-28 после экзогенного добавления 100 мкМ Q10 в культуральную среду.
Фиг. 13 - карта известных процессов апоптозного пути.
Фиг. 14 - анализ иммуноблоттингом Bcl-xl.
Фиг. 15 - анализ иммуноблоттингом образцов SK-MEL-28, обработанных антителами Виментин.
Фиг. 16 - анализ иммуноблоттингом лизиса клеток из различных клеточных линий, оцененный с помощью пяти антител к комплексам окислительного фосфорилирования (MitoSciences #MS601).
Фиг. 17 - сравнение с помощью иммуноблоттинга уровней F1-альфа.
Фиг. 18 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на С-III-Core 2.
Фиг. 19 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на С-П-30.
Фиг. 20 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на C-IV-COX II.
Фиг. 21 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на C-I-20 (ND6).
Фиг. 22 - анализ иммуноблоттингом различных типов клеток на пять митохондриальных белков.
Фиг. 23 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на комплекс V белка C-V-α.
Фиг. 24 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на C-III-Core 1.
Фиг. 25 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на Порин (VDAC1).
Фиг. 26 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на Циклофилин D.
Фиг. 27 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на Цитохром С.
Фиг. 28 - теоретическая модель Q10 (сферическая), входящего в липид-связывающий канал И№4альфа (1M7W.pdb) в открытую конформацию Helix 10.
Фиг. 29 - графическое изображение эпидермальной концентрации CoQ10 у самцов свиней после лечения раскрытой здесь композицией, имеющей проникающий агент.
Фиг. 30 - графическое изображение эпидермальной концентрации CoQ10 у самок свиней после лечения контрольной композицией.
Фиг. 31 - фотографическое изображение целевого повреждения 1 до обработки.
Фиг. 32 - фотографическое изображение целевого повреждения 1 после обработки.
Фиг. 33 - фотографическое изображение целевого повреждения 2 до обработки.
Фиг. 34 - фотографическое изображение целевого повреждения 2 после обработки.
Фиг. 35 - фотографическое изображение целевого повреждения 3 до обработки.
Фиг. 36 - фотографическое изображение целевого повреждения 3 после обработки.
Фиг. 37 - OCR в HDFa клетках в разном глюкозном состоянии в норме и при гипоксии.
Фиг. 38 - OCR в HASMC клетках в разном глюкозном состоянии в норме и при гипоксии.
Фиг. 39 - OCR значения в MCF-7 клетках рака молочной железы в отсутствие и в присутствии 31510 и стрессоров.
Фиг. 40 - OCR значения в РаСа-2 раковых клетках поджелудочной железы в отсутствие и в присутствии 31510 и стрессоров.
Подробное описание изобретения
I. Общие описания и определения.
При использовании здесь каждый из следующих терминов имеет значение, соответствующее ему в этом разделе.
Термины в единственном числе, используемые в настоящем документе, относятся к одному или более (т.е. по меньшей мере к одному) грамматическому объекту статьи. Например, один элемент обозначает один элемент или более одного элемента.
Термин включая используется здесь в значении и взаимозаменяемо с фразой включая, но не ограничиваясь.
Термин или используется здесь в значении и взаимозаменяемо с термином и/или, если только контекст прямо не указывает на другое.
Термин такой как используется здесь в значении и взаимозаменяемо с фразой такой как, но не ограничиваясь.
Пациент или субъект, подвергнутый лечению по способу изобретения, может означать или человека или не являющееся человеком животное, предпочтительно млекопитающее. Надо отметить, что клинические наблюдения, описанные здесь, были проведены на людях, и, по меньшей мере, в некоторых модификациях субъектами являются люди.
Терапевтически эффективное количество означает количество соединения, которое, будучи введено пациенту для лечения болезни, достаточно для оказания эффекта лечения болезни. Если соединение вводится для профилактики болезни, количество достаточно для избежания или отсрочки наступления болезни. Терапевтически эффективное количество будет варьировать в сильной зависимости от соединения, болезни и ее серьезности и возраста, веса и тому подобного у пациента, подвергаемого лечению.
Профилактика или предотвращение относится к уменьшению риска развития болезни или заболевания (т.е. причиной того, что по крайней мере один из клинических симптомов болезни не разовьется у пациента, который может быть подвержен или предрасположен к болезни, но еще не иметь ее или не показывать симптомов болезни).
- 9 034552
Термин профилактическое или терапевтическое количество относится к введению субъекту одной или более композиций, о которых идет речь. Если введение предшествует клиническому проявлению нежелаемого состояния (например, болезни или другого нежелаемого состояния организма), тогда воздействие является профилактическим, т.е. оно предотвращает развитие в организме нежелательного состояния, а в случае, если введение происходит после проявления нежелательного состояния, воздействие является терапевтическим (т.е. имеет своей целью уменьшить, улучшить или поддержать существующее нежелательное состояние или его побочные эффекты).
Термин терапевтический эффект относится к местному или системному эффекту у животных, особенно млекопитающих, и в первую очередь человека, причиной которого является фармакологически активное вещество. Термин таким образом относится к любому веществу, которое намереваются использовать для диагностики, курса лечения, облегчения, лечения или предотвращения болезни или в увеличении желаемого физического или ментального развития и условий у животных или людей. Фраза терапевтически эффективное количество означает, такое количество вещества, которое производит определенное желаемое местное или системное действие в приемлемом соотношении польза/риск, применимом к любому лечению. В некоторых вариантах воплощения терапевтически эффективное количество вещества будет зависеть от его терапевтического индекса, растворимости и тому подобного. Например, определенные композиции, раскрытые в способах настоящего изобретения, могут вводиться в достаточном количестве для получения обоснованного соотношения преимущество/риск, применимого к такому лечению.
Пациент означает любое животное (например, человек или не являющееся человеком млекопитающее), которое может быть субъектом по меньшей мере одного медицинского вмешательства (например, лечения, диагностики/прогностических тестов, и т.д.), включая лошадей, собак, кошек, свиней, коз, кроликов, хомяков, обезьян, морских свинок, крыс, мышей, ящериц, змей, коров, рыб и птиц.
Метаболический путь относится к последовательности энзим-опосредованных реакций, которые трансформируют одно соединение в другое и предоставляют промежуточные продукты и энергию для клеточных функций. Метаболический путь может быть линейным или цикличным.
Метаболический статус относится к молекулярному содержанию в определенной клеточной, многоклеточной или тканевой среде в определенный момент времени, оцененному по различным химическим и биологическим показателям, которые имеют отношение к состоянию здоровья или болезни.
Термин микрочип относится к совокупности определенных полинуклеотидов, олигонуклеотидов, полипептидов (например, антител) или пептидов, синтезированных на субстрате, таком как бумага, нейлон или другой тип мембраны, фильтра, тонкой пластинки, стеклянной пластинки или любой другой твердой подложки.
Термины заболевания и болезни используются взаимозаменяемо и относятся к любому отклонению от нормальной структуры или функции любой части, органа или системы организма (или любой их комбинации). Определенная болезнь выражается по характерным симптомам и признакам, включая биологические, химические и физические изменения и часто связывается с множеством других факторов, включая, но не ограничиваясь, демографическим, окружающей среды, генетическим и медицинским историческим факторами. Определенные характерные признаки, симптомы и соответствующие факторы могут быть подсчитаны различными методами для получения важной диагностической информации.
Термин экспрессия, используемый здесь, означает процесс, по которому полипептид образуется из ДНК. Процесс включает транскрипцию на гене мРНК и трансляцию на этой мРНК полипептида. В зависимости от контекста, в котором это выражение используется, экспрессия может относиться к образованию РНК, белка или и того, и другого.
Термин уровень экспрессии гена относится к уровню мРНК, а также пре-мРНК, образующихся транскриптов РНК, промежуточных транскриптов, зрелой(ых) мРНК и продуктов распада, или к уровню белка, кодируемого этим геном в клетке.
Термин модуляция относится к положительному регулированию (т.е. активации или стимуляции), отрицательному регулированию (т.е. ингибированию или супрессии) в качестве реакции или к тому и другому в комбинации или отдельно. Модулятор является композицией или молекулой, которая модулирует, и может быть, например, агонистом, антагонистом, активатором, стимулятором, супрессором или ингибитором.
Термин промежуточный продукт биосинтеза коэнзима, используемый здесь, характеризует те соединения, которые образуются при химическом/биологическом превращении тирозина и ацетил-СоА в убихинон. Промежуточные продукты биосинтеза коэнзима включают 3-гексапренил-4-гидроксибензоат, 3-гексапренил-4,5-дигидроксибензоат, 3-гексапренил-4-гидрокси-5-метоксибензоат, 2-гексапренил-6метокси-1,4-бензохинон, 2-гексапренил-3-метил-6-метокси-1,4-бензохинон, 2-гексапренил-3-метил-5гидрокси-6-метокси-1,4-бензохинон, 3-октапренил-4-гидроксибензоат, 2-октапренилфенол, 2октапренил-6-метолксифенол, 2-октапренил-3-метил-6-метокси-1,4-бензохинон, 2-октапренил-3-метил-5гидрокси-6-метокси-1,4-бензохинон, 2-декапренил-3 -метил-5 -гидрокси-6-метокси-1,4-бензохинон, 2декапренил-3 -метил-6-метокси-1,4-бензохинон, 2-декапренил-6-метокси-1,4-бензохинон, 2-декапренил6-метоксифенол, 3-декапренил-4-гидрокси-5-метоксибензоат, 3-декапренил-4,5-дигидроксибензоат, 3- 10 034552 декапренил-4-гидроксибензоат, 4-гидроксифенилпируват, 4-гидроксифениллактат, 4-гидроксибензоат, 4гидрокициннамат и гексапренидифосфат.
Термин троламин, используемый здесь, относится к Троламину NF, Триэтаноламину, TEAlan ®, TEAlan 99%, Триэтаноламину, 99%, Триэтаноламину, NF или Триэтаноламину, 99%, NF. Эти термины могут быть использованы здесь взаимозаменяемо.
В некоторых модификациях соединения настоящего изобретения, например МВМ или эпипереключатели, описанные здесь, могут быть использованы для лечения поддающегося влиянию Коэнзима Q10 состояния у субъектов, нуждающихся в таком лечении. Выражение поддающееся влиянию коэнзима Q10 состояние или поддающееся влиянию CoQ10 состояние/болезнь включает болезни, расстройства, состояния, которые можно лечить, предотвращать или иным образом облегчать путем введения коэнзима Q10. Не имея стремления ограничиваться какой-либо определенной теорией, и как будет в дальнейшем описано здесь, полагается, что функции CoQ10, по меньшей мере частично, состоят в вызове метаболического переключения в микроокружении клетки, таком как переключение на тип и/или уровень окислительного фосфорилирования в клетках с нормальным состоянием. Соответственно в некоторых вариантах воплощения изобретения поддающиеся влиянию CoQ10 состояния являются состояниями, которые возникают вследствие измененного метаболизма в клеточном микроокружении. Поддающиеся влиянию коэнзима Q10 состояния включают, например, онкологические заболевания, которые, например, могут смещаться в сторону гликолиза и биосинтеза лактата. В некоторых вариантах воплощения изобретения поддающиеся влиянию CoQ10 онкологические заболевания включают рак легких, рак поджелудочной железы, рак молочных желез, рак простаты, рак печени или рак костей, плоскоклеточные карциномы, базальноклеточные карциномы, меланомы и актинические кератозы, в числе прочих. Поддающиеся влиянию коэнзима Q10 состояния включают также другие онкологические заболевания, как описано в настоящем документе.
Поддающиеся влиянию коэнзима Q10 состояния также включают, например, метаболические расстройства, такие как ожирение, диабеты, преддиабетные состояния, метаболический синдром и эндокринные нарушения.
Поддающиеся влиянию коэнзима Q10 состояния включают, кроме того, другие метаболические расстройства, в настоящем документе.
В некоторых вариантах воплощения изобретения соединения настоящего изобретения, например, МВМ или эпи-переключатели, описанные здесь, действуют подобно коэнзиму Q10. При использовании в настоящем документе фраза действовать подобно коэнзиму Q10 означает способность соединения демонстрировать, по меньшей мере частично, такое же или подобное действие, как коэнзим Q10. В некоторых вариантах воплощения изобретения соединения настоящего изобретения демонстрируют 25% или более от действия коэнзима Q10. В некоторых вариантах воплощения изобретения соединения настоящего изобретения демонстрируют до 130% от действия коэнзима Q10. В некоторых вариантах воплощения изобретения соединения настоящего изобретения демонстрируют около 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 или 130% действия коэнзима Q10. Следует понимать, что каждое значение, перечисленное в этом параграфе, можно модифицировать термином около. Кроме того, следует понимать, что значение в любом диапазоне, который находится между любыми двумя величинами, перечисленными в этом параграфе, тем самым входит в настоящее изобретение. Например, в некоторых вариантах воплощения соединения настоящего изобретения демонстрируют действие коэнзима Q10 между около 50 и около 100%. В некоторых вариантах воплощения действием, которое подобно у коэнзима Q10 и соединений настоящего изобретения, является способность вызывать переключение клеточного метаболизма. В некоторых вариантах воплощения изобретения действие, которое подобно у CoQ10 и у соединений настоящего изобретения, оценивается по НРК (норма расхода кислорода, OCR) и/или НВКО (норма внеклеточного окисления, ECAR).
При использовании здесь, онкологическое заболевание относится ко всем типам раковых или злокачественных опухолей или неоплазм, обнаруженных у людей, включая, не ограничиваясь: лейкемии, лимфомы, меланомы, карциномы и саркомы. При использовании здесь, термины или выражения онкологическое заболевание, рак, неоплазма и опухоль используются взаимозаменяемо и или в единственной, или во множественной форме, относятся к клеткам, которые подверглись злокачественному перерождению, которое сделало их патологичными для организма носителя. В некоторых вариантах воплощения онкологическое заболевание является поддающимся влиянию коэнзима Q10 состоянием.
В некоторых вариантах воплощения изобретения онкологическое заболевание или рак характеризуется отсутствием апоптозов. В других вариантах воплощения онкологическое заболевание или рак характеризуется повышенным ангиогенезом. В других вариантах воплощения онкологическое заболевание или рак характеризуется деградацией внеклеточного матрикса (ВКМ). В еще одних вариантах воплощения, онкологическое заболевание или рак характеризуется потерей контроля клеточного цикла. В еще одних вариантах воплощения, онкологическое заболевание или рак характеризуется переключением ме- 11 034552 таболического управления с митохондриального окислительного фосфорилирования на увеличение использования и/или зависимости от поступления лактата и гликолиза. В следующих вариантах воплощения, онкологическое заболевание или рак характеризуется адаптированными иммуномодуляторными механизмами, помогающими избегнуть иммунного надзора. В одном варианте воплощения онкологическое заболевание или рак характеризуется по меньшей мере двумя из вышеперечисленных характеристик, например возрастанием ангиогенеза и деградацией ВКМ. В одном варианте воплощения онкологическое заболевание или рак характеризуется по меньшей мере тремя из вышеперечисленных характеристик. В одном варианте воплощения онкологическое заболевание или рак характеризуется по меньшей мере четырьмя из вышеперечисленных характеристик. В одном варианте воплощения онкологическое заболевание или рак характеризуется по меньшей мере пятью из вышеперечисленных характеристик. В одном варианте воплощения онкологическое заболевание или рак характеризуется всеми шестью из вышеперечисленных характеристик.
Соответственно в некоторых вариантах воплощения соединения настоящего изобретения действуют, восстанавливая способность к апоптозам или вызывая апоптозы. В других вариантах воплощения соединения настоящего изобретения действуют, ослабляя, снижая или подавляя ангиогенез. В еще одних вариантах воплощения соединения настоящего изобретения действуют, восстанавливая внеклеточный матрикс. В других вариантах воплощения соединения настоящего изобретения действуют, восстанавливая контроль клеточного цикла. В еще одних вариантах воплощения соединения настоящего изобретения действуют, переключая управление метаболизмом обратно с гликолиза на митохондриальное окислительное фосфорилирование. В следующих вариантах воплощения соединения настоящего изобретения действуют, возвращая иммунный надзор или восстанавливая способность организма распознавать раковые клетки как чужеродные.
Не имея стремления ограничиваться какой-либо определенной теорией, полагаем, что обычно существует скоординированный каскад событий, которые в совокупности приводят к развитию рака. Таким образом, в некоторых воплощениях рак не проявляет простой зависимости 1 ген - 1 белок - основная причинно-следственная связь. В некоторых воплощениях рак является физиологическим болезненным состоянием, которое выражается в изменениях ткани и перестройках, которые приводят к образованию опухолей, изменяют состояние ткани, например энергетическое, подрывают целостность внеклеточного матрикса, что приводит к возможности образования метастаз, отсутствии иммунного надзора и/или измененном состоянии ангиогенеза.
Первичные раковые клетки (то есть клетки, близкие к злокачественной трансформации) можно легко отличить от нераковых клеток с помощью хорошо известных техник, в частности при гистологическом исследовании. Определение раковой клетки, используемое здесь, включает не только первичные раковые клетки, но также стволовые раковые клетки, а кроме того предраковые клетки или любые клетки, образовавшиеся от предшественника раковой клетки. Это включает метастазировавшие раковые клетки, и культуры in vitro и клеточные линии, образовавшиеся от раковых клеток. Если речь идет о типе рака, который обычно проявляется как солидная опухоль, клинически определяемая опухоль является опухолью, которая определяется на основании массы опухоли, например, с помощью таких процедур, как компьютерная томография, МР-томография, рентген, ультразвуковое обследование или пальпация, и/или которая определяется на основании экспрессии одного или более ракоспецифичных антигенов в образце, взятом от пациента.
При использовании здесь, позитивное кратное изменение относится к положительной регуляции или возрастанию (экспрессии) генов, которые перечислены в соответствующих таблицах.
При использовании здесь, негативное кратное изменение относится к отрицательной регуляции или снижению (экспрессии) генов, которые перечислены в соответствующих таблицах.
В некоторых вариантах воплощения изобретения, где определенные перечисленные гены связаны более чем с одним из условий лечения, таким как различные временные периоды после лечения или лечения различными концентрациями потенциального фактора влияния (например, CoQ10), кратное изменение определенного гена относится к самому длинному зарегистрированному промежутку времени. В других вариантах воплощения кратное изменение определенного гена относится к самому короткому зарегистрированному промежутку времени. В других вариантах воплощения кратное изменение определенного гена относится к лечению самой высокой концентрацией фактора-В (например, CoQ10). В других вариантах воплощения кратное изменение определенного гена относится к лечению самой низкой концентрацией фактора-В (например, CoQ10). В других вариантах воплощения кратное изменение определенного гена относится к модуляции (например, положительной или отрицательной регуляции), согласованной с терапевтическим эффектом фактора-В.
В определенных вариантах воплощения позитивное или негативное кратное изменение относится к любому из генов, перечисленных в любой из табл. 1-28 (например, 2-4 и 6-28). В определенных вариантах воплощения позитивное или негативное кратное изменение относится к любому из генов, перечисленных в любой из табл. 1-28 (например, 2-4 и 6-28), за исключением одной из таблиц (например, за исключением табл. 1, 5 и т.д.). В определенных вариантах воплощения, позитивное или негативное кратное изменение относится к любому из генов, перечисленных в любой из табл. 1-28 (например, 2-4 и 6-28), за
- 12 034552 исключением любых двух таблиц (например, за исключением табл. 1 и 5, за исключением табл. 2 и 16, и т.д.). В определенных вариантах воплощения позитивное или негативное кратное изменение относится к любому из генов, перечисленных в любой из табл. 1-28 (например, 2-4 и 6-28), за исключением любых трех таблиц; или за исключением любых четырех таблиц; или за исключением любых 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более таблиц. В определенных вариантах воплощения позитивное или негативное кратное изменение относится к любому из генов, перечисленных в любой из табл. 1-28 (например, 2-4 и 6-28), за исключением табл. 1, 5, 9, и 12.
Теперь будет сделана детальная ссылка на предпочитаемые воплощения изобретения. Хотя изобретение будет описано в соответствии с предпочтительными воплощениями, следует понимать, что изобретение не следует ограничивать этими предпочтительными воплощениями. Напротив, изобретение включает альтернативы, модификации и эквиваленты, которые можно включить в объем и область изобретения, как определено в приложенной формуле.
II. Факторы влияния на внутреннюю среду.
В настоящем изобретении представлены способы лечения онкологических заболеваний путем введения фактора влияния на внутреннюю среду. Факторы влияния на внутреннюю среду (факторы влияния, В-факторы) являются молекулами, которые благотворным образом влияют или модулируют болезненную внутреннюю среду человека или не являющегося человеком млекопитающего, давая возможность болезненной внутренней среде измениться, восстановив или поддержав нормальную или здоровую внутреннюю среду, что приводит к нормальному состоянию. Эпи-переключатели включают как многоаспектные внутриклеточные молекулы (МВМ), так и эпиметаболические переключатели (эпипереключатели), определенные ниже.
В определенных вариантах воплощения МВМ и эпи-переключатели, раскрытые здесь, включают те, которые обычно используются в качестве пищевых добавок. В определенных вариантах воплощения, эти МВМ и/или эпи-переключатели, раскрытые здесь, являются фармацевтической маркой. В определенных вариантах воплощения МВМ и/или эпи-переключатели, имеющие фармацевтическую марку, имеют чистоту между около 95 и около 100% и включают все значения между 95 и 100%. В определенных вариантах воплощения чистота МВМ и/или эпи-переключателей составляет 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9, 99,9 или 100%. В определенных вариантах воплощения МВМ и/или эпипереключатели свободны или практически свободны от эндотоксинов. В других вариантах воплощения МВМ и/или эпи-переключатели свободны или практически свободны от чужеродных белковых веществ. В определенных вариантах воплощения МВМ и/или эпи-переключателем является CoQ10.
1. Многоаспектная внутриклеточная молекула (МВМ).
Термин многоаспектная внутриклеточная молекула (МВМ) является выделенной версией или синтезированной версией эндогенной молекулы, которая в природе образуется в организме и/или присутствует по меньшей мере в одной клетке человека. МВМ характеризуется одной или более, двумя или более, тремя или более или всеми следующими функциями. МВМ способны проникать в клетку, и проникновение в клетку включает полное или частичное проникновение в клетку, пока биологически активная часть молекулы полностью не войдет в клетку. МВМ способны запускать механизмы сигнальной трансдукции и/или экспрессии генов в клетке. МВМ являются многоаспектными, поскольку молекулы одновременно обладают как терапевтическим действием, так и являются носителем, т.е. переносчиком лекарства. МВМ также являются многоаспектными, поскольку молекулы одним образом действуют на состояние болезни и другим образом на нормальное состояние. Например, в случае CoQ-10, введение CoQ-10 в клетки меланомы в присутствии VEGF приводит к снижению уровня Bcl2, который, в свою очередь, приводит к снижению онтогенетического потенциала клеток меланомы. Напротив, в нормальном фибробласте, при одновременном введении CoQ-10 и VEFG эффект на уровни Bcl2 не оказывается. Предпочительно МВМ избирательно действует на клетки в состоянии болезни, и по большей части не оказывает эффекта на (соседние) клетки в нормальном состоянии. Предпочтительно МВМ избирательно оказывает влияние на клетки в болезненном состоянии, близкие по фенотипу, метаболическому статусу, генотипу, уровням экспрессии мРНК/белков и т.д., приближая клетки к нормальному состоянию.
В одном варианте воплощения МВМ является также эпи-переключателем. В другом варианте воплощения МВМ не является эпи-переключателем. Специалист в данной области техники поймет, что подразумевается, что МВМ изобретения также включает в себя смесь двух или более эндогенных молекул, где смесь характеризуется одной или более вышеупомянутых функций. Эндогенные молекулы в смеси представлены в таком соотношении, что смесь действует как МВМ.
МВМ могут быть молекулами, имеющими липидную основу или не имеющими липидной основы. Примеры МВМ включают, не ограничиваясь, CoQ10, ацетил Со-А, пальмитил Со-А, L-карнитин, аминокислоты, такие как, например, тирозин, фенилаланин и цистеин. В одном воплощении МВМ является маленькой молекулой. В одном воплощении изобретения МВМ не является CoQ10. МВМ может идентифицировать обычным образом любой специалист, используя любой из анализов, подробно описанных в настоящем документе.
В некоторых вариантах воплощения МВМ включает соединения семейства витаминов В или нуклеотиды, мононуклеотиды или динуклеотиды, которые содержат соединения семейства витаминов В.
- 13 034552
Соединения семейства витаминов В включают, например, тиамин (витамин В1), ниацин (также известный как никотиновая кислота или витамин В3), или пиридоксин (витамин В6), а также провитамины, такие как пантенол (провитамин В5). В некоторых вариантах воплощения МВМ выбирается из тиамина, ниацина и пиридоксина. Нуклеозиды, мононуклеотиды или динуклеотиды, в состав которых входят соединения семейства витаминов В, включают, например, нуклеозиды, мононуклеотиды или динуклеотиды, в состав которых входит молекула аденина или ниацина (никотиновой кислоты). В некоторых вариантах воплощения МВМ выбирается из аденозина, аденозиндифосфата (АДФ), флавин аденозин динуклеотида (ФАД, который содержит части витамина В2 и АДФ) и динуклеотид никотиновой кислоты.
В других вариантах воплощения МВМ включает аминокислоты. Примеры аминокислот включают, например, тирозин (например, L-тирозин), цистеин, фенилаланин (например, L-фенилаланин) и аланин. В некоторых вариантах воплощения аминокислотой является фенилаланин или аланин. В некоторых вариантах воплощения МВМ включает производные аминокислот, такие как 4-гидроксифенилпируват или ацетилглицин.
В некоторых вариантах воплощения МВМ является аналогом глюкозы, например молекулой глюкозы, где одна группа -ОН или -CH2OH замещена группой -СООН, -СОО или -NH2. Примеры аналогов глюкозы включают глюкозамин, глюциронид и глюкуронат.
В некоторых вариантах воплощения МВМ выбирается из соединений формулы (I)
где n является целым числом из 0 или 1;
R1, R2, R3 и R4, при их наличии, каждый независимо, выбираются из водорода и гидроксилаили R1 и R2 вместе с углеродом, к которому они присоединяются, образуют карбонильную (С=О) группу;
W является -СООН или -N(CH3)3 +;
X является водородом, отрицательно заряженным или катионом щелочного металла, такого как Na+ Понятно, что когда п равно О, CHR3 группа связана с заместителем W.
В некоторых вариантах воплощения W является -N(Gn3)3 +. В некоторых вариантах воплощения МВМ является карнитином, таким как L-карнитин.
В некоторых вариантах воплощения МВМ является дикарбоновой кислотой. В некоторых вариантах воплощения W является -СООН. В некоторых вариантах воплощения R3 является водородом. В некоторых вариантах воплощения n равно 0. В некоторых вариантах воплощения каждый из R1 и R2 независимо является водородом. В некоторых вариантах воплощения W является -СООН, R3 является водородом, n равно 0 и каждый из R1 и R2 независимо является водородом. В некоторых вариантах воплощения n равно 1. В некоторых вариантах воплощения R1 и R2 берутся вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуя карбонильную (С=О) группу. В некоторых вариантах воплощения R4 является водородом. В некоторых вариантах воплощения R4 является гидроксилом. В некоторых вариантах воплощения W является -СООН, R3 является водородом, n равно 1 и R1 и R2 берутся вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуя карбонильную (С=О) группу.
В некоторых вариантах воплощения МВМ является промежуточным продуктом цикла Кребса, излишки которого сдвигают цикл Кребса в сторону окислительного фосфорилирования. Примеры промежуточных продуктов цикла Кребса, которые являются МВМ, включают янтарную кислоту или сукцинат, яблочную кислоту или малат и α-кетоглутаровую кислоту или α-кетоглутарат.
В некоторых вариантах воплощения МВМ является строительным блоком CoQ10, который имеет следующую структуру:
Таким образом, строительные блоки CoQ10 включают, не ограничиваясь, фенилаланин, тирозин, 4гидроксифенилпируват, фенилацетат, 3-метокси-4-гидроксиманделат, ванилиновую кислоту, 4гидрокибензоат, мевалоновую кислоту, фарнезил, 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинон, а также их соответствующие кислоты или ионы. В некоторых вариантах воплощения МВМ выбирается из фенинлаланина, тирозина, 4-гироксифенилпирувата, фенилацетата и 4-гидроксибензоата.
(i) Способы идентификации МВМ.
В настоящем изобретении представлены способы идентификации МВМ. Способы идентификации МВМ включают, в целом, экзогенное добавление к клетке эндогенной молекулы и оценку действия на клетку, например на профиль микроокружения клетки, которое производит эндогенная молекула. Действие на клетку оценивается по следующим параметрам (один или несколько): клеточное строение, мРНК, белки, липиды и/или метаболический уровень, для идентификации изменений в профиле клеточной мик
- 14 034552 росреды. В одном варианте воплощения клетки являются культивируемыми клетками, например in vitro. В одном варианте воплощения клетки находятся в организме. Эндогенная молекула может быть добавлена в клетку в одной концентрации или может быть добавлена в клетку в различных концентрациях. В одном варианте воплощения эндогенная молекула добавляется к клеткам так, что уровень эндогенной молекулы в клетках поднимается (например, поднимается в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 раз или больше) по сравнению с уровнем эндогенной молекулы в контрольной клетке, не подвергавшейся воздействию.
Молекулы, которые вызывают изменение в клетке, как определяется по изменениям, например, в следующих параметрах (одному или нескольким): морфологии, физиологии и/или составу (например, мРНК, белки, липиды, метаболиты), могут, кроме того, оцениваться для определения, различаются ли вызываемые изменения в профиле клеточной микросреды между болезненным клеточным состоянием и нормальным клеточным состоянием. Клетки (например, линии клеточных культур) различного тканевого происхождения, клеточного типа или состояния, могут быть оценены путем сравнительной оценки. Например, изменения, вызванные в профиле клеточной микросреды раковой клетки, могут быть сравнимы с изменениями, вызванными в нераковой или нормальной клетке. Эндогенная молекула, которая, как наблюдается, вызывает изменения в профиле микросреды клетки (например, вызывает изменения в морфологии, физиологии и/или составу, например, мРНК, белки, липиды или метаболиты в клетке и/или различным образом (например, предпочтительно) вызывает изменения в профиле клеточной микросреды в болезенной клетке по сравнению с нормальной клеткой, идентифицируется как МВМ.
МВМ изобретения могут быть МВМ, имеющими липидную основу, или МВМ, не имеющими липидной основы. Способы идентификации МВМ, имеющих липидную основу, включают вышеописанные базовые клеточные способы, в которых имеющая липидную основу эндогенная молекула экзогенно добавляется к клетке. В предпочтительном варианте воплощения, имеющая липидную основу эндогенная молекула добавляется к клетке таким образом, что уровень имеющей липидную основу эндогенной молекулы в клетке повышается. В одном варианте воплощения уровень имеющей липидную основу эндогенной молекулы повышается в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 раз или больше по сравнению с уровнем в контрольных клетках, не подвергавшихся воздействию. Формула и доставка молекулы с липидной основой в клетку зависит от свойств каждой исследуемой молекулы, но многие способы известны специалистам. Примеры формулы и доставки молекул с липидной основой включают, не ограничиваясь, солюбилизацию ко-растворителями, молекулыпереносчики, липосомы, дисперсии, суспензии, дисперсии наночастиц, эмульсии, например эмульсии типа масло в воде или вода в масле, мультифазные эмульсии, например эмульсии типа масло в воде в масле, полимерный захват и инкапсуляцию. Доставка МВМ с липидной основой в клетку может быть подтверждена экстракцией клеточных липидов и количественным определением МВМ с помощью обычных способов, известных специалистам, таких как масс-спектрометрия.
Способы идентификации не имеющих липидной основы МВМ включают вышеописанные базовые клеточные способы, в которых не имеющая липидной основы эндогенная молекула экзогенно добавляется к клетке. В предпочтительном варианте воплощения не имеющая липидной основы эндогенная молекула добавляется к клетке таким образом, что уровень имеющей липидную основу эндогенной молекулы в клетке повышается. В одном варианте воплощения уровень не имеющей липидную основу эндогенной молекулы повышается в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 раз или больше по сравнению с уровнем в контрольных клетках, не подвергавшихся воздействию. Формула и доставка не имеющей липидной основы молекулы в клетку зависит от свойств каждой исследуемой молекулы, но многие способы известны специалистам. Примеры формулы и доставки не имеющих липидной основы молекул, включают, не ограничиваясь, солюбилизацию ко-растворителями, молекулы-переносчики, активный транспорт, полимерный захват или адсорбцию, полимерную прививку, липосомную инкапсуляцию, и композицию с направленными системами доставки. Доставка МВМ с липидной основой в клетку может быть подтверждена экстракцией клеточных липидов и количественным определением МВМ с помощью обычных способов, известных специалистам, таких как массспектрометрия.
2. Эпиметаболические переключатели (эпи-переключатели).
При использовании здесь, эпиметаболический переключатель (эпи-переключатель) является молекулой (эндогенной или экзогенной), которая модулирует метаболическое переключение от здорового (или нормального) состояния к болезненному состоянию и наоборот, тем самым поддерживая или восстанавливая здоровье клеток, тканей, систем и/или здоровье человека в целом. Эпи-переключатели способны к эффективной нормализации в тканевой микросреде. Например, эпи-переключатель включает любую молекулу, которая способна, при добавлении или извлечении из клетки, влиять на микросреду (например, на метаболический статус) клетки. Специалисты поймут, что под эпи-переключателем изобретения также может подразумеваться смесь из двух или более молекул, где смесь характеризуется одной или более из вышеупомянутых функций. Молекулы в смеси представлены в таком соотношении, что смесь действует как эпи-переключатель. Примеры эпи-переключателей включают, не ограничиваясь, coQ-10; витамин D3; ЕСМ компоненты, такие как фибронектин; иммуномодуляторы, такие как TNFa и
- 15 034552 любые интерлейкины, например IL-5, IL-12, IL-23; факторы ангиогенеза и факторы апоптоза.
В некоторых вариантах воплощения эпи-переключатель является энзимом, таким как энзим, который или прямо принимает участие в катализации одной или более реакций в цикле Кребса, или вырабатывает промежуточные продукты цикла Кребса, избыток которых запускает цикл Кребса. В некоторых вариантах воплощения энзим является энзимом неокислительной фазы пентозофосфатного пути, таким как трансальдолаза или транскетолаза. В других вариантах воплощения энзим является компонентом энзима или энзимного комплекса, который способствует циклу Кребса, таким как синтаза или лигаза. Примеры энзимов включают сукцинил СоА синтазу (энзим цикла Кребса) или пируват карбоксилазу (лигазу, которая катализирует обратимую карбоксилацию пирувата с образованием оксалоацетата (ОАА), промежуточного продукта цикла Кребса).
В некоторых вариантах воплощения эпи-переключатель является строительным блоком CoQ10. Строительные блоки CoQ10 включают, не ограничиваясь, фенилаланин, тирозин, 4гидроксифенилпируват, фенилацетат, 3-метокси-4-гидрокиманделат, ванилиновую кислоту, 4гидрокибензоат, мевалоновую кислоту, фарнезил, 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинон, а также их соответствующие кислоты или ионы. В некоторых вариантах воплощения эпи-переключатель выбирается из фенилаланина, тирозина, 4-гидроксифенилпирувата, фенилацетата и 4-гидроксибензоата.
В некоторых вариантах воплощения эпи-переключатель является соединением семейства витаминов В. В семейство витаминов В входят, например, рибофлавин (витамин В2) или его аналоги. Эпипереключатели также включают любые аналоги или неактивные формы лекарства, которые могут превращаться в ходе метаболизма in vivo в любые эндогенные МВМ, такие как описанные здесь.
В одном варианте воплощения эпи-переключатель является также МВМ. В одном варианте воплощения эпи-переключатель не является CoQ10. Специалисты в данной области могут обычным образом идентифицировать эпи-переключатели с помощью анализов, подробно описанных в настоящем документе.
(i) Способы идентификации эпи-переключателей.
Эпиметаболические переключатели (эпи-переключатели) являются молекулами, способными модулировать метаболический статус клетки, например вызывать метаболическое переключение со здорового (или нормального) состояния на болезненное состояние и наоборот, и тем самым способными поддерживать или восстанавливать здоровье клеток, тканей, органов, систем и/или здоровье человека в целом. Эпи-переключатели изобретения, таким образом, полезны для диагностической оценки болезненного состояния. Кроме того, эпи-переключатели изобретения полезны для терапевтических применений, где применение или введение эпи-переключателя (или модуляция эпи-переключателя другими терапевтическими молекулами) приводит к нормализации клеточной микросреды и болезненного состояния.
Идентификация эпи-метаболического переключателя включает, в общем, установление молекулярного профиля, например метаболитов, липидов, белков или РНК (их индивидуальные профили или в комбинации) для совокупности клеток или тканей, которые демонстрируют различные болезненные состояния, прогрессию или агрессивность. Молекула из профиля(ей), у которой изменение уровня (например, возрастание или уменьшение уровня) коррелирует с болезненным состоянием, прогрессией или агрессивностью, идентифицируется как потенцильный эпи-переключатель.
В одном варианте воплощения эпи-переключатель является также МВМ. Потенциальные эпипереключатели можно оценить по их способности проникать в клетки путем экзогенного присоединения к клетке при использовании любого количества обычных способов, известных специалистам в данной области, и при использовании любого способа, описанного здесь. Например, проникновение потенциального эпи-переключателя в клетку можно подтвердить экстракцией клеточного содержимого и оценкой количества потенциального эпи-переключателя обычными способами, известными специалистам в данной области, такими как масс-спектрометрия. Потенциальный эпи-переключатель, способный проникать в клетку, тем самым идентифицируется как МВМ.
Для идентификации эпи-переключателя, потенциальный эпи-переключатель затем оценивается по способности переключать метаболический статус клетки. Способность потенциальных эпипереключателей переключать метаболический статус клеточной микросреды оценивается по вхождению (например, экзогенному присоединению) в клетку потенциального эпи-переключателя и мониторингу в клетке одного или более признаков: изменений экспрессии генов (например, изменения в мРНК или экспрессии белков), изменений концентрации липидов или уровней метаболитов, изменений уровней биоэнергетичных молекул, изменений клеточной энергетики и/или изменений функции или числа митохондрий. Способность потенциальных эпи-переключателей переключать метаболический статус клеточной микросреды обычно может быть идентифицирована специалистом в данной области при использовании любого из способов, подробно описанных в настоящем документе. Потенциальные эпи-переключатели в дальнейшем оцениваются по способности переключать метаболический статус больной клетки в нормальное здоровое состояние (или, напротив, по способности переключать метаболический статус нормальной клетки на состояние болезни). Потенциальный эпи-переключатель, способный переключать метаболический статус больной клетки в нормальное здоровое состояние (или переключать метаболический статус нормальной клетки на состояние болезни), таким образом идентифицируется как эпи- 16 034552 переключатель. В предпочтительных вариантах воплощения эпи-переключатель не оказывает негативного влияния на здоровье и/или рост нормальных клеток.
Эпиметаболические переключатели изобретения включают, не ограничиваясь, низкомолекулярные метаболиты, молекулы с липидной основой и белки и РНК. Для идентификации метаболического переключателя в классе низкомолекулярных эндогенных метаболитов, устанавливаются метаболитные профили совокупности клеток или тканей, которые демонстрируют различные болезненные состояния, прогрессию или агрессивность. Метаболитный профиль для каждой клетки или ткани определяется путем экстракции метаболитов из клетки или ткани и последующих идентификации и количественной оценки метаболитов с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области, включающих, например, методы жидкостной хроматографии в совокупности с масс-спектрометрией или газовой хроматографии в совокупности с масс-спектрометрией. Метаболиты, у которых изменение уровня (например, возрастание или уменьшение уровня) коррелирует с болезненным состоянием, прогрессией или агрессивностью, идентифицируются как потенциальные эпи-переключатели.
Для идентификации эпи-метаболических переключателей в классе эндогенных молекул, имеющих липидную основу, устанавливаются липидные профили для совокупности клеток или тканей, которые демонстрируют различные болезненные состояния, прогрессию или агрессивность. Липидный профиль для каждой клетки или ткани определяется путем экстракции метаболитов из клетки или ткани и последующих идентификации и количественной оценки метаболитов с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области, включающих, например, методы жидкостной хроматографии в совокупности с масс-спектрометрией или газовой хроматографии в совокупности с массспектрометрией. Липиды, у которых изменение уровня (например, возрастание или уменьшение уровня основной массы или следов) коррелирует с болезненным состоянием, прогрессией или агрессивностью, идентифицируются как потенциальные эпи-переключатели.
Для идентификации эпиметаболических переключателей в классе белков и РНК, устанавливаются профили экспрессии генов для совокупности клеток или тканей, которые показывают различные болезненные состояния, прогрессию или агрессивность. Профиль экспрессии для каждой клетки или ткани определяется по уровню(ям) мРНК или белка с использованием стандартных протеомических методов, анализа мРНК или генома, например, подробно описанных в настоящем документе. Гены, у которых возрастание экспрессии (например, возрастание или уменьшение экспрессии мРНК или уровня белка) коррелирует с болезненным состоянием, прогрессией или агрессивностью, идентифицируются как потенциальные эпи-переключатели.
Когда молекулярные профили, описанные выше, установлены (например, для растворимых метаболитов, молекул с липидной основой, белков, РНК или других биологических классов соединений), проводятся анализы клеточных и биохимических путей обмена, для выявления известных связей между идентифицированными потенциальными эпи-переключателями в клеточной микросреде. Эта информация, полученная благодаря таким анализам клеточных и/или биохимических путей обмена, может быть использована для группирования путей обмена и потенциальных эпи-переключателей.
Полезность эпи-переключателя для модулирования болезненного состояния может быть в дальнейшем оценена и подтверждена специалистами с использованием любого из способов, известных специалистам в данной области или подробно описанных в настоящем документе. Полезность эпипереключателя для модулирования болезненного состояния может быть оценена путем прямой экзогенной доставки эпи-переключателя в клетку или в организм. Полезность эпи-переключателя для модулирования болезненного состояния может быть альтернативно оценена путем разработки молекул, которые прямо модулируют эпи-переключатель (например, уровень или активность эпи-переключателя). Полезность эпи-переключателя для модулирования болезненного состояния может также быть оценена путем разработки молекул, которые непрямо модулируют эпи-переключатель (например, уровень или активность эпи-переключателя) путем регулирования других молекул, таких как гены (например, регулируя РНК или уровень белка), включенных в тот же путь синтеза, что и эпи-переключатель.
Эпи-метаболитический подход, описанный здесь, способствует идентификации эндогенных молекул, которые существуют в клеточной микросреде и уровни которых чувствительны и контролируются генетически, мРНК, или основанными на белках механизмах. Обнаруженные в нормальных клетках регуляторные пути, которые запускаются эпи-переключателями настоящего изобретения, могут предоставлять терапевтическую ценность в разрегулированной или болезненной клеточной микросреде. Кроме того, эпи-метаболитический подход, описанный здесь, идентифицирует эпи-переключатели, которые могут предоставлять диагностический индикатор для использования в клиническом отборе пациентов, в наборах для диагностики болезней или как прогностический индикатор.
III. Анализы, используемые для идентификации МВМ/эпи-переключателей.
Приемы и способы настоящего изобретения, предназначенные для выделения и идентификации представляющих интерес молекул и соединений, включают, не ограничиваясь: жидкостную хроматографию (ЖХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), масс-спектрометрию (МС), газовую хроматографию (ГХ), жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию (ЖХ-МС), газовую хроматографию/масс-спектрометрию (ГХ-МС), ядерный магнитный резонанс (ЯМР), магнитную резонансную
- 17 034552 томографию (МРТ), инфракрасную спектрометрию с преобразованием Фурье (ПФ-ИК) и массспектрометрию с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС). Следует понимать, что техники массспектрометрии включают, не ограничиваясь, использование магнитных секторов и двухфокусных приборов, трансмиссионных квадрупольных приборов, квадрупольных приборов ионных ловушек, времяпролетных приборов (TOF), приборов ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FTMS), и времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF MS).
Количественное определение уровней биоэнергетических молекул.
Факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут быть идентифицированы по изменениям в уровнях клеточных биоэнергетических молекул (например, АТФ, пирувата, АДФ, НАДН, НАД, НАДФН, НАДФ, ацетилСоА, FADH2) в клетках, к которым применили возможный эпипереключатель. В типовых методах определения уровней биоэнергетичеких молекул используется колорометрия, флюоресценция и/или биолюминесцентные способы. Примеры таких способов приведены ниже.
Уровни АТФ внутри клетки могут быть оценены при помощи различных способов и систем, известных специалистам в данной области. Например, в одной системе цитоплазматическая АТФ, вышедшая из лизированных клеток, реагирует с люциферином и энзимом люциферазой, выделяя свет. Эта биолюминесценция подсчитывается на биолюминометре, и таким образом можно подсчитать концентрацию внутриклеточной АТФ (набор для анализа АТФ EnzyLight™ (ЕАТР-100), BioAssay Systems, Hayward, Калифорния). В другой системе, например, и АТФ, и ее дефосфорилированная форма, АДФ, подсчитываются с помощью биолюминесценции; после того как уровни АТФ подсчитаны, АДФ трансформируется в АТФ и затем определяется и подсчитывается с использованием той же люциферазной системы (набор для анализа отношения АДФ/АТФ ApoSENSOR™, BioVision Inc., Mountain View, Калифорния).
Пируват является важным промежуточным продуктом в клеточных путях обмена. Пируват может превращаться в углевод путем глюконеогенеза, превращаться в жирную кислоту или усваиваться при посредстве ацетил СоА или превращаться в аланин или этанол в зависимости от метаболического статуса клетки. Таким образом, определение уровней пирувата дает подсчет метаболической активности и статус клеточного образца. Один способ для определения пирувата, например, использует как колориметрию, так и флюорометрию для определения концентраций пирувата в различных диапазонах (набор для анализа пирувата EnzyChrom™ (Cat# EPYR-100), BioAssay Systems, Hayward, Калифорния).
Факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут влиять на процесс окислительного фосфорилирования, проходящий в митохондриях клеток, которые задействованы в образовании и поддержании биоэнергетических молекул в клетках. Кроме способов определения изменений в клеточной энергетике непосредственно в клеточных культурах и образцах (описанных выше), существуют способы, определяющие и подсчитывающие действия компонентов дискретных энзимов и комплексов митохондрий в клетках. Например, анализ полной активности OXPHOS MT-OXC MitoTox™ (MitoSciences Inc., Eugene, Орегон) может определять и подсчитывать действия соединений, примененных непосредственно к комплексам I-V, выделенным из митохондрий. Способы определения и подсчета действий индивидуальных митохондриальных комплексов, таких как НАДН дегидрогеназа (Комплекс I), цитохром с оксидаза (Комплекс IV) и АТФ синтаза (Комплекс V) также доступны (MitoSciences Inc., Eugene, Орегон).
Оценка клеточной энергетики.
Факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут также быть идентифицированы по изменениям в клеточной энергетике. Один пример оценки клеточной энергетики - оценка в реальном времени потребления молекулярного кислорода и/или изменений в рН среды клеточной культуры. Например, способность потенциального эпи-переключателя модулировать метаболический статус клетки может быть анализирована с использованием, например, XF24 Анализатора (Seahorse, Inc.). Эта технология позволяет в реальном времени определить изменение кислорода и рН в монослое клеток для того, чтобы оценить биоэнергетику клеточной микросреды. XF24 Анализатор подсчитывает и сравнивает показатель потребления кислорода (OCR), который является оценкой аэробного метаболизма и внеклеточного окисления (ECAR), который является оценкой гликолиза, и оба служат индикаторами клеточной энергетики.
Оценка окислительного фосфорилирования и митохондриальной функции.
Окислительное фосфорилирование - это процесс, путем которого АТФ образуется при окислении питательных соединений, осуществляющийся у эукариот благодаря белковым комплексам, встроенным в мембраны митохондрий. Поскольку окислительное фосфорилирование является основным источником АТФ в клетках большинства организмов, изменения активности окислительного фосфорилирования могут сильно видоизменить метаболизм и энергетический баланс в клетке. В некоторых вариантах воплощения изобретения факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут определяться и/или идентифицироваться благодаря своему действию на окислительное фосфорилирование. В некоторых вариантах воплощения факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут опреде- 18 034552 ляться и/или идентифицироваться благодаря своему действию на специфические аспекты окислительного фосфорилирования, включая, не ограничиваясь, цепь транспорта электронов и синтез АТФ.
Встроенные в мембрану белковые комплексы митохондрий, которые осуществляют процессы, участвующие в окислительном фосфорилировании, выполняют специфические задачи и имеют номера I, II, III и IV. Эти комплексы, вместе с проходящей сквозь мембрану АТФ-синтазой (также известной как комплекс V), являются ключевыми единицами, участвующими в процессах окислительного фосфорилирования. В дополнение к анализам, которые могут определить действия факторов влияния (например, МВМ или эпи-переключателей) на функцию митохондрий в общем и процессы окислительного фосфорилирования в частности, существуют анализы, которые можно использовать для определения действий эпи-перключателей на отдельный комплекс, выделенный из остальных комплексов.
Комплекс I, также известный как НАДН-коэнзим Q оксидоредуктаза или НАДХ дегидрогеназа, является первым белком в цепи транспорта электронов. В некоторых вариантах воплощения можно провести определение и подсчет действия эпи-переключателя на образование НАД' комплексом I. Например, комплекс может быть извлечен методом иммунного захвата из образца в 96-луночный планшет; окисление НАДН в НАД' происходит одновременно с восстановлением молекулы красителя, у которой коэффициент поглощения возрастает на 450 нМ (набор для микропланшетного анализа активности фермента комплекса I, MitoSciences Inc., Eugene, Орегон).
Комплекс IV, также известный как цитохором с оксидазой (ЦО), является последним белком в цепи транспорта электронов. В некоторых вариантах воплощения можно провести определение и подсчет действия эпи-переключателя на окисление цитохрома с и восстановление кислорода до воды комплексом IV. Например, ЦО можно извлечь путем иммуносорбции в микролуночный планшет и оценить окисление ЦО с помощью колориметрического анализа (набор для микропланшетного анализа активности фермента комплекса IV, MitoSciences Inc., Eugene, Орегон).
Последним ферментом в процессе окислительного фосфорилирования является АТФ-синтаза (комплекс V), которая использует протонный градиент, созданный другими комплексами, для синтеза АТФ из АДФ. В некоторых вариантах воплощения можно провести определение и подсчет действия эпипереключателя на активность АТФ. Например, активность и количество АТФ-синтазы в образце также можно оценить по АТФ-синтазе, которую извлекают путем иммуносорбции в микролуночный планшет. Фермент при определенных условиях может функционировать также как АТФ-аза, таким образом в этом анализе активности АТФ-синтазы в степень, в которой АТФ редуцируется до АДФ, оценивается по определению одновременного окисления НАДН до НАД'. Количество АТФ подсчитывается с использованием меченого антитела к АТФ-азе (набор для микропланшетного двойного анализа АТФ-синтазы (активность + количество), MitoSciences Inc., Eugene, Орегон). Дополнительные анализы окислительного фосфорилирования включают анализы, которые определяют действие на активность комплексов II и III. Например, система полного OXPHOS МТ-ОХС MitoTox™ (MitoSciences Inc., Eugene, Орегон) может использоваться для оценки действия соединения на комплексы II и III, а также комплексы I, IV и V, для предоставления данных о действии соединения на всю систему окислительного фосфорилирования.
Как замечено выше, наблюдение в реальном времени образцов интактных клеток может быть проведено с использованием проб на изменение содержания кислорода и рН в клеточной культуральной среде. Эти анализы клеточной энергетики дают широкое представление о митохондриальной функции и действиях потенциальных факторов влияния (например, МВМ или эпи-переключателей) на активность митохондрий в клетках образца.
Факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут также действовать на митохондриальную проницаемость (МРТ), явление, заключающееся в том, что проницаемость митохондриальных мембран возрастает вследствие образования митохондриальных проницаемых транзитных пор (МРТР). Возрастание митохондриальной проницаемости может приводить к разбуханию митохондрий, неспособности осуществлять окислительное фосфорилирование с образованием АТФ и к гибели клетки. МРТ может участвовать в индукции апоптозов (см., например, Halestrap, A.P., Biochem. Soc. Trans. 34:232-237 (2006) и Lena, A. et al. JouPHKl of Translational Med. 7:13-26 (2009), полное описание которого включено в настоящую заявку путем ссылки).
В некоторых вариантах воплощения осуществляются детекция и количественный подсчет действия фактора влияния (например, МВМ или эпи-переключателя) на образование, прекращение и/или действие МРТ и МРТР. Например, аналитические исследования могут определить МРТ благодаря использованию специальных молекул красителя (кальцеина), локализующихся во внутренней мембране митохондрий и других клеточных структур. Использование другой молекулы, CoCl2, служит для подавления флюоресценции красителя кальцеина в цитозоле. CoCl2, однако, не может иметь доступ внутрь митохондрий, таким образом флюоресценция в митохондриях не подавляется, пока не появляется МРТ и CoCl2 не получает возможность попадать внутрь митохондрий благодаря МРТР. Потеря митохондриальноспецифичного флюоресцентного сигнала говорит о наличии МРТ. Проточная цитометрия может быть использована для оценки флюоресценции в клетках и органеллах (набор для анализа переходных пор MitoProbe™, Molecular Probes, Eugene, Орегон). В дополнительных анализах используется флюоресцент- 19 034552 ный микроскоп для оценки экспериментальных результатов (набор для анализа митохондриальных переходных пор Image-iT™ LIVE, Molecular Probes, Eugene, Орегон).
Измерение клеточной пролиферации и воспалительной реакции.
В некоторых вариантах воплощения изобретения факторы влияния (например, МВМ или эпипереключатели) могут быть идентифицированы и оценены по их действию на образование или активность молекул, связанных с клеточной пролиферацией и/или воспалительной реакции. Эти молекулы включают, не ограничиваясь, цитокины, факторы роста, гормоны, компоненты внеклеточного матрикса, хемокины, нейропептиды, нейротрансмиттеры, нейротрофины и другие молекулы, участвующие в клеточном сигналинге, а также внутриклеточные молекулы, такие как те, которые участвуют в сигнальной трансдукции.
Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является фактором роста с потенциальными ангиогенезными, васкулогенными и митогенными свойствами. VEGF стимулирует проницаемость и разбухание эндотелия, и действие VEGF связано с многочисленными болезнями и расстройствами, включая ревматоидные артриты, метастазирующий рак, возрастную дегенерацию макулы и диабетическую ретинопатию.
В некоторых вариантах воплощения изобретения фактор влияния (например, МВМ или эпипереключатель) может быть идентифицирован и охарактеризован по его действию на образование VEGF. Например, клетки, существующие в условиях гипоксии или имитации ацидоза, будут показывать возрастание VEGF образования. VEGF, выделяемый в среду, может быть исследован с использованием ELISA или других основанных на антителах анализах, с использованием имеющихся в продаже анти-VEGF антител (R&D Systems, Minneapolis, Миннесота). В некоторых вариантах воплощения изобретения эпипереключатель может быть идентифицирован и и/или описан на основе его действия(й) на реакцию клеток на VEGF и/или на основе его действия(й) на экспрессию или активность VEGF рецептора.
Фактор некроза опухолей (TNF), задействованный как в работе здоровой иммунной системы, так и при аутоиммунных болезнях, является ключевым медиатором при воспалении и активности иммунной системы. В некоторых вариантах воплощения изобретения эпи-переключатель может быть идентифицирован и характеризован по его влиянию на образование или активность TNF. Например, TNF, образующийся в культивируемых клетках и секретируемый в среду, может быть подсчитан с использованием иммуноферментного твердофазного анализа и других основанных на антителах способах, известных специалистам. Кроме того, в некоторых вариантах воплощения фактор влияния может быть идентифицирован и охарактеризован по его действию(ям) на экспрессию рецептора к (Human TNF RI Duoset, R&D Systems, Minneapolis, Миннесота).
Компоненты внеклеточного матрикса (ЕСМ) играют роль как в структуре клеток и тканей, так и в процессах сигналинга. Например, латентный трансформирующий фактор роста бета связывается с белками, являющимися компонентами ЕСМ, что создает резервуар трансформирующего фактора роста бета(TGFP) внутри ЕСМ. Матрикс-связывающий TGFP может высвобождаться во время процессов трансформации матрикса и может влиять на действие фактора роста на близлежащие клетки (Dallas, S. Methods in Mol. Biol. 139:231-243 (2000)).
В некоторых вариантах воплощения фактор влияния (например, МВМ или эпи-переключатель) может быть идентифицирован и охарактеризован по его действию на образование ЕСМ в культивируемых клетках. У исследователей есть полноценные технологии, благодаря которым можно исследовать и количественно определить образование ЕСМ в клетках, а также состав ЕСМ. Например, синтез ЕСМ в клетках можно оценить, внедряя клетки в гидрогель перед инкубацией. Биохимические и другие анализы проводились на ЕСМ, образованном клетками после сбора клеток и расщепления в гидрогеле (Strehin, I. и Elisseeff, J. Methods in Mol. Bio. 522:349-362 (2009)).
В некоторых вариантах воплощения может быть идентифицировано или охарактеризовано действие фактора влияния (например, МВМ или эпи-переключателя) на образование, наличие или отсутствие ЕСМ или одного из его компонентов в организме. Разработаны техники для получения мышей с заданным нокаутом генов, которые позволяют нокаутировтаь определенные ЕСМ гены только в отдельных типах клеток или на определенных стадиях развития (Brancaccio, M. et al. Methods in Mol Bio. 522:15-50 (2009)). Таким образом можно оценить действие применения или введения эпи-переключателя или потенциального эпи-переключателя на активность или отсутствие определенных ЕСМ компонентов в определенных тканях на определенных стадиях развития.
Измерение целостности плазматической мембраны и гибели клеток.
Факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут быть идентифицированы по изменениям целостности плазматической мембраны в клеточном образце и/или по изменениям числа или проницаемости клеток, которые подвержены апоптозам, некрозам или клеточным изменениям, которые демонстрируют повышенную или пониженную вероятность гибели клеток.
Анализ лактатдегидрогеназы (LDH) может дать оценку клеточного статуса и уровней повреждения. LDH является стабильным и сравнительно обильным цитоплазматическим ферментом. Когда плазматическая мембрана теряет физическую целостность, LDH выходит в межклеточное пространство. Более высокие концентрации LDH коррелируют с более высокими уровнями повреждения плазматической
- 20 034552 мембраны и гибели клеток. Примеры анализов LDH включают анализы, которые используют колориметрическую систему для определения и количественного подсчета уровней LDH в образце, а восстановленная форма тетразоловой соли образуется при активности фермента LDH (набор лактат-дегидрогеназы
QuantiChrom™ (DLDH-100), BioAssay Systems, Hayward, Калифорния; набор определения цитотоксичности LDH, Clontech, Mountain View, Калифорния).
Апоптоз - это процесс программируемой гибели клеток, который может начинаться с множества различных событий. Изменения скорости и/или числа клеток, которые подверглись апоптозам, можно определять с помощью различных анализов. Одним типом анализа, который используется для детекции и количественного определения апоптозов, является каспазный анализ. Каспазы - это цистеинпротеназы, специфичные для аспаргиновой кислоты, которые активируются при протеолитическом расщеплении во время апоптоза. Примеры анализов, которые определяют активированные каспазы, включают аналитические системы PhiPhiLux® (Oncolmmunin, Inc., Gaithersburg, Мэриленд) и Caspase-Glo® 3/7 (Promega Corp., Madison, Висконсин). Дополнительные анализы, которые могут определить апоптозы и изменения процента или числа клеток, подвергшихся апоптозу в сравниваемых образцах, включают TUNEL/ДНК фрагментационные анализы. Эти анализы определяют от 180 до 200 пар оснований ДНК фрагментов, образовавшихся в ядре во время фазы апоптоза. Примеры TUNEL/ДНК фрагментационных анализов включают набор для определения гибели клеток in situ (Roche Applied Science, Indianapolis, Индиана) и TUNEL колориметрические и флюорометрические системы DeadEnd™ (Promega Corp., Madison, Висконсин).
Некоторые апоптозные анализы детектируют и делают количественную оценку белков, связанных с апоптозами и/или неапоптозным состоянием. Например, мультиплексный анализ цитотоксичности MultiTox-Fluor (Promega Corp., Madison, Висконсин) использует один субстрат, флюоресцентную систему для детекции и подсчета протеаз, специфичных для живых и мертвых клеток, тем самым оценивая отношение живых клеток и клеток, подвергшихся апоптозу, в образце клеток или тканей.
В продаже имеются дополнительные способы детекции и количественной оценки апоптозов, которые включают анализы, определяющие клеточную проницаемость (например, анализ апоптоза APOPercentage™, Biocolor, Великобритания) и анализы для Annexin V (например, набор для определения апоптоза Annexin V-Biotin, BioVision Inc., Mountain View, Калифорния).
IV. Лечение онкологических заболеваний.
В настоящем изобретении представлены способы лечения или профилактики онкологического заболевания у человека, включая введение фактора влияния человеку в количестве, достаточном для лечения или профилактики онкологического заболевания, тем самым леча или предотвращая онкологическое заболевание. В одном варианте воплощения фактор влияния не является CoQ10.
При использовании здесь, онкологическое заболевание относится ко всем типам рака или неоплазмы или злокачественных опухолей, находимых у людей, включающих, не ограничиваясь, лейкемии, лимфомы, меланомы, карциномы и саркомы.
Используемые здесь термины или словосочетания онкологическое заболевание, рак, неоплазма и опухоль используются взаимозаменяемо и или в единственной, или во множественной форме относятся к клеткам, которые подверглись злокачественной трансформации, которая сделала их патологичными для организма носителя. Первичные раковые клетки (то есть клетки, близкие к злокачественной трансформации) можно легко отличить от нераковых клеток с помощью хорошо известных техник, в частности при гистологическом исследовании. Определение раковой клетки, используемое здесь, включает не только первичные раковые клетки, но также стволовые раковые клетки, а кроме того предраковые клетки или любые клетки, образовавшиеся от предшественника раковой клетки. Это включает метастазировавшие раковые клетки, и культуры in vitro и клеточные линии, образовавшиеся от раковых клеток. Если речь идет о типе рака, который обычно проявляется как солидная опухоль, клинически определяемая опухоль является опухолью, которая определяется на основании массы опухоли, например, с помощью таких процедур, как компьютерная томография, МР-томография, рентген, ультразвуковое обследование или пальпация, и/или которая определяется на основании экспрессии одного или более ракоспецифичных антигенов в образце, взятом от пациента.
Термин саркома в общем относится к опухоли, которая состоит из субстанции, подобной эмбриональной соединительной ткани, и как правило состоит из тесно лежащих клеток в фибриллярной или гомогенной субстанции. Примеры сарком, которые можно лечить фактором влияния настоящего изобретения, включают, не ограничиваясь, хондросаркому, фибросаркому, лимфосаркому, меланосаркому, миксосаркому, остеосаркому, саркому Эйбмети, злокачественную липому, липосаркому, альвеолярную саркому мягких тканей, амеобластосаркому, ботриоидную саркому, хлорому, хориокарциному, эмбриональную саркому, саркому опухоли Вильмса, эндометриальную саркому, стромальную саркому, саркому Юинга, фасциальную саркому, фибробластическую саркому, злокачественную остеобластокластому, гранулоцитарную саркому, саркому Ходжкина, идиопатическую множественную геморрагическую саркому, иммунобластическую саркому В-клеток, лимфому, иммунобластическую саркому Т-клеток, саркому Йенсена, саркому Калоши, саркому клеток Купфера, ангиосаркому, лейкосаркому, злокачествен- 21 034552 ную мезензимому саркому, паростальную саркому, ретикулоцитную саркому, саркому Рауса, сероцитозную саркому, синовиальную саркому и телеангиэктактическую саркому.
Термин меланома употребляется для обозначения опухоли, образующейся из меланоцитарной системы кожи и других органов. Меланомы, которые можно лечить факторами влияния изобретения, включают, не ограничиваясь, например, акральную ленгтигинозную меланому, амеланотическую меланому, эпителиоидный невус, меланому Клаудмана, меланому S91, меланому Гардинга-Пасси, ювенильную меланому, предраковый меланоз, злокачественную меланому, узловатую меланому, субунгалную меланому и поверхностную распространенную меланому.
Термин карцинома относится к злокачественным новообразованиям, состоящим из эпителиальных клеток, которые имеют тенденцию проникать в окружающие ткани и образовывать метастазы. Карциномы, которые можно лечить факторами влияния настоящего изобретения, включают, не ограничиваясь, например, ацинарную карциному, ацинозную карциному, аденокистозную карциному, железистокистозную карциному, карциному аденоматозум, карциному коры надпочечников, альвеолярную карциному, альвеолярно-клеточную карциному, базально-клеточную карциному, базоцеллюлярную карциному, базальную карциному, плоскоклеточную базальную карциному, бронхиоальвеолярную карциному, бронхиолярную карциному, бронхогенную карциному, медуллярную карциному, холангиогенную карциному, хорионкарциному, коллоидную карциному, комедокарциному, карциному тела матки, решетчатую карциному, карциному плевры, карциному кожи, цилиндрическую карциному, карциному цилиндрических клеток, протоковую карциному, твердую карциному, эмбриональную карциному, круглоклеточную карциному, эпиермоидную карциному, эпителиальную карциному аденоидов, экзофитную карциному, рак из язвы, карциному фиброзум, перстневидно-клеточную карциному, слизеобразующую карциному, гигантоклеточную карциному, железистую карциному, гранулезоклеточную карциному, пиломатрикс карцинома, гематоидную карциному, гепатоцеллюлярную карциному, карциному клеток Гюртле, гиалиновую карциному, гипернефроидную карциному, инфантильную эмбриональную карциному, карциному in situ, интраэпидермальную карциному, интраэпителиальную карциному, карциному Кромпехера, карциному клеток Кульчитского, крупноклеточную карциному, карциному хрусталика, хрусталиковую карциному, липоматозную карциному, лимфоэпителиальную карциному, медуллярную карциному, мозговидную карциному, меланотическую карциному, мягкую карциному, мукоидную карциному, карциному муципарум, мукоцеллюлярную карциному, мукоэпидермоидную карциному, карциному мукозум, слизистую карциному, карциному миксоматодес, носоглоточную карциному, овсяно-клеточную карциному, карциному оссификанс, остеоидную карциному, папиллярную карциному, перипортальную карциному, преинвазивную карциному, карциному шиловидных клеток, слизеобразующую карциному, почечноклеточную карциному, карциному резервных клеток, саркомоподобную карциному, шнейдериановскую карциному, фиброзную карциному, карциному скроти, перстневидноклеточную карциному, недифференцированную карциному, мелкоклеточную карциному, соланоид карциному, карциному сферических клеток, веретоноклеточную карциному, губчатую карциному, плоскоклеточную карциному, стринг карциному, карциному телангиектатикум, карциному телангиектодес, переходно-клеточную карциному, карциному туберозум, туберозную карциному, бородавчатую карциному и карциному виллозум.
Как правило, фактор влияния может быть использован для профилактического или терапевтического лечения любой неоплазмы. В одном варианте воплощения факторы влияния настоящего изобретения используются для лечения солидных опухолей. В различных вариантах воплощения изобретения фактор влияния (например, CoQ10) используется для лечения различных типов рака кожи (например, плоскоклеточной карциномы или базальноклеточной карциномы), рака печени, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака простаты, рака печени или рака костей. В одном варианте воплощения фактор влияния, например CoQ10, используется для лечения онкологического заболевания кожи, включающего, не ограничиваясь, плоскоклеточные карциномы (включая SCCIS (in situ) и более агрессивные плоскоклеточные карциномы), базальноклеточные карциномы (включая поверхностные, узелковые и инфильтратные базальноклеточные карциномы), меланомы и актинические кератозы. Однако лечение использованием фактора влияния не ограничивается вышеперечисленными типами рака. Примеры раков, поддающихся лечению фактором влияния, включают, не ограничиваясь, рак мозга, головы и шеи, простаты, молочной железы, семенников, поджелудочной железы, печени, кишечника, мочевого пузыря, почек, легких, немелкоклеточный рак легких, меланому, мезотелиому, рак матки, шейки матки, яичников, саркому, рак костей, желудка и медуллобластому.
Дополнительные примеры раков, которые можно лечить фактором влияния настоящего изобретения, включают, например, болезнь Ходжкина, неходжскинскую лимфому, множественную миелому, нейробластому, рак молочной железы, рак яичника, рак легких, рабдомиосаркома, первичный тромбоцитоз, первичная макроглобулинемия, мелкоклеточные легочные опухоли, первичные опухоли мозга, рак желудка, рак кишечника, злокачественную инсуланому поджелудочной железы, злокачественный карциноид, рак мочевого пузыря, предраковые повреждения кожи, рак семенников, лимфомы, рак щитовидной железы, нейробластому, рак пищевода, рак мочеполового тракта, злокачественную гиперкалцемию, рак шейки матки, рак эндометрия, рак коры надпочечников и рак простаты. В одном варианте воплощения онкологическое заболевание или рак, который можно лечить фактором влияния, например, CoQ10, не
- 22 034552 является меланомой.
Настоящее изобретение, кроме того, предоставляет способы лечения или профилактики онкологического заболевания у людей, включающие выявление людей, подверженных онкологическому заболеванию, и введение вышеупомянутым людям терапевтически эффективного количества фактора-В, способного блокировать анаэробное использование глюкозы и усиливать митохондриальное окислительное фосфорилирование, тем самым леча или предотвращая онкологическое заболевание.
Следует понимать, что определение раковой клетки, используемое здесь, включает раковую клетку, которая вырабатывает энергию путем анаэробного гликолиза (например, гликолиза, за которым следует ферментация молочной кислоты в цитозоле), аэробный гликолиз или митохондриальное окислительное фосфорилирование (например, гликолиз, за которым следует окисление пирувата в митохондриях) или комбинацию анаэробного гликолиза и аэробного гликолиза. В одном варианте воплощения раковая клетка вырабатывает энергию преимущественно путем анаэробного гликолиза (например, не менее 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более энергии клетки вырабатывается путем анаэробного гликолиза). В одном варианте воплощения, раковая клетка вырабатывает энергию преимущественно путем аэробного гликолиза (например, не менее 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более энергии клетки вырабатывается путем аэробного гликолиза). Следует также понимать, что определение раковой клетки, используемое здесь, включает популяцию раковых клеток или смесь раковых клеток, включающее клетки, которые вырабатывают энергию путем анаэробного гликолиза и клетки, которые вырабатывают энергию путем аэробного гликолиза. В одном варианте воплощения, популяция раковых клеток включает преимущественно клетки, которые вырабатывают энергию путем анаэробного гликолиза (например, не менее 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более клеток в популяции вырабатывают энергию путем анаэробного гликолиза). В одном варианте воплощения, популяция раковых клеток включает преимущественно клетки, которые вырабатывают энергию путем аэробного гликолиза (например, не менее 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более клеток в популяции).
Используемое здесь словосочетание анаэробное использование глюкозы или анаэробный гликолиз или гликолизный путь обмена относится к клеточному вырабатыванию энергии путем гликолиза, следующего после молочнокислой ферментации в цитозоле. Например, многие раковые клетки вырабатывают энергию путем анаэробного гликолиза.
Используемое здесь словосочетание аэробный гликолиз или митохондриальное окислительное фосфорилирование относится к клеточному вырабатыванию энергии путем гликолиза, следующего после окисления пирувата в митохондриях.
Используемая здесь фраза может блокировать анаэробное использование глюкозы и усиливать митохондриальное окислительное фосфорилирование или переключать с гликолизного пути обмена на митохондриальное окислительное фосфорилирование относится к способности фактора влияния (например, эпиметаболического переключателя) вызывать переключение или изменение в метаболическом статусе клетки от анаэробного гликолиза к аэробному гликолизу или митохондриальному окислительному фосфорилированию. При использовании здесь, переключение (с гликолиза на митохондриальное окислительное фосфорилирование) относится к снижению энергетической зависимости от гликолизного пути обмена, предпочтительно к уровню, наблюдаемому в нормальных клетках. Абсолютный уровень митохондриального окислительного фосфорилирования также может уменьшаться или снижаться, но предпочтительно в сочетании с повышением эффективности митохондриального окислительного фосфорилирования.
В некоторых вариантах воплощения изобретения онкологическое заболевание, подвергающееся лечению, не является заболеванием, которое обычно лечится местным введением с ожиданием системной доставки активного агента в терапевтически эффективных уровнях. При использовании здесь, фраза не является заболеванием, которое обычно лечится местным введением относится к онкологическим заболеваниям, которые не лечатся обычно или стандартно терапевтическим агентом посредством местного введения, но обычно лечатся терапевтическим агентом посредством, например, внутривенного введения. Онкологические заболевания, обычно не лечащиеся посредством местного введения, включают, не ограничиваясь, рак молочной железы, рак простаты, рак печени, рак поджелудочной железы и рак костей.
В настоящем изобретении также представлен способ лечения или профилактики агрессивного онкологического заболевания у людей, включающий введение фактора влияния человеку в выбранной более низкой дозе, чем в дозах, используемых или выбираемых для менее агрессивных или неагрессивных онкологических заболеваний, тем самым леча или предотвращая агрессивное онкологическое заболевание. В связанном аспекте изобретения представлен способ лечения или профилактики неагрессивного онкологического заболевания у человека, включающего введение фактора влияния человеку в выбранной более высокой дозе, чем в дозах, используемых или выбираемых для агрессивных онкологических заболеваний, тем самым леча или предотвращая неагрессивное онкологическое заболевание.
Используемый здесь термин агрессивное онкологическое заболевание относится к онкологическому заболеванию, включающему быстро растущую опухоль. Агрессивное онкологическое заболевание обычно не реагирует или плохо реагирует на терапевтическое лечение. Примеры агрессивных онкологических заболеваний включают, не ограничиваясь, карциному поджелудочной железы, гепатоцеллюляр- 23 034552 ную карциному, саркому Юинга, метастазирующий рак молочной железы, метастазирующую меланому, рак мозга (астроцитома, глиобластома), андроген-независимый рак простаты, рак яичников и неходжкинскую лимфому.
При использовании здесь, термин неагрессивное онкологическое заболевание относится к онкологическому заболеванию, включающему медленно растущую опухоль. Неагрессивное онкологическое заболевание обычно хорошо или средне реагирует на терапевтическое лечение. Примеры неагрессивных онкологических заболеваний включают, не ограничиваясь, неметастазирующий рак груди, андрогензависимый рак простаты, мелкоклеточный рак легких и острую лимфоцитную лейкемию. В одном варианте воплощения неагрессивные онкологические заболевания включают любое онкологическое заболевание, которое не является агрессивным онкологическим заболеванием.
Выбранная более низкая дозировка CoQ10 для лечения агрессивных онкологических заболеваний должна включать дозы ниже, чем в дозовом режиме, который обычно используется или выбирается для менее агрессивных или неагрессивных онкологических заболеваний. В различных вариантах воплощения выбранная более низкая доза CoQ10, которая около 1,5, около 2, около 3, около 4, около 5 или около 10 раз ниже, чем в дозовом режиме, который обычно используется или выбирается для менее агрессивных или неагрессивных онкологических заболеваний. Следует понимать, что выбранная более низкая дозировка CoQ10 включает также более короткое время лечения (например, в 1,5, 2, 3, 4, 5 или 10 раз более короткое время лечения) CoQ10 или менее частое введение (например, наполовину менее частое, в 3, 4, 5, 10, 20 или 24 раза менее частое) CoQ10 по сравнению с временем лечения или протоколами введения, используемыми или выбранными для менее агрессивных или неагрессивных онкологических заболеваний. В различных вариантах воплощения, выбранная более низкая дозировка коэнзима Q10 для лечения агрессивных онкологических заболеваний включает от около 0,0001 до около 5,0, от около 0,001 до около 1,0, от около 0,001 до около 0,5, от около 0,001 до около 0,4, от около 0,001 до около 0,30, от около 0,001 до около 0,25, от около 0,001 до 0,20, от около 0,001 до около 0,12 или от около 0,001 до около 0,09 мг CoQ10 на 1 см2 кожи. В других вариантах воплощения, коэнзим Q10 применяется к целевой ткани в дозе около 0,0001, 0,001, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24, 0,25, 0,26, 0,27, 0,28, 0,29, 0,30, 0,31, 0,32, 0,33, 0,34, 0,35, 0,36, 0,37, 0,38, 0,39, 0,40, 0,41, 0,42, 0,43, 0,44, 0,45, 0,46, 0,47, 0,48, 0,49 или 0,5 мг CoQ10 на 1 см2 кожи. Следует понимать, что интервалы, для которых любое из этих значений выше или ниже границ, также рассматриваются как часть этого изобретения, например, от около 0,005 до около 0,09 мг CoQ10 на 1 см2 кожи.
