JP2017214413A - エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する代謝性障害の治療方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子又は環境影響因子を使用してヒトの代謝性障害を治療する方法及び製剤の提供。【解決手段】哺乳動物の代謝性障害を治療する、代謝性障害の症状を緩和する、代謝性障害の進行を阻害する、又は代謝性障害を予防する方法であって、少なくとも1つの環境影響因子(env影響因子)を含む治療的有効量の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、ここで環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常化されたミトコンドリア酸化的燐酸化への細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発し、正常細胞において、ミトコンドリア酸化的燐酸化への細胞代謝エネルギーシフトを実質に誘発しない、方法。代謝性障害がコエンザイムQ10又はその代謝産物もしくはその類似体による治療に応答性又は感受性である、方法。環境影響因子がコエンザイムQ10である、方法。【選択図】図1
Description
関連出願
本出願は、“Methods for Treatment of Oncological Disorders Using an Epimetabolic Shifter(Coenzyme Q10)”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,241(代理人整理番号:117732−00601)、“Methods for Treatment of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,243(代理人整理番号:117732−00701)、“Methods for the Diagnosis of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,244(代理人整理番号:117732−00801)、“Methods for Treatment of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,245(代理人整理番号:117732−00901)、および“Methods for the Diagnosis of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,246(代理人整理番号:117732−01001)の優先権を主張し、上述の各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられている。
本出願は、“Methods for Treatment of Oncological Disorders Using an Epimetabolic Shifter(Coenzyme Q10)”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,241(代理人整理番号:117732−00601)、“Methods for Treatment of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,243(代理人整理番号:117732−00701)、“Methods for the Diagnosis of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,244(代理人整理番号:117732−00801)、“Methods for Treatment of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,245(代理人整理番号:117732−00901)、および“Methods for the Diagnosis of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,246(代理人整理番号:117732−01001)の優先権を主張し、上述の各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられている。
本発明は、糖尿病および肥満などの代謝性障害の治療、予防、および低減に関するものである。
食事後に血糖のレベルが上昇するにつれて、インスリンが分泌され、エネルギー源として血液からグルコースを活動的に取り込むために末梢組織(骨格筋および脂肪)の細胞を刺激する。調節異常となったインスリンの分泌および作用の結果としてのグルコース恒常性の損失は、典型的には、糖尿病などの代謝性障害を生じ、これは、肥満によって同時に誘発されるか、または肥満によってさらに悪化される可能性がある。これらの状態はしばしば致死的であるので、血流からの適切なグルコースクリアランスを回復させるためのストラテジーが必要とされている。
糖尿病は膵臓に対する広範な損傷を引き起こすいかなる状態(例えば、膵炎、腫瘍、コルチコステロイドまたはペンタミジンなどの特定の薬物の投与、鉄過剰(例えば、血色素症)、後天性または遺伝性内分泌障害、および外科的切除)に対して二次的に発生する可能性があるが、典型的には、糖尿病の最も一般的な型はインスリンシグナル伝達系の一次的障害から発生する。2つの主要な型の糖尿病、すわわち、1型糖尿病(インスリン依存性糖尿病(IDDM)としてもまた知られる)および2型糖尿病(インスリン非依存性または非インスリン依存性糖尿病(NIDDM)としてもまた知られる)が存在しており、これらは、それらの異なる病原メカニズムにも関わらず、共通の長期にわたる合併症を共有している。
一次性糖尿病のすべての症例の約10%に達する1型糖尿病は、膵臓のインスリン産生β細胞の広範な破壊によって特徴付けられる器官特異的自己免疫疾患である。結果としてのインスリン産生の減少は、不可避的にグルコース代謝の調節不全をもたらす。インスリンの投与は、この状態に罹患している患者に顕著な利益を提供するが、インスリンの短い血清半減期は、正常血糖の維持に対する主要な障害である。代替治療は膵島移植であるが、このストラテジーに付随する成功は限られいる。
より大きな割合の集団に影響を与えている2型糖尿病は、インスリンの分泌の調節不全および/またはインスリンへに対する末梢組織の応答の減少、すなわち、インスリン抵抗性によって特徴付けられる。2型糖尿病の病因は不明のままであるが、疫学的研究は、この型の糖尿病は、各々が、それ自体の素因のリスクに寄与し、かつ過剰体重、食事、運動不足、薬物、および過度のアルコール消費を含む環境因子によって改変される複数の遺伝子欠損または多型の集合から生じることを示唆している。種々の治療的処置が2型糖尿病の管理のために利用可能であるが、これらには、種々の衰弱性副作用が付随する。したがって、2型糖尿病であるかまたはそのリスクがあると診断された患者は、しばしば、体重の減少、食事の変更、運動、および適度なアルコール摂取を含む、より健康的なライフスタイルを採るようにアドバイスされる。しかし、このようなライフスタイルの変化は、糖尿病によって引き起こされた血管および器官の損傷を逆転させるには十分ではない。
本明細書でCoQ10、Q10、ユビキノン、またはユビデカレノンとも呼ばれるコエンザイムQ10は、普及している栄養補助食品であり、CoQ10の還元型であるユビキノールの抗酸化特性を通じて免疫系の保護を助けるビタミン様栄養補助食品として、カプセル剤形で栄養食品店、健康食品店、薬局などにて見出すことができる。CoQ10は、当分野で認識されており、その全体の開示が参照により本明細書に組み入れられている、国際公開番号WO2005/069916にさらに記載されている。
CoQ10は、人体の大半の組織および他の哺乳動物の組織のいたるところで見出される。ヒトにおけるCoQ10の組織分布および酸化還元状態は、BhagavanおよびChopra(2006 Free Radical Research 40(5):445−453)による総論において概説されている。著者らは、「一般原則として、心臓、腎臓、肝臓および筋肉などのエネルギー要求または代謝活性の高い組織は、比較的高濃度のCoQ10を含有する」ことを報告している。著者らはさらに「脳および肺を除く組織中のCoQ10の大部分はヒドロキノンまたはユビキノール(uniquinol)としての還元型であり、このことはこれらの2つの組織における酸化ストレスの上昇を反映するものと思われる」ことを報告している。特に、Bhagavanは、心臓、腎臓、肝臓、筋肉、腸(intenstine)、および血液(血漿)の中で、それぞれ、約61%、75%、95%、65%、95%、および96%のCoQ10が還元型で存在することを報告している。同様に、Ruiz−Jiminez et al.(2007 J. Chroma A, 1175, 242−248)は、ヒト血漿がQ10および還元型のQ10(Q10H2)について評価されたときに、この分子の大部分(90%)が還元型で見い出されたことを報告している。
CoQ10は非常に親油性であり、大部分は水に不溶性である。CoQ10は非常に親油性であり、大部分は水に不溶性である。水中でのその不溶性、脂質中での限られた溶解性、および比較的大きな分子量に起因して、経口投与されたCoQ10の吸収の効率は乏しい。BhagavanおよびChopraは「ラットを用いた1つの研究において、経口投与されたCoQ10の約2〜3%のみが吸収されたことが報告された」と報告している。BhagavanおよびChopraは、「ラット研究からのデータは、腸における吸収の間またはその後のいずれかに、CoQ10はユビキノールに還元されることを示す」とさらに報告している。
糖尿病の管理のために現在利用可能であるストラテジーが最適に次ぐものであるならば、より効果的でありかつこのような消耗性副作用と関連しない治療の切実な必要性が存在する。
本発明は、一部は、ミトコンドリア機能不全が代謝性疾患(糖尿病および肥満など)を含む広範囲の疾患に関連しており、CoQ10などのある内因性分子がこのような代謝性疾患の診断、治療、および予防の成功の鍵を握っているという発見に基づいている。本発明は、一部は、これらの主要な内因性分子が、酸化的リン酸化に直接影響を及ぼすことによって正常なミトコンドリア機能を維持するのに重要な役割を果たし、より正常化されたミトコンドリア酸化的(osidative)リン酸化の回復または促進が代謝性疾患の進行を有効に治療または予防できるという発見にも基づいている。本発明はさらに、あるクラスの環境影響因子(例えばCoQ10)が代謝性疾患の疾患細胞において、より正常化されたミトコンドリア酸化的リン酸化に向けた細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発することができるという発見に基づいている。これらの環境影響因子は、治療エンドポイントを表す方式で、代謝性障害(糖尿病など)の主要な指標となる細胞内ターゲットを調節することができる。
本発明はさらに、内因性コエンザイムQ10(本明細書ではCoQ10またはQ10とも呼ばれる)の細胞への適用がアポトーシス応答を生じるという発見に少なくとも1部において基づいている。アポトーシス性応答は、癌細胞において選択的に誘導される。ミトコンドリアQ10レベルの時間および用量応答が観察され、48時間後に細胞ミトコンドリア中のQ10のレベルは6倍上昇した。本発明はさらに、Q10が、供給された酸化型(酸化促進)に維持され、還元型のQ10H2(抗酸化)にはいかなる有意な量でも転換されないという驚くべきかつ予想されなかった発見に基づいている。本発明は、Q10で処置された細胞中で有意な数のタンパク質およびmRNAのレベルが調節されるというさらなる発見に基づいている。これらの調節されたタンパク質は、アポトーシス,癌生物学および細胞増殖、解糖および代謝、分子輸送、ならびに細胞シグナル伝達を含む、複数の細胞経路中に密集することが見出された。
本明細書に記載される出願人らのデータは、Q10の作用のメカニズムに洞察を与えてきた。特に、理論に拘束されることを望むものではないが、出願人の発見は、Q10が細胞微小環境に代謝シフトを誘導することを示す。多くの疾患は、改変された代謝状態に関連して(associeated)いることが公知である。例えば、示差的代謝が癌細胞において起こることが知られており(Warurg効果)、それによって、多くの癌細胞が、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化(ピルビン酸の酸化)によるのではなく、サイトゾル中での解糖、続いて乳酸発酵によって優勢にエネルギーを産生する。別の例において、糖尿病および肥満などの代謝性障害は、グルコース代謝の変化と関連する。
したがって本発明は、第1の態様において、哺乳動物のCoQ10応答性障害を治療する、CoQ10応答性障害の症状を緩和する、CoQ10応答性障害の進行を阻害する、またはCoQ10応答性障害を予防する方法であって、少なくとも1つの環境影響因子(env影響因子)を含む治療的有効量の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察された解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルへの細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する方法を提供する。
一実施形態において、CoQ10応答性障害は代謝性障害である。
本発明は、別の態様において、哺乳動物の代謝性障害を治療する、代謝性障害の症状を緩和する、代謝性障害の進行を阻害する、または代謝性障害を予防する方法であって、少なくとも1つの環境影響因子(env影響因子)を含む治療的有効量の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常化されたミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する方法を提供する。
一実施形態において、環境影響因子は、哺乳動物の正常細胞において、ミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを実質的に誘発しない。
一実施形態において、哺乳動物はヒト(または非ヒト哺乳動物)である。
一実施形態において、代謝性障害はコエンザイムQ10またはその代謝産物もしくはその類似体による治療に応答性または感受性である。
一実施形態において、代謝性障害は、代謝性疾患の原因となる、または原因として代謝性疾患を引き起こす、改変された遺伝子調節および/またはタンパク質−タンパク質相互作用を引き起こす、ミトコンドリア酸化的リン酸化機能の調節不全によって特徴付けられる。
一実施形態において、環境影響因子は(a)ベンゾキノンまたはベンゾキノン環の生合成を容易にする少なくとも1つの分子、ならびに(b)イソプレノイドユニットの合成および/またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする少なくとも1つの分子を含む。
一実施形態において、ベンゾキノン環の生合成を容易にする前記少なくとも1つの分子は、以下を含む:L−フェニルアラニン、DL−フェニルアラニン、D−フェニルアラニン、L−チロシン、DL−チロシン、D−チロシン、4−ヒドロキシ−フェニルピルベート、3−メトキシ−4−ヒドロキシマンデレート(バニリンマンデレートまたはVMA)、バニリン酸、ピリドキシン、またはパンテノールを含む。
一実施形態において、イソプレノイドユニットの合成および/またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする前記少なくとも1つの分子は:フェニルアセテート、4−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、アセチルグリシン、アセチルCoA、またはファルネシルを含む。
一実施形態において、環境影響因子は:(a)L−フェニルアラニン、L−チロシン、および4−ヒドロキシフェニルピルベートの1つ以上;ならびに(b)4−ヒドロキシベンゾエート、フェニルアセテート、およびベンゾキノンの1つ以上を含む。
一実施形態において、環境影響因子は:(a)Bcl−2発現を阻害するおよび/もしくはカスパーゼ−3発現を促進する;ならびに/または(b)細胞増殖を阻害する。
一実施形態において、環境影響因子は多次元細胞内分子(MIM)である。一実施形態において、MIMは:アルファケトグルタレート/アルファケトグルタル酸、リンゴ酸塩/リンゴ酸、コハク酸塩/コハク酸、グルコサミン、アデノシン、アデノシン2リン酸、グルクロニド/グルクロン酸、ニコチン酸、ニコチン酸ジヌクレオチド、アラニン/フェニルアラニン、ピリドキシン、チアミン、またはフラビンアデニンジヌクレオチドから選択される。一実施形態において、多次元細胞内分子はアセチルCo−A、パルミチルCo−A、L−カルニチン、およびアミノ酸、例えばチロシン、フェニルアラニン、およびシステインからなる群より選択される。
一実施形態において、環境影響因子はエピメタボリックシフター(エピシフター)である。一実施形態において、エピメタボリックシフターは:トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、スクシニルCoAシンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、またはリボフラビンから選択される。一実施形態において、エピメタボリックシフターは:コエンザイムQ10、ビタミンD3および細胞外マトリクス構成要素からなる群より選択される。一実施形態において、エピメタボリックシフターはコエンザイムQ10である。一実施形態において、細胞外マトリクス構成要素は、フィブロネクチン、免疫調節薬(例えばTNFαまたはインターロイキン)、血管新生因子、およびアポトーシス因子からなる群より選択される。
一実施形態において、ヒトの集団が治療され、集団の少なくとも25%は、治療されている障害に対して治療的である全身的環境影響因子レベルを有していた。他の実施形態では、ヒトの集団が治療され、上記集団のうちの少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上が、治療されている障害についての治療効果のある、全身性コエンザイムQ10レベルを有していた。上限または下限としてのこれらの値のいずれか1つを有する範囲、例えば10%〜25%、15%〜35%、25%〜50%、35%〜60%、40%〜70%、50%〜75%、60%〜85%または70%〜90%も本発明の一部であると意図されることが理解されるべきである。
一実施形態において、代謝性障害は、治療的有効レベルでの活性剤の全身送達を期待した局所投与を介して通例治療される障害ではない。
一実施形態において、治療されているヒト組織における環境影響因子の濃度は、健常または正常状態を表すヒト組織の対照標準の環境影響因子の濃度とは異なる。
一実施形態において、ヒトに投与された環境影響因子の型は、ヒトにおける全身循環中で見出される優勢型とは異なる。一実施形態において、環境影響因子はヒトに酸化型で投与される。
一実施形態において、ヒトの代謝性障害を治療するのに十分な量は、ミトコンドリア酸化的リン酸化を上方調節または下方調節する。
一実施形態において、ヒトの代謝性障害を治療するのに十分な量は、グルコースの嫌気的使用および/またはラクテート生合成を調節する。
本発明は、別の態様において、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、環境影響因子を代謝性障害を治療または予防するのに十分な量でヒトに投与することを含み、環境影響因子が治療の間にその酸化型が維持されるように投与され、これにより代謝性障害を治療または予防する方法を提供する。
一実施形態において、ヒトに投与された環境影響因子の形態は、ヒトにおける全身循環中で見出される優勢形態とは異なる。
本発明は、また別の態様において、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、代謝性障害に罹患しているヒト対象を選択すること;ならびにミトコンドリア酸化的リン酸化を増強することができる、および場合によりグルコースの嫌気的使用を遮断することができるenv影響因子の治療的有効量を前記ヒトに投与して、これにより代謝性障害を治療または予防することを含む方法を提供する。
本発明は、別の態様において、代謝性障害の治療を必要する哺乳動物の疾患細胞においてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強する方法であって、少なくとも1つのenv影響因子を含む治療的有効量の医薬組成物を前記哺乳動物に投与して、これにより哺乳動物の前記疾患細胞にてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強することを含む方法を提供する。
本発明の方法の一実施形態において、方法は、正の倍率変化を有する表2〜4および表6〜28および表63〜68に挙げられた分子からなる群より選択される1つ以上の遺伝子の発現を上方調節して;ならびに/または負の倍率変化を有する表2〜4および表6〜28および表63〜68に挙げられた分子からなる群より選択されるの1つ以上の遺伝子の発現を下方調節して、これにより代謝性障害を治療または予防することをさらに含む。一実施形態において、方法は、HNF4−アルファ、Bcl−xl、Bcl−xS、BNIP−2、Bcl−2、Birc6、Bcl−2−L11、XIAP、BRAF、Bax、c−Jun、Bmf、PUMA、cMyc、トランスアルドラーゼ1、COQ1、COQ3、COQ6、プレニルトランスフェラーゼ、4−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子2、一酸化窒素シンターゼ2A、スーパーオキシドディスムターゼ2、VDAC、Baxチャネル、ANT、シトクロムc、複合体I、複合体II、複合体III、複合体IV、Foxo3a、DJ−1、IDH−1、Cpt1CおよびカムキナーゼIIからなる群より選択される1つ以上の遺伝子の発現を調節することをさらに含む。
本発明の方法の一実施形態において、治療は、環境影響因子と表2〜4および6〜28および63〜68に挙げられた分子からなる群より選択される分子との相互作用を介してなされる。一実施形態において、治療は、環境影響因子とHNF4−アルファ、Bcl−xl、Bcl−xS、BNIP−2、Bcl−2、Birc6、Bcl−2−L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c−Jun、Bmf、PUMA、cMyc、トランスアルドラーゼ1、COQ1、COQ3、COQ6、プレニルトランスフェラーゼ、4−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子2、一酸化窒素シンターゼ2A、スーパーオキシドディスムターゼ2、VDAC、Baxチャネル、ANT、シトクロムc、複合体I、複合体II、複合体III、複合体IV、Foxo3a、DJ−1、IDH−1、Cpt1CおよびカムキナーゼIIからなる群より選択されるタンパク質との相互作用を介してなされる。一実施形態において、治療は、env影響因子とHNF4アルファとの相互作用を介してなされる。一実施形態において、治療は、env影響因子とトランスアルドラーゼとの相互作用を介してなされる。
本発明の方法の一実施形態において、代謝性障害は、糖尿病、肥満、前糖尿病、メタボリックシンドロームおよび代謝性障害の主要な要素からなる群より選択される。
一実施形態において、代謝性障害は糖尿病であり、env影響因子はベータ細胞機能、インスリン代謝、および/またはグルカゴン沈着に影響を及ぼす。
一実施形態において、代謝性障害が肥満であり、env影響因子はミトコンドリアにおけるベータ細胞酸化、脂肪細胞サイズの低下、および/またはコルチゾールレベルの制御に影響を及ぼす。
一実施形態において、代謝性障害は心血管疾患であり、env影響因子は中膜における平滑筋細胞増殖の低下、脂質過酸化、トロンボキサン−ax2合成、TNFa、IL−1B、血小板凝集、一酸化窒素(NO)産生の低下、プラーク沈着および/または正常化した血糖制御に影響を及ぼす。
一実施形態において、代謝性障害の主要な要素は、空腹時血糖異常、耐糖能異常、腹囲増加、内臓脂肪量増加、空腹時血漿グルコースの増加、空腹時血漿トリグリセリドの増加、高密度リポタンパク質レベルの低下、血圧の上昇、インスリン抵抗性、高インスリン血症、心血管疾患、動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、脳血管疾患、うっ血性心不全、血漿ノルエピネフリンの上昇、心血管関連炎症因子の上昇、血管内皮機能障害を増強する血漿因子の上昇、高リポタンパク血症、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症、過食症、高血糖症、高脂血症、および高血圧症(hypertension)または高血圧症(high blood pressure)、食後血漿トリグリセリドレベルまたは遊離脂肪酸レベルの上昇、細胞酸化ストレスまたはその血漿指標の上昇、循環過凝固状態の増加、肝臓脂肪症、肝臓脂肪症(hetaptic steatosis)、腎不全および腎機能不全を含む腎疾患を含む。
本発明の方法の一実施形態において、方法は、追加の治療剤、例えば真性糖尿病治療剤、糖尿病合併症治療剤、抗高脂血剤、降圧剤または抗高血圧剤、抗肥満剤、利尿薬、化学治療剤、免疫治療剤および免疫抑制剤の投与をさらに含む。一実施形態において、代謝性障害は、糖尿病、肥満、前糖尿病、メタボリックシンドロームおよび代謝性障害のいずれかの主要な要素からなる群より選択される。一実施形態において、代謝性障害の主要な要素は、空腹時血糖異常、耐糖能異常、腹囲増加、内臓脂肪量増加、空腹時血漿グルコースの増加、空腹時血漿トリグリセリドの増加、空腹時高密度リポタンパク質レベルの低下、血圧の上昇、インスリン抵抗性、高インスリン血症、心血管疾患、動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、脳血管疾患、うっ血性心不全、血漿ノルエピネフリンの上昇、心血管関連炎症因子の上昇、血管内皮機能障害を増強する血漿因子の上昇、高リポタンパク血症、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症、過食症、高血糖症、高脂血症、および高血圧症または高血圧症、食後血漿トリグリセリドレベルまたは遊離脂肪酸レベルの上昇、細胞酸化ストレスまたはその血漿指標の上昇、循環過凝固状態の増加、肝臓脂肪症、肝臓脂肪症、腎不全および腎機能不全を含む腎疾患からなる群より選択される。
本発明の方法の一実施形態において、方法は、追加の治療剤、例えば真性糖尿病治療剤、糖尿病合併症治療剤、抗高脂血剤、降圧剤または抗高血圧剤、抗肥満剤、利尿薬、化学治療剤、免疫治療剤および免疫抑制剤の投与をさらに含む。
本発明は、別の態様において、代謝性障害を治療するのに有効である薬剤を同定する方法であって、環境影響因子を選択することと;細胞の代謝状態をシフトさせることができる環境影響因子を同定することと;環境影響因子が代謝性障害を治療するのに有効であるか否かを判定して;これにより代謝性障害を治療するのに有効である薬剤を同定することとを含む方法を提供する。
一実施形態において、環境影響因子は、mRNA発現、タンパク質発現、脂質または代謝産物濃度、生体エネルギー分子のレベル、細胞エネルギー特性、ミトコンドリア機能およびミトコンドリア数のいずれか1つ以上の変化を測定することによって、細胞の代謝状態をシフトさせることができるとして同定される。
一実施形態において、代謝性障害の治療に有効な環境影響因子は、患者のグルコースレベルまたは脂質レベルを低下させることができる。
本発明は、なお別の態様において、多次元細胞内分子を同定する方法であって、細胞を内因性分子と接触させることと;細胞微小環境プロフィールに対する内因性分子の効果を監視することと;細胞微小環境プロフィールに変化を誘発する内因性分子を同定して;これにより多次元細胞内分子を同定することとを含む方法を提供する。
一実施形態において、方法は、罹患した細胞および正常な対照細胞の細胞微小環境プロフィールに対する内因性分子の効果を比較することと;罹患した細胞の細胞微小環境プロフィールに対する変化を、正常な対照細胞と比較して示差的に発する内因性分子を同定して;これによりMIMを同定することをさらに含む。
一実施形態において、細胞微小環境プロフィールに対する効果は、mRNA、タンパク質、脂質および代謝産物からなる群より選択される細胞分子のレベルまたは活性の変化を測定することによって監視される。
本発明は、なお別の態様において、エピメタボリックシフターを同定する方法であって、示差的疾患状態を提示する2つ以上の細胞または組織について分子プロフィールを比較することと;レベルの変化が疾患状態に相関する分子プロフィールから分子を同定することと;分子を細胞に導入することと;分子が細胞の代謝状態をシフトさせる能力を評価することとを含み、細胞の代謝状態をシフトさせることができる分子がエピメタボリックシフターとして同定される方法を提供する。
一実施形態において、分子プロフィールは、代謝産物プロフィール、脂質プロフィール、タンパク質プロフィールまたはRNAプロフィールからなる群より選択される。
一実施形態において、分子は、正常な細胞の健康または増殖に悪影響を及ぼさない。
本発明は、別の態様において、本発明の方法のいずれかによって同定された薬剤を含む組成物を提供する。本発明は、関連する態様において、本発明の組成物を含むキットをさらに提供する。
本発明は、別の態様において、患者のグルコースレベルを低下させる方法であって、本発明の組成物の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。本発明は、関連する態様において、患者の脂質レベルを低下させる方法であって、本発明の組成物の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。
I.定義
本明細書で使用する場合、以下の用語のそれぞれが、本セクションおける用語と関連する意味を有する。
本明細書で使用する場合、以下の用語のそれぞれが、本セクションおける用語と関連する意味を有する。
冠詞「a」および「an」は、冠詞の文法的対象のうち1つまたは1つを超える(すなわち少なくとも1つ)を指すために本明細書で使用される。1例として、「要素」は、1つの要素または1つを超える要素を意味する。
「含む(including)」という用語は、「限定されるわけではないが、含む」という句を意味するために本明細書で使用され、「限定されるわけではないが、含む」と互換的に使用される。
「または」という用語は、状況が別途明らかに指摘しない限り、「および/または」という用語を意味するために本明細書で使用され、「および/または」という用語と互換的に使用される。
「などの」という用語は、「限定されるわけではないが、などの」という句を意味するために本明細書で使用され、「限定されるわけではないが、などの」と互換的に使用される。
本発明の方法によって治療される「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物のどちらか、好ましくは哺乳動物を意味することができる。
「治療的有効量」は、疾患を治療するために患者に投与されたときに疾患に対してこのような治療をもたらすのに十分である化合物の量を意味する。疾患を予防するために投与されたときに、量は、疾患の開始を回避または遅延するのに十分である。「治療的有効量」は、化合物、疾患およびその重症度ならびに治療される患者の年齢、体重などに応じて変動するであろう。
「予防すること」または「予防」は、疾患または障害を獲得するリスクの低減(すなわち疾患の臨床症候の少なくとも1つを、疾患に曝露され得るまたは疾患の素因があり得るが、疾患の症候をまだ経験または提示していない患者において発症させないようにすること)を指す。
「予防」または「治療」処置という用語は、対象組成物の1つ以上の対象への投与を指す。望ましくない症状(例えば宿主動物の疾患または他の望ましくない状態)の臨床顕在化の前に投与される場合、ここで処置は予防的であり、すなわち処置は宿主が望ましくない症状を発症することから保護するのに対して、望ましくない症状の顕在化後に投与される場合、処置は治療である(すなわち既存の望ましくない症状またはそれからの副作用を減少、緩和または維持するものとする)。
「治療効果」という用語は、動物、特に哺乳動物、およびさらに詳細にはヒトにおいて薬理学的活性物質によって引き起こされる、局所または全身効果を指す。該用語はそれゆえ、動物またはヒトにおける疾患の診断、治癒、軽減、処置もしくは予防でのまたは所望の身体的もしくは精神的発達および状態の増強での使用が意図されるいずれの物質も意味する。「治療的有効量」という句は、いずれの処置にも適用できる合理的な利益/リスク比にてある望ましい局所または全身効果を産生するような物質の量を意味する。ある実施形態において、化合物の治療的有効量は、その治療指数、溶解性などに依存するであろう。例えば、本発明の方法によって見出されたある化合物は、このような処置に適用できる合理的な利益/リスク比を産生するために十分な量で投与され得る。
「患者」とは、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、サル、モルモット、ラット、マウス、トカゲ、ヘビ、ヒツジ、ウシ、魚およびトリを含む、いずれかの動物(例えばヒト)を意味する。
「代謝経路」は、1つの化合物を別の化合物に変換して、中間体および細胞機能のためのエネルギーを提供する、一連の酵素媒介反応を指す。代謝経路は線形または環式であることができる。
「代謝状態」は、各種の化学的および生物学的指標が健康または疾患の状態に関連するため、各種の化学的および生物学的指標によって測定されるような所与の時点における特定の細胞、多細胞または組織環境の分子内容物を指す。
「マイクロアレイ」という用語は、基質、例えば紙、ナイロンもしくは他の種類の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、またはその他の好適な固体支持体上で合成された別個のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド(例えば抗体)またはペプチドのアレイを指す。
「障害」および「疾患」という用語は、包括的に使用され、体のいずれの部分、器官または系(またはそのいずれの組み合わせ)の正常な構造または機能からのいずれの逸脱も指す。特異的疾患は、生物学的、化学的および物理的変化を含む特徴的症候および徴候によって明らかとなり、限定されるわけではないが、人口統計学的因子、環境因子、雇用因子、遺伝的因子および病歴因子を含む、多種多様の他の因子と関連することが多い。ある特徴的な徴候、症候、および関連因子は、重要な診断情報を産する多種多様の方法によって定量化することができる。
「発現」という用語は、ポリペプチドがDNAから産生されるプロセスを意味するために本明細書で使用される。プロセスは、遺伝子のmRNAへの転写およびこのmRNAのポリペプチドへの翻訳を包含する。使用される状況に応じて、「発現」は、RNA、タンパク質またはその両方の産生を指す。
「遺伝子の発現レベル」または「遺伝子発現レベル」という用語は、mRNA、ならびにプレmRNA新生転写物、転写プロセシング中間体、成熟mRNAおよび分解生成物のレベル、または細胞中の遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルを指す。
「調節」という用語は、応答の上方調節(すなわち活性化または刺激)、下方調節(すなわち阻害または抑制)、または組み合わされたもしくは別々のその2つを指す。「モジュレーター」は、調節する化合物または分子であり、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、アクチベーター、刺激物質、サプレッサー、または阻害剤であり得る。
「コエンザイム生合成経路の中間体」という用語は、本明細書で使用する場合、チロシンおよびアセチルCoAのユビキノン(uqiquinone)への化学的/生物学的変換の間に形成される化合物を特徴付ける。コエンザイム生合成経路の中間体は、3−ヘキサプレニル−4−ヒドロキシベンゾエート、3−ヘキサプレニル−4,5−ジヒドロキシベンゾエート、3−ヘキサプレニル−4−ヒドロキシ−5−メトキシベンゾエート、2−ヘキサプレニル−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−ヘキサプレニル−3−メチル−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−ヘキサプレニル−3−メチル−5−ヒドロキシ−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、3−オクタプレニル−4−ヒドロキシベンゾエート,2−オクタプレニルフェノール、2−オクタプレニル−6−メチルオキシ(metholxy)フェノール,2−オクタプレニル−3−メチル−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−オクタプレニル−3−メチル−5−ヒドロキシ−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−デカプレニル−3−メチル−5−ヒドロキシ−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−デカプレニル−3−メチル−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−デカプレニル−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−デカプレニル−6−メトキシフェノール、3−デカプレニル−4−ヒドロキシ−5−メトキシベンゾエート、3−デカプレニル−4,5−ジヒドロキシベンゾエート、3−デカプレニル−4−ヒドロキシベンゾエート、4−ヒドロキシフェニルピルベート、4−ヒドロキシフェニルラクテート、4−ヒドロキシ−ベンゾエート、4−ヒドロキシシンナメートおよびヘキサプレニル(hexapreny)ジホスフェートを含む。
本明細書中で使用される場合は、表現「グルコースの嫌気的使用」または「嫌気的解糖」は、解糖、それに続くサイトゾル中での乳酸発酵による細胞のエネルギー産生をいう。例えば多くの癌細胞は、嫌気的解糖によってエネルギーを産生する。
本明細書で使用する場合、「好気的解糖」または「ミトコンドリア酸化的リン酸化」は、ミトコンドリアでの解糖によるエネルギーの細胞産生とそれに続くピルビン酸の酸化を指す。
本明細書中で使用される場合は、表現「グルコースの嫌気的使用を遮断し、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を促進することができる」は、嫌気的解糖から好気的解糖へまたはミトコンドリアの酸化的リン酸化への細胞の代謝状態のシフトあるいは変化を誘導する環境影響因子(例えば、エピメタボリックシフター)の能力をいう。
ここで本発明の好ましい実施形態への参照が詳細になされるであろう。本発明は好ましい実施形態と併せて記載されるが、本発明をこれらの好ましい実施形態に制限することが意図されていないことが理解されるであろう。反対に、添付請求項によって定義されるような本発明の精神および範囲に含まれ得る代替、修正、および均等物を扱うことが意図される。
II.環境影響因子
本発明は、環境影響因子の投与によって代謝性障害を治療する方法を提供する。「環境影響因子(Env−influencers)」は、有効な方法でヒトの疾患環境に影響を及ぼすかまたはヒトの疾患環境を調節する分子であり、これによりヒトの疾患環境を、正常な環境または正常な状態に通じる健康な環境にシフトさせる、そのような環境に戻して再度確立させる、あるいはそのような環境を維持することが可能となる。env影響因子は、下で定義するような多次元細胞内分子(MIM)およびエピメタボリックシフター(エピシフター)の両方を含む。
本発明は、環境影響因子の投与によって代謝性障害を治療する方法を提供する。「環境影響因子(Env−influencers)」は、有効な方法でヒトの疾患環境に影響を及ぼすかまたはヒトの疾患環境を調節する分子であり、これによりヒトの疾患環境を、正常な環境または正常な状態に通じる健康な環境にシフトさせる、そのような環境に戻して再度確立させる、あるいはそのような環境を維持することが可能となる。env影響因子は、下で定義するような多次元細胞内分子(MIM)およびエピメタボリックシフター(エピシフター)の両方を含む。
1.多次元細胞内分子(MIM)
「多次元細胞内分子(MIM)」という用語は、体によって自然に産生されるおよび/またはヒトの少なくとも1つの細胞中に存在する内因性分子の単離されたものまたは合成産生されたものである。MIMは、以下の機能の1つ以上、2つ以上、3つ以上、またはすべてによって特徴付けられる。MIMは細胞に進入することが可能であり、細胞への進入は、分子の生物活性部分が完全に細胞に進入する限り、細胞への完全または部分進入を含む。MIMは、細胞内でシグナル伝達および/または遺伝子発現機構を誘導することが可能である。MIMは、治療薬および担体の両方、例えば薬物送達効果を有するという点で多次元である。MIMはまた、疾患状態において1つの方法で作用し、正常な状態においては異なる方法で作用するという点で多次元である。例えばCoQ−10の場合、VEGFの存在下での黒色腫細胞へのCoQ−10の投与は、Bcl2レベルの低下をもたらし、次に黒色腫細胞の発癌能の低下をもたらす。対照的に、正常な線維芽細胞において、CoQ−10およびVEFGの同時投与は、Bcl2のレベルに対する効果は有さない。好ましくはMIMは、疾患状態の細胞において選択的に作用し、正常な状態の(マッチング)細胞において実質的に効果を有さない。好ましくはMIMは、疾患状態の細胞を、表現型、代謝状態、遺伝子型、mRNA/タンパク質発現レベルなどで正常な状態の(マッチング細胞)に選択的に近づける。
「多次元細胞内分子(MIM)」という用語は、体によって自然に産生されるおよび/またはヒトの少なくとも1つの細胞中に存在する内因性分子の単離されたものまたは合成産生されたものである。MIMは、以下の機能の1つ以上、2つ以上、3つ以上、またはすべてによって特徴付けられる。MIMは細胞に進入することが可能であり、細胞への進入は、分子の生物活性部分が完全に細胞に進入する限り、細胞への完全または部分進入を含む。MIMは、細胞内でシグナル伝達および/または遺伝子発現機構を誘導することが可能である。MIMは、治療薬および担体の両方、例えば薬物送達効果を有するという点で多次元である。MIMはまた、疾患状態において1つの方法で作用し、正常な状態においては異なる方法で作用するという点で多次元である。例えばCoQ−10の場合、VEGFの存在下での黒色腫細胞へのCoQ−10の投与は、Bcl2レベルの低下をもたらし、次に黒色腫細胞の発癌能の低下をもたらす。対照的に、正常な線維芽細胞において、CoQ−10およびVEFGの同時投与は、Bcl2のレベルに対する効果は有さない。好ましくはMIMは、疾患状態の細胞において選択的に作用し、正常な状態の(マッチング)細胞において実質的に効果を有さない。好ましくはMIMは、疾患状態の細胞を、表現型、代謝状態、遺伝子型、mRNA/タンパク質発現レベルなどで正常な状態の(マッチング細胞)に選択的に近づける。
一実施形態において、MIMはエピシフターでもある。別の実施形態において、MIMはエピシフターではない。当業者は、本発明のMIMが2つ以上の内因性分子の混合物を含むことも意図され、混合物が上述の機能の1つ以上によって特徴付けられることを認識するであろう。混合物中の内因性分子は、混合物がMIMとして機能するような比で存在する。
MIMは、脂質ベース分子または非脂質ベース分子であることができる。MIMの例は、限定されるわけではないが、CoQ10、アセチルCo−A、パルミチルCo−A、L−カルニチン、例えばチロシン、フェニルアラニン、およびシステインなどのアミノ酸を含む。一実施形態において、MIMは小型分子である。本発明の一実施形態において、MIMはCoQ10でない。MIMは、本明細書で詳細に記載されたアッセイのいずれかを使用して、当業者によって日常的に同定することができる。
いくつかの実施形態において、MIMは、ビタミンBファミリーの化合物、またはビタミンBファミリーの化合物を含むヌクレオシド、モノヌクレオチドもしくはジヌクレオチドを含む。ビタミンBファミリーの化合物は、例えばチアミン(ビタミンB1)、ナイアシン(ニコチン酸またはビタミンB3としても公知)、またはピリドキシン(ビタミンB6)ならびにパンテノール(プロビタミンB5)などのプロビタミンを含む。いくつかの実施形態において、MIMは、チアミン、ナイアシンおよびピリドキシンから選択される。ビタミンBファミリーの化合物を含むヌクレオシド、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチドは例えば、アデニンまたはナイアシン(ニコチン酸)分子を含むヌクレオシド、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、MIMは、アデノシン、アデノシン2リン酸(ADP)、フラビンアデノシンジヌクレオチド(FAD、ビタミンB2およびADPの一部を含む)およびニコチン酸ジヌクレオチドから選択される。
他の実施形態において、MIMはアミノ酸を含む。アミノ酸の例は、例えばチロシン(例えばL−チロシン)、システイン、フェニルアラニン(例えばL−フェニルアラニン)およびアラニンを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸はフェニルアラニンまたはアラニンである。いくつかの実施形態において、MIMは、4−ヒドロキシフェニルピルベートまたはアセチルグリシンなどのアミノ酸誘導体を含む。
いくつかの実施形態において、MIMはグルコース類似体、例えば1個の−OHまたは−CH2OH置換基が−COOH、−COO−または−NH2置換基によって置換されているグルコース分子である。グルコース類似体の例は、グルコサミン、グルクロン酸、グルクロニドおよびグルクロン酸塩を含む。
式中
nは0または1の整数であり;
R1、R2、R3およびR4は存在するとき、水素およびヒドロキシルからそれぞれ独立して選択される、またはR1およびR2は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル(C=O)基を形成し;
Wは−COOHまたは−N(CH3)3 +であり;ならびに
Xは、水素、負の電荷またはNa+などのアルカリ金属カチオンである。
nは0または1の整数であり;
R1、R2、R3およびR4は存在するとき、水素およびヒドロキシルからそれぞれ独立して選択される、またはR1およびR2は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル(C=O)基を形成し;
Wは−COOHまたは−N(CH3)3 +であり;ならびに
Xは、水素、負の電荷またはNa+などのアルカリ金属カチオンである。
nが0であるとき、CHR3基がW置換基に結合されていることが理解される。
いくつかの実施形態において、Wは−N(CH3)3 +である。いくつかの実施形態において、MIMは、L−カルニチンなどのカルニチンである。
いくつかの実施形態において、MIMはジカルボン酸である。いくつかの実施形態において、Wは−COOHである。いくつかの実施形態において、R3は水素である。いくつかの実施形態において、nは0である。いくつかの実施形態において、R1およびR2はそれぞれ独立して水素である。いくつかの実施形態において、Wは−COOHであり、R3は水素であり、nは0であり、ならびにR1およびR2はそれぞれ独立して水素である。いくつかの実施形態において、nは1である。いくつかの実施形態において、R1およびR2は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル(C=O)基を形成する。いくつかの実施形態において、R4は水素である。いくつかの実施形態において、R4はヒドロキシルである。いくつかの実施形態において、Wは−COOHであり、R3は水素であり、nは1であり、ならびにR1およびR2は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル(C=O)基を形成する。
いくつかの実施形態において、MIMはクレブス回路の中間体であり、過剰な中間体がクレブス回路を生産的な酸化的リン酸化に向けて操縦する。MIMである例示的なクレブス回路中間体は、コハク酸またはコハク酸塩、リンゴ酸またはリンゴ酸塩、およびα−ケトグルタル酸またはα−ケトグルタレートを含む。
それゆえ、CoQ10の構成単位は、限定されるわけではないが、フェニルアラニン、チロシン、4−ヒドロキシフェニルピルベート、フェニルアセテート、3−メトキシ−4−ヒドロキシマンデレート、バニリン酸、4−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、ファルネシル、2,3−ジメトキシ−5−メチル−p−ベンゾキノン、ならびに対応するその酸またはイオンを含む。いくつかの実施形態において、MIMは、フェニルアラニン、チロシン、4−ヒドロキシフェニルピルベート、フェニルアセテートおよび4−ヒドロキシベンゾエートから選択される。
(i)MIMを同定する方法
本発明は、MIMを同定する方法を提供する。MIMを同定する方法は、細胞への内因性分子の外部からの添加および内因性分子の細胞、例えば細胞微小環境プロフィールに対する効果の評価を包含する。細胞に対する効果は細胞、mRNA、タンパク質、脂質、および/または代謝産物レベルの1つ以上で評価されて、細胞微小環境プロフィールにおける改変を同定する。一実施形態において、細胞は例えばインビトロで培養された培養細胞である。一実施形態において、細胞は生物中に存在する。内因性分子は、細胞に単一の濃度で添加され得る、または細胞に一連の濃度にわたって添加され得る。一実施形態において、内因性分子は対照の未処置細胞中の内因性分子のレベルと比較して、細胞中の内因性分子のレベルが上昇するように細胞に添加される(例えば1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍またはそれ以上、上昇する)。
本発明は、MIMを同定する方法を提供する。MIMを同定する方法は、細胞への内因性分子の外部からの添加および内因性分子の細胞、例えば細胞微小環境プロフィールに対する効果の評価を包含する。細胞に対する効果は細胞、mRNA、タンパク質、脂質、および/または代謝産物レベルの1つ以上で評価されて、細胞微小環境プロフィールにおける改変を同定する。一実施形態において、細胞は例えばインビトロで培養された培養細胞である。一実施形態において、細胞は生物中に存在する。内因性分子は、細胞に単一の濃度で添加され得る、または細胞に一連の濃度にわたって添加され得る。一実施形態において、内因性分子は対照の未処置細胞中の内因性分子のレベルと比較して、細胞中の内因性分子のレベルが上昇するように細胞に添加される(例えば1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍またはそれ以上、上昇する)。
例えば形態、生理機能、および/または組成(例えばmRNA、タンパク質、脂質、代謝産物)のいずれか1つ以上における改変により検出されるような、細胞中の変化を誘導する分子は、細胞微小環境プロフィールに対して誘導された変化が疾患細胞状態と正常な細胞状態との間で異なるか否かを判定するためにさらに評価され得る。多様な組織源、細胞タイプ、または疾患状態の細胞(例えば細胞培養系統)が、比較評価のために評価され得る。例えば癌細胞の細胞微小環境プロフィールにおける誘導された変化は、非癌性または正常な細胞に誘導された変化と比較され得る。細胞の微小環境プロフィールにおける変化を誘導すること(例えば細胞の形態、生理機能および/または組成、例えばmRNA、タンパク質、脂質もしくは代謝産物の変化を誘導する)および/または正常な細胞と比較して疾患細胞の微小環境プロフィールにおける変化を示差的(例えば優先的)に誘導することが観察される内因性分子は、MIMとして同定される。
本発明のMIMは、脂質ベースMIMまたは非脂質ベースMIMであり得る。脂質ベースMIMを同定する方法は、脂質ベース内因性分子が細胞に外部から添加される上記の細胞ベース方法を包含する。好ましい実施形態において、脂質ベース内因性分子は、細胞中の脂質ベース内因性分子のレベルが上昇するように、細胞に添加される。一実施形態において、脂質ベース内因性分子のレベルは、未処置対照細胞のレベルと比較して、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍またはそれ以上、上昇する。脂質ベース分子の製剤および細胞への送達は、試験された各分子の特性に依存するが、多くの方法が当分野で公知である。脂質ベース分子の製剤および送達の例は、限定されるわけではないが、共溶媒による可溶化、担体分子、リポソーム、分散剤、懸濁剤、ナノ粒子分散剤、乳剤、例えば水中油型または油中水型乳剤、多相乳剤、例えば油中水中油型乳剤、ポリマー捕捉および封入を含む。脂質ベースMIMの細胞への送達は、質量分析法などの当分野で公知の所定の方法による、細胞脂質の抽出およびMIMの定量によって確認することができる。
非脂質ベースMIMを同定する方法は、非脂質ベース内因性分子が細胞に外部から添加される上記の細胞ベース方法を包含する。好ましい実施形態において、非脂質ベース内因性分子は、細胞中の非脂質ベース内因性分子のレベルが上昇するように、細胞に添加される。一実施形態において、非脂質ベース内因性分子のレベルは、未処置対照細胞のレベルと比較して、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍またはそれ以上、上昇する。非脂質ベース分子の製剤および細胞への送達は、試験された各分子の特性に依存するが、多くの方法が当分野で公知である。非脂質ベース分子の製剤および送達様式の例は、限定されるわけではないが、共溶媒による可溶化、、担体分子、能動輸送、ポリマー捕捉または吸着、ポリマーグラフト化、リポソーム封入およびターゲット化送達系を用いた製剤を含む。非脂質ベースMIMの細胞への送達は、質量分析法などの当分野で公知の所定の方法による、細胞内容物の抽出およびMIMの定量によって確認され得る。
2.エピメタボリックシフター(エピシフター)
本明細書で使用する場合、「エピメタボリックシフター」(エピシフター)は、健常(または正常な)状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを調節して、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および/または宿主の健康を維持または再建する分子(内因性または外因性)である。エピシフターは、組織微小環境の正常化を達成することができる。例えば、エピシフターは、細胞に添加されたまたは細胞で消耗されたときに、細胞の微小環境(例えば代謝状態)に影響を及ぼすことができるいずれの分子も含む。当業者は、本発明のエピシフターが2つ以上の分子の混合物を含むことも意図され、混合物が上述の機能の1つ以上によって特徴付けられることを認識するであろう。混合物中の分子は、混合物がエピシフターとして機能するような比で存在する。エピシフターの例は、限定されるわけではないが、CoQ−10;ビタミンD3;フィブロネクチンなどのECM構成要素;TNFαまたはインターロイキンのいずれかなどの免疫調節薬、例えばIL−5、IL−12、IL−23;血管新生因子;およびアポトーシス因子を含む。
本明細書で使用する場合、「エピメタボリックシフター」(エピシフター)は、健常(または正常な)状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを調節して、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および/または宿主の健康を維持または再建する分子(内因性または外因性)である。エピシフターは、組織微小環境の正常化を達成することができる。例えば、エピシフターは、細胞に添加されたまたは細胞で消耗されたときに、細胞の微小環境(例えば代謝状態)に影響を及ぼすことができるいずれの分子も含む。当業者は、本発明のエピシフターが2つ以上の分子の混合物を含むことも意図され、混合物が上述の機能の1つ以上によって特徴付けられることを認識するであろう。混合物中の分子は、混合物がエピシフターとして機能するような比で存在する。エピシフターの例は、限定されるわけではないが、CoQ−10;ビタミンD3;フィブロネクチンなどのECM構成要素;TNFαまたはインターロイキンのいずれかなどの免疫調節薬、例えばIL−5、IL−12、IL−23;血管新生因子;およびアポトーシス因子を含む。
いくつかの実施形態において、エピシフターは、クレブス回路における1つ以上の反応への触媒作用に直接関与する、またはクレブス回路中間体(過剰な中間体がクレブス回路を操縦する)を産生するかのどちらかである酵素などの、酵素である。いくつかの実施形態において、酵素は、トランスアルドラーゼ、またはトランスケトラーゼなどのペントースリン酸経路の非酸化的段階の酵素である。他の実施形態において、酵素は、シンターゼまたはリガーゼなどの、クレブス回路を容易にする構成要素酵素または酵素複合体である。例示的な酵素は、スクシニルCoAシンターゼ(クレブス回路酵素)またはピルビン酸カルボキシラーゼ(クレブス回路中間体であるオキサロ酢酸(OAA)を形成するために、ピルビン酸の可逆的カルボキシル化を触媒するリガーゼ)を含む。
いくつかの実施形態において、エピシフターはCoQ10の構成単位である。CoQ10の構成単位は、限定されるわけではないが、フェニルアラニン、チロシン、4−ヒドロキシフェニルピルベート、フェニルアセテート、3−メトキシ−4−ヒドロキシマンデレート、バニリン酸、4−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、ファルネシル、2,3−ジメトキシ−5−メチル−p−ベンゾキノン、ならびに対応するその酸またはイオンを含む。いくつかの実施形態において、エピシフターは、フェニルアラニン、チロシン、4−ヒドロキシフェニルピルベート、フェニルアセテートおよび4−ヒドロキシベンゾエートから選択される。
いくつかの実施形態において、エピシフターはビタミンBファミリーの化合物である。ビタミンBファミリーの化合物は例えば、リボフラビン(ビタミンB2)、またはその類似体を含む。エピシフターは、本明細書に記載する内因性MIMなどの、内因性MIMのいずれにもインビボで代謝され得る、いずれの類似体またはプロドラッグも含む。
一実施形態において、エピシフターもMIMである。一実施形態において、エピシフターはCoQ10でない。エピシフターは、本明細書で詳細に記載されたアッセイのいずれかを使用して、当業者によって日常的に同定することができる。
(i)エピシフターを同定する方法
エピメタボリックシフター(エピシフター)は、細胞の代謝状態を調節する、例えば健常(または正常な)状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを誘導することが可能である分子であり、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および/または宿主の健康を維持または再建することが可能である。本発明のエピシフターはそれゆえ、罹患状態の診断評価に有用性を有する。本発明のエピシフターは、エピシフターの適用または投与(他の治療分子によるエピシフターの調節)効果が組織微小環境および疾患状態における正常化をもたらす治療用途においてさらなる有用性を有する。
エピメタボリックシフター(エピシフター)は、細胞の代謝状態を調節する、例えば健常(または正常な)状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを誘導することが可能である分子であり、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および/または宿主の健康を維持または再建することが可能である。本発明のエピシフターはそれゆえ、罹患状態の診断評価に有用性を有する。本発明のエピシフターは、エピシフターの適用または投与(他の治療分子によるエピシフターの調節)効果が組織微小環境および疾患状態における正常化をもたらす治療用途においてさらなる有用性を有する。
エピメタボリックシフターの同定は概して、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、例えば代謝産物、脂質、タンパク質またはRNAの分子プロフィール(個別のまたは併用されたプロフィール)を確立することを包含する。レベルの変化(例えばレベルの上昇または低下)が疾患状態、進行または侵襲性に相関するプロフィールからの分子は、潜在的エピシフターとして同定される。
一実施形態において、エピシフターはMIMでもある。潜在的なエピシフターは、当分野で公知のいくつもの所定の技法を使用することによって、および本明細書に記載する方法のいずれかを使用することによって、細胞への外部からの添加時に細胞に進入するその能力が評価され得る。例えば、潜在的エピシフターの細胞中への進入は、質量分析法などの当分野で公知の所定の方法による、細胞内容物の抽出および潜在的エピシフターの定量によって確認され得る。これにより、細胞に進入することができる潜在的エピシフターは、MIMとして同定される。
エピシフターを同定するために、潜在的エピシフターは次に、細胞の代謝状態をシフトさせる能力について評価される。潜在的エピシフターが細胞微小環境の代謝状態をシフトさせる能力は、細胞に潜在的エピシフターを導入すること(例えば外部から添加すること)ならびに細胞において:遺伝子発現の変化(例えばmRNAもしくはタンパク質発現の変化)、脂質もしくは代謝産物レベルの濃度変化、生体エネルギー分子レベルの変化、細胞エネルギー特性の変化、および/またはミトコンドリアの機能もしくは数の変化の1つ以上を監視することによって評価される。細胞微小環境の代謝状態をシフトさせることが可能である潜在的エピシフターは、本明細書で詳細に記載されたアッセイのいずれかを使用して、当業者によって日常的に同定することができる。潜在的エピシフターは、疾患細胞の代謝状態を正常な健常状態に向けてシフトさせる能力について(または反対に、正常細胞の代謝状態をを罹患状態に向けてシフトさせる能力について)、さらに評価される。それゆえ、疾患細胞の代謝状態を正常な健常状態に向けてシフトさせる(または健常な正常細胞の代謝状態を罹患状態に向けてシフトさせる)ことが可能である潜在的エピシフターは、エピシフターとして同定される。好ましい実施形態において、エピシフターは、正常細胞の健康および/または増殖に悪影響を及ぼさない。
本発明のエピメタボリックシフターは、限定されるわけではないが、小型分子代謝産物、脂質ベース分子、ならびにタンパク質およびRNAを含む。小型分子内因性代謝産物のクラスでエピメタボリックシフターを同定するために、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、代謝産物プロフィールが確立される。各細胞または組織の代謝産物プロフィールは、細胞または組織から代謝産物を抽出することならびに次に例えば液体−クロマトグラフィー連結質量分析法またはガスクロマトグラフィー連結質量分析法を含む、当業者に公知の所定の方法を使用して、代謝産物を同定および定量することによって決定される。レベルの変化(例えばレベルの上昇または低下)が疾患の状態、進行または侵襲性に相関する代謝産物は、潜在的エピシフターとして同定される。
内因性脂質ベース分子のクラスでエピメタボリックシフターを同定するために、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、脂質プロフィールが確立される。各細胞または組織の脂質プロフィールは、脂質抽出法と、続いての例えば液体−クロマトグラフィー連結質量分析法またはガスクロマトグラフィー連結質量分析法を含む、当業者に公知の所定の方法を使用する脂質の同定および定量によって決定される。レベルの変化(大量または微量レベルの上昇または低下)が疾患の状態、進行または侵襲性に相関する脂質は、潜在的エピシフターとして同定される。
タンパク質およびRNAのクラスでエピメタボリックシフターを同定するために、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、遺伝子発現プロフィールが確立される。各細胞または組織の発現プロフィールは、例えば本明細書に詳細に記載されているような標準プロテオミクス法、mRNAアレイ法、またはゲノムアレイ法を使用して、mRNAレベルおよび/またはタンパク質レベルで決定される。発現の変化(例えばmRNAまたはタンパク質レベルでの発現の上昇または低下)が疾患の状態、進行または侵襲性に相関する遺伝子は、潜在的エピシフターとして同定される。
(例えば可溶性代謝産物、脂質ベース分子、タンパク質、RNA、または他の生物学的クラスの組成物について)上記の分子プロフィールがいったん確立されると、細胞および生化学経路分析が行われて、細胞環境における同定された潜在的エピシフターの間の公知の連関が解明される。このような細胞および/または生化学経路分析によって得られた本情報は、経路および潜在的エピシフターを分類するために利用され得る。
エピシフターが疾患状態を調節する有用性は、当分野で公知のまたは本明細書で詳細に記載されたいくつものアッセイを使用して、当業者がさらに評価および確認することができる。エピシフターが疾患状態を調節する有用性は、エピシフターの細胞または生物への直接外因性送達によって評価することができる。エピシフターが疾患状態を調節する有用性は代わりに、エピシフター(例えばエピシフターのレベルまたは活性)を直接調節する分子の発生によって評価することができる。エピシフターが疾患状態を調節する有用性はまた、エピシフターと同じ経路に配置された(例えばRNAまたはタンパク質レベルで調節される)遺伝子などの他の分子を調節することによる、エピシフター(例えばエピシフターのレベルまたは活性)を間接的に調節する分子の発生によって評価することができる。
本明細書に記載するエピメタボローム手法は、細胞微小環境に存在し、そのレベルが遺伝子機構、mRNA機構、またはタンパク質ベース機構を通じて検知および管理される内因性分子の同定を容易にする。本発明のエピシフターが引き起こす、正常細胞で見出される調節応答経路は、誤調節または疾患細胞環境における治療価値を提供し得る。加えて、本明細書に記載するエピメタボリック手法は、臨床患者選択における、疾患診断キットにおける、または予後指標としての使用のための診断指示を提供し得るエピシフターを同定する。
ある実施形態において、本明細書で開示するMIMおよびエピシフターは、栄養補助食品として慣習的に使用されているものを除く。ある実施形態において、本明細書で開示されるこれらのMIMおよび/またはエピシフターは製薬グレードである。ある実施形態において、製薬グレードのMIMおよび/またはエピシフターは、約95%と約100%の間の純度を有し、95%と100%の間のすべての値を含む。ある実施形態において、MIMおよび/またはエピシフターの純度は、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.9または100%である。ある実施形態において、MIMおよび/またはエピシフターは、内毒素を含まない。他の実施形態においては、MIMSおよび/またはエピシフターは外来のタンパク質物質を含まない。ある実施形態において、MIMおよび/またはエピシフターはCoQ10である。
III.MIM/エピシフターを同定するのに有用なアッセイ
目的の分子および化合物を分離および同定するために用いた本発明の技法および方法は、限定されるわけではないが:液体クロマトグラフィー(LC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析(MS)、ガスクロマトグラフィー(GC)、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC−MS)、ガスクロマトグラフィー/質量分析(GC−MS)、核磁気共鳴(NMR)、磁気共鳴画像法(MRI)、フーリエ変換赤外(FT−IR)、および誘導結合プラズマ質量分析(ICP−MS)を含む。質量分析技法は、限定されるわけではないが、扇形磁場2重収束型装置、透過型4重極装置、4重極イオントラップ型装置、飛行時間型装置(TOF)、フーリエ変換サイクロトロン共鳴型装置(FT−MS)およびマトリクス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI−TOF MS)の使用を含むことが、さらに理解される。
目的の分子および化合物を分離および同定するために用いた本発明の技法および方法は、限定されるわけではないが:液体クロマトグラフィー(LC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析(MS)、ガスクロマトグラフィー(GC)、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC−MS)、ガスクロマトグラフィー/質量分析(GC−MS)、核磁気共鳴(NMR)、磁気共鳴画像法(MRI)、フーリエ変換赤外(FT−IR)、および誘導結合プラズマ質量分析(ICP−MS)を含む。質量分析技法は、限定されるわけではないが、扇形磁場2重収束型装置、透過型4重極装置、4重極イオントラップ型装置、飛行時間型装置(TOF)、フーリエ変換サイクロトロン共鳴型装置(FT−MS)およびマトリクス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI−TOF MS)の使用を含むことが、さらに理解される。
生体エネルギー分子レベルの定量:
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、候補エピシフターが適用された細胞の細胞生体エネルギー分子レベル(例えばATP、ピルビン酸、ADP、NADH、NAD、NADPH、NADP、アセチルCoA、FADH2)の変化によって同定され得る。生体エネルギー分子レベルの例示的なアッセイは、比色(colorometric)、蛍光、および/または生物発光ベースの方法を使用する。このようなアッセイの例は下で提供される。
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、候補エピシフターが適用された細胞の細胞生体エネルギー分子レベル(例えばATP、ピルビン酸、ADP、NADH、NAD、NADPH、NADP、アセチルCoA、FADH2)の変化によって同定され得る。生体エネルギー分子レベルの例示的なアッセイは、比色(colorometric)、蛍光、および/または生物発光ベースの方法を使用する。このようなアッセイの例は下で提供される。
細胞内のATPのレベルは、当分野で公知のいくつかのアッセイおよび系を用いて測定することができる。例えば1つの系において、溶解細胞から放出された細胞質ATPは、ルシフェリンおよび酵素ルシフェラーゼと反応して、光を産生する。本生物発光はバイオルミノメータによって測定され、溶解細胞の細胞内ATP濃度を計算することができる(EnzyLight(商標)ATPアッセイキット(EATP−100)、BioAssay Systems、Hayward、CACA)。別の系において、例えばATPおよびその脱リン酸化型のADPの両方が生物発光を介して計算される;ATPレベルが計算された後、ADPはATPに変換されて、次に同じルシフェラーゼ系(ApoSENSOR(商標)ADP/ATP比アッセイキット、BioVision Inc.、Mountain View、CA)を使用して検出および計算される。
ピルベートは、細胞代謝経路において重要な中間体である。ピルベートは、細胞の代謝状態に応じて、糖新生を介して炭水化物に変換され得るか、アセチルCoAを介して脂肪酸に変換もしくは代謝され得るか、またはアラニンもしくはエタノールに変換され得る。それゆえピルベートレベルの検出は、細胞試料の代謝性活性および状態の尺度を提供する。ピルベートを検出する1つのアッセイは例えば、比色および蛍光定量の両方を使用して、異なる範囲内でのビルベート濃度を検出する(EnzyChrom(商標)ピルビン酸アッセイキット(カタログ番号EPYR−100)、BioAssay Systems、Hayward、CA)。
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞中での生体エネルギー分子の発生および維持に関与している細胞中のミトコンドリアによって行われる、酸化的リン酸化のプロセスに影響を及ぼし得る。細胞培養物および試料の細胞エネルギー特性の変化を直接検出するアッセイ(後述する)に加えて、細胞中のミトコンドリアの別々の酵素および複合体に対する化合物の効果を検出および定量するアッセイが存在する。例えばMT−OXC MitoTox(商標)Complete OXPHOS活性アッセイ(MitoSciences Inc.,Eugene、OR)は、ミトコンドリアから抽出された複合体I〜Vに直接適用された化合物の効果を検出および定量することができる。NADHデヒドロゲナーゼ(複合体I)、シトクロムcオキシダーゼ(複合体IV)およびATPシンターゼ(複合体V)などの個別のミトコンドリア複合体に対する効果の検出および定量のアッセイも利用可能である(MitoSciences Inc.、Eugene、OR)。
細胞エネルギー特性の測定:
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞エネルギー特性の変化によっても同定され得る。細胞エネルギー特性の測定の1例は、分子酸素の消費および/または細胞培養物の培地のpHの変化のリアルタイム測定である。例えば潜在的エピシフターが細胞の代謝状態を調節する能力は、例えばXF24アナライザ(Seahorse,Inc.)を使用して分析され得る。本技術によって、細胞微小環境の生体エネルギーを評価するための、細胞の単層における酸素およびpH変化のリアルタイム検出が可能となる。XF24アナライザは、どちらも細胞エネルギー特性の主要な指標である、好気性代謝の尺度である酸素消費速度(OCR)および解糖の尺度である細胞外酸化(ECAR)を測定および比較する。
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞エネルギー特性の変化によっても同定され得る。細胞エネルギー特性の測定の1例は、分子酸素の消費および/または細胞培養物の培地のpHの変化のリアルタイム測定である。例えば潜在的エピシフターが細胞の代謝状態を調節する能力は、例えばXF24アナライザ(Seahorse,Inc.)を使用して分析され得る。本技術によって、細胞微小環境の生体エネルギーを評価するための、細胞の単層における酸素およびpH変化のリアルタイム検出が可能となる。XF24アナライザは、どちらも細胞エネルギー特性の主要な指標である、好気性代謝の尺度である酸素消費速度(OCR)および解糖の尺度である細胞外酸化(ECAR)を測定および比較する。
酸化的リン酸化およびミトコンドリア機能の測定
酸化的リン酸化は、ミトコンドリアの膜に埋め込まれたタンパク質複合体を介して真核生物中で行われる栄養化合物の酸化を介して、ATPが発生されるプロセスである。大半の生物の細胞における主なATP源として、酸化的リン酸化活性の変化は、細胞内での代謝およびエネルギーバランスを強力に改変することができる。本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、酸化的リン酸化に対するその効果によって検出および/または同定され得る。いくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、限定されるわけではないが、電子輸送鎖およびATP合成を含む、酸化的リン酸化の特異的な態様に対するその効果によって検出および/または同定され得る。
酸化的リン酸化は、ミトコンドリアの膜に埋め込まれたタンパク質複合体を介して真核生物中で行われる栄養化合物の酸化を介して、ATPが発生されるプロセスである。大半の生物の細胞における主なATP源として、酸化的リン酸化活性の変化は、細胞内での代謝およびエネルギーバランスを強力に改変することができる。本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、酸化的リン酸化に対するその効果によって検出および/または同定され得る。いくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、限定されるわけではないが、電子輸送鎖およびATP合成を含む、酸化的リン酸化の特異的な態様に対するその効果によって検出および/または同定され得る。
酸化的リン酸化に関与するプロセスを行うミトコンドリア膜埋込みタンパク質複合体は、特異的タスクを実行し、I、II、IIIおよびIVとナンバリングされる。これらの複合体は、内膜貫通膜ATPシンターゼ(複合体Vとしても公知)と共に、酸化的リン酸化プロセスに関与する主要な実体である。環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)の、一般にミトコンドリア機能、および特に酸化的リン酸化プロセスに対する効果を検査できるアッセイに加えて、個別の複合体に対するエピシフターの効果を、他の複合体と別に検査するために使用できるアッセイが利用可能である。
NADH−コエンザイムQオキシドレダクターゼまたはNADHデヒドロゲナーゼとしても公知の複合体Iは、電子輸送鎖中の第1のタンパク質である。いくつかの実施形態において、複合体IによるNAD+の産生に対するエピシフターの効果の検出および定量が行われ得る。例えば複合体は、96ウェルプレート中の試料から免疫捕捉することができる;NADHからNAD+への酸化は、450nMにて吸光度の上昇を有する染料分子の還元と同時に起こる(複合体I酵素活性マイクロプレート・アッセイ・キット、MitoSciences Inc.、Eugene、OR)。
シトクロムcオキシダーゼ(COX)としても公知の複合体IVは、電子輸送鎖中の最後のタンパク質である。いくつかの実施形態において、シトクロムcの酸化および複合体IVによる酸素の水への還元に対するエピシフターの効果の検出および定量が行われ得る。例えばCOXをマイクロウェルプレート中で免疫捕捉して、COXの酸化を比色アッセイ(複合体IV酵素活性マイクロプレート・アッセイ・キット、MitoSciences Inc.,Eugene、OR)によって測定することができる。
酸化的リン酸化プロセスの最後の酵素は、他の複合体によって生成されたプロトン勾配を使用して、ADPからのATPの合成を促進する、ATPシンターゼ(複合体V)である。いくつかの実施形態において、ATPシンターゼの活性に対するエピシフターの効果の検出および定量が行われ得る。例えば試料中のATPシンターゼの活性およびATPシンターゼの量はどちらも、マイクロウェル・プレート・ウェル中で免疫捕捉されたATPシンターゼについて測定され得る。酵素は、ある条件下でATPアーゼとしても機能することができ、それゆえATPシンターゼ活性についての本アッセイにおいて、ATPがADPに還元される速度は、NADHのNAD+への同時酸化を検出することによって測定される。ATPの量は、ATPアーゼに標識された抗体を使用して計算される(ATPシンターゼ・デュプレクシング(活性+量)マイクロプレート・アッセイ・キット、MitoSciences Inc.,Eugene、OR)。酸化的リン酸化の追加のアッセイは、複合体IIおよびIIIの活性に対する効果を試験するアッセイを含む。例えばMT−OXC MitoTox(商標)Complete OXPHOSシステム(MitoSciences Inc.,Eugene、OR)を使用して、複合体IIおよびIIIならびに複合体I、IVおよびVに対する効果を評価し、酸化的リン酸化系全体に対する化合物の効果についてのデータを提供することができる。
上記のように、無処置細胞試料のリアルタイム観察は、細胞培養培地における酸素消費およびpHの変化のためのプローブを使用して行うことができる。細胞エネルギー特性のこれらのアッセイは、ミトコンドリア機能の大まかな概要および試料の細胞内のミトコンドリアの活性に対する潜在的環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)の効果を提供する。
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、ミトコンドリア膜透過性遷移孔(MPTP)の形成のために透過性の上昇を経験する現象である、ミトコンドリア膜透過性遷移(MPT)にも影響を及ぼし得る。ミトコンドリア透過性の上昇は、ミトコンドリア膨潤、すなわち酸化的リン酸化およびATP発生および細胞死の実行不能をもたらすことができる。MPTは、アポトーシスの誘導に関与し得る(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Halestrap,A.P.,Biochem.Soc.Trans.34:232−237(2006)およびLena,A.et al.Journal of Translational Med.7:13−26(2009)を参照)。
いくつかの実施形態において、MPTおよびMPTPの形成、中断および/または遂行に対する環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)の効果の検出および定量が測定される。例えばアッセイは、ミトコンドリアおよび他のサイトゾルコンパートメントの内膜内に局在する特殊化染料分子(カルセイン)の使用を通じて検出することができる。別の分子、CoCl2の適用は、サイトゾル中でのカルセイン染料の蛍光をスケルチするよう働く。しかしCoCl2はミトコンドリア内部にアクセスできず、それゆえMPTが起こって、CoCl2がMPTPを介してミトコンドリア内部にアクセスできない限り、ミトコンドリア中のカルセイン蛍光はスケルチされない。ミトコンドリア特異的蛍光シグナルの消失は、MPTの発生を通知する。フローサイトメトリが使用されて、細胞および細胞小器官の蛍光を評価することができる(MitoProbe(商標)遷移孔アッセイキット、Molecular Probes、Eugene、OR)。追加のアッセイは、実験結果を評価するために蛍光顕微鏡を利用する(Image−iT(商標)LIVEミトコンドリア遷移孔アッセイキット、Molecular Probes,Eugene、OR)。
細胞増殖および炎症の測定
本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞増殖および/または炎症に関連する分子の産生または活性に対するその影響によって同定および評価され得る。これらの分子は、限定されるわけではないが、サイトカイン、成長因子、ホルモン、細胞外マトリクスの構成要素、ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ニューロトロフィンおよび細胞シグナル伝達に関与する他の分子、ならびにシグナル伝達に関与する細胞内分子などの細胞内分子を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞増殖および/または炎症に関連する分子の産生または活性に対するその影響によって同定および評価され得る。これらの分子は、限定されるわけではないが、サイトカイン、成長因子、ホルモン、細胞外マトリクスの構成要素、ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ニューロトロフィンおよび細胞シグナル伝達に関与する他の分子、ならびにシグナル伝達に関与する細胞内分子などの細胞内分子を含む。
血管内皮成長因子(VEGF)は、強力な血管新生特性、血管特性および分裂促進特性を有する成長因子である。VEGFは内皮透過性および膨潤を刺激し、VEGF活性は、関節リウマチ、転移性癌、老年性黄斑変性および糖尿病性網膜症を含む多数の疾患および障害に関わっている。
本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、VEGFの産生に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。例えば低酸素条件またはアシドーシスを模倣する条件で維持された細胞は、VEGF産生の向上を呈するであろう。培地中に分泌されたVEGFは、ELISAまたは、利用可能な抗VEGF抗体(R&D Systems,Minneapolis、MN)を使用する他の抗体ベースアッセイを使用してアッセイすることができる。本発明のいくつかの実施形態において、エピシフターは、細胞のVEGFへの応答性に対するその効果に基づいておよび/またはVEGF受容体の発現もしくは活性に対するその効果に基づいて同定および/または特徴付けされ得る。
腫瘍壊死因子(TNF)は、健常免疫系機能ならびに自己免疫疾患の両方に関わり、炎症および免疫系活性化の主要なメディエータである。本発明のいくつかの実施形態において、エピシフターは、TNFの産生または活性に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。例えば培養細胞により産生され、培地中に分泌されたTNFは、ELISAおよび当分野で公知の他の抗体ベースアッセイを介して定量することができる。さらに、いくつかの実施形態において、環境影響因子は、TNFの受容体(ヒトTNF RI Duoset、R&D Systems、Minneapolis、MN)の発現に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。
細胞外マトリクス(ECM)の構成要素は、細胞および組織の構造ならびにシグナル伝達プロセスの両方において役割を果たす。例えば潜在型形質転換成長因子ベータ結合タンパク質は、ECM内に形質転換成長因子ベータ(TGFβ)のリザーバを生成するECM構成要素である。マトリクス結合TGFβは、マトリクス再構築のプロセスの間に放出され、付近の細胞に成長因子効果を及ぼすことができる(Dallas,S.Methods in Mol.Biol.139:231−243(2000))。
いくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、培養された細胞のECMの生成に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。研究者らは、細胞によるECMの生成、ならびにECMの組成を研究および定量することができる技法を開発してきた。例えば細胞によるECMの合成は、インキュベーションの前に細胞をハイドロゲルに埋込むことによって評価することができる。細胞によって発生したECMに対する生化学的分析および他の分析は、細胞収集およびハイドロゲルの消化の後に遂行される(Strehin,I.and Elisseeff,J.Methods in Mol.Bio.522:349−362(2009))。
いくつかの実施形態において、生物中のECMまたはその構成要素の1つの産生、状態または欠失に対する環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)の効果は同定および特徴付けされ得る。別々の種類の細胞中でまたは発生のあるステージにおいてのみ特定のECM遺伝子のノックアウトを可能にする条件的ノックアウト(KO)マウスを生成する技法が開発されている(Brancaccio,M.et al.Methods in Mol Bio.522:15−50(2009))。特定の組織中でまたは発生の特定のステージにおける特定のECM構成要素の活性または非存在に対するエピシフターまたは潜在的エピシフターの適用または投与の効果は、それゆえ評価され得る。
原形質膜完全性および細胞死の測定
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞死の見込みの上昇または低下を証明する、アポトーシス、壊死もしくは細胞変化を受ける細胞試料の原形質膜完全性の変化および/または細胞の数もしくはパーセンテージの変化によって同定され得る。
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞死の見込みの上昇または低下を証明する、アポトーシス、壊死もしくは細胞変化を受ける細胞試料の原形質膜完全性の変化および/または細胞の数もしくはパーセンテージの変化によって同定され得る。
乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)のアッセイは、細胞ステータスおよび損傷のレベルの測定を提供することができる。LDHは、安定で比較的豊富な細胞質酵素である。原形質膜が物理的完全性を失うとき、LDHは細胞外コンパートメントへ逃れる。LDHのより高い濃度は、原形質膜損傷および細胞死のより高いレベルと相関する。LDHアッセイの例は、試料中のLDHのレベルを検出および定量する比色系を使用し、テトラゾリウム塩の還元型がLDH酵素の活性を介して産生されるアッセイを含む(QuantiChrom(商標)乳酸デヒドロゲナーゼキット(DLDH−100)、BioAssay Systems、Hayward、CA;LDH細胞傷害性検出キット、Clontech、Mountain View、CA)。
アポトーシスは、多種多様の異なる開始イベントを有し得るプログラムされた細胞死のプロセスである。いくつかのアッセイを使用して、アポトーシスを受ける細胞の速度および/または数の変化を検出することができる。アポトーシスを検出および定量するために使用される1種類のアッセイは、カスパーゼ(capase)アッセイである。カスパーゼ(Capase)は、アポトーシスの間のタンパク質分解切断を介して活性化される、アスパラギン酸特異的システインプロテアーゼである。活性化カスパーゼ(capase)を検出するアッセイの例は、PhiPhiLux(登録商標)(OncoImmunin,Inc.、Gaithersburg、MD)およびCaspase−Glo(登録商標)3/7アッセイシステム(Promega Corp.、Madison、WI)を含む。比較試料中でアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージまたは数の変化を検出できる追加のアッセイは、TUNEL/DNA断片化アッセイを含む。これらのアッセイは、アポトーシスの実行段階の間にヌクレアーゼによって発生した180〜200塩基対DNAフラグメントを検出する。例示的なTUNEL/DNA断片化は、インサイチュ細胞死検出キット(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)およびDeadEnd(商標)比色および蛍光定量TUNELシステム(Promega Corp.、Madison、WI)を含む。
いくつかのアポトーシスアッセイは、アポトーシスおよび/または非アポトーシス状態に関連するタンパク質を検出および定量する。例えばMultiTox−Fluor Multiplex細胞傷害性アッセイ(Promega Corp.、Madison、WI)は、単一基質の蛍光定量(fluorimetric)システムを使用して、生細胞および死細胞に特異的なプロテアーゼを検出および定量し、それゆえ細胞または組織試料における生細胞の、アポトーシスを受けた細胞に対する比を提供する。
アポトーシスを検出または定量するために利用可能な追加のアッセイは、細胞透過性(例えばAPOPercentage(商標)アポトーシスアッセイ、Biocolor、UK)およびアネキシンVについてのアッセイ(例えばアネキシンV−ビオチンアポトーシス検出キット、BioVision Inc.,Mountain View、CA)を含む。
IV.代謝性障害の治療
いくつかの実施形態において、本発明の化合物、本明細書に記載する例えば環境影響因子、例えばMIMまたはエピシフターは、それを必要とする対象においてコエンザイムQ10応答性状態を治療するために使用され得る。言語「コエンザイムQ10反応性状態」または「CoQ10反応性状態」には、コエンザイムQ10の投与により治療する、予防する、または別の意味で緩和することができる疾患、障害、状態、および/または症状が含まれる。いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではなく、本明細書でさらに記載されるように、細胞微小環境への代謝シフト、例えば正常状態細胞における酸化的リン酸化の種類および/またはレベルに向けたシフトを誘導することによって、少なくとも部分的に機能することが考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、CoQ10応答性状態は、細胞微小環境の代謝の改変から生じる状態である。一実施形態において、CoQ10応答性障害は代謝性障害である。コエンザイムQ10応答性状態は、例えば肥満、糖尿病、糖尿病前症、メタボリックシンドローム、満腹、および内分泌異常などの代謝性障害を含む。コエンザイムQ10応答性状態は、本明細書に記載するような他の代謝性障害をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明の化合物、本明細書に記載する例えば環境影響因子、例えばMIMまたはエピシフターは、それを必要とする対象においてコエンザイムQ10応答性状態を治療するために使用され得る。言語「コエンザイムQ10反応性状態」または「CoQ10反応性状態」には、コエンザイムQ10の投与により治療する、予防する、または別の意味で緩和することができる疾患、障害、状態、および/または症状が含まれる。いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではなく、本明細書でさらに記載されるように、細胞微小環境への代謝シフト、例えば正常状態細胞における酸化的リン酸化の種類および/またはレベルに向けたシフトを誘導することによって、少なくとも部分的に機能することが考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、CoQ10応答性状態は、細胞微小環境の代謝の改変から生じる状態である。一実施形態において、CoQ10応答性障害は代謝性障害である。コエンザイムQ10応答性状態は、例えば肥満、糖尿病、糖尿病前症、メタボリックシンドローム、満腹、および内分泌異常などの代謝性障害を含む。コエンザイムQ10応答性状態は、本明細書に記載するような他の代謝性障害をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明の化合物、例えば本明細書に記載するMIMまたはエピシフターは、コエンザイムQ10と共通の活性を共有する。本明細書で使用する場合、「コエンザイムQ10と共通の活性を共有する」という句は、化合物がコエンザイムQ10と同じまたは類似の活性の少なくとも一部を呈する能力を指す。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムQ10の活性の25%またはそれ以上を呈する。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムQ10の活性の最大約130%(130%を含む)を呈する。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムQ10の活性の約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、101%、102%、103%、104%、105%、106%、107%、108%、109%、110%、111%、112%、113%、114%、115%、116%、117%、118%、119%、120%、121%、122%、123%、124%、125%、126%、127%、128%、129%、または130%を呈する。本段落に挙げられた各値が「約」という用語によって修飾され得ることが理解される。加えて、本段落に挙げられたいずれの2つの値によって定義されたいずれの範囲も、本発明に含まれることを意味することが理解される。例えばいくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムQ10の活性の約50%〜約100%を呈する。いくつかの実施形態において、コエンザイムQ10および本発明の化合物によって共有される活性は、細胞代謝におけるシフトを誘導する能力である。ある実施形態において、CoQ10および本発明の化合物はによって共有される活性は、OCR(酸素消費速度)および/またはECAR(細胞外酸性化速度)によって測定される。
本発明は、哺乳動物のCoQ10応答性障害を治療する、CoQ10応答性障害の症状を緩和する、CoQ10応答性障害の進行を阻害する、またはCoQ10応答性障害を予防する方法であって、少なくとも1つの環境影響因子(env影響因子)を含む治療的有効量の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察された解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルへの細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する方法を提供する。
本発明は、哺乳動物の代謝性障害を治療する、代謝性障害の症状を緩和する、代謝性障害の進行を阻害する、または代謝性障害を予防する方法であって、少なくとも1つの環境影響因子(env影響因子)を含む治療的有効量の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常化されたミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する方法をさらに提供する。
本発明は、代謝性障害の治療を必要とする哺乳動物の疾患細胞においてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強する方法であって、少なくとも1つのenv影響因子を含む治療的有効量の医薬組成物を前記哺乳動物に投与して、これにより哺乳動物の前記疾患細胞にてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強することを含む方法をさらに提供する。
本発明は、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、環境影響因子を代謝性障害を治療または予防するのに十分な量でヒトに投与して、これにより代謝性障害を治療または予防することを含む方法をさらに提供する。
本発明は、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、代謝性障害に罹患しているヒト対象を選択することと、グルコースの嫌気的使用の遮断およびミトコンドリア酸化的リン酸化の増強が可能であるenv影響因子の治療的有効量を前記ヒトに投与して、これにより代謝性障害を治療または予防することとを含む方法をさらに提供する。
本発明は、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、環境影響因子(env影響因子)を代謝性障害を治療または予防するのに十分な量でヒトに投与することを含み、環境影響因子(env影響因子)が治療の間にその酸化型が維持されるように投与され、これにより代謝性障害を治療または予防する方法をなおさらに提供する。
「代謝性障害」とは、患者の代謝の改変から生じるいずれの病的症状も意味する。このような障害には、異常な全身グルコース、脂質および/またはタンパク質の代謝、ならびにそこから発生する病理学的な結果に関連するものが含まれる。代謝性障害には、例えば、高血糖を生じる、グルコース恒常性の変化から生じるものが含まれる。本発明に従うと、グルコースレベルの変化は、典型的には、健常個体におけるこのようなレベルと比較して、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%さえのグルコースレベルの増加である。代謝性障害は細胞増殖、成長、分化、または移動、恒常性の細胞調節、細胞内もしくは細胞間の連絡;組織機能、例えば、肝臓機能、筋肉機能、または脂肪細胞機能;生物における全身性応答、例えば、ホルモン応答(例えば、インスリン応答)などの細胞機能に有害な影響を与え得る。代謝性障害には、肥満、糖尿病(本明細書では真性糖尿病ともいわれる)(例えば、I型糖尿病、II型糖尿病、MODY、および妊娠性糖尿病)、前糖尿病、メタボリックシンドローム、満腹、および、例えば、加齢からくる内分泌異常が含まれるがこれらに限定されない。代謝性障害のさらなる例には、過食症、食欲不振、トリグリセリド貯蔵疾患、バルデー−ビードル症候群、ローレンス−ムーン症候群、プラーダ−ラブハート−ウィリー症候群、カーンズ−セイヤー症候群、拒食症、中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損、および悪液質が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、代謝性障害はコエンザイムQ10応答性状態である。
「代謝性障害を治療、減少、または予防する」により、このような状態を、それが起こる前または起こった後で緩和することが意味される。等価な未処置対照と比較した場合に、このような減少または予防の程度は、任意の標準的な技術によって測定されるように、少なくとも5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%、または100%である。
真性糖尿病は、血糖の慢性的な上昇(高血糖)をもたらす代謝性疾患の異質な一群である。糖尿病は、グルコース調節の損失をもたらす、膵島の破壊または機能不全によって特徴付けられる。2つの主要な型の真性糖尿病は、「インスリン依存性糖尿病」(「IDDM」)または「若年発症型糖尿病」としてもまた知られるI型糖尿病、および「インスリン非依存性糖尿病」(「NIDDM」)または「成人発症型糖尿病」としてもまた知られるII型糖尿病である。
「I型糖尿病」は、高血糖症を生じるインスリン産生の結果的な消失を伴う、膵臓ベータ細胞の自己免疫媒介破壊から発生する症状を指す。I型糖尿病は、生存を確実にするために、インスリン補充療法を必要とする。注射用インスリンおよび経口血糖降下薬などの医薬は、糖尿病患者をより長く生かすことを可能にするが、糖尿病は、心臓病および癌に次ぐ第3の主要な死亡要因のままである。しかし、これらの医薬は、高血糖レベルと低血糖レベルの間の揺れを妨害するために完全に十分な血糖レベルを制御せず、腎臓、眼、および血管に損傷を生じる。糖尿病のコントロールと合併症に関する臨床試験(Diabetes Control and Complications Trial)(DCCT)は、血糖の強烈な制御が、1日あたり1回もしくは2回のインスリン注射からなる従来の治療と比較して、網膜症、腎症、および神経障害などの糖尿病の合併症を有意に遅延することを示す。DCCTにおける強烈な治療は、1日あたり3回以上のインスリンの複数注射、または外部ポンプによる連続皮下インスリン注入(CSII)を含んだ。インスリンポンプは、インスリンの生理学的置き換えに近似するために皮下の複数毎日注射(MDI)に対する種々の代替的アプローチの1つである。
「2型糖尿病」とは、患者が125mg/dl(6.94mmol/L)よりも高い空腹時血糖または血清グルコースの濃度を有する状態をいう。II型糖尿病は、正常レベルより高レベルの血漿インスリンの存在下で高血糖によって特徴付けられ、すべての症例の90%より多くを表し、最も頻繁には過体重の40歳より上の成人で起こる。II型糖尿病の進行は血糖の濃度の増加と関連し、グルコース誘導性インスリン分泌の速度の相対的な減少と連動している。II型糖尿病において、炭水化物代謝を制御する組織プロセスは、インスリンに対する感受性の減少を有すると考えられており、それゆえに、インスリン産生の欠如からは起こらず、血中のグルコースレベルの増加に対する感受性の減少およびインスリンを産生することによって応答する能力のなさから起こる。あるいは、糖尿病は、インスリンの標的細胞上でのインスリンの作用を媒介する分子機構における種々の欠損、例えば、それらの細胞表面上のインスリン受容体の欠如から生じるのかもしれない。それゆえに、II型糖尿病の治療は、頻繁にはインスリンの投与を必要としないが、例えば、スルホニルウレアなどの経口血糖降下薬を用いる治療によって増強される、食事およびライフスタイルの変化に基づいてもよい。
「前糖尿病」とは、患者が2型糖尿病を発症しやすい状態をいう。前糖尿病は、損なわれた耐糖能の定義を拡張し、100mg/dL以上の高い正常範囲内での空腹時血糖(Meigs et al.,Diabetes 2003 52:1475−1484)および空腹時高インスリン血(血漿インスリン濃度の上昇)を有する個体を含む。
「肥満」とは、患者が30kg/m2以上のBMIを有する症状を指す。「内臓型肥満」とは、男性患者では1.0、女性患者では0.8のウエスト対ヒップ比率をいう。別の態様において、内臓肥満は、インスリン抵抗性および前糖尿病の発症のリスクを規定する。
「過体重」は、25kg/m2を超えて30kg/m2未満のBMIを有する患者を指す。「体重増加」とは、行動の習慣もしくは嗜癖、例えば、過食もしくは暴食、禁煙と関連した、または生物学的な(生命の)変化、例えば、男性における加齢および女性における閉経に伴う体重増加、もしく妊娠後の女性の体重増加と関連した、体重の増加をいう。
X症候群とも呼ばれる「メタボリックシンドローム」(MS)は、身体における他の経路および系に影響を与える代謝性障害をいう。もともと、メタボリックシンドロームは、心臓血管疾患を強化するように相乗作用する一群の代謝性障害(肥満、インスリン抵抗性、高血圧、および異常脂質血症、主に高トリグリセリド血症)として定義された。より最近では(2001)、米国コレステロール教育プログラム(the U.S. National Cholesterol Education Program)(NCEP)は、以下の5つの判断基準からのいずれか3つに合致するものとして「メタボリックシンドローム」を分類した:少なくとも110mg/dLの空腹時グルコースレベル、少なくとも150mg/dLの血漿トリグリセリドレベル(高トリグリセリド血症)、男性においては40mg/dlよりも下、女性においては50mg/dlよりも下のHDLコレステロール、少なくとも130/85mmHgの血圧(高血圧)、および中心性肥満、中心性肥満は男性では40インチより上、女性では35インチよりも上の含む腰周りとして定義される。現在のところ、メタボリックシンドロームについて国際的に認められている定義が以下のように他に3つ存在する:1)世界保健機関(World Health Organization)2)米国心臓協会(American Heart Association)/国立心肺血液研究所(National Heart,Lung and blood Institute)(AHA/NHLBI)および3)国際糖尿病連合(International Diabetes Federation)(IDF)。WHO、AHA/NHLBI、およびIDFによるメタボリックシンドロームの定義はNECPの定義と非常に類似しており、すべてがこの症候群を定義するために同じ代謝パラメーターを使用しているが、WHOはまた、空腹時インスリンレベルの評価も含んでいる(Moebus S et al, Cardiovascular Diabetology, 6:1−10,2007;Athyros V G et al,Int.J.Cardiology,117:204−210,2007)。これらの異なる定義の中でこの症候群を有するとして分類される必要があるこれらの代謝パラメーターについての閾値のさらにわずかな違いは、これらの異なる定義に従うと、この症候群を有するか、または有さないという特定の対象の異なる分類を生じ得る。また、MSを伴う心臓血管疾患(CVD)の有病率は使用される定義によって変動する。(Moebus S et al,Cardiovascular Diabetology,6:1−10,2007;Athyros V G et al,Int.J.Cardiology,117:204−210,2007)。米国糖尿病学会(the American Diabetes Association)は、過体重5人のうち1人がメタボリックシンドロームに苦しんでいると見積もっている。
他の態様において、メタボリックシンドロームは、X症候群、インスリン抵抗性症候群、インスリン抵抗性高血圧、代謝高血圧症候群、代謝異常症候群を含むがこれらに限定されない、受け入れられている同義語によって説明される。メタボリックシンドロームの構成要素には、耐糖能異常、損なわれた耐糖能、損なわれた空腹時血清グルコース、損なわれた空腹時血糖、高インスリン血症、前糖尿病、肥満、内臓型肥満、高トリグリセリド血症、遊離脂肪酸の血清濃度の上昇、C反応性タンパク質の血清濃度の上昇、リポタンパク質の血清濃度の上昇、ホモシステインの血清濃度の上昇、低密度リポタンパク質(LDL)−コレステロールの血清濃度の上昇、リポタンパク質関連ホスホリパーゼ(A2)の血清濃度の上昇、高密度リポタンパク質(HDL)−コレステロールの血清濃度の減少、HDL(2b)−コレステロールの血清濃度の減少、アディポネクチンの血清濃度の減少、およびタンパク尿が含まれるがこれらに限定されない(以下を参照のこと:Pershadsingh HA.Peroxisome proliferator−activated receptor−gamma: therapeutic target for diseases beyond diabetes:quo vadis?Expert Opin Investig Drugs.(2004)13:215−28、およびそこに引用される参考文献)。
前述の代謝性障害の「主要な要素」には、空腹時血糖異常、耐糖能異常、腹囲増加、内臓脂肪量増加、空腹時血漿グルコースの増加、空腹時血漿トリグリセリドの増加、空腹時高密度リポタンパク質レベルの低下、血圧の上昇、インスリン抵抗性、高インスリン血症、心血管疾患(またはその構成要素、例えば、動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、または脳血管疾患)、うっ血性心不全、血漿ノルエピネフリンの上昇、心血管関連炎症因子の上昇、血管内皮機能障害を増強する血漿因子の上昇、高リポタンパク血症、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症、過食症、高血糖症、高脂血症、および高血圧症または高血圧症、食後血漿トリグリセリドレベルまたは遊離脂肪酸レベルの上昇、細胞酸化ストレスまたはその血漿指標の上昇、循環過凝固状態の増加、肝臓脂肪症、肝臓脂肪症(hetaptic steatosis)、腎不全および腎機能不全が含まれるがこれらに限定されない。
「インスリン抵抗性」とは、グルコース負荷への通常の応答を超えている循環インスリンレベルが正常血糖状態を維持するために必要とされる状態をいう(Ford et al.,JAMA.2002, 287:356−9)。インスリン抵抗性および治療に対してインスリン抵抗性を有する患者の応答は、インスリン抵抗性の信頼できる指標である、インスリン抵抗性に対する恒常性モデル評価(HOMA−IR)スコアを評価することによって定量されてもよい(Katsuki et al.,Diabetes Care 2001,24:362−5)。恒常性評価モデル(HOMA)−IRスコアによるインスリン抵抗性の見積もりはGalvin et al.,Diabet Med 1992,9:921−8において開示されている式、HOMA−IR=[空腹時血清インスリン(μU/mL)]×[空腹時血漿グルコース(mmol/L)/22.5]によって計算されてもよい。
「高インスリン血症」は、対象が、インスリン抵抗性を有し、正常血糖を有するかまたは有さず、空腹時または食後血清または血漿インスリン濃度が正常のインスリン抵抗性を有さないやせた個体のそれよりも上に上昇しており、<1.0(男性)または<0.8(女性)のウエスト対ヒップ比率を有する状態として定義される。
「耐糖能異常」(IGT)という用語は、耐糖能試験が行われたときに、正常と高血糖の間に含まれる血糖レベルを有する人を説明するために使用される。このような人は、彼らが糖尿病であると考えられていないにも関わらず、糖尿病を発症するリスクがより高い。例えば、耐糖能異常とは、患者が110mg/dlより大きくかつ126mg/dl(7.00mmol/L)未満の空腹時血糖濃度もしくは空腹時血清グルコース濃度、または140mg/dl(7.78mmol/L)より大きくかつ200mg/dl(11.11mmol/L)未満の食事2時間後の血糖もしくは血清グルコース濃度を有する状態をいう。
「高血糖症」(高い血液糖類)の状態は、血糖レベルが高すぎる状態である。典型的には、高血糖は、血糖レベルが180mg/dlより上に上昇するときに起こる。高血糖の徴候には、頻尿、過度の口渇、およびより長い時間スパンでは、体重減少が含まれる。
「低血糖症」(低い血液糖類)の状態は、血糖レベルが低すぎる状態である。典型的には、低血糖は、血糖レベルが70mg/dlよりも下に低下するときに起こる。低血糖の徴候には、不機嫌、四肢の無感覚(とりわけ、手および腕)、錯乱、身震い、または眩暈が含まれる。この状態は利用可能な量を超えた過度のインスリンが存在する場合に生じるので、これは、時折、インスリン反応といわれる。
(i)代謝性障害の診断
本発明の方法および組成物は、糖尿病などの代謝性障害と診断された、または代謝性障害を有するリスクに瀕している、いずれの患者も治療するのに有用である。代謝性障害(例えば、糖尿病または肥満)の発症が予防される患者は、このような診断を受けてもよいし、受けなくてもよい。当業者は、本発明の患者が標準的な試験に供されてもよく、または1つ以上のリスク要因の存在に起因して高いリスクがある患者であるとして、検査なしで同定されてもよいことを理解する。
本発明の方法および組成物は、糖尿病などの代謝性障害と診断された、または代謝性障害を有するリスクに瀕している、いずれの患者も治療するのに有用である。代謝性障害(例えば、糖尿病または肥満)の発症が予防される患者は、このような診断を受けてもよいし、受けなくてもよい。当業者は、本発明の患者が標準的な試験に供されてもよく、または1つ以上のリスク要因の存在に起因して高いリスクがある患者であるとして、検査なしで同定されてもよいことを理解する。
代謝性障害の診断は、本明細書に記載する方法などの、当分野で公知のいずれの標準方法を使用しても遂行され得る。糖尿病を診断するための方法は、例えば、米国特許番号6,537,806号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。糖尿病は、例えば、グルコースおよびケトンレベル(脂肪の分解産物)を測定する尿検査(検尿);血中のグルコースのレベルを測定する検査;耐糖能検査;および哺乳動物から収集された生物試料(例えば、血液、血清、または尿)中の代謝性障害に特徴的な分子マーカーを検出するアッセイ(例えば、糖尿病の場合においてはヘモグロビンAlc(HbAlc)レベルの測定)を使用して診断および監視されてもよい。