Выбранная более высокая дозировка CoQ10 для лечения неагрессивных онкологических заболеваний должна включать дозы выше, чем в дозовом режиме, который обычно используется или выбирается для агрессивных онкологических заболеваний. В различных вариантах воплощения изобретения, выбранная более высокая доза CoQ10 в около 1,5, около 2, около 3, около 4, около 5 раз или около 10 раз выше, чем в дозовом режиме, который обычно используется или выбирается для агрессивных онкологических заболеваний. Следует понимать, что выбранная более высокая дозировка CoQ10 включает также более продолжительное время лечения (например, в 1,5, 2, 3, 4, 5 раз или 10 раз более продолжительное время лечения) CoQ10 или более частое введение (например, в 1,5, в 2, в 3, 4, 5, 10, 20 раз или 24 раза более частое) CoQ10 по сравнению со временем лечения или протоколом введения, обычно используемым или выбранным для агрессивных онкологических заболеваний. В различных вариантах воплощения, выбранная более высокая дозировка коэнзима Q10 для лечения агрессивного онкологического заболевания включает от около 0,001 до около 10,0, от около 0,005 до около 10,0, от около 0,01 до около 10,0, от около 0,05 до около 5,0, от около 0,05 до около 2,0, от около 0,05 до около 1,0, от около 0,05 до около 0,7, от около 0,10 до около 0,50 или от около 0,12 до 0,5 мг CoQ10 на 1 см2 кожи. В других вариантах воплощения, коэнзим Q10 применяется к целевой ткани в дозе около 0,001, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24, 0,25, 0,26, 0,27, 0,28, 0,29, 0,30, 0,31, 0,32, 0,33, 0,34, 0,35, 0,36, 0,37, 0,38, 0,39, 0,40, 0,41, 0,42, 0,43, 0,44, 0,45, 0,46, 0,47, 0,48, 0,49, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мг CoQ10 на 1 см2 кожи. Следует понимать, что что интервалы, для которых любое из этих значений выше или ниже границ, также рассматриваются как часть этого изобретения, например, от около 0,15 до около 0,5 мг CoQ10 на 1 см2 кожи.
В одном варианте воплощения, фактор влияния настоящего изобретения уменьшает размер опухоли, ингибирует рост опухоли и/или продлевает время выживания субъекта, имеющего опухоль. Соответственно настоящее изобретение также относится к способу лечения опухолей у людей или других животных путем введения таким людям или животным эффективного, нетоксичного количества фактора влияния. Специалист в данной области сможет, путем обычного эксперимента определить, какое эффективное, нетоксичное количество фактора влияния требуется для целей лечения злокачественных опухолей. Например, терапевтически активное количество фактора влияния может варьировать в соответствии с такими факторами, как стадия болезни (например, стадия I по сравнению со стадией IV), возрастом, полом, медицинскими проблемами (например, иммуноподавляющие условия или болезни) и весом пациента, и способностью фактора влияния вызывать желаемую реакцию у пациента. Дозовый режим может быть отрегулирован для получения оптимальной терапевтической реакции. Например, несколько раз- 24 034552 дельных доз могут вводиться ежедневно или доза может быть пропорционально уменьшена, если это показано при острой необходимости терапевтической ситуации.
V. Терапевтические мишени при онкологических заболеваниях.
В настоящем изобретении представлены способы идентификации терапевтических мишеней при онкологических заболеваниях. В изобретении также представлены терапевтические мишени, идентифицированные такими способами. Идентификация терапевтической цели включает, в общем, экзогенное применение фактора-В или возможного фактора-В на клетку или группу клеточных линий, и последующую оценку изменений, вызванных в подвергшейся воздействию клетке по сравнению с контрольной клеткой, не подвергавшейся воздействию. Вызванные клеточные изменения, которые прослеживаются, включают, не ограничиваясь, изменения морфологии, физиологии или состава, например, уровня РНК, белков, жиров или метаболитов, в клетке. Вызванные клеточные изменения как результат воздействия возможного фактора-В можно проследить с использованием любого из анализов, описанных в настоящем документе. Например, изменения экспрессии генов по уровню мРНК можно оценить по методу ПНР в режиме реального времени, в котором изменения в экспрессии генов, влияющие на уровень белка, можно проследить с использованием антительных микропанелей и 2-D гель-электрофореза. Гены, идентифицированные как модулированные возможным факторов-В (например, по мРНК и/или уровню белка) затем оценивались по перспективе системной биологии с использованием анализа метаболизма (программа Ingenuity IPA) и при изучении известной литературы. Гены, идентифицированные как потенциальные терапевтические мишени, затем проходили подтверждающий анализ, такой как иммуноблоттинг, нокаут миРНК или рекомбинантные методы, основанные на выработке и характеристике белка. Затем для идентификации модуляторов мишеней можно использовать скрининговые анализы. Модуляторы терапевтических мишеней полезны как новые терапевтические агенты для онкологических заболеваний. Модуляторы терапевтических мишеней можно обычным образом идентифицировать с использованием скрининговых анализов, детально описанных в настоящем документе, или с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области техники.
Гены, идентифицированные здесь как модулированные (например, положительно или отрицательно модулированные, по мРНК или уровню белка) посредством МВМ/эпи-переключателя, CoQ10, являются мишенями для лекарства изобретения. Мишени для лекарства изобретения включают, не ограничиваясь, гены, перечисленные здесь ниже в табл. 1-28. Основанные на результатах экспериментов, описанных здесь в приложениях, ключевые белки, модулированные Q10, связаны с или могут быть классифицированы по различным путям обмена или группам молекул, включая факторы транскрипции, апоптозный ответ, пентозофосфатный путь, путь биосинтеза, окислительный стресс (про-окиданты), мембранные перестройки и метаболизм окислительного фосфорилирования. На основании полученных здесь результатов ключевыми белками, модулируемыми CoQ10, являются следующие. Ключевой белок, модулируемый CoQ10 и являющийся трансприпционным фактором, HNF4альфа. Ключевые белки, модулируемые CoQ10 и связанные с апоптозным ответом, включают Bcl-xl, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2L11 (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, и сМус. Ключевой белок, модулируемый CoQ10 и связанный с пентозофосфатным путем, является трансальдолазой 1. Ключевые белки, модулируемые CoQ10 и связанные с путями биосинтеза, включают COQ1, COQ3, COQ6, пренилтрансферазу и 4-гидроксибензоат. Ключевые белки, модулируемые CoQ10 и связанные с окислительным стрессом (прооксиданты), включают нейтрофильный цитоплазматический фактор 2, синтазу оксида азота 2А и супероксиддисмутазу 2 (митохондриальную). Ключевые белки, модулируемые CoQ10 и связанные с метаболизмом окислительного фосфорилирования, вкючают Цитохром с, комплекс I, комплекс II, комплекс III и комплекс IV. Другие ключевые белки, которые прямо или опосредованно модулируются CoQ10, включают Foxo 3а, DJ-1, IDH-1, Cpt1C и Cam киназу II.
Соответственно в одном варианте воплощения изобретения мишени лекарственного средства могут включать HNF4-альфа, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11 (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, cMyc, трансальдолазу 1, COQ1, COQ3, COQ6, пренилтрансферазу, 4-гидробензоазу, нейтрофильный цитоплазматический фактор 2, синтазу оксида азота 2А и супероксиддисмутазу 2, VDAC, Bax channel, ANT, Цитохром с, комплекс I, комплекс II, комплекс III, комплекс IV, Foxo 3а, DJ-1, IDH-1, Cpt1C и Cam киназу II. В предпочитаемых вариантах воплощения мишени лекарственного средства могут включать HNF4A, трансальдолазу, NM23 и BSCv. В одном варианте воплощения мишенью лекарственного средства является TNF4A. В одном варианте воплощения мишенью лекарственного средства является трансальдолаза. В одном варианте воплощения мишенью лекарственного средства является NM23. В одном варианте воплощения мишенью лекарственного средства является BSCv. Скринирующие анализы, полезные для идентификации модуляторов или идентификации мишеней лекарственных средств, описаны ниже.
VI. Скрининговые анализы.
В настоящем изобретении также представлены способы (также называемые здесь скрининговые анализы) идентификации модуляторов, т.е. кандидатов или тестируемых соединений или агентов (например, белков, пептидов, пептидомиметиков, пептоидов, маленьких молекул или других веществ), которые модулируют экспрессию и/или активность идентифицированной терапевтической мишени изобре- 25 034552 тения. Такие анализы обычно включают в себя реакцию между терапевтической мишенью изобретения и одним или более исследуемым соединением. Другие соединения сами могут быть или тестируемыми соединениями или комбинацией тестируемых компонентов и веществ, естественно связывающихся с маркером изобретения. Соединения, идентифицированные посредством анализов, таких как описанные здесь, могут быть полезны, например, для лечения или профилактики онкологического заболевания.
Исследуемые соединения, используемые в скрининговых анализах настоящего изобретения, могут быть получены из любого доступного источника, включая систематические библиотеки природных и/или синтетических соединений. Исследуемые соединения также могут быть получены путем любого из многочисленных подходов в комбинированных библиотечных способах, известных специалистам, включая: биологические библиотеки; пептоидные библиотеки (библиотеки молекул, имеющих функциональность пептидов, но с новым, не пептидным каркасом, устойчивым к ферментному расщеплению, но тем не менее остающимся биоактивным; см, например, Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85); территориально доступные параллельные библиотеки твердой фазы или растворимой фазы; синтетические библиотечные способы, требующие деконволюции; библиотечные способы и синтетические библиотечные способы, использующие аффинную хроматографию. Подходы биологической библиотеки и пептоидной библиотеки ограничены пептидными библиотеками, в то время как другие четыре подхода пригодны для библиотек пептидов, непептидных олигомеров или низкомолекулярных соединений (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145).
Примеры способов для синтеза молекулярных библиотек можно найти в специальной литературе: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; и in Gallop et al. (1994) J. Med Chem. 37:1233.
Библиотеки соединений могут быть представлены в растворах (например, Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421) или в частицах (Lam, 1991, Nature 354:82-84), чипах (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), бактериях и/или спорах (Ladner, USP 5,223,409), плазмидах (Cull et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) или фагах (Scott и Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, supra.).
Скрининговые способы настоящего изобретения включают в себя контакт клеток с исследуемым соединением и определение способности исследуемого соединения модулировать экспрессию и/или активность терапевтической мишени изобретения в клетке. Экспрессия и/или активность терапевтической мишени изобретения может быть определена, как описано в настоящем документе. Экспрессия и/или активность терапевтической мишени изобретения может также быть определена с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области. В одном варианте воплощения соединение выбирается на основе его способности повышать экспрессию и/или активность терапевтической мишени изобретения. В одном варианте воплощения соединение выбирается на основе его способности повышать экспрессию и/или активность терапевтической мишени, выбранной из белков, перечисленных в табл. 1-28, где терапевтическая мишень положительно модулируется CoQ10 (например, показывает положительное кратное изменение). В одном варианте воплощения соединение выбирается на основе его способности понижать экспрессию и/или активность терапевтической мишени изобретения. В одном варианте воплощения соединение выбирается на основе его способности понижать экспрессию и/или активность терапевтической мишени, выбранной из белков, перечисленных в табл. 1-28, где терапевтическая мишень отрицательно модулируется CoQ10 (например, показывает отрицательное кратное изменение).
В другом варианте воплощения настоящего изобретения представлены способы скринирования возможных или тестируемых соединений, которые являются субстратами терапевтических мишеней изобретения или их биологически активных составляющих. В еще одном варианте воплощения изобретения представлены способы скринирования возможных или тестируемых соединений, которые связываются с терапевтическими мишенями изобретения или их биологически активными составляющими. Определение способности тестируемого вещества прямо связываться с терапевтической мишенью может быть проведено при соединении вещества с радиоизотопной или энзимной меткой таким образом, что такое связывание соединения с терапевтической мишенью можно определить, детектируя меченное маркером соединение в комплексе. Например, соединения (например, маркер к субстрату) можно пометить I, I, S, С или Н, прямо или опосредованно, и радиоактивный изотоп будет детектирован или прямым подсчетом радиоэмиссии или подсчетом сцинцилляции. Альтернативно, соединения способа могут быть энзимно помечены, например, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой или люциферазой, и энзимная метка детектируется путем определения превращения соответствующего субстрата в продукт.
Это изобретение также относится к новым агентам, идентифицированным по вышеописанным способам скринирования. Соответственно в объеме этого изобретения для дальнейшего использования находится агент, идентифицированный, как описано здесь, в соответствующей модели на животных. Например, агент, способный модулировать экспрессию и/или активность маркера изобретения, идентифи- 26 034552 цированный, как описано здесь, может быть использован в модели на животных для определения эффективности, токсичности или побочных эффектов воздействия такого агента. Альтернативно, агент, идентифицированный, как описано здесь, может быть использован в модели на животных для определения механизма действия такого агента. Кроме того, это изобретение относится к использованию новых агентов, идентифицированным по вышеописанным способам скринирования, для лечения, как описано выше.
VII. Фармацевтические композиции и фармацевтическое введение.
Факторы влияния изобретения могут быть включены в фармацевтические композиции, подходящие для введения субъекту. Типично, фармацевтическая композиция содержит фактор влияния изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. При использовании здесь фармацевтически приемлемый носитель включает все без исключения растворы, диспергентные среды, покрытия, антибактериальные и антигрибковые агенты, изотонический и абсорбирующий агенты и подобные тому физиологически совместимые. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или несколько из воды, солевого раствора, фосфатного буферного солевого раствора, декстрозы, глицерина, этанола и подобных соединений, а также их комбинации. Во многих случаях будет предпочтительным включить в состав изотонические агенты, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут также включать в минорных количествах вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие реагенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок годности или эффективность фактора влияния.
Композиции настоящего изобретения могут быть в различных формах. Они включают, например, жидкости, полутвердые и твердые дозированные формы, такие как жидкие растворы (например, инъецируемые и вливаемые растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, кремы, лосьоны, жидкие мази, мази или пасты, капли для введения в глаза, уши или нос, липосомы и суппозитории. Предпочитаемая форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения.
Факторы влияния настоящего изобретения могут вводиться различными способами, известными специалистам в данной области. Для многих терапевтических применений, предпочитаемым путем/способом введения является подкожная инъекция, внутривенная инъекция или вливание. Как поймут специалисты в данной области, путь и/или способ введения будет варьировать в зависимости от желаемых результатов. В некоторых вариантах воплощения активное соединение может быть приготовлено с носителем, который защитит соединение от быстрого высвобождения, таким как рецептура контролируемого высвобождения, включающая импланты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут использоваться биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы для приготовления таких рецептур запатентованы или в основном известны специалистам в данной области; см., например, Системы доставки лекарств с непрерывным и контролируемым высвобождением, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. В одном варианте воплощения способ введения является парентеральным (например, внутривенным, подкожным, внутрибрюшинным, внутримышечным). В одном варианте воплощения фактор влияния вводится путем внутривенного вливания или инъекции. В другом варианте воплощения фактор влияния вводится путем внутримышечной или подкожной инъекции. В предпочтительном варианте воплощения фактор влияния вводится местно.
Терапевтические композиции типично должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть по рецептуре раствором, микроэмульсией, дисперсией, липосомой или другой упорядоченной структурой, подходящей для высокой концентрации лекарства. Стерильные инъецируемые растворы могут быть приготовлены путем включения активного компонента (например, фактора влияния) в требуемое количество подходящего раствора с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, как требуется, с последующим фильтрованием и стерилизацией. Как правило, дисперсии приготавливаются путем включения активного компонента в стерильный носитель, который содержит базовую дисперсную среду и требуемые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных лиофилизованных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов предпочитаемыми способами приготовления являются вакуумная сушка и распылительная сушка, которые дают порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного желаемого ингредиента из их раствора, предварительно стерелизованного и профильтрованного. Необходимая текучесть раствора может быть достигнута, например, с использованием покрытия, такого как лецитин, поддержанием нужного размера частиц в случае дисперсии и использованием поверхностно-активных веществ. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута включением в композицию реагента, который задерживает абсорбцию, например, солей моностеарата и желатина.
Техники и рецептуры в основном можно найти в публикации Фармацевтические науки, Remmington, Meade Publishing Co., Easton, Пенсильвания. Для системного введения предпочтительна инъекция, включая внутримышечную, внутривенную, внутрибрюшинную и подкожную. Композиции для инъекции могут быть сделаны по рецептуре в жидких растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Ханка или раствор Рингера. Кроме того, соединения могут быть изготовлены в твердой форме и растворены или превращены в суспензию непосредственно перед использованием.
- 27 034552
Также включаются лиофилизированные формы.
Фармацевтические композиции для орального введения могут иметь форму, например, таблеток или капсул, приготовленных стандартными способами с фармацевтически приемлемыми наполнителями, такими как связывающие реагенты (например, желатинированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазочные вещества (например, стеарат магния, тальк или окись кремния); разрыхлители (например, картофельный крахмал или натрия гликолят крахмала); или увлажняющие реагенты (например, лауретсульфат натрия). Таблетки могут быть покрыты по способам, хорошо известным специалистам в данной области. Жидкие препараты для орального введения могут иметь форму, например, растворов, сиропов или суспензий или они могут быть представлены в виде сухого продукта для соединения с водой или другим подходящим носителем перед использованием. Такие жидкие препараты могут быть приготовлены обычными способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие реагенты (например, сорбитный сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгирующие агенты (например, лецитин или гуммиарабик); безводные носители (например, атионд масло, жирные эфиры, этиловый спирт или ректифицированные растительные масла) и консерванты (например, метил или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Препараты могут также при необходимости содержать буферные соли, ароматизаторы, подкрашивающие и подслащивающие вещества.
Препараты для орального введения могут быть разработаны так, чтобы обеспечить контролируемое высвобождение активного компонента. Для введения через рот композиции могут иметь форму таблеток или лепешек, изготовленных стандартным образом. Для введения путем ингаляции соединения для использования в соответствии с настоящим изобретением легко доставляются в форме аэрозольного спрея, подающегося из баллона под давлением или небулайзера, с использованием подходящей сжатой жидкости, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозольного баллона под давлением дозированная единица может быть точно определена, если обеспечить доставку клапаном постоянного количества. Капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в ингаляторе или инжекторе могут быть разработаны с содержанием порошка смеси компонентов и подходящей порошковой базы, такой как лактоза или крахмал.
Соединения могут быть изготовлены для парентерального введения путем инъекции, например путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Рецептуры для инъекции могут быть представлены в лекарственной форме со стандартной дозировкой, например, в ампулах или мультидозных емкостях, с добавленным консервантом. Композиции могут иметь такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в жировых или водных носителях, и могут содержать рецептурные реагенты, такие как суспензирующие, стабилизирующие и/или дисперсирующие реагенты. Альтернативно, активный ингредиент может быть в форме порошка для соединения с подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой, перед использованием.
Соединения могут быть также изготовлены в ректальной композиции, такой как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие традиционную суппозиторную основу, такую как кокосовое масло или другие глицериды.
В дополнение к композициям, описанным выше, соединения могут также быть изготовлены как депо препарата. Такие долгодействующие композиции могут вводиться имплантацией (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. Так, например, в композиции могут входить подходящие полимерные или гидрофобные вещества (например, как эмульсия в соответствующем масле) или ионообменные смолы, или в виде слаборастворимых производных, например, как слаборастворимая соль.
Системное введение может также быть трансмукозальным или трансдермальным. Для трансмукозального или трансдермального введения в рецептуре используются пенетранты, пригодные для преодоления барьера. Такие пенетранты в большинстве своем известны специалистам и включают, например, соли желчных кислот и производные фусидовой кислоты, для облегчения проникновения могут быть использованы детергенты. Трансмукозальное введение может быть произведено с использованием назальных спреев или суппозиториев. Для местного введения, соединение(я) изобретения смешиваются в виде мазей, бальзамов, гелей или кремов, известных в большинстве своем специалистам. Местно может быть использован водный раствор для лечения повреждений или воспаления для ускорения исцеления.
Композиции могут, при желании, быть представлены в виде упаковки или диспенсера, который может содержать одну или более дозовых единиц в форме, содержащей активный ингредиент. Упаковка может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистер. К упаковке или диспенсеру могут прилагаться инструкции по применению.
Для терапии, включающей введение нуклеиновых кислот, соединение(я) изобретения могут быть изготовлены во множестве форм введения, включая системное и местное введение. Техники и рецептуры в большинстве своем можно найти в публикации Фармацевтические науки, Remmington, Meade Publishing Co., Easton, Пенсильвания. Для системного введения предпочтительна инъекция, включая внутри- 28 034552 мышечную, внутривенную, внутрибрюшинную, внутриузловую и подкожную. Для инъекции соединения(й) изобретения могут быть изготовлены в жидких растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Ханка и раствор Рингера. Кроме того, соединение(я) могут быть изготовлены в твердой форме и растворены или превращены в суспензию непосредственно перед использованием. Также включаются лиофилизированные формы.
В одном варианте воплощения, композиции, содержащие фактор влияния, вводятся местно. Предпочтительно представлять активный ингредиент, т.е. фактор-В, как фармацевтическую композицию. Активного ингредиента может содержаться для местного введения от около 0,001 до около 20% от массы по весу композиции в конечном продукте, хотя он может составлять до 30% от массы, предпочтительно от около 1 до около 20% от массы композиции. Местные композиции настоящего изобретения содержат активный ингредиент вместе с одним или более приемлемым носителем(ями), а также опционально любой другой терапевтический ингредиент(ы). Носитель(и) должен быть приемлемым в отношении того, что должен сочетаться с другими ингредиентами композиции и не причинять вред реципиенту.
При лечении пациента, у которого выявлена соответствующая болезнь, вводится терапевтически эффективное количество агента или агентов. Терапевтически эффективная доза означает такое количество соединения, которое приводит к облегчению симптомов или удлинению срока жизни пациента.
Токсичность и терапевтическая эффективность таких соединений должна определяться стандартными фармацевтическими процедурами в клеточных культурах или экспериментальных животных, например определением ЛД50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ЭД50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение между токсичным и терапевтическим эффектами называется терапевтическим индексом и может быть выражено как соотношение ЛД50/ЭД50. Предпочтительны соединения, которые показывают высокие терапевтические индексы. Данные, полученные из таких клеточных исследований и исследований на животных, могут быть использованы в разработке диапазона дозировки для использования у людей. Дозировка таких соединений находится предпочтительно внутри диапазона циркулирующих концентраций, которые включают ЭД50 с маленькой или отсутствующей токсичностью. Дозировка может варьировать внутри этого диапазона в зависимости от применяемой формы дозы и используемого способа введения.
Для любого соединения, используемого в способе изобретения, терапевтически эффективная доза может быть установлена непосредственно из исследований клеточной культуры. Например, доза может быть разработана в моделях на животных для достижения циркулирующей концентрации в плазме в диапазоне, который включает IC50, как определено в клеточной культуре. Такая информация может быть использована для более точного определения полезной дозы для людей. Уровни в плазме могут быть подсчитаны, например, при помощи ВЭЖХ.
Точная композиция, путь введения и дозировка могут быть выбраны отдельным врачом с учетом состояния пациента, (см., например, Fingl et al., Фармакологическая основа терапии, 1975, гл. 1 с. 1). Следует заметить, что внимательный медик будет знать, как и когда следует остановить, прервать или отрегулировать введение, приводящее к токсичности или к дисфункции органа. И наоборот, внимательный врач также будет знать, как отрегулировать лечение к более высоким уровням, если клинический ответ не адекватен (не допуская токсичность). Размер вводимой дозы при лечении соответствующего патологического расстройства будет варьировать в соответствии с серьезностью состояния, подвергающегося лечению, и способа введения. Серьезность состояния может, например, быть оценена, частично, путем стандартных прогностических способов оценки. Более того, доза и, возможно, частота дозы, также будет варьировать в зависимости от возраста, веса тела и реакции отдельного пациента. Программа, сопоставимая с обсуждаемой выше, может быть использована в ветеринарной медицине.
В зависимости от определенных состояний, подвергаемых лечению, соответствующие агенты могут быть созданы и введены системно или местно. Техники для разработки формулы и введения можно найти в публикации Фармацевтические науки, Remington, 18е изд., Mack Publishing Co., Easton, Пенсильвания. (1990). Подходящие способы введения могут включать оральное, ректальное, трансдермальное, вагинальное, трансмукозальное или кишечное введение; парентеральную доставку, включая внутримышечные, подкожные, костномозговые инъекции, а также интратекальные, прямые внутрижелудочковые, внутривенные, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции, перечислено лишь несколько способов.
Композиции, описанные выше, могут вводиться субъекту в любой подходящей рецептуре. В дополнение к лечению онкологического заболевания местными композициями CoQ10 в других аспектах изобретения CoQ10 может быть доставлен другими способами. Например, CoQ10 может быть разработан для парентеральной доставки, например, для подкожной, внутривенной, внутримышечной или внутриопухолевой инъекции. Могут использоваться другие способы доставки, например липосомная доставка или диффузия из прибора, наполненного композицией. Композиции могут вводиться одним болюсом, множественными инъекциями или непрерывной инфузией (например, внутривенно или путем перитонеального диализа). Для парентерального введения композиции предпочтительно разрабатываются в стерильной апирогенной форме. Композиции настоящего изобретения также могут вводиться in vitro в клетку (например, для вызова апоптозов в раковой клетке в культуре in vitro) непосредственным добав- 29 034552 лением композиции к жидкости, в которой содержится клетка.
В зависимости от определенных состояний, подвергаемых лечению, соответствующие агенты могут быть созданы и введены системно или местно. Техники для разработки формулы и введения можно найти в публикации Фармацевтические науки, Remington, 18е изд., Mack Publishing Co., Easton, Пенсильвания. (1990). Подходящие способы введения могут включать оральное, ректальное, трансдермальное, вагинальное, трансмукозальное или кишечное введение; парентеральную доставку, включая внутримышечные, подкожные, костномозговые инъекции, а также интратекальные, прямые внутрижелудочковые, внутривенные, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции, перечислено лишь несколько способов.
Для инъекции агенты изобретения могут быть разработаны в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Ханка, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Для такого трансмукозального введения в рецептуре используются пенетранты, пригодные для преодоления барьера. Такие пенетранты в большинстве своем известны специалистам в данной области.
Использование фармацевтически пригодных носителей в рецептуре соединений, раскрытых здесь для практики изобретения, в дозах, пригодных для системного введения, входит в объем изобретения. С правильным выбором носителя и подходящей технологией производства, композиции настоящего изобретения, в частности, разработанные как растворы, могут вводиться парентерально, например, путем внутривенной инъекции. Могут быть легко разработаны композиции с использованием фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных специалистам, в дозах, подходящих для орального введения. Такие носители дают возможность композициям изобретения быть изготовленными в виде таблеток, пилюль, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, суспензий и тому подобного, для орального введения пациенту, подвергаемому лечению.
Агенты, предназначенные для внутриклеточного введения, могут вводиться с использованием техник, хорошо известных специалистам, имеющим стандартные знания в данной области. Например, такие агенты могут быть инкапсулированы в липосомы, затем введены, как описано выше. Липосомы являются сферическими липидными двухслойными структурами с водным содержимым. Все молекулы, представленные в водном растворе во время образования липосомы, включены в водную среду. Содержимое липосом защищено от внешней микросреды и, поскольку липосомы проникают сквозь клеточные мембраны, эффективно доставляется в цитоплазму клеток. Кроме того, вследствие своей гидрофобности маленькие органические молекулы могут вводиться прямо внутриклеточно.
Фармацевтические композиции, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в эффективном количестве для достижения соответствующей цели. Определение эффективного количества вполне возможно для специалистов в данной области, особенно в свете детального раскрытия, предоставленного здесь. В дополнение к активным ингредиентам эти фармацевтические композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, содержащие вспомогательные вещества, которые способствуют созданию содержащих активные компоненты препаратов, которые можно использовать в фармацевтике. Препараты, формула которых подходит для орального введения, могут быть в форме таблеток, драже, капсул или растворов. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть произведены по способу, который сам по себе известен, например, посредством стандартного смешивания, растворения, грануляции, приготовления драже, процессов возгонки, эмульгирования, инкапсулирования, улавливания или лиофилизации.
Композиции, подходящие для местного введения, включают жидкости или полужидкие препараты, подходящие для проникновения сквозь кожу в месте, где требуется лечение, такие как жидкие мази, лосьоны, кремы, мази или пасты и капли, подходящие для введения в глаза, уши или нос. Капли в соответствии с настоящим изобретением могут быть в виде стерильных водных или жировых растворов и могут быть приготовлены путем разведения активного ингредиента в подходящем водном растворе бактерицидного и/или фунгицидного реагента и/или любого другого подходящего консерванта, и предпочтительно включать поверхностно-активный реагент. Получившийся в результате раствор затем может быть очищен и стерилизован путем фильтрации и помещен в контейнер по асептичной технологии. Примерами бактерицидных и фунгицидных реагентов, подходящих для включения в капли, являются нитрат или ацетат фенилртути (0,002%), хлорид бензалкония (0,01%) и ацетат хлоргексидина (0,01%). Подходящие растворы для приготовления жирового раствора включают глицерин, разведенный спирт и пропиленгликоль.
Лосьоны в соответствии с настоящим изобретением включают те, которые подходят для применения для кожи или глаз. Глазной лосьон может содержать стерильный водный раствор, необязательно содержащий бактерицид, который может быть приготовлен по способам, похожим на способы, описанные для приготовления капель. Лосьоны или жидкие мази для применения для кожи могут также включать подсушивающий и охлаждающий кожу реагент, такой как спирт или ацетон, и/или увлажнитель, такой как глицерин или масло, такое как касторовое масло или арахисовое масло.
Кремы, мази или пасты в соответствии с настоящим изобретением являются полутвердыми форму
- 30 034552 лами с активным ингредиентом для наружного применения. Они могут быть сделаны путем смеси активного ингредиента в мелкодисперсной или порошковой форме, отдельно или в растворе или суспензии в водной или неводной жидкости, с воздухом в подходящем механизме, с масляной или немасляной основой. Основа может содержать углеводороды, такие как твердый, мягкий или жидкий парафин, глицерин, пчелиный воск, металлсодержащее мыло; растительный клей; масло природного происхождения, такое как миндальное, кукурузное, арахисовое, касторовое или оливковое масло; шерстяной жир или его производные, или жирные кислоты, такие как стеариновая или олеиновая кислоты вместе со спиртом, таким как пропиленгликоль или макрогели. Композиция может включать любой подходящий поверхностно-активный агент, такие как анионный, катионный или неионизированный поверхностно-активный агент, такие как эфиры сорбита или их полиоксиэтиленовые производные. Также могут быть включены суспендирующие агенты, такие как природные смолы, производные целлюлозы или неорганические вещества, такие как кремний, и другие ингредиенты, такие как ланолин.
Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных компонентов в растворимой в воде форме. Кроме того, суспензии активных компонентов могут быть приготовлены в виде подходящих для масляных инъекций суспензий. Подходящие липофильные растворы или несущие среды включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Суспензии для водных инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как натрия карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость компонентов, что позволяет проникать раствору в более высокой концентрации.
Фармацевтические препараты для орального использования могут представлять собой комбинацию активных компонентов с твердыми вспомогательными веществами, необязательно размолотыми, в результате чего получается смесь, и произведенными в виде смеси гранул, после добавления подходящих вспомогательных веществ, при желании, для получения таблеток или драже. Подходящими вспомогательными веществами являются, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, гидроксипропилметил-целлюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон (ПВП). При желании можно добавить дезинтегрирующие агенты, такие как поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соли, такие как альгинат натрия.
Драже производятся в соответствующей оболочке. Для этой целей могут быть использованы концентрированные растворы сахара, которые необязательно могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, карбопол гель, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы лака и подходящие органические растворители или смеси растворителей. К оболочке таблеток или драже могут быть добавлены красители или пигменты для идентификации или характеристики различных комбинаций или доз активных компонентов.
Фармацевтические препараты, которые можно использовать орально, включают плотно наполненные капсулы, сделанные из желатина, а также мягкие, запечатанные капсулы, сделанные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Плотно наполненные капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителями, такими как лактоза, связующими веществами, такими как крахмал, и/или лубрикантами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторы. В мягких капсулах активные компоненты могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные кислоты, жидкий парафин или жидкий полиэтиленгликоль. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы.
Композиция при желании может включать буферную систему. Буферные системы выбираются так, чтобы поддерживать или буферезировать рН композиций внутри желаемого диапазона. Термин буферная система или буфер, используемые здесь, означают растворенный реагент или реагенты, которые, находясь в водном растворе, стабилизируют такой раствор, не давая произойти сильным изменениям рН (концентрации ионов водорода или активности) при добавлении к нему кислот или оснований. Растворенный реагент или реагенты, которые таким образом отвечают за устойчивость или изменения рН от стартового значения рН в буфере в диапазоне, указанном выше, хорошо известны. Хотя подходящих буферов существует очень много, предпочитаемым буфером является моногидрат фосфата калия.
Конечное значение рН фармацевтической композиции может варьировать внутри физиологически совместимого диапазона. Обязательно, чтобы конечное значение рН не раздражало кожу человека и предпочтительно, чтобы оно способствовало трансдермальному транспорту активного компонента, т.е. CoQ10. Без нарушения этого условия рН может быть выбрано так, чтобы усилить стабильность соединения CoQ10 и чтобы при необходимости подогнать к нужному состоянию консистенцию. В одном варианте воплощения предпочтительное значение рН от около 3,0 до около 7,4, более предпочтительное от около 3,0 до около 6,5, наиболее предпочтительное от около 3,5 до около 6,0. В композиции предпочтительных местных носителей основным компонентом является вода, обязательно очищенная, например деоинизированная вода. Такие носители содержат воду в диапазоне от более чем около 50 до около 95%,
- 31 034552 на основе общего веса композиции. Конкретное количество присутствующей воды не является критичным, однако оно подгоняется для получения желаемой вязкости (обычно от около 50 до около 10000 сП) и/или концентрации других компонентов. Местные носители предпочтительно имеют вязкость не менее около 30 сП.
Другие известные трансдермальные проникающие в кожу факторы также могут быть использованы для содействия доставки CoQ10. Иллюстрацией являются сульфоксиды, такие как диметилсульфоксид (ДМСО) и подобные ему вещества; циклические амиды, такие как 1-додецилазациклогептан-2-он (Azone.TM., зарегистрированная торговая марка Nelson Research, Inc.) и подобные ему вещества; амиды, такие как N.N-диметилацетамид (ДМА) N.N-диэтилтолуамид. N.N-диметилформамид. N,Nдиметилоктамид, N.N-диметилдекамид, и подобные вещества; производные пирролидона, такие как Nметил-2-пирролидон, 2-пирролидон, 2-пирролидон-5-карбоксильная кислота, №(2-гидроксиэтил)-2пирролидон или его эфиры жирных кислот, 1-лаурил-4-метоксикарбонил-2-пирролидон, Nталловалкилпирролидоны, и подобные вещества; полиолы, такие как пропиленгликоль, этиленгликоль, полиэтиленгликоль, дипропиленгликоль, глицерин, гексантриол и подобные вещества; линейные и разветвленные жирные кислоты, такие как олеиновая, линолевая, лауриновая, валериановая, гептановая, капроновая, миристиновая, изовалериановая, неопентановая, триметилгексановая, изостеариновая и подобные вещества; спирты, такие как этанол, пропанол, бутанол, октанол, олеиловый, стеариловый, ланолиновый спирты, и подобные вещества; анионные поверхностно-активные вещества, такие как лаурат натрия, натрий лаурилсульфат, и подобные вещества, катионные поверхностно-активные вещества, такие как хлорид бензалколия, хлорид додецилтриметиламмония, бромид цетилтриметиламмония, и подобные вещества; неионные поверхностно-активные вещества, такие как эфиры пропоксилированного полиоксиэтилена, например, Полоксамер 231, Полоксамер 182, Полоксамер 184, и подобные вещества, этоксилированные жирные кислоты, например Tween 20, Myjr 45, и подобные вещества, производные сорбитана, например Tween 40, Tween 60, Tween 80, Span 60, и подобные вещества, этоксилирированные спирты, например полиоксиэтилена (4) лауиловый эфир (Brij 30), полиоксиэтилена (2) олеиловый эфир (Brij 93), и подобные вещества, лецитин и производные лецитина, и подобные вещества; терпены, такие как Dлимонен, α-пинен, β-карен, α-терпинеол, карвол, карвон, ментон, оксид лимонена, оксид α-пинена, эвкалиптовое масло и подобные вещества. Также подходят в качестве проникающих сквозь кожу факторов органические кислоты и эфиры, такие как салициловая кислота, метилсалицилат, лимонная кислота, янтарная кислота и подобные вещества.
В одном варианте воплощения настоящего изобретения представлены композиции, содержащие CoQ10, и способы их приготовления. Предпочтительно композиции содержат по меньшей мере от около 1 до около 25 вес.% CoQ10. CoQ10 можно приобрести у Asahi Kasei N&P (Hokkaido, Japan) как Убидекаренон (USP). CoQ10 также можно приобрести у Kaneka Q10 как Kaneka Q10 (USP УБИДЕКАРЕНОН) в порошковой форме (Pasadena, Texas, USA). CoQ10, использованный в способах, приведенных здесь, имеет следующие характеристики: остаточные растворители соответствуют требованию USP 467; содержание воды менее чем 0,0%, менее чем 0,05% или менее чем 0,2%; остаток после прокаливания 0,0%, менее чем 0,05% или менее чем 0,2%; содержание тяжелых металлов менее чем 0,002% или менее чем 0,001%; чистота между 98-100%, или 99,9%, или 99,5%. Способы приготовления композиций предоставлены в разделе примеров ниже.
В некоторых вариантах воплощения изобретения предоставляются способы для лечения или профилактики онкологического заболевания у людей местным введением коэнизма Q10 людям таким образом, чтобы оказать лечебное или профилактическое действие, где человеку вводится местная доза коэнзима Q10 с местным наполнителем, где коэнзим Q10 применяется к целевой ткани в диапазоне от около 0,01 до около 0,5 мг коэнзима Q10 на 1 см2 кожи. В одном варианте воплощения коэнзим Q10 применяется к целевой ткани в диапазоне от около 0,09 до около 0,15 мг CoQ10 на 1 см2 кожи. В различных вариантах воплощения, коэнзим Q10 применяется к целевой ткани в диапазоне от около 0,001 до около 5,0, от около 0,005 до около 1,0, от около 0,005 до около 0,5, от около 0,01 до около 0,5, от около 0,025 до около 0,5, от около 0,05 до около 0,4, от около 0,05 до около 0,30, от около 0,10 до около 0,25 или от около 0,10 до 0,20 мг CoQ10 на 1 см2 кожи. В других вариантах воплощения, коэним Q10 применяется к целевой ткани в дозе около 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24, 0,25, 0,26, 0,27, 0,28, 0,29, 0,30, 0,31, 0,32, 0,33, 0,34, 0,35, 0,36, 0,37, 0,38, 0,39, 0,40, 0,41, 0,42, 0,43, 0,44, 0,45, 0,46, 0,47, 0,48, 0,49 или 0,5 мг CoQ10 на 1 см2 кожи. В одном варианте воплощения, коэнзим Q10 применяется к целевой ткани в дозе около 0,12 мг CoQ10 на 1 см2 кожи. Следует понимать, что диапазоны значений, в которых границами является любая из этих величин, также следует рассматривать как часть этого изобретения, например, от около 0,03 до около 0,12, от около 0,05 до около 0,15, от около 0,1 до около 0,20 или от около 0,32 до около 0,49 мг CoQ10 на 1 см2 кожи.
В другом варианте воплощения изобретения, коэнзим Q10 вводится в форме крема CoQ10 в дозе между 0,5 и 10 мм крема CoQ10 на 1 см2 кожи, где крем CoQ10 содержит между 1 и 5% коэнзима Q10. В одном варианте воплощения, крем CoQ10 содержит около 3% коэнзима Q10. В других вариантах воплощения, крем CoQ10 содержит около 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 или 5% коэнзима Q10. В различных вари- 32 034552 антах воплощения, крем CoQ10 вводится в дозе около 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0,
6.5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 или 10 мм крема CoQ10 на 1 см2 кожи. Следует понимать, что диапазоны значений, в которых границами является любая из этих величин, также следует рассматривать как часть этого изобретения, например, между около 0,5 и около 5,0, около 1,5 и 2,5 или около 2,5 и 5,5 мг крема CoQ10 на 1 см2 кожи.
В другом варианте воплощения коэнзим Q10 вводится в форме крема CoQ10 в дозе между 3 и 5 мм крема CoQ10 на 1 см2 кожи, где крем CoQ10 содержит между 1 и 5% коэнзима Q10. В одном варианте воплощения крем CoQ10 содержит около 3% коэнзима Q10. В других вариантах воплощения крем CoQ10 содержит около 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 или 5% коэнзима Q10. В различных вариантах воплощения крем CoQ10 вводится в дозе около 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5,
4.6, 4,7, 4,8, 4,9 или 5,0 мм крема CoQ10 на 1 см2 кожи. Следует понимать, что диапазоны значений, в которых границами является любая из этих величин, также следует рассматривать как часть этого изобретения, например, между около 3,0 и около 4,0, около 3,3 и 5,3 или около 4,5 и 4,9 мг крема CoQ10 на 1 см кожи.
Некоторые аспекты изобретения предоставляют способы для лечения или профилактики онкологического заболевания у людей путем местного введения коэнзима Q10, так чтобы имели место лечение или профилактика, где коэнзим Q10 местно применяется один или несколько раз за 24 ч в течение шести недель или более.
Некоторые аспекты изобретения предоставляют способ для приготовления 3% крема коэнзима Q10, который включает этапы приготовления Фаз А, В, С, D и Е и комбинацию всех фаз, такую как формирование масло-в-воде эмульсии 3% CoQ10 крема.
В некоторых вариантах воплощения ингредиенты фазы А включают алкил С12-15 бензоат NF 4,00 вес.%, цетиловый спирт 2,00 вес.%, глицерина стеарат/ПЭГ-100 4,5 вес.% и стеариловый спирт NF 1,50 вес.%, тогда как ингредиенты фазы В включают диэтиленгликоль моноэфир NF 5,00 вес.%, глицерин USP 2,00 вес.%, пропиленгликоль USP 1,50 вес.%, феноксиэтанол NF 0,475 вес.%, очищенную воду USP 16,725 вес.% и дисперсию карбомера 2% 40,00 вес.%, и ингредиенты фазы С включают молочную кислоту USP 0,50 вес.%, раствор лактата натрия USP 2,00 вес.%, троламин NF 1,30 вес.% и очищенную воду USP 2,50 вес.%. Кроме того, в этих воплощениях ингредиенты фазы D включают диоксид титана USP 1,00 вес.%, а ингредиенты фазы Е включают CoQ10 21% концентрат 15 вес.%.
В некоторых других вариантах воплощения ингредиенты фазы А включают каприновый/каприлиновый триглицерид 4,00 вес.%, цетиловый спирт 2,00 вес.%, глицерина стеарат/ПЭГ-100 4,5 вес.% и стеариловый спирт NF 1,50 вес.%, тогда как ингредиенты фазы В включают диэтиленгликоля моноэфир NF 5,0 вес.%, глицерин USP 2,00 вес.%, пропиленгликоль USP 1,50 вес.%, феноксиэтанол NF 0,475 вес.%, очищенную воду USP 16,725 вес.% и дисперсию карбомера 2% 40,00 вес.%, и ингредиенты фазы С включают молочную кислоту USP 0,50 вес.%, раствор лактата натрия USP 2,00 вес.%, троламин NF 1,30 вес.% и очищенную воду USP 2,50 вес.%. Кроме того, в этих воплощениях ингредиенты фазы D включают диоксид титана USP 1,00 вес.%, а ингредиенты фазы Е включают CoQ10 21% концентрат 15 вес.%.
В некоторых вариантах воплощения изобретения предоставляются способы приготовления 3% крема коэнзима Q10, которые включают этапы (1) добавления ингредиентов фазы А в соответствующую емкость и нагрев до 70-80°С на водяной бане; (2) добавление ингредиентов фазы В, за исключением дисперсии карбомера, в соответствующую емкость и смешение для образования смешанной фазы В; (3) помещение ингредиентов фазы Е в соответствующую емкость и расплавление их при 50-60°С на водяной бане для образования расплавленной фазы; (4) добавление дисперсии карбомера к емкости со смесью и нагрев до 70-80°С с одновременным перемешиванием; (5) добавление смешанной фазы В к емкости со смесью, с поддержанием температуры на уровне 70-80°С; (6) добавление ингредиентов фазы С к емкости со сместью, с поддержанием температуры на уровне 70-80°С; (7) добавление ингредиентов фазы D к емкости со смесью и последующее перемешивание и гомогенизирование содержимого емкости; затем (8) остановка гомогенизации и охлаждение содержимого емкости до 50-60°С; затем (9) прекращение перемешивания и добавление расплавленной фазы Е к емкости со смесью для образования дисперсии; (10) постоянное перемешивание до тех пор, пока дисперсия не станет ровной и однородной; затем (11) охлаждение содержимого емкости со смесью до 45-50°С.
В некоторых других вариантах воплощения изобретения предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая 3% крем CoQ10. Крем включает фазу А, имеющую C12-15 алкилбензоат 4,00 вес.% в композиции, цетиловый спирт 2,00 вес.% в композиции, стеариловый спирт 1,5 вес.%, глицерилстеарат и ПЭГ-100 4,5 вес.%; фазу В, имеющую глицерин 2,00 вес.%, пропиленгликоль 1,5 вес.%, этоксидигликоль 5,0 вес.%, феноксиэтанол 0,475 вес.%, дисперсию карбомера 40,00 вес.%, очищенную воду 16,725 вес.%; фазу С, имеющую триэтаноламид 1,300 вес.%, молочную кислоту 0,500 вес.%, раствор лактата натрия 2,000 вес.%, воду 2,5 вес.%; фазу D, имеющую диоксид титана 1,000 вес.%; и фазу Е, имеющую CoQ10 21% концентрации 15,000 вес.%. В некоторых вариантах воплощения дисперсия карбомера включает воду, феноксиэтанол, пропиленгликоль и карбомер 940.
- 33 034552
В некоторых других вариантах воплощения изобретения, предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая 3% крем CoQ10. Крем включает фазу А, имеющую каприновый/каприлиновый триглицерид 4,00 вес.% в композиции, цетиловый спирт 2,00 вес.% в композиции, стеариловый спирт 1,5 вес.%, глицерилстеарат и ПЭГ-100 4,5 вес.%; фазу В, имеющую глицерин 2,00 вес.%, пропиленгликоль 1,5 вес.%, этоксидигликоль 5,0 вес.%, феноксиэтанол 0,475 вес.%, дисперсию карбомера 40,00 вес.%, очищенную воду 16,725 вес.%; фазу С, имеющую триэтаноламид 1,300 вес.%, молочную кислоту 0,500 вес.%, раствор лактата натрия 2,000 вес.%, воду 2,5 вес.%; фазу D, имеющую диоксид титана 1,000 вес.%; и фазу Е, имеющую CoQ10 21% концентрации 15,000 вес.%. В некоторых вариантах воплощения дисперсия карбомера включает воду, феноксиэтанол, пропиленгликоль и карбомер 940.
В некоторых других вариантах воплощения изобретения предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая 1,5% крем CoQ10. Крем включает фазу А, имеющую С12-15 алкилбензоат 5,000 вес.% в композиции, цетиловый спирт 2,00 вес.% в композиции, стеариловый спирт 1,5 вес.%, глицерилстеарат и ПЭГ-100 4,500 вес.%; фазу В, имеющую глицерин 2,000 вес.%, пропилен 1,750 вес.%, этоксидигликоль 5,000 вес.%, феноксиэтанол 0,463 вес.%, дисперсию карбомера 50,00 вес.%, очищенную воду 11,377 вес.%; фазу С, имеющую триэтаноламид 1,300 вес.%, молочную кислоту 0,400 вес.%, раствор лактата натрия 2,000 вес.%, и воду 4,210 вес.%; фазу D, имеющую диоксид титана 1,00 вес.%; и фазу Е, имеющую CoQ10 21% концентрации 1,500 вес.%.
В некоторых других вариантах воплощения изобретения предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая 1,5% крем CoQ10. Крем включает фазу А, имеющую каприновый/каприлиновый триглицерид 5,000 вес.% в композиции, цетиловый спирт 2,000 вес.% в композиции, стеариловый спирт 1,50 вес.%, глицерилстеарат и ПЭГ-100 4,500 вес.%; фазу В, имеющую глицерин 2,000 вес.%, пропилен 1,750 вес.%, этоксидигликоль 5,000 вес.%, феноксиэтанол 0,463 вес.%, дисперсию карбомера 50,00 вес.%, очищенную воду 11,377 вес.%; фазу С, имеющую триэтаноламид 1,3 вес.%, молочную кислоту 0,400 вес.%, раствор лактата натрия 2,000 вес.%, и воду 4,210 вес.%; фазу D, имеющую диоксид титана 1,000 вес.%; и фазу Е, имеющую CoQ10 21% концентрации 1,500 вес.%. В некоторых вариантах воплощения дисперсия карбомера включает воду, феноксиэтанол, пропиленгликоль и карбомер 940.
1. Комбинированная терапия.
В некоторых вариантах воплощения фактор влияния изобретения и/или содержащие его фармацевтические композиции могут использоваться в комбинированной терапии по крайней мере с одним другим терапевтическим агентом, который может быть другим фактором влияния и/или содержащей его фармацевтической композицией. Фактор влияния и/или содержащая его фармацевтическая композиция и другой терапевтический агент могут действовать аддитивно или более предпочтительно синергически. В одном варианте воплощения фактор влияния и/или содержащая его фармацевтическая композиция вводится одновременно с введением другого терапевтического агента. В другом варианте воплощения, смесь и/или содержащая ее фармацевтическая композиция вводится до или после введения другого терапевтического агента.
В одном варианте воплощения терапевтические способы изобретения включают дополнительные агенты. Например, в одном варианте воплощения дополнительный агент для использования в терапевтических способах изобретения является хемотерапевтическим агентом.
Хемотерапевтические агенты обычно принадлежат к различным классам, включая, например: 1) ингибиторы топоизомеразы II (цитотоксичные антибиотики), такие как антрациклины/антраценедины, например, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин и неморубицин, антрахиноны, например, митоксантрон и лозоксантрон, и подофиллотоксины, например, этопозид и тенипозид; 2) агенты, которые влияют на образование микротрубочек (ингибиторы митоза), такие как растительные алкалоиды (например, соединения, принадлежащие к семейству алкалинов, азотсодержащих молекул, получаемых из растений и являющихся биологически активными и цитотоксичными), например, таксаны, например паклитаксел и доцетаксел, и алкалоиды барвинка (Vinca rosea), например винбластин, винкритин и винорелбин, и производные подофиллотоксина; 3) алкилирующие реагенты, такие как азотистый иприт, смеси этиленэмина, алкилсульфонаты и другие соединения с алкильным действием, такие как нитрозомочевина, дакарбазин, циклофосфамид, ифосфамид и мелфалан; 4) антиметаболиты (ингибиторы нуклеозидов), например, фолаты, например фолиевая кислота, фторпиримидины, аналоги пуринов или пиримидинов, такие как 5фторурацил, капецитабин, гемцитабин, метокрексат и эдатрексат; 5) ингибиторы топоизомеразы I, такие как топотекан, иринотекан и 9-нитрокамптотецин, и производные камптотецина; и 6) соединения платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин. Приведенные в качестве примера хемотерапевтические агенты для использования в способах изобретения включают, не ограничиваясь, амифозин (этиол), цисплатин, дакарбазин (DTIC), дактиномицин, мехлорметамин (азотистый иприт), стрептозоцин, циклофосфамид, каррнустин (BCNU), ломустин (CCNU), доксорубицин (адриамицин), доксорубицин липо (доксил), гемцитабин (гемзар), даунорубицин, даунорубицин липо (дауноксом), прокарбазин, митомицин, цитарабин, этопозид, метотрексат, 5-фторурацил (5-FU), винбластин, винкристин, блеомицин, паклитаксел (таксол), доцетаксел (таксотер), алдеслейкин, аспарагиназу, бусульфан, карбоплатин, кладрибин, камптотецин, CPT-I 1,10-гидрокси-7-этил-камптотецин (SN38), дакарбазин, S-I капецитабин, фторафур, 5'дезоксифторуридин, UFT, энилурацил, дезоксицитидин, 5-азацитозин, 5-азадеоксицитозин, ал
- 34 034552 лопуринол, 2-хлороаденозин, триметрексат, аминоптерин, метилен-10-деазааминоптерин (MDAM), оксаплатин, пикоплатин, тетраплатин, сатраплатин, платинум-DACH, или маплатин, CI-973, JM-216, и их аналоги, эпирубицин, этопозида фосфат, 9-аминокамптотецин, 10, 11-метилендиоксикамптотецин, каренитецин, 9-нитрокамптотецин, TAS 103, виндезин, L-фенилаланина иприт, ифосфамидмефосфамид, перфосфамид, трофосфамида кармустин, семустин, эпотилоны А-Е, томудекс, 6-меркаптопурин, 6тиогуанин, амсакрин, этопозида фосфат, каренитецин, ацикловир, валацикловир, ганцикловир, амантадин, римантадин, ламивудин, зидовудин, бевацизумаб, трастузумаб, ритуксимаб, 5-фторурацил, Капецитабин, Пентостатин, Триметрексат, Кладрибин, флоксуридин, флударабин, гидроксимочевину, ифосфамид, идарубицин, месна, иринотекан, митоксантрон, топотекан, леопролид, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, пликамицин, митотан, пегаспаргас, пентостатин, пипоброман, пликамицин, стрептозоцин, тамоксифен, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепа, урамустин, винорелбин, хлорамбуцил, цисплан, доксорубицин, паклитаксел (таксол) и блеомицин, и их комбинации, которые очевидны специалистам, основываясь на соответствующем стандарте лечения определенной опухоли или рака.
В другом варианте воплощения дополнительный агент для использования в комбинированной терапии изобретения является биологическим агентом.
Биологические агенты (также называемые биопрепаратами) являются продуктами биологической системы, например организма, клетки или рекомбинантной системы. Примеры таких биологических агентов включают молекулы нуклеиновых кислот (например, антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот), интерфероны, интерлейкины, колониестимулирующие факторы, антитела, например моноклональные антитела, антиангиогенные агенты и цитокины. Примеры биологических агентов более детально обсуждаются ниже и в массе своей принадлежат к различным классам, включая, например: 1) гормоны, гормональные аналоги и гормональные комплексы, например эстрогены и аналоги эстрогенов, прогестерон, аналоги прогестерона и прогестины, андрогены, адренокортикостероиды, антиэстрогены, антиандрогены, антитестостероны, ингибиторы стероида надпочечников и антилютеинизирующие гормоны; и 2) ферменты, белки, пептиды, поликлональные и/или моноклональные антитела, такие как интерлейкины, интерфероны, колониестимулирующие факторы и т.д.
В одном варианте воплощения биопродуктом является интерферон. Интерфероны (IFN) являются типом биологических агентов и естественным образом присутствуют в организме. Интерфероны также производятся в лабораторных условиях и их дают пациентам с раком при биологической терапии. Показано, что они улучшают действие иммунной системы пациентов с раком против раковых клеток.
Интерфероны могут работать прямо в раковых клетках, замедляя их рост, или же могут быть причиной изменения раковых клеток в клетки с более нормальным поведением. Некоторые интерфероны также могут стимулировать естественные киллерные (NK) клетки, Т-клетки и макрофаги, которые являются типами белых кровяных телец в кровотоке, помогающими бороться с раковыми клетками.
В одном варианте воплощения биопродукт является интерлейкином. Интерлейкины (IL) стимулируют рост и активность многих иммунных клеток. Они являются белками (цитокинами и хемокинами), которые естественным образом присутствуют в организме, но также могут быть сделаны в лабораторных условиях.
Некоторые интерлейкины стимулируют рост и активность иммунных клеток, таких как лимфоциты, которые работают на разрушение раковых клеток.
В другом варианте воплощения биопродукт является колониестимулирующим фактором.
Колониестимулирующие факторы (CSF) являются белками, которые дают пациентам для того, чтобы стволовые клетки в костном мозге вырабатывали больше кровяных клеток. Организм постоянно нуждается в новых белых кровяных клетках, красных кровяных клетках и тромбоцитах, особенно если имеется рак. CSF даются вместе с химиотерапией для того, чтобы помочь поддержать иммунную систему. Когда раковые пациенты получают химиотерапию, способность костного мозга вырабатывать новые кровяные клетки подавляется, что делает пациентов более подверженными развитию инфекций. Отдельные части иммунной системы не могут функционировать без кровяных клеток, таким образом колониестимулирующие факторы способствуют тому, чтобы стволовые клетки костного мозга вырабатывали белые кровяные клетки, тромбоциты и красные кровяные клетки.
При достаточном образовании клеток, другие способы лечения рака могут продолжаться, что дает пациентам возможность безопасного получения более высокой дозы химиотерапии.
В другом варианте воплощения биопродуктом является антитело. Антитела, например моноклональные антитела, являются агентами, производимыми в лабораторных условиях, которые связываются с раковыми клетками.
Когда разрушающие рак агенты вводятся в организм, они находят антитела и убивают раковые клетки. Агенты моноклональных антител не разрушают здоровые клетки. Моноклональные антитела достигают своего терапевтического эффекта благодаря различным механизмам. Они могут оказывать прямое влияние на появление апоптозов или программируемую гибель клеток. Они могут блокировать рецепторы факторов роста, эффективно останавливая пролиферацию опухолевых клеток. В клетках, которые экспрессируют моноклональные антитела, они могут привести к образованию анти-идиотипичных антител.
- 35 034552
Примеры антител, которые можно использовать в комбинированной терапии настоящего изобретения, включают анти-CD20 антитела, такие как, но не ограничиваясь, цетуксимаб, тозитумомаб, ритуксимаб и ибритумомаб. Лнти-ПВК2 антитела также могут быть использованы в комбинации с фактором влияния изобретения для лечения рака. В одном варианте воплощения, анти-НВК2 антителом является Трастузумаб (Герцептин). Другие примеры антител, которые могут быть использованы в комбинации с фактором влияния для лечения рака, включают анти-СП52 антитела (например, Ллемтузумаб), анти-CD22 антитела (например, Эпратузумаб), и анти-CD33 антитела (например, Немтузумаб озогамицин). ЛнтиVBGF антитела также могут быть использованы в комбинации с фактором влияния для лечения рака. В одном варианте воплощения анти-VBGF антителом является бевацизумаб. В других воплощениях биологическим агентом является антитело, которое является анти-BGFR антителом, например цетуксимабом. Другим примером является антигликопротеин 17-1Л антитело эдреколомаб.
В другом варианте воплощения биопродуктом является цитокин. Терапия цитокинами использует белки (цитокины), которые помогают иммунной системе субъекта распознавать и разрушать те клетки, которые являются раковыми. Цитокины образуются естественным образом в организме иммунной системой, но их также можно производить в лаборатории. Эта терапия используется при продвинутой меланоме и при вспомогательной терапии (терапии, которая дается после или в дополнение к основному лечению рака). Терапия цитокинами охватывает все части организма, убивая раковые клетки и подавляя рост опухолей.
В другом варианте воплощения биопродукт является гибридным белком. Например, рекомбинантный человеческий Apo2L/TRAIL (Генентеч) может быть использован в комбинационной терапии. Apo2/TRAIL является первым двойным про-апоптозным рецептором агонистом, разработанным для активации проапоптозных рецепторов DR4 и DR5, которые участвуют в регуляции апоптозов (программируемой гибели клеток).
В одном варианте воплощения биопродукт является молекулой антисмысловой нуклеиновой кислоты.
При использовании здесь, антисмысловая нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна смысловой нуклеотидной кислоте, кодирующей белок, например комплементарна кодирующей нити двунитевой молекулы кДНК, комплементарна последовательности мРНК или комплементарна кодирующей нити гена. Соответственно антисмысловая нуклеиновая кислота может связываться водородными связями со смысловой нуклеиновой кислотой.
В одном варианте воплощения биопродукт является миРНК молекулой, например, молекулой, которая усиливает ангиогенез, например, bFGF, VBGF и BGFR. В одном варианте воплощения биологический агент, который ингибирует ангиогенез, опосредует РНКи. РНК интерференция (РНКи) - это постранскрипционный процесс, который подавляет экспрессию определенных генов, использующий двунитевую РНК (днРНК) для деградации мессенджера РНК (мРНК), содержащего ту же последовательность, что и днРНК (Sharp, Р.Л. и Zamore, P.D. 287, 2431-2432 (2000); Zamore, P.D., et al. Cell 101, 25-33 (2000), Tuschl, T. et al. Genes Dev. 13, 3191-3197 (1999); Cottrell T.R. и Doering T.L. 2003. Trends Microbiol. 11:37-43; Bushman F.2003. Mol Therapy. 7:9-10; McManus M.T. и Sharp P.A. 2002. Nat Rev Genet. 3.73747). Процесс происходит, когда эндогенная рибонуклеаза расщепляет длинную днРНК на более короткие фрагменты, например, на РНК длиной 21 или 22 нуклеотида, называемые малыми интерферирующими РНК или миРНКРНЮ. Маленькие фрагменты РНК затем опосредуют деградацию целевой мРНК. Наборы для синтеза РНКи доступны в продаже, например, у New Bngland Biolabs или Ambion. В одном варианте воплощения может быть задействован один или более реактивов для использования в антисмысловой РНК в молекулах, которые опосредуют РНКи.
Использование антисмысловых нуклеиновых кислот для отрицательного регулирования экспрессии определенного белка в клетке хорошо известно специалистам (см., например, Weintraub, Н. et al., Лнтисмысловая РНК как молекулярный инструмент для генетического анализа, обзоры - тенденции в генетике, т. 1(1) 1986; Askari, F.K. и McDonnell, W.M. (1996) N. Bng. J. Med. 334:316-318; Bennett, M.R. и Schwartz, S.M. (1995) Circulation 92:1981-1993; Mercola, D. и Cohen, J.S. (1995) Cancer Gene Ther. 2:47-59; Rossi, JJ. (1995) Br. Med. Bull. 51.217-225; Wagner, R.W. (1994) Nature 372:333-335). Лнтисмысловая нуклеиновая молекула содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна кодирующей нити другой нуклеиновой молекулы (например, последовательность мРНК) и соответственно может водородными связями связываться с кодирующей нитью другой нуклеиновой молекулы. Лнтисмысловые последовательности, комплементарные последовательности мРНК, могут быть комплементарны последовательности, находящейся в кодирующем участке мРНК, в 5' или 3' нетранслирующем участке мРНК или участке, соединяющим кодирующий участок и нетранслирующий участок (например, связь 5' нетранслирующего участка и кодирующего участка). Кроме того, антисмысловая нуклеиновая кислота может быть комплементарна последовательности регуляторного участка гена, кодирующего мРНК, например последовательности инициации транскрипции или регуляторного элемента. Предпочтительно антисмысловая нуклеиновая кислота создана так, чтобы быть комплементарной участку, предшествующему или перекрывающему инициирующий кодон кодирующей нити или в 3' нетранслируемом участке мРНК.
Предоставляя последовательность кодирующей нити молекулы, которая усиливает ангиогенез, ан
- 36 034552 тисмысловые нуклеиновые кислоты изобретения могут быть созданы по правилам спаривания оснований Уотсона и Крика. Антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты может быть комплементарна всему кодирующему региогу мРНК, но более предпочтительны олигонуклеотиды, которые являются антисмысловыми только для части кодирующего или некодирующего участка мРНК. Например, антисмысловой олигонуклеотид может быть комплементарен участку, соседнему с сайтом начала трансляции мРНК. Длина антимыслового нуклеотида может составлять, например, около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов в длину.
Антисмысловая нуклеиновая кислота изобретения может быть создана с использованием химического синтеза и ферментных реакций лигирования с использованием процедур, известных специалистам. Например, антисмысловая нуклеиновая кислота (например, антисмысловой олигонуклеотид) может быть химически синтезирована с использованием существующих в природе нуклеотидов или различных модифицированных нуклеотидов, разработанных для повышения биологической стабильности молекул или повышения физической стабильности дуплексов, образованных между антисмысловой и смысловой нуклеиновой кислотами, например, могут быть использованы производные фосфоротиолата и нуклеотиды с замещенным акридином. Примеры модифицированных нуклеотидов, которые могут быть использованы в производстве антисмысловой нуклеиновой кислоты, включают 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5хлорурацил, 5-йодурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксиметил)урацил, 5карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометил урацил, дигидроурацил, бета-Dгалактозилквеуозин, инозин, Ыб-изопентениладенин, 1-метилгуанин, 1-метиллинозин, 2,2диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, Ыб-аденин, 7метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-О-маннозилквеуозин, 5'-метоксикарбоксиметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-Ыб-изопентениладенин, урацил-5оксиацетиловую кислоту (v), вибутоксозин, псевдоурацил, квеуозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, урацил-5-оксиацетиловую кислоту, метиловый эфир оксиацетиловой кислоты, урацил-5-окиацетиловую кислоту (v), 5-метил-2-тиоурацил, 3-(3-амино-3-Ы-2карбоксипропил) урацил, (acp3)w, и 2,б-диаминопурин. Для подавления экспрессии в клетках, можно использовать один или более антисмысловых олигонуклеотидов. Альтернативно, антисмысловая нуклеиновая кислота может быть произведена биологически, с использованием вектора экспрессии, в котором нуклеиновая кислота субклонирована в антисмысловой ориентации (т.е. РНК, транскрибируемая из встроенной нуклеиновой кислоты, будет в антисмысловой ориентации по отношению к целевой нуклеиновой кислоте, что будет описано в дальнейшем в соответствующем разделе).
В еще одном варианте воплощения молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты изобретения является а-аномерной молекулой нуклеиновой кислотой. а-Аномерная нуклеиновая кислота образует специфические двунитевые гибриды с комплементарной РНК, в которых, в отличие от обычных а-единиц, нити располагаются параллельно друг другу (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:бб25-бб41). Молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты может также включать 2'-о-метилрибонуклеотид (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:б131-б148) или химерный РНК-ДНК аналог (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).
В другом варианте воплощения антисмысловая нуклеиновая кислота изобретения является соединением, которое опосредует РНКи. РНК интерферирующие агенты включают, не ограничиваясь, молекулы нуклеиновых кислот, включая РНК молекулы, которые являются гомологами целевых генов или геномных последовательностей, малой интерферирующей РНК (миРНК), короткой шпильки или малой шпильки РНК (мшРНК), и малых молекул, которые интерферируют или подавляют экспрессию целевого гена путем РНК-интерференции (РНКи). РНК интерференция (РНКи) - это постранскрипционный процесс, который подавляет экспрессию определенных генов, использующий двунитевую РНК (днРНК) для деградации мессенджера РНК (мРНК), содержащего ту же последовательность, что и днРНК (Sharp, P.A. и Zamore, P.D. 287, 2431-2432 (2000); Zamore, P.D., et al. Cell 101, 25-33 (2000). Tuschl, T. et al. Genes Dev. 13, 3191-3197 (1999)). Процесс происходит, когда эндогенная рибонуклеаза расщепляет длинную днРНК на более короткие фрагменты, например на РНК длиной 21 или 22 нуклеотида, называемые малыми интерферирующими РНК или миРНКРН^. Маленькие фрагменты РНК затем опосредуют деградацию целевой мРНК. Наборы для синтеза РНКи доступны в продаже, например, у New England Biolabs или Ambion. В одном варианте воплощения может быть задействован один или более реактивов, описанных выше для использования в антисмысловой РНК.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие молекулы, которые, например, ингибируют ангиогенез, могущие быть введены субъекту в форме, подходящей для экспрессии кодируемого белка в клетках субъекта, также могут быть использованы в способах изобретения. Примеры молекул, которые ингибируют ангиогенез, включают, не ограничиваясь, TSP-I, TSP-2, IFN-g, IFN-a, ангиостатин, эндостатин, тумастатин, канстатин, VEGI, PEDF, вазогибин и 1б кДа фрагмент пролактина 2-метоксиэстрадиола (см. Kerbel (2004) J. Clin Invest 114:884, в качестве обзора).
Например, полноразмерная или частичная последовательность кДНК клонируется в рекомбинантном векторе экспрессии, и вектор вводится в клетку с использованием стандартных техник молекулярной биологии. аДНК может наблюдаться, например, при амплификации с использованием полимеразно
- 37 034552 цепной реакции (ПЦР) или путем скринирования соответствующей библиотеки сДНК. Нуклеотидные последовательности кДНК могут использоваться для создания праймеров для ПЦР, которые позволяют амплифицироваться сДНК стандартными ПЦР-методами или для разработки гибридизационной пробы, которая может использоваться для скринирования сДНК библиотеки с использованием стандартных методов гибридизации. После выделения или амплификации кДНк фрагменты ДНК вводятся в подходящий вектор экспрессии.
Примеры биологических агентов для использования в способах изобретения включают, не ограничиваясь, гефитиниб (Iressa), анастразол, диэтилстилбестерол, эстрадиол, премарин, ралоксифен, прогестерон, норэтинодрел, эстистерон, диместистерон, ацетат мегестрола, ацетат медроксипрогестерона, капроат гидроксипрогестерона, норэтистерон, метилтестостерон, тестостерон, дексамтазон, преднизолон, кортизол, солюмедрол, тамоксифен, фулвестрант, торемифен, аминоглутетимид, тестолактон, дролоксифен, анастрозол, бикалутамид, флутамид, нилутамид, гозерелин, флутамид, леупролид, трипторелин, аминоглутетимид, митотан, гозерелин, цетуксимаб, эрлотиниб, иматиниб, Тозитумомаб, Алемтузумаб, Трастузумаб, Гемтузумаб, Ритуксимаб, Ибритумомама тиуксетан, Бевацизумаб, Денилейкин дифтитокс, Даклизумаб, интерферон альфа, интерферон бета, анти-4-lBB, анти-4-lBBL, анти-CD40, анти-CD 154, анти-ОХ40, анти-ОХ40L, анти-CD28, анти-CD80, анти-CD86, анти-CD70, анти-CD27, анти-HVEM, антиLIGHT, анти-GITR, анти-GITRL, анти-CTLA-4, растворимый OX40L, растворимый 4-IBBL, растворимый CD154, растворимый GITRL, растворимый LIGHT, растворимый CD70, растворимый CD80, растворимый CD86, растворимый CTLA4-Ig, GVAX®, и их комбинации, которые очевидны специалистам на основе соответствующих стандартов лечения определенной опухоли или рака. Растворимые формы агентов могут быть сделаны как, например, гибридные белки, путем связи агента, например, с Ig-Fc участком.
Следует заметить, что более чем один добавочный агент, например 1, 2, 3, 4, 5, может быть введен в комбинации с фактором влияния. Например, в одном варианте воплощения два химиотерапевтических агента могут быть введены в комбинации с фактором влияния. В другом варианте воплощения могут быть введены химиотерапевтический агент, биологический агент и фактор влияния.
Могут быть использованы различные формы биологических агентов. Они включают, без ограничений, такие формы, как молекулы-предшественники, незаряженные молекулы, молекулярные комплексы, соли, эфиры, амиды и тому подобные, которые являются биологически активными, будучи имплантированы, инъецированы или иным образом введены в опухоль.
Настоящее изобретение в дальнейшем иллюстрируется следующими примерами, которые не следует рассматривать как ограничивающие. Содержание всех ссылок и опубликованных патентов и заявок на патенты, цитируемых в заявке, включены в настоящую заявку путем ссылки.
Примеры изобретения
Настоящее изобретение, описанное на данный момент в целом, будет лучше понято благодаря ссылкам на следующие примеры, которые включены только с целями иллюстрации определенных аспектов и модификаций настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как ограничивающие изобретение, поскольку специалист распознает из данных здесь описаний и следующих примеров другие способы, агенты, соединения или способы анализа данных, все без ограничения, которые могут быть применены, не выходя за заявленный объем формулы изобретения.
Содержание всех патентов, заявок на патенты, публикаций патентов или научных статей, цитируемых в любом месте этой заявки, включены в настоящую заявку путем ссылки в полном объеме.
Практика настоящего изобретения использует, в случае соответствия и если не указано иное, стандартные техники клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, вирусологии, рекомбинатной ДНК и иммунологии, известные специалистам. Такие техники описаны в литературе; см., например, Молекулярное клонирование: лабораторное пособие, 3-е изд., под ред. Sambrook и Russell (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 2001); учебник Способы в энзимологии (Academic Press, Inc., N.Y.); Применение антител, вторая редакция под ред. Harlow и Lane, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Действующие протоколы в клеточной биологии, под ред. Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford, и Yamada, John Wiley и Sons, Inc., New York, 1999; и Протоколы ПЦР, под ред. Bartlett et al., Humana Press, 2003.
Пример 1. Идентификация CoQ10 как МВМ.
Для того чтобы оценить CoQ10 как потенциальную МВМ, CoQ10 в окисленной форме был экзогенно добавлен к группе клеточных линий, включая как линии раковых клеток, так и линии нормальных контрольных клеток, и были оценены изменения, вызванные в профиле клеточного микроокружения для каждой клеточной линии из группы. Были оценены изменения в клеточной морфологии/физиологии и в составе клетки, включая уровни мРНК и белков, и проведено сравнение по этим параметрам больных и здоровых клеток. Результаты этих экспериментов идентифицировали CoQ10 и в особенности окисленную форму CoQ10, как МВМ.
В первой серии экспериментов изменения в клеточной морфологии/физиологии были оценены при исследовании чувствительности и апоптозного ответа клеток к CoQ10. Группа линий клеток кожи, включающая контрольные клеточные линии (в первую очередь культуру кератиноцитов и меланоцитов) и несколько линий раковых клеток кожи (SK-MEL-28, неметастазирующая меланома кожи; SK-MEL-2,
- 38 034552 метастазирующая меланома кожи; или SCC, плоскоклеточная карцинома; РаСа2, клеточная линия рака поджелудочной железы; или HEP-G2, клеточная линия рака печени) были подвергнуты воздействию различных концентраций коэнзима Q10. Результаты этих экспериментов показывают, что линии раковых клеток демонстрируют дозозависимый ответ, отличный от ответа линий контрольных клеток, при этом индукция апоптоза и смерть клеток происходят только в раковых клетках. Примеры экспериментов описаны детально в примере 3 ниже.
Затем были проведены исследования для оценки изменений в составе клеток после обработки CoQ10. Изменения в экспрессии генов на уровне мРНК анализировались с использованием метода ПЦР в режиме реального времени. Примеры экспериментов описаны детально в примерах 6 и 9-13 ниже. В дополнительных экспериментах изменения в экспрессии генов по уровню белка анализировались с использованием метода антител на микрочипах, 2-мерного гель электрофореза, за которым следовала идентификация белка с использованием масс-спектрометрии, и иммуноблоттинга. Примеры экспериментов описаны детально ниже в примерах 4, 7 и 8 соответственно. Результаты этих исследований демонстрируют, что важные изменения в экспрессии генов как по уровню мРНК, так и по уровню белка, были вызваны в исследуемых клеточных линиях благодаря добавлению окисленной формы CoQ10. Было обнаружено, что гены, модулированные воздействием CoQ10, группировались по различным клеточным путям, включая апоптозы, биологию рака и роста клетки, гликолиз и метаболизм, молекулярный транспорт и клеточный сигналинг.
Были проведены эксперименты для подтверждения вхождения CoQ10 в клетку и определения концентрации и формы CoQ10, присутствующего в клетке. В частности, концентрация коэнзима Q10, а также форма CoQ10 (т.е. окисленная или восстановленная), присутствующего в митохондриях, была определена путем анализа богатых митохондриями препаратов, выделенных из клеток, обработанных CoQ10. Было подтверждено, что концентрация коэнзима Q10, присутствующего в митохондриях, возрастает время- и дозозависимым образом при добавлении экзогенного Q10. Непредсказуемым и неожиданным результатом явилось то, что было установлено присутствие CoQ10 в митохондриях преимущественно в окисленной форме. Кроме того, изменения в концентрациях белков из богатых митохондриями образцов были проанализированы с использованием 2-D гель электрофорезов и идентификации белка путем массспектрометрии. Результаты этих экспериментов показали, что концентрации окисленной формы CoQ10 в митохондриях, определяемые на различных временных точках, коррелируют с широким многообразием клеточных изменений, что доказывается путем модуляции мРНК и концентраций белка для специфических белков, связанных с путями метаболизма и апоптоза. Примеры экспериментов детально описаны в примере 5 ниже.
Результаты, описанные здесь в Приложениях, идентифицировали эндогенную молекулу CoQ10 и в особенности окисленную форму CoQ10, как МВМ. Например, результаты идентифицировали CoQ10 как МВМ, поскольку наблюдалось, что CoQ10 вызывал изменения в экспрессии генов как по уровню мРНК, так и по уровню белка. Результаты показали, что CoQ10 имеет многоаспектный характер, поскольку CoQ10 вызывал различные изменения в клеточной морфологии/физиологии и клеточном составе (например, различные изменения в экспрессии генов как по уровню мРНК, так и по уровню белка), в состоянии болезни (например, раке) по сравнению с нормальным (например, нераковым) состоянием. Больше того, результаты показали, что CoQ10 имеет многоаспектный характер, поскольку CoQ10 был способен входить в клетки и таким образом демонстрировал как терапевтическое действие, так и функции носителя.
Пример 2. Способы идентификации связанных с болезнью процессов и биомаркеры онкологических заболеваний.
Из клеточных исследований, в которых клеточные линии обрабатывались изучаемыми молекулами, по количеству мРНК, количеству белковых антител и по 2D гель-электрофорезу были оценены различия между обработанными и необработанными клетками. Белки, идентифицированные по сравнительным анализам образцов как модулированные МВМ или эпи-переключателем, оценивались по перспективе системной биологии с использованием анализа метаболизма (программа Ingenuity IPA) и обзору известной литературы. Белки, идентифицированные как потенциальные терапевтические или биомаркерные мишени, подвергались подтверждающим анализам, таким как иммуноблоттинг, нокаут миРНК или создание рекомбинантных белков и характеризующие способы.
Материалы и способы для примеров 3-8.
Коэнзим Q10 исходный раствор.
А 500 мкМ коэнзима Q10 (5% изопропанол в среде для роста клеток) был приготовлен следующим образом. 10 мл 500 мкМ исходного раствора коэнзима Q10 приготовлялся свежим каждый раз.
Молекулярный вес: 863,34 (0,0005 моль/л)(0,010 л)(863,34 г/моль) = 0,004317 г.
Чтобы приготовить 10 мл 500 мкМ исходного раствора, 4,32 мг коэнзима Q10 взвешивалось в 15 мл пробирке Falcon, и добавлялось 500 мкл изопропанола. Раствор нагревался на 50-60°С водяной бане при перемешивании до полного растворения. К этому раствору добавлялось 9,5 мл среды (той же среды, в которой росли клетки).
Клеточная культура.
- 39 034552
Клетки были получены из коллекции культур американского типа или Gibco. Клетки выращивались в среде DMEM/F-12 с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки, 0,25 мкг/мл амфотерицина,
100 мкг/мл стрептомицина и 100 U мл-1 пенициллина. Клетки содержались в атмосфере 95% воздуха и
5% СО2 при 37°С.
Обработка коэнзимом Q10 и выделение общего белка.
Клетки росли до 85% заселенности до того, как их подвергали влиянию Q10. В среду добавили Q10 в таком количестве, чтобы получить 50 и 100 микромолярные концентрации. Колбы были разделены на контроль, 50 мкМ Q10 и 100 мкМ Q10. Белок был выделен из обработанных и контрольных колб через 4, 8, 12 и 24 ч. Для выделения белков клетки были промыты три раза 5 мл ледяного PBS с рН 7,4. Затем клетки были промыты в 3 мл PBS, осаждены центрифугированием и ресуспендированы в лизирующем буфере с рН 7,4 (80 мМ TRIS-HCl, 1% SDS, с ингибиторами протеазы и фосфатазы). Концентрации белка были подсчитаны с использованием метода ВСА.
Клеточные линии.
Клеточные линии, перечисленные ниже, были размножены и для каждой создан клеточный банк. Было получено большое число клеток для различных исследований и собран материл для анализов. Как правило, когда для поддержания клеточных линий не требовалась определенная клеточная среда, используемой для роста клеток средой была DMEMF-12 с 5% сывороткой. Клетки как правило росли до 7580% заселенности (свободного пространства) перед сбором и использованием в клеточных исследований и последующими стандартными способами. Для экспериментов были взяты следующие клеточные линии:
SK-MEL-28 (неметастазирующая меланома кожи),
SK-MEL-2 (метастазирующая меланома кожи),
HEKa (кератиноциты, кожный контроль),
НЕМа (меланоциты, кожный контроль), nFIB (неонатальные фибробласты),
HEP-G2 (рак печени) [SBH линия клеток],
SkBr-3 (рак молочной железы, Her2 сверхэкспрессия),
MCF-7 (рак молочной железы, р53 мутация),
РС-3 (рак простаты) [SBH линия клеток],
SkBr-3 (аденокарцинома молочной железы человека),
NCI-ES-0808 SCC (плоскоклеточная карцинома),
РаСа-2,
NIH-3T3.
Клеточная культура.
Клетки были получены из коллекции культур американского типа или Gibco. Клетки выращивались в среде DMEM/F-12 с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки, 0,25 мкг/мл амфотерицина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 U мл-1 пенициллина. Клетки содержались в атмосфере 95% воздуха и 5% СО2 при 37°С.
Клетки злокачественной меланомы кожи SK-MEL28 росли и содержались DMEM/F12 с Глютамаксом (Invitrogen, Carlsbad, Калифорния) с добавкой 5% FBS, амфотерицина и пенициллина/стрептомицина. Клетки росли при 37°С с 5% СО2. Детали дополнительных клеточных линий и условий роста перечислены в таблице ниже.
Таблица 1
Клеточные линии, анализированные на чувствительность к Q10
Клеточная линия Описание Условия роста
РаСа2 Карцинома поджелудочной железы DMEM/F12 с Глютамакс + 10%FBS, 2.5% лошадиная сыворотка, амфотерицин, пенициллин/стрептомицин.
HepG2 Г епатоцеллюлярная карцинома МЕМ с солями Earles с добавлением 10% FBS, амфотерицина, пенициллина/стрептомицина, пирувата натрия и заменимых аминокислот.
РСЗ Аденокарцинома простаты DMEM/F12 с Глютамакс с добавлением 5%FBS, амфотерицина и пенициллина/ стрептомицина.
SKBr3 Рак молочной железы DMEM/F12 с Глютамакс с добавлением 5% FBS и амфотерицина, пенициллина/ стрептомицина.
MCF-7 Рак молочной железы DMEM/F12 с Глютамакс с добавлением 5% FBS и амфотерицина, пенициллина/ стрептомицина.
Обработка Q10 SKMEL28 клеток.
- 40 034552
SK-MEL28 клетки были обработаны 100 мкМ Q10 или контрольным раствором. Q10 был приготовлен следующим образом. В 15 мл пробирку с крышкой было перенесено 4,32 мг Q10 (производство Cytotech) и затем растворено добавлением 500 мкл изопропанола. Получившийся раствор был нагрет на 65°С водяной бане и размешан на вортексе на большой скорости. Раствор Q10/изопропанола был доведен до объема 10 мл добавлением отстоявшейся среды для клеточной культуры. Исходный раствор затем был размешан на вортексе для достижения максимальной растворимости Q10. Исходный раствор был разведен (2 мл исходного раствора и 8 мл среды) для получения конечной концентрации 100 мкмМ Q10. Для контрольного раствора к 9,5 мл среды было добавлено 500 мкл изопропанола. Контрольный исходный раствор был затем разведен (2 мл исходного раствора) 8 мл среды. Клетки собирались через 6, 16, 24, 48 или 72 ч после начала обработки.
Обработка клеток Q10 SCC.
SCC клетки были обработаны 100 мкМ Q10 (подготовленным, как описано выше) или 6, или 24 ч. Контрольными клетками были необработанные клетки. Клетки были собраны и осаждены через различное время после обработки и осадок был заморожен свежим и хранился при -80°С, пока РНК не было выделено по XTAL, как описано ниже.
Выделение РНК.
Клетки после различного времени обработки были лизированы для выделения РНК с использованием RNeasy Mini kit (Qiagen, Inc., Valencia CA) no инструкциям производителя. РНК было подсчитано путем определения оптической плотности при 260 нм.
Синтез первой нити.
Первая нить кДНК была синтезирована с 1 мкг общей РНК с использованием набора для синтеза первой нити RT2 (SABiosciences., Frederick Мэриленд) по рекомендациям производителя.
ПНР в режиме реального времени.
Продукты синтеза первой нити были растворены в воде, смешаны с SYBR зеленой мастер-микс (реакционная смесь, SABiosciences., Frederick, Мэриленд) и помещены в прибор для ПЦР анализа. ПЦР в режиме реального времени была осуществлена для нескольких аналитических наборов (апоптозные анализы, диабетические анализы, анализы окислительного стресса и оксидантной защиты, и анализы белков теплового шока) (SABiosciences, Frederick, Мэриленд) на Biorad CFX96.
Определение чувствительности клеточных линий к коэнзиму Q10 путем Nexin анализа для апоптозов.
Процент клеток в раннем и позднем апоптозах был подсчитан через 24 ч после обработки коэнзимом Q10. Ранний и поздний апоптозы использовались как маркеры для понимания различий в чувствительности различных линий раковых клеток к коэнзиму Q10. Различными тестируемыми клеточными линиями были РаСа2, HepG2, РС-3, SKBr3, MCF-7 и SK-MEL28. Клеткам дали адгезировать в течение ночи в 96-луночных планшетах. Эти клетки были обработаны контрольным раствором, 50 мкМ Q10 или 100 мкМ коэнзима Q10. Через 24 ч наличие апоптозных клеток было оценено на проточном цитометре РСА96 (Guava Technologies, Hayward, Калифорния). Кроме того, некоторые клетки были обработаны 4 мкМ Стауроспорином в течение 2 ч в качестве позитивного контроля на апоптозы. Клетки были промыты PBS и диссоциированы 50 мкл Accumax (Innovative Cell Technologies, San Diego, Калифорния) при комнатной температуре. Диссоциация была остановлена добавлением культуральной среды, содержащей 1% Pluronic F-68 (Sigma-Aldrich, St.Louis, Миссури). Затем 100 мкл Nexin реагента (Guava Technologies, Hayward, Калифорния) было добавлено в каждую лунку. Через 20 мин инкубации в темноте исследование проводилось в чашках со слабой адгезией для минимизации повторного присоединения клеток к субстрату. Nexin реагент содержит два красителя. Annexin-V-PE, который определяет уровень фосфотидил серина на внешней стороне клеток, характеризирует ранние апоптозные клетки. Второй краситель, 7AAD проникает только в поздние апоптозные клетки, что отличает их от живых (здоровых) и ранних апоптозных клеток. Процент четырех популяций клеток: живых, ранних апоптозных, поздних апоптозных и остатков клеток определялся с использованием программы Cytosoft 2.5.7 (Guava Technologies, Hayward, Калифорния).
Иммуноблоттинг.
Примерно 50 мкг белка исследовалось на образец путем иммуноблоттинга. Все эксперименты были поставлены трижды плюс контроль. Белки были разделены в 12% TRIS-HCl геле, перенесены путем электрофореза на нитроцеллюлозные мембраны и блокированы с использованием 5% сыворотки и TBST раствором перед инкубацией с первичными антителами. Первичные антитела инкубировались в течение ночи при 4°С в 5% BSA и TBST растворе. Вторичные антитела инкубировались в течение 1 ч при 4°. Все антитела были получены по технологии клеточной сигнализации. Антитела были использованы в соотношении 1:1000, за исключением β-актина, соотношение которого составляло 1:5000. Блоты были получены и результаты были подсчитаны с использованием NIH Java денсинометра и программы Image J. Все блоты были также исследованы и нормализованы по соответствующей экспрессии β-актина.
Двухмерные электрофорезы.
Перед изоэлектрическим фокусированием (IEF) образцы были растворены в 40 мМ Tris, 7 М моче
- 41 034552 вине, 2 М тиомочевине и 1% С7 цвиттерионным детергентом, восстановлены трибутилфосфином и алкилированы 10 мМ акриламидом в течение 90 мин при комнатной температуре. После этого образцы были проведены через 10-кДа прибор Amicon Ultra по меньшей мере с 3 объемами ресуспендирующего буфера, содержащего 7 М мочевину, 2 М тиомочевину и 2% CHAPS для восстановления проводимости образца. Одна сотня микрограмм белка была подвергнута IEF при 11-см рН от 3 до 10, рН от 4 до 7 или рН от 6 до 11 на полосках с фиксированным градиентом рН (GE, Amersham, USA) 100,000 вольт-час. После IEF, полоски с фиксированным градиентом рН были откалиброваны в 6 М мочевине, 2% SDS, 50 мМ Tris-ацетат буфере, рН 7,0, и 0,01% бромфеноле голубом и поставлен SDS-полиактриламид гель электрофорез на 8-16% Tris-HCl Precast Gel, 1 мм (Bio-Rad, USA). Электрофорезы в геле были поставлены дважды. Затем они останавливались в SYPRO Ruby, 80 мл/гель (Invitrogen, USA) и получали их изображение на Fuji FLA-5100 лазерном сканере или переносили на PVDF мембрану.
Дополнительная информация была получена для контрольных образцов для определения полезности белковой идентификации при использовании способов, которые используют dPC (Protein Forest Inc.) избирательное pI фракционирование, за которым следует трипсиновое расщепление dPC комплексом с масс-спектрометрии идентификацией и полу-подсчетом (Nanomate или LC/LTQ/MS). dPC анализы, проведенные с контрольными образцами, показали свою полезность для идентификации большой субпопуляции белков. Материалы, полученные в ходе исследований, были направлены в архив, так чтобы их можно было использовать в качестве источника для необходимых в будущем исследований.
Анализ изображений 2D-геля.
Анализы всех изображений геля были осуществлены с использованием Progenesis Discovery и Pro (Nonlinear Dynamics Inc., Newcastle upon Tyne, Великобритания). После детекции точек, совмещения, фоновой субтракции, нормализации и фильтрации данные для SYPRO Ruby гель изображений были экспортированы. Парные сравнения между группами были проведены с использованием критерия Стьюдента для идентификации точек, экспрессия которых достоверно изменилась (р > 0,05).
Исследование с помощью антител.
Микрочип для антител (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma) был использован для скринингового исследования с помощью 700 белковых антител для оценки изменений в уровнях концентрации белков в обработанных Q10 клетках (SK-MEL-28, SCC). Экспрессия белка в клеточном экстракте устанавливалась, когда белок связывался с соответствующим антителом, помещенным на пластинку. Перед связыванием белки прямо метились флюоресцентным красителем, который потом использовался для флюоресцентной визуализации и количественного анализа. Исследование использовалось для сравнения белковых профилей экспрессии в двух образцах (исследуемый и референсный образцы), каждый метился различным Су красителем (Су3 или Су5) и два образца использовались совместно в равных белковых концентрациях в исследовании. Интенсивность флюоресцентного сигнала для каждого образца затем записывалась отдельно на длине волны, соответствующей красящей метке образца, и сравнивалась.
Высокие дозы коэнзима Q10 регулируют экспрессию генов, включенных в апоптозный, диабетический и окислительного стресса пути в культивируемых SKMEL-28 клетках.
Детали эксперимента.
SKMEL-28 клетки (АТСС Каталог # НТВ-72) являются неместастазирующими клетками меланомы кожи, которые выращивались в среде DMEM/F-12, содержащей Глютамакс (Invitrogen Cat# 10565-042), с добавлением 5% FBS, пенициллина, стрептомицина и амфотерицина, были обработаны средой или 100 мкМ коэнзима Q10 в течение различного времени. Любые изменения в экспрессии генов, следовавшие за обработкой коэнзимом Q10, были подсчитаны с использованием методов ПЦР в режиме реального времени (Apoptosis Cat #PAHS-12, Diabetes Cat #PAHS-023 и Oxidative Stress Cat #PAHS-065) (SABiosciences, Frederick, Мэриленд).
Исходная концентрация 500 мкМ коэнзима Q10 была приготовлена путем растворения 4,32 мг в 500 мкл изопропанола, который затем разводился до 10 мл добавлением среды. Альтернативно выполналось перемешивание и нагрев до 65°С растворенного Q10. 2 мл исходного раствора разводилось до 10 мл средой для получения среды, содержащей 100 мкМ Q10, которая использовалась для обработки клеток. Параллельно приготовлялся контрольный раствор по тому же протоколу, за исключением того, что коэнзим Q10 не добавлялся.
SKMEL-28 клетки были помещены с плотностью 1х 105 клеток на лунку в 6-луночный планшет. Через 24 ч, когда клетки прикрепились и заселенность составляла 50%, добавили контрольный раствор или 100 мкМ Q10. Клетки были собраны через 6, 16, 24, 48 или 72 ч после обработки Q10, а обработанные контрольным раствором клетки были собраны через 24 ч. Клетки лизировались для выделения РНК в течение различного времени обработки с использованием мини-набора RNeasy (Qiagen, Inc., Valencia, Калифорния, Cat #74104) по инструкциям производителя с использованием микроцентрифуги и обработки ДНКазой. Количество РНК определялось при определении оптической плотности на 260 нм.
ПЦР в режиме реального времени проводилось путем синтеза с первой нити кДНК с использованием 0,4-1 мкг общей РНК в качестве матрицы с использованием набора синтеза первой нити RT2 (SABiosciences., Frederick, Мэриленд, Cat# C-03) с этапом элиминации геномной ДНК в соответствии с рекомендациями производителя. Продукты синтеза с первой нити были растворены в воде, смешаны с SYBR
- 42 034552 зеленой мастер-микс (реакционная смесь, SABiosciences., Frederick, Мэриленд, Cat#PA-010-12) и с ними были проведены ПЦР-анализы с праймерами для 84 различных генов, связанных с обычным метаболизмом, 5 конститутивных генов, использованных для нормализации, обратной транскрипции и ПНРконтроля. ПЦР в режиме реального времени проходила в Biorad Cfx96. Амплификация была начата горячим стартом для активации фермента, продолжалась 40 циклов (95°С - 15 с этап денатурации и 60°С - 1 мин этап отжига и удлинения), с последующей программой кривой плавления. Значения Ct, полученные от ПЦР термоциклера по всем обработанным группам, были занесены в таблицу Excel и загружены в программу сравнительного анализа, доступную по адресу www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php.
Очистка богатых митохондриями образцов.
Детали эксперимента: SKMEL-28, NCI-ES0808 и NIH-3T3 клетки, обработанные 100 мкМ Q10 24 или 48 ч вместе с клетками, которые были собраны при t=0, промыты и извлечены из колб Т160. Клетки центрифугировали, собрали осадок, заморозили и хранили при -80°С до выделения митохондрий. Клеточный осадок был разморожен, ресуспендирован и измельчен в гомогенизаторе Даунса. Гомогенат был центрифугирован и митохондрии выделены с использованием реагентов и протокола, рекомендованных набором выделения митохондрий для культурных клеток (MitoSciences, Eugene, Орегон, Cat # MS852). Фракция митохондрий была разделена на аликвоты и хранилась при -80°С.
Способ подсчета Коэнзима Q10 и Убихинола-10.
Способ одновременного определения коэнзима Q10 (Q10) и восстановленной формы убихинола-10 (Q10H2) был выполнен на основе недавно опубликованного способа (Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chromatogr. A, 1175, 242-248) благодаря использованию LC-MS/MS с ионизацией электрораспылением (ESI) в режиме определения положительных ионов. Возможны высоко избирательная идентификация и чувствительный подсчет Q10 и Q10H2, вкупе с идентификацией других выбранных липидов. Аликвота богатых митохондриями образцов из SK-MEL-28, обработанных 100 мкМ Q10, была подвергнута стандартной преобработке, основанной на осаждении белка (100 мкл клеточного осадка, диспергированного ультразвуком в 300 мкл 1-пропанола), экстракции жидкость-жидкость (добавить 100 мкл воды к супернатанту и экстрагировать Х3 200 мкл н-гексана), выпаривании комбинированных гексановых экстрактов до высыхания и восстановление в 50 мкл 95:5 метанол/гексан (по объему). Анализ был проведен LC-MS/MS на Waters Quattro II тройном квадрупольном масс-спектрометре с Prism RP 1 X 100 мм, колонками с частицами размером 5 мкм (Keystone Scientific). Изократическое элюирование с 4 мМ формиата аммония в смеси 20% изопропилового спирта и 80% метанола со скоростью потока 50 мкл/мин. Было введено 10 мкл каждого образца. MRM анализ был проведен с использованием m/z 882,7>197,00 (Q10H2) и m/z 880,80>197,00 (Q10) переходов с напряжением на конусе 40 и энергией столкновений 30.
Пример 3. Чувствительность клеточных линий к CoQ10.
Множество клеточных линий тестировались на чувствительность к Q10 после 24 ч обработки с использованием реагента (Nexin реагент), который содержит два типа красителей, 7AAD и Annexin-V-PE. Краситель 7-AAD проникает в клетки с проницаемой мембраной, в первую очередь в те клетки, которые находятся на поздней стадии апоптоза. Annexin-V-PE - это краситель, который связывается с фосфотидил серином, который появляется на внешней поверхности плазматической мембраны у ранних апоптозных клеток. Nexin реагент таким образом может быть использован для различения популяций апоптозных клеток в проточном цитометре.
РаСа2 клетки показали увеличение как ранних, так и поздних апоптозных клеток (5-10% отобранных клеток) с 50 и 100 мкМ Q10 после 24 ч обработки Q10. РС-3 клетки также показали увеличение как ранней, так и поздней апоптозной популяции с 50 и 100 мкМ Q10, хотя возрастание было меньше по сравнению с РаСа2 клетками. MCF-7 и SK-MEL28 клетки показали возрастание только ранней апоптозной популяции с 50 и 100 мкМ Q10. HepG2 клетки также были чувствительны к обработке 50 мкМ Q10, где наблюдалось возрастание поздних апоптозных и ранних апоптозных стадий на около 20% от отобранных клеток. SKBr3 была единственной исследованной клеточной линией, которая не показала никакого значимого увеличения ранних и поздних апоптозов при обработке как 50, так и 100 мкМ Q10. Результаты представлены на фиг. 1-6.
Для того чтобы получить дополнительное подтверждение, что воздействие Q10 приводит к апоптозному ответу у HepG2 раковых клеток печени, второе апоптозное исследование было оценено с использованием основанного на ApoStrand™ ELISA метода, где подсчитывались однонитевые ДНК. ApoStrand™ ELISA основывается на чувствительности ДНК в апоптозных клетках к денатурации формамидом и на детекции денатурированных ДНК моноклональными антителами к однонитевым ДНК (онДНК). Обработка раковых клеток печени линии HepG2 50 и 100 мкМ Q10 привела к детектируемым апоптозам, с дозозависимым ответом в 17 и 32% соответственно (фиг. 7). Эти результаты совпадают с наблюдением индуцированных Q10 апоптозов в других линиях раковых клеток из других тканей (например, SCC, SKMEL-28, MCF-7 и РС-3).
Пример 4. Протеомический анализ клеток, обработанных Q10.
Клеточный осадок образцов, обработанных Q10, был анализирован с использованием протеомичеких методов. Клеточные осадки были лизированы и обработаны с использованием 2-D геля и иммуноб- 43 034552 лоттинга. Три клеточных типа (SKMEL-28, SCC, и nFib) были обработаны Q10 и подвергнуты протеомитической характеристике путем 2-D гель электрофореза.
Протеометический анализ SKMEL-28 клеток, обработанных Q10.
В первой экспериментальной серии, проведенной и оцененной путем иммуноблоттинга и 2-D гель электрофореза, участвовала линия клеток рака кожи SKMEL-28. Эта экспериментальная серия включала SK-MEL-28 клетки, обработанные 3, 6, 12 и 24 ч 0, 50 или 100 мкМ Q10.
Обработанные Q10 образцы SK-MEL-28 были подвергнуты 2-D гель электрофорезу (фиг. 8) и анализировались на идентификацию изменений в концентрациях белка по сравнению с контрольными образцами. Был проведен сравнительный анализ 943 точек в двадцати четырех гелях, где сравнивались контрольный образец и все обработанные образцы. Анализы включали идентификацию изменений на точках во времени, из-за возрастания, снижения или пост-трансляционной модификации.
Анализы обнаружили тридцать два статистически достоверно различимых точечных изменений. По ним двадцать статистически неопределимых точки были извлечены и подвергнуты белковой идентификации путем расщепления трипсином и масс-спектрометрии. Охарактеризованные пептиды были найдены в белковой базе данных с помощью аналитической программы Mascot и MSRAT для идентификации белков (табл. 2).
Таблица 2
Белки, идентифицированные как показавшие различную реакцию на обработку Q10 в клетках SKMEL-28
Время (Ч) О|и Копп мк\ 11 2D точка # Экспрессия Разница Белок Название Тип
3 5и 528 понизилась 1,234 Kaicnciui D CTSD пептидаза
3 50 702 понизилась 1,575 [Паперонин содержащий ГСР1, субъединица 3 сстз цругое
3 50 74 понизилась 1,383 Фактор инициации грансляции эукариот 3 EIF3G регулятор грансляции
3 50 829 понизилась 1,074 Рибосомальный белок Р2 RPLP2 цругое
3 50 368 понизилась 1,121 Грансальдолаза 1 TALDO1 фермент
6 50 452 возросла 1,464 Фактор инициации грансляции эукариот 6 EIF6 регулятор грансляции
6 50 175 возросла 1,32 Стоматин; HSPC322 STOM другое
6 50 827 возросла 1,457 Тирозин З/Триптофан 5монооксигеназы активации белок YWHAZ фермент
6 50 139 возросла 1,628 Виментин VIM цругое
6 50 218 возросла 1,416 Виментин VIM цругое
6 50 218 возросла 1,212 Виментин VIM цругое
6 50 139 возросла 1,036 Виментин VIM цругое
6 50 507 понизилась 1,379 Ламин В1 LMNB1 другое
6 50 571 понизилась 1,832 Рецептор импорта в митохондрии Тош22 ТОММ22 транспортер
12 50 166 возросла 1,171 ALG-2 интерактивный белок 1 PDCD6IP другое
12 50 550 возросла 1,747 Пептидилпролил изомераза А PPIA фермент
12 50 613 понизилась 1,802 Галецин-1 LGALS1 цругое
12 50 242 понизилась 1,373 Фосфоглицерат мутаза; фосфоманномутаза 2 PGAM2 фосфатаза
24 50 326 понизилась 1,385 глицил-tPHK синтаза GARS фермент
24 50 419 понизилась 1,451 Гомолог Mago-nashi МА GOH цругое
3 100 528 понизилась 1,036 Катепсин D CTSD пептидаза
3 100 702 понизилась 1,151 [Паперонин содержащий ГСР1, субъединица 3 сстз другое
3 100 74 понизилась 1,122 фактор инициации грансляции эукариот 3 EIF3G регулятор грансляции
3 100 829 понизилась 1,145 Рибосомальный белок Р2 RPLP2 цругое
3 100 368 понизилась 1,209 Грансальдолаза 1 TALDO1 фермент
6 100 139 возросла 1,829 Виментин VIM цругое
6 100 218 возросла 1,761 Виментин VIM цругое
6 100 452 понизилась 1,134 фактор инициации грансляции эукариот 6 EIF6 регулятор грансляции
6 100 252 понизилась 1,4 Sec 13 белок, Кератин II ?
6 100 827 понизилась 1,12 Тирозин З/Триптофан 5монооксигеназы активации белок YWHAZ фермент
12 100 76 возросла 1,679 галецин-1; кератин II LGALS1 цругое
Ключевой находкой этого эксперимента было уменьшение трансальдолазы 1, что поддерживает предположение, что Q10 действует, изменяя метаболический статус внутри раковой клетки. Трансальдолаза 1 - фермент в пути пентозофосфата (также известного как гексомонофосфатный шунт). Трансальдолаза (ЕС:2.2.1.2) катализирует обратимый перенос трехуглеродной кетольной единицы с седогептулозы 7-фосфата на глицеральдегид 3-фосфат для формирования эритрозы 4-фосфата и фруктозы 6-фосфата. Этот фермент, вместе с транскетолазой, осуществляет связь между гликолитическим и пентозофосфатным путями. Это важно для синтеза нуклеотидов и синтеза НАДФН, для содействия образованию восстанавливающих эквивалентов для биосинтетических реакций и для поддержания восстановительной среды.
- 44 034552
Недавняя публикация (Basta, P., et.al. August 2008, Cancer Detect Prevention, 32, 200-208) предоставила доказательство генетического полиморфизма трансальдолазы и была связана с плоскоклеточной карциномой головы и шеи. Другая недавняя публикация (Qian, Y., et.al. May 2008, Biochem J, 415, 123134) идентифицировала отсутствие трансальдолазы как модулятора митохондриального гомеостаза, потока Са2+ и апоптозов.
По этим первичным результатам другие белки, идентифицированные путем 2-D гель-электрофореза как модулированные Q10 в SK-MEL-28, были анализированы по известным связям (фиг. 9). Функциональная оценка этих белков показала, что существует группа, участвующая в 14-3-3-опосредованном сигналинге (PDCP6IP, YWHAZ и VIM), наряду с отдельными белками, связанными со множеством процессов [клеточный цикл; пентозофосфатный путь (TALDO1); церамид сигналинге (CTSD); аминоацилтРНК биосинтезе (GARS) и импорте белков в митохондрии (ТОМ22)].
Протеомический анализ SCC клеток, обработанных Q10.
Другая линия клеток рака кожи, плоскоклеточная карцинома (SCC), также была подготовлена и проанализирована путем 2-D гель-электрофореза, как в предыдущем эксперименте по анализу SK-MEL28. SCC клетки были обработаны 100 мкМ Q10 в течение 6 или 24 ч до сбора. Были взяты также контрольные необработанные клетки. Клеточный осадок был лизирован и образцы были подвергнуты 2-D электрофорезу (дважды на точку). Были проведены анализы шести сотен белковых точек в сравнительном исследовании, где контрольный образец сравнивался с 6- и 24-часовым воздействием.
Верхние двадцать пять статистически достоверно различимых изменений на точках были оценены путем сравнительного анализа в 2-D электрофорез-геле. По ним двадцать точек были извлечены и подвергнуты белковой идентификации путем расщепления трипсином и масс-спектрометрии (результаты представлены в табл. 3 ниже).
Таблица 3
Белки, идентифицированные как показавшие различную реакцию на 100 мкМ обработку Q10 в клетках SCC на 6 и 24 ч
Точка # Белок Название Клеточная локализация Функция Реакция (кратное изменение)
331 Трансальдолаза 1 TALDO1 Цитоплазма Фермент Уменьшение (1,5) на 6 и 14 ч
23 Человеческий BSCv (хромосома 20 рамка считывания 3) C20ORF3 Плазматическая мембрана Стриктозидин синтаза Уменьшение (2,1) на 6 и 24 ч
54 NM23 белок NME1 -Ядро, (митохондрии?) Киназа Увеличение (-1,2) на 6 ч, уменьшение на 24 ч
116 Два человеческих ESTs из MCF7 клеточной линии рака молочной железы (HSP 70) HSP70 Уменьшение (2,6) на 6 ч, последующее уменьшение на 24 ч
176 белок 1 теплового шока 27кДа HSPB1 Цитоплазма Ответ на внешний стресс Увеличение (-1,9) на 6 и 24 ч
135 Кератин I KRT1 Цитоплазма Промежуточные филаменты Уменьшение (2,3) на 6 и 24 ч
50 Кератин 14 KRT14 Цитоплазма Промежуточные филаменты Увеличение (-1,6) на 6 и 24 ч
68 Кератин 13 KRT13 Цитоплазма Промежуточные филаменты Увеличение (-1,5) на 6 и 24 ч
49 Протеасома Бета 7 PSMB7 Цитоплазма СУБЪЕДИНИЦА протеасомы Уменьшение (1,6) только на 24 ч
93 Субъединица 3 активатора протеасомы PSME3 Цитоплазма Пептидаза Уменьшение (1,3) только на 24 ч
66 Rho GDP диссоциации ингибитор (GDI) альфа ARHGDIA Цитоплазма Ингибитор Уменьшение (1,5) только на 6 ч
1 Неизвестен? Уменьшение (9,5)
Трансальдолаза 1.
Как наблюдалось ранее у SKMEL-28 клеток, обработанных Q10, фермент трансальдолаза 1 был мо- 45 034552 дулирован с уменьшением в концентрациях. Это дает независимое от предыдущего наблюдения подтверждение связи между Q10 и перестройками в трансальдолазе (и таким образом в метаболическом статусе клетки).
Трансальдолаза - фермент неокислительной фазы пентозофосфатного пути (фиг. 10). Пентозофосфатный путь является ключевым моментом в метаболическом статусе клетки для образования никотинамидадениндинуклеотидфосфата (восстановленного НАДХ) для восстановительного биосинтеза и для образования рибозы, которая является необходимым компонентом АТФ, ДНК и РНК. Трансальдолаза также связывает пентозофосфатный путь с гликолизом. Гликолиз - метаболический путь, по которому раковые клетки получают энергию, необходимую для поддержания жизни клетки, если митохондриальный процесс окислительного фосфорилирования не задействован. Q10 является необходимым коэнзимным фактором, требующимся для окислительного фосфорилирования и образования АТФ в митохондриях.
BSCv: точка 23 была новым белком человека из хромосомы 20, названным BSCv. BSCv белок также известен как связанный с плазматической мембраной адипоцитов белок (названия генов: АРМАР или C20orf3) и предполагается, что он является мембранным белком типа II с последовательностью, подобной белковому семейству синтаз стриктозидина. Обработка Q10 приводит к уменьшению концентраций этого белка. Этот белок не очень хорошо охарактеризован, и его гомология с стриктозидин синтазами не подтверждена. Интересно, что этот белок связывается с ролью в дифференциации адипоцитов (Albrektsen et al., 2001). Недавние протеомические исследования человеческой сальниковой жировой ткани идентифицировали BSCv как один из девяти белков с различной экспрессией при поликистозном синдроме яичников (ПКСЯ) у страдающих ожирением женщин (Corton, 2008 Hum. Reprod. 23: 651-661). Поскольку он является белком клеточной оболочки, который реагирует на Q10, антитело к BSCv было бы полезно и как биомаркер. На основании настоящих результатов и доступной литературы, BSCv потенциально может играть роль при раке и диабете.
NM23A: неметастатических клеток 1, белок (NM23A, также известный как NME1), считающийся метастатическим супрессором. Этот ген (NME1) был идентифицирован, поскольку уровни его мРНК транскриптов падают в высоко метастазирующих клетках. Белок обладает активностью как нуклеозид дифосфат киназа (НДК) и существует как гексамер, состоящий из А (кодирумой этим геном) и В (кодируемой NME2) изоформ. Мутации по этому гену идентифицированы в агрессивных нейробластомах. Активность NDK поддерживает равновесие между концентрациями различных нуклеозидтрифосфатов, как, например, при превращении GTP, образующегося в цикле лимонной кислоты (Кребса), в АТФ. Комплекс NDK связывается с р53 через взаимодействие с STRAP. Следует заметить, что STRAP связан с HNF4A. Таким образом, NM23A является потенциальным белком, участвующим в путях, важных для клеточного контроля и лечения болезни.
Rho GDP диссоциации ингибитор (GDI) альфа: GDI регулирует GDP/GTP обменную реакцию Rho белков путем ингибирования диссоциации GDP от них, и последующего связывания GTP с ними. Белок показывает положительную регуляцию в раковых клетках.
Пример 5. Анализы митохондриального обогащения.
Доказательства по нескольким линиям подтвердили, что оценка тесной связи роли митохондриальных белков и биологии рака и реакции на Q10 является достоверной. Во-первых, Q10 в процессах митохондриального окислительного фосфорилирования для образования энергии в нормальных клетках играет необходимую роль. Однако метаболическое переключение, которое происходит в раковых клетках, приводит к тому, что энергия образуется по альтернативному пути гликолиза, не требующем Q10. Вовторых, апоптозный ответ клеток требует наличия митохондриальных белков. Установлено, что Q10 стимулирует апоптозы в раковых клетках (семейство белков Вс1-2, цитохром с). Наконец, новые митохондриальные белки идентифицированы как модулированные воздействием Q10, что показано изменением уровня белка в митохондриях при импорте рецепторного белка ТОМ22 (см. эксперименты, описанные здесь).
Получение богатых митохондриями образцов.
Клетки рака кожи SKMEL-28 были обработаны 100 мкМ Q10 или пустым раствором в течение 6, 19 или 48 ч. Клетки были собраны путем промывки и соскабливания клеток с Т-160 колб (4 на каждую временную точку). Клетки были собраны путем центрифугирования и осадок был заморожен и хранился при -80°С. Клеточный осадок был ресуспендирован и разрушен с использованием 2 мл гомогенизатора Dounce. Реагенты и способы были получены из набора для выделения митохондрий для культивируемых клеток (MitoSciences, Cat# MS852). Получившиеся в результате образцы митохондрий были разделены на 75 мкл аликвоты (4-5 аликвот на образец) и хранились при -80°С.
Протеомический анализ богатых митохондриями образцов, выделенных из SK-MEL-28 клеток, обработанных Q10.
2-D гель-электрофорез был осуществлен на белках, растворенных из двух аликвот SK-MEL-28 богатых митохондриями образцов, обработанных 100 мкМ Q10 в течение 6, 19 и 48 ч (одновременно с соответствующими обработанными пустым раствором контролями). Образцы были подвергнуты 2-D элек- 46 034552 трофорезу (дважды на каждой точке). Были проведены анализы 525 белковых точек в сравнительном исследовании, где контрольный образец сравнивался с образцами других временных точек (фиг. 11).
Девять статистически достоверно различимых изменений на точках были выбраны для сравнительного анализа в 2-D электрофорез-геле. По ним 9 точек были извлечены и подвергнуты белковой идентификации путем расщепления трипсином и масс-спектрометрии.
Таблица 4
Белки, идентифицированные как показавшие различную реакцию на обработку Q10 в SKMEL-28 митохондриях
Spot # Белок Название Функция Реакция (кратное изменение)
11 Неизвестный белок ? ? Повышение (1?3) на 6 ч, после этого снижение на низкие уровни
131 Неизвестен, такой же как на точке #11, модифицированный ? ? Понижение (1?3) на 6 ч, еще более сильное снижение на 19 и 48 ч
279 ацил-СоА тиоэстеразы 7 изоформа hBACHb АСОТ7 Расщепление жирных ацил-СоА на свободные жирные кислоты и СоА Понижение (1?3) на 6 ч, возвращение к норме на 48 ч
372 Пируват киназа РКМ2 Катализ образования фосфоенолпирувата из пирувата и АТР Повышение (1?5) на 6 ч, возвращение к норме на 48 ч
ПО Белок егбО PDIA3 Белок дисульфид изомераза Повышение на 19 и 48 ч
185 Кератин 10 KRT10 Промежуточный филамент Повышение только на 19 ч
202 Бета-Актин Структурный белок Повышение только на 19 ч
246 Малектин MLEC Углеводсвязывающий белок эндоплазматического ретикулума и возможный участник ранних этапов белкового N- гликозилирования Повышение только на 19 ч
75 Биспир альный домен, содержащий 58 CCDC58 Консервативный гипотетический белок - формирование пор ядра Повышение на 48 ч
Ацил-СоА тиоэстераза 7.
Ацил-СоА тиоэстераза 7 (АСОТ7) является членом энзимного семейства, которое катализирует гидролиз жирного ацил-СоА в свободную жирную кислоту и СоА. Этот фермент таким образом играет роль в регуляции липидного метаболизма и клеточного сигналинга. АСОТ7 связан с длинноцепочечными ацил-СоА субстратами с цепями жирных кислот, состоящими из 8-16 атомов углерода (С8-С16). Точная функция АСОТ7 в клетке понятна не до конца. Транскрипция этого гена активируются связывающим стерол регуляторный элемент белком 2, что подтверждает его функцию в метаболизме холестерина.
Результаты этого примера показывают, что АСОТ7 потенциально участвует в метаболизме Q10, прямо или косвенно. Таким образом, целевая АСОТ7 может содействовать модуляции внутриклеточных уровней Q10 и тем самым влиять на клеточные эффекты Q10.
Пируваткиназа.
Пируваткиназа - фермент, участвующий в последнем этапе гликолиза. Он катализирует перенос фосфатной группы с фосфоенолпирувата (PEP) к АДФ, производя одну молекулу пирувата и одну молекулу АТФ.
- 47 034552
Белком предположительно является РКМ2, изоформа типа 2, которая была идентифицирована в богатом митохондриями образце SK-MEL-28. Хорошо известно, что эта изоформа участвует в образовании и регуляции опухолевых клеток.
Подсчет уровней Q10 в митохондриях.
Способ одновременного определения коэнзима Q10 (Q10) и восстановленной формы убихинола-10 (Q10H2) был выполнен на основе недавно опубликованного способа (Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chroma A, 1175, 242-248) благодаря использованию LC-MS/MS с ионизацией электрораспылением (ESI) в режиме определения положительных ионов. Возможны высоко избирательная идентификация и чувствительный подсчет Q10 и Q10H2, вкупе с идентификацией других выбранных липидов. Аликвоты богатых митохондриями образцов из SK-MEL-28, обработанных 100 мкМ Q10, были подвергнуты стандартной преобработке, основанной на осаждении белка, экстракции жидкость-жидкость, выпаривании до высыхания и восстановлению в 50 мкл смеси 95:5 метанол/гексан (по объему).
В этом анализе были подсчитаны Q10, Q10H2 и Q9 (табл. 5). Уровни соответствующей молекулы Q9 были низкими, и близко от уровня детекции. Уровни необработанных образцов были сравнительно постоянными, с 6 ч обработанным Q10 образцом, имеющим тот же уровень. Для контроля за вариабельностью материала образцов были подсчитаны также уровни холестерина для подтверждения того, что различия не происходят вследствие погрешностей в размере образцов. Когда уровни Q10 были верными по сравнению со значениями общего белка, наблюдаемого в белковой экстракции других аликвот из тех же митохондриальных проб, сравнительные соотношения были сопоставимыми. Таким образом, достоверное возрастание уровней Q10 наблюдалось на 19 ч (~в 3 раза) с даже большим возрастанием на временной точке 48 ч (~ в 6 раз) (фиг. 12).
нг/образец | мкг/образ~
Q9 qio Q1OH2 Холестерол
Таблица 5 HPLC-MS результаты количественного определения уровней Q10, присутствующего в богатых митохондриями образцах из SK-MEL-28 клеток, обработанных 100 мкМ Q10 в среде
Площадь пика
Файл Образец Инъекци! Q9 Q10
081204-05 lOOHrStd 245,342 352792
081204-06 6 ч контроль#! 10% 2560 32649|
081204-07 Холостой раствор# 1 5ul 3781 3174|
081204-08 Холостой раствор# 2 5 ul 2396 43991
081204-09 6 ч контроль#2 20% 1572 36328|
081204-10 Холостой контрол >#310 ul 1722 25041
081204-11 48 ч Q10 обработ. 20% 4879 16449и|
081204-12 48 ч контроль 20% 2412 25552|
081204-13 6 ч Q10 обработ. 20% 692 2542=|
081204-14 19 ч Q10 обработ. 20% 1161 59164|
081204-15 19 ч контроль 20% 901 1999Ч|
Неожиданным результатом этого исследования было обнаружение того, что Q10 попадал в клетки в окисленной форме. Для 48-часовых образцов восстановленная форма Q10H2 также была подсчитана, и было обнаружено, что она присутствует в достоверно более низких количествах (0,28 нг/образец CoQ10H2 по сравнению с 46,63 нг/образец CoQ10). Было общее возрастание (в 3 раза) в уровнях Q10H2 в обработанном Q10 48-часовом образце, хотя уровни были близкими к предполагаемому порогу чувствительности способа. Интересно, что окисленная форма (Q10) может действовать как прооксидант в биологических системах. В соответствии с литературой, когда человеческая плазма была оценена по Q10 и Q10H2, было обнаружено, что большинство (90%) молекул присутствуют в восстановленной форме Q10H2 (Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chroma A, 1175, 242-248), которая может действовать как антиоксидант.
Таким образом, эти результаты подтверждают и дают количественную оценку того, что уровни Q10 возрастают в митохондриях после экзогенного добавления Q10 в среду. Неожиданным открытием было то, что Q10 оставался в той же окисленной форме (про-оксидант), в которой его добавили, и не превращался в восстановленную (анти-оксидант) форму Q10H2 в каком-либо значительном количестве.
Пример 6. Анализы ПЦР в режиме реального времени.
Эксперимент 1. Апоптозный анализ.
Как обсуждалось в примере 3, обработка раковых клеток Q10 вызывает гибель части этих клеток вследствие апоптозных процессов. Чтобы идентифицировать белки, задействованные в реакции на Q10, были применены методы полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени (RT-ГГЦР) для идентификации изменений в уровнях мРНК для генов/белков, включенных в целевые пути, связанные с апоптозом.
При использовании ПЦР методов как скринингового механизма оценивался спектр целевых моле- 48 034552 кул, которые потенциально предлагались как способные отвечать на биологическое действие Q10 внутри клеток. Изменения в уровнях мРНК были оценены с использованием количественных оценок ПЦР в режиме реального времени для определения уровней мРНК в отобранных заранее подсериях, содержащих специфических целевых путей.
Для интерпретации мРНК результатов идентифицировались и оценивались гены, у которых в два раза изменялась транскрипция их мРНК. Уровень генной транскрипции для образования мРНК дает только грубую оценку потенциальных изменений в уровне экспрессируемого белка. Специалисты в данной области поймут, что каждая мРНК может иметь различные степени, в какой она деградирует или в какой ее трансляция неэффективна, поэтому в результате будут получаться различные количества белка. SkBr-3 клетки, обработанные 50 мкМ Q10 24 ч Способ анализа RT-ПЦР был использован для количественного определения изменений уровней мРНК для всех 84 белков, связанных с апоптозным путем. Эксперименты с апоптозным анализом ПЦР в режиме реального времени на SkBr3 с Q10 (24 ч) показали, что влияние было оказано на следующие мРНК: Bcl2, Bcl2L1, Bcl2L11, Birc6, Bax, Xiap, Hprt1, Apaf1, Abl1, Braf. Эти результаты также предоставили доказательства того, что обработка Q10 вызывает апоптозный ответ в раковых клетках.
Таблица 6А
Обо !начен 1 lojo'/Kiiie 1 пшене Relseq Описание 11;ι :г>;нн1с iciia
не ВСЕ2Е1 .1Ы1НМOipimaie.i Ы1НЧ pci). IM i η in 13.195- Ils. ч 10900 _\_\1_13858 ВСЕ2-иодо0иыи 1 BCL-XL.S
BNIP2 6.3291 Hs.646490 NM_004330 ВСТ2/аденовирус E1B BNIP-2/NIP2
BCL2 5.4717 Hs. 150749 NM_000633 19кДа взаимо действующ ий белок 2 В-клетки CLL/лимфома Bcl-2
BIRC6 4.7966 Hs.150107 NM_016252 2 Бакуловирусный IAP APOLLON/B
BCL2L11 4.6012 Hs.469658 NM_006538 повтор-содержащий 6 (аполлон) ВСЕ2-подобный 11 RUCE BAM/BIM
XIAP 4.3832 Hs.356076 NM_001167 (содействие апоптозам) Х-с вязанный ингибитор API3/BIRC4
BRAF 4.3832 Hs.550061 NM_004333 апоптозов гомолог В1 вирусного B-raf
ВАХ 3.896 Hs.631546 NM_004324 онкогена мышиной саркомы V-raf ВСЕ2-связанный X 1/BRAF1 Вах zeta
APAF1 2.6244 Hs.708112 NM001160 белок Фактор 1, CED4/DKFZp
HPRT1 -160.6748 Hs.412707 NM 000194 активирующий апоптозную пептидазу Гипоксантин 781В1145 HGPRT/HPRT
Фосфорибозилтрасфераз а 1 (синдром ЛешНихана)
Согласованные результаты трех независимых экспериментов на SK-MEL-28 клетках представлены ниже в табл. 6В. В SCC клетках многие гены также регулируются обработкой 100 мкМ Q10. Гены в апоптозном анализе, которые по видимости регулируются в SCC клетках, описаны в табл. 7. Мы обнаружили, что многие гены регулируются на 6 ч, как в SK-MEL-28 клетках, так и в SCC клетках. На 24 ч регуляция уменьшается. Гены которые по видимости регулируются как в SK-MEL-28 клетках, так и в SCC клетках, описаны в табл. 8.
- 49 034552
Таблица 6В
Гены в клетках SK-MEL-28, которые регулируются воздействием 100 мкМ Q10 при анализе апоптозным анализом
Обозначени е Описание Регуляция Локализа ция Возможные функции
ABL1 С-abl онкоген 1, рецептор тирозинкиназы Отрицательно регулируется на 72 часах -Ядро Тирозинкиназа
BAG1 BCL2- ассоциированный атероген Положительно регулируется на 48 часах Цитоплаз ма Анти-апоптоз, путь рецептора глюкокортикоида
BCL2 В-клетки CLL/лимфома 2 Отрицательно регулируется на 48 часах Цитоплаз ма Гибель клеток
BCL2A1 В CL2 -связанный белок А1 Отрицательно регулируется на 48 часах Цитоплаз ма Регулятор каспаз, фосфорилирование ТР73
BCL2L1 В CL2 -подобный 1 Отрицательно регулируется на 72 часах Цитоплаз ма Ингибитор каспаз
BCL2L10 В CL2 -подобный 10 (содействие апоптозам) Отрицательно регулируется на 48 часах Цитоплаз ма Активатор каспаз
BCL2L11 В CL2 -подобный 11 (содействие Отрицательно регулируется на Цитоплаз ма Про-апоптоз, активатор каспазы
- 50 034552
апоптозам) 48 часах 3
BIRC3 Бакуловирусный IAP повтор- содержащий 3 Отрицательно регулируется на 6 часах Цитоплаз ма Анти-апоптоз
BIRC8 Бакуловирусный IAP повтор- содержащий 8 Отрицательно регулируется на 48 часах Цитоплаз ма Активатор каспаз
CARD8 Семейство поддерживающег о каспазы домена, член 8 Отрицательно регулируется на 48 часах -Ядро Активатор каспаз
CASP14 Каспаза 14, связанная с апоптозом цистеинпептидаза Отрицательно регулируется на 48 часах Цитоплаз ма Связанная с апоптозами цистеинпептидаза
CASP5 Каспаза 5, связанная с апоптозом цистеинпептидаза Отрицательно регулируется на 48 часах Цитоплаз ма Связанная с апоптозами цистеинпептидаза
CD40LG CD40 лиганд (TNF суперсемейство, член 5, rnnep-IgM синдром) Отрицательно регулируется на 48 часах Внеклеточ ное пространс тво Связывание рецептора CD40
CIDEA DFFA-подобный эффектор а, вызывающий клеточную гибель Положительно регулируется на 48 часах Цитоплаз ма Про-апоптоз
FADD Fas (TNFRSF6)связанный через домен гибели Отрицательно регулируется на 6 часах Цитоплаз ма Про-апоптоз
FAS Суперсемейство рецепторов Fas (TNF , член 6) Положительно регулируется на 48 часах Плазмати ческая мембрана Про-апоптоз
FASLG Fas лиганд Отрицательно Внеклеточ Про-апоптоз
- 51 034552
(суперсемейство TNF, член 6) регулируется на 48 часах ное пространс тво
GADD45A Задержка роста и индуцирование повреждения ДНК, альфа Положительно регулируется на 48 часах -Ядро Задержка роста
HRK Harakiri, BCL2 взаимодействую щий белок (содержит только ВНЗ домен) Отрицательно регулируется на 48 часах Цитоплаз ма Про-апоптоз
PYCARD PYD и CARD домен содержащий Отрицательно регулируется на 6 часах Цитоплаз ма Активатор апоптозной протеазы
TNF Фактор некроза опухолей (суперсемейство TNF, член 2) Положительно регулируется на 48 часах, затем отрицательно регулируется Внеклеточ ное пространс тво Связывание TNF рецептора
TNFRSF10A Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 10а Положительно регулируется на 48 часах, затем отрицательно регулируется Плазмати ческая мембрана Активатор каспаз
TNFRSF10B Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 10Ь Отрицательно регулируется на 72 часах Плазмати ческая мембрана р53 сигналинг, активатор каспаз.
TNFRSF1A Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 1А Отрицательно регулируется на 72 часах Плазмати ческая мембрана Про-апоптоз
- 52 034552
TNFRSF21
Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 21
CD27 молекула
Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 9
Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 10
Опухолевый белок р73
TNF рецепторсвязанный фактор
TNF рецепторсвязанный фактор4
Отрицательно регулируется часах
Отрицательно регулируется часах
Отрицательно регулируется часах
Положительно на на на регулируется на часах часах
Отрицательно регулируется на часах
Отрицательно регулируется на часах
Плазмати ческая мембрана
Плазмати ческая мембрана
Плазмати ческая мембрана
Внеклеточ ное пространс тво
Отрицательно регулируется на
Фактор транскрипции
Цитоплаз ма
Цитоплаз ма
Активатор каспаз
Ингибитор каспаз
Про-апоптоз
Про-апоптоз
Домен «цинковых пальцев»
Домен «цинковых пальцев»
Таблица 7
Гены в SCC клетках, которые регулируются воздействием
100 мкМ Q10 при анализе апоптозным анализом
Обозначение Описание Регуляция
АКТ! Гомолог 1 вирусного онкогена мышиной тимомы V-akt Отрицательно регулируется на 6 часах и затем положительно регулируется на 24 часах.
BAG4 ВСТ2-ассоциированный атаноген 4 Положительно регулируется на 24 часах.
ВАХ ВСТ2-ассоциированный X белок Положительно регулируется на 24 часах.
BCL2 В-клеток CLL/лимфома 2 Положительно регулируется на 24 часах.
BCL2L1 ВСТ2-подобный 1 Отрицательно регулируется на 6 часах и затем положительно регулируется на 24 часах.
BIRC3 Бакуловирусный IAP повтор- содержащий 3 Отрицательно регулируется на 6 часах.
BNIP3 ВСГ2/аденовирус Е1В 19кДа взаимодействующий белок 3 Отрицательно регулируется на 24 часах.
CARD6 Семейство поддерживающего каспазы домена, член 6 Отрицательно регулируется на 6 часах.
CASP6 Каспаза 6, связанная с апоптозом цистеинпептидаза Положительно регулируется на 24 часах.
CASP7 Каспаза 7, связанная с апоптозом цистеинпептидаза Положительно регулируется на 24 часах.
CD40 CD40 молекула, суперсемейство TNF рецепторов, член 5 Отрицательно регулируется на 6 часах.
FADD Fas (ТМРК8Р6)-связанный через домен гибели Положительно регулируется на 24 часах.
GADD45A Задержка роста и индуцирование Положительно регулируется
- 53 034552
повреждения ДНК, альфа на 24 часах.
HRK Harakiri, BCL2 взаимодействующий белок (содержит только ВНЗ домен) Положительно регулируется на 24 часах.
TNFRSF21 Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 21 Отрицательно регулируется на 6 часах.
TNFRSF25 Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 25 Отрицательно регулируется на 6 часах и затем положительно регулируется на 24 часах.
CD27 CD27 молекула Отрицательно регулируется на 6 часах.
TNFRSF9 Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 9 Отрицательно регулируется на 6 часах.
TNFSF10 Фактора некроза опухолей (лиганд) суперсемейство, член 10 Положительно регулируется на 24 часах.
CD70 CD70 молекула Отрицательно регулируется на 6 часах.
ТР53 Опухолевый белок р53 Положительно регулируется на 24 часах.
ТР73 Опухолевый белок р73 Отрицательно регулируется на 6 часах и затем положительно регулируется на 24 часах.
TRAF2 TNF рецептор-ассоциированный фактор 2 Положительно регулируется на 24 часах.
Таблица 8
Г ены апоптозного анализа, которые регулируются воздействием
100 мкМ Q10 и в SK-MEL-28, и в SCC клетках
Обозначение Описание
BCL2 В-клеток CLL/лимфома 2
BCL2L1 ВСЬ2-подобный 1 (Bcl-xl)
BIRC3 Б акуловирусный IAP повтор-содержащий 3
FADD Fas (ТКРК8Р6)-связанный через домен гибели
GADD45A Задержка роста и индуцирование повреждения ДНК, альфа
TNFRSF21 Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 21
CD27 CD27 молекула
TNFRSF9 Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 9
TNFSF10 Фактора некроза опухолей (лиганд) суперсемейство, член 10
ТР73 Опухолевый белок р73
TRAF2 TNF рецептор-ассоциированный фактор 2
Интересно, что измененные уровни мРНК показали значимую положительную регуляцию в сериях апоптозных белков, где Bcl-xl был выше всего. Это также наблюдалось в экспериментах анализа белка на SK-MEL-28 клетках.
Bcl-xl является трансмембранной молекулой в митохондриях (Bcl-xl является обозначением базальноклеточная сверхбольшая лимфома). Она включена в сигнальный путь трансдукции FAS-L и является одним из нескольких антиапоптозных белков, которые являются членами белкового семейства Bcl2. Она задействована в выживании раковых клеток. Однако известно, что альтернативный сплайсинг Bclх мРНК человека может приводить по меньшей мере к двум различным видам Bcl-х мРНК, Bcl-xL и BclxS. Преобладающий белковый продукт (233 аминокислоты) - более крупная Bcl-х мРНК, Bcl-xL, которая подавляет клеточную гибель вследствие удаления фактора роста (Boise et al., 1993. Cell 74, 597-608). BclxS, с другой стороны, ингибирует возможность Bcl-2 ингибировать клеточную гибель и делает клетки
- 54 034552 более восприимчивыми к апоптозной гибели клеток. Используемые анализы не различают, какая изоформа является положительно регулируемой. Bcl-х изоформа, которая положительно регулируется
CoQ10 в этих исследованиях, может быть определена обычными способами, известными специалистам, например использованием RT-ПЦР способов для оценки соотношения двух изоформ мРНК сплайсинга (Bcl-xL vs Bcl-sL).
Из наблюдения связанных с апоптозом белков было замечено, что множественные про- и антиапоптозные факторы в BCL-2 семействе или взаимодействие с этими факторами модулировали уровни экспрессии (BCL2L11, BNIP2, BAG1, HRK, BAK1, BCL2, BCL2L1). Эти белки управляют проникновением через мембраны митохондрий.
Ранний маркер апоптозного ответа наблюдался вместе с положительной регуляцией каспазы-9 (16 ч), что согласуется с предыдущими наблюдениями апоптозов с каспазой 3/7 белков. Индукция стресссигналинг путей приводит к высвобождению Циторохрома с из митохондрий и активации apaf-1 (апоптосомы), которая, в свою очередь, расщепляет про-энзимы каспазы-9 в активную форму. После инициации каспаза-9 начинает расщеплять прокаспазу-3 и прокаспазу-7, запуская дополнительные апоптозные пути.
Семейство рецепторов к фактору некроза опухолей также постоянно имеет отношение к модулированным белкам.
Замечена также сильная отрицательная регуляция опухолевого белка р73. Анализы множества опухолей, обычно находимых у человека, включая рак молочной железы и яичников, показали высокую экспрессию р73 по сравнению с нормальными тканями в соответствующих областях. Недавние открытия подтверждают, что дерегулируемая сверхэкспрессия транскрипционных факторов в организме, участвующих в регуляции клеточного цикла и синтезе ДНК в клетках млекопитающих (например, E2F-1), вызывает экспрессию р73. Это подтверждает, что р73 может быть онкобелком, но может быть задействован в различных механизмах, которые связаны с р53 белком. На фиг. 13 представлена схема апоптозного пути.
Клетки SKMEL-28.
Из наблюдения связанных с апоптозом белков было замечено, что множественные про- и антиапоптозные факторы в BCL-2 семействе или взаимодействие с этими факторами модулировали уровни экспрессии (BCL2L11, BNIP2, BAG1, HRK, BAK1, BCL2, BCL2L1). Эти белки управляют проникновением через мембраны митохондрий.
Ранний маркер апоптозного ответа наблюдался вместе с положительной регуляцией каспазы-9 (16 ч), что согласуется с предыдущими наблюдениями апоптозов с каспазой 3/7 белков. Индукция стресссигналинг путей приводит к высвобождению Циторохрома с из митохондрий и активации apaf-1 (апоптосомы), которая, в свою очередь, расщепляет про-энзимы каспазы-9 в активную форму. После инициации каспаза-9 начинает расщеплять прокаспазу-3 и прокаспазу-7, запуская дополнительные апоптозные пути.
Таблица 9
Изменения в уровнях мРНК в SKMEL-28 клетках, обработанных 100 мкМ Q10, оцененных по RT-ПЦР анализам, сосредоточенным на апоптозных путях
справ. Поел. Описание Обознач ение 6 ч Q10 16 ч Q10 24 ч Q10 72 ч Q10
NM_006538 BCL2-подобный 11 (содействие апоптозам) BCL2L1 1 2,13 2,41 1,92 2,51
NM_000875 Инсулинподобный рецептор фактора роста 1 IGF1R 1,77 1,09 1,33 1,25
NM_004048 Бета-2микроглобулин В2М 1,74 1,76 1,58 з,и
NM_003921 В-клеток CLL/лимфома 10 BCL10 1,55 1,87 1,48 -з,п
NM_004330 ВСГ2/аденовирус Е1В 19кДа взаимодействующ ий белок 2 BNIP2 1,46 1,51 1,57 -1,61
NM_005157 С-abl онкоген 1, рецептор тирозин киназы ABL1 1,42 2,77 -1,22 -2,03
- 55 034552
NM_004323 BCL2- ассоциированный атаноген BAG1 1,41 1,44 -1,61 -2,45
NM_001229 Каспаза 9, связанная с апоптозом цистеинпептидаза CASP9 1,32 3,96 1,83 1,14
NM_003806 Harakiri, BCL2 взаимодействующ ий белок (содержит только ВНЗ домен) HRK 1,18 4,52 2,73 -1,14
NM_001924 Задержка роста и индуцирование повреждения ДНК, альфа GADD45 А 1,07 3,34 1,13 -2,36
NM_001188 BCL2- антагонист/киллер 1 ВАК1 1,06 2,73 -1,00 -4,54
NM_004295 TNF рецептор- связанный фактор 4 TRAF4 -1,91 2,63 -1,58 -740,66
NM_003842 Суперсемейство рецепоров факторов некроза опухолей, член 10Ь TNFRSF 10В -2,07 1,53 -1,81 -710,49
NM_000633 В-клеток CLL/лимфома 2 BCL2 -2,98 -1,63 -2,82 -11,36
NM_001242 CD27 молекула CD27 -3,40 -2,38 -1,35 -12,72
NM_014430 Клеточную гибель вызывающий DFFA-подобный эффектор b CIDEB -3,48 1,56 -3,69 -2,59
NM_001065 Суперсемейство рецепоров TNFRSF 1А -4,53 2,28 -3,30 1,22
факторов некроза опухолей, член 1А
NM_005427 Опухолевый белок р73 ТР73 -4,66 -9,80 -8,71 -26,96
NM_003844 Суперсемейство рецепоров факторов некроза опухолей, член 10а TNFRSF 10А -4,84 -5,26 -4,33 -11,84
NM_138578 BCL2-подобный 1 BCL2L1 -4,94 -1,80 -6,17 -7,04
NM_001165 Бакуловирусный IAP повтор- содержащий 3 BIRC3 -13,68 -1,98 -2,42 -3,42
Семейство рецепторов к фактору некроза опухолей также постоянно имеет отношение к модулированным белкам.
Замечена также сильная отрицательная регуляция опухолевого белка р73. Анализы множества опухолей, обычно находимых у человека, включая рак молочной железы и яичников, показали высокую экспрессию р73 по сравнению с нормальными тканями в соответствующих областях. Недавние открытия подтверждают, что дерегулируемая сверхэкспрессия транскрипционных факторов в организме, участвующих в регуляции клеточного цикла и синтезе ДНК в клетках млекопитающих (например, E2F-1), вызывает экспрессию р73. Это подтверждает, что р73 может быть онкобелком, но может быть задействован в различных механизмах, которые связаны с р53 белком.
Эксперимент 2. ПЦР в режиме реального времени. Анализы, использующие наборы окислительного стресса и антиоксидантной защиты.
Для идентификации белков, которые были включены в Q10 ответ, был использован метод полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени (RT-ПЦР) для идентификации изменений в уровнях мРНК для генов/белков, включенных в целевые пути окислительного стресса и антиоксидантной защи
- 56 034552 ты.
В табл. 10 ниже перечисляются гены, которые регулируются в SK-MEL28 клетки, обработанные 100 мкМ Q10. Результаты даются только для тех генов, которые являются регулируемыми в двух независимых экспериментах.
Хотя существует достоверное количество генных регуляций, наблюдаемых на 6 ч, большинство достоверных изменений в уровнях РНК наблюдаются на 48 ч.
Таблица 10
Гены в SK-MEL-28 клетках, которые регулируются при обработке 100 мкМ Q10, что видно по анализам окислительного стресса и антиоксидантной защиты Arrays
Обозна чение Описание Регуляция Локализа ция Возможные функции.
ALB Альбумин Отрицательная регуляция на часах 48 Внеклеточное пространств о Белок-носитель, анти- апоптозная
АОХ1 Альдегид оксидаза 1 Положительная регуляция с 16 часов Цитоплазма Образование свободных радикалов, метаболизм ксенобиотиков
АРОЕ Аполипопротеин Е Отрицательная регуляция на часах 48 Внеклеточное пространств о Метаболизм липидов
АТОХ1 АТХ1 антиоксидантного белка 1 гомолог (дрожжи) Отрицательная регуляция на часах 48 Цитоплазма Метаболизм меди
BNIP3 В СЕ2/аденовирус Е1В 19кДа взаимодействующи й белок 3 Отрицательная регуляция на часах 48 Цитоплазма Анти-апоптоз
CSDE1 Домен холодового шока, содержащий El, РНК- связывающийся Отрицательная регуляция на часах 48 Цитоплазма Регуляция транскрипции
CYBA Цитохром Ь-245, альфа полипептид Отрицательная регуляция на часах 48 Цитоплазма Апоптозы
CYGB Цитоглобин Отрицательная регуляция на часах 48 Цитоплазма Пероксидаза, транспортер
- 57 034552
DHCR24 24- дегидрохолистерин редуктаза Отрицательная регуляция на 6 часах Цитоплазма Перенос электронов, связывание с ТР53, участие в апоптозах
DUOXI Двойная оксидаза 1 Положительная регуляция на 48 часах Плазматичес кая мембрана Связывание ионов кальция, перенос электронов.
DUOX2 Двойная оксидаза 2 Отрицательная регуляция на 48 часах Неизвестна Связывание ионов кальция
EPHX2 Эпоксида гидролаза 2, цитоплазматическа я Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Метаболизм арахидоновой кислоты
ЕРХ Эозинофил пероксидаза Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Метаболизм фенилаланина, апоптозы.
GPX2 Глутатиона пероксидаза 2 (желудочнокишечная) Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Перенос электронов, связывание с ТР53, участие в апоптозах
GPX3 Глутатиона пероксидаза 3 (плазма) Положительная регуляция на 48 часах Внеклеточное пространств о Метаболизм арахидоновой кислоты, отрицательная регуляция в карциномах
GPX5 Глутатиона пероксидаза 5 (эпидидемальный андрогенсвязанный белок) Положительная регуляция на 48 часах Внеклеточное пространств о Метаболизм арахидоновой кислоты.
GPX6 Глутатиона пероксидаза 6 (обонятельная) Отрицательная регуляция на 48 часах Внеклеточное пространств о Метаболизм арахидоновой кислоты.
GSR Глутатиона редуктаза Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Метаболизм глутамата и глутатиона, апоптозы
GTF2I Общий фактор транскрипции II, i Отрицательная регуляция на 6 часах Ядро Активатор транскрипции, транскрипция fos.
- 58 034552
KRTl Кератин 1 (эпидермолитическ ий гиперкератоз) Положительная регуляция на 48 часах Цитоплазма Связывание сахара
LPO Лактопероксидаза Отрицательная регуляция на 48 часах Внеклеточное пространств о Метаболизм фенилаланина
MBL2 Маннозасвязывающий лектин (белок С) 2, растворимый (недостаток опсонина) Отрицательная регуляция на 48 часах Внеклеточное пространств о Дополнительный сигналинг, распознавание паттерна в рецепторах
MFST3 Микросомального глутатиона S- трансфераза 3 Положительная регуляция на 16 часах Цитоплазма Метаболизм ксенобиотиков.
MPO Миелопероксидаза Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Анти-апоптоз, метаболизм фенилаланина
MPV17 MpV17 митохондриальный внутренний мембранный белок Отрицательная регуляция на 6 часах Цитоплазма Поддержание митохондриальной ДНК.
MT3 Металлотио неин 3 Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Связывание ионов меди.
NCF1 Нейтрофильный цитоплазматически й фактор 1, (хронический гранулематоз, аутосома 1) Отрицательная регуляция с 6 часах Цитоплазма Образование свободных радикалов
NCF2 Нейтрофильный цитоплазматически й фактор 2 (65кДа, хронический гранулематоз, аутосома 2) Положительная регуляция на 48 часах Цитоплазма Перенос электронов
- 59 034552
NME5 Белок, экспрессирующийс я в неметастазирующи х клетках 5, (нуклеотиддифосфат киназа) Отрицательная регуляция на 48 часах Неизвестна Метаболизм киназ, пуринов и пиримидинов
NOS2A Оксида азота синтаза 2А (индуцируемая, гепатоциты) Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Сигналинг рецептора глюкокортикоида, апоптозы
OXR1 Устойчивость к окислению 1 Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Реакция на окислительный стресс
PDLIM1 PDZ и LIM домен 1 (elfin) Положительная регуляция на48 часах Цитоплазма Активатор транскрипции
PIP3-E Фосфоинозитидсвязывающий белок PIP3-E Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Пероксидаза
PRDX2 Пероксиредоксин 2 Отрицательная регуляция на 6 часах Цитоплазма Роль в метаболизме фенилаланина. Роль в гибели клеток
PRDX4 Пероксиредоксин 4 Отрицательная регуляция с 24 часов Цитоплазма Тиоредоксин пероксидаза
PREXI Фосфатидилинозит ол 3,4,5- трисфосфатзависимый RAC 1 Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Формирует окисленные свободные радикалы
PRG3 Протеогликан 3 Отрицательная регуляция на 48 часах Внеклеточное пространство Роль в гибели клеток.
PTGS1 Простат ландинэндопероксид синтаза 1 (простагландин G/Η синтаза и циклооксигеназа) Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Метаболизм арахидоновой кислоты, синтез простагландинов
- 60 034552
PTGS2 Простат ландинэндоперокид синтаза 2 (простагландин G/Η синтаза и циклоокигеназа) Положительная регуляция на 48 часах Цитоплазма Метаболизм арахидоновой кислоты, синтез простагландинов
PXDN Пероксидаз гомолог (Drosophila) Положительная регуляция на 48 часах Неизвестна Связывание с TRAF4, связывание ионов кальция, связывание ионов железа.
PXDNL Пероксидаз гомолога (Drosophila)подобный Отрицательная регуляция на 48 часах Неизвестна пероксидаза, связывание ионов кальция, связывание ионов железа.
RNF7 Ring finger белок 7 Положительная регуляция на 16 часах Ядро апоптозы, связывание ионов меди, путь обмена убихинона
SGK2 Сыворотка/г люко к ортикоид регулируемая киназа 2 Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Киназа, регулятор каналов калия
SIRT2 Сиртуин (мо лчащего МАТ локуса информацио нно й регуляции 2 гомолог) 2 (S. cerevisiae) Положительная регуляция на 16 часах Ядро Фактор транскрипции
SOD1 Супероксиддисмут аза 1, растворимая (амиотрофический боковой склероз 1 (у взрослых)) Положительная регуляция на 16 часах Цитоплазма Апоптозы, активатор каспазы
SOD2 Супероксиддисмут аза 2, митоходриальная Положительная регуляция на 16 часах Цитоплазма Апоптозы, регулируется TNF.
SOD3 Супероксиддисмут аза 3, внеклеточная Отрицательная регуляция на 48 часах Внеклеточное пространство Про-апоптозное
SRXN1 Сульфиредоксина 1 гомолог (S. cerevisiae) Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Связывание ДНК, оксидоредуктаза
ТРО Тиреоидпероксидаза Отрицательная регуляция на 48 часах Плазматичес кая мембрана Йодирование тироглобулина, метаболизм тирозина, метаболизм фенилаланина
TTN Титин Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Актина цитоскелета сигналинг, интегрина сигналинг
TXNDC 2 Тиоредоксин домен-содержащий 2 (сперматозоиды) Отрицательная регуляция на 48 часах Цитоплазма Метаболизм пиримидинов
Нейтрофильный цитоплазматический фактор 2 (NCF2, 65кДа, хронический гранулематоз, аутосома 2) был одним из тех, чьи мРНК индуцировались вначале (наблюдалось на 6 ч). Впоследствии на временной точке 16 ч и дальше, после задержки на первичной фазе, индуцировались очень высокие уровни нейтрофильного цитоплазматического фактора (NCF1) (хронический гранулематоз, аутосома 1).
Нейтрофильный цитоплазматический фактор 2 является цитоплазматической субъединицей мультибелкового комплекса, известного как НАДФН оксидаза, обычно находимая в нейтрофилах. Эта оксидаза вырабатывает множество супероксидов, которые попадают в полость нейтрофильной фагосомы.
НАДФН оксидаза (никотинамид аденин динуклеотид фосфатоксидаза) является связанным с мембраной энзимным коплексом. Ее можно обнаружить в плазматической мембране, а также в мембране фагосомы. Она состоит из шести следующих субъединиц:
a Rho гуанозин трифосфотаза (GTPa3a), обычно Rac1 или Rac2 (Rac - обозначение для Rhoсвязанного С3 субстрата ботулинического токсина), пять phox единиц (Phox - обозначение для фагоцитарной оксидазы):
- 61 034552
Р91-РНОХ (содержит гем), p22phox, p40phox, p47phox (NCF1), p67phox (NCF2).
Замечено, что уровни других НАДФН оксизад не изменились. Ферментом является NOX5, который является новой НАДФН оксидазой, вырабатывающей супероксиды и действующей как Н+ канал (2+)зависимым образом.
Кроме того, фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат-зависимый RAC обменный агент 1(PREX1) также положительно регулировался. Этот белок действует как фактор обмена нуклеотида гуанина для RHO семейства маленьких GTP-связывающих белков (RACs). Показано, что он связывает и активирует RAC1 превращая связанный GDP в свободный GTP. Кодируемый белок, который находится в основном в цитоплазме, активируется фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфатом и бета-гамма субъединицами гетеротримерных G белков.
Вторым основным рано индуцированным белком была синтаза оксида азота 2А (индуцируемая, гепатоциты) (NOS2A). Оксид азота - реактивный свободный радикал, который действует как биологический медиатор в нескольких процессах, включая нейротрансмиссию и антимикробную и антиопухолевую активность. Этот ген кодирует синтазу оксида азота, которая экспрессируется в печени и индуцируется комбинацией липополисахаридов и определенных цитокинов.
Супероксиддисмутаза 2, митохондриальная (SOD2), является членом семейства железо/марганец содержащих супероксиддисмутаз. Она кодирует митохондриальный белок, который формирует гомотетрамер и связывает один ион марганца на субъединицу. Этот белок связывает супероксидные побочные продукты окислительного фосфорилирования и превращает их в перекись водорода и двухатомный кислород. Мутации по этому гену связаны с идиопатической кардиомиопатией (ИКМП), преждевременным старением, спорадической болезнью двигательного нейрона и раком.
Примером отрицательной белковой регуляции является Forkhead box M1 (FOXM1), про которого известно, что этот белок играет ключевую роль в последовательности событий клеточного цикла, где пики эндогенной экспрессии FOXM1 наблюдаются на фазах S и G2/M. Недавние исследования показали, что FOXM1 регулирует экспрессию множества G2/М-специфичных генов, таких как Plk1, циклин В2, Nek2 и CENPF и играет важную роль в поддержании сегрегации хромосом и стабильности генома. FOXM1 ген в настоящее время известен как протоонкоген человека. Аномальная сверхрегуляция FOXM1 участвует в онкогенезе базальноклеточной карциномы (БКК). FOXM1 сверхрегуляцию позднее обнаружили в большинстве солидных раков человека, включая рак печени, молочной железы, легких, простаты, шейки матки, кишечника, поджелудочной железы и мозга. Дальнейшие исследования БКК и Q10 должны определить уровни FOXM1.
SKMEL-28 клетки.
Дальнейшие эксперименты проводились с использованием SKMEL-28 клеток. Уровни мРНК, присутствующей в SKMEL-28 клетках, обработанных 100 мкМ Q10, сравнивались с уровнями необработанных клеток на различных временных точках с использованием методов ПЦР в режиме реального времени (RT-ПЦР). ПЦР-анализ (SABiosciences) представляет собой серию оптимизированных для ПЦР в режиме реального времени праймерных анализов в 96-луночных планшетах для задействованных в метаболизме или связанных с болезнью генов, а также соответствующие контроли количества РНК. ПЦРанализ осуществляет анализ генной экспрессии с помощью чувствительной ПЦР в режиме реального времени и возможность определения мультигенного профиля на микрочипе.
Таблица 11
Список и классификация мРНК уровней, оцененных по ПЦР-анализам окислительного стресса и антиоксидантной защиты
Антиоксиданты:
ПпютатионачтеЕОксидазьДСРхД GPX1, GPX2, GPX3, GPX4, GPX5 GPX6 GPX7 , G3Z1.
Peroxiredoxins (ТРх): PRDX1, PRDX2, PRDX3, PRDX4, PRDX5, PRDX6.
|АЩиед1еЕОксидазь|САТ, CYGB, DUOXI, DUOX2 , УХ GPR1.se. LPO МРО, PIP3 -Е, PIGS1,
PTGS2, PXDN, PXDNL, ТРО, TTN.
Другие антиоксидантАСВ. АРОЕ, GSR, МТЗ, SELS, SOD1, SOD3, SRXN1, TXNDC2, TXNRD.I , TXNRD2 .
Гены, вовлеченные в метаболизм активных частиц кислорода (ROS):
С^еЕОЩИ^ись^^ SOD1, аза, SOD3
Другие гены, вовлеченные в супероксидный метабмжн.2. CCS, CYBA, DUOXI, DUOX2, . МТЗ, NCF1,
NCF2, NOS2A' N0X5 ' ИИ' PRG3·
Другие гены, вовлеченные в метаболизм ROSOX1, BNIP3, ЕРНХ2, MPV17, SFTPD.