代謝性障害について治療される患者は、医療実務者がこのような状態を有すると診断した人である。診断は、本明細書に記載されているものなどの任意の適切な手段によって実施されてもよい。糖尿病または肥満の発症が予防される患者は、このような診断を受けてもよいし、受けなくてもよい。当業者は、本発明の患者が標準的な検査に供されたかもしれないか、または、家族歴、肥満、特定の民族性(例えば、アフリカ系アメリカ人およびヒスパニック系アメリカ人)、妊娠性糖尿病または9ポンドより重い赤ちゃんの出産、高血圧、肥満または糖尿病の素因がある病理学的状態を有すること、高い血液レベルのトリグリセリド、高い血液レベルのコレステロール、分子マーカーの存在(例えば、自己抗体の存在)、および年齢(45歳を超える年齢)などの1つ以上のリスク因子の存在に起因して検査なしで高リスクであるとして同定されたかもしれないことを理解する。個体は、彼らの体重が、彼らの身長のために所望される最大体重よりも20%(女性では25%)以上である場合に肥満であると考えられる。100ポンドを超える過体重である成人は、病的に肥満であると考えられる。肥満は、30kg/m2を超えるボディマス指数(BMI)としても定義される。
ランダム血漿グルコース検査(1日のうちの任意の時間に採取される)が200mg/dL以上の値を示す場合、空腹時血漿グルコース検査が126mg/dL以上の値を示す場合(8時間後)、または人が水に溶解された75グラムのグルコースを含む飲料を消費した2時間後に採取された血液試料中で、経口耐糖能検査(OGTT)が200mg/dL以上の血漿グルコース値を示す場合に、患者は糖尿病のリスクがあるかまたは糖尿病であると診断される可能性がある。OGTTは3時間の時間にわたる時間が決められた間隔で血漿グルコースを測定する。望ましくは、本発明に従って治療された糖尿病患者における血漿グルコースのレベルは、160〜60mg/dLの間、150〜70mg/dLの間、140〜70mg/dLの間、135〜80mg/dLの間、および好ましくは120〜80mg/dLの間の範囲である。
任意に、2ヶ月および3ヶ月の間の平均血糖レベルを評価するヘモグロビンAlc(HbAlc)検査が利用されてもよい。糖尿病ではない人は、典型的には、4%〜6%の間の範囲のHbAlc値を有する。HbAlcの1%毎の増加で、血糖レベルは約30mg/dL増加し、合併症のリスクは増加する。好ましくは、本発明に従って治療される患者のHbAlc値は、9%未満、7%未満、6%未満、および最も好ましくは、約5%まで減少される。したがって、治療される患者のHbAlcレベルは、好ましくは、治療の前のこのようなレベルと比較して、10%、20%、30%、40%、50%、またはそれ以上低減される。
任意に、2ヶ月および3ヶ月の間の平均血糖レベルを評価するヘモグロビンAlc(HbAlc)検査が利用されてもよい。糖尿病ではない人は、典型的には、4%〜6%の間の範囲のHbAlc値を有する。HbAlcの1%毎の増加で、血糖レベルは約30mg/dL増加し、合併症のリスクは増加する。好ましくは、本発明に従って治療される患者のHbAlc値は、9%未満、7%未満、6%未満、および最も好ましくは、約5%まで減少される。したがって、治療される患者のHbAlcレベルは、好ましくは、治療の前のこのようなレベルと比較して、10%、20%、30%、40%、50%、またはそれ以上低減される。
妊娠性糖尿病は、典型的には、OGTTの間に測定される血漿グルコース値に基づいて診断される。グルコースレベルは、通常、妊娠の間にはより低いので、妊娠における糖尿病の診断のための閾値は、妊娠の前の同じ人よりも低い。女性が以下の数字のいずれかに合致するかまたはこれを超える2つの血漿グルコースの読み取りを有する場合、彼女は妊娠性糖尿病である:95mg/dLの空腹時血漿グルコースレベル、180mg/dLの1時間レベル、155mg/dLの2時間レベル、または140mg/dLの3時間レベル。
ケトン検査もまた、I型糖尿病を診断するために利用されてもよい。十分なインスリンがない場合にケトン類は血中に蓄積するので、これらは最終的には尿に蓄積する。高レベルの血中ケトンは、ケトアシドーシスと呼ばれる深刻な状態を生じる可能性がある。
米国糖尿病協会のガイドラインによれば、2型糖尿病と診断されるためには、個体は、126mg/dl以上の空腹時血漿グルコースレベル、または200mg/dl以上の2時間経口グルコース負荷試験(OGTT)血漿グルコース値を有さなければならない(Diabetes Care,26:S5−S20,2003)。
前糖尿病と呼ばれる関連状態は、100mg/dlより上であるが126mg/dl未満の空腹時グルコースレベル、または140mg/dlより上であるが200mg/dl未満の2時間OGTT血漿グルコースレベルを有するとして定義される。山のような証拠が、前糖尿病状態が心臓血管疾患を発症するためのリスク因子であり得ることを示唆している(Diabetes Care 26:2910−2914,2003)。損なわれた耐糖能または損なわれた空腹時グルコースともまたいわれる前糖尿病は、2型糖尿病、心臓血管疾患、および死亡を発症するための大きなリスク因子である。前糖尿病を効果的に治療することによって、2型糖尿病の発症を予防する治療的介入を開発することに大きな注目が集まってきた(Pharmacotherapy,24:362−71,2004)。
肥満(普通、約>30kg/m2のボディマス指数として定義される)は、高インスリン血症、インスリン抵抗性、糖尿病、高血圧症、および脂質異常症などの多種多様の病的症状に関連することが多い。これらの状態の各々は、心臓血管疾患のリスクに寄与する。
インスリン抵抗性、高血圧、および異常脂質血症とともに、肥満はメタボリックシンドローム(X症候群としても知られる)の構成要素と考えられており、これらは、一緒に相乗作用して心臓血管疾患を促進する。より最近では、米国コレステロール教育プログラムは、会議にて、以下の5つの判断基準からのいずれか3つに合致するものとして「メタボリックシンドローム」を分類した:少なくとも110mg/dLの空腹時グルコースレベル、少なくとも150mg/dLの血漿トリグリセリドレベル(高トリグリセリド血症)、男性においては40mg/dlよりも下、女性においては50mg/dlよりも下のHDLコレステロール、少なくとも130/85mmHgの血圧(高血圧)、および中心性肥満、中心性肥満は男性では40インチより上、女性では35インチよりも上の含む腹部腰周りとして定義される。
(ii)代謝性障害の治療有効性の影響評価
当業者は、上記の試験のいずれかの使用、または当該分野において公知である任意の他の試験が本発明の治療的処置の有効性を監視するために使用されてもよいことを認識する。ヘモグロビンAlc(HbAlc)レベルの測定は以前の2〜3ヶ月の間に平均血糖の指標であるので、この試験は、糖尿病治療に対する患者の応答を監視するために使用されてもよい。
当業者は、上記の試験のいずれかの使用、または当該分野において公知である任意の他の試験が本発明の治療的処置の有効性を監視するために使用されてもよいことを認識する。ヘモグロビンAlc(HbAlc)レベルの測定は以前の2〜3ヶ月の間に平均血糖の指標であるので、この試験は、糖尿病治療に対する患者の応答を監視するために使用されてもよい。
本発明の治療方法は、患者におけるグルコースレベルまたは脂質レベルの減少において有効である。「グルコースレベルの減少」によって、未処置対照と比較して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%グルコースレベルを減少することが意味される。望ましくは、グルコースレベルは、正常血糖レベルまで、すなわち、150〜60mg/dLの間、140〜70mg/dLの間、130〜70mg/dLの間、125〜80mg/dLの間、および好ましくは120〜80mg/dLの間まで減少される。グルコースレベルのこのような減少は、血液からのグルコースのクリアランスに関連する生物学的活性の任意の1つを増加させることによって得られてもよい。したがって、グルコースレベルを減少させる能力を有する薬剤は、インスリンの産生、分泌、または作用を増加させてもよい。インスリンの作用は、例えば、末梢組織によるグルコースの取り込みを増加させることによって、および/または肝臓のグルコース産生を減少させることによって増加されてもよい。あるいは、本発明の薬剤は、腸からの炭水化物の吸収を減少させ、グルコーストランスポーター活性を変化させ(例えば、GLUT4発現、固有活性、または移行を増加させることによって)、インスリン感受性組織の量を増加させ(例えば、筋肉細胞または脂肪細胞分化を増加させることによって)、または脂肪細胞もしくは筋肉細胞における遺伝子転写を変化させてもよい(例えば、代謝経路遺伝子の脂肪細胞発現からの因子の分泌の変化)。望ましくは、本発明の薬剤は、グルコースクリアランスに関連する2以上の活性を増加する。「脂質レベルの減少」によって、未処置対照と比較して、少なくとも1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%脂質のレベルを減少することが意味される。
「グルコースレベルが減少するようにインスリンシグナル伝達経路を変化させる」によって、全体の結果が血漿からのグルコースのクリアランスの増加であるように、インスリンシグナル伝達に関与する活性のいずれか1つを変化させる(増加または減少させることによって)ことが意味される。例えば、本発明のenv影響因子は、インスリンシグナル伝達経路を変化させ、インスリンの産生、分泌、もしくは作用の増加、末梢組織によるグルコースの取り込みの増加、肝臓グルコース産生の減少、または腸からの炭水化物の吸収の減少を引き起こす。
環境影響因子、例えば、エピシフターがグルコースレベルを減少させ、それによって代謝性障害を治療する能力は、当該分野において公知である標準的なアッセイを使用して評価されてもよい。例えば、グルコースの取り込みを増加させる薬剤を同定する細胞ベースのスクリーニングアッセイが利用されてもよい。特に、細胞培養中の分化した脂肪細胞が、放射性標識されたグルコースによって検出されるように、インスリン刺激の際にグルコースの取り込みを増加するエピシフターの能力を評価するために利用できる。別の例示的なアッセイにおいて、非糖尿病対象に由来する細胞の条件付き不死化によって得られたヒト筋芽細胞が、インスリンを陽性対照として使用して、グリコーゲン合成に対する薬剤の効果をスクリーニングするために使用できる。処置の前に、細胞は血清飢餓状態にされ、次いで、2時間の時間の間、放射性標識されたグルコースを含む無血清培地中で、エピシフターまたは対照のいずれかを用いてインキュベートされ、その後、グリコーゲン合成が測定される。例示的なアッセイは実施例においてさらに説明される。
V.代謝性障害の治療ターゲット
本発明は、代謝性障害の治療ターゲットを同定する方法を提供する。本発明は、このような方法によって同定された治療ターゲットをさらに提供する。治療ターゲットの同定は概して、env影響因子または候補env影響因子の細胞または株化細胞のパネルへの外因性適用、および続いての、処置細胞に対して誘導された変化の、未処置細胞と比較した評価を包含する。監視される誘導された細胞変化は、限定されるわけではないが、細胞の形態、生理機能または組成物、例えばRNA、タンパク質、脂質または代謝産物のレベルに対する変化を含む。候補env影響因子による処置の結果として誘導された細胞変化は、本明細書に記載するアッセイのいずれを使用しても監視することができる。例えばmRNAレベルでの遺伝子発現の変化はリアルタイムPCRアレイによって評価することができるが、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化は抗体マイクロアレイおよび2次元ゲル電気泳動を使用することによって監視することができる。候補env影響因子によって調節されているとして(例えばmRNAレベルおよび/またはタンパク質レベルで)同定された遺伝子は次に、経路分析を使用するシステム・バイオロジー・パースペクティブ(Systems Biology perspective using analysis)(Ingenuity IPAソフトウェア)からおよび公知の文献の検討によって評価される。潜在的な治療ターゲットとして同定された遺伝子を次に、ウェスタンブロット分析、siRNAノックダウン、または組換えタンパク質産生およびキャラクタリゼーション方法などの確認アッセイに供する。次にスクリーニングアッセイを使用して、ターゲットのモジュレーターを同定することができる。治療ターゲットのモジュレーターは、代謝性障害の新規治療剤として有用である。治療ターゲットのモジュレーターは、本明細書で詳細に記載するスクリーニングアッセイを使用して、または当業者に公知の所定の方法を使用することによって、日常的に同定することができる。
本発明は、代謝性障害の治療ターゲットを同定する方法を提供する。本発明は、このような方法によって同定された治療ターゲットをさらに提供する。治療ターゲットの同定は概して、env影響因子または候補env影響因子の細胞または株化細胞のパネルへの外因性適用、および続いての、処置細胞に対して誘導された変化の、未処置細胞と比較した評価を包含する。監視される誘導された細胞変化は、限定されるわけではないが、細胞の形態、生理機能または組成物、例えばRNA、タンパク質、脂質または代謝産物のレベルに対する変化を含む。候補env影響因子による処置の結果として誘導された細胞変化は、本明細書に記載するアッセイのいずれを使用しても監視することができる。例えばmRNAレベルでの遺伝子発現の変化はリアルタイムPCRアレイによって評価することができるが、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化は抗体マイクロアレイおよび2次元ゲル電気泳動を使用することによって監視することができる。候補env影響因子によって調節されているとして(例えばmRNAレベルおよび/またはタンパク質レベルで)同定された遺伝子は次に、経路分析を使用するシステム・バイオロジー・パースペクティブ(Systems Biology perspective using analysis)(Ingenuity IPAソフトウェア)からおよび公知の文献の検討によって評価される。潜在的な治療ターゲットとして同定された遺伝子を次に、ウェスタンブロット分析、siRNAノックダウン、または組換えタンパク質産生およびキャラクタリゼーション方法などの確認アッセイに供する。次にスクリーニングアッセイを使用して、ターゲットのモジュレーターを同定することができる。治療ターゲットのモジュレーターは、代謝性障害の新規治療剤として有用である。治療ターゲットのモジュレーターは、本明細書で詳細に記載するスクリーニングアッセイを使用して、または当業者に公知の所定の方法を使用することによって、日常的に同定することができる。
MIM/エピシフター、CoQ10によって調節されている(例えばmRNAレベルまたはタンパク質レベルのどちらかで上方調節または下方調節されている)として本明細書で同定された遺伝子は、本発明の薬物ターゲットである。本発明の薬物ターゲットは、限定されるわけではないが、本明細書の表2〜4および6〜28および63〜68に続いて挙げられた遺伝子を含む。出願人によって本明細書に記載された実験の結果に基づいて、Q10によって調節された主要なタンパク質は、転写因子、アポトーシス応答、ペントースリン酸経路、生合成経路、酸化ストレス(酸化促進物質)、膜改変、および酸化的リン酸化代謝を含む異なる経路または分子の群に関連する、または分類することができる。本明細書で提供された結果に基づいて、CoQ10によって調節される主要なタンパク質は下のようにまとめられる。CoQ10によって調節され、転写因子である主要なタンパク質は、HNF4アルファである。CoQ10によって調節され、アポトーシス応答に関連する主要なタンパク質は、Bcl−xl、Bcl−xl、Bcl−xS、BNIP−2、Bcl−2、Birc6、Bcl−2−L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c−Jun、Bmf、PUMA、およびcMycを含む。CoQ10によって調節され、ペントースリン酸経路に関連する主要なタンパク質は、トランスアルドラーゼ1である。CoQ10によって調節され、生合成経路に関連する主要なタンパク質は、COQ1、COQ3、COQ6、プレニルトランスフェラーゼおよび4−ヒドロキシベンゾエートを含む。CoQ10によって調節され、酸化ストレス(酸化促進物質)に関連する主要なタンパク質は、好中球サイトゾル因子2、一酸化窒素シンターゼ2Aおよびスーパーオキシドディスムターゼ2(ミトコンドリア)を含む。CoQ10によって調節され、酸化的リン酸化代謝に関連する主要なタンパク質は、シトクロムc、複合体I、複合体II、複合体IIIおよび複合体IVを含む。CoQ10によって直接または間接的に調節されるさらなる主要なタンパク質は、Foxo3a、DJ−1、IDH−1、Cpt1CおよびカムキナーゼIIを含む。
したがって、本発明の一実施形態において、薬物ターゲットはHNF4−アルファ、Bcl−xl、Bcl−xS、BNIP−2、Bcl−2、Birc6、Bcl−2−L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c−Jun、Bmf、PUMA、cMyc、トランスアルドラーゼ1、COQ1、COQ3、COQ6、プレニルトランスフェラーゼ、4−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子2、一酸化窒素シンターゼ2A、スーパーオキシドディスムターゼ2、VDAC、Baxチャネル、ANT、シトクロムc、複合体I、複合体II、複合体III、複合体IV、Foxo3a、DJ−1、IDH−1、Cpt1CおよびカムキナーゼIIを含み得る。好ましい実施形態において、薬物ターゲットはHNF4A、トランスアルドラーゼ、NM23およびBSCvを含み得る。一実施形態において、薬物ターゲットはTNF4Aである。一実施形態において、薬物ターゲットはトランスアルドラーゼである。一実施形態において、薬物ターゲットはNM23である。一実施形態において、薬物ターゲットはBSCvである。同定された薬物ターゲットのモジュレーターを同定するのに有用なスクリーニングアッセイが下に記載される。
VI.スクリーニングアッセイ
本発明は、本発明の同定された治療ターゲットの発現および/または活性を調節する、モジュレーター、すなわち候補または試験化合物または薬剤(例えばタンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、ペプトイド、小型分子または他の薬物)を同定するための方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる)も提供する。このようなアッセイは通例、本発明の治療ターゲットと1つ以上のアッセイ構成要素との間の反応を含む。他の構成要素は、試験化合物自体、または試験化合物および本発明のマーカーの天然結合パートナーの組み合わせのどちらかであり得る。本明細書に記載するアッセイなどのアッセイを介して同定された化合物は、代謝性障害を治療または予防するのに有用であり得る。
本発明は、本発明の同定された治療ターゲットの発現および/または活性を調節する、モジュレーター、すなわち候補または試験化合物または薬剤(例えばタンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、ペプトイド、小型分子または他の薬物)を同定するための方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる)も提供する。このようなアッセイは通例、本発明の治療ターゲットと1つ以上のアッセイ構成要素との間の反応を含む。他の構成要素は、試験化合物自体、または試験化合物および本発明のマーカーの天然結合パートナーの組み合わせのどちらかであり得る。本明細書に記載するアッセイなどのアッセイを介して同定された化合物は、代謝性障害を治療または予防するのに有用であり得る。
本発明のスクリーニングアッセイで使用される試験化合物は、天然および/または合成化合物の系統的ライブラリーを含む、いずれの利用可能な供給源からも取得され得る。試験化合物はまた:生物ライブラリー;ペプトイドライブラリー(ペプチドの官能基を有するが、酵素分解の抵抗性であるが、それにもかかわらず生物活性を保持する新規の非ペプチド主鎖を持つ、分子のライブラリー;例えばZuckermann et al.,1994,J.Med.Chem.37:2678−85を参照);空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー;逆重畳を必要とする合成ライブラリー法;「1ビーズ1化合物」ライブラリー法;およびアフィニティクロマトグラフィー選択を使用するライブラリー法を含む、当分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数の手法のいずれによっても取得され得る。生物ライブラリーおよびペプトイドライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されているが、他の4つの手法は化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは小型分子ライブラリーに適用できる(Lam,1997,Anticancer Drug Des.12:145)。12:145)を参照のこと。
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当分野において、例えば:DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909;Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422;Zuckermann et al.(1994).J.Med.Chem.37:2678;Cho et al.(1993)Science 261:1303;Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;およびGallop et al.(1994)J.Med.Chem.37:1233に見出すことができる。
化合物のライブラリーは、溶液中に(例えばHoughten,1992,Bio技法s 13:412−421)、またはビーズ(Lam,1991,Nature 354:82−84)、チップ(Fodor,1993,Nature 364:555−556)、細菌および/もしくは胞子(Ladner,米国特許5,223,409)、プラスミドの上に(Cull et al,1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:1865−1869)またはファージの上に(Scott and Smith,1990,Science 249:386−390;Devlin,1990,Science 249:404−406;Cwirla et al,1990,Proc.Natl.Acad.Sci. 87:6378−6382;Felici,1991,J.Mol.Biol.222:301−310;Ladner、上掲)提供され得る。
本発明のスクリーニング方法は、細胞を試験化合物と接触させることと、試験化合物が細胞中での本発明の治療ターゲットの発現および/または活性を調節する能力を決定することとを含む。本発明の治療ターゲットの発現および/または活性は、本明細書に記載するように決定することができる。本発明の治療ターゲットの発現および/または活性は、当業者に公知の所定の方法によっても決定することができる。一実施形態において、化合物は、本発明の治療ターゲットの発現および/または活性を上昇させるその能力に基づいて選択される。一実施形態において、化合物は、表2〜4および6〜28および63〜68に挙げられたタンパク質から選択される治療ターゲットの発現および/または活性を上昇させるその能力に基づいて選択され、該治療ターゲットはCoQ10によって上方調節されている(例えば正の倍率変化を呈する)。一実施形態において、化合物は、本発明の治療ターゲットの発現および/または活性を低下させるその能力に基づいて選択される。一実施形態において、化合物は、表2〜4および6〜28および63〜68に挙げられたタンパク質から選択される治療ターゲットの発現および/または活性を低下させるその能力に基づいて選択され、該治療ターゲットはCoQ10によって下方調節されている(例えば負の倍率変化を呈する)。
別の実施形態において、本発明は、本発明の治療ターゲットの基質またはその生物活性部分である候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。また別の実施形態において、本発明は、本発明の治療ターゲットの基質またはその生物活性部分に結合する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。試験化合物が治療ターゲットに直接結合する能力を決定することは、例えば、化合物の薬物ターゲットへの結合が複合体中の標識マーカー化合物を検出することによって決定できるように、化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングすることによって達成することができる。例えば化合物(例えばマーカー基質)に131I、125I、35S、14C、または3Hを直接または間接的のどちらかで標識して、放射性同位体を電波放出の直接カウントによってまたはシンチレーションカウントによって検出することができる。あるいは、アッセイ構成要素に例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼを酵素標識して、酵素標識を適切な基質の生成物への変換の決定によって検出することができる。
本発明は、上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規薬剤にさらに関する。したがって、適切な動物モデルにおいて本明細書に記載するように同定された薬剤をさらに使用することは、本発明の範囲内である。例えば本明細書に記載するように同定された本発明のマーカーの発現および/または活性を調節することができる薬剤を動物モデルで使用して、このような薬剤を用いた治療の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載するように同定された薬剤を動物モデルで使用して、このような薬剤の作用機序を決定することができる。さらに、本発明は、上記スクリーニングアッセイによって同定された、上記治療のための新規薬剤の使用に関する。
VII.医薬組成物および製薬的投与
本発明の環境影響因子を対象への投与に好適な医薬組成物中に組み入れることができる。通例、医薬組成物は、本発明の環境影響因子および製薬的に許容され得る担体を含む。本明細書で使用する場合、「製薬的に許容され得る担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散剤、媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性である同様のものを含む。製薬的に許容され得る担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの1つ以上、ならびにその組み合わせを含む。多くの場合において、等張性剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。製薬的に許容され得る担体は、環境影響因子の有効期間または有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、保存料または緩衝液などの微量の補助物質をさらに含み得る。
本発明の環境影響因子を対象への投与に好適な医薬組成物中に組み入れることができる。通例、医薬組成物は、本発明の環境影響因子および製薬的に許容され得る担体を含む。本明細書で使用する場合、「製薬的に許容され得る担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散剤、媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性である同様のものを含む。製薬的に許容され得る担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの1つ以上、ならびにその組み合わせを含む。多くの場合において、等張性剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。製薬的に許容され得る担体は、環境影響因子の有効期間または有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、保存料または緩衝液などの微量の補助物質をさらに含み得る。
本発明の組成物は、多種多様の形であり得る。これらは例えば、液体剤(例えば注射用および輸液用液剤)、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉剤、クリーム、ローション、軟膏またはペースト剤(pasts)、眼、耳または鼻への投与に好適な滴剤、リポソームおよび坐剤などの液体、半固体および固体投薬形を含む。好ましい形は、投与および治療用途の所期の様式に依存する。
本発明の環境影響因子は、当分野で公知の多種多様の方法によって投与することができる。多くの治療用途では、好ましい投与経路/様式は、皮下注射、静脈内注射または輸液である。当業者によって認識されるように、投与経路および/または様式は、所望の結果に応じて変動するであろう。ある実施形態において、活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、高速放出から化合物を保護するであろう担体を用いて調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製のための多くの方法は、特許が取得されているか、または概して当業者に公知である。例えばSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978を参照。一実施形態において、投与様式は非経口(例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)である。一実施形態において、環境影響因子は、静脈内輸液または注射によって投与される。別の実施形態において、環境影響因子は、筋肉内または皮下注射によって投与される。好ましい実施形態において、環境影響因子は局所投与される。
治療組成物は通例、製造および貯蔵条件下で滅菌および安定性でなければならない。組成物は、液剤、マイクロエマルション、分散剤、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤することができる。滅菌注射用液剤は、要求される量の活性化合物(すなわち環境影響因子)を、必要に応じて上で列挙した各種の他の成分を含む適切な溶媒に組み入れ、それに続いて濾過滅菌することによって調製できる。概して、分散剤は、活性化合物を、基本分散媒および上に列挙されたものから要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌凍結乾燥粉剤の場合、好ましい調製方法は、その先に滅菌濾過した溶液から活性成分およびいずれかの追加の望ましい成分の粉剤を産する、真空乾燥および噴霧乾燥技法である。液剤の適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には要求される粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。注射用組成物の延長吸収は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
技法および製剤は一般に、Remmington’s Pharmaceutical Sciences,Meade Publishing Co.,Easton,Pa.に見出され得る。全身投与のためには、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注射が好ましい。注射の場合、本発明の化合物は、液体剤中で、好ましくはハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液中で製剤することができる。加えて、化合物は固体形で製剤され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形も含まれる。
経口投与では、医薬組成物は、結合剤(例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(例えばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム);潤滑剤(例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(例えばジャガイモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム);または湿潤剤(例えばラウリル硫酸ナトリウム)などの製薬的に許容され得る賦形剤を用いて慣習的な手段によって調製された、例えば錠剤またはカプセル剤の形をとり得る。錠剤は、当分野で周知の方法によってコーティングされ得る。経口投与のための液体調製物は、例えば液剤、シロップ剤または懸濁剤の形をとり得る、またはこれらは、使用前の水または他の好適なビヒクルによる構成のための無水生成物として提供され得る。このような液体調製物は、懸濁化剤(例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂);乳化剤(例えばレシチンまたはアラビアゴム);非水性ビヒクル(例えばアチオンド油(ationd oil)、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油);および保存料(例えばメチルもしくはプロピル−p−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)などの製薬的に許容され得る添加剤を用いて慣習的な手段によって調製され得る。調製物は必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。
経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出を与えるように好適に製剤され得る。頬側投与では、組成物は、慣習的な方式で製剤された錠剤またはロゼンジ剤の形を取り得る。吸入による投与では、本発明による使用のための化合物は、好適な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスの使用による加圧パックまたはネブライザからのエアゾールスプレー提供の形で便利に送達される。加圧エアゾールの場合、投薬単位は、計量された量を送達する弁を設けることによって決定され得る。吸入器または注入器での使用のための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末ベースの粉末ミックスを含有して製剤され得る。
化合物は、注射による、例えばボーラス注射または連続輸液による非経口投与のために製剤され得る。注射用製剤は、保存料が添加されて、単位投薬形で、例えばアンプルでまたは複数用量容器で与えられ得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤としてのこのような形を取り得て、懸濁化剤、安定剤および/または分散化剤などの製剤化剤を含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水による構成のための粉末形であり得る。
化合物は、例えばココアバターまたは他のグリセリドなどの慣習的な坐剤用ベースをを含有する、坐剤または留置浣腸などの経直腸組成物としても製剤され得る。
先に記載した製剤に加えて、化合物はデポー調製物としても調合され得る。このような長期作用型製剤は、インプラントによって(例えば皮下的にまたは筋肉内に)または筋肉内注射によって投与され得る。それゆえ、例えば化合物は、好適なポリマー材料または疎水性材料(例えば許容され得る油中の乳剤として)もしくはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤され得る。
全身投与は、経粘膜または経皮手段によっても可能である。経粘膜または経皮投与では、透過されるバリアにとって適切な浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、概して当分野で公知であり、含む,例えば経粘膜投与のためには、胆汁塩およびフシジン酸誘導体を含み、加えて洗剤が透過を容易にするために使用され得る。経粘膜投与は、鼻内スプレーまたは坐剤の使用により得る。局所投与では、本発明の化合物は、概して当分野で公知の軟膏、塗布剤、ゲル、またはクリームに製剤される。洗浄液を局所的に使用して、傷害または炎症を処置し、治癒を加速することができる。
組成物は所望ならば、活性成分を含有する1つ以上単位投薬形を含有し得るパックまたはディスペンサデバイスで与えられ得る。パックは例えば、金属箔またはブリスターパックなどのプラスチック箔を含み得る。パックまたはディスペンサデバイスは、投与のための説明書が添付され得る。
核酸の投与を包含する療法では、全身および局所または局在投与を含む多種多様の投与様式のために、本発明の化合物を製剤することができる。技法および製剤は一般に、Remmington’s Pharmaceutical Sciences,Meade Publishing Co.,Easton,Pa.に見出され得る。全身投与のためには、筋肉内、静脈内、腹腔内、結節内、および皮下を含む注射が好ましい。注射の場合、本発明の化合物は、液体剤中で、好ましくはハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液中で製剤することができる。加えて、化合物は固体形で製剤され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形も含まれる。
一実施形態において、環境影響因子を含む組成物は局所投与される。活性成分、すなわちenv影響因子を製薬的製剤として与えることが好ましい。活性成分は、局所投与のの場合、最終生成物において製剤の重量で約0.001%〜約20%w/wを構成し得るが、活性成分は製剤の30%w/w、好ましくは約1%〜約20%w/wをも構成し得る。本発明の局所製剤は、活性成分を1つ以上のそのための許容され得る担体および場合によりその他の治療成分と共に含む。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントにとって有害でないという意味で、「許容され得る」べきである。
目的の障害を呈している患者を治療するにあたって、これらのような1つまたは複数の薬剤の治療的有効量が投与される。治療的有効用量は、患者における症候の改善または生存の延長を生じる化合物の量を指す。
このような化合物の毒性および治療有効性は、LD50(集団の50%にとって致死性である用量)およびED50(集団の50%にとって治療的有効な用量)を決定するための、細胞培養または実験動物の標準製薬手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数であり、治療指数は比LD50/ED50として表すことができる。大きい治療指数を呈する化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から取得したデータは、ヒトで使用するための投薬量の範囲を製剤するのに使用することができる。このような化合物の投薬量は好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないED50を含む循環濃度の範囲内に存在する。投薬量は、用いた投薬形および利用した投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
本発明の方法で使用されるいずれの化合物でも、治療的有効用量は細胞培養アッセイから最初に推定することができる。例えば用量は、細胞培養で決定されたようなIC50を含む循環血漿濃度を達成する動物モデルにおいて、製剤することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより的確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えばHPLCによって測定され得る。
正確な製剤、投与経路および投薬量は、患者の症状を考慮して個別の医師によって選定されることができる(例えばFingl et al.,in The Pharmacological Basis of Therapeutics,1975,Ch.1 p.1を参照)。担当医が毒性、または器官障害のために投与を中止、中断、または調整する方法および時点を理解していることに注目すべきである。反対に、担当医は(毒性を除く)臨床応答が十分でなかった場合に、治療をより高レベルに調整することも理解しているであろう。目的の発癌(oneogenic)障害の管理における投与用量の大きさは、治療される症状の重症度および投与経路によって変動するであろう。症状の重症度は、例えば一部は、標準予後評価方法によって評価され得る。さらに用量およびおそらく投薬頻度も、個別の患者の年齢、体重、および応答によって変動するであろう。獣医学において、上述のプログラムに匹敵するプログラムが使用され得る。
治療されている特定の症状に応じて、このような薬剤は、全身的または局所的に製剤および投与され得る。Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1990)に見出され得る。好適な経路は、ほんのいくつか例を挙げると、経口、経直腸、経皮、経膣、経粘膜、または経腸投与;筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を含む非経口送達を含み得る。
上記の組成物は、いずれの好適な製剤中でも対象に投与され得る。環境影響因子、例えばCoQ10の局所製剤による代謝性障害の治療に加えて、本発明の他の態様において、環境影響因子、例えばCoQ10は他の方法によって送達されるかもしれない。例えば、環境影響因子、例えばCoQ10は非経口送達のために、例えば皮下、静脈内、筋肉内、または腫瘍内注射のために製剤化されるかもしれない。送達の他の方法、例えばリポソーム送達または組成物を含浸させたデバイスからの拡散が使用されるかもしれない。組成物は、単回ボーラス、複数回注射で、または連続輸液によって(例えば静脈内にまたは腹膜透析によって)によって投与され得る。非経口投与では、組成物は好ましくは、発熱物質を含まない滅菌形で製剤される。本発明の組成物は、組成物を細胞が含有されている流体に単に添加することによって、(例えばインビトロ培養物中の癌細胞のアポトーシスを誘導するために)インビトロで細胞に投与することもできる。
治療されている特定の症状に応じて、このような薬剤は、全身的または局所的に製剤および投与され得る。Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1990)に見出され得る。好適な経路は、ほんのいくつか例を挙げると、経口、経直腸、経皮、経膣、経粘膜、または経腸投与;筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を含む非経口送達を含み得る。
注射では、本発明の薬剤は水溶液で、好ましくはハンクス液、リンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液、または生理学的生理食塩水緩衝液で製剤され得る。このような経粘膜投与では、透過されるバリアにとって適切な浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、概して当分野で公知である。
本発明の実施のために本明細書で開示された化合物を全身投与に好適な投薬形に製剤するための、製薬的に許容され得る担体の使用は、本発明の範囲内である。担体の適正な選出および好適な製造実施によって、本発明の組成物、特に液剤として製剤された組成物は、静脈内注射になどによって非経口的に投与され得る。化合物は、当分野で周知の製薬的に許容され得る担体を使用して、経口投与に好適な投薬形にただちに製剤することができる。このような担体によって、本発明の化合物を治療される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤することができる。
細胞内投与されることを意図される薬剤は、当業者に周知の技法によって投与され得る。例えばこのような薬剤は、リポソーム中に封入され、次に上記のように投与され得る。リポソームは、水性の内部を有する球状脂質2重層である。リポソーム形成の時点で水溶液中に存在するすべての分子は、水性の内部に組み入れられる。リポソームの内容物は、外部微小環境から保護されながらも、リポソームが細胞膜と融合するために、細胞質中に効率的に送達される。加えて、小型有機分子は、その疎水性のために、細胞内に直接投与され得る。
本発明での使用に好適な医薬組成物は、その所期の目的を達成する有効量で含有されている組成物を含む。有効量の決定は、とりわけ本明細書で提供された詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、製薬的に使用することができる活性化合物の調製物への処理を容易にする賦形剤および助剤を含んだ、好適な製薬的に許容され得る担体を含有し得る。経口投与用に製剤された調製物は、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、または液剤の形であり得る。本発明の医薬組成物は、それ自体公知である方式で、例えば慣習的混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、浮上、乳化、封入、捕捉または凍結乾燥のプロセスによって製造され得る。
局所投与に好適な製剤は、皮膚を通じた治療が必要である部位への浸透に好適なリニメント剤、液剤、クリーム、軟膏またはペースト剤、および眼、耳または鼻への投与に好適な滴剤などの液体または半液体調製物を含む。本発明による滴剤は、滅菌水性または油性溶液または懸濁剤を含んでもよく、殺菌剤および/または殺真菌剤および/またはその他の好適な保存料の、および好ましくは表面活性界面活性剤を含む好適な水溶液に、活性成分を溶解することによって調製され得る。得られた溶液は次に、濾過によって清澄および滅菌され、無菌技法によって容器に移され得る。滴剤への包含に好適な殺菌剤および殺真菌剤は、硝酸または酢酸フェニル水銀(0.002%)、塩化ベンザルコニウム(0.01%)および酢酸クロルヘキシジン(0.01%)である。油性液剤の調製に好適な溶媒は、グリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールを含む。
本発明によるローションは、皮膚または眼への適用に好適なローションを含む。眼用ローションは、場合により殺菌剤を含有する滅菌水溶液を含んでもよく、液剤の調製方法に類似した方法によって調製され得る。皮膚への適用のためのローションまたはリニメント剤は、アルコールもしくはアセトンなどの乾燥を促進して皮膚を冷やす薬剤および/またはグリセロールなどの保湿剤またはヒマシ油もしくはラッカセイ油などの油も含み得る。
本発明によるクリーム、軟膏またはペースト剤は、外部適用のための活性成分の半固体製剤である。これらは単独のまたは水性もしくは非水性流体による溶液または懸濁液中の微粉化形または粉末化形の活性成分を、好適な機械を用いてグリースまたは非グリース基剤と混合することによって作製され得る。基剤は、固形パラフィン、軟パラフィンまたは流動パラフィンなどの炭化水素、グリセロール、ミツロウ、金属石鹸;滑粘薬;アーモンド油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然源の油;羊毛脂もしくはその誘導体、またはプロピレングリコールなどのアルコールまたはマクロゲルと共にステアリン酸またはオレイン酸などの脂肪酸を含み得る。製剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤またはソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などの非イオン性界面活性剤などのいずれの好適な界面活性剤も組み入れ得る。天然ゴム、セルロース誘導体などの懸濁化剤またはケイ質(silicaceous)シリカなどの無機材料、およびラノリンなどの他の成分も含まれ得る。
非経口投与のための製薬的製剤は、水溶形の活性化合物の水溶液を含む。加えて、活性化合物の懸濁剤は、適切な油性注射用懸濁剤として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油など脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪油、またはリポソームを含む。水性注射用懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁剤の粘度を上昇させる物質を含有し得る。場合により、懸濁剤は、高濃度の液剤の調製を可能にするために、好適な安定剤または化合物の溶解性を上昇させる薬剤も含有し得る。
経口使用のための製薬調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせて、場合により得られた混合物を粉砕し、所望の場合には錠剤または糖衣錠コアを取得するための好適な助剤を添加した後に顆粒の混合物を処理することによって取得することができる。好適な賦形剤は、特にラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤;例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)などのセルロース調製物である。所望ならば、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩が添加され得る。
糖衣錠コアは、好適なコーティングを施されている。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る、濃縮糖溶液が使用され得る。色素または顔料は、同定のためにまたは活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
経口的に使用することができる製薬調製物は、ゼラチンで作製されたプッシュ・フィット・カプセル剤、ならびにグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で作製された軟シールカプセル剤を含む。プッシュ・フィット・カプセル剤は、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および/またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合により安定剤と混合された活性成分を含むことができる。軟カプセル剤において、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁され得る。加えて、安定剤が添加され得る。
組成物は所望ならば、緩衝液系を含むことができる。緩衝液系は、組成物のpHを望ましい範囲内に維持または緩衝するように選定される。「緩衝液系」または「緩衝液」という用語は本明細書で使用する場合、1つまたは複数の溶質剤であって、水溶液中にあるときに、酸または塩基がそれに添加された場合のpH(または水素イオン濃度もしくは活性)の大きな変化に対してこのような溶液を安定させる溶質剤を指す。それゆえ上で指摘された範囲における開始時の緩衝pH値からのpHの抵抗または変化に関係する、1つまたは複数の溶質剤は周知である。無数の好適な緩衝剤があるが、リン酸カリウム1水和物が好ましい緩衝液である。
医薬組成物の最終pH値は、生理学的に適合可能な範囲内で変動し得る。最終pH値は、ヒト皮膚を必ずしも刺激する値ではなく、好ましくは活性化合物、すなわちCoQ10の経皮輸送が促進されるような値である。pHは、本制約に反することなく、CoQ10化合物の安定性を改善し、必要なときには稠度を調整するように選択され得る。一実施形態において、好ましいpH値は、約3.0〜約7.4、さらに好ましくは約3.0〜約6.5、最も好ましくは約3.5〜約6.0である。
好ましい局所送達ビヒクルでは、組成物の残りの構成要素は、必然的に精製されている水、例えば脱イオン水である。このような送達ビヒクル組成物は、組成物の総重量に基づいて、約50〜約95パーセントを超える範囲の水を含有する。しかし存在する水の明確な量は重要ではなく、所望の粘度(通常約50cps〜約10,000cps)および/または他の構成要素の濃度を取得するように調整することができる。局所送達ビヒクルは好ましくは、少なくとも約30センチポイズの粘度を有する。
他の公知の経皮浸透エンハンサーを使用して、CoQ10の送達を容易にすることもできる。例証的なのは、ジメチルスルホキシド(DMSO)などのスルホキシド;1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オン(アゾン(商標)、Nelson Research,Inc.の登録商標)などの環式アミド;N,N−ジメチルアセトアミド(DMA)N,N−ジエチルトルアミド、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルオクタアミド、N,N−ジメチルデカアミドなどのアミド;N−メチル−2−ピロリドン、2−ピロリドン、2−ピロリドン−5−カルボン酸、N−(2−ヒドロキシエチル)−2−ピロリドンまたはその脂肪酸エステル、1−ラウリル−4−メトキシカルボニル−2−ピロリドン、N−タローアルキルピロリドンなどのピロリドンの誘導体;プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセロール、ヘキサントリオールなどのポリオール;オレイン酸、リノレン酸、ラウリン酸、吉草酸、ヘプタン酸、カプロン酸、ミリスチン酸、イソ吉草酸、ネオペンタン酸、トリメチルヘキサン酸、イソステアリン酸などの直鎖または分枝脂肪酸;エタノール、プロパノール、ブタノール、オクタノール、オレイル、ステアリル、リノレイルなどのアルコール;ラウリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムなどのアニオン性界面活性剤;塩化ベンザルコニウム、ドデシルトリメチル塩化アンモニウム、セチルトリメチル臭化アンモニウムなどのカチオン性界面活性剤;プロポキシ化ポリオキシエチレンエーテル、例えばポロキサマー231、ポロキサマー182、ポロキサマー184など、エトキシ化脂肪酸、例えばツイン20,Myjr45など、ソルビタン誘導体、例えばツイン40、ツイン60、ツイン80、スパン60など、エトキシ化アルコール、例えばポリオキシエチレン(4)ラウリルエーテル(Brij30)、ポリオキシエチレン(2)オレイルエーテル(Brij93)など、レシチンおよびレシチン誘導体などの非イオン性界面活性剤;D−リモネン、α−ピネン、β−カレン、α−テルピネオール、カルボール、カルボン、メントン、酸化リモネン、酸化α−ピネン、ユーカリ油などのテルペンである。サリチル酸、サリチル酸メチル、クエン酸、コハク酸などの有機酸およびエステルも、皮膚浸透エンハンサーとして好適である。
一実施形態において、本発明は、CoQ10組成物およびその調製方法を提供する。好ましくは、組成物は少なくとも約1%〜約25%w/wのCoQ10を含む。CoQ10は旭化成N&P(北海道、日本)から、ユビデカレノン(USP)として入手することができる。CoQ10は、Kaneka Q10から粉末形のKanekaQ10(USP UBIDECARENONE)(Pasadena,Texas、USA)として取得することもできる。本明細書で例示された方法で使用されるCoQ10は、以下の特徴を有する:残りの溶媒はUSP 467の必要条件を満足する;水含有率は、0.0%未満、0.05%未満、または0.2%未満である;強熱残分は0.0%、0.05%未満、または0.2%未満である;重金属含有率は0.002%未満、または0.001%未満である;純度は98〜100%もしくは99.9%、または99.5%。組成物を調製する方法は、下の実施例のセクションに提供されている。
本発明のある実施形態において、コエンザイムQ10を、治療または予防が行われるようにヒトに局所投与することによって、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、コエンザイムQ10がターゲット組織に皮膚1平方センチメートルに付きコエンザイムQ10約0.01〜約0.5ミリグラムの範囲で適用される、局所ビヒクル中のコエンザイムQ10の局所用量がヒトに投与される方法が提供される。一実施形態において,コエンザイムQ10はターゲット組織に、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.09〜約0.15mgで適用される。各種の実施形態において、コエンザイムQ10はターゲット組織に、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.001〜約5.0mg、約0.005〜約1.0mg、約0.005〜約0.5mg、約0.01〜約0.5mg、約0.025〜約0.5mg、約0.05〜約0.4mg、約0.05〜約0.30mg、約0.10〜約0.25mg、または約0.10〜0.20mgの範囲で適用される。他の実施形態において,コエンザイムQ10はターゲット組織に皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.10mg、0.11mg、0.12mg、0.13mg、0.14mg、0.15mg、0.16mg、0.17mg、0.18mg、0.19mg、0.20mg、0.21mg、0.22mg、0.23mg、0.24mg、0.25mg、0.26mg、0.27mg、0.28mg、0.29mg、0.30mg、0.31mg、0.32mg、0.33mg、0.34mg、0.35mg、0.36mg、0.37mg、0.38mg、0.39mg、0.40mg、0.41mg、0.42mg、0.43mg、0.44mg、0.45mg、0.46mg、0.47mg、0.48mg、0.49mgまたは0.5mgの用量で適用される。一実施形態において,コエンザイムQ10はターゲット組織に、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.12mgの用量で適用される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか1つを有する範囲、例えば皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.03〜約0.12mg、約0.05〜約0.15mg、約0.1〜約0.20mg、または約0.32〜約0.49mgも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