Гены, ответственные за окислительньйЖЖаа. АРОЕ, АТОХ1, CAT, CCL5, 8¾¾. CYGB, DGKK, DHCR24, DUOXI, DUOX2, DUSP1, EPX, FOXM1, GLRX2, GPR156 , GPX1, GPX2 , GPX3, GPX4. GPX5, GPX6, GPX7 . GSS, KRT1, i.PO, MH.2. MPO, MSRA. NM 1:.5, NUDT1, OXR1, OXSR1, PDLIM1, PIP3-E, PNKP, PRDX2, PRDX5, PRDX6, PRNP, RNF7, SCARA3. SUS. SEPPI SGK2, SIRT2, S0D1, SRXN1, STK25, TPO, 'N, TXNRD2 .
Наиболее сильные изменения уровней мРНК после 6 ч обработки 100 мкМ Q10 на SKMEL-28 клетках показаны путем визуального выделения названия белка (возрастание - полужирный шрифт; сниже
- 62 034552 ние - подчеркивание; нет изменений - серый).
Таблица 12
Данные различной временной обработки 100 мкМ SKMEL-28
справ, нос. 1. Обо iiui iciiiie Описание (> ч Q1O 16 ч Q1O 24 ч Q10 48 ч Q10 Q1O
NM_000265 NCF1 Нейтрофильный цитоплазматический фактор 1, (хронический гранулематоз, аутосома 1) 0 ВЫСОК ое 3,3829 15,7838 31,5369
ΝΜ_012423 RPL13 A Рибосомальный белок L13a -0,9025 3,1857 2,5492 4,9253 7,82
NM_020820 PREXI Фосфатидилинозитол 3,4,5-трисфосфат-завис имый RAC 1 -3,2971 2,867 0,3222 6,3719 7,476
NM_012237 SIRT2 Сиртуин (молчащего МАТ-локуса информацио нно й регуляции 2 гомолог) 2 (S. cerevisiae) -0,9025 4,0829 4,4766 5,7166 6,6257
NM_005125 CCS Шаперон меди для супероксиддисмутазы -0,6206 3,0077 3,452 2,9801 6,1539
NM_181652 PRDX5 Пероксиредоксин 5 -2,995 3,0454 3,5381 4,7955 6,0169
NM_016276 SGK2 Сыворотка/глю ко корти коид регулирумая киназа 2 0 0 0 0,5995 5,937
NM_003551 NME5 Белок, экспрессирующийся в неметастазирующих клетках 5 (ну клеозид-ди фосфат киназа) -0,6652 3,1138 3,3694 3,1549 5,782
NM_004417 DUSP1 Двойная специфичная фосфатаза 1 -0,6998 0,5902 2,7713 3,321 5,5375
NM_001752 CAT Каталаза -0,8589 2,8424 0,1046 3,8557 5,3988
- 63 034552
NM_000041 APOE Аполипопротеин E -0,8212 3,2069 -0,954 3 3,7694 5,3315
NM_000101 CYBA Цитохром b-245, альфа полипептид -0,3945 4,3475 3,9208 6,2452 5,0762
NM_000433 NCF2 Нейтрофильный цитоплазматический фактор 2 (65кДа, хронический гранулематоз, аутосома 2) 1,2266 3,0077 0,0954 5,476 0
NM_000963 PTGS2 Простагландин-эндопе роксид синтаза 2 (простагландин G/H синтаза и циклооксигеназа) -0,6912 2,7046 2,6552 4,0553 -3,3022
NM_183079 PRNP Прионный белок (р27-30) (болезнь Крейтцфельда-Якоба, синдром Г ерстмана- ШтрауслераШейнкера, фатальная семейная бессонница) -0,2144 3,5236 2,9086 5,0837 -3,9396
NM_004052 BNIP3 ВСЕ2/аденовирус Е1В 19кДа взаимодействующий белок 3 -2,9376 3,3288 4,312 -18,206 9 -4,8424
NM_000242 MBL2 Манноза-связывающий лектин (белок С) 2, растворимый (недостаток опсонина) -0,3622 -1,907 2 -3,014 2 -1,1854 -6,4544
NM_021953 FOXM1 Forkhead box Ml -0,8135 0,068 -0,921 6 3,3655 -10,095 3
Изменения уровней мРНК мониторились RT-ПЦР методами и были получены данные по анализам окислительного стресса и антиоксидантной защиты.
Нейтрофильный цитоплазматический фактор 2 (NCF2, 65кДа, хронический гранулематоз, аутосома 2) был одним из тех, чьи мРНК индуцировались вначале (наблюдалось на 6 ч). Впоследствии на временной точке 16 ч и дальше, после задержки на первичной фазе, индуцировались очень высокие уровни нейтрофильного цитоплазматического фактора (NCF1) (хронический гранулематоз, аутосома 1).
Нейтрофильный цитоплазматический фактор 2 является цитоплазматической субъединицей мультибелкового комплекса, известного как НАДФН оксидаза, обычно находимая в нейтрофилах. Эта оксидаза вырабатывает множество супероксидов, которые попадают в полость нейтрофильной фагосомы. НАДФН оксидаза (никотинамид аденин динуклеотид фосфатоксидаза) является связанным с мембраной энзимным комплексом. Ее можно обнаружить в плазматической мембране, а также в мембране фагосомы. Она состоит из шести следующих субъединиц:
a Rho гуанозин трифосфотаза (GTP-аза), обычно Rac1 или Rac2 (Rac - обозначение для Rhoсвязанного С3 субстрата ботулинического токсина), пять phox единиц (Phox - обозначение для фагоцитарной оксидазы):
Р91-РНОХ (содержит гем), p22phox, p40phox, p47phox (NCF1), p67phox (NCF2).
Замечено, что уровни других НАДФН оксизад не изменились. Ферментом является NOX5, который является новой НАДФН оксидазой, вырабатывающей супероксиды и действующей как Н+ канал (2+)зависимым образом.
Кроме того, фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат-зависимый RAC обменный агент 1(PREX1) также положительно регулировался. Этот белок действует как фактор обмена нуклеотида гуанина для RHO семейства маленьких GTP-связывающих белков (RACs). Показано, что он связывает и активирует RAC1 превращая связанный GDP в свободный GTP. Кодируемый белок, который находится в основном в ци- 64 034552 топлазме, активируется фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфатом и бета-гамма субъединицами гетеротримерных G белков.
Вторым основным рано индуцированным белком была синтаза оксида азота 2А (индуцируемая, гепатоциты) (NOS2A). Оксид азота - реактивный свободный радикал, который действует как биологический медиатор в нескольких процессах, включая нейротрансмиссию и антимикробную и антиопухолевую активность. Этот ген кодирует синтазу оксида азота, которая экспрессируется в печени и индуцируется комбинацией липополисахаридов и определенных цитокинов.
Примером отрицательной белковой регуляции является Forkhead box M1 (FOXM1), про которого известно, что этот белок играет ключевую роль в последовательности событий клеточного цикла, где пики эндогенной экспрессии FOXM1 наблюдаются на фазах S и G2/M. Недавние исследования показали, что FOXM1 регулирует экспрессию множества G2/М-специфичных генов, таких как Plk1, циклин В2, Nek2 и CENPF, и играет важную роль в поддержании сегрегации хромосом и стабильности генома. FOXM1 ген в настоящее время известен как протоонкоген человека. Аномальная сверхрегуляция FOXM1 участвует в онкогенезе базальноклеточной карциномы (БКК). FOXM1 сверхрегуляцию позднее обнаружили в большинстве солидных раков человека, включая рак печени, молочной железы, легких, простаты, шейки матки, кишечника, поджелудочной железы и мозга. Дальнейшие исследования БКК и Q10 должны определить уровни FOXM1.
Эксперимент 3. Анализы ПЦР в режиме реального времени, использующие анализ теплового шока.
Анализы теплового шока были проведены для SCC клеток, и данные регулируемых генов представлены ниже в табл. 13.
Таблица 13
Гены белков теплового шока, регулируемые обработкой 100 мкМ Q10 в SCC клетках
Обозначение Описание Регуляция Локализация Возможные функции
CCT6B Шаперонин содержащий TCP1, субъединица 6В (zeta 2) Отрицательно регулируется на 24 часах Цитоплазма Укладка белков и сборка белковых комплексов.
ДНКДА! DnaJ (Hsp40) гомолог, субсемейство А, член 1 Положительно регулируется на 6 часах. Ядро Реагирует на повреждение ДНК и изменения в
- 65 034552
укладке белков.
ДНЮВ13 DnaJ (Hsp40) связанный, субсемейство В, член 13 Отрицательно регулируется на 6 часах. Неизвестна Укладка белков и апоптозы.
ДНК1В5 DnaJ (Hsp40) гомолог, субсемейство В, член 5 Отрицательно регулируется на 6 часах. Неизвестна Связывает HSP, участвует в укладке белков и в сборке белковых комплексов.
днюем 2 DnaJ (Hsp40) гомолог, субсемейство С, член 12 Отрицательно регулируется на 6 часах. Неизвестна Связывает HSP, участвует в укладке белков и в сборке белковых комплексов.
ДНЮС4 DnaJ (Hsp40) гомолог, субсемейство С, член 4 Отрицательно регулируется на 6 часах. Цитоплазма Связывает HSP, участвует в укладке белков и в сборке белковых комплексов.
ДНЮС5В DnaJ (Hsp40) гомолог, субсемейство С, член 5 бета Отрицательно регулируется на 6 часах. Неизвестна Участвует в укладке белков, реагирует на изменения в укладке белков.
HSPA8 Теплового шока 70 кДа белок 8 Положительно регулируется на 6 часах. Цитоплазма Регулирует TNF, связывает BAG1, STUB1, ТР53, участвует в апоптозах.
HSPH1 Теплового шока 105 кДа/HO к Да белок 1 Положительно регулируется на 6 часах. Цитоплазма Связывается с HSPA8, важен для укладки белков, реагирует на разворачивание белков и стресс.
Эксперимент 4. Анализы ПЦР в режиме реального времени, использующие диабетический анализ.
Эксперименты, описанные в этом примере, были проведены для проверки общей гипотезы, что Q10 оказывает влияние на множество генов и меняет метаболический статус клетки. мРНК из SKMEL-28 клеток, обработанных 100 мкМ Q10, была оценена на RT-ПЦР по набору целевых белков, участвующих в диабетическом и связанными с ним путями. Результаты этого эксперимента демонстрируют, что для нескольких белков, участвующих в путях гликолиза и процессинге инсулина, изменились уровни экспрессии их мРНК (представлено в табл. 14).
- 66 034552
Таблица 14
Основные изменения уровней мРНК в SKMEL-28 клетках, обработанных 100 мкМ Q10 в течение 16 ч
Refseq Описание Обозначение Кратное изменение после 16 часов (100 mkMQIO)
NM_000162 Глюкокиназа (гексокиназа 4) GCK 8,5386
NM_178849 Г епатоцитов ядерный фактор 4, альфа HNF4A 8,421
NM_005249 Forkhead box G1 FOXG1 4,6396
NM_000599 Инсулин-подобный фактор роста связывающий белок 5 IGFBP5 2,2721
NM_001101 Актин, бета АСТВ -2,0936
NM_002863 Фосфорилаза, гликоген; печень (болезнь Г ерса, гликогенез VI типа) PYGL -2,65
NM_001065 Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 1А TNFRSF1A -2,8011
NM_021158 Гомолог Tribbles 3 (Drosophila) TRIB3 -2,8011
NM_003749 Инсулин рецептора субстрат IRS2 -2,9404
2
NM_004578 RAB4A, член RAS семейство онкогенов RAB4A -3,1296
NM_004176 Регулирующий стеролы элемент, связывающий транскрипционный фактор 1 SREBF1 -3,5455
NM_004969 Инсулин-расщепляющий фермент IDE -4,4878
NM_005026 Фосфоинозитид-3-киназа, каталитический, дельта полипептид PIK3CD -6,8971
NM_000208 Инсулин рецептор INSR -8,6099
NM_003376 Фактор роста эндотелия сосудов А VEGFA -15,5194
NM_001315 Митоген-активируемая протеинкиназа14 МАРК 14 -74,3366
Результаты этих первичных экспериментов показывают, что уровни мРНК для множества инсулинсвязанных белков модулировались в обоих направлениях. Результаты показывают, что Q10 мог бы влиять на лечение и/или оценку диабетической болезни.
Дальнейшие эксперименты проводились для подтверждения результатов, полученных на SK-MEL28 клетках, обработанных Q10. Многие гены в SK-MEL-28 клетках регулируются уже на 6 ч после обработки после обработки Q10. Однако первичная регуляция становится менее заметной на 16 и 24 ч. Около 48 ч мы обнаружили, что многие гены диабетического набора снова стали сильно регулируемыми. Совпадающие результаты двух или более независимых экспериментов представлены ниже в табл. 15. В SCC клетках также показана регуляция некоторых генов, на 6 и 24 ч после обработки Q10. Эти результаты, полученные на SCC клетках, представлены в табл. 16, а гены, которые регулируются и в SK-MEL-28 клетках, и в SCC клетках, представлены в табл. 17.
- 67 034552
Таблица 15
Связанные с диабетом гены в SK-MEL-28 клетках, регулируемые обработкой 100 мкМ Q10
Обозначен не Описание Регуляция Локализа ция Возможные функции
ADRB3 Адренергический, бета- 3-, рецептор Отрицательно регулируется на 48 часах Плазмати ческая мембрана сАМР сигналинг, G-белка сигналинг
СЕАСАМ1 Молекула клеточной адгезии 1, связанная с карциоэмбриональным антигеном (билиарный гликопротеин) Отрицательно регулируется на 48 часах Внеклето чное пространс тво Анти-апоптоз, позитивная регуляция ангиогенеза.
СЕВРА ССААТ/энхансер связывающий белок (С/ЕВР), альфа Положительно регулируется на 48 часах Ядро Г люкокортикоидн ого рецептора сигналинг, VDR/RXR активация.
CTLA4 Цитотоксичный Т- лимфоцитассоциированный белок 4 Отрицательно регулируется на 48 часах Плазмати ческая мембрана Т клеток рецептора сигналинг, активирует CASP8.
DUSP4 Двойная специфичная фосфатаза4 Отрицательно регулируется на 48 часах Ядро Фосфатаза
ENPP1 Эктонуклеотидная пирофосфатаза/фосфоди эстераза 1 Отрицательно регулируется на 48 часах Плазмати ческая мембрана Негативная регуляция пути инсулинового рецептора
FOXC2 Forkhead box С2 (MFH-1, мезенхимный forkhead 1) Отрицательно регулируется на 48 часах Ядро Анти-апоптоз, фактор транскрипции
G6PD Глюкоза-6фосфатдегидрогеназа Положительно регулируется на 48 часах, затем отрицательно регулируется Цитоплаз ма Пентозофосфатны й путь, метаболизм глутатиона.
НМ0Х1 Гем оксигеназа (дециклическая) 1 Отрицательно регулируется на Цитоплаз ма Гем оксигеназа дециклическая
- 68 034552
48 часах
ICAMl Молекула внутриклеточной адгезии 1 (CD54), рецептор риновируса человека Отрицательно регулируется на 48 часах Плазмати ческая мембрана Регулируется аторвастатином, влияет на некоторые каспазы.
IL4R Интерлейкина 4 рецептор Отрицательно регулируется на 48 часах Плазмати ческая мембрана Положительная регуляция ТР73, связывает IRS1 и IRS2
IRS1 Рецептора инсулина субстрат 1 Положительно регулируется на 48 часах, затем отрицательно регулируется Плазмати ческая мембрана Связывает инсулин рецептор
IRS2 Рецептора инсулина субстрат 2 Отрицательно регулируется на 48 часах Плазмати ческая мембрана IGF-1 сигналинг
NSF N -эти лмал е имид сенситивный фактор Отрицательно регулируется на 48 часах Цитоплаз ма GABA сигналинг
PIK3CD Фосфоинозитид-3 киназа, каталитический дельта полипептид Отрицательно регулируется на 48 часах Цитоплаз ма Киназа
PPARG Рецептор, активирующий пролиферацию пероксисом, гамма Отрицательно регулируется на 48 часах Ядро Транскрипционны й фактор
PRKCB1 Протеинкиназа С, бета 1 Отрицательно регулируется на 48 часах Цитоплаз ма РКС семейство
SELL Селектин L (молекула адгезии лимфоцитов 1) Отрицательно регулируется на 48 часах Плазмати ческая мембрана Активирует RAS, МАРК
SREBF1 Стерол-регуляторный элемент связывающий фактор транкрипции 1 Положительно регулируется на 48 часах, затем отрицательно регулируется Ядро Транскрипционны й фактор
STXBP1 Синтаксин связывающий белок 1 Отрицательно регулируется на Цитоплаз ма Присутствует в богатой миелином
- 69 034552
48 часах фракции.
TGFB1 Трансформирующий фактор роста, бета 1 Положительно регулируется на 48 часах, затем отрицательно регулируется Внеклето чное пространс тво Про-апоптоз
NKX2-1 NK2 гомеобокс 1 Отрицательно регулируется на 48 часах -Ядро Транскрипционны й активатор
TNF Фактор некроза опухолей (TNF суперсемейство, член 2) Положительно регулируется на 48 часах Внеклето чное пространс тво Про-апоптоз
TNFRSF1A Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 1А Отрицательно регулируется на 72 часах Плазмати ческая мембрана Про-апоптоз
VEGFA Фактор роста эндотелия сосудовА Положительно регулируется на 58 часах, затем отрицательно регулируется Цитоплаз ма Киназа
Таблица 16
Связанные с диабетом гены SCC клеток, регулируемые обработкой 100 мкМ Q10
Обозначение Описание Регуляция.
G6PD Глюкоза-6-фосфат дегидрогеназа Отрицательно регулируется на 6 часах.
ICAM1 Молекула межклеточной адгезии 1 (CD54), рецептор риновируса человека Отрицательно регулируется на 6 часах.
INPPL1 Инозитол полифосфат фосфатаза- подобный 1 Отрицательно регулируется на 6 часах.
NOS3 Оксида азота синтаза 3 (эндотелиальные клетки) Отрицательно регулируется на 6 часах.
PIK3CD Фосфоинозитид-3-киназа, катализатор, дельта полипептид Отрицательно регулируется на 6 часах.
- 70 034552
PPARA Рецептор, активирующий пролиферацию пероксисом, альфа Отрицательно регулируется на 6 часах.
PYGL Фосфорилаза, гликоген; печень (болезнь Герса, гликогенез VI типа) Отрицательно регулируется на 6 часах.
SREBF1 Стерол-регуляторный элемент связывающий транкрипционный фактор 1 Отрицательно регулируется на 6 часах.
STXBP2 Синтаксин связывающий белок 2 Отрицательно регулируется на 6 часах.
TNF Фактор некроза опухолей (TNF суперсемейство, член 2) Отрицательно регулируется на 6 часах.
TNFRSF1A Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 1А Отрицательно регулируется на 6 и 24 часах.
VEGFA Фактор роста эндотелия сосудов А Отрицательно регулируется на 6 часах.
Таблица 17
Гены, связанные с диабетом, регулируемые обработкой
100 мкМ Q10 как в SK-MEL-28, так и в SCC клетках
Обозначение Описание.
G6PD Г люкоза-6-фосфатд егидрогеназа
ICAM1 Молекула внутриклеточной адгезии 1 (CD54), рецептор риновируса человека
PIK3CD Фосфоинозитид-3-киназа, катализатор, дельта полипептид
SREBF1 Стерол-регуляторный элемент связывающий транкрипционный фактор 1
TNF Фактор некроза опухолей(ЕМЕ суперсемейство, член 2)
TNFRSF1A Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 1А
VEGFA Фактор роста эндотелия сосудовА
Уровни мРНК для множества имеющих отношение к инсулину белков модулировались в обоих направлениях. Q10 оказывает воздействие на регуляцию клеточного метаболизма, и таким образом влияет на болезни, связанные с нарушением метаболизма, такие как диабет. Ниже обсуждаются два белка, которые показали значительную модуляцию.
Митоген-активируемая протеинкиназа 14 (MAPK14).
Митоген-активируемая протеинкиназа 14 (MAPK14) является членом семейства МАР-киназ. МАРкиназы действуют как интеграционные точки во множестве биохимических сигналов и участвуют во множестве клеточных процессов, таких как пролиферация, дифференциация, регуляция транскрипции и развитие. Результаты этого эксперимента показывают, что MAPK14 обнаружила значительную отрицательную регуляцию.
Гепатоцитов ядерный фактор 4, альфа (HNF4A).
HNF4 (гепатоцитов ядерный фактор) является ядерным рецепторным белком, экспрессирующимся по большей части в печени, кишечнике, почках и бета-клетках поджелудочной железы, который очень важен для развития печени. У человека существуют две изоформы NHF4, альфа и гамма, кодируемые двумя различными генами HNF4A и HNF4G соответственно (см., например, Chartier F.L., Bossu J.P., Laudet V., Fruchart J.C., Laine В. (1994). Клонирование и секвенирование сДНК, с кодированием гепатоцитного ядерного фактора человека 4 демонстрирует наличие двух изоформ в печени человека, Gene 147 (2): 269-72.)
HNF4 первоначально считался рецептором-сиротой. Однако позже обнаружили, что активность HNF4 поддерживается постоянным связыванием со множеством жирных кислот (см., например, Sladek F. (2002). В отчаянном поиске... чего-то. Mol Cell 10 (2): 219-221 и Jump D.B., Botolin D., Wang Y., Xu J., Christian B., Demeure О. (2005). Регуляция транскрипции гепатического гена при помощи жирных кислот. J Nutr 135 (11)). Связывающийся с лигандом домен HNF4, как и у других ядерных рецепторов,
- 71 034552 принимает каноническую форму односпирального сэндвича (см., например, Wisely G.B., Miller A.B., Davis R.G., Thornquest A.D. Jr., Johnson R., Spitzer T., Seller A., Shearer B., Moore J.T., Miller A.B., Willson T.M., Williams S.P. (2002). Гепатоцитный ядерный фактор 4 является фактором транскрипции, который, в основном, связывает жирные кислоты, Structure 10 (9): 1225-34 и Dhe-Paganon S., Duda K., Iwamoto M., Chi Y.I., Shoelson S.E. (2002). Кристаллическая структура связывающего домена альфа-лиганда HNF4 в комплексе с эндогенным лигандом жирной кислоты, J Biol Chem 277 (41): 37973-6) и взаимодействует с ко-активаторными белками (см., например, Duda K., Chi Y.I., Shoelson S.E. (2004). Структурная основа для Н№-4альфа активации при помощи связывания лигандом и соактиватором, J Biol Chem 279 (22): 23311-6).
Мутации по гену HNF4-a связаны с развитием приступов диабета взрослых в молодом возрасте (MODY) (см., например, Fajans S.S., Bell G.I., Polonsky K.S. (2001). Молекулярные механизмы и клиническая патофизиология диабета взрослых в молодом возрасте, NEngl J Med345 (13): 971-80.)
Гепатоцитов ядерный фактор 4 (HNF4) является тканеспецифичным транскрипционным фактором, про которого известно, что он регулирует большое число генов в гепатоцитах и клетках поджелудочной железы. Хотя HNF4 высоко экспрессируется в некоторых отделах почек, о его роли в этом органе и об Н№4-регулируемых генах в почечных клетках известно мало. Распространенность и активность HNF4 часто уменьшаются в клетках почечной карциномы (RCC), что указывает на то, что некоторые опухоли подавляют функцию HNF4 в почечных клетках. Интересно, что показано, что многие гены, регулируемые HNF4, дерегулируются в исследованиях RCC на микрочипах. Эти гены (ACY1, WT1, SELENBP1, COBL, EFHD1, AGXT2L1, ALDH5A1, ТНЕМ2, АВСВ1, FLJ14146, CSPG2, TRIM9 и HEY1) являются хорошими кандидатами на роль генов, активность которых изменяется при снижении HNF4 в RCC.
В структуре лиганд-связывающего домена И№4альфа (1M7W.pdb; Dhe-Paganon (2002) JBC, 277, 37973) наблюдался маленький липид, который был выделен из Е. coli. Кристалл содержит две конформации белка, где удлиненная спираль 10 и короткая спираль 12 имеют альтернативные конформации. Интересно, что при изучении липид-связывающего участка нашли, что там существуют два участка. Один выходящий участок захватывает головную группу маленького липида, и было замечено, что несколько карман-образующих регионов колаколизованы с этим выходящим участком. Есть гипотеза, что Q10 специфически связывается с этим транскрипционным фактором. Когда моделируется, как Q10 встраивается в этот связанный с липидами канал, кольцо Q10 входит в карман (фиг. 28). Мутация с неизвестными функциями (E276Q) могла бы иметь потенциал для упорядочения остатков, выпрямляющих этот карман, и тем самым оказывать негативное воздействие на предполагаемое связывание Q10.
Кроме того, в согласии с такой моделью связывания Q10, гидрофобный хвост выходил бы за внутреннюю полость и взаимодействовал бы с удлиненным helix 10. Таким образом, это взаимодействие могло бы потенциально менять конформацию helix 10/12 группы. Это могло бы затем менять равновесие активация/инактивация активности транскрипционного фактора.
Пример 7. Анализы антителами на микрочипах.
Оценка концентрации белка, связанной с наличием Q10, была проведена с использованием метода антител на микрочипах. Микрочип содержал антитела примерно к 700 белкам, широкому диапазону типов белков и потенциальным маркерам обменных путей.
Первоначальный эксперимент для определения изменений уровней концентрации белков в клетках, обработанных Q10, был проведен на микрочипах с антителами (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma) и SK-MEL-28 клетками, обработанными 6 или 24 ч. Клетки были собраны и экстрагированы для получения растворимого белкового супернатанта. Две порции белков (~1 мг в общем) из каждого образца (1 мг/мл) каждая были помечены флюоресцентной меткой (Су3 и Су5 соответственно). Избыточная метка была удалена из белка, и материал использовался для инкубации на микрочипах. Для сравнения образцов с двух временных точек были смешаны равные количества белка, при этом каждый образец относился к различному меченому типу (например, 3-часовой экстракт, меченый Су3, был смешан с 24-часовым экстрактом, меченым Су5). После инкубации с микрочипом (в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем), микрочипы были промыты и высушены. Микрочипы сканировались на флюоресцентном лазерном сканере для подсчета сравнительной флюресцентной интенсивности Су3 и Су5 меток.
- 72 034552
Таблица 18
Белки с повысившимися уровнями в SK-MEL-28 клетках после 24-часовой обработки 50 мкМ Q10
Название Соотношение
Cdkl 0,1
DcRl 0,1
Протеинкиназа СЬ2 0,1
Фактора некроза опухолей растворимый рецептор II 0,1
BAD 0,1
Каспаза 13 0,2
FBI1 PAKEMON 0,2
Zyxin 0,2
Cdc25A о,з
PIASx о,з
Фактор роста нервов b о,з
Протеинтирозинфосфатаза PEST о,з
hBRM hSNF2a 0,4
GRP94 0,4
Кальмодулин 0,4
Серин треонин протеинфосфатаза 2С а b 0,4
ARC 0,4
НеурабинП 0,4
Синтаза оксида азота bNOS 0,4
Серин треонин протеинфосфатаза 1Ь 0,4
Таблица 19
Белки с возросшими уровнями в SK-MEL-28 клетках после 24-часовой обработки 50 мкМ Q10
Название Соотношение
Белок теплового шока 110 0,4
Серин треонин протеинфосфатаза Igl 0,4
СОХИ 0,5
HSP70 0,5
BLK 0,5
Цитокератин 8 12 0,5
BUBR1 0,5
FOXC2 0,5
Серин треонин протеинфосфатаза 2 А Bg 0,5
MSH6 0,5
DR6 0,5
Rad 17 0,5
BAF57 0,5
Трансформирующий фактор роста b pan 0,5
ВТК 0,5
Серин треонин протеинфосфатаза 2 А/В рап2 0,5
СЧРаза 0,5
SynCAM 0,5
Ядерный антиген пролиферирующих клеток 0,5
Название Соотношение
BclxL 4,2
BID 3,7
Bmf 3,7
PUMA ЬЬсЗ з,о
Zip-Киназа 2,8
Bmf 2,8
DcR2 2,7
E2F1 2,7
FAK pTyr577 2,5
FKHRL1 FOXO3a 2,5
MTBP 2,5
Коннексин 32 2,5
Аннексии VII 2,4
рбЗ 2,4
SUMO1 2,4
lAfadin 2,3
MDMX 2,3
Pyk2 2,3
RIP Рецептор- взаимодействующий белок 2,3
RICK 2,3
IKKa 2,3
Bclx 2,3
Afadin 2,2
Пролиферирующий 2,2
Название Соотношение
Класпин 2Д
GRP75 2Д
Каспаза 6 2Д
ILP2 2Д
аАктинин 2Д
Витронектин 2Д
DRAK1 2Д
PTEN 2Д
Grb2 2Д
HDAC4 2,0
HDAC7 2,0
Синтаза оксида азота bNOS 2,0
HDAC2 2,0
р38МАРК 2,0
Рилин 2,0
Протеинкиназа Cd 2,0
сегЬВЗ 2,0
hSNF5 INI1 2,0
Протеинкиназа Са 2,0
Глутаматный penenTopNMDAR 2а 2,0
Лептин 2,0
Диметилированный гистон НЗ diMeLys4 2,0
BID 2,0
МеСР2 2,0
- 73 034552
клеточный белок ΚΪ67
Гистон НЗ pSer28 2,2
CASK LIN2 2,2
Центрин 2,2
ТОМ22 2,1
Синтаза оксида азота эндотелиальная eNOS 2,1
Протеинкиназа В а 2,1
Ламинин 2,1
Миозина lb ядерный 2,1
Каспаза 7 2,1
МАР Киназа 2 ERK2 2,1
KIF17 2,1
Рецептор фактора роста нервов р75 2,0
Киназа легких цепей миозина 2,0
cRaf pSer621 2,0
GRP78 BiP 2,0
сМус 2,0
Rafi 2,0
МТА2 MTA1L 2,0
Sir2 2,0
ATF2 pThr69 71 2,0
Протеинкиназа C 2,0
Протеинкиназа Cb2 2,0
Для того чтобы подтвердить ранее наблюдавшиеся апоптозные белки и чтобы расширить оценку по большому числу про-апоптозных и анти-апоптозных белков, были выбраны два метода исследования, по которым можно скринировать большое семейство потенциально задествованных белков.
Во-первых, микрочип с антителами (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma) был использован для скрининга с использованием 700 белковых антител для определения изменений в уровнях концентраций белков в SK-MEL-28 клетках, обработанных 24 ч с 50 мкМ Q10.
Из экспериментов с антителами, на SKMEL-28 с Q10 (24 ч) были идентифицированы следующие белки с измененными уровнями: Bcl-xl, Bmf, BTK, BLK, cJun (pSer63), Коннексин 32, PUMA bbc3, BID, Par4, cCb1. Главное заключение, выведенное из этого первичного исследования, состояло в том, что на ожидаемые пре-апоптозные белки было оказано влияние.
Исследования на микрочипах с антителами на SK-MEL-28.
Микрочип с антителами (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma) был использован для скрининга с использованием 700 белковых антител для определения изменений в уровнях концентраций белков в SKMEL-28 клетках, обработанных 24 ч с 50 мкМ Q10.
Таблица 20
Изменения уровней белка в SKMEL-28, обработанных 50 мкМ Q10
Название Номер антител (Sigma) SKMEL28 Q10/ SKMEL28 контроль SKMEL28/ HEKa контроль HEKa Q10Z HEKa контроль
BclxL B9429 2,46 1,04 1,83
PUMA bbc3 P4743 2,31 1,14 2,14
Bmf B1559 2,23 1,12 2,H
Bmf B1684 2,09 1,13 1,74
eJun pSer63 J2128 1,99 1,14 1,85
BLK B8928 1,94 1,05 1,51
Из экспериментов с антителами на SKMEL-28 с Q10 (24 ч) были идентифицированы следующие белки с измененными уровнями: Bcl-xl, Bmf, BTK, BLK, cJun (pSer63), Коннексин 32, PUMA bbc3, BID, Par4, cCbl. Эти данные подтверждают, что уровни пре-апоптозных белков изменились после инкубации с повышенными уровнями экзогенно добавленного Q10.
Bcl-xl (базальноклеточная лимфома сверхбольшая) является трансмембранной молекулой в митохондриях. Она включена в сигнальный путь трансдукции FAS-L и является одним из нескольких антиапоптозных белков, которые являются членами белкового семейства Bcl-2. Она задействована в выживании раковых клеток. Однако известно, что альтернативный сплайсинг Bcl-х мРНК человка может приводить по крайней мере к двум различным видам Bcl-х мРНК, Bcl-xL и Bcl-xS. Преобладающий белковый продукт (233 аминокислоты) - более крупная Bcl-х мРНК, Bcl-xL, которая подавляет клеточную гибель вследствие удаления фактора роста (Boise et al., 1993. Cell 74, 597-608). Bcl-xS, а с другой стороны, ингибирует возможность Bcl-2 ингибировать клеточную гибель и делает клетки более восприимчивыми к апоптозной гибели клеток.
- 74 034552
Таблица 21
Протеины с возросшими уровнями в SCC клетках после 24 ч обработки 100 мкМ Q10
Название Соотношение Название Соотношение
PUMA ЬЬсЗ 3,81 Sir2 2,25
HDAC7 3,21 DcR3 2,24
BID 3,12 RbAp48 RbAp46 2,21
МТВР 3,00 OGlcNAc Трансфераза 2,21
р38 МАР Киназа неактивированная 2,93 GRP78 BiP 2,20
PKR 2,87 Sin3A 2,20
TRAIL 2,86 p63 2,20
DR5 2,86 Пресенилин1 2,19
Cdk3 2,82 РМЛ 2,18
ЫКадгерин 2,71 PAKlpThr212 2,17
Рилин 2,68 HDAC8 2,16
р35 Cdk5 Регулятор 2,63 HDAC6 2,15
HDAC10 2,60 Синтаза оксида азота индуцируемая iNOS 2,15
RAP1 2,59 Нейрофибромин 2,15
PSF 2,56 Синтаксин 6 2,13
сМус 2,55 Parkin 2,12
Метилированного гистона НЗ MeLys9 2,54 Rad 17 2,И
HDAC1 2,51 Синтаза оксида азота bNOS 2,10
F1A 2,48 TIS7 2,09
ROCK1 2,45 OP 18 Статмин (статмин 1/онкобелок 18 ) 2,08
Bim 2,45 фосфо-Ь-Катенин pSer45 2,07
FXR2 2,44 НеурабинП 2,07
DEDAF 2,44 е Тубулин 2,07
DcRl 2,40 РКВ pThr308 2,07
APRIL 2,40 Орнитин Декарбоксилаза 2,07
PRMT1 2,36 Р53 ВР1 2,06
Pyk2 pTyr580 2,34 Рук2 2,05
Витронектин 2,33 HDAC5 2,05
Синаптоподин 2,32 Коннексин 43 2,05
Каспаза 13 2,30 al Синтрофии 2,04
Синтаксин 8 2,29 MRP1 2,04
DR6 2,29 сегЬВ4 2,03
BLK 2,28 S Нитроцистеин 2,03
ROCK2 2,28 SGK 2,02
Rab5 2,01
Убиквитина С терминальная гидролаза L1 2,01
Миозина lb ядерный 2,00
Раг4 апоптозного ответа простаты 4 2,00
- 75 034552
Таблица 22
Протеины с понизившимися уровнями в SCC клетках после 24 ч обработки 100 мкМ Q10
Название Соотношение
API 0,68
Центрин 0,55
CUGBP1 0,67
Цистатин А 0,69
Цитокератин СК5 0,60
Фибронектин 0,63
gParvin 0,70
Независимый фактор роста 1 0,63
Фактор роста нервов b 0,60
ПроКаспаза 8 0,72
Rab7 0,62
Rab9 0,73
Серин треонин протеинфосфатаза Igl 0,71
Серин треонин протеинфосфатаза 2 А Bg 0,73
SKM1 0,70
SLIPR MAGI3 0,67
Спектрин а и b 0,70
Spred2 0,66
TRFI 0,74
Пример 8. Иммуноблоттинги.
Первый эксперимент, проведенный и оцененный с помощью иммуноблоттинга и 2-D гельэлектрофорезов был осуществлен на линии клеток рака кожи SKMEL-28. В этой экспериментальной серии участвовали SK-MEL-28 клетки, обработанные в течение 3, 6, 12, и 24 ч 50 или 100 мкМ Q10.
Различные типы клеток были оценены путем иммуноблоттинга с антителами к Bcl-xL (фиг. 14), антителами к Виментину (фиг. 15), серией антител к функции митохондриального окислительного фосфорилирования (фиг. 16-21) и с серией антител, связанных с целостностью митохондриальной мембраны (фиг. 22-27). Результаты этих экспериментов демонстрируют, что некоторые из исследуемых белков в результате обработки клеток Q10 показали положительную или отрицательную регуляцию.
Пример 9. Связанные с диабетом гены, идентифицированные как модулированные по уровням мРНК вследствие обработки клеток рака поджелудочной железы (РаСа2) 100 мкМ Q10.
Диабетные анализы были применены для образцов, обработанных 100 мкМ Q10, в различное время после обработки. Эксперименты были проведены практически так же, как описано выше. Различные гены, которые, как было обнаружено, были модулированы обработкой Q10, приведены в табл. 23 ниже. Результаты показывают, что обработка Q10 модулировала следующие гены:
АВСС8, ACLY, ADRB3, CCL5, CEACAM1, CEBRA, F0XG1, FOXP3, G6PD, GLP1R, GPD1, HNF4A, ICAM1, IGFBP5, INPPL1, IRS2, MAPK14, ME1, NFKB1, PARP1, РПСЗС2В, PIK3CD, PPARGC1B, PRKAG2, PTPN1, PYGL, SLC2A4, SNAP25, HNF1B, TNRFSF1A, TRIB3, VAPA, VEGFA, IL4R и IL6.
- 76 034552
Таблица 23
Гены диабетного анализа, экспрессия которых регулируется 100 мкМ Q10 и возможные функции которых в клетке положительно регулируются (серый) и отрицательно регулируются (белый)
Название гена Функция гена
ADRB сАМР сш на. и и и . С (-белка сш на. и и и
( (1.5 1 lpiipo.iln.ie .ни аилы для CCR5 и pei улпрусчея Т\ 1
СПАСАМ 1 Ап 1 п-апонюшая. по ;ιι ι пиная роуляция aiinioi eneta
GI.PRI Повышение инсулиновой и уменьшение секреции ι.ιιοκίΐι οιιοΒοίί секреции поджелудочной желе'.ой
GPDI Meia6o.ni’>м ушеволов. 11АД11 окисление
KAMI Pei улпрусчея а юрвасча ι ином. ιιροιiccciipye i некоюрые каспа >ы
МАРКИ Κοιι ι рольная ючка повреждения ДПК. aiii hoi cue 5. процесс MCiaoo.in;ма ι люко’.ы
PARPI ДПК воссιailOB.iei11ie. pei y.nipyci TP53. XOS2A. XI KB. BocciaiioB.iciiiic le.ioMcpois
PIK3C2B Фосфонно ;ιι ι пл опосредованный chi iia.iiinr. pei y.11ipycι АКТ и АКТЕ
PIK3CD Кипа ’.а
PYGI. Meiaoo.iiHM ушеволов. peiynupyei i.iiikoicii ii ι.111koi eiiciiii ι a ;\
SI.C2A4 Peiy.inpyci i.iiokoiv н pei улпрусчея IXS н инсулином
SXAP25 Регуляция инсу.1111ιοΒοΓί секреции. laxuai iieiipoiранемп11ера
СЕВРА Гдюкокоршкоидпых рецешоров сш налит, VDRRNR активация.
FOXP3 Регулирует IL4, IL2.
G6PD Пентозофосфатный путь, метаболизм глутатиона.
IGFBP5 Регуляция клеточного роста, регулируется IGF1
INPPL1 Регулирует Akt и гликоген.
IRS2 IGF-1 сигналинг
МЕ1 Регулирует яблочную кислоту и регулируется ТЗ.
NFKB1 Регулирует IL6 и TNF.
PPARGC1B Регулируется МАРКИ
PRKAG2 Биосинтез жирных кислот, холестерина.
ΡΤΡΝ1 Дефосфорилирует JAK2 и ЕОБрецептор киназы.
VEGFA Киназа, ангиогенез
IL4R Положительно регулируется ТР73, связывается с IRS1 и IRS2
HNF1B HNF4A
TNFRSF1A Про-апоптоз
TRIB3 Регулирует АКТ1 и негативный регулятор NFkB.
VAPA Регулирует NFkB, миграцию везикул.
Пример 10. Связанные с ангиогенезом гены, идентифицированные как модулированные по уровням мРНК вследствие обработки клеток рака поджелудочной железы (РаСа2) 100 мкМ Q10.
Ангиогенезные анализы были применены для образцов, обработанных 100 мкМ Q10, в различное
- 77 034552 время после обработки. Эксперименты были проведены практически так же, как описано выше. Различные гены, которые, как было обнаружено, были модулированы обработкой Q10, приведены в табл. 24 ниже. Результаты показывают, что обработка Q10 модулировала следующие гены: AKT1, ANGPTL4,
ANGPEP, CCL2, CDH4, CXCL1, EDG1, EFNA3, EFNB2, EGF, FGF1, ID3, IL1R, IL8, KDR, NRP1, РЕСАМ1, PROK2, SERPINF1, SPHK1, STAB1, TGFB1, VEGFA и VEGFB.
Таблица 24
Список генов, связанных с ангиогенезом, экспрессия которых регулируется 100 мкМ Q10 и возможные функции которых в клетке положительно регулируются (серый) и отрицательно регулируются (белый)
Ген Функция гена.
A\GPTL4 aiiiiiani iioiene;. iiei а ιίιβηι.ιπ peiy.iMiop анонююв. Meiaoo.in ;.м липидов.
¢1)115 Рамчнпе кровяных сосудов, клсючпая а.нешя. iiei ai пвиып pci удя юр клеιочном пролиферации
1 Gl 1 клсючпая а.нешя. клсючпая пролиферация
АКТ! Процесс метаболизма углеводов, процесс биосинтеза гликогена, процесс метаболизма глюкозы, путь сигналинга рецептора инсулина, активация про-апоптозных генных продуктов, апоптозные изменения митохондрий
ΑΝΡΕΡ протеолизиз, развитие многоклеточности, клеточная дифференциация
CCL2 хемотаксис, анти-апоптоз, JAK-STAT каскад, морфогенез органов, репликация вирусного генома
CXCL1 хемотаксис, воспалительная реакция, иммунный ответ, негативная регуляция клеточной пролиферации, организация и биогенез актинового цитоскелета
EDG1 позитивная регуляция клеточной пролиферации, трансмиссия нервного импульса, регуляция клеточной адгезии, дифференцировка нейронов, позитивная регуляция миграции клеток, позитивная регуляция Ras
EFNB2 клетка-клетка сигналинг, регулируется VEGFA.
EGF Активация активности МАРКК, позитивная регуляция митозов, ДНК репликация
ILIB Ответ на глюкокортикоидную стимуляцию, апоптозы, сигнальная трансдукция, клетка-клетка сигналинг, негативная регуляция клеточной пролиферации
IL8 Задержка клеточного цикла
KDR VEGF путь, регулируется АКТ.
NRP1 клеточная адгезия, сигнальная трансдукция, клетка-клетка сигналинг, клеточная пролиферация, регулируется VEGFA
РЕСАМ 1 Клеточная адгезия, регулируемая TNF.
PROK2 Активация МАРК, анти-апоптоз, клеточная пролиферация,
- 78 034552
регулирует АКТ,
SPHK1 анти-апоптоз, клеточная пролиферация, регулирует митозы, миграцию клеток.
STAB1 Воспалительная реакция, клеточная адгезия, рецепторопосредованный эндоцитоз, клетка-клетка сигналинг, негативная регуляция ангиогенеза, защитная реакция на бактерии
VEGFA анти-апоптоз, регулирует TNF, регулируется HIF1.
Пример 11. Связанные с апоптозом гены, идентифицированные как модулированные по уровням мРНК вследствие обработки клеток рака поджелудочной железы (РаСа2) 100 мкМ Q10.
Апоптозные анализы были применены для образцов, обработанных 100 мкМ Q10, в различное время после обработки. Эксперименты были проведены практически так же, как описано выше. Различные гены, которые, как было обнаружено, были модулированы обработкой Q10, приведены в табл. 25 ниже. Результаты показывают, что обработка Q10 модулировала следующие гены: ABL1, AKT1, Bcl2L1, BclAF1, CASP1, CASP2, CASP6, CIDEA, FADD, LTA, TNF, TNFSFIOA и TNFSF10.
Таблица 25
Список генов, связанных с апоптозами, экспрессия которых регулируется
100 мкМ Q10 и возможные функции которых в клетке положительно регулируются (серый) и отрицательно регулируются (белый)
1 еп <1>\ ι i κι ii 1Я i сна
CASPI 1 Ipo-aiioiiios. Pei y.inpyci II. 1B. pel y.iiipyeica I X1
CASPb llpo-aiionios. pely.inpyci PARP. \ICI.I. APP
1X1 K. ici он пая пролиферация. дифференцировка. ai ιοί позы, метоо.пнм ,ιιιιιιι.ιοΒ и коац ляция
1 XI SI Ίο 1 Ipo-aiioii ι о s. pely.inpyci каспаsi.i
ABL1 Регулирует Bcl2Ll, TP53, про-апоптоз, организация и биогенез актинового цитоскелета.
АКТ! Про-апоптоз, апоптозные изменения в митохондриях, транспорт углеводов, реакция на тепловой шок, метаболизм глюкозы, путь
IGF сигналинга.
BclAFl Про-апоптоз.
Bcl2Ll Анти-апоптоз, высвобождение цитохрома с из митохондрий, регулирует каспазы, связывается с BAD, ВАХ, BC12L11
CASP2 Анти-апоптоз.
CIDEA Про-апоптоз
FADD Про-апоптоз
LTA Про-апоптоз
TNFSFIOA Активатор каспаз
Пример 12. ПЦР диабетический анализ на клетках рака печени (HepG2).
HepG2 (рака печени) клетки были обработаны или раствором-носителем в течение 24 ч или 100 мкМ Q10 в течение различного времени. Обработка была проведена на 1 х 105 клеток на лунку, после чего следовала процедура, использованная для РаСа2 клеток (выше, примеры 9-11). Однако общее количество РНК, выделенной из этих образцов, было ниже ожидаемого. Обратная транскриптаза нормально работает при использовании 1 мкг общей РНК (определено подсчетом на 260 нм). Максимальный объем, который мог быть использован для обратной транкриптазы, составляет 8 мкл. Поскольку концентрация РНК была низкой, в RT-ПЦР анализах использовались образцы, обработанные раствором-носителем и Q10 в течение 16 и 48 ч с использованием 0,44 мкг РНК. Был проведен первичный анализ тенденций и паттернов в регуляции генов HepG2 обработкой 100 мкМ Q10, как представлено в табл. 26 ниже. Результаты показали, что каждый из генов PPARGC1A, PRKAA1 и SNAP25 показал отрицательную регуляцию на 16 ч после обработки (примерно в 20, 6 и 5 раз соответственно). На 48 ч после обработки PPARGC1A и PRKAA1 показали нормальное состояние или слабую положительную регуляцию, тогда как SNAP25 показал отрицательную регуляцию примерно в 2 раза.
- 79 034552
Таблица 26
Список генов, регулируемых в диабетическом анализе, где
HepG2 клетки обработаны 100 мкМ Q10
Ген Название гена Функция гена.
PPARGC1A Рецептор, активирующий пролиферацию пероксисом гамма, коактиватор 1 альфа Участвует в гибели клеток, пролиферации, клеточном дыхании и трансмембранном потенциале.
PRKAA1 протеинкиназа, АМРактивируемый, альфа 1 каталитическая субъединица Регулирует ТР53 и участвует в апоптозах, регулирует гликолиз, регулирует активность метаболитических ферментов.
SNAP25 С инаптосомальноассоциированный белок, 25кДа Играет роль в транспорте, встраивании, экзоцитозе и высвобождении молекул.
Пример 13. ПЦР ангиогенезный анализ на клетках рака печени (HepG2).
HepG2 (рака печени) клетки были обработаны или раствором-носителем в течение 24 ч или 100 мкМ Q10 в течение различного времени. Обработка была проведена на 1 х 105 клеток на лунку, после чего следовала процедура, использованная для РаСа2 клеток (выше, примеры 9-11). Однако общее количество РНК, выделенной из этих образцов, было ниже ожидаемого. Обратная транскриптаза нормально работает при использовании 1 мкг общей РНК (определено подсчетом на 260 нм). Максимальный объем, который мог быть использован для обратной транскриптазы, составляет 8 мкл. Поскольку концентрация РНК была низкой, в RT-ПЦР анализах использовались образцы, обработанные раствором-носителем и Q10 в течение 16 ч и 48 ч с использованием 0,44 мкг РНК. Был проведен первичный анализ тенденций и паттернов в регуляции генов HepG2 обработкой 100 мкМ Q10, как представлено в табл. 27 ниже. Результаты показали, что каждый из генов ANGPTL3, ANGPTL4, CXCL1, CXCL3, CXCL5, ENG, MMP2 и TIMP3 показал положительную регуляцию на 16 ч после обработки (примерно в 5.5, 3, 3, 3.2, 3, 3, 1 и 6.5, 6 и 5 раз соответственно). ID3 показал отрицательную регуляцию на 16 ч после обработки Q10, примерно в 5 раз по сравнению с контролем. На 48 ч после обработки ANGPTL3, CXCL1, CXCL3, ENG и TIMP3 еще показывали положительную регуляцию (примерно в 3.5, 1.5, 3.175, 2 и 3 раза соответственно по сравнению с контролем), тогда как ANGPTL4, CXCL5, ID3 и ММР2 показывали отрицательную регуляцию примерно в 1, 1, 2 и 18 раз соответственно по сравнению с контролем.
- 80 034552
Таблица 27
Список генов, регулируемых в ангиогенезном анализе, где HepG2 клетки обработаны 100 мкМ Q10
Ген Название гена Функция гена
ANGPTL3 ангиопоэтин-подобный 3 Преимущественно экспрессируется в печени, роль в клеточной миграции и адгезии, регулирует метаболизм жирных кислот и глицерина.
ANGPTL4 ангиопоэтин-подобный 4 Регулируется PPARG, ингибитор апоптозов в эндотелиоцитах сосудистой стенки, играет роль в метаболизме липидов и глюкозы и чувствительности к инсулину
CXCL1 хемокин (С-Х-С motif) лиганд 1 (меланомы роста стимуляция активности, альфа) Роль в клеточной пролиферации и миграции
CXCL3 хемокин (С-Х-С motif) лиганд 3 Активация хемокинов, активация звездчатых клеток печени, миграция, пролиферация.
CXCL5 хемокин (С-Х-С motif) лиганд 5 Продукция вместе с IL8 при стимуляции IL1 или TNFA. Играет роль в хемотаксисе, миграции, пролиферации.
ENG Эндоглин Связывание с TGFBR и участие в миграции, пролиферации, прикреплении и инвазивности
ID3 Ингибитор ДНК связывающегося 3, доминантного негативного Регулирует ММР2, регулируется TGFB1, витамином D3, ретиноевой кислотой, VEGFA, участвует в апоптозах,
helix-loop-helix белка пролиферации, дифференцировке, миграции.
ММР2 матрикса металлопептидаза 2 (желатиназа А, 72кДа желатиназа, 72кДа тип IV коллагеназа) Активация звездчатых клеток печени, HIFD сигналинг, связывание с TIMP3, участие в образовании опухолей, апоптозах, пролиферации, инвазионности, миграции и хемотаксисе.
TIMP3 TIMP металлопептидаз ингибитор 3 Регулирует ММР2, ICAM1. Регулируется TGFB, EGF, TNF, FGF и ТР53. Участвует в апоптозах, клеточной адгезии и злокачественном перерождении.
Белки, известные своим участием в процессе ангиогенеза, были компонентами RT-ПЦР анализа. Ангиогенез является критически важным процессом, благодаря которому раковые клетки становятся злокачественными. Некоторые из этих белков также вовлечены в диабет.
ANGPTL3 и ANGPTL4.
В литературе, имеющей отношение к ANGPTL3, этот белок связывается с регуляцией метаболизма липидов. В частности, из литературы (Li, С. Curr Opin Lipidol. 2006 Apr; 17(2): 152-6) известно, что и ангиопоэтины, и ангиопоэтин подобные белки имеют сходные структуры доменов. ANGPTL3 и 4 единственные два члена этого суперсемейства, которые ингибируют активность липопротеинлипаз. Однако ANGPTL3 и 4 по-разному регулируются на многих уровнях, что подтверждается тем, что in vivo их функции не избыточны. ANGPTL3 и 4 протеолетически превращаются в две половины и по-разному регулируются ядерными рецепторами. Трансгенная сверхэкспрессия ANGPTL4 так же, как нокаут
- 81 034552
ANGPTL3 или 4, демонстрирует, что эти два белка играют важную роль в метаболизме липопротеинов: образующийся в печени ANGPTL3 ингибирует липопротенилипазную активность преимущественно во время пищеварения, тогда как ANGPTL4 играет важную роль и во время пищеварения, и в промежутках между пищеварением. Кроме того, ANGPTL4 регулирует тканеспецифичную доставку липопротеинпроизводных жирных кислот. ANGPTL4 таким образом является эндокринным или аутокринным/паракринным ингибитором липопротеинлипаз, в зависимости от места экспрессии.
Липопротеинлипаза является ферментом, который гидролизует липиды в липопротеинах, таких как хиломикроны и липопротеины с очень низкой плотностью (VLDL), в три жирные кислоты и одну молекулу глицерина. Липопротеинлипазная активность в данных тканях является лимитирующей скорость стадией для усваивания триглицерид-производной жирной кислоты. Дисбаланс в разделении жирных кислот имеет значительные метаболические последствия. Показано, что высокожировые диеты приводят к тканеспецифичной сверхэкспрессии LPL, которая задействована в тканеспецифичной резистентности к инсулину и последующем развитии сахарного диабета типа 2.
Результаты этого примера показывают, что Q10 модулирует белки, участвующие в метаболизме липидов, что подтверждает важность дальнейших исследований ANGPTL3/ANGPTL4 и связанных с ними обменных путей. Например, ANGPTL3/ANGPTL4 играют определенную роль в следующих путях: Akt, холестерин, жирные кислоты, HDL-холестерин, HNF1A, ITGA5, ItGa5, ITGAV, ITG83, Lтрилодотинонин, LIPG, LPL, Марк, Nrth, NR1H3, PPARD, PTK2, RXRA, триацилглерол и 9-цисретиноевая кислота.
Пример 14. ПЦР анализ на клетках рака печени (HEPG2).
Апоптозные анализы были применены для образцов, обработанных 100 мкМ Q10 в течение 16 и 48 ч, как описано выше. Однако анализ для 48 ч был проведен с использованием в качестве фулорофора FAM, а не SYBR. И FAM, и SYBR флуоресцируют на одной длине волны.
Различные гены, которые, как было обнаружено, были модулированы обработкой Q10, приведены в табл. 28 ниже. Результаты показывают, что CASP9 показала положительную регуляцию на 16 ч после обработки Q10, примерно в 61 раз по сравнению с контролем, тогда как BAG1 и TNFRSF1A показали отрицательную регуляцию на 16 ч после обработки примерно в 6 и 4 раза соответственно по сравнению с контролем. На 48 ч после обработки CASP9, BAG1 и TNFRSF1A показали положительную регуляцию примерно в 55, 1 и 1 раза соответственно по сравнению с контролем.
Таблица 28
Список генов, регулируемых в апоптозном анализе, где HepG2 клетки обработаны 100 мкМ Q10
Ген Название гена Функция гена.
BAG1 В СТ2-ассоциированый атаноген Участвует в апоптозах
CASP9 каспаза 9, связанная с апоптозом цистеинпептидаза Апоптоз через высвобождение цитохрома с.
TNFRSF1A Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 1А Анти-апоптоз, связывает многие факторы гибели клеток, регулирует ICAM1
Пример 15. Определение способности МВМ или эпи-переключателя лечить онкологическое расстройство.
Способность выбранного МВМ или эпи-переключателя, например CoQ10, воздействовать на онкологическое расстройство, например меланому, оценивалась на мышиной модели. Меланомные опухоли вызываются у мышей инъекцией SK-MEL28 в подкожный слой. В исследование на животных входили как контрольная, так и лечебная группы, каждая состояла из четырех мышей. Мышам привили две опухоли. Местная формула МВМ или эпи-переключателя применялась к опухолям в лечебной группе ежедневно в течение 30 дней, после чего опухоли вырезали и определяли их массу. МВМ или эпипереключатель идентифицировался как эффективный в лечении опухоли, если разница средней массы лечебной группы и контроля была достоверной.
Пример 16. Идентификация МВМ, связанной с онкологическим расстройством.
Для того чтобы оценить перспективную молекулу (например, фактор влияния) как потенциальную МВМ, выбранная перспективная МВМ экзогенно добавлялась к нескольким клеточным линиям, включая как больные (раковые) линии клеток, так и линии нормальных контрольных клеток, и оценивались изменения, вызванные в профиле клеточного микроокружения для каждой клеточной линии.
Изменения в клеточной морфологии, физиологии и/или составе клеток, включая, например, мРНК и уровни белков, оценивались и сравнивались для больных клеток по сравнению с нормальными клетками.
Изменения в клеточной морфологии/физиологии оценивались по определению чувствительности и апоптозного ответа клеток к перспективной МВМ. Эти эксперименты проводились, как детально описа- 82 034552 но в примере 3. Вкратце, группа клеточных линий, содержавшая по крайней мере одну контрольную линию клеток и по крайней мере одну линию раковых клеток подвергалась воздействию различных концентраций перспективной МВМ. Чувствительность клеточных линий к потенциальной МВМ оценивалась по мониторингу клеточного выживания в разное время и в диапазоне применявшихся концентраций. Апоптозный ответ клеточных линий к потенциальной МВМ оценивался с использованием, например, Nexin реагента в комбинации с методом проточной цитометрии. Nexin реагент содержит комбинацию двух красителей, 7AAD и Annexin-V-PE, и позволяет оценить популяцию клеток на раннем и позднем апоптозах. Можно использовать дополнительный апоптозный анализ, который оценивает однонитевые ДНК, с использованием, например, APOSTRAND™ ELISA метода. Чувствительность и апоптозный ответ больных и контрольных клеточных линий оценивались и сравнивались. Молекула, которая демонстрирует различную цитотоксичность и/или по-разному вызывает апоптозный ответ в больных клетках по сравнению с нормальными клетками, идентифицировалась как МВМ.
Оценивались изменения в составе клеток после воздействия перспективной МВМ. Изменения в экспрессии генов на уровне мРНК анализировались с использованием метода ПЦР-анализа в режиме реального времени. Эти эксперименты проведены, как описано детально в примерах 6 и 9-13. Вкратце, перспективная МВМ экзогенно добавлялась к одной или более клеточным линиям, включая, например, линию больных клеток и линию нормальных контрольных клеток, и мРНК выделялась из клеток через различное время после воздействия. Уровень mPHKs для генов, участвующих в специфичных путях, оценивался с использованием целевых анализов, включая, например, анализы, специфичные для апоптозов, окислительного стресса и антиоксидантной защиты, ангиогенеза, теплового шока или диабета. Г ены, у которых транскрипция их мРНК менялась в два раза или больше, идентифицировались и оценивались. Молекула, которая вызывает изменения в уровнях мРНК в клетках и/или вызывает различные изменения в уровне одной или более мРНК в больных клетках по сравнению с нормальными клетками, идентифицировалась как МВМ.
В дополнительных экспериментах, изменения в экспрессии генов по уровню белка анализировались с использованием метода антител на микрочипах, 2-мерного гель электрофореза, за которым следовала идентификация белка с использованием масс-спектрометрии, и иммуноблоттинга. Эти эксперименты проведены, как описано в примерах 7, 4 и 8 соответственно. Вкратце, перспективная МВМ экзогенно добавлялась к одной или более клеточным линиям, включая, например, линию больных клеток и линию нормальных контрольных клеток, и растворенный белок экстрагировался из клеток в различное время, например на 6 или 24 ч после обработки. Изменения, вызванные в уровнях белков перспективной МВМ, оценивались с использованием микрочипов с антителами, содержащих антитела к около 700 белкам, широкому диапазону типов белков и потенциальным маркерам обменных путей. Дальнейший дополнительный протеомический анализ мог быть проведен с использованием мерного (2-D) гель-электрофореза в совокупности с методом масс-спектрометрии. Перспективная МВМ экзогенно добавлялась к одной или более клеточным линиям, включая, например, линию больных клеток и линию нормальных контрольных клеток, и клеточный осадок лизировался и подвергался 2-D гель-электрофорезу. Гели анализировались для идентификации изменений в уровнях белков в обработанных образцах по сравнению с контрольными, необработанными образцами. Гели анализировались для идентификации изменений на временных точках, для того чтобы определить возросшие уровни, снизившиеся уровни или посттрансляционную модификацию. Точки, показавшие статистически достоверные изменения, извлекались и подвергались белковой идентификации расщеплением пепсином и характеризации масс-спектрометрией. Проводился поиск охарактеризованных пептидов в белковой базе данных, например, с программными анализами Mascot и MSRAT для идентификации белков. В дополнение к вышеупомянутым 2-D гель анализам и экспериментам с антителами на микрочипах, потенциальные изменения в уровнях специфических белков, вызванные перспективной МВМ, могли быть оценены путем иммуноблоттинга. Во всех протеомических экспериментах белки с возросшими или снизившимися уровнями в различных клеточных линиях идентифицировались и оценивались. Молекула, которая вызывает изменения в уровнях белков в клетках и/или вызывает различные изменения в уровне одного или более белков в больных клетках по сравнению с нормальными клетками, идентифицируется как МВМ.
Гены, относительно которых было обнаружено, что они модулируются воздействием перспективной МВМ из вышеупомянутых экспериментов, становились объектами клеточных и биохимических путей анализов и в соответствии с ними могли быть разделены на несколько клеточных путей метаболизма, включая апоптозы, биологию рака и рост клеток, гликолиз и метаболизм, молекулярный транспорт и клеточный сигналинг.
Проводились эксперименты для подтверждения вхождения перспективной МВМ в клетки, для определения того, локализовалась ли перспективная МВМ внутри клетки, и для определения уровня и формы перспективной МВМ, присутствующей в клетке. Эксперименты проводились, например, как описано детально в примере 5. Например, для определения уровня и формы перспективной МВМ, присутствующей в митохондриях, получались и анализировались богатые митохондриями препараты из клеток, обработанных перспективной МВМ. Тем самым можно подтвердить, что уровень перспективной МВМ, присутствующей в митохондриях, возрастает время- и дозозависимым образом при добавлении экзоген
- 83 034552 ной перспективной МВМ. Кроме того, изменения уровней белков из богатых митохонриями образцов анализировались с использованием 2-D гель-электрофореза, и белок идентифицировался с помощью масс-спектроскопии, как описывалось выше для белковых образцов из целых клеток. Перспективные МВМ, для которых обнаружено, что они проникают в клетку и присутствуют в повышенной концентрации, например, в митохондриях, идентифицировались как МВМ. Уровни перспективной МВМ в клетках или, например, специфически в митохондриях, определявшиеся на разных временных точках, могут коррелировать с другими наблюдаемыми клеточными изменениями, что подтверждается, например, модуляцией мРНК и уровней белка для определенных белков.
Перспективные МВМ, для которых было установлено, что они вызывают изменения в составе клеток, например вызывают изменения экспрессии генов на уровне мРНК или белков, идентифицируются как МВМ. Перспективные МВМ для которых было установлено, что они вызывают разные изменения в морфологии, физиологии или составе клеток (например, разные изменения экспрессии генов на уровне мРНК или белков), в болезненном состоянии (например, раковых) по сравнению с нормальными (например, нераковыми) клетками идентифицируются как МВМ и в особенности как имеющие многоаспектный характер. Перспективные МВМ, относительно которых было обнаружено, что они способны проникать в клетки, идентифицировались как МВМ и в особенности как имеющие многоаспектный характер, поскольку тем самым перспективные МВМ демонстрировали в добавление к терапевтическому действию также и действие молекулы-переносчика.
Пример 17. Идентификация CoQ10 как эпи-переключателя, связанного с онкологическим расстройством.
Группа линий клеток кожи, включающая контрольные клеточные линии (в первую очередь культуру кератиноцитов и меланоцитов) и несколько линий раковых клеток кожи (SK-MEL-28, неместастазирующая меланома кожи; SK-MEL-2, метастазирующая меланома кожи; илиг SCC, плоскоклеточная карцинома; РаСа2, клеточная линия рака поджелудочной железы; или HEP-G2, клеточная линия рака печени) были подвергнуты воздействию различных концентраций коэнзима Q10. Линии раковых клеток показали дозозависимый ответ, отличавшийся по сравнению с контрольными линиями клеток, где индукция апоптозов и клеточная гибель имели место только в раковых клетках. Примеры экспериментов описаны детально, например, в примере 3.
Были проведены анализы для оценки изменений в мРНК и уровнях белка после воздействия CoQ10 в ранее идентифицированных клетках. Изменения экспрессии мРНК анализировались с использованием ПЦР в режиме реального времени на микрочипах, специфичных для апоптозов, оксислительного стресса и аксидантов, ангиогенеза и диабета. Изменения экспрессии белка анализировались с использованием анализа антител на микрочипах и иммуноблоттинга. Результаты этих анализов демонстрировали, в клеточных линиях в результате добавления коэнзима Q10 наблюдались значительные изменения экспрессии генов, на уровне как мРНК, так и белков. В результате обработки CoQ10 наблюдалась модуляция многочисленных генов, про которые было известно, что они связаны с процессами клеточного метаболизма или участвуют в них. Например, было обнаружено, что экспрессия белка ядерного рецептора HNF4A модулируется в клетках после обработки Q10. Экспрессия трансальдолазы 1 (TAL) также модулировалась в клетках, обработанных Q10. TAL балансирует уровни НАДФН и промежуточных продуктов реактивного кислорода, тем самым регулируя трансмембранный потенциал митохондрий, который критически важен для синтеза АТФ и выживания клеток. Имеющие особое значение для онкологических заболеваний, многие гены, известные как связанные, например, с апоптозами, биологией рака и ростом клеток, были идентифицированы как регулируемые Q10. Примеры экспериментов описаны здесь детально, например, в примерах 4, 6-9.
Q10 является необходимым кофактором для возбуждения процессов фосфорилирования в митохондриях для вырабатывания энергии. Уровень коэнзима Q10, а также формы CoQ10, присутствующей в митохондриях, был определен путем анализа богатых митохондриями препаратов из клеток, обработанных CoQ10. Подтвердилось, что уровень коэнзима Q10, присутствующего в митохондриях, возрастает время- и дозозависимым образом при добавлении экзогенного Q10. Время обработки коррелировало с множеством клеточных изменений, наблюдаемых в модуляции уровней мРНК и белков для определенных белков, связанных с путями метаболизма и апоптоза. Примеры экспериментов описаны здесь детально, например, в примере 5.
Результаты, описанные здесь, идентифицируют эндогенную молекулу CoQ10 как эпипереключатель. В особенности результаты идентифицируют CoQ10 как вызывающую переключение в метаболическом статусе и частичное восстановление функций митохондрий в клетках. Эти заключения основываются на следующей интерпретации данных, описанных здесь, и существующих на настоящее время представлений в соответствующей области.
Известно, что Q10 синтезируется, активно транспортируется, накапливается и используется во внутренней мембране митохондрий. Известно также, что Q10 - необходимый кофактор в процессах окислительного фосфорилирования в митохондриях, вырабатывающих энергию. Однако в большинстве раковых клеток энергия вырабатывается преимущественно в процессе гликолиза, следующего за ферментацией молочной кислоты в цитоплазме, а не после окисления пирувата в митохондриях, как у боль
- 84 034552 шинства нормальных клеток. Окислительное фосфорилирование включает транспорт электронов комплексами и цитохромом с. Апоптозы включают разрушение митохондрий, когда про-апоптозные факторы вызывают повышенную проницаемость внутренней мембраны митохондрий. Используя различные метаболические пути энергетического синтеза, раковые клетки способны ослаблять нормальную апоптозную реакцию на дефекты в клетке. Не имея намерения ограничиваться теорией, Заявители делают предположение, что Q10 функционирует, положительно регулируя белки пути окислительного фосфорилировани, таким образом возвращая митохондриальную функцию назад к состоянию, при котором распознаются онкогенетические дефекты и запускается апоптоз. Таким образом, Q10 действует как эпипереключатель, переключающий метаболический статус клетки.
Пример 18. Идентификация эпи-переключателя, связанного с онкологическим заболеванием.
Группа линий клеток кожи, включающая контрольные клеточные линии (в первую очередь культуру кератиноцитов и меланоцитов) и несколько линий раковых клеток кожи (SK-MEL-28, неместастазирующая меланома кожи; SK-MEL-2, метастазирующая меланома кожи; или SCC, плоскоклеточная карцинома; РаСа2, клеточная линия рака поджелудочной железы; или HEP-G2, клеточная линия рака печени) были подвергнуты воздействию различных концентраций перспективного эпи-переключателя. Изменения в клеточной морфологии/физиологии были оценены при исследовании чувствительности и апоптозного ответа клеток к перспективному эпи-переключателю. Эти эксперименты были проведены, как детально описано в примере 3. Вкратце, чувствительность клеточных линий к перспективному эпипереключателю оценивалась путем мониторинга выживания клеток на различных временных точках и в диапазоне применяемых концентраций. Апоптозный ответ клеточных линий к перспективному эпипереключателю оценивался с использованием, например, Nexin реагента в комбинации с методом проточной цитометрии. Nexin реагент содержит комбинацию двух красителей, 7AAD и Annexin-V-PE, и позволяет количественно определить популяцию клеток на ранних и поздних апоптозах. Дополнительное апоптозное исследование, в котором оцениваются однонитевые ДНК, может использовать, например, метод ApostrandTM ELISA. Чувствительность и апоптозный ответ больных и контрольных клеточных линий оценивались и сравнивались. Перспективные эпи-переключатели оценивались на основе их способности предпочтительно или выборочно ингибировать клеточный рост в раковых клетках по сравнению с нормальными или контрольными клетками. Перспективные эпи-переключатели в дальнейшем оценивались на основе их способности предпочтительно или выборочно вызывать апоптозы в раковых клетках по сравнению с нормальными или контрольными клетками.
Были проведены анализы для оценки изменений в уровнях мРНК и белков ранее идентифицированных клеток после обработки перспективным эпи-переключателем. Изменения уровней мРНК анализировались с использованием ПЦР в режиме реального времени на микрочипах. Эти эксперименты были проведены, как описано детально в примерах 6 и 9-13. Вкратце, мРНК выделялась из клеток через различное время после воздействия. Уровни мРНК для генов, участвующих в специфичных путях, оценивались с использованием целевых анализов, включая, например, анализы, специфичные для апоптозов, окислительного стресса и антиоксидантной защиты, ангиогенеза, теплового шока или диабета. Гены, у которых транскрипция их мРНК менялась в два раза или больше, идентифицировались и оценивались.
Микрочип для антител (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma) был использован для скринингового исследования с помощью 700 белковых антител для оценки изменений в уровнях концентрации белков в обработанных Q10 клетках (SK-MEL-28, SCC). Экспрессия белка в клеточном экстракте устанавливалась, когда белок связывался с соответствующим антителом, помещенным на пластинку. Перед связыванием белки прямо метились флюоресцентным красителем, который потом использовался для флюоресцентной визуализации и количественного анализа. Исследование использовалось для сравнения белковых профилей экспрессии в двух образцах (исследуемый и референсный образцы), каждый метился различным Су красителем (Су3 или Су5) и два образца использовались совместно в равных белковых концентрациях в исследовании. Интенсивность флюоресцентного сигнала для каждого образца затем записывалась отдельно на длине волны, соответствующей красящей метке образца, и сравнивалась.
Изменения в экспрессии белков анализируются с использованием анализов антител на микрочипах, 2-D гель-электрофорез анализов в совокупности с масс-спектроскопией, и анализов иммуноблоттингом. Эти эксперименты проводились, как детально описано в примерах 7, 4 и 8 соответственно. Вкратце, растворимый белок выделялся из клеток на различных временных точках, например 6 или 24 ч, после чего обрабатывался перспективным эпи-переключателем. Изменения, вызванные в уровнях белков перспективным эпи-переключателем, оценивались с использованием микрочипа на антителах, содержащего антитела к примерно 700 белкам, широкому диапазону типов белков и потенциальным маркерам обменных путей. Дальнейшие дополнительные протеомичские анализы можно провести с использованием 2мерного (2-D) гель-электрофореза в совокупности с методом масс-спектроскопии. Перспективный эпипереключатель экзогенно добавлялся к клеточным линиям и клеточный осадок лизировался и подвергался 2-D гель-электрофорезу. Гели анализировались для идентификации изменений в уровнях белков в обработанных образцах по сравнению с контрольными, необработанными образцами. Гели анализировались для идентификации изменений на разных временных точках обработки, для определения возросших уровней, снизившихся уровней или посттрансляционной модификации. Точки, показавшие статистиче
- 85 034552 ски достоверные изменения, извлекались и подвергались белковой идентификации путем трипсинового расщепления и масс-спектроскопии. Охарактеризованные пептиды искались в белковой базе данных, например, с программами Mascot и MSRAT для идентификации белков. В добавление к предшествовавшим 2-D гель-анализам и экспериментам с антителами на микрочипах, потенциальные изменения уровней специфических белков, вызванные возможной МВМ, могли быть оценены иммуноблоттингом. Во всех протеомических экспериментах белки с возросшими или снизившимися уровнями в различных клеточных линиях идентифицировались и оценивались.
Возможные эпи-переключатели оценивались на основе изменений, вызванных в экспрессии генов, в уровнях мРНК и/или белков, в клеточных линиях в следствие добавления возможного эпипереключателя. В особенности по связи с онкологическими заболеваниями возможные эпипереключатели оценивались на основе их способности модулировать гены, известные своей связью или включенностью в клеточные метаболические процессы.
Уровень возможного эпи-переключателя, также как форма возможного эпи-переключателя, присутствующая в клетке или в определенной клеточной локации определялась с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области. Например, уровень возможного эпи-переключателя в митохондриях в зависимости от времени и дозы определялся путем анализа богатых митохондриями препаратов из клеток, обработанных возможным эпи-переключателем. Уровни возможного эпипереключателя в митохондриях на разных временных точках можно было сравнить и определить их корреляцию с другими наблюдаемыми клеточными изменениями, такими как модуляция уровней мРНК и белков для специфичных белков, связанных с метаболизмом и путями апоптоза.
Перспективные эпи-переключатели, которые, как наблюдалось, вызывали переключение метаболического статуса в клетке на основании результатов, наблюдаемых в предыдущих экспериментах, идентифицируются как эпи-переключатели. Например, перспективный эпи-переключатель, который проявлял цитотоксичность и/или индуцировал апоптозы в клетках, идентифицировался как эпи-переключатель. Предпочтительно перспективный эпи-переключатель, который проявлял различную цитотоксичность и/или по-разному вызывал апоптозную реакцию в больных (раковых) клетках по сравнению с нормальными клетками (например, эпи-переключатель, который по-разному модулирует экспрессию белков, участвующих в апоптозах в раковых клетках по сравнению с нормальными клетками), идентифицировался как эпи-переключатель.
Пример 19. Идентификация витамина D3 как эпи-переключателя.
Витамин D3, или 1α, 25-дигидроксивитамин D3 (также известный как кальцитриол) является метаболитом витамина D, который синтезируется из витамина в двухэтапном энзимном процессе. Витамин D3 взаимодействует со своим повсеместным ядерным рецептором витамина D (VDR), регулируя транскрипцию широкого спектра генов, участвующих в кальциевом и фосфатном гомеостазе, а также в делении и дифференцировке клеток. Сообщалось, что витамин D3 обладает антираковым действием во многочисленных модельных системах, включая плоскоклеточную карциному, аденокарциному простаты, рак яичников, молочной железы и легких (обзор Deeb et al. 2007 Nature Reviews Cancer 7:684-700).
Сообщалось, что антираковые эффекты витамина D3 участвуют во многих механизмах, включая остановку роста на G1 фазе клеточного цикла, апоптозы, дифференцировку опухолевых клеток, разрушение посредников фактора роста - сигналов выживания клеток, и ингибирование ангиогенезов и клеточной адгезии (обзор Deeb et al. 2007 Nature Reviews Cancer 7:684-700). Например, сообщалось, уделяя особенное внимание апоптозам, что витамин D3 вызывает апоптозы, регулируя ключевые медиаторы апоптозов, такие как подавление экспрессии анти-апоптозов, белки пред-выживания BCL2 и BCL-XL, или вызывая экспрессию про-апоптозных белков (например, ВАХ, BAK и BAD) (Deeb et al. 2007). В другом примере сообщалось, уделяя особенное внимание ангиогенезу, что витамин D3 ингибирует пролиферацию некоторых эндотелиальных клеток, имеющих опухолевое происхождение, и ингбирует экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), который вызывает ангиогенез в опухолях (обзор Masuda и Jones, 2006 Mol. Cancer Ther. 5(4): 797-8070). В другом примере сообщалось, уделяя особенное внимание остановке клеточного цикла, что витамин D3 вызывает транскрипцию гена циклин-зависимой киназы ингибитора p21WAFI/CIPI и вызывает синтез и/или стабилизацию циклин-зависимой киназы ингибитора р27KIPI белка, которые чрезвычайно важны для индукции остановки G1 (Deeb et al. 2007).
На основе предыдущих наблюдений витамин D3 идентифицировался как эпи-переключатель, т.е. обладающий способностью переключать метаболический статус клетки. Витамин D3 является эпипереключателем благодаря своей способности вызывать апоптозы в клетках и в особенности на основании его способности по-разному подавлять клеточный рост и вызывать апоптозную реакцию в больных (раковых) клетках по сравнению с нормальными клетками (например, по-разному модулировать экспрессию белков, таких как BCL-2, BCL-XL, и ВАХ, включенных в апоптозы, в раковых клетках по сравнению с нормальными).
Пример 20. Сравнительная чувствительность онкогенных и нормальных клеток к коэнзиму Q10.
Определялось и сравнивалось действие обработки коэнзимом Q10 на различные линии онкогенных и нормальных клеток. Чувствительность клеток к коэнзиму Q10 оценивалась путем мониторинга индукции апоптозов. CoQ10 обработка клеток проводилась, как описано детально ниже в разделе материалы и
- 86 034552 способы. Индукция апоптозов в обработанных клетках оценивалась путем мониторинга индикаторов ранних апоптозов (например, Bcl-2 экспрессия, активация каспаз и путем использования анализа по аннексину V), как описано ниже. В этих исследованиях была определена минимальная дозировка CoQ10, например концентрация CoQ10, и время обработки, требуемые для вызова апоптозов в ряде клеточных линий.
Неожиданным результатом было то, что данные показали, что эффективность обработки коэнзимом Q10 была выше в клеточных типах, которые демонстрируют повышенный онкогенетический и/или высокий метастатический потенциал, т.е. клеточные типы, которые образовались из более агрессивных раков или опухолей. Результаты этих исследований представлены ниже в табл. 29. Данные показывают, что CoQ10 более эффективен время- и дозозависимым образом в клетках, которые имеют более агрессивный раковый статус. Более того, в нормальных клетках наблюдался неожиданный отличный от раковых клеток эффект. Именно коэнзим Q10 неожиданно обнаружил слабую поддерживающую роль в нормальной клеточной среде, где у нормальных клеток наблюдалась повышенная пролиферация и миграция, включая кератиноциты и дермальные фибробласты.
Действие коэнзима Q10 на регуляцию генов и белковые механизмы отличается у раковых и нормальных клеток. Ключевые клеточные механизмы и компоненты, такие как мембранная проницаемость, транспортные механизмы, иммуномодуляция, ангиогенез, контроль клеточного цикла, геномная стабильность, окислительный контроль, гликолитический поток, метаболитический контроль и интеграция экстраклеточных матричных белков, дисрегулируются и таким образом генетическая и молекулярная карта клетки изменяется. Болезненная среда поддерживает управление клеточными контролирующими процессами. Данные, приведенные здесь, подтверждают, что CoQ10 запускает больший уровень эффективности (например, в раковых клетках по сравнению с нормальными клетками, и в клетках с более агрессивным раковым статусом по сравнению с клетками менее агрессивного или неагрессивного ракового статуса), нормализуя некоторые ключевые вышеупомянутые процессы способом, который позволяет восстановить апоптозный потенциал.
Таблица 29
Минимальные концентрации и время обработки CoQ10, требующиеся для индукции ранних апоптозов в различных клеточных типах
Тканевое происхождение (Тип клеток) Индикация ранних апоптозов (Вс1-2, аннексии V, или активатор каспаз) Концентраци я (мкМ) Время (ч) Уровень агрессивности 1 = нормальная ткань 2 = злокачествен ная 3 = метастазирую щая
КОЖА:
Кератиноциты (Нека, Некп) Нет Н/Д Н/Д 1
Фибробласты (nFib) Нет Н/Д Н/Д 1
Меланоциты (Нета, LP) Нет Н/Д Н/Д 1
Меланома Сильная 20 24 2
- 87 034552
(Skmel 28)
Меланома (Skmel 2) Очень сильная 25 24 3
see, Плоскоклеточн ая карцинома Очень сильная 25 24
МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА:
MCF-7 Сильная 50 48 2
SkBr-3 Очень сильная 50 24 3
ВТ-20 Сильная 100 48 2
ZR-75 Слабая 200 72 2
MDAMB468 Сильная 100 48 2
Маммарные фибробласты: 184А1 и 184В5) (Lawrence Berkeley) Нет н/д 1
ПРОСТАТА:
РСЗ Очень сильная 25 24 3
ПЕЧЕНЬ:
HepG2 Очень сильная 50 24 3
НерЗВ Очень сильная 50 24 3
КОСТИ:
Остеосаркома (143Ь) Очень сильная 50 48 2
Саркома Юинга (NCI) Исключительно сильная 5 1
ПОДЖЕЛУДО ЧНАЯ ЖЕЛЕЗА:
РаСа2 Очень сильная 25 24
Сердце:
Гладкие мускулы аорты (HASMC) Нет н/д н/д 1
Материалы и способы.
Подготовка и обработка клеток.
Подготовка клеток в чашках или колбах.
Клетки культивировались в Т-75 колбах в соответствующей среде с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 1% PSA (пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В) (Invitrogen и Cellgro) в 37°С инкубаторе с 5% CO2 до достижения 70-80% заселенности. Для сбора клеток для обработки в колбы добавили 1 мл трипсина, аспирировали, добавили дополнительные 3 мл трипсина и инкубировали при 37°С 3-5 мин. Клетки затем нейтрализовали равным объемом среды и получившийся раствор центрифу
- 88 034552 гировали на 10000 об/мин в течение 8 мин. Супернатант аспирировался, и клетки были ресуспендированы в 8,5 мл среды. Смесь 500 мкл ресуспензии и 9,5 мл изопропанола были приготовлены, и было определено соответствующее число клеток, посаженных в каждую чашку. Опыты с контрольными группами и группами с концентрациями в диапазоне 0-200 мкМ были поставлены трижды. Из 500 мкМ CoQ-10 исходного раствора была осуществлена серия растворений для достижения экспериментальной концентрации в соответствующих чашках. Чашки инкубировались в 37°С инкубаторе с 5% CO2 в течение 0-72 ч в зависимости от типа клеток и протокола экспериментов.
Выделение белка и количественный подсчет.
Подготовка клеток в чашках.
Следующий за обработкой клеток период инкубации был завершен, было осуществлено выделение белка. Чашки всех обработанных групп были промыты дважды 2 мл , и однажды 1 мл ледяного 1х фосфатного буферного солевого раствора (PBS). PBS был аспирирован из чашек только после 2-х промывок. Клетки были аккуратно собраны в микроцентрифужные пробирки с использованием конечного объема третьей промывки и центрифугированы на 10000 об/мин в течение 10 мин. После центрифугирования супернатант был собан и осадок был лизирован 50 мкл лизирующего буфера (1 мкл протеазы и ингибитора фосфатазы на каждые 100 мкл лизирующего буфера). Пробы затем были заморожены на ночь при -20°С.
Подготовка клеток в колбах.
Следующий за обработкой клеток период инкубации был завершен, было осуществлено выделение белка. Колбы всех обработанных групп были промыты дважды 5 мл и однажды 3 мл ледяного 1х фосфатного буферного солевого раствора (PBS). PBS был аспирирован из чашек только после 2-х промывок. Клетки были аккуратно собраны в 15 мл микроцентрифужные пробирки с использованием конечного объема третьей промывки и центрифугированы на 10000 об/мин в течение 10 мин. После центрифугирования супернатант был собран и осадок был лизирован в соответствующем количестве лизирующего буфера (1 мкл протеазы и ингибитора фосфатазы на каждые 100 мкл лизирующего буфера). Объем лизирующего буфера зависел от количества осадка. Пробы были перенесены в микроцентрифужные пробирки и заморожены на ночь при -20°С.
Количественный подсчет белка.
Пробы были разморожены при -4°С и обработаны ультразвуком для того, чтобы обеспечить гомогенизацию на следующий день после выделения белка. Количественная оценка белков была проведена с использованием микроВСА набора для белкового анализа (Pierce). Для приготовления проб для иммуноблоттинга был приготовлен 1:19 раствор бетамеркаптоэтанола (Sigma) для буфера (Bio-Rad). Пробы были разведены 1:1 с буферным раствором бетамеркаптоэтанола, нагреты при 95°С в течение 5 мин и заморожены на ночь при -20°С.
Иммуноблоттинг.
Bcl-2, каспаза, 9, Цитохром с.
Объем проб для добавления был определен с использованием приближенной средней концентрации белка, наблюдаемой по ВСА белковому анализу. Приблизительно 30-60 мкг белка было добавлено на каждую временную точку обработки. Белки были разделены с трехкратным повтором в 12% Tris-HCl готовом геле (Bio-Rad) или вручную сделанном геле в1х буфере при 85 и 100 В. Белки затем переносились на микроцеллюлозную бумагу на 1 ч при 100 В и блокировались еще на 1 ч в 5% растворе сыворотки. Мембраны были помещены в первичные антитела (1 мкл Ат:1000 мкл TBST) (Cell Signaling) на ночь при -4°С. На следующий день мембраны промывались три раза в течение 10 мин Tris-буферным солевым Tween-20 (TBST), и вторичные антитела (антикроличьи; 1 мкл Ат:1000 мкл TBST) были добавлены на 1 ч при -4°С. Мембраны снова были промыты трижды в течение 10 мин TBST и была сделана хемолюминисценция с использованием Pico или Femto субстрата (Pierce). Мембраны затем были обработаны во временных интервалах, которые давали лучшие визуальные результаты. После обработки мембраны хранились в TBST при -4°С до подсчета уровней актина.
Актин
Мембраны были помещены в первичные антитела к актину (1 мкл Ат:5000 мкл TBST) (клеточный сигналинг) на 1 ч при -4°С, промыты трижды по 10 мин TBST, и вторичные антитела (мышиные; 1 мкл Ат:1000 мкл TBST) были добавлены на 1 ч при -4°С. Мембраны снова были промыты трижды в течение 10 мин TBST и была сделана хемолюминисценция с использованием Pico субстрата (Pierce). Мембраны затем были обработаны во временных интервалах, которые давали лучшие визуальные результаты.
Аннексин V анализ.
Клетки промывались дважды в PBS10X и ресуспендировались в связывающем буфере (0,1 М HEPES, рН 7,4; 1,4 М NaCl; 25 мМ CaCl2). Пробы по 100 мкл были добавлены к культуральной пробирке с 5 мкл аннексин-ПЭ красителем или 7-ADD. Клетки были смешаны и инкубировались без света при комнатной температуре в течение 15 мин. После этого 400 мкл 1X связывающего буфера было добавлено к каждой пробе и их подвергли анализу путем проточной цитометрии.
Примеры 21-25, приведенные здесь, взяты из международной заявки WO 2008/116135. Полное со- 89 034552 держание заявки включено сюда путем ссылки. Ради соблюдения последовательности номера этих примеров не меняются, но номера этих таблиц не связаны с таблицами, приведенными формуле изобретения.
Пример 21. Способ приготовления CoQ10 22% концентрата, который включает пентиленгликоль.
Концентрат был приготовлен с CoQ10 как липофильным биоактивным агентом. Около 10 кг полисорбата 80 было помещено в вакуумный выпарной аппарат и нагрето до температуры от около 50 до около 65°С. Около 8,8 кг CoQ10 было добавлено к полисорбату 80 и для поддержания температуры от около 50 до около 65°С был применен вакуум, и содержимое смешивалось около 15 мин. Получившийся в результате материал может называться здесь CoQ10 фазой или первой фазой. CoQ10 был растворен в полисорбате 80 в герметичном выпарном аппарате, при вакууме и температуре смеси полисорбата/CoQ10 от около 50 до около 55°C.
В отдельном аппарате около 15,8 кг воды было нагрето до температуры от около 50 до около 55°C и около 0,2 кг феноксиэтанола и около 2 кг пентиленгликоля HYDROLITE 5®, USP были добавлены к воде и смешаны до достижения прозрачности и однородности. Затем было добавлено около 8 кг Фосфолипона® 85G перед диспергированием. Получившийся в результате материал может называться здесь водяной фазой или второй фазой. Водяная фаза достигла однородной дисперсии и гидратации лецитина фосфолипон-типа и была добавлена к CoQ10/жидкому полисорбату, как описано ниже, при температуре от около 50 до около 55°C.
Гомогинезатор Сильверсона, подобный tL4RT модели Сильверсона, применяемой для лабораторных партий, был использован для соединения двух фаз, описанных выше (т.е. CoQ10 фазы и водяной фазы). Применялся гомогенизатор с использованием стандартного эмульсионного экрана и смешивания на полной мощности (от около 7000 до около 10000 об/мин) около 5 мин при закрытой рециркуляционной цепи и под вакуумом (от около 18 до около 20 мм Hg) при температурах от около 50 до около 55°C с работающей мешалкой, пока растворенный CoQ10 не был полностью инкапсулирован и достиг однородной дисперсии, тем самым создав густую, однородную липосомную дисперсию. Получившийся в результате CoQ10 концентрат содержал CoQ10 в концентрации около 22 вес.%. Концентрация Фосфолипона® 85G составляла около 8 вес.% от общего веса композиции, то есть в комбинации с двумя фазами, описанными выше.
В отдельных экспериментах был произведен 1 кг лабораторной партии 22% CoQ10 концентрата, описанного выше, и во время гомогенизации брались образцы с 5-минутными интервалами. Размер частиц липосом образцов, взятых в разное время, определялся с использованием лазерного дифракционного оборудования (Malvern 2000) в соответствии с предписаниями производителя. Детали процесса гомогенизации и размеры частиц, наблюдаемые во время гомогенизации, представлены ниже в табл. 1.
Таблица 1
Время процесса (минуты) Скорость головки гомогенизатора Сильверсона L4RT Диаметр частиц (нм) Интенсивность Приблизительная температура, С
частиц, <300нм %,
5 7000 108 84,9 55
10 7000 162 57,8 65
15 7000 112 85,4 55
20 7000 149 67,0 62
30 7000 120 83,0 55
45 7000 107 85,0 55
Как можно видеть из табл. 1, с формулой концентрата CoQ10 и процессом, описанными выше, возможно производить липосомы со средним диаметром 107 нм и распределением частиц, при котором 85% от всех липосом производилось с размером от около 59 до около 279 нм. За короткое время процесса (около 5 мин) производится липосомная дисперсия CoQ10 точно так же эффективно, как за долгое время процесса (около 45 мин). Как можно также видеть из вышесказанного, оптимальные липосомные частицы наблюдаются, когда CoQ10 не подвергается температурам выше около 55°С.
Пример 22. Способ приготовления А 2% дисперсии карбомера.
Дисперсия кросс-связанного полимера акриловой кислоты была приготовлена для использования как вязкий агент в составе крема. Используемая акриловая кислота, карбомер 940, была приготовлена с 2% дисперсией со следующими компонентами, перечисленными ниже в табл. 2.
- 90 034552
Таблица 2
Фаза Торговая марка Название по CTFA процент Количество (кг)
1 феноксиэтанол 0,500 0,0750
1 Г идролит-5 5,000 0,7500
2 Очищенная вода 92,500 13,8750
3 ACRITAMER 940 CARBOMER 940 2,000 0,3000
Всего 100,000 15,0000
Процесс производства проходил следующим образом. Оборудование было вымыто и продезинфицировано. На лабораторном столе ингредиенты фазы 1 были смешаны до достижения прозрачности и однородности. Требуемое количество воды (фаза 2) было взвешено и добавлено к фазе в выпарном аппарате гомогенизатора, описанного выше в примере 1. Вода была нагрета в цилиндре с паровой рубашкой до температуры от около 60 до около 65°C. Фаза 1 затем была добавлена к водной фазе 2 при средней скорости перемешивания до достижения прозрачности и однородности. Контейнер фазы 1 был промыт технологической водой и температура поддерживалась от около 60 до около 65°C. Мешалка затем была запущена на большой скорости, и был добавлен порошок карбомер 940 (фаза 3).
Температура поддерживалась от около 60 до около 65°C и смешивание продолжалось на средней скорости от около 500 до около 800 об/мин, пока весь порошок карбомера 940 не был добавлен. Порошок карбомер медленно добавлялся в воронку смеси фаз 1 и 2. Порошок вручную медленно сыпался так, чтобы полное количество карбомера было добавлено не менее чем за 10 мин.
Смешивание продолжалось при средней скорости мешалок, пока весь порошок не был полностью дисперсирован и не присутствовало рыбьих глаз. Процесс производства шел так, что весь не нейтрализованный порошок карбомера 940 был полностью дисперсирован для достижения ровной полупрозрачной дисперсии или полностью гидратированного полимера карбомера. Перемешивание партии было достаточно высоким для того чтобы создать видимую воронку, но не настолько высоким, чтобы вызывать разбрызгивание. Правильное смешивание партии проводилось на высокой скорости от около 800 до около 1300 об/мин в течение периода времени от около 60 до около 90 мин. Температура партии поддерживалась от около 60 до около 65°C при начале смешивания и от около 55 до около 65°C во время смешивания. Поддерживаемая температура способствовала дисперсии карбомер полимера и помогала предотвратить агломерацию.
Партия была охлаждена до от около 25 до около 30°С с охлажденной водой, пропущенной через паровую рубашку цилиндра, и смешивание продолжалось на средней скорости. Для микроопределения качества, рН, удельной плотности и вязкости брались пробы.
Пример 23. Способ приготовления CoQ10 кремов (1,5, 3,0 и 5,0%) с использованием 22% концентрата CoQ10.
Эмульсионная основа крема была создана с использованием нескольких фаз в комбинации с содержащими концентрат CoQ10 липосомами примера 1. Фазы А-D были скомбинированы для образования основы крема. Фаза Е была 22% концентратом CoQ10 примера 1 (22 вес.% CoQ10). Детали приготовления эмульсионной основы крема и последующего добавления 22% концентрата CoQ10 примера 1 перечислены ниже.
Для приготовления содержащего 1,5 вес.% 22% концентрата CoQ10 (CoQ10 крем 1,5%) процедура комбинации различных фаз была проделана с ингредиентами, перечисленными в табл. 3-7.
- 91 034552
Таблица 3
CoQ10 крем 1,5%
Фаза Торговая марка Название по CTFA процент Количество(г)
RITOMOLLIENT TN С12-15 Алкилбензоат 5,000 1,0000
RITA СА Цетиловый спирт 2,500 0,5000
RITA SA Стеариловый спирт 2,000 0,4000
RITAPRO 165 Г лицерилстеарат и PEG-100 Стеарат 4,500 0,9000
Фаза А (жировая фаза) включала C12-15 алкилбензоаты, которые являются легкими эфирами, добавленными для смягчения и растекаемости. Цетиловый спирт и стеариловый спирт были восками, добавленными для придания формы или текстуры крема, и глицерина стеарат и ПЭГ-100 стеарата смесь были основными эмульгаторами, включенными для формирования эмульсии масло-в-воде (м/в). Ингредиенты фазы А были взвешены в вакуумном выпарном аппарате и нагреты до температуры от около 70 до около 75 °C на водяной бане.
Таблица 4
Фаза Торговая марка Название CTFA по процент Количество(г)
В RITA GLYCERIN Г лицерин 2,000 0,4000
В HYDROLITE-5 Пентиленгликоль 2,125 0,4250
В TRANSCUTOL P Этоксидигликоль 5,000 1,0000
В феноксиэтанол Феноксиэтанол 0,463 0,0926
В ACRITOMER 940, 2% дисперсия Вода, КАРБОМФЕР 940 50,000 10,0000
в Очищенная вода USP Вода 11,000 2,2000
Фаза В (водяная фаза) содержала глицерин для увлажнения кожи, пропиленгликоль для увлажнения, придания коже проницаемости и для улучшения профиля микробиологической сохранности, этоксидигликоль для улучшения проницаемости кожи для CoQ10 липосом; феноксиэтанол для микробиологической сохранности; очищенную воду в качестве фазы растворителя и карбомер 940 дисперсию примера 2 для контроля реологических свойств формул кремов и для придания стабильности основной эмульсии.
Ингредиенты фазы В были помещены в отдельные вакуумные выпарные аппараты. Ингредиенты смешивались на средней скорости при нагреве от около 70 до около 75°C (без вакуума). Когда ингредиенты фазы В достигли температуры от около 70 до около 75 °C, ингредиенты фазы А были добавлены при температуре от около 70 до около 75°C на средней скорости смешивания. Смесь фаз А и В рециркулировала в гомогенизаторе Сильверсона, как описано выше в примере 1 (стандартный напор), до перехода к следующему этапу процесса.
- 92 034552
Таблица 5
Фаза Торговая марка Название по CTFA процент Количество(г)
С TEALAN 99% триэаноламин 1,300 0,2600
С RITALAC LA USP Молочная кислота 0,300 0,0600
С RITALAC NAL Лактат 2,000 0,4000
натрия, вода
С Дистиллированная вода вода 3,312 0,6624
В фазе С (нейтрализующая и буферная фаза), очищенная вода действовала как растворитель и разбавитель для других ингредиентов этой фазы. Триэтаноламин был основным нейтрализатором сополимера акриловой кислоты карбомер в водяной фазе (фазе В); раствор лактата натрия (60 вес.% в воде) и молочной кислоты были добавлены в качестве буферной системы для создания и поддержания конечной рН крема от около 5 до около 5,5, что совпадает с естественным диапазоном рН кожи.
Ингредиенты фазы С были взвешены и смешаны до однородности и нагреты до температуры от около 60 до около 65°C. Смесь фазы С была добавлена в вакуумный выпарной смеситель, содержащий фазы А и В с миксером на скорости от средней до высокой.
Смешивание продолжалось до перехода к следующему этапу процесса.
Таблица 6
Фаза Торговая марка Название по CTFA процент Количество(г)
D TITANIUM DIOXIDE Диоксид титана 1,000 0,2000
Фаза D (пигментная фаза). Диспергируемый в воде порошок диоксида титана был использован в формуле только с целью осветления оттенка окончательного цвета крема. Желто-оранжевый цвет крема, который ему придал CoQ10, был заметно уменьшен и улучшен в косметических целях добавлением около 1 вес.% диоксида титана.
Для фазы D процесса, взвешенный TiO2 было добавлен в емкость (к фазам А-С) и смешан и рециркулирован в гомогенизаторе Сильверсона (высокий напор) около 10 мин или до полной однородности (цвет изменился до требуемого).
Важно было удостовериться, что нет агломерации или группирования диоксида титана на пластинах смесителя; это было подтверждено визуальным осмотром. Гомогенизатор Сильверсона, как описано в примере 1, был использован с высоким напором для того чтобы добиться максимальной деагломерации и измельчения диоксида титана. Конечная дисперсия диоксида титана была проверена Hegman PH-175 гигрометром.
Таблица 7
Фаза Торговая марка Название по CTFA процент Количество(г)
Е Концентрат CoQ10 22% ( из примера 1 выше) Вода, Полисорбат 80, Убихинон, лецитин, пентиленгликоль, феноксиэтанол 7,500 1,500
Итого 100,000 20,000
Рециркуляция была остановлена и емкость была охлаждена до от около 50 до около 55 °C при средней скорости смешивания, скорость около 30 об/мин. Предварительно взвешенный 22% концентрат CoQ10 (фаза Е) из примера 1 был нагрет до от около 45 до около 50°С и добавлен в емкость (к фазам АD).
Все фазы были смешаны на средней скорости около 60 об/мин в вакууме до достижения однород
- 93 034552 ности. Поддерживалась температура около 50°С.
Емкость была охлаждена до от около 35 до около 45°C при скорости смешивания около 60 об/мин и использовании вакуума.
Получившийся в результате материал был помещен в контейнеры для хранения.
Для приготовления крема, содержащего 22% концентрат CoQ10 в количестве 3 вес.% (CoQ10 крем 3%), была проведена точно такая же процедура, как и описанная для приготовления крема, содержащего 22% концентрат CoQ10 в количестве 1,5 вес.% (CoQ10 крем 1,5%). Материалы каждой фазы и использованные количества перечислены ниже в табл. 8-12.
Таблица 8
Крем CoQlO 3%
Фаза Торговая марка Название по CTFA процент Количество(г)
А RITOMOLLIENT TN С12-25 алкил бензоат 4,000 0,8000
А RITA СА Цетиловый спирт 2,500 0,5000
А RITA SA Стеариловый спирт 2,000 0,4000
А RITAPRO 165 Глицерил стеарат и ПЕГ-100 стеарат 4,500 0,9000
Таблица 9
Фаза Торговая марка Название CTFA по процент Количество(г)
В RITA GLYCERIN Глицерин 2,000 0,4000
В HYDROLITE-5 Пентилен 2,250 0,4500
гликоль
гликоль
В TRACUTOL Р этоксиэтанол 5,000 1,0000
В ф егноксиэтанол феноксиэтанол 0,463 0,0926
в TRANSCUTOL 940, 2% дисперсия Вода, CARBOMER 940 40,000 8,0000
в Очищенная вода, USP вода 15,000 3,0000
- 94 034552
Таблица 10
Фаза Торговая марка Название по CTFA процент Количество(г)
С TEALAN 99% триэтаноламин 1,300 0,2600
С RITALAC LA Молочная кислота 0,500 0,1000
С RITALAC NAL Лактат натрия, вода 2,000 0,4000
С Очищенная вода, USP вода 2,487 0,4974
Таблица 11
Фаза Торговая марка Название CTFA по процент Количество(г)
С TITANIUM DIOXIDE, #3328 Диоксид титана 1,000 0,2000
Таблица 12
Фаза Торговая марка Название по CTFA процент Количество(г)
Е Концентрат CoQlO 22% (из примера 1 выше) Вода POLYSORBATE 80, убихинон, лецитин, пентилен гликоль феноксиэтанол 15,000 3,0000
100,000 20,000
Подобный крем был приготовлен с использованием CoQ10 22% концентрата из примера 1 в количестве около 25 вес.% для создания крема, имеющего CoQ10 22% концентрат в концентрации около 5 вес.%.
Перечисление компонентов CoQ10 кремов, имеющих 1,5 вес.% CoQ10, 3 вес.% CoQ10 и 5 вес.% CoQ10 приведены ниже в табл. 13-15 соответственно. Следует заметить, что во всех формулах, приведенных здесь и ниже для CoQ10 кремов, фактически количество использованного CoQ10 22% концентрата превышало конечную теоретическую концентрацию CoQ10 22% концентрата на около 5% от целевой концентрации. Так, для CoQ10 крема 1,5% фактическое использованное количество было 7,5 вес.% CoQ10 22% концентрата, что составляло 1,58 вес.% CoQ10. CoQ10 крем 3% был сделан с 15 вес.% CoQ10 22% концентрата, что составляло теоретическое количество 3,15 вес.% CoQ10. 5% дополнительного лекарства было добавлено для увеличения срока годности продукта и поддержания содержания лекарства от около 90 до около 110% от заявленного или ожидаемого содержания лекарства.
- 95 034552
Крем CoQ10 1,5%
Таблица 13
Фаза Торговая марка INCL Название процент Поставщик
А RITAMOLLIENT TN С12-15 алкил бензоат 5,000 RITA
А RITA СА Цетиловый спирт 2,000 RITA
А RITA SA Стеариловый спирт 1,500 RITA
А RITAPRO 165 Глицерил стеарат и ПЕГ-100 Стеарат 4,500 RITA
В RITA GLYCERINE Глицерин 2,000 RITA
HYDROLITE 5 Пентилен гликоль 2,125 SYMROSE
В TRANSCUTOL P Этоксидигликоль 5,000 GATTEFOSSE’
В ф еноксиэтанол Феноксидигликоль 0,463 RITA
в Очищенная вода Деионизованная вода 11,000
в ACRITAMER 940 дисперсия,. 2% Вода, пентилен гликоль, CARBOMER 940, феноксиэтанол 50,000
с Очищенная вода USP Вода 4,212
с триэтаноламин Триэтаноламин 1,300 RITA
с RITALAC NAL Лактат натрия и и вода 2,000 RITA
C RITALAC LA USP Молочная кислота 0,400 RITA
D TITANIUM DIOXIDE #3328 Диоксид титана 1,000 MPSI
E Концентрат Липосом CoQlO, 22масс% ( из примера 1) Вода POLYSORBATE 80 Ибихинон, лецитин, пентилен гликоль, феноксиетанол 7,500
итого 100,000
- 96 034552
Таблица 14
Крем CoQ 10 3,0%
- 97 034552
Таблица 15
CoQ10 крем 5%
Фаза Ингредиент масс. %
А С12-С15 алкилбензоат 3.000
А Ц,етиловый спирт 2.000
А Стеариловый спирт Е500
А Глицерилстеарат и PEG100 стеарат 4.500
В Глицерин 2.000
В Пентиленгликоль 2.000
В Этоксидигликоль 5.000
в Феноксиэтанол 0.450
в Карбомер 35.000
в Очищенная вода 14.000
с Лактат натрия 2.000
с Очищенная вода 0.750
с Триэтаноламин 1.300
с Молочная кислота 0.500
D Диоксид титана 1.000
Е CoQlO концентрат 22% 25.000
Всего: 100.000
Примечание: 5% производственное превышение CoQ10 22% концентрации было добавлено к партиям CoQ10 крема 1,5%, CoQ10 крема 3,0% и CoQ10 крема 5% (1,5% плюс 0,075%, 3% плюс 0,15% и 5% плюс 2,5%).
Пример 24. Местное применение CoQ10 крема (1,5, 3,0 или 5,0%).
Содержащие CoQ10 кремы, произведенные в примере 3 (т.е. CoQ10 крем 1,5%, CoQ10 крем 3% и CoQ10 крем 5%) выше были применены к коже свиней. Местное дозовое исследование проводилось на двух свиньях, один самец и одна самка. У каждого животного было 6 тестируемых областей; три тестируемых области с каждой стороны. У каждой свиньи на одну сторону (3 места) наносилась доза крема один раз в день в течение 7 дней, а на противоположную сторону (3 тестируемых области) каждой свиньи доза крема наносилась только один раз в 1 день. Кремы из примера 3, приготовленные с этоксидигликолем, использовались для самцов животных. Самки животных получали 3 тестируемых формулы, которые содержали те же ингредиенты, что и в образцах, произведенных в примере 3 выше, за исключением того, что они содержали 5% 1,3-бутиленгликоля вместо 5% этоксидигликоля. Детали этих формул, сделанных с 1,3-бутиленгликолем, которые содержали 1,5% CoQ10 22% концентрата по весу, 3% CoQ10 22% концентрата по весу и 5% CoQ10 22% концентрата по весу, перечислены ниже в табл. 16-18 соответственно.
- 98 034552
Таблица 16
Крем CoQ10 1.5% номинально активного основания бутиленгликоля
Фаза Ингредиент масс. %
А С12-С15 алкилбензоат 5.000
А Цетиловый спирт 2.000
А Стеариловый спирт Е500
А Глицерилстеарат и PEG100 стеарат 4.500
В Глицерин 2.000
В Пентиленгликоль 2.125
В Бутиленгликоль 5.000
в Феноксиэтанол 0.463
в Карбомер 50.000
в Очищенная вода 11.001
с Лактат натрия 2.000
с Очищенная вода 4.211
с Триэтаноламин 1.300
с Молочная кислота 0.400
D Диоксид титана 1.000
Е CoQlO концентрат 22% 4.500
Всего: 100.000
Таблица 17
Крем CoQ10 3% номинально активного основания бутиленгликоля
Фаза Ингредиент масс. %
А С12-С15 алкилбензоат 4.000
А Цетиловый спирт 2.000
А Стеариловый спирт 1.500
А Глицерилстеарат и PEG100 стеарат 4.500
В Глицерин 2.000
В Пентиленгликоль 2.250
В Бутиленгликоль 5.000
- 99 034552
В Феноксиэтанол 0.476
в Карбомер 40.000
в Очищенная вода 16.000
с Лактат натрия 2.000
с Очищенная вода 2.474
с Триэтаноламин 1.300
с Молочная кислота 0.500
D Диоксид титана 1.000
Е CoQlO концентрат 22% 15.000
Всего: 100.000
Таблица 18
Крем CoQ10 5% номинально активного основания бутиленгликоля
Фаза Ингредиент масс. %
А С12-С15 алкилбензоат 3.000
А Цетиловый спирт 2.000
А Стеариловый спирт 1.500
А Глицерилстеарат и PEG100 стеарат 4.500
В Глицерин 2.000
В Пентиленгликоль 2.000
- 100 034552
В Бутиленгликоль 5.000
в Феноксиэтанол 0.450
в Карбомер 35.000
в Очищенная вода 14.000
с Лактат натрия 2.000
с Очищенная вода 0.750
с Триэтаноламин 1.300
с Молочная кислота 0.500
D Диоксид титана 1.000
Е CoQlO концентрат 22% 25.000
Всего: 100.000
Все животные получили одинаковую дозу каждой формулы, каждая по 200 мг, на 121 см2 области применения, один раз или ежедневно в течение 7 дней.
После применения образцы кожи были получены и анализированы следующим образом. Тестируемые области кожи были аккуратно промыты в смеси мягкого мыла и воды (например, 1% Ivory Soap в воде или эквивалент), чтобы удалить любые остатки местной тестируемой композиции. Если вырезанная область кожи была больше, чем область, получавшая дозу крема, то область, получавшая дозу крема, была помечена несмываемыми чернилами, чтобы отметить ту область кожи, которая получила дозу крема. Участок кожи полной толщины был вырезан скальпелем по размеру примерно 10x10 см, на глубину, включавшую слой подкожной клетчатки. После вырезания участок кожи был разложен на плоской поверхности, завернут в два слоя целлофановой упаковки (SARAN WRAP.TM. или эквивалент) и быстро заморожен при температуре около -70°С или ниже. Каждый участок кожи был идентифицирован надлежащим образом (например, идентификационный номер животного, номер исследования, дата и т.д.). Образцы хранились при -70°С или ниже до исследования.
Каждый участок кожи был помещен в водонепроницаемый пластиковый контейнер и разморожен в нем при температуре от около 30 до около 35°C на водяной бане. После размораживания каждый участок кожи был аккуратно промыт дистиллированной деионизированной водой для удаления каких-либо поверхностных остатков средства и крови. Все подкожные ткани (например, жировая) были удалены скальпелем до уровня папиллярной дермы.
Каждый участок кожи затем очищался (TRANSPORE.TM., от 3М) от около 10 до около 20 раз, пока примерно 10-25% поверхности не стало блестеть. Этот процесс удалил роговой слой и какие-либо поверхностью остатки средства.
На каждом большом участке кожи были выделены чернилами 6 областей. Площадь выделенных областей составляла 1 см2.
Каждый участок кожи был помещен в водонепроницаемый пластиковый контейнер и опущен в водяную баню при около 65°C (+/-3°С) для инициации процесса отделения эпидермиса от дермы. Тестируемые области затем вырезались из большого участка кожи, и эпидерма отделялась от дермы. Отдельные участки кожи взвешивались и вес записывался. Отдельные участки кожи были измельчены скальпелем, помещены в надписанные пробирки и хранились для последующих анализов.
Образцы кожи были экстрагированы в изопропаноле (IPA) на шейкере около 47 ч, затем хранились при около -20°С до начала дальнейших процедур. Образцы затем центрифугировались при около 13500 об/мин около 10 мин и супернатант был собран в 2-мл янтарные ампулы.
Количественная оценка CoQ10 была произведена при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ-UV). Вкратце, ВЭЖХ была проведена на Hewlett-Packard 1100 Series ВЭЖХ системе с Agilent 1100 Series LC/MSD. Система растворителей, включавшая около 65% этанола и около 35% метанола, была пропущена через Aquasil С18 колонку (около 3, около 100 мм, 5.mu.) при скорости потока около 1 мл/мин. Было введено 10 мкл на пробу. Пиковые области были подсчитаны для определения
- 101 034552 концентрации с использованием внешней стандартной кривой, приготовленной по стандарту. У кривой был резкий выброс на IPA из-за растворимости CoQ10 в воде.
Результаты содержания CoQ10 в коже свиней суммированы на фиг. 1 и 2 и в табл. 19 и 20 ниже. 6 повторов на кусок кожи коррелировали с весом ткани и было получено среднее для каждой серии дозировок.
Таблица 19
Средний ±SD вес ткани (n=42)
Донор Эпидермис (граммы) Дерма (граммы)
5061873 (самец) 0.037 ±0.012 0.682 ±0.129
5061521 (самка) 0.026 ±0.007 0.603 ± 0.090
Таблица 20
Среднее: ±SD подсчитанная концентрация CoQ10 в коже свиней (п=6/кусок)
Донор Пол Сторона Доза (мг) Эпидермис (мкг/г) Дерма (мкг/г)
5061873 Самец Левая 1.5 137.7 ±58.2 0.72 ±1.12
5061873 Самец Левая 3.0 188.7 ±40.3 <LLQ
5061873 Самец Левая 5.0 163.4 ±39.1 0.16 ±0.39
5061873 Самец Правая 1.5 519.3 ±101.2 0.93 ±0.81
5061873 Самец Правая 3.0 315.3 ±227.0 <LLQ
5061873 Самец Правая 5.0 331.2 ±128.7 <LLQ
5061873 Самец Центр 0 24.6 ±11.5 <LLQ
5061521 Самка Левая 1.5 135.6 ±39.2 <LLQ
5061521 Самка Левая 3.0 211.8 ±60.5 <LLQ
5061521 Самка Левая 5.0 211.9 ±67.8 <LLQ
5061521 Самка Правая 1.5 118.4 ±32.6 <LLQ
5061521 Самка Правая 3.0 84.7 ±24.6 <LLQ
5061521 Самка Правая 5.0 118.1 ±26.6 <LLQ
5061521 Самка Центр 0 25.7 ±21.8 <LLQ
<LLQ = ниже нижнего уровня возможного диапазона детекции (т.е. не определяется).
Данные показывают, что измеряемые количества CoQ10 наблюдались во всех эпидермальных образцах и в отдельных дермальных образцах.
Было обнаружено, что все обработанные участки эпидермиса содержали CoQ10 в уровнях, который был достоверно больше, чем в необработанных участках (р<0,001).
Не было достоверной разницы между содержанием CoQ10 в эпидермисе по трем использованным при обработке тремя концентрациям в участках кожи как самцов, так и самок (р>0,02).
Между самцами и самками свиней для участков с правой стороны животного (1-дневная обработка) содержание в эпидермисе для 1,5% CoQ10 и 5% CoQ10 обработок в участках из кожи самцов было достоверно выше, чем то, что наблюдалось в коже самок (р<0,003), но не для 3% CoQ10 обработки (р=0,0329). Таким образом, как можно видеть из этих данных, проникновение CoQ10 в однократной дозе было достоверно выше для этоксидигликолевой формулы по сравнению с бутиленгликолевой формулой (р<0,003 для 1,5% и 5% доз и р=0,0329 для 3% дозы).
Эпидермальные уровни для участков кожи как самцов, так и самок для всех трех применявшихся доз, для 7-дневного периода обработки (левая сторона) были статистически идентичны.
Содержание в дерме наблюдалось только в участках кожи самцов для 1,5% CoQ10 и 5% CoQ10 применявшихся доз для 7-дневного периода обработки (левая сторона) и 1,5% CoQ10 применявшихся доз 1-дневного периода обработки (правая сторона).
Сводные данные представлены в табл. 21.
- 102 034552
Таблица 21
% концентрации 1.5 3 5
Мкг лекарства / мг формулы 15 30 50
Примененное количество (мг) 200 200 200
Общее количество примененного лекарства (мкг) 3000 6000 10000
Обработанный участок (см2) 121 121 121
Мкг лекарства/см2 24.79 49.59 82.64
Самцы левая сторона (x7d)
Эпидермис мкг/см2 3.470 6.688 7.311
% доза/см2 14.0 13.5 8.8
Дерма (мкг/ см2) 0.575 0 0.106
% доза/см2 2.3 0.0 0.1
Самцы правая сторона (xld)
Эпидермис мкг/см2 18.309 8.215 10.986
% доза/см2 73.8 16.6 13.3
Дерма (мкг/ см2) 0.582 0 0
% доза/см2 2.3 0.0 0.0
Если экстраполировать данные из табл. 21 ко всему участку кожи, проникновение CoQ10 будет таким, как представлено ниже в табл. 22.
- 103 034552
Таблица 22
Если экстраполировать на всю область
1,5 3 5
Элидер мис 419,87 809,248 884,631
(мкм/121см2)
% дозы 14,0 13,5 8,8
Если экстраполировать на всю область
1,5 3 5
Элидер мис
(мкм/121см2) 2215,389 994,015 1329,306
% дозы 73,8 16,6 13,3
Одноразовое применение формулы CoQ10 крема составляло в среднем 12, 17 или 70% от применяемой дозы для соответственно 5, 3 и 1,5% CoQ10 формул крема. Как правило, проникновение CoQ10 в однократной дозировке было достоверно выше для этоксидигликольной формулы по сравнению с бутиленгликольной формулой (р<0,003 для 1,5 и 5% доз и р=0,0329 для 3% дозы). Данные показывают, что существует возрастание эпидермального содержания при применяемой концентрации 3% CoQ10 по сравнению с 5% CoQ10 дозой, эквивалентной дозе 3% CoQ10. Это подтверждает, что кожа насыщается CoQ10 при 3% CoQ10 дозе или же что носитель неспособен доставить больше CoQ10, чем в концентрации 3% CoQ10. Можно видеть, что уровни, достигнутые в коже после 7 дней местного применения, были идентичны у 2 животных.
Для формулы этоксидигликоля и для однократного применения наблюдалось среднее проникновение 73,8, 16,6 и 13,3% для соответственно 1,5, 3 и 5% этоксидигликоль содержащих кремов.
Интересным и неожиданным открытием было то, что диспропорциональное количество CoQ10 было обнаружено в эпидермисе для 1,5% крема, самой низкой тестируемой дозы CoQ10. He желая связываться какой-либо теорией, это усиленное проникновение CoQ10 могло быть функцией отношения CoQ10 к этоксидигликолю в формуле крема или могло возможно быть связано с отношением этоксидигликоля к CoQ10 и фосфолипидным липосомам. Сравнительно более высокое отношение этоксидигликоля к CoQ10, использованное в креме, содержащем более низкую концентрацию CoQ10, могло быть связано с более высокими количествами CoQ10, обнаруженными в эпидермисе.
1,5% крем и 3% крем также успешно прошли 9 недель ускоренных испытаний (хранение при около 35°C и около 50°С); прошли 5 циклов замораживания-разморозки при упаковке как в пластиковые банки, так и в металлические тубы, и прошли USP микробиологический тест. Результаты были подтверждены в той же системе с по-разному разработанными партиями и 1,5, 3 и 5% весовыми концентрациями CoQ10 в прототипе основы формулы крема.
Пример 25. Способ формирования CoQ10 кремов (1,5, 3,0 и 5,0%) с использованием CoQ10 21% концентрата.
Кремы были произведены, как описано в примере 3 выше, за исключением того, что вместо пентиленгликоля был использован пропиленгликоль (1,2-пентан диол; Hydrolite-5, Symrise). Вначале был произведен концентрат, как описано в примере 1 выше, с компонентами, перечисленными в табл. 23.
- 104 034552
Таблица 23
Формула партии - концентрат CoQ 10
Фаза
Наименование сырья Теоретическое значение Масс.% кг
А Полисорбат 80 NF 25,000 5,000
А Ибед екаренонН SP 21,000 4,200
В Пропилен гликоль USP 10,000 2,000
В Феноксиэтанол NF 0,500 0,100
С Очищенная вода USP 35,500 7,100
с Лецитин NF 8,000 1,600
итого 100,000 20,000
Получившийся в результате CoQ10 концентрат (CoQ10 21% концентрат) содержал CoQ10 в концентрации около 21 вес.%.
А дисперсия карбомера была приготовлена, как описано в примере 2 выше, для использования в формировании крема с компонентами, перечисленными в табл. 24.
Таблица 24
Формула партии - дисперсия карбомера
Фаза Название сырья Теоретическое количество Весовой % Кг
А Феноксиэтанол NF 0.500 0.0900
А Пропиленгликоль USP 5.000 0.9000
В Очищенная вода USP 92.500 16.6500
С Карбомер 940 NF 2.000 0.3600
Всего 100.000 18.000
Крем, имеющий 1,5 вес.% CoQ10 21% концентрата, и другой крем, имеющий 3 вес.% CoQ10 21% концентрата, были приготовлены, как описано выше в примере 3, с компонентами, перечисленными ниже в табл. 25 и 26.
- 105 034552
Формула партии - крем CoQ10 1,5%
Таблица 25
Фаза Название сырья Теоретическое количество
Весовой % Кг
А Алки лС 12-15Бензоат NF 5.000 1.000
А Цетиловый спирт NF 2.000 0.400
А Стеариловый спирт NF 1.500 0.300
А Глицерил стеарат и PEG-100 стеарат 4.500 0.900
В Глицерин USP 2.000 0.400
В Пропиленгликоль USP 1.750 0.350
В Диэтиленгликоль моноэтиловый эфир NF 5.000 1.000
в Феноксиэтанол NF 0.463 0.093
в Дисперсия карбомера, 2% 50.000 10.000
в Очищенная вода USP 8.377 1.675
в Очищенная вода USP (для промывок) 3.000 0.600
с Троламин NF 1.300 0.260
с Молочная кислота USP 0.400 0.080
с Раствор лактата натрия USP 2.000 0.400
с Очищенная вода USP 4.210 0.842
D Диоксид титана USP 1.000 0.200
Е CoQlO концентрат, 21% 7.500 1.500
Всего 100.00 20.00
- 106 034552
Таблица 26
Формула партии - крем CoQ10 3%
Фаза Название сырья Теоретическое количество
Весовой % Кг
А АлкилС 12-15Бензоат NF 4.000 0.800
А Цетиловый спирт NF 2.000 0.400
А Стеариловый спирт NF 1.500 0.300
А Глицерилстеарат и PEG-100 стеарат 4.500 0.900
В Глицерин USP 2.000 0.400
В Пропиленгликоль USP 1.500 0.300
В Диэтиленгликоль моноэтиловый эфир NF 5.000 1.000
в Феноксиэтанол NF 0.475 0.095
в Дисперсия карбомера, 2% 40.000 8.000
в Очищенная вода USP 13.725 2.745
в Очищенная вода USP (для промывок) 3.000 0.600
с Троламин NF 1.300 0.260
с Молочная кислота USP 0.500 0.100
с Раствор лактата натрия USP 2.000 0.400
с Очищенная вода USP 2.500 0.500
D Диоксид титана USP 1.000 0.200
Е CoQlO концентрат, 21% 15.000 3.000
Всего 100.000 20.000
Пример 26. Способ формирования CoQ10 21% концентрата, который включает пропиленгликоль.
Композиция концентрата CoQ10 21% была приготовлена путем комбинации фаз А и В, как описано ниже. Фаза А включала убидекаренон USP (CoQ10) 21 вес.% и полисорбат 80 NF 25 вес.%. Фаза В включала пропиленгликоль USP 10,00 вес.%, феноксиэтанол NF 0,50 вес.%, лецитин NF (Фосфолипон 85G) 8,00 вес.% и очищенную воду USP 35,50 вес.%. Все весовые проценты соответствовали весу полной композиции CoQ10 21% концентрата. Проценты и другие детали перечислены в следующей таблице.
Таблица 27а
Фаза Торговое название INCI Name Процент
А Ri tab ate 80 Полисорбат 80 25,000
А Убидекаренон Убихинон 21,000
В Очищенная вода Вода 35,500
В Пропиленгликоль Пропиленгликоль 10,000
В Феноксиэтанол Феноксиэтанол 0,500
в Фосфолипон 85G Лецитин 8,000
Общее 100,000
Феноксиэтанол и полипропиленгликоль были помещены в соответствующий контейнер и смешаны до достижения прозрачности. Требуемое количество воды было добавлено во второй контейнер (смесительный чан 1). Смесительный чан 1 во время смешивания был нагрет до температуры между 45 и 55°C. Раствор феноксиэтанол/пропиленгликоль был добавлен к воде и смешан до достижения прозрачности и однородности. Когда содержимое водяной фазы в смесительном чане 1 находилось в диапазоне от 45 до 55°C, Фосфолипон G был добавлен на скорости смешивания от низкой до средней. Чтобы избежать како- 107 034552 го-либо пенообразования, содержимое смесительного чана 1 смешивалось до тех пор, пока фосфолипон не стал однородно дисперсным. Полисорбат 89 был добавлен в соответствующий контейнер (смесительный чан 2) и нагрет до температуры между 50 и 60°С. Затем в смесительный чан 2 был добавлен убидекаренон. При поддержании температуры между 50 и 60 °С смесительный чан 2 смешивался до тех пор, пока весь убидекаренон не растворился. После того как весь убидекаренон растворился, водяная фаза была медленно добавлена в смесительный чан 2. Когда все материалы были соединены, содержимое было гомогенизировано, пока дисперсия не стала ровной и однородной. Соблюдая осторожность, чтобы не перегреть, температура поддерживалась между 50 и 60°С. Гомогенизатор затем остановили и содержимое смесительного чана 2 было перемещено в соответствующий контейнер для хранения.
Пример 27. Способ формирования 0,5 кг партии CoQ10 21% концентрата, который включает пропиленгликоль.
0,5 кг CoQ10 композиции концентрацией 21% было приготовлено путем комбинации фаз А и В, как описано ниже. Фаза А включала убидекаренон USP (CoQ10) 21 вес.% и полисорбат 80 NF 25 вес.%. Фаза В включала пропиленгликоль USP 8,00 вес.%, феноксиэтанол NF 0,50 вес.%, лецитин NF (Фосфолипон 85G) 8,00 вес.% и очищенную воду USP 35,50 вес.%. Все весовые проценты соответствовали весу полной композиции CoQ10 21% концентрата. Проценты и другие детали перечислены в следующей таблице.
Таблица 28а
Фаза Торговое название INCI название Процент Количество (кг)
А Ritabate 80 Полисорбат 80 25,000 0,1250
А Убидекаренон Убихинон 21,000 0,1050
В Очищенная вода вода 35,500 0,1775
В Пропиленгликоль Пропиленгликоль 10,000 0,0500
В Феноксиэтанол Феноксиэтанол 0,500 0,0025
В Фосфолипон 85G Лецитин 8,000 0,0400
Общее 100,000 0,5000
Все оборудование было вымыто и продезинфицировано. Полисорбат 80 был взвешен прямо в выпарном аппарате PK-2 и нагрет в вакуумном выпарном аппарате PK-2 до 50-55 °C. Убидекаренон USP был взвешен на лабораторном столе и вес дважды проверен перед добавлением в емкость PK-2 (с выключенными мешалками). PK-2 был герметично закрыт. Герметично закрытый PK-2 смешивал на низкой скорости, поддерживая температуру 50-55°C и вакуум в течение 15 мин. Фазу проверили, чтобы убедиться, что весь порошок растворился в полисорбате, перед тем как перейти к следующему этапу. В PK1, требуемое количество воды было добавлено и нагрето до 50-55°C. На лабораторном столе феноксиэтанол и Гидролит-5 были взвешены и смешаны до достижения прозрачности и однородности, и вода была добавлена при средней скорости смешивания до достижения прозрачности и однородности. Когда водяная смесь достигла 50-55°C, был добавлен лецитин при низкой или средней скорости смешивания, для избежания пенообразования, и смешивался до достижения диспергированности. Водяная фаза была перенесена из PK-1 в 5-галлоновый контейнер. С водяной фазой и CoQ10 фазой при 50-55°C, водяная фаза была добавлена к CoQ10 фазе при средней скорости смешивания. Когда все материалы были перенесены в PK-2, партия была рециркулирована в аппарате Сильверсона со стандартной ножевой головкой при 7000 об/мин в течение 3-5 мин с PK-2 выпарным аппаратом и в вакууме. Температура поддерживалась при 50-55°C и не допускалось перегревание. Рециркуляцию остановили и партия была охлаждена при 30-35°C при средней скорости смешивания. Концентрат был перекачан во временные переносные контейнеры.
Пример 28. Способ приготовления 20 кг партии CoQ10 21% концентрата, который включает пропиленгликоль.
кг CoQ10 композиции концентрацией 21% было приготовлено путем комбинации ингредиентов фаз А, В и С. Фаза А включала полисорбат 80 NF 25 вес.% и убидекаренон USP (CoQ10) 21 вес.%. Фаза В включала пропиленгликоль USP 10,00 вес.% и феноксиэтанол NF 0,50 вес.%. Фаза С включала очищенную воду USP 35,50 вес.% и лецитин NF 8,00 вес.%.
Проценты, количества и другие детали перечислены в следующей таблице.
- 108 034552
Т аблица 29
Фазы RM Номер Название сырья Теоретическое количество
% по весу г
А RM-002 RM-002: Полисорбат 80 NF 25,000 5000
А RM-010 RM-010: Убидекаренон USP 21,000 4200
В RM-021 RM-021: Пропиленгликоль USP 10,000 2000
В RM-013 RM-013: Феноксиэтанол NF 0,500 100,0
С RM-011 RM-011: Очищенная вода USP 35,500 7100
с RM-017 RM-017: Лецитин NF 8,000 1600
Всего 100,000 20000
Для очистки РК-2 (закрытый вакуумный
сосуд)
RM-019 или RM- 020 Азот 97% NF AsotNF необх. кол-во необх. кол- во
Для приготовления 20 кг партии CoQ10 21% концентрата оборудование было тщательно вымыто и проверено. Все оборудование было откалибровано. 100,0 г феноксиэтанола было взвешено и помещено в чистый стакан.
Для приготовления фазы В 2000 г пропиленгликоля были взвешены и помещены в чистый 2-л SS стакан. Затем 2000 г очищенной воды было взвешено и помещено в чистый контейнер, помеченный вода для промывки.
К 2-л SS стакану, содержащему предварительно взвешенные 2000 г пропиленгликоля, было добавлено 100 г предварительно взвешенного феноксиэтанола. Стакан, содержавший феноксиэтанол, был промыт в 2 л стакане с 1/3 воды для промывки. Содержимое 2 л стакана было перемешано лопаткой до достижения прозрачности и однородности и было помечено как фаза В.
На следующем этапе было взвешено 1600 г лецитина и было взвешено 5100 г очищенной воды. Надлежащим образом помеченные партии веществ были помещены в устройства регистрации температуры TIC-1 для PK-1 и TIC-2 для PK-2. 5100 г очищенной воды было добавлено к PK-1 и вода была вручную нагрета в PK-1 до 50-55 °C. Мешалка была запущена на малой скорости оборотов. Раствор фазы В затем был медленно добавлен из 2-л SS стакана в PK-1. SS стакан затем был промыт с приблизительно 1/3 воды для промывки. Вода для промывки была медленно перемещена в PK-1. Температура поддерживалась вручную при 50-55°C. Затем медленно был добавлен лецитин NF и смешивался до тех пор, пока не стал диспергированным. Температура поддерживалась вручную при 50-55°C и смешивание продолжалось, пока фаза В не была готова для переноса в PK-2.
Для приготовления фазы А 5000 г полисорбата 80 было взвешено и помещено в чистый контейнер и было взвешено 4200 г убидекаренона USP. Для составления концентрата оборудование включало закрытый вакуумный сосуд (PK-2), гомогенизатор Сильверсона (Р-2) и насос Waukesha (P-1). Вначале убедились, что нижний вентиль PK-2 закрыт. Предварительно взвешенные 5000 г полисорбата 80 были затем добавлены в PK-2 через отверстие в смотровом стекле. Смотровое стекло было закрыто на PK-2 после того, как добавление было закончено.
Затем был включен PK-2 смеситель и полисорбат 80 вручную нагревался в PK-2 до 50-55°C. Когда температура полисорбата 80 достигла нужного диапазона, 4200 г предварительно взвешенного убидекаренона USP было добавлено через отверстие для доступа PK-2. Для удаления убидекаренона, который налип на лопасти мешалки во время добавления, использовалась лопаточка. Когда добавление было завершено, смотровое окно было закрыто. Температура поддерживалась вручную при 50-55°C, перемешивание длилось 15 мин. Содержимое PK-2 проверялось через смотровое стекло для оценки того, растворился ли убидекаренон в полисорбате 80. PK-1 смеситель (А-1) был затем выключен.
Через отверстие для доступа PK-2 содержание PK-1 (фазы В) было добавлено к PK-2. Затем PK-1 был промыт оставшейся водой вода для промывки. PK-2 был вручную нагрет до 50-55°C. Содержимое PK-2 затем рециркулировало в Р-1 и Р-2 Сильверсона с ножевой головкой в Р-2 на максимальных об/мин в течение 5-10 мин. Вакуум был включен и поддерживался на максимуме для предотвращения пенообразования. Температура поддерживалась вручную при 50-55°C.
- 109 034552
Было взято четыре пробы: два образца по 30 г для микротеста и два образца по 400 г для физического/химического анализа. Одна серия образцов была помечена как взятая. Продукт затем был перенесен в чистый HDPE закрытый контейнер. Размер партии составлял 20000 г.
Пример 29. Способ приготовления CoQ10 крема 1,5%.
Композиция CoQ10 крема 1,5% была приготовлена путем комбинации фаз А-Е, как описано ниже. Фаза А включала алкил C12-15 бензоат NF 5,000 вес.%, цетиловый спирт 2,000 вес.%, глицерина стеарат/ПЭГ-100 4,5 вес.% и стеариловый спирт NF 1,5 вес.%. Проценты и количество отражены в следующей таблице.
Таблица 30
Фаза Торговое название CTFA Name Процент
А Ritamollient TN Cl2-15 алкилбензоат 4,000
А Rita СА Цетиловый спирт 2,000
А Rita SA Стеариловый спирт 1,500
А Ritapro 165 Глицерина стеарат и ПЭГ-100 стеарат 4,500
Фаза В включала диэтиленгликоля моноэфир NF 5,000 вес.%, глицерин USP 2,000 вес.%, пропиленгликоль USP 1,750 вес.%, феноксиэтанол NF 0,463 вес.%, очищенную воду USP 11,377 и 2% дисперсию карбомера 50,00 вес.%. Проценты и количество отражены в следующей таблице.
Таблица 31
Фаза Торговое название CTFA Название Процент |
В Rita глицерин Глицерин 2,000
В Пропиленгликоль Пропиленгликоль 1,750
В Transcutol Р Этоксидигликоль 5,000
В Феноксиэтанол Феноксиэтанол 0,463
В Acritamer 940, 2% дисперсия Вода, Феноксиэтанол, пропиленгликоль и карбомер 940 50,000
В Очищенная вода USP Вода 11,377
Фаза С включала молочную кислоту USP 0,400 вес.%, раствор лактата натрия USP 2,000 вес.%, троламин NF 1,300 вес.% и очищенную воду USP 4,210 вес.%. Проценты и количество отражены в следующей таблице.
Таблица 32
Фаза Торговое название CTFA Название Процент
С TEAlan 99% Триэтаноламин 1,300
С Ritalac LA USP Молочная кислота 0,400
С Ritalac NAL Лактат натрия, вода 2,000
С Дистиллированная вода вода 4,210
Фаза D включала диоксид титана USP 1,000 вес.%. Фаза Е включала CoQ10 21% концентрат, 7,50 вес.%. Все весовые проценты соответствовали весу полной композиции 1,5% CoQ10 крема. Проценты и другие детали перечислены в следующих таблицах.
Таблица 33
Фаза Торговое название CTFA Название Процент
D Диоксид титана, #3328 Диоксид титана 1,000
Таблица 34
Фаза Торговое название CTFA Название Процент
Е CoQlO 21% концентрация Вода, полисорбат 80, убихинон, лецитин, пропиленгликоль, феноксиэтанол 7,500
При приготовлении композиции CoQ10 крема 1,5% ингредиенты фазы А были добавлены в соот- 110 034552 ветствующий контейнер и нагреты до температуры между 70 и 80°С на водяной бане. Ингредиенты фазы В, за исключением дисперсии карбомер, были добавлены в выпарной аппарат PK-2 и смешаны на средней скорости при нагреве между 70 и 80°С. Ингредиенты фазы С были добавлены в соответствующий контейнер и нагреты до температуры между 70 и 80°С на водяной бане. Концентрат CoQ10 фазы Е был добавлен в соответствующий контейнер и расплавлен при температуре между 50 и 60°С с использованием водяной бани, при смешивании, необходимом для достижения однородности. Дисперсия карбомера была добавлена в соответствующий контейнер (емкость для смешивания) и нагрета до температуры между 70 и 80°С во время смешивания. Продолжая смешивание, ингредиенты фазы В были добавлены к нагретой дисперсии карбомера в емкость для смешивания, температура при этом поддерживалась. Продолжая смешивание, ингредиенты фазы С были добавлены к содержимому емкости для смешивания, температура при этом поддерживалась. Содержимое емкости постоянно перемешивалось и гомогенезировалось. Миксер затем был выключен, но гомогенизация продолжалась, пока ингредиенты фазы D добавлялись к емкости для смешивания. Миксер был затем включен и ингредиенты смешивались и гомогенизировались до достижения полной однородности (проверка по цвету). Гомогенизатор затем был остановлен и партия была охлаждена при температуре между 50 и 60°С. Миксер был затем выключен и расплавленный концентрат CoQ10 был добавлен к емкости для смешивания. Миксер был затем включен и содержимое смешивалось/рециркулировало, пока дисперсия не стала ровной и однородной. Содержимое емкости для смешивания затем было охлаждено при температуре между 45 и 50° С. Охлажденное содержимое затем было перенесено в соответствующий контейнер для хранения перед упаковкой.
Пример 30. Способ приготовления 0,5 кг партии CoQ10 крема 1,5%.
Композиция CoQ10 крема 1,5% была приготовлена путем комбинации фаз А-Е, как описано ниже. Фаза А включала алкил C12-15 бензоат NF 5,000 вес.%, цетиловый спирт 2,000 вес.%, глицерина стеарат/ПЭГ-100 4,5 вес.% и стеариловый спирт NF 1,5 вес.%. Проценты, количество и другие детали отражены в следующей таблице.
Таблица 35
Фаза Торговое название CTFA Название Процент Количество (кг)
А Ritamollient TN Cl2-15 алкилбензоат 4,000 0,0250
А Rita CA Цетиловый спирт 2,000 0,0100
А Rita SA Стеариловый спирт 1,500 0,0075
А Ritapro 165 Глицерина стеарат и ПЭГ-100 стеарат 4,500 0,0225
Фаза В включала диэтиленгликоля моноэфир NF 5,000 вес.%, глицерин USP 2,000 вес.%, пропиленгликоль USP 1,750 вес.%, феноксиэтанол NF 0,463 вес.%, очищенную воду USP 11,377 вес.% и 2% дисперсию карбомера 50,00 вес.%. Проценты, количество и другие детали отражены в следующей таблице.
Таблица 36
Фаза Торговое название CTFA Название Процент Количество (кг)
В Rita глицерин Глицерин 2,000 0,0100
В Пропиленгликоль Пропиленгликоль 1,750 0,0088
В Transcutol Р Этоксидигликоль 5,000 0,0250
В Феноксиэтанол Феноксиэтанол 0,463 0,0023
В Acritamer 940, 2% дисперсия Вода, феноксиэтанол, пропиленгликоль, и карбомер 940 50,000 0,2500
В Очищенная вода USP Вода 11,377 0,0569
Фаза С включала молочную кислоту USP 0,400 вес.%, раствор лактата натрия USP 2,000 вес.%, троламин NF 1,300 вес.% и очищенную воду USP 4,210 вес.%. Проценты, количество и другие детали отражены в следующей таблице.
Таблица 37
Фаза Торговое название CTFA Название Процент Количество (кг)
С TEAlan 99% Триэтаноламин 1,300 0,0065
С Ritalac LA USP Молочная кислота 0,400 0,0020
С Ritalac NAL Лактат натрия, вода 2,000 0,0100
С Дистиллированная вода вода 4,210 0,0211
Фаза D включала диоксид титана USP 1,000 вес.%. Фаза Е включала CoQ10 21% концентрат, 7,500
- 111 034552 вес.%. Все весовые проценты соответствовали весу полной композиции 1,5% CoQ10 крема. Проценты, количество и другие детали отражены в следующей таблице.
Таблица 38
Фаза Торговое название СТЕА Название Процен т Количе ство (кг)
D Диоксид титана, #3328 Диоксид титана 1,000 0,0050
Е CoQ 10 21% концентрация Вода, полисорбат 80, убихинон, лецитин, пропиленгликол ь, феноксиэтанол 7,500 0,0375
При приготовлении композиции CoQ10 крема 1,5% ингредиенты фазы А были взвешены и нагреты до температуры между 70-70°С на водяной бане. Ингредиенты фазы В были добавлены в выпарной аппарат PK-2 и смешаны на средней скорости при нагреве между 70-75°C. Когда фаза В достигла 70-75°C, фаза А была добавлена при 70-75°C на средней скорости смешивания. Фазы А и В затем рециркулировали в аппарате Сильверсона. Ингредиенты фазы С были взвешены, смешаны и нагреты до 60-65°C. Ингредиенты фазы С затем были добавлены в выпарной аппарат PK-2 с перемешиванием на средней скорости. При продолжении смешивания, фаза D была добавлена к партии в PK-2 выпарной аппарат. Партия постоянно смешивалась и рециркулировала в аппарате Сильверсона до достижения полной однородности.
Циркуляция была остановлена и партия была охлаждена при температуре между 50-55°C с перемешиванием на средней скорости. После нагревания ингредиенты фазы Е при температуре между 45 и 50°С были добавлены к партии и партия смешивалась при вакууме на средней скорости до достижения однородности. Температура поддерживалась при 50°С. Партия затем была охлаждена до 30-35°C со скоростью перемешивания от низкой до средней и в вакууме. Затем партия была откачана в контейнер для хранения.
Пример 31. Способ приготовления 20 кг партии CoQ10 крема 1,5%.
кг партии CoQ10 крема 1,5% были приготовлены путем комбинации фаз А-Е. Проценты, количество и другие детали для каждой фазы отражены в следующей таблице.
Таблица 39
Фаза RM номер Название сырья Теоретиче количеств! % по весу ское 0 г
А RM-026 RM-026: Каприновый/ каприлиновый триглицерид 5,000 1000,0
А RM-003 RM-003: Цетиловый спирт ΝΓ 2,000 400,0
А RM-005 RM-005: Стеариловый спирт NT 1,500 300,0
А RM-016 RM-016: Глицерин Стеарат/ПЭГ-100 Стеарат 4,500 900,0
В RM-001 RM-001: Глицерин USP 2,000 400,0
В RM-021 RM-021: Пропиленгликоль 1,750 350,0
- 112 034552
USP
в RM-007 RM-007: Диэтиленгликоля моноэтиловый эфир NF 5,000 1000,0
в RM-013 RM-013: Феноксиэтанол NF 0,465 93,0
в IP-003 IP-003: Дисперсия карбомера, 2% 50,000 10000, 0
в RM-011 RM-011: Очищенная вода USP 8,375 1675,0
в RM-011 RM-011: Очищенная вода USP (для промывки) 3,000 600,0
с RM-009 RM-009: Троламин NF 1,300 260,0
с RM-006 RM-006: Молочная кислота USP 0,400 80,0
с RM-012 RM-012: Раствор лактата натрия USP, 60% 2,000 400,0
с RM-011 RM-011: Очищенная вода USP 4,210 842,0
D RM-008 RM-008: Диоксид титана USP 1,000 200,0
Е IP-004 IP-004: CoQlO концентрат, 21% 7,500 1500,0
Всего 100,00 20000, 0
Для очистки РК-2 (Вакуумная емкость)
RM-019 or RM-020 Азот 97% NF или Азот NF необх. кол-во необх. кол-во
Реактивы были взвешены в кювету с особой аккуратностью для избежания рассыпания. Вначале было взвешено 200 г диоксида титана (фаза D). Затем 600 г очищенной воды было взвешено и помечено как вода для смывания - фаза В.
При приготовлении фазы А 1000 г капринового/каприлинового триглицерида, 400 г цетилового спирта NF, 300 г стеарилового спирта NF и 900 г глицерилстеарата/ПЭГ-100 было взвешено. Эти предварительно взвешенные ингредиенты фазы А затем были добавлены в 4-л SS стакан и контейнер помечен как фаза А. Следует заметить, что эта предсмесь должна быть использована в течение 24 ч. Контейнер с фазой А затем был закрыт и отставлен для более позднего использования.
Для приготовления фазы В, 10000 г 2% дисперсии карбомера, как в примере 11А, было взвешено. Затем было добавлено 400 г глицерина USP, 350 г пропиленгликоля, 1000 г диэтиленгликоля моноэтилэфира NF и 93 г феноксиэтанола NF. 1675 г очищенной воды было взвешено и контейнер был помечен как очищенная вода для фазы В. Эти предварительно взвешенные ингредиенты фазы В были добавлены в 10 л SS стакан и помечены как фаза В. Следует заметить, что эта предсмесь должна быть использована в течение 24 ч. Контейнер с фазой А затем был закрыт и отставлен для более позднего использования.
Для приготовления фазы С 260 г триэтаноламина NF, 400 г раствора лактата натрия USP, 60%, 842 г очищенной воды (помеченной как очищенная вода для фазы С) и 80 г молочной кислоты USP было взвешено. Эти предварительно взвешенные ингредиенты фазы С были затем добавлены в 2-л SS стакан для следующей процедуры: (1) 260 г триэтаноламина, (2) 400 г раствора лактата натрия, 60%, (3) 842 г очищенной воды USP для фазы С и (4) 80 г молочной кислоты USP. Следует заметить, что предсмесь следует использовать в течение 24 ч. Содержимое контейнера фазы С затем было вручную смешано лопаточкой до достижения прозрачности и однородности. Контейнер фазы С был закрыт и отставлен для позднейшего использования.
Для приготовления фазы Е 1500 г CoQ10 21% концентрата было взвешено и помещено в контейнер для фазы Е и отставлено для позднейшего использования.
Для приготовления 20 кг партии CoQ10 крема 1,5% были подготовлены 2 водяные бани. Стакан фазы А был помещен на водяную баню при 70-75 °C и содержимое было вручную смешано лопаточкой до достижения прозрачности и однородности. Стакан фазы С был затем помещен на водяную баню при 6065°C и содержимое стакана фазы С было вручную смешано лопаточкой до достижения прозрачности и однородности. Подобным образом стакан фазы Е был помещен на водяную баню при 50-55°C. Содержи- 113 034552 мое контейнера фазы Е было вручную смешано лопаточкой до достижения прозрачности и однородности.
Дополнительное использованное оборудование включало водяную баню (Е-1), закрытую вакуумную емкость (PK-2), насос Waukesha (P-1) и ножевую головку для гомогенизатора Сильверсона.
Вначале убедились, что нижний вентиль PK-2 закрыт и что PK-2 должным образом закрыт. Смотровое стекло было затем убрано. Предварительно взвешенные 10000 г 2,0% дисперсии карбомера были затем добавлены в PK-2 через отверстие в смотровом стекле. Лопаточка использовалась для переноса 2,0% карбомера дисперсии со стенок контейнера. TIC-2 (указатель температуры) для PK-2 был затем включен для гарантии правильности операции. Смеситель для PK-2 (А-2) затем был включен и 2,0% дисперсия карбомера в PK-2 нагревалась с паровой рубашкой до 70-80°С. Вакуум был выключен. Смотровое стекло затем было вынуто из PK-2 и фаза В из SS стакана была медленно добавлена в PK-2 через отверстие смотрового стекла. Контейнер фазы В затем был промыт водой для промывки фазы В. Промывочная вода была добавлена в PK-2 через отверстие смотрового стекла. Фаза А была затем медленно добавлена к PK-2. Лопаточка использовалась для переноса фазы А со стенок контейнера в SS стакан. Надо заметить, что температура фазы А должна быть между 70-80°С при добавлении к PK-2. Нижний вентиль PK-2 затем был открыт. Р-1 (насос Waukesha) и Р-2 (гомогенизатор Сильверсона) были включены и содержимое PK-2 (вакуумная емкость) были гомогенизированы. Фаза С была медленно добавлена в PK-2 через отверстие для доступа. Надо заметить, что температура должна быть между 70-80°С при добавлении к PK-2. Затем удостоверились, что гомогенизатор работал более 5 мин, прежде чем А-2 (смеситель) был выключен. Предварительно взвешенные 200,0 г диоксида титана фазы затем были медленно засыпаны через 100 ячеечное сито в PK-2. Лопаточка использовалась для того чтобы убрать весь диоксид титана, который налип на лопасти PK-2.
Смотровое стекло затем было вынуто и включен А-2. Содержимое продолжало перемешиваться во время рециркулирования через Р-1 (насос Waukesha) и Р-2. Содержимое было гомогенизировано в течение 10 мин или до достижения полной однородности (проверка цвета). Р-2 был остановлен через 10 мин. Содержимое PK-2 было охлаждено до 50-60°С. Смотровое стекло было вынуто и расплавленный CoQ10 21% концентрат (фаза Е, как в Примере 7А) был медленно добавлен к PK-2. Смотровое стекло затем было помещено обратно.
Содержимое PK-2 было смешано до достижения однородности и рециркулировано Р-1. Температура поддерживалась на уровне 50-60°С. Начали пропускание потока азота NF и затем С-2 (вакуумный насос) был включен. Следует заметить, что лучше избежать образования пены продукта. Партия затем была охлаждена до 45-50°С и были включены вакуум и азот NF. Когда продукт охладили до нужной температуры, С-2 был выключен и вакуум и азот NF были ослаблены. Поток азота NF закончился. Выпускной вентиль затем был очищен от продукта перед тем как собрать пробы или упаковать продукт. Продукт был перенесен в предварительно взвешенные, чистые, ПЭНД закрытые контейнеры. А-2, Р-1 и поток азота NF были выключены и партия была закончена и помечена как TIC-2.
Было взято две 30 г (минимум) проб для микротеста и два образца по 400 г (минимум) для физического/химического анализа. Одна серия образцов была помечена как взято. Наполненные контейнеры были взвешены. Размер партии составлял 20000 г.
Пример 32. Способ приготовления 18 кг партии дисперсии карбомера 2%.
кг композиции партии 2,0% дисперсии карбомера было приготовлено путем комбинации фаз АС, как описано ниже. Фаза А включала пропиленгликоль USP 0,50 вес.% и феноксиэтанол NF 5,00 вес.%. Фаза В включала очищенную воду USP 92,50 вес.%, а фаза С включала карбомер 940 NF 2,00 вес.%. Все весовые проценты соответствовали весу полной композиции CoQ10 крема 2%. Проценты и другие детали перечислены в следующей таблице.
Таблица 40
Фаза Торговое название CTFA Название Процент Количе ство (кг)
А Феноксиэтанол Феноксиэтано л 5,00 ОД
А Пропиленгликоль Пропиленгли коль 0,500 0,09
В Очищенная вода, Очищенная 92,500 16,65
- 114 034552
USP вода
С Acritamer 940 Карбомер 940 NF 2,000 0,3600
Всего 100,000 18,00
В соответствующем контейнере ингредиенты фазы А были смешаны до достижения прозрачности и однородности. Во второй контейнер (емкость для смешивания) была добавлена очищенная вода фазы В. Порция очищенной воды (вода для промывки) была оставлена для промывания контейнера фазы А. Вода во втором контейнере была нагрета до температуры между 60 и 65°C. Ингредиенты фазы А были добавлены к воде фазы В и вода для промывания использовалась для промывания контейнера фазы А. Содержимое контейнера фазы А затем было смешано до достижения прозрачности и однородности. Скорость миксера была повышена во время медленного добавления (засыпания) карбомера 940 фазы С в емкость для смешивания. Смешивание продолжалось, пока весь порошок не был полностью дисперсирован и не было присутствия рыбьих глаз. Температура поддерживалась между 60 и 65°C. Содержимое затем было перенесено в соответствующий контейнер для хранения.
Пример 33. Способ приготовления 3 кг партии дисперсии карбомера 2%.
кг композиции партии 2,0% дисперсии карбомера было приготовлено путем комбинации фаз А-С, как описано ниже. Фаза А включала пропиленгликоль USP 5,00 вес.% и феноксиэтанол NF 0,50 вес.%. Фаза В включала очищенную воду USP 92,50 вес.%, а фаза С включала карбомер 940 NF 2,00 вес.%. Все весовые проценты соответствовали весу полной композиции CoQ10 крема 2%. Проценты и другие детали перечислены в следующей таблице.
Таблица 41
Фаза Торговое название CTFA Название Процент Количе ство (кг)
А Феноксиэтанол Феноксиэтано 0,500 0,0150
л
А Пропиленгликоль Пропиленгли коль 5,000 0,1500
В Очищенная вода, USP Вода 92,500 2,7750
С Acritamer 940 Карбомер 940 2,000 0,0600
Всего 100,000 3,0000
Все оборудование было чистым и продезинфицированным. На лабораторном столе ингредиенты фазы А были смешаны до достижения прозрачности и однородности. Требуемое количество воды было взвешено и добавлено к выпарному аппарату PK-1 (резервуар фазы). Вода в PK-1 была нагрета с паровой рубашкой до 60-65°C. Фаза А была добавлена к фазе В при среднем смешивании до достижения прозрачности и однородности. Контейнер с фазой А был промыт соответствующей водой при поддержании температуры 60-65°C. Смешивание продолжалось при средней-высокой скорости, пока весь порошок не был полностью дисперсирован и не было присутствия рыбьих глаз. Из содержимого были взяты микро пробы на качество, рН, удельную плотность и вязкость. Партия затем была отобрана насосом в чистую и продезинфицированный 5-галлоновую закрытую бутыль, рН, удельная плотность и вязкость соответствовали спецификациям.