本発明の別の実施形態において、コエンザイムQ10はCoQ10クリームの形で、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10クリーム0.5〜10ミリグラムの投薬量にて投与され、ここでCoQ10クリームは1〜5%のコエンザイムQ10を含む。一実施形態において、CoQ10クリームは、約3%のコエンザイムQ10を含む。他の実施形態において、CoQ10クリームは、約1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%または5%のコエンザイムQ10を含む。各種の実施形態において、CoQ10クリームは、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10クリーム約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5または10ミリグラムの投薬量で投与される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか1つを有する範囲、例えば皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10クリーム約0.5〜約5.0mg、約1.5〜2.5mg、または約2.5〜5.5mgも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
別の実施形態において、コエンザイムQ10はCoQ10クリームの形で、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10クリーム3〜5ミリグラムの投薬量にて投与され、ここでCoQ10クリームは1〜5%のコエンザイムQ10を含む。一実施形態において、CoQ10クリームは、約3%のコエンザイムQ10を含む。他の実施形態において、CoQ10クリームは、約1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%または5%のコエンザイムQ10を含む。各種の実施形態において、CoQ10クリームは、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10クリーム約3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9または5.0ミリグラムの投薬量で投与される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか1つを有する範囲、例えば皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10クリーム約3.0〜約4.0mg、約3.3〜5.3mg、または約4.5〜4.9mgも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
本発明のある態様は、コエンザイムQ10を治療または予防が行われるようにヒトに局所投与することによって、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、コエンザイムQ10は24時間につき1回以上、6週間以上にわたって局所適用される方法を提供する。
本発明のある態様は、相A、B、C、DおよびEを調製するステップと、3%CoQ10クリームの水中油型乳剤が形成されるようにすべての相を合せるステップとを含む、コエンザイムQ10クリーム3%を調製する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、相A成分は、4.00%w/wのアルキルC12−15ベンゾエートNF、2.00%w/wのセチルアルコールNF、4.5%w/wのステアリン酸グリセリル/PEG−100および1.50%w/wのステアリルアルコールNFを含むが、相B成分は、5.00%w/wのジエチレングリコールモノエチルエーテルNF、2.00%w/wのグリセリンUSP、1.50%w/wのプロピレングリコールUSP、0.475%w/wのフェノキシエタノールNF、16.725%w/wの精製水USPおよび40.00%w/wのカルボマー分散剤2%を含み、相C成分は、0.50%w/wの乳酸USP、2.00%w/wの乳酸ナトリウム溶液USP、1.30%w/wのトロラミンNF、および2.50%w/wの精製水USPを含む。さらにこれらの実施形態において、相D成分は1.00%w/wの二酸化窒素USPを含むが、相E成分は15%w/wのCoQ10 21%濃縮物を含む。
「トロラミン」という用語は、本明細書で使用する場合、トロラミンNF、トリエタノールアミン、TEAlan(登録商標)、TEAlan99%、トリエタノールアミン、99%、トリエタノールアミン、NFまたはトリエタノールアミン、99%、NFを指すこれらの用語は、本明細書で互換的に使用され得る。
ある他の実施形態において、相A成分は、4.00%w/wのカプリン酸/カプリル酸トリグリセリド、2.00%w/wのセチルアルコールNF、4.5%w/wのステアリン酸グリセリル/PEG−100および1.50%w/wのステアリルアルコールNFを含むが、相B成分は、5.00%w/wのジエチレングリコールモノエチルエーテルNF、2.00%w/wのグリセリンUSP、1.50%w/wのプロピレングリコールUSP、0.475%w/wのフェノキシエタノールNF、16.725%w/wの精製水USPおよび40.00%w/wのカルボマー分散剤2%を含み、相C成分は、0.50%w/wの乳酸USP、2.00%w/wの乳酸ナトリウム溶液USP、1.30%w/wのトロラミンNF、および2.50%w/wの精製水USPを含む。さらにこれらの実施形態において、相D成分は1.00%w/wの二酸化窒素USPを含むが、相E成分は15%w/wのCoQ10 21%濃縮物を含む。
本発明のある実施形態において、(1)相A成分を好適な容器に添加して、水浴内で70〜80℃まで加熱するステップと;(2)カルボマー分散剤を除く相B成分を好適な容器に添加して、混合して混合相Bを形成するステップと;(3)相E成分を好適な容器に入れ、水浴を使用して50〜60℃にて相E成分を溶融して、溶融相Eを形成するステップと;(4)カルボマー分散剤を混合タンクに添加して、混合しながら70〜80℃まで加熱するステップと;(5)温度を70〜80℃に維持しながら、混合相Bを混合タンクに添加するステップと;(6)温度を70〜80℃に維持しながら、相C成分を混合タンクに添加するステップと;(7)相D成分を混合タンクに添加して、次に混合タンクの内容の混合および均質化を続けるステップと;次に(8)均質化を停止して、混合タンクの内容物を50〜60℃に冷却するステップと;次に(9)混合を中止して、溶融相Eを混合タンクに添加して分散剤を形成するステップと;(10)次に、分散剤が滑らかで均一になるまで混合を再開するステップと;次に(11)混合タンクの内容物を45〜50℃まで冷却するステップとを含む、コエンザイムQ10クリーム3%の調製方法が提供される。
本発明のいくつかの他の実施形態において、CoQ10クリーム3%を含む医薬組成物が提供される。クリームは、組成物の4.00%w/wのC12−15アルキルベンゾエート、組成物の2.00%w/wのセチルアルコール、組成物の1.5%w/wのステアリルアルコール、4.5%w/wのステアリン酸グリセリルおよびPEG−100を有する相A;2.00%w/wのグリセリン、1.5%w/wのプロピレングリコール、5.0%w/wのエトキシジグリコール、0.475%w/wのフェノキシエタノール、40.00%w/wのカルボマー分散剤、16.725%w/wの精製水を有するB相;1.300%w/wのトリエタノールアミン、0.500%w/wの乳酸、2.000%w/wの乳酸ナトリウム溶液、2.5%w/wの水を有する相C;1.000%w/wの二酸化チタンを有する相D;および15.000%w/wのCoQ10 21%濃縮物を有する相Eを含む。いくつかの実施形態において、カルボマー分散剤は、水、フェノキシエタノール、プロピレングリコールおよびカルボマー940を含む。
本発明のいくつかの他の実施形態において、CoQ10クリーム3%を含む医薬組成物が提供される。クリームは、組成物の4.00%w/wのカプリン酸/カプリル酸トリグリセリド、組成物の2.00%w/wのセチルアルコール、組成物の1.5%w/wのステアリルアルコール、4.5%w/wのステアリン酸グリセリルおよびPEG−100を有する相A;2.00%w/wのグリセリン、1.5%w/wのプロピレングリコール、5.0%w/wのエトキシジグリコール、0.475%w/wのフェノキシエタノール、40.00%w/wのカルボマー分散剤、16.725%w/wの精製水を有するB相;1.300%w/wのトリエタノールアミン、0.500%w/wの乳酸、2.000%w/wの乳酸ナトリウム溶液、2.5%w/wの水を有する相C;1.000%w/wの二酸化チタンを有する相D;および15.000%w/wのCoQ10 21%濃縮物を有する相Eを含む。いくつかの実施形態において、カルボマー分散剤は、水、フェノキシエタノール、プロピレングリコールおよびカルボマー940を含む。
本発明のいくつかの他の実施形態において、CoQ10クリーム1.5%を含む医薬組成物が提供される。クリームは、5.000%w/wのC12−15アルキルベンゾエート、2.000%w/wのセチルアルコール、1.5%w/wのステアリルアルコール、4.500%w/wのステアリン酸グリセリルおよびPEG−100ステアリン酸を有するA相;2.000%w/wのグリセリン、1.750%w/wのプロピレン、5.000%w/wのエトキシジグリコール、0.463%w/wのフェノキシエタノール、50%w/wのカルボマー分散剤、および11.377%w/wの精製水を有する相B;1.3%w/wのトリエタノールアミン、0.400%w/wの乳酸、2.000%w/wの乳酸ナトリウム溶液および4.210%w/wの水を有する相C;1.000%w/wの二酸化チタンを有する相D;ならびに1.500%w/wのCoQ10 21%濃縮物を有する相Eを含む。
本発明のいくつかの他の実施形態において、CoQ10クリーム1.5%を含む医薬組成物が提供される。クリームは、5.000%w/wのカプリン酸/カプリル酸トリグリセリド、2.000%w/wのセチルアルコール、1.5%w/wのステアリルアルコール、4.500%w/wのステアリン酸グリセリルおよびPEG−100ステアリン酸を有するA相;2.000%w/wのグリセリン、1.750%w/wのプロピレン、5.000%w/wのエトキシジグリコール、0.463%w/wのフェノキシエタノール、50%w/wのカルボマー分散剤、および11.377%w/wの精製水を有する相B;1.3%w/wのトリエタノールアミン、0.400%w/wの乳酸、2.000%w/wの乳酸ナトリウム溶液および4.210%w/wの水を有する相C;1.000%w/wの二酸化チタンを有する相D;ならびに1.500%w/wのCoQ10 21%濃縮物を有する相Eを含む。いくつかの実施形態において、カルボマー分散剤は、水、フェノキシエタノールおよびプロピレングリコールを含む。
1.併用療法
ある実施形態において、本発明の環境影響因子および/またはその医薬組成物は、異なる環境影響因子および/またはその医薬組成物であり得る、少なくとも1つの他の治療剤を用いる併用療法で使用することができる。環境影響因子および/またはその医薬組成物ならびに他の治療剤は、相加的に、またはさらに好ましくは相乗的に作用することができる。一実施形態において、環境影響因子および/またはその医薬組成物は、別の治療剤の投与と同時に投与される。別の実施形態において、化合物および/またはその医薬組成物は、他の治療剤の投与の前にまたはそれに続いて投与される。
ある実施形態において、本発明の環境影響因子および/またはその医薬組成物は、異なる環境影響因子および/またはその医薬組成物であり得る、少なくとも1つの他の治療剤を用いる併用療法で使用することができる。環境影響因子および/またはその医薬組成物ならびに他の治療剤は、相加的に、またはさらに好ましくは相乗的に作用することができる。一実施形態において、環境影響因子および/またはその医薬組成物は、別の治療剤の投与と同時に投与される。別の実施形態において、化合物および/またはその医薬組成物は、他の治療剤の投与の前にまたはそれに続いて投与される。
本発明の環境影響因子と共に使用できる他の治療剤の例は、限定されるわけではないが、真性糖尿病治療剤、糖尿病合併症治療剤、抗高脂血剤、降圧剤または抗高血圧剤、抗肥満剤、利尿薬、化学治療剤、免疫治療剤、免疫抑制剤などを含む。
真性糖尿病を治療する薬剤の例は、インスリン製剤(例えばウシまたはブタの膵臓から抽出された動物インスリン製剤;微生物または方法を使用する遺伝子工学技術によって合成されたヒトインスリン製剤)、インスリン感受性増強剤、その製薬的に許容され得る塩、水和物、または溶媒和物(例えばピオグリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン、ネトグリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン、テサグリタザル、ファルグリタザル、CLX−0921、R−483、NIP−221、NIP−223、DRF−2189、GW−7282TAK−559、T−131、RG−12525、LY−510929、LY−519818、BMS−298585、DRF−2725、GW−1536、GI−262570、KRP−297、TZD18(Merck)、DRF−2655など)、アルファ−グリコシダーゼ阻害剤(例えばボグリボース、アカルボース、ミグリトール、エミグリテートなど)、ビグアニド(例えばフェンホルミン、メトホルミン、ブホルミンなど)またはスルホニル尿素(例えばトルブタミド、グリベンクラミド、グリクラジド、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、グリクロピラミド、グリメピリドなど)ならびに他のインスリン分泌促進剤(例えばレパグリニド、セナグリニド、ナテグリニド、ミチグリニド、GLP−1など)、アミリンアゴニスト(例えばプラムリンチドなど)、ホスホチロシンホスファターゼ阻害剤(例えばバナジン酸など)などを含む。
糖尿病合併症を治療する薬剤の例は、限定されるわけではないが、アルドースレダクターゼ阻害剤(例えばトルレスタット、エパルレスタット、ゼナレスタット、ゾポルレスタット、ミナルレスタット、フィダレスタット(fidareatat)、SK−860、CT−112など)、神経栄養因子(例えばNGF、NT−3、BDNFなど)、PKC阻害剤(例えばLY−333531など)、終末糖化産物(AGE)阻害剤(例えばALT946、ピマゲジン、ピラドキサミン(pyradoxamine)、フェナシルチアゾリウムブロミド(ALT766)など)、活性酸素失活剤(例えばチオクト酸またはその誘導体、フラボン、イソフラボン、フラボノン、プロシアニジン、アントシアニジン、ピクノジェノール、ルテイン、リコピンを含むバイオフラボノイド、ビタミンE、コエンザイムQなど)、脳血管拡張剤(例えばチアプリド、メキシレチン(mexiletene)など)を含む。
抗高脂血症剤は、例えばコレステロール合成阻害剤であるスタチンベース化合物(例えばプラバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、アトロバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチンなど)、トリグリセリド低下効果を有するスクアレンシンターゼ阻害剤またはフィブラート化合物(例えばフェノフィブラート、ゲムフィブロジル、ベザフィブラート、クロフィブラート、シンフィブラート、クリノフィブラートなど)を含む。
降圧剤は、例えばアンジオテンシン変換酵素阻害剤(例えばカプトプリル、エナラプリル、デラプリル、ベナゼプリル、シラザプリル、エナラプリル、エナラプリラト、ホシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリルなど)またはアンジオテンシンIIアンタゴニスト(例えばロサルタン、カンデサルタンシレキセチル、オルメサルタンメドキソミル、エプロサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、タソサルタン、ポミサルタン、リピサルタン、フォラサルタンなど)を含む。
抗肥満剤は、例えば中枢性抗肥満剤(例えばデクスフェンフルラミン、フェンフルラミン、フェンテルミン、シブトラミン、アンフェプラモン、デクスアンフェタミン、マジンドール、フェニルプロパノールアミン、クロベンゾレックスなど)、消化管リパーゼ阻害剤(例えばオルリスタットなど)、β−3アゴニスト(例えばCL−316243、SR−58611−A、UL−TG−307、SB−226552、AJ−9677、BMS−196085など)、ペプチドベース食欲抑制剤(例えばレプチン、CNTFなど)、コレシストキニンアゴニスト(例えばリンチトリプト、FPL−15849など)などを含む。
利尿剤は、例えばキサンチン誘導体(例えばサリチル酸ナトリウムテオブロミン、サリチル酸カルシウムテオブロミンなど)、チアジド製剤(例えばエチアジド、シクロペンチアジド、トリクロロメチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、ベンチルヒドロクロロチアジド、ペンフルチジド、ポリチアジド、メチクロチアジドなど)、抗アルドステロン製剤(例えばスピロノラクトン、トリアムテレンなど)、デカルボキシラーゼ阻害剤(例えばアセタゾラミドなど)、クロルベンゼンスルホンアミド製剤(例えばクロルタリドン、メフルシド、インダパミドなど)、アゾセミド、イソソルビド、エタクリン酸、ピレタニド、ブメタニド、フロセミドなどを含む。
化学治療剤は、例えばアルキル化剤(例えばシクロホスファミド、イホスファミドなど)、代謝アンタゴニスト(例えばメトトレキサート、5−フルオロウラシルなど)、抗癌性抗生物質(例えばマイトマイシン、アドリアマイシンなど)、植物由来抗癌剤(例えばビンクリスチン、ビンデシン、タキソールなど)、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシドなどを含む。これらの物質の中で、フルツロンおよびネオフルツロンなどの5−フルオロウラシル誘導体が好ましい。
免疫治療剤は、例えば微生物または細菌構成要素(例えばムラミルジペプチド誘導体、ピシバニールなど)、免疫増強活性を有する多糖類(例えばレンチナン、シゾフィラン、クレスチンなど)、遺伝子工学技術によって取得されたサイトカイン(例えばインターフェロン、インターロイキン(IL)など)、コロニー刺激因子(例えば顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン(erythropoetin)など)などを含み、これらの物質の中で、好ましいものはIL−1、IL−2、IL−12などである。
免疫抑制剤は、例えばカルシニューリン阻害剤/イムノフィリンモジュレーター、例えばシクロスポリン(サンドイミューン、ジェングラフ、ネオーラル)、タクロリムス(プログラフ、FK506)、ASM981、シロリムス(RAPA、ラパマイシン、ラパミューン)、またはその誘導体SDZ−RAD、グルココルチコイド(プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾンなど)、プリン合成阻害剤(ミコフェノール酸モフェチル、MMF、セルセプト(登録商標)、アザチオプリン、シクロホスファミド)、インターロイキンアンタゴニスト(バシリキシマブ、ダクリズマブ、デオキシスパガリン)、リンパ球除去剤、例えば抗胸腺細胞グロブリン(サイモグロブリン、リンフォグロブリン)、抗CD3抗体(OKT3)などを含む。
加えて、動物モデルにおいてまたは臨床段階で悪液質改善効果が確認された薬剤、例えばシクロオキシゲナーゼ阻害剤(例えばインドメタシンなど)[Cancer Research,Vol.49,page 5935−5939,1989]、プロゲステロン誘導体(例えばメゲストロール酢酸)[Journal of Clinical Oncology,Vol.12,page 213−225,1994]、グルコステロイド(例えばデキサメタゾンなど)、メトクロプラミドベース剤、テトラヒドロカンナビノールベース剤、脂質代謝改善剤(例えばエイコサペンタン酸など)[British Journal of Cancer,Vol.68,page 314−318,1993]、成長ホルモン、IGF−1、TNF−α、LIF、IL−6およびオンコスタチンMに対する抗体も、本発明による化合物と同時に用いられ得る。
本発明は、制限するとして解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例証される。本願を通じて引用されているすべての参考文献ならびに公開された特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられている。
本発明はここで一般に記載されており、当業者が、本明細書の上記の教示および以下の実施例から、他のアッセイ、細胞の種類、薬剤、作製物、またはデータ分析方法が、すべて制限なく、請求された本発明の範囲から逸脱せずに使用できることを認識しているので、単に本発明の実施形態のある態様の例証の目的のために含まれており、本発明を制限する意図するものではない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。
本出願のいずれの箇所で参照されたいずれの特許、特許出願、特許公報、または科学論文の内容も、その全体が本明細書に組み入れられている。
本発明の実施は、適切な場合および別途指摘しない限り,当業者の技法範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、ウイルス学、組換えDNA、および免疫学の慣習的な技法を用いるであろう。このような技法は、文献に記載されている。例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,ed.by Sambrook and Russell(Cold Spring Harbor Laboratory Press:2001);専門書、Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);Using Antibodies,Second Edition by Harlow and Lane,Cold Spring Harbor Press,New York,1999;Current Protocols in Cell Biology,ed.by Bonifacino,Dasso,Lippincott−Schwartz,Harford,およびYamada,John Wiley and Sons,Inc.,New York,1999;and PCR Protocols,ed.by Bartlett et al.,Humana Press,2003を参照。
実施例1:MIMとしてのCoQ10の同定
潜在的なMIMとしてCoQ10を評価するために、酸化型のCoQ10を癌株化細胞および正常な対照株化細胞の両方を含む株化細胞のパネルに外部から添加して、パネルの各株化細胞について細胞微小環境プロフィールに誘導された変化を影響評価した。mRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方を含む、細胞形態/生理機能に対するおよび細胞組成物に対する変化を、正常細胞との比較として疾患細胞について評価および比較した。これらの実験結果は、CoQ10、および特にCoQ10の酸化型をMIMとして同定した。
潜在的なMIMとしてCoQ10を評価するために、酸化型のCoQ10を癌株化細胞および正常な対照株化細胞の両方を含む株化細胞のパネルに外部から添加して、パネルの各株化細胞について細胞微小環境プロフィールに誘導された変化を影響評価した。mRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方を含む、細胞形態/生理機能に対するおよび細胞組成物に対する変化を、正常細胞との比較として疾患細胞について評価および比較した。これらの実験結果は、CoQ10、および特にCoQ10の酸化型をMIMとして同定した。
実験の第1セットでは、細胞形態/生理機能に対する変化をCoQ10に対する細胞の感受性およびアポトーシス応答を検査することによって評価した。対照株化細胞(ケラチノサイトおよびメラノサイトの初代培養)および複数の皮膚癌株化細胞(SK−MEL−28、非転移性皮膚黒色腫;SK−MEL−2、転移性皮膚黒色腫;またはSCC、扁平上皮細胞癌腫;PaCa2、膵臓癌株化細胞;またはHEP−G2、肝臓癌株化細胞)を含む皮膚株化細胞のパネルを各種のレベルのコエンザイムQ10によって処置した。これらの実験結果は、癌株化細胞が、対照株化細胞と比較して改変された用量依存性応答を癌細胞のみにおけるアポトーシスおよび細胞死の誘導と共に呈することを証明した。例示的な実験を下の実施例3に詳細に記載する。
次に、CoQ10による処置後に細胞の組成の変化を影響評価するアッセイを用いた。リアルタイムPCRアレイ法を使用して、mRNAレベルでの遺伝子発現の変化を分析した。例示的な実験を下の実施例6および9〜13に詳細に記載する。相補的実験において、抗体マイクロアレイ法、2次元ゲル電気泳動、それに続く質量分析キャラクタリゼーションを使用するタンパク質同定(identificuation)を使用することによって、およびウェスタンブロット分析によって、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化を分析した。例示的な実験を下の実施例4、7および8にそれぞれ詳細に記載する。これらのアッセイからの結果は、検査された株化細胞において、遺伝子発現の著しい変化がmRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方で、酸化型CoQ10の添加により誘導されることを証明した。CoQ10処置によって調節された遺伝子は、アポトーシス、癌生物学および細胞増殖、解糖および代謝、分子輸送、ならびに細胞シグナル伝達を含む、複数の細胞経路中に密集することが見出された。
CoQ10の細胞中への進入を確認し、細胞中に存在するCoQ10のレベルおよび型を決定するために実験を行った。特に、ミトコンドリア中に存在するコエンザイムQ10のレベル、ならびにCoQ10の型(すなわち酸化型または還元型)を、CoQ10で処置した細胞からのミトコンドリア濃縮調製物を分析することによって決定した。ミトコンドリア中に存在するコエンザイムQ10のレベルは、外因性Q10の添加に伴って、時間および用量依存的な様式で増加することが確認された。驚くべき予想外の結果において、CoQ10はミトコンドリア中に主に酸化型で存在することが決定された。加えて、濃縮試料からのタンパク質のレベルの変化を2次元ゲル電気泳動および質量分析キャラクタリゼーションによるタンパク質同定によって分析した。これらの実験からの結果は、検査された時間経過でのミトコンドリア中の酸化型CoQ10のレベルが、代謝経路およびアポトーシス経路に関連する特異的タンパク質のmRNAレベルおよびタンパク質レベルの調節によって明示されるように、多岐にわたる細胞変化に相関することを証明した。例示的な実験を下の実施例5に詳細に記載する。
本明細書で出願人らによって記載された結果は、内因性分子CoQ10、および特にCoQ10の酸化型をMIMとして同定した。例えば結果がCoQ10をMIMとして同定したのは、CoQ10がmRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方での遺伝子発現の変化を誘導することが観察されたためである。結果がCoQ10が多次元特徴を有するとして同定したのは、CoQ10が、正常な(例えば非癌性)状態と比較した疾患状態(例えば癌)において、細胞形態/生理機能および細胞組成物の示差的変化(例えばmRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方での遺伝子発現の示差的変化)を誘導したためである。その上、結果は、CoQ10が細胞に進入することができ、それゆえ治療効果および担体効果の両方を呈するという点で多次元特徴を有するとして同定した。
実施例2:代謝性障害についての疾患関連プロセスおよびバイオマーカーを同定するための方法
株化細胞が目的の分子によって処置された細胞ベースアッセイから、処置細胞対非処置細胞の相違をmRNAアレイ、タンパク質抗体アレイ、および2次元ゲル電気泳動によって評価する。比較試料分析からMIMまたはエピシフターによって調節されることが同定されたタンパク質を、経路分析を使用するシステム・バイオロジー・パースペクティブ(Systems Biology perspective using analysis)(Ingenuity IPAソフトウェア)および公知の文献の検討から評価した。潜在的な治療ターゲットまたはバイオマーカーターゲットとして同定されたタンパク質を、ウェスタンブロット分析、siRNAノックダウン、または組換えタンパク質産生およびキャラクタリゼーション方法などの確認アッセイに供する。
株化細胞が目的の分子によって処置された細胞ベースアッセイから、処置細胞対非処置細胞の相違をmRNAアレイ、タンパク質抗体アレイ、および2次元ゲル電気泳動によって評価する。比較試料分析からMIMまたはエピシフターによって調節されることが同定されたタンパク質を、経路分析を使用するシステム・バイオロジー・パースペクティブ(Systems Biology perspective using analysis)(Ingenuity IPAソフトウェア)および公知の文献の検討から評価した。潜在的な治療ターゲットまたはバイオマーカーターゲットとして同定されたタンパク質を、ウェスタンブロット分析、siRNAノックダウン、または組換えタンパク質産生およびキャラクタリゼーション方法などの確認アッセイに供する。
実施例3〜8の物質および方法
コエンザイムQ10ストック
500μMコエンザイムQ10(細胞増殖培地中5%イソプロパノール)を以下のように調製した。500μMコエンザイムQ10ストック10mLは、毎回更新した。分子量:863.34
(0.0005mol/L)(0.010L)(863.34g/mol)=0.004317g
500μMストック10mLを作製するために、4.32mgコエンザイムQ10を15mLファルコンチューブに秤量して、イソプロパノール500μLを添加した。溶液を完全に溶解するために撹拌しながら、50〜60℃の水浴で加温した。本溶液に培地9.5mL(細胞を培養したのと同じ培地)を添加した。
コエンザイムQ10ストック
500μMコエンザイムQ10(細胞増殖培地中5%イソプロパノール)を以下のように調製した。500μMコエンザイムQ10ストック10mLは、毎回更新した。分子量:863.34
(0.0005mol/L)(0.010L)(863.34g/mol)=0.004317g
500μMストック10mLを作製するために、4.32mgコエンザイムQ10を15mLファルコンチューブに秤量して、イソプロパノール500μLを添加した。溶液を完全に溶解するために撹拌しながら、50〜60℃の水浴で加温した。本溶液に培地9.5mL(細胞を培養したのと同じ培地)を添加した。
細胞培養
細胞をAmerican Type Culture CollectionまたはGibcoから取得した。細胞を5%ウシ胎仔血清、0.25ug/mLアンホテリシン、100ug/mLストレプトマイシン、および100UmL−1ペニシリンを補足したDMEM/F−12培地で培養した。細胞を37℃の95%空気および5%CO2の雰囲気中で維持した。
細胞をAmerican Type Culture CollectionまたはGibcoから取得した。細胞を5%ウシ胎仔血清、0.25ug/mLアンホテリシン、100ug/mLストレプトマイシン、および100UmL−1ペニシリンを補足したDMEM/F−12培地で培養した。細胞を37℃の95%空気および5%CO2の雰囲気中で維持した。
コエンザイムQ10処置および全タンパク質単離
細胞をQ10に曝露する前に85%コンフルエントまで培養した。補足培地をQ10によって50および100マイクロモル濃度に調整した。フラスコを対照、50μMQ10、および100μMQ10によって3通り処置した。タンパク質を処置フラスコおよび対照フラスコから4、8、12、および24時間後に単離した。タンパク質の単離のために、細胞はpH7.4の氷冷PBS5mLによって3回洗浄した。細胞を次にPBS3mL中でこすり取り、遠心分離によってペレット化し、pH7.4の溶解緩衝液(プロテアーゼ阻害剤およびリン酸阻害剤を含む、80mM TRIS−HCl、1%SDS)に再懸濁させた。BCA法を使用してタンパク質濃度を定量した。
細胞をQ10に曝露する前に85%コンフルエントまで培養した。補足培地をQ10によって50および100マイクロモル濃度に調整した。フラスコを対照、50μMQ10、および100μMQ10によって3通り処置した。タンパク質を処置フラスコおよび対照フラスコから4、8、12、および24時間後に単離した。タンパク質の単離のために、細胞はpH7.4の氷冷PBS5mLによって3回洗浄した。細胞を次にPBS3mL中でこすり取り、遠心分離によってペレット化し、pH7.4の溶解緩衝液(プロテアーゼ阻害剤およびリン酸阻害剤を含む、80mM TRIS−HCl、1%SDS)に再懸濁させた。BCA法を使用してタンパク質濃度を定量した。
株化細胞
下に挙げる株化細胞を増殖させて、それぞれについて細胞バンクを樹立した。各種のアッセイのための細胞の大規模産生を遂行して、分析のために材料を収集した。一般に、株化細胞の維持に細胞特異的培地が不要であるとき、細胞増殖増殖に使用した培地は5%血清を含むDMEMF−12であった。細胞は通例、続いての分割ならびに細胞アッセイおよび標準実施方法における使用の前に、75〜80%コンフルエント(クリアスペーシング(clear spacing))まで増殖させた。実験のために以下の株化細胞を樹立した:
SK−MEL−28(非転移性皮膚黒色腫)
SK−MEL−2(転移性皮膚黒色腫)
HEKa(ケラチノサイト、皮膚対照)
HEMa(メラノサイト、皮膚対照)
nFIB(新生児線維芽細胞)
HEP−G2(肝臓癌)[SBH株化細胞]
SkBr−3(乳癌、Her2過剰発現)
MCF−7(乳癌、p53突然変異)
PC−3(前立腺癌)[SBH株化細胞]
SkBr−3(ヒト乳腺癌)
NCI−ES−0808
SCC(扁平上皮細胞癌腫)
PaCa−2
NIH−3T3
細胞培養:
細胞をAmerican Type Culture CollectionまたはGibcoから取得した。細胞を5%ウシ胎仔血清、0.25ug/mLアンホテリシン、100ug/mLストレプトマイシン、および100UmL−1ペニシリンを補足したDMEM/F−12培地で培養した。細胞を37℃の95%空気および5%CO2の雰囲気中で維持した。
下に挙げる株化細胞を増殖させて、それぞれについて細胞バンクを樹立した。各種のアッセイのための細胞の大規模産生を遂行して、分析のために材料を収集した。一般に、株化細胞の維持に細胞特異的培地が不要であるとき、細胞増殖増殖に使用した培地は5%血清を含むDMEMF−12であった。細胞は通例、続いての分割ならびに細胞アッセイおよび標準実施方法における使用の前に、75〜80%コンフルエント(クリアスペーシング(clear spacing))まで増殖させた。実験のために以下の株化細胞を樹立した:
SK−MEL−28(非転移性皮膚黒色腫)
SK−MEL−2(転移性皮膚黒色腫)
HEKa(ケラチノサイト、皮膚対照)
HEMa(メラノサイト、皮膚対照)
nFIB(新生児線維芽細胞)
HEP−G2(肝臓癌)[SBH株化細胞]
SkBr−3(乳癌、Her2過剰発現)
MCF−7(乳癌、p53突然変異)
PC−3(前立腺癌)[SBH株化細胞]
SkBr−3(ヒト乳腺癌)
NCI−ES−0808
SCC(扁平上皮細胞癌腫)
PaCa−2
NIH−3T3
細胞培養:
細胞をAmerican Type Culture CollectionまたはGibcoから取得した。細胞を5%ウシ胎仔血清、0.25ug/mLアンホテリシン、100ug/mLストレプトマイシン、および100UmL−1ペニシリンを補足したDMEM/F−12培地で培養した。細胞を37℃の95%空気および5%CO2の雰囲気中で維持した。
皮膚悪性黒色腫SK−MEL28細胞を5%FBS、アンホテリシンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補足したグルタマックス(Invitrogen,Carlsbad CA)を含むDMEM/F12中で培養および維持した。細胞を37℃にて5%CO2によって増殖させた。追加の株化細胞および成長条件の詳細事項を下の表で概説する。
SKMEL28細胞のQ10処置:
SK−MEL28細胞を100μM Q10または対照ビヒクルによって処置した。Q10の製剤は以下の通りである。15mLキャップ付きチューブに、Q10 4.32mg(Cytotechより供給)を移し、次にイソプロパノール500μlの添加により溶解させた。得られた溶液を65℃の水浴で加温して、高速でボルテックスした。Q10/イソプロパノール溶液の体積を平衡にした細胞培養培地の添加により、10mLにした。ストック溶液を次にボルテックスして、Q10の溶解性を最大にした。ストック溶液を希釈して(培地8mLによりストック2mL)100μ MQ10の最終濃度を取得した。対照ビヒクルでは、培地9.5mLをイソプロパノール500μLに添加した。対照ストック(ストック2mL)を培地8mLでさらに希釈した。細胞を処置開始の6、16、24、48または72時間後に収集した。
SK−MEL28細胞を100μM Q10または対照ビヒクルによって処置した。Q10の製剤は以下の通りである。15mLキャップ付きチューブに、Q10 4.32mg(Cytotechより供給)を移し、次にイソプロパノール500μlの添加により溶解させた。得られた溶液を65℃の水浴で加温して、高速でボルテックスした。Q10/イソプロパノール溶液の体積を平衡にした細胞培養培地の添加により、10mLにした。ストック溶液を次にボルテックスして、Q10の溶解性を最大にした。ストック溶液を希釈して(培地8mLによりストック2mL)100μ MQ10の最終濃度を取得した。対照ビヒクルでは、培地9.5mLをイソプロパノール500μLに添加した。対照ストック(ストック2mL)を培地8mLでさらに希釈した。細胞を処置開始の6、16、24、48または72時間後に収集した。
SCC細胞のQ10処置:
SCC細胞を100μM Q10(上記のように調製)によって6時間または24時間のどちらかで処置した。対照細胞は未処置細胞であった。処置後、各種の時間にて収集およびペレット化して、ペレットを急速凍結させ、RNAを下記のようにXTALにて単離するまで−80℃にて貯蔵した。
SCC細胞を100μM Q10(上記のように調製)によって6時間または24時間のどちらかで処置した。対照細胞は未処置細胞であった。処置後、各種の時間にて収集およびペレット化して、ペレットを急速凍結させ、RNAを下記のようにXTALにて単離するまで−80℃にて貯蔵した。
RNA単離:
RNeasy Miniキット(Qiagen,Inc.,Valencia CA)キットをメーカーの説明書に従って使用して、細胞を各種の処置時間にRNA単離のために溶解させた。RNAを260nmにおける光学密度を測定することによって定量した。
RNeasy Miniキット(Qiagen,Inc.,Valencia CA)キットをメーカーの説明書に従って使用して、細胞を各種の処置時間にRNA単離のために溶解させた。RNAを260nmにおける光学密度を測定することによって定量した。
第1鎖合成:
第1鎖cDNAを、RT2第1鎖合成キット(SABiosciences.,Frederick MD)をメーカーの推奨に従って使用して、全RNA 1μgから合成した
リアルタイムPCR:
第1鎖合成からの生成物を水で希釈して、SYBRグリーン・マスター・ミックス(SABiosciences.,Frederick MD)と混合し、PCRアレイ上に添加した。リアルタイムPCRをBiorad CFX96でPCRアレイ(アポトーシスアレイ、糖尿病アレイ、酸化ストレスアレイおよび抗酸化防御アレイならびに熱ショックタンパク質アレイ)(SABiosciences,Frederick MD)に対して実行した。
第1鎖cDNAを、RT2第1鎖合成キット(SABiosciences.,Frederick MD)をメーカーの推奨に従って使用して、全RNA 1μgから合成した
リアルタイムPCR:
第1鎖合成からの生成物を水で希釈して、SYBRグリーン・マスター・ミックス(SABiosciences.,Frederick MD)と混合し、PCRアレイ上に添加した。リアルタイムPCRをBiorad CFX96でPCRアレイ(アポトーシスアレイ、糖尿病アレイ、酸化ストレスアレイおよび抗酸化防御アレイならびに熱ショックタンパク質アレイ)(SABiosciences,Frederick MD)に対して実行した。
アポトーシスのためのネキシンアッセイによる、コエンザイムQ10に対する株化細胞感受性の決定:
早期および後期アポトーシスでの細胞のパーセンテージをコエンザイムQ10処置の24時間後に定量した。早期および後期アポトーシスを、コエンザイムQ10に対する各種の癌株化細胞の感受性の相違を理解するためのマーカーとして使用した。試験した各種の株化細胞は、PaCa2、HepG2、PC−3、SKBr3、MCF−7およびSK−MEL28であった。細胞を96ウェルプレート内で一晩接着させた。これらの細胞を対照ビヒクル、50μM Q10または100μMコエンザイムQ10のいずれかによって処置した。24時間後、アポトーシス細胞の存在がPCA96フローサイトメータ(Guava Technologies,Hayward、CA)で推定された。加えていくつかの細胞を、アポトーシスの正の対照としての4μMスタウロスポリンで2時間処置した。細胞を最初にPBSで洗浄して、Accumax(Innovative Cell Technologies,San Diego、CA)50μLによって室温にて剥離させた。1%プルロニックF−68(Sigma−Aldrich,St.Louis、MO)を含有する培養培地の添加によって、解離を停止させた。ネキシン試薬100μL(Guava Technologies,Hayward、CA)を各ウェルに添加した。暗所での20分間のインキュベーションの後、アッセイを低結合プレートにて遂行して、細胞の基質への再結合を最小限に抑えた。ネキシン試薬は2種類の染料を含有している。アネキシン−V−PEは、早期アポトーシス細胞の特徴である、ホスファチジル(phosphotidyl)セリンを細胞の外部にて検出する。第2の染料7−AADは、生(健常)および早期アポトーシス細胞から排除されるが、後期アポトーシス細胞のみに浸透する。4つの細胞集団;生、早期アポトーシス細胞、後期アポトーシスおよび破片のパーセンテージは、Cytosoft 2.5.7ソフトウェア(Guava Technologies,Hayward、CA)を使用して決定した。
早期および後期アポトーシスでの細胞のパーセンテージをコエンザイムQ10処置の24時間後に定量した。早期および後期アポトーシスを、コエンザイムQ10に対する各種の癌株化細胞の感受性の相違を理解するためのマーカーとして使用した。試験した各種の株化細胞は、PaCa2、HepG2、PC−3、SKBr3、MCF−7およびSK−MEL28であった。細胞を96ウェルプレート内で一晩接着させた。これらの細胞を対照ビヒクル、50μM Q10または100μMコエンザイムQ10のいずれかによって処置した。24時間後、アポトーシス細胞の存在がPCA96フローサイトメータ(Guava Technologies,Hayward、CA)で推定された。加えていくつかの細胞を、アポトーシスの正の対照としての4μMスタウロスポリンで2時間処置した。細胞を最初にPBSで洗浄して、Accumax(Innovative Cell Technologies,San Diego、CA)50μLによって室温にて剥離させた。1%プルロニックF−68(Sigma−Aldrich,St.Louis、MO)を含有する培養培地の添加によって、解離を停止させた。ネキシン試薬100μL(Guava Technologies,Hayward、CA)を各ウェルに添加した。暗所での20分間のインキュベーションの後、アッセイを低結合プレートにて遂行して、細胞の基質への再結合を最小限に抑えた。ネキシン試薬は2種類の染料を含有している。アネキシン−V−PEは、早期アポトーシス細胞の特徴である、ホスファチジル(phosphotidyl)セリンを細胞の外部にて検出する。第2の染料7−AADは、生(健常)および早期アポトーシス細胞から排除されるが、後期アポトーシス細胞のみに浸透する。4つの細胞集団;生、早期アポトーシス細胞、後期アポトーシスおよび破片のパーセンテージは、Cytosoft 2.5.7ソフトウェア(Guava Technologies,Hayward、CA)を使用して決定した。
免疫ブロッティング
試料当りおよそ50μgのタンパク質を、免疫ブロッティングによってアッセイした。すべての処置は対照を用いて3通り実行した。タンパク質を12%TRIS−HClゲル上で分離し、電気泳動を介してニトロセルロース膜に移し、1次抗体によるインキュベーションの前に5%牛乳およびTBST溶液を使用して遮断した。1次抗体を5%BSAおよびTBST溶液中4℃にて一晩インキュベートした。2次抗体を4℃にて1時間インキュベートした。すべての抗体をCell Signaling Technologyから購入した。抗体は、1:5000の比のβアクチンを除いて、1:1000の比で使用した。ブロットを展開させて、結果はNIH Javaベースの濃度計分析ソフトウェアImage Jを使用して定量した。すべてのブロットはプローブも行い、そのそれぞれのβアクチン発現に正規化した。
試料当りおよそ50μgのタンパク質を、免疫ブロッティングによってアッセイした。すべての処置は対照を用いて3通り実行した。タンパク質を12%TRIS−HClゲル上で分離し、電気泳動を介してニトロセルロース膜に移し、1次抗体によるインキュベーションの前に5%牛乳およびTBST溶液を使用して遮断した。1次抗体を5%BSAおよびTBST溶液中4℃にて一晩インキュベートした。2次抗体を4℃にて1時間インキュベートした。すべての抗体をCell Signaling Technologyから購入した。抗体は、1:5000の比のβアクチンを除いて、1:1000の比で使用した。ブロットを展開させて、結果はNIH Javaベースの濃度計分析ソフトウェアImage Jを使用して定量した。すべてのブロットはプローブも行い、そのそれぞれのβアクチン発現に正規化した。
2次元電気泳動
等電点電気泳動(IEF)の前に、試料を40mM Tris、7M尿素、2Mチオ尿素、および1%C7両性イオン洗剤中に溶解させて、トリブチルホスフィンによって還元し、10mMアクリルアミドによって室温にて90分間アルキル化した。試料を10kDaカットオフAmicon Ultraデバイスに通した後、7M尿素、2Mチオ尿素、および2%CHAPSからなる少なくとも3倍量の再懸濁緩衝液によって、試料の伝導率を低下させる。タンパク質100マイクログラムを、11cm pH3〜10、pH4〜7またはpH6〜11の固定化pH勾配ストリップ(GE,Amersham、USA)にて100,000ボルト時までIEFに供した。IEFの後、固定化pH勾配ストリップを6M尿素、2%SDS、50mM Tris酢酸緩衝液、pH7.0、および0.01%ブロムフェノールブルー中で平衡にして、8〜16%Tris−HClプレキャストゲル1mm(Bio−Rad、USA)でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルは2通り実行した。これらにどちらも固定、SYPRO Ruby、80mL/ゲル(Invitrogen、USA)での染色および5100 Fuji Laserスキャナーでの撮像、またはPVDF膜上への移動を行った。
等電点電気泳動(IEF)の前に、試料を40mM Tris、7M尿素、2Mチオ尿素、および1%C7両性イオン洗剤中に溶解させて、トリブチルホスフィンによって還元し、10mMアクリルアミドによって室温にて90分間アルキル化した。試料を10kDaカットオフAmicon Ultraデバイスに通した後、7M尿素、2Mチオ尿素、および2%CHAPSからなる少なくとも3倍量の再懸濁緩衝液によって、試料の伝導率を低下させる。タンパク質100マイクログラムを、11cm pH3〜10、pH4〜7またはpH6〜11の固定化pH勾配ストリップ(GE,Amersham、USA)にて100,000ボルト時までIEFに供した。IEFの後、固定化pH勾配ストリップを6M尿素、2%SDS、50mM Tris酢酸緩衝液、pH7.0、および0.01%ブロムフェノールブルー中で平衡にして、8〜16%Tris−HClプレキャストゲル1mm(Bio−Rad、USA)でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルは2通り実行した。これらにどちらも固定、SYPRO Ruby、80mL/ゲル(Invitrogen、USA)での染色および5100 Fuji Laserスキャナーでの撮像、またはPVDF膜上への移動を行った。
対照試料についての追加の情報を取得して、dPC(Protein Forest Inc.)選択的pI分画、それに続くdPCプラグのトリプシン消化を質量分析同定および半定量(semi−quantization)(NanomateまたはLC/LTQ/MS)と共に利用する方法を使用して、タンパク質同定の有用性を試験した。対照試料を用いて遂行したdPC分析は、タンパク質の大型サブセットの同定でその有用性を証明した。試験の間に産生された材料は、将来、必要が生じた場合に資源として利用され得るように保存した。
2次元ゲル画像分析:
すべてのゲル画像の分析は、Progenesis Discovery and Pro(Nonlinear Dynamics Inc.,Newcastle upon Tyne、UK)を使用して遂行した。スポット検出、マッチング、バックグラウンド除去、正規化、およびフィルタリングの後、SYPRO Rubyゲル画像のデータをエクスポートした。Progenesis Discoveryでスチューデントのt検定を使用して群間の対比較を遂行し、発現が著しく改変されたスポットを同定した(p>0.05)。
すべてのゲル画像の分析は、Progenesis Discovery and Pro(Nonlinear Dynamics Inc.,Newcastle upon Tyne、UK)を使用して遂行した。スポット検出、マッチング、バックグラウンド除去、正規化、およびフィルタリングの後、SYPRO Rubyゲル画像のデータをエクスポートした。Progenesis Discoveryでスチューデントのt検定を使用して群間の対比較を遂行し、発現が著しく改変されたスポットを同定した(p>0.05)。
抗体アレイ:
抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ、Sigma)を利用して700超のタンパク質抗体をスクリーニングし、Q10処置細胞(SK−MEL−28、SCC)におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。細胞抽出物におけるタンパク質の発現は、スライド上にスポットされた対応する抗体にタンパク質が結合されたときに検出される。結合の前に、タンパク質を蛍光描出および定量的分析に使用される蛍光染料で直接標識する。アレイを異なるCyDye(Cy3またはCy5)によってそれぞれ標識された2つの試料のタンパク質発現プロフィールを比較するために使用して(試験試料対参照試料)、2つの試料を等しいタンパク質濃度でアレイ上に同時に適用する。次に各試料の蛍光シグナル強度を試料の染料標識に対応する波長にて個別に記録して、比較する。
抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ、Sigma)を利用して700超のタンパク質抗体をスクリーニングし、Q10処置細胞(SK−MEL−28、SCC)におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。細胞抽出物におけるタンパク質の発現は、スライド上にスポットされた対応する抗体にタンパク質が結合されたときに検出される。結合の前に、タンパク質を蛍光描出および定量的分析に使用される蛍光染料で直接標識する。アレイを異なるCyDye(Cy3またはCy5)によってそれぞれ標識された2つの試料のタンパク質発現プロフィールを比較するために使用して(試験試料対参照試料)、2つの試料を等しいタンパク質濃度でアレイ上に同時に適用する。次に各試料の蛍光シグナル強度を試料の染料標識に対応する波長にて個別に記録して、比較する。
高用量のコエンザイムQ10は、培養されたSKMEL−28細胞のアポトーシス経路、糖尿病経路および酸化ストレス経路に関与する遺伝子の発現を調節する。
実験詳細事項:5%FBS、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンホテリシンを補足した、グルタマックス(Invitrogenカタログ番号10565−042)を含有するDMEM−F12中で培養されたSKMEL−28細胞(ATCCカタログ番号HTB−72)は、非転移性、皮膚黒色腫細胞であり、ビヒクルまたは100uMコエンザイムQ10によって各種の長さの時間にわたって処置した。コエンザイムQ10処置の結果として生じる遺伝子発現のいずれの変化も、リアルタイムPCRアレイ(アポトーシスカタログ番号PAHS−12、糖尿病カタログ番号PAHS−023および酸化ストレスカタログ番号PAHS−065)(SABiosciences,Frederick、MD)を使用して定量した。
500uMコエンザイムQ10のストック濃縮物を、イソプロパノール500ul中に4.32mgを溶解することによって調製して、これを培地の添加により10mlまでさらに希釈した。ボルテックスおよび65℃までの加熱を交互に行って、コエンザイムQ10を溶解させた。ストック溶液2mlを培地により10mlに希釈して、100uM Q10含有培地を得て、これを細胞の処置に使用した。コエンザイムQ10を添加しないことを除いた類似のプロトコールによって、ビヒクルを並行して調製した。
SKMEL−28細胞を6ウェルプレートにて1×105細胞/ウェルの密度で播種した。24時間後、細胞が結合して50%コンフルエントであるときに、ビヒクルまたは100uM Q10のどちらかを添加した。細胞をQ10処置の6、16、24、48または72時間後に収集したが、ビヒクル処置細胞は24時間後に収集した。スピンカラムおよびオンカラムDNアーゼ処置を用い、RNeasy Miniキット(Qiagen,Inc.,Valencia CA カタログ番号74104)キットをメーカーの説明書に従って使用して、細胞を各種の処置時間にRNA単離のために溶解させた。260nmにおける吸光度を測定することによってRNAを定量した。
リアルタイムPCRを、全RNA0.4〜1ugをテンプレートとして使用する第1鎖cDNA合成によって、ゲノムDNA消失ステップを用いるRT2第1鎖合成キット(SABiosciences.,Frederick、MD、カタログ番号C−03)をメーカーの推奨に従って用いて行った。第1鎖合成からの生成物を水で希釈して、SYBRグリーン・マスター・ミックス(SABiosciences.,Frederick MD、カタログ番号PA−010−12)と混合し、共通経路内で連結された84種類の異なる遺伝子、正規化に使用される5種類のハウスキーピング遺伝子、逆転写およびPCR対照を含有するPCRアレイ上に添加した。リアルタイムPCRをBiorad Cfx96に対して実行した。酵素を活性化させるホットスタートによって増幅を開始し、それぞれ(95℃−15秒変性ステップおよび60℃−1分アニーリングおよび伸長ステップ)の40サイクルがに続き、溶融曲線プログラムが続いた。Ct値(全ての処置群についてのPCRサーモサイクラーによる出力)をエクセルシートにまとめ、http://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php.で入手できる比較分析ソフトウェアにロードした。
ミトコンドリア濃縮試料の精製:
実験詳細事項:100μM Q10によって24または48時間処置されたSKMEL−28細胞、NCI−ES0808細胞およびNIH−3T3細胞を、t=0にて収集された細胞と共に、T160フラスコから洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離して、ペレット化し、急速凍結させ、ミトコンドリアが単離されるまで−80℃にて貯蔵した。細胞ペレットを解凍して、再懸濁させ、ダウンスホモジナイザで破砕した。ホモジネートを遠心分離して、培養細胞用ミトコンドリア単離キット(Mitochondria Isolation kit for Cultured cells)(MitoSciences,Eugene OR、カタログ番号MS852)によって推奨された試薬およびプロトコールを使用してミトコンドリアを単離した。ミトコンドリア画分をアリコートし、−80℃で保存した。
実験詳細事項:100μM Q10によって24または48時間処置されたSKMEL−28細胞、NCI−ES0808細胞およびNIH−3T3細胞を、t=0にて収集された細胞と共に、T160フラスコから洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離して、ペレット化し、急速凍結させ、ミトコンドリアが単離されるまで−80℃にて貯蔵した。細胞ペレットを解凍して、再懸濁させ、ダウンスホモジナイザで破砕した。ホモジネートを遠心分離して、培養細胞用ミトコンドリア単離キット(Mitochondria Isolation kit for Cultured cells)(MitoSciences,Eugene OR、カタログ番号MS852)によって推奨された試薬およびプロトコールを使用してミトコンドリアを単離した。ミトコンドリア画分をアリコートし、−80℃で保存した。
コエンザイムQ10およびユビキノール−10の定量方法:
コエンザイムQ10(Q10)および還元型ユビキノール−10(Q10H2)の同時決定の方法は、最近公開された方法(Ruiz−Jimenez,2007,J.Chromatogr.A,1175,242−248)に基づいて、LC−MS/MSを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化(ESI)と共に使用することによって行った。Q10およびQ10H2の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。100μM Q10によって処置されたSK−MEL−28からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量を、タンパク質沈殿(1−プロパノール300μl中で超音波処理された充填細胞100μl)、液液抽出(上清に水100μlを添加して、X3をn−ヘキサン200μlで抽出する)、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および95:5メタノール/ヘキサン(v/v)50μlでの再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。分析は、Prism RP 1×100mm、5μm粒径カラムを備えたWaters Quattro II 3連4重極質量分析計(Keystone Scientific)でのLC−MS/MSによった。流速50μl/分での20%イソプロピルアルコール80%メタノール中の4mMギ酸アンモニウムによる定組成溶離。各試料10μlを注入した。MRM分析は、m/z882.7>197.00(Q10H2)およびm/z880.80>197.00(Q10)トランジションをコーン電圧40および衝突エネルギー30と共に使用して遂行した。
コエンザイムQ10(Q10)および還元型ユビキノール−10(Q10H2)の同時決定の方法は、最近公開された方法(Ruiz−Jimenez,2007,J.Chromatogr.A,1175,242−248)に基づいて、LC−MS/MSを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化(ESI)と共に使用することによって行った。Q10およびQ10H2の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。100μM Q10によって処置されたSK−MEL−28からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量を、タンパク質沈殿(1−プロパノール300μl中で超音波処理された充填細胞100μl)、液液抽出(上清に水100μlを添加して、X3をn−ヘキサン200μlで抽出する)、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および95:5メタノール/ヘキサン(v/v)50μlでの再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。分析は、Prism RP 1×100mm、5μm粒径カラムを備えたWaters Quattro II 3連4重極質量分析計(Keystone Scientific)でのLC−MS/MSによった。流速50μl/分での20%イソプロピルアルコール80%メタノール中の4mMギ酸アンモニウムによる定組成溶離。各試料10μlを注入した。MRM分析は、m/z882.7>197.00(Q10H2)およびm/z880.80>197.00(Q10)トランジションをコーン電圧40および衝突エネルギー30と共に使用して遂行した。
実施例3:CoQ10に対する株化細胞の感受性
いくつかの株化細胞のQ10に対する感受性を、適用の24時間後に2種類の染料、7AADおよびアネキシン−V−PEの組み合わせを含有する試薬(ネキシン試薬)を使用することによって試験した。7AAD染料は、透過性細胞膜によって細胞;主に後期アポトーシスにある細胞の中に進入するであろう。アネキシン−V−PEは、早期アポトーシス細胞の原形質膜の外面に露出されたホスファチジル(Phosphotidyl)セリンに結合する染料である。それゆえネキシン試薬を使用して、フローサイトメータでアポトーシス細胞の異なる集団を区別することができる。
いくつかの株化細胞のQ10に対する感受性を、適用の24時間後に2種類の染料、7AADおよびアネキシン−V−PEの組み合わせを含有する試薬(ネキシン試薬)を使用することによって試験した。7AAD染料は、透過性細胞膜によって細胞;主に後期アポトーシスにある細胞の中に進入するであろう。アネキシン−V−PEは、早期アポトーシス細胞の原形質膜の外面に露出されたホスファチジル(Phosphotidyl)セリンに結合する染料である。それゆえネキシン試薬を使用して、フローサイトメータでアポトーシス細胞の異なる集団を区別することができる。
PaCa2細胞は、50μM Q10および100μM Q10によりQ10適用の24時間後に、早期および後期アポトーシス細胞の両方で上昇を示した(ゲート細胞の5〜10%の間)。PC−3細胞も、50μMおよび100μM Q10によって早期および後期アポトーシス集団で上昇を示したが、上昇はPaCa2細胞と比較して小さかった。MCF−7およびSK−MEL28細胞は50μMおよび100μM Q10によって、早期アポトーシス集団のみで上昇を示した。HepG2細胞も50μM Q10処置に感受性であり、後期アポトーシスステージおよび早期アポトーシスステージに集まったゲート細胞の約20%の上昇があった。SKBr3は、50μMまたは100μM Q10処置のどちらによっても早期および後期アポトーシスで大きな上昇を少しも示さなかった、試験した中で唯一の株化細胞であった。結果を図1〜6に示す。
Q10処置がHepG2肝臓癌細胞でアポトーシス応答を引き起こすことをさらに確認するために、第2のアポトーシスアッセイを、単鎖DNAを測定するApoStrand(商標)ELISAベース法を使用して評価した。ApoStrand(商標)ELISAは、アポトーシス細胞中のDNAのホルムアミド変性に対する感受性および単鎖DNA(ssDNA)に対するモノクローナル抗体による変性DNAの検出に基づく。肝臓癌株化細胞HepG2の50および100μM Q10による処置は、それぞれ17%および32%の用量応答で検出可能なアポトーシスを生じた(図7)。これらの結果は、他の組織からの他の癌株化細胞(例えばSCC、SKMEL−28、MCF−7、およびPC−3)においてアポトーシスを誘導するQ10の観察結果と一致する。
実施例4:Q10によって処置した細胞のプロテオミクス分析
Q10によって処置した試料の細胞ペレットをプロテオミクス法によって分析した。細胞ペレットを溶解させて、2次元ゲルおよびウェスタンブロット分析で使用するために処置した。3つの細胞タイプ(SKMEL−28、SCC、およびnFib)をQ10によって処置して、2次元ゲル電気泳動によるプロテオミクスキャラクタリゼーションに供した。
Q10によって処置した試料の細胞ペレットをプロテオミクス法によって分析した。細胞ペレットを溶解させて、2次元ゲルおよびウェスタンブロット分析で使用するために処置した。3つの細胞タイプ(SKMEL−28、SCC、およびnFib)をQ10によって処置して、2次元ゲル電気泳動によるプロテオミクスキャラクタリゼーションに供した。
Q10によって処置したSKMEL−28細胞のプロテオミクス分析
ウェスタンブロットおよび2次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第1の実験セットは、皮膚癌株化細胞SKMEL−28であった。本実験セットは、0、50または100μM Q10によって3、6、12、および24時間処置されたSK−MEL−28細胞を包含していた。
ウェスタンブロットおよび2次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第1の実験セットは、皮膚癌株化細胞SKMEL−28であった。本実験セットは、0、50または100μM Q10によって3、6、12、および24時間処置されたSK−MEL−28細胞を包含していた。
Q10処置SK−MEL−28試料のセットを、2次元ゲル電気泳動に供し(図8)、対照試料に対するタンパク質レベルの変化を同定するために分析した。すべての24時間ゲルにわたる943スポットの比較分析を遂行して、対照試料を処置試料すべてに対して比較した。分析は、上昇、低下、または翻訳後修飾による、時間経過にわたるスポット変化の同定を含んでいた。
分析は、32の統計的に有意な示差的スポット変化を見出した。これより、20個の非冗長性スポットを切除して、トリプシン消化によるタンパク質同定および質量分析キャラクタリゼーションに供した。キャラクタリゼーションされたペプチドをMascot and MSRATソフトウェア分析を用いてタンパク質データベースで検索して、タンパク質を同定した(表2)。
本実験の主要な発見は、トランスアルドラーゼ1の減少であり、このことはQ10が癌細胞内の代謝状態を改変することにより作用するという前提を裏付けた。トランスアルドラーゼ1は、ペントースリン酸経路(ヘキソースモノリン酸分路としても公知)中の酵素である。トランスアルドラーゼ(EC:2.2.1.2)は、3炭素ケトールユニットのセドヘプツロース7−リン酸からグリセルアルデヒド3−リン酸への可逆的移動を触媒して、エリトロース4−リン酸およびフルクトース6−リン酸を形成する。本酵素は、トランスケトラーゼと共に、解糖経路とペントース−リン酸経路との間に連結を提供する。このことはヌクレオチドおよびNADPH合成に関連しており、生合成反応のための還元等価物の産生および還元環境の維持を容易にする。
最近の刊行物(Basta,P.,et.al.August 2008,Cancer Detect Prevention,32,200−208)は、トランスアルドラーゼにおける遺伝的多型の証拠を提供し、頭部および頸部の扁平上皮細胞癌腫に結び付けられた。最近の別の刊行物(Qian,Y.,et.al.May 2008,Biochem J,415,123−134)は、ミトコンドリアホメオスタシスのモジュレーターとしてのトランスアルドラーゼの欠乏、Ca2+流入およびアポトーシスを同定した。
これらの初期の結果から、SK−MEL−28細胞中でQ10によって調節されているような、2次元ゲル電気泳動によって同定された残りのタンパク質を公知の関係について分析した(図9)。これらのタンパク質の機能性評価は、14−3−3−媒介シグナル伝達に関与する群(PDCP6IP、YWHAZ、およびVIM)が、多種多様のプロセス[細胞周期;ペントースリン酸経路(TALDO1);セラミドシグナル伝達(CTSD);アミノアシル−tRNA生合成(GARS)、およびミトコンドリアタンパク質インポート(TOM22)]に結び付けられた個別のタンパク質と共にあることを明らかにした。
Q10によって処置したSCC細胞のプロテオミクス分析
別の皮膚癌株化細胞の扁平上皮細胞癌腫(SCC)も調製して、前のSK−MEL−28分析の追跡実験として、2次元ゲル電気泳動によって分析した。SCC細胞を100μM Q10によって、収集前に6時間または24時間処置した。未処置細胞の対照も収集した。細胞ペレットを溶解させ、試料を2次元電気泳動に供した(2通り)。比較試験での600個を超えるタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を6時間および24時間処置に対して比較した。
別の皮膚癌株化細胞の扁平上皮細胞癌腫(SCC)も調製して、前のSK−MEL−28分析の追跡実験として、2次元ゲル電気泳動によって分析した。SCC細胞を100μM Q10によって、収集前に6時間または24時間処置した。未処置細胞の対照も収集した。細胞ペレットを溶解させ、試料を2次元電気泳動に供した(2通り)。比較試験での600個を超えるタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を6時間および24時間処置に対して比較した。
上位25の統計的に有意な示差的スポット変化を2次元電気泳動ゲルの比較分析から評価した。これより、20個のスポットを切除して、トリプシン消化による同定および質量分析キャラクタリゼーションに供した(結果を下の表3にまとめる)。
トランスアルドラーゼ1:Q10で処置したSKMEL−28細胞で先に観察されたように、酵素トランスアルドラーゼ1はレベルの低下によって調節された。これは、Q10とトランスアルドラーゼの改変(およびそれゆえ細胞の代謝状態)との連関についての以前の観察結果を独立して確証するものである。
トランスアルドラーゼは、ペントースリン酸経路の非酸化的段階における酵素である(図10)。ペントースリン酸経路は、還元的生合成のためのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(還元型NADH)の発生のための細胞の代謝状態において、ならびにATP、DNA、およびRNAの必須構成要素であるリボースの形成において重要である。トランスアルドラーゼはまた、ペントースリン酸経路を解糖に連結する。解糖は、酸化的リン酸化のミトコンドリアプロセスが利用されないため、癌細胞が細胞生存に必要なエネルギーを取得する代謝経路である。Q10は、酸化的リン酸化およびミトコンドリアATP産生に必要とされる必須のコエンザイム因子である。
BSCv:スポット23は、BSCvという名称の、染色体20からの新規ヒトタンパク質であった。BSCvタンパク質は、脂肪細胞血漿膜結合型タンパク質(遺伝子名:APMAPまたはC20orf3)としても公知であり、タンパク質のストリクトシジン・シンターゼ・ファミリーに配列類似性を有するシングルパスII型膜タンパク質であることが予測されている。Q10処置は、本タンパク質のレベルの低下を引き起こした。本タンパク質は、十分に特徴付けもされておらず、ストリクトシジンシンターゼとのその相同性も確認されてもいない。興味深いことに、本タンパク質は脂肪細胞分化の役割に関連してきた(Albrektsen et al.,2001)。ヒト大網脂肪組織の最近のプロテオミクス研究はBSCvを、病的肥満女性による多嚢胞性(polcystic)卵巣症候群(PCOS)の差次的発現を有する9種類のタンパク質のうちの1つとして同定した(Corton,2008 Hum.Reprod.23:651−661に概説されている)。Q10に応答する細胞表面タンパク質としてのBSCvに対する抗体は、バイオマーカーとして有用であろう。現在の結果および入手可能な文献に基づいて、BSCvは癌および糖尿病で潜在的な役割を有し得る。
NM23A:非転移性細胞1タンパク質(NM23A、NME1としても公知)は、転移サプレッサーとであると考えられる。本遺伝子(NME1)は、高転移性細胞におけるその低下したmRNA転写レベルのために同定された。該タンパク質は、ヌクレオシド2リン酸キナーゼ(NDK)としての活性を有し、「A」アイソフォーム(本遺伝子によりコードされた)および「B」アイソフォーム(NME2によりコードされた)で構成されたヘキサマーとして存在する。本遺伝子における突然変異は、侵襲性神経芽細胞腫において同定されている。NDK活性は、例えばクエン酸(クレブス)回路で産生されたGTPがATPに変換されるときなどに、異なるヌクレオシド3リン酸の濃度の間で平衡を維持する。NDK複合体は、STRAPとの相互作用を通じてp53に関連している。STRAPがHNF4Aに連結されていることは注目に値する。それゆえNM23Aは、細胞制御および疾患治療に重要な経路に関与する潜在的タンパク質である。
Rho GDP解離阻害剤(GDI)アルファ:GDIは、Rhoタンパク質からのGDPの解離、および続いてのRhoタンパク質へのGTPの結合を阻害することによって、RhoタンパクのGDP/GTP交換反応を調節する。該タンパク質は、癌細胞において上方調節される。
実施例5:ミトコンドリア濃縮分析
複数の一連の証拠は、ミトコンドリアタンパク質の役割および癌生物学およびQ10応答のより綿密な評価が正当化されることを示唆した。第1に、正常細胞におけるエネルギー産生のためのミトコンドリア酸化的リン酸化プロセスには、Q10の不可欠の役割がある。しかし、癌細胞に出現するのは、Q10を必要としない解糖の代わりの経路によるエネルギー産生への代謝シフトである。第2に、細胞のアポトーシス応答は、ミトコンドリアタンパク質の出現を必要とする。Q10は、癌細胞における刺激アポトーシスとして樹立されてきた(Bcl−2ファミリータンパク質、シトクロムc)。最後に、ミトコンドリアインポート受容体タンパク質TOM22のタンパク質レベルの調節によって例示されるように(本明細書に記載する実験を参照)、新たなミトコンドリアタンパク質がQ10処置によって調節されていることが同定された。
複数の一連の証拠は、ミトコンドリアタンパク質の役割および癌生物学およびQ10応答のより綿密な評価が正当化されることを示唆した。第1に、正常細胞におけるエネルギー産生のためのミトコンドリア酸化的リン酸化プロセスには、Q10の不可欠の役割がある。しかし、癌細胞に出現するのは、Q10を必要としない解糖の代わりの経路によるエネルギー産生への代謝シフトである。第2に、細胞のアポトーシス応答は、ミトコンドリアタンパク質の出現を必要とする。Q10は、癌細胞における刺激アポトーシスとして樹立されてきた(Bcl−2ファミリータンパク質、シトクロムc)。最後に、ミトコンドリアインポート受容体タンパク質TOM22のタンパク質レベルの調節によって例示されるように(本明細書に記載する実験を参照)、新たなミトコンドリアタンパク質がQ10処置によって調節されていることが同定された。
ミトコンドリア濃縮試料の産生
皮膚癌SKMEL−28細胞を100μM Q10または偽ビヒクルによって6、19、または48時間にわたって処置した。細胞をT−160フラスコ(各時点ごとに4個)から洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離によって採取し、ペレットを急速凍結させて−80℃にて貯蔵した。細胞ペレットを再懸濁させ、2mLダウンスホモジナイザを使用して破砕した。試薬および方法は、培養細胞用ミトコンドリア単離キット(MitoSciences,カタログ番号MS852)から取得した。結果として生じたミトコンドリア試料一定分量75μL(1試料に付き、4〜5個の一定分量)に分け、−80℃にて貯蔵した。
皮膚癌SKMEL−28細胞を100μM Q10または偽ビヒクルによって6、19、または48時間にわたって処置した。細胞をT−160フラスコ(各時点ごとに4個)から洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離によって採取し、ペレットを急速凍結させて−80℃にて貯蔵した。細胞ペレットを再懸濁させ、2mLダウンスホモジナイザを使用して破砕した。試薬および方法は、培養細胞用ミトコンドリア単離キット(MitoSciences,カタログ番号MS852)から取得した。結果として生じたミトコンドリア試料一定分量75μL(1試料に付き、4〜5個の一定分量)に分け、−80℃にて貯蔵した。
Q10によって処置されたSK−MEL−28細胞から単離されたミトコンドリア濃縮試料のプロテオミクス分析
2次元ゲル電気泳動は、100μM Q10によって6、19、および48時間処置されたSK−MEL−28ミトコンドリア濃縮試料に2個の一定分量から溶解されたタンパク質に対して(対応する偽ビヒクル対照と共に)遂行した。試料を2次元電気泳動に供した(2通り)。525個のタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を残りの時点の試料に対して比較した(図11)。
2次元ゲル電気泳動は、100μM Q10によって6、19、および48時間処置されたSK−MEL−28ミトコンドリア濃縮試料に2個の一定分量から溶解されたタンパク質に対して(対応する偽ビヒクル対照と共に)遂行した。試料を2次元電気泳動に供した(2通り)。525個のタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を残りの時点の試料に対して比較した(図11)。
アシル−CoAチオエステラーゼ7:アシル−CoAチオエステラーゼ7(ACOT7)は、脂肪アシル−CoAの遊離脂肪酸およびCoAの加水分解を触媒する酵素ファミリーのメンバである。本酵素はそれゆえ、脂質代謝および細胞シグナル伝達の調節に役割を果たす。ACOT7は、8〜16個の炭素原子(C8−C16)の脂肪酸鎖を有する長鎖アシルCoA基質に対する選択性を有する。ACOT7における正確な細胞機能は、十分に理解されていない。本遺伝子の転写は、ステロール調節要素結合タンパク質2によって活性化され、それゆえコレステロール代謝における機能を示唆する。
本実施例の結果は、ACOT7がQ10の代謝に直接または間接的に潜在的に関与することを指摘する。それゆえターゲティングACOT7は、Q10の細胞間レベルの調節を促進して、それゆえ細胞Q10効果に影響を及ぼすことができる。
ピルビン酸キナーゼ:ピルビン酸キナーゼは、解糖の最後のステップに関与する酵素である。ピルビン酸キナーゼは、ホスホエノールピルビン酸(PEP)からADPへのリン酸基の移動を触媒して、ピルビン酸1分子およびATP1分子を産する。
タンパク質は、これがミトコンドリア濃縮SK−MEL−28試料から同定されたので、おそらく2型アイソフォームのPKM2のタンパク質である。本アイソフォームは、腫瘍細胞形成および調節に関与することが周知である。
ミトコンドリアにおけるQ10レベルの定量
コエンザイムQ10(Q10)および還元型ユビキノール−10(Q10H2)の同時決定の方法は、最近公開された方法(Ruiz−Jimenez,2007,J.Chroma A,1175,242−248)に基づいて、LC−MS/MSを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化(ESI)と共に使用することによって実行した。Q10およびQ10H2の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。100μM Q10によって処置されたSK−MEL−28からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量を、タンパク質沈殿、液液抽出、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および95:5メタノール/ヘキサン(v/v)での再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。
コエンザイムQ10(Q10)および還元型ユビキノール−10(Q10H2)の同時決定の方法は、最近公開された方法(Ruiz−Jimenez,2007,J.Chroma A,1175,242−248)に基づいて、LC−MS/MSを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化(ESI)と共に使用することによって実行した。Q10およびQ10H2の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。100μM Q10によって処置されたSK−MEL−28からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量を、タンパク質沈殿、液液抽出、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および95:5メタノール/ヘキサン(v/v)での再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。
本分析において、Q10、Q10H2、およびQ9を定量した(表5)。関連する分子Q9のレベルは低く、検出レベル付近であった。未処置試料のレベルは、この同じレベルを有する6時間Q10処置試料と比較的一致していた。全材料の試料分散を制御するために、コレステロールのレベルも測定して、差が試料サイズ誤差によるものでないことを確認した。Q10レベルが同じミトコンドリア調製物の他の一定分量のタンパク質抽出によって取得された全タンパク質値に対して補正されたときに、相対比は比較可能であった。それゆえQ10レベルの著しい上昇が19時間後に得られ(約3倍)、48時間時点までになお大きな上昇(約6倍)が得られた(図12)。
本試験からの驚くべき結果は、Q10が酸化型として細胞に供給されるという発見であった。48時間試料では、還元型Q10H2も測定され、著しく低い量で存在することが見出された(CoQ10 46.63ng/試料と比較して、CoQ10H2 0.28ng/試料)。Q10処置48時間試料においてQ10H2のレベルの一般的な上昇(3倍)があったが、レベルはアッセイの推定検出限界付近であった。興味深いことに、酸化型(Q10)は、生物系において酸化エンハンサーとして作用することができる。文献によれば、ヒト血漿をQ10およびQ10H2を評価したとき、分子の大部分(90%)は、抗酸化剤として作用することができる、Q10H2の還元型で見出された(Ruiz−Jimenez,2007,J.Chroma A,1175,242−248)。
それゆえこれらの結果は、培地へのQ10の外部からの添加時にQ10のレベルがミトコンドリア中で上昇することを確認および定量する。驚くべきおよび予想外の発見は、Q10がいずれの著しい量でも供給された酸化型(酸化促進)で維持されて、Q10H2の還元(抗酸化)型に変化されないことであった。
実施例6:リアルタイムPCRアレイ
実験1:アポトーシスアレイ
実施例3で上述したように、癌細胞のQ10への曝露は、アポトーシスプロセスによりこれらの細胞の部分に死を誘導する。Q10応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法を用いて、アポトーシスにターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子/タンパク質についてのmRNAのレベルの変化を同定した。
実験1:アポトーシスアレイ
実施例3で上述したように、癌細胞のQ10への曝露は、アポトーシスプロセスによりこれらの細胞の部分に死を誘導する。Q10応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法を用いて、アポトーシスにターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子/タンパク質についてのmRNAのレベルの変化を同定した。
それゆえPCRアレイをスクリーニングツールとして使用して、細胞内のQ10の生物学的作用の様式への洞察を潜在的に供給する一連の分子ターゲットを評価した。80の経路特異的ターゲットを含有する事前に選択されたサブセットのmRNAレベルを影響評価するためのリアルタイムPCR定量を使用して、mRNAの変化を評価した。
mRNA結果の解釈のために、そのmRNA転写が2倍のレベルで改変された遺伝子を同定および評価した。mRNAのみを産生する遺伝子転写のレベルは、発現されたタンパク質のレベルの潜在的な変化の大まかな推定値を提供する。当業者は、各mRNAが非効率的なことに、mRNAの分解またはその翻訳で異なる速度を有し得て、それゆえ異なる量のタンパク質を生じることを認識するであろう。
50um Q10によって24時間処置したSkBr−3細胞
RT−PCRのアッセイ方法を利用して、合計84のアポトーシス経路関連タンパク質に対するmRNAレベルの変化の尺度を提供した。Q10(24時間)を用いた、SkBr3に対するリアルタイムPCRアポトーシス分析による実験は、以下のmRNA:Bcl2、Bcl2L1、Bcl2L11、Birc6、Bax、Xiap、Hprt1、Apaf1、Abl1、Brafが影響されていることを同定した。これらの結果は再度、Q10処置に対する癌細胞のアポトーシス応答を裏付ける証拠を提供した。
RT−PCRのアッセイ方法を利用して、合計84のアポトーシス経路関連タンパク質に対するmRNAレベルの変化の尺度を提供した。Q10(24時間)を用いた、SkBr3に対するリアルタイムPCRアポトーシス分析による実験は、以下のmRNA:Bcl2、Bcl2L1、Bcl2L11、Birc6、Bax、Xiap、Hprt1、Apaf1、Abl1、Brafが影響されていることを同定した。これらの結果は再度、Q10処置に対する癌細胞のアポトーシス応答を裏付ける証拠を提供した。
SK−MEL−28細胞による3つの独立した実験からの一致した結果を下の表6Bにまとめる。100μM Q10処置により多くの遺伝子は、SCC細胞において同様に調節される。SCC細胞で調節されると思われるアポトーシスアレイの遺伝子を表7に記載する。我々は、多くの遺伝子がSK−MEL−28細胞およびSCC細胞の両方で6時間後に調節されていることを見出している。24時間までに調節は低下する。SK−MEL−28細胞およびSCC細胞の両方で調節されると思われる遺伝子を表8に記載する。
興味深いことに、改変されたmRNAレベルは、一連のアポトーシスタンパク質において著しい上方調節を示し、Bcl−xlは最も高いものの1つであった。これはSK−MEL−28細胞に対するタンパク質アレイ実験でも観察された。
Bcl−xlは、ミトコンドリア中の膜貫通分子である(Bcl−xlは「基底細胞リンパ腫−特大」を表す)。Bcl−xlは、FAS−Lのシグナル伝達経路に関与し、タンパク質のBcl−2ファミリーのメンバである複数の抗アポトーシスタンパク質の1つである。Bcl−xlは、癌細胞の生存に関わってきた。しかし、ヒトBcl−xmRNAの選択的スプライシングが少なくとも2種類の別個のBcl−xmRNA種、Bcl−xLおよびBcl−xSを生じ得ることが公知である。優勢なタンパク質生成物(233アミノ酸)は、成長因子除去時に細胞死を阻害する、より大型のBcl−x mRNAであるBcl−xLである(Boise et al.,1993.Cell74,597−608)。他方では、Bcl−xSは、Bcl−2が細胞死を阻害する能力を阻害して、細胞をアポトーシス細胞死に対して感受性にする。利用した使用アッセイは、どのBcl−xのアイソフォームが上方調節されているかを識別しない。これらの研究でCoQによって上方調節されているBcl−xアイソフォームは、当分野で公知の所定の方法によって、例えばRT−PCR方法を使用することによって決定され、2種類のmRNAスプライシングアイソフォームの比(Bcl−xL対Bcl−sL)が評価され得る。
アポトーシス関連タンパク質の調査から、複数のアポトーシス促進因子および抗アポトーシス因子がBCL−2ファミリー中にあること、またはこれらの因子と相互作用するタンパク質が発現レベルを調節したこと(BCL2L11、BNIP2、BAG1、HRK、BAK1、BCL2、BCL2L1)が観察された。これらのタンパク質は、ミトコンドリア外膜透過を支配する。
アポトーシス応答の早期マーカーは、カスパーゼ3/7タンパク質によるアポトーシスの以前の観察結果と一致する、カスパーゼ−9の上方調節(16時間)によって観察される。ストレスシグナル伝達経路の誘導は、ミトコンドリアからのシトクロムcの放出およびapaf−1(アポトソーム)の活性化を引き起こし、次にカスパーゼ−9のプロ酵素を切断して活性型とする。いったん開始されると、カスパーゼ−9はプロカスパーゼ−3およびプロカスパーゼ−7の切断を進めて、追加のアポトーシス経路を始動させる。
調節されているタンパク質の腫瘍壊死因子受容体ファミリーへの一貫した連結もある。
腫瘍タンパク質p73の強力な下方調節も注目される。乳癌および卵巣癌を含む、ヒトに見出される多くの腫瘍の分析は通例、対応する範囲において正常な組織と比較したときに、p73の高い発現を示す。最近の発見は、哺乳動物細胞において細胞周期制御およびDNAの合成に関与する体内の転写因子(すなわち:E2F−1)の調節解除された過剰発現がp73の発現を誘導することを示唆している。該示唆は、p73は腫瘍性タンパク質であり得るが、関連するp53タンパク質とは異なる機構を包含し得ることである。アポトーシス経路のマッピングを示す概略図を図13に示す。
SKMEL−28細胞
アポトーシス関連タンパク質の調査から、複数のアポトーシス促進因子および抗アポトーシス因子がBCL−2ファミリー中にあること、またはこれらの因子と相互作用するタンパク質が発現レベルを調節したこと(BCL2L11、BNIP2、BAG1、HRK、BAK1、BCL2、BCL2L1)が観察された。これらのタンパク質は、ミトコンドリア外膜透過を支配する。
アポトーシス関連タンパク質の調査から、複数のアポトーシス促進因子および抗アポトーシス因子がBCL−2ファミリー中にあること、またはこれらの因子と相互作用するタンパク質が発現レベルを調節したこと(BCL2L11、BNIP2、BAG1、HRK、BAK1、BCL2、BCL2L1)が観察された。これらのタンパク質は、ミトコンドリア外膜透過を支配する。
アポトーシス応答の早期マーカーは、カスパーゼ3/7タンパク質によるアポトーシスの以前の観察結果と一致する、カスパーゼ−9の上方調節(16時間)によって観察される。ストレスシグナル伝達経路の誘導は、ミトコンドリアからのシトクロムcの放出およびapaf−1(アポトソーム)の活性化を引き起こし、次にカスパーゼ−9のプロ酵素を切断して活性型とする。いったん開始されると、カスパーゼ−9はプロカスパーゼ−3およびプロカスパーゼ−7の切断を進めて、追加のアポトーシス経路を始動させる。
調節されているタンパク質の腫瘍壊死因子受容体ファミリーへの一貫した連結がある。
腫瘍タンパク質p73の強力な下方調節も注目される。乳癌および卵巣癌を含む、ヒトに見出される多くの腫瘍の分析は通例、対応する範囲において正常な組織と比較したときに、p73の高い発現を示す。最近の発見は、哺乳動物細胞において細胞周期制御およびDNAの合成に関与する体内の転写因子(すなわち:E2F−1)の調節解除された過剰発現がp73の発現を誘導することを示唆している。該示唆は、p73は腫瘍性タンパク質であり得るが、関連するp53タンパク質とは異なる機構を包含し得ることである。
実験2:酸化ストレスおよび抗酸化防御アレイを使用するリアルタイムPCRアレイ
Q10応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法を用いて、酸化ストレスおよび抗酸化防御にターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子/タンパク質についてのmRNAのレベルの変化を同定した。
Q10応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法を用いて、酸化ストレスおよび抗酸化防御にターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子/タンパク質についてのmRNAのレベルの変化を同定した。
下の表10は、100μM Q10処置によりSK−MEL28細胞で調節される遺伝子を挙げる。結果は、2つの独立した実験で調節されるこのような遺伝子のみについて与える。6時間では著しい量の遺伝子調節が見られるが、48時間ではRNAレベルの最も著しい変化が見られる。
好中球サイトゾル因子2(NCF2、65kDa、慢性肉芽腫性疾患、常染色体2)は、初期トップ誘導mRNAの1つであった(6時間にて観察された)。続いて16時間の時点以降、好中球サイトゾル因子1(NCF1)(慢性肉芽腫性疾患、常染色体1)は、初期誘導相後に非常に高レベルで誘導された。
好中球サイトゾル因子2は、好中球に普通見出されるNADPHオキシダーゼとして公知の多タンパク質複合体のサイトゾルサブユニットである。本オキシダーゼは、好中球食胞の内腔に送達されるスーパーオキシドのバーストを産生する。
NADPHオキシダーゼ(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ)は、膜結合酵素複合体である。NADPHオキシダーゼは、原形質膜ならびに食胞の膜に見出すことができる。NADPHオキシダーゼは、原形質膜ならびに食胞の膜に見出すことができる。これは6つのサブユニットで構成されている。これらのサブユニットは: 1つのRhoグアノシントリホスファターゼ(GTPアーゼ)、通常Rac1またはRac2(Racは、Rho関連C3ボツリヌス毒素基質を表す)
・5つの「phox」ユニット(Phoxは、食細胞オキシダーゼを表す。)
○ P91−PHOX(ヘムを含有する)
○ p22phox
○ p40phox
○ p47phox(NCF1)
○ p67phox(NCF2)
別のNADPHオキシダーゼレベルが変化しないことに注目される。酵素は、スーパーオキシドを発生して、Ca(2+)依存性方式でH+チャネルとして機能する新規NADPHオキシダーゼである、NOX5である。
・5つの「phox」ユニット(Phoxは、食細胞オキシダーゼを表す。)
○ P91−PHOX(ヘムを含有する)
○ p22phox
○ p40phox
○ p47phox(NCF1)
○ p67phox(NCF2)
別のNADPHオキシダーゼレベルが変化しないことに注目される。酵素は、スーパーオキシドを発生して、Ca(2+)依存性方式でH+チャネルとして機能する新規NADPHオキシダーゼである、NOX5である。
加えて、ホスファチジルイノシトール3,4,5−3リン酸依存性RAC交換因子1(PREX1)も上方調節された。本タンパク質は、小型GTP結合タンパク質(RAC)のRHOファミリーのグアニンヌクレオチド交換因子として作用する。結合されているGDPを遊離GTPと交換することによって、RAC1を結合および活性化することが示されてきた。主に細胞質で見出されるコードされたタンパク質は、ホスファチジルイノシトール−3,4,5−3リン酸およびヘテロトリマーGタンパク質のベータガンマサブユニットによって活性化される。
第2の主な早期誘導タンパク質は、一酸化窒素シンターゼ2A(誘導性、肝細胞)(NOS2A)であった。一酸化窒素は、神経伝達ならびに抗菌および抗腫瘍活性を含む複数のプロセスにおいて、生物学的媒介物として作用する反応性遊離ラジカルである。本遺伝子は、肝臓で発現され、リポ多糖類およびあるサイトカインの併用によって誘導可能である一酸化窒素シンターゼをコードする。
スーパーオキシドディスムターゼ2、ミトコンドリア(SOD2)は、鉄/マンガンスーパーオキシドディスムターゼファミリーのメンバである。これはホモテトラマーを形成し、サブユニットに付きマンガンイオン1個を結合するミトコンドリアタンパク質をコードする。本タンパク質は、酸化的リン酸化のスーパーオキシド副生成物に結合して、これらを過酸化水素および2原子酸素に変換する。本遺伝子の突然変異は、関連する特発性心筋症(IDC)、早期老化、散発性運動ニューロン疾患、および癌に関連してきた。
下方調節されたタンパク質の例は、内因性FOXM1発現がS期およびG2/M期にピークに達する細胞周期進行で主要な役割を果たすことが公知である、フォークヘッドボックスM1(FOXM1)である。最近の研究は、G2/M特異的遺伝子、例えばPlk1、サイクリンB2、Nek2およびCENPFの大型アレイの発現を調節して、染色体分離およびゲノム安定性の維持において重要な役割を果たすことを示している。FOXM1遺伝子は今や、ヒト癌原遺伝子として公知である。FOXM1の異常な上方調節は、基底細胞癌腫(BCC)の腫瘍形成に関与している。FOXM1上方調節は続いて、肝臓、乳房、肺、前立腺、子宮頸部、結腸、膵臓、および脳を含む、固形ヒト癌の大部分で見出された。BCCおよびQ10によるさらなる研究によってFOXM1レベルを評価すべきである。
SKMEL−28細胞
SKMEL−28細胞を使用して、さらなる実験を行った。リアルタイムPCR法(RT−PCR)を使用して、100μM Q10によって処置されたSKMEL−28細胞中に存在するmRNAのレベルを未処置細胞のレベルと各種の時点にて比較した。PCRアレイ(SABiosciences)は、経路または疾患に焦点を合せた遺伝子ならびに適切なRNA品質管理のための、96ウェルプレートでの最適化リアルタイムPCRプライマアッセイのセットである。PCRアレイは、リアルタイムPCR感度およびマイクロアレイの多遺伝子プロファイリング能力を有する遺伝子発現分析を実施する。
SKMEL−28細胞を使用して、さらなる実験を行った。リアルタイムPCR法(RT−PCR)を使用して、100μM Q10によって処置されたSKMEL−28細胞中に存在するmRNAのレベルを未処置細胞のレベルと各種の時点にて比較した。PCRアレイ(SABiosciences)は、経路または疾患に焦点を合せた遺伝子ならびに適切なRNA品質管理のための、96ウェルプレートでの最適化リアルタイムPCRプライマアッセイのセットである。PCRアレイは、リアルタイムPCR感度およびマイクロアレイの多遺伝子プロファイリング能力を有する遺伝子発現分析を実施する。
好中球サイトゾル因子2(NCF2、65kDa、慢性肉芽腫性疾患、常染色体2)は、初期トップ誘導mRNAの1つであった(6時間にて観察された)。続いて16時間の時点以降、好中球サイトゾル因子1(NCF1)(慢性肉芽腫性疾患、常染色体1)は、初期誘導相後に非常に高レベルで誘導された。
好中球サイトゾル因子2は、好中球に普通見出されるNADPHオキシダーゼとして公知の多タンパク質複合体のサイトゾルサブユニットである。本オキシダーゼは、好中球食胞の内腔に送達されるスーパーオキシドのバーストを産生する。NADPHオキシダーゼ(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ)は、膜結合酵素複合体である。NADPHオキシダーゼは、原形質膜ならびに食胞の膜に見出すことができる。これは6つのサブユニットで構成されている。これらのサブユニットは:
・1つのRhoグアノシントリホスファターゼ(GTPアーゼ)、通常Rac1またはRac2(Racは、Rho関連C3ボツリヌス毒素基質を表す)
・5つの「phox」(食細胞オキシダーゼ)ユニット
P91−PHOX(ヘムを含有する)
p22phox
p40phox
p47phox(NCF1)
p67phox(NCF2)である。
・1つのRhoグアノシントリホスファターゼ(GTPアーゼ)、通常Rac1またはRac2(Racは、Rho関連C3ボツリヌス毒素基質を表す)
・5つの「phox」(食細胞オキシダーゼ)ユニット
P91−PHOX(ヘムを含有する)
p22phox
p40phox
p47phox(NCF1)
p67phox(NCF2)である。
別のNADPHオキシダーゼレベルが変化しないことに注目される。酵素は、スーパーオキシドを発生して、Ca(2+)依存性方式でH+チャネルとして機能する新規NADPHオキシダーゼである、NOX5である。
加えて、ホスファチジルイノシトール3,4,5−3リン酸依存性RAC交換因子1(PREX1)も上方調節された。本タンパク質は、小型GTP結合タンパク質(RAC)のRHOファミリーのグアニンヌクレオチド交換因子として作用する。結合されているGDPを遊離GTPと交換することによって、RAC1を結合および活性化することが示されてきた。主に細胞質で見出されるコードされたタンパク質は、ホスファチジルイノシトール−3,4,5−3リン酸およびヘテロトリマーGタンパク質のベータガンマサブユニットによって活性化される。
第2の主な早期誘導タンパク質は、一酸化窒素シンターゼ2A(誘導性、肝細胞)(NOS2A)であった。一酸化窒素は、神経伝達ならびに抗菌および抗腫瘍活性を含む複数のプロセスにおいて、生物学的媒介物として作用する反応性遊離ラジカルである。本遺伝子は、肝臓で発現され、リポ多糖類およびあるサイトカインの併用によって誘導可能である一酸化窒素シンターゼをコードする。
下方調節されたタンパク質の例は、内因性FOXM1発現がS期およびG2/M期にピークに達する細胞周期進行で主要な役割を果たすことが公知である、FOXM1である。最近の研究は、G2/M特異的遺伝子、例えばPlk1、サイクリンB2、Nek2およびCENPFの大型アレイの発現を調節して、染色体分離およびゲノム安定性の維持において重要な役割を果たすことを示している。FOXM1遺伝子は今や、ヒト癌原遺伝子として公知である。FOXM1の異常な上方調節は、基底細胞癌腫(BCC)の腫瘍形成に関与している。FOXM1上方調節は続いて、肝臓、乳房、肺、前立腺、頸部、子宮、結腸、膵臓、および脳を含む、固形ヒト癌の大部分で見出された。
実験4:糖尿病アレイを使用するリアルタイムPCRアレイ
本実施例に記載した実験を遂行して、Q10が、複数の遺伝子に影響を有し、細胞の代謝状態を変更するであろうという仮説全体を試験した。100μM Q10によって処置したSKMEL−28細胞からのmRNAを糖尿病および関連経路に関与するターゲットタンパク質のパネルに対して評価した。本実験からの結果は、解糖経路およびインスリンプロセシングに関与する複数のタンパク質のmRNA発現レベルが改変されることを証明している(表14にまとめる)。
本実施例に記載した実験を遂行して、Q10が、複数の遺伝子に影響を有し、細胞の代謝状態を変更するであろうという仮説全体を試験した。100μM Q10によって処置したSKMEL−28細胞からのmRNAを糖尿病および関連経路に関与するターゲットタンパク質のパネルに対して評価した。本実験からの結果は、解糖経路およびインスリンプロセシングに関与する複数のタンパク質のmRNA発現レベルが改変されることを証明している(表14にまとめる)。
本初期実験の結果は、多種多様のインスリン関連タンパク質のmRNAレベルが両方向に調節されたことを示す。結果は、糖尿病の治療および/または評価に影響を有するであろうことを指摘する。
次にさらなる実験を行って、Q10によって処置したSK−MEL−28細胞から取得した上の結果を確認した。SK−MEL−28細胞中の遺伝子の多くが、Q10処置の早くも6時間後に調節されている。しかし初期調節は、16時間および24時間までにより明らかでなくなる。48時間付近で、我々は糖尿病アレイの多くの遺伝子が再度強力に調節されることを見出している。2つ以上の独立した実験からの一致した結果を下の表15にまとめる。SCC細胞もQ10処置の6時間後および24時間後の両方に、いくつかの遺伝子における調節を呈するように思われる。表16にはSCC細胞のこれらの結果をまとめ、表17にはSK−MEL−28細胞およびSCC細胞の両方で調節される遺伝子をまとめる。
多種多様のインスリン関連タンパク質のmRNAレベルが両方向に調節された。Q10は細胞代謝に対して影響を有し、それゆえ糖尿病などの代謝調節疾患に影響する。著しく調節された2種類のタンパク質について、下でさらに述べる。
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ14(MAPK14):マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ14(MAPK14)は、MAPキナーゼファミリーのメンバである。MAPキナーゼは、複数の生化学シグナルの統合点として作用し、増殖、分化、転写調節および発生などの多岐にわたる細胞プロセスに関与している。本実験の結果は、MAPK14が著しく下方調節されたことを示す。
肝細胞核因子4、アルファ(HNF4A):HNF4(肝細胞核因子4)は、肝臓発生に不可欠である肝臓、腸、腎臓、および膵臓ベータ細胞で大部分が発現される核受容体タンパク質である。ヒトにおいては、2種類の別々の遺伝子HNF4AおよびHNF4GによってそれぞれコードされたNHF4の2種類のアイソフォーム、アルファおよびガンマがある(例えばChartier FL,Bossu JP,Laudet V,Fruchart JC,Laine B(1994).“Cloning and sequencing of cDNAs encoding the human hepatocyte nuclear factor 4 indicate the presence of two isoforms in human liver”.Gene 147(2):269−72を参照)。
HNF4は当初、オーファン受容体として分類された。しかしHNF4は後に、多種多様の脂肪酸に連続的に結合されるために構成的に活性であることが見出された(例えばSladek F(2002).“Desperately seeking...something”.Mol Cell 10(2):219−221およびJump DB,Botolin D,Wang Y,Xu J,Christian B,Demeure O(2005).“Fatty acid regulation of hepatic gene transcription”.J Nutr 135(11)を参照)。 HNF4のリガンド結合ドメインは、他の核受容体と同様に、基準(canonical)アルファらせんサンドイッチフォールディングを取り(例えばWisely GB,Miller AB,Davis RG,Thornquest AD Jr,Johnson R,Spitzer T,Sefler A,Shearer B,Moore JT,Miller AB,WillsonTM,Williams SP(2002).“Hepatocyte nuclear factor 4 is a transcription factor that constitutively binds fatty acids”.Structure 10(9):1225−34およびDhe−Paganon S,Duda K,Iwamoto M,Chi YI,Shoelson SE(2002).“Crystal structure of the HNF4 alpha ligand binding domain in complex with endogenous fatty acid ligand”.J Biol Chem 277(41):37973−6を参照)、コアクチベータータンパク質と相互作用する(例えばDuda K,Chi YI,Shoelson SE(2004).“Structural basis for HNF−4alpha activation by ligand and coactivator binding”.J Biol Chem 279(22):23311−6に概説されている)。HNF4−α遺伝子の突然変異は、若年発症成人型糖尿病(MODY)と結び付けられてきた(例えばFajans SS,Bell GI,Polonsky KS(2001)“Molecular mechanisms and clinical pathophysiology of maturity−onset diabetes of the young”.N Engl J Med 345(13):971−80を参照)。
肝細胞核因子4(HNF4)は、肝細胞および膵臓細胞において多数の遺伝子を調節することが公知の組織特異的転写因子である。HNF4は腎臓のいくつかの部位で高度に発現されることが公知であるが、本器官におけるその役割についておよび腎臓細胞におけるHNF4調節遺伝子についてはほとんど知られていない。HNF4の存在量および活性は腎臓細胞癌腫(RCC)では頻繁に低下し、腎臓細胞におけるHNF4の多少の腫瘍抑制機能を示す。興味深いことに、HNF4によって調節された遺伝子の多くは、RCCマイクロアレイ試験では調節解除されることが示されている。これらの遺伝子(ACY1、WT1、SELENBP1、COBL、EFHD1、AGXT2L1、ALDH5A1、THEM2、ABCB1、FLJ14146、CSPG2、TRIM9およびHEY1)は、RCCにおけるHNF4の低下時に活性が変化する遺伝子の良好な候補である。
HNF4アルファのリガンド結合ドメインの構造において(1M7W.pdb;Dhe−Paganon(2002)JBC,277,37973);小型脂質が観察され、大腸菌産生から同時精製された。結晶はタンパク質の2種類の立体配座を含有し、ここで伸長らせん10および短らせん12が交互の立体配座を有している。脂質結合領域の検査時に、興味深いことに、2つの出口領域があることが見出された。一方の領域は小型脂質の頭基を保持して、複数のポケット領域が本出口ポートと共局在していることが注目される。仮説は、Q10が本転写因子に特異的に結合するということである。本脂質結合トンネル中にモデル化されるとき、Q10環は表面ポケット中に適合するであろう(図28)。公知の機能喪失型突然変異(E276Q)は、本表面ポケットを裏打ちするように残基を配列する潜在能を有し、それゆえ推定上のQ10結合に悪影響を有するであろう。
加えて、本Q10結合モデルによって、疎水性尾部は内部空洞から延出して、次に伸長らせん10と相互作用するであろう。それゆえ、本相互作用は、らせん10/12基の立体配座を潜在的に改変することができる。このことは次に、転写因子活性の活性化/不活性化平衡を改変し得る。
実施例7:抗体マイクロアレイ分析
Q10の存在によるタンパク質濃度の評価を、抗体マイクロアレイ法の利用によって評価した。マイクロアレイは、700超のタンパク質の抗体を含有し、広範囲のタンパク質タイプおよび潜在的な経路マーカーをサンプリングした。
Q10の存在によるタンパク質濃度の評価を、抗体マイクロアレイ法の利用によって評価した。マイクロアレイは、700超のタンパク質の抗体を含有し、広範囲のタンパク質タイプおよび潜在的な経路マーカーをサンプリングした。
Q10によって処置された細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価するための初期実験は、抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ、Sigma)および6時間または24時間処置したSK−MEL−28細胞を用いて行った。細胞を収集および抽出して、可溶性タンパク質上清を取得した。各試料(1mg/mLの)からのタンパク質の2つの分量(合計約1mg)を蛍光染料(それぞれCy3およびCy5)によってそれぞれ標識した。過剰な染料をタンパク質から除去して、材料をマイクロアレイインキュベーションに利用した。2つの時点の試料を比較するために、等量のタンパク質を異なる標識タイプである各試料と混合した(例えばCy3で標識された3時間抽出物を、Cy5で標識された24時間抽出物と混合した)。(メーカーの推奨プロトコールに従った)マイクロアレイチップによるインキュベーション後に、チップを洗浄および乾燥した。マイクロアレイを蛍光レーザスキャナーによってスキャンして、Cy3およびCy5染料の相対蛍光強度を測定した。
先に観察されたアポトーシスタンパク質を確認するために、およびより多数のアポトーシス促進および抗アポトーシスタンパク質への評価を拡張するために、潜在的に包含される広範なタンパク質のファミリーをスクリーニングすることができる2種類のアッセイ方法を選定した。
第1に、抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ,Sigma)を利用して700超のタンパク質抗体をスクリーニングし、50μM Q10によって24時間処置されたSK−MEL−28細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。
以下は、Q10(24時間)を用いたSKMEL−28に対する抗体アレイ実験からのレベルの改変を有する同定されたタンパク質の一部である:Bcl−xl、Bmf、BTK、BLK、cJun(pSer63)、コネキシン32、PUMA bbc3、BID、Par4、cCbl。本初期試験からの主な結論は、予想されたアポトーシス促進タンパク質が改変されたことであった。
SK−MEL−28の抗体マイクロアレイ
抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ,Sigma)を利用して700超のタンパク質抗体をスクリーニングし、50μM Q10によって24時間処置されたSK−MEL−28細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。
抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ,Sigma)を利用して700超のタンパク質抗体をスクリーニングし、50μM Q10によって24時間処置されたSK−MEL−28細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。
以下は、Q10(24時間)を用いたSKMEL−28に対する抗体アレイ実験からのレベルの改変を有する同定されたタンパク質の一部である:Bcl−xl、Bmf、BTK、BLK、cJun(pSer63)、コネキシン32、PUMA bbc3、BID、Par4、cCbl。これらのデータは、外部から添加されたQ10のレベルの上昇により、アポトーシス促進タンパク質のレベルがインキュベーション時に改変されることを確認している。
Bcl−xl(「基底細胞リンパ腫−特大」)は、ミトコンドリア中の膜貫通分子である。Bcl−xlは、FAS−Lのシグナル伝達経路に関与し、タンパク質のBcl−2ファミリーのメンバである複数の抗アポトーシスタンパク質の1つである。Bcl−xlは、癌細胞の生存に関わってきた。しかし、ヒトBcl−xmRNAの選択的スプライシングが少なくとも2種類の別個のBcl−xmRNA種、Bcl−xLおよびBcl−xSを生じ得ることが公知である。優勢なタンパク質生成物(233アミノ酸)は、成長因子除去時に細胞死を阻害する、より大型のBcl−x mRNAであるBcl−xLである(Boise et al.,1993.Cell 74,597−608)。他方では、Bcl−xSは、Bcl−2が細胞死を阻害する能力を阻害して、細胞をアポトーシス細胞死に対して感受性にする。
実施例8:ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロットおよび2次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第1の実験を皮膚癌株化細胞SKMEL−28に対して行った。本実験セットは、50または100μM Q10によって3、6、12、および24時間処置されたSK−MEL−28細胞を包含していた。
ウェスタンブロットおよび2次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第1の実験を皮膚癌株化細胞SKMEL−28に対して行った。本実験セットは、50または100μM Q10によって3、6、12、および24時間処置されたSK−MEL−28細胞を包含していた。
多種多様の細胞タイプを、Bcl−xLの抗体(図14)、ビメンチンの抗体(図15)、ミトコンドリア酸化的リン酸化機能の一連の抗体(図16〜21)およびミトコンドリア膜完全性に関連する一連の抗体(図22〜27)に対してウェスタンブロット分析によって評価した。これらの実験による結果は、複数の検査されたタンパク質がQ10による細胞処置の結果として上方調節または下方調節されることを証明した。
実施例9:100um Q10による膵臓癌細胞(PaCa2)の処置によってmRNAレベルが調節されているとして同定された糖尿病関連遺伝子
100uM Q10によって処置された試料に、処置後の各種の時間に糖尿病アレイを実行した。実験は本質的に上記のように実施された。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表23に要約される。これらの結果は、以下の遺伝子がQ10処理によって調節されることを示した:ABCC8、ACLY、ADRB3、CCL5、CEACAM1、CEBRA、FOXG1、FOXP3、G6PD、GLP1R、GPD1、HNF4A、ICAM1、IGFBP5、INPPL1、IRS2、MAPK14、ME1、NFKB1、PARP1、PIK3C2B、PIK3CD、PPARGC1B、PRKAG2、PTPN1、PYGL、SLC2A4、SNAP25、HNF1B、TNRFSF1A、TRIB3、VAPA、VEGFA、IL4RおよびIL6。
100uM Q10によって処置された試料に、処置後の各種の時間に糖尿病アレイを実行した。実験は本質的に上記のように実施された。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表23に要約される。これらの結果は、以下の遺伝子がQ10処理によって調節されることを示した:ABCC8、ACLY、ADRB3、CCL5、CEACAM1、CEBRA、FOXG1、FOXP3、G6PD、GLP1R、GPD1、HNF4A、ICAM1、IGFBP5、INPPL1、IRS2、MAPK14、ME1、NFKB1、PARP1、PIK3C2B、PIK3CD、PPARGC1B、PRKAG2、PTPN1、PYGL、SLC2A4、SNAP25、HNF1B、TNRFSF1A、TRIB3、VAPA、VEGFA、IL4RおよびIL6。
実施例10:100μM Q10を用いる膵臓癌細胞(PaCa2)の処理によってmRNAレベルが調節されるとして同定される血管新生関連遺伝子
処理後の様々な時点において100μM Q10で処理された試料について血管新生アレイが実行された。実験は本質的に上記のように実施された。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表24に要約される。これらの結果は、以下の遺伝子がQ10処理によって調節されることを示した:AKT1、ANGPTL4、ANGPEP、CCL2、CDH4、CXCL1、EDG1、EFNA3、EFNB2、EGF、FGF1、ID3、IL1B、IL8、KDR、NRP1、PECAM1、PROK2、SERPINF1、SPHK1、STAB1、TGFB1、VEGFA、およびVEGFB。
処理後の様々な時点において100μM Q10で処理された試料について血管新生アレイが実行された。実験は本質的に上記のように実施された。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表24に要約される。これらの結果は、以下の遺伝子がQ10処理によって調節されることを示した:AKT1、ANGPTL4、ANGPEP、CCL2、CDH4、CXCL1、EDG1、EFNA3、EFNB2、EGF、FGF1、ID3、IL1B、IL8、KDR、NRP1、PECAM1、PROK2、SERPINF1、SPHK1、STAB1、TGFB1、VEGFA、およびVEGFB。
実施例11:100μM Q10を用いる膵臓癌細胞(PaCa2)の処理によってmRNAレベルで調節されるとして同定されるアポトーシス関連遺伝子
処理後の様々な時点において100μM Q10で処理された試料についてアポトーシスアレイが実行された。実験は本質的に上記のように実施された。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表25に要約される。これらの結果は、以下の遺伝子がQ10処理によって調節されることを示した:ABL1、AKT1、Bcl2L1、BclAF1、CASP1、CASP2、CASP6、CIDEA、FADD、LTA、TNF、TNFSF10A、およびTNFSF10。
処理後の様々な時点において100μM Q10で処理された試料についてアポトーシスアレイが実行された。実験は本質的に上記のように実施された。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表25に要約される。これらの結果は、以下の遺伝子がQ10処理によって調節されることを示した:ABL1、AKT1、Bcl2L1、BclAF1、CASP1、CASP2、CASP6、CIDEA、FADD、LTA、TNF、TNFSF10A、およびTNFSF10。
実施例12:肝臓癌(HepG2)細胞上でのPCR糖尿病アレイ
HepG2(肝臓癌)細胞は、24時間ビヒクルと、または様々な時間の間100μM Q10のいずれかで処理された。処理は、PaCa2細胞において利用された手順に従って(上記、実施例9〜11)、ウェルあたり1×105細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたRNAの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、1μgの総RNA(260nmにおける測定によって決定される)を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は8μlである。RNA濃度が低いので、ビヒクル、ならびに16時間および48時間Q10処理された試料を使用するRT−PCRアレイ分析が、0.44μgのRNAを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表26において要約されるように、100μM Q10処理を用いる、HepG2遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。結果は、遺伝子PPARGC1A、PRKAA1、およびSNAP25の各々が処理の16時間後に下方調節されたことを示した(それぞれ、約20倍、6倍、および5倍)。処理後48時間において、PPARGC1AおよびPRKAA1は正常化され、またはわずかに上方調節されたのに対して、SNAP25は約2倍下方調節された。
HepG2(肝臓癌)細胞は、24時間ビヒクルと、または様々な時間の間100μM Q10のいずれかで処理された。処理は、PaCa2細胞において利用された手順に従って(上記、実施例9〜11)、ウェルあたり1×105細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたRNAの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、1μgの総RNA(260nmにおける測定によって決定される)を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は8μlである。RNA濃度が低いので、ビヒクル、ならびに16時間および48時間Q10処理された試料を使用するRT−PCRアレイ分析が、0.44μgのRNAを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表26において要約されるように、100μM Q10処理を用いる、HepG2遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。結果は、遺伝子PPARGC1A、PRKAA1、およびSNAP25の各々が処理の16時間後に下方調節されたことを示した(それぞれ、約20倍、6倍、および5倍)。処理後48時間において、PPARGC1AおよびPRKAA1は正常化され、またはわずかに上方調節されたのに対して、SNAP25は約2倍下方調節された。
実施例13:肝臓癌(HEPG2)細胞上のPCR血管新生アレイ
HepG2(肝臓癌)細胞は、24時間ビヒクルと、または様々な時間の間100μM Q10のいずれかで処理された。処理は、PaCa2細胞において利用された手順に従って(上記、実施例9〜11)、ウェルあたり1×105細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたRNAの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、1μgの総RNA(260nmにおける測定によって決定される)を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は8μlである。RNA濃度が低いので、ビヒクル、ならびに16時間および48時間Q10処理された試料を使用するRT−PCRアレイ分析が、0.44μgのRNAを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表27において要約されるように、100μM Q10処理を用いる、HepG2遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表27に要約される。結果は、遺伝子ANGPTL3、ANGPTL4、CXCL1、CXCL3、CXCL5、ENG、MMP2、およびTIMP3の各々が処理の16時間後に上方調節されたことを示した(それぞれ、対照のそれよりも、約5.5倍、3倍、3倍、3.2倍、3倍、3倍、1倍、および6.5倍、6倍および5倍)。ID3は、Q10処理の16時間後に、対照の約5倍下方調節された。処理の48時間後に、ANGPTL3、CXCL1、CXCL3、ENG、およびTIMP3はまだ上方調節されたのに対して(それぞれ、対照よりも約3.5倍、1.5倍、3.175倍、2倍、および3倍)、ANGPTL4、CXCL5、ID3、およびMMP2は、対照よりも、それぞれ、約1倍、1倍、2倍、および18倍下方調節された。
HepG2(肝臓癌)細胞は、24時間ビヒクルと、または様々な時間の間100μM Q10のいずれかで処理された。処理は、PaCa2細胞において利用された手順に従って(上記、実施例9〜11)、ウェルあたり1×105細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたRNAの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、1μgの総RNA(260nmにおける測定によって決定される)を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は8μlである。RNA濃度が低いので、ビヒクル、ならびに16時間および48時間Q10処理された試料を使用するRT−PCRアレイ分析が、0.44μgのRNAを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表27において要約されるように、100μM Q10処理を用いる、HepG2遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表27に要約される。結果は、遺伝子ANGPTL3、ANGPTL4、CXCL1、CXCL3、CXCL5、ENG、MMP2、およびTIMP3の各々が処理の16時間後に上方調節されたことを示した(それぞれ、対照のそれよりも、約5.5倍、3倍、3倍、3.2倍、3倍、3倍、1倍、および6.5倍、6倍および5倍)。ID3は、Q10処理の16時間後に、対照の約5倍下方調節された。処理の48時間後に、ANGPTL3、CXCL1、CXCL3、ENG、およびTIMP3はまだ上方調節されたのに対して(それぞれ、対照よりも約3.5倍、1.5倍、3.175倍、2倍、および3倍)、ANGPTL4、CXCL5、ID3、およびMMP2は、対照よりも、それぞれ、約1倍、1倍、2倍、および18倍下方調節された。
血管新生のプロセスに関与していることが知られているタンパク質は、RT−PCRアレイの構成要素であった。血管新生は、癌細胞が悪性になる決定的なプロセスである。これらのタンパク質のいくつかは糖尿病にも関わりがある。
ANGPTL3およびANGPTL4:ANGPTL3に関連する文献は、このタンパク質を脂質代謝の調節に関連付けている。特に、この文献(Li,C.Curr Opin Lipidol.2006 Apr;17(2):152−6)は、アンジオポエチンとアンジオポエチン様タンパク質の両方が類似のドメイン構造を共有することを教示している。ANGPTL3および4は、リポタンパク質リパーゼ活性を阻害するこのスーパーファミリーの2つのみのメンバーである。しかし、ANGPTL3および4は、複数のレベルで示差的に調節されており、インビボでの冗長でない機能を示唆している。ANGPTL3および4は、タンパク質分解的に2つの半分にプロセスされ、核受容体によって示差的に調節されている。ANGPTL4のトランスジェニック過剰発現ならびにANGPTL3または4のノックアウトは、これらの2つのタンパク質が脂質タンパク質代謝において本質的な役割を果たしていることを実証している:肝臓由来のANGPTL3は食事を与えられた状態で主にリポタンパク質リパーゼ活性を阻害するのに対して、ANGPTL4は、食事を与えられた状態と空腹時状態の両方で重要な役割を果たしている。加えて、ANGPTL4は、リポタンパク質誘導脂肪酸の組織特異的送達を調節する。このように、ANGPTL4は、発現のその部位に依存して、リポタンパク質リパーゼのエンドクリンまたはオートクリン/パラクリン阻害剤である。
リポタンパク質リパーゼは、キロミクロンおよび超低密度リポタンパク質(VLDL)において見い出されるものなどのリポタンパク質中の脂質を、3つの遊離脂肪酸と1つのグリセロール分子に加水分解する酵素である。所定の組織中でのリポタンパク質リパーゼ活性は、トリグリセリド誘導脂肪酸の取り込みのための律速段階である。脂肪酸の分配のバランスの悪さは、大きな代謝的な結果を有する。高脂肪食はLPLの組織特異的過剰発現を引き起こすことが示されており、これは、組織特異的インスリン抵抗性および結果としての2型糖尿病の発症に関わってきた。
本実施例の結果は、Q10が脂質代謝に関わっている調節タンパク質であり、従って、ANGPTL3/ANGPTL4およびそれらの関連する経路のさらなる研究を正当化することを示す。例えば、ANGPTL3/ANGPTL4は、以下の経路において役割を果たすことに関わっている:Akt、コレステロール、脂肪酸、HDL−コレステロール、HNF1A、ITGA5、ITGA5、ITGAV、ITG83、L−トリヨードチロニン(trilodothynonine)、LIPG、LPL、Mapk、Nrth、NR1H3、PPARD、PTK2、RXRA、トリアシルグリセロール(triacylglerol)、および9−シス−レチノイン酸。
実施例14:肝臓癌(HEPG2)細胞上のPCRアポトーシスアレイ
アポトーシスアレイは、上記のように、16時間および48時間、100μM Q10で処理された試料について実行された。しかし、48時間のアレイは、SYBRの代わりに蛍光団としてFAMを選んで実行された。FAMとSYBRの両方は同じ波長で蛍光を発する。
実施例14:肝臓癌(HEPG2)細胞上のPCRアポトーシスアレイ
アポトーシスアレイは、上記のように、16時間および48時間、100μM Q10で処理された試料について実行された。しかし、48時間のアレイは、SYBRの代わりに蛍光団としてFAMを選んで実行された。FAMとSYBRの両方は同じ波長で蛍光を発する。
Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表28に要約される。これらの結果は、CASP9がQ10処理の16時間後に対照の約61倍上方調節されたのに対し、BAG1およびTNFRSF1Aは、処理の16時間後に対照よりもそれぞれ約6倍および4倍下方調節されたことを示す。処理後48時間では、CASP9、BAG1、およびTNFRSF1Aは、対照よりもそれぞれ約55倍、1倍、および1倍上方調節された。
実施例15:代謝性障害を治療するためのエピシフターの能力の評価
選択されたエピシフター、例えば、CoQ10が代謝性障害、例えば、糖尿病を治療することが可能か否かを決定するために、インスリン刺激されたグルコースの取り込みの増加をインビトロで監視する細胞ベースのアッセイが利用される。特に、分化したマウス脂肪細胞が、放射活性グルコースのシンチレーション計数によって検出されるのと同様に(例えば、Perkin Elmer 1450 Microbeta JET readerを使用する)、インスリン刺激の際にグルコース取り込みが増加する能力を有する薬剤を同定するために使用される。これらのアッセイは以下のように実施される。
選択されたエピシフター、例えば、CoQ10が代謝性障害、例えば、糖尿病を治療することが可能か否かを決定するために、インスリン刺激されたグルコースの取り込みの増加をインビトロで監視する細胞ベースのアッセイが利用される。特に、分化したマウス脂肪細胞が、放射活性グルコースのシンチレーション計数によって検出されるのと同様に(例えば、Perkin Elmer 1450 Microbeta JET readerを使用する)、インスリン刺激の際にグルコース取り込みが増加する能力を有する薬剤を同定するために使用される。これらのアッセイは以下のように実施される。
材料および方法
Prees培地:「Prees」培地とも呼ばれるComplete培地は以下のように調製される。ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)は、L−グルタミン、ペニシリン−Gおよびストレプトマイシン(pen/strep)、および熱不活化ウシ胎仔血清(FBS)(65℃で30分間熱不活化)で補充される。血清は細胞の成長、接着および分化に影響を与え得るので、任意の新たなロットの血清は使用前に最初に試験された。指示色素の赤色/オレンジ色によって示されるように、pHが適正な範囲内(約7)になるまで、培地はインキュベーター(5%CO2)中で平衡化された。培地がピンク色になる場合(高pHを示す)、基礎条件が細胞に影響を与え、分化培地−1(DM1)および分化培地−2(DM2)において使用されるインスリンを変性させる可能性があるので、本発明者らは培地を廃棄した。
Prees培地:「Prees」培地とも呼ばれるComplete培地は以下のように調製される。ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)は、L−グルタミン、ペニシリン−Gおよびストレプトマイシン(pen/strep)、および熱不活化ウシ胎仔血清(FBS)(65℃で30分間熱不活化)で補充される。血清は細胞の成長、接着および分化に影響を与え得るので、任意の新たなロットの血清は使用前に最初に試験された。指示色素の赤色/オレンジ色によって示されるように、pHが適正な範囲内(約7)になるまで、培地はインキュベーター(5%CO2)中で平衡化された。培地がピンク色になる場合(高pHを示す)、基礎条件が細胞に影響を与え、分化培地−1(DM1)および分化培地−2(DM2)において使用されるインスリンを変性させる可能性があるので、本発明者らは培地を廃棄した。
分化培地:分化培地1(DM1)は、10%FBS、L−グルタミン、pen/strep、IBMX(375μM)、インスリン(120nM)、およびデキサメタゾン(188nM)を補充することによって調製された。分化培地2(DM2)は、10%FBSを有するDMEM、L−グルタミン、pen/strep、およびインスリン(120nM)を補充することによって調製された。
ゼラチン処理プレートの調製:細胞培養プレートの調製は以下のようにゼラチン処理される。ゼラチン(蒸留水中1% w/v)は、オートクレーブされ、室温で保存された。各細胞培養ウェルの底はゼラチン溶液で均一に覆われ、泡が形成されていないことを確実にした。この溶液は除去され、ゼラチンの薄膜を残した。これらのプレートは、組織培養フードの下に放置して乾燥させる。次に、プレートはPBSで洗浄され、その後、0.5%グルタル酸ジアルデヒド溶液(蒸留水中グルタルアルデヒド)が細胞培養ウェルに加えられた。10分後、ウェルはpen/strepを含むDMEMで2回洗浄される。各洗浄工程は、約5分間続くべきである。
細胞培養:3T3−L1プレ脂肪細胞は、およそ2〜3日毎に、または約60%のコンフルエンスに到達した際に分けられる。過度のコンフルエンスは、これらの細胞が脂肪細胞に分化する能力に影響を与える可能性がある。
他の試薬:D−(+)グルコース(「コールド」グルコース、放射性標識されていない)が、10mMの最終濃度までDPBSミックスに加えられた。
溶解緩衝液、塩基の混合物(例えば、0.5N最終濃度の水酸化ナトリウム)、および洗剤(例えば、0.1% w/vの最終濃度に希釈されたドデシル硫酸ナトリウム(SDS))が各回新鮮に調製された(使用の1〜2時間以内)。使用前に、溶解緩衝液は、緩衝剤の沈殿を回避するために、約30分間の時間、室温を超える温度まであたためられた。
グルコース取り込みの決定:プレ脂肪細胞3T3−L1細胞が、約5000細胞/ウェルの密度でプレートされる(黒色NUNC96ウェルプレート中)。これらの細胞は、2つの別々の工程で脂肪細胞に分化される。最初に、細胞は、分化培地−1(DM1)中で、2〜3日間の間培養される(脂肪細胞分化の1日目)。DM1は、増殖を妨害し、脂肪細胞特異的遺伝子の発現を誘導する。次に、細胞は分化培地−2(DM2)中で3〜4日間培養され、その後、培養培地は新鮮なDM2によって置き換えられる。グルコース取り込みアッセイは、分化の9〜15日目に実施される。
実験の2日前に(分化の7〜13日目)、DM2は除去され、新鮮なPrees培地で置き換えられる。候補化合物はこのときに加えられ、約48時間のインキュベーション時間を与える。実験の当日に、細胞(この時点で分化の9〜15日目)は、DPBS、硫酸マグネシウム(0.8mM)、およびHepes(10mM)、pH約7中で3時間血清飢餓状態とされる。このインキュベーション時間後、インスリン(10nM)を含有する新鮮なDPBSが脂肪細胞に加えられる。いかなるインスリンも有さない新鮮なDPBSが細胞上に配置され、これは陰性対照として働く。37℃で25分間のインキュベーション後、放射性グルコース(14Cで標識、最終濃度0.04mM、各ウェル中約0.26μCi14C−グルコース)が室温で15分間の間、培地に加えられる。次に、培地が除去され、細胞は徹底的に洗浄され、そして溶解される。溶解に際して、細胞は、ウェルの底から脱離して、小さな、曇った固まりを形成する。10%氷酢酸が各ウェルに加えられ、溶解反応を中和する。次に、シンチレーション液がウェルに加えられ、グルコースの取り込みが、MicroBetaプレートリーダーを使用して、各ウェル中の放射能の量を測定することによって決定される。
前述の実験プロトコールを使用して、エピシフターが、インビトロで細胞中のインスリン刺激されたグルコースの取り込みを増強、増加、または増大するときに、エピシフターは、代謝性障害、例えば、糖尿病を治療することが可能であると同定される。
実施例16:代謝性障害と関連するMIMの同定
潜在的なMIMとしての候補分子(例えば、環境影響因子)を評価するために、選択された候補MIMが、疾患(癌)細胞系統と正常対照細胞系統の両方を含む細胞系統のパネルに外因的に加えられ、パネル中の各細胞系統の細胞微少環境プロフィールに対して誘導された変化が評価される。例えば、mRNAおよびタンパク質のレベルを含む、細胞形態学、生理学、および/または細胞組成に対する変化が評価され、正常細胞との比較と同様に、疾患細胞について比較される。
潜在的なMIMとしての候補分子(例えば、環境影響因子)を評価するために、選択された候補MIMが、疾患(癌)細胞系統と正常対照細胞系統の両方を含む細胞系統のパネルに外因的に加えられ、パネル中の各細胞系統の細胞微少環境プロフィールに対して誘導された変化が評価される。例えば、mRNAおよびタンパク質のレベルを含む、細胞形態学、生理学、および/または細胞組成に対する変化が評価され、正常細胞との比較と同様に、疾患細胞について比較される。
細胞形態学/生理学の変化は、候補MIMに対する細胞の感受性およびアポトーシス性応答を調べることによって評価される。これらの実験は、実施例3に詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、少なくとも1つの対照細胞系統および少なくとも1つの癌細胞系統からなる細胞系統のパネルが、種々の濃度の候補MIMで処理される。潜在的なMIMに対する細胞系統の感受性は、様々な時間、および適用される濃度の範囲にわたって細胞生存を監視することによって評価される。潜在的MIMに対する細胞系統のアポトーシス性応答は、例えば、フローサイトメトリー方法論と組み合わせたネキシン試薬を使用することによって評価される。ネキシン試薬は、2種の染料、7AADおよびアネキシン−V−PEの組み合わせを含み、初期および後期のアポトーシスにおける細胞集団の定量化を可能にする。例えば、Apostrand(商標)ELISA方法論を使用する、一本鎖DNAを測定するさらなるアポトーシスアッセイが使用されてもよい。疾患および対照の細胞系統の感受性およびアポトーシス性応答が評価および比較される。正常細胞と比較されるような疾患細胞において、示差的な細胞傷害性を表示し、および/またはアポトーシス性応答を示差的に誘導する分子がMIMとして同定される。
候補MIMを用いる下の処置後の細胞の組成の変化が評価される。mRNAレベルでの遺伝子発現の変化がリアルタイムPCRアレイ方法論を使用して分析される。これらの実験は、実施例6および9〜13において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補MIMは、例えば、疾患細胞系統および正常対照細胞系統を含む1種以上の細胞系統に外因的に加えられ、mRNAは処置後の様々な時点で細胞から抽出される。特定の経路に関与する遺伝子のmRNAのレベルは、例えば、アポトーシス、酸化ストレスおよび自己酸化防御、血管新生、熱ショック、または糖尿病に特異的なアレイを含む、標的とされる経路アレイを使用することによって評価される。2倍レベル以上で遺伝子のmRNA転写が変化される遺伝子が同定および評価される。細胞中でmRNAレベルの変化を誘導し、および/または正常細胞と比較して疾患細胞において1種以上のmRNAのレベルの示差的な変化を誘導する分子はMIMとして同定される。
相補実験において、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化は、抗体マイクロアレイ方法論、二次元ゲル電気泳動、続いて質量分析による特徴付けを使用するタンパク質の同定を使用することによって、およびウェスタンブロット分析によって分析される。これらの実験は、それぞれ、実施例7、4、および8において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補MIMは、例えば、疾患細胞系統および正常対照細胞系統を含む1種以上の細胞系統に外因的に加えられ、可溶性タンパク質が、処置後の様々な時点、例えば、6時間または24時間で細胞から抽出される。タンパク質レベルで誘導された候補MIMによる変化が、広い範囲のタンパク質型および潜在的な経路マーカーをサンプリングしている700種を超えるタンパク質に対する抗体を含む抗体マイクロアレイを使用することによって評価される。さらなる相補プロテオーム分析は、質量分析方法論と連動した二次元(2−D)ゲル電気泳動を利用することによって実行できる。候補MIMは、例えば、疾患細胞および正常対照細胞系統を含む1種以上の細胞系統に外因的に加えられ、細胞ペレットは溶解され、二次元ゲル電気泳動に供される。ゲルは、未処置試料である対照と比べて処置試料でのタンパク質レベルの変化を同定するために分析される。ゲルは、レベルの増加、レベルの減少、または翻訳後修飾に起因する、処置の時間経過にわたるスポット変化の同定について分析される。統計学的に有意な変化を示すスポットは、トリプシン消化および質量分析による特徴付けによるタンパク質同定のために、切り出され、提出される。特徴付けされたペプチドは、例えば、MascotおよびMSRATソフトウェア分析を用いて、タンパク質データベースに対して検索され、タンパク質を同定する。前述の2−Dゲル分析および抗体マイクロアレイ実験に加えて、候補MIMによって誘導される特定のタンパク質のレベルに対する潜在的な変化が、ウェスタンブロット分析によって評価されてもよい。すべてのプロテオーム実験において、種々の細胞系統におけるレベルの増加または減少を伴うタンパク質が同定および評価される。細胞中でタンパク質レベルの変化を誘導し、および/または正常細胞と比較して疾患細胞において1種以上のタンパク質のレベルの示差的な変化を誘導する分子がMIMとして同定される。
前述の実験から候補MIMを用いる処置によって調節されることが見い出された遺伝子は、細胞および生化学的経路分析に供され、それによって、例えば、アポトーシス、癌生物学、および細胞増殖、解糖および代謝、分子輸送、ならびに細胞シグナル伝達を含む種々の細胞経路に分類できる。
候補MIMの細胞への侵入を確認するため、候補MIMが細胞内に局在化されるようになるか否かを決定するため、ならびに細胞中に存在する候補MIMのレベルおよび型を決定するための実験が実行される。これらの実験は、例えば、実施例5に詳細に記載されているように実行される。例えば、ミトコンドリアに存在する候補MIMのレベルおよび型を決定するために、候補MIMで処置された細胞からのミトコンドリア富化調製物が調製および分析される。ミトコンドリアに存在する候補MIMのレベルは、それによって、外因性候補MIMの添加に伴って、時間および用量依存的な様式で増加することが確認できる。加えて、ミトコンドリア富化試料からのタンパク質のレベルの変化は、全体の細胞タンパク質試料のために上記に記載されたように、二次元ゲル電気泳動および質量分析の特徴付けによるタンパク質同定を使用することによって分析される。細胞に侵入することが見い出され、例えば、ミトコンドリアにおいて増加レベルで存在することが見い出された候補MIMは、MIMとして同定される。試験された時間経過にわたる細胞中の、または例えば、具体的には、ミトコンドリア中の候補MIMのレベルは、例えば、特定のタンパク質のmRNAおよびタンパク質レベルの調節によって証明されるように、他に観察される細胞の変化と相関できる。
細胞組成の変化を誘導すること、例えば、mRNAまたはタンパク質レベルでの遺伝子発現の変化を誘導することが観察された候補MIMは、MIMとして同定される。疾患状態(例えば、糖尿病または肥満)において、正常状態と比較して、細胞形態学、生理学、または細胞組成(例えば、mRNAまたはタンパク質レベルでの遺伝子発現のディファレンシャルな変化)のディファレンシャルな変化を誘導することが観察された候補MIMは、MIMとして、特に、多次元特性を有するとして同定される。細胞に入ることが可能であることが見い出された候補MIMは、候補MIMがそれによって治療効果に加えてキャリア効果を提示するので、MIMとして、特に、多次元性質を有するとして同定される。
実施例17:代謝性障害と関連するエピシフターとしてのCoQ10の同定
対照細胞系統(ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養)およびいくつかの皮膚癌細胞系統(非転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−28;転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−2;または扁平上皮細胞癌であるSCC;膵臓癌細胞系統であるPaCa2;または肝臓癌細胞系統であるHEP−G2)からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルのコエンザイムQ10で処置された。癌細胞系統は、対照細胞系統と比較したときに、用量依存的応答の変化を示し、癌細胞においてのみ、アポトーシスおよび細胞死の誘導を伴った。詳細な例示的な実験は、例えば、本明細書の実施例3に提示される。
対照細胞系統(ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養)およびいくつかの皮膚癌細胞系統(非転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−28;転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−2;または扁平上皮細胞癌であるSCC;膵臓癌細胞系統であるPaCa2;または肝臓癌細胞系統であるHEP−G2)からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルのコエンザイムQ10で処置された。癌細胞系統は、対照細胞系統と比較したときに、用量依存的応答の変化を示し、癌細胞においてのみ、アポトーシスおよび細胞死の誘導を伴った。詳細な例示的な実験は、例えば、本明細書の実施例3に提示される。
アッセイは、CoQ10を用いる処置後に上記に同定される細胞のmRNAおよびタンパク質レベルでの組成の変化を評価するために利用される。mRNA発現の変化は、アポトーシス、酸化ストレスおよび抗酸化剤、血管新生、および糖尿病の各々について特異的であるリアルタイムPCRマイクロアレイを使用して分析された。タンパク質発現の変化は、抗体マイクロアレイ分析およびウェスタンブロット分析を使用して分析された。これらのアッセイからの結果は、mRNAとタンパク質の両方のレベルで、コエンザイムQ10の添加に起因して、細胞系統中で、遺伝子発現の有意な変化が起こっていたことを実証した。細胞の代謝プロセスに付随するか、またはそれに関与することが知られている多数の遺伝子が、CoQ10を用いる処置の結果として、調節されるものとして観察された。例えば、核受容体タンパク質HNF4Aの発現は、Q10処置後に細胞中で上方調節されていることが見い出された。トランスアルドラーゼ1(TAL)の発現もまた、Q10で処置された細胞中で調節された。TALはNADPHおよび反応性酸素中間体のレベルのバランスをとり、それによって、ミトコンドリアの膜電位を調節し、これは、ATP合成および細胞生存の決定的なチェックポイントである。代謝性障害と特に関連するものの中で、例えば、糖尿病と関連することが知られている多数の遺伝子がQ10によって調節されるとして同定された。詳細な例示的な実験が、例えば、本明細書の実施例4、6、7、8、および9に提示されている。
Q10は、エネルギー産生のためにミトコンドリアの中での酸化的(exidative)リン酸化プロセスのための必須のコファクターである。ミトコンドリア中に存在するコエンザイムCoQ10のレベルは、CoQ10の型と同様に、CoQ10で処置された細胞からミトコンドリアが富化された調製物を分析することによって決定される。ミトコンドリア中に存在するコエンザイムQ10のレベルは、外因性Q10の添加に伴って、時間および用量依存的な様式で増加することが確認された。時間経過は、代謝およびアポトーシス経路と関連する特定のタンパク質についてmRNAおよびタンパク質レベルの調節において観察されるような広範な種々の細胞の変化と相関した。詳細な例示的な実験は、例えば、本明細書の実施例5に提示される。
本明細書に記載された結果は、エピシフターとして内因性分子CoQ10を同定した。特に、結果は、細胞中で、代謝状態のシフト、および部分的にミトコンドリア機能の回復を誘導するとしてCoQ10を同定した。これらの結論は、本明細書に記載されているデータの以下の解釈、および関連分野における現在の知見に基づいている。
Q10は、合成され、ミトコンドリア内膜に能動輸送され、そこで富化され、およびそこで利用されることが知られている。Q10はまた、エネルギー産生のためのミトコンドリアにおける酸化的リン酸化のプロセスのための必須のコファクターであることも知られている。しかし、多くの癌細胞は、多くの正常細胞のようにミトコンドリアにおいてピルビン酸の酸化によるのではなく、解糖とその後の細胞質ゾル中での乳酸発酵によって、優勢にエネルギーを生産する。酸化的リン酸化は、電子伝達系およびシトクロムcを含む。アポトーシスはミトコンドリアの破壊を含み、アポトーシス促進性因子によるミトコンドリア内膜の浸透能(permiabilization)を伴う。様々な代謝エネルギー合成経路を利用することによって、癌細胞は、細胞中の異常に対する通常のアポトーシス性応答を軽減することが可能である。理論によって束縛されることを望まないが、出願人は、酸化的リン酸化経路のタンパク質を上方調節すること、従って、発癌の欠陥を認識し、アポトーシスの引き金を引く状態に戻るようにミトコンドリアの機能にスイッチを入れることによってQ10が機能していることを提案する。したがって、Q10は、細胞の代謝状態をシフトさせることによってエピシフターとして作用している。
実施例18:代謝性障害と関連するエピシフターの同定
対照細胞系統(例えば、ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養)および癌細胞系統(例えば、非転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−28;転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−2;または扁平上皮細胞癌であるSCC;膵臓癌細胞系統であるPaCa2;または肝臓癌細胞系統であるHEP−G2)からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルの候補エピシフターで処置された。細胞形態学/生理学の変化は、候補エピシフターに対する細胞の感受性およびアポトーシス性応答を調べることによって評価される。これらの実験は、実施例3に詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補エピシフターに対する細胞系統の感受性は、様々な時間、および適用される濃度の範囲にわたって細胞生存を監視することによって評価される。候補エピシフターに対する細胞系統のアポトーシス性応答は、例えば、フローサイトメトリー方法論と組み合わせたネキシン試薬を使用することによって評価される。ネキシン試薬は、2種の染料、7AADおよびアネキシン−V−PEの組み合わせを含み、初期および後期のアポトーシスにおける細胞集団の定量化を可能にする。例えば、Apostrand(商標)ELISA方法論を使用する、一本鎖DNAを測定するさらなるアポトーシスアッセイが使用されてもよい。疾患および対照の細胞系統の感受性およびアポトーシス性応答が評価および比較される。候補エピシフターは、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的に細胞増殖を阻害するそれらの能力に基づいて評価される。候補エピシフターはさらに、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的にアポトーシスを誘導するそれらの能力に基づいて評価される。
対照細胞系統(例えば、ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養)および癌細胞系統(例えば、非転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−28;転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−2;または扁平上皮細胞癌であるSCC;膵臓癌細胞系統であるPaCa2;または肝臓癌細胞系統であるHEP−G2)からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルの候補エピシフターで処置された。細胞形態学/生理学の変化は、候補エピシフターに対する細胞の感受性およびアポトーシス性応答を調べることによって評価される。これらの実験は、実施例3に詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補エピシフターに対する細胞系統の感受性は、様々な時間、および適用される濃度の範囲にわたって細胞生存を監視することによって評価される。候補エピシフターに対する細胞系統のアポトーシス性応答は、例えば、フローサイトメトリー方法論と組み合わせたネキシン試薬を使用することによって評価される。ネキシン試薬は、2種の染料、7AADおよびアネキシン−V−PEの組み合わせを含み、初期および後期のアポトーシスにおける細胞集団の定量化を可能にする。例えば、Apostrand(商標)ELISA方法論を使用する、一本鎖DNAを測定するさらなるアポトーシスアッセイが使用されてもよい。疾患および対照の細胞系統の感受性およびアポトーシス性応答が評価および比較される。候補エピシフターは、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的に細胞増殖を阻害するそれらの能力に基づいて評価される。候補エピシフターはさらに、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的にアポトーシスを誘導するそれらの能力に基づいて評価される。
候補エピシフターを用いる処置後に上記に同定された細胞のmRNAおよびタンパク質レベルでの組成物の変化を評価するためのアッセイが利用される。mRNAレベルの変化はリアルタイムPCRマイクロアレイを使用して分析される。これらの実験は、実施例6および9〜13において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、mRNAは、処置後の様々な時点で細胞から抽出される。特定の経路に関与する遺伝子のmRNAのレベルは、アポトーシス、酸化ストレスおよび自己酸化防御、血管新生、熱ショック、または糖尿病に特異的なアレイを含む、標的とされる経路アレイを使用することによって評価される。2倍レベル以上で遺伝子のmRNA転写が変化される遺伝子が同定および評価される。
タンパク質発現の変化は、抗体マイクロアレイ分析、質量分析特徴付けと連動した二次元ゲル電気泳動分析、およびウェスタンブロット分析を使用して分析される。これらの実験は、それぞれ、実施例7、4、および8において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、可溶性タンパク質は、候補エピシフターを用いる処置後の様々な時間、例えば、6時間または24時間で細胞から抽出される。候補エピシフターによってタンパク質レベルまで誘導された変化は、広い範囲のタンパク質型および潜在的な経路マーカーをサンプリングしている700種を超えるタンパク質に対する抗体を含む抗体マイクロアレイを使用することによって評価される。さらなる相補プロテオーム分析は、質量分析方法論と連動した二次元(2−D)ゲル電気泳動を利用することによって実行できる。候補エピシフターは、細胞系統に外因的に加えられ、細胞ペレットは溶解され、2−Dゲル電気泳動に供される。ゲルは、未処置試料である対照と比べて処置試料でのタンパク質レベルの変化を同定するために分析される。ゲルは、レベルの増加、レベルの減少、または翻訳後修飾に起因する、処置の時間経過にわたるスポット変化の同定について分析される。統計学的に有意な変化を示すスポットは、トリプシン消化および質量分析による特徴付けによるタンパク質同定のために、切り出され、提出される。特徴付けされたペプチドは、例えば、MascotおよびMSRATソフトウェア分析を用いて、タンパク質データベースに対して検索され、タンパク質を同定する。前述の2−Dゲル分析および抗体マイクロアレイ実験に加えて、候補MIMによって誘導される特定のタンパク質のレベルに対する潜在的な変化が、ウェスタンブロット分析によって評価されてもよい。すべてのプロテオーム実験において、種々の細胞系統におけるレベルの増加または減少を伴うタンパク質が同定および評価される。
候補エピシフターは、候補エピシフターの添加に起因して、細胞系統中で、mRNAおよび/またはタンパク質レベルで遺伝子発現に誘導される変化に基づいて評価される。特に、候補エピシフターは、細胞代謝プロセスに付随するかまたはそれに関与することが知られている遺伝子を調節するそれらの能力に基づいて評価される。代謝性障害と特に関連するものの中で、候補エピシフターは、例えば、糖尿病または肥満と関連することが知られている遺伝子を調節するそれらの能力に基づいて評価される。
細胞または特定の細胞位置に存在する候補エピシフターのレベル、ならびに候補エピシフターの型は、当業者に公知である日常的な方法を使用して決定される。例えば、経時的かつ一定の範囲の用量にわたるミトコンドリアにおける候補エピシフターのレベルは、候補エピシフターを用いて処置された細胞からのミトコンドリア富化調製物を分析することによって決定される。時間経過にわたってのミトコンドリアにおける候補エピシフターのレベルは、観察された他の細胞の変化、例えば、代謝経路およびアポトーシス経路に関連する特定のタンパク質のmRNAおよびタンパク質のレベルの調節と比較および相関できる。
前述の実験から得られた結果に基づいて細胞の代謝状態のシフトを誘導することが観察された候補エピシフターは、エピシフターとして同定される。例えば、細胞中でインスリン刺激されたグルコースの取り込みを増強、増加、または増大する候補エピシフターはエピシフターとして同定される。
実施例19:エピシフターとしてのビタミンD3の同定
ビタミンD3、すなわち、1α、25−ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオールとしてもまた知られる)は、ビタミンDから2段階酵素プロセスによって合成されるビタミンD代謝物である。ビタミンD3はその遍在性核ビタミンD受容体(VDR)と相互作用し、カルシウムおよびリン酸の恒常性ならびに細胞分裂および分化に関与する遺伝子の広範なスペクトルの転写を調節する。ビタミンD3は、扁平上皮細胞癌、前立腺腺癌、卵巣癌、乳癌、および肺癌を含む多数のモデル系において抗癌効果を有することが報告されている(Deeb et al.2007 Nature Reviews Cancer 7:684−700に概説されている)。
ビタミンD3、すなわち、1α、25−ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオールとしてもまた知られる)は、ビタミンDから2段階酵素プロセスによって合成されるビタミンD代謝物である。ビタミンD3はその遍在性核ビタミンD受容体(VDR)と相互作用し、カルシウムおよびリン酸の恒常性ならびに細胞分裂および分化に関与する遺伝子の広範なスペクトルの転写を調節する。ビタミンD3は、扁平上皮細胞癌、前立腺腺癌、卵巣癌、乳癌、および肺癌を含む多数のモデル系において抗癌効果を有することが報告されている(Deeb et al.2007 Nature Reviews Cancer 7:684−700に概説されている)。
ビタミンD3の抗癌効果は、細胞周期のG1期での増殖停止、アポトーシス、腫瘍細胞分化、増殖因子媒介性細胞生存シグナルの破壊、ならびに血管新生および細胞接着の阻害を含む、複数のメカニズムを含むことが報告されている(Deeb et al.2007 Nature Reviews Cancer 7:684−700に概説されている)。例えば、特にアポトーシスに関して、ビタミンD3は、アポトーシスの鍵となる媒介因子を調節すること、例えば、抗アポトーシス性の、生存促進性タンパク質BCL2およびBCL−XLの発現を抑制すること、またはアポトーシス促進性タンパク質(例えば、BAX、BAK、およびBAD)の発現を誘導することによってアポトーシスを誘導することが報告されてきた(Deeb et al.2007)。さらなる例において、特に血管新生に関連して、ビタミンD3は、いくつかの腫瘍由来内皮細胞の増殖を阻害すること、および腫瘍において血管新生を誘導する血管内皮増殖因子(VEGF)の発現を阻害することが報告されてきた(Masuda and Jones,2006 Mol.Cancer Ther.5(4):797−8070に概説されている)。別の例において、特に細胞周期停止に関して、ビタミンD3は、サイクリン依存性キナーゼインヒビターp21WAFI/CIPIの遺伝子転写を誘導すること、ならびにサイクリン依存性キナーゼインヒビターp27KIPIタンパク質の合成および/または安定化を誘導することが報告されており、これらの両方とも、G1停止の誘導のために決定的である(Deeb et al.2007)。
上述の観察に基づいて、すなわち、細胞の代謝状態をシフトされるその能力により、ビタミンD3はエピシフターとして同定される。ビタミンD3は、細胞中でアポトーシスを誘導するその能力により、特に、正常細胞と比較した場合に、疾患(癌)細胞において示差的に細胞増殖を阻害し、およびアポトーシス性応答を誘導するその能力に基づいて、エピシフターである(例えば、正常細胞と比較した場合に、癌細胞においてアポトーシスに関与する、BCL−2、BCL−XL、およびBAXなどのタンパク質の発現を示差的に調節する)。
実施例20:コエンザイムQ10を用いて処置された細胞のウェスタン分析
過去50年にわたって、悪性形質転換の根底にある原因としての特定のプロセスに影響を与える内因性/外因性因子に関わりがある膨大な量の情報が生じてきた。臨床的および基礎的文献は、DNA構造および機能の変化が、癌を遺伝病として規定する、癌の開始および進行において顕著な役割を果たすという証拠を提供している(Wooster,2010;Haiman,2010)。1920年代初頭、発癌の病因論の根本的な変化を特徴付けることに従事していたOtto Warburgおよび他の研究者は、2つの主要な観察(a)Warburg効果としてもまた知られる、酸素の存在下でのエネルギー産生のためのATPの生成においてグルコースを輸送および利用する細胞の能力、ならびに(b)ミトコンドリアATPの産生の減少に導く電子伝達の変化を含む、ミトコンドリアの構造および機能の変動を記述した。過去数年間は、癌の病因論、すなわち、癌を転移性疾患として見ることにおける細胞バイオエネルギーの中心的な役割を調べることの復活であった。
過去50年にわたって、悪性形質転換の根底にある原因としての特定のプロセスに影響を与える内因性/外因性因子に関わりがある膨大な量の情報が生じてきた。臨床的および基礎的文献は、DNA構造および機能の変化が、癌を遺伝病として規定する、癌の開始および進行において顕著な役割を果たすという証拠を提供している(Wooster,2010;Haiman,2010)。1920年代初頭、発癌の病因論の根本的な変化を特徴付けることに従事していたOtto Warburgおよび他の研究者は、2つの主要な観察(a)Warburg効果としてもまた知られる、酸素の存在下でのエネルギー産生のためのATPの生成においてグルコースを輸送および利用する細胞の能力、ならびに(b)ミトコンドリアATPの産生の減少に導く電子伝達の変化を含む、ミトコンドリアの構造および機能の変動を記述した。過去数年間は、癌の病因論、すなわち、癌を転移性疾患として見ることにおける細胞バイオエネルギーの中心的な役割を調べることの復活であった。
歴史的には、遺伝子の変異が遺伝子発現の変化の原因であると考えられてきたけれども、発癌を支持する遺伝子発現に影響を与える際に決定的な役割を果たす後成的プロセスを支持している文献が蓄積しつつある。これは、多くの遺伝子の突然変異率が低く、癌細胞において見い出される多数の(スペクトルの)変異を説明できないという観察によって証明されている。後成的変化は、ヒストンテールのメチル化および修飾によって調節され、両方の変化は、ヒストンアセチル化のために、コファクター、例えば、アセチルCoA要求の利用性を必要とするので、細胞のエネルギー(栄養)状態に固有に連関している(参照)。アセチルCoAの生合成は、解糖とクレブス回路に依存し、細胞内エネルギー状態を遺伝子の発現および活性の調節に直接連関させる。
正常細胞において、ミトコンドリアの酸化的リン酸化は、十分なATPを生成して、正常な生理学的活性および細胞生存を維持するためのエネルギー要求に合致している。ミトコンドリアのエネルギー産生の結果は、反応性酸素種(ROS)の生成であり、その異常な産生はミトコンドリアの損傷に導く(参照)。発癌の病因論に関わりがある現象である、ミトコンドリアによる長期ROS生成は、遺伝子の変異の累積的蓄積をもたらすことが十分に確立されている。癌細胞はROS生成を最小化するようにミトコンドリア呼吸を減少し、エネルギー産生を維持するために解糖に切り替わることが示唆されてきた。したがって、酸化的リン酸化から解糖へのエネルギー産生の進行的シフトは、生理学的機能を維持するためにエネルギー産生を維持するために細胞にとって必須であり、正常細胞の表現型から癌細胞の表現型への進行に付随し得る。ミトコンドリアの遺伝的構成における変化(変異)の蓄積と連携した細胞のエネルギー(生体エネルギー)プロフィールの進行性シフトは、細胞メタボロームを変化させる。解糖の推移に対するミトコンドリアのリン酸化の結果としての全細胞メタボロームプロフィールの変化は、異常な生体エネルギー誘導性メタボロームプロフィールに対応し、発癌を支持する根底にある原因である。非癌性正常ミトコンドリア酸化的リン酸化関連細胞生体エネルギーの状態への細胞メタボロームシフトを誘発するために内因性分子を使用する標的化介入は、癌の治療における治療エンドポイントを表す。
エピメタボロームシフトを引き起こすMIMとしてのコエンザイムQ10
本明細書に提示されるデータは、コエンザイムQ10を用いた正常および癌細胞の処置が、解糖−ミトコンドリア酸化ストレス連続体の中で鍵となる生化学的末端を調節するタンパク質の発現の変化に関与することを実証する。ウェスタンブロッティングおよび酸素消費によるタンパク質発現の評価を説明するデータの組み合わせは、正常細胞において、コエンザイムQ10の曝露後に、正常な解糖およびミトコンドリア速度の有意な変化がないことを実証する。したがって、正常細胞系統、例えば、HDFa(正常ヒト成体線維芽細胞)、HASMC(正常ヒト大動脈平滑筋細胞)、nFib(正常線維芽細胞)、およびHeKa(正常ヒトケラチン生成細胞)におけるタンパク質の発現の値およびミトコンドリア呼吸速度は、ベースライン生理学的状態を表すと見なすことができる。癌細胞系統、例えば、HepG2(肝臓癌)、PaCa−2(膵臓癌)、MCF7(乳癌)、SK−MEL(黒色腫)、およびSCC−25(扁平上皮細胞癌)におけるタンパク質の発現およびミトコンドリア呼吸速度の何らかの逸脱は、この場合は、癌における疾患の開始/進行に起因する変化を表す。実験的証拠は、癌細胞に対するコエンザイムQ10の曝露が、正常細胞を彷彿とさせる細胞の病態生理学的再組織化と関わりがあるという仮説に対するサポートを提供する。具体的には、本明細書に提供されるデータは、癌細胞中でのコエンザイムQ10曝露は、正常細胞において観察される細胞構造に対する、細胞構造の全体的な再組織化の誘導の原因である、解糖経路におけるシフトおよびミトコンドリアの酸化的リン酸化と関わりがあることを実証する。
本明細書に提示されるデータは、コエンザイムQ10を用いた正常および癌細胞の処置が、解糖−ミトコンドリア酸化ストレス連続体の中で鍵となる生化学的末端を調節するタンパク質の発現の変化に関与することを実証する。ウェスタンブロッティングおよび酸素消費によるタンパク質発現の評価を説明するデータの組み合わせは、正常細胞において、コエンザイムQ10の曝露後に、正常な解糖およびミトコンドリア速度の有意な変化がないことを実証する。したがって、正常細胞系統、例えば、HDFa(正常ヒト成体線維芽細胞)、HASMC(正常ヒト大動脈平滑筋細胞)、nFib(正常線維芽細胞)、およびHeKa(正常ヒトケラチン生成細胞)におけるタンパク質の発現の値およびミトコンドリア呼吸速度は、ベースライン生理学的状態を表すと見なすことができる。癌細胞系統、例えば、HepG2(肝臓癌)、PaCa−2(膵臓癌)、MCF7(乳癌)、SK−MEL(黒色腫)、およびSCC−25(扁平上皮細胞癌)におけるタンパク質の発現およびミトコンドリア呼吸速度の何らかの逸脱は、この場合は、癌における疾患の開始/進行に起因する変化を表す。実験的証拠は、癌細胞に対するコエンザイムQ10の曝露が、正常細胞を彷彿とさせる細胞の病態生理学的再組織化と関わりがあるという仮説に対するサポートを提供する。具体的には、本明細書に提供されるデータは、癌細胞中でのコエンザイムQ10曝露は、正常細胞において観察される細胞構造に対する、細胞構造の全体的な再組織化の誘導の原因である、解糖経路におけるシフトおよびミトコンドリアの酸化的リン酸化と関わりがあることを実証する。
正常細胞において、解糖アウトプットの終点は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化(OXPHOS)、すなわち、クレブスサイクル(トリカルボン酸回路、TCA、またはクエン酸回路としても知られる)に入るための解糖経路を経由したグルコースからピルビン酸の生成に連関しており、還元当量を生成して、ATP産生のためにOXPHOSをサポートする。したがって、正常細胞において、解糖に関与する遺伝子産物の発現および機能的な方向付けは、ピルビン酸の十分な生成およびそれがクレブスサイクルに入ることに向けて準備される。癌細胞における解糖およびクレブスサイクルに関与する鍵となるタンパク質の発現および機能の異常調節は、ミトコンドリア機能の顕著な減少に伴う解糖の増強を生じる。ミトコンドリア呼吸鎖に選択的に影響を与える内因性分子であるコエンザイムQ10への癌細胞の曝露は、解糖およびクレブスサイクル経路のタンパク質の発現を変化させ(正常化し)、エネルギー産生(すなわち、ATP生成)がミトコンドリアに回復されるように、生体エネルギーシフトを容易にする。
実験手順
ウェスタンブロット実験1
実験のために使用された細胞はHDFa細胞およびMCF−7細胞であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24時間後に収穫された。全細胞ペレットが1mLのC7緩衝液中で一度に再懸濁され、ラベルされた15mLチューブに移された。次いで、試料は、低温室にて、氷上で、番号14の設定で6回の超音波パルスを使用して超音波処理された。超音波処理後、試料は2500gで短時間遠心分離し、試料は2mlチューブに移された。50mL試料チューブに残っている泡を使用して、各試料のpHが確認された(pHは9.0である)。
ウェスタンブロット実験1
実験のために使用された細胞はHDFa細胞およびMCF−7細胞であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24時間後に収穫された。全細胞ペレットが1mLのC7緩衝液中で一度に再懸濁され、ラベルされた15mLチューブに移された。次いで、試料は、低温室にて、氷上で、番号14の設定で6回の超音波パルスを使用して超音波処理された。超音波処理後、試料は2500gで短時間遠心分離し、試料は2mlチューブに移された。50mL試料チューブに残っている泡を使用して、各試料のpHが確認された(pHは9.0である)。
試料のアルキル化および還元は、10μlの1Mアクリルアミド、25μlのトリブチルホスフィン(tributylphoshene)を加えること、および断続的に混合しながらの90分間のインキュベーションによって、各試料について実施された。インキュベーション後、10μlの1M DTTが加えられ、チューブは20,000gで20℃にて10分間遠心分離され、そして10kカットオフを有するラベルしたAmicon Ultra遠心フィルターユニット(Millipore カタログ番号UFC801024)に上清が移された。試料は、2分間隔で、2500gで15分間遠心分離された。電気伝導度は、Chaps単独ならびに試料について、電気伝導度メーターを使用して測定された。試料の電気伝導度が高い場合、1mlのchapsが緩衝液交換のために加えられ、体積が250μlに下がるまで、2500gで再度遠心分離された。電気伝導度が200以下であったとき、試料は、上清の体積が150〜100μlの間になるまで、5分間隔で2500gで遠心分離された。試料上清はエッペンドルフチューブに移され、BSAを標準として使用してBradfordアッセイが実施された。
試料は上記のような標準のプロトコールに従って処置され、各試料中のタンパク質の量はBradfordアッセイによって決定された。10μgタンパク質に等価な試料体積が、以下に示されるように、Lamelliローディング染料(LDS)およびMilliQ水を用いて調製され、4〜12%Bis−Tris Novex NuPAGEゲル(Invitrogen,カタログ番号NP0323Box)上で泳動された。
ゲルは、1×MOPS緩衝液を使用し、NOVEX Xcell Surelockシステムを使用して、200Vで50分間泳動された。次いで、ゲルは、NOVEX Xcell Surelock湿式転写プロトコールを使用して、30Vで1時間転写された。ブロットは、InvitrogenからのSimply Blue Safestain(LC6065)で染色された。
HDFaおよびMCF−7試料におけるIDH1およびATPクエン酸リアーゼレベル 転写後、各ブロットは、2枚のWhatman濾紙の間に配置され、15〜20分間乾燥された。乾燥後、ブロットは、日付、試料の型、およびブロット1かブロット2のいずれかをHB鉛筆でラベルされた。分子量マーカーは、鉛筆で輪郭が描かれ、1本線は青色であり、2本線は着色マーカーであった。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で1時間室温でブロッキングされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄された。ブロット1は5%BSAを有するTBST中のIDH1に対する一次抗体(Cell Signaling番号3997)(1:1000希釈)でプローブされ、ブロット2は、振盪しながら4℃で一晩のインキュベーションによって、1:1000希釈の5%BSA中のATPクエン酸リアーゼについてのウサギポリクローナル抗体(Cell Signaling番号4332)を用いた。一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
HDFaおよびMCF−7試料におけるアクチンレベル
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。次いで、ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして1:5000希釈の5% BSA中のアクチンに対する抗体(Sigma カタログ 番号A5316、クローンAC−74)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との1時間のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。次いで、ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして1:5000希釈の5% BSA中のアクチンに対する抗体(Sigma カタログ 番号A5316、クローンAC−74)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との1時間のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ウェスタンブロット実験2
この実験において使用された細胞は、SKMEL28、SCC−25、nFib、およびHekaであり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の3、6、および/または24時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、4〜12% Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
この実験において使用された細胞は、SKMEL28、SCC−25、nFib、およびHekaであり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の3、6、および/または24時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、4〜12% Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
4つの細胞系統についてのIDH1のレベル
転写後、ブロットは15〜20分間乾燥され、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄された。次いで、これは、5% BSAを有するTBST中のIDH1に対する一次抗体(Cell Signaling 番号3997)(1:1000希釈)を用いて、振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。IDH1に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)を用いて、室温で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
転写後、ブロットは15〜20分間乾燥され、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄された。次いで、これは、5% BSAを有するTBST中のIDH1に対する一次抗体(Cell Signaling 番号3997)(1:1000希釈)を用いて、振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。IDH1に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)を用いて、室温で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
4つの異なる細胞系統におけるATPクエン酸リアーゼレベル
イソクエン酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄された。次いで、これは、1:1000希釈の5% BSA中のATPクエン酸リアーゼについてのウサギポリクローナル抗体(Cell Signaling 番号4332)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。ATPクエン酸リアーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
異なる4つの細胞系統におけるアクチンレベル
ATPクエン酸リアーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:5000希釈の5% BSA中のアクチンに対する抗体(Sigma カタログ番号 A5316、クローンAC−74)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との1時間のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
イソクエン酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄された。次いで、これは、1:1000希釈の5% BSA中のATPクエン酸リアーゼについてのウサギポリクローナル抗体(Cell Signaling 番号4332)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。ATPクエン酸リアーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
異なる4つの細胞系統におけるアクチンレベル
ATPクエン酸リアーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:5000希釈の5% BSA中のアクチンに対する抗体(Sigma カタログ番号 A5316、クローンAC−74)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との1時間のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ウェスタンブロット実験3
この実験において使用された細胞は、HepG2細胞、HASMC細胞、およびPACA2細胞であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の48時間後に収穫された。この実験において(ウェスタンブロット実験3)、および本実施例において以下に記載される実験のすべてにおいて(すなわち、ウェスタンブロット実験4〜9)、細胞は、5mM グルコース(「5G」)または22mM グルコース(「22G」)のいずれかでさらに処置された。細胞に由来する試料は処理され、そして上記のように4〜12% Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
この実験において使用された細胞は、HepG2細胞、HASMC細胞、およびPACA2細胞であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の48時間後に収穫された。この実験において(ウェスタンブロット実験3)、および本実施例において以下に記載される実験のすべてにおいて(すなわち、ウェスタンブロット実験4〜9)、細胞は、5mM グルコース(「5G」)または22mM グルコース(「22G」)のいずれかでさらに処置された。細胞に由来する試料は処理され、そして上記のように4〜12% Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
HASMC対PACA2およびHepG2におけるIDH1、ATPクエン酸リアーゼ、およびアクチンレベル
IDH1、ATPクエン酸リアーゼ、およびアクチンのレベルは、本質的に、上記のように、IDH1、ATPクエン酸リアーゼ、およびアクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
IDH1、ATPクエン酸リアーゼ、およびアクチンのレベルは、本質的に、上記のように、IDH1、ATPクエン酸リアーゼ、およびアクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
ウェスタンブロット実験4
この実験において使用された細胞はHepG2であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、4〜12% Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
この実験において使用された細胞はHepG2であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、4〜12% Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
HepG2細胞における乳酸デヒドロゲナーゼレベル
転写後、各ブロットは15〜20分間乾燥され、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。次いで、このブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で、室温で1時間ブロッキングされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、5% BSA中の乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体(abcam ab2101;ポリクローナル)(1:1000希釈)を用いて、振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(ウサギ抗ヤギ;1:10,000希釈)を用いて、室温で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
転写後、各ブロットは15〜20分間乾燥され、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。次いで、このブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で、室温で1時間ブロッキングされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、5% BSA中の乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体(abcam ab2101;ポリクローナル)(1:1000希釈)を用いて、振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(ウサギ抗ヤギ;1:10,000希釈)を用いて、室温で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
HepG2細胞における筋肉型ピルビン酸キナーゼ(PKM2)レベル
乳酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:500希釈の5% BSA中のピルビン酸キナーゼM2に対するウサギポリクローナル抗体(NOVUS BIOLOGICALS カタログ番号 H00005315−D01P)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。ピルビン酸キナーゼM2に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、各ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
乳酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:500希釈の5% BSA中のピルビン酸キナーゼM2に対するウサギポリクローナル抗体(NOVUS BIOLOGICALS カタログ番号 H00005315−D01P)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。ピルビン酸キナーゼM2に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、各ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
HepG2細胞におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼβレベル
ピルビン酸キナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。抗体が剥がされたことおよびECF試薬が働いたことを確認した後、ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:5000希釈の5% BSA中のピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する抗体(ABNOVA カタログ番号 H00005162−M03)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。ピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、各ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ピルビン酸キナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。抗体が剥がされたことおよびECF試薬が働いたことを確認した後、ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:5000希釈の5% BSA中のピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する抗体(ABNOVA カタログ番号 H00005162−M03)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。ピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、各ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
HepG2細胞におけるアクチンレベル
ピルビン酸デヒドロゲナーゼブロットは、本質的に上記のように、剥がされ、次いで、アクチンについて再プローブされた。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼブロットは、本質的に上記のように、剥がされ、次いで、アクチンについて再プローブされた。
ウェスタンブロット実験5
この実験において使用された細胞はMIAPACA2(PACA2)であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。PACA2試料は、本質的に上記のように、処理され、そしてゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
この実験において使用された細胞はMIAPACA2(PACA2)であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。PACA2試料は、本質的に上記のように、処理され、そしてゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
PaCa2細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)レベル
LDHおよびPDHのレベルは、本質的に上記のように、LDHおよびPDHに対する一次抗体でブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
LDHおよびPDHのレベルは、本質的に上記のように、LDHおよびPDHに対する一次抗体でブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
PaCa2細胞におけるカスパーゼ3レベル
ブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5% BSA中のカスパーゼ3に対する抗体(Santacruz Biotechnology 番号sc7272、1:200希釈)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。カスパーゼ3に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、各ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5% BSA中のカスパーゼ3に対する抗体(Santacruz Biotechnology 番号sc7272、1:200希釈)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。カスパーゼ3に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、各ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ウェスタンブロット実験6
このウェスタンブロット実験において使用された細胞はPC−3、HepG2、MCF−7、HDFa、およびPACA2であり、これらは、コエンザイムQ10 IV製剤で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24時間後に収穫された。本質的に上記のように、試料は処理され、ゲルは泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
このウェスタンブロット実験において使用された細胞はPC−3、HepG2、MCF−7、HDFa、およびPACA2であり、これらは、コエンザイムQ10 IV製剤で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24時間後に収穫された。本質的に上記のように、試料は処理され、ゲルは泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
異なる細胞型におけるカスパーゼ(Capase)3およびアクチンレベル
カスパーゼ3およびアクチンのレベルは、本質的に上記に記載されるように、カスパーゼ3およびアクチンに対する一次抗体を用いて、ブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
カスパーゼ3およびアクチンのレベルは、本質的に上記に記載されるように、カスパーゼ3およびアクチンに対する一次抗体を用いて、ブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
ウェスタンブロット実験7
この実験において使用された細胞はヒト大動脈平滑筋(HASMC)細胞であり、これは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。本質的に上記のように、HASMC試料は処置され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
この実験において使用された細胞はヒト大動脈平滑筋(HASMC)細胞であり、これは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。本質的に上記のように、HASMC試料は処置され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
アクチンのための実験プロトコール:
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
Hif 1α、カスパーゼ3、およびPDHBのための実験プロトコール:
アクチンブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:200希釈の5%BSA中のHif 1α、カスパーゼ3、またはPDHBに対する抗体で、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。Hif 1αに対する一次抗体(Abcam ab2185;抗ウサギ)は、5%BSA中で1:500希釈であった。カスパーゼ3に対する一次抗体(Santacruz sc7272;抗ウサギ)は、5%BSA中で1:200希釈であった。ピルビン酸デヒドロゲナーゼβ(PDHB)に対する一次抗体(Novus Biologicals H00005162−M03;抗マウス)は、5%BSA中で1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、室温にて1時間、二次抗体(PDHB抗マウス;Hif 1a、およびカスパーゼ3抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、各ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
アクチンブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:200希釈の5%BSA中のHif 1α、カスパーゼ3、またはPDHBに対する抗体で、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。Hif 1αに対する一次抗体(Abcam ab2185;抗ウサギ)は、5%BSA中で1:500希釈であった。カスパーゼ3に対する一次抗体(Santacruz sc7272;抗ウサギ)は、5%BSA中で1:200希釈であった。ピルビン酸デヒドロゲナーゼβ(PDHB)に対する一次抗体(Novus Biologicals H00005162−M03;抗マウス)は、5%BSA中で1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、室温にて1時間、二次抗体(PDHB抗マウス;Hif 1a、およびカスパーゼ3抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、各ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
PKM2、SDHB、およびSDHCのための実験プロトコール:
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、TBS−T中の5%BSA中のPKM2、SDHB、またはSDHCに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。SDHCに対する一次抗体(ABNOVA H00006391−M02;抗マウス)は1:500希釈であった。SDHBに対する一次抗体は、Abcam ab4714−200から;抗マウス;1:1000希釈であっった。ピルビン酸キナーゼM2(PKM2)に対する一次抗体は、Novus Biologicals H00005315−D0IPから;抗ウサギ;1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(SDHB&C抗マウス;およびPKM2抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、TBS−T中の5%BSA中のPKM2、SDHB、またはSDHCに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。SDHCに対する一次抗体(ABNOVA H00006391−M02;抗マウス)は1:500希釈であった。SDHBに対する一次抗体は、Abcam ab4714−200から;抗マウス;1:1000希釈であっった。ピルビン酸キナーゼM2(PKM2)に対する一次抗体は、Novus Biologicals H00005315−D0IPから;抗ウサギ;1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(SDHB&C抗マウス;およびPKM2抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
LDHおよびBikのための実験プロトコール:
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5%BSA中のLDHまたはBikに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。LDHに対する一次抗体はAbcam ab2101から;抗ヤギ;1:1000希釈であった。Bikに対する一次抗体は、Cell Signaling番号9942から;抗ウサギ;1:1000希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(LDH抗ヤギ;Jackson LaboratoriesおよびBik抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5%BSA中のLDHまたはBikに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。LDHに対する一次抗体はAbcam ab2101から;抗ヤギ;1:1000希釈であった。Bikに対する一次抗体は、Cell Signaling番号9942から;抗ウサギ;1:1000希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(LDH抗ヤギ;Jackson LaboratoriesおよびBik抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ウェスタンブロット実験9
使用された細胞はHepG2細胞であり、これは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。本質的に上記のように、HepG2試料は処理され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
使用された細胞はHepG2細胞であり、これは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。本質的に上記のように、HepG2試料は処理され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
アクチンのための実験プロトコール:
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
カスパーゼ3およびMMP−6のための実験プロトコール:
アクチンブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5%BSA中のカスパーゼ3またはMMP−6に対する抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。カスパーゼ3に対する一次抗体(Abcam ab44976−100;抗ウサギ)は5%BSA中1:500希釈であった。MMP−6に対する一次抗体(Santacruz scMM0029−ZB5;抗マウス)は5%BSA中1:100希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、室温にて1時間、二次抗体(MMP−6抗マウス;カスパーゼ3抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
アクチンブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5%BSA中のカスパーゼ3またはMMP−6に対する抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。カスパーゼ3に対する一次抗体(Abcam ab44976−100;抗ウサギ)は5%BSA中1:500希釈であった。MMP−6に対する一次抗体(Santacruz scMM0029−ZB5;抗マウス)は5%BSA中1:100希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、室温にて1時間、二次抗体(MMP−6抗マウス;カスパーゼ3抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
LDHのための実験プロトコール:
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪を伴う、5%BSA中または5%ミルク中のLDHに対する一次抗体とのインキュベーションによって、4℃で一晩プローブされた。LDH080309b1に対する一次抗体(Abcam ab2101;抗ヤギ)は5%BSA中1:1000希釈であった。LDH080309b2に対する一次抗体(Abcam ab2101;抗ヤギ)は5%ミルク中1:1000希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(Jackson Immuno Research 抗ヤギ;1:10,000希釈;305−055−045)で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪を伴う、5%BSA中または5%ミルク中のLDHに対する一次抗体とのインキュベーションによって、4℃で一晩プローブされた。LDH080309b1に対する一次抗体(Abcam ab2101;抗ヤギ)は5%BSA中1:1000希釈であった。LDH080309b2に対する一次抗体(Abcam ab2101;抗ヤギ)は5%ミルク中1:1000希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(Jackson Immuno Research 抗ヤギ;1:10,000希釈;305−055−045)で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
トランスアルドラーゼおよびHif1aのための実験プロトコール:
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5%BSA中のトランスアルドラーゼまたはHif1aに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する抗体(Abcam ab67467;抗マウス)は1:500希釈であった。Hif1aに対する抗体(Abcam ab2185;抗ウサギ)は1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウスまたは抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5%BSA中のトランスアルドラーゼまたはHif1aに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する抗体(Abcam ab67467;抗マウス)は1:500希釈であった。Hif1aに対する抗体(Abcam ab2185;抗ウサギ)は1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウスまたは抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
IGFBP3およびTP53のための実験プロトコール:
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5%BSA中のIGFBP3またはTP53に対する一次抗体で一晩プローブされた。IGFBP3に対する一次抗体(Abcam ab76001;抗ウサギ)は1:100希釈であった。TP53に対する一次抗体(Sigma Aldrich AV02055;抗ウサギ)は1:100希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5%BSA中のIGFBP3またはTP53に対する一次抗体で一晩プローブされた。IGFBP3に対する一次抗体(Abcam ab76001;抗ウサギ)は1:100希釈であった。TP53に対する一次抗体(Sigma Aldrich AV02055;抗ウサギ)は1:100希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
トランスアルドラーゼおよびPDHBのための実験プロトコール:
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5%BSA中のトランスアルドラーゼまたはPDHBに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する一次抗体(Santacruz sc51440;抗ヤギ)は1:200希釈であった。PDHBに対する一次抗体(Novus Biologicals H00005162−M03;抗マウス)は1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ヤギまたは抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5%BSA中のトランスアルドラーゼまたはPDHBに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する一次抗体(Santacruz sc51440;抗ヤギ)は1:200希釈であった。PDHBに対する一次抗体(Novus Biologicals H00005162−M03;抗マウス)は1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ヤギまたは抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
結果
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−1−(IDH−1)
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−1−(IDH−1)は、ミトコンドリア基質の中に通常存在するTCA回路の一部である酵素の1つである。しかし、IDH1は、イソクエン酸からα−ケトグルタル酸への酸化的脱カルボキシル化を触媒し、2段階工程で二酸化炭素を生成する細胞質ゾル型の酵素である。IDH1は、細胞質ゾルおよびペルオキシソームに存在するNADP+依存性型である。IDH1はSer113リン酸化によって不活性化され、クエン酸回路がないものを含む多くの種において発現される。IDH1は、部分的にHIF−1の活性化を通して、不活性化が腫瘍形成に寄与する腫瘍抑制因子として通常は機能しているようである(Bayley2010;Reitman,2010)。最近の研究は、膠芽細胞腫の病因学におけるIDH1の不活性化変異に関わっている(Bleeker,2009;Bleeker,2010)。
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−1−(IDH−1)
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−1−(IDH−1)は、ミトコンドリア基質の中に通常存在するTCA回路の一部である酵素の1つである。しかし、IDH1は、イソクエン酸からα−ケトグルタル酸への酸化的脱カルボキシル化を触媒し、2段階工程で二酸化炭素を生成する細胞質ゾル型の酵素である。IDH1は、細胞質ゾルおよびペルオキシソームに存在するNADP+依存性型である。IDH1はSer113リン酸化によって不活性化され、クエン酸回路がないものを含む多くの種において発現される。IDH1は、部分的にHIF−1の活性化を通して、不活性化が腫瘍形成に寄与する腫瘍抑制因子として通常は機能しているようである(Bayley2010;Reitman,2010)。最近の研究は、膠芽細胞腫の病因学におけるIDH1の不活性化変異に関わっている(Bleeker,2009;Bleeker,2010)。
コエンザイムQ10での処置は、MCF−7、SKMEL28、HepG2、およびPaCa−2細胞を含む癌細胞株におけるIDH1の発現を増加した。SCC25細胞系統においては中程度の発現の増加が存在した。ヒト由来初代線維芽細胞HDFaとは対照的に、nFIBおよびヒト大動脈平滑筋細胞HASMCは、コエンザイムQ10に応答して、IDH1の発現パターンの有意な変化を実証しなかった。α−ケトグルタル酸(α−KG)は、TCA回路における鍵となる中間体であり、イソクエン酸から生化学的に合成され、最終的にはスクシニルCoAに転換され、薬物となり得るMIMおよびエピシフターである。α−KGはTCA回路の中間体を補充するために細胞によって使用でき、酸化的リン酸化を増加するための還元当量の生成を生じるので、α−KGの生成はTCA回路における決定的な岐路として働く。したがって、コエンザイムQ10媒介性のIDH1発現の増加は、癌細胞における酸化的リン酸化を増強するためにミトコンドリアのTCA回路によって使用できる中間体の形成を生じる。結果は以下の表に要約される。
ATPクエン酸リアーゼ(ACL)
ATPクエン酸リアーゼ(ACL)は、細胞質ゾル中でアセチルCoAおよびオキサロ酢酸の形成を触媒するホモテトラマー(〜126kd)酵素である。この反応は、糖生成と同様に、脂肪酸、コレステロール、およびアセチルコリンの生合成のための最初の非常に重要なステップである(Towle et al.,1997)。栄養およびホルモンがこの鍵となる酵素の発現レベルおよびリン酸化状態を調節している。AktおよびPKAによるACLのSer454リン酸化が報告されている(Berwick.,DC MW et al.,2002;Pierce MW et al.,1982)。
ATPクエン酸リアーゼ(ACL)は、細胞質ゾル中でアセチルCoAおよびオキサロ酢酸の形成を触媒するホモテトラマー(〜126kd)酵素である。この反応は、糖生成と同様に、脂肪酸、コレステロール、およびアセチルコリンの生合成のための最初の非常に重要なステップである(Towle et al.,1997)。栄養およびホルモンがこの鍵となる酵素の発現レベルおよびリン酸化状態を調節している。AktおよびPKAによるACLのSer454リン酸化が報告されている(Berwick.,DC MW et al.,2002;Pierce MW et al.,1982)。
データは、正常細胞および癌細胞におけるATPクエン酸リアーゼに対するコエンザイムQ10の効果を説明している。癌細胞において、ACL酵素の発現の用量依存的な減少が存在することが一貫して観察されている。対照的に、正常細胞においては、ACLの発現の増加に向かう傾向が存在するようである。細胞質ゾルACLは、増殖因子刺激の間および分化の間に、細胞におけるヒストンアセチル化のために必須であることが実証されてきた。新生物プロセスにおいて重要なプロセスであるヒストンアセチル化のために必須であるアセチルCoAを生成するために、ACLが細胞質ゾルのグルコース由来のクエン酸を利用するという事実は、癌細胞機能に影響を与える際のコエンザイムQ10誘導ACL発現の役割を実証する。細胞質ゾルACLによってクエン酸から生成されたアセチルCoAは、細胞分裂の間の新たな脂質およびコレステロールの生合成のための供給源として働く。したがって、コエンザイムQ10で誘導されるACL発現の変化は、癌細胞に対して正常細胞における脂質およびコレステロールの合成のためのアセチルCoAの利用可能性を変化させる。結果は以下の表に要約される。
ピルビン酸キナーゼM2(PKM2)
ピルビン酸キナーゼは、解糖経路に関わる酵素である。これは、ホスホエノールピルビン酸(PEP)からアデノシン二リン酸(ADP)へのリン酸の転移の原因であり、ATPおよびピルビン酸を生成する。PKM2は、解糖のピルビン酸キナーゼのアイソザイムであり、その発現は組織の代謝機能によって特徴付けられ、すなわち、M2アイソザイムは、胚細胞などの高いエネルギーの必要性を伴う正常細胞を迅速に増殖させる際に発現され、高い率の核酸合成を必要とする肺細胞および膵島細胞などの少数の分化した正常細胞においてもまた発現される。PKM2は、細胞のエネルギーの要求に合致するために解糖経路に対するそれらの依存性に起因して、腫瘍細胞中で高度に発現されている。通常は胚に限定されていると考えられているPKM2アイソフォームは、癌性細胞中で再発現されている。PKM2を発現する細胞は、より強力な好気性解糖表現型を好み(代謝表現型のシフトを示す)、乳酸産生の増加および酸化的リン酸化の減少を伴う。したがって、癌細胞におけるPKM2の発現の減少は、解糖経路を経由してエネルギー生成をシフトまたは下方調節し、これは、癌の治療において有用であるストラテジーである。データは、正常細胞および癌細胞におけるPKM2の変動する発現パターンを実証し、癌細胞は正常と比較してより高いレベルの発現を実証する。コエンザイムQ10での細胞の処置は、正常細胞および癌細胞において、PKM2のより上側のおよびより下側のバンドレベルの発現パターンを変化させた。試験された癌細胞においてPKM2発現の用量依存的な減少が存在し、および癌細胞において大きな変化は観察されなかった。結果は以下の表に要約される。
ピルビン酸キナーゼは、解糖経路に関わる酵素である。これは、ホスホエノールピルビン酸(PEP)からアデノシン二リン酸(ADP)へのリン酸の転移の原因であり、ATPおよびピルビン酸を生成する。PKM2は、解糖のピルビン酸キナーゼのアイソザイムであり、その発現は組織の代謝機能によって特徴付けられ、すなわち、M2アイソザイムは、胚細胞などの高いエネルギーの必要性を伴う正常細胞を迅速に増殖させる際に発現され、高い率の核酸合成を必要とする肺細胞および膵島細胞などの少数の分化した正常細胞においてもまた発現される。PKM2は、細胞のエネルギーの要求に合致するために解糖経路に対するそれらの依存性に起因して、腫瘍細胞中で高度に発現されている。通常は胚に限定されていると考えられているPKM2アイソフォームは、癌性細胞中で再発現されている。PKM2を発現する細胞は、より強力な好気性解糖表現型を好み(代謝表現型のシフトを示す)、乳酸産生の増加および酸化的リン酸化の減少を伴う。したがって、癌細胞におけるPKM2の発現の減少は、解糖経路を経由してエネルギー生成をシフトまたは下方調節し、これは、癌の治療において有用であるストラテジーである。データは、正常細胞および癌細胞におけるPKM2の変動する発現パターンを実証し、癌細胞は正常と比較してより高いレベルの発現を実証する。コエンザイムQ10での細胞の処置は、正常細胞および癌細胞において、PKM2のより上側のおよびより下側のバンドレベルの発現パターンを変化させた。試験された癌細胞においてPKM2発現の用量依存的な減少が存在し、および癌細胞において大きな変化は観察されなかった。結果は以下の表に要約される。
乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)
LDHは、NADHおよびNAD+の同時相互変換を伴う、ピルビン酸および乳酸の相互交換を触媒する酵素である。これは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を負担して、還元当量の生成およびATP生成のための低い細胞酸素の緊張の下で、ピルビン酸をラクテート(乳酸)に転換する能力を有する。癌細胞は、典型的には、ATPおよび還元当量および還元ミトコンドリアOXPHOSを生成するために解糖流入を維持するためにLDHの発現の増加を実証する。したがって、癌細胞における還元当量は、TCA回路にピルビン酸が入ることを容易にするための乳酸の生成から代謝をシフトさせる。コエンザイムQ10を用いる処置は、癌における乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)発現を減少させ、これは正常細胞においては最小の効果を伴うものであり、細胞質ピルビン酸から乳酸への転換を最小化することによって、解糖からミトコンドリアOXPHOSへのATPの生成のための癌細胞の生体エネルギーのシフトを誘発する際のコエンザイムQ10の役割を支持する。結果は以下の表に要約される。
LDHは、NADHおよびNAD+の同時相互変換を伴う、ピルビン酸および乳酸の相互交換を触媒する酵素である。これは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を負担して、還元当量の生成およびATP生成のための低い細胞酸素の緊張の下で、ピルビン酸をラクテート(乳酸)に転換する能力を有する。癌細胞は、典型的には、ATPおよび還元当量および還元ミトコンドリアOXPHOSを生成するために解糖流入を維持するためにLDHの発現の増加を実証する。したがって、癌細胞における還元当量は、TCA回路にピルビン酸が入ることを容易にするための乳酸の生成から代謝をシフトさせる。コエンザイムQ10を用いる処置は、癌における乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)発現を減少させ、これは正常細胞においては最小の効果を伴うものであり、細胞質ピルビン酸から乳酸への転換を最小化することによって、解糖からミトコンドリアOXPHOSへのATPの生成のための癌細胞の生体エネルギーのシフトを誘発する際のコエンザイムQ10の役割を支持する。結果は以下の表に要約される。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ−B(PDH−E1)
ピルビン酸デヒドロゲナーゼベータ(PDH−E1)は、ピルビン酸をアセチルCoAに転換するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体(PDC)の一部である第1の酵素成分である。PDH−E1は、その活性のためにチアミンをコファクターとして必要とし、ミトコンドリアにおけるTCAサイクルに入るためにピルビン酸からアセチルCoAへの転換のために必須であるPDC複合体における最初の2つの生化学反応を実施する。したがって、癌細胞におけるPDH−E1の発現の増加に伴って、同時に起こるPKM2およびLDHの発現の減少は、ATPの生成のためにミトコンドリアOXPHOSを増強することに向けてピルビン酸が入ることの速度を増強する。データは、正常細胞および癌細胞系統におけるPDH−E1の発現のために、この酵素のベースライン発現が、正常細胞と比較して、癌細胞で減少されていることを示す。コエンザイムQ10を用いる処置は、癌細胞におけるPDH−E1タンパク質の発現の進行的な増加に関連し、正常細胞においては最小限の変化を伴う。結果は以下の表に要約される。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼベータ(PDH−E1)は、ピルビン酸をアセチルCoAに転換するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体(PDC)の一部である第1の酵素成分である。PDH−E1は、その活性のためにチアミンをコファクターとして必要とし、ミトコンドリアにおけるTCAサイクルに入るためにピルビン酸からアセチルCoAへの転換のために必須であるPDC複合体における最初の2つの生化学反応を実施する。したがって、癌細胞におけるPDH−E1の発現の増加に伴って、同時に起こるPKM2およびLDHの発現の減少は、ATPの生成のためにミトコンドリアOXPHOSを増強することに向けてピルビン酸が入ることの速度を増強する。データは、正常細胞および癌細胞系統におけるPDH−E1の発現のために、この酵素のベースライン発現が、正常細胞と比較して、癌細胞で減少されていることを示す。コエンザイムQ10を用いる処置は、癌細胞におけるPDH−E1タンパク質の発現の進行的な増加に関連し、正常細胞においては最小限の変化を伴う。結果は以下の表に要約される。
カスパーゼ3
アポトーシスの開始の制御は、しばしば、開始因子のカスパーゼである、カスパーゼ−2、−9、および−8/10のレベルで発揮される。外部のアポトーシスの経路において、カスパーゼ−8は、一旦活性になると、実行因子のカスパーゼ(例えば、カスパーゼ−3)を直接切断し、活性化する。活性型カスパーゼ−3は、他のカスパーゼ(6、7、および9)ならびに細胞中の関連する標的(例えば、PARPおよびDFF)を活性化する。これらの研究において、エフェクターカスパーゼ−3タンパク質のレベルは、コエンザイムQ10に応答して、癌細胞系統および正常細胞系統において測定された。アポトーシスの制御は開始因子カスパーゼを通してであり、その代わりに、多数のシグナル伝達経路が、エフェクターカスパーゼの直接阻害を通してアポトーシスシグナルの伝達を遮断することが注目されるべきである。例えば、P38MAPKは、カスパーゼ−3をリン酸化し、その活性を抑制する(Alvarado−Kristensson et al.,2004)。興味深いことに、同じ研究におけるタンパク質ホスファターゼ(PP2A)またはプロテインキナーゼCデルタ(PKCデルタ)の活性化(Voss et al.,2005)は、カスパーゼ−3活性化を増幅し、そしてアポトーシスシグナルの伝達を強化するように、p38MAPKの効果と反対に作用できる。それゆえに、カスパーゼ−3活性化のレベルにおける事象またはカスパーゼ3活性化後の事象は、いくつかの場合において細胞の究極の運命を決定するかもしれない。
アポトーシスの開始の制御は、しばしば、開始因子のカスパーゼである、カスパーゼ−2、−9、および−8/10のレベルで発揮される。外部のアポトーシスの経路において、カスパーゼ−8は、一旦活性になると、実行因子のカスパーゼ(例えば、カスパーゼ−3)を直接切断し、活性化する。活性型カスパーゼ−3は、他のカスパーゼ(6、7、および9)ならびに細胞中の関連する標的(例えば、PARPおよびDFF)を活性化する。これらの研究において、エフェクターカスパーゼ−3タンパク質のレベルは、コエンザイムQ10に応答して、癌細胞系統および正常細胞系統において測定された。アポトーシスの制御は開始因子カスパーゼを通してであり、その代わりに、多数のシグナル伝達経路が、エフェクターカスパーゼの直接阻害を通してアポトーシスシグナルの伝達を遮断することが注目されるべきである。例えば、P38MAPKは、カスパーゼ−3をリン酸化し、その活性を抑制する(Alvarado−Kristensson et al.,2004)。興味深いことに、同じ研究におけるタンパク質ホスファターゼ(PP2A)またはプロテインキナーゼCデルタ(PKCデルタ)の活性化(Voss et al.,2005)は、カスパーゼ−3活性化を増幅し、そしてアポトーシスシグナルの伝達を強化するように、p38MAPKの効果と反対に作用できる。それゆえに、カスパーゼ−3活性化のレベルにおける事象またはカスパーゼ3活性化後の事象は、いくつかの場合において細胞の究極の運命を決定するかもしれない。
カスパーゼ−3はシステイン−アスパラギン酸プロテアーゼであり、これは、細胞アポトーシスの実行フェーズで中心的な役割を果たす。癌細胞におけるカスパーゼ3のレベルは、コエンザイムQ10処置に伴って増加される。対照的に、正常細胞におけるカスパーゼ−3の発現は、正常細胞において中程度に減少された。結果は以下の表に要約される。
コハク酸デヒドロゲナーゼ(SDH)
コハク酸−コエンザイムQ還元酵素としてもまた知られるコハク酸デヒドロゲナーゼは、TCAと電子伝達系の両方に関わるミトコンドリア内膜の複合体である。TCAにおいては、この複合体は、ユビキノンからユビキノールへの同時に起こる還元に伴って、コハク酸からフマル酸への酸化を触媒する(Baysal et al.,Science 2000;およびTomlinson et al.,Nature Genetics 2002)。SDHのB、C、およびDサブユニットにおける生殖系列突然変異は、家族性傍神経節腫または平滑筋腫の開始事象であることが見い出された(Baysal et al.,Science 2000)。
コハク酸−コエンザイムQ還元酵素としてもまた知られるコハク酸デヒドロゲナーゼは、TCAと電子伝達系の両方に関わるミトコンドリア内膜の複合体である。TCAにおいては、この複合体は、ユビキノンからユビキノールへの同時に起こる還元に伴って、コハク酸からフマル酸への酸化を触媒する(Baysal et al.,Science 2000;およびTomlinson et al.,Nature Genetics 2002)。SDHのB、C、およびDサブユニットにおける生殖系列突然変異は、家族性傍神経節腫または平滑筋腫の開始事象であることが見い出された(Baysal et al.,Science 2000)。
ウェスタンブロッティング分析は、コエンザイムQ10で処置された癌細胞のミトコンドリア調製物においてSDHサブユニットBの発現を特徴付けるために使用された。結果は、コエンザイムQ10処置が、細胞のミトコンドリアにおけるSDHタンパク質レベルの増加に関連することを示唆する。これらの結果は、コエンザイムQ10の作用のメカニズムの1つがTCA回路およびミトコンドリアに向かう細胞の代謝を、SDHBなどのミトコンドリア酵素のレベルを増加することによってシフトされることを示唆する。結果は以下の表に要約される。
低酸素誘導因子−1
低酸素誘導因子(Hif)は、αおよびβサブユニットから構成される転写因子である。酸素正常状態下では、Hif1αのタンパク質レベルは、翻訳後事象の結果を介するその連続的な分解により、非常に低い。解糖と酸化的リン酸化の間のシフトは、一般的には、ピルビン酸の異化的な運命を決定する2つの酵素PDHおよびLDHの相対的な活性によって制御されると考えられている。Hifは、PDKを刺激することによって、LDHレベルを誘導し、PDH活性を阻害することによって、この決定的な分岐(bifurgation)点を制御する。ミトコンドリアから細胞質ゾルにピルビン酸代謝を迂回させるこの能力により、Hifは、癌細胞における生体エネルギーのスイッチの決定的な媒介因子であると考えられている。
低酸素誘導因子(Hif)は、αおよびβサブユニットから構成される転写因子である。酸素正常状態下では、Hif1αのタンパク質レベルは、翻訳後事象の結果を介するその連続的な分解により、非常に低い。解糖と酸化的リン酸化の間のシフトは、一般的には、ピルビン酸の異化的な運命を決定する2つの酵素PDHおよびLDHの相対的な活性によって制御されると考えられている。Hifは、PDKを刺激することによって、LDHレベルを誘導し、PDH活性を阻害することによって、この決定的な分岐(bifurgation)点を制御する。ミトコンドリアから細胞質ゾルにピルビン酸代謝を迂回させるこの能力により、Hifは、癌細胞における生体エネルギーのスイッチの決定的な媒介因子であると考えられている。
コエンザイムQ10での処置は、癌細胞のミトコンドリア調製物において、後でのHif1αタンパク質レベルを減少させた。正常細胞の全細胞溶解物において、Hif1aの下側のバンドが観察され、同様に減少を示した。結果は以下の表に要約される。
実施例21:CoQ10によって処置された正常細胞および癌細胞における酸素消費速度(OCR)および細胞外酸化(ECAR)の分析
この実施例は、ストレッサー(例えば、高血糖、低酸素、乳酸)の非存在下および/または存在下で、本発明の代表的なMIM/エピシフター−CoQ10−による処置への細胞の曝露が、正常な生理学的条件下での正常細胞において観察される値を代表する解糖/乳酸生合成およびミトコンドリア酸化的リン酸化(ECARおよびOCR値によって測定されるような)へのシフトと関連することを実証する。
この実施例は、ストレッサー(例えば、高血糖、低酸素、乳酸)の非存在下および/または存在下で、本発明の代表的なMIM/エピシフター−CoQ10−による処置への細胞の曝露が、正常な生理学的条件下での正常細胞において観察される値を代表する解糖/乳酸生合成およびミトコンドリア酸化的リン酸化(ECARおよびOCR値によって測定されるような)へのシフトと関連することを実証する。
出願人は、癌細胞中のCoQ10での処置が、解糖および乳酸生合成の同時に起こる減少を伴う、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を増強する特定のタンパク質の発現の変化と関連することを先のセクションで実証した。この実施例は、インビトロ実験モデルにおける溶存酸素および細胞外pHレベルを測定する機器であるSeaHorse XF分析装置(SeaHorse Biosciences Inc,North Billerica,MA)を使用して細胞系統において酸素消費速度(OCR)を測定することによって、ミトコンドリアの酸化的リン酸化の直接測定を得ることができることを示す。
細胞外微小環境のpHは、腫瘍中では、細胞内(細胞質)および周囲の正常組織のpHと比較して、比較的酸性である。この腫瘍の特徴は、細胞外マトリックス(ECM)に侵入する能力、続いてシグナル伝達カスケードを開始する腫瘍転移の代表的な特質を含む複数の目的に役立ち、このシグナル伝達カスケードは、以下をさらに調節する:
・腫瘍の血管新生
・細胞周期のターンオーバーを制御する停止メカニズムの活性化の増加
・免疫監視に対する細胞の回避システムを容易にする免疫調節メカニズム
・解糖流入および乳酸利用への依存性を増加する代謝制御エレメント
・発癌性を増加させるように働く、Bcl−2、IAP、EndoG、AIFなどの鍵となるアポトーシス遺伝子ファミリーの異常調節。
・腫瘍の血管新生
・細胞周期のターンオーバーを制御する停止メカニズムの活性化の増加
・免疫監視に対する細胞の回避システムを容易にする免疫調節メカニズム
・解糖流入および乳酸利用への依存性を増加する代謝制御エレメント
・発癌性を増加させるように働く、Bcl−2、IAP、EndoG、AIFなどの鍵となるアポトーシス遺伝子ファミリーの異常調節。
任意の特定の理論に束縛されることは望まないが、腫瘍における外部微小環境の酸性pHは、解糖表現型の変化からの乳酸産生の増加に起因する、腫瘍細胞から押し出された水素イオン濃度の増加の結果である。
この実験において、正常細胞系統におけるOCRおよび細胞外酸性化速度(ECAR)は、ベースラインの値を決定するために、CoQ10の存在下および非存在下で得られた。そのネイティブな栄養環境において、正常細胞系統における基礎OCR速度は異なっており、通常は、身体中の細胞の生理学的役割の関数であることが観察された。
例えば、1つのセットの実験は、ヒト成体皮膚線維芽細胞系統である、非癌性細胞系統HDFaを使用して実施された。線維芽細胞は、最初に合成され、組織のために構造フレームワーク(ストロマ)を形成する、細胞外マトリックス(ECM)成分およびコラーゲンを分泌する。加えて、線維芽細胞は、創傷治癒および局所的免疫調節などの多数の機能の組織の使節(ambassadors)として働くことが知られている。正常な生理学的条件下では、正常な線維芽細胞におけるエネルギー要求は、解糖と酸化的リン酸化の組み合わせを使用することに合致する−解糖はECMの合成のための必要な栄養を提供する。
HDFaと対照的に、HASMC(ヒト大動脈平滑筋細胞)は、動脈、静脈、リンパ管、胃腸管、呼吸管、膀胱、および興奮−収縮結合の調節を受ける能力を有する他の組織において見い出される。HASMC細胞などの平滑筋の収縮を受ける能力はATPによって提供されるエネルギーを要求する。これらの組織は、ATPがミトコンドリアから供給され得る低いエネルギーモードから、迅速なATPの生成のために解糖に切り換えることによってエネルギーが提供される高エネルギーモード(運動/ストレスの間)に移行する。したがって、正常平滑筋細胞は、ミトコンドリアOXPHOSと解糖の組み合わせを使用でき、正常な生理学的環境下でのそれらのエネルギー要求を満たす。
それらのそれぞれの生理学的役割(すなわち、HDFaおよびHASMC)の違いは、SeaHorse XF分析装置を使用してこれらの細胞系統において測定される休止状態のOCR値で観察された。図29および30は、生理学的に正常なグルコース条件(約4.6mM)および高グルコース(高血糖)条件において増殖したHDFaおよびHASMC細胞におけるOCRを記載する。
正常な酸素利用能下にあるいずれの処理も行わなかったHDFaについてのベースラインOCR値は、5.5mMのグルコースの存在下ではおよそ40pmol/分である(図29)。この値は、細胞が22mMグルコースに維持されたときにわずかに上昇された。対照的に、HASMC細胞において、5.5mMグルコースにおけるOCR値は約90ピコモル/分であり、OCR値は、22mMグルコースの間に約40ピコモル/分まで下降した。したがって、高血糖条件下では、HDFaとHASMCの間の示差的な応答が存在し、それらのそれぞれの生理学的な構成および機能における固有の違いをさらに実証する。
細胞におけるCoQ10での処置は、正常(5mM)グルコース条件において観察された状態に代表的であるOCRの変化と関連する。生理学的応答の複雑性は、低酸素緊張の存在下で混合される。したがって、CoQ10曝露は、特定の細胞に対して固有である生理学的状態に向かう正常細胞中のOCR速度の変化と関連する。
以下の表51は、5.5mMおよび22mMグルコースにおける正常酸素および低酸素条件下でのCoQ10の存在下および非存在下でのHDFa細胞中のECAR値(mpH/分)を説明する。正常細胞において、CoQ10での処置は、それがたとえこれらの細胞においてOCRに影響を与えたとしても、ECAR値に対して最小限の影響を有したことが観察できる。高グルコース低酸素条件において、CoQ10での処置は、未処置の正常酸素条件において観察された値までの、上昇したECARの低下に関連した。
表52において、HASMCにおける測定されたベースラインECAR値(mpH/分)はHDFaのそれと比較して高かった。低酸素状態の誘導は、解糖の増加に続いて起こる細胞内低酸素誘導性アシドーシスと関連する可能性が最も高いECARの増加を引き起こした。
CoQ10での処置は、正常酸素での正常グルコース条件において観察される値に向けた低酸素条件における高血糖HASMC細胞におけるECAR速度の下向きの傾向と関連することが観察された。これらのデータは、特定の細胞の型の生理学的役割に固有である生理学的変数、異常な状態において観察される変化(例えば、高血糖)の存在が、CoQ10で処置されたときに正常に向けてシフトされることを実証する。
対照的に、癌細胞(例えば、MCF−7、PaCa−2)は、培養中の維持のための解糖表現型に起因して、正常細胞と比較してより高いレベルのグルコースでの培養に固有に準備されている。CoQ10での処置は、OCR値の一貫した減少を引き起こした(図31および図32)。
MCF−7およびPaCa−2細胞におけるOCR値に対するCoQ10の効果は、正常HDFaおよびHASMC細胞のそれと類似しており、この変動性応答は、癌細胞系統の個々の代謝プロフィールに基づいて治療応答を示唆するものであった。
表53は、PaCa−2細胞におけるECAR値を記載する。正常細胞と比較して、癌細胞は、ATP生成のために高グルコースを使用するように表現型的に準備されており(解糖の増強)、21mpH/分でより高いECARを生じる(表53、未処置正常酸素についてのECAR17mM)。CoQ10での処置は、解糖で生成された乳酸の減少に付随する可能性が最も高い、これらの条件下でのECAR速度の有意な減少を生じる。これらの細胞におけるOCRの関連する減少は、ミトコンドリアOXPHOSの効率の増加と最も関連したようであった。
OCRおよびECARの同様の比較(データ示さず)は、HAEC(正常ヒト大動脈内皮細胞)、MCF−7(乳癌)、HepG2(肝臓癌)、および高度に転移性のPC−3(前立腺癌)細胞系統を含む多数の他の正常細胞および癌細胞において決定された。試験された細胞系統のすべてにおいて、ストレッサー(例えば、高血糖、低酸素、乳酸)の非存在下および/または存在下でのCoQ10への曝露は、正常の生理学的条件下での正常細胞において観察される値に代表的なOCRおよびECARの値のシフトと関連した。したがって、細胞死を含む、癌の治療におけるCoQの全体的な効果は、解糖からミトコンドリアOXPHOSへの細胞の生体エネルギーのシフトと協調した、プロテオミクス的、ゲノム的、代謝学な結果に対するその集合的な影響の下流の効果である。
実施例22:CoQ10の生合成のためのビルディングブロック分子
この実施例は、CoQ10生合成の特定の前駆体、例えば、ベンゾキノン環の生合成のためのもの、およびイソプレノイド反復の生合成のためのもの、ならびにベンゾキノン環へのそれらの付属物(「ビルディングブロック成分」)が、単独で投与でき、もしくは標的細胞と組み合わせて投与でき、ならびにアポトーシス阻害剤Bcl−2の下方調節、および/またはアポトーシス促進因子カスパーゼ−3の上方調節をもたらすことを実証する。特定の前駆体またはそれらの組み合わせは、細胞増殖もまた阻害し得る。データは、CoQ10投与と実質的に同じ結果を達成するために、CoQ10前駆体がCoQ10の代わりに使用されてもよいことを示唆する。
この実施例は、CoQ10生合成の特定の前駆体、例えば、ベンゾキノン環の生合成のためのもの、およびイソプレノイド反復の生合成のためのもの、ならびにベンゾキノン環へのそれらの付属物(「ビルディングブロック成分」)が、単独で投与でき、もしくは標的細胞と組み合わせて投与でき、ならびにアポトーシス阻害剤Bcl−2の下方調節、および/またはアポトーシス促進因子カスパーゼ−3の上方調節をもたらすことを実証する。特定の前駆体またはそれらの組み合わせは、細胞増殖もまた阻害し得る。データは、CoQ10投与と実質的に同じ結果を達成するために、CoQ10前駆体がCoQ10の代わりに使用されてもよいことを示唆する。
実験において使用された特定の例示的な実験条件は以下に列挙される。
Skmel−28黒色腫細胞は、5%ウシ胎仔血清(FBS)および1×最終濃度の抗生物質を補充したDMEM/F12中で培養された。細胞は、85%コンフルエンシーまで増殖され、3、6、12、および24時間の間、ビルディングブロック(構成単位)成分で処置された。次いで、細胞はペレット化され、ウェスタンブロット分析が実施された。
試験ビルディングブロック成分は、L−フェニルアラニン、DL−フェニルアラニン、D−フェニルアラニン、L−チロシン、DL−チロシン、D−チロシン、4−ヒドロキシ−フェニルピルベート、フェニルアセテート、3−メトキシ4−ヒドロキシマンデレート(バニリルマンデル酸またはVMA)、バニリン酸、4−ヒドロキシ−ベンゾエート、ピリドキシン、パンテノール、メバロン酸、アセチルグリシン、アセチルCoA、ファルネシル、および2,3−ジメトキシ−5−メチル−p−ベンゾキノンを含んだ。
ウェスタンブロット分析において、細胞は冷PBS中でペレット化され、溶解され、そしてタンパク質レベルはBCAタンパク質アッセイを使用して定量された。全細胞溶解物は、4%ローディング12%泳動Tris−HClゲルにロードされた。次いで、タンパク質はニトロセルロースペーパーに転写され、次いで、5%ミルクTris緩衝液で1時間ブロックされた。次いで、タンパク質は、一次抗体(Bcl−2およびカスパーゼ−3)に一晩曝露された。次いで、ニトロセルロースペーパーは、Pico Chemilluminescentに5分間曝露され、タンパク質発現が記録された。曝露後、アクチンが同じ方法を使用して定量された。ImageJを使用して、タンパク質発現のレベルが定量された。t検定が使用されて統計学的有意さについて分析した。
実験の例証的な結果は以下に要約される。
ビルディングブロック成分L−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析:キノン環構造についての合成経路に着手する前に、L−フェニルアラニンがチロシンに転換される。ウェスタンブロット分析は、黒色腫細胞におけるアポトーシスタンパク質の発現の任意の変化を定量するように実施された。試験された濃度は5μM、25μM、および100μMであった。初期の研究は、0.4Mの濃度のフェニルアラニンを含んだDMEM/F12培地にL−フェニルアラニンを加えた。5μM、25μM、および100μMについては、培地中のL−フェニルアラニンの最終濃度は、それぞれ、0.405M、0.425M、および0.500Mであった。これらの最終濃度は、3、6、12、および24時間のインキュベーション時間の間、Skmel−28細胞に対して試験された。細胞は、80%コンフルエンシーまで増殖され、その後、処置培地を加え、上記のようにウェスタンブロット分析手順を使用して収穫された。統計学的に有意なBcl−2の減少は、3時間および12時間のインキュベーション後に、100μM L−フェニルアラニンについて観察された。5μM L−フェニルアラニンについては、統計学的に有意なBcl−2の減少は、インキュベーションの6時間後に観察された。25μM L−フェニルアラニンについては、統計学的に有意なBcl−2の減少、および統計学的に有意なカスパーゼ−3の増加が12時間のインキュベーション後に観察された。統計学的に有意なBcl−2の減少は、アポトーシス能力の変化を示し、統計学的に有意なカスパーゼ−3の増加は細胞がアポトーシスを受けていることを確認する。たとえ試料サイズおよび標準偏差に起因して、この実験においてこれらの時点は統計学的に有意ではないとしても、対照と比較してBcl−2の減少の一定の傾向が存在した。
ビルディングブロック成分D−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析:生物活性L−フェニルアラニンの化学合成型であるD−フェニルアラニンは、L−フェニルアラニンに対する比較のために試験された。3つすべての濃度について(5μM、25μM、および100μMのD−フェニルアラニン)、インキュベーションの6時間後にBcl−2発現の有意な減少が存在した。加えて、5μMおよび25μMについては、インキュベーションの3時間後に有意な減少が存在した。5μMおよび100μM濃度については、カスパーゼ−3発現の有意な増加が、6時間のインキュベーション後に観察された。
ビルディングブロック成分DL−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析:DL−フェニルアラニンもまた、L−フェニルアラニンとの比較のために試験された。再度、5μM、25μM、および100μMの濃度がSkmel−28細胞に対して試験された。インキュベーション時間は、3、6、12、および24時間であった。統計学的に有意なカスパーゼ−3の増加が3時間のインキュベーション後に観察された。統計学的に有意なBcl−2の減少が24時間のインキュベーション後に観察された。Bcl−2の減少およびカスパーゼ−3の増加の傾向が、すべての他の濃度およびインキュベーション時点であるが、これらは、この実験においては統計学的に有意ではなかった。
ビルディングブロック成分L−チロシンのウェスタンブロット分析:L−チロシンはCoQ10のキノン環構造の合成のためのビルディングブロック成分である。L−チロシンの初期の試験は、ウェスタンブロット分析のために十分に高いタンパク質濃度を生じなかった。この研究から25μMより下の濃度がウェスタンブロット分析のために試験された。使用されたDMEM/F12培地は、0.398467MのL−チロシン二ナトリウム塩を含んだ。初期濃度は500nM、5μM、および15μM増加された。統計学的に有意なカスパーゼ−3の増加は、12時間のインキュベーション後に500nM濃度について観察された。統計学的に有意なカスパーゼ−3の増加もまた、5Aについて観察され、統計学的に有意なBcl−2の減少は、24時間のインキュベーション後に5μM濃度について観察された。統計学的に有意なBcl−2の減少は、24時間のインキュベーション後に500μMおよび5μM濃度について観察された。
ビルディングブロック成分D−チロシンのウェスタンブロット分析:L−チロシンの合成型であるD−チロシンは、黒色腫(melanonal)細胞に対するL−チロシンのアポトーシス性効果に対しての比較のために試験された。L−チロシンを用いる初期の研究に基づいて、ウェスタンブロット分析のために25μMより下の濃度が選ばれた。試験された濃度は1μM、5μM、および15μMであった。D−チロシンは、12および24時間の期間の間、5μMおよび15μM濃度についてBcl−2発現の減少を示した。カスパーゼ−3は、3、12、および24時間の期間で、5μM濃度について有意に増加された。12および24時間の期間で、1μMについてカスパーゼ−3発現の増加もまた存在した。加えて、12時間の期間で、5μMについてカスパーゼ−3発現の増加が存在する。
ビルディングブロック成分DL−チロシンのウェスタンブロット分析:L−チロシンの合成型であるDL−チロシンもまた、細胞に対するL−チロシンのアポトーシス効果に対する比較のために試験された。12時間のインキュベーション後に1μMおよび15μM濃度において、ならびに24時間のインキュベーション後に5μMについて見られたBcl−2発現の統計学的な減少が存在する。カスパーゼ−3発現の増加もまた、12時間のインキュベーション後に5μMおよび15μMについて観察された。
ビルディングブロック成分4−ヒドロキシ−フェニルピルベートのウェスタンブロット分析:4−ヒドロキシ−フェニルピルベートは、アミノ酸であるチロシンおよびフェニルアラニンから誘導され、環構造の合成において役割を果たす可能性がある。1μM、5μM、および15μMの濃度がBcl−2およびカスパーゼ−3発現のために試験された。5μMおよび15μM濃度について、24時間のインキュベーション後にBcl−2発現の有意な減少が存在し、12時間のインキュベーション後にカスパーゼ−3発現の有意な増加が存在した。
ビルディングブロック成分フェニルアセテートのウェスタンブロット分析:フェニルアセテートは、4−ヒドロキシ−ベンゾエートに転換される能力を有し、これは、環構造への側鎖の結合において役割を果たす。試験された濃度は、1μM、5μM、および15μMであった。フェニルアセテートについては、12時間および24時間のインキュベーション後に5μMおよび15μMの濃度についてBcl−2発現の減少が存在した。カスパーゼ−3発現の増加は、12時間および24時間のインキュベーション後に5μMおよび15μMの濃度について観察された。
ビルディングブロック成分3−メトキシ4−ヒドロキシマンデレート(バニリルマンデレートまたはVMA)のウェスタンブロット分析:VMAは、CoQ10キノン環構造の合成のためのさらなる成分である。試験された濃度は100nM、250nM、500nM、1μM、25μM、50μM、および100μMであった。統計学的に有意なアポトーシス効果はこの実験において観察されなかったが、データはBcl−2発現の下向きの傾向を示した。
ビルディングブロック成分バニリン酸のウェスタンブロット分析:バニリン酸(Vanillic)はキノン環の合成のための前駆体であり、500nm、5μM、および15μMの濃度で試験された。ウェスタンブロット分析は、Bcl−2およびカスパーゼ−3発現を測定した。バニリン酸は24時間インキュベーション時点での500nMおよび5μMの濃度についてBcl−2発現を有意に減少することが示された。15μM濃度について、3時間のインキュベーション後にBcl−2発現の減少が存在した。24時間、15μMとともにインキュベートした細胞において、カスパーゼ−3発現の有意な増加が存在した。
ビルディングブロック成分4−ヒドロキシベンゾエートのウェスタンブロット分析:4−ヒドロキシベンゾエートは、環構造へのイソプレノイド側鎖の結合において役割を果たす。試験された濃度は、500nM、1μM、および50μMであった。24時間のインキュベーション後、15μM濃度でBcl−2発現の有意な減少が存在した。
ビルディングブロック成分4−ピリドキシンのウェスタンブロット分析:ピリドキシンはCoQ10のキノン環構造の合成のための別の前駆体ビルディングブロックである。この化合物のために試験された濃度は、5μM、25μM、および100μMである。細胞はBcl−2およびカスパーゼ−3のそれらのレベルについてアッセイされた。ピリドキシンは黒色腫細胞中での24時間のインキュベーション後にBcl−2の有意な減少を示した。
ビルディングブロック成分パンテノールのウェスタンブロット分析:パンテノールはCoQ10のキノン環構造の合成のおいて役割を果たす。黒色腫細胞に対して試験された濃度は5μM、25μM、および100μMである。この化合物は、25μM濃度についてBcl−2発現の有意な減少を示した。
ビルディングブロック成分メバロン酸のウェスタンブロット分析:メバロン酸はCoQ10の合成のための主要な成分の1つである。この化合物は、500nM、1μM、25μM、および50μMの濃度で試験された。この実験において、Bcl−2発現の有意な減少またはカスパーゼ−3発現の有意な増加は存在しなかった。
ビルディングブロック成分アセチルグリシンのウェスタンブロット分析:CoQ10の合成のための別の経路は、イソプレノイド(側鎖)合成である。アセチルグリシンの付加は、コエンザイムAをアセチルCoAに転換し、これは、イソプレノイド合成のためのメバロン酸経路に入る。試験された濃度は5μM、25μM、および100μMであった。アセチルグリシンの試験は、5μMおよび25μMの濃度についての12時間のインキュベーション後にBcl−2発現の有意な減少を示した。Bcl−2の有意な減少は、24時間インキュベーションの時点で100μM濃度について記録された。
ビルディングブロック成分アセチルCoAのウェスタンブロット分析:アセチルCoAはCoQ10の合成のためのメバロン酸経路のための前駆体である。試験された濃度は500nm、1μM、25μM、および50μMであった。試験された時点および濃度について、Bcl−2発現の有意な減少またはカスパーゼ−3発現の有意な増加は観察されなかった。
ファルネシルと組み合わせたビルディングブロック成分L−チロシンのウェスタンブロット分析:L−チロシンは、CoQ10のキノン環構造の合成のための前駆体の1つである。以前の実験は、L−フェニルアラニンおよびL−チロシンとの、培地中のL−チロシンの反応を試験した。本研究において、L−チロシンは、L−フェニルアラニンおよびL−チロシンの添加なしの培地中で試験された。本研究において、試験されたL−チロシンの最終濃度は、500nM、5μM、および15μMであった。ファルネシルは、50μMの濃度で試験された。3時間および6時間の時点について、有意な応答は観察されなかった。
ファルネシルと組み合わせたビルディングブロック成分L−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析:キノン環構造の合成のための前駆体であるL−フェニルアラニンは、L−チロシンおよびL−フェニルアラニンを含まない培地中でファルネシルと組み合わせて試験された。ウェスタンブロット分析は、Bcl−2およびカスパーゼ−3の発現をアッセイするために実施された。L−フェニルアラニンの最終濃度は、5μM、25μM、および100μMであった。ファルネシルは50μMの濃度で加えられた。本研究は、以下の表に示されるような試験された濃度および組み合わせの多くについてBcl−2発現の減少を示した。
4−ヒドロキシ−ベンゾエートのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ:この実験のセットは、細胞増殖に対する異なるビルディングブロック分子を組み合わせることの効果を評価するための細胞増殖アッセイを使用した。
最初の研究は、4−ヒドロキシ−ベンゾエートをベンゾキノンと組み合わせる効果を試験した。細胞は48時間インキュベートされ、その後、細胞の計数が生細胞について実施された。各試験群は対照と比較され、各組み合わせ群はベンゾキノン対照と比較された。化合物はベンゾキノンの付加のために統計学的に分析された。以下の表は細胞計数結果を要約し、ここで、X印は細胞数の統計学的な減少を示す。
4−ヒドロキシベンゾエート(4−hydroxybenzoic)およびベンゾキノンおよび組み合わせとともにインキュベートされた細胞の細胞数の有意な減少が存在した。70μMベンゾキノンと組み合わせた50μM 4−ヒドロキシベンゾエートの組み合わせについて、ベンゾキノン対照と比較して細胞数の有意な減少が存在した。これは、このモル比についての相乗効果を示唆する。
さらなるモル比を試験するさらなる研究が実施された。最初の試験において、4−ヒドロキシベンゾエート(4−hydroxybenzoic)は、500nM、1μM、および50μMの濃度で試験された。これらの濃度は、2,3−ジメトキシ−5−メチル−p−ベンゾキノン(Benzo)との組み合わせで試験された。試験されたBenzoの濃度は25μM、50μM、および100μMであった。黒色腫細胞は80%コンフルエンシーまで増殖され、ウェルあたり40K細胞の濃度で、6ウェルプレートに播種された。細胞は、CoQ10、4−ヒドロキシベンゾエート、Benzo、および4−ヒドロキシベンゾエート/Benzoの組み合わせで処置された。
HBを含有する処置培地について細胞増殖の有意な減少が存在する。さらに、ベンゾキノンとのHBの組み合わせは、対応するベンゾキノン濃度とともにインキュベートされた細胞と比較して、細胞数の有意な減少を示した。
細胞増殖アッセイもまた、新生児線維芽細胞に対して実施された。試験されたHBの濃度は、500nM、5μM、および25μMであった。HBはまた、25μM、50μM、および100μMの濃度でベンゾキノンと組み合わせて試験された。黒色腫細胞は、ウェルあたり40k細胞で播種され、24時間の間処置された。細胞はトリプシン処理され、コールターカウンターを使用して定量された。
統計学的分析は、線維芽細胞の有意な減少を示さなかった。このことは、正常細胞における毒性は、最小限から全くないまでであることを示す。
フェニル酢酸とベンゾキノンの組み合わせの細胞増殖アッセイ:フェニル酢酸は、4−ヒドロキシ安息香酸(環構造の結合を容易にする)の合成の前駆体である。細胞増殖アッセイが、CoQ10およびベンゾキノンと組み合わせてフェニル酢酸をインキュベートすることの効果をアッセイするために実施された。
データは、ベンゾキノンと組み合わせたフェニル酢酸の付加が、細胞増殖を有意に減少したことを示す。CoQ10とフェニル酢酸の組み合わせは、CoQ10およびベンゾキノンの単独とのインキュベーションと比較して、細胞数を有意に減少する。
4−ヒドロキシ−ベンゾエートのファルネシルとの組み合わせの細胞増殖アッセイ:4−ヒドロキシ−ベンゾエートは、ファルネシルと組み合わせてインキュベートされた。結果の要約は以下に列挙される。4−ヒドロキシベンゾエートグループは対照およびファルネシル対照グループと比較された。Xは細胞数の統計学的減少を意味する。
L−フェニルアラニンのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ:細胞増殖アッセイは、ベンゾキノンと組み合わせたL−フェニルアラニンの組み合わせを試験するために実施された。以下は、対照およびベンゾキノン対照と比較されたL−フェニルアラニンの結果の要約である。Xは統計学的な減少を意味する。
同様の相乗作用的役割は、ベンゾキノンと組み合わせたL−フェニルアラニンについて見られる。
L−フェニルアラニンのファルネシルとの組み合わせの細胞増殖アッセイ:ファルネシルと組み合わせてインキュベートされたL−フェニルアラニンの組み合わせ細胞増殖研究の予備的結果。L−フェニルアラニンは、対照およびファルネシル対照グループに対して比較された。Xは細胞数の統計学的減少を意味する。
L−チロシンのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ:L−チロシンはベンゾキノンと組み合わせてインキュベートされ、その後、細胞計数が実施された。グループは、対照グループおよびベンゾキノン対照グループと比較された。
ベンゾキノンの付加は、細胞数に対するL−チロシンの効果を増幅しなかった。
L−チロシンおよびファルネシルを組み合わせることは、この実験において細胞数を減少させることに対して相乗作用を有するようには見えない。
CoQ10の合成は2つの主要部分に分けられ、これは、環構造の合成および側鎖構造の合成からなる。ここで、発癌性細胞は、側鎖および環構造の構成要素の合成のための前駆体である化合物が補充された。これらの結果は、環構造の合成に関与する3つの主要な構成要素および環構造の側鎖構造への結合において役割を果たす2つの化合物の研究に焦点を当ててきた。Bcl−2の有意な減少を示し、カスパーゼ−3発現を増加するこれら3つの化合物は、1)L−フェニルアラニン、2)L−チロシン、および3)4−ヒドロキシフェニルピルベートである。側鎖の環構造への結合に関与する2つの化合物は、1)4−ヒドロキシベンゾエートおよび2)フェニル酢酸である。
これらの結果は、2,3ジメトキシ−5−メチル−p−ベンゾキノン(ベンゾキノン)と組み合わされたこれらの化合物の外部からの送達が、細胞増殖をかなり阻害することも示した。このことは、ベンゾキノン環への側鎖の結合のための化合物での環構造の補充は、損なわれたCoQ10合成メカニズムを補充し得ることを示す。このことはまた、細胞プロセスによって必要とされる機能的特性を維持するために分子の安定化を補助し得る。フェニル酢酸は、4−ヒドロキシベンゾエートの合成のための前駆体であり、ベンゾキノンと組み合わせたこの外因性送達は、発癌性細胞において同様の効果を有する。
実施例23:糖尿病の細胞モデルにおけるコエンザイムQ10による遺伝子発現の調節 コエンザイムQ10は、酸化的リン酸化に直接的に影響を与えることによって正常なミトコンドリア機能の維持において確立された役割を有する内因性分子である。糖尿病などの代謝性障害の鍵となる指標として治療エンドポイントを示す様式で働く細胞内標的を調節する際のコエンザイムQ10の能力を実証する実験的な証拠が提示されている。
糖尿病の原因または治療に関連する遺伝子の発現をコエンザイムQ10がいかにして調節するかを理解するために、ヒト腎臓由来の不死化初代腎臓近位尿細管細胞系統(HK−2)およびヒト大動脈平滑筋細胞(HASMC)の初代培養が実験モデルとして使用された。HK−2およびHASMC細胞は、5.5mMグルコースで培養中に正常に維持され、これは、ヒト血液中で正常と考えられる範囲に対応する濃度である。しかし、糖尿病環境を刺激するために、両方の細胞系統は、続いて、22mMグルコースに維持され、これは、慢性高血糖に関連するヒト血液中で観察される範囲に対応する。続いて、細胞内調節プロセスが糖尿病状態を模倣するように機能的に適合されるように、細胞は3継代にわたり増殖させた。細胞系統の選択は、損なわれた心臓血管機能の進行性の病態生理学に加えて、腎機能不全および末期の腎臓病(ESRD)への進行に対する糖尿病の生理学的影響に基づいた。
糖尿病PCRアレイを使用するHK−2細胞における遺伝子発現に対するコエンザイムQ10の効果
糖尿病PCRアレイ(SABiosciences)は、同時に84種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された4種の処置は以下の通りである。
糖尿病PCRアレイ(SABiosciences)は、同時に84種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された4種の処置は以下の通りである。
・HK−2;
・HK−2H維持された22mMグルコース;
・HK2(H)+50μMコエンザイムQ10;および
・HK2(H)+100μMコエンザイムQ10。
・HK−2H維持された22mMグルコース;
・HK2(H)+50μMコエンザイムQ10;および
・HK2(H)+100μMコエンザイムQ10。
糖尿病アレイ(カタログ番号PAHS−023E,SABiosciences Frederick MD)に対するHK−2試料のリアルタイムPCRデータのストリンジェント分析は、遺伝子調節がHK−2正常未処置細胞よりも少なくとも2倍の調節ではなく、0.05未満のp値であるすべての結果を排除するように行われた。慢性高血糖またはコエンザイムQ10のいずれかによって調節されることが観察された遺伝子が表63に列挙され、それらの機能および細胞下局在(Ingenuity Pathway Analysis由来)は表64に列挙される。
調節されたレベルを用いて検出されたRNA転写物の中で、癌胎児性抗原関連細胞接着分子1(CEACAM1)が、特に、100μMコエンザイムQ10処置を用いて、HK2(H)細胞において高度に上方調節されているとして同定された。CD66aおよびBGP−Iとしてもまた知られているCEACAM−1は、CEAスーパーファミリーの膜結合CEAサブファミリーに属する、115−200KDI型膜貫通糖タンパク質である。細胞の表面上で、これは非共有結合性のホモ−およびヘテロダイマーを形成する。細胞外領域は、3つのC2型Ig様ドメインおよび1つのN末端V型Ig様ドメインを含む。C末端から第2のC2型ドメイン(aa320およびその向こう)を含む複数のスプライシング変異体が存在する。インタクトなマウスにおけるCEACAM1発現の欠如は、糖尿病に関連するメタボリックシンドロームを促進することが提案されているのに対して、CEACAM1発現の増加はインスリンの内部化と関連し、これは、インスリン感受性の増加およびグルコースの利用(例えば、血液から細胞へのグルコースの移動)を示唆し、従って、2型糖尿病に特徴的な特質であるインスリン抵抗性を軽減する。
表63に示されるように、インスリン受容体(INSR)発現もまた、コエンザイムQ10で処置された糖尿病性HK−2細胞中で変化された。理論によって束縛されることは望まないが、コエンザイムQ10処置に伴うINSRの発現の増加は、インスリン感受性を増強し(単独でまたはCEACAM1の発現に加えてのいずれかで)、糖尿病に関連する主要な生理学的/代謝的合併症を逆転する潜在能力を有する。
ミトコンドリアアレイを使用するHK−2細胞における遺伝子発現に対するコエンザイムQ10の効果
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ(カタログ番号PAHS 087E、SABisociences Frederick MD)を使用してアッセイされた。慢性高血糖および/またはコエンザイムQ10処置によって調節された遺伝子は表65に列挙され、一方それらの機能は表66に含まれる。
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ(カタログ番号PAHS 087E、SABisociences Frederick MD)を使用してアッセイされた。慢性高血糖および/またはコエンザイムQ10処置によって調節された遺伝子は表65に列挙され、一方それらの機能は表66に含まれる。
現在までに、糖尿病におけるコエンザイムQ10によって処置された糖尿病HK−2細胞中で同定された4種類のミトコンドリア遺伝子(表65)の役割は、特徴付けられていない。
研究2:糖尿病PCRアレイを使用するHASMC細胞における遺伝子発現に対するコエンザイムQ10の効果
糖尿病PCRアレイ(SABiosciences)は、同時に84種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された4種の処置は以下の通りである。
糖尿病PCRアレイ(SABiosciences)は、同時に84種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された4種の処置は以下の通りである。
・HASMC;
・HASMCH維持された22mMグルコース;
・HASMC(H)+50μMコエンザイムQ10;および
・HASMC(H)+100μMコエンザイムQ10。
・HASMCH維持された22mMグルコース;
・HASMC(H)+50μMコエンザイムQ10;および
・HASMC(H)+100μMコエンザイムQ10。
糖尿病アレイ(カタログ番号PAHS−023E,SABiosciences Frederick MD)に対するHASMC試料のリアルタイムPCRデータのストリンジェント分析は、遺伝子調節がHASMC正常未処置細胞よりも少なくとも2倍の調節ではなく、0.05未満のp値であるすべての結果を排除するように行われた。慢性高血糖またはコエンザイムQ10のいずれかによって調節されることが観察された遺伝子が表67に列挙される。
HASMC細胞において、コエンザイムQ10での高血糖細胞の処置は、血管機能の調節に関与する遺伝子(AGT)、インスリン感受性の調節に関与する遺伝子(CEACAM1、INSR、SELL)、および炎症/免疫機能の調節に関与する遺伝子(IL−6、TNF、CCL5)の発現の変化を生じた。理論によって束縛されることは望まないが、INSRの発現の増加は、HASMC細胞におけるインスリン感受性の増加と関する可能性があり、これは、糖尿病の治療において有益である生理学的特性であり、一方、IL−6は、その免疫調節特性に加えて、骨格筋細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵臓β細胞、および神経内分泌細胞に対する作用によって、直接的と間接的の両方で、グルコースの恒常性および代謝に影響を与えることが提案されてきた。活性化の際に、正常T細胞は、RANTESおよびケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド(CCL5)を発現および分泌する。CCL5は脂肪細胞によって発現され、血清レベルのRANTESは肥満および2型糖尿病において増加される。しかし、表67において示されるように、コエンザイムQ10でのHASMC細胞の処置は、CCL5の発現の有意な減少を引き起こす。前述のデータに基づいて、コエンザイムQ10の投与が、糖尿病の管理における治療的な利点を有することが予測される。
ミトコンドリアアレイを使用するHASMC細胞中での遺伝子発現に対するコエンザイムQ10の効果
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ(カタログ番号PAHS 087E、SABisociences Frederick MD)を使用してアッセイされた。慢性高血糖および/またはコエンザイムQ10処置によって調節された遺伝子は表68に示される。
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ(カタログ番号PAHS 087E、SABisociences Frederick MD)を使用してアッセイされた。慢性高血糖および/またはコエンザイムQ10処置によって調節された遺伝子は表68に示される。
コエンザイムQ10でのHASMC細胞の処置は、プログラムされた細胞死、すなわち、アポトーシスを調節する遺伝子(BCL2L1、NOXAとしても知られるPMIAP1)、トランスポータータンパク質(SLC25A1[クエン酸トランスポーター]、SLC25A13[アスパラギン酸−グルタミン酸エクスチェンジャー]、SLC25A19[チアミンピロリン酸トランスポーター]、およびSLC25A22[グルタミン酸−水素同時トランスポーター])、およびミトコンドリアマトリックス輸送タンパク質(MFN1、TIMM44、およびTOMM40)の発現の変化を生じた。これらのトランスポーターの活性は、クレブス回路のために必須の前駆体の調節、およびミトコンドリアの酸化的リン酸化の維持において重要な役割を果たしている。これらの結果は、コエンザイムQ10への糖尿病性HASMC細胞の曝露は、細胞質およびミトコンドリアの遺伝子の発現の変化と関連し、これは次には、コエンザイムQ10と一致しており、糖尿病の処置における治療の利点を提供する。
コエンザイムQ10でHASMC細胞およびHK−2細胞を処置することによって、または高血糖性環境において得られたデータの比較は、4種の遺伝子が両方の細胞系統(例えば、遺伝子発現アッセイにおけるPIK3C2BおよびSELLならびにミトコンドリアアレイアッセイにおけるTOMM40およびTSPO)においてコエンザイムQ10によって共通して調節されることを明らかにする。これらの結果は、糖尿病環境におけるコエンザイムQ10での細胞の処置が、糖尿病の原因または治療に関与することが知られている遺伝子の発現の変化に関連することを実証する。
等価物
当業者は、日常的な範囲を超えない実験を使用して、本明細書に記載された特定の実施形態および方法の多くの等価物を認識し、またはそれを確認することが可能である。このような等価物は、添付の特許請求の範囲の範囲に包含されることが意図される。
当業者は、日常的な範囲を超えない実験を使用して、本明細書に記載された特定の実施形態および方法の多くの等価物を認識し、またはそれを確認することが可能である。このような等価物は、添付の特許請求の範囲の範囲に包含されることが意図される。
Claims (44)
- 哺乳動物の代謝性障害を治療する、代謝性障害の症状を緩和する、代謝性障害の進行を阻害する、または代謝性障害を予防する方法であって、少なくとも1つの環境影響因子(env影響因子)を含む治療的有効量の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、ここで環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常化されたミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、方法。
- 環境影響因子が哺乳動物の正常細胞において、ミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを実質的に誘発しない、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物がヒト(または非ヒト哺乳動物)である、請求項1に記載の方法。
- 代謝性障害がコエンザイムQ10またはその代謝産物もしくはその類似体による治療に応答性または感受性である、請求項1に記載の方法。
- 代謝性障害が、代謝性疾患の一因となるか、または原因となって代謝性疾患を引き起こす改変された遺伝子調節および/またはタンパク質−タンパク質相互作用を引き起こすミトコンドリア酸化的リン酸化機能の調節不全によって特徴付けられる、請求項1に記載の方法。
- 環境影響因子が:
(a)ベンゾキノンまたはベンゾキノン環の生合成を容易にする少なくとも1つの分子、ならびに
(b)イソプレノイドユニットの合成および/またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする少なくとも1つの分子
を含む、請求項1に記載の方法。 - ベンゾキノン環の生合成を容易にする前記少なくとも1つの分子が:L−フェニルアラニン、DL−フェニルアラニン、D−フェニルアラニン、L−チロシン、DL−チロシン、D−チロシン、4−ヒドロキシ−フェニルピルベート、3−メトキシ−4−ヒドロキシマンデレート(バニリンマンデレートまたはVMA)、バニリン酸、ピリドキシン、またはパンテノールを含む、請求項6に記載の方法。
- イソプレノイドユニットの合成および/またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする前記少なくとも1つの分子が:酢酸フェニルフェニルアセテート、4−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、アセチルグリシン、アセチルCoA、またはファルネシルを含む、請求項6に記載の方法。
- 環境影響因子が:
(a)L−フェニルアラニン、L−チロシン、および4−ヒドロキシフェニルピルベートの1つ以上;ならびに
(b)4−ヒドロキシベンゾエート、フェニルアセテート、およびベンゾキノンの1つ以上;を含む、請求項1に記載の方法。 - 環境影響因子が:
(a)Bcl−2発現を阻害するおよび/もしくはカスパーゼ−3発現を増進する;ならびに/または
(b)細胞増殖を阻害する、
請求項1に記載の方法。 - 環境影響因子が多次元細胞内分子(MIM)である、請求項1に記載の方法。
- MIMが:アルファケトグルタレート/アルファケトグルタル酸、マレート/リンゴ酸、スクシネート/コハク酸、グルコサミン、アデノシン、アデノシン二リン酸、グルクロニド/グルクロン酸、ニコチン酸、ニコチン酸ジヌクレオチド、アラニン/フェニルアラニン、ピリドキシン、チアミン、またはフラビンアデニンジヌクレオチドから選択される、請求項11に記載の方法。
- 環境影響因子がエピメタボリックシフター(エピシフター)である、請求項1に記載の方法。
- エピメタボリックシフターが:トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、スクシニルCoAシンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、またはリボフラビンから選択される、請求項13に記載の方法。
- エピメタボリックシフターがコエンザイムQ10である、請求項13に記載の方法。
- 治療されているヒトの組織における環境影響因子の濃度が、健常または正常状態を表すヒト組織の対照標準の環境影響因子の濃度とは異なる、請求項1に記載の方法。
- ヒトに投与された環境影響因子の形態がヒトにおける全身循環中で見出される優勢形態とは異なる、請求項1に記載の方法。
- ヒトの代謝性障害を治療するのに十分な量が、ミトコンドリア酸化的リン酸化を上方調節または下方調節する、請求項1に記載の方法。
- ヒトの代謝性障害を治療するのに十分な量が、グルコースの嫌気的使用および/またはラクテート生合成を調節する、請求項18に記載の方法。
- 治療がenv影響因子とHNF4アルファとの相互作用を介してなされる、請求項1に記載の方法。
- 治療がenv影響因子とトランスアルドラーゼとの相互作用を介してなされる、請求項1に記載の方法。
- 代謝性障害が糖尿病、肥満、前糖尿病、メタボリックシンドロームおよび代謝性障害のいずれかの主要な要素からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 代謝性障害が糖尿病であり、env影響因子がベータ細胞機能、インスリン代謝、および/またはグルカゴン沈着に影響を及ぼす、請求項22に記載の方法。
- 代謝性障害が肥満であり、env影響因子がミトコンドリアにおけるベータ細胞酸化、脂肪細胞サイズの低下、および/またはコルチゾールレベルの制御に影響を及ぼす、請求項22に記載の方法。
- 代謝性障害が心血管疾患であり、env影響因子が中膜における平滑筋細胞増殖の低下、脂質過酸化、トロンボキサン−ax2合成、TNFa、IL−1B、血小板凝集、一酸化窒素(NO)産生の低下、プラーク沈着および/または正常化した血糖制御に影響を及ぼす、請求項22に記載の方法。
- 前記代謝性障害の主要な要素が空腹時血糖異常、耐糖能異常、腹囲増加、内臓脂肪量増加、空腹時血漿グルコースの増加、空腹時血漿トリグリセリドの増加、空腹時高密度リポタンパク質レベルの低下、血圧の上昇、インスリン抵抗性、高インスリン血症、心血管疾患、動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、脳血管疾患、うっ血性心不全、血漿ノルエピネフリンの上昇、心血管関連炎症因子の上昇、血管内皮機能障害を増強する血漿因子の上昇、高リポタンパク血症、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症、過食症、高血糖症、高脂血症、および高血圧症(hypertension)または高血圧症(high blood pressure)、食後血漿トリグリセリドレベルまたは遊離脂肪酸レベルの上昇、細胞酸化ストレスまたはその血漿指標の上昇、循環過凝固状態の増加、肝臓脂肪症、肝臓脂肪症(hetaptic steatosis)、腎不全および腎機能不全を含む腎疾患からなる群より選択される、請求項22に記載の方法。
- 追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 追加の治療剤が真性糖尿病治療剤、糖尿病合併症治療剤、抗高脂血剤、降圧剤または抗高血圧剤、抗肥満剤、利尿薬、化学治療剤、免疫治療剤および免疫抑制剤からなる群より選択される、請求項27に記載の方法。
- 代謝性障害の治療を必要する哺乳動物の疾患細胞においてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強する方法であって、少なくとも1つのenv影響因子を含む治療的有効量の医薬組成物を前記哺乳動物に投与して、これにより哺乳動物の前記疾患細胞にてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強することを含む、方法。
- 正の倍率変化を有する表2〜4および表6〜28および表63〜68に挙げられた分子からなる群より選択される1つ以上の遺伝子の発現を上方調節すること;ならびに/または負の倍率変化を有する表2〜4および表6〜28および表63〜68に挙げられた分子からなる群より選択される1つ以上の遺伝子の発現を下方調節することをさらに含む、請求項29に記載の方法。
- HNF4−アルファ、Bcl−xl、Bcl−xS、BNIP−2、Bcl−2、Birc6、Bcl−2−L11、XIAP、20 BRAF、Bax、c−Jun、Bmf、PUMA、cMyc、トランスアルドラーゼ1、COQ1、COQ3、COQ6、プレニルトランスフェラーゼ、4−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子2、一酸化窒素シンターゼ2A、スーパーオキシドディスムターゼ2、VDAC、Baxチャネル、ANT、シトクロムc、複合体I、複合体II、複合体III、複合体IV、Foxo3a、DJ−1、IDH−1、Cpt1CおよびカムキナーゼIIからなる群より選択される1つ以上の遺伝子の発現を調節することをさらに含む、請求項29に記載の方法。
- 代謝性障害が糖尿病、肥満、前糖尿病、メタボリックシンドロームおよび代謝性障害のいずれかの主要な要素からなる群より選択される、請求項29〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記代謝性障害の主要な要素が空腹時血糖異常、耐糖能異常、腹囲増加、内臓脂肪量増加、空腹時血漿グルコースの増加、空腹時血漿トリグリセリドの増加、空腹時高密度リポタンパク質レベルの低下、血圧の上昇、インスリン抵抗性、高インスリン血症、心血管疾患、動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、脳血管疾患、うっ血性心不全、血漿ノルエピネフリンの上昇、心血管関連炎症因子の上昇、血管内皮機能障害を増強する血漿因子の上昇、高リポタンパク血症、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症、過食症、高血糖症、高脂血症、および高血圧症または高血圧症、食後血漿トリグリセリドレベルまたは遊離脂肪酸レベルの上昇、細胞酸化ストレスまたはその血漿指標の上昇、循環過凝固状態の増加、肝臓脂肪症、肝臓脂肪症、腎不全および腎機能不全を含む腎疾患からなる群より選択される、請求項29〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項29〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 追加の治療剤が真性糖尿病治療剤、糖尿病合併症治療剤、抗高脂血剤、降圧剤または抗高血圧剤、抗肥満剤、利尿薬、化学治療剤、免疫治療剤および免疫抑制剤からなる群より選択される、請求項34に記載の方法。
- 代謝性障害を治療するのに有効である薬剤を同定する方法であって:
(1)環境影響因子を選択することと;
(2)細胞の代謝状態をシフトさせることができる環境影響因子を同定することと;
(3)環境影響因子が代謝性障害を治療するのに有効か否かを判定して;
これにより代謝性障害を治療するのに有効である薬剤を同定することとを含む、方法。 - 環境影響因子がmRNA発現、タンパク質発現、脂質または代謝産物濃度、生体エネルギー分子のレベル、細胞エネルギー特性、ミトコンドリア機能およびミトコンドリア数のいずれか1つ以上の変化を測定することによって、細胞の代謝状態をシフトさせることができるとして同定される、請求項36に記載の方法。
- 代謝性障害の治療に有効な環境影響因子が患者のグルコースレベルまたは脂質レベルを低下させることができる、請求項36に記載の方法。
- 請求項36〜39のいずれか1項に記載の方法によって同定された薬剤を含む組成物。
- 請求項39に記載の組成物を含むキット。
- 患者のグルコースレベルを低下させる方法であって、請求項39に記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む、方法。
- 患者の脂質レベルを低下させる方法であって、請求項39に記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む、方法。
- 哺乳動物のコエンザイムQ10応答性障害を治療する、コエンザイムQ10応答性障害の症状を緩和する、コエンザイムQ10応答性障害の進行を阻害する、またはコエンザイムQ10応答性障害を予防する方法であって、少なくとも1つの環境影響因子(env影響因子)を含む治療的有効量の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察された解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルへの細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、方法。
- コエンザイムQ10応答性障害が代謝性障害である、請求項43に記載の方法。
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