Пример 34. Способ приготовления 18 кг партии дисперсии карбомера 2%.
кг партии дисперсии карбомера 2,0% было приготовлено путем комбинации фаз А-С. Фаза А включала феноксиэтанол NF 0,50 вес.%, пропиленгликоль USP 5,00 вес.%, очищенную воду USP 92,50 вес.% и включала карбомер 940 NF 2,00 вес.%.
- 115 034552
Таблица 42
RM
Теоретическое
Фаза
Номер
Название сырья количество
% по весу GMS
А RM-013 Феноксиэтанол NF 0,500 90,0
А RM-021 Пропиленгликоль USP 5,000 900
В RM-011 Очищенная вода USP 92,500 16650
С RM-004 Карбомер 940 NF 2,000 360
Всего 100,000 18000
Оборудование, использованное в приготовлении этой партии, включало весы Sartorius, весы Mettler, регистрирующее устройство, закрытую фазовую емкость и 2-л стакан из нержавеющей стали (SS).
Перед взвешиванием ингредиентов рабочая зона была вымыта и проверена. Все оборудование было тщательно очищено, проверено и откалибровано. Калибровка весов была проверена и записана. Контейнеры для взвешивания были взвешены для избежания разбрызгивания во время взвешивания. Вначале 1650 г очищенной воды было взвешено и помещено в контейнер, помеченный вода для промывки. Другие 15000 г очищенной воды также были взвешены. 360 г карбомера 940 NF также были взвешены.
Фаза А была приготовлена путем взвешивания 90 г феноксиэтанола в стакан. 900 г пропиленгликоля USP затем было взвешено в 2-л SS стакан. Предварительно взвешенный феноксиэтанол NF был затем добавлен в 2-л SS стакан, содержащий предварительно взвешенный пропиленгликоль. Остаток феноксиэтанола, остававшийся в стакане, был смыт приблизительно 1/3 воды для промывки. Контейнер был затем помечен как фаза А. Следует заметить, что предварительная смесь должна быть использована в течение 24 ч.
Фаза А была смешана лопаточкой до достижения прозрачности и однородности. Лопаточка была затем промыта 1/3 воды для промывки.
После приготовления фазы А дисперсия была смешана с использованием закрытой фазовой емкости (PK-1). Должным образом помеченное устройство было помещено в TIC-1 (температурный регистратор). TIC-1 (Honeywell Temperature Recorder) был включен и обеспечил правильную работу. После проверки, что нижний клапан PK-1 закрыт, предварительно взвешанная очищенная вода USP была добавлена к PK-1. SS стакан был промыт в PK-1 с оставшейся водой для промывки.
Смеситель был включен на среднюю мощность и содержимое PK-1 было нагрето с паровой рубашкой до 60-65°C. Подходящие диапазоны также включают 55-70°С. Смеситель был поставлен на самую быструю скорость, не вызывавшую разбрызгивания. Предварительно взвешенный карбомер 940 NF был равномерно засыпан через 50 ячеечное сито в PK-1 за период времени не менее 15 мин, но не более 20 мин. Температура поддерживалась на уровне 60-65°C, однако подходящий диапазон составляет 55-70°С. Смеситель затем был включен на более быструю скорость. Смешивание продолжалось не менее 1 ч при быстрой работе смесителя, пока весь порошок не стал дисперсным и не было присутствия рыбьих глаз. Лопаточка была использована для того, чтобы дисперсировать весь порошок, который налип на лопасти вортекса.
Было взято две 30 г пробы для микротеста и два образца по 400 г (для физического/химического анализа. Одна серия образцов была помечена как взято. Продукт был перенесен в чистые, HDPE закрытые контейнеры. Размер партии составлял 18000 г.
Пример 35. Способ приготовления CoQ10 крема 3%, который включает CoQ10 21% концентрат и алкилбензоат.
Композиция CoQ10 крема 3% была приготовлена путем комбинации следующих фаз. Фаза А включала алкил С12-15 бензоат NF 4,00 вес.%, цетиловый спирт 2,00 вес.%, глицерина стеарат/ПЭГ-100 4,50 вес.% и стеариловый спирт NF 1,5 вес.%. Проценты, количество и другие детали перечислены в следующей таблице.
Таблица 43
Фаза Торговое название CTFA Название Процент
А RITAMOLLIENT TN С12-15 алкилбензоат 4,000
А Rita СА Цетиловый спирт 2,000
А Rita SA Стеариловый спирт 1,500
- 116 034552
Фаза В включала диэтиленгликоля моноэфир NF 5,00 вес.%, глицерин USP 2,00 вес.%, пропиленгликоль USP 1,50 вес.%, феноксиэтанол NF 0,475 вес.%, очищенную воду USP 16,725 вес.% и 2% дисперсию карбомера 40,00 вес.%. Проценты, количество и другие детали перечислены в следующей таблице.
Таблица 44
А Ritapro 165 Глицерина стеарат и ПЭГ-100 стеарат 4,500
Фаза Торговое название CTFA Название Процент
В RITA Глицерин Глицерин 2,000
В Пропиленгликоль Пропиленгликоль 1,500
В Transcutol Р Этоксидигликоль 5,000
В Феноксиэтанол Феноксиэтанол 0,475
В Acritamer 940, 2% дисперсия Вода, феноксиэтанол, пропиленгликоль, карбомер 940 40,000
В Очищенная вода, USP вода 16,725
Фаза С включала молочную кислоту USP 0,50 вес.%, раствор лактата натрия USP 2,00 вес.%, троламин NF 1,30 вес.% и очищенную воду USP 2,50 вес.%. Проценты, количество и другие детали перечислены в следующей таблице.
Таблица 45
Фаза Торговое название CTFA Название Процент
С Tealan 99% Триэтаноламин 1,300
С Ritalac LA Молочная кислота 0,500
С Ritalac NAL Лактат натрия, вода 2,000
С Очищенная вода, USP Вода 2,500
Фаза D включала диоксид титана USP 1,00 вес.%, а фаза Е включала CoQ10 21% концентрат 15 вес.%. Проценты, количество и другие детали перечислены в следующей таблице.
Таблица 46
Фаза Торговое название СТЕА Название Процент
D Диоксид титана, #3328 ДИОКСИД ТИТАНА 1,000
Е CoQlO концентрация 21% Пропиленгликоль, полисорбат 80, убихинон, вода, феноксиэтанол 15
Все весовые проценты соответствовали весу полной композиции CoQ10 крема 3%.
Ингредиенты фазы А были добавлены в соответствующий контейнер и нагреты до температуры между 70 и 80°С на водяной бане. Ингредиенты фазы В, за исключением дисперсии карбомера, были добавлены в PK-2 выпарной аппарат и смешаны на средней скорости при нагреве между 70 и 80°С. Ингредиенты фазы С были добавлены в соответствующий контейнер и нагреты до температуры между 70 и 80°С на водяной бане. Концентрат CoQ10 фазы Е был добавлен в соответствующий контейнер и расплавлен при температуре между 50 и 60°С с использованием водяной бани, при смешивании, необходимом для достижения однородности. Дисперсия карбомера была добавлена в соответствующий контейнер (емкость для смешивания) и нагрета до температуры между 70 и 80°С во время смешивания. Продолжая смешивание, ингредиенты фазы В были добавлены к нагретой дисперсии карбомера в емкость для смешивания, температура при этом поддерживалась. Содержимое емкости постоянно перемешивалось и гомогенезировалось. Миксер затем был выключен, но гомогенизация продолжалась, пока ингредиенты фазы D добавлялись к емкости для смешивания. Миксер был затем включен и ингредиенты смешивались и гомогенизировались до достижения полной однородности (проверка по цвету). Гомогенизатор затем был остановлен и партия была охлаждена при температуре между 50 и 60°С. Миксер был затем выклю- 117 034552 чен и расплавленный концентрат CoQ10 был добавлен к емкости для смешивания. Миксер был затем включен, и содержимое смешивалось/рециркулировало, пока дисперсия не стала ровной и однородной.
Содержимое емкости для смешивания затем было охлаждено при температуре между 45 и 50°С. Охлажденное содержимое затем было перенесено в соответствующий контейнер для хранения перед упаковкой.
Пример 36. Способ приготовления 0,5 кг CoQ10 крема 3%, который включает CoQ10 21% концентрат и алкилбензоат.
0,5 кг партии CoQ10 крема 3,0% было приготовлено путем комбинации следующих фаз. Фаза А включала алкил C12-15 бензоат NF 4,00 вес.%, цетиловый спирт 2,00 вес.%, глицерина стеарат/ПЭГ-100 4,50 вес.% и стеариловый спирт NF 1,5 вес.%. Проценты, количество и другие детали перечислены в следующей таблице.
Таблица 47
Фаза Торговое название CTFA Название Процент Количество (кг)
А Caprylic C12-15 алкил бензоат 4,000 0,0200
А Rita СА Цетиловый спирт 2,000 0,0100
А Rita SA Стеариловый спирт 1,500 0,0075
А Ritapro 165 Глицерина стеарат и ПЭГ-100 стеарат 4,500 0,0225
Фаза В включала диэтиленгликоля моноэфир NF 5,00 вес.%, глицерин USP 2,00 вес.%, пропиленгликоль USP 1,50 вес.%, феноксиэтанол NF 0,475 вес.%, очищенную воду USP 16,725 вес.% и 2% дисперсию карбомера 40,00 вес.%. Проценты, количество и другие детали перечислены для соответствующей фазы в таблице ниже.
Таблица 48
Фаза Торговое название CTFA Название Процент Количеств о (кг)
В Rita глицерин Глицерин 2,000 0,0100
В Пропиленгликоль Пропиленгликоль 1,500 0,0075
В Transcutol Р Этоксидигликоль 5,000 0,0250
В Феноксиэтанол Феноксиэтанол 0,475 0,0024
В Acritamer 940, 2% дисперсия Вода, феноксиэтанол, пропилен гликоль, карбомер 940 40,000 0,2000
В Очищенная вода, USP Вода 16,725 0,0836
Фаза С включала молочную кислоту USP 0,50 вес.%, раствор лактата натрия USP 2,00 вес.%, троламин NF 1,30 вес.% и очищенную воду USP 2,50 вес.%. Проценты, количество и другие детали перечислены в следующей таблице.
Таблица 49
Фаза Торговое название CTFA Название Процент Количество (кг)
С Tealan 99% Триэтаноламин 1,300 0,0065
С Ritalac LA Молочная кислота 0,500 0,0025
С Ritalac NAL Лактат натрия, вода 2,000 0,0100
С Очищенная вода, USP Вода 2,500 0,0125
Фаза D включала диоксид титана USP 1,00 вес.%, а фаза Е включала CoQ10 21% концентрат 15 вес.%. Проценты, количество и другие детали перечислены в следующей таблице.
- 118 034552
Таблица 50
Фазы Торговое название СТЕА Название Процент Количество (кг)
D Диоксид титана, #3328 Диоксид титана 1,000 0,0050
Е CoQlO 21% концентрат Пропиленгликоль, полисорбат 80, вода, убихинон, лецитин, феноксиэтанол 15,000 0,0750
Все весовые проценты соответствовали весу полной композиции CoQ10 крема 3%.
Ингредиенты фазы А были добавлены в соответствующий контейнер и нагреты до температуры между 70 и 80°С на водяной бане. Ингредиенты фазы В, за исключением дисперсии карбомера, были добавлены в соответствующий контейнер и смешаны. Ингредиенты фазы С были добавлены в соответствующий контейнер и нагреты до температуры между 70 и 80°С на водяной бане. Концентрат CoQ10 21% фазы Е был добавлен в соответствующий контейнер и расплавлен при температуре между 50 и 60°С с использованием водяной бани. Ингредиенты смешивались при необходимости для достижения однородности. Дисперсия карбомера была добавлена в соответствующий контейнер (емкость для смешивания) и нагрета до температуры между 70 и 80°С во время смешивания. Продолжая смешивание, ингредиенты фазы В были добавлены к нагретой дисперсии карбомера в емкость для смешивания, температура при этом поддерживалась. Содержимое емкости постоянно перемешивалось и гомогенезировалось. Миксер затем был выключен, но гомогенизация продолжалась. Пока гомогенизация продолжалась, диоксид титана фазы D добавлялся к емкости для смешивания. Миксер был затем включен и ингредиенты смешивались и гомогенизировались до достижения полной однородности (проверка по цвету). Гомогенизатор затем был остановлен и партия была охлаждена при температуре между 50 и 60°С. Миксер был затем выключен и расплавленный концентрат CoQ10 21% был добавлен к емкости для смешивания. Миксер был затем впоследствии включен и содержимое смешивалось/рециркулировало, пока дисперсия не стала ровной и однородной. Содержимое емкости для смешивания затем было охлаждено при температуре между 45 и 50°С. Охлажденное содержимое затем было перенесено в соответствующий контейнер для хранения перед упаковкой.
Пример 37. Способ приготовления 0,5 кг CoQ10 крема 3%, который включает CoQ10 21% концентрат и каприновый/каприлиновый триглицерид.
0,5 кг партии CoQ10 крема 3,0% было приготовлено путем комбинации следующих фаз. Фаза А включала каприлиновый/каприновый триглицерид 4,00 вес.%, цетиловый спирт 2,00 вес.%, глицерина стеарат/ПЭГ-100 4,50 вес.% и стеариловый спирт NF 1,5 вес.%. Проценты и количества перечислены в следующей таблице.
Таблица 51
Фаза Торговое название СТЕА Название Процент Количество (кг)
А Caprylic Каприновый триглицерид 4,000 0,0200
А Rita СА Цетиловый спирт 2,000 0,0100
А Rita SA Стеариловый спирт 1,500 0,0075
А Ritapro 165 Глицерина стеарат и ПЭГ-100 стеарат 4,500 0,0225
Фаза В включала диэтиленгликоля моноэфир NF 5,00 вес.%, глицерин USP 2,00 вес.%, пропиленгликоль USP 1,50 вес.%, феноксиэтанол NF 0,475 вес.%, очищенную воду USP 16,725 вес.% и 2% дисперсию карбомера 40,00 вес.%. Проценты и количества перечислены в следующей таблице.
- 119 034552
Таблица 52
Фаза Торговое название CTFA Название Процент Количеств о (кг)
В Rita глицерин Глицерин 2,000 0,0100
В Пропиленгликоль Пропиленгликоль 1,500 0,0075
В Transcutol Р Этоксидигликоль 5,000 0,0250
В Феноксиэтанол Феноксиэтанол 0,475 0,0024
В Acritamer 940, 2% дисперсия Вода, феноксиэтанол, пропилен гликоль, карбомер 940 40,000 0,2000
В Очищенная вода, USP ВОДА 16,725 0,0836
Фазы С включала молочную кислоту USP 0,50 вес.%, раствор лактата натрия USP 2,00 вес.%, триэтаноламин NF 1,30 вес.% и очищенную воду USP 2,50 вес.%. Проценты, количества и другие детали перечислены в следующей таблице.
Таблица 53
Фаза Торговое название CTFA Название Процент Количество (кг)
С Tealan 99% Триэтаноламин 1,300 0,0065
С Ritalac LA Молочная кислота 0,500 0,0025
С Ritalac NAL Лактат натрия, вода 2,000 0,0100
С Очищенная вода, USP Вода 2,500 0,0125
Фаза D включала диоксид титана USP 1,00 вес.%, а фаза Е включала CoQ10 21% концентрат 15 вес.%. Проценты, количества и другие детали перечислены в следующих таблицах.
Таблица 54
Фазы Торговое название CTFA Название Процент Количество (кг)
D Диоксид титана, #3328 ДИОКСИД ТИТАНА 1,000 0,0050
Е CoQlO 21% концентрат Пропиленгликоль, полисорбат 80, вода, убихинон, лецитин, феноксиэтанол 15,000 0,0750
Все весовые проценты соответствовали весу полной композиции CoQ10 крема 3%.
Ингредиенты фазы А были добавлены в соответствующий контейнер и нагреты до температуры между 70 и 80°С на водяной бане. Ингредиенты фазы В, за исключением дисперсии карбомера, были добавлены в соответствующий контейнер и смешаны. Ингредиенты фазы С были добавлены в соответствующий контейнер и нагреты до температуры между 70 и 80°С на водяной бане. Концентрат CoQ10 21% фазы Е был добавлен в соответствующий контейнер и расплавлен при температуре между 50 и 60°С с использованием водяной бани. Ингредиенты смешивались при необходимости для достижения однородности. Дисперсия карбомера была добавлена в соответствующий контейнер (емкость для смешивания) и нагрета до температуры между 70 и 80°С во время смешивания. Продолжая смешивание, ингредиенты фазы В были добавлены к нагретой дисперсии карбомера в емкость для смешивания, температура при этом поддерживалась. Содержимое емкости постоянно перемешивалось и гомогенезировалось. Миксер затем был выключен, но гомогенизация продолжалась. Пока гомогенизация продолжалась, диоксид титана фазы D добавлялся к емкости для смешивания. Миксер был затем включен и ингредиенты смешивались и гомогенизировались до достижения полной однородности (проверка по цвету). Гомогенизатор затем был остановлен и партия была охлаждена при температуре между 50 и 60°С. Миксер был затем выключен и расплавленный концентрат CoQ10 21% был добавлен к емкости для смешивания. Миксер был затем впоследствии включен и содержимое смешивалось/рециркулировало, пока дисперсия не стала ровной и однородной. Содержимое емкости для смешивания затем было охлаждено при температуре между 45 и 50°С. Охлажденное содержимое затем было перенесено в соответствующий контейнер для хранения перед упаковкой.
Пример 38. Способ приготовления 20 кг CoQ10 крема 3%, который включает CoQ10 21% концентрат и каприновый/каприлиновый триглицерид.
кг партии CoQ10 крема 3,0% было приготовлено путем комбинации ингредиентов фаз А-Е. Ве- 120 034552 совые проценты, количества и другие детали ингредиентов каждой фазы перечислены в следующей таблице.
Таблица 55
Фаза RM Number Название сырья Теоретиче количеств % по весу ское о г
А RM-026 RM-026: Каприновый/каприлиновый триглицерид 4,000 800,0
А RM-003 RM-003: Цетиловый спирт 2,000 400,0
NF
А RM-005 RM-005: Стерариловывй спирт NF 1,500 300,0
А RM-016 RM-016: Глицерина стеарат /ПЭГ-100 Стеарат 4,500 900,0
В RM-001 RM-001: Глицерин USP 2,000 400,0
В RM-021 RM-021: Пропиленгликоль USP 1,500 300,0
В RM-007 RM-007: Диэтиленгликоля моноэтиловый эфир NF 5,000 1000,0
в RM-013 RM-013: Феноксиэтанол NF 0,475 95,0
в IP-003 IP-003: Карбомера дисперсия, 2% 40,000 8000,0
в RM-011 RM-011: Очищенная вода USP 13,725 2745,0
в RM-011 RM-011: Очищенная вода USP (для промывки) 3,000 600,0
с RM-009 RM-009: ТроламинМР 1,300 260,0
с RM-006 RM-006: Молочная кислота USP 0,500 100,0
с RM-012 RM-012: Раствор лактата натрия USP, 60% 2,000 400,0
с RM-011 RM-011: Очищенная вода USP 2,500 500,0
D RM-008 RM-008: Диоксид титана USP 1,000 200,0
Е IP-004 IP-004: CoQlO концентрат, 21% 15,000 3000,0
Всего 100,00 20000,0
Для очистки РК-2 (Вакуумная емкость)
RM-019 or RM- 020 Азот 97% NF или AsotNF необх. кол-во необх. кол-во
Для приготовления 20 кг партии CoQ10 крема 3% использовались следующие процедуры. Перед взвешиванием химических ингредиентов с особой тщательностью убедились в том, что место работы и все оборудование чистое. Вначале химические ингредиенты были взвешены, особенно тщательно избегая разбрызгивания.
Вначале было взвешено 200 г диоксида титана USP (фаза D). Затем 600 г очищенной воды (помеченной вода для промывки - фаза В) было взвешено.
Для приготовления фазы А 800 г капринового/каприлинового триглицерида, 400 г цетилового спирта NF, 300 г стеарилового спирта NF, 900 г глицерина стеарата/ПЭГ-100 стеарата было взвешено. Эти предварительно взвешенные ингредиенты фазы А были добавлены к 4-л SS стакану и помечены как фаза А. Следует отметить, что предсмесь следует использовать в течение 24 ч. Контейнер фазы А затем был закрыт и отставлен для позднейшего использования.
- 121 034552
Для приготовления фазы В 8000 г 2,0% дисперсии карбомера, 400 г глицерина USP, 300 г пропиленгликоля, 1000 г диэтиленгликоля моноэтилового эфира NF, 95 г феноксиэтанола NF и 2,745 г очищенной воды USP (помеченной очищенная вода для фазы В) были взвешены. Эти предварительно взвешенные ингредиенты фазы В затем были добавлены в 10-л SS стакан. Следует отметить, что предсмесь следует использовать в течение 24 ч. Содержимое контейнера фазы В было вручную смешано лопаточкой до достижения прозрачности и однородности. Контейнер фазы В затем был закрыт и отставлен для позднейшего использования.
Для приготовления фазы С 260 г триэтаноламина NF, 400 г раствора лактата натрия USP, 60% 500 г очищенной воды (помеченной очищенная вода для фазы С) и 100 г молочной кислоты USP было взвешено. Эти ингредиенты фазы С были затем добавлены к 2-л SS стакану в следующем порядке: (1) 260 г троламина, (2) 400 г раствора лактата натрия, 60%, (3) 500 г очищенной воды для фазы С и (4) 100 г молочной кислоты USP. Контейнер был помечен как фаза С. Следует отметить, что предсмесь следует использовать в течение 24 ч. Содержимое контейнера фазы С было вручную смешано лопаточкой до достижения прозрачности и однородности. Контейнер фазы С затем был закрыт и отставлен для позднейшего использования.
Для приготовления фазы Е 3000 г CoQ10 21% концентрата было взвешено и помещено в контейнер, помеченный фаза Е. Контейнер фазы С затем был закрыт и отставлен для позднейшего использования.
Для составления смеси CoQ10 крема 3% 2 водяные бани были использованы для нагрева фаз А, С и Е. Во-первых, фазы А стакан был помещен на водяную баню при 70-75°C и содержимое смешивалось вручную лопаточкой до достижения прозрачности и однородности. Стакан фазы С был помещен на водяную баню при 60-65 °C. Содержимое стакана фазы С смешивалось вручную лопаточкой до достижения прозрачности и однородности. Стакан фазы Е был помещен на водяную баню при температуре 50-55°C. Содержимое стакана фазы Е смешивалось вручную лопаточкой до достижения прозрачности и однородности.
Для составления крема были использованы водяная баня (Е-1), закрытая вакуумная емкость (PK-2), Waukesha насос (Р-1) и гомогенизатор Сильверсона.
Вначале убедились, что нижний вентиль PK-2 закрыт и что PK-2 закрыт. Смотровое стекло затем было вынуто из PK-2 и предварительно взвешенные 10000 г 2,0% дисперсии карбомера были добавлены в PK-2 емкость через отверстие смотрового стекла. Для удаления дисперсии карбомера 2%, который налип на лопасти мешалки во время добавления, использовалась лопаточка. TIC-2 (регистратор температуры) для PK-2 затем был включен, и убедились, что регистратор работает правильно.
Смеситель (А-2) для PK-2 был включен и 2,0% дисперсия карбомера нагревалась с паровой рубашкой до 70-80°С. Смотровое стекло затем было вынуто из PK-2 и фаза В медленно добавлялась из SS стакана в PK-2, через отверстие смотрового стекла. Контейнер фазы В затем был промыт водой для промывки фазы В. Эта промывка затем была добавлена к PK-2 через отверстие смотрового стекла.
Фаза А затем была медленно добавлена к PK-2. Лопаточка использовалась для переноса фазы А, оставшейся на стенках SS стакана. Следует заметить, что температура фазы А должна быть между 70-80°С при добавлении к PK-2.
Вначале убедились, что нижний вентиль PK-2 закрыт и что PK-2 должным образом закрыт. Смотровое стекло было затем убрано. Предварительно взвешенные 10000 г 2,0% дисперсии карбомера были затем добавлены в PK-2 через отверстие в смотровом стекле. Лопаточка использовалась для переноса 2,0% дисперсии карбомера со стенок контейнера. The TIC-2 (указатель температуры) для PK-2 был затем включен для гарантии правильности операции. Смеситель для PK-2 (А-2) затем был включен и 2,0% дисперсия карбомера в PK-2 нагревалась с паровой рубашкой до 70-80°С. Вакуум был выключен. Смотровое стекло затем было вынуто из PK-2 и фаза В, из SS стакана, была медленно добавлена в PK-2 через отверстие смотрового стекла. Контейнер фазы В затем был промыт водой для промывки фазы В. Промывочная вода была добавлена в PK-2 через отверстие смотрового стекла. Фаза А была затем медленно добавлена к PK-2. Лопаточка использовалась для переноса фазы А со стенок контейнера в SS стакан. Надо заметить, что температура фазы А должна быть между 70-80°С при добавлении к PK-2. Нижний вентиль PK-2 затем был открыт. Р-1 (насос Waukesha) и Р-2 (гомогенизатор Сильверсона) были включены и содержимое PK-2 (вакуумная емкость) были гомогенизированы. Фаза С была медленно добавлена в PK-2 через отверстие для доступа. Надо заметить, что температура должна быть между 70-80°С при добавлении к PK-2. Затем удостоверились, что гомогенизатор работал более 5 мин, прежде чем А-2 (смеситель) был выключен. Предварительно взвешенные 200,0 г диоксида титана фазы затем были медленно засыпаны через 100 ячеечное сито в PK-2. Лопаточка использовалась для того чтобы убрать весь диоксид титана, который налип на лопасти PK-2.
Нижний вентиль PK-2 затем был открыт и Р-1 насос и Р-2 (гомогенизатор Сильверсона) были включены. Содержимое PK-2 было гомогенизировано.
Фаза С была медленно добавлена в PK-2 через отверстие для доступа. Надо заметить, что температура должна быть между 70-80°С при добавлении к PK-2. Затем удостоверились, что гомогенизатор работал более 5 мин, прежде чем смеситель А-2 был выключен. Предварительно взвешенные 200 г диокси- 122 034552 да титана USP затем были медленно засыпаны через 100 ячеечное сито в PK-2. Лопаточка использовалась для того чтобы убрать весь диоксид титана, который налип на лопасти PK-2.
Смотровое стекло затем было вынуто и А-2 включен. Содержимое продолжало перемешиваться во время рециркулирования через Р-1 и Р-2. Гомогенизация продолжалась 10 мин или до достижения полной однородности (проверка цвета). Р-2 был остановлен через 10 мин. Содержимое PK-2 было охлаждено до 50-60°С. Смотровое стекло было вынуто и расплавленный CoQ10 21% концентрат фазы Е был медленно добавлен к PK-2. Смотровое стекло затем было помещено обратно.
Содержимое PK-2 было смешано с А-2 до достижения однородности. Температура поддерживалась на уровне 50-60°С и содержимое рециркулировало сквозь Р-1. Был начат поток азота NF и затем С-2 (вакуумный насос) был включен. Следует заметить, что лучше избежать образования пены продукта. Партия затем была охлаждена до 45-50°С и вакуум и азот NF были включены. Когда продукт охладили до нужной температуры, С-2 (вакуумный насос) был выключен и вакуум и азот NF ослабились. Поток азота NF закончился. Выпускной вентиль затем был очищен от продукта перед тем, как собрать пробы или упаковать продукт.
Продукт был перенесен в предварительно взвешенные, чистые, ПЭНД закрытые контейнеры. Насос А-2, Р-1 Waukesha и поток азота NF были выключены и партия была закончена и помечена как TIC-2.
Было взято две 30 г (минимум) проб для микротеста и два образца по 400 г (минимум) для физического/химического анализа. Одна серия образцов была помечена как взято. Наполненные контейнеры были взвешены. Размер партии составлял 20000 г.
Пример 39. Способ лечения SCCIS местным применением CoQ10 крема 3%.
Композиция CoQ10 крема 3,0%, как описано выше (например, примеры 15 и 16), была местно применена к in situ кожным плоскоклеточным карциномам (SCCIS). 35 субъектов подверглись местному лечению медикаментом на основе 3,0% CoQ10 вода-в-масле эмульсионного крема. Медикамент был упакован и хранился при комнатной температуре в защищенных от света контейнерах.
Анализы выборки были определены как (1) выбранная для лечения (ITT) выборка, (2) безопасная выборка и (3) протокольная (РР) выборка. ITT выборка включала всех субъектов, которые были выбраны для исследования лекарства (CoQ10 3%). Безопасная выборка включала всех субъектов, которые получили по меньшей мере одну дозу изучаемого продукта. РР выборка включала всех субъектов, у которых была SCCIS, подтвержденная гистологическими данными, которые на шестой неделе подверглись гистологическому исследованию и не пропустили ни одного визита.
Субъекты были в других в других отношениях взрослыми мужчинами и женщинами по меньшей мере с одним подтвержденным повреждением SCCIS, не находившемся на лице. Повреждения SCCIS, подходившие для экстирпации, имели минимальную площадь 0,5 см2 и максимальный диаметр 2,0 см и находились на таком месте, которое можно было защитить от солнечных лучей во время исследования. Примерно в одно и то же время каждое утро пациент промывал область повреждения, а затем наносил небольшое количество с горошину (50-100 мг) местного медикамента в виде крема на кусок вощеной бумаги или аппликатор. Пациент затем накладывал подходящее количество крема на повреждение и окружающую область с использованием ватного тампона или аппликаторной палочки. Обработанный участок не мылся по меньшей мере 8 ч после аппликации. Приблизительно в одно и то же время каждый вечер процедура повторялась. Повреждение и окружающая область защищались от солнечных лучей под одеждой.
В первый день лечения измерялся диаметр и подсчитывалась область повреждения. Повреждения также фотографировались. На 1, 2, 3, 4 и 5 неделях субъекты оценивались и делались записи их основных показателей: давление крови, скорость пульса, скорость дыхания, оральная температура. Следующие клинические признаки/симптомы раздражения кожи на основании следующих таблиц также градировались для оценки безопасности лечения CoQ10 3%: эритема, шелушение, сухость, зуд, жжение.
Таблица 56
Эритема
0 Эритема не наблюдается
1 Легкое покраснение, ограниченное маленьким участком
2 Среднее покраснение на большей части обработанного участка
3 Заметное покраснение на большей части обработанного участка
4 Сильное покраснение, наличие отека, возможные изъявления
- 123 034552
Таблица 57
Шелушение
0 Шелушение не наблюдается
1 Слабое отслаивание или отдельные небольшие чешуйки могут наблюдаться на отдельных участках
2 Среднее отслаивание/шелушение. Легко заметные трещины. Края чешуек покрывают большую часть обработанного участка
3 Заметное шелушение, трещины, отслаивание и падающие чешуйки на большей части обработанного участка
4 Присутствуют большие куски отслаивающегося эпидермиса
Таблица 58
Сухость
0 Жирный блеск на большей части обработанного участка
1 Нормальное, нет сухости, нет заметного блеска
2 Легкая сухость, проявляющаяся на маленькой части обработанного участка
3 Средняя сухость, проявляющаяся на большей части обработанного участка
4 Сильная сухость, трещины по всему обработанному участку
Таблица 59
Зуд
0 Нет зуда
1 Временами слабый зуд, не влияющий на повседневную активность
2 Слабый зуд, присутствующий большую часть времени, не влияющий на повседневную активность или сон
3 Средний зуд, временами мешающий повседневной активности или сну
4 Интенсивный зуд, мешающий повседневной активности или сну
Таблица 60
Жжение
0 Нет жжения
1 Временами слабое жжение, не влияющее на повседневную активность
2 Слабое жжение, присутствующее большую часть времени, не влияющее на повседневную активность или сон
3 Среднее жжение, временами мешающее повседневной активности или сну
4 Интенсивное жжение, мешающее повседневной активности или сну
Оценка безопасности по эритеме.
В начале исследования 32 пациента (91,4%) имели определенную степень эритемы. Эти признаки у большинства пациентов были от слабого до среднего (28 пациентов, 80%) и 4 пациента (11,4%) имели заметное (степень 3) покраснение. На 6 неделе эритема отсутствовала у 4 пациентов (11,8%) и была слабой или средней у 30 пациентов (88,2%), тогда как эритема степени 3 не наблюдалась. Максимальная степень эритемы, наблюдавшаяся во время исследования, стала слабее по сравнению с началом исследования у 7 пациентов, не изменилась у 15 пациентов и стала сильнее у 13 пациентов. Конечная степень эритемы уменьшилась по сравнению с началом исследования у 11 пациентов, не изменилась у 22 пациентов и ухудшилась у 2 пациентов.
Оценка безопасности по шелушению: В начале исследования 27 пациентов (77,1%) имели определенную степень шелушения и 8 пациентов (22,9%) не имели. На 6 неделе видимое шелушение отсутствовало у 16 пациентов (47,1%), было легким у 17 пациентов (50%), и было средним только у одного 1 пациента (2,9%). Максимальная степень шелушения, наблюдавшаяся во время исследования, стала слабее по сравнению с началом исследования у 7 пациентов, не изменилась у 20 пациентов и стала сильнее у 8 пациентов. Конечная степень эритемы уменьшилась по сравнению с началом исследования у 16 пациентов, не изменилась у 24 пациентов и ухудшилась у 5 пациентов.
- 124 034552
Оценка безопасности по сухости.
У восьми пациентов (22,9%) имелась легкая или средняя сухость в начале исследования, а 77,1% не имели сухости (степень 1) или жирный блеск (степень 0) на обрабатываемом участке. На 6 неделе у всех пациентов, кроме 1, степень сухости была 0 или 1 (97,1%).
Максимальная степень сухости, наблюдавшаяся во время исследования, стала слабее по сравнению с началом исследования у 7 пациентов, не изменилась у 23 пациентов и стала сильнее у 5 пациентов. Конечная степень сухости уменьшилась по сравнению с началом исследования у 13 пациентов, не изменилась у 21 пациента и ухудшилась у 1 пациента.
Оценка безопасности по зуду.
Большинство пациентов в начале исследования сообщали об отсутствии (74,3%) или о слабом, случайном (20%) зуде, а 2 субъекта (5,7%) сообщили о зуде степени 2 или 3. На 6 неделе зуд стал слабее настолько, что 94,1% не было зуда и только 2 пациента (5,9%) имели слабый, случайный зуд. С недели 1 до недели 6 ни у одного пациента зуд не превышал степень 1 (слабый, случайный зуд). Максимальная степень сухости, наблюдавшаяся во время исследования, стала слабее по сравнению с началом исследования у 5 пациентов, не изменилась у 24 пациентов, и стала сильнее у 6 пациентов. Конечная степень зуда уменьшилась по сравнению с началом исследования у 9 пациентов, не изменилась у 24 пациентов, и ухудшилась у 2 пациентов.
Оценка безопасности по жжению.
В начале исследования жжение отсутствовало у большинства пациентов (94,3%) и было слабым у 2 пациентов (5,7%). Эти значения оставались практически неизменными в ходе исследования. Ни у одного пациента значение не превышало степень 1 (слабую) и только у двух пациентов значение имело степень 1 на каком-либо визите с Дня 1 (начало исследования) до конца недели 6. Максимальная степень жжения, наблюдавшаяся во время исследования, стала слабее по сравнению с началом исследования у 2 пациентов, не изменилась от нет жжения у 28 субъектов, и ухудшилась (от нет до слабой) у 5 субъектов. Конечная степень жжения уменьшилась по сравнению с началом исследования у 2 пациентов, не изменилась у 31 пациента и ухудшилась у 2 пациентов.
Также измерялись диаметры повреждений и определялись размеры участка для оценки эффективности воздействия CoQ10 3%. В конце 6 недели периода лечения был назначен последний визит, где были сделаны измерения основных показателей и установлены клинические признаки/симптомы. Физическое исследование также было осуществлено на 6 неделе в последний визит. На последнем визите были также взяты образцы крови на голодный желудок в течение 3 ч после последней аппликации крема для определения концентрации CoQ10 в плазме. Повреждения были сфотографированы, измерены диаметры и определены размеры участка.
Результаты местного лечения SCCIS CoQ10 кремом 3% показали эффективность, как изображено на фотографиях до и после лечения на фиг. 4-9. Первичным критерием оценки эффективности был процент пациентов с полной реакцией, определенной как негативная гистологическая оценка целевого повреждения на неделе 6. Вторичным критерием оценки эффективности был процент пациентов с частичным ответом, определявшимся как по меньшей мере 50% уменьшение области (определявшейся по двум главным диаметрам) обработанного повреждения на неделе 6. Результаты показали, что 23,5% ITT выборки имели полный ответ на неделе 6, а 18,5% РР выборки имели полный ответ на неделе 6.
Вторичные результаты оценки эффективности показали, что ITT выборка имела 26,5% частичного 50% ответа и 2,9% имела 75% частичного ответа на неделе 6. Частичный ответ наблюдался уже на неделе 1 у 2 пациентов и неделе 2 у 8 пациентов. Самая высокая степень частичного ответа наблюдалась на неделях 4 и 5. Интересно, что у 8 пациентов с полным ответом на неделе 6, 4 пациента не имели частичного ответа, основанного на визуальной инспекции, и ни у кого не было 75% ответа. В РР выборке 22,2% имели 50% частичный ответ, тогда как 0% имели 75% частичный ответ. Среднее изменение и средний процент изменения повреждения были -0,3 см2 и -26,1% соответственно, в ITT выборке на неделе 6 и -0,3 см2 и -23,4% соответственно в РР выборке.
В целом, CoQ10 3% крем был безопасным и хорошо переносимым. Полное излечение было достигнуто у примерно 25% пациентов ITT выборки.
Пример 40. Способ лечения ВСС местным применением CoQ10 крема 3%.
Базальноклеточная карцинома (ВСС) - наиболее распространенная форма кожных злокачественных заболеваний и наиболее распространенная форма рака в Соединенных Штатах. По оценке Американского Общества Рака каждый год диагностируется около 800000 новых случаев базальноклеточной карциномы.
Поверхностная базальноклеточная карцинома (sBCC) редко метастазирует и обычно излечима хирургическим вмешательством или местными агентами.
Композиция CoQ10 крема 3,0%, как описано выше в примерах 35-36, была местно применена к 160 здоровых в других отношениях взрослым мужчинам или женщинам с одним или более гистологически подтвержденными повреждениями, вызванными базальноклеточной карциномой (sBCC). Для лечения выбиралось одно подтверждение с минимальной площадью 0,5 см2 и максимальным диаметром 2,0 см. sBCC повреждение не находилось на лице и его можно было защитить от солнечных лучей во время ис- 125 034552 следования.
Это исследование было рандомизированным, слепым двойным плацебо-контролируемым параллельным исследованием. Каждый субъект был случайным образом распределен в одну из 4 групп: 1,5% CoQ10 крем qd (один раз в день) плюс крем-носитель qd (один раз в день), 3,0% CoQ10 крем qd (один раз в день) плюс крем-носитель qd (один раз в день), 3,0% CoQ10 крем bid (дважды в день) или кремноситель bid (дважды в день). В каждой группе было 40 пациентов.
Таблица 61
AM РМ
1. 3% CoQlO 3% CoQlO
2. Носитель В 3% CoQlO
3. Носитель А* 1,5% CoQlO
4. Носитель А Носитель А
На первом скрининговом визите измерялись диаметры повреждений и определялся размер участка. Участки определялись оценкой двух наибольших перпендикулярных диаметров и умножением для получения результата в см2. Основные показатели субъектов измерялись и записывались и было проведено физическое обследование. Брались образцы крови на голодный желудок и был проведен полный анализ крови (СВС), а также клинический биохимический анализ на липиды. Образцы крови собирались для определения базовых концентраций CoQ10 в плазме, образцы брались дважды и хранились. Также делались анализы мочи и для женщин с возможной беременностью делался тест на беременность по моче. Пациенты затем классифицировались по следующим клиническим признакам/симптомам раздражения кожи: эритема, шелушение, сухость, зуд, жжение.
На первый день исследования (день 1) основные показатели пациентов снова были записаны и клинические признаки/симптомы раздражения кожи были классифицированы как на скрининговом визите. Пациентов также опросили о нежелательных явлениях, параллельном использовании местных продуктов и параллельном использовании медицинских препаратов. Целевые sBCC повреждения были затем сфотографированы и оценены по диаметру и размеру участка, как на скрининговом визите. Пациентам затем дали медицинский набор, содержащий CoQ10 медицинский препарат. CoQ10 крем применялся пациентом дважды в день в течение шести недель к sBCC повреждению и 1 см близлежащей кожи.
Режим дозирования включал в себя промывание поврежденного участка примерно в одно и то же время каждое утро, распределение небольшого количества с горошину (50-100 мг) крема на кусок вощеной бумаги или аппликатор. Субъект затем накладывал подходящее количество крема на повреждение и окружающую область с использованием ватного тампона или аппликаторной палочки. Обработанный участок не мылся по меньшей мере 8 ч после аппликации. Приблизительно в одно и то же время каждый вечер процедура повторялась. Повреждение и окружающая область защищались от солнечных лучей под одеждой.
Были промежуточные визиты пациентов, которые происходили на неделях 1, 2, 3, 4, и 5. На каждом из этих визитов основные показатели записывались, как на первом визите, и клинические признаки/симптомы классифицировались. Диаметр повреждения оценивался и определялся размер участка. Пациентов затем опрашивали о нежелательных явлениях, параллельном использовании местных продуктов и параллельном использовании медицинских препаратов. Клиническая оценка проводилась еженедельно.
В конце периода лечения основные показатели были записаны как на первоначальном визите и клинические признаки/симптомы были градированы. Диаметр повреждения оценивался и определялся размер участка. Также проводилось физическое обследование. Брались образцы крови не более чем через 3 ч после последнего применения крема для определения концентраций CoQ10 в плазме. Был проведен полный анализ крови (СВС) и клинический биохимический анализ на липиды.
На четвертой неделе после лечения (неделя 10 исследования) пациент возвращался для заключительной оценки и экстирпации участка повреждения sBCC. Основные показатели были взяты и записаны и клинические признаки/симптомы, как на первоначальном скрининговом визите, были классифицированы.
Результаты лечения показали после обзора патологии 110 пациентов, что по меньшей мере 20% пациентов, которые получали местное лечение CoQ10 кремом 3%, демонстрировали уменьшение симптомов, как было определено по понятным специалистам критериям эффективности. В частности, у 24 из 110 пациентов не было признаков sBCC на основе биопсии поврежденного участка на 8 неделях.
Пример 41. Фармакокинетические результаты местного воздействия CoQ10.
BALB/c мыши были рандомально разделены на девять групп по восемь мышей в каждой (группы I-IX). Группа I воздействию не подвергалась. В день 0 группы II-VIII были местно обработаны 0,1 г тестируемой композиции (крем масло-в-воде, эмульсия, содержащая 3 вес.% CoQ10, крем с добавлением С-14 радиометки API 31510) в дозе 5 мг/см2. Радиоактивный API 31510 был добавлен в партию 3% кре
- 126 034552 ма, чтобы обогатить экспериментальную формулу крема специфической активностью приблизительно 50 мкКи/г продукта или 5 мкКи/дозу введения. Тестируемая композиция местно наносилась на кожу на спине каждой мыши в группах II-IX стеклянной палочкой. Сразу же после получения дозировки животные группы II были забиты и кровь, моча, фекалии и целевые органы (печень, поджелудочная железа и селезенка) были извлечены и взвешены. Из крови была получена сыворотка и каждый орган был гомогенизирован. Группы III-VIII были забиты на 2, 4, 8, 12, 18 и 24 ч после получения дозировки соответственно, и у них были взяты те же пробы. Группа IX местно обрабатывалась 0,1 г тестируемой композиции в течение семи дней (дни 0-6). На день 7, через 24 ч после последнего применения тестируемой композиции на день 6, группы I и IX были забиты и у них были взяты те же пробы, что и у предыдущих групп. У каждого образца определялось число распадов в 1 мин (DPM) и значение DPM/тип образца считалось для каждой группы.
Оценка основывалась на подсчете уровней радиоактивности в сыворотке, моче, фекалиях и целевых органах (печени, поджелудочной железе и селезенке) на различных временных точках с целью определить уровни подкожного проникновения тестируемого вещества на 24 ч и определить, где лекарство аккумулируется в соответствии со способом применения.
Сводная таблица среднего веса образцов в граммах для каждой группы представлена ниже.
Таблица 62
Поджелудочная железа Печень Селезенка Фекалии Моча Кровь
Группа! 0,2907 1,4468 0,0776 0,0654 Не определяется 0,43 IS
Группа П 0,1691 1,3352 0,0935 0,0164 Не определяется 0,4530
ГруппаШ 0,1300 1,0688 0,1777 0,0324 0,0890 0,4429
ГруппаIV 0,1377 0,9893 0,0846 0,0292 0,0802 0,3770
ГруппаV 0,1780 0,7105 0,0760 0,0299 0,0864 0,3222
Группа VI 0,1156 0,8994 0,0595 0,0328 Не определяется 0,3273
Группа VII 0,2864 1,1312 0,3355 0,0160 0,0671 0,2077
Группа ЛТП 0,1969 1,1929 0,0905 0,0350 0,0097 0,3093
ГруппаIX 0,3068 1,2912 0,0839 0,1034 Не определяется 0,3439
Среднее ОДО 12 1,1184 0,1199 0,041 0,0665 0,3572
Распады в 1 мин (DPM) представлены в табл. 63 и подсчитаны на сцинтилляционном счетчике для каждого типа образца ткани из каждого животного. Средний DPM для каждого типа образца был подсчитан. После того как результаты были приведены к количеству 1 мл, среднее было затем разделено на средний вес органа для того чтобы получить DPM на 1 г ткани. Контрольные (группа I) результаты были затем вычтены из результатов каждой группы для удаления фоновой радиации и получения актуального числа среднего DPM на 1 г ткани для каждого образца в группе. При делении на константу 2220000 результаты были преобразованы в микрокюри на 1 г ткани. Конечные результаты представляют пикокюри (микрокюри х 1000) на 1 г ткани. Результаты для органов представлены в таблицах и графиках ниже.
Таблица 63 Результаты по целевым органам. Пикокюри на 1 г ткани
Поджелудочная железа Печень Селезенка
Час 0 - Группа П 1,09 10,34 0,40
Час 2 - Группа Ш 0,87 0,14 0,09
Час 4-Группа IV 0,47 1,П 1,07
Час 8 - Группа V 6,05 2,80 0,45
Час 12 - Группа VI 0,13 0,96 0,46
Час 18 - Группа VII 0,03 2,02 -0,15
Час 24 - Группа 0,07 2,40 0,030
- 127 034552
Данные отражают, что тестируемая композиция аккумулировалась преимущественно в поджелудочной железе на приблизительно 8 ч после дозировки и также, в меньшем количестве, в печени на 8 ч после дозировки. Количество пикокюри на 1 г ткани в селезенке и поджелудочной железе уменьшился почти до нуля к 18 ч после дозировки. На часе 0 в печени результаты были аномальными из-за одного животного с исключительно высоким количеством DPM на 0 ч после дозировки. Одно возможное объяснение этого аномально высокого результата состоит в том, что животное сумело употребить тестируемое вещество внутрь слизав его с кожи, или слизав его с лап после того, как потерло место дозы. Это возможно могло доставить тестируемое вещество в печень намного быстрее, чем подкожная абсорбция. После 8-часового пика в печени вещество слабо падает на 12 ч, но к 18 ч слабо возрастает и остается таким же на 24 ч.
График результатов по целевым органам (продолжение).
Количество тестируемых веществ, накопленных в каждом целевом органе, выведено не для всех животных в группах II-VIII, процент пикокюри на 1 г ткани выведен в таблице ниже.
Таблица 65
Поджелудочная железа Печень Селезенка
ЧасО 12,51% 52,30% 15,21%
Час 2 9,99% 0,71% 3,42%
Час 4 5,40% 5,61% 40,68%
Час 8 69,46% 14,16% 17,49%
Час 12 1,49% 4,86% 17,49%
Час 18 0,34% 10,22% -5,70%
Час 24 0,80% 12,14% 11,41%
Группы II-VIII получили дозу 4,112 мкКи тестируемого вещества. Таблица внизу представляет количества микрокюри на каждый целевой орган в каждый временной период.
Таблица 66
Поджелудочная железа Печень Селезенка
Группа II - 0 часов 0,0011 0,0103 0,0004
Группа III - 2 часа 0,0009 0,0001 0,0001
Группа IV - 4 часа 0,0005 0,0011 0,0011
Группа V - 8 часов 0,0060 0,0028 0,0005
Группа VI -12 часов 0,0001 0,0010 0,0005
Группа VII -18 часов 0,0000 0,0020 -0,0002
Группа Vni - 24 часа 0,0001 0,0024 0,0003
После деления этих чисел на 4112 (количество микрокюри в каждой дозе), получаются проценты, которые представляют количество тестируемого вещества в каждом органе на каждый период времени. Таблица внизу представляет эти проценты.
Поджелудочная Печень железа
Таблица 67
Селезенка
ЧасО 0,03% 0,25% 0,01%
Час 2 0,02% 0,00% 0,00%
Час 4 0,03% 0,03%
Час 8 0,15% 0,07% 0,01%
Час 2 0,00% 0,02% 0,01%
Час 18 0,00% 0,05% 0,00%
Час 24 0,00% 0.06% 0,01%
- 128 034552
Средний процент тестируемой композиции в микрокюри, попавших в целевой орган, составлял
0,03, 0,07 и 0,01% в поджелудочной железе, печени и селезенке соответственно.
Для проб телесных выделений конечные результаты были представлены в пикокюри на 1 мл. Это количество наблюдалось при преобразовании DPM до 1 мл, вычитании результатов группы I, и последующего деления на постоянную 2220000 для наблюдения микрокюри на 1 мл. Умножением этого результата на 1000, были получены пикокюри на 1 мл. Средние пикокюри на 1 мл для фекалий и мочи представлены на таблице и графике ниже.
Таблица 68 мл 1 мл ________________фекалий мочи Час 0-Группа П -0,0413 0,0002
Час 2-Группа Ш 18,2417 0,0000
Час 4 -Группа W 3,9348 0,0305
Час 8 - Группа V 117,1009 0,0081
Час. 12-Группа VI 52,7089 -0,0015
Час 18 - Группа 0,7791 0,0057
Час 24-Группа 0,1303 0,0016
Таблица 69
График результатов по образцам выделений
Данные отражают, что тестируемая композиция аккумулировалась преимущественно в фекалиях через 8 ч после дозировки, продолжала присутствовать на 12 ч после дозировки, но была значительно ниже на 18 ч после дозировки. Нет признаков того, что тестируемая композиция аккумулировалась в моче на какой-либо точке во время исследования.
Результаты по крови были подсчитаны таким же образом, как результаты по телесным выделениям. Подсчеты для пикокюри на 1 мл в крови дали отрицательные числа из-за высокого значения DPM в группе I - контрольной группе. Это было результатом того, что два животных имели более высокие значения DPM в крови, чем ожидалось. Результаты для крови представлены в таблице и графике ниже.
Таблица 70
1 мл крови
Час 0 - Группа I -0,3706
Час 2 - Группа II -0,3896
Час 4 - Группа Ш -0,2877
Час 8 - Группа IV -0.0890
Час 12 - ГруппаУ -0,1965
Час 18 - Группа VI 0,2164
Час 24 - Группа VII -0,9545
Таблица 71
График результатов по крови
Часы после дозировки
-“---Кровь
Данные показывают, что тестируемое вещество не аккумулируется в крови; за исключением того, что тестируемое вещество может присутствовать в крови на 18 ч после дозировки. Странно, что не было найдено значительных количеств тестируемого вещества в крови, особенно поскольку тестируемая композиция наблюдалась в печени и поджелудочной железе. Одно объяснение заключается в подкожной абсорбции тестируемой композиции через кожу прямо в органы; однако, вряд ли тестируемая композиция не попадает в кровь после проникновения через кожу. Другая возможность заключается в том, что кровь немедленно распознает чужеродную субстанцию и депозитирует тестируемый материал в печень. Последняя дозировка для группы II была в 10:23 и первое животное из группы II было забито в 10:45. 22
- 129 034552 мин могли быть достаточным временем для того чтобы кровь освободилась от чужеродного материала.
Данные по группе IX считались отдельно, поскольку животные группы IX получали дозу неоднократно, а не один раз, и у них было 7 дней для абсорбции тестируемой композиции. Данные группы IX представлены на схемах ниже.
Таблица 72
Пикокюри на грамм ткани из образцов органов
Поджелудочная железа Печень Селезенка
Группа IX 0,12 2,01 1,19
Средние пикокюри на 1 г ткани для групп II-VIII составляли 1,24, 2,83 и 0,38 для поджелудочной железы, печени и селезенки соответственно. Результаты группы IX для органов были ниже, чем среднее для поджелудочной железы, близкими к среднему для печени и выше, чем среднее для селезенки. Данные показывают, что существуют возрастающие количества тестируемой композиции в селезенке на день 7 и что количества тестируемой композиции в печени на день 7 были сравнимы с теми же количествами, обнаруженными в печени на 18 и 24 ч после дозировки.
Таблица 73
Пикокюри на мл из образцов выделений
Фекалии Моча
Группа IX 25,0650 -0,0011
Средние пикокюри на 1 мл для фекалий для групп II-VIII было 27,55 и для мочи было 0,0064. Результаты фекалий группы IX и мочи не были аномальными и показывали лишь минимальные признаки наличия тестируемого вещества в фекалиях.
Таблица 74
Пикокюри на мл из образцов крови
Кровь
Группа IX -0,0538
Как и с другими группами, результаты крови группы IX показывают, что тестируемое вещество не накапливается в крови.
Общие результаты показывают, что нет достоверной разницы по весу целевых органов, фекалий, мочи или крови между группами. В моче значительных количеств тестируемого вещества не было обнаружено. Не было мочи, собранной у групп I (контроль), II (час 0) или VI (час 12). За исключением группы VII (18 ч после дозировки), тестируемое вещество не определялось в значительном количестве в крови в любое время в течение исследования. Самые высокие количества пикокюри на 1 г ткани и пикокюри на 1 мл были отмечены у группы V (8 ч после дозировки) и наибольшая концентрация на этом времени была обнаружена в фекалиях и поджелудочной железе. Также в группе V, возросшие уровни пикокюри на 1 г ткани были найдены в печени. В печени после слабого провала на 12 уровни оставались достаточно высокими на 18 и 24 ч и сравнимые уровни были найдены в печени группы IX (животные день 7). После пика на 8 ч после дозировки количества в поджелудочной железе снизились почти до нулевых уровней, включая результаты группы IX. Количества в селезенке возрастали на 4 и затем уменьшались почти до нулевых уровней к 18. Однако эти количества возрастали для группы IX, показывая аккумулируемое тестируемое вещество в селезенке на день 7. Наблюдалась подкожная абсорбция тестируемого вещества или метаболитов тестируемого вещества, поскольку соединение было найдено в печени и поджелудочной железе. Странно, что тестируемое вещество не присутствовало в крови в значительных количествах, поскольку ожидаемым путем транспорта должен был быть кровоток. Возможным объяснением могло быть быстрое очищение тестируемого вещества из крови печенью и поджелудочной железой. Другая возможность состоит в том, что тестируемое вещество заглатывалось животным, или путем слизывания самой дозы, или путем лизания лап, которыми они терли место, куда была нанесена доза.
Пример 42. Анализ иммуноблоттингом клеток, обработанных коэнзимом Q10.
За последние пять десятилетий был накоплен громадный объем информации касательно эндогенных/экзогенных факторов, влияющих на специфические процессы, лежащие в основе злокачественной трансформации. Клиническая и базовая литература дает доказательства того, что изменения в структуре и функциях ДНК играют важную роль в инициации и развитии рака, определяя рак как генетическую болезнь. (Wooster, 2010; Haiman, 2010). В начале 1920-х Otto Warburg и другие исследователи, занимавшиеся характеристикой фундаментальных изменений в этиологии онкогенеза, описали два главных наблюдения: (а) способность клеток транспортировать и утилизировать глюкозу при образовании АТФ в для образования энергии в присутствии кислорода - также известного как эффект Варбурга и (b) изменения в структуре и функции митохондрий - включая изменения в транспорте электронов, приводящие к уменьшению образования митохондриальной АТФ. Последние несколько лет в исследованиях возвращается представление о центральной роли клеточной биоэнергетики в этиологии рака, т.е. на взгляде на рак как на метаболическое заболевание.
Хотя исторически мутации в генах считаются отвечающими за изменения в генной экспрессии, на
- 130 034552 копились литературные данные в поддержку того, что эпигенетические процессы играют ключевую роль во влиянии на экспрессию генов в поддержании канцерогенеза. Это доказывается наблюдениями, что скорость мутаций большинства генов низкая и не может быть причиной множества мутаций, находимых в раковых клетках. Эпигенетические изменения регулируются метилированием и модификацией гистоновых хвостов, и те и другие по сути связаны с энергетическим (нутриентным) статусом клеток, так как им требуется доступность ко-факторов, например ацетил СоА требуется для гистонового ацетилирования (ref). Биосинтез ацетил СоА зависит от гликолиза и цикла Кребса, прямо связанных с внутриклеточным энергетическим статусом для регуляции экспрессии и активности генов.
В нормальных клетках митохондриальное окислительное фосфорилирование производит значительное количество АТФ, соответствующее энергетическим нуждам для поддержания физиологической активности и поддержания жизни клетки. Следствием митохондриального вырабатывания энергии является образование химически активных кислородных радикалов (ROS), аберрантные продукты которых приводят к повреждению митохондрий (refs). Хорошо установлено, что постоянное образование ROS митохондриями приводит к кумулятивной аккумуляции генетических мутаций, феномену, который участвует в этиологии канцерогенеза. Подтверждено, что в раковых клетках снижается митохондриальное дыхание для минимизации образования ROS, и происходит переключение на гликолиз для поддержания образования энергии. Таким образом, постепенное переключение образования энергии с окислительного фосфорилирования на гликолиз было бы необходимым для клеток для поддержания образования энергии, поддержания физиологических функций и могло быть связано с движением фенотипа нормальной клетки в сторону раковой клетки. Постепенное переключение клеточного энергетического (биоэнергетического) профиля в совокупности с накопившимися изменениями (мутациями) в митохондриальном геноме приводит к изменениям в клеточном метаболизме. Изменения в метаболическом профиле всей клетки вследствие перехода от митохондриального фосфорилирования к гликолизу соответствуют анормальной биоэнергетике, вызванной метаболическим профилем и более глубокими причинами, поддерживающими канцерогенез. Целевое вмешательство с использованием эндогенных молекул для вызова клеточного метаболического переключения к условиям неканцерогенного нормального митохондриального окислительного фосфорилирования, связанного с клеточным биоэнергетическим статусом, представляет собой терапевтический критерий эффективности в лечении рака.
Коэнзим Q10 как МВМ, вызывающая эпи-метаболическое переключение.
Данные, представленные здесь, демонстрируют, что лечение нормальных и раковых клеток коэнзимом Q10 связано с изменениями в экспрессии белков, которые регулируют ключевые биохимические точки в континууме гликолиз - митохондриальный окислительный стресс. Комбинация данных, описывающих оценку экспрессии белков иммуноблоттингом и степенями кислородного потребления, демонстрирует, что в нормальных клетках нет значимых изменений в нормальных степенях гликолиза и митохондриального дыхания вследствие воздействия коэнзима Q10. Таким образом, значения экспрессии белков и степени митохондриального дыхания в нормальных клеточных линиях, например HDFa (нормальные фибробласты взрослого человека), HASMC (нормальные гладкие мускульные клетки аорты человека), nFib (нормальные фибробласты) и HeKa (нормальные кератиоциты человека), можно рассматривать как отображающие базовый физиологический статус. Любые отклонения в экспрессии белков и степени митохондриального дыхания в линиях раковых клеток, например HepG2 (рак печени), РаСа-2 (рак поджелудочной железы), MCF7 (рак молочной железы), SK-MEL (меланома) и SCC-25 (плоскоклеточная карцинома), представляет изменение вследствие возникновения/прогрессирования болезни, в данном случае рака. Экспериментальные доказательства поддерживают гипотезу, что воздействие коэнзима Q10 на раковые клетки связано с клеточной патофизиологической реорганизацией, которая вспоминает о нормальных клетках. Именно приведенные здесь данные демонстрируют, что воздействие коэнзима Q10 на раковые клетки связано с переключением в гликолитических путях и митохондриалном окислительном фосфорилировании, отвечающем за индукцию глобальной реорганизации клеточной архитектуры к наблюдаемой в нормальных клетках.
В нормальных клетках конец гликолитического производства связан с митохондриальным окислительным фосфорилированием (OXPHOS), т.е. генерацией пирувата из глюкозы через глюкозный путь для вхождения в цикл Кребса (также известный как цикл трикарбоксильной кислоты, ТСА, или цикл лимонной кислоты) для образования восстановленных эквивалентов для поддержания митохондриального OXPHOS для образования АТФ. Таким образом, в нормальных клетках экспрессия и функциональная ориентация генного продукта, участвующего в гликолизе, служит затравкой адекватной генерации пирувата и его вхождению в цикл Кребса. Дисрегулируемая экспрессия и функция ключевых белков, участвующих в путях гликолиза и цикла Кребса в раковых клетках, приводит к повышению гликолиза со значительным снижением митохондриальной функции. Воздействие на раковые клетки коэнзима Q10, эндогенной молекулы, которая селективно влияет на митохондриальную дыхательную цепь, влияет (нормализует) на экспрессию белков путей гликолиза и цикла Кребса, содействуя биоэнергетическому переключению, так что образование энергии (т.е. генерация АТФ) восстанавливается в митохондриях.
- 131 034552
Экспериментальная процедура
Иммуноблоттинг эксперимент 1.
Клетками, использовавшимися для эксперимента, были HDFa и MCF-7 клетки, которые обрабатывались или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях, 50 и 100 мкМ, и собирались через 24 ч после обработки. Весь клеточный осадок сразу же ресуспендировался в 1 мл С7 буфера и переносился в меченые 15 мл тубы. Образцы затем подвергались обработке ультразвуком в холодной комнате на льду с использованием 6 ультразвуковых импульсов с шагом #14. Образцы центрифугировались короткое время на 2500 г после обработки ультразвуком и переносились в 2-мл пробирки. У каждого образца проверялось рН (рН должно быть 9,0) с использованием пены, остававшейся в 50-мл пробирке.
Алкилирование и восстановление проб осуществлялась для каждой пробы добавлением 10 мкл 1М акриламида, 25 мкл трибутилфосфена и инкубацией в течение 90 мин с прерывистым смешиванием. После инкубации 10 мкл 1М DTT добавлялось и пробирки центрифугировались при 20000 г и 20°С в течение 10 мин, супернатант переносился в помеченные Amicon Ultra фильтры для центрифугирования с 10 k сечениями (Millipore catalog # UFC 801024). Образцы 2 раза центрифугировались по 15 мин на 2500 г. Проводимость оценивалась только для чапсов. Если проводимость проб была высокой, тогда 1 мл чапсов добавлялось и снова центрифугировалось на 2500 г, пока объем не снижался до 250 мкл. Если проводимость была 200 или менее, образцы центрифугировались на 5-минутных интервалах при 2500 г, пока объем супернатанта не становился между 150-100 мкл. Пробы супернатанта переносились в эппендорфы, и делался анализ Брадфорда с использованием BSA как стандарта.
Пробы были обработаны по стандартному протоколу, как описано выше, и количество белка на каждую пробу определялось по анализу Брадфорда. Объемы проб, эквивалентные 10 мкг белка, были приготовлены, как показано ниже, с красителем Lamelli Loading (LDS) и MilliQ водой, и разгонялись в 412% Bis-Tris Novex NuPAGE геле (Invitrogen, cat # NP0323Box).
Гели разгонялись в течение 50 мин с использованием 1X MOPS буфера, с использованием NO VEX Xcell Surelock системы при 200 В. Гели затем переносились в течение 1 ч с использованием NOVEX Xcell Surelock протокола влажного переноса при 30 В. Блоты красились с Simply Blue Safestain от Invitrogen (LC6065).
IDH1 и АТФ цитрат лиазы уровни в HDFa и MCF-7 образцах.
После переноса каждый блот был помещен между 2 бумажными фильтрами Whatman и высушен в течение 15-20 мин. После сушки на блотах НВ карандашом были помечены дата, тип образца и номер блота (1 или 2). Молекулярный вес маркеров был очерчен карандашом с одной линией для голубого и двойной для цветного маркера. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-151; 2Х 5' каждый). Блот 1 был зондирован первичным антителом для IDH1 (Cell Signaling # 3997) в TBST с 5% BSA (разведение 1:1000) и блот 2 с кроличьим поликлональным антителом для АТФ цитрата лиазы в 5% BSA (Cell Signaling #4332) при разведении 1:1000 и инкубировался на ночь при 4°С с перемешиванием. После ночной инкубации с первичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-151; 2Х 5' каждый) и зондированы вторичными антителами (антикроличьи; 1:10000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-151; 2Х 5' каждый), затем инкубированы с ECF реагентом в течение 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Уровни актина в HDFa и MCF-7 образцах.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота были сканированы на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-Т при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и были зондированы вторичным антителом (антимышиные; 1:10000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Иммуноблоттинг эксперимент 2.
Клетками, использованными в этом эксперименте, были SKMEL28, SCC-25, nFib и Heka, которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях, 50 или 100 мкМ и собраны после 3, 6 и/или 24 ч обработки. Пробы были обработаны и разогнаны в 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE геле, как описано выше. Гели были разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше.
Уровни IDH1 для 4 клеточных линий.
После переноса блот был высушен в течение 15-20 мин, активирован метанолом 5 с, промыт водой
- 132 034552 мин и TBST 15 мин. Блот блокировался в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывался 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и был зондирован вторичным антителом (антимышиные; 1:10000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Блот блокировался в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывался 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый). Затем блот зондировался первичным антителом для IDH1 (Cell Signaling # 3997) в TBST с 5% BSA (разведение 1:1000) на ночь при 4°С на шейкере. После ночной инкубации с первичными антителами блот промывался 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и был зондирован вторичными антителами (антикроличьи; 1:10,000 разведение) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блот был промыт 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), затем инкубировался с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
АТФ цитрат лиазы уровни в 4 различных клеточных линиях.
Изоцитрат дегидрогеназы блот был зачищен путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. Блот сканировался на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блот активировался метанолом 5 с, промывался водой 5 мин и TBST 15 мин. Блот блокировался в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывался 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый). Затем блот зондировался кроличьим поликлональным антителом к АТФ цитрат лиазе в 5% BSA (Cell Signaling #4332) при разведении 1:10000 на ночь при 4°С на шейкере. После ночной инкубации с первичными антителами к АТФ цитрат лиазе блот промывался 3 раза TBS-T (Х-15'; 2Х 5' каждый) и был зондирован вторичными антителами (антикроличьи; 1:10,000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блот был промыт 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), затем инкубировался с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Уровни актина в 4 различных клеточных линиях.
Изоцитрат дегидрогеназы блот был зачищен путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. Блот сканировался на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блот активировался метанолом 5 с, промывался водой 5 мин и TBST 15 мин. Блот блокировался в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре, затем промывался 3 раза TBS-T (Х-15'; 2Х 5' каждый) и зондировался антителом к актину в 5% BSA (Sigma catalog # А5316, клон АС-74) 1:5000 разведение на 1 ч при комнатной температуре на шейкере. После 1 ч инкубации с первичными антителами к актину мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и были зондированы вторичными антителами (антимышиные; 1:10,000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блот был промыт 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), затем инкубировался с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Имммуноблоттинг эксперимент 3.
Клетками, использованными в этом эксперименте, были HepG2, HASMC и РАСА2 клетки, которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях (50 и 100 мкМ) и собраны через 48 ч после обработки. В этом эксперименте (иммуноблоттинг эксперимент 3) и во всех экспериментах, описанных ниже в этом примере (т.е. иммуноблоттинг эксперименты с 4 по 9), клетки были дополнительно обработаны или 5 мМ глюкозой (5G) или 22 мМ глюкозой (22G). Образцы, взятые из клеток, были обработаны и разогнаны в 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE геле, как описано выше. Гели были разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше.
IDH1, АТФ цитрат лиазы и актина уровни в HASMC vs. PACA2 и HepG2.
Уровни IDH1, АТФ цитрат лиазы и актина были определены путем зондирования блотов первичными антителами к IDH1, АТФ цитрат лиазе и актину, в основном как описано выше.
Иммуноблоттинг эксперимент 4.
Клетками, использованными в этом эксперименте, были HepG2 клетки, которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях (50 и 100 мкМ) и собраны через 24 или 48 ч после обработки. Образцы были обработаны и разогнаны в 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE геле, как описано выше. Гели были разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше.
Уровни лактат дегидрогеназы в HepG2 клетках.
После переноса каждый блот был высушен в течение 15-20 мин, активирован метанолом 5 с, промыт водой 5 мин и TBST 15 мин. Блот блокировался в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T
- 133 034552 при комнатной температуре, затем промывался 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондирован первичным антителом к лактатдегидрогеназе (Abcam ab2101; поликлональные) в 5% BSA (1:10000 разведение) на ночь при 4°С на шейкере. После ночной инкубации с первичными антителами к АТФ цитрат лиазе блот промывался 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и был зондирован вторичными антителами (кроличьи антикоза; 1:10,000 разведение) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блот был промыт 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировался с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Пируват киназы мышечной формы (PKM2) уровни в HepG2 клетках.
Лактата дегидрогеназы блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались кроличьим поликлональным антителом к пируват киназе М2 в 5% BSA (Novus Biologicals catalog # H00005315-D01P) 1:500 разведение на ночь при 4°С на шейкере. После ночной инкубации с первичными антителами к пируват киназе М2 мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (антикроличьи; 1:10,000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блот был промыт 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировался с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Уровни пируват дегидрогеназы бета в HepG2 клетках.
Пируват киназы блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. После того как убедились, что зачистка антитела и ECF реагент работает, блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре, затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к пируват дегидрогиназе М2 в 5% BSA (ABNOVA catalog # H00005162-M03) 1:500 разведение на ночь при 4°С на шейкере. После ночной инкубации с первичными антителами к пируват дегидрогеназе мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (антимышиные; 1:10,000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блот был промыт 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), затем инкубировался с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Уровни актина в HepG2 клетках.
Пируват дегидрогеназы блоты были зачищены и затем вновь зондированы антителами к актину, как описано выше.
Иммуноблоттинг эксперимент 5.
Клетками, использованными в этом эксперименте, были MIAPACA2 (РАСА2) клетки, которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях (50 и 100 мкМ) и собраны через 24 или 48 ч после обработки. РАСА2 образцы были обработаны и гели разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше.
Лактат дегидрогеназы (LDH) и пируват дегидрогеназы (PDH) уровни в РаСа2 клетках.
Уровни LDH и PDH определялись путем зондирования блотов подряд первичными антителами к LDH и PDH, по существу, как описано выше.
Каспазы 3 уровня в РаСа2 клетках.
Блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре, затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к каспазе 3 в 5% BSA (Santacruz Biotechnology # sc7272) 1:200 разведение на ночь при 4°С на шейкере. После ночной инкубации с первичными антителами к каспазе 3 мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (антимышиные; 1:10000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), затем инкубировались с
- 134 034552
ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Иммуноблоттинг эксперимент 6.
Клетками, использованными в этом эксперименте с иммуноблоттингом, были РС-3, HepG2, MCF-7, HDFa и РАСА2, которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 IV формулой и собраны через 24 ч после обработки. Образцы были обработаны и гели были разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше. Каспаза 3 и уровни актина в различных клеточных типах.
Уровни каспазы 3 и актина определялись зондированием блотов первичными антителами к каспазе 3 и актину, как описано выше.
Иммуноблоттинг эксперимент 7.
Клетками, использованными в этом эксперименте, были клетки гладкой мускулатуры аорты человека (HASMC), которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях (50 и 100 мкМ) и собраны через 24 или 48 ч после обработки. РАСА2 образцы были обработаны и гели разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше.
Экспериментальный протокол для актина.
Уровни актина определялись зондированием блотов первичными антителами к актину, как описано выше.
Экспериментальный протокол для Hif 1 alpha, каспазы 3 и PDHB.
Актиновые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле с последующими двумя 10минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре, затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к Hif 1 alpha, каспазе 3 или PDHB в 5% BSA (1:200 при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к Hif 1 alpha (Abcam ab2185; антикроличье) были разведены 1:500 в 5% BSA. Первичные антитела к каспазе 3 (Santacruz sc7272; антикроличье) были разведены 1:200 в 5% BSA. Первичные антитела к пируват дегидрогеназе бета (PDHB) (Novus Biologicals H00005162-M03; антимышиное) были разведены 1:500 в 5% BSA. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (PDHB антимышиное; Hif 1a и каспаза 3 антикроличье; 1:10000 разведение) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Экспериментальный протокол для PKM2, SDHB и SDHC.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к PKM2, SDHB или SDHC в 5% BSA в TBS-T (1:200 при инкубации на ночь при 4°С) на малой скорости шейкера. Первичные антитела к SDHC (ABNOVA H00006391-M02; антимышиное) были разведены 1:500. Первичные антитела к SDHB были из Abcam ab4714-200; антимышиное; были разведены 1:1000. Первичные антитела к пируваткиназе М2 (PKM2) были из Novus Biologicals H00005315-D0IP; антикроличье; были разведены 1:500. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (SDHB & С антимышиное; и PKM2 антикроличье; 1:10000 разведение) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Экспериментальный протокол для LDH и Bik.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к LDH или Bik в 5% BSA в TBS-T при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к LDH были из Abcam ab2101; антикозье; были разведены 1:1000. Первичные антитела к Bik были из Cell Signaling #9942; антикроличье; были разведены 1:1000. После инку- 135 034552 бации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (LDH антикозье; Jackson Laboratories) и Bik антикроличье; 1:10000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Иммуноблоттинг эксперимент 9.
Использованными клетками были HepG2, которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях, 50 и 100 мкМ, и собраны через 24 или 48 ч после обработки. HepG2 образцы были обработаны и гели разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше.
Экспериментальный протокол для актина.
Уровни актина определялись зондированием блотов первичными антителами к актину, как описано выше.
Экспериментальный протокол для каспазы 3 и ММР-6.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к каспазе 3 или ММР-6 в 5% BSA в TBS-T при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к каспазе 3 (Abcam ab44976-100; антикроличье) были разведены 1:500 в 5% BSA. Первичные антитела к ММР-6 (Santacruz scMM0029-ZB5; антимышиное) были разведены 1:100 в 5% BSA. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (ММР-6 антимышиное; каспаза 3 антикроличье; 1:10000 разведение) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Экспериментальный протокол для LDH.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре, затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к LDH в 5% BSA или 5% сыворотке при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к LDH 080309b1 (Abcam ab2101; антикозье) были разведены 1:1000 в 5% BSA. Первичные антитела к LDH 080309b2 (Abcam ab2101; антикозье) были разведены 1:100 в 5% BSA. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (Jackson Immuno Research антикозье; 1:10000 разведение; 305-055-045) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Экспериментальный протокол для трансальдолазы и Hif1a.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре, затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к трансальдолазе или Hif1a в 5% BSA при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к трансальдолазе (Abcam ab67467; антимышиное) были разведены 1:500. Первичные антитела к Hif1a (Abcam ab2185; антикроличье) были разведены 1:500. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (антимышиное или антикроличье; 1:10000 разведение) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Экспериментальный протокол для IGFBP3 и ТР53.
- 136 034552
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре, затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителами к IGFBP3 или ТР53 в 5% BSA при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к IGFBP3 (Abcam ab76001; антикроличье) были разведены 1:100. Первичные антитела к ТР53 (Sigma Aldrich AV02055; антикроличье) были разведены 1:100. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (антикроличье; 1:10,000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Экспериментальный протокол для трансальдолазы и PDHB.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре, затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителами к трансальдолазе или PDHB в 5% BSA при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к трансальдолазе (Santacruz sc51440; антикозье) были разведены 1:200. Первичные антитела к PDHB (Novus Biologicals H00005162-M03; антимышиное) были разведены 1:500. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (антикозье или антимышиное; 1:10000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 и при 500 В.
Результаты.
Изоцитрат дегидрогеназа - 1 (IDH-1).
Изоцитрат дегидрогеназа - один из ферментов, который является частью ТСА цикла, который обычно присутствует внутри митохондриального матрикса. Однако IDH1 является цитоплазматической формой энзима, которая катализирует окислительное декарбоксилирование изоцитрата в α-кетоглутарат и вырабатывает диоксид углерода в двухэтапном процессе. IDH1 является НАДФ+ зависимой формой, которая присутствует в цитоплазме и пероксисоме. IDH1 инактивируется Ser113 фосфорилированием и экспрессируется во многих видах, включая те, у которых нет цикла лимонной кислоты. Судя по всему, в норме IDH1 функционирует как супрессор опухолей, который при инактивации способствует онкогенезу, частично за счет активации HIF-1 пути (Bayley 2010; Reitman, 2010). Недавние исследования вовлекли инактивирующие мутации в IDH1 в этиологию глиобластомы (Bleeker, 2009; Bleeker, 2010).
Обработка коэнзимом Q10 повышала экспрессию IDH1 в линиях раковых клеток, включая MCF-7, SKMEL28, HepG2 и РаСа-2 клетки. Было среднее возрастание экспрессии в SCC25 клеточных линиях. Напротив, культуры первичных фибробластов человека HDFa, nFIB и клеток гладкой мускулатуры аорты человека HASMC не показали значительных изменений в экспрессионном паттерне IDH1 в ответ на коэнзим Q10. α-Кетоглутарат (α-КГ) является ключевым промежуточным продуктом в цикле ТСА, биохимически синтезируемым из изоцитрата, в конечном итоге превращающемся в сукцинил соА и являющимся лекарственно-ориентированным МВМ и эпи-переключателем. Образование α-КГ служит критическим местом связи в ТСА цикле, поскольку может использоваться клеткой для пополнения промежуточных веществ в цикле, приводя к образованию восстановленных эквивалентов и возрастанию окислительного фосфорилировния. Таким образом, кооэнзим Q10, опосредуя возрастание экспрессии IDH1, приводит к формированию промежуточных продуктов, которые могут быть использованы в митохондриальном ТСА цикле для увеличения окислительного фосфорилирования в раковых клетках. Результаты суммированы в таблицах ниже.
- 137 034552
Таблица 75
IDH1 в HDFa и MCF-7
Состав Средняя нормализованная интенсивность
HDF, среда 346
НОР24-50-Коэнзим Q10 519
HDF24-100-Коэнзим Q10 600
MCF, среда 221
МСР24-50-Коэнзим Q10 336
MCF24-100-Коэнзим Q10 649
Таблица 76
IDH1 в HASMC vs. HepG2 после обработки
Количество - Состав Нормализованная интенсивность
НА85д48-среда 20
НА85д48-50-Коэнзим Q10 948
HAS5g48-l00-Коэнзим Q10 1864
HAS22G48-Cpefla 1917
HAS22G48-50-Ko3H3hm Q10 1370
HAS22G48-100-Коэнзим Q10 1023
Hep5g48-Cpefla 14892
Hep5g48-50-Ko3H3HM Q10 14106
Hep5g48-100-Коэнзим Q10 15774
Нер22О48-Среда 16558
Нер22С48-50-Коэнзим Q10 15537
Hep22G48-100-Коэнзим Q10 27878
Таблица 77
IDH1 в HASMC vs. PACA2 после обработки
Количество - Состав Нормализованная интенсивность
НА85ё48-Среда 562
HAS5g48-50-Ko3H3HM Q10 509
HAS5g48-l00-Коэнзим Q10 627
HAS22G48-Cpefla 822
НА822О48-50-Коэнзим Q10 1028
HAS22G48-100-Коэнзим Q10 1015
РАСА5ё48-Среда 1095
P AC A5g48-5 0-Коэнзим Q10 1095
PACA5g48-100-Коэнзим Q10 860
РАСА22О48-Среда 1103
РАСА22О48-50-Коэнзим Q10 1503
PACA22G48-100-Коэнзим Q10 1630
АТФ цитрат лиаза (ACL).
АТФ цитрат лиаза (ACL) является гомотетрамерным (~126 кд) ферментом, который катализирует образование ацетил-СоА и оксалоацетата в цитоплазме. Эта реакция является очень важным первым этапом в биосинтезах жирных кислот, холестерина и ацетилхолина, а также для глюкогенеза (Towle et al.,
- 138 034552
1997). Питательные вещества и гормоны регулируют уровень экспрессии и фосфориляционный статус этого ключевого фермента. Сообщалось о Ser454 фосфорилировании ACL благодаря Akt и PKA (Berwick, D.C. M.W. et al., 2002; Pierce M.W. et al., 1982).
Данные описывают действие коэнзима Q10 на АТФ цитрат лиазу в нормальных и раковых клетках. Постоянно наблюдается, что в раковых клетках существует дозозависимое снижение экспрессии ACL ферментов. И, напротив, судя по всему существует тенденция возрастания экспрессии ACL в нормальных клетках. Цитоплазматический ACL демонстрирует необходимость для ацетилирования гистонов в клетке во время стимуляции фактора роста и во время дифференцировки. Тот факт, что ACL утилизирует цитоплазматической глюкозы дериват цитрат для образования Ацетил СоА, необходимого для ацетилирования гистонов, процесса, важного в процессе новообразований, демонстрирует роль коэнзима Q10, вызывающего экспрессию ACL, влияющего на функцию раковых клеток. Ацетил СоА, вырабатывающийся из цитрата благодаря цитоплазматическому ACL, служит источником для биосинтезов новых липидов и холестерина во время деления клеток. Таким образом, коэнзим Q10, вызывающий изменения в экспрессии ACL, влияет на способность Ацетил СоА синтезировать липиды и холестерин в нормальных клетках по сравнению с раковыми клетками.
Результаты суммированы в таблицах ниже.
Таблица 78
ATPCL в HDFa и MCF-7
Состав Средняя нормализованная интенсивность
HDF-Среда ~15000
HDF-50-Коэнзим Q10 ~17500
HDF-100-Коэнзим Q10 -25000
MCF-Среда -7500
MCF-50-Коэнзим Q10 -7500
MCF-100-Коэнзим Q10 - 12500
Таблица 79
АТР цитрат лиаза ~kd полоса в HASMC vs. HepG2
Количество - состав Нормализованная интенсивность
HAS5g48-cpefla 24557
HAS5g48-50-Ko3H3HM Q10 23341
HAS5g48-100-Ko3H3HM Q10 25544
HAS22G48-cpefla 27014
НА822О48-50-Коэнзим Q10 21439
HAS22G48-100-Коэнзим Q10 19491
Hep5g48-cpefla 28377
Hep5g48-50-Ko3H3HM Q10 24106
Hep5g48-100-Ko3H3HM Q10 22463
Нер22С48-Среда 24262
Нер22С48-50-Коэнзим Q10 31235
Hep22G48- 100-Коэнзим Q10 50588
Таблица 80
АТФ цитрат лиаза ~kd полоса в HASMC vs. PACA2
Количество - Состав Нормализованная интенсивность
HAS5g48-cpefla 11036
- 139 034552
НА85д48-50-Коэнзим Q10 12056
НА85д48-100-Коэнзим Q10 15265
НА822О48-среда 18270
HAS22G48-50-Ko3H3hm Q10 15857
HAS22G48-100-Коэнзим Q10 13892
PACA5g48-cpefla 11727
PACA5g48-50-Ko3H3HM Q10 8027
PACA5g48-100-Коэнзим Q10 4942
РАСА22О48-среда 8541
РАСА22О48-50-Коэнзим Q10 9537
PACA22G48-100-Коэнзим Q10 14901
Таблица 81
ATP цитрат лизаза в HepG2 и РАСА2 как % от CTR
Количество - Состав Нормализованная интенсивность
PACA5g48-cpefla 1,00
PACA5g48-50-Ko3H3HM Q10 0,68
PACA5g48-100-Коэнзим Q10 0,42
РАСА22О48-среда 1,00
РАСА22О48-50-Коэнзим Q10 1,12
PACA22G48-100-Коэнзим Q10 1,74
Hep5g48-cpefla 1,00
Hep5g48-50-Ko3H3HM Q10 0,85
Hep5g48-100-Коэнзим Q10 0,79
Нер22О48-среда 1,00
Нер22О48-50-Коэнзим Q10 1,29
Hep22G48-100-Коэнзим Q10 2,09
Пируват киназа М2 (PKM2).
Пируват киназа является ферментом, участвующем в гликолитическом пути. Она отвечает за перенос фосфата с фосфоенолпирувата (PEP) на аденозиндифосфат (АДФ) с образованием АТФ и пирувата. PKM2 является изоэнзимом гликолитической пируваткиназы, экспрессия которого характеризуется по метаболитической функции ткани, т.е. М2 изоэнзим экспрессируется в нормальных быстро пролиферирующих клетках с высокими энергетическими потребностями, такими как эмбриональные клетки, и также экспрессируется в нескольких нормальных дифферинцированных тканях, таких как легкие и инсулоциты поджелудочной железы, где требуется высокая степень синтеза нуклеиновых кислот. PKM2 в высокой степени экспрессируется в опухолевых клетках вследствие своей зависимости от гликолитического пути, отвечающего энергетическим потребностям клетки. PKM2 изоформа, в норме считающаяся ограниченной эмбриональным периодом, ре-экспрессируется в раковых клетках. Клетки, экспрессирующие PKM2, поддерживают сильный аэробный гликолитический фенотип (показывающий переключение в метаболитическом фенотипе) с возрастанием образования лактата и снижением окислительного фосфорилирования. Таким образом, снижение экспрессии PKM2 в раковых клетках переключает или отрицательно регулирует образование энергии благодаря гликолитическому пути, стратегии, которая полезна в лечении рака. Данные демонстрируют различный паттерн экспрессии PKM2 в нормальных и раковых клетках, где раковые клетки демонстрируют более высокий уровень экспрессии по сравнению с нормальными. Обработка клеток коэнзимом Q10 изменяет экспрессионный паттерн PKM2 выше и ниже исходных уровней в нормальных и раковых клетках (фиг. 81-85). В исследуемых раковых клетках существует дозозависимое снижение экспрессии PKM2, и в основном не наблюдается изменений в нормальных клетках. Результаты суммированы в таблицах ниже.
- 140 034552
Таблица 82
Пируваткиназа мышечная форма 2 верхняя полоса в HepG2
Количество - Состав Нормализованный объем (24 ч) Нормализования интенсивность (48 ч)
5г-Среда 28386 413
5г-50-Коэнзим Q10 29269 303
5 г-100-Коэнзим Q10 18307 354
22Г-МесНа 25903 659
22-50-Коэнзим Q10 22294 562
22G-100-Коэнзим Q10 19560 601
Таблица 83
Пируваткиназа мышечная форма 2 нижняя полоса (58 КД) в HepG2
Количество - Состав Нормализованный объем (24 ч) Нормализованный объем (24 ч)
5г-Среда 10483 310
5г-50-Коэнзим Q10 11197 185
5 г-100-Коэнзим Q10 7642 122
22О-Среда 9150 306
22О-50-Коэнзим Q10 6302 344
22G-100- Коэнзим Q10 6904 465
Таблица 84
Пируваткиназа мышечная форма 2 верхняя полоса в HASMC клетках после обработки
Количество - Состав Нормализованная интенсивность
5г48-Среда 608
5г48-50-Коэнзим Q10 811
5г48-100-Коэнзим Q10 611
22048-Среда 516
22О48-50-Коэнзим Q10 595
22G48-100-Коэнзим Q10 496
22024-Среда 301
22С24-50-Коэнзим Q10 477
22G24-100-Коэнзим Q10 701
Лактат дегидрогеназа (LDH).
LDH является ферментом, который катализирует взаимное превращение пирувата и лактата с одновременным взаимным превращением НАДН и НАД+. Он обладает способностью превращать пируват в лактат (молочную кислоту) при низком давлении кислорода в клетке для образования восстановленных эквивалентов и образования АТФ за счет митохондриального окислительного фосфорилирования. Раковые клетки обычно демонстрируют повышенную экспрессию LDH для поддержания гликолитического потока для образования АТФ и восстановленных эквивалентов и уменьшения митохондриального OX
- 141 034552
PHOS. Таким образом, уменьшение экспрессии LDH в раковых клетках переключает метаболизм с образования лактата на содействие входу пирувата в ТСА цикл. Обработка коэнзимом Q10 уменьшала экспрессию лактатдегидрогеназы (LDH) при раке с минимальным действием на нормальные клетки, поддерживая роль коэнзима Q10 в вызове переключения в биоэнергетике раковых клеток для образования АТФ с гликолитического на митохондриальные OXPHOS источники путем минимизации превращения цитоплазматического пирувата в молочную кислоту. Результаты суммированы в таблицах ниже.
Таблица 85
Лактат дегидрогеназа в HepG2
Количество - Состав Нормализованный объем (24 ч) Нормализованный объем (48 ч)
5г-Среда 7981 5997
5г-50-Коэнзим Q10 7900 5188
5 г-100-Коэнзим Q10 6616 7319
22О-Среда 9171 7527
22О-50-Коэнзим Q10 7550 6173
22G-100-Коэнзим Q10 7124 9141
Таблица 86
Лактат дегидрогеназа в HepG2 как % контроля от 2 экспериментов
Количество - Состав Средний объем как % от контроля
5β24-ΟρβΛα 1,00
5g24-50-Ko3H3HM Q10 0,64
5g24-100-Коэнзим Q10 1,06
5g48-Cpeaa 1,00
5g48-50-Ko3H3HM Q10 1,12
5g48-100-Коэнзим Q10 1,21
22G24-Cpeaa 1,00
22О24-50-Коэнзим Q10 1,21
22G24-100-Коэнзим Q10 1,44
22G48-Cpeaa 1,00
22О48-50-Коэнзим Q10 0,95
22G48-100-Коэнзим Q10 0,67
Таблица 87
Лактатдегидрогеназа в РАСА
Количество - Состав Нормализованный объем (24 ч) Нормализованный объем (48 ч)
5г-Среда 2122 2360
5г-50-Коэнзим Q10 5068 2978
5г-100-Коэнзим Q10 3675 2396
22О-Среда 4499 2332
22О-50-Коэнзим Q10 10218 2575
22G-100-Коэнзим Q10 7158 3557
- 142 034552
Пируват дегидрогеназа - В (PDH-E1).
Пируват дегидрогеназа бета (PDH-E1) является первым ферментным компонентом, который является частью пируватдегидрогеназного комплекса (PDC), который превращает пируват в ацетилСоА. PDH-E1 требует тиамина как кофактора для своей активности, осуществляет первые две биохимические реакции в PDC комплексе, необходимые для превращения пирувата в ацетилСоА для вхождения в ТСА цикл в митохондриях. Таким образом, сопутствующее снижение экспрессии PKM2 и LDH в ходе возрастания экспрессии PDH-E1 в раковых клетках увеличивает степень вхождения пирувата для усиления митохондриального OXPHOS для образования АТФ. Данные показывают, что экспрессия PDH-E1 в нормальных и раковых клеточных линиях, исходная линия экспрессии этого фермента уменьшается при раке по сравнению с нормальными клетками. Воздействие коэнзимом Q10 связано с прогрессивным повышением экспрессии PDH-E1 белков в раковых клетках при минимальных изменениях в нормальных клетках. Результаты суммированы в таблицах ниже.
Таблица 88
Пируват дегидрогеназа бета в HepG2
Количество - Состав Нормализованный объем (24 ч) Нормализованный объем (48 ч)
5г-Среда 517 100
5г-50-Коэнзим Q10 921 123
5 г-100-Коэнзим Q10 433 205
22О-Среда 484 181
22О-50-Коэнзим Q10 426 232
22G-100-Коэнзим Q10 340 456
Таблица 89
Пируват дегидрогеназа бета в РАСА2
Количество - Состав Нормализованный объем (48 ч) Нормализованный объем (48 ч)
5г-Среда 323 375
5г-50-Коэнзим Q10 492 339
5г-100-Коэнзим Q10 467 252
22О-Среда 572 276
22О-50-Коэнзим Q10 924 279
22G-100-Коэнзим Q10 1201 385
- 143 034552
Таблица 90
Пируват дегидрогеназа бета в HASMC после обработки
Количество - Состав Нормализованный объем
5г48-Среда 140
5г48-50-Коэнзим Q10 147
5г48-100-Коэнзим Q10 147
22С48-Среда 174
22G48-50-Коэнзим Q10 149
22G48-100-Коэнзим Q10 123
22О24-Среда 140
22G24-50-Коэнзим Q10 145
22G24-100-Коэнзим Q10 150
Каспаза 3.
Контроль начала апоптозов часто влияет на уровень инициатора каспаз, каспазы-2, -9 и -8/10. Во внешнем пути апоптозов каспаза-8 активируется, прямо расщепляется и активирует каспазы-убийцы (такие как каспаза-3). Активная каспаза-3 расщепляет и активирует другие каспазы (6, 7 и 9), а также и соответствующие цели в клетках (например, PARP и DFF). В этих исследованиях уровни эффекторов белка каспазы-3 оценивались в раковых клеточных линиях и в нормальных клеточных линиях в ответ на коэнзим Q10. Следует заметить, что хотя считается, что контроль за апоптозами идет через инициатора каспаз, множество сигнальных путей прерывается взамен передачи апоптозного сигнала через прямую ингибицию эффекторов каспаз. Для, например, Р38 MAPK фосфорилирует каспазу-3 и поддерживает ее активность (Alvarado-Kristensson et al., 2004). Интересно, что активация белка фосфотазы (РР2А) в том же исследовании или протеинкиназы С дельта (PKC дельта) (Voss et al., 2005) может препятствовать действию р38 MAPK усиливать активацию каспазы-3 и содействовать передаче апоптозного сигнала. Следовательно, события на уровне активации каспазы-3 или после активации каспазы-3 могут определять конечную судьбу клетки в некоторых случаях.
Каспаза-3 является цистеин-аспаргиновой кислоты протеиназой, которая играет центральную роль в фазе осуществления клеточного апоптоза. Уровни каспазы 3 в раковых клетках возрастали при обработке коэнзимом Q10. Напротив, экспрессия каспазы-3 в нормальных клетках умеренно понизилась. Результаты суммированы в таблицах ниже.
Таблица 91
Каспаза 3 в РАСА2
Количество - Состав Нормализованный объем (24 ч) Нормализованный объем (24 ч)
5г-Среда 324 300
5г-50-Коэнзим Q10 325 701
5 г-100-Коэнзим Q10 374 291
22О-Среда 344 135
22О-50-Коэнзим Q10 675 497
22G-100-Коэнзим Q10 842 559
- 144 034552
Таблица 92
Каспаза 3 в HepG2 клетках как % контроля от 2 экспериментов
Количество - Состав Нормализованный объем как % от контроля
5г24-Среда 1,00
5г24-50-Коэнзим Q10 1,08
5г24-100-Коэнзим Q10 1,76
5г48-Среда 1,00
5г48-50-Коэнзим Q10 1,44
5г48-100-Коэнзим Q10 0,95
22024-Среда 1,00
22О24-50-Коэнзим Q10 1,39
22G24-100-Коэнзим Q10 1,78
22048-Среда 1,00
22О48-50-Коэнзим Q10 1,50
22G48-100-Коэнзим Q10 1,45
Таблица 93
Каспаза 3 в HASMC после обработки
Количество - Состав Нормализованный объем
5г48-Среда 658
5г48-50-Коэнзим Q10 766
5г48-100-Коэнзим Q10 669
22048-Среда 846
22О48-50-Коэнзим Q10 639
22G48-100-Коэнзим Q10 624
22024-Среда 982
22О24-50-Коэнзим Q10 835
22G24-100-Коэнзим Q10 865
Сукцинат дегидрогеназа (SDH).
Сукцинат дегидрогеназа, также известная как сукцинат-коэнзим Q редуктаза, является комплексом внутренней митохондриальной мембраны, которая задействована и в ТСА, и в электронной транспортной цепи. В ТСА этот комплекс катализирует окисление сукцината до фумарата с сопутствующим восстановлением убихинона до убихинола (Baysal et al., Science 2000; и Tomlinson et al., Nature Genetics 2002). Обнаружено, что генеративные мутации в SDH В, С и D субъединицах инициируют события семейной параганглиомы или лейомиомы (Baysal et al., Science 2000).
Иммуноблоттинг использовался для характеристики экспрессии SDH субъединицы В в митохондриальных препаратах раковых клеток, обработанных коэнзимом Q10. Результаты подтверждают, что обработка коэнзимом Q10 связана с возрастанием уровней SDH белка в митохондриях клеток. Эти результаты подтверждают, что одним из механизмов действия коэнзима Q10 является переключение метаболизма клеток на ТСА цикл и на митохондрии благодаря возрастанию уровней митохондриальных ферментов, таких как SDHB. Результаты суммированы в таблице ниже.
- 145 034552
Таблица 94
Сукцинат дегидрогеназа В в NCIE0808 митопрепаратах
Состав - Время Средний нормализованный объем
Среда 531
50 мкМ Коэнзим Q10, Зч 634
100 мкМ Коэнзим Q10, Зч 964
50 мкМ Коэнзим Q10, 6ч 1077
100 мкМ Коэнзим Q10, 6ч 934
Индуцирующий гипоксию фактор - 1.
Индуцирующий гипоксию фактор (Hif) является транскрипционным фактором, состоящим из альфа и бета субъединиц. При нормоксии уровни белка Hif1 альфа очень низкие вследствие его постоянной деградации в последовательности посттрансляционных событий. Обычно считается, что переключение между гликолизом и окислительным фосфорилированием контролируется совместной активностью двух ферментов PDH и LDH, которые определяют катаболическую судьбу пирувата. Hif контролирует эту критическую точку бифуркации, индуцируя уровни LDH и ингибируя активность PDH путем стимуляции PDK. Благодаря своей способности отводить метаболизм пирувата от митохондрий в цитоплазму, Hif считается ключевым медиатором биоэнергетического переключения в раковой клетке.
Воздействие коэнзима Q10 снижает уровни белка Hif1 альфа в митохондриальных препаратах раковых клеток. В лизатах нормальных клеток также наблюдается более слабая полоса Hif1, показывающая снижение. Результаты суммированы в таблицах ниже.
Таблица 95
Hif1 альфа слабая полоса в HASMC клетках после обработки
Количество - Состав Нормализованный объем
5г48-Среда 22244
5г48-50-Коэнзим Q10 21664
5г48-100-Коэнзим Q10 19540
22048-Среда 14752
22G48-50-Коэнзим Q10 17496
22G48-100-Коэнзим Q10 23111
22024-Среда 21073
22О24-50-Коэнзим Q10 18486
22G24-100-Коэнзим Q10 17919
- 146 034552
Таблица 96
Hif1 альфа более сильная полоса в HepG2 после обработки
Количество - Состав Нормализоавнный объем
5г24-Среда 12186
5г24-50-Коэнзим Q10 8998
5г24-100-Коэнзим Q10 9315
5г48-Среда 8868
5г48-50-Коэнзим Q10 8601
5 г48-100-Коэнзим Q10 10192
22024-Среда 11748
22О24-50-Коэнзим Q10 14089
22G24-100-Коэнзим Q10 8530
22048-Среда 8695
22О48-50-Коэнзим Q10 9416
22G48-100-Коэнзим Q10 5608
Пример 43. Анализ степени потребления кислорода (OCR) и внеклеточной кислотности (ECAR) в нормальных и раковых клетках, обработанных CoQ10.
Этот пример демонстрирует, что воздействие на клетки репрезентативной МВМ/эпипереключателем изобретения - CoQ10 - в отсутствие и/или присутствии стрессора (например, гиперглицемии, гипоксии, молочной кислоты), связано с переключением между гликолизом/биосинтезом лактата и митохондриальным окислительным фосфорилированием (как оценено по значениям ECAR и OCR), в сторону значений, наблюдаемых в нормальных клетках при нормальных физиологических условиях.
Заявители демонстрировали в предыдущих разделах, что воздействие CoQ10 на раковые клетки связано с изменениями экспрессии определенных белков, которые усиливают митохондриальное окислительное фосфорилирование, с сопутствующим снижением гликолиза и биосинтеза лактата. Этот пример показывает, что непосредственную оценку митохондриального окислительного фосфорилирования можно наблюдать путем подсчета степени потребления кислорода (OCR) в клеточных линиях с использованием SeaHorse XF анализатора, инструмента, который оценивает растворенный кислород и внеклеточные уровни в in vitro экспериментальной модели (SeaHorse Biosciences Inc, North Billerica, MA).
pH внеклеточного микроокружения сравнительно кислый в опухолях по сравнению с внутриклеточным (цитоплазматическим) рН и окружающими нормальными тканями. Этот характерный признак опухолей служит множеству целей, включая способность нарушать внеклеточный матрикс (ЕСМ), отличительную черту опухолевых метастаз, которая впоследствии инициирует сигнальный каскад, который затем модулирует ангиогенез в опухоли, повышенную активацию механизма остановки, контролирующего включение-выключение клеточного цикла, иммуномодулирующие механизмы, которые содействуют системе клеточной системы уклонения от иммунного надзора, элементы метаболического контроля, которые повышают зависимость от гликолитического потока и потребления лактата, дисрегуляцию ключевых семейств апоптозных генов, таких как Bcl-2, IAP, EndoG, AIF, которые служат возрастанию онкогенности.
Не имея стремления ограничиваться какой-либо определенной теорией, кислая рН внешнего микроокружения в опухоли является последствием возрастания концентрации ионов водорода, вышедших из опухолевых клеток из-за возросшего образования лактата из-за изменившегося гликолитического фенотипа.
В этом эксперименте OCR и степень внеклеточной кислотности (ECAR) в нормальных клеточных линиях наблюдались в присутствии и отсутствие CoQ10 для определения базовых величин. Наблюдалось, что в своем естественном окружении базовые степени OCR в нормальных клеточных линиях различны, и обычно зависят от физиологической роли клеток в теле.
Например, одна серия экспериментов была проведена с использованием неканцерогенной клеточной линии HDFa, которая является клеточной линией дермальных фибробластов у взрослых людей. Фибробласты - клетки, которые в основном синтезируют и секретируют компоненты внеклеточного матрикса (ЕСМ) и коллаген, который формирует структурный каркас (строму) тканей. Кроме того, известно,
- 147 034552 что фибробласты служат в ткани посредниками множества функций, таких как заживление мелких ран и местная иммуномодуляция. При нормальных физиологических условиях энергетические потребности нормальных фибробластов удовлетворяются использованием комбинации гликолиза и окислительного фосфорилировния - гликолиз предоставляет необходимые вещества для синтеза ЕСМ.
В отличие от HDF, HASMC (клетки гладкой мускулатуры аорты человека) находятся в артериях, венах, лимфатических сосудах, пищеварительном тракте, дыхательных путях, мочевом пузыре и в других тканях со способностью подвергаться регулируемому возбуждению и сокращению. Способность гладких мускулов, таких как клетки HASMC, сокращаться, требует энергии, запасенной в АТФ. Эти ткани переходят от низкоэнергетической модели, когда АТФ может поставляться из митохондрий, к высокоэнергетической модели (во время физической активности/стресса), когда энергия предоставляется путем переключения на гликолиз для быстрого образования АТФ. Таким образом, нормальные клетки гладкой мускулатуры могут использовать комбинацию митохондриального OXPHOS и гликолиза для удовлетворения своих энергетических потребностей в нормальном физиологическом состоянии.
Разница в их сравнительных физиологических ролях (т.е. HDFa и HASMC) наблюдалась в остаточных OCR значениях, подсчитанных в этих клеточных линиях с использованием SeaHorse XF анализатора. Фиг. 37 и 38 ниже описывают OCR в HDFa и HASMC клетках, растущих в условиях физиологически нормального количества глюкозы (около 4,6 мМ) и при повышенной глюкозе (гипергликемия).
Базовое значение OCR для HDFa в отсутствие каких-либо воздействий при нормальной доступности кислорода примерно 40 пмоль/мин (фиг. 37; выше) в присутствии 5,5 мМ глюкозы. Это значение слегка повысилось, когда клетки содержали в 22 мМ глюкозе. Напротив, в клетках HASMC значения OCR при 5,5 мМ глюкозы примерно 90 пмоль/мин, и значение OCR уменьшилось до примерно 40 пмоль/мин в присутствии 22 мМ глюкозы. Таким образом, в условиях гипергликемии существует различная реакция у HDFa и HASMC, что демонстрирует врожденные различия в их соответствующем физиологическом складе и функциях.
Обработка CoQ10 в клетках связана с изменениями в OCR, которая проявляется в условиях, наблюдаемых при нормальных глюкозных условиях (5 мМ). Сложность физиологического ответа соответствует присутствию малой плотности кислорода. Таким образом, влияние CoQ10 связано с изменениями в степенях OCR в нормальных клетках в сторону физиологического статуса, который присущ определенным типам клеток.
Табл. 97 ниже описывает значения ECAR (мрН/мин) в HDFa клетках в присутствии или отсутствие CoQ10 в условиях нормоксии и гипоксии при 5,5 мМ и 22 мМ глюкозы. Можно видеть, что у нормальных клеток обработка CoQ10 имела минимальное влияние на значения ECAR, даже когда было оказано влияние на OCR в этих клетках. В условиях гипоксии при больших значениях глюкозы обработка CoQ10 была связана с понижением повышенного ECAR до значения, которое наблюдалось в условиях нормоксии и отсутствии обработки.
Таблица 97
ECAR значения в HDFa клетках в отсутствие и присутствии CoQ10 в условиях нормоксии и гипоксии при 5,5 и 22 мМ глюкозы
Нормоксия (5,5 Гипоксия (5,5 Нормоксия (22 Гипоксия (22 мМ) мМ) мМ) мМ)
Обработка ECAR SEM ECAR SEM ECAR SEM ECAR SEM
Необработанные 5 1,32 5 0,62 5 0,62 9 0,81
50мкМ 31510 6 1,И 5 0,78 5 0,78 6 0,70
ЮОмкМ 31510 6 0,76 5 1,19 5 1,19 8 1,07
В табл. 98 оцененные базовые значения ECAR (мрН/мин) в HASMC были выше по сравнению с HDFa. To, что условия гипоксии стали причиной повышения ECAR, скорее всего связано с тем, что внутриклеточная гипоксия вызывает ацидозы во вторую очередь после возрастания гликолиза.
Таблица 98 ECAR значения в клетках HASMC в отсутствие и присутствии CoQ10 в условиях нормоксии и гипоксии в условиях 5,5 и 22 мМ глюкозы
Нормоксия (5,5 Гипоксия (5,5 Нормоксия (22 Гипоксия (22 мМ) мМ) мМ) мМ)
Обработка ECAR SEM ECAR SEM ECAR SEM ECAR SEM
Необработанные 9 2,22 11 2,18 22 2,08 19 1,45
50мкМ 31510 9 2,13 11 2,54 21 1,72 17 1,60
ЮОмкМ 31510 9 1,72 13 2,30 22 1,64 17 1,47
Наблюдалось, что обработка CoQ10 связана со спускающимся трендом степеней ECAR в гипергли- 148 034552 кемичных клетках HASMC в условиях гипоксии по сравнению со значением, которое наблюдается в условиях нормоксии при нормальной глюкозе. Эти данные показывают наличие физиологической изменчивости, которое свойственно физиологической роли определенного типа клеток, изменения наблюдаются при анормальных условиях (например, гипергликемии) и происходит переключение на норму при воздействии CoQ10.
Напротив, раковые клетки (например, MCF-7, РаСа-2) по сути своей склонны к культуре с более высокими уровнями глюкозы по сравнению с нормальными клетками из-за своего гликолитического фенотипа, поддерживающегося в культуре. Воздействие CoQ10 приводит к последовательному уменьшению значений OCR (фиг. 39 и 40).
Действие CoQ10 на значения OCR в MCF-7 и РаСа-2 клетках было подобно действию на нормальные HDFa и HASMC клетки, тогда как вариабельный ответ подтверждал терапевтическую реакцию, основанную на индивидуальном метаболитическом профиле линии раковых клеток.
Таблица 99
ECAR значения в РаСа-2 клетках в отсутствие и присутствии CoQ10 в условиях нормоксии и гипоксии при 5,5 и 22 мМ глюкозе
Нормоксия (17 Гипоксия (17 Нормоксия (22 Гипоксия (22 мМ) мМ) мМ) мМ)
Обработка ECAR SEM ECAR SEM ECAR SEM ECAR SEM
Необработанные 21 5,97 16 3,41 24 4,35 36 5,65
50мкМ 31510 13 3,08 12 1,66 20 5,15 25 4,58
ЮОмкМ 31510 14 2,14 17 2,59 19 3,38 30 5,62
Табл. 99 описывает значения ECAR в РаСа-2 клетках. В отличие от нормальных клеток, раковые клетки фенотипически склонны использовать высокие уровни глюкозы для образования АТФ (усиленный гликолиз), что приводит к повышенному ECAR (табл. 99, ECAR для необработанной нормоксии 17 мМ) при 21 мрН/мин. Обработка CoQ10 дает значительное уменьшение степени ECAR при этих условия, скорее всего связанное с уменьшением вырабатываемой при гликолизе молочной кислоты. Связанное уменьшение OCR в этих клетках скорее всего связано с повышенной эффективностью митохондриального OXPHOS.
Подобное сравнение OCR и ECAR значений (данные не показаны), определенных для множества других нормальных и раковых клеток, включает НАЕС (нормальные эндотелиальные клетки аорты человека), MCF-7 (рак молочной железы), HepG2 (рак печени) и сильно метастазирующие РС-3 (рак простаты) клеточные линии. Во всех этих исследуемых линиях воздействие CoQ10 в отсутствие и/или присутствии стрессоров (например, гипергликемии, гипоксии, молочной кислоты) было связано с переключением в значениях OCR и ECAR к значениям, наблюдаемым в нормальных клетках при нормальных физиологических условиях. Таким образом, общее действие CoQ10 на лечение рака, включая клеточную гибель, является эффектом потока из-за его совместного влияния на протеомические, геномные, метаболические результаты одновременно с переключением клеточной биоэнергетики с гликолиза на митохондриальное OXPHOS.
Пример 44. Структурные молекулярные элементы для биосинтеза CoQ10.
Этот пример демонстрирует, что определенные предшественники биосинтеза CoQ10, такие как те, которые участвуют в биосинтезе бензохинонового кольца, и те, которые участвуют в биосинтезе изопроновых повторов и их присоединении к бензохиноновому кольцу (компоненты структурных элементов), могут вводиться отдельно или вводиться в комбинации с целевыми клетками, и оказывать эффект отрицательной регуляции на ингибитор апоптозов Bcl-2, и/или положительной регуляции на промотор апоптозов каспазу-3. Определенные предшественники или их комбинации могут также ингибировать клеточную пролиферацию. Данные подтверждают, что такие предшественники CoQ10 могут быть использованы вместо CoQ10 для достижения по большей части таких же результатов, как и при введении CoQ10.
Определенные приведенные в качестве примера экспериментальные условия, использованные в экспериментах, перечислены ниже.
Skmel-28 клетки меланомы культивировались в DMEM/F12 с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1X конечной концентрации антибиотиков. Клетки росли до 85% заселенности и были обработаны компонентами структурных элементов в течение 3, 6, 12 и 24 ч. Клетки затем были собраны и проведен иммуноблоттинг.
Исследуемые компоненты строительных элементов включали L-фенилаланин, DL-фенилаланин, Dфенилаланин, L-тирозин, DL-тирозин, D-тирозин, 4-гидроксифенилпируват, фенилацетат, 3-метокси-4гидроксиманделат (манделат ванилина или VMA), ванилиновую кислоту, 4-гидроксибензоат, пироксин, пантенол, мевалоновую кислоту, ацетилглицин, ацетил-СоА, фарнезил и 2,3-диметокси-5-метил-пбензохинон.
Для иммуноблоттинга клетки были собраны в холодный PBS, лизированы и уровни белка были ко- 149 034552 личественно определены с использованием ВСА белкового анализа. Общий лизат клеток был помещен в 12% Tris-HCl гель. Белки затем были перенесены на нитроцеллюлозную бумагу, а затем блокированы 5% сывороткой Tris-буферного раствора в течение 1 ч. Белки затем подвергались действию первичных антител (Bcl-2 и каспаза-3) в течение ночи. Нитроцеллюлозная бумага затем экспозировалась в Pico Chemilluminescent на 5 мин и регистрировалась экспрессия белка. После экспозиции актин подсчитывался по такому же способу. С использованием ImageJ были подсчитаны уровни белковой экспрессии. t-Тест использовался для анализа статистической достоверности.
Иллюстративные результаты экспериментов представлены ниже.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов L-фенилаланина.
Перед тем как вступить в путь синтеза структуры кольца хинона, L-фенилаланин превращается в тирозин. Иммуноблоттинг был проведен для определения любых изменений в экспрессии апоптозных белков в клетках меланомы. Тестировались следующие концентрации: 5, 25 и 100 мкМ. В первоначальных исследованиях L-фенилаланин добавлялся к DMEM/F12 среде, которая содержала его в концентрации 0,4 М. Для 5, 25 и 100 мкМ конечная концентрация L-фенилаланина в среде была 0,405, 0,425 и 0,500 М соответственно. Эти конечные концентрации исследовались на Skmel-28 клетках в течение периодов инкубации 3, 6, 12 и 24 ч. Клетки росли до 80% заселенности до добавления воздействующей среды и собирались с использованием процедуры иммуноблоттинга, как описано выше. Статистически достоверное снижение Bcl-2 наблюдалось при 100 мкМ L-фенилаланина после 3 и 12 ч инкубации. При 5 мкМ Lфенилаланина статистически достоверное снижение Bcl-2 наблюдалось после 6 ч инкубации. При 25 мкМ L-фенилаланина статистически достоверное снижение Bcl-2 и статистически достоверное возрастание каспазы-3 наблюдались после 12 ч инкубации. Статистически достоверное снижение Bcl-2 показывает изменение апоптозного потенциала, статистически достоверное возрастание каспазы-3 подтверждает, что клетки подверглись апоптозу. Имелась постоянная тенденция снижения Bcl-2 по сравнению с контролем, хотя из-за размера образцов и стандартного отклонения в этом эксперименте эти временные точки не были статистически достоверными.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов D-фенилаланина.
D-фенилаланин, химически синтезированная форма биоактивного L-фенилаланина, исследовался в сравнении с L-фенилаланином. Для всех трех концентраций (5, 25 и 100 мкМ) D-фенилаланина наблюдалось достоверное уменьшение экспрессии Bcl-2 после 6 ч инкубации. Кроме того, для 5 и 25 мкМ наблюдалось достоверное уменьшение после 3 ч инкубации. Для 5 и 100 мкМ концентраций наблюдалось достоверное возрастание экспрессии каспазы-3 после 6 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов DL-фенилаланина.
DL-фенилаланин также исследовался в сравнении с L-фенилаланином. Опять концентрации 5, 25 и 100 мкМ исследовались на Skmel-28 клетках. Периоды инкубации составляли 3, 6, 12 и 24 ч. Статистически достоверное возрастание каспазы-3 наблюдалось после 3 ч инкубации. Статистически достоверное снижение Bcl-2 наблюдалось после 24 ч инкубации. Хотя тенденция снижения Bcl-2 и возрастания каспазы-3 наблюдалась при всех концентрациях и на всех временных точках, это не было статистически достоверным в этом эксперименте.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов L-тирозина.
L-тирозин является компонентом структурных элементов в синтезе структуры кольца хинона CoQ10. Первичное исследование L-тирозина не дало концентраций белка, достаточно высоких для иммуноблоттинга. В этом исследовании концентрации 25 мкМ исследовались иммуноблоттингом. В DMEM/F12 среде использовалась содержащая L-тирозин динатриевая соль в концентрации 0.398467 М. Первоначальная концентрация была увеличена до 500 пМ, 5 и 15 мкМ. Статистически достоверное возрастание каспазы-3 наблюдалось для 500 пМ концентраций после 12 ч инкубации. Статистически достоверное снижение Bcl-2 наблюдалось для 5 мкМ концентрации после 24 ч инкубации. Статистически достоверное снижение Bcl-2 наблюдалось для 500 и 5 мкМ концентраций после 24 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов D-тирозина.
D-тирозин, синтетическая форма L-тирозина, исследовался в сравнении с апоптозным действием Lтирозина на клетки меланомы. Основываясь на первоначальных исследованиях L-тирозина, для иммуноблоттинга были выбраны концентрации ниже 25 мкМ. Тестируемыми концентрациями были 1, 5 и 15 мкМ. D-тирозин показал уменьшение экспрессии Bcl-2 при 5 и 15 мкМ концентрациях на 12- и 24часовых временных периодах. Каспаза-3 значительно возрастала при концентрациях 5 мкМ на 3, 12- и 24-временных периодах. Также наблюдалось возрастание экспрессии каспазы-3 при 1 мкМ на 12- и 24 временных периодах. Кроме того, существует возрастание экспрессии каспазы-3 при 5 мкМ на 12часовом временном периоде.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов DL-тирозина.
DL-тирозин, синтетическая форма L-тирозина, также исследовался в сравнении с апоптозным действием L-тирозина на клетки. Существует статистически достоверное уменьшение экспрессии Bel-2, наблюдаемое при 1 и 15 мкМ концентрациях после 12 ч инкубации и при 5 мкМ после 24 ч инкубации. Возрастание экспрессии каспазы-3 также наблюдалось при 5 и 15 мкМ после 12 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов 4-гидроксифенилпирувата.
- 150 034552
4-Гидроксифенилпируват получается из аминокислот тирозина и фенилаланина и может играть роль в синтезе структуры кольца. Концентрации 1, 5 и 15 мкМ исследовались на экспрессию Bel-2 и каспазы-3. Для 5 и 15 мкМ концентраций наблюдается значительное уменьшение экспрессии Bcl-2 после 24 ч инкубации и значительное возрастание экспрессии каспазы-3 после 12 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов фенилацетата.
Фенилацетат потенциально может превратиться в 4-гидроксибензоат, который играет роль в присоединении боковой цепи к структуре кольца. Тестировались следующие концентрации: 1, 5 и 15 мкМ. Для фенилацетата наблюдается уменьшение экспрессии Bel-2 для концентраций 5 и 15 мкМ после 12 и 24 ч инкубации. Возрастание экспрессии каспазы-3 наблюдалось для концентраций 5 и 15 мкМ после 12 и 24 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов 3-метокси-4-гидроксиманделат (манделат ванилина или VMA).
VMA является дополнительным компонентом для синтеза структуры кольца хинона CoQ10. Тестировались следующие концентрации: 100, 250, 500 нМ, 1, 25, 50 и 100 мкМ. Хотя статистически достоверное апоптозное действие в этом эксперименте не наблюдалось, данные показывают тенденцию снижения экспрессии Bcl-2.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов ванилиновой кислоты.
Ванилиновая кислота является предшественником синтеза кольца хинона и исследовалась в концентрациях 500 нМ, 5 и 15 мкМ. Экспрессию Bcl-2 и каспазы-3 оценили путем иммуноблоттинга. Ванилиновая кислота показала достоверное уменьшение экспрессии Bcl-2 при концентрациях 500 нМ и 5 мкМ на временной точке 24 ч инкубации. Для концентрации 15 мкМ наблюдается уменьшение экспрессии Вс1-2 после 3 ч инкубации. Для клеток, инкубированных с 15 мкМ в течение 24 ч, наблюдается значительное повышение экспрессии каспазы-3.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов 4-гидроксибензоата.
4-Гидроксибензойная кислота играет роль в присоединении изопреноидной боковой цепи к структуре кольца. Тестировались следующие концентрации: 500 нМ, 1 и 50 мкМ. Наблюдалось достоверное уменьшение экспрессии Bel-2 для концентраций 15 мкМ после 24 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов 4-пиродоксина.
Пиродоксин - другой предшествующий структурный элемент для синтеза структуры кольца хинона CoQ10. Для этого компонента тестировались следующие концентрации: 5, 25 и 100 мкМ. Клетки оценивались по уровням Bcl-2 и каспазы-3. Пиридоксин показал значительное снижение экспрессии Bcl-2 в клетках меланомы после 24 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов пантенола.
Пантенол играет роль в синтезе структуры кольца хинона CoQ10. Концентрации, тестируемые на клетках меланомы, были следующими: 5, 25 и 100 мкМ. Этот компонент показал значительное снижение экспрессии Bcl-2 при 25 мкМ концентрации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов мевалона.
Мевалоновая кислота является одним из основных компонентов в синтезе CoQ10. Для этого компонента тестировались следующие концентрации: 500 нМ, 1, 25 и 50 мкМ. В этом эксперименте не было показано достоверного уменьшения экспрессии Bel-2 или возрастания экспрессии каспазы-3.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов ацетилглицина.
Другим путем для синтеза CoQ10 является изопреноидный синтез (боковой цепи). Добавление ацетилглицина превращает коэнзим А в ацетил-СоА, который входит в путь мевалона для изопреноидного синтеза. Тестировались следующие концентрации: 5, 25 и 100 мкМ. Исследование ацетилглицина показало значительное уменьшение экспрессии Bcl-2 после 12 ч инкубации при концентрациях 5 и 25 мкМ. Значительное уменьшение Bcl-2 было отмечено при 100 мкМ концентрации при 24 ч временной точке инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов ацетил-СоА.
Ацетил-СоА является предшественником в мевалоновом пути в синтезе CoQ10. Тестировались следующие концентрации: 500 нМ, 1, 25 и 50 мкМ. Не наблюдалось значительного снижения экспрессии Bcl-2 или возрастания каспазы-3 при тестируемых концентрациях и временных точках.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов L-тирозина в комбинации с фарнезилом.
L-Тирозин является одним из предшественников в синтезе структуры кольца хинона CoQ10. Предыдущие эксперименты исследовали воздействие L-тирозина в среде с L-фенилаланином и L-тирозином. В этом исследовании L-тирозин изучался в среде без добавления L-фенилаланина и L-тирозина. В этом исследовании конечными тестируемыми концентрациями L-тирозина были 500 нМ, 5 и 15 мкМ. Фарнезил тестировался в концентрации 50 мкМ. Не наблюдалось достоверного влияния на 3 и 6-часовых временных точках.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов L-фенилаланина в комбинации с фарнезилом.
L-Фенилаланин, предшественник синтеза структуры кольца хинона, исследовался в комбинации с фарнезилом в среде, свободной от L-тирозина и L-фенилаланина. Иммуноблоттинг был проведен для оценки экспрессии Bcl-2 и каспазы-3. Конечными концентрациями L-фенилаланина были 5, 25 и 100
- 151 034552 мкМ. Фарнезил был добавлен в концентрации 50 мкМ. Это исследование показало уменьшение экспрессии Bcl-2 для большинства тестируемых концентраций и комбинаций, как показано в таблице ниже.
Lфенилаланин 3 ч 6 ч 12 ч 24 ч
Вс1-2 Cas-3 Вс1-2 Cas-3 Вс1-2 Cas-3 Вс1-2 Cas-3
5 мкМ X
5 мкМ w/ Фарнезил X X
25 мкМ X X
25 мкМ w/ Фарнезил X X
100 мкМ X X X
100 мкМ w/ Фарнезил X
Анализ клеточной пролиферации при комбинации 4-гидроксибензоата с бензохиноном.
Эта серия экспериментов использовала анализ клеточной пролиферации для определения действия комбинированных различных строительных блоков молекул на клеточную пролиферацию.
Первое исследование определяло действие комбинации 4-гидроксибензоата с бензохиноном. Клетки инкубировались 48 ч, после чего определялось число клеток для живых клеток. Каждая тестовая группа сравнивалась с контролем и каждая комбинационная группа сравнивалась с контролем по бензохинону. Композиции статистически анализировались при добавлении бензохинона. Следующая таблица суммирует результаты подсчета клеток, где X означает статистическое уменьшение числа клеток.
4-гидрокси По сравнению с Ctrl По сравнению с 4гидрокси композицией w/o бензохинона По сравнению с контролем по бензохинону
500 нм X
500 нм w/ Benzo (35 мкМ) X X
500 нм w/ Benzo (70 мкМ) X X
1 мкМ X
1 мкМ w/ Benzo (35 мкМ) X X
1 мкМ w/ Benzo (70 мкМ) X X
50 мкМ X
50 мкМ w/ Benzo (35 мкМ) X
50 мкМ w/ Benzo (70 мкМ) X X X
Существует значительное уменьшение числа клеток, инкубированных с 4-гидроксибензоатом и бензохиноном и в комбинации. Для комбинации 50 мкМ 4-гидроксибензоата в комбинации с 70 мкМ бензохинона существует значительное уменьшение числа клеток по сравнению с контролем по бензохинону. Это подтверждает синергетичечское действие этого молярного соотношения.
Дополнительные исследования были проведены для исследования дополнительных молярных соотношений. Для первого теста 4-гидроксибензоат был тестирован в концентрации 500 нМ, 1 и 50 мкМ. Эти концентрации тестировались в комбинации с 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохиноном (Benzo). Тестируемая концентрация Benzo составляла 25, 50 и 100 мкМ. Клетки меланомы росли до заселенности 80% и сажались в 6-луночные планшеты в концентрации 40K клеток на лунку. Клетки были обработаны CoQ10, 4-гидроксибензоатом, Benzo, и комбинацией 4-гидроксибензоат/бензо.
Т-тест был проведен с р<0,05 как статистически достоверной. X означает статистически достоверное уменьшение числа клеток.
- 152 034552
Контроль vs Benzo 25 мкМ X
Контроль vs Benzo (В) 50 мкМ
Контроль vs Benzo (В) 100 мкМ X
Контроль vs 4-Гидроксибензоат (НВ) Контроль нМ X
Контроль vs НВ 1 мкМ X
Контроль vs НВ 50 мкМ X
500 нМ НВ vs 500 нМ НВ w/ 25 В X
500 нМ НВ vs 500 нМ НВ w/ 50 В X
500 нМ НВ vs 500 нМ НВ w/ 100 В X
1 мкМ НВ vs 1 мкМ НВ w/ 25 В X
1 мкМ НВ vs 1 мкМ НВ w/ 50 В X
1 мкМ НВ vs 1 мкМ НВ w/ 100 В
50 мкМ НВ vs 50 мкМ НВ w/ 25 В X
50 мкМ НВ vs 50 мкМ НВ w/ 50 В X
50 мкМ НВ vs 50 мкМ НВ w/ 100 В
500 нМ НВ w/ 25 В vs 25 В X
500нМНВ w/50Bvs50B X
500 нМ НВ w/ 100 В vs 100 В X
1 мкМ НВ w/ 25 В vs 25 В X
1 мкМ НВ w/ 50 В vs 50 В X
1 мкМ НВ w/ 100 В vs 100 В
50 мкМ НВ w/ 25 В vs 25 В X
50 мкМ НВ w/ 50 В vs 50 В X
50 мкМ НВ w/ 100 В vs 100 В
Существует значительное уменьшение пролиферации клеток в среде, содержащей НВ. Больше того, комбинация НВ с бензохиноном показала значительное уменьшение числа клеток, сравнимое с клетками, инкубированными с соответствующими концентрациями бензохинона.
Анализ клеточной пролиферации также был сделан на клетках неонатальных фибробластов. Концентрации тестируемого НВ были 500 нМ, 5 и 25 мкМ. НВ также тестировался в комбинации с бензохиноном в концентрациях 25, 50 и 100 мкМ. Клетки меланомы были посажены по 40k клеток на лунку и были обработаны в течение 24 ч. Клетки были обработаны трипсином и подсчитаны с использованием счетчика.
Статистический анализ не показал значительного уменьшения клеток фибробластов. Это показывает минимальную токсичность или ее отсутствие в нормальных клетках.
Анализ клеточной пролиферации при комбинации фенилацетата и бензохинона.
Фенилацетат является предшественником синтеза 4-гидроксибензойной кислоты (облегчает присоединение структуры кольца). Анализ клеточной пролиферации был осуществлен для определения эффекта инкубации с фенилацетатом в комбинации с CoQ10 и бензохиноном.
- 153 034552
Контроль и 25/25 мкМ Ben X
Контроль и 25/50 мкМ Ben X
Контроль и 25/100 мкМ Ben X
Контроль и 25/25 мкМ Q-10 X
Контроль и 25/25 мкМ Q-10 X
Контроль и 25/50 мкМ Q-10 X
Контроль и 25/100 мкМ Q-10 X
Контроль и Ben 25 X
Контроль и Ben 50 X
Контроль и Ben 100 X
Контроль и Q-10 25
Контроль и Q-10 50
Контроль и Q-10 100 X
Ben 25 мкМ и 500 нМ/25 мкМ Ben X
Ben 25 мкМ и 5 нМ/25 мкМ Ben X
Ben 25 мкМ и 25 нМ/25 мкМ Ben X
Ben 50 мкМ и 500 нМ/50 мкМ Ben X
Ben 50 мкМ и 5 нМ/50 мкМ Ben X
Ben 50 мкМ и 25 нМ/50 мкМ Ben X
Ben 100 мкМ и 500 нМ/100 мкМ Ben
Ben 100 мкМ и 5 нМ/100 мкМ Ben
Ben 100 мкМ и 25 нМ/100 мкМ Ben
Q-10 25 мкМ и 500 нМ/25 мкМ Q-10 X
Q-10 25 мкМ и 5 нМ/25 мкМ Q-10 X
Q-10 25 мкМ и 25 нМ/25 мкМ Q-10 X
Q-10 50 мкМ и 500 нМ/50 мкМ Q-10 X
Q-10 50 мкМ и 5 нМ/50 мкМ Q-10 X
Q-10 50 мкМ и 25 нМ/50 мкМ Q-10 X
Q-10 100 мкМ и 500 нМ/100 мкМ Q-10 X
Q-10 100 мкМ и 5 нМ/100 мкМ Q-10 X
Q-10 100 мкМ и 25 нМ/100 мкМ Q-10 X
Данные показывают, что добавление фенилацетата в комбинации с бензохиноном значительно уменьшает клеточную пролиферацию. Комбинация с CoQ10 и фенилацетатом значительно уменьшает число клеток по сравнению с инкубацией с CoQ10 одним бензохиноном.
Анализ клеточной пролиферации при комбинации 4-гидроксибензоата с фарнезилом.
4-Гидроксибензоат был инкубирован в комбинации с фарнезилом. Суммарные результаты перечислены ниже. Группы 4-гидроксибензоата сравнивались с контрольными и фарнезил-контрольными группами. X означает статистически достоверное уменьшение числа клеток.
4-гидроксибензоат По сравнению с контролем По сравнению с 4гидрокси в совокупности с w/o фарнезилом По сравнению с фарнезил контролем
500 нМ X
500 нМ w/ фарнезил (35мкМ) X
- 154 034552
500 нМ w/ фарнезил (70мкМ) X
1 мкМ Ошибка
1 мкМ w/ фарнезил (35 мкМ) Ошибка
1 мкМ w/ фарнезил (70 мкМ) Ошибка
50 мкМ X
50 мкМ w/ фарнезил (35 мкМ) X
50 мкМ w/ фарнезил (70 мкМ) X
Анализ клеточной пролиферации при комбинации L-фенилаланина с бензохиноном.
Анализ клеточной пролиферации был проведен для тестирования комбинации L-фенилаланина в комбинации с безнохиноном. Ниже суммированы результаты по L-фенилаланину в сравнении с контролем и бензохиноновым контролем. X показывает статистически достоверное уменьшение.
L-фенилаланин По сравнению с контролем По сравнению с Lфенилаланином в совкупности с w/o бензохиноном По сравнению с бензохиноновым контролем
5 мкМ
5 мкМ w/ Benzo (50 мкМ) X
5 мкМ w/ Benzo (100 мкМ) X
25 мкМ
25 мкМ w/ Benzo (50 мкМ) X
25 мкМ w/ Benzo (100 мкМ) X
100 мкМ
100 mkMw/ Benzo (50 мкМ) X X X
100 mkMw/ Benzo (100 мкМ) X X X
Подобная синергетическая роль наблюдается для L-фенилаланина в комбинации с бензохиноном.
Анализ клеточной пролиферации при комбинации L-фенилаланина с фарнезилом.
Предварительные результаты комбинации исследований клеточной пролиферации L-фенилаланина, инкубированных в комбинации с фарнезилом. L-фенилаланин сравнивался с контрольными и фарнезилконтрольными группами. X обозначает статистически достоверное уменьшение числа клеток.
L-фенилаланин По сравнению с контролем По сравнению с Lфенилаланином в совокупности с w/o Фарнезил По сравнению с фарнезил контролем
5 мкМ
5 мкМ w/ Фарнезил (50 мкМ)
5 мкМ w/ Фарнезил (100 мкМ)
25 мкМ X
25 мкМ w/ Фарнезил (50 мкМ) X X X
25 мкМ w/ Фарнезил (100 мкМ) X X X
100 мкМ X
100 мкМ w/ Фарнезил (50 мкМ) X X
100 мкМ w/ Фарнезил (100 мкМ) X
Анализ клеточной пролиферации при комбинации L-тирозина с бензохиноном.
- 155 034552
L-тирозин использовался для инкубации в комбинации с бензохиноном, после чего было подсчитано число клеток. Группы сравнивались с контрольными группами и бензохиноновыми контрольными группами.
L-тирозин По сравнению с контролем По сравнению с Lтирозином в совокупности с w/o бензохиноном По сравнению с бензохиноновым контролем
500 нМ
500 нМ w/ Benzo (50 мкМ)
500 нМ w/ Benzo (100 мкМ)
5 мкМ X
5 мкМ w/ Benzo (50 мкМ) X
5 мкМ w/ Benzo (100 мкМ) X
15 мкМ X
15 мкМ w/ Benzo (50 мкМ) X
15 мкМ w/ Benzo (100 мкМ) X
Добавление бензохинона не амплифицирует эффект L-тирозина на число клеток.
Анализ клеточной пролиферации при комбинации L-тирозина с бензохиноном.
Это исследование исследует комбинацию L-тирозина с фарнезилом. Группы сравнивались с контролем и фарнезил-контрольными группами.
L-тирозин По сравнению с контролем По сравнению с Lтирозином в совокупности с w/o Фарнезил По сравнению с Фарнезил контролем
500 нМ
500 нМ w/ Фарнезил (50 мкМ)
500 нМ w/ Фарнезил (50 мкМ)
5 мкМ X
5 мкМ w/ Фарнезил (50 X
мкМ)
5 мкМ w/ Фарнезил (100 мкМ) X
15 мкМ X
15 мкМ w/ Фарнезил (50 мкМ) X
15 мкМ w/ Фарнезил (100 мкМ) X
Комбинация L-тирозина и фарнезила не приводит к синергическому эффекту на уменьшение числа клеток в этом эксперименте.
Синтез CoQ10 разделяется на две основные части, которые состоят из синтеза структуры кольца и синтеза структуры боковой цепи. Здесь к онкогенным клеткам были добавлены вещества, которые являются предшественниками для компонентов синтеза боковой цепи и структуры кольца. Наши результаты сосредоточены на исследовании 3 основных компонентов, включенных в синтез структуры кольца, и двух компонентов, которые играют роль в присоединении структуры кольца к структуре боковой цепи. Тремя компонентами, показавшими значительное уменьшение Bcl-2 и возрастание каспазы-3 экспрессии, были: 1) L-фенилаланин, 2) L-тирозин и 3) 4-гидроксифенилпируват. Двумя компонентами, включенными в присоединение боковой цепи к структуре кольца, были: 1) 4-гидроксибензоат и 2) фенилацетат.
Наши результаты также показали, что экзогенная доставка этих компонентов в комбинации с 2,3диметокси-5-метил-п-бензохиноном (бензохинон) значительно ингибирует пролиферацию клеток. Это
- 156 034552 показывает, что добавка структуры кольца с компонентами для присоединения боковой цепи к бензохиноновому кольцу может дополнительно усилить механизм синтеза CoQ10. Это может также содействовать стабилизации молекулы в поддержании функциональных свойств, необходимых для клеточных процессов. Фенилацетат, являющийся предшественником синтеза 4-гидроксибензоата, который экзогенно доставляется в комбинации с бензохиноном и имеет подобное влияние на онкогенные клетки.
Пример 45. Модуляция генной экспрессии коэнзимом Q10 в клеточной модели диабета.
Коэнзим Q10 является эндогенной молекулой с устоявшейся ролью в поддержании нормальной митохондриальной фукнции, прямо влияя на окислительное фосфорилирование. Существует экспериментальное доказательство, которое демонстрирует способность коэнзима Q10 модулировать внутриклеточные цели, которые служат ключевыми показателями метаболических расстройств, таких как диабеты, таким образом достигая терапевтического эффекта.
Для того чтобы понять, как коэнзим Q10 регулирует экспрессию генов, связанных с причиной или лечением диабета, в качестве экспериментальной модели были использованы иммортальная первичная линия клеток проксимальных канальцев почек, произошедшая из почки человека (HK-2), и первичные культуры гладких мускульных клеток аорты человека (HASMC). HK-2 и HASMC клетки нормально поддерживаются в культуре с 5,5 мМ глюкозы, которая является концентрацией, связанной с диапазоном, считающимся нормальным для крови человека. Однако для того чтобы симулировать диабетическое окружение, обе клеточные линии впоследствии содержались при 22 мМ глюкозы, что соответствует значениям, наблюдаемым в крови человека, связанным с хронической гипергликемией. Клеткам впоследствии дали размножаться через 3 перехода, так что во внутриклеточных регуляционных процессах МВМ функционально адаптировались к диабетическому состоянию. Выбор клеточной линии основывался на физиологическом влиянии диабета на почечную дисфункцию и прогрессию абсолютной почечной недостаточности (ESRD) в добавление к прогрессивной патофизиологии подорванной кардиоваскулярной функции.
Действие коэнзима Q10 на экспрессию генов в HK-2 клетках с использованием диабетического ПНР анализа.
Диабетический ПНР анализ (SABiosciences) применяется для скринирования 84 генов одновременно. В этом исследовании тестировались следующее 4 обработки:
HK-2;
HK-2^), содержавшаяся при 22 мМ глюкозы;
HK-2^) + 50 мкМ коэнзима Q10 и
HK-2^) + 100 мкМ коэнзима Q10.
Точный анализ данных ПЦР в режиме реального времени HK-2 образцов по диабетическому анализу (Cat # PAHS-023E, SABiosciences Frederick, Мэриленд) был сделан для того, чтобы исключить все результаты, где регуляция генов менее чем в два раза по сравнению с нормальными необработанными HK2 клетками с значением р менее чем 0,05. Гены, для которых наблюдалось, что они регулируются или хронической гипергликемией, или коэнзимом Q10, перечислены в табл. 100 и их функции и внутриклеточная локация (взятые из Ingenuity Pathway Analysis) перечислены в табл. 101.
Таблица 100
Гены НК-2(Н) Кратность регуляции Значение р НК-2(Н)-50 мкМ Коэнзим Q10 кратность регуляции значени ер НК-2(Н)-100 мкМ Коэнзим Q10 Кратность регуляции Значение р
СЕАСАМ1 1,26 0,409 3,47 0,067 5,36 0,032
PIK3C2B 1,48 0,131 2,32 0,115 3,31 0,003
INSR -1,09 0,568 2,51 0,103 2,88 0,024
TNF 2,00 0,005 2,57 0,042 2,81 0,020
ENPP1 -1,50 0,002 1,42 0,238 2,67 0,038
PRKCB -1,75 0,005 1,82 0,280 2,49 0,042
DUSP4 1,27 0,318 1,24 0,455 2,26 0,060
SELL -1,58 0,219 1,77 0,042 2,06 0,021
SNAP25 -1,00 0,934 1,46 0,377 1,97 0,059
Таблица 101
Обозначени е Entrez название гена Локализация Тип(ы)
СЕАСАМ1 Молекула клеточной адгезии 1, связанная с карциоэмбриональным антигеном (билиарный гликопротеин) Плазматическая мембрана трансмембранн ый рецептор
- 157 034552
PIK3C2B фосфоинозитид-3-киназа, класс 2, бета полипептид Цитоплазма Киназа
INSR Инсулировый рецептор Плазматическая мембрана Киназа
TNF Фактор некроза опухолей (TNF суперсемейство, член 2) Внеклеточное пространство Цитокин
ENPP1 Эктонуклеотидная пирофосфатаза/фосфодиэстераза 1 Плазматическая мембрана Фермент
PRKCB Протеинкиназа С, бета Цитоплазма Киназа
DUSP4 Двойная специфичная фосфатаза 4 -Ядро Фосфатаза
SELL Селектин L Плазматическая мембрана Другое
SNAP25 Синаптосома-ассоциированный белок, 25кДа Плазматическая мембрана Транспортер
Среди детектируемых РНК транскриптов с модулированными уровнями ракового эмбрионального антигена молекула клеточной адгезии 1 (СЕАСАМ1) была идентифицирована как высоко положительно регулируемая в HK-2(H) клетках, особенно обработкой 100 мкМ коэнзима Q10. СЕАСАМ-1, также известный как CD66a и BGP-I, является 115-200 KD типом I трансмембранного гликопротеина, который принадлежит к субсемейству мембран-связанных СЕА из суперсемейства СЕА. На поверхности клеток он формирует нековалентные гомо- и гетеродимеры. Внеклеточный регион содержит три С2-типа Igподобных доменов и один N-терминальный V-тип Ig-подобного домена. Существуют множественные сплайс-вариации, включающие С-терминальные регионы для второго С2-типа домена (аа 320 и далее). Предполагается, что отсутствие интактной экспрессии СЕАСАМ1 у мышей усиливает метаболический синдром, связанный с диабетами, тогда как возрастание экспрессии СЕАСАМ1 связывается с возрастающей инсулиновой интернализацией, которая подтверждает возрастание инсулиновой чувствительности и утилизации глюкозы (например, движения глюкозы из крови в клетки), таким образом смягчая резистентность к инсулину, отличительный признак сахарного диабета 2 типа.
Как показано в табл. 100, экспрессия инсулинового рецептора (INSR) также меняется в диабетических HK-2 клетках, обработанных коэнзимом Q10. Не имея стремления ограничиваться теорией, возрастание экспрессии INSR при обработке коэнзимом Q10 должно усилить чувствительность к инсулину (или одного, или в совокупности с экспрессией СЕАСАМ1) с возможностью развернуть основные физиологические/метаболические трудности, связанные с диабетом.
Действие коэнзима Q10 на экспрессию генов в HK-2 клетках с использованием митохондриального анализа.
Дифференциальная экспрессия митохондриальных генов при диабете оценивалась с использованием митохондриальных анализов (Cat# PAHS 087E, SABisociences Frederick, Мэриленд). Гены, которые регулируются хронической гипергликемией и/или воздействием коэнзима Q10, перечислены в табл. 102, а их функции и локализация перечислены в табл. 103.
Таблица 102
Гены НК 2 (Н) необработа нный Р значение НК-2(Н) 50 мкМ Коэнзима Q10 р значение НК-2(Н) 100 мкМ Коэнзима Q10 Р значение
GRPEL1 -1,5837 0,151255 -2,6512 0,04704 -1,933 0,139161
SLC25A3 -8,6338 0,071951 -8,2059 0,0425 -1,6984 0,995194
TOMM40 -2,3134 0,140033 -1,1567 0,115407 -1,9509 0,038762
TSPO -3,6385 0,111056 -6,7583 0,073769 -2,1104 0,167084
- 158 034552
Таблица 103
Обозначение Entrez Название гена Локализация Тип(ы)
GRPEL1 GrpE-подобный 1, митохондриальный (Е. coli) Митохондрия Другое
SLC25A3 Растворимых переносчиков семейство 25 (митохондриальный переносчик; фосфата переносчик), член 3 Митохондриальная мембрана. Транспортер
ТОММ40 Транслоказа внешнего митохондриального мембранного 40 гомолога(дрожжи) Внешняя мембрана митохондрии. Ионный канал
TSPO Транс локаторный белок (18кДа) Внешняя мембрана митохондрии. Трансмембранный рецептор
На сегодняшний день роль четырех митохондриальных генов, идентифицированных (табл. 102) в диабетических HK-2 клетках, обработанных коэнзимом Q10, не охарактеризована в диабете.
Исследование 2. Действие коэнзима Q10 на экспрессию генов в HASMC клетках с использованием диабетического ПЦР анализа.
Диабетический ПЦР анализ (SABiosciences) позволяет скринировать одновременно 84 гена. 4 обработками, тестированными в этом исследовании, были:
HASMC;
HASMC(H), содержавшиеся в 22 мМ глюкозы;
HASMC^) + 50 мкМ коэнзима Q10 и
HASMC(H) + 100 мкМ коэнзима Q10.
Точный анализ данных ПЦР в режиме реального времени HASMC образцов по диабетическому анализу (Cat # PAHS-023E, SABiosciences Frederick, Мэриленд) был сделан для того, чтобы исключить все результаты, где регуляция генов менее чем в два раза по сравнению с нормальными необработанными HASMC клетками с значением p менее чем 0,05. Гены, для которых наблюдалось, что они регулируются или хронической гипергликемией, и/или коэнзимом Q10, перечислены в табл. 104.
Таблица 104
Гены HASMC- (H) значение Р HASMC- (Н)-50 мкМ коэнзима Q10 значение Р HASMC(Н)-100 мкМ коэнзима Q10 значение р
AGT 1,3051 0,547507 -1,0169 0,781622 2,3027 0,030195
CCL5 -17,4179 0,013798 -5,3796 0,022489 -4,6913 0,022696
СЕАСАМ1 -5,5629 0,012985 -5,3424 0,014436 -5,8025 0,012948
IL6 2,7085 0,049263 3,8172 0,012685 6,0349 0,000775
INSR 1,4649 0,207788 1,9622 0,081204 2,0801 0,016316
NFKB1 1,482 0,072924 1,3779 0,191191 2,0898 0,027694
PIK3C2B 2,0479 0,218276 1,4331 0,254894 2,6329 0,069422
SELL -1,9308 0,087513 1,2476 0,393904 4,0371 0,000177
TNF -1,814 0,108322 -3,2434 0,043526 -1,8489 0,133757
В клетках HASMC обработка гипергликемичных клеток коэнзимом Q10 привела к изменению экспрессии в генах, включенных в регуляцию васкулярной функции (AGT), чувствительности к инсулину (СЕАСАМ1, INSR, SELL) и воспалительной/иммунной функции (TL-6, TNF, CCL5). Не имея стремления ограничиваться теорией, возрастание экспрессии INSR может быть связано с возрастанием инсулиновой чувствительности в HASMC клетках, которая является физиологическим свойством, которое благоприятно для лечения диабета, тогда как IL-6, в дополнение к своим иммунорегулирующим свойствам, как предполагается, действует на гомеостаз и метаболизм глюкозы как прямо, так и опосредованно, путем действия на скелетные мышечные клетки, адипоциты, гепаоциты, панкреатические β-клетки и нейроэндокринные клетки. Перед активацией нормальная Т-клетка экспрессирует и секретирует RANTES и хемокиновый (C-Cmotif) лиганд (CCL5). CCL5 экспрессируется адипоцитами, и уровни RANTES в сыворотке возрастают при ожирении и диабете 2 типа. Однако, как показано в табл. 104, обработка HASMC клеток коэнзимом Q10 приводит к значительному уменьшению экспрессии CCL5. Основываясь на вышеизложенных данных, мы надеемся, что введение коэнзима Q10 будет давать терапевтическую пользу в лечении диабета.
Действие коэнзима Q10 на экспрессию генов в HASMC клетках с использованием митохондриального анализа.
Различная экспрессия митохондриальных генов была исследована с использованием митохондриального анализа (Cat# PAHS 087E, SABisociences Frederick, Мэриленд). Гены, которые регулируются или хронической гипергликемией, и/или коэнзимом Q10, показаны в табл. 105.
- 159 034552
Таблица 105
Гены HASMC- (Н) значение Р HASMC(Н) 50 мкМ коэнзима Q10 значение Р HASMC- (Н)-100 мкМ коэнзима Q10 значение р
BCL2L1 -1,6558 0,244494 -2,7863 0,008744 -2,3001 0,014537
MFN1 -1,4992 0,317009 -1,2585 0,021185 -2,2632 0,005961
PMAIP1 -4,7816 0,206848 -6,8132 0,000158 -4,352 0,000286
SLC25A1 -2,2051 0,020868 -1,834 0,00581 -3,0001 0,03285
SLC25A13 -2,0527 0,035987 -1,5 0,029019 -1,5245 0,043712
SLC25A19 -1,0699 0,417217 -1,4257 0,104814 -2,1214 0,007737
SLC25A22 -2,1747 0,007344 -1,9839 0,0013 -10,3747 0,003437
TIMM44 -1,3605 0,414909 -2,3214 0,004118 -1,9931 0,010206
TOMM40 -1,1982 0,428061 -2,0922 0,002195 -2,2684 0,003272
TSPO -1,402 0,304875 -2,0586 0,061365 -2,3647 0,044656
Обработка гипергликемичных HASMC клеток коэнзимом Q10 привела к изменению экспрессии в генах, которые регулируют программируемую клеточную гибель или апоптоз (BCL2L1, PMIAP1 также известный как NOXA), белки транспортеры (SLC25А1 [транспортер цитрата], SLC25A13 [антипортер аспартата-глутамата], SLC25A19 [транспортер тиамин пирофосфата] и SLC25A22 [глутамат-гидроген котранспортер]) и белки транспорта в митохондриальном матриксе (MFN1, TIMM44 и ТОММ40). Активность этих транспортеров играет важную роль в регуляции предшественников, необходимых для цикла Кребса и поддержания митохондриального окислительного фосфорилирования. Эти результаты показывают, что воздействие на диабетические клетки HASMC коэнзимом Q10 связано с изменениями в экспрессии цитоплазматических и митохондриальных генов, что, в свою очередь, согласуется с тем, что коэнзим Q10 предоставляет терапевтическую пользу в лечении диабета.
Сравнение с данными, наблюдаемыми при воздействии на HASMC клетки и HK-2 клетки коэнзимом Q10 или в гипергликемическом окружении, показывает, что 4 гена обычно регулируются коэнзимом Q10 в обеих клеточных линиях (например, PIK3С2В и SELL в анализе генной экспрессии и ТОММ40 и TSPO в митохондриальном анализе). Эти результаты демонстрируют, что воздействие на клетки в диабетическом состоянии коэнзимом Q10 связано с изменением экспрессии генов, про которых известно, что они связаны с причиной или лечением диабета.
Пример 46. In vivo действие введения коэнзима Q10 на рак поджелудочной железы.
Внутривенное введение формулы с коэнзимом Q10 было оценено для лечения рака поджелудочной железы в модели на животных. Крысы с индуцированным раком поджелудочной железы были рандомально разделены на группы и получали одну из следующих 9 обработок:
группа А: контроль, группа В: солевой раствор, группа С: носитель, группа D: 5 мг/кг коэнзима Q10, группа Е: 10 мг/кг коэнзима Q10, группа F: 25 мг/кг коэнзима Q10, группа G: 50 мг/кг коэнзима Q10, группа Н: 5 мг/кг доксорубицина, группа I: 50 мг/кг коэнзима Q10 и 5 мг/кг доксорубицина.
После 28 дней все животные в группах А и В и большинство животных из группы С умерли. Напротив, большинство животных из групп D-F остались жить, и те животные, которые получали более высокие дозы коэнзима Q10, оставались в живых дольше. Более того, все животные, получавшие наиболее высокую дозу коэнзима Q10 (группа G), оставались живыми 28 дней. Эти данные показывают полную дозозависимую кривую, в которой животные, получающие более высокие дозы, имеют более высокий показатель выживаемости.
Чтобы оценить эффективность коэнзима Q10 в лечении рака поджелудочной железы в комбинации с доксорубицином, группе Н вводился один доксорубицин, тогда как группе I вводилась комбинация доксорубицина и коэнзима Q10. После 28 дней значительное число животных в группе Н умерло вследствие токсичности доксорубицина, тогда как у животных из группы I показатель выживаемости был выше. Эти данные подтверждают, что в дополнение к повышению выживаемости, связанной с раком поджелудочной железы, коэнзим Q10 может также смягчать токсические побочные эффекты химиотерапии.
Эквиваленты.
Специалисты в данной области понимают, или будут способны понять, используя обычные эксперименты, многие эквиваленты изобретений, описанных в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты полностью включены в объем формулы изобретения.

Claims (5)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ лечения или предотвращения прогрессирования онкологических заболеваний у млекопитающих, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, избирательно вызывающей в раковых клетках млекопитающих переключение клеточного энергетического метаболизма с гликолиза на митохондриальное окислительное фосфорилирование, к уровням, наблюдаемым в нормальных клетках млекопитающих при нормальных физиологических условиях, причем фармацевтическая композиция содержит комбинацию, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) комбинации 4-гидроксибензоата и 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинона;
    (b) комбинации фенилацетата и 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинона и (c) комбинации L-фенилаланина и 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинона.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что млекопитающим является человек.
  3. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что онкологическое заболевание реагирует или чувствительно к лечению CoQ10 или его аналогами.
  4. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что онкологическое заболевание выбрано из группы, состоящей из лейкемии, лимфомы, меланомы, карциномы и саркомы.
  5. 5. Способ по п.1, дополнительно включающий проведение хирургического вмешательства, радиационной терапии, гормональной терапии, терапии антителами, терапии факторами роста, цитокинами, и химиотерапии.
EA201101521A 2009-05-11 2010-05-11 Способ лечения или предотвращения прогрессирования онкологических заболеваний EA034552B1 (ru)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17724509P 2009-05-11 2009-05-11
US17724309P 2009-05-11 2009-05-11
US17724109P 2009-05-11 2009-05-11
US17724409P 2009-05-11 2009-05-11
US17724609P 2009-05-11 2009-05-11
PCT/US2010/034376 WO2010132440A2 (en) 2009-05-11 2010-05-11 Methods for treatment of oncological disorders using epimetabolic shifters, multidimensional intracellular molecules, or environmental influencers

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201101521A1 EA201101521A1 (ru) 2012-09-28
EA034552B1 true EA034552B1 (ru) 2020-02-19

Family

ID=43085533

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201101519A EA201101519A1 (ru) 2009-05-11 2010-05-11 Способы диагностики метаболических нарушений, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспектные внутриклеточные молекулы или факторы влияния
EA201101522A EA201101522A1 (ru) 2009-05-11 2010-05-11 Способы лечения болезней с использованием эпиметаболического переключателя (коэнзим q10)
EA201101520A EA201101520A1 (ru) 2009-05-11 2010-05-11 Способы диагностики онкологических заболеваний, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспектные внутриклеточные молекулы или факторы влияния
EA201101523A EA023913B1 (ru) 2009-05-11 2010-05-11 Способы лечения метаболических нарушений, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспектные внутриклеточные молекулы или факторы влияния
EA201101521A EA034552B1 (ru) 2009-05-11 2010-05-11 Способ лечения или предотвращения прогрессирования онкологических заболеваний

Family Applications Before (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201101519A EA201101519A1 (ru) 2009-05-11 2010-05-11 Способы диагностики метаболических нарушений, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспектные внутриклеточные молекулы или факторы влияния
EA201101522A EA201101522A1 (ru) 2009-05-11 2010-05-11 Способы лечения болезней с использованием эпиметаболического переключателя (коэнзим q10)
EA201101520A EA201101520A1 (ru) 2009-05-11 2010-05-11 Способы диагностики онкологических заболеваний, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспектные внутриклеточные молекулы или факторы влияния
EA201101523A EA023913B1 (ru) 2009-05-11 2010-05-11 Способы лечения метаболических нарушений, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспектные внутриклеточные молекулы или факторы влияния

Country Status (13)

Country Link
US (15) US9205064B2 (ru)
EP (5) EP2429511B1 (ru)
JP (13) JP6169846B2 (ru)
KR (7) KR20180056816A (ru)
CN (7) CN102481270A (ru)
AU (9) AU2010247800A1 (ru)
BR (5) BRPI1010908A2 (ru)
CA (5) CA2763347C (ru)
EA (5) EA201101519A1 (ru)
IL (5) IL216297A0 (ru)
MX (6) MX357528B (ru)
SG (10) SG10201402293SA (ru)
WO (5) WO2010132486A2 (ru)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2680825C (en) * 2007-03-22 2013-10-29 Cytotech Labs, Llc Topical formulations having enhanced bioavailability
CN102481270A (zh) 2009-05-11 2012-05-30 博格生物系统有限责任公司 利用表观代谢转变剂、多维细胞内分子或环境影响剂治疗肿瘤障碍的方法
WO2015103447A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 Rapamycin Holdings, Llc Oral rapamycin nanoparticle preparations and use
EP2544663B1 (en) 2010-03-12 2018-01-03 Berg LLC Intravenous formulations of coenzyme q10 (coq10) and methods of use thereof
CA2810746A1 (en) * 2010-06-30 2012-01-05 Galderma Research & Development Method for preventing or treating skin tumor
SG182016A1 (en) * 2010-12-14 2012-07-30 Univ Singapore Method of detecting resistance to cancer therapy
EP2656076B1 (en) * 2010-12-20 2017-11-01 Cameron K. Tebbi Methods of detecting leukemia/ lymphoma and induction of the same
US9783785B2 (en) 2010-12-20 2017-10-10 Cameron K. Tebbi Screening methods for detection of susceptibility to leukemia and lymphomas
CA2824752C (en) 2011-01-13 2018-08-14 Expression Pathology, Inc. Bcl-2-like protein 11 srm/mrm assay
WO2012104834A1 (en) * 2011-02-03 2012-08-09 Pharmedica Ltd. New oral dissolving films for insulin administration, for treating diabetes
CN103501859B (zh) 2011-03-02 2017-08-25 博格有限责任公司 基于细胞的探询式分析及其应用
RU2453849C1 (ru) * 2011-03-11 2012-06-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" Способ определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях
AU2012240222B2 (en) * 2011-04-04 2017-04-27 Berg Llc Methods of treating central nervous system tumors
WO2012174286A1 (en) * 2011-06-14 2012-12-20 Edison Pharmaceuticals, Inc. Catechol derivatives for treatment of oxidative stress diseases
EA201490047A1 (ru) 2011-06-17 2014-08-29 Берг Ллк Ингаляционные фармацевтические композиции
CN102453769A (zh) * 2011-12-27 2012-05-16 芮屈生物技术（上海）有限公司 白血病病变前期mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用
BR112014022103B1 (pt) 2012-03-06 2022-04-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Composições e seus usos
EA038600B1 (ru) * 2012-04-02 2021-09-21 Берг Ллк Основанные на клетках перекрестные анализы и их применение
NZ702369A (en) * 2012-06-01 2016-12-23 Berg Llc Treatment of solid tumors using coenzyme q10
MX2015002915A (es) * 2012-09-06 2015-07-06 Hitachi Chemical Co Ltd Metodos para estimacion de la inmunidad especifica de peptido.
WO2014046603A1 (en) 2012-09-19 2014-03-27 Grespo Ab Compositions for improvement of brain function
US10302630B2 (en) 2012-10-09 2019-05-28 The Procter & Gamble Company Method of identifying or evaluating beneficial actives and compositions containing the same
WO2014059009A1 (en) 2012-10-09 2014-04-17 The Procter & Gamble Company Method of identifying synergistic cosmetic combinations
US9138393B2 (en) 2013-02-08 2015-09-22 The Procter & Gamble Company Cosmetic compositions containing substituted azole and methods for improving the appearance of aging skin
US9144538B2 (en) 2013-02-08 2015-09-29 The Procter & Gamble Company Cosmetic compositions containing substituted azole and methods for alleviating the signs of photoaged skin
EP2967058A4 (en) * 2013-03-15 2017-03-01 The Board of Regents of The University of Texas System Use of inhibitors of mtor to improve vascular functions in apoe4 carriers
WO2014152086A1 (en) * 2013-03-19 2014-09-25 The Procter & Gamble Company Method of measuring the metabolic indicators of hair follicles
AU2014251045B2 (en) * 2013-04-08 2019-06-13 Berg Llc Treatment of cancer using coenzyme Q10 combination therapies
WO2014181968A1 (ko) * 2013-05-09 2014-11-13 가톨릭대학교 산학협력단 메트포민과 코엔자임 q10을 유효성분으로 함유하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물
EP3013371A4 (en) * 2013-06-26 2017-04-26 Rett Syndrome Research Trust Rett syndrome and treatments therefore
SG10201907816RA (en) 2013-09-04 2019-09-27 Berg Llc Methods of treatment of cancer by continuous infusion of coenzyme q10
CN103585619A (zh) * 2013-10-31 2014-02-19 浙江大学 Dj-1蛋白在制备骨肉瘤诊断和治疗产品中的应用
LT3071561T (lt) 2013-11-22 2021-08-25 Sabre Therapeutics Llc Autotaksino inhibitorių junginiai
US20160310572A1 (en) * 2013-12-02 2016-10-27 Wayne State University Compositions and methods to diagnose diabetes and/or to treat negative effects of diabetes
EP3094968B1 (en) * 2014-01-15 2020-12-09 The Regents of The University of California Metabolic screening for gestational diabetes
EP3129466B1 (en) * 2014-04-07 2020-08-05 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Modulating cell proliferation and pluripotency
CN111848494B (zh) 2014-04-17 2023-08-01 伊谬诺米特医疗有限公司 胍化合物及其用途
US9051320B1 (en) 2014-08-18 2015-06-09 Pharmakea, Inc. Methods for the treatment of metabolic disorders by a selective small molecule autotaxin inhibitor
EP3187878B1 (en) * 2014-08-26 2019-07-31 Keio University Anti-cancer agent sensitivity-determining marker
WO2016040725A1 (en) 2014-09-11 2016-03-17 Berg Llc Bayesian causal relationship network models for healthcare diagnosis and treatment based on patient data
US10632104B2 (en) 2015-05-27 2020-04-28 Sabre Therapeutics Llc Autotaxin inhibitors and uses thereof
DE112016003948T5 (de) 2015-08-31 2018-05-09 City Of Sapporo Molekulare verfahren zum beurteilen einer urothelialen erkrankung
US20170168055A1 (en) * 2015-12-11 2017-06-15 Expression Pathology, Inc. SRM/MRM Assays
EP3763732A1 (en) * 2016-11-25 2021-01-13 Koninklijke Philips N.V. Method to distinguish tumor suppressive foxo activity from oxidative stress
WO2018116307A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 The National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd. Methods for treating diabetes using vdac1 inhibitors
CN110191946A (zh) 2016-12-23 2019-08-30 学校法人庆应义塾 诱导cd8+t细胞的组合物及方法
EP3634391A4 (en) 2017-05-17 2021-02-24 Berg LLC USE OF COENZYME Q10 FORMULATIONS IN THE TREATMENT AND PREVENTION OF BUBBLE EPIDERMOLYSIS
CN109111522B (zh) * 2017-06-22 2022-02-01 北海康成（北京）医药科技有限公司 预测食管癌对抗erbb3抗体治疗的应答的方法和试剂盒
JP7209951B2 (ja) * 2017-10-30 2023-01-23 日本メナード化粧品株式会社 白髪予防及び改善剤
WO2019099873A1 (en) 2017-11-17 2019-05-23 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Cancer therapy by degrading dual mek signaling
AU2019217041B2 (en) * 2018-02-09 2022-09-15 Keio University Compositions and methods for the induction of CD8+ T-cells
SG11202102204PA (en) 2018-09-25 2021-04-29 Ponce De Leon Health Designated Activity Company Process of making calcium alpha-ketoglutarate
EP3914711A2 (en) 2019-01-23 2021-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of ophthalmic conditions with angiopoietin-like 7 (angptl7) inhibitors
US11845989B2 (en) 2019-01-23 2023-12-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of ophthalmic conditions with angiopoietin-like 7 (ANGPTL7) inhibitors
JP2022523564A (ja) 2019-03-04 2022-04-25 アイオーカレンツ， インコーポレイテッド 機械学習を使用するデータ圧縮および通信
WO2021102356A1 (en) 2019-11-20 2021-05-27 Berg Llc Combination therapy of a coenzyme q10 compound and radiation therapy for treatment of glioma
JP2021084891A (ja) * 2019-11-28 2021-06-03 株式会社ノエビア 抗老化剤
CN112924681B (zh) * 2019-12-05 2023-01-17 张曼 尿液krt10蛋白及其多肽片段在正常妊娠中的应用
KR102383788B1 (ko) * 2020-06-12 2022-04-05 이화여자대학교 산학협력단 신체적 스트레스 상태를 평가하는 방법
US20230255912A1 (en) * 2020-07-02 2023-08-17 Ponce De Leon Health Designated Activity Company Compositions and methods for treating crp-mediated diseases
US11938152B2 (en) 2020-08-06 2024-03-26 Kedar N Prasad High-dose antioxidants in cancer treatment
CA3201624A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of liver diseases with cell death inducing dffa like effector b (cideb) inhibitors
CA3210480A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of inflammation with glucocorticoids and angiopoietin-like 7 (angptl7) inhibitors
CN114306608B (zh) * 2022-01-04 2024-01-16 上海科技大学 一类适应低氧或缺氧微环境的肿瘤的治疗靶点及其应用
CN116486916A (zh) * 2022-11-03 2023-07-25 杭州联川生物技术股份有限公司 一种单细胞转录组濒死细胞和多细胞过滤方法、介质和设备
CN117347643B (zh) * 2023-12-05 2024-02-06 成都泰莱生物科技有限公司 用于判断肺部结节良恶性的代谢标志物组合及其筛选方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030138792A1 (en) * 2001-05-31 2003-07-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention and therapy of cervical cancer
US20040133352A1 (en) * 1999-06-28 2004-07-08 Michael Bevilacqua Identification, monitoring and treatment of disease and characterization of biological condition using gene expression profiles
US20060035981A1 (en) * 2003-08-02 2006-02-16 Mazzio Elizabeth A Inhibition of anaerobic glucose metabolism and corresponding composition as a natural non-toxic approach to cancer treatment

Family Cites Families (389)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4525350A (en) * 1975-02-20 1985-06-25 The New England Institute, Inc. Methods of stimulating host defense system with coenzymes Q4 to Q.sub.1
JPS5775916A (en) 1980-10-29 1982-05-12 Nippon Chemiphar Co Ltd Coenzyme q pharmaceutical and its preparation
JPS58113127A (ja) 1981-12-28 1983-07-05 Ajinomoto Co Inc ユビデカレノン含有水性液
IT1157269B (it) * 1982-03-19 1987-02-11 Seuref Ag Nuove formulazioni farmaceutiche contenenti il coenzima q10 adatte per la somministrazione topica
JPS58201711A (ja) * 1982-05-19 1983-11-24 Eisai Co Ltd ユビデカレノン含有リポソ−ム被覆体
US4515736A (en) * 1983-05-12 1985-05-07 The Regents Of The University Of California Method for encapsulating materials into liposomes
US4833128A (en) 1984-12-28 1989-05-23 Neil Solomon Dietary supplement
US4824669A (en) 1985-04-11 1989-04-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Formulations of coenzyme Q10 for intravenous use
US4895727A (en) * 1985-05-03 1990-01-23 Chemex Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical vehicles for exhancing penetration and retention in the skin
JPS62123113A (ja) 1985-11-22 1987-06-04 Green Cross Corp:The ユビデカレノン含有脂肪乳剤
US4843071A (en) 1986-12-05 1989-06-27 Serotonin Industries Of Charleston Method and composition for treating obesity, drug abuse, and narcolepsy
US5651991A (en) 1987-10-28 1997-07-29 Nippon Shinyaku Co. Ltd. Drug carriers
JP2600726B2 (ja) 1987-11-30 1997-04-16 大正製薬株式会社 微粒子脂肪乳剤
GB8811410D0 (en) 1988-05-13 1988-06-15 Unilever Plc Treatment of skin disorders
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5015483A (en) * 1989-02-09 1991-05-14 Nabisco Brands, Inc. Liposome composition for the stabilization of oxidizable substances
JP2828655B2 (ja) 1989-04-14 1998-11-25 エーザイ株式会社 脂溶性薬物含有水性液
US5580575A (en) * 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5585112A (en) 1989-12-22 1996-12-17 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres
US5962243A (en) 1990-04-18 1999-10-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for the identification of farnesyltransferase inhibitors
ATE117665T1 (de) 1990-11-14 1995-02-15 Oreal Amphiphile, nichtionische derivate des glycerins sowie die entsprechenden zwischenprodukte, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende zusammensetzungen.
SE502569C2 (sv) 1991-05-31 1995-11-13 British Tech Group Användning av en immunologiskt inert matris av en sterol och saponiner som kan bilda sfäriska nanopartiklar med snäv storleksfördelning som läkemedelsbärare, partiklar, komposition samt kit
US5378461A (en) * 1991-07-12 1995-01-03 Neigut; Stanley J. Composition for the topical treatment of skin damage
US5605930A (en) 1991-10-21 1997-02-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Compositions and methods for treating and preventing pathologies including cancer
US6461593B1 (en) 1992-02-19 2002-10-08 Biomedical And Clinical Research Therapy with coenzyme Q10 to reduce subgingival microorganisms in patients with periodontal disease
DE69328771T2 (de) 1992-02-24 2000-12-07 East Carolina University Green Verfahren zur hemmung der karzinogenese durch behandlung mit dehydroepiandrosteron und dessen analoge
US6093706A (en) 1992-03-04 2000-07-25 Bioresponse, L.L.C. Combined dehydroepiandrosterone and retinoid therapy for epithelial disorders
FR2697841B1 (fr) 1992-11-12 1995-01-13 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux dérivés du taxane, leur préparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
US5602184A (en) 1993-03-03 1997-02-11 The United States Of America As Represented By Department Of Health And Human Services Monoterpenes, sesquiterpenes and diterpenes as cancer therapy
EP0688325A1 (en) 1993-03-08 1995-12-27 Eisai Co., Ltd. Phosphonic acid derivatives
DE59406065D1 (de) 1993-03-24 1998-07-02 Ciba Geigy Ag Verfahren zur Herstellung einer Liposomendispersion im Hochdruckbereich
DE4327063A1 (de) 1993-08-12 1995-02-16 Kirsten Dr Westesen Ubidecarenon-Partikel mit modifizierten physikochemischen Eigenschaften
US7083572B2 (en) 1993-11-30 2006-08-01 Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. Therapeutic delivery systems
DE4410238A1 (de) * 1994-03-25 1995-09-28 Beiersdorf Ag Hautpflegemittel
US20020049422A1 (en) 1994-03-31 2002-04-25 Brewitt Barbara A. Homeopathic preparations
AU4510596A (en) 1994-12-06 1996-06-26 National Research Council Of Canada Water soluble ubiquinone compositions, prodrugs, and methods relating thereto
US6958150B2 (en) 1994-12-15 2005-10-25 Advance Biofactures Of Curacao, N.V. Reduction of adipose tissue
US6005086A (en) 1995-01-13 1999-12-21 The Salk Institute For Biological Studies Farnesoid activated receptor polypeptides, and nucleic acid encoding the same
DE19537027A1 (de) 1995-10-05 1997-04-10 Beiersdorf Ag Hautpflegemittel für alte Haut
EP0856026A1 (en) 1995-10-19 1998-08-05 Receptagen Corporation Discrete-length polyethylene glycols
US5944012A (en) 1996-03-25 1999-08-31 Pera; Ivo E. Method for dispensing antioxidant vitamins by inhalation background of the invention
DE19615577A1 (de) * 1996-04-19 1997-10-23 Beiersdorf Ag Verwendung von Salicin als antiirritativer Wirkstoff in kosmetischen und topischen dermatologischen Zubereitungen
US5891465A (en) * 1996-05-14 1999-04-06 Biozone Laboratories, Inc. Delivery of biologically active material in a liposomal formulation for administration into the mouth
GB9625895D0 (en) 1996-12-13 1997-01-29 Riley Patrick A Novel compound useful as therapeutic agents and assay reagents
ES2159938T3 (es) 1997-02-11 2001-10-16 Mse Pharmazeutika Gmbh Preparados transdermicos, orales e intravenosos de 2,3-dimetoxi-5-metil-6-decaprenil-1,4-benzoquinona.
US20040228910A1 (en) 1997-02-11 2004-11-18 Mse Pharmazeutika Gmbh Transdermal, oral and intravenous formulations of 2, 3-dimethoxy-5-methyl-6-decaprenyl-1, 4-benzoquinone
EP1007018B1 (de) * 1997-02-12 2003-10-08 MSE Pharmazeutika GmbH Verwendung von 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaprenyl-1,4-benzochinon inder behandlung von tinnitus
IT1291113B1 (it) * 1997-03-20 1998-12-29 Sigma Tau Ind Farmaceuti Composizione nutritiva terapeutica per soggetti affetti da diabete mellito
US6372234B1 (en) 1997-05-27 2002-04-16 Sembiosys Genetics Inc. Products for topical applications comprising oil bodies
US6599513B2 (en) 1997-05-27 2003-07-29 Sembiosys Genetics Inc. Products for topical applications comprising oil bodies
AU9221698A (en) 1997-09-04 1999-03-22 Biozone Laboratories, Inc. Oral liposomal delivery system
US6576660B1 (en) 1997-10-31 2003-06-10 Arch Development Corporation Methods and compositions for regulation of 5-α-reductase activity
US6696484B2 (en) * 1997-10-31 2004-02-24 University Of Chicago Office Of Technology And Intellectual Property Method and compositions for regulation of 5-alpha reductase activity
WO1999026657A1 (en) 1997-11-25 1999-06-03 Musc Foundation For Research Development Inhibitors of nitric oxide synthase
US6372880B1 (en) 1997-12-25 2002-04-16 Mitsui Chemicals, Inc. Copolymer and process for preparing the same
US6048846A (en) 1998-02-26 2000-04-11 Cochran; Timothy M. Compositions used in human treatment
EP1065931A4 (en) 1998-04-02 2006-10-11 Avicena Group Inc COMPOSITIONS CONTAINING CREATINE COMBINED WITH A SECOND AGENT
US6806076B1 (en) 1998-04-14 2004-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing isoprenoid compounds by microorganisms and a method for screening compounds with antibiotic or weeding activity
US6503523B2 (en) 1998-05-07 2003-01-07 Gs Development A.B. Skin care agents containing combinations of active agents consisting of vitamin a derivatives and UBI- or plastoquinones
ATE233549T1 (de) 1998-06-19 2003-03-15 Skyepharma Canada Inc Neues verfahren zur herstellung von partikeln wasserunlöslicher komponenten im grössenbereich bis 2000 nm
US6093743A (en) 1998-06-23 2000-07-25 Medinox Inc. Therapeutic methods employing disulfide derivatives of dithiocarbamates and compositions useful therefor
DE19828081C2 (de) 1998-06-24 2000-08-10 Cognis Deutschland Gmbh W/O-Emulsionsgrundlagen
JP2002520511A (ja) 1998-07-16 2002-07-09 コグニス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング Ｐｉｔエマルジョンの使用
CA2337690C (en) 1998-07-27 2013-10-01 Texas Pharmaceuticals, Inc. Chemically induced intracellular hyperthermia
WO2000007607A1 (en) 1998-08-04 2000-02-17 Kosbab, John, V. Nutrient and therapeutic compositions for the treatment of cancer
US6417223B1 (en) * 1998-09-23 2002-07-09 Research Development Foundation Tocopherols, tocotrienols, other chroman and side chain derivatives and uses therof
US6048886A (en) * 1998-10-05 2000-04-11 Neigut; Stanley Compositions and delivery systems for the topical treatment of psoriasis and other conditions of the skin
IT1304406B1 (it) * 1998-10-21 2001-03-19 Danital Italia S R L Preparazione per la veicolazione di principi attivi basata su acidigrassi polinsaturi del gruppo omega 3.
US20050123938A1 (en) * 1999-01-06 2005-06-09 Chondrogene Limited Method for the detection of osteoarthritis related gene transcripts in blood
US20040034107A1 (en) * 1999-02-11 2004-02-19 Mse Pharmazeutika Gmbh Ubiquinone Qn for the treatment of pain
US20050019268A1 (en) 1999-02-11 2005-01-27 Mse Pharmazeutika Gmbh Spray containing ubiquinone Qn
US6248363B1 (en) 1999-11-23 2001-06-19 Lipocine, Inc. Solid carriers for improved delivery of active ingredients in pharmaceutical compositions
US20030104048A1 (en) 1999-02-26 2003-06-05 Lipocine, Inc. Pharmaceutical dosage forms for highly hydrophilic materials
US7374779B2 (en) 1999-02-26 2008-05-20 Lipocine, Inc. Pharmaceutical formulations and systems for improved absorption and multistage release of active agents
US6632443B2 (en) 2000-02-23 2003-10-14 National Research Council Of Canada Water-soluble compositions of bioactive lipophilic compounds
US6140067A (en) * 1999-04-30 2000-10-31 Mitokor Indicators of altered mitochondrial function in predictive methods for determining risk of type 2 diabetes mellitus
US6482943B1 (en) 1999-04-30 2002-11-19 Slil Biomedical Corporation Quinones as disease therapies
US6803193B1 (en) 1999-06-23 2004-10-12 The Penn State Research Foundation Methods to identify modulators of the mevalonate pathway in sterol synthesis
US6242491B1 (en) 1999-06-25 2001-06-05 Rima Kaddurah-Daouk Use of creatine or creatine compounds for skin preservation
DE59912559D1 (de) 1999-07-02 2005-10-20 Cognis Ip Man Gmbh Mikrokapseln - III
US6630160B1 (en) 1999-09-07 2003-10-07 Genetic Services Management, Inc. Process to modulate disease risk with doses of a nutraceutical
US20030104080A1 (en) 1999-09-07 2003-06-05 Singh Parashu Ram Topical urea composition
US7005274B1 (en) 1999-09-15 2006-02-28 Migenix Corp. Methods and compositions for diagnosing and treating arthritic disorders and regulating bone mass
CN1409637A (zh) 1999-10-14 2003-04-09 日清制油株式会社 皮肤美化剂、皮肤用抗老化剂、皮肤用增白剂和外用制剂
US7309688B2 (en) 2000-10-27 2007-12-18 Johnson & Johnson Consumer Companies Topical anti-cancer compositions and methods of use thereof
US20020049176A1 (en) * 1999-11-10 2002-04-25 Anderson Christen M. Modulation of mitochondrial mass and function for the treatment of diseases and for target and drug discovery
US20030180352A1 (en) 1999-11-23 2003-09-25 Patel Mahesh V. Solid carriers for improved delivery of active ingredients in pharmaceutical compositions
US7083780B2 (en) 1999-12-11 2006-08-01 Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg Cosmetic composition containing hydroxyethers
WO2001045661A2 (de) * 1999-12-20 2001-06-28 Cognis France, S.A. Kosmetische und/oder pharmazeutische zubereitungen
AUPQ515000A0 (en) 2000-01-19 2000-02-10 Grigg, Geoffrey Walter Treatment of uv induced immunosuppression
WO2001056562A1 (fr) 2000-02-04 2001-08-09 Takeda Chemical Industries, Ltd. Compositions d'emulsions stables
NZ509803A (en) 2000-02-09 2001-08-31 Paul A Treatment of fibromyalgia with ubiquinone 10 and succinic acid
US20020044913A1 (en) * 2000-02-11 2002-04-18 Hamilton Nathan D. Cosmetics to support skin metabolism
FR2804864B1 (fr) 2000-02-11 2003-04-04 Serobiologiques Lab Sa Extraits de residus issus de la fabrication du vin et leur utilisation en cosmetique ou pharmacologie
DE50115609D1 (de) * 2000-02-17 2010-10-14 Basf Se Wässrige Dispersion wasserunlöslicher organischer UV-Filtersubstanzen
DE10007322A1 (de) 2000-02-17 2001-08-23 Cognis Deutschland Gmbh Perlglanzmittel
FR2805464B1 (fr) 2000-02-25 2003-02-14 Serobiologiques Lab Sa Preparations cosmetiques contenant des extraits de la plante mourera fluviatilis
DE10009996B4 (de) 2000-03-02 2005-10-13 Cognis Ip Management Gmbh Feststoffgranulate mit monodisperser Korngrößenverteilung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung
US6664287B2 (en) 2000-03-15 2003-12-16 Bethesda Pharmaceuticals, Inc. Antioxidants
US6866864B2 (en) 2000-03-20 2005-03-15 Ahmed Mousa Compositions and methods of use in the treatment of angiogenesis and vascular-related disorders
BR0109603A (pt) 2000-03-27 2004-02-25 Schott Glas Novas composições cosméticas, de higiene pessoal, agente de limpeza e de suplemento nutricional e métodos para fabricar e utilizar as mesmas
US6447760B2 (en) 2000-05-08 2002-09-10 Playtex Products, Inc. Sunless tanning compositions
RU2283098C2 (ru) 2000-05-09 2006-09-10 Канека Корпорейшн Кожные композиции, содержащие кофермент q в качестве активного ингредиента
US6468552B1 (en) 2000-06-02 2002-10-22 Neutrogena Corporation Stabilized compositions containing oxygen-labile active agents
SE0002189D0 (sv) * 2000-06-09 2000-06-09 Metcon Medicin Ab New method and assay
DE10031703A1 (de) 2000-06-29 2002-01-10 Beiersdorf Ag Verwendung von Calcium freisetzenden oder bindenden Substanzen zur gezielten Schächung oder Stärkung der Barrierefunktion der Haut
EP1170015A1 (de) 2000-07-06 2002-01-09 Laboratoires Serobiologiques(Societe Anonyme) Verwendung von Extrakten des Pilzes Grifola frondosa
DE10033022A1 (de) * 2000-07-07 2002-01-17 Cognis Deutschland Gmbh Aerosole
US20030012825A1 (en) 2000-07-10 2003-01-16 Charles Kapper Metallized molecule therapies
US6465517B1 (en) 2000-07-11 2002-10-15 N.V. Nutricia Composition for the treatment of migraine
DE10034619A1 (de) * 2000-07-17 2002-01-31 Cognis Deutschland Gmbh Aniontensidfreie niedrigviskose Trübungsmittel
DE10036655A1 (de) 2000-07-26 2002-02-07 Basf Ag Kosmetische oder dermatologische Zubereitungen zur Vermeidung von Hautschädigungen durch Peroxide
DE10036799A1 (de) 2000-07-28 2002-02-07 Beiersdorf Ag Neues Mittel zur Behandlung der Haare und der Kopfhaut
US7198801B2 (en) 2000-08-03 2007-04-03 Antares Pharma Ipl Ag Formulations for transdermal or transmucosal application
US20020045230A1 (en) 2000-08-14 2002-04-18 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
FR2813195B1 (fr) 2000-08-29 2003-04-04 Serobiologiques Lab Sa Utilisation d'extraits de la plante cassia alata dans des produits de soin
US6441050B1 (en) 2000-08-29 2002-08-27 Raj K. Chopra Palatable oral coenzyme Q liquid
DE10048260A1 (de) 2000-09-29 2002-04-11 Beiersdorf Ag Kosmetische oder dermatologische Zubereitungen mit einem Gehalt an Aminoguanidin und/oder dessen Derivaten und Strukturanaloga zur Hautaufhellung von Altersflecken und/oder zur Verhinderung der Hautbräunung, insbesondere der durch UV-Strahlung hervorgerufenen Hautbräunung
DE10053328A1 (de) * 2000-10-27 2002-05-08 Cognis Deutschland Gmbh Kosmetische Zubereitungen
US6689385B2 (en) * 2000-11-03 2004-02-10 Chronorx Llc Formulations for the treatment of insulin resistance and type 2 diabetes mellitus
US6403116B1 (en) 2000-11-03 2002-06-11 Triarco Inductries, Inc. Coenzyme Q10 formulation
IT1317938B1 (it) 2000-11-17 2003-07-15 Sigma Tau Healthscience Spa Composizione per la prevenzione e/o il trattamento di alterazioni delmetabolismo lipidico, delle forme allergiche e per attivare le difese
US20070003536A1 (en) 2000-11-21 2007-01-04 Zimmerman Amy C Topical skin compositions, their preparation, and their use
AUPR177300A0 (en) 2000-11-29 2000-12-21 Centre For Molecular Biology And Medicine Therapeutic methods
AU2002221934A1 (en) 2000-12-16 2002-06-24 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Health promoting compositions
DE10064818A1 (de) 2000-12-22 2002-06-27 Basf Ag Verwendung von Chroman-Derivaten in kosmetischen oder dermatologischen Zubreitungen
US6806069B2 (en) * 2001-01-09 2004-10-19 Pharmachem Laboratories, Inc. Ubiquinone composition and methods related thereto
FR2819414A1 (fr) 2001-01-15 2002-07-19 Cognis France Sa Preparations cosmetiques et/ou pharmaceutiques comprenant des extraits de plantes dites a resurrection
WO2002056823A2 (en) 2001-01-18 2002-07-25 Arnold Hoffman Redox therapy for tumors
HUP0302567A2 (hu) 2001-01-25 2003-12-29 Bristol-Myers Squibb Co. Epotilon analógokat tartalmazó parenterális adagolási formák és eljárás az előállításukra
NL1017205C2 (nl) 2001-01-26 2002-07-29 Adriaan Emanuel Hendricus Wiel Medicinale en cosmetische toepassing van hop en co-enzym Q10.
ITRM20010044A1 (it) 2001-01-29 2002-07-29 Sigma Tau Healthscience Spa Integratore alimentare ad effetto dimagrante.
WO2002060484A1 (en) 2001-01-31 2002-08-08 Idec Pharmaceuticals Corporation Use of cd23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
ITMI20010204A1 (it) 2001-02-02 2002-08-02 Hunza Di Marazzita Maria Carme Specialita' terapeutiche dotate di attivita' antiossidante ed in grado di controllare l'eccesso del peso corporeo
FR2821624B1 (fr) 2001-03-01 2004-01-02 Sod Conseils Rech Applic Nouveau polynucleotide utilisable pour moduler la proliferation des cellules cancereuses
EP1372412A2 (en) 2001-03-09 2004-01-02 Societe Des Produits Nestle S.A. Composition improving age-related physiological deficits and increasing longevity
DE10113050A1 (de) 2001-03-15 2002-09-19 Beiersdorf Ag Selbstschäumende oder schaumförmige Zubereitungen organischen Hydrokolloiden
DE10113046A1 (de) 2001-03-15 2002-09-26 Beiersdorf Ag Selbstschäumende schaumförmige Zubereitungen mit organischen Hydrokolliden und partikulären hydrophobisierten und/oder ölabsorbierenden Festkörpersubstanzen
DE10113053A1 (de) 2001-03-15 2002-09-19 Beiersdorf Ag Selbstschäumende oder schaumförmige Zubereitungen mit anorganischen Gelbildnern und organischen Hydrololloiden
DE60211581D1 (de) 2001-03-23 2006-06-29 Oreal Hautbehandlungsmittel enthaltend Fasern und Ubichinone
US20030031688A1 (en) * 2001-04-02 2003-02-13 Dipak Ghosh Cosmetic composition with improved skin moisturizing properties
US6727234B2 (en) * 2001-04-03 2004-04-27 University Of Iowa Research Foundation Isoprenoid analog compounds and methods of making and use thereof
US6469061B1 (en) 2001-04-04 2002-10-22 Ramot University Authority For Applied Research And Industrial Development Limited Jasmonate pharmaceutical composition for treatment of cancer
DE10118269A1 (de) 2001-04-12 2002-10-17 Cognis Deutschland Gmbh Kosmetische Zubereitungen
US6686485B2 (en) * 2001-04-19 2004-02-03 Daniel David West Synthesis of coenzyme Q10, ubiquinone
AU2002303427A1 (en) 2001-04-24 2002-11-05 East Carolina University Compositions and formulations with a non-glucocorticoid steroid and/or a ubiquinone and kit for treatment of respiratory and lung disease
AU2002256359A1 (en) 2001-04-24 2002-11-05 Epigenesis Pharmaceuticals, Inc. Antisense and anti-inflammatory based compositions to treat respiratory disorders
US20040049022A1 (en) 2001-04-24 2004-03-11 Nyce Jonathan W. Composition & methods for treatment and screening
US6582723B2 (en) 2001-05-03 2003-06-24 Wayne F. Gorsek Cancer immune composition for prevention and treatment of individuals
JP3742602B2 (ja) 2001-05-09 2006-02-08 株式会社カネカ 還元型補酵素ｑの安定な溶液
JP4603192B2 (ja) 2001-05-10 2010-12-22 株式会社カネカ 毛髪頭皮用組成物
US7754205B2 (en) 2001-05-10 2010-07-13 Kaneka Corporation Composition for transmucosal administration containing conenzyme Q as the active ingredient
GB0111279D0 (en) 2001-05-10 2001-06-27 Nycomed Imaging As Radiolabelled liposomes
DE10123771B4 (de) 2001-05-16 2019-01-10 Beiersdorf Ag Verwendung von Elektrolyten zur Stärkung der Barrierefunktion der Haut
EP1260212A1 (de) 2001-05-21 2002-11-27 Cognis France S.A. Kosmetische Mittel
US20050118151A1 (en) * 2001-05-29 2005-06-02 Syddansk Universitet Proteins in diabetes proteome anlysis
NZ529339A (en) 2001-05-30 2004-08-27 Laxdale Ltd Coenzyme Q and eicosapentaenoic acid (EPA)
EP1262167A1 (de) 2001-06-01 2002-12-04 Cognis France S.A. Kosmetische Zubereitungen enthaltend ein Extrakt von keimenden Pflanzen
US7091241B2 (en) 2001-06-01 2006-08-15 Summa Health System Nontoxic potentiation/sensitization of cancer therapy by supplementary treatment with combined vitamins C and K3
US6506915B1 (en) * 2001-06-14 2003-01-14 Daniel David West Synthesis of coenzyme Q10 ubiquinone
US6696060B2 (en) 2001-06-14 2004-02-24 Clearant, Inc. Methods for sterilizing preparations of monoclonal immunoglobulins
FR2826017B1 (fr) 2001-06-15 2004-06-11 Cognis France Sa Melanges de tensioactifs
SE0102380D0 (sv) 2001-07-02 2001-07-02 Macronova Ab Kräm för behandling av åldersförändringar i huden hos människa
DE10133198A1 (de) 2001-07-07 2003-01-23 Beiersdorf Ag Kreatin enthaltende kosmetische und dermatologische Zubereitungen zur Behandlung und aktiven Prävention trockener Haut und anderer negativer Veränderungen der physiologischen Homöostase der gesunden Haut
JP2003020495A (ja) 2001-07-10 2003-01-24 Cognis Japan Ltd 油脂組成物
EP2351765A3 (en) 2001-07-10 2012-02-22 Lakewood-Amedex, Inc Oligonucleotide-containing pharmacological compositions and their use
CH695085A5 (de) * 2001-07-13 2005-12-15 Mibelle Ag Cosmetics Formulierungen zur Pflege der Haut nach Laserbehandlungen und/oder chemischen Peelings und Verwendung der Formulierungen.
TWI235146B (en) * 2001-07-16 2005-07-01 Kaneka Corp Method of stabilizing reduced coenzyme q10 and method of acidic crystallization
IL159894A0 (en) 2001-07-17 2004-06-20 Res Dev Foundation Therapeutic agents comprising pro-apoptotic proteins
FR2827603B1 (fr) 2001-07-18 2003-10-17 Oreal Composes derives de diaminopyrazole substitues par un radical heteroaromatique et leur utilisation en teinture d'oxydation des fibres keratiniques
EP1411951B2 (en) 2001-07-27 2010-11-10 N.V. Nutricia Enteral compositions for the prevention and/or treatment of sepsis
EP1281392A1 (de) 2001-08-02 2003-02-05 Cognis France S.A. Kosmetische und/oder pharmaceutische Zubereitungen enthaltend Pflanzenextrakte
US6503506B1 (en) 2001-08-10 2003-01-07 Millenium Biotechnologies, Inc. Nutrient therapy for immuno-compromised patients
DE10139580A1 (de) * 2001-08-10 2003-02-20 Beiersdorf Ag Kosmetische und dermatologische Zubereitungen in Form von O/W-Emulsionen mit einem Gehalt an Sterinen und/oder C12-C40-Fettsäuren
DE10143964A1 (de) 2001-09-07 2003-03-27 Basf Ag Emulgatorarme oder emulgatorfreie Systeme vom Typ Öl-in-Wasser mit einem Gehalt an Stabilisatoren und einem aminosubstituierten Hydroxybenzophenon
DE10143962A1 (de) 2001-09-07 2003-03-27 Basf Ag Kosmetische und dermatologische Zubereitungen in Form von O/W-Emulsionen, enthaltend ein aminosubstituiertes Hydroxybenzophenon
DE10143963A1 (de) 2001-09-07 2003-03-27 Basf Ag Kosmetische und dermatologische Zubereitungen in Form von W/O-Emulsionen, enthaltend ein aminosubstituiertes Hydroxybenzophenon
EP1432400A1 (en) * 2001-09-18 2004-06-30 Ciba SC Holding AG Use of guaiol for treating the skin
DE10150725A1 (de) 2001-10-13 2003-04-17 Cognis Deutschland Gmbh Aniontensidfreie niedrigviskose Trübungsmittel
US7247714B2 (en) 2001-10-16 2007-07-24 Atherogenics, Inc. Protection against oxidative stress and inflammation by a cytoprotective response element
US7560123B2 (en) 2004-08-12 2009-07-14 Everett Laboratories, Inc. Compositions and methods for nutrition supplementation
US6723527B2 (en) 2001-10-26 2004-04-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for determining toxicity reversing agents
ES2261760T3 (es) 2001-10-26 2006-11-16 Cognis Ip Management Gmbh Solucion impregnante para toallitas cosmeticas.
ES2320980T3 (es) 2001-11-03 2009-06-01 Astrazeneca Ab Derivados de quinazolina como agentes antitumorales.
US7435725B2 (en) 2001-11-06 2008-10-14 The Quigly Corporation Oral compositions and methods for prevention, reduction and treatment of radiation injury
US20030105027A1 (en) 2001-11-06 2003-06-05 Rosenbloom Richard A. Nutritional supplements and methods for prevention, reduction and treatment of radiation injury
US20030105031A1 (en) 2001-11-06 2003-06-05 Rosenbloom Richard A. Methods for the treatment of skin disorders
US6753325B2 (en) 2001-11-06 2004-06-22 The Quigley Corporation Composition and method for prevention, reduction and treatment of radiation dermatitis
US20030118536A1 (en) 2001-11-06 2003-06-26 Rosenbloom Richard A. Topical compositions and methods for treatment of adverse effects of ionizing radiation
US7527932B2 (en) * 2001-11-09 2009-05-05 Medstar Research Institute, Inc. Method of using physiological markers to estimate cardiovascular risk
DE10155769A1 (de) * 2001-11-14 2003-05-22 Cognis Deutschland Gmbh Kosmetische und/oder pharmazeutische Emulsionen
DE10160682A1 (de) * 2001-12-11 2003-06-18 Cognis Deutschland Gmbh Emollients und kosmetische Zusammensetzungen
US6652891B2 (en) 2001-12-12 2003-11-25 Herbasway Laboratories, Llc Co-enzyme Q10 dietary supplement
DE10162026A1 (de) 2001-12-18 2003-07-03 Cognis Deutschland Gmbh Hochkonzentriert fließfähige Perlglanzkonzentrate
DE10162351A1 (de) * 2001-12-18 2003-07-03 Cognis Deutschland Gmbh Kosmetische und/oder pharmazeutische Emulsionen
ITRM20010755A1 (it) 2001-12-20 2003-06-20 Simonelli Giuseppe Uso del chinone q10 per il trattamento delle malattie oculari.
TWI305547B (en) 2001-12-27 2009-01-21 Kaneka Corp Processes for producing coenzyme q10
US20030129253A1 (en) 2002-01-03 2003-07-10 Milley Christopher J. Stable aqueous suspension
MXPA04006489A (es) 2002-01-18 2004-10-04 Basf Ag Preparaciones cosmeticas y dermatologicas para evitar danos cutaneos causados por peroxidos.
TW200302056A (en) 2002-01-18 2003-08-01 Kaneka Corp Method for stabilizing reduced coenzyme Q10 and composition therefor
US7357918B2 (en) * 2002-01-31 2008-04-15 Ciba Specialty Chemicals Corp. Micropigment mixtures
DE60307234T2 (de) * 2002-02-12 2007-07-05 Dsm Ip Assets B.V. Sonnenschutzzusammensetzungen sowie dihydropyridine und dihydropyrane
AU2003205738A1 (en) 2002-02-14 2003-09-04 Dsm Ip Assets B.V. Water-dispersible coenzyme q10 dry powders
EP1340486A1 (de) 2002-03-01 2003-09-03 Cognis France S.A. Verwendung von Zuckerestern
US20030167556A1 (en) 2002-03-05 2003-09-11 Consumers Choice Systems, Inc. Methods and devices for transdermal delivery of anti-aging compounds for treatment and prevention of facial or neck skin aging
DE10254315A1 (de) 2002-03-15 2003-10-02 Cognis Deutschland Gmbh Emollients und kosmetische Zubereitungen
EP1490399A2 (en) 2002-03-20 2004-12-29 Syddansk Universitet Human diabetes-mediating proteins
TW200304372A (en) * 2002-03-20 2003-10-01 Kanegafuchi Chemical Ind Compositions for diabetes
DE10212528A1 (de) * 2002-03-21 2003-10-02 Cognis Deutschland Gmbh Ölphasen für kosmetische Mittel
US7811594B2 (en) * 2002-03-28 2010-10-12 Beiersdorf Ag Crosslinked oil droplet-based cosmetic or pharmaceutical emulsions
DE10213957A1 (de) * 2002-03-28 2003-10-09 Beiersdorf Ag Vernetzte kosmetische oder pharmazeutische phospholipidhaltige Gele und Emulsionen auf der Basis von ethylenoxidhaltigen oder propylenoxidhaltigen Emulgatoren
US20040101874A1 (en) 2002-04-12 2004-05-27 Mitokor Inc. Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome
DE10217474A1 (de) 2002-04-19 2003-11-06 Cognis Deutschland Gmbh Sonnenschutzemulsion mit Schaumspender
US20060193905A1 (en) 2002-05-14 2006-08-31 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Direct cellular energy delivery system
AU2003233653B2 (en) 2002-05-23 2008-08-07 Umd, Inc. Compositions and method for transmucosal drug delivery and cryoprotection
DE10223486A1 (de) 2002-05-27 2003-12-11 Beiersdorf Ag Kosmetische und/oder dermatologische Zubereitung mit 2,3-Dibenzylbutyrolactonen
ES2269955T3 (es) 2002-06-03 2007-04-01 Ciba Specialty Chemicals Holding Inc. Formulaciones para proteccion de uv.
US7182950B2 (en) 2002-06-12 2007-02-27 Nutralease Ltd. Nano-sized self-assembled liquid dilutable vehicles
DE10226018A1 (de) 2002-06-12 2003-12-24 Cognis Deutschland Gmbh Zubereitungen mit konjugiertem Linolalkohol
US7147841B2 (en) 2002-06-17 2006-12-12 Ciba Specialty Chemicals Corporation Formulation of UV absorbers by incorporation in solid lipid nanoparticles
AU2003246592A1 (en) 2002-06-26 2004-01-19 Europroteome Ag Tumour marker and the use thereof for the diagnosis and treatment of tumour diseases
US7060733B2 (en) 2002-08-15 2006-06-13 The Regents Of The University Of California Methods for treating pancreatitis with curcumin compounds and inhibitors of reactive oxygen species
WO2004028474A2 (en) 2002-09-25 2004-04-08 University Of Rochester Caspase inhibitors as anticancer agents
US6953786B2 (en) * 2002-10-01 2005-10-11 The Regents Of The University Of California Compositions comprising plant-derived polyphenolic compounds and inhibitors of reactive oxygen species and methods of using thereof
FR2845602B1 (fr) * 2002-10-11 2005-07-08 Servier Lab Association entre un ligand des recepteurs actives par les proliferateurs de peroxisomes et un agent antioxydant et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US7083813B2 (en) 2002-11-06 2006-08-01 The Quigley Corporation Methods for the treatment of peripheral neural and vascular ailments
EP1421929A3 (de) 2002-11-21 2004-11-24 Cognis Deutschland GmbH & Co. KG Emollients und kosmetische Zubereitungen
DE10256881A1 (de) 2002-12-05 2004-06-24 Beiersdorf Ag Neue topische Verwendung von Bis-Arylimidazo[1,2-a]thiolanderivaten
US20040110848A1 (en) 2002-12-10 2004-06-10 Peffley Dennis M Method and kit for treating cancer
CA2509832A1 (en) 2002-12-16 2004-07-01 Garvan Institute Of Medical Research Methods of treatment of feeding disorders or disorders of glucose uptake and for modifying metabolism and identifying therapeutic reagents therefor
JP2006526140A (ja) 2002-12-24 2006-11-16 バイオサイト インコーポレイテッド 鑑別診断のためのマーカーおよびその使用方法
AU2003303520A1 (en) 2003-01-02 2004-07-29 Gerard M. Housey Irs modulators
US20090036516A1 (en) 2003-01-13 2009-02-05 Ctg Pharma S.R.L. Compounds for treating metabolic syndrome
JP4671953B2 (ja) 2003-01-20 2011-04-20 チバ ホールディング インコーポレーテッド Ｕｖ吸収剤としてのトリアジン誘導体
JP2006514661A (ja) 2003-02-03 2006-05-11 デーエスエム アイピー アセッツ ベー． ヴェー． 新規な安定化されたケイ皮酸エステルサンスクリーン組成物
US7258876B2 (en) 2003-02-05 2007-08-21 Craig Bozzacco Topical composition for treating infectious conditions of skin and mucosa
CN1208052C (zh) 2003-03-20 2005-06-29 上海家化联合股份有限公司 一种辅酶q10前体脂质体及其制备方法
EP1606270B1 (en) 2003-03-24 2013-08-14 Basf Se Symmetrical triazine derivatives
EP2465516A1 (en) 2003-04-08 2012-06-20 Barrie Tan Annatto extract compositions, including geranyl geraniols and methods of use
US20050037102A1 (en) 2003-07-18 2005-02-17 Barrie Tan Annatto extract compositions including tocotrienols and tocopherols and methods of use
JP2004321171A (ja) * 2003-04-11 2004-11-18 Fancl Corp 飲食品
EP1473043A1 (en) 2003-04-29 2004-11-03 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG Pharmaceutical combination for the treatment of diseases involving cell proliferation, migration or apotosis of myeloma cells, or angiogenesis
JP2004345988A (ja) * 2003-05-21 2004-12-09 Eisai Co Ltd リボフラビン系化合物を含む医薬組成物
US7438903B2 (en) * 2003-06-06 2008-10-21 Nbty, Inc. Methods and compositions that enhance bioavailability of coenzyme-Q10
US20040253323A1 (en) 2003-06-11 2004-12-16 Giles Brian C. Ionic cancer therapy and methods for using same in the treatment of tumors and metastasis
US8003094B2 (en) 2003-06-25 2011-08-23 Charles Erwin Chemical combination and method for increasing delivery of Coenzyme Q10
US20050026879A1 (en) 2003-07-31 2005-02-03 Robinson Cynthia B. Combination of dehydroepiandrosterone or dehydroepiandrosterone-sulfate with a tyrosine kinase inhibitor, delta opioid receptor antagonist, neurokinin receptor antagonist, or VCAM inhibitor for treatment of asthma or chronic obstructive pulmonary disease
US20050026848A1 (en) 2003-07-31 2005-02-03 Robinson Cynthia B. Combination of dehydroepiandrosterone or dehydroepiandrosterone-sulfate with a methylxanthine derivative for treatment of asthma or chronic obstructive pulmonary disease
US8802161B2 (en) 2003-08-02 2014-08-12 Florida Agricultural And Mechanical University Herbal composition and method of use for the treatment of cancer
US20070248693A1 (en) 2003-08-02 2007-10-25 Elizabeth Mazzio Nutraceutical composition and method of use for treatment / prevention of cancer
US20080069779A1 (en) * 2003-08-04 2008-03-20 Foamix Ltd. Foamable vehicle and vitamin and flavonoid pharmaceutical compositions thereof
US20050036976A1 (en) * 2003-08-12 2005-02-17 Joel Rubin Topical skin care composition
WO2005020940A1 (de) 2003-08-27 2005-03-10 Beiersdorf Ag Kapsel deren kapselhülle bei topischer anwendung nicht mehr gesondert warhnembar ist
US7169385B2 (en) 2003-09-29 2007-01-30 Ronald G. Udell Solubilized CoQ-10 and carnitine
US8124072B2 (en) 2003-09-29 2012-02-28 Soft Gel Technologies, Inc. Solubilized CoQ-10
US8105583B2 (en) 2003-09-29 2012-01-31 Soft Gel Technologies, Inc. Solubilized CoQ-10
BRPI0414858A (pt) 2003-10-02 2006-11-21 Sembiosys Genetics Inc métodos para preparação de corpos de óleo compreendendo ingredientes ativos
DE10347218A1 (de) 2003-10-10 2005-05-12 Cognis Deutschland Gmbh Sonnenschutzmittel
CN1897950A (zh) 2003-10-14 2007-01-17 惠氏公司 稠合芳基和杂芳基衍生物及其使用方法
DE10347940A1 (de) 2003-10-15 2005-05-19 Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg Selbstemulgierende Zubereitungen
KR20060100402A (ko) 2003-10-31 2006-09-20 가부시키가이샤 가네카 환원형 보효소 ｑ 함유 조성물
EP1682228B1 (en) 2003-11-05 2009-12-02 DSM IP Assets B.V. Light protecting composition with reduced total amount of uv filter containing a polysiloxane-based uv filter
US20050100537A1 (en) 2003-11-10 2005-05-12 Evans Gregory S. Methods and kits for reducing cellular damage, inhibiting free radical production, and scavenging free radicals in mammals
US8932649B2 (en) 2003-11-14 2015-01-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for treating a neoplastic disease in a subject using inorganic selenium-containing compounds
DE10354052A1 (de) 2003-11-17 2005-06-16 Beiersdorf Ag Kosmetikum mit empfindlichen Inhaltsstoffen
US20050118235A1 (en) 2003-12-02 2005-06-02 Shiguang Yu Dietary non-essential amino acid tyrosine regulates the body weight of animals through regulating the animal appetite or food intake
EP1750651B1 (en) 2003-12-18 2017-11-29 Nestec S.A. Composition for improving skin, hair and coat health containing flavanones
JP4742526B2 (ja) * 2003-12-26 2011-08-10 シンフォニアテクノロジー株式会社 Ｉｃチップ実装体の製造方法及び製造装置
CN1953743B (zh) * 2004-01-22 2010-12-08 迈阿密大学 局部辅酶q10制剂及其使用方法
US20050226947A1 (en) 2004-02-04 2005-10-13 Dale Kern Agents for sequestering serum aging factors and uses therefore
US20070149618A1 (en) 2004-02-17 2007-06-28 Action Medicines, S.L. Methods of use for 2,5-dihydroxybenzene sulfonic acid compounds for the treatment of cancer, rosacea and psoriasis
NZ549159A (en) 2004-02-19 2011-01-28 Chemaphor Inc Topical formulations for the treatment of skin conditions
US7780873B2 (en) 2004-02-23 2010-08-24 Texas A&M University System Bioactive complexes compositions and methods of use thereof
AU2004316985A1 (en) 2004-02-23 2005-09-15 The Texas A & M University System Antioxidant compositions and methods of use thereof
US20050202521A1 (en) 2004-03-10 2005-09-15 Albert Crum Methods of assessing the need for and the effectiveness of therapy with antioxidants
DE102004014615A1 (de) 2004-03-23 2005-10-13 Beiersdorf Ag Taurinhaltige Zubereitungen zur Verbesserung der Hautbarriere
WO2005104213A2 (en) * 2004-04-06 2005-11-03 Basf Aktiengesellschaft COSMETIC FORMULATIONS COMPRISING ZnO NANOPARTICLES
US20050226858A1 (en) 2004-04-09 2005-10-13 Kaneka Corporation Compositions containing reduced coenzyme Q10 and carotenoid
US7351739B2 (en) 2004-04-30 2008-04-01 Wellgen, Inc. Bioactive compounds and methods of uses thereof
US7723569B2 (en) * 2004-04-30 2010-05-25 National Institute Of Agrobiological Sciences Method for producing ubiquinone-10 in plant
IL161899A0 (en) 2004-05-10 2005-11-20 Hoffman Arnold Kit for treatment of cancer
JP2005323573A (ja) 2004-05-17 2005-11-24 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 遺伝子発現データ解析方法および、疾患マーカー遺伝子の選抜法とその利用
US20070202090A1 (en) 2004-05-18 2007-08-30 Mirko Prosek Water Soluble Form Of Coenzyme Q10 In The Form Of An Inclusion Complex With Beta-Cyclodextrin, Process Of Preparing, And Use Thereof
US20080075684A1 (en) 2004-05-24 2008-03-27 Basf Aktiengesellschaft Keratin-Binding Polypeptides
KR20050112942A (ko) 2004-05-28 2005-12-01 주식회사 뉴트렉스테크놀러지 비만 억제용 조성물
US20050288333A1 (en) 2004-06-08 2005-12-29 Kem William R Controlling angiogenesis with anabaseine analogs
WO2006009825A1 (en) 2004-06-17 2006-01-26 Virun, Inc. Compositions comprising a mucoadhesive protein and an active principle for mucosal delivery of said agents
WO2005123101A1 (en) * 2004-06-18 2005-12-29 Symrise Gmbh & Co. Kg Blackberry extract
RU2007102086A (ru) * 2004-06-21 2008-07-27 Хатчисон Медифарма Энтерпрайзис Лимитед (Bs) Химиотерапия рака
ES2380940T3 (es) 2004-06-28 2012-05-21 Dsm Ip Assets B.V. Composiciones cosméticas que contienen hidrolizados de proteína
US20070225255A1 (en) 2004-07-13 2007-09-27 Eleonore Frohlich Use of Mitochondrially Targeted Antioxidant in the Treatment of Liver Diseases and Epithelial Cancers
US20060069068A1 (en) 2004-07-15 2006-03-30 Nanobac Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of diseases characterized by pathological calcification
MX2007001098A (es) 2004-07-28 2009-02-11 Raymond M Pleva Composicion de aceite de emu y fruta.
JP2006070016A (ja) 2004-08-02 2006-03-16 Kaneka Corp 還元型補酵素ｑを含有する美白用組成物
WO2006017494A2 (en) * 2004-08-02 2006-02-16 Elizabeth Mazzio Inhibition of anaerobic glucose metabolism
EP2377532A1 (en) 2004-08-18 2011-10-19 Ace ApS Cosmetic and pharmaceutical compositions comprising ACE inhibitors and/or angiotensin II receptor antagonists for treating dermatological disorders
WO2006023342A2 (en) 2004-08-20 2006-03-02 Tishcon Corp Synergistic conjugated linoleic acid (cla) and carnitine combination
US20060051462A1 (en) * 2004-09-03 2006-03-09 Wang Jimmy X Self emulsifying compositions for delivering lipophilic coenzyme Q10 and other dietary ingredients
US7288263B2 (en) 2004-09-13 2007-10-30 Evera Laboratories, Llc Compositions and methods for treatment of skin discoloration
CN101102768A (zh) * 2004-09-17 2008-01-09 中国医学科学院医药生物技术研究所 治疗高脂血症的方法和组合物
US20060062755A1 (en) 2004-09-21 2006-03-23 Woodward John R Method of cancer screening; method of cancer treatment; and method of diabetes treatment
JP5093998B2 (ja) 2004-09-22 2012-12-12 大塚製薬株式会社 色素沈着予防又は改善剤
DE102004046235A1 (de) 2004-09-22 2006-03-30 Altana Pharma Ag Arzneimittelzubereitung
CA2581775A1 (en) 2004-09-27 2006-04-06 Sigmoid Biotechnologies Limited Dihydropyrimidine microcapsule - formulations
CA2584138A1 (en) 2004-10-18 2006-04-27 Raphael C. Lee Methods and compositions for treatment of free radical injury
US20060120997A1 (en) 2004-10-29 2006-06-08 Biomune, Inc. Cancer therapeutic compositions
BRPI0517930A (pt) 2004-11-02 2008-10-21 Dsm Ip Assets Bv aditivo para preparações de protetor solar contra uv
US8349359B2 (en) 2004-11-07 2013-01-08 Your Energy Systems, LLC Liposomal formulation for oral administration of glutathione (reduced)
GB0424891D0 (en) * 2004-11-11 2004-12-15 Boots Co Plc Topical compositions
US8961958B2 (en) 2004-11-16 2015-02-24 Bioavailability, Inc High concentration self-microemulsifying coenzyme Q10 preparations for nutritional use
US20060110415A1 (en) 2004-11-22 2006-05-25 Bioderm Research Topical Delivery System for Cosmetic and Pharmaceutical Agents
US20060127384A1 (en) 2004-12-09 2006-06-15 Sergio Capaccioli Coenzyme Q10 as antiapoptotic agent
US7862995B2 (en) 2004-12-10 2011-01-04 Targeted Molecular Diagnostics Methods and materials for predicting responsiveness to treatment with dual tyrosine kinase inhibitor
EP1828774A1 (en) 2004-12-14 2007-09-05 F. Hoffmann-Roche AG Cd99 as target/marker for insulin resistance
WO2006063402A1 (en) 2004-12-16 2006-06-22 Melvin Mackenzie Stewart Therapeutic compositions based on extracts of plants from the genus plumeria (frangipani)
NO20045674D0 (no) 2004-12-28 2004-12-28 Uni I Oslo Thin films prepared with gas phase deposition technique
US20060286046A1 (en) 2005-01-05 2006-12-21 Haber C Andrew Skin care compositions
US20060188492A1 (en) 2005-01-13 2006-08-24 Chronorx Llc, An Alaska Limited Liability Company Topical management of ocular and periocular conditions
DE102005007980A1 (de) 2005-02-22 2006-02-23 Clariant Gmbh Kosmetische, pharmazeutische oder dermatologische Zubereitungen enthaltend Copolymerwachse
WO2006103750A1 (ja) 2005-03-29 2006-10-05 Nippon Meat Packers, Inc. 肥満改善用組成物、機能性食品及び医薬用組成物
JP2008534619A (ja) 2005-04-01 2008-08-28 ザイムス， エルエルシー ＣｏＱ１０を送達システムとして使用する皮膚強化
CN1853507A (zh) 2005-04-28 2006-11-01 尚宝虎 一种没有副作用的可用于饮料和固体口服制剂或食品添加的减肥新组方
JP2007001922A (ja) * 2005-06-23 2007-01-11 Asahi Kasei Pharma Kk 透析患者における腎疾患改善剤、又は機能性食品
JPWO2007013556A1 (ja) * 2005-07-28 2009-02-12 株式会社カネカ 癌予防用組成物
US20070026072A1 (en) 2005-07-28 2007-02-01 Stephen Olsen Benzoquinones of enhanced bioavailability
US20070053985A1 (en) 2005-08-24 2007-03-08 Kaneka Corporation Coenzyme Q10-containing fine particle with excellent dispersibility
CN1928556A (zh) 2005-09-05 2007-03-14 中国医学科学院基础医学研究所 中国人2型糖尿病血清标志物的检测试剂盒
US20070071779A1 (en) 2005-09-26 2007-03-29 Leggit Ingenuity, Llc Compositions for delivering lipophilic agents to the intestinal mucosa and method of making thereof
EP1876448A1 (en) 2005-09-30 2008-01-09 DIGILAB BioVisioN GmbH Method and analytical reagents for identifying therapeutics using biomarkers responsive to thiazolidinediones.
US20070092469A1 (en) * 2005-10-26 2007-04-26 Eric Jacobs Topically applied Glucosamine Sulfate and all its related, precursor, and derivative compounds significantly increases the skin's natural produciton of hyaluronic acid for the rejuvenation of healthier younger-looking skin; while PhosphatidylCholine is required to replace its deficiency caused by topical Dimethylaminoethanol (DMAE)
US8506956B2 (en) * 2005-10-31 2013-08-13 Kaneka Corporation Method for stabilizing reduced coenzyme Q10
US9265792B2 (en) 2005-11-16 2016-02-23 Patricia A. Riley Integument cell regeneration formulation
JP5984324B2 (ja) * 2005-12-01 2016-09-06 メディカル プログノシス インスティテュート エー／エス 治療反応のバイオマーカーを同定するための方法および装置、ならびに治療効果を推定するためのその使用
CA2631713A1 (en) 2005-12-02 2007-09-13 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Modulators of cdc2-like kinases (clks) and methods of use thereof
JP2007176804A (ja) * 2005-12-27 2007-07-12 Ｚｍｃ−Ｋｏｕｇｅｎ株式会社 痩身作用を有する医薬又は健康食品
US20070172436A1 (en) 2006-01-23 2007-07-26 Jerry Zhang Nonaqueous ascorbic acid compositions and methods for preparing same
US20070184076A1 (en) 2006-02-07 2007-08-09 Unger Evan C Liquid-filled nanodroplets for anti-cancer therapy
US20070184041A1 (en) 2006-02-09 2007-08-09 Burja Adam M Methods and compositions related to production of coenzyme q10
US8211634B2 (en) * 2006-02-14 2012-07-03 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cancer
US8067152B2 (en) 2006-02-27 2011-11-29 The Fred Hutchinson Cancer Research Center Liver cancer biomarkers
US20070203091A1 (en) 2006-02-28 2007-08-30 Eliezer Rapaport Methods and therapeutic compositions for improving liver, blood flow and skeletal muscle functions in advanced diseases and aging
DK1993515T3 (da) 2006-03-10 2009-12-07 Laboswiss Ag Fremgangsmåde til solubilisering, dispergering og stabilisering af stoffer, produkter, der er fremstillet efter fremgangsmåden og anvendelsen af samme
US7335384B2 (en) 2006-03-17 2008-02-26 4K Nutripharma International Nutrient compositions for the treatment and prevention of inflammation and disorders associated therewith
US8030013B2 (en) * 2006-04-14 2011-10-04 Mount Sinai School Of Medicine Methods and compositions for the diagnosis for early hepatocellular carcinoma
WO2007126086A1 (ja) 2006-04-28 2007-11-08 Kaneka Corporation 還元型補酵素ｑ10の精製方法
AU2007244232B2 (en) 2006-04-28 2012-07-19 Kaneka Corporation Method for stabilization of reduced coenzyme Q10
US8021659B2 (en) 2006-04-28 2011-09-20 Naidu Lp Coenzyme Q10, lactoferrin and angiogenin compositions and uses thereof
CA2977089A1 (en) 2006-05-02 2007-11-15 University Of Miami Topical co-enzyme q10 formulations and treatment of pain, fatigue and wounds
WO2007142347A1 (ja) 2006-06-05 2007-12-13 Shimadzu Corporation 腫瘍マーカー及び癌疾病の罹患の識別方法
US20080020022A1 (en) 2006-06-05 2008-01-24 Udell Ronald G Chewable co-enzyme q-10 capsule
US20080014187A1 (en) 2006-07-15 2008-01-17 Bryant Villeponteau Compositions and Methods for Treating Hypertension and Inflammation
US8894993B2 (en) * 2006-08-04 2014-11-25 Natreon Inc. Mitochondria-targeted antioxidants
US7645616B2 (en) * 2006-10-20 2010-01-12 The University Of Hong Kong Use of lipocalin-2 as a diagnostic marker and therapeutic target
WO2008069276A1 (ja) 2006-12-06 2008-06-12 Kaneka Corporation 癌治療剤および発癌抑制剤
CN101015524B (zh) * 2007-02-15 2011-09-14 沈阳药科大学 辅酶q10口服乳剂及其制备方法
CA2680825C (en) 2007-03-22 2013-10-29 Cytotech Labs, Llc Topical formulations having enhanced bioavailability
WO2008156654A2 (en) * 2007-06-15 2008-12-24 Massachusetts Institute Of Technology Cytoskeleton modulators for treating metabolic disorders
US20090005398A1 (en) 2007-06-27 2009-01-01 Mohammed Dar Methods For The Treatment of Central Nervous System Tumors
US7989007B2 (en) 2007-07-03 2011-08-02 Vincent James Enterprises, Llc Weight loss composition
KR100849537B1 (ko) 2007-07-04 2008-07-31 유효경 코엔자임 큐텐의 나노에멀젼 조성물
MX341954B (es) 2007-07-17 2016-09-08 Metabolon Inc Biomarcadores para prediabetes, enfermedades cardiovasculares y otros transtornos relacionados con sindrome metabolico, y metodos de uso de los mismos.
CN101091890A (zh) 2007-07-26 2007-12-26 沈阳药科大学 一种复合型乳化剂及用其制备的乳剂及其制备方法
US7776894B2 (en) 2007-08-17 2010-08-17 Burnham Institute For Medical Research Compositions and methods for inhibiting growth and metastasis of melanoma
RU2345367C1 (ru) 2007-08-22 2009-01-27 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО НГМУ Росздрава) Способ прогнозирования тяжести течения и эффективности лечения лимфом
JP2009050168A (ja) * 2007-08-23 2009-03-12 Tsujido Kagaku Kk 食品組成物
JP2010540498A (ja) 2007-09-28 2010-12-24 ウニヴェルズィテーツシュピタール バーゼル 癌の治療のための免疫リポソーム
JP2009096757A (ja) * 2007-10-17 2009-05-07 Tsujido Kagaku Kk 脂肪代謝抑制剤
JP5767812B2 (ja) 2007-12-06 2015-08-19 バーグ リミテッド ライアビリティ カンパニー 生物学的利用率が向上した吸入可能な組成物
US20110136231A1 (en) * 2008-04-11 2011-06-09 Cytotech Labs, Llc Methods and use of inducing apoptosis in cancer cells
US8460886B2 (en) 2008-07-04 2013-06-11 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Use of an efficacy marker for optimizing therapeutic efficacy of an anti-human PD-1 antibody on cancers
WO2010065601A1 (en) 2008-12-03 2010-06-10 Amorcyte, Inc. Infarct area perfusion-improving compositions and methods of vascular injury repair
DE102008060773A1 (de) 2008-12-05 2010-06-10 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Verschluss für einen Behälter
US8247435B2 (en) 2009-02-19 2012-08-21 Thornthwaite Jerry T Formulations for treating human and animal diseases
CN102481270A (zh) 2009-05-11 2012-05-30 博格生物系统有限责任公司 利用表观代谢转变剂、多维细胞内分子或环境影响剂治疗肿瘤障碍的方法
EA201270325A1 (ru) 2009-08-25 2012-11-30 Ситотех Лэбс, Ллс Способы лечения саркомы с использованием эпиметаболической сдвигающей добавки (кофермента q10)
US8506954B2 (en) 2009-12-01 2013-08-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Tumor vaccination in combination with hematopoietic cell transplantation for cancer therapy
EP2544663B1 (en) 2010-03-12 2018-01-03 Berg LLC Intravenous formulations of coenzyme q10 (coq10) and methods of use thereof
CA3225438A1 (en) 2010-07-19 2012-01-26 Remedy Pharmaceuticals, Inc. Methods of intravenous adminstration of glyburide and other drugs
US9125835B2 (en) 2010-11-12 2015-09-08 Rutgers, The State University Of New Jersey Synergistic combinations to reduce particle dose for targeted treatment of cancer and its metastases
AU2012240222B2 (en) 2011-04-04 2017-04-27 Berg Llc Methods of treating central nervous system tumors
NZ702369A (en) 2012-06-01 2016-12-23 Berg Llc Treatment of solid tumors using coenzyme q10
AU2014251045B2 (en) 2013-04-08 2019-06-13 Berg Llc Treatment of cancer using coenzyme Q10 combination therapies
SG10201907816RA (en) 2013-09-04 2019-09-27 Berg Llc Methods of treatment of cancer by continuous infusion of coenzyme q10
JP6398212B2 (ja) 2014-02-12 2018-10-03 株式会社Ihi 軸受構造、および、過給機
JP2017530130A (ja) 2014-10-03 2017-10-12 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 腫瘍が誘発する自然免疫応答の免疫抑制を阻害する方法としてのアネキシンｖの使用
CN107106590B (zh) 2014-10-24 2022-10-18 阿斯利康(瑞典)有限公司 组合
US9827308B2 (en) 2014-12-10 2017-11-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Mini-intronic plasmid DNA vaccines in combination with LAG3 blockade
WO2017087576A1 (en) 2015-11-16 2017-05-26 Berg Llc Methods of treatment of temozolomide-resistant glioma using coenzyme q10
US20180021270A1 (en) 2016-07-21 2018-01-25 Berg Llc Methods for the treatment of cancer using coenzyme q10 in combination with immune checkpoint modulators

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040133352A1 (en) * 1999-06-28 2004-07-08 Michael Bevilacqua Identification, monitoring and treatment of disease and characterization of biological condition using gene expression profiles
US20030138792A1 (en) * 2001-05-31 2003-07-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention and therapy of cervical cancer
US20060035981A1 (en) * 2003-08-02 2006-02-16 Mazzio Elizabeth A Inhibition of anaerobic glucose metabolism and corresponding composition as a natural non-toxic approach to cancer treatment

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAZZIO, ELIZABETH A. et al., "Effects of enhancing mitochondrial oxidative phosphorylation with reducing equivalents and ubiquinone on 1-methyl-4-phenylpyridinium toxicity and complex I-IV damage in neuroblastoma cells", Biochemmical Pharmacology, 2004, vol. 67, p. 1167-84, See abstract, page 1168 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016269471A1 (en) 2016-12-22
EA201101522A1 (ru) 2012-09-28
IL216295A0 (en) 2012-01-31
AU2010247755B2 (en) 2016-09-15
BRPI1011025A8 (pt) 2016-07-19
JP2012526555A (ja) 2012-11-01
KR101860294B1 (ko) 2018-07-02
EA201101520A1 (ru) 2012-09-28
MX2011011942A (es) 2011-12-06
CN102483419B (zh) 2017-12-15
WO2010132507A2 (en) 2010-11-18
BRPI1011025A2 (pt) 2016-03-29
JP2018021064A (ja) 2018-02-08
MX357528B (es) 2018-07-13
US20200157630A1 (en) 2020-05-21
CA2761717A1 (en) 2010-11-18
BRPI1010827A2 (pt) 2019-09-24
AU2010247734A1 (en) 2011-12-15
EP2430194A4 (en) 2013-09-04
EA201101519A1 (ru) 2012-10-30
WO2010132486A2 (en) 2010-11-18
EP2430194A2 (en) 2012-03-21
JP2016023189A (ja) 2016-02-08
WO2010132479A2 (en) 2010-11-18
SG175996A1 (en) 2011-12-29
IL216296B (en) 2020-06-30
CA2763325A1 (en) 2010-11-18
EP2429512A4 (en) 2013-07-31
KR20120034647A (ko) 2012-04-12
CA2763336A1 (en) 2010-11-18
US20180355435A1 (en) 2018-12-13
SG175992A1 (en) 2011-12-29
AU2010247755A1 (en) 2011-12-15
US9205064B2 (en) 2015-12-08
US20110110914A1 (en) 2011-05-12
JP2012526829A (ja) 2012-11-01
US20180334721A1 (en) 2018-11-22
WO2010132486A3 (en) 2011-03-03
AU2016204621A1 (en) 2016-07-21
WO2010132502A3 (en) 2011-04-21
IL216298A0 (en) 2012-01-31
JP6169846B2 (ja) 2017-07-26
WO2010132479A3 (en) 2011-03-31
US20160145693A1 (en) 2016-05-26
AU2010247734B2 (en) 2016-04-14
SG10201402289VA (en) 2014-07-30
MX351083B (es) 2017-09-29
JP2017018134A (ja) 2017-01-26
EA201101523A1 (ru) 2012-10-30
US11028446B2 (en) 2021-06-08
SG175994A1 (en) 2011-12-29
EP2429511A2 (en) 2012-03-21
KR20180018833A (ko) 2018-02-21
AU2010247750B2 (en) 2016-09-22
EP2430455A2 (en) 2012-03-21
JP6254979B2 (ja) 2017-12-27
MX2011011958A (es) 2012-02-13
US20210002725A1 (en) 2021-01-07
WO2010132440A3 (en) 2011-04-07
MX2011011949A (es) 2012-02-13
BRPI1010576A2 (pt) 2016-03-15
MX2011011947A (es) 2012-01-30
CN102481269B (zh) 2015-10-07
AU2016222515A1 (en) 2016-09-22
JP2012526554A (ja) 2012-11-01
KR20120060945A (ko) 2012-06-12
US20150023940A1 (en) 2015-01-22
BRPI1010908A2 (pt) 2016-03-15
US20110027247A1 (en) 2011-02-03
SG10201402287TA (en) 2014-07-30
CN102482713B (zh) 2017-06-30
CN102482713A (zh) 2012-05-30
EP2429511B1 (en) 2019-02-20
JP5903734B2 (ja) 2016-04-13
SG10201402293SA (en) 2014-08-28
JP2018048125A (ja) 2018-03-29
JP2012526824A (ja) 2012-11-01
CN104825429A (zh) 2015-08-12
EP2429512A2 (en) 2012-03-21
KR20140014390A (ko) 2014-02-06
US9896731B2 (en) 2018-02-20
SG175993A1 (en) 2011-12-29
US10351915B2 (en) 2019-07-16
CA2763347C (en) 2021-11-23
SG10201402288RA (en) 2014-07-30
AU2010247800A1 (en) 2011-12-15
JP2017214413A (ja) 2017-12-07
JP6081195B2 (ja) 2017-02-15
JP2016023190A (ja) 2016-02-08
US20210332439A1 (en) 2021-10-28
US20110123986A1 (en) 2011-05-26
CN102481269A (zh) 2012-05-30
IL216296A0 (en) 2012-01-31
EP2429513A4 (en) 2013-08-14
EP2429513A2 (en) 2012-03-21
IL216297A0 (en) 2012-01-31
WO2010132440A2 (en) 2010-11-18
MX345044B (es) 2017-01-16
SG175991A1 (en) 2011-12-29
KR20180056816A (ko) 2018-05-29
WO2010132507A3 (en) 2011-03-31
MX349796B (es) 2017-08-11
CA2762213A1 (en) 2010-11-18
EP2430455A4 (en) 2013-09-04
CN105287449A (zh) 2016-02-03
MX2011011940A (es) 2012-06-25
AU2016222422A1 (en) 2016-09-22
CA2763336C (en) 2018-10-30
JP2012526828A (ja) 2012-11-01
BRPI1010648A2 (pt) 2016-03-15
CN102481271A (zh) 2012-05-30
KR20120088555A (ko) 2012-08-08
SG10201402291QA (en) 2014-07-30
EA023913B1 (ru) 2016-07-29
CA2763347A1 (en) 2010-11-18
US10519504B2 (en) 2019-12-31
IL216299A0 (en) 2012-01-31
US20110123987A1 (en) 2011-05-26
WO2010132502A2 (en) 2010-11-18
US20190010554A1 (en) 2019-01-10
US20220081720A1 (en) 2022-03-17
AU2010247750A1 (en) 2011-12-15
AU2010247761A1 (en) 2011-12-15
CN102483419A (zh) 2012-05-30
JP5903735B2 (ja) 2016-04-13
US20170137879A1 (en) 2017-05-18
KR20120034649A (ko) 2012-04-12
US20110020312A1 (en) 2011-01-27
EP2429511A4 (en) 2013-08-28
JP2017074038A (ja) 2017-04-20
EA201101521A1 (ru) 2012-09-28
JP2015199746A (ja) 2015-11-12
KR101829201B1 (ko) 2018-02-19
CN102481270A (zh) 2012-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11028446B2 (en) Methods for treatment of oncological disorders using an epimetabolic shifter (coenzyme Q10)

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU