JP2018048125A - エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する腫瘍性障害の処置方法 - Google Patents
エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する腫瘍性障害の処置方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018048125A JP2018048125A JP2017172885A JP2017172885A JP2018048125A JP 2018048125 A JP2018048125 A JP 2018048125A JP 2017172885 A JP2017172885 A JP 2017172885A JP 2017172885 A JP2017172885 A JP 2017172885A JP 2018048125 A JP2018048125 A JP 2018048125A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- neoplastic disorder
- environmental impact
- factor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/12—Ketones
- A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/194—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having two or more carboxyl groups, e.g. succinic, maleic or phthalic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
- G01N33/5735—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2121/00—Preparations for use in therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
- G01N2800/7028—Cancer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Obesity (AREA)
Abstract
【課題】新規腫瘍性障害治療法の提供。
【解決手段】癌性細胞においてグルコースの嫌気的使用を選択的に遮断し、ミトコンデリア酸化的リン酸化を増強する為に、治療的有効量のコエンザイムQ10および製薬的に許容され得る担体を含む製薬組成物を投与する事によるエピメタボリックシフター、多次元細胞内分子または環境影響因子を使用してヒトの腫瘍性障害を処置する方法および製剤。
【選択図】図1
【解決手段】癌性細胞においてグルコースの嫌気的使用を選択的に遮断し、ミトコンデリア酸化的リン酸化を増強する為に、治療的有効量のコエンザイムQ10および製薬的に許容され得る担体を含む製薬組成物を投与する事によるエピメタボリックシフター、多次元細胞内分子または環境影響因子を使用してヒトの腫瘍性障害を処置する方法および製剤。
【選択図】図1
Description
関連出願
本出願は、“Methods for Treatment of Oncological Disorders Using an Epimetabolic Shifter(Coenzyme Q10)”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,241(代理人整理番号:117732−00601)、“Methods for Treatment of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,243(代理人整理番号:117732−00701)、“Methods for the Diagnosis of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,244(代理人整理番号:117732−00801)、“Methods for Treatment of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,245(代理人整理番号:117732−00901)、および“Methods for the Diagnosis of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,246(代理人整理番号:117732−01001)の優先権を主張する。上述の各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられている。
本出願は、“Methods for Treatment of Oncological Disorders Using an Epimetabolic Shifter(Coenzyme Q10)”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,241(代理人整理番号:117732−00601)、“Methods for Treatment of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,243(代理人整理番号:117732−00701)、“Methods for the Diagnosis of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,244(代理人整理番号:117732−00801)、“Methods for Treatment of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,245(代理人整理番号:117732−00901)、および“Methods for the Diagnosis of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,246(代理人整理番号:117732−01001)の優先権を主張する。上述の各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられている。
癌は現在、先進国における主要な死亡原因の1つであり、現代社会にとって深刻な脅威である。癌はいずれの年齢のいずれの器官のいずれの組織においても発症する可能性がある。世界中で、毎年1000万人超が癌と診断され、この数は2020年までに毎年、新患1500万人に増加することが推定される。癌は世界中で毎年600万件または死亡の12%を引き起こすと考えられる。
癌の病因は明確には理解されていない。癌は、遺伝的感受性、染色体切断障害、ウイルス、環境因子および免疫障害を含む、長年の継続中の研究にわたる多くの因子に結び付けられてきた、または関連してきた。癌は、病状の大きなカテゴリを網羅する。癌細胞は、体のほぼいずれの器官および/または組織にでも発生する可能性がある。体の一部において細胞が制御不能な増殖または分化を開始するときに、癌が発症する。
最近の研究は腫瘍形成の分子機構の多くの我々の理解を大いに向上させ、癌の処置に多数の新たな手段を提供してきたが、大半の悪性腫瘍の標準処置は完全摘出、化学療法、および放射線療法のままである。これらの各処置はますます成功しているが、多数の望ましくない副作用を引き起こし得る。例えば外科手術は疼痛、健常組織への外傷、および瘢痕化を生じ得る。放射線療法は癌細胞を死滅させる利点を有するが、同時に非癌性組織も損傷する。化学療法は、各種の抗癌薬の患者への投与を包含する。これらの標準処置は、有害な副作用、例えば悪心、免疫抑制、胃潰瘍および2次腫瘍形成を伴うことが多い。
多くの個人および会社は長年にわたって、幅広い癌の処置での改善を求めて広範囲に及ぶ研究を実施してきた。会社は、癌のためのより有益な療法を提供することを望んで、化学的実体、例えば小型分子、および生物製剤、例えば抗体を含む生物活性剤を開発している。試験された生物活性剤には、一部の個人または癌の種類で作用して、有益な治療効果を提供したものもあれば、この試験プロトコルで失敗した、または最小の治療効果を有したものもあった。今日までに研究された他の生物活性剤は、完全に理解されていない作用機序を有する。
本明細書でCoQ10、Q10、ユビキノン、またはユビデカレノンとも呼ばれるコエンザイムQ10は、普及している栄養補助食品であり、CoQ10の還元型であるユビキノールの抗酸化特性を通じて免疫系の保護を助けるビタミン様栄養補助食品として、カプセル剤形で栄養食品店、健康食品店、薬局などにて見出すことができる。CoQ10は、当分野で認識されており、その全体の開示が参照により本明細書に組み入れられている、国際公開番号WO2005/069916にさらに記載されている。
CoQ10は、人体の大半の組織および他の哺乳動物の組織のいたるところで見出される。ヒトにおけるCoQ10の組織分布および酸化還元状態は、Bhagavan HN,et al.による総説論文、Coenzyme Q10:Absorption,tissue uptake,metabolism and pharmacokinetic,Free Radical Research 40(5),445−453(2006)(以下、Bhagavan,et al.)で総説されている。著者らは、「一般原則として、心臓、腎臓、肝臓および筋肉などのエネルギー要求または代謝活性の高い組織は、比較的高濃度のCoQ10を含有する」ことを報告している。著者らはさらに「脳および肺を除く組織中のCoQ10の大部分はヒドロキノンまたはユビキノール(uniquinol)としての還元型であり、このことはこれらの2つの組織における酸化ストレスの上昇を反映するものと思われる」ことを報告している。特にBhagavan et al.は、心臓、腎臓、肝臓、筋肉、腸(intenstine)および血液(血漿)において、CoQ10のそれぞれ約61%、75%、95%、65%、95%および96%が還元型であることも報告している。同様に、Ruiz−Jiminez,et al.,Determination of the ubiquinol−10 and ubiquinone−10(coenzyme Q10)in human serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry to evaluate the oxidative stress,J.Chroma A 1175(2),242−248(2007)(以下、Ruiz−Jiminez,et al.)は、ヒト血漿がQ10およびQ10の還元型(Q10H2)について評価されたときに、分子の大部分(90%)が還元型で見出されたことを報告している。
CoQ10は非常に親油性であり、大部分は水に不溶性である。水へのその不溶性、脂質への限定された溶解性、および比較的大きい分子量のために、経口投与されたCoQ10の吸収効率は不十分である。Bhagavan,et al.は「ラットを用いた1つの研究において、経口投与されたCoQ10のわずか約2〜3%が吸収されることが報告された」ことを報告している。Bhagavan,et al.はさらに「ラットの研究からのデータは、腸での吸収の間または後のどちらかに、CoQ10がユビキノールに還元されることを指摘している」ことを報告している。
CoQ10は、文献において長年にわたって癌に関係してきた。文献で報告された関連の、いくつかの代表的ではあるが、完全に包括的というわけではない例が下に記載される。Karl Folkers,et al.,Survival of Cancer Patients on Therapy with Coenzyme Q10,Biochemical and Biophysical Research Communication 192,241−245(1993)(以下「Folkers,et al.」)は、「CoQ10による療法を受けた」癌患者の8つの病歴および「5〜15年の期間にわたる」この生存履歴について記載している。CoQ10は、膵臓癌腫、腺癌、喉頭癌腫、乳癌、結腸癌、肺癌および前立腺癌を含む、異なる種類の癌を有する患者8名に経口投与された。Folkers,et al.は「これらの結果が今や、全身的プロトコルを正当化する」と述べている。Lockwood,et al.,Progress on Therapy of Breast Cancer with Vitamin Q10 and the Regression of Metastases,Biochemical and Biophysical Research Communication 212,172−177(1995)(以下「Lockwood,et al.」)は、ビタミンQ10を用いた乳癌の療法の進歩」について報告している別の総説論文である。Lockwood,et al.は、非腫瘍および腫瘍組織におけるビタミンQ10の可変レベルを明らかにした、動物およびヒトに対する35年間の国際的研究を扱い、腫瘍を有する処置マウスの中の生存マウスの増加に基づく宿主防御系に固有のビタミンQ10に関するデータを含む」Folkers,et al.に言及している。Lockwood,et al.はさらに、乳癌症例における可変欠乏レベルを明らかにした、スウェーデンおよびアメリカの癌患者199名のCoQ10の血中レベルを決定した研究に依拠して、「ヒト癌のビタミンQ10療法の可能性が1961年に明白となった」ことを述べている。2002年7月9日に発行された米国特許第6,417,233(以下Sears,et al.)は、ミトコンドリア病の予防および/または処置のための脂溶性ベンゾキノン、例えばコエンザイムQ10を含有する組成物について記載している。Sears,et al.は、「CoQ10処置が癌患者にいくつかの利益を提供することが報告されている(第2欄、30〜31行を参照)」ことを述べている。
本出願の出願日時点で、National Cancer Instituteは、癌処置におけるCoQ10の、多数の患者を包含する良好に設計臨床試験が行われていないのは、「研究が行われた方法および報告された情報の量によって、利益がコエンザイムQ10またはその他によって生じたのか否かが不明確にされたためである」ことを報告している。www.cancer.gov/cancertopics/pdq/cam/coenzymeQ10/patient/allpages(2008年9月29日)にて利用できる、The National Cancer Institute(NCI)を参照。NCIは特に、乳癌患者における標準処置後のアジュバント療法としての、数名の患者が処置によって助けられたように思われるCoQ10の使用に関する3つの小規模な研究を引用し、「しかし、研究設計および報告の弱点によって、利益がコエンザイムQ10またはその他によって生じたのか否かが不明確にされたためである」ことを繰返し述べている。NCIは「これらの研究は以下の弱点を有した:研究はランダム化または制御されていなかった;患者はコエンザイムQ10に加えて他の栄養補助食品を使用した;患者は、コエンザイムQ10療法の前または間に標準処置を受けた;および詳細事項が研究のすべての患者に報告されていなかった」ことを明記している。NCIはさらに「逸話的報告において、コエンザイムQ10が膵臓癌、肺癌、結腸癌、直腸癌および前立腺癌を有する患者を含む、数名の癌患者がより長く生存するのを助けた」ことを報告しているが、「しかしこれらの報告で記載された患者は、化学療法、放射線療法および外科手術を含む、コエンザイムQ10以外の他の処置も受けた」ことを示している。
2006年2月16日に公開された米国特許公開番号2006/0035981(以下「Mazzio 2006」)は、宿主とは反対である、エネルギーを得るグルコースの非酸化的リン酸化のためのこの嫌気的要件に関して癌の脆弱性を活用する組成物を使用して、ヒトおよび動物の癌を処置または予防する方法および製剤について記載している。Mazzio 2006の製剤は、酸化的代謝を相乗的に促進するおよび/または乳酸デヒドロゲナーゼもしくは嫌気的グルコース代謝を妨げる1つ以上の化合物を含有して、さらに詳細には「2,3−ジメトキシ−5−メチル−1,4−ベンゾキノン(本明細書では「DMBQ」とも呼ばれる)(キノイドベース)ならびに対応するヒドロキノン、ユビクロメノール、ユビクロマノールまたは合成/天然誘導体および類似体を含む一連のユビキノン全体についての選択肢を含有すると記載されている。Mazzio 2006、3ページ、段落0010を参照。Mazzio 2006は、「抗癌剤としての短鎖ユビキノン(CoQ<3)を確認し、「2,3−ジメトキシ−5−メチル−1,4−ベンゾキノン(DMBQ)が抗癌剤としてCoQ10よりも1000倍を超えて強力であることをなおさらに確認している。Mazzio 2006、3ページ、段落0011を参照。Mazzio 2006はさらに、研究が「CoQ10が予想されたほど致死性であることを見出さず」および「癌に対してCoQ10を用いた同様の以前の研究が多少矛盾していた」ことを述べている。本記述を裏付ける引用の広範囲に及ぶリストについては、Mazzio 2006の3〜4ページを参照。
2007年10月25日に公開された米国特許公開番号2007/0248693(以下「Mazzio 2007」)はまた、癌を処置または予防する栄養補給組成物およびこの使用について記載している。再度、公開された本特許出願は、短鎖ユビキノンに焦点を合せており、本発明の不可欠な構成要素でないことを明確に述べている。Mazzio 2007によると、「CoQ10は、癌細胞においてミトコンドリア複合体II活性のVmaxを上昇させることができるが(Mazzio and Soliman,Biochem Pharmacol.67:1167−84,2004)、これは複合体IVを通じてミトコンドリア呼吸またはO2利用の速度を制御しなかった。そしてCoQ10は、予想されたほど致死性ではなかった。同様に、癌に対するCoQ10の結果が矛盾していた」。Mazzio 2007、5ページ、段落0019を参照。
出願人らは以前に、動物対象における腫瘍増殖速度を低下させるためのCoQ10の局所製剤および方法について記載した(Hsia et al.、2005年8月4日に公開されたWO2005/069916)。Hsia et al.に記載された実験において、CoQ10は皮膚癌細胞の培養物においてアポトーシス速度を上昇させたが、正常な細胞では上昇させなかったことが示された。その上、腫瘍担持動物のCoQ10の局所製剤を用いた処置は、動物の腫瘍増殖速度を劇的に低下させることが示された。
本発明は、少なくとも一部は、ヒトおよび/または細胞内でのCoQ10の役割をより完璧に理解することに基づく。特に、本発明の方法および製剤は、少なくとも一部は、ヒト臨床試験を設計および実行することによってならびに/またはCoQ10をヒト対象に投与して、これらの試験および/または処置レジメンの間に出現する驚くべきおよび予想外の結果を観察することによって習得された、腫瘍性障害に対するCoQ10の治療活性について得られた知識に基づいている。本発明の方法および製剤はさらに、少なくとも一部は、インビトロでの細胞のCoQ10処置の広範囲に及ぶ研究から得られた、CoQ10の治療機構への洞察に基づいている。
具体的に、少なくとも1つの実施形態において、本発明の方法および製剤は明確に、少なくとも一部は、コエンザイムQ10(本明細書ではCoQ10またはQ10とも呼ばれる)の細胞への適用が、正常な細胞増殖に対する効果なしに、またはいくつかの場合において有効な効果と共に、癌細胞におけるアポトーシス応答の選択的誘導を生じるという驚くべき発見に基づいている。その上、少なくとも1つの追加の実施形態において、侵襲性癌から誘導された株化細胞は、より低い侵襲性癌または非侵襲性癌から誘導された株化細胞と比較して、CoQ10に対して感受性である(例えば細胞傷害および/またはアポトーシスの誘導のために必要なCoQ10の濃度がより低いおよび/または処置時間がより短い)ことが予想外に見出された。ミトコンドリアQ10レベルの時間および用量応答が観察され、48時間後に細胞ミトコンドリア中のQ10のレベルは6倍上昇した。少なくとも1つの追加の実施形態において、本発明はさらに、Q10がいずれの著しい量でも供給された酸化型(酸化促進)で維持されて、Q10H2の還元(抗酸化)型に変換されないという驚くべきおよび予想外の発見に基づいている。別の実施形態において、本発明はなおさらに、著しい数の遺伝子の発現が、酸化型のQ10によって処置された細胞において調節されるという発見に基づいている。これらの調節されたタンパク質は、アポトーシス,癌生物学および細胞増殖、解糖および代謝、分子輸送、ならびに細胞シグナル伝達を含む、複数の細胞経路中に密集することが見出された。
まとめると、本明細書に記載する結果は、Q10の治療機構への洞察を提供した。例えば理論に拘束されることを望むものではないが、出願人の発見は、Q10および特に、Q10の酸化型が細胞微小環境への代謝シフトを誘導することを指摘している。癌細胞には示差的代謝が出現することが公知であり(ワーブルグ効果)、これにより大半の癌細胞は、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化(ピルビン酸塩の酸化)によってよりもむしろ、主にサイトゾルにおける解糖とこれに続く乳酸発酵によってエネルギーを産生する。出願人の発見は、Q10が癌細胞の代謝状態を、グルコースの嫌気的使用からミトコンドリア酸化的リン酸化にシフトできることを指摘している。
本明細書に示す出願人のデータに基づいて、Q10は多次元細胞内分子(MIM)およびエピメタボリックシフター(エピシフター)として同定された。本発明は、他のMIMおよび/またはエピシフターを同定する方法を提供する。本発明はさらに、MIM、エピシフターおよびこれを使用することによって腫瘍性障害を処置する方法を提供する。
したがって、本発明は第1の態様において、腫瘍性障害を処置または予防するのに十分な量の、コエンザイムQ10でない環境影響因子(env影響因子)をヒトに投与することと、これによりヒトの腫瘍性障害を処置または予防することとを備える、ヒトの腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供する。
関連する態様において、本発明は、少なくとも1つの環境影響因子(env影響因子)を含む製薬組成物の治療的有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを備え、環境影響因子が哺乳動物の癌性細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察されたレベルに向かって、解糖からミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症状を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防する方法を提供する。
本明細書で使用する場合、「解糖」は、ピルビン酸塩から乳酸塩を産生する関係する乳酸塩生合成を場合により包含する。
ある実施形態において、環境影響因子は、哺乳動物の非癌性細胞において、解糖からミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを実質的に誘発しない。
ある実施形態において、哺乳動物はヒト、または非ヒト哺乳動物である。
ある実施形態において、環境影響因子は、コエンザイムQ10、またはその代謝産物もしくはその類似体(イソプレニルリピートを有さないまたは少なくとも1つのイソプレニルリピートを有する類似体を含む)ではない。
ある実施形態において、腫瘍性障害はコエンザイムQ10またはその代謝産物もしくはその類似体による処置に応答性または感受性である。
ある実施形態において、環境影響因子は癌性細胞中でアポトーシスまたは細胞死機構を誘導する。
ある実施形態において、環境影響因子は癌性細胞中で血管新生を阻害する。
ある実施形態において、環境影響因子は癌性細胞中の微小環境内で免疫関連要素の調節を誘導する。
ある実施形態において、環境影響因子は癌性細胞中で細胞周期制御の変化を誘導する。
ある実施形態において、環境影響因子は:(a)ベンゾキノンまたはベンゾキノン環の生合成を容易にする少なくとも1つの分子、および(b)イソプレノイドユニットの合成および/またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする少なくとも1つの分子を備える。
ある実施形態において、ベンゾキノン環の生合成を容易にする少なくとも1つの分子は:L−フェニルアラニン、DL−フェニルアラニン、D−フェニルアラニン、L−チロシン、DL−チロシン、D−チロシン、4−ヒドロキシ−フェニルピルビン酸、3−メトキシ−4−ヒドロキシマンデル酸(バニリンマンデル酸またはVMA)、バニリン酸、ピリドキシン、またはパンテノールを備える。
ある実施形態において、イソプレノイドユニットの合成および/またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする少なくとも1つの分子は:酢酸フェニル、4−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、アセチルグリシン、アセチル−CoA、またはファルネシルを備える。
ある実施形態において、環境影響因子は:(a)L−フェニルアラニン、L−チロシン、および4−ヒドロキシフェニルピルビン酸の1つ以上;ならびに(b)4−ヒドロキシベンゾエート、酢酸フェニル、およびベンゾキノンの1つ以上を備える。
ある実施形態において、環境影響因子は:(a)Bcl−2発現を阻害するおよび/もしくはカスパーゼ−3発現を増進する;ならびに/または(b)細胞増殖を阻害する。
1実施形態において、env影響因子は多次元細胞内分子(MIM)である。ある実施形態において、MIMは:アルファケトグルタル酸塩/アルファケトグルタル酸、リンゴ酸塩/リンゴ酸、コハク酸塩/コハク酸、グルコサミン、アデノシン、アデノシン2リン酸、グルクロニド/グルクロン酸、ニコチン酸、ニコチン酸ジヌクレオチド、アラニン/フェニルアラニン、ピリドキシン、チアミン、またはフラビンアデニンジヌクレオチドから選択される。1実施形態において、MIMはアセチルCo−A、パルミチルCo−A、L−カルニチン、およびアミノ酸(例えばチロシン、フェニルアラニン、およびシステイン)から成る群より選択される。
1実施形態において、env影響因子はエピメタボリックシフター(エピシフター)である。ある実施形態において、エピメタボリックシフターは:トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、スクシニルCoAシンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、またはリボフラビンから選択される方法。1実施形態において、エピシフターはビタミンD3およびECM構成要素から成る群より選択される。1実施形態において、ECM構成要素はフィブロネクチン;免疫調節薬(例えばTNFαまたはインターロイキン、例えばIL−5、IL−12、IL−23のいずれか)血管新生因子;およびアポトーシス因子から成る群より選択される。
1実施形態において、ヒトの集団が処置され、集団の少なくとも25%は、処置されている障害に対して治療的である全身的環境影響因子(例えばコエンザイムQ10)レベルを有した。他の実施形態において、ヒトの集団が処置され、集団の少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上は、処置されている障害に対して治療的である全身的環境影響因子(例えばコエンザイムQ10)レベルを有した。上限または下限としてのこれらの値のいずれか1つを有する範囲、例えば10%〜25%、15%〜35%、25%〜50%、35%〜60%、40%〜70%、50%〜75%、60%〜85%または70%〜90%も本発明の一部であると意図されることが理解されるべきである。
1実施形態において、ヒトの集団が処置され、集団の少なくとも25%が癌の組織病状、臨床観察、写真分析、CTスキャン、MRI画像、血液、血清または血漿マーカー含む、当分野で認識されたエンドポイントによって測定されるような症候の減少(dimishment)を有した。
1実施形態において、ヒトの集団が処置され、集団の少なくとも50%が癌の組織病状、臨床観察、写真分析、CTスキャン、MRI画像、血液、血清または血漿マーカー含む、当分野で認識されたエンドポイントによって測定されるような症候の減少(dimishment)を有した。
他の実施形態において、ヒトの集団が処置され、集団の少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%またはそれ以上が癌の組織病状、臨床観察、写真分析、CTスキャン、MRI画像、血液、血清または血漿マーカー含む、当分野で認識されたエンドポイントによって測定されるような症候の減少(dimishment)を有した。上限または下限としてのこれらの値のいずれか1つを有する範囲、例えば10%〜25%、15%〜35%、25%〜50%、35%〜60%、40%〜70%、50%〜75%、60%〜85%または70%〜90%も本発明の一部であると意図されることが理解されるべきである。
各種の実施形態において、処置されたヒトの集団は、約3名の患者、約5名の患者、約10名の患者、約15名の患者、約20名の患者、約25名の患者、約30名の患者、約35名の患者、約40名の患者、約50名の患者、約60名の患者、約70名の患者、約80名の患者、約90名の患者、約100名の患者、約125名の患者、約150名の患者、約160名の患者、約175名の患者、約200名の患者、約250名の患者、約300名の患者、約400名の患者またはそれ以上であり得る。1実施形態において、(処置されたヒトの集団は)上限または下限としてのこれらの値のいずれか1つを有する範囲、例えば約10〜約25名の、約15〜約35名の、約25〜約50名の、または約20〜約160名の患者も本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
当業者が1つ以上の当分野で認識されたエンドポイントの検査時に、当分野の常識に基づいて症候の減少を有した患者を認識できることが理解されるであろう。例えば当業者は、インサイチュ皮膚扁平上皮細胞癌腫などの皮膚癌病巣の写真(例えば本明細書の実施例で提供された写真など)を処置前後で検査および比較することができ、例えば病巣のサイズの減少、病巣の色、または癌を通例示す病巣のその他の視覚的特徴に基づいて症候の減少を認識することができるであろう。別の例において、当業者は、例えば皮膚癌の組織病状を処置前後で検査および比較することができ、癌の発癌能または重症度の減少を示す組織病状の変化に基づいて症候の減少を認識することができるであろう。別の例において、当業者は、転移病巣の腫瘍または部位のCTスキャンまたはMRI画像を処置前後で検査および比較することができ、例えば原発性腫瘍のサイズの減少または転移病巣のサイズもしくは数の減少に基づいて症候の減少を認識することができるであろう。
1実施形態において、ヒトの腫瘍性障害を処置するのに十分な量は、グルコースの嫌気的使用(および/または乳酸塩生合成)を下方調節して、ミトコンドリア酸化的リン酸化を上方調節する。
1実施形態において、処置されている腫瘍性障害は、通例、局所投与によって処置される障害、例えば乳癌または前立腺癌ではなく、治療的に有効なレベルでの活性剤の全身送達が期待される。
1実施形態において、処置されているヒト組織におけるenv影響因子の濃度は、健常または正常状態を表すヒト組織の対照標準のenv影響因子の濃度とは異なる。
1実施形態において、ヒトに投与されたenv影響因子の型は、ヒトにおける全身循環中で見出される優勢型とは異なる。
1実施形態において、処置は、env影響因子と、表1〜28に挙げられた遺伝子の群(例えば表2〜4、6〜28;とりわけ同じ細胞タイプで異なるアッセイ方法を使用して、上方もしくは下方調節が一貫して示された遺伝子、または異なる細胞タイプにわたって、同じアッセイ方法または異なるアッセイ方法のどちらかによって、上方または下方調節が一貫して示された遺伝子;好ましくは上方または下方調節の規模は同じであるかまたは類似している(例えば最大倍の上昇または低下は、最小倍の上昇または低下の10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、または5倍を超えない)〜選択された遺伝子との相互作用を介して行われる。
1実施形態において、処置は、env影響因子と、HNF4−アルファ、Bcl−xl、Bcl−xS、BNIP−2、Bcl−2、Birc6、Bcl−2−L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c−Jun、Bmf、PUMA、cMyc、トランスアルドラーゼ1、COQ1、COQ3、COQ6、プレニルトランスフェラーゼ、4−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子2、一酸化窒素シンターゼ2A、スーパーオキシドディスムターゼ2、VDAC、Baxチャネル、ANT、シトクロムc、複合体1、複合体II、複合体III、複合体IV、Foxo3a、DJ−1、IDH−1、Cpt1C、カムキナーゼII、および/または表1〜28(例えば表2〜4、6〜28)に挙げられた遺伝子のいずれかから成る群より選択されるタンパク質との相互作用を介して行われる。
1実施形態において、腫瘍性障害は:白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫から成る群より選択される。
1実施形態において、方法はさらに、追加の治療剤または処置レジメンを投与することを備える。
別の態様において、本発明は、より低い侵襲性癌または非侵襲性腫瘍性障害のために使用または選択された投薬レジメンよりも低い選択された用量で環境影響因子(env影響因子)をヒトに投与することと、これにより侵襲性腫瘍性障害を処置または予防することとを備えた、ヒトの侵襲性腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供する。
関連する態様において、本発明は、侵襲性腫瘍性障害のために使用または選択された投薬レジメンを超える選択されたより高い用量で環境影響因子(env影響因子)をヒトに投与することと、これにより非侵襲性腫瘍性障害を処置または予防することとを備えた、ヒトの非侵襲性腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供する。
1実施形態において、腫瘍性障害は、白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫から成る群より選択される。
1実施形態において、侵襲性腫瘍性障害は、膵臓癌腫、肝細胞癌腫、ユーイング肉腫、転移性乳癌、転移性黒色腫、脳腫瘍(星状細胞腫、神経膠芽腫)、神経内分泌癌、結腸癌、肺癌、骨肉腫、アンドロゲン非依存性前立腺癌、卵巣癌および非ホジキンリンパ腫から成る群より選択される。
1実施形態において、非侵襲性腫瘍性障害は、非転移性乳癌、アンドロゲン依存性前立腺癌、小細胞肺癌、急性リンパ球性白血病から成る群より選択される。
1実施形態において、方法は、外科手術、放射線療法、ホルモン療法、抗体療法、成長因子を用いた療法、サイトカイン、および化学療法から成る群より選択される処置レジメンをさらに備える。
また別の態様において、本発明は、哺乳動物の癌性細胞においてグルコースの嫌気的使用を選択的に遮断して、ミトコンドリア酸化的リン酸化を、正常な生理学的条件下で哺乳動物の正常細胞において観察されるレベルに向かって増強するために、少なくとも1つのenv影響因子の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍性障害の処置を必要とする哺乳動物の癌性細胞においてグルコースの嫌気的使用(解糖)を(選択的に)遮断して、ミトコンドリア酸化的リン酸化を増強する方法を提供する。
1実施形態において、方法は、(1)正の倍率変化を有する表1〜28(例えば2〜4および6〜28)に示す遺伝子から成る群より選択される1つ以上の遺伝子の発現を上方調節すること;および/または(2)負の倍率変化を有する表1〜28(例えば2〜4および6〜28)から成る群より選択される1つ以上の遺伝子の発現を下方調節することをさらに備える。
1実施形態において、方法は、HNF4−アルファ、Bcl−xl、Bcl−xS、BNIP−2、Bcl−2、Birc6、Bcl−2−L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c−Jun、Bmf、PUMA、cMyc、トランスアルドラーゼ1、COQ1、COQ3、COQ6、プレニルトランスフェラーゼ、4−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子2、一酸化窒素シンターゼ2A、スーパーオキシドディスムターゼ2、VDAC、Baxチャネル、ANT、シトクロムc、複合体1、複合体II、複合体III、複合体IV、Foxo3a、DJ−1、IDH−1、Cpt1CおよびカムキナーゼIIから成る群より選択される1つ以上の遺伝子の発現を調節することをさらに含む。
1実施形態において、腫瘍性障害は、白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫から成る群より選択される。
1実施形態において、方法は、外科手術、放射線療法、ホルモン療法、抗体療法、成長因子を用いた療法、サイトカイン、および化学療法から成る群より選択される処置レジメンをさらに備える。
なおさらなる態様において、本発明は、哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防するために有効な環境影響因子を同定する方法であって:(1)腫瘍性障害の癌細胞を備える罹患した生物試料、および癌細胞を備えていない正常な生物試料を取得することと;(2)罹患した生物試料および正常な生物試料を候補環境影響因子と接触させることと;(3)罹患した生物試料および正常な生物試料中に存在する、正の倍率変化を有するおよび/または負の倍率変化を有する、表1〜28(例えば表2〜4および6〜28)に挙げられたマーカーから成る群より選択される、1つ以上のマーカーの発現レベルを決定することと;(4)罹患した生物試料および正常な生物試料中の1つ以上の(one of more)マーカーの発現レベルを比較して;有効な環境影響因子が、罹患した生物試料中で正の倍率変化を有する1つ以上のマーカーを上昇させるおよび/または負の倍率変化を有する1つ以上のマーカーの発現レベルを低下させるが、正常な生物試料中では実質的に上昇/低下させない候補環境影響因子として同定されることと;を備えた方法を提供する。
関連する態様において、本発明は、哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防する方法であって:(1)腫瘍性障害の癌細胞を備える罹患した生物試料、および癌細胞を備えていない正常な生物試料を取得することと;(2)罹患した生物試料および正常な生物試料を候補環境影響因子と接触させることと;(3)罹患した生物試料および正常な生物試料中に存在する、正の倍率変化を有するおよび/または負の倍率変化を有する、表1〜28に挙げられたマーカーから成る群より選択される、1つ以上のマーカーの発現レベルを決定することと;(4)罹患した生物試料および正常な生物試料中の1つ以上のマーカーの発現レベルを比較して;有効な環境影響因子が、罹患した生物試料中で正の倍率変化を有する1つ以上のマーカーを上昇させるおよび/または負の倍率変化を有する1つ以上のマーカーの発現レベルを低下させるが、正常な生物試料中では実質的に上昇/低下させない候補環境影響因子として同定されることと;(5)有効な環境影響因子を哺乳動物に投与して;これにより哺乳動物の腫瘍性障害を処置することと;を備えた方法を提供する。
また別の関連する実施形態において、本発明は、哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防するために有効な環境影響因子を同定する方法であって:(1)腫瘍性障害の癌細胞を備える罹患した生物試料、および癌細胞を備えていない正常な生物試料を取得することと;(2)罹患した生物試料および正常な生物試料を候補環境影響因子と接触させることと;(3)候補環境影響因子との接触前後の罹患した生物試料および正常な生物試料中の解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルを決定して;有効な環境影響因子が、罹患した生物試料中でミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルを上昇させるおよび/または解糖のレベルを低下させるが、正常な生物試料中では実質的に上昇/低下させない候補環境影響因子として同定されることと;を備えた方法を提供する。
また別の関連する実施形態において、本発明は、哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防する方法であって:(1)腫瘍性障害の癌細胞を備える罹患した生物試料、および癌細胞を備えていない正常な生物試料を取得することと;(2)罹患した生物試料および正常な生物試料を候補環境影響因子と接触させることと;(3)候補環境影響因子との接触前後の罹患した生物試料および正常な生物試料中の解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルを決定して、有効な環境影響因子が、罹患した生物試料中でミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルを上昇させるおよび/または解糖のレベルを低下させるが、正常な生物試料中では実質的に上昇/低下させない候補環境影響因子として同定されることと;(4)有効な環境影響因子を哺乳動物に投与して;これにより哺乳動物の腫瘍性障害を処置することと;を備えた、哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防する方法を提供する。
ある実施形態において、解糖のレベルはECARとして測定され、および/またはミトコンドリア酸化的リン酸化はOCRとして測定される。
1実施形態において、env影響因子はコエンザイムQ10でない。
さらなる態様において、本発明は、(a)細胞を内因性分子と接触させることと;(b)細胞微小環境プロフィールに対する内因性分子の効果を監視することと;(c)細胞微小環境プロフィールに対して変化を誘導する内因性分子を同定して;これにより多次元細胞内分子(MIM)を同定することを備えた、多次元細胞内分子(MIM)を同定する方法を提供する。
1実施形態において、方法は、罹患した細胞および正常な対照細胞の細胞微小環境プロフィールに対する内因性分子の効果を比較することと;罹患した細胞の細胞微小環境プロフィールに対する変化を、正常な対照細胞と比較して示差的に発する内因性分子を同定して;これによりMIMを同定することをさらに備える。
1実施形態において、細胞微小環境プロフィールに対する効果は、mRNA、タンパク質、脂質および代謝産物から成る群より選択される細胞分子のレベルまたは活性の変化を測定することによって監視される。
別の態様において、本発明は、(a)示差的疾患状態を提示する2つ以上の細胞または組織の分子プロフィールを比較することと;(b)レベルの変化が疾患状態に相関する分子プロフィールから分子を同定することと;(c)分子を細胞に導入することと;(d)分子の細胞の代謝性状態をシフトさせる能力を評価して;細胞の代謝性状態をシフトすることができる分子がエピメタボリックシフター(エピシフター)として同定されることを備えた、エピメタボリックシフター(エピシフター)を同定する方法を提供する。
1実施形態において、分子プロフィールは、代謝産物プロフィール、脂質プロフィール、タンパク質プロフィールまたはRNAプロフィールから成る群より選択される。
1実施形態において、分子は、正常な細胞の健康または増殖に悪影響を及ぼさない。
また別の態様において、本発明は、腫瘍性障害の処置に有効である薬剤を同定する方法であって:(1)候補環境影響因子を提供することと;(2)候補環境影響因子が細胞の代謝状態をシフトする能力を決定することと;(3)腫瘍性障害の処置に有効か否かを決定して;細胞の代謝状態をシフトすることができ、腫瘍性障害の処置に有効である候補環境影響因子が腫瘍性障害の処置に有効な薬剤として同定されることを備えた方法を提供する。
1実施形態において、env影響因子は、mRNA発現、タンパク質発現、脂質レベル、代謝産物レベル、生体エネルギー分子のレベル、細胞エネルギー特性、ミトコンドリア機能およびミトコンドリア数の1つ以上の変化を測定することによって、細胞の代謝状態をシフトできるとして同定される。
また別の態様において、本発明は、本発明の上述の方法によって同定された薬剤を備えた組成物を提供する。
別の態様において、本発明は:少なくとも1つの環境影響因子(env影響因子)を含む製薬組成物の治療的有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを備え、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察された解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルに向かって、細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、哺乳動物のCoQ10反応性障害もしくは状態を処置する、CoQ10反応性障害もしくは状態の症状を緩和する、CoQ10反応性障害もしくは状態の進行を阻害する、またはCoQ10反応性障害もしくは状態を予防する方法を提供する。
ある実施形態において、CoQ10反応性障害は腫瘍性障害である。
適用可能な場合または明確に否定されていない場合、本明細書に記載する実施形態のいずれの1つもその他の1つ以上の実施形態と、実施形態が本発明の別の態様の下に記載されていても、併用可能であることが考慮される。
I.概要および定義
本明細書で使用する場合、以下の用語のそれぞれが、本セクションおける用語と関連する意味を有する。
冠詞「a」および「an」は、冠詞の文法的対象のうち1つまたは1つを超える(すなわち少なくとも1つ)を指すために本明細書で使用される。1例として、「要素」は、1つの要素または1つを超える要素を意味する。
「含む(including)」という用語は、「限定されるわけではないが、含む」という句を意味するために本明細書で使用され、「限定されるわけではないが、含む」と互換的に使用される。
「または」という用語は、状況が別途明らかに指摘しない限り、「および/または」という用語を意味するために本明細書で使用され、「および/または」という用語と互換的に使用される。
「などの」という用語は、「限定されるわけではないが、などの」という句を意味するために本明細書で使用され、「限定されるわけではないが、などの」と互換的に使用される。
本発明の方法によって処置される「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物のどちらか、好ましくは哺乳動物を意味することができる。本明細書に記載する臨床観察がヒト対象によって行われ、少なくともいくつかの実施形態において、対象はヒトであることに注目すべきである。
「治療的有効量」は、疾患を処置するために患者に投与されたときに疾患に対してこのような処置をもたらすのに十分である化合物の量を意味する。疾患を予防するために投与されたときに、量は、疾患の開始を回避または遅延するのに十分である。「治療的有効量」は、化合物、疾患およびその重症度ならびに処置される患者の年齢、体重などに応じて変動するであろう。
「予防すること」または「予防」は、疾患または障害を獲得するリスクの低減(すなわち疾患の臨床症候の少なくとも1つを、疾患に曝露され得るまたは疾患の素因があり得るが、疾患の症候をまだ経験または提示していない患者において発症させないようにすること)を指す。
「予防」または「治療」処置という用語は、対象組成物の1つ以上の対象への投与を指す。望ましくない症状(例えば宿主動物の疾患または他の望ましくない状態)の臨床顕在化の前に投与される場合、ここで処置は予防的であり、すなわち処置は宿主が望ましくない症状を発症することから保護するのに対して、望ましくない症状の顕在化後に投与される場合、処置は治療である(すなわち既存の望ましくない症状またはそれからの副作用を減少、緩和または維持するものとする)。
「治療効果」という用語は、動物、特に哺乳動物、およびさらに詳細にはヒトにおいて薬理学的活性物質によって引き起こされる、局所または全身効果を指す。該用語はそれゆえ、動物またはヒトにおける疾患の診断、治癒、軽減、処置もしくは予防でのまたは所望の身体的もしくは精神的発達および状態の増強での使用が意図されるいずれの物質も意味する。「治療的有効量」という句は、いずれの処置にも適用できる合理的な利益/リスク比にてある望ましい局所または全身効果を産生するような物質の量を意味する。ある実施形態において、化合物の治療的有効量は、その治療指数、溶解性などに依存するであろう。例えば、本発明の方法によって見出されたある化合物は、このような処置に適用できる合理的な利益/リスク比を産生するために十分な量で投与され得る。
「患者」とは、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、サル、モルモット、ラット、マウス、トカゲ、ヘビ、ヒツジ、魚およびトリを含む、少なくとも1つの医療的介入(例えば処置、診断/予後試験など)を受けることができるいずれかの動物(例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物)を意味する。
「代謝経路」は、1つの化合物を別の化合物に変換して、中間体および細胞機能のためのエネルギーを提供する、一連の酵素媒介反応を指す。代謝経路は線形または環式であることができる。
「代謝状態」は、各種の化学的および生物学的指標が健康または疾患の状態に関連するため、各種の化学的および生物学的指標によって測定されるような所与の時点における特定の細胞、多細胞または組織環境の分子内容物を指す。
「マイクロアレイ」という用語は、基質、例えば紙、ナイロンもしくは他の種類の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、またはその他の好適な固体支持体上で合成された別個のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド(例えば抗体)またはペプチドのアレイを指す。
「障害」および「疾患」という用語は、包括的に使用され、体のいずれの部分、器官または系(またはそのいずれの組合せ)の正常な構造または機能からのいずれの逸脱も指す。特異的疾患は、生物学的、化学的および物理的変化を含む特徴的症候および徴候によって明らかとなり、限定されるわけではないが、人口統計学的因子、環境因子、雇用因子、遺伝的因子および病歴因子を含む、多種多様の他の因子と関連することが多い。ある特徴的な徴候、症候、および関連因子は、重要な診断情報を産する多種多様の方法によって定量化することができる。
「発現」という用語は、ポリペプチドがDNAから産生されるプロセスを意味するために本明細書で使用される。プロセスは、遺伝子のmRNAへの転写およびこのmRNAのポリペプチドへの翻訳を包含する。使用される状況に応じて、「発現」は、RNA、タンパク質またはその両方の産生を指す。
「遺伝子の発現レベル」または「遺伝子発現レベル」という用語は、mRNA、ならびにプレmRNA新生転写物、転写プロセシング中間体、成熟mRNAおよび分解生成物のレベル、または細胞中の遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルを指す。
「調節」という用語は、応答の上方調節(すなわち活性化または刺激)、下方調節(すなわち阻害または抑制)、または組合されたもしくは別々のその2つを指す。「モジュレーター」は、調節する化合物または分子であり、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、アクチベーター、刺激物質、サプレッサー、または阻害剤であり得る。
「コエンザイム生合成経路の中間体」という用語は、本明細書で使用する場合、チロシンおよびアセチル−CoAのユビキノン(uqiquinone)への化学的/生物学的変換の間に形成される化合物を特徴付ける。コエンザイム生合成経路の中間体は、3−ヘキサプレニル−4−ヒドロキシベンゾエート、3−ヘキサプレニル−4,5−ジヒドロキシベンゾエート、3−ヘキサプレニル−4−ヒドロキシ−5−メトキシベンゾエート、2−ヘキサプレニル−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−ヘキサプレニル−3−メチル−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−ヘキサプレニル−3−メチル−5−ヒドロキシ−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、3−オクタプレニル−4−ヒドロキシベンゾエート、2−オクタプレニルフェノール、2−オクタプレニル−6−メトキシ(metholxy)フェノール、2−オクタプレニル−3−メチル−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−オクタプレニル−3−メチル−5−ヒドロキシ−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−デカプレニル−3−メチル−5−ヒドロキシ−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−デカプレニル−3−メチル−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−デカプレニル−6−メトキシ−1,4−ベンゾキノン、2−デカプレニル−6−メトキシフェノール、3−デカプレニル−4−ヒドロキシ−5−メトキシベンゾエート、3−デカプレニル−4,5−ジヒドロキシベンゾエート、3−デカプレニル−4−ヒドロキシベンゾエート、4−ヒドロキシフェニルピルビン酸、4−ヒドロキシフェニル乳酸、4−ヒドロキシ−ベンゾエート、4−ヒドロキシ桂皮酸およびヘキサプレニル(hexapreny)2リン酸を含む。
「トロラミン」という用語は、本明細書で使用する場合、トロラミンNF、トリエタノールアミン、TEAlan(登録商標)、TEAlan 99%、トリエタノールアミン、99%、トリエタノールアミン、NFまたはトリエタノールアミン、99%、NFを指すこれらの用語は、本明細書で互換的に使用され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の化合物、例えば本明細書に記載するMIMまたはエピシフターは、それを必要とする対象においてコエンザイムQ10応答性状態を処置するために使用される。「コエンザイムQ10応答性状態」、または「CoQ10応答性状態/疾患」という専門語は、コエンザイムQ10の投与によって処置、予防、またはそうでなければ改善することができる疾患、障害、状態および/または症状を含む。いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではなく、本明細書でさらに記載されるように、細胞微小環境への代謝シフト、例えば正常状態細胞における酸化的リン酸化の種類および/またはレベルに向けたシフトを誘導することによって、少なくとも部分的に機能することが考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、CoQ10応答性状態は、細胞微小環境の代謝の改変から生じる状態である。コエンザイムQ10応答性状態は、例えば解糖および乳酸塩生合成に向かって偏り得る、例えば腫瘍性障害を含む。いくつかの実施形態において、CoQ10応答性腫瘍性障害は数ある中でも、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、または骨癌、扁平上皮細胞癌腫、基底細胞癌腫、黒色腫、および光線性角化症を含む。コエンザイムQ10応答性状態は、本明細書に記載するような他の腫瘍性障害をさらに含む。
コエンザイムQ10応答性状態は、例えば肥満、糖尿病、糖尿病前症、メタボリックシンドローム、満腹、および内分泌異常などの代謝性障害も含む。コエンザイムQ10応答性状態は、本明細書に記載するような他の代謝性障害をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明の化合物、例えば本明細書に記載するMIMまたはエピシフターは、コエンザイムQ10と共通の活性を共有する。本明細書で使用する場合、「コエンザイムQ10と共通の活性を共有する」という句は、化合物がコエンザイムQ10と同じまたは類似の活性の少なくとも一部を呈する能力を指す。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムQ10の活性の25%またはそれ以上を呈する。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムQ10の活性の最大約130%(130%を含む)を呈する。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムQ10の活性の約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、101%、102%、103%、104%、105%、106%、107%、108%、109%、110%、111%、112%、113%、114%、115%、116%、117%、118%、119%、120%、121%、122%、123%、124%、125%、126%、127%、128%、129%、または130%を呈する。本段落に挙げられた各値が「約」という用語によって修飾され得ることが理解される。加えて、本段落に挙げられたいずれの2つの値によって定義されたいずれの範囲も、本発明に含まれることを意味することが理解される。例えばいくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムQ10の活性の約50%〜約100%を呈する。いくつかの実施形態において、コエンザイムQ10および本発明の化合物によって共有される活性は、細胞代謝におけるシフトを誘導する能力である。ある実施形態において、CoQ10および本発明の化合物はによって共有される活性は、OCR(酸素消費速度)および/またはECAR(細胞外酸性化速度)によって測定される。
本明細書で使用する場合、「腫瘍性障害」は、限定されるわけではないが:白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫を含む、ヒトに見出されるあらゆる種類の癌または新生物または悪性腫瘍を指す。本明細書で使用する場合、「腫瘍性障害」、「癌」、「新生物」、および「腫瘍」という用語または専門語は、互換的におよび単数形または複数形のどちらかで使用され、これらを宿主生物に対して病的にする悪性形質転換を受けた細胞を指す。いくつかの実施形態において、腫瘍性障害はコエンザイムQ10応答性状態である。
いくつかの実施形態において、腫瘍性障害または癌は、アポトーシスの欠如によって特徴付けられる。他の実施形態において、腫瘍性障害または癌は、血管新生の増加によって特徴付けられる。他の実施形態において、腫瘍性障害または癌は、細胞外マトリクス(ECM)の分解によって特徴付けられる。また他の実施形態において、腫瘍性障害または癌は、細胞周期制御の消失によって特徴付けられる。なお他の実施形態において、腫瘍性障害または癌は、ミトコンドリア酸化的リン酸化から乳酸塩および解糖流量に対する利用および/または依存性の向上への代謝管理のシフトによって特徴付けられる。さらなる実施形態において、腫瘍性障害または癌は、免疫監視(immunosurveilance)を逃れて適応した免疫調節機構によって特徴付けられる。1実施形態において、腫瘍性障害または癌は、上の特色の少なくとも2つ、例えば血管新生の増加またはECMの分解によって特徴付けられる。1実施形態において、腫瘍性障害または癌は、上の特色の少なくとも3つによって特徴付けられる。1実施形態において、腫瘍性障害または癌は、上の特色の少なくとも4つによって特徴付けられる。1実施形態において、腫瘍性障害または癌は、上の特色の少なくとも5つによって特徴付けられる。1実施形態において、腫瘍性障害または癌は、上の特色の6つすべてによって特徴付けられる。
したがっていくつかの実施形態において、本発明の化合物は、アポトーシスの能力を回復することまたはアポトーシスを誘導することによって機能する。他の実施形態において,本発明の化合物は、血管新生を減少、低下または阻害することによって機能する。なお他の実施形態において、本発明の化合物は、再建している細胞外マトリクスを回復することによって機能する。他の実施形態において、本発明の化合物は、細胞周期制御を回復することによって機能する。なお他の実施形態において、本発明の化合物は、解糖からミトコンドリア酸化的リン酸化へ代謝管理を逆にシフトすることによって機能する。さらなる実施形態において、本発明の化合物は、免疫監視を回復するまたは体が癌細胞を異物として認識する能力を回復することによって機能する。
いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、通例、一体となって癌を発症する協調された段階的に起こるイベントがあると考えられる。すなわち、いくつかの実施形態において、癌は、1遺伝子−1タンパク質−根本因果関係のみに依存しているわけではない。いくつかの実施形態において、癌は、腫瘍となる組織変化および改変、改変された組織状態、例えばエネルギー特性、転移能を与える損なわれた細胞外マトリクス完全性、免疫監視(immunosurveilance)の欠如および/または改変された血管新生状態となって現れる生理学的疾患状態である。
原発性癌細胞(すなわち、悪性形質転換の部位付近から得た細胞)は、十分に確立された技法、特に組織学的検査によって、非癌性細胞からただちに区別することができる。癌細胞の定義は、本明細書で使用する場合、原発性癌細胞だけではなく、癌幹細胞、ならびに癌前駆細胞または癌祖先細胞(cancer cell ancestor)に由来するいずれの細胞も含む。これは転移癌細胞、ならびに癌細胞に由来するインビトロ培養物および株化細胞を含む。固形腫瘍として正常に現れる癌細胞の種類に言及するとき、「臨床的検出可能な」腫瘍は、腫瘍塊に基づいて;例えばCATスキャン、MR画像、X線、超音波もしくは触診、などの手順によって検出可能であるおよび/または患者から入手可能な試料中の1つ以上の癌特異的抗原の発現のために検出可能である腫瘍である。
本明細書で使用する場合、「正の倍率変化」は、関連する表に挙げられた遺伝子の「上方調節」または「(発現の)上昇」を指す。
本明細書で使用する場合、「負の倍率変化」は、関連する表に挙げられた遺伝子の「下方調節」または「(発現の)低下」を指す。
ある実施形態において、特定の挙げられた遺伝子が、処置後の異なる期間または各種の濃度の潜在的な環境影響因子(例えばCoQ10)による処置などの、1を超える処置条件に関連している場合、その特定の遺伝子の倍率変化は最長記録処置時間を指す。他の実施形態において、その特定の遺伝子の倍率変化は、最短記録処置時間を指す。他の実施形態において、その特定の遺伝子の倍率変化は、env影響因子(例えばCoQ10)の最高濃度による処置を指す。他の実施形態において、その特定の遺伝子の倍率変化は、env影響因子(例えばCoQ10)の最低濃度による処置を指す。また他の実施形態において、その特定の遺伝子の倍率変化は、env影響因子の治療効果と一致する方式における調節(例えば上方または下方調節)を指す。
ある実施形態において、正または負の倍率変化は、表1〜28(例えば2〜4および6〜28)のいずれかに挙げられたいずれかの遺伝子の倍率変化を指す。ある実施形態において、正または負の倍率変化は、1つの表を除く(例えば表1を除く、表5を除くなど)、表1〜28(例えば2〜4および6〜28)のいずれかに挙げられたいずれかの遺伝子の倍率変化を指す。ある実施形態において、正または負の倍率変化は、いずれか2つの表を除く(例えば表1および5を除く、表2および16を除くなど)、表1〜28(例えば2〜4および6〜28)のいずれかに挙げられたいずれかの遺伝子の倍率変化を指す。ある実施形態において、正または負の倍率変化は、いずれか3つの表を除く;またはいずれか4つの表を除く;またはいずれか5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10またはそれ以上の表を除く、表2および16を除くなど)、表1〜28(例えば2〜4および6〜28)のいずれかに挙げられたいずれかの遺伝子の倍率変化を指す。ある実施形態において、正または負の倍率変化は、表1、5、9、および12を除く、表1〜28(例えば2〜4および6〜28)のいずれかに挙げられたいずれかの遺伝子の倍率変化を指す。
ここで本発明の好ましい実施形態への参照が詳細になされるであろう。本発明は好ましい実施形態と併せて記載されるが、本発明をこれらの好ましい実施形態に制限することが意図されていないことが理解されるであろう。反対に、添付請求項によって定義されるような本発明の精神および範囲に含まれ得る代替、修正、および均等物を扱うことが意図される。
II.環境影響因子
本発明は、環境影響因子の投与により腫瘍性障害を処置する方法を提供する。「環境影響因子」(env影響因子)に、ヒト(または非ヒト哺乳動物)の疾患環境を、正常状態をもたらす正常環境または健常環境へシフトさせる、これらの環境を再建させるまたこれらの環境を保持させる有益な方式で、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の疾患環境に影響するまたは疾患環境を調節する分子である。env影響因子は、下で定義するような多次元細胞内分子(MIM)およびエピメタボリックシフター(エピシフター)の両方を含む。
本発明は、環境影響因子の投与により腫瘍性障害を処置する方法を提供する。「環境影響因子」(env影響因子)に、ヒト(または非ヒト哺乳動物)の疾患環境を、正常状態をもたらす正常環境または健常環境へシフトさせる、これらの環境を再建させるまたこれらの環境を保持させる有益な方式で、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の疾患環境に影響するまたは疾患環境を調節する分子である。env影響因子は、下で定義するような多次元細胞内分子(MIM)およびエピメタボリックシフター(エピシフター)の両方を含む。
ある実施形態において、本明細書で開示するMIMおよびエピシフターは、栄養補助食品として慣習的に使用されているものを除く。ある実施形態において、本明細書で開示されるこれらのMIMおよび/またはエピシフターは製薬グレードである。ある実施形態において、製薬グレードのMIMおよび/またはエピシフターは、約95%と約100%の間の純度を有し、95%と100%の間のすべての値を含む。ある実施形態において、MIMおよび/またはエピシフターの純度は、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.9または100%である。ある実施形態において、MIMおよび/またはエピシフターは、内毒素を含まない、または実質的に含まない。他の実施形態において、MIMおよび/またはエピシフターは、異種タンパク質材料を含まない、または実質的に含まない。ある実施形態において、MIMおよび/またはエピシフターはCoQ10である。
1.多次元細胞内分子(MIM)
「多次元細胞内分子(MIM)」という用語は、体によって自然に産生されるおよび/またはヒトの少なくとも1つの細胞中に存在する内因性分子の単離されたものまたは合成産生されたものである。MIMは、以下の機能の1つ以上、2つ以上、3つ以上、またはすべてによって特徴付けられる。MIMは細胞に進入することが可能であり、細胞への進入は、分子の生物活性部分が完全に細胞に進入する限り、細胞への完全または部分進入を含む。MIMは、細胞内でシグナル伝達および/または遺伝子発現機構を誘導することが可能である。MIMは、治療薬および担体の両方、例えば薬物送達効果を有するという点で多次元である。MIMはまた、疾患状態において1つの方法で作用し、正常な状態においては異なる方法で作用するという点で多次元である。例えばCoQ−10の場合、VEGFの存在下での黒色腫細胞へのCoQ−10の投与は、Bcl2レベルの低下をもたらし、次に黒色腫細胞の発癌能の低下をもたらす。対照的に、正常な線維芽細胞において、CoQ−10およびVEFGの同時投与は、Bcl2のレベルに対する効果は有さない。好ましくは、MIMは疾患状態の細胞において選択的に作用し、正常な状態の(マッチング)細胞において実質的に効果を有さない。好ましくは、MIMは疾患状態の細胞を、表現型、代謝状態、遺伝子型、mRNA/タンパク質発現レベルなどで正常な状態の(マッチング細胞)に選択的に近づける。
「多次元細胞内分子(MIM)」という用語は、体によって自然に産生されるおよび/またはヒトの少なくとも1つの細胞中に存在する内因性分子の単離されたものまたは合成産生されたものである。MIMは、以下の機能の1つ以上、2つ以上、3つ以上、またはすべてによって特徴付けられる。MIMは細胞に進入することが可能であり、細胞への進入は、分子の生物活性部分が完全に細胞に進入する限り、細胞への完全または部分進入を含む。MIMは、細胞内でシグナル伝達および/または遺伝子発現機構を誘導することが可能である。MIMは、治療薬および担体の両方、例えば薬物送達効果を有するという点で多次元である。MIMはまた、疾患状態において1つの方法で作用し、正常な状態においては異なる方法で作用するという点で多次元である。例えばCoQ−10の場合、VEGFの存在下での黒色腫細胞へのCoQ−10の投与は、Bcl2レベルの低下をもたらし、次に黒色腫細胞の発癌能の低下をもたらす。対照的に、正常な線維芽細胞において、CoQ−10およびVEFGの同時投与は、Bcl2のレベルに対する効果は有さない。好ましくは、MIMは疾患状態の細胞において選択的に作用し、正常な状態の(マッチング)細胞において実質的に効果を有さない。好ましくは、MIMは疾患状態の細胞を、表現型、代謝状態、遺伝子型、mRNA/タンパク質発現レベルなどで正常な状態の(マッチング細胞)に選択的に近づける。
1実施形態において、MIMはエピシフターでもある。別の実施形態において、MIMはエピシフターではない。当業者は、本発明のMIMが2つ以上の内因性分子の混合物を含むことも意図され、混合物が上述の機能の1つ以上によって特徴付けられることを認識するであろう。混合物中の内因性分子は、混合物がMIMとして機能するような比で存在する。
MIMは、脂質ベース分子または非脂質ベース分子であることができる。MIMの例は、限定されるわけではないが、CoQ10、アセチルCo−A、パルミチルCo−A、L−カルニチン、例えばチロシン、フェニルアラニン、およびシステインなどのアミノ酸を含む。1実施形態において、MIMは小型分子である。本発明の1実施形態において、MIMはCoQ10でない。MIMは、本明細書で詳細に記載されたアッセイのいずれかを使用して、当業者によって日常的に同定することができる。
いくつかの実施形態において、MIMは、ビタミンBファミリーの化合物、またはビタミンBファミリーの化合物を備えるヌクレオシド、モノヌクレオチドもしくはジヌクレオチドを含む。ビタミンBファミリーの化合物は、例えばチアミン(ビタミンB1)、ナイアシン(ニコチン酸またはビタミンB3としても公知)、またはピリドキシン(ビタミンB6)ならびにパンテノール(プロビタミンB5)などのプロビタミンを含む。いくつかの実施形態において、MIMは、チアミン、ナイアシンおよびピリドキシンから選択される。ビタミンBファミリーの化合物を備えるヌクレオシド、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチドは例えば、アデニンまたはナイアシン(ニコチン酸)分子を含むヌクレオシド、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、MIMは、アデノシン、アデノシン2リン酸(ADP)、フラビンアデノシンジヌクレオチド(FAD、ビタミンB2およびADPの一部を備える)およびニコチン酸ジヌクレオチドから選択される。
他の実施形態において、MIMはアミノ酸を含む。アミノ酸の例は、例えばチロシン(例えばL−チロシン)、システイン、フェニルアラニン(例えばL−フェニルアラニン)およびアラニンを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸はフェニルアラニンまたはアラニンである。いくつかの実施形態において、MIMは、4−ヒドロキシフェニルピルビン酸またはアセチルグリシンなどのアミノ酸誘導体を含む。
いくつかの実施形態において、MIMはグルコース類似体、例えば1個の−OHまたは−CH2OH置換基が−COOH、−COO−または−NH2置換基によって置換されているグルコース分子である。グルコース類似体の例は、グルコサミン、グルクロン酸、グルクロニドおよびグルクロン酸塩を含む。
いくつかの実施形態において、MIMは、式(I)の化合物から選択され:
式中
nは0または1の整数であり;
R1、R2、R3およびR4は存在するとき、水素およびヒドロキシルからそれぞれ独立して選択される、またはR1およびR2は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル(C=O)基を形成し;
Wは−COOHまたは−N(CH3)3 +であり;ならびに
Xは、水素、負の電荷またはNa+などのアルカリ金属カチオンである。
式中
nは0または1の整数であり;
R1、R2、R3およびR4は存在するとき、水素およびヒドロキシルからそれぞれ独立して選択される、またはR1およびR2は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル(C=O)基を形成し;
Wは−COOHまたは−N(CH3)3 +であり;ならびに
Xは、水素、負の電荷またはNa+などのアルカリ金属カチオンである。
nが0であるとき、CHR3基がW置換基に結合されていることが理解される。
いくつかの実施形態において、Wは−N(CH3)3 +である。いくつかの実施形態において、MIMは、L−カルニチンなどのカルニチンである。
いくつかの実施形態において、MIMはジカルボン酸である。いくつかの実施形態において、Wは−COOHである。いくつかの実施形態において、R3は水素である。いくつかの実施形態において、nは0である。いくつかの実施形態において、R1およびR2はそれぞれ独立して水素である。いくつかの実施形態において、Wは−COOHであり、R3は水素であり、nは0であり、ならびにR1およびR2はそれぞれ独立して水素である。いくつかの実施形態において、nは1である。いくつかの実施形態において、R1およびR2は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル(C=O)基を形成する。いくつかの実施形態において、R4は水素である。いくつかの実施形態において、R4はヒドロキシルである。いくつかの実施形態において、Wは−COOHであり、R3は水素であり、nは1であり、ならびにR1およびR2は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル(C=O)基を形成する。
いくつかの実施形態において、MIMはクレブス回路の中間体であり、過剰な中間体がクレブス回路を生産的な酸化的リン酸化に向けて操縦する。MIMである例示的なクレブス回路中間体は、コハク酸またはコハク酸塩、リンゴ酸またはリンゴ酸塩、およびα−ケトグルタル酸またはα−ケトグルタル酸塩を含む。
それゆえ、CoQ10の構成単位は、限定されるわけではないが、フェニルアラニン、チロシン、4−ヒドロキシフェニルピルビン酸、フェニル酢酸、3−メトキシ−4−ヒドロキシマンデル酸、バニリン酸、4−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、ファルネシル、2,3−ジメトキシ−5−メチル−p−ベンゾキノン、ならびに対応するその酸またはイオンを含む。いくつかの実施形態において、MIMは、フェニルアラニン、チロシン、4−ヒドロキシフェニルピルビン酸、フェニル酢酸および4−ヒドロキシベンゾエートから選択される。
(i)MIMを同定する方法
本発明は、MIMを同定する方法を提供する。MIMを同定する方法は、細胞への内因性分子の外部からの添加および内因性分子の細胞、例えば細胞微小環境プロフィールに対する効果の評価を包含する。細胞に対する効果は細胞、mRNA、タンパク質、脂質、および/または代謝産物レベルの1つ以上で評価されて、細胞微小環境プロフィールにおける改変を同定する。1実施形態において、細胞は例えばインビトロで培養された培養細胞である。1実施形態において、細胞は生物中に存在する。内因性分子は、細胞に単一の濃度で添加され得る、または細胞に一連の濃度にわたって添加され得る。1実施形態において、内因性分子は対照の未処置細胞中の内因性分子のレベルと比較して、細胞中の内因性分子のレベルが上昇するように細胞に添加される(例えば1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍またはそれ以上、上昇する)。
本発明は、MIMを同定する方法を提供する。MIMを同定する方法は、細胞への内因性分子の外部からの添加および内因性分子の細胞、例えば細胞微小環境プロフィールに対する効果の評価を包含する。細胞に対する効果は細胞、mRNA、タンパク質、脂質、および/または代謝産物レベルの1つ以上で評価されて、細胞微小環境プロフィールにおける改変を同定する。1実施形態において、細胞は例えばインビトロで培養された培養細胞である。1実施形態において、細胞は生物中に存在する。内因性分子は、細胞に単一の濃度で添加され得る、または細胞に一連の濃度にわたって添加され得る。1実施形態において、内因性分子は対照の未処置細胞中の内因性分子のレベルと比較して、細胞中の内因性分子のレベルが上昇するように細胞に添加される(例えば1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍またはそれ以上、上昇する)。
例えば形態、生理機能、および/または組成(例えばmRNA、タンパク質、脂質、代謝産物)のいずれか1つ以上における改変により検出されるような、細胞中の変化を誘導する分子は、細胞微小環境プロフィールに対して誘導された変化が疾患細胞状態と正常な細胞状態との間で異なるか否かを判定するためにさらに評価され得る。多様な組織源、細胞タイプ、または疾患状態の細胞(例えば細胞培養系統)が、比較評価のために評価され得る。例えば癌細胞の細胞微小環境プロフィールにおける誘導された変化は、非癌性または正常な細胞に誘導された変化と比較され得る。細胞の微小環境プロフィールにおける変化を誘導すること(例えば細胞の形態、生理機能および/または組成、例えばmRNA、タンパク質、脂質もしくは代謝産物の変化を誘導する)および/または正常な細胞と比較して罹患細胞の微小環境プロフィールにおける変化を示差的(例えば優先的)に誘導することが観察される内因性分子は、MIMとして同定される。
本発明のMIMは、脂質ベースMIMまたは非脂質ベースMIMであり得る。脂質ベースMIMを同定する方法は、脂質ベース内因性分子が細胞に外部から添加される上記の細胞ベース方法を包含する。好ましい実施形態において、脂質ベース内因性分子は、細胞中の脂質ベース内因性分子のレベルが上昇するように、細胞に添加される。1実施形態において、脂質ベース内因性分子のレベルは、未処置対照細胞のレベルと比較して、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍またはそれ以上、上昇する。脂質ベース分子の製剤および細胞への送達は、試験された各分子の特性に依存するが、多くの方法が当分野で公知である。脂質ベース分子の製剤および送達の例は、限定されるわけではないが、共溶媒による可溶化、担体分子、リポソーム、分散剤、懸濁剤、ナノ粒子分散剤、乳剤、例えば水中油型または油中水型乳剤、多相乳剤、例えば油中水中油型乳剤、ポリマー捕捉および封入を含む。脂質ベースMIMの細胞への送達は、質量分析法などの当分野で公知の所定の方法による、細胞脂質の抽出およびMIMの定量によって確認することができる。
非脂質ベースMIMを同定する方法は、非脂質ベース内因性分子が細胞に外部から添加される上記の細胞ベース方法を包含する。好ましい実施形態において、非脂質ベース内因性分子は、細胞中の非脂質ベース内因性分子のレベルが上昇するように、細胞に添加される。1実施形態において、非脂質ベース内因性分子のレベルは、未処置対照細胞のレベルと比較して、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍またはそれ以上、上昇する。非脂質ベース分子の製剤および細胞への送達は、試験された各分子の特性に依存するが、多くの方法が当分野で公知である。非脂質ベース分子の製剤および送達様式の例は、限定されるわけではないが、共溶媒による可溶化、、担体分子、能動輸送、ポリマー捕捉または吸着、ポリマーグラフト化、リポソーム封入およびターゲット化送達系を用いた製剤を含む。非脂質ベースMIMの細胞への送達は、質量分析法などの当分野で公知の所定の方法による、細胞内容物の抽出およびMIMの定量によって確認され得る。
2.エピメタボリックシフター(エピシフター)
本明細書で使用する場合、「エピメタボリックシフター」(エピシフター)は、健常(または正常な)状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを調節して、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および/または宿主の健康を維持または再建する分子(内因性または外因性)である。エピシフターは、組織微小環境の正常化を達成することができる。例えば、エピシフターは、細胞に添加されたまたは細胞で消耗されたときに、細胞の微小環境(例えば代謝状態)に影響を及ぼすことができるいずれの分子も含む。当業者は、本発明のエピシフターが2つ以上の分子の混合物を含むことも意図され、混合物が上述の機能の1つ以上によって特徴付けられることを認識するであろう。混合物中の分子は、混合物がエピシフターとして機能するような比で存在する。エピシフターの例は、限定されるわけではないが、CoQ−10;ビタミンD3;フィブロネクチンなどのECM構成要素;TNFαまたはインターロイキンのいずれかなどの免疫調節薬、例えばIL−5、IL−12、IL−23;血管新生因子;およびアポトーシス因子を含む。
本明細書で使用する場合、「エピメタボリックシフター」(エピシフター)は、健常(または正常な)状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを調節して、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および/または宿主の健康を維持または再建する分子(内因性または外因性)である。エピシフターは、組織微小環境の正常化を達成することができる。例えば、エピシフターは、細胞に添加されたまたは細胞で消耗されたときに、細胞の微小環境(例えば代謝状態)に影響を及ぼすことができるいずれの分子も含む。当業者は、本発明のエピシフターが2つ以上の分子の混合物を含むことも意図され、混合物が上述の機能の1つ以上によって特徴付けられることを認識するであろう。混合物中の分子は、混合物がエピシフターとして機能するような比で存在する。エピシフターの例は、限定されるわけではないが、CoQ−10;ビタミンD3;フィブロネクチンなどのECM構成要素;TNFαまたはインターロイキンのいずれかなどの免疫調節薬、例えばIL−5、IL−12、IL−23;血管新生因子;およびアポトーシス因子を含む。
いくつかの実施形態において、エピシフターは、クレブス回路における1つ以上の反応への触媒作用に直接関与する、またはクレブス回路中間体(過剰な中間体がクレブス回路を操縦する)を産生するかのどちらかである酵素などの、酵素である。いくつかの実施形態において、酵素は、トランスアルドラーゼ、またはトランスケトラーゼなどのペントースリン酸経路の非酸化的段階の酵素である。他の実施形態において、酵素は、シンターゼまたはリガーゼなどの、クレブス回路を容易にする構成要素酵素または酵素複合体である。例示的な酵素は、スクシニルCoAシンターゼ(クレブス回路酵素)またはピルビン酸カルボキシラーゼ(クレブス回路中間体であるオキサロ酢酸(OAA)を形成するために、ピルビン酸の可逆的カルボキシル化を触媒するリガーゼ)を含む。
いくつかの実施形態において、エピシフターはCoQ10の構成単位である。CoQ10の構成単位は、限定されるわけではないが、フェニルアラニン、チロシン、4−ヒドロキシフェニルピルビン酸、フェニル酢酸、3−メトキシ−4−ヒドロキシマンデル酸、バニリン酸、4−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、ファルネシル、2,3−ジメトキシ−5−メチル−p−ベンゾキノン、ならびに対応するその酸またはイオンを含む。いくつかの実施形態において、エピシフターは、フェニルアラニン、チロシン、4−ヒドロキシフェニルピルビン酸、フェニル酢酸および4−ヒドロキシベンゾエートから選択される。
いくつかの実施形態において、エピシフターはビタミンBファミリーの化合物である。ビタミンBファミリーの化合物は例えば、リボフラビン(ビタミンB2)、またはその類似体を含む。エピシフターは、本明細書に記載する内因性MIMなどの、内因性MIMのいずれにもインビボで代謝され得る、いずれの類似体またはプロドラッグも含む。
1実施形態において、エピシフターもMIMである。1実施形態において、エピシフターはCoQ10でない。エピシフターは、本明細書で詳細に記載されたアッセイのいずれかを使用して、当業者によって日常的に同定することができる。
(i)エピシフターを同定する方法
エピメタボリックシフター(エピシフター)は、細胞の代謝状態を調節する、例えば健常(または正常な)状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを誘導することが可能である分子であり、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および/または宿主の健康を維持または再建することが可能である。本発明のエピシフターはそれゆえ、罹患状態の診断評価に有用性を有する。本発明のエピシフターは、エピシフターの適用または投与(他の治療分子によるエピシフターの調節)効果が組織微小環境および疾患状態における正常化をもたらす治療用途においてさらなる有用性を有する。
エピメタボリックシフター(エピシフター)は、細胞の代謝状態を調節する、例えば健常(または正常な)状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを誘導することが可能である分子であり、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および/または宿主の健康を維持または再建することが可能である。本発明のエピシフターはそれゆえ、罹患状態の診断評価に有用性を有する。本発明のエピシフターは、エピシフターの適用または投与(他の治療分子によるエピシフターの調節)効果が組織微小環境および疾患状態における正常化をもたらす治療用途においてさらなる有用性を有する。
エピメタボリックシフターの同定は概して、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、例えば代謝産物、脂質、タンパク質またはRNAの分子プロフィール(個別のまたは併用されたプロフィール)を確立することを包含する。レベルの変化(例えばレベルの上昇または低下)が疾患状態、進行または侵襲性に相関するプロフィールからの分子は、潜在的エピシフターとして同定される。
1実施形態において、エピシフターはMIMでもある。潜在的なエピシフターは、当分野で公知のいくつもの所定の技法を使用することによって、および本明細書に記載する方法のいずれかを使用することによって、細胞への外部からの添加時に細胞に進入するその能力が評価され得る。例えば、潜在的エピシフターの細胞中への進入は、質量分析法などの当分野で公知の所定の方法による、細胞内容物の抽出および潜在的エピシフターの定量によって確認され得る。これにより、細胞に進入することができる潜在的エピシフターは、MIMとして同定される。
エピシフターを同定するために、潜在的エピシフターは次に、細胞の代謝状態をシフトする能力について評価される。潜在的エピシフターが細胞微小環境の代謝状態をシフトする能力は、細胞に潜在的エピシフターを導入すること(例えば外部から添加すること)ならびに細胞において:遺伝子発現の変化(例えばmRNAもしくはタンパク質発現の変化)、脂質もしくは代謝産物レベルの濃度変化、生体エネルギー分子レベルの変化、細胞エネルギー特性の変化、および/またはミトコンドリアの機能もしくは数の変化の1つ以上を監視することによって評価される。細胞微小環境の代謝状態をシフトすることが可能である潜在的エピシフターは、本明細書で詳細に記載されたアッセイのいずれかを使用して、当業者によって日常的に同定することができる。潜在的エピシフターは、罹患細胞の代謝状態を正常な健常状態に向けてシフトする能力について(または反対に、正常細胞の代謝状態をを罹患状態に向けてシフトする能力について)、さらに評価される。それゆえ、罹患細胞の代謝状態を正常な健常状態に向けてシフトする(または健常な正常細胞の代謝状態を罹患状態に向けてシフトする)ことが可能である潜在的エピシフターは、エピシフターとして同定される。好ましい実施形態において、エピシフターは、正常細胞の健康および/または増殖に悪影響を及ぼさない。
本発明のエピメタボリックシフターは、限定されるわけではないが、小型分子代謝産物、脂質ベース分子、ならびにタンパク質およびRNAを含む。小型分子内因性代謝産物のクラスでエピメタボリックシフターを同定するために、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、代謝産物プロフィールが確立される。各細胞または組織の代謝産物プロフィールは、細胞または組織から代謝産物を抽出することならびに次に例えば液体−クロマトグラフィー連結質量分析法またはガスクロマトグラフィー連結質量分析法を含む、当業者に公知の所定の方法を使用して、代謝産物を同定および定量することによって決定される。レベルの変化(例えばレベルの上昇または低下)が疾患の状態、進行または侵襲性に相関する代謝産物は、潜在的エピシフターとして同定される。
内因性脂質ベース分子のクラスでエピメタボリックシフターを同定するために、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、脂質プロフィールが確立される。各細胞または組織の脂質プロフィールは、脂質抽出法と、続いての例えば液体−クロマトグラフィー連結質量分析法またはガスクロマトグラフィー連結質量分析法を含む、当業者に公知の所定の方法を使用する脂質の同定および定量によって決定される。レベルの変化(大量または微量レベルの上昇または低下)が疾患の状態、進行または侵襲性に相関する脂質は、潜在的エピシフターとして同定される。
タンパク質およびRNAのクラスでエピメタボリックシフターを同定するために、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、遺伝子発現プロフィールが確立される。各細胞または組織の発現プロフィールは、例えば本明細書に詳細に記載されているような標準プロテオミクス法、mRNAアレイ法、またはゲノムアレイ法を使用して、mRNAレベルおよび/またはタンパク質レベルで決定される。発現の変化(例えばmRNAまたはタンパク質レベルでの発現の上昇または低下)が疾患の状態、進行または侵襲性に相関する遺伝子は、潜在的エピシフターとして同定される。
(例えば可溶性代謝産物、脂質ベース分子、タンパク質、RNA、または他の生物学的クラスの組成物について)上記の分子プロフィールがいったん確立されると、細胞および生化学経路分析が行われて、細胞環境における同定された潜在的エピシフターの間の公知の連関が解明される。このような細胞および/または生化学経路分析によって得られた本情報は、経路および潜在的エピシフターを分類するために利用され得る。
エピシフターが疾患状態を調節する有用性は、当分野で公知のまたは本明細書で詳細に記載されたいくつものアッセイを使用して、当業者がさらに評価および確認することができる。エピシフターが疾患状態を調節する有用性は、エピシフターの細胞または生物への直接外因性送達によって評価することができる。エピシフターが疾患状態を調節する有用性は代わりに、エピシフター(例えばエピシフターのレベルまたは活性)を直接調節する分子の発生によって評価することができる。エピシフターが疾患状態を調節する有用性はまた、エピシフターと同じ経路に配置された(例えばRNAまたはタンパク質レベルで調節される)遺伝子などの他の分子を調節することによる、エピシフター(例えばエピシフターのレベルまたは活性)を間接的に調節する分子の発生によって評価することができる。
本明細書に記載するエピメタボローム手法は、細胞微小環境に存在し、そのレベルが遺伝子機構、mRNA機構、またはタンパク質ベース機構を通じて検知および管理される内因性分子の同定を容易にする。本発明のエピシフターが引き起こす、正常細胞で見出される調節応答経路は、誤調節または罹患細胞環境における治療価値を提供し得る。加えて、本明細書に記載するエピメタボリック手法は、臨床患者選択における、疾患診断キットにおける、または予後指標としての使用のための診断指示を提供し得るエピシフターを同定する。
III.MIM/エピシフターを同定するのに有用なアッセイ
目的の分子および化合物を分離および同定するために用いた本発明の技法および方法は、限定されるわけではないが:液体クロマトグラフィー(LC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析(MS)、ガスクロマトグラフィー(GC)、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC−MS)、ガスクロマトグラフィー/質量分析(GC−MS)、核磁気共鳴(NMR)、磁気共鳴画像法(MRI)、フーリエ変換赤外(FT−IR)、および誘導結合プラズマ質量分析(ICP−MS)を含む。質量分析技法は、限定されるわけではないが、扇形磁場2重収束型装置、透過型4重極装置、4重極イオントラップ型装置、飛行時間型装置(TOF)、フーリエ変換サイクロトロン共鳴型装置(FT−MS)およびマトリクス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI−TOF MS)の使用を含むことが、さらに理解される。
目的の分子および化合物を分離および同定するために用いた本発明の技法および方法は、限定されるわけではないが:液体クロマトグラフィー(LC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析(MS)、ガスクロマトグラフィー(GC)、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC−MS)、ガスクロマトグラフィー/質量分析(GC−MS)、核磁気共鳴(NMR)、磁気共鳴画像法(MRI)、フーリエ変換赤外(FT−IR)、および誘導結合プラズマ質量分析(ICP−MS)を含む。質量分析技法は、限定されるわけではないが、扇形磁場2重収束型装置、透過型4重極装置、4重極イオントラップ型装置、飛行時間型装置(TOF)、フーリエ変換サイクロトロン共鳴型装置(FT−MS)およびマトリクス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI−TOF MS)の使用を含むことが、さらに理解される。
生体エネルギー分子レベルの定量
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、候補エピシフターが適用された細胞の細胞生体エネルギー分子レベル(例えばATP、ピルビン酸、ADP、NADH、NAD、NADPH、NADP、アセチルCoA、FADH2)の変化によって同定され得る。生体エネルギー分子レベルの例示的なアッセイは、比色(colorometric)、蛍光、および/または生物発光ベースの方法を使用する。このようなアッセイの例は下で提供される。
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、候補エピシフターが適用された細胞の細胞生体エネルギー分子レベル(例えばATP、ピルビン酸、ADP、NADH、NAD、NADPH、NADP、アセチルCoA、FADH2)の変化によって同定され得る。生体エネルギー分子レベルの例示的なアッセイは、比色(colorometric)、蛍光、および/または生物発光ベースの方法を使用する。このようなアッセイの例は下で提供される。
細胞内のATPのレベルは、当分野で公知のいくつかのアッセイおよび系を用いて測定することができる。例えば1つの系において、溶解細胞から放出された細胞質ATPは、ルシフェリンおよび酵素ルシフェラーゼと反応して、光を産生する。本生物発光はバイオルミノメータによって測定され、溶解細胞の細胞内ATP濃度を計算することができる(EnzyLight(商標)ATPアッセイキット(EATP−100)、BioAssay Systems、Hayward、CA)。別の系において、例えばATPおよびその脱リン酸化型のADPの両方が生物発光を介して計算される;ATPレベルが計算された後、ADPはATPに変換されて、次に同じルシフェラーゼ系(ApoSENSOR(商標) ADP/ATP比アッセイキット、BioVision Inc.、Mountain View、CA)を使用して検出および計算される。
ピルビン酸塩は、細胞代謝経路において重要な中間体である。ピルビン酸塩は、細胞の代謝状態に応じて、糖新生を介して炭水化物に変換され得るか、アセチルCoAを介して脂肪酸に変換もしくは代謝され得るか、またはアラニンもしくはエタノールに変換され得る。それゆえピルビン酸塩レベルの検出は、細胞試料の代謝性活性および状態の尺度を提供する。ピルビン酸塩を検出する1つのアッセイは例えば、比色および蛍光定量の両方を使用して、異なる範囲内でのピルビン酸濃度を検出する(EnzyChrom(商標)ピルビン酸アッセイキット(カタログ番号EPYR−100)、BioAssay Systems、Hayward、CA)。
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞中での生体エネルギー分子の発生および維持に関与している細胞中のミトコンドリアによって行われる、酸化的リン酸化のプロセスに影響を及ぼし得る。細胞培養物および試料の細胞エネルギー特性の変化を直接検出するアッセイ(後述する)に加えて、細胞中のミトコンドリアの別々の酵素および複合体に対する化合物の効果を検出および定量するアッセイが存在する。例えばMT−OXC MitoTox(商標)Complete OXPHOS活性アッセイ(MitoSciences Inc.,Eugene、OR)は、ミトコンドリアから抽出された複合体I〜Vに直接適用された化合物の効果を検出および定量することができる。NADHデヒドロゲナーゼ(複合体I)、シトクロムcオキシダーゼ(複合体IV)およびATPシンターゼ(複合体V)などの個別のミトコンドリア複合体に対する効果の検出および定量のアッセイも利用可能である(MitoSciences Inc.、Eugene、OR)。
細胞エネルギー特性の測定
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞エネルギー特性の変化によっても同定され得る。細胞エネルギー特性の測定の1例は、分子酸素の消費および/または細胞培養物の培地のpHの変化のリアルタイム測定である。例えば潜在的エピシフターが細胞の代謝状態を調節する能力は、例えばXF24アナライザ(Seahorse,Inc.)を使用して分析され得る。本技術によって、細胞微小環境の生体エネルギーを評価するための、細胞の単層における酸素およびpH変化のリアルタイム検出が可能となる。XF24アナライザは、どちらも細胞エネルギー特性の主要な指標である、好気性代謝の尺度である酸素消費速度(OCR)および解糖の尺度である細胞外酸化(ECAR)を測定および比較する。
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞エネルギー特性の変化によっても同定され得る。細胞エネルギー特性の測定の1例は、分子酸素の消費および/または細胞培養物の培地のpHの変化のリアルタイム測定である。例えば潜在的エピシフターが細胞の代謝状態を調節する能力は、例えばXF24アナライザ(Seahorse,Inc.)を使用して分析され得る。本技術によって、細胞微小環境の生体エネルギーを評価するための、細胞の単層における酸素およびpH変化のリアルタイム検出が可能となる。XF24アナライザは、どちらも細胞エネルギー特性の主要な指標である、好気性代謝の尺度である酸素消費速度(OCR)および解糖の尺度である細胞外酸化(ECAR)を測定および比較する。
酸化的リン酸化およびミトコンドリア機能の測定
酸化的リン酸化は、ミトコンドリアの膜に埋め込まれたタンパク質複合体を介して真核生物中で行われる栄養化合物の酸化を介して、ATPが発生されるプロセスである。大半の生物の細胞における主なATP源として、酸化的リン酸化活性の変化は、細胞内での代謝およびエネルギーバランスを強力に改変することができる。本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、酸化的リン酸化に対するその効果によって検出および/または同定され得る。いくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、限定されるわけではないが、電子輸送鎖およびATP合成を含む、酸化的リン酸化の特異的な態様に対するその効果によって検出および/または同定され得る。
酸化的リン酸化は、ミトコンドリアの膜に埋め込まれたタンパク質複合体を介して真核生物中で行われる栄養化合物の酸化を介して、ATPが発生されるプロセスである。大半の生物の細胞における主なATP源として、酸化的リン酸化活性の変化は、細胞内での代謝およびエネルギーバランスを強力に改変することができる。本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、酸化的リン酸化に対するその効果によって検出および/または同定され得る。いくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、限定されるわけではないが、電子輸送鎖およびATP合成を含む、酸化的リン酸化の特異的な態様に対するその効果によって検出および/または同定され得る。
酸化的リン酸化に関与するプロセスを行うミトコンドリア膜埋込みタンパク質複合体は、特異的タスクを実行し、I、II、IIIおよびIVとナンバリングされる。これらの複合体は、内膜貫通膜ATPシンターゼ(複合体Vとしても公知)と共に、酸化的リン酸化プロセスに関与する主要な実体である。環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)の、一般にミトコンドリア機能、および特に酸化的リン酸化プロセスに対する効果を検査できるアッセイに加えて、個別の複合体に対するエピシフターの効果を、他の複合体と別に検査するために使用できるアッセイが利用可能である。
NADH−コエンザイムQオキシドレダクターゼまたはNADHデヒドロゲナーゼとしても公知の複合体Iは、電子輸送鎖中の第1のタンパク質である。いくつかの実施形態において、複合体IによるNAD+の産生に対するエピシフターの効果の検出および定量が行われ得る。例えば複合体は、96ウェルプレート中の試料から免疫捕捉することができる;NADHからNAD+への酸化は、450nMにて吸光度の上昇を有する染料分子の還元と同時に起こる(複合体I酵素活性マイクロプレート・アッセイ・キット、MitoSciences Inc.、Eugene、OR)。
シトクロムcオキシダーゼ(COX)としても公知の複合体IVは、電子輸送鎖中の最後のタンパク質である。いくつかの実施形態において、シトクロムcの酸化および複合体IVによる酸素の水への還元に対するエピシフターの効果の検出および定量が行われ得る。例えばCOXをマイクロウェルプレート中で免疫捕捉して、COXの酸化を比色アッセイ(複合体IV酵素活性マイクロプレート・アッセイ・キット、MitoSciences Inc.,Eugene、OR)によって測定することができる。
酸化的リン酸化プロセスの最後の酵素は、他の複合体によって生成されたプロトン勾配を使用して、ADPからのATPの合成を促進する、ATPシンターゼ(複合体V)である。いくつかの実施形態において、ATPシンターゼの活性に対するエピシフターの効果の検出および定量が行われ得る。例えば試料中のATPシンターゼの活性およびATPシンターゼの量はどちらも、マイクロウェル・プレート・ウェル中で免疫捕捉されたATPシンターゼについて測定され得る。酵素は、ある条件下でATPアーゼとしても機能することができ、それゆえATPシンターゼ活性についての本アッセイにおいて、ATPがADPに還元される速度は、NADHのNAD+への同時酸化を検出することによって測定される。ATPの量は、ATPアーゼに標識された抗体を使用して計算される(ATPシンターゼ・デュプレクシング(活性+量)マイクロプレート・アッセイ・キット、MitoSciences Inc.,Eugene、OR)。酸化的リン酸化の追加のアッセイは、複合体IIおよびIIIの活性に対する効果を試験するアッセイを含む。例えばMT−OXC MitoTox(商標)Complete OXPHOSシステム(MitoSciences Inc.,Eugene、OR)を使用して、複合体IIおよびIIIならびに複合体I、IVおよびVに対する効果を評価し、酸化的リン酸化系全体に対する化合物の効果についてのデータを提供することができる。
上記のように、無処置細胞試料のリアルタイム観察は、細胞培養培地における酸素消費およびpHの変化のためのプローブを使用して行うことができる。細胞エネルギー特性のこれらのアッセイは、ミトコンドリア機能の大まかな概要および試料の細胞内のミトコンドリアの活性に対する潜在的環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)の効果を提供する。
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、ミトコンドリア膜透過性遷移孔(MPTP)の形成のために透過性の上昇を経験する現象である、ミトコンドリア膜透過性遷移(MPT)にも影響を及ぼし得る。ミトコンドリア透過性の上昇は、ミトコンドリア膨潤、すなわち酸化的リン酸化およびATP発生および細胞死の実行不能をもたらすことができる。MPTは、アポトーシスの誘導に関与し得る(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Halestrap,A.P.,Biochem.Soc.Trans.34:232−237(2006)およびLena,A.et al.Journal of Translational Med.7:13−26(2009)を参照)。
いくつかの実施形態において、MPTおよびMPTPの形成、中断および/または遂行に対する環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)の効果の検出および定量が測定される。例えばアッセイは、ミトコンドリアおよび他のサイトゾルコンパートメントの内膜内に局在する特殊化染料分子(カルセイン)の使用を通じて検出することができる。別の分子、CoCl2の適用は、サイトゾル中でのカルセイン染料の蛍光をスケルチするよう働く。しかしCoCl2はミトコンドリア内部にアクセスできず、それゆえMPTが起こって、CoCl2がMPTPを介してミトコンドリア内部にアクセスできない限り、ミトコンドリア中のカルセイン蛍光はスケルチされない。ミトコンドリア特異的蛍光シグナルの消失は、MPTの発生を通知する。フローサイトメトリが使用されて、細胞および細胞小器官の蛍光を評価することができる(MitoProbe(商標)遷移孔アッセイキット、Molecular Probes、Eugene、OR)。追加のアッセイは、実験結果を評価するために蛍光顕微鏡を利用する(Image−iT(商標) LIVEミトコンドリア遷移孔アッセイキット、Molecular Probes,Eugene、OR)。
細胞増殖および炎症の測定
本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞増殖および/または炎症に関連する分子の産生または活性に対するその影響によって同定および評価され得る。これらの分子は、限定されるわけではないが、サイトカイン、成長因子、ホルモン、細胞外マトリクスの構成要素、ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ニューロトロフィンおよび細胞シグナル伝達に関与する他の分子、ならびにシグナル伝達に関与する細胞内分子などの細胞内分子を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞増殖および/または炎症に関連する分子の産生または活性に対するその影響によって同定および評価され得る。これらの分子は、限定されるわけではないが、サイトカイン、成長因子、ホルモン、細胞外マトリクスの構成要素、ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ニューロトロフィンおよび細胞シグナル伝達に関与する他の分子、ならびにシグナル伝達に関与する細胞内分子などの細胞内分子を含む。
血管内皮成長因子(VEGF)は、強力な血管新生特性、血管特性および分裂促進特性を有する成長因子である。VEGFは内皮透過性および膨潤を刺激し、VEGF活性は、関節リウマチ、転移性癌、老年性黄斑変性および糖尿病性網膜症を含む多数の疾患および障害に関わっている。
本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、VEGFの産生に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。例えば低酸素条件またはアシドーシスを模倣する条件で維持された細胞は、VEGF産生の向上を呈するであろう。培地中に分泌されたVEGFは、ELISAまたは、利用可能な抗VEGF抗体(R&D Systems,Minneapolis、MN)を使用する他の抗体ベースアッセイを使用してアッセイすることができる。本発明のいくつかの実施形態において、エピシフターは、細胞のVEGFへの応答性に対するその効果に基づいておよび/またはVEGF受容体の発現もしくは活性に対するその効果に基づいて同定および/または特徴付けされ得る。
腫瘍壊死因子(TNF)は、健常免疫系機能ならびに自己免疫疾患の両方に関わり、炎症および免疫系活性化の主要なメディエータである。本発明のいくつかの実施形態において、エピシフターは、TNFの産生または活性に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。例えば培養細胞により産生され、培地中に分泌されたTNFは、ELISAおよび当分野で公知の他の抗体ベースアッセイを介して定量することができる。さらに、いくつかの実施形態において、環境影響因子は、TNFの受容体(ヒトTNF RI Duoset、R&D Systems、Minneapolis、MN)の発現に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。
細胞外マトリクス(ECM)の構成要素は、細胞および組織の構造ならびにシグナル伝達プロセスの両方において役割を果たす。例えば潜在型形質転換成長因子ベータ結合タンパク質は、ECM内に形質転換成長因子ベータ(TGFβ)のリザーバを生成するECM構成要素である。マトリクス結合TGFβは、マトリクス再構築のプロセスの間に放出され、付近の細胞に成長因子効果を及ぼすことができる(Dallas,S.Methods in Mol.Biol.139:231−243(2000))。
いくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、培養された細胞のECMの生成に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。研究者らは、細胞によるECMの生成、ならびにECMの組成を研究および定量することができる技法を開発してきた。例えば細胞によるECMの合成は、インキュベーションの前に細胞をハイドロゲルに埋込むことによって評価することができる。細胞によって発生したECMに対する生化学的分析および他の分析は、細胞収集およびハイドロゲルの消化の後に遂行される(Strehin,I.and Elisseeff,J.Methods in Mol.Bio.522:349−362(2009))。
いくつかの実施形態において、生物中のECMまたはその構成要素の1つの産生、状態または欠失に対する環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)の効果は同定および特徴付けされ得る。別々の種類の細胞中でまたは発生のあるステージにおいてのみ特定のECM遺伝子のノックアウトを可能にする条件的ノックアウト(KO)マウスを生成する技法が開発されている(Brancaccio,M.et al.Methods in Mol Bio.522:15−50(2009))。特定の組織中でまたは発生の特定のステージにおける特定のECM構成要素の活性または非存在に対するエピシフターまたは潜在的エピシフターの適用または投与の効果は、それゆえ評価され得る。
原形質膜完全性および細胞死の測定
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞死の見込みの上昇または低下を証明する、アポトーシス、壊死もしくは細胞変化を受ける細胞試料の原形質膜完全性の変化および/または細胞の数もしくはパーセンテージの変化によって同定され得る。
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞死の見込みの上昇または低下を証明する、アポトーシス、壊死もしくは細胞変化を受ける細胞試料の原形質膜完全性の変化および/または細胞の数もしくはパーセンテージの変化によって同定され得る。
乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)のアッセイは、細胞ステータスおよび損傷のレベルの測定を提供することができる。LDHは、安定で比較的豊富な細胞質酵素である。原形質膜が物理的完全性を失うとき、LDHは細胞外コンパートメントへ逃れる。LDHのより高い濃度は、原形質膜損傷および細胞死のより高いレベルと相関する。LDHアッセイの例は、試料中のLDHのレベルを検出および定量する比色系を使用し、テトラゾリウム塩の還元型がLDH酵素の活性を介して産生されるアッセイを含む(QuantiChrom(商標)乳酸デヒドロゲナーゼキット(DLDH−100)、BioAssay Systems、Hayward、CA;LDH細胞傷害性検出キット、Clontech、Mountain View、CA)。
アポトーシスは、多種多様の異なる開始イベントを有し得るプログラムされた細胞死のプロセスである。いくつかのアッセイを使用して、アポトーシスを受ける細胞の速度および/または数の変化を検出することができる。アポトーシスを検出および定量するために使用される1種類のアッセイは、カスパーゼ(capase)アッセイである。カスパーゼ(Capase)は、アポトーシスの間のタンパク質分解切断を介して活性化される、アスパラギン酸特異的システインプロテアーゼである。活性化カスパーゼ(capase)を検出するアッセイの例は、PhiPhiLux(登録商標)(OncoImmunin,Inc.、Gaithersburg、MD)およびCaspase−Glo(登録商標) 3/7アッセイシステム(Promega Corp.、Madison、WI)を含む。比較試料中でアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージまたは数の変化を検出できる追加のアッセイは、TUNEL/DNA断片化アッセイを含む。これらのアッセイは、アポトーシスの実行段階の間にヌクレアーゼによって発生した180〜200塩基対DNAフラグメントを検出する。例示的なTUNEL/DNA断片化は、インサイチュ細胞死検出キット(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)およびDeadEnd(商標)比色および蛍光定量TUNELシステム(Promega Corp.、Madison、WI)を含む。
いくつかのアポトーシスアッセイは、アポトーシスおよび/または非アポトーシス状態に関連するタンパク質を検出および定量する。例えばMultiTox−Fluor Multiplex細胞傷害性アッセイ(Promega Corp.、Madison、WI)は、単一基質の蛍光定量(fluorimetric)システムを使用して、生細胞および死細胞に特異的なプロテアーゼを検出および定量し、それゆえ細胞または組織試料における生細胞の、アポトーシスを受けた細胞に対する比を提供する。
アポトーシスを検出または定量するために利用可能な追加のアッセイは、細胞透過性(例えばAPOPercentage(商標)アポトーシスアッセイ、Biocolor、UK)およびアネキシンVについてのアッセイ(例えばアネキシンV−ビオチンアポトーシス検出キット、BioVision Inc.,Mountain View、CA)を含む。
IV.腫瘍性障害の処置
本発明は、腫瘍性障害を処置または予防するのに十分な量の環境影響因子をヒトに投与して、これにより腫瘍性障害を処置または予防することを含む、ヒトの腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供する。1実施形態において、環境影響因子はCoQ10でない。
本発明は、腫瘍性障害を処置または予防するのに十分な量の環境影響因子をヒトに投与して、これにより腫瘍性障害を処置または予防することを含む、ヒトの腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供する。1実施形態において、環境影響因子はCoQ10でない。
本明細書で使用する場合、「腫瘍性障害」は、限定されるわけではないが:白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫を含む、ヒトに見出されるあらゆる種類の癌または新生物または悪性腫瘍を指す。本明細書で使用する場合、「腫瘍性障害」、「癌」、「新生物」、および「腫瘍」という用語または専門語は、互換的におよび単数形または複数形のどちらかで使用され、これらを宿主生物に対して病的にする悪性形質転換を受けた細胞を指す。原発性癌細胞(すなわち、悪性形質転換の部位付近から得た細胞)は、十分に確立された技法、特に組織学的検査によって、非癌性細胞からただちに区別することができる。癌細胞の定義は、本明細書で使用する場合、原発性癌細胞だけではなく、癌幹細胞、ならびに癌前駆細胞または癌祖先細胞に由来するいずれの細胞も含む。これは転移癌細胞、ならびに癌細胞に由来するインビトロ培養物および株化細胞を含む。固形腫瘍として正常に現れる癌細胞の種類に言及するとき、「臨床的検出可能な」腫瘍は、腫瘍塊に基づいて;例えばCATスキャン、MR画像、X線、超音波もしくは触診、などの手順によって検出可能であるおよび/または患者から入手可能な試料中の1つ以上の癌特異的抗原の発現のために検出可能である腫瘍である。
「肉腫」という用語は概して、胚性結合組織のような物質から成り、概して線維物質または均質物質に埋込まれた密に充填された細胞から構成される腫瘍を指す。本発明の環境影響因子によって処置できる肉腫の例は、限定されるわけではないが、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバネシー(Abmethy’s)肉腫、脂肪肉腫、リポ肉腫、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色肉腫、絨毛癌腫、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、B細胞の免疫芽細胞肉腫、リンパ腫、T細胞の免疫芽細胞肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クップファー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉肉腫、傍骨性肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、および毛細管拡張性(telangiectaltic)肉腫を含む。
「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味すると解釈される。本発明の環境影響因子によって処置できる黒色腫は、限定されるわけではないが、例えば末端黒子型黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、S91黒色腫、ハーディング−パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫、および表在拡大型黒色腫を含む。
「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤して転移を生じる傾向がある上皮細胞から成る、悪性新生物を指す。「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤して転移を生じる傾向がある上皮細胞から成る、悪性新生物を指す。本発明の環境影響因子によって処置できる癌腫は、限定されるわけではないが、例えば腺房癌腫、腺房細胞癌腫、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌腫、腺腫性癌腫、副腎皮質の癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫、基底細胞(basal cell)癌腫、基底細胞(basocellulare)癌腫、類基底細胞癌腫、基底有棘細胞癌腫、気管支肺胞上皮癌腫、細気管支癌腫、気管支原性癌腫、大脳様(cerebriform)癌腫、胆管細胞癌腫、絨毛癌腫、コロイド癌腫、面皰癌腫、子宮体癌腫、篩状癌腫、鎧状癌腫、皮膚癌腫、円柱癌腫、円柱細胞癌腫、腺管癌腫、硬癌腫、胎児性癌腫、脳様癌腫、類表皮(epiermoid)癌腫、腺様上皮癌腫、外向発育癌腫、潰瘍癌腫、線維(fibrosum)癌腫、膠様(gelatiniform)癌腫、膠様(gelatinous)癌腫、巨細胞(giant cell)癌腫、巨細胞(gigantocellulare)癌腫、腺癌腫、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫、血性(hematoid)癌腫、肝細胞癌腫、ヒュルトレ細胞癌腫、ヒアリン癌腫、明細胞腺(hypemephroid)癌腫、小児胎児性癌腫、上皮内癌腫、表皮内癌腫、上皮内癌腫、Krompecher癌腫、クルチツキー細胞癌腫、大細胞癌腫、レンズ状(lenticular)癌腫、レンズ状(lenticulare)癌腫、脂肪性癌腫、リンパ上皮癌腫、髄様癌腫(carcinoma medullare)、髄様癌腫(medullary carcinoma)、黒色癌腫、軟癌腫(carcinoma molle)、粘液性癌腫、粘液分泌癌腫(carcinoma muciparum)、粘液細胞癌腫、粘液性類表皮癌、粘膜癌腫(carcinoma mucosum)、粘膜癌腫(mucous carcinoma)、粘液腫癌腫(carcinoma myxomatodes)、上咽頭癌、燕麦細胞、骨化性癌腫、類骨癌腫、乳頭状癌腫、門脈周囲癌腫、前浸潤癌腫、有棘細胞癌腫、粥状癌腫(pultaceous carcinoma)、腎細胞癌腫、予備細胞癌腫、肉腫様癌腫、シュナイダー癌腫、硬性癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純癌腫、小細胞癌腫、ソラノイド(solanoid)癌腫、回転楕円面細胞癌腫、紡錘体細胞癌腫、海綿様癌腫、扁平上皮癌腫、扁平上皮細胞癌腫、ストリング癌腫(string carcinoma)、血管拡張性癌腫、毛細管拡張症様癌腫、移行細胞癌腫、結節状癌腫(carcinoma tuberosum)、結節状癌腫(tuberous carcinoma)、いぼ状癌腫、および絨毛癌腫を含む。
一般に環境影響因子は、いずれの新生物も予防的にまたは治療的に処置するために使用され得る。1実施形態において、本発明の環境影響因子は、固形腫瘍を処置するために使用される。本発明の各種の実施形態において、環境影響因子(例えばCoQ10)は、各種の種類の皮膚癌(例えば扁平上皮細胞癌腫または基底細胞癌腫)、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、または骨癌の処置に使用される。1実施形態において、環境影響因子、例えばCoQ10は、限定されるわけではないが、扁平上皮細胞癌腫(SCCIS(上皮内)およびさらに侵襲性扁平上皮細胞癌腫を含む)、基底細胞癌腫(表在癌腫、結節性癌腫および浸潤性基底細胞癌腫を含む)、黒色腫、および光線性角化症を含む、皮膚腫瘍性障害の処置に使用される。しかし、環境影響因子を使用する処置は、上述の種類の癌に限定されない。環境影響因子を用いた処置に適する癌の例は、限定されるわけではないが、脳腫瘍、頭部頸部癌、前立腺癌、乳癌、精巣癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸癌、膀胱癌、腎臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、中皮腫、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、肉腫、骨癌、胃癌および髄芽細胞腫を含む。
本発明の環境影響因子によって処置することができる追加の癌は、例えばホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵島細胞腺腫、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、および前立腺癌を含む。1実施形態において、環境影響因子、例えばCoQ10によって処置することができる腫瘍性障害または癌は、黒色腫ではない。
本発明は、腫瘍性障害に罹患しているヒト対象を選択することと、グルコースの嫌気的使用の遮断およびミトコンドリア酸化的リン酸化の増強が可能であるenv影響因子の治療的有効量を前記ヒトに投与して、これにより腫瘍性障害を処置または予防することとを含む、ヒトの腫瘍性障害を処置または予防する方法をさらに提供する。
癌細胞の定義は、本明細書で使用する場合、嫌気的解糖(例えばサイトゾルにおける解糖とそれに続く乳酸発酵)、好気的解糖もしくはミトコンドリア酸化的リン酸化(例えばミトコンドリアにおける解糖とそれに続くピルビン酸の酸化)、または嫌気的解糖および好気的解糖の組合せによってエネルギーを産生する癌細胞を含むことを意図する。1実施形態において、癌細胞は、主に嫌気的解糖によってエネルギーを産生する(細胞のエネルギーの例えば少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上が嫌気的解糖によって産生される)。1実施形態において、癌細胞は、主に嫌気的解糖によってエネルギーを産生する(細胞のエネルギーの例えば少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上が嫌気的解糖によって産生される)。癌細胞の定義は、本明細書で使用する場合、嫌気的解糖によってエネルギーを産生する細胞および好気的解糖によってエネルギーを産生する細胞を備える癌細胞集団または癌細胞の混合物を含むことも意図される。1実施形態において、癌細胞集団は、嫌気的解糖によってエネルギーを産生する細胞を主に備える(集団の細胞の例えば少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上が嫌気的解糖によってエネルギーを産生する)。1実施形態において、癌細胞集団は、好気的解糖によってエネルギーを産生する細胞を主に備える(集団の細胞の例えば少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上)。
本明細書で使用する場合、「グルコース嫌気的使用」または「嫌気的解糖」または「解糖経路」という句は、サイトゾルでの解糖によるエネルギーの細胞産生とそれに続く乳酸発酵を指す。例えば多くの癌細胞は、嫌気的解糖によってエネルギーを産生する。
本明細書で使用する場合、「好気的解糖」または「ミトコンドリア酸化的リン酸化」は、ミトコンドリアでの解糖によるエネルギーの細胞産生とそれに続くピルビン酸の酸化を指す。
本明細書で使用する場合、「グルコースの嫌気的使用の遮断およびミトコンドリア酸化的リン酸化の増強が可能である」または「解糖経路からミトコンドリア(mitocondrial)酸化的リン酸化へのシフト」という句は、環境影響因子(例えばエピメタボリックシフター)の、嫌気的解糖から好気的解糖またはミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞の代謝状態のシフトまたは変化を誘導する能力を指す。本明細書で使用する場合、「(解糖からミトコンドリア酸化的リン酸化への)シフト」は、好ましくは正常細胞で見られるレベルに向かう、解糖経路に対するエネルギー依存性の低下を指す。同時に(Concommittantly)、ミトコンドリア酸化的リン酸化の絶対レベルは低減または低下もし得るが、好ましくはミトコンドリア酸化的リン酸化の効率向上と関連している。
本発明のいくつかの実施形態において、処置される腫瘍性障害は、治療的有効レベルでの活性剤の全身送達を期待した局所投与を介して通例処置される障害ではない。本明細書で使用する場合、「局所投与を介して通例処置される障害ではない」という句は、局所投与を介して治療剤によって通例または日常的に処置されないが、むしろ例えば静脈内投与を介して治療剤によって通例処置される腫瘍性障害を指す。局所投与を介して通例処置されない腫瘍性障害は、限定されるわけではないが、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、および骨癌を含む。
本発明は、より低い侵襲性癌または非侵襲性腫瘍性障害のために使用または選択された投薬レジメンよりも低い選択された用量で環境影響因子をヒトに投与することと、これにより侵襲性腫瘍性障害を処置または予防することとを備えた、ヒトの侵襲性腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供する。関連する態様において、本発明は、侵襲性腫瘍性障害のために使用または選択された投薬レジメンを超える選択されたより高い用量で環境影響因子をヒトに投与することと、これにより非侵襲性腫瘍性障害を処置または予防することとを備えた、ヒトの非侵襲性腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供する。
本明細書で使用する場合、「侵襲性腫瘍性障害」という用語は、急成長腫瘍を包含する腫瘍性障害を指す。侵襲性腫瘍性障害は通例、治療処置に応答しない、または不十分にしか応答しない。侵襲性腫瘍性障害の例は、限定されるわけではないが、膵臓癌腫、肝細胞癌腫、ユーイング肉腫、転移性乳癌、転移性黒色腫、脳腫瘍(星状細胞腫、神経膠芽腫)、神経内分泌癌、結腸癌、肺癌、骨肉腫、アンドロゲン非依存性前立腺癌、卵巣癌および非ホジキンリンパ腫を含む。
本明細書で使用する場合、「非侵襲性腫瘍性障害」という用語は、低成長腫瘍を包含する腫瘍性障害を指す。非侵襲性腫瘍性障害は通例、治療処置に有利にまたは中程度に応答する。非侵襲性腫瘍性障害の例は、限定されるわけではないが、非転移性乳癌、アンドロゲン依存性前立腺癌、小細胞肺癌および急性リンパ球性白血病を含む。1実施形態において、非侵襲性腫瘍性障害は、侵襲性腫瘍性障害でないいずれの腫瘍性障害も含む。
侵襲性腫瘍性障害の処置のために選択されるCoQ10の低い用量は、より低い侵襲性または非侵襲性の腫瘍性障害のために通例使用または選択される投薬レジメンよりも低い投薬量を含むことを意図する。各種の実施形態において、選択されるCoQ10のより低い投薬量は、より低い侵襲性または非侵襲性の腫瘍性障害のために通例使用または選択される投薬レジメンよりも、約1.5倍低い、約2倍低い、約3倍低い、約4倍低い、約5倍低いまたは約10倍低い。選択されるCoQ10のより低い投薬量は、より低い侵襲性または非侵襲性腫瘍性障害のために通例使用または選択される処置時間または投与プロトコルと比較して、CoQ10のより短い処置時間(例えば1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍または10倍短い処置時間)またはCoQ10のより低頻度の投与(例えば半分の頻度、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍または24倍低い頻度)を含むことが理解されるであろう。各種の実施形態において、侵襲性腫瘍性障害の処置のために選択されるコエンザイムQ10のより低い投薬量は、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.0001〜約5.0mg、約0.001〜約1.0mg、約0.001〜約0.5mg、約0.001〜約0.4mg、約0.001〜約0.30mg、約0.001〜約0.25mg、約0.001〜0.20mg、約0.001〜約0.12mg、または約0.001〜約0.09mgを含む。他の実施形態において、コエンザイムQ10はターゲット組織に、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.0001mg、0.001mg、0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.10mg、0.11mg、0.12mg、0.13mg、0.14mg、0.15mg、0.16mg、0.17mg、0.18mg、0.19mg、0.20mg、0.21mg、0.22mg、0.23mg、0.24mg、0.25mg、0.26mg、0.27mg、0.28mg、0.29mg、0.30mg、0.31mg、0.32mg、0.33mg、0.34mg、0.35mg、0.36mg、0.37mg、0.38mg、0.39mg、0.40mg、0.41mg、0.42mg、0.43mg、0.44mg、0.45mg、0.46mg、0.47mg、0.48mg、0.49mgまたは0.5mgの用量で適用される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか1つを有する範囲、例えば皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.005〜約0.09mgも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
非侵襲性腫瘍性障害の処置のために選択されるCoQ10のより高い投薬量は、侵襲性腫瘍性障害のために通例使用または選択される投薬レジメンよりも高い投薬量を含むことを意図される。各種の実施形態において、選択されるCoQ10のより高い投薬量は、侵襲性腫瘍性障害のために通例使用または選択される投薬レジメンよりも約1.5倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍または約10倍高い。選択されるCoQ10のより低い投薬量は、侵襲性腫瘍性障害のために通例使用または選択される処置時間または投与プロトコルと比較して、CoQ10のより長い処置時間(例えば1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍または10倍長い処置時間)またはCoQ10のより高い頻度の投与(例えば1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍または24倍高い頻度)を含むことが理解されるであろう。各種の実施形態において、侵襲性腫瘍性障害の処置のために選択されるコエンザイムQ10のより高い用量は、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.001〜約10.0mg、約0.005〜約10.0mg、約0.01〜約10.0mg、約0.05〜約5.0mg、約0.05〜約2.0mg、約0.05〜約1.0mg、約0.05〜約0.7mg、約0.10〜約0.50mg、または約0.12〜0.5mgを含む。他の実施形態において,コエンザイムQ10はターゲット組織に、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.001mg、0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.10mg、0.11mg、0.12mg、0.13mg、0.14mg、0.15mg、0.16mg、0.17mg、0.18mg、0.19mg、0.20mg、0.21mg、0.22mg、0.23mg、0.24mg、0.25mg、0.26mg、0.27mg、0.28mg、0.29mg、0.30mg、0.31mg、0.32mg、0.33mg、0.34mg、0.35mg、0.36mg、0.37mg、0.38mg、0.39mg、0.40mg、0.41mg、0.42mg、0.43mg、0.44mg、0.45mg、0.46mg、0.47mg、0.48mg、0.49mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mgまたは1.0mgの用量で適用される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか1つを有する範囲、例えば皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.15〜約0.5mgも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
1実施形態において、本発明の環境影響因子は、腫瘍サイズを縮小する、腫瘍増殖を阻害する、および/または腫瘍担持対象の生存時間を延長する。したがって本発明は、ヒトまたは他の動物の腫瘍を、このようなヒトまたは動物に環境影響因子の有効な非毒性量を投与することによって処置する方法にも関する。当業者は、所定の実験によって、悪性腫瘍を処置する目的での環境影響因子の有効な非毒性量を決定できるであろう。例えば環境影響因子の治療的活性量は、疾患ステージ(例えばステージI対ステージIV)、対象の年齢、性別、医学的合併症(例えば免疫抑制性症状または疾患)および体重、ならびに環境影響因子が対象において望ましい応答を誘導する能力などの因子に従って変動し得る。投薬レジメンは、最適治療応答を提供するように調整され得る。例えば、複数の分割用量が毎日投与され得る、または用量は、治療状況の緊急性によって指示されるように比例的に低減され得る。
V.腫瘍性障害の治療ターゲット
本発明は、腫瘍性障害の治療ターゲットを同定する方法を提供する。本発明は、このような方法によって同定された治療ターゲットをさらに提供する。治療ターゲットの同定は概して、env影響因子または候補env影響因子の細胞または株化細胞のパネルへの外因性適用、および続いての、処置細胞に対して誘導された変化の、未処置細胞と比較した評価を包含する。監視される誘導された細胞変化は、限定されるわけではないが、細胞の形態、生理機能または組成物、例えばRNA、タンパク質、脂質または代謝産物のレベルに対する変化を含む。候補env影響因子による処置の結果として誘導された細胞変化は、本明細書に記載するアッセイのいずれを使用しても監視することができる。例えばmRNAレベルでの遺伝子発現の変化はリアルタイムPCRアレイによって評価することができるが、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化は抗体マイクロアレイおよび2次元ゲル電気泳動を使用することによって監視することができる。候補env影響因子によって調節されているとして(例えばmRNAレベルおよび/またはタンパク質レベルで)同定された遺伝子は次に、経路分析を使用するシステム・バイオロジー・パースペクティブ(Systems Biology perspective using analysis)(Ingenuity IPAソフトウェア)からおよび公知の文献の検討によって評価される。潜在的な治療ターゲットとして同定された遺伝子を次に、ウェスタンブロット分析、siRNAノックダウン、または組換えタンパク質産生およびキャラクタリゼーション方法などの確認アッセイに供する。次にスクリーニングアッセイを使用して、ターゲットのモジュレーターを同定することができる。治療ターゲットのモジュレーターは、腫瘍性障害の新規治療剤として有用である。治療ターゲットのモジュレーターは、本明細書で詳細に記載するスクリーニングアッセイを使用して、または当業者に公知の所定の方法を使用することによって、日常的に同定することができる。
本発明は、腫瘍性障害の治療ターゲットを同定する方法を提供する。本発明は、このような方法によって同定された治療ターゲットをさらに提供する。治療ターゲットの同定は概して、env影響因子または候補env影響因子の細胞または株化細胞のパネルへの外因性適用、および続いての、処置細胞に対して誘導された変化の、未処置細胞と比較した評価を包含する。監視される誘導された細胞変化は、限定されるわけではないが、細胞の形態、生理機能または組成物、例えばRNA、タンパク質、脂質または代謝産物のレベルに対する変化を含む。候補env影響因子による処置の結果として誘導された細胞変化は、本明細書に記載するアッセイのいずれを使用しても監視することができる。例えばmRNAレベルでの遺伝子発現の変化はリアルタイムPCRアレイによって評価することができるが、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化は抗体マイクロアレイおよび2次元ゲル電気泳動を使用することによって監視することができる。候補env影響因子によって調節されているとして(例えばmRNAレベルおよび/またはタンパク質レベルで)同定された遺伝子は次に、経路分析を使用するシステム・バイオロジー・パースペクティブ(Systems Biology perspective using analysis)(Ingenuity IPAソフトウェア)からおよび公知の文献の検討によって評価される。潜在的な治療ターゲットとして同定された遺伝子を次に、ウェスタンブロット分析、siRNAノックダウン、または組換えタンパク質産生およびキャラクタリゼーション方法などの確認アッセイに供する。次にスクリーニングアッセイを使用して、ターゲットのモジュレーターを同定することができる。治療ターゲットのモジュレーターは、腫瘍性障害の新規治療剤として有用である。治療ターゲットのモジュレーターは、本明細書で詳細に記載するスクリーニングアッセイを使用して、または当業者に公知の所定の方法を使用することによって、日常的に同定することができる。
MIM/エピシフター、CoQ10によって調節されている(例えばmRNAレベルまたはタンパク質レベルのどちらかで上方調節または下方調節されている)として本明細書で同定された遺伝子は、本発明の薬物ターゲットである。本発明の薬物ターゲットは、限定されるわけではないが、続いて本明細書の表1〜28に続いて挙げられた遺伝子を含む。出願人によって本明細書に記載された実験の結果に基づいて、Q10によって調節された主要なタンパク質は、転写因子、アポトーシス応答、ペントースリン酸経路、生合成経路、酸化ストレス(酸化促進物質)、膜改変、および酸化的リン酸化代謝を含む異なる経路または分子の群に関連する、または分類することができる。本明細書で提供された結果に基づいて、CoQ10によって調節される主要なタンパク質は下のようにまとめられる。CoQ10によって調節され、転写因子である主要なタンパク質は、HNF4アルファである。CoQ10によって調節され、アポトーシス応答に関連する主要なタンパク質は、Bcl−xl、Bcl−xl、Bcl−xS、BNIP−2、Bcl−2、Birc6、Bcl−2−L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c−Jun、Bmf、PUMA、およびcMycを含む。CoQ10によって調節され、ペントースリン酸経路に関連する主要なタンパク質は、トランスアルドラーゼ1である。CoQ10によって調節され、生合成経路に関連する主要なタンパク質は、COQ1、COQ3、COQ6、プレニルトランスフェラーゼおよび4−ヒドロキシベンゾエートを含む。CoQ10によって調節され、酸化ストレス(酸化促進物質)に関連する主要なタンパク質は、好中球サイトゾル因子2、一酸化窒素シンターゼ2Aおよびスーパーオキシドディスムターゼ2(ミトコンドリア)を含む。CoQ10によって調節され、酸化的リン酸化代謝に関連する主要なタンパク質は、シトクロムc、複合体I、複合体II、複合体IIIおよび複合体IVを含む。CoQ10によって直接または間接的に調節されるさらなる主要なタンパク質は、Foxo3a、DJ−1、IDH−1、Cpt1CおよびカムキナーゼIIを含む。
したがって、本発明の1実施形態において、薬物ターゲットはHNF4−アルファ、Bcl−xl、Bcl−xS、BNIP−2、Bcl−2、Birc6、Bcl−2−L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c−Jun、Bmf、PUMA、cMyc、トランスアルドラーゼ1、COQ1、COQ3、COQ6、プレニルトランスフェラーゼ、4−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子2、一酸化窒素シンターゼ2A、スーパーオキシドディスムターゼ2、VDAC、Baxチャネル、ANT、シトクロムc、複合体1、複合体II、複合体III、複合体IV、Foxo3a、DJ−1、IDH−1、Cpt1CおよびカムキナーゼIIを含み得る。好ましい実施形態において、薬物ターゲットはHNF4A、トランスアルドラーゼ、NM23およびBSCvを含み得る。1実施形態において、薬物ターゲットはTNF4Aである。1実施形態において、薬物ターゲットはトランスアルドラーゼである。1実施形態において、薬物ターゲットはNM23である。1実施形態において、薬物ターゲットはBSCvである。同定された薬物ターゲットのモジュレーターを同定するのに有用なスクリーニングアッセイが下に記載される。
VI.スクリーニングアッセイ
本発明は、本発明の同定された治療ターゲットの発現および/または活性を調節する、モジュレーター、すなわち候補または試験化合物または薬剤(例えばタンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、ペプトイド、小型分子または他の薬物)を同定するための方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる)も提供する。このようなアッセイは通例、本発明の治療ターゲットと1つ以上のアッセイ構成要素との間の反応を備える。他の構成要素は、試験化合物自体、または試験化合物および本発明のマーカーの天然結合パートナーの組合せのどちらかであり得る。本明細書に記載するアッセイなどのアッセイを介して同定された化合物は、腫瘍性障害を処置または予防するのに有用であり得る。
本発明は、本発明の同定された治療ターゲットの発現および/または活性を調節する、モジュレーター、すなわち候補または試験化合物または薬剤(例えばタンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、ペプトイド、小型分子または他の薬物)を同定するための方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる)も提供する。このようなアッセイは通例、本発明の治療ターゲットと1つ以上のアッセイ構成要素との間の反応を備える。他の構成要素は、試験化合物自体、または試験化合物および本発明のマーカーの天然結合パートナーの組合せのどちらかであり得る。本明細書に記載するアッセイなどのアッセイを介して同定された化合物は、腫瘍性障害を処置または予防するのに有用であり得る。
本発明のスクリーニングアッセイで使用される試験化合物は、天然および/または合成化合物の系統的ライブラリーを含む、いずれの利用可能な供給源からも取得され得る。試験化合物はまた:生物ライブラリー;ペプトイドライブラリー(ペプチドの官能基を有するが、酵素分解の抵抗性であるが、それにもかかわらず生物活性を保持する新規の非ペプチド主鎖を持つ、分子のライブラリー;例えばZuckermann et al.,1994,J.Med.Chem.37:2678−85を参照);空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー;逆重畳を必要とする合成ライブラリー法;「1ビーズ1化合物」ライブラリー法;およびアフィニティクロマトグラフィー選択を使用するライブラリー法を含む、当分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数の手法のいずれによっても取得され得る。生物ライブラリーおよびペプトイドライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されているが、他の4つの手法は化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは小型分子ライブラリーに適用できる(Lam,1997,Anticancer Drug Des.12:145)。
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当分野において、例えば:DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909;Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422;Zuckermann et al.(1994).J.Med.Chem.37:2678;Cho et al.(1993)Science 261:1303;Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;およびGallop et al.(1994)J.Med.Chem.37:1233に見出すことができる。
化合物のライブラリーは、溶液中に(例えばHoughten,1992,Bio技法s 13:412−421)、またはビーズ(Lam,1991,Nature 354:82−84)、チップ(Fodor,1993,Nature 364:555−556)、細菌および/もしくは胞子(Ladner,USP 5,223,409)、プラスミドの上に(Cull et al,1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:1865−1869)またはファージの上に(Scott and Smith,1990,Science 249:386−390;Devlin,1990,Science 249:404−406;Cwirla et al,1990,Proc.Natl.Acad.Sci. 87:6378−6382;Felici,1991,J.Mol.Biol.222:301−310;Ladner、上掲)提供され得る。
本発明のスクリーニング方法は、細胞を試験化合物と接触させることと、試験化合物が細胞中での本発明の治療ターゲットの発現および/または活性を調節する能力を決定することとを備える。本発明の治療ターゲットの発現および/または活性は、本明細書に記載するように決定することができる。本発明の治療ターゲットの発現および/または活性は、当業者に公知の所定の方法によっても決定することができる。1実施形態において、化合物は、本発明の治療ターゲットの発現および/または活性を上昇させるその能力に基づいて選択される。1実施形態において、化合物は、表1〜28に挙げられたタンパク質から選択される治療ターゲットの発現および/または活性を上昇させるその能力に基づいて選択され、該治療ターゲットはCoQ10によって上方調節されている(例えば正の倍率変化を呈する)。1実施形態において、化合物は、本発明の治療ターゲットの発現および/または活性を低下させるその能力に基づいて選択される。1実施形態において、化合物は、表1〜28に挙げられたタンパク質から選択される治療ターゲットの発現および/または活性を低下させるその能力に基づいて選択され、該治療ターゲットはCoQ10によって下方調節されている(例えば負の倍率変化を呈する)。
別の実施形態において、本発明は、本発明の治療ターゲットの基質またはその生物活性部分である候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。また別の実施形態において、本発明は、本発明の治療ターゲットの基質またはその生物活性部分に結合する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。試験化合物が治療ターゲットに直接結合する能力を決定することは、例えば、化合物の薬物ターゲットへの結合が複合体中の標識マーカー化合物を検出することによって決定できるように、化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングすることによって達成することができる。例えば化合物(例えばマーカー基質)に131I、125I、35S、14C、または3Hを直接または間接的のどちらかで標識して、放射性同位体を電波放出の直接カウントによってまたはシンチレーションカウントによって検出することができる。あるいはアッセイ構成要素に例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼを酵素標識して、酵素標識を適切な基質の生成物への変換の決定によって検出することができる。
本発明は、上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規薬剤にさらに関する。したがって、適切な動物モデルにおいて本明細書に記載するように同定された薬剤をさらに使用することは、本発明の範囲内である。例えば本明細書に記載するように同定された本発明のマーカーの発現および/または活性を調節することができる薬剤を動物モデルで使用して、このような薬剤を用いた処置の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは本明細書に記載するように同定された薬剤を動物モデルで使用して、このような薬剤の作用機序を決定することができる。さらに、本発明は、上記スクリーニングアッセイによって同定された、上記処置のための新規薬剤の使用に関する。
VII.製薬組成物および製薬的投与
本発明の環境影響因子を対象への投与に好適な製薬組成物中に組み入れることができる。通例、製薬組成物は、本発明の環境影響因子および製薬的に許容され得る担体を備える。本明細書で使用する場合、「製薬的に許容され得る担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散剤、媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性である同様のものを含む。製薬的に許容され得る担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの1つ以上、ならびにその組合せを含む。多くの場合において、等張性剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。製薬的に許容され得る担体は、環境影響因子の有効期間または有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、保存料または緩衝液などの微量の補助物質をさらに含み得る。
本発明の環境影響因子を対象への投与に好適な製薬組成物中に組み入れることができる。通例、製薬組成物は、本発明の環境影響因子および製薬的に許容され得る担体を備える。本明細書で使用する場合、「製薬的に許容され得る担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散剤、媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性である同様のものを含む。製薬的に許容され得る担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの1つ以上、ならびにその組合せを含む。多くの場合において、等張性剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。製薬的に許容され得る担体は、環境影響因子の有効期間または有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、保存料または緩衝液などの微量の補助物質をさらに含み得る。
本発明の組成物は、多種多様の形であり得る。これらは例えば、液体剤(例えば注射用および輸液用液剤)、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉剤、クリーム、ローション、リニメント剤、軟膏またはペースト剤、眼、耳または鼻に投与するための滴剤、リポソームおよび坐剤などの液体、半固体および固体投薬形を含む。好ましい形は、投与および治療用途の所期の様式に依存する。
本発明の環境影響因子は、当分野で公知の多種多様の方法によって投与することができる。多くの治療用途では、好ましい投与経路/様式は、皮下注射、静脈内注射または輸液である。当業者によって認識されるように、投与経路および/または様式は、所望の結果に応じて変動するであろう。ある実施形態において、活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、高速放出から化合物を保護するであろう担体を用いて調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製のための多くの方法は、特許が取得されているか、または概して当業者に公知である。例えばSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978を参照。1実施形態において、投与様式は非経口(例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)である。1実施形態において、環境影響因子は、静脈内輸液または注射によって投与される。別の実施形態において、環境影響因子は、筋肉内または皮下注射によって投与される。好ましい実施形態において、環境影響因子は局所投与される。
治療組成物は通例、製造および貯蔵条件下で滅菌および安定性でなければならない。組成物は、液剤、マイクロエマルション、分散剤、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤することができる。滅菌注射用液剤は、要求される量の活性化合物(すなわち環境影響因子)を、必要に応じて上で列挙した各種の他の成分を含む適切な溶媒に組み入れ、それに続いて濾過滅菌することによって調製できる。概して、分散剤は、活性化合物を、基本分散媒および上に列挙されたものから要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌凍結乾燥粉剤の場合、好ましい調製方法は、その先に滅菌濾過した溶液から活性成分およびいずれかの追加の望ましい成分の粉剤を産する、真空乾燥および噴霧乾燥技法である。液剤の適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には要求される粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。注射用組成物の延長吸収は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
技法および製剤は一般に、Remmington’s Pharmaceutical Sciences,Meade Publishing Co.,Easton,Pa.に見出され得る。全身投与のためには、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注射が好ましい。注射の場合、本発明の化合物は、液体剤中で、好ましくはハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液中で製剤することができる。加えて、化合物は固体形で製剤され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形も含まれる。
経口投与では、製薬組成物は、結合剤(例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(例えばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム);潤滑剤(例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(例えばジャガイモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム);または湿潤剤(例えばラウリル硫酸ナトリウム)などの製薬的に許容され得る賦形剤を用いて慣習的な手段によって調製された、例えば錠剤またはカプセル剤の形をとり得る。錠剤は、当分野で周知の方法によってコーティングされ得る。経口投与のための液体調製物は、例えば液剤、シロップ剤または懸濁剤の形をとり得る、またはこれらは、使用前の水または他の好適なビヒクルによる構成のための無水生成物として提供され得る。このような液体調製物は、懸濁化剤(例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂);乳化剤(例えばレシチンまたはアラビアゴム);非水性ビヒクル(例えばアチオンド油(ationd oil)、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油);および保存料(例えばメチルもしくはプロピル−p−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)などの製薬的に許容され得る添加剤を用いて慣習的な手段によって調製され得る。調製物は必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。
経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出を与えるように好適に製剤され得る。頬側投与では、組成物は、慣習的な方式で製剤された錠剤またはロゼンジ剤の形を取り得る。吸入による投与では、本発明による使用のための化合物は、好適な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスの使用による加圧パックまたはネブライザからのエアゾールスプレー提供の形で便利に送達される。加圧エアゾールの場合、投薬単位は、計量された量を送達する弁を設けることによって決定され得る。吸入器または注入器での使用のための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末ベースの粉末ミックスを含有して製剤され得る。
化合物は、注射による、例えばボーラス注射または連続輸液による非経口投与のために製剤され得る。注射用製剤は、保存料が添加されて、単位投薬形で、例えばアンプルでまたは複数用量容器で与えられ得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤としてのこのような形を取り得て、懸濁化剤、安定剤および/または分散化剤などの製剤化剤を含有し得る。あるいは活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水による構成のための粉末形であり得る。
化合物は、例えばココアバターまたは他のグリセリドなどの慣習的な坐剤用ベースをを含有する、坐剤または留置浣腸などの経直腸組成物としても製剤され得る。
先に記載した製剤に加えて、化合物はデポー調製物としても調合され得る。このような長期作用型製剤は、インプラントによって(例えば皮下的にまたは筋肉内に)または筋肉内注射によって投与され得る。それゆえ、例えば化合物は、好適なポリマー材料または疎水性材料(例えば許容され得る油中の乳剤として)もしくはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤され得る。
全身投与は、経粘膜または経皮手段によっても可能である。経粘膜または経皮投与では、透過されるバリアにとって適切な浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、概して当分野で公知であり、含む,例えば経粘膜投与のためには、胆汁塩およびフシジン酸誘導体を含み、加えて洗剤が透過を容易にするために使用され得る。経粘膜投与は、鼻内スプレーまたは坐剤の使用により得る。局所投与では、本発明の化合物は、概して当分野で公知の軟膏、塗布剤、ゲル、またはクリームに製剤される。洗浄液を局所的に使用して、傷害または炎症を処置し、治癒を加速することができる。
組成物は所望ならば、活性成分を含有する1つ以上単位投薬形を含有し得るパックまたはディスペンサデバイスで与えられ得る。パックは例えば、金属箔またはブリスターパックなどのプラスチック箔を備え得る。パックまたはディスペンサデバイスは、投与のための説明書が添付され得る。
核酸の投与を包含する療法では、全身および局所または局在投与を含む多種多様の投与様式のために、本発明の化合物を製剤することができる。技法および製剤は一般に、Remmington’s Pharmaceutical Sciences,Meade Publishing Co.,Easton,Pa.に見出され得る。全身投与のためには、筋肉内、静脈内、腹腔内、結節内、および皮下を含む注射が好ましい。注射の場合、本発明の化合物は、液体剤中で、好ましくはハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液中で製剤することができる。加えて、化合物は固体形で製剤され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形も含まれる。
1実施形態において、環境影響因子を備える組成物は局所投与される。活性成分、すなわちenv影響因子を製薬的製剤として与えることが好ましい。活性成分は、局所投与のの場合、最終生成物において製剤の重量で約0.001%〜約20%w/wを構成し得るが、活性成分は製剤の30%w/w、好ましくは約1%〜約20%w/wをも構成し得る。本発明の局所製剤は、活性成分を1つ以上のそのための許容され得る担体および場合によりその他の治療成分と共に備える。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントにとって有害でないという意味で、「許容され得る」べきである。
目的の障害を呈している患者を処置するにあたって、これらのような1つまたは複数の薬剤の治療的有効量が投与される。治療的有効用量は、患者における症候の改善または生存の延長を生じる化合物の量を指す。
このような化合物の毒性および治療有効性は、LD50(集団の50%にとって致死性である用量)およびED50(集団の50%にとって治療的有効な用量)を決定するための、細胞培養または実験動物の標準製薬手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数であり、治療指数は比LD50/ED50として表すことができる。大きい治療指数を呈する化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から取得したデータは、ヒトで使用するための投薬量の範囲を製剤するのに使用することができる。このような化合物の投薬量は好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないED50を含む循環濃度の範囲内に存在する。投薬量は、用いた投薬形および利用した投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
本発明の方法で使用されるいずれの化合物でも、治療的有効用量は細胞培養アッセイから最初に推定することができる。例えば用量は、細胞培養で決定されたようなIC50を含む循環血漿濃度を達成する動物モデルにおいて、製剤することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより的確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えばHPLCによって測定され得る。
正確な製剤、投与経路および投薬量は、患者の症状を考慮して個別の医師によって選定されることができる(例えばFingl et al.,in The Pharmacological Basis of Therapeutics,1975,Ch.1 p.1を参照)。担当医が毒性、または器官障害のために投与を中止、中断、または調整する方法および時点を理解していることに注目すべきである。反対に、担当医は(毒性を除く)臨床応答が十分でなかった場合に、処置をより高レベルに調整することも理解しているであろう。目的の発癌(oneogenic)障害の管理における投与用量の大きさは、処置される症状の重症度および投与経路によって変動するであろう。症状の重症度は、例えば一部は、標準予後評価方法によって評価され得る。さらに用量およびおそらく投薬頻度も、個別の患者の年齢、体重、および応答によって変動するであろう。獣医学において、上述のプログラムに匹敵するプログラムが使用され得る。
処置されている特異的症状に応じて、このような薬剤は、全身的または局所的に製剤および投与され得る。Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1990)に見出され得る。好適な経路は、ほんのいくつか例を挙げると、経口、経直腸、経皮、経膣、経粘膜、または経腸投与;筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を含む非経口送達を含み得る。
上記の組成物は、いずれの好適な製剤中でも対象に投与され得る。CoQ10の局所製剤による腫瘍性障害の処置に加えて、本発明の他の態様において、CoQ10は他の方法によって送達されるかもしれない。例えば、CoQ10は非経口送達のために、例えば皮下、静脈内、筋肉内、または腫瘍内注射のために製剤されるかもしれない。送達の他の方法、例えばリポソーム送達または組成物を含浸させたデバイスからの拡散が使用されるかもしれない。組成物は、単回ボーラス、複数回注射で、または連続輸液によって(例えば静脈内にまたは腹膜透析によって)によって投与され得る。非経口投与では、組成物は好ましくは、発熱物質を含まない滅菌形で製剤される。本発明の組成物は、組成物を細胞が含有されている流体に単に添加することによって、(例えばインビトロ培養物中の癌細胞のアポトーシスを誘導するために)インビトロで細胞に投与することもできる。
処置されている特異的症状に応じて、このような薬剤は、全身的または局所的に製剤および投与され得る。Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1990)に見出され得る。好適な経路は、ほんのいくつか例を挙げると、経口、経直腸、経皮、経膣、経粘膜、または経腸投与;筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を含む非経口送達を含み得る。
注射では、本発明の薬剤は水溶液で、好ましくはハンクス液、リンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液、または生理学的生理食塩水緩衝液で製剤され得る。このような経粘膜投与では、透過されるバリアにとって適切な浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、概して当分野で公知である。
本発明の実施のために本明細書で開示された化合物を全身投与に好適な投薬形に製剤するための、製薬的に許容され得る担体の使用は、本発明の範囲内である。担体の適正な選出および好適な製造実施によって、本発明の組成物、特に液剤として製剤された組成物は、静脈内注射になどによって非経口的に投与され得る。化合物は、当分野で周知の製薬的に許容され得る担体を使用して、経口投与に好適な投薬形にただちに製剤することができる。このような担体によって、本発明の化合物を処置される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤することができる。
細胞内投与されることを意図される薬剤は、当業者に周知の技法によって投与され得る。例えばこのような薬剤は、リポソーム中に封入され、次に上記のように投与され得る。リポソームは、水性の内部を有する球状脂質2重層である。リポソーム形成の時点で水溶液中に存在するすべての分子は、水性の内部に組み入れられる。リポソームの内容物は、外部微小環境から保護されながらも、リポソームが細胞膜と融合するために、細胞質中に効率的に送達される。加えて、小型有機分子は、その疎水性のために、細胞内に直接投与され得る。
本発明での使用に好適な製薬組成物は、その所期の目的を達成する有効量で含有されている組成物を含む。有効量の決定は、とりわけ本明細書で提供された詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。活性成分に加えて、これらの製薬組成物は、製薬的に使用することができる活性化合物の調製物への処理を容易にする賦形剤および助剤を備えた、好適な製薬的に許容され得る担体を含有し得る。経口投与用に製剤された調製物は、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、または液剤の形であり得る。本発明の製薬組成物は、それ自体公知である方式で、例えば慣習的混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、浮上、乳化、封入、捕捉または凍結乾燥のプロセスによって製造され得る。
局所投与に好適な製剤は、皮膚を通じた処置が必要である部位への浸透に好適なリニメント剤、液剤、クリーム、軟膏またはペースト剤、および眼、耳または鼻への投与に好適な滴剤などの液体または半液体調製物を含む。本発明による滴剤は、滅菌水性または油性溶液または懸濁剤を備え得て、殺菌剤および/または殺真菌剤および/またはその他の好適な保存料の、および好ましくは表面活性界面活性剤を含む好適な水溶液に、活性成分を溶解することによって調製され得る。得られた溶液は次に、濾過によって清澄および滅菌され、無菌技法によって容器に移され得る。滴剤への包含に好適な殺菌剤および殺真菌剤は、硝酸または酢酸フェニル水銀(0.002%)、塩化ベンザルコニウム(0.01%)および酢酸クロルヘキシジン(0.01%)である。油性液剤の調製に好適な溶媒は、グリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールを含む。
本発明によるローションは、皮膚または眼への適用に好適なローションを含む。眼用ローションは、場合により殺菌剤を含有する滅菌水溶液を備え得て、液剤の調製方法に類似した方法によって調製され得る。皮膚への適用のためのローションまたはリニメント剤は、アルコールもしくはアセトンなどの乾燥を促進して皮膚を冷やす薬剤および/またはグリセロールなどの保湿剤またはヒマシ油もしくはラッカセイ油などの油も含み得る。
本発明によるクリーム、軟膏またはペースト剤は、外部適用のための活性成分の半固体製剤である。これらは単独のまたは水性もしくは非水性流体による溶液または懸濁液中の微粉化形または粉末化形の活性成分を、好適な機械を用いてグリースまたは非グリース基剤と混合することによって作製され得る。基剤は、固形パラフィン、軟パラフィンまたは流動パラフィンなどの炭化水素、グリセロール、ミツロウ、金属石鹸;滑粘薬;アーモンド油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然源の油;羊毛脂もしくはその誘導体、またはプロピレングリコールなどのアルコールまたはマクロゲルと共にステアリン酸またはオレイン酸などの脂肪酸を備え得る。製剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤またはソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などの非イオン性界面活性剤などのいずれの好適な界面活性剤も組み入れ得る。天然ゴム、セルロース誘導体などの懸濁化剤またはケイ質(silicaceous)シリカなどの無機材料、およびラノリンなどの他の成分も含まれ得る。
非経口投与のための製薬的製剤は、水溶形の活性化合物の水溶液を含む。加えて、活性化合物の懸濁剤は、適切な油性注射用懸濁剤として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油など脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪油、またはリポソームを含む。水性注射用懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁剤の粘度を上昇させる物質を含有し得る。場合により、懸濁剤は、高濃度の液剤の調製を可能にするために、好適な安定剤または化合物の溶解性を上昇させる薬剤も含有し得る。
経口使用のための製薬調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組合せて、場合により得られた混合物を粉砕し、所望の場合には錠剤または糖衣錠コアを取得するための好適な助剤を添加した後に顆粒の混合物を処理することによって取得することができる。好適な賦形剤は、特にラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤;例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)などのセルロース調製物である。所望ならば、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩が添加され得る。
糖衣錠コアは、好適なコーティングを施されている。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る、濃縮糖溶液が使用され得る。色素または顔料は、同定のためにまたは活性化合物用量の異なる組合せを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
経口的に使用することができる製薬調製物は、ゼラチンで作製されたプッシュ・フィット・カプセル剤、ならびにグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で作製された軟シールカプセル剤を含む。プッシュ・フィット・カプセル剤は、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および/またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合により安定剤と混合された活性成分を含むことができる。軟カプセル剤において、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁され得る。加えて、安定剤が添加され得る。
組成物は所望ならば、緩衝液系を含むことができる。緩衝液系は、組成物のpHを望ましい範囲内に維持または緩衝するように選定される。「緩衝液系」または「緩衝液」という用語は本明細書で使用する場合、1つまたは複数の溶質剤であって、水溶液中にあるときに、酸または塩基がそれに添加された場合のpH(または水素イオン濃度もしくは活性)の大きな変化に対してこのような溶液を安定させる溶質剤を指す。それゆえ上で指摘された範囲における開始時の緩衝pH値からのpHの抵抗または変化に関係する、1つまたは複数の溶質剤は周知である。無数の好適な緩衝剤があるが、リン酸カリウム1水和物が好ましい緩衝液である。
製薬組成物の最終pH値は、生理学的に適合可能な範囲内で変動し得る。最終pH値は、ヒト皮膚を必ずしも刺激する値ではなく、好ましくは活性化合物、すなわちCoQ10の経皮輸送が促進されるような値である。pHは、本制約に反することなく、CoQ10化合物の安定性を改善し、必要なときには稠度を調整するように選択され得る。1実施形態において、好ましいpH値は、約3.0〜約7.4、さらに好ましくは約3.0〜約6.5、最も好ましくは約3.5〜約6.0である。
好ましい局所送達ビヒクルでは、組成物の残りの構成要素は、必然的に精製されている水、例えば脱イオン水である。このような送達ビヒクル組成物は、組成物の総重量に基づいて、約50〜約95パーセントを超える範囲の水を含有する。しかし存在する水の明確な量は重要ではなく、所望の粘度(通常約50cps〜約10,000cps)および/または他の構成要素の濃度を取得するように調整することができる。局所送達ビヒクルは好ましくは、少なくとも約30センチポイズの粘度を有する。
他の公知の経皮浸透エンハンサを使用して、CoQ10の送達を容易にすることもできる。例証的なのは、ジメチルスルホキシド(DMSO)などのスルホキシド;1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オン(アゾン(商標)、Nelson Research,Inc.の登録商標)などの環式アミド;N,N−ジメチルアセトアミド(DMA)N,N−ジエチルトルアミド、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルオクタアミド、N,N−ジメチルデカアミドなどのアミド;N−メチル−2−ピロリドン、2−ピロリドン、2−ピロリドン−5−カルボン酸、N−(2−ヒドロキシエチル)−2−ピロリドンまたはその脂肪酸エステル、1−ラウリル−4−メトキシカルボニル−2−ピロリドン、N−タローアルキルピロリドンなどのピロリドンの誘導体;プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセロール、ヘキサントリオールなどのポリオール;オレイン酸、リノレン酸、ラウリン酸、吉草酸、ヘプタン酸、カプロン酸、ミリスチン酸、イソ吉草酸、ネオペンタン酸、トリメチルヘキサン酸、イソステアリン酸などの直鎖または分枝脂肪酸;エタノール、プロパノール、ブタノール、オクタノール、オレイル、ステアリル、リノレイルなどのアルコール;ラウリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムなどのアニオン性界面活性剤;塩化ベンザルコニウム、ドデシルトリメチル塩化アンモニウム、セチルトリメチル臭化アンモニウムなどのカチオン性界面活性剤;プロポキシ化ポリオキシエチレンエーテル、例えばポロキサマー231、ポロキサマー182、ポロキサマー184など、エトキシ化脂肪酸、例えばツイン20,Myjr45など、ソルビタン誘導体、例えばツイン40、ツイン60、ツイン80、スパン60など、エトキシ化アルコール、例えばポリオキシエチレン(4)ラウリルエーテル(Brij30)、ポリオキシエチレン(2)オレイルエーテル(Brij93)など、レシチンおよびレシチン誘導体などの非イオン性界面活性剤;D−リモネン、α−ピネン、β−カレン、α−テルピネオール、カルボール、カルボン、メントン、酸化リモネン、酸化α−ピネン、ユーカリ油などのテルペンである。サリチル酸、サリチル酸メチル、クエン酸、コハク酸などの有機酸およびエステルも、皮膚浸透エンハンサとして好適である。
1実施形態において、本発明は、CoQ10組成物およびその調製方法を提供する。好ましくは、組成物は少なくとも約1%〜約25%w/wのCoQ10を備える。CoQ10は旭化成N&P(北海道、日本)から、ユビデカレノン(USP)として入手することができる。CoQ10は、Kaneka Q10から粉末形のKanekaQ10(USP UBIDECARENONE)(Pasadena,Texas、USA)として取得することもできる。本明細書で例示された方法で使用されるCoQ10は、以下の特徴を有する:残りの溶媒はUSP 467の必要条件を満足する;水含有率は、0.0%未満、0.05%未満、または0.2%未満である;強熱残分は0.0%、0.05%未満、または0.2%未満である;重金属含有率は0.002%未満、または0.001%未満である;純度は98〜100%もしくは99.9%、または99.5%。組成物を調製する方法は、下の実施例のセクションに提供されている。
本発明のある実施形態において、コエンザイムQ10を、処置または予防が行われるようにヒトに局所投与することによって、ヒトの腫瘍性障害を処置または予防する方法が提供され、ここでコエンザイムQ10がターゲット組織に皮膚1平方センチメートルに付きコエンザイムQ10約0.01〜約0.5ミリグラムの範囲で適用される、局所ビヒクル中のコエンザイムQ10の局所用量がヒトに投与される。1実施形態において,コエンザイムQ10はターゲット組織に、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.09〜約0.15mgで適用される。各種の実施形態において、コエンザイムQ10はターゲット組織に、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.001〜約5.0mg、約0.005〜約1.0mg、約0.005〜約0.5mg、約0.01〜約0.5mg、約0.025〜約0.5mg、約0.05〜約0.4mg、約0.05〜約0.30mg、約0.10〜約0.25mg、または約0.10〜0.20mgの範囲で適用される。他の実施形態において,コエンザイムQ10はターゲット組織に皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.10mg、0.11mg、0.12mg、0.13mg、0.14mg、0.15mg、0.16mg、0.17mg、0.18mg、0.19mg、0.20mg、0.21mg、0.22mg、0.23mg、0.24mg、0.25mg、0.26mg、0.27mg、0.28mg、0.29mg、0.30mg、0.31mg、0.32mg、0.33mg、0.34mg、0.35mg、0.36mg、0.37mg、0.38mg、0.39mg、0.40mg、0.41mg、0.42mg、0.43mg、0.44mg、0.45mg、0.46mg、0.47mg、0.48mg、0.49mgまたは0.5mgの用量で適用される。1実施形態において,コエンザイムQ10はターゲット組織に、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.12mgの用量で適用される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか1つを有する範囲、例えば皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10約0.03〜約0.12mg、約0.05〜約0.15mg、約0.1〜約0.20mg、または約0.32〜約0.49mgも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
本発明の別の実施形態において、コエンザイムQ10はCoQ10クリームの形で、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10クリーム0.5〜10ミリグラムの投薬量にて投与され、ここでCoQ10クリームは1〜5%のコエンザイムQ10を備える。1実施形態において、CoQ10クリームは、約3%のコエンザイムQ10を備える。他の実施形態において、CoQ10クリームは、約1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%または5%のコエンザイムQ10を備える。各種の実施形態において、CoQ10クリームは、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10クリーム約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5または10ミリグラムの投薬量で投与される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか1つを有する範囲、例えば皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10クリーム約0.5〜約5.0mg、約1.5〜2.5mg、または約2.5〜5.5mgも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
別の実施形態において、コエンザイムQ10はCoQ10クリームの形で、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10クリーム3〜5ミリグラムの投薬量にて投与され、ここでCoQ10クリームは1〜5%のコエンザイムQ10を備える。1実施形態において、CoQ10クリームは、約3%のコエンザイムQ10を備える。他の実施形態において、CoQ10クリームは、約1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%または5%のコエンザイムQ10を備える。各種の実施形態において、CoQ10クリームは、皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10クリーム約3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9または5.0ミリグラムの投薬量で投与される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか1つを有する範囲、例えば皮膚1平方センチメートルに付きCoQ10クリーム約3.0〜約4.0mg、約3.3〜5.3mg、または約4.5〜4.9mgも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
本発明のある態様は、コエンザイムQ10を処置または予防が行われるようにヒトに局所投与することによって、ヒトの腫瘍性障害を処置または予防する方法を提供し、ここでコエンザイムQ10は24時間につき1回以上、6週間以上にわたって局所適用される。
本発明のある態様は、相A、B、C、DおよびEを調製するステップと、3%CoQ10クリームの水中油型乳剤が形成されるようにすべての相を合せるステップとを含む、コエンザイムQ10クリーム3%を調製する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、相A成分は、4.00%w/wのアルキルC12−15ベンゾエートNF、2.00%w/wのセチルアルコールNF、4.5%w/wのステアリン酸グリセリル/PEG−100および1.50%w/wのステアリルアルコールNFを含むが、相B成分は、5.00%w/wのジエチレングリコールモノエチルエーテルNF、2.00%w/wのグリセリンUSP、1.50%w/wのプロピレングリコールUSP、0.475%w/wのフェノキシエタノールNF、16.725%w/wの精製水USPおよび40.00%w/wのカルボマー分散剤2%を含み、相C成分は、0.50%w/wの乳酸USP、2.00%w/wの乳酸ナトリウム溶液USP、1.30%w/wのトロラミンNF、および2.50%w/wの精製水USPを含む。さらにこれらの実施形態において、相D成分は1.00%w/wの二酸化窒素USPを含むが、相E成分は15%w/wのCoQ10 21%濃縮物を含む。
ある他の実施形態において、相A成分は、4.00%w/wのカプリン酸/カプリル酸トリグリセリド、2.00%w/wのセチルアルコールNF、4.5%w/wのステアリン酸グリセリル/PEG−100および1.50%w/wのステアリルアルコールNFを含むが、相B成分は、5.00%w/wのジエチレングリコールモノエチルエーテルNF、2.00%w/wのグリセリンUSP、1.50%w/wのプロピレングリコールUSP、0.475%w/wのフェノキシエタノールNF、16.725%w/wの精製水USPおよび40.00%w/wのカルボマー分散剤2%を含み、相C成分は、0.50%w/wの乳酸USP、2.00%w/wの乳酸ナトリウム溶液USP、1.30%w/wのトロラミンNF、および2.50%w/wの精製水USPを含む。さらにこれらの実施形態において、相D成分は1.00%w/wの二酸化窒素USPを含むが、相E成分は15%w/wのCoQ10 21%濃縮物を含む。
本発明のある実施形態において、(1)相A成分を好適な容器に添加して、水浴内で70〜80℃まで加熱するステップと;(2)カルボマー分散剤を除く相B成分を好適な容器に添加して、混合して混合相Bを形成するステップと;(3)相E成分を好適な容器に入れ、水浴を使用して50〜60℃にて相E成分を溶融して、溶融相Eを形成するステップと;(4)カルボマー分散剤を混合タンクに添加して、混合しながら70〜80℃まで加熱するステップと;(5)温度を70〜80℃に維持しながら、混合相Bを混合タンクに添加するステップと;(6)温度を70〜80℃に維持しながら、相C成分を混合タンクに添加するステップと;(7)相D成分を混合タンクに添加して、次に混合タンクの内容の混合および均質化を続けるステップと;次に(8)均質化を停止して、混合タンクの内容物を50〜60℃に冷却するステップと;次に(9)混合を中止して、溶融相Eを混合タンクに添加して分散剤を形成するステップと;(10)次に、分散剤が滑らかで均一になるまで混合を再開するステップと;次に(11)混合タンクの内容物を45〜50℃まで冷却するステップとを含む、コエンザイムQ10クリーム3%の調製方法が提供される。
本発明のいくつかの他の実施形態において、CoQ10クリーム3%を備える製薬組成物が提供される。クリームは、組成物の4.00%w/wのC12−15アルキルベンゾエート、組成物の2.00%w/wのセチルアルコール、組成物の1.5%w/wのステアリルアルコール、4.5%w/wのステアリン酸グリセリルおよびPEG−100を有する相A;2.00%w/wのグリセリン、1.5%w/wのプロピレングリコール、5.0%w/wのエトキシジグリコール、0.475%w/wのフェノキシエタノール、40.00%w/wのカルボマー分散剤、16.725%w/wの精製水を有するB相;1.300%w/wのトリエタノールアミン、0.500%w/wの乳酸、2.000%w/wの乳酸ナトリウム溶液、2.5%w/wの水を有する相C;1.000%w/wの二酸化チタンを有する相D;および15.000%w/wのCoQ10 21%濃縮物を有する相Eを含む。いくつかの実施形態において、カルボマー分散剤は、水、フェノキシエタノール、プロピレングリコールおよびカルボマー940を含む。
本発明のいくつかの他の実施形態において、CoQ10クリーム3%を備える製薬組成物が提供される。クリームは、組成物の4.00%w/wのカプリン酸/カプリル酸トリグリセリド、組成物の2.00%w/wのセチルアルコール、組成物の1.5%w/wのステアリルアルコール、4.5%w/wのステアリン酸グリセリルおよびPEG−100を有する相A;2.00%w/wのグリセリン、1.5%w/wのプロピレングリコール、5.0%w/wのエトキシジグリコール、0.475%w/wのフェノキシエタノール、40.00%w/wのカルボマー分散剤、16.725%w/wの精製水を有するB相;1.300%w/wのトリエタノールアミン、0.500%w/wの乳酸、2.000%w/wの乳酸ナトリウム溶液、2.5%w/wの水を有する相C;1.000%w/wの二酸化チタンを有する相D;および15.000%w/wのCoQ10 21%濃縮物を有する相Eを含む。いくつかの実施形態において、カルボマー分散剤は、水、フェノキシエタノール、プロピレングリコールおよびカルボマー940を含む。
本発明のいくつかの他の実施形態において、CoQ10クリーム1.5%を備える製薬組成物が提供される。クリームは、5.000%w/wのC12−15アルキルベンゾエート、2.000%w/wのセチルアルコール、1.5%w/wのステアリルアルコール、4.500%w/wのステアリン酸グリセリルおよびPEG−100ステアリン酸を有するA相;2.000%w/wのグリセリン、1.750%w/wのプロピレン、5.000%w/wのエトキシジグリコール、0.463%w/wのフェノキシエタノール、50%w/wのカルボマー分散剤、および11.377%w/wの精製水を有する相B;1.3%w/wのトリエタノールアミン、0.400%w/wの乳酸、2.000%w/wの乳酸ナトリウム溶液および4.210%w/wの水を有する相C;1.000%w/wの二酸化チタンを有する相D;ならびに1.500%w/wのCoQ10 21%濃縮物を有する相Eを含む。
本発明のいくつかの他の実施形態において、CoQ10クリーム1.5%を備える製薬組成物が提供される。クリームは、5.000%w/wのカプリン酸/カプリル酸トリグリセリド、2.000%w/wのセチルアルコール、1.5%w/wのステアリルアルコール、4.500%w/wのステアリン酸グリセリルおよびPEG−100ステアリン酸を有するA相;2.000%w/wのグリセリン、1.750%w/wのプロピレン、5.000%w/wのエトキシジグリコール、0.463%w/wのフェノキシエタノール、50%w/wのカルボマー分散剤、および11.377%w/wの精製水を有する相B;1.3%w/wのトリエタノールアミン、0.400%w/wの乳酸、2.000%w/wの乳酸ナトリウム溶液および4.210%w/wの水を有する相C;1.000%w/wの二酸化チタンを有する相D;ならびに1.500%w/wのCoQ10 21%濃縮物を有する相Eを含む。いくつかの実施形態において、カルボマー分散剤は、水、フェノキシエタノールおよびプロピレングリコールを含む。
1.併用療法
ある実施形態において、本発明の環境影響因子および/またはその製薬組成物は、異なる環境影響因子および/またはその製薬組成物であり得る、少なくとも1つの他の治療剤を用いる併用療法で使用することができる。環境影響因子および/またはその製薬組成物ならびに他の治療剤は、相加的に、またはさらに好ましくは相乗的に作用することができる。1実施形態において、環境影響因子および/またはその製薬組成物は、別の治療剤の投与と同時に投与される。別の実施形態において、化合物および/またはその製薬組成物は、他の治療剤の投与の前にまたはそれに続いて投与される。
ある実施形態において、本発明の環境影響因子および/またはその製薬組成物は、異なる環境影響因子および/またはその製薬組成物であり得る、少なくとも1つの他の治療剤を用いる併用療法で使用することができる。環境影響因子および/またはその製薬組成物ならびに他の治療剤は、相加的に、またはさらに好ましくは相乗的に作用することができる。1実施形態において、環境影響因子および/またはその製薬組成物は、別の治療剤の投与と同時に投与される。別の実施形態において、化合物および/またはその製薬組成物は、他の治療剤の投与の前にまたはそれに続いて投与される。
1実施形態において、本発明の治療方法は、追加の薬剤を備える。例えば1実施形態において、本発明の治療方法で使用するための追加の薬剤は、化学治療剤である。
化学治療剤は一般に、例えば:1.トポイソメラーゼII阻害剤(細胞傷害性抗生物質)、例えばアントラサイクリン/アントラセンジオン、例えばドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびネモルビシン、アントラキノン、例えばミトキサントロンおよびロソキサントロン、ならびにポドフィロトキシン(podophillotoxines)、例えばエトポシドおよびテニポシド;2.微小管形成に影響を及ぼす薬剤(有糸分裂阻害剤)、例えば植物アルカロイド(例えば生物活性および細胞傷害性である、植物に由来するアルカリ性窒素含有分子のファミリーに属する化合物)、例えばタキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル、ならびにビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン、ならびにポドフィロトキシンの誘導体;3.アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、スルホン酸アルキルならびにニトロソウレア、ダカルバジン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファランなどのアルキル化作用を有する他の化合物;4.抗代謝産物(ヌクレオシド阻害剤)、例えば葉酸塩、例えば葉酸、フルオロピリミジン(fiuropyrimidines)、プリンまたはピリミジン類似体、例えば5−フルオロウラシル、カペシタビン、ゲムシタビン、メトトレキサートおよびエダトレキサート;5.トポイソメラーゼI阻害剤、例えばトポテカン、イリノテカン、ならびに9−ニトロカンプトテシン、およびカンプトテシン誘導体;ならびに6.トポイソメラーゼI阻害剤、例えばトポテカン、イリノテカン、ならびに9−ニトロカンプトテシン、およびカンプトテシン誘導体;ならびに6.白金化合物/錯体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンを含む各種のクラスに属する。本発明の方法で使用するための例示的な化学治療剤は、限定されるわけではないが、アミフォスチン(エチヨル)、シスプラチン、ダカルバジン(DTIC)、ダクチノマイシン、メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン(carrnustine)(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、ドキソルビシンリポ(ドキシル)、ゲムシタビン(ジェムザール)、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ(ダウノキソーム)、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、5−フルオロウラシル(5−FU)、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル(タキソール)、ドセタキセル(タキソテール)、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、CPT−Ill、10−ヒドロキシ−7−エチル−カンプトテシン(SN38)、ダカルバジン、S−Iカペシタビン、フトラフル、5’デオキシフルオロウリジン,UFT、エニルウラシル、デオキシシチジン、5−アザシトシン、5−アザデオキシシトシン、アロプリノール、2−クロロアデノシン、トリメトレキサート、アミノプテリン、メチレン−10−デアザアミノプテリン(MDAM)、オキサプラチン、ピコプラチン、テトラプラチン、サトラプラチン、プラチナ−DACH、オルマプラチン、CI−973、JM−216、およびその類似体、エピルビシン、リン酸エトポシド、9−アミノカンプトテシン、10,11−メチレンジオキシカンプトテシン、カレニテシン、9−ニトロカンプトテシン、TAS103、ビンデシン、L−フェニルアラニンマスタード、イホスファミド メフォスファミド、ペルフォスファミド,トリホスファミド カルムスチン、セムスチン、エポチロンA−E、トムデックス、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、アムサクリン、リン酸エトポシド、カレニテシン、アシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、アマンタジン、リマンタジン、ラミブジン、ジドブジン、ベバシズマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、5−フルオロウラシル、カペシタビン、ペントスタチン、トリメトレキセート、クラドリビン、フロキシウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロランブシル、シスプラチン,ドキソルビシン,パクリタキセル(タキソール)およびブレオマイシン、ならびに特定の腫瘍または癌の適切な治療標準に基づいて当業者にただちに明らかにとなるその組合せを含む。
別の実施形態において、本発明の併用療法で使用するための追加の薬剤は、生物剤である。
生物剤(生物製剤とも呼ばれる)は、生物系の生成物、例えば生物、細胞、または組換え系の生成物である。このような生物剤の例は、核酸分子(例えばアンチセンス核酸分子)、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、抗体、例えばモノクローナル抗体、抗血管新生剤、およびサイトカインを含む。例示的な生物剤は、下でさらに詳細に議論され、一般に、例えば:1.ホルモン、ホルモン類似体、およびホルモン複合体、例えばエストロゲンおよびエストロゲン類似体、プロゲステロン、プロゲステロン、プロゲステロン類似体およびプロゲスチン、アンドロゲン、アデノコルチコステロイド、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、抗テストステロン、副腎ステロイド阻害剤、および抗黄体形成ホルモン;ならびに2.酵素、タンパク質、ペプチド、ポリクローナルおよび/またはモノクローナル抗体、例えばインターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子などを含む各種のクラスに属する。
1実施形態において、生物製剤はインターフェロンである。インターフェロン(IFN)は、体内で自然に発生するタイプ生物剤である。インターフェロンは実験室でも産生されて、生物療法にて癌患者に与えられる。インターフェロンは、癌患者の免疫系が癌細胞に対して作用する方法を改善することが示されている。
インターフェロンは、癌細胞に直接働いて、その増殖を遅延させ得る、またはインターフェロンは癌細胞をより正常な挙動を有する細胞に変化させ得る。いくつかのインターフェロンは、癌細胞への対抗を補助する血流中の白血球のタイプである、ナチュラルキラー細胞(NK)細胞、T細胞、およびマクロファージも刺激し得る。
1実施形態において、生物製剤はインターロイキンである。インターロイキン(IL)は、多くの免疫細胞の増殖および活性を刺激する。インターロイキンは、体内で自然に出現するが、実験室でも作製することができるタンパク質(サイトカインおよびケモカイン)である。
いくつかのインターロイキンは、癌細胞を破壊するよう働く、リンパ球などの免疫細胞の増殖および活性を刺激する。
別の実施形態においては、生物製剤はコロニー刺激因子である。
コロニー刺激因子(CSF)は、患者に投与されて、骨髄内の幹細胞がより多くの血液細胞を産生するよう促進するタンパク質である。体は常に、とりわけ癌が存在するときに、新たな白血球、赤血球、および血小板を必要とする。CSFは、化学療法と共に投与されて、免疫系を増強するのを補助する。癌患者が化学療法を受けるとき、骨髄が新たな血液細胞を産生する能力は抑制され、患者は感染をより発症しやすくなる。免疫系の一部は血液細胞なしでは機能できず、それゆえコロニー刺激因子は、骨髄幹細胞が白血球、血小板、および赤血球を産生するよう促進する。
他の癌処置は適正な細胞産生によって、患者が引き続いてより高い用量の化学療法を安全に受けられるようにできる。
別の実施形態において、生物製剤は抗体である。抗体、例えばモノクローナル抗体は、癌細胞に結合する、実験室で産生される物質である。
癌破壊剤が体内に導入されるとき、癌破壊剤は抗体を探し出して、癌細胞を死滅させる。モノクローナル抗体剤は、健常細胞を破壊しない。モノクローナル抗体は、各種の機構を通じてその治療効果を達成する。モノクローナル抗体は、アポトーシスまたはプログラムされた細胞死を産生するのに直接効果を有することができる。モノクローナル抗体は、増殖因子受容体を遮断することができ、腫瘍細胞の増殖を有効に停止させる。モノクローナル抗体を発現する細胞において、モノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体の形成を引き起こすことができる。
本発明の併用処置で使用され得る自体の例は、抗CD20抗体、例えば限定されるわけではないが、セツキシマブ、トシツモマブ、リツキシマブ、およびイブリツモマブを含む。抗HER2抗体も、癌の処置のために環境影響因子と併用して使用され得る。1実施形態において、抗HER2抗体はトラスツズマブ(ヘルセプチン)である。癌の処置のために環境影響因子と併用して使用され得る抗体の他の例は、抗CD52抗体(例えばアレムツズマブ)、抗CD−22抗体(例えばエピラツズマブ)、および抗CD33抗体(例えばゲムツズマブオゾガマイシン)を含む。抗VEGFも、癌の処置のために環境影響因子と併用して使用され得る。1実施形態において、抗VEGF抗体はベバシズマブである。他の実施形態において、生物剤は、抗EGFR抗体、例えばセツキシマブである抗体である。別の実施例は、抗糖タンパク質17−1A抗体のエドレコロマブである。
別の実施形態において、生物製剤はサイトカインである。サイトカイン療法はタンパク質(サイトカイン)を使用して、対象の免疫系が癌性である細胞を認識および破壊するのを補助する。サイトカインは、免疫系によって体内で自然に産生されるが、実験室でも作製することができる。本療法は、進行した黒色腫によって、およびアジュバント療法(原発性癌処置の後に、またはこれに加えて投与される療法)と共に使用される。サイトカイン療法は体のあらゆる部分に到達して、癌細胞を死滅させ、腫瘍が増殖するのを防止する。
別の実施形態において、生物製剤は融合タンパク質である。例えば、組換えヒトApo2L/TRAIL(Genentech)は併用療法で使用され得る。Apo2/TRAILは、アポトーシス(プログラムされた細胞死)の調節に関与するアポトーシス促進性受容体DR4およびDR5を両方とも活性化するように設計された、第1の2重アポトーシス促進性受容体アゴニストである。
1実施形態において、生物製剤はアンチセンス核酸分子である。
本明細書で使用する場合、「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である、例えば2本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的である、mRNA配列に相補的である、または遺伝子のコード鎖に相補的であるヌクレオチド配列を備える。したがって、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合することができる。
1実施形態において、生物剤は、例えば血管新生を増強する分子の、例えばbFGF、VEGFおよびEGFRのsiRNA分子である。1実施形態において、血管新生を阻害する生物剤はRNAiを媒介する。RNA干渉(RNAi)は、2本鎖RNA(dsRNA)を使用して、dsRNAと同じ配列を含有するメッセンジャRNA(mRNA)を分解する、転写後ターゲット遺伝子サイレンシング技法である(Sharp,P.A.and Zamore,P.D.287,2431−2432(2000);Zamore,P.D.,et al.Cell 101,25−33(2000).Tuschl,T.et al.Genes Dev.13,3191−3197(1999);Cottrell TR,and Doering TL.2003.Trends Microbiol.11:37−43;Bushman F.2003.Mol Therapy.7:9−10;McManus MT and Sharp PA.2002.Nat Rev Genet.3.737−47)。プロセスが行われるのは、内因性リボヌクレアーゼがより長いdsRNAを切断して、低分子干渉RNAまたはsiRNAと呼ばれる、より短い、例えば21または22ヌクレオチド長RNAにするときである。次により小さいRNAセグメントが、ターゲットmRNAの分解を媒介する。RNAiの合成キットは、例えばNew England BiolabsまたはAmbionから市販されている。1実施形態において、アンチセンスRNAで使用するための1つ以上の化学薬品を、RNAiを媒介する分子中で用いることができる。
細胞における特定のタンパク質の発現を下方調節するためのアンチセンス核酸の使用は、当分野で周知である(例えばWeintraub,H.et al.,Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis,Reviews−Trends in Genetics,Vol.1(1)1986;Askari,F.K.and McDonnell,W.M.(1996)N.Eng.J.Med.334:316−318;Bennett,M.R.and Schwartz,S.M.(1995)Circulation 92:1981−1993;Mercola,D.and Cohen,J.S.(1995)Cancer Gene Ther.2:47−59;Rossi,JJ.(1995)Br.Med.Bull.51.217−225;Wagner,R.W.(1994)Nature 372:333−335を参照)。アンチセンス核酸分子は、別の核酸分子のコード鎖に相補的であるヌクレオチド配列(例えばmRNA配列)を備え、したがって他の核酸分子のコード鎖に水素結合することができる。mRNAの配列に相補的なアンチセンス配列は、mRNAのコード領域、mRNAの5’もしくは3’非翻訳領域またはコード領域と非翻訳領域を橋架けする領域(例えば5’非翻訳領域とコード領域の接合部にて)に見出される配列に相補的であることができる。さらにアンチセンス核酸は順次、mRNAをコードする遺伝子の調節領域、例として転写開始配列または調節要素に相補的であることができる。好ましくは、アンチセンス核酸は、コード鎖上のまたはmRNAの3’未翻訳領域内の開始コドンに先行するまたは開始コドンに及ぶ領域に相補的であるように設計されている。
血管新生を強化する分子のコード鎖配列を考えると、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソン・クリック塩基対合則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、mRNAのコード領域全体に相補的であることができるが、さらに好ましくはmRNAのコードまたは非コード領域の部分のみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的であることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが例えば約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチドであることができる。
本発明のアンチセンス核酸は、当分野で公知の手順を使用する化学合成および酵素ライゲーション反応を使用して作製することができる。例えばアンチセンス核酸(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然型ヌクレオチドまたは分子の生物安定性を向上させるまたはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成された2本鎖の物理的安定性を向上させるように設計された多様に修飾されたヌクレオチドを使用して、化学的に合成することができ、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸を発生させるために使用できる修飾ヌクレオチドの例は、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−D−ガラクトシルケウオシン(queosine)、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン,2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、ベータ−D−マンノシルケウオシン(queosine)、5’−メトキシカルボキシメチルウラシル,5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケウオシン(queosine)、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6−ジアミノプリンを含む。細胞における発現を阻害するために、1つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。あるいはアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向で中にサブクローニングされている発現ベクターを使用して生物学的に産生することができる(すなわち以下の小節でさらに記載されるように、挿入された核酸から転写されたRNAは、目的のターゲット核酸に対してアンチセンス配向であろう)。
また別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、a−アノマー核酸分子である。a−アノマー核酸分子は、通常のa−ユニットとは反対に、鎖が相互に平行に並んだ、相補的RNAとの特異的な2本鎖ハイブリッドを形成する(Gaultier et al.(1987)Nucleic Acids.Res.15:6625−6641)。アンチセンス核酸分子は、2’−o−メチルリボヌクレオチド(Inoue et al.(1987)Nucleic Acids Res.15:6131−6148)またはキメラRNA−DNA類似体(Inoue et al.(1987)FEBS Lett.215:327−330)も備えることができる。
別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、RNAiを媒介する化合物である。RNA干渉剤は、限定されるわけではないが、ターゲット遺伝子またはゲノム配列と相同であるRNA分子を含む核酸分子、「低分子干渉RNA」(siRNA)、「「短ヘアピン」または「小ヘアピンRNA」(shRNA)、およびRNA干渉(RNAi)によるターゲット遺伝子の発現を妨害または阻害する小型分子を含む。RNA干渉は、2本鎖RNA(dsRNA)を使用して、dsRNAと同じ配列を含有するメッセンジャRNA(mRNA)を分解する、転写後ターゲット遺伝子サイレンシング技法である(Sharp,P.A.and Zamore,P.D.287,2431−2432(2000);Zamore,P.D.,et al.Cell 101,25−33(2000).Tuschl,T.et al.Genes Dev.13,3191−3197(1999))。プロセスが行われるのは、内因性リボヌクレアーゼがより長いdsRNAを切断して、低分子干渉RNAまたはsiRNAと呼ばれる、より短い、例えば21または22ヌクレオチド長RNAにするときである。次により小さいRNAセグメントが、ターゲットmRNAの分解を媒介する。RNAiの合成キットは、例えばNew England BiolabsまたはAmbionから市販されている。1実施形態においてアンチセンスRNAで使用するための上述の1つ以上の化学薬品を用いることができる。
例えば血管新生を阻害する分子をコードする核酸分子は、対象の細胞でのコード化タンパク質の発現に好適な形で対象中に導入され得て、本発明の方法においても使用され得る。血管新生を阻害する例示的な分子は、限定されるわけではないが、TSP−I、TSP−2、IFN−g、IFN−a、アンギオスタチン、エンドスタチン、ツマスタチン、カンスタチン、VEGI、PEDF、バソヒビン、およびプロラクチン2−メトキシエストラジオールの16kDaフラグメントを含む(総説については、Kerbel(2004)J.Clin Invest 114:884を参照)。
例えば全長または部分cDNA配列は組換え発現ベクター中にクローニングされ、ベクターは標準分子生物学技法を使用して細胞中に形質移入される。cDNAは、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用する増幅によってまたは適切なcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。cDNAのヌクレオチド配列は、標準PCR方法によるcDNAの増幅を可能にするPCRプライマの設計に、または標準ハイブリダイゼーション方法を使用してcDNAライブラリーをスクリーニングするために使用できるハイブリダイゼーションプローブの設計に使用することができる。cDNAの単離または増幅の後に、DNAフラグメントは好適な発現ベクター中に導入される。
本発明の方法で使用するための例示的な生物剤は、限定されるわけではないが、ゲフィチニブ(イレッサ)、アナストロゾール(anastrazole)、ジエチルスチルベストロール(diethylstilbesterol)、エストラジオール、プレマリン、ラロキシフェン、プロゲステロン、ノルエチノドレル、エチステロン(esthisterone)、ジメチステロン(dimesthisterone)、酢酸メゲストロール、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ノルエチステロン、メチルテストステロン、テストステロン、デキサメタゾン(dexamthasone)、プレドニゾン、コルチゾール、ソルメドロール、タモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、アミノグルテチミド、テストラクトン、ドロロキシフェン、アナストロゾール、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、ゴセレリン、フルタミド、ロイプリド、トリプトレリン、アミノグルテチミド、ミトタン、ゴセレリン、セツキシマブ、エルロチニブ、イマチニブ、トシツモマブ、アレムツズマブ,トラスツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、ベバシズマブ、デニロイキンジフチトクス、ダクリズマブ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、抗4−lBB、抗4−lBBL、抗CD40、抗CD154、抗OX40、抗OX40L、抗CD28、抗CD80、抗CD86、抗CD70、抗CD27、抗HVEM、抗LIGHT、抗GITR、抗GITRL、抗CTLA−4、可溶性OX40L、可溶性4−IBBL、可溶性CD154、可溶性GITRL、可溶性LIGHT、可溶性CD70、可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CTLA4−Ig、GVAX(登録商標)、および特定の腫瘍または癌の適切な標準治療に基づいて当業者にただちに明らかとなるその組合せを含む。薬剤の可溶形は、薬剤を例えばIg−Fc領域と作動的に連結することによって、例えば融合タンパク質として作製され得る。
1を超える、例えば1、2、3、4、5の薬剤が環境影響因子と併用して投与され得ることに注目すべきである。例えば1実施形態において、2つの化学治療剤が環境影響因子と併用して投与され得る。別の実施形態において、化学治療剤、生物剤、および環境影響因子が投与され得る。
各種の生物剤の各種の形が使用され得る。これらは制限なく、腫瘍中にインプラント、注射またはそうでなければ挿入されたときに生物的に活性化される、プロフォーム分子、非荷電分子、分子複合体、塩、エーテル、エステル、アミドなどのような形を含む。
本発明は、制限するとして解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例証される。本願を通じて引用されているすべての参考文献ならびに公開された特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられている。
本発明はここで一般に記載されており、当業者が、本明細書の上記の教示および以下の実施例から、他のアッセイ、細胞の種類、薬剤、作製物、またはデータ分析方法が、すべて制限なく、請求された本発明の範囲から逸脱せずに使用できることを認識しているので、単に本発明の実施形態のある態様の例証の目的のために含まれており、本発明を制限する意図するものではない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。
本出願のいずれの箇所で参照されたいずれの特許、特許出願、特許公報、または科学論文の内容も、その全体が本明細書に組み入れられている。
本発明の実施は、適切な場合および別途指摘しない限り,当業者の技法範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、ウイルス学、組換えDNA、および免疫学の慣習的な技法を用いるであろう。このような技法は、文献に記載されている。例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,ed.by Sambrook and Russell(Cold Spring Harbor Laboratory Press:2001);専門書、Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);Using Antibodies,Second Edition by Harlow and Lane,Cold Spring Harbor Press,New York,1999;Current Protocols in Cell Biology,ed.by Bonifacino,Dasso,Lippincott−Schwartz,Harford,およびYamada,John Wiley and Sons,Inc.,New York,1999;and PCR Protocols,ed.by Bartlett et al.,Humana Press,2003を参照。
実施例1:MIMとしてのCoQ10の同定
潜在的なMIMとしてCoQ10を評価するために、酸化型のCoQ10を癌株化細胞および正常な対照株化細胞の両方を含む株化細胞のパネルに外部から添加して、パネルの各株化細胞について細胞微小環境プロフィールに誘導された変化を影響評価した。mRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方を含む、細胞形態/生理機能に対するおよび細胞組成物に対する変化を、正常細胞との比較として罹患細胞について評価および比較した。これらの実験結果は、CoQ10、および特にCoQ10の酸化型をMIMとして同定した。実験の第1セットでは、細胞形態/生理機能に対する変化をCoQ10に対する細胞の感受性およびアポトーシス応答を検査することによって評価した。対照株化細胞(ケラチノサイトおよびメラノサイトの初代培養)および複数の皮膚癌株化細胞(SK−MEL−28、非転移性皮膚黒色腫;SK−MEL−2、転移性皮膚黒色腫;またはSCC、扁平上皮細胞癌腫;PaCa2、膵臓癌株化細胞;またはHEP−G2、肝臓癌株化細胞)を含む皮膚株化細胞のパネルを各種のレベルのコエンザイムQ10によって処置した。これらの実験結果は、癌株化細胞が、対照株化細胞と比較して改変された用量依存性応答を癌細胞のみにおけるアポトーシスおよび細胞死の誘導と共に呈することを証明した。例示的な実験を下の実施例3に詳細に記載する。
潜在的なMIMとしてCoQ10を評価するために、酸化型のCoQ10を癌株化細胞および正常な対照株化細胞の両方を含む株化細胞のパネルに外部から添加して、パネルの各株化細胞について細胞微小環境プロフィールに誘導された変化を影響評価した。mRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方を含む、細胞形態/生理機能に対するおよび細胞組成物に対する変化を、正常細胞との比較として罹患細胞について評価および比較した。これらの実験結果は、CoQ10、および特にCoQ10の酸化型をMIMとして同定した。実験の第1セットでは、細胞形態/生理機能に対する変化をCoQ10に対する細胞の感受性およびアポトーシス応答を検査することによって評価した。対照株化細胞(ケラチノサイトおよびメラノサイトの初代培養)および複数の皮膚癌株化細胞(SK−MEL−28、非転移性皮膚黒色腫;SK−MEL−2、転移性皮膚黒色腫;またはSCC、扁平上皮細胞癌腫;PaCa2、膵臓癌株化細胞;またはHEP−G2、肝臓癌株化細胞)を含む皮膚株化細胞のパネルを各種のレベルのコエンザイムQ10によって処置した。これらの実験結果は、癌株化細胞が、対照株化細胞と比較して改変された用量依存性応答を癌細胞のみにおけるアポトーシスおよび細胞死の誘導と共に呈することを証明した。例示的な実験を下の実施例3に詳細に記載する。
次に、CoQ10による処置後に細胞の組成の変化を影響評価するアッセイを用いた。リアルタイムPCRアレイ法を使用して、mRNAレベルでの遺伝子発現の変化を分析した。例示的な実験を下の実施例6および9〜13に詳細に記載する。相補的実験において、抗体マイクロアレイ法、2次元ゲル電気泳動、それに続く質量分析キャラクタリゼーションを使用するタンパク質同定(identificuation)を使用することによって、およびウェスタンブロット分析によって、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化を分析した。例示的な実験を下の実施例4、7および8にそれぞれ詳細に記載する。これらのアッセイからの結果は、検査された株化細胞において、遺伝子発現の著しい変化がmRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方で、酸化型CoQ10の添加により誘導されることを証明した。CoQ10処置によって調節された遺伝子は、アポトーシス、癌生物学および細胞増殖、解糖および代謝、分子輸送、ならびに細胞シグナル伝達を含む、複数の細胞経路中に密集することが見出された。
CoQ10の細胞中への進入を確認し、細胞中に存在するCoQ10のレベルおよび型を決定するために実験を行った。特に、ミトコンドリア中に存在するコエンザイムQ10のレベル、ならびにCoQ10の型(すなわち酸化型または還元型)を、CoQ10で処置した細胞からのミトコンドリア濃縮調製物を分析することによって決定した。ミトコンドリア中に存在するコエンザイムQ10のレベルは、外因性Q10の添加に伴って、時間および用量依存的な様式で増加することが確認された。驚くべき予想外の結果において、CoQ10はミトコンドリア中に主に酸化型で存在することが決定された。加えて、濃縮試料からのタンパク質のレベルの変化を2次元ゲル電気泳動および質量分析キャラクタリゼーションによるタンパク質同定によって分析した。これらの実験からの結果は、検査された時間経過でのミトコンドリア中の酸化型CoQ10のレベルが、代謝経路およびアポトーシス経路に関連する特異的タンパク質のmRNAレベルおよびタンパク質レベルの調節によって明示されるように、多岐にわたる細胞変化に相関することを証明した。例示的な実験を下の実施例5に詳細に記載する。
本明細書で出願人らによって記載された結果は、内因性分子CoQ10、および特にCoQ10の酸化型をMIMとして同定した。例えば結果がCoQ10をMIMとして同定したのは、CoQ10がmRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方での遺伝子発現の変化を誘導することが観察されたためである。結果が、CoQ10が多次元特徴を有するとして同定したのは、CoQ10が、正常な(例えば非癌性)状態と比較した疾患状態(例えば癌)において、細胞形態/生理機能および細胞組成物の示差的変化(例えばmRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方での遺伝子発現の示差的変化)を誘導したためである。その上、結果は、CoQ10が細胞に進入することができ、それゆえ治療効果および担体効果の両方を呈するという点で多次元特徴を有するとして同定した。
実施例2:腫瘍性障害の疾患関連プロセスおよびバイオマーカーを同定する方法
株化細胞が目的の分子によって処置された細胞ベースアッセイから、処置細胞対非処置細胞の相違をmRNAアレイ、タンパク質抗体アレイ、および2次元ゲル電気泳動によって評価する。比較試料分析からMIMまたはエピシフターによって調節されることが同定されたタンパク質を、経路分析を使用するシステム・バイオロジー・パースペクティブ(Systems Biology perspective using analysis)(Ingenuity IPAソフトウェア)および公知の文献の検討から評価した。潜在的な治療ターゲットまたはバイオマーカーターゲットとして同定されたタンパク質をウェスタンブロット分析、siRNAノックダウン、または組換えタンパク質産生およびキャラクタリゼーション方法などの確認アッセイに供した。
株化細胞が目的の分子によって処置された細胞ベースアッセイから、処置細胞対非処置細胞の相違をmRNAアレイ、タンパク質抗体アレイ、および2次元ゲル電気泳動によって評価する。比較試料分析からMIMまたはエピシフターによって調節されることが同定されたタンパク質を、経路分析を使用するシステム・バイオロジー・パースペクティブ(Systems Biology perspective using analysis)(Ingenuity IPAソフトウェア)および公知の文献の検討から評価した。潜在的な治療ターゲットまたはバイオマーカーターゲットとして同定されたタンパク質をウェスタンブロット分析、siRNAノックダウン、または組換えタンパク質産生およびキャラクタリゼーション方法などの確認アッセイに供した。
実施例3〜8の物質および方法
コエンザイムQ10ストック
500μMコエンザイムQ10(細胞増殖培地中5%イソプロパノール)を以下のように調製した。500μMコエンザイムQ10ストック10mLは、毎回更新した。分子量:863.34
(0.0005mol/L)(0.010L)(863.34g/mol)=0.004317g
コエンザイムQ10ストック
500μMコエンザイムQ10(細胞増殖培地中5%イソプロパノール)を以下のように調製した。500μMコエンザイムQ10ストック10mLは、毎回更新した。分子量:863.34
(0.0005mol/L)(0.010L)(863.34g/mol)=0.004317g
500μMストック10mLを作製するために、4.32mgコエンザイムQ10を15mLファルコンチューブに秤量して、イソプロパノール500μLを添加した。溶液を完全に溶解するために撹拌しながら、50〜60℃の水浴で加温した。本溶液に培地9.5mL(細胞を培養したのと同じ培地)を添加した。
細胞培養
細胞をAmerican Type Culture CollectionまたはGibcoから取得した。細胞を5%ウシ胎仔血清、0.25ug/mLアンホテリシン、100ug/mLストレプトマイシン、および100UmL−1ペニシリンを補足したDMEM/F−12培地で培養した。細胞を37℃の95%空気および5%CO2の雰囲気中で維持した。
細胞をAmerican Type Culture CollectionまたはGibcoから取得した。細胞を5%ウシ胎仔血清、0.25ug/mLアンホテリシン、100ug/mLストレプトマイシン、および100UmL−1ペニシリンを補足したDMEM/F−12培地で培養した。細胞を37℃の95%空気および5%CO2の雰囲気中で維持した。
コエンザイムQ10処置および全タンパク質単離
細胞をQ10に曝露する前に85%コンフルエントまで培養した。補足培地をQ10によって50および100マイクロモル濃度に調整した。フラスコを対照、50μMQ10、および100μMQ10によって3通り処置した。タンパク質を処置フラスコおよび対照フラスコから4、8、12、および24時間後に単離した。タンパク質の単離のために、細胞はpH7.4の氷冷PBS 5mLによって3回洗浄した。細胞を次にPBS 3mL中でこすり取り、遠心分離によってペレット化し、pH7.4の溶解緩衝液(プロテアーゼ阻害剤およびリン酸阻害剤を含む、80mM TRIS−HCl、1%SDS)に再懸濁させた。BCA法を使用してタンパク質濃度を定量した。
細胞をQ10に曝露する前に85%コンフルエントまで培養した。補足培地をQ10によって50および100マイクロモル濃度に調整した。フラスコを対照、50μMQ10、および100μMQ10によって3通り処置した。タンパク質を処置フラスコおよび対照フラスコから4、8、12、および24時間後に単離した。タンパク質の単離のために、細胞はpH7.4の氷冷PBS 5mLによって3回洗浄した。細胞を次にPBS 3mL中でこすり取り、遠心分離によってペレット化し、pH7.4の溶解緩衝液(プロテアーゼ阻害剤およびリン酸阻害剤を含む、80mM TRIS−HCl、1%SDS)に再懸濁させた。BCA法を使用してタンパク質濃度を定量した。
株化細胞
下に挙げる株化細胞を増殖させて、それぞれについて細胞バンクを樹立した。各種のアッセイのための細胞の大規模産生を遂行して、分析のために材料を収集した。一般に、株化細胞の維持に細胞特異的培地が不要であるとき、細胞増殖増殖に使用した培地は5%血清を含むDMEMF−12であった。細胞は通例、続いての分割ならびに細胞アッセイおよび標準実施方法における使用の前に、75〜80%コンフルエント(クリアスペーシング(clear spacing))まで増殖させた。実験のために以下の株化細胞を樹立した:
SK−MEL−28(非転移性皮膚黒色腫)
SK−MEL−2(転移性皮膚黒色腫)
HEKa(ケラチノサイト、皮膚対照)
HEMa(メラノサイト、皮膚対照)
nFIB(新生児線維芽細胞)
HEP−G2(肝臓癌)[SBH株化細胞]
SkBr−3(乳癌、Her2過剰発現)
MCF−7(乳癌、p53突然変異)
PC−3(前立腺癌)[SBH株化細胞]
SkBr−3(ヒト乳腺癌)
NCI−ES−0808
SCC(扁平上皮細胞癌腫)
PaCa−2
NIH−3T3
下に挙げる株化細胞を増殖させて、それぞれについて細胞バンクを樹立した。各種のアッセイのための細胞の大規模産生を遂行して、分析のために材料を収集した。一般に、株化細胞の維持に細胞特異的培地が不要であるとき、細胞増殖増殖に使用した培地は5%血清を含むDMEMF−12であった。細胞は通例、続いての分割ならびに細胞アッセイおよび標準実施方法における使用の前に、75〜80%コンフルエント(クリアスペーシング(clear spacing))まで増殖させた。実験のために以下の株化細胞を樹立した:
SK−MEL−28(非転移性皮膚黒色腫)
SK−MEL−2(転移性皮膚黒色腫)
HEKa(ケラチノサイト、皮膚対照)
HEMa(メラノサイト、皮膚対照)
nFIB(新生児線維芽細胞)
HEP−G2(肝臓癌)[SBH株化細胞]
SkBr−3(乳癌、Her2過剰発現)
MCF−7(乳癌、p53突然変異)
PC−3(前立腺癌)[SBH株化細胞]
SkBr−3(ヒト乳腺癌)
NCI−ES−0808
SCC(扁平上皮細胞癌腫)
PaCa−2
NIH−3T3
細胞培養:
細胞をAmerican Type Culture CollectionまたはGibcoから取得した。細胞を5%ウシ胎仔血清、0.25ug/mLアンホテリシン、100ug/mLストレプトマイシン、および100UmL−1ペニシリンを補足したDMEM/F−12培地で培養した。細胞を37℃の95%空気および5%CO2の雰囲気中で維持した。
細胞をAmerican Type Culture CollectionまたはGibcoから取得した。細胞を5%ウシ胎仔血清、0.25ug/mLアンホテリシン、100ug/mLストレプトマイシン、および100UmL−1ペニシリンを補足したDMEM/F−12培地で培養した。細胞を37℃の95%空気および5%CO2の雰囲気中で維持した。
皮膚悪性黒色腫SK−MEL28細胞を5%FBS、アンホテリシンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補足したグルタマックス(Invitrogen,Carlsbad CA)を含むDMEM/F12中で培養および維持した。細胞を37℃にて5%CO2によって増殖させた。追加の株化細胞および成長条件の詳細事項を下の表で概説する。
SKMEL28細胞のQ10処置:
SK−MEL28細胞を100μM Q10または対照ビヒクルによって処置した。Q10の製剤は以下の通りである。15mLキャップ付きチューブに、Q10 4.32mg(Cytotechより供給)を移し、次にイソプロパノール500μlの添加により溶解させた。得られた溶液を65℃の水浴で加温して、高速でボルテックスした。Q10/イソプロパノール溶液の体積を平衡にした細胞培養培地の添加により、10mLにした。ストック溶液を次にボルテックスして、Q10の溶解性を最大にした。ストック溶液を希釈して(培地8mLによりストック2mL)100μ MQ10の最終濃度を取得した。対照ビヒクルでは、培地9.5mLをイソプロパノール500μLに添加した。対照ストック(ストック2mL)を培地8mLでさらに希釈した。細胞を処置開始の6、16、24、48または72時間後に収集した。
SK−MEL28細胞を100μM Q10または対照ビヒクルによって処置した。Q10の製剤は以下の通りである。15mLキャップ付きチューブに、Q10 4.32mg(Cytotechより供給)を移し、次にイソプロパノール500μlの添加により溶解させた。得られた溶液を65℃の水浴で加温して、高速でボルテックスした。Q10/イソプロパノール溶液の体積を平衡にした細胞培養培地の添加により、10mLにした。ストック溶液を次にボルテックスして、Q10の溶解性を最大にした。ストック溶液を希釈して(培地8mLによりストック2mL)100μ MQ10の最終濃度を取得した。対照ビヒクルでは、培地9.5mLをイソプロパノール500μLに添加した。対照ストック(ストック2mL)を培地8mLでさらに希釈した。細胞を処置開始の6、16、24、48または72時間後に収集した。
SCC細胞のQ10処置:
SCC細胞を100μM Q10(上記のように調製)によって6時間または24時間のどちらかで処置した。対照細胞は未処置細胞であった。処置後、各種の時間にて収集およびペレット化して、ペレットを急速凍結させ、RNAを下記のようにXTALにて単離するまで−80℃にて貯蔵した。
SCC細胞を100μM Q10(上記のように調製)によって6時間または24時間のどちらかで処置した。対照細胞は未処置細胞であった。処置後、各種の時間にて収集およびペレット化して、ペレットを急速凍結させ、RNAを下記のようにXTALにて単離するまで−80℃にて貯蔵した。
RNA単離:
RNeasy Miniキット(Qiagen,Inc.,Valencia CA)キットをメーカーの説明書に従って使用して、細胞を各種の処置時間にRNA単離のために溶解させた。RNAを260nmにおける光学密度を測定することによって定量した。
RNeasy Miniキット(Qiagen,Inc.,Valencia CA)キットをメーカーの説明書に従って使用して、細胞を各種の処置時間にRNA単離のために溶解させた。RNAを260nmにおける光学密度を測定することによって定量した。
第1鎖合成:
第1鎖cDNAを、RT2第1鎖合成キット(SABiosciences.,Frederick MD)をメーカーの推奨に従って使用して、全RNA 1μgから合成した
第1鎖cDNAを、RT2第1鎖合成キット(SABiosciences.,Frederick MD)をメーカーの推奨に従って使用して、全RNA 1μgから合成した
リアルタイムPCR:
第1鎖合成からの生成物を水で希釈して、SYBRグリーン・マスター・ミックス(SABiosciences.,Frederick MD)と混合し、PCRアレイ上に添加した。リアルタイムPCRをBiorad CFX96でPCRアレイ(アポトーシスアレイ、糖尿病アレイ、酸化ストレスアレイおよび抗酸化防御アレイならびに熱ショックタンパク質アレイ)(SABiosciences,Frederick MD)に対して実行した。
第1鎖合成からの生成物を水で希釈して、SYBRグリーン・マスター・ミックス(SABiosciences.,Frederick MD)と混合し、PCRアレイ上に添加した。リアルタイムPCRをBiorad CFX96でPCRアレイ(アポトーシスアレイ、糖尿病アレイ、酸化ストレスアレイおよび抗酸化防御アレイならびに熱ショックタンパク質アレイ)(SABiosciences,Frederick MD)に対して実行した。
アポトーシスのためのネキシンアッセイによる、コエンザイムQ10に対する株化細胞感受性の決定:
早期および後期アポトーシスでの細胞のパーセンテージをコエンザイムQ10処置の24時間後に定量した。早期および後期アポトーシスを、コエンザイムQ10に対する各種の癌株化細胞の感受性の相違を理解するためのマーカーとして使用した。試験した各種の株化細胞は、PaCa2、HepG2、PC−3、SKBr3、MCF−7およびSK−MEL28であった。細胞を96ウェルプレート内で一晩接着させた。これらの細胞を対照ビヒクル、50μM Q10または100μMコエンザイムQ10のいずれかによって処置した。24時間後、アポトーシス細胞の存在がPCA96フローサイトメータ(Guava Technologies,Hayward、CA)で推定された。加えていくつかの細胞を、アポトーシスの正の対照としての4μMスタウロスポリンで2時間処置した。細胞を最初にPBSで洗浄して、Accumax(Innovative Cell Technologies,San Diego、CA)50μLによって室温にて剥離させた。1%プルロニックF−68(Sigma−Aldrich,St.Louis、MO)を含有する培養培地の添加によって、解離を停止させた。ネキシン試薬100μL(Guava Technologies,Hayward、CA)を各ウェルに添加した。暗所での20分間のインキュベーションの後、アッセイを低結合プレートにて遂行して、細胞の基質への再結合を最小限に抑えた。ネキシン試薬は2種類の染料を含有している。アネキシン−V−PEは、早期アポトーシス細胞の特徴である、ホスファチジル(phosphotidyl)セリンを細胞の外部にて検出する。第2の染料7−AADは、生(健常)および早期アポトーシス細胞から排除されるが、後期アポトーシス細胞のみに浸透する。4つの細胞集団;生、早期アポトーシス細胞、後期アポトーシスおよび破片のパーセンテージは、Cytosoft 2.5.7ソフトウェア(Guava Technologies,Hayward、CA)を使用して決定した。
早期および後期アポトーシスでの細胞のパーセンテージをコエンザイムQ10処置の24時間後に定量した。早期および後期アポトーシスを、コエンザイムQ10に対する各種の癌株化細胞の感受性の相違を理解するためのマーカーとして使用した。試験した各種の株化細胞は、PaCa2、HepG2、PC−3、SKBr3、MCF−7およびSK−MEL28であった。細胞を96ウェルプレート内で一晩接着させた。これらの細胞を対照ビヒクル、50μM Q10または100μMコエンザイムQ10のいずれかによって処置した。24時間後、アポトーシス細胞の存在がPCA96フローサイトメータ(Guava Technologies,Hayward、CA)で推定された。加えていくつかの細胞を、アポトーシスの正の対照としての4μMスタウロスポリンで2時間処置した。細胞を最初にPBSで洗浄して、Accumax(Innovative Cell Technologies,San Diego、CA)50μLによって室温にて剥離させた。1%プルロニックF−68(Sigma−Aldrich,St.Louis、MO)を含有する培養培地の添加によって、解離を停止させた。ネキシン試薬100μL(Guava Technologies,Hayward、CA)を各ウェルに添加した。暗所での20分間のインキュベーションの後、アッセイを低結合プレートにて遂行して、細胞の基質への再結合を最小限に抑えた。ネキシン試薬は2種類の染料を含有している。アネキシン−V−PEは、早期アポトーシス細胞の特徴である、ホスファチジル(phosphotidyl)セリンを細胞の外部にて検出する。第2の染料7−AADは、生(健常)および早期アポトーシス細胞から排除されるが、後期アポトーシス細胞のみに浸透する。4つの細胞集団;生、早期アポトーシス細胞、後期アポトーシスおよび破片のパーセンテージは、Cytosoft 2.5.7ソフトウェア(Guava Technologies,Hayward、CA)を使用して決定した。
免疫ブロッティング
試料当りおよそ50μgのタンパク質を、免疫ブロッティングによってアッセイした。すべての処置は対照を用いて3通り実行した。タンパク質を12%TRIS−HClゲル上で分離し、電気泳動を介してニトロセルロース膜に移し、1次抗体によるインキュベーションの前に5%牛乳およびTBST溶液を使用して遮断した。1次抗体を5%BSAおよびTBST溶液中4℃にて一晩インキュベートした。2次抗体を4℃にて1時間インキュベートした。すべての抗体をCell Signaling Technologyから購入した。抗体は、1:5000の比のβアクチンを除いて、1:1000の比で使用した。ブロットを展開させて、結果はNIH Javaベースの濃度計分析ソフトウェアImage Jを使用して定量した。すべてのブロットはプローブも行い、そのそれぞれのβアクチン発現に正規化した。
試料当りおよそ50μgのタンパク質を、免疫ブロッティングによってアッセイした。すべての処置は対照を用いて3通り実行した。タンパク質を12%TRIS−HClゲル上で分離し、電気泳動を介してニトロセルロース膜に移し、1次抗体によるインキュベーションの前に5%牛乳およびTBST溶液を使用して遮断した。1次抗体を5%BSAおよびTBST溶液中4℃にて一晩インキュベートした。2次抗体を4℃にて1時間インキュベートした。すべての抗体をCell Signaling Technologyから購入した。抗体は、1:5000の比のβアクチンを除いて、1:1000の比で使用した。ブロットを展開させて、結果はNIH Javaベースの濃度計分析ソフトウェアImage Jを使用して定量した。すべてのブロットはプローブも行い、そのそれぞれのβアクチン発現に正規化した。
2次元電気泳動
等電点電気泳動(IEF)の前に、試料を40mM Tris、7M尿素、2Mチオ尿素、および1%C7両性イオン洗剤中に溶解させて、トリブチルホスフィンによって還元し、10mMアクリルアミドによって室温にて90分間アルキル化した。試料を10kDaカットオフAmicon Ultraデバイスに通した後、7M尿素、2Mチオ尿素、および2%CHAPSから成る少なくとも3倍量の再懸濁緩衝液によって、試料の伝導率を低下させる。タンパク質100マイクログラムを、11cm pH3〜10、pH4〜7またはpH6〜11の固定化pH勾配ストリップ(GE,Amersham、USA)にて100,000ボルト時までIEFに供した。IEFの後、固定化pH勾配ストリップを6M尿素、2%SDS、50mM Tris酢酸緩衝液、pH7.0、および0.01%ブロムフェノールブルー中で平衡にして、8〜16%Tris−HClプレキャストゲル1mm(Bio−Rad、USA)でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルは2通り実行した。これらにどちらも固定、SYPRO Ruby、80mL/ゲル(Invitrogen、USA)での染色およびFuji FLA−5100レーザスキャナでの撮像、またはPVDF膜上への移動を行った。
等電点電気泳動(IEF)の前に、試料を40mM Tris、7M尿素、2Mチオ尿素、および1%C7両性イオン洗剤中に溶解させて、トリブチルホスフィンによって還元し、10mMアクリルアミドによって室温にて90分間アルキル化した。試料を10kDaカットオフAmicon Ultraデバイスに通した後、7M尿素、2Mチオ尿素、および2%CHAPSから成る少なくとも3倍量の再懸濁緩衝液によって、試料の伝導率を低下させる。タンパク質100マイクログラムを、11cm pH3〜10、pH4〜7またはpH6〜11の固定化pH勾配ストリップ(GE,Amersham、USA)にて100,000ボルト時までIEFに供した。IEFの後、固定化pH勾配ストリップを6M尿素、2%SDS、50mM Tris酢酸緩衝液、pH7.0、および0.01%ブロムフェノールブルー中で平衡にして、8〜16%Tris−HClプレキャストゲル1mm(Bio−Rad、USA)でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルは2通り実行した。これらにどちらも固定、SYPRO Ruby、80mL/ゲル(Invitrogen、USA)での染色およびFuji FLA−5100レーザスキャナでの撮像、またはPVDF膜上への移動を行った。
対照試料についての追加の情報を取得して、dPC(Protein Forest Inc.)選択的pI分画、それに続くdPCプラグのトリプシン消化を質量分析同定および半定量(semi−quantization)(NanomateまたはLC/LTQ/MS)と共に利用する方法を使用して、タンパク質同定の有用性を試験した。対照試料を用いて遂行したdPC分析は、タンパク質の大型サブセットの同定でその有用性を証明した。試験の間に産生された材料は、将来、必要が生じた場合に資源として利用され得るように保存した。
2次元ゲル画像分析:
すべてのゲル画像の分析は、Progenesis Discovery and Pro(Nonlinear Dynamics Inc.,Newcastle upon Tyne、UK)を使用して遂行した。スポット検出、マッチング、バックグラウンド除去、正規化、およびフィルタリングの後、SYPRO Rubyゲル画像のデータをエクスポートした。Progenesis Discoveryでスチューデントのt検定を使用して群間の対比較を遂行し、発現が著しく改変されたスポットを同定した(p>0.05)。
すべてのゲル画像の分析は、Progenesis Discovery and Pro(Nonlinear Dynamics Inc.,Newcastle upon Tyne、UK)を使用して遂行した。スポット検出、マッチング、バックグラウンド除去、正規化、およびフィルタリングの後、SYPRO Rubyゲル画像のデータをエクスポートした。Progenesis Discoveryでスチューデントのt検定を使用して群間の対比較を遂行し、発現が著しく改変されたスポットを同定した(p>0.05)。
抗体アレイ:
抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ、Sigma)を利用して700超のタンパク質抗体をスクリーニングし、Q10処置細胞(SK−MEL−28、SCC)におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。細胞抽出物におけるタンパク質の発現は、スライド上にスポットされた対応する抗体にタンパク質が結合されたときに検出される。結合の前に、タンパク質を蛍光描出および定量的分析に使用される蛍光染料で直接標識する。アレイを異なるCyDye(Cy3またはCy5)によってそれぞれ標識された2つの試料のタンパク質発現プロフィールを比較するために使用して(試験試料対参照試料)、2つの試料を等しいタンパク質濃度でアレイ上に同時に適用する。次に各試料の蛍光シグナル強度を試料の染料標識に対応する波長にて個別に記録して、比較する。
抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ、Sigma)を利用して700超のタンパク質抗体をスクリーニングし、Q10処置細胞(SK−MEL−28、SCC)におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。細胞抽出物におけるタンパク質の発現は、スライド上にスポットされた対応する抗体にタンパク質が結合されたときに検出される。結合の前に、タンパク質を蛍光描出および定量的分析に使用される蛍光染料で直接標識する。アレイを異なるCyDye(Cy3またはCy5)によってそれぞれ標識された2つの試料のタンパク質発現プロフィールを比較するために使用して(試験試料対参照試料)、2つの試料を等しいタンパク質濃度でアレイ上に同時に適用する。次に各試料の蛍光シグナル強度を試料の染料標識に対応する波長にて個別に記録して、比較する。
高用量のコエンザイムQ10は、培養されたSKMEL−28細胞のアポトーシス経路、糖尿病経路および酸化ストレス経路に関与する遺伝子の発現を調節する。
実験詳細事項:5%FBS、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンホテリシンを補足した、グルタマックス(Invitrogenカタログ番号10565−042)を含有するDMEM−F12中で培養されたSKMEL−28細胞(ATCCカタログ番号HTB−72)は、非転移性、皮膚黒色腫細胞であり、ビヒクルまたは100uM コエンザイムQ10によって各種の長さの時間にわたって処置した。コエンザイムQ10処置の結果として生じる遺伝子発現のいずれの変化も、リアルタイムPCRアレイ(アポトーシスカタログ番号PAHS−12、糖尿病カタログ番号PAHS−023および酸化ストレスカタログ番号PAHS−065)(SABiosciences,Frederick、MD)を使用して定量した。
500uMコエンザイムQ10のストック濃縮物を、イソプロパノール500ul中に4.32mgを溶解することによって調製して、これを培地の添加により10mlまでさらに希釈した。ボルテックスおよび65℃までの加熱を交互に行って、コエンザイムQ10を溶解させた。ストック溶液2mlを培地により10mlに希釈して、100uM Q10含有培地を得て、これを細胞の処置に使用した。コエンザイムQ10を添加しないことを除いた類似のプロトコルによって、ビヒクルを並行して調製した。
SKMEL−28細胞を6ウェルプレートにて1×105細胞/ウェルの密度で播種した。24時間後、細胞が結合して50%コンフルエントであるときに、ビヒクルまたは100uM Q10のどちらかを添加した。細胞をQ10処置の6、16、24、48または72時間後に収集したが、ビヒクル処置細胞は24時間後に収集した。スピンカラムおよびオンカラムDNアーゼ処置を用い、RNeasy Miniキット(Qiagen,Inc.,Valencia CA カタログ番号74104)キットをメーカーの説明書に従って使用して、細胞を各種の処置時間にRNA単離のために溶解させた。260nmにおける吸光度を測定することによってRNAを定量した。
リアルタイムPCRを、全RNA0.4〜1ugをテンプレートとして使用する第1鎖cDNA合成によって、ゲノムDNA消失ステップを用いるRT2第1鎖合成キット(SABiosciences.,Frederick、MD、カタログ番号C−03)をメーカーの推奨に従って用いて行った。第1鎖合成からの生成物を水で希釈して、SYBRグリーン・マスター・ミックス(SABiosciences.,Frederick MD、カタログ番号PA−010−12)と混合し、共通経路内で連結された84種類の異なる遺伝子、正規化に使用される5種類のハウスキーピング遺伝子、逆転写およびPCR対照を含有するPCRアレイ上に添加した。リアルタイムPCRをBiorad Cfx96に対して実行した。酵素を活性化させるホットスタートによって増幅を開始し、それぞれ(95℃−15秒変性ステップおよび60℃−1分アニーリングおよび伸長ステップ)の40サイクルがに続き、溶融曲線プログラムが続いた。すべての処置群のPCRのPCRサーモサイクラからの出力であるCt値をExcelスプレッドシートで整理して、www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.phpで利用可能な比較分析ソフトウェアにロードした。
ミトコンドリア濃縮試料の精製:
実験詳細事項:100μM Q10によって24または48時間処置されたSKMEL−28細胞、NCI−ES0808細胞およびNIH−3T3細胞を、t=0にて収集された細胞と共に、T160フラスコから洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離して、ペレット化し、急速凍結させ、ミトコンドリアが単離されるまで−80℃にて貯蔵した。細胞ペレットを解凍して、再懸濁させ、ダウンスホモジナイザで破砕した。ホモジネートを遠心分離して、培養細胞用ミトコンドリア単離キット(Mitochondria Isolation kit for Cultured cells)(MitoSciences,Eugene OR、カタログ番号MS852)によって推奨された試薬およびプロトコルを使用してミトコンドリアを単離した。ミトコンドリア画分を一定分量に分割して、−80℃にて貯蔵した。
実験詳細事項:100μM Q10によって24または48時間処置されたSKMEL−28細胞、NCI−ES0808細胞およびNIH−3T3細胞を、t=0にて収集された細胞と共に、T160フラスコから洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離して、ペレット化し、急速凍結させ、ミトコンドリアが単離されるまで−80℃にて貯蔵した。細胞ペレットを解凍して、再懸濁させ、ダウンスホモジナイザで破砕した。ホモジネートを遠心分離して、培養細胞用ミトコンドリア単離キット(Mitochondria Isolation kit for Cultured cells)(MitoSciences,Eugene OR、カタログ番号MS852)によって推奨された試薬およびプロトコルを使用してミトコンドリアを単離した。ミトコンドリア画分を一定分量に分割して、−80℃にて貯蔵した。
コエンザイムQ10およびユビキノール−10の定量方法:
コエンザイムQ10(Q10)および還元型ユビキノール−10(Q10H2)の同時決定の方法は、最近公開された方法(Ruiz−Jimenez,2007,J.Chromatogr.A,1175,242−248)に基づいて、LC−MS/MSを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化(ESI)と共に使用することによって行った。Q10およびQ10H2の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。100μM Q10によって処置されたSK−MEL−28からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量を、タンパク質沈殿(1−プロパノール300μl中で超音波処理された充填細胞100μl)、液液抽出(上清に水100μlを添加して、X3をn−ヘキサン200μlで抽出する)、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および95:5 メタノール/ヘキサン(v/v)50μlでの再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。分析は、Prism RP 1×100mm、5μm粒径カラムを備えたWaters Quattro II 3連4重極質量分析計(Keystone Scientific)でのLC−MS/MSによった。流速50μl/分での20%イソプロピルアルコール80%メタノール中の4mMギ酸アンモニウムによる定組成溶離。各試料10μlを注入した。MRM分析は、m/z882.7>197.00(Q10H2)およびm/z880.80>197.00(Q10)トランジションをコーン電圧40および衝突エネルギー30と共に使用して遂行した。
コエンザイムQ10(Q10)および還元型ユビキノール−10(Q10H2)の同時決定の方法は、最近公開された方法(Ruiz−Jimenez,2007,J.Chromatogr.A,1175,242−248)に基づいて、LC−MS/MSを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化(ESI)と共に使用することによって行った。Q10およびQ10H2の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。100μM Q10によって処置されたSK−MEL−28からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量を、タンパク質沈殿(1−プロパノール300μl中で超音波処理された充填細胞100μl)、液液抽出(上清に水100μlを添加して、X3をn−ヘキサン200μlで抽出する)、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および95:5 メタノール/ヘキサン(v/v)50μlでの再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。分析は、Prism RP 1×100mm、5μm粒径カラムを備えたWaters Quattro II 3連4重極質量分析計(Keystone Scientific)でのLC−MS/MSによった。流速50μl/分での20%イソプロピルアルコール80%メタノール中の4mMギ酸アンモニウムによる定組成溶離。各試料10μlを注入した。MRM分析は、m/z882.7>197.00(Q10H2)およびm/z880.80>197.00(Q10)トランジションをコーン電圧40および衝突エネルギー30と共に使用して遂行した。
実施例3:CoQ10に対する株化細胞の感受性
いくつかの株化細胞のQ10に対する感受性を、適用の24時間後に2種類の染料、7AADおよびアネキシン−V−PEの組合せを含有する試薬(ネキシン試薬)を使用することによって試験した。7AAD染料は、透過性細胞膜によって細胞;主に後期アポトーシスにある細胞の中に進入するであろう。アネキシン−V−PEは、早期アポトーシス細胞の原形質膜の外面に露出されたホスファチジル(Phosphotidyl)セリンに結合する染料である。それゆえネキシン試薬を使用して、フローサイトメータでアポトーシス細胞の異なる集団を区別することができる。
いくつかの株化細胞のQ10に対する感受性を、適用の24時間後に2種類の染料、7AADおよびアネキシン−V−PEの組合せを含有する試薬(ネキシン試薬)を使用することによって試験した。7AAD染料は、透過性細胞膜によって細胞;主に後期アポトーシスにある細胞の中に進入するであろう。アネキシン−V−PEは、早期アポトーシス細胞の原形質膜の外面に露出されたホスファチジル(Phosphotidyl)セリンに結合する染料である。それゆえネキシン試薬を使用して、フローサイトメータでアポトーシス細胞の異なる集団を区別することができる。
PaCa2細胞は、50μM Q10および100μM Q10によりQ10適用の24時間後に、早期および後期アポトーシス細胞の両方で上昇を示した(ゲート細胞の5〜10%の間)。PC−3細胞も、50μMおよび100μM Q10によって早期および後期アポトーシス集団で上昇を示したが、上昇はPaCa2細胞と比較して小さかった。MCF−7およびSK−MEL28細胞は50μMおよび100μM Q10によって、早期アポトーシス集団のみで上昇を示した。HepG2細胞も50μM Q10処置に感受性であり、後期アポトーシスステージおよび早期アポトーシスステージに集まったゲート細胞の約20%の上昇があった。SKBr3は、50μMまたは100μM Q10処置のどちらによっても早期および後期アポトーシスで大きな上昇を少しも示さなかった、試験した中で唯一の株化細胞であった。結果を図1〜6に示す。
Q10処置がHepG2肝臓癌細胞でアポトーシス応答を引き起こすことをさらに確認するために、第2のアポトーシスアッセイを、単鎖DNAを測定するApoStrand(商標)ELISAベース法を使用して評価した。ApoStrand(商標)ELISAは、アポトーシス細胞中のDNAのホルムアミド変性に対する感受性および単鎖DNA(ssDNA)に対するモノクローナル抗体による変性DNAの検出に基づく。肝臓癌株化細胞HepG2の50および100μM Q10による処置は、それぞれ17%および32%の用量応答で検出可能なアポトーシスを生じた(図7)。これらの結果は、他の組織からの他の癌株化細胞(例えばSCC、SKMEL−28、MCF−7、およびPC−3)においてアポトーシスを誘導するQ10の観察結果と一致する。
実施例4:Q10によって処置した細胞のプロテオミクス分析
Q10によって処置した試料の細胞ペレットをプロテオミクス法によって分析した。細胞ペレットを溶解させて、2次元ゲルおよびウェスタンブロット分析で使用するために処置した。3つの細胞タイプ(SKMEL−28、SCC、およびnFib)をQ10によって処置して、2次元ゲル電気泳動によるプロテオミクスキャラクタリゼーションに供した。
Q10によって処置した試料の細胞ペレットをプロテオミクス法によって分析した。細胞ペレットを溶解させて、2次元ゲルおよびウェスタンブロット分析で使用するために処置した。3つの細胞タイプ(SKMEL−28、SCC、およびnFib)をQ10によって処置して、2次元ゲル電気泳動によるプロテオミクスキャラクタリゼーションに供した。
Q10によって処置したSKMEL−28細胞のプロテオミクス分析
ウェスタンブロットおよび2次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第1の実験セットは、皮膚癌株化細胞SKMEL−28であった。本実験セットは、0、50または100μM Q10によって3、6、12、および24時間処置されたSK−MEL−28細胞を包含していた。
ウェスタンブロットおよび2次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第1の実験セットは、皮膚癌株化細胞SKMEL−28であった。本実験セットは、0、50または100μM Q10によって3、6、12、および24時間処置されたSK−MEL−28細胞を包含していた。
Q10処置SK−MEL−28試料のセットを、2次元ゲル電気泳動に供して(図8)、対照試料に対するタンパク質レベルの変化を同定するために分析した。すべての24時間ゲルにわたる943スポットの比較分析を遂行して、対照試料を処置試料すべてに対して比較した。分析は、上昇、低下、または翻訳後修飾による、時間経過にわたるスポット変化の同定を含んでいた。
分析は、32の統計的に有意な示差的スポット変化を見出した。これより、20個の非冗長性スポットを切除して、トリプシン消化によるタンパク質同定および質量分析キャラクタリゼーションに供した。キャラクタリゼーションされたペプチドをMascot and MSRATソフトウェア分析を用いてタンパク質データベースで検索して、タンパク質を同定した(表2)。
本実験の主要な発見は、トランスアルドラーゼ1の減少であり、このことはQ10が癌細胞内の代謝状態を改変することにより作用するという前提を裏付けた。トランスアルドラーゼ1は、ペントースリン酸経路(ヘキソースモノリン酸分路としても公知)中の酵素である。トランスアルドラーゼ(EC:2.2.1.2)は、3炭素ケトールユニットのセドヘプツロース7−リン酸からグリセルアルデヒド3−リン酸への可逆的移動を触媒して、エリトロース4−リン酸およびフルクトース6−リン酸を形成する。本酵素は、トランスケトラーゼと共に、解糖経路とペントース−リン酸経路との間に連結を提供する。このことはヌクレオチドおよびNADPH合成に関連しており、生合成反応のための還元等価物の産生および還元環境の維持を容易にする。
最近の刊行物(Basta,P.,et.al.August 2008,Cancer Detect Prevention,32,200−208)は、トランスアルドラーゼにおける遺伝的多型の証拠を提供し、頭部および頸部の扁平上皮細胞癌腫に結び付けられた。最近の別の刊行物(Qian,Y.,et.al.May 2008,Biochem J,415,123−134)は、ミトコンドリアホメオスタシスのモジュレーターとしてのトランスアルドラーゼの欠乏、Ca2+流入およびアポトーシスを同定した。
これらの初期の結果から、SK−MEL−28細胞中でQ10によって調節されているような、2次元ゲル電気泳動によって同定された残りのタンパク質を公知の関係について分析した(図9)。これらのタンパク質の機能性評価は、14−3−3−媒介シグナル伝達に関与する群(PDCP6IP、YWHAZ、およびVIM)が、多種多様のプロセス[細胞周期;ペントースリン酸経路(TALDO1);セラミドシグナル伝達(CTSD);アミノアシル−tRNA生合成(GARS)、およびミトコンドリアタンパク質インポート(TOM22)]に結び付けられた個別のタンパク質と共にあることを明らかにした。
Q10によって処置したSCC細胞のプロテオミクス分析
別の皮膚癌株化細胞の扁平上皮細胞癌腫(SCC)も調製して、前のSK−MEL−28分析の追跡実験として、2次元ゲル電気泳動によって分析した。SCC細胞を100μM Q10によって、収集前に6時間または24時間処置した。未処置細胞の対照も収集した。細胞ペレットを溶解させ、試料を2次元電気泳動に供した(2通り)。比較試験での600個を超えるタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を6時間および24時間処置に対して比較した。
別の皮膚癌株化細胞の扁平上皮細胞癌腫(SCC)も調製して、前のSK−MEL−28分析の追跡実験として、2次元ゲル電気泳動によって分析した。SCC細胞を100μM Q10によって、収集前に6時間または24時間処置した。未処置細胞の対照も収集した。細胞ペレットを溶解させ、試料を2次元電気泳動に供した(2通り)。比較試験での600個を超えるタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を6時間および24時間処置に対して比較した。
上位25の統計的に有意な示差的スポット変化を2次元電気泳動ゲルの比較分析から評価した。これより、20個のスポットを切除して、トリプシン消化による同定および質量分析キャラクタリゼーションに供した(結果を下の表3にまとめる)。
トランスアルドラーゼ1:Q10で処置したSKMEL−28細胞で先に観察されたように、酵素トランスアルドラーゼ1はレベルの低下によって調節された。これは、Q10とトランスアルドラーゼの改変(およびそれゆえ細胞の代謝状態)との連関についての以前の観察結果を独立して確証するものである。
トランスアルドラーゼは、ペントースリン酸経路の非酸化的段階における酵素である(図10)。ペントースリン酸経路は、還元的生合成のためのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(還元型NADH)の発生のための細胞の代謝状態において、ならびにATP、DNA、およびRNAの必須構成要素であるリボースの形成において重要である。トランスアルドラーゼはまた、ペントースリン酸経路を解糖に連結する。解糖は、酸化的リン酸化のミトコンドリアプロセスが利用されないため、癌細胞が細胞生存に必要なエネルギーを取得する代謝経路である。Q10は、酸化的リン酸化およびミトコンドリアATP産生に必要とされる必須のコエンザイム因子である。
BSCv:スポット23は、BSCvという名称の、染色体20からの新規ヒトタンパク質であった。BSCvタンパク質は、脂肪細胞血漿膜結合型タンパク質(遺伝子名:APMAPまたはC20orf3)としても公知であり、タンパク質のストリクトシジン・シンターゼ・ファミリーに配列類似性を有するシングルパスII型膜タンパク質であることが予測されている。Q10処置は、本タンパク質のレベルの低下を引き起こした。本タンパク質は、十分に特徴付けもされておらず、ストリクトシジンシンターゼとのその相同性も確認されてもいない。興味深いことに、本タンパク質は脂肪細胞分化の役割に関連してきた(Albrektsen et al.,2001)。ヒト大網脂肪組織の最近のプロテオミクス研究はBSCvを、病的肥満女性による多嚢胞性(polcystic)卵巣症候群(PCOS)の差次的発現を有する9種類のタンパク質のうちの1つとして同定した(Corton,2008 Hum.Reprod.23:651−661に概説されている)。Q10に応答する細胞表面タンパク質としてのBSCvに対する抗体は、バイオマーカーとして有用であろう。現在の結果および入手可能な文献に基づいて、BSCvは癌および糖尿病で潜在的な役割を有し得る。
NM23A:非転移性細胞1タンパク質(NM23A、NME1としても公知)は、転移サプレッサーとであると考えられる。本遺伝子(NME1)は、高転移性細胞におけるその低下したmRNA転写レベルのために同定された。該タンパク質は、ヌクレオシド2リン酸キナーゼ(NDK)としての活性を有し、「A」アイソフォーム(本遺伝子によりコードされた)および「B」アイソフォーム(NME2によりコードされた)で構成されたヘキサマーとして存在する。本遺伝子における突然変異は、侵襲性神経芽細胞腫において同定されている。NDK活性は、例えばクエン酸(クレブス)回路で産生されたGTPがATPに変換されるときなどに、異なるヌクレオシド3リン酸の濃度の間で平衡を維持する。NDK複合体は、STRAPとの相互作用を通じてp53に関連している。STRAPがHNF4Aに連結されていることは注目に値する。それゆえNM23Aは、細胞制御および疾患処置に重要な経路に関与する潜在的タンパク質である。
Rho GDP解離阻害剤(GDI)アルファ:GDIは、Rhoタンパク質からのGDPの解離、および続いてのRhoタンパク質へのGTPの結合を阻害することによって、RhoタンパクのGDP/GTP交換反応を調節する。該タンパク質は、癌細胞において上方調節される。
実施例5:ミトコンドリア濃縮分析
複数の一連の証拠は、ミトコンドリアタンパク質の役割および癌生物学およびQ10応答のより綿密な評価が正当化されることを示唆した。第1に、正常細胞におけるエネルギー産生のためのミトコンドリア酸化的リン酸化プロセスには、Q10の不可欠の役割がある。しかし、癌細胞に出現するのは、Q10を必要としない解糖の代わりの経路によるエネルギー産生への代謝シフトである。第2に、細胞のアポトーシス応答は、ミトコンドリアタンパク質の出現を必要とする。Q10は、癌細胞における刺激アポトーシスとして樹立されてきた(Bcl−2ファミリータンパク質、シトクロムc)。最後に、ミトコンドリアインポート受容体タンパク質TOM22のタンパク質レベルの調節によって例示されるように(本明細書に記載する実験を参照)、新たなミトコンドリアタンパク質がQ10処置によって調節されていることが同定された。
複数の一連の証拠は、ミトコンドリアタンパク質の役割および癌生物学およびQ10応答のより綿密な評価が正当化されることを示唆した。第1に、正常細胞におけるエネルギー産生のためのミトコンドリア酸化的リン酸化プロセスには、Q10の不可欠の役割がある。しかし、癌細胞に出現するのは、Q10を必要としない解糖の代わりの経路によるエネルギー産生への代謝シフトである。第2に、細胞のアポトーシス応答は、ミトコンドリアタンパク質の出現を必要とする。Q10は、癌細胞における刺激アポトーシスとして樹立されてきた(Bcl−2ファミリータンパク質、シトクロムc)。最後に、ミトコンドリアインポート受容体タンパク質TOM22のタンパク質レベルの調節によって例示されるように(本明細書に記載する実験を参照)、新たなミトコンドリアタンパク質がQ10処置によって調節されていることが同定された。
ミトコンドリア濃縮試料の産生
皮膚癌SKMEL−28細胞を100μM Q10または偽ビヒクルによって6、19、または48時間にわたって処置した。細胞をT−160フラスコ(各時点ごとに4個)から洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離によって採取し、ペレットを急速凍結させて−80℃にて貯蔵した。細胞ペレットを再懸濁させ、2mLダウンスホモジナイザを使用して破砕した。試薬および方法は、培養細胞用ミトコンドリア単離キット(MitoSciences,カタログ番号MS852)から取得した。結果として生じたミトコンドリア試料一定分量75μL(1試料に付き、4〜5個の一定分量)に分け、−80℃にて貯蔵した。
皮膚癌SKMEL−28細胞を100μM Q10または偽ビヒクルによって6、19、または48時間にわたって処置した。細胞をT−160フラスコ(各時点ごとに4個)から洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離によって採取し、ペレットを急速凍結させて−80℃にて貯蔵した。細胞ペレットを再懸濁させ、2mLダウンスホモジナイザを使用して破砕した。試薬および方法は、培養細胞用ミトコンドリア単離キット(MitoSciences,カタログ番号MS852)から取得した。結果として生じたミトコンドリア試料一定分量75μL(1試料に付き、4〜5個の一定分量)に分け、−80℃にて貯蔵した。
Q10によって処置されたSK−MEL−28細胞から単離されたミトコンドリア濃縮試料のプロテオミクス分析
2次元ゲル電気泳動は、100μM Q10によって6、19、および48時間処置されたSK−MEL−28ミトコンドリア濃縮試料に2個の一定分量から溶解されたタンパク質に対して(対応する偽ビヒクル対照と共に)遂行した。試料を2次元電気泳動に供した(2通り)。525個のタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を残りの時点の試料に対して比較した(図11)。
2次元ゲル電気泳動は、100μM Q10によって6、19、および48時間処置されたSK−MEL−28ミトコンドリア濃縮試料に2個の一定分量から溶解されたタンパク質に対して(対応する偽ビヒクル対照と共に)遂行した。試料を2次元電気泳動に供した(2通り)。525個のタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を残りの時点の試料に対して比較した(図11)。
9つの統計的に有意な示差的スポット変化を2次元電気泳動ゲルの比較分析から選択した。9個のスポットを切除して、トリプシン消化による同定および質量分析キャラクタリゼーションに供した。
アシル−CoAチオエステラーゼ7:アシル−CoAチオエステラーゼ7(ACOT7)は、脂肪アシル−CoAの遊離脂肪酸およびCoAの加水分解を触媒する酵素ファミリーのメンバーである。本酵素はそれゆえ、脂質代謝および細胞シグナル伝達の調節に役割を果たす。ACOT7は、8〜16個の炭素原子(C8−C16)の脂肪酸鎖を有する長鎖アシルCoA基質に対する選択性を有する。ACOT7における正確な細胞機能は、十分に理解されていない。本遺伝子の転写は、ステロール調節要素結合タンパク質2によって活性化され、それゆえコレステロール代謝における機能を示唆する。
本実施例の結果は、ACOT7がQ10の代謝に直接または間接的に潜在的に関与することを指摘する。それゆえターゲティングACOT7は、Q10の細胞間レベルの調節を促進して、それゆえ細胞Q10効果に影響を及ぼすことができる。
ピルビン酸キナーゼ:ピルビン酸キナーゼは、解糖の最後のステップに関与する酵素である。ピルビン酸キナーゼは、ホスホエノールピルビン酸(PEP)からADPへのリン酸基の移動を触媒して、ピルビン酸1分子およびATP1分子を産する。
タンパク質は、これがミトコンドリア濃縮SK−MEL−28試料から同定されたので、おそらく2型アイソフォームのPKM2のタンパク質である。本アイソフォームは、腫瘍細胞形成および調節に関与することが周知である。
ミトコンドリアにおけるQ10レベルの定量
コエンザイムQ10(Q10)および還元型ユビキノール−10(Q10H2)の同時決定の方法は、最近公開された方法(Ruiz−Jimenez,2007,J.Chroma A,1175,242−248)に基づいて、LC−MS/MSを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化(ESI)と共に使用することによって実行した。Q10およびQ10H2の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。100μM Q10によって処置されたSK−MEL−28からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量を、タンパク質沈殿、液液抽出、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および95:5 メタノール/ヘキサン(v/v)での再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。
コエンザイムQ10(Q10)および還元型ユビキノール−10(Q10H2)の同時決定の方法は、最近公開された方法(Ruiz−Jimenez,2007,J.Chroma A,1175,242−248)に基づいて、LC−MS/MSを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化(ESI)と共に使用することによって実行した。Q10およびQ10H2の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。100μM Q10によって処置されたSK−MEL−28からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量を、タンパク質沈殿、液液抽出、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および95:5 メタノール/ヘキサン(v/v)での再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。
本分析において、Q10、Q10H2、およびQ9を定量した(表5)。関連する分子Q9のレベルは低く、検出レベル付近であった。未処置試料のレベルは、この同じレベルを有する6時間Q10処置試料と比較的一致していた。全材料の試料分散を制御するために、コレステロールのレベルも測定して、差が試料サイズ誤差によるものでないことを確認した。Q10レベルが同じミトコンドリア調製物の他の一定分量のタンパク質抽出によって取得された全タンパク質値に対して補正されたときに、相対比は比較可能であった。それゆえQ10レベルの著しい上昇が19時間後に得られ(約3倍)、48時間時点までになお大きな上昇(約6倍)が得られた(図12)。
本試験からの驚くべき結果は、Q10が酸化型として細胞に供給されるという発見であった。48時間試料では、還元型Q10H2も測定され、著しく低い量で存在することが見出された(CoQ10 46.63ng/試料と比較して、CoQ10H2 0.28ng/試料)。Q10処置48時間試料においてQ10H2のレベルの一般的な上昇(3倍)があったが、レベルはアッセイの推定検出限界付近であった。興味深いことに、酸化型(Q10)は、生物系において酸化エンハンサとして作用することができる。文献によれば、ヒト血漿をQ10およびQ10H2を評価したとき、分子の大部分(90%)は、抗酸化剤として作用することができる、Q10H2の還元型で見出された(Ruiz−Jimenez,2007,J.Chroma A,1175,242−248)。
それゆえこれらの結果は、培地へのQ10の外部からの添加時にQ10のレベルがミトコンドリア中で上昇することを確認および定量する。驚くべきおよび予想外の発見は、Q10がいずれの著しい量でも供給された酸化型(酸化促進)で維持されて、Q10H2の還元(抗酸化)型に変化されないことであった。
実施例6:リアルタイムPCRアレイ
実験1:アポトーシスアレイ
実施例3で上述したように、癌細胞のQ10への曝露は、アポトーシスプロセスによりこれらの細胞の部分に死を誘導する。Q10応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法を用いて、アポトーシスにターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子/タンパク質についてのmRNAのレベルの変化を同定した。
実験1:アポトーシスアレイ
実施例3で上述したように、癌細胞のQ10への曝露は、アポトーシスプロセスによりこれらの細胞の部分に死を誘導する。Q10応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法を用いて、アポトーシスにターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子/タンパク質についてのmRNAのレベルの変化を同定した。
それゆえPCRアレイをスクリーニングツールとして使用して、細胞内のQ10の生物学的作用の様式への洞察を潜在的に供給する一連の分子ターゲットを評価した。80の経路特異的ターゲットを含有する事前に選択されたサブセットのmRNAレベルを影響評価するためのリアルタイムPCR定量を使用して、mRNAの変化を評価した。
mRNA結果の解釈のために、そのmRNA転写が2倍のレベルで改変された遺伝子を同定および評価した。mRNAのみを産生する遺伝子転写のレベルは、発現されたタンパク質のレベルの潜在的な変化の大まかな推定値を提供する。当業者は、各mRNAが非効率的なことに、mRNAの分解またはその翻訳で異なる速度を有し得て、それゆえ異なる量のタンパク質を生じることを認識するであろう。
50um Q10によって24時間処置したSkBr−3細胞
RT−PCRのアッセイ方法を利用して、合計84のアポトーシス経路関連タンパク質に対するmRNAレベルの変化の尺度を提供した。Q10(24時間)を用いた、SkBr3に対するリアルタイムPCRアポトーシス分析による実験は、以下のmRNA:Bcl2、Bcl2L1、Bcl2L11、Birc6、Bax、Xiap、Hprt1、Apaf1、Abl1、Brafが影響されていることを同定した。これらの結果は再度、Q10処置に対する癌細胞のアポトーシス応答を裏付ける証拠を提供した。
RT−PCRのアッセイ方法を利用して、合計84のアポトーシス経路関連タンパク質に対するmRNAレベルの変化の尺度を提供した。Q10(24時間)を用いた、SkBr3に対するリアルタイムPCRアポトーシス分析による実験は、以下のmRNA:Bcl2、Bcl2L1、Bcl2L11、Birc6、Bax、Xiap、Hprt1、Apaf1、Abl1、Brafが影響されていることを同定した。これらの結果は再度、Q10処置に対する癌細胞のアポトーシス応答を裏付ける証拠を提供した。
SK−MEL−28細胞による3つの独立した実験からの一致した結果を下の表6Bにまとめる。100μM Q10処置により多くの遺伝子は、SCC細胞において同様に調節される。SCC細胞で調節されると思われるアポトーシスアレイの遺伝子を表7に記載する。我々は、多くの遺伝子がSK−MEL−28細胞およびSCC細胞の両方で6時間後に調節されていることを見出している。24時間までに調節は低下する。SK−MEL−28細胞およびSCC細胞の両方で調節されると思われる遺伝子を表8に記載する。
興味深いことに、改変されたmRNAレベルは、一連のアポトーシスタンパク質において著しい上方調節を示し、Bcl−xlは最も高いものの1つであった。これはSK−MEL−28細胞に対するタンパク質アレイ実験でも観察された。
Bcl−xlは、ミトコンドリア中の膜貫通分子である(Bcl−xlは「基底細胞リンパ腫−特大」を表す)。Bcl−xlは、FAS−Lのシグナル伝達経路に関与し、タンパク質のBcl−2ファミリーのメンバーである複数の抗アポトーシスタンパク質の1つである。Bcl−xlは、癌細胞の生存に関わってきた。しかし、ヒトBcl−xmRNAの選択的スプライシングが少なくとも2種類の別個のBcl−xmRNA種、Bcl−xLおよびBcl−xSを生じ得ることが公知である。優勢なタンパク質生成物(233アミノ酸)は、成長因子除去時に細胞死を阻害する、より大型のBcl−x mRNAであるBcl−xLである(Boise et al.,1993.Cell 74,597−608)。他方では、Bcl−xSは、Bcl−2が細胞死を阻害する能力を阻害して、細胞をアポトーシス細胞死に対して感受性にする。利用した使用アッセイは、どのBcl−xのアイソフォームが上方調節されているかを識別しない。これらの研究でCoQによって上方調節されているBcl−xアイソフォームは、当分野で公知の所定の方法によって、例えばRT−PCR方法を使用することによって決定され、2種類のmRNAスプライシングアイソフォームの比(Bcl−xL対Bcl−sL)が評価され得る。
アポトーシス関連タンパク質の調査から、複数のアポトーシス促進因子および抗アポトーシス因子がBCL−2ファミリー中にあること、またはこれらの因子と相互作用するタンパク質が発現レベルを調節したこと(BCL2L11、BNIP2、BAG1、HRK、BAK1、BCL2、BCL2L1)が観察された。これらのタンパク質は、ミトコンドリア外膜透過を支配する。
アポトーシス応答の早期マーカーは、カスパーゼ3/7タンパク質によるアポトーシスの以前の観察結果と一致する、カスパーゼ−9の上方調節(16時間)によって観察される。ストレスシグナル伝達経路の誘導は、ミトコンドリアからのシトクロムcの放出およびapaf−1(アポトソーム)の活性化を引き起こし、次にカスパーゼ−9のプロ酵素を切断して活性型とする。いったん開始されると、カスパーゼ−9はプロカスパーゼ−3およびプロカスパーゼ−7の切断を進めて、追加のアポトーシス経路を始動させる。
調節されているタンパク質の腫瘍壊死因子受容体ファミリーへの一貫した連結もある。
腫瘍タンパク質p73の強力な下方調節も注目される。乳癌および卵巣癌を含む、ヒトに見出される多くの腫瘍の分析は通例、対応する範囲において正常な組織と比較したときに、p73の高い発現を示す。最近の発見は、哺乳動物細胞において細胞周期制御およびDNAの合成に関与する体内の転写因子(すなわち:E2F−1)の調節解除された過剰発現がp73の発現を誘導することを示唆している。該示唆は、p73は腫瘍性タンパク質であり得るが、関連するp53タンパク質とは異なる機構を包含し得ることである。アポトーシス経路のマッピングを示す概略図を図13に示す。
SKMEL−28細胞
アポトーシス関連タンパク質の調査から、複数のアポトーシス促進因子および抗アポトーシス因子がBCL−2ファミリー中にあること、またはこれらの因子と相互作用するタンパク質が発現レベルを調節したこと(BCL2L11、BNIP2、BAG1、HRK、BAK1、BCL2、BCL2L1)が観察された。これらのタンパク質は、ミトコンドリア外膜透過を支配する。
アポトーシス関連タンパク質の調査から、複数のアポトーシス促進因子および抗アポトーシス因子がBCL−2ファミリー中にあること、またはこれらの因子と相互作用するタンパク質が発現レベルを調節したこと(BCL2L11、BNIP2、BAG1、HRK、BAK1、BCL2、BCL2L1)が観察された。これらのタンパク質は、ミトコンドリア外膜透過を支配する。
アポトーシス応答の早期マーカーは、カスパーゼ3/7タンパク質によるアポトーシスの以前の観察結果と一致する、カスパーゼ−9の上方調節(16時間)によって観察される。ストレスシグナル伝達経路の誘導は、ミトコンドリアからのシトクロムcの放出およびapaf−1(アポトソーム)の活性化を引き起こし、次にカスパーゼ−9のプロ酵素を切断して活性型とする。いったん開始されると、カスパーゼ−9はプロカスパーゼ−3およびプロカスパーゼ−7の切断を進めて、追加のアポトーシス経路を始動させる。
調節されているタンパク質の腫瘍壊死因子受容体ファミリーへの一貫した連結がある。
腫瘍タンパク質p73の強力な下方調節も注目される。乳癌および卵巣癌を含む、ヒトに見出される多くの腫瘍の分析は通例、対応する範囲において正常な組織と比較したときに、p73の高い発現を示す。最近の発見は、哺乳動物細胞において細胞周期制御およびDNAの合成に関与する体内の転写因子(すなわち:E2F−1)の調節解除された過剰発現がp73の発現を誘導することを示唆している。該示唆は、p73は腫瘍性タンパク質であり得るが、関連するp53タンパク質とは異なる機構を包含し得ることである。
実験2:酸化ストレスおよび抗酸化防御アレイを使用するリアルタイムPCRアレイ
Q10応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法を用いて、酸化ストレスおよび抗酸化防御にターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子/タンパク質についてのmRNAのレベルの変化を同定した。
Q10応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法を用いて、酸化ストレスおよび抗酸化防御にターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子/タンパク質についてのmRNAのレベルの変化を同定した。
下の表10は、100μM Q10処置によりSK−MEL28細胞で調節される遺伝子を挙げる。結果は、2つの独立した実験で調節されるこのような遺伝子のみについて与える。6時間では著しい量の遺伝子調節が見られるが、48時間ではRNAレベルの最も著しい変化が見られる。
好中球サイトゾル因子2(NCF2、65kDa、慢性肉芽腫性疾患、常染色体2)は、初期トップ誘導mRNAの1つであった(6時間にて観察された)。続いて16時間の時点以降、好中球サイトゾル因子1(NCF1)(慢性肉芽腫性疾患、常染色体1)は、初期誘導相後に非常に高レベルで誘導された。
好中球サイトゾル因子2は、好中球に普通見出されるNADPHオキシダーゼとして公知の多タンパク質複合体のサイトゾルサブユニットである。本オキシダーゼは、好中球食胞の内腔に送達されるスーパーオキシドのバーストを産生する。
NADPHオキシダーゼ(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ)は、膜結合酵素複合体である。NADPHオキシダーゼは、原形質膜ならびに食胞の膜に見出すことができる。これは6つのサブユニットで構成されている。これらのサブユニットは:
1つのRhoグアノシントリホスファターゼ(GTPアーゼ)、通常Rac1またはRac2(Racは、Rho関連C3ボツリヌス毒素基質を表す)
5つの「phox」ユニット(Phoxは、食細胞オキシダーゼを表す。)
・P91−PHOX(ヘムを含有する)
・p22phox
・p40phox
・p47phox(NCF1)
・p67phox(NCF2)
・P91−PHOX(ヘムを含有する)
・p22phox
・p40phox
・p47phox(NCF1)
・p67phox(NCF2)
別のNADPHオキシダーゼレベルが変化しないことに注目される。酵素は、スーパーオキシドを発生して、Ca(2+)依存性方式でH+チャネルとして機能する新規NADPHオキシダーゼである、NOX5である。
加えて、ホスファチジルイノシトール3,4,5−3リン酸依存性RAC交換因子1(PREX1)も上方調節された。本タンパク質は、小型GTP結合タンパク質(RAC)のRHOファミリーのグアニンヌクレオチド交換因子として作用する。結合されているGDPを遊離GTPと交換することによって、RAC1を結合および活性化することが示されてきた。主に細胞質で見出されるコードされたタンパク質は、ホスファチジルイノシトール−3,4,5−3リン酸およびヘテロトリマーGタンパク質のベータガンマサブユニットによって活性化される。
第2の主な早期誘導タンパク質は、一酸化窒素シンターゼ2A(誘導性、肝細胞)(NOS2A)であった。一酸化窒素は、神経伝達ならびに抗菌および抗腫瘍活性を含む複数のプロセスにおいて、生物学的媒介物として作用する反応性遊離ラジカルである。本遺伝子は、肝臓で発現され、リポ多糖類およびあるサイトカインの併用によって誘導可能である一酸化窒素シンターゼをコードする。
スーパーオキシドディスムターゼ2、ミトコンドリア(SOD2)は、鉄/マンガンスーパーオキシドディスムターゼファミリーのメンバーである。これはホモテトラマーを形成し、サブユニットに付きマンガンイオン1個を結合するミトコンドリアタンパク質をコードする。本タンパク質は、酸化的リン酸化のスーパーオキシド副生成物に結合して、これらを過酸化水素および2原子酸素に変換する。本遺伝子の突然変異は、関連する特発性心筋症(IDC)、早期老化、散発性運動ニューロン疾患、および癌に関連してきた。
下方調節されたタンパク質の例は、内因性FOXM1発現がS期およびG2/M期にピークに達する細胞周期進行で主要な役割を果たすことが公知である、フォークヘッドボックスM1(FOXM1)である。最近の研究は、G2/M特異的遺伝子、例えばPlk1、サイクリンB2、Nek2およびCENPFの大型アレイの発現を調節して、染色体分離およびゲノム安定性の維持において重要な役割を果たすことを示している。FOXM1遺伝子は今や、ヒト癌原遺伝子として公知である。FOXM1の異常な上方調節は、基底細胞癌腫(BCC)の腫瘍形成に関与している。FOXM1上方調節は続いて、肝臓、乳房、肺、前立腺、子宮頸部、結腸、膵臓、および脳を含む、固形ヒト癌の大部分で見出された。BCCおよびQ10によるさらなる研究によってFOXM1レベルを評価すべきである。
SKMEL−28細胞
SKMEL−28細胞を使用して、さらなる実験を行った。リアルタイムPCR法(RT−PCR)を使用して、100μM Q10によって処置されたSKMEL−28細胞中に存在するmRNAのレベルを未処置細胞のレベルと各種の時点にて比較した。PCRアレイ(SABiosciences)は、経路または疾患に焦点を合せた遺伝子ならびに適切なRNA品質管理のための、96ウェルプレートでの最適化リアルタイムPCRプライマアッセイのセットである。PCRアレイは、マイクロアレイのリアルタイムPCR感受性および多遺伝子プロファイリング能力を用いて遺伝子発現分析を遂行する。
SKMEL−28細胞を使用して、さらなる実験を行った。リアルタイムPCR法(RT−PCR)を使用して、100μM Q10によって処置されたSKMEL−28細胞中に存在するmRNAのレベルを未処置細胞のレベルと各種の時点にて比較した。PCRアレイ(SABiosciences)は、経路または疾患に焦点を合せた遺伝子ならびに適切なRNA品質管理のための、96ウェルプレートでの最適化リアルタイムPCRプライマアッセイのセットである。PCRアレイは、マイクロアレイのリアルタイムPCR感受性および多遺伝子プロファイリング能力を用いて遺伝子発現分析を遂行する。
好中球サイトゾル因子2(NCF2、65kDa、慢性肉芽腫性疾患、常染色体2)は、初期トップ誘導mRNAの1つであった(6時間にて観察された)。続いて16時間の時点以降、好中球サイトゾル因子1(NCF1)(慢性肉芽腫性疾患、常染色体1)は、初期誘導相後に非常に高レベルで誘導された。
好中球サイトゾル因子2は、好中球に普通見出されるNADPHオキシダーゼとして公知の多タンパク質複合体のサイトゾルサブユニットである。本オキシダーゼは、好中球食胞の内腔に送達されるスーパーオキシドのバーストを産生する。NADPHオキシダーゼ(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ)は、膜結合酵素複合体である。NADPHオキシダーゼは、原形質膜ならびに食胞の膜に見出すことができる。これは6つのサブユニットで構成されている。これらのサブユニットは:
・1つのRhoグアノシントリホスファターゼ(GTPアーゼ)、通常Rac1またはRac2(Racは、Rho関連C3ボツリヌス毒素基質を表す)
・5つの「phox」(食細胞オキシダーゼ)ユニット
・P91−PHOX(ヘムを含有する)
・p22phox
・p40phox
・p47phox(NCF1)
・p67phox(NCF2)である。
・1つのRhoグアノシントリホスファターゼ(GTPアーゼ)、通常Rac1またはRac2(Racは、Rho関連C3ボツリヌス毒素基質を表す)
・5つの「phox」(食細胞オキシダーゼ)ユニット
・P91−PHOX(ヘムを含有する)
・p22phox
・p40phox
・p47phox(NCF1)
・p67phox(NCF2)である。
別のNADPHオキシダーゼレベルが変化しないことに注目される。酵素は、スーパーオキシドを発生して、Ca(2+)依存性方式でH+チャネルとして機能する新規NADPHオキシダーゼである、NOX5である。
加えて、ホスファチジルイノシトール3,4,5−3リン酸依存性RAC交換因子1(PREX1)も上方調節された。本タンパク質は、小型GTP結合タンパク質(RAC)のRHOファミリーのグアニンヌクレオチド交換因子として作用する。結合されているGDPを遊離GTPと交換することによって、RAC1を結合および活性化することが示されてきた。主に細胞質で見出されるコードされたタンパク質は、ホスファチジルイノシトール−3,4,5−3リン酸およびヘテロトリマーGタンパク質のベータガンマサブユニットによって活性化される。
第2の主な早期誘導タンパク質は、一酸化窒素シンターゼ2A(誘導性、肝細胞)(NOS2A)であった。一酸化窒素は、神経伝達ならびに抗菌および抗腫瘍活性を含む複数のプロセスにおいて、生物学的媒介物として作用する反応性遊離ラジカルである。本遺伝子は、肝臓で発現され、リポ多糖類およびあるサイトカインの併用によって誘導可能である一酸化窒素シンターゼをコードする。
下方調節されたタンパク質の例は、内因性FOXM1発現がS期およびG2/M期にピークに達する細胞周期進行で主要な役割を果たすことが公知である、FOXM1である。最近の研究は、G2/M特異的遺伝子、例えばPlk1、サイクリンB2、Nek2およびCENPFの大型アレイの発現を調節して、染色体分離およびゲノム安定性の維持において重要な役割を果たすことを示している。FOXM1遺伝子は今や、ヒト癌原遺伝子として公知である。FOXM1の異常な上方調節は、基底細胞癌腫(BCC)の腫瘍形成に関与している。FOXM1上方調節は続いて、肝臓、乳房、肺、前立腺、頸部、子宮、結腸、膵臓、および脳を含む、固形ヒト癌の大部分で見出された。
実験3:熱ショックアレイを使用するリアルタイムPCRアレイ
SCC細胞に熱ショックアレイを実行して、調節された遺伝子のデータを下の表13にまとめる。
SCC細胞に熱ショックアレイを実行して、調節された遺伝子のデータを下の表13にまとめる。
実験4:糖尿病アレイを使用するリアルタイムPCRアレイ
本実施例に記載した実験を遂行して、Q10が、複数の遺伝子に影響を有し、細胞の代謝状態を変更するであろうという仮説全体を試験した。100μM Q10によって処置したSKMEL−28細胞からのmRNAを糖尿病および関連経路に関与するターゲットタンパク質のパネルに対して評価した。本実験からの結果は、解糖経路およびインスリンプロセシングに関与する複数のタンパク質のmRNA発現レベルが改変されることを証明している(表14にまとめる)。
本実施例に記載した実験を遂行して、Q10が、複数の遺伝子に影響を有し、細胞の代謝状態を変更するであろうという仮説全体を試験した。100μM Q10によって処置したSKMEL−28細胞からのmRNAを糖尿病および関連経路に関与するターゲットタンパク質のパネルに対して評価した。本実験からの結果は、解糖経路およびインスリンプロセシングに関与する複数のタンパク質のmRNA発現レベルが改変されることを証明している(表14にまとめる)。
本初期実験の結果は、多種多様のインスリン関連タンパク質のmRNAレベルが両方向に調節されたことを示す。結果は、糖尿病の処置および/または評価に影響を有するであろうことを指摘する。
次にさらなる実験を行って、Q10によって処置したSK−MEL−28細胞から取得した上の結果を確認した。SK−MEL−28細胞中の遺伝子の多くが、Q10処置の早くも6時間後に調節されている。しかし初期調節は、16時間および24時間までにより明らかでなくなる。48時間付近で、我々は糖尿病アレイの多くの遺伝子が再度強力に調節されることを見出している。2つ以上の独立した実験からの一致した結果を下の表15にまとめる。SCC細胞もQ10処置の6時間後および24時間後の両方に、いくつかの遺伝子における調節を呈するように思われる。表16にはSCC細胞のこれらの結果をまとめ、表17にはSK−MEL−28細胞およびSCC細胞の両方で調節される遺伝子をまとめる。
多種多様のインスリン関連タンパク質のmRNAレベルが両方向に調節された。Q10は細胞代謝に対して影響を有し、それゆえ糖尿病などの代謝調節疾患に影響する。著しく調節された2種類のタンパク質について、下でさらに述べる。
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ14(MAPK14):マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ14(MAPK14)は、MAPキナーゼファミリーのメンバーである。MAPキナーゼは、複数の生化学シグナルの統合点として作用し、増殖、分化、転写調節および発生などの多岐にわたる細胞プロセスに関与している。本実験の結果は、MAPK14が著しく下方調節されたことを示す。
肝細胞核因子4、アルファ(HNF4A):HNF4(肝細胞核因子4)は、肝臓発生に不可欠である肝臓、腸、腎臓、および膵臓ベータ細胞で大部分が発現される核受容体タンパク質である。ヒトにおいては、2種類の別々の遺伝子HNF4AおよびHNF4GによってそれぞれコードされたNHF4の2種類のアイソフォーム、アルファおよびガンマがある(例えばChartier FL,Bossu JP,Laudet V,Fruchart JC,Laine B(1994).“Cloning and sequencing of cDNAs encoding the human hepatocyte nuclear factor 4 indicate the presence of two isoforms in human liver”.Gene 147(2):269−72を参照)。
HNF4は当初、オーファン受容体として分類された。しかしHNF4は後に、多種多様の脂肪酸に連続的に結合されるために構成的に活性であることが見出された(例えばSladek F(2002).“Desperately seeking...something”.Mol Cell 10(2):219−221およびJump DB,Botolin D,Wang Y,Xu J,Christian B,Demeure O(2005).“Fatty acid regulation of hepatic gene transcription”.J Nutr 135(11)を参照)。HNF4のリガンド結合ドメインは、他の核受容体と同様に、基準(canonical)アルファらせんサンドイッチフォールディングを取り(例えばWisely GB,Miller AB,Davis RG,Thornquest AD Jr,Johnson R,Spitzer T,Sefler A,Shearer B,Moore JT,Miller AB,WillsonTM,Williams SP(2002).“Hepatocyte nuclear factor 4 is a transcription factor that constitutively binds fatty acids”.Structure 10(9):1225−34およびDhe−Paganon S,Duda K,Iwamoto M,Chi YI,Shoelson SE(2002).“Crystal structure of the HNF4 alpha ligand binding domain in complex with endogenous fatty acid ligand”.J Biol Chem 277(41):37973−6を参照)、コアクチベータータンパク質と相互作用する(例えばDuda K,Chi YI,Shoelson SE(2004).“Structural basis for HNF−4alpha activation by ligand and coactivator binding”.J Biol Chem 279(22):23311−6に概説されている)。
HNF4−α遺伝子の突然変異は、若年発症成人型糖尿病(MODY)と結び付けられてきた(例えばFajans SS,Bell GI,Polonsky KS(2001)“Molecular mechanisms and clinical pathophysiology of maturity−onset diabetes of the young”.N Engl J Med 345(13):971−80を参照)。
肝細胞核因子4(HNF4)は、肝細胞および膵臓細胞において多数の遺伝子を調節することが公知の組織特異的転写因子である。HNF4は腎臓のいくつかの部位で高度に発現されることが公知であるが、本器官におけるその役割についておよび腎臓細胞におけるHNF4調節遺伝子についてはほとんど知られていない。HNF4の存在量および活性は腎臓細胞癌腫(RCC)では頻繁に低下し、腎臓細胞におけるHNF4の多少の腫瘍抑制機能を示す。興味深いことに、HNF4によって調節された遺伝子の多くは、RCCマイクロアレイ試験では調節解除されることが示されている。これらの遺伝子(ACY1、WT1、SELENBP1、COBL、EFHD1、AGXT2L1、ALDH5A1、THEM2、ABCB1、FLJ14146、CSPG2、TRIM9およびHEY1)は、RCCにおけるHNF4の低下時に活性が変化する遺伝子の良好な候補である。
HNF4アルファのリガンド結合ドメインの構造において(1M7W.pdb;Dhe−Paganon(2002)JBC,277,37973);小型脂質が観察され、大腸菌産生から同時精製された。結晶はタンパク質の2種類の立体配座を含有し、ここで伸長らせん10および短らせん12が交互の立体配座を有している。脂質結合領域の検査時に、興味深いことに、2つの出口領域があることが見出された。一方の領域は小型脂質の頭基を保持して、複数のポケット領域が本出口ポートと共局在していることが注目される。仮説は、Q10が本転写因子に特異的に結合するということである。本脂質結合トンネル中にモデル化されるとき、Q10環は表面ポケット中に適合するであろう(図28)。公知の機能喪失型突然変異(E276Q)は、本表面ポケットを裏打ちするように残基を配列する潜在能を有し、それゆえ推定上のQ10結合に悪影響を有するであろう。
加えて、本Q10結合モデルによって、疎水性尾部は内部空洞から延出して、次に伸長らせん10と相互作用するであろう。それゆえ、本相互作用は、らせん10/12基の立体配座を潜在的に改変することができる。このことは次に、転写因子活性の活性化/不活性化平衡を改変し得る。
実施例7:抗体マイクロアレイ分析
Q10の存在によるタンパク質濃度の評価を、抗体マイクロアレイ法の利用によって評価した。マイクロアレイは、700超のタンパク質の抗体を含有し、広範囲のタンパク質タイプおよび潜在的な経路マーカーをサンプリングした。
Q10の存在によるタンパク質濃度の評価を、抗体マイクロアレイ法の利用によって評価した。マイクロアレイは、700超のタンパク質の抗体を含有し、広範囲のタンパク質タイプおよび潜在的な経路マーカーをサンプリングした。
Q10によって処置された細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価するための初期実験は、抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ、Sigma)および6時間または24時間処置したSK−MEL−28細胞を用いて行った。細胞を収集および抽出して、可溶性タンパク質上清を取得した。各試料(1mg/mLの)からのタンパク質の2つの分量(合計約1mg)を蛍光染料(それぞれCy3およびCy5)によってそれぞれ標識した。過剰な染料をタンパク質から除去して、材料をマイクロアレイインキュベーションに利用した。2つの時点の試料を比較するために、等量のタンパク質を異なる標識タイプである各試料と混合した(例えばCy3で標識された3時間抽出物を、Cy5で標識された24時間抽出物と混合した)。(メーカーの推奨プロトコルに従った)マイクロアレイチップによるインキュベーション後に、チップを洗浄および乾燥した。マイクロアレイを蛍光レーザスキャナによってスキャンして、Cy3およびCy5染料の相対蛍光強度を測定した。
先に観察されたアポトーシスタンパク質を確認するために、およびより多数のアポトーシス促進および抗アポトーシスタンパク質への評価を拡張するために、潜在的に包含される広範なタンパク質のファミリーをスクリーニングすることができる2種類のアッセイ方法を選定した。
第1に、抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ,Sigma)を利用して700超のタンパク質抗体をスクリーニングし、50μM Q10によって24時間処置されたSK−MEL−28細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。
以下は、Q10(24時間)を用いたSKMEL−28に対する抗体アレイ実験からのレベルの改変を有する同定されたタンパク質の一部である:Bcl−xl、Bmf、BTK、BLK、cJun(pSer63)、コネキシン32、PUMA bbc3、BID、Par4、cCbl。本初期試験からの主な結論は、予想されたアポトーシス促進タンパク質が改変されたことであった。
SK−MEL−28の抗体マイクロアレイ
抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ,Sigma)を利用して700超のタンパク質抗体をスクリーニングし、50μM Q10によって24時間処置されたSK−MEL−28細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。
抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ,Sigma)を利用して700超のタンパク質抗体をスクリーニングし、50μM Q10によって24時間処置されたSK−MEL−28細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。
以下は、Q10(24時間)を用いたSKMEL−28に対する抗体アレイ実験からのレベルの改変を有する同定されたタンパク質の一部である:Bcl−xl、Bmf、BTK、BLK、cJun(pSer63)、コネキシン32、PUMA bbc3、BID、Par4、cCbl。これらのデータは、外部から添加されたQ10のレベルの上昇により、アポトーシス促進タンパク質のレベルがインキュベーション時に改変されることを確認している。
Bcl−xl(「基底細胞リンパ腫−特大」)は、ミトコンドリア中の膜貫通分子である。Bcl−xlは、FAS−Lのシグナル伝達経路に関与し、タンパク質のBcl−2ファミリーのメンバーである複数の抗アポトーシスタンパク質の1つである。Bcl−xlは、癌細胞の生存に関わってきた。しかし、ヒトBcl−xmRNAの選択的スプライシングが少なくとも2種類の別個のBcl−xmRNA種、Bcl−xLおよびBcl−xSを生じ得ることが公知である。優勢なタンパク質生成物(233アミノ酸)は、成長因子除去時に細胞死を阻害する、より大型のBcl−x mRNAであるBcl−xLである(Boise et al.,1993.Cell 74,597−608)。他方では、Bcl−xSは、Bcl−2が細胞死を阻害する能力を阻害して、細胞をアポトーシス細胞死に対して感受性にする。
実施例8:ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロットおよび2次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第1の実験を皮膚癌株化細胞SKMEL−28に対して行った。本実験セットは、50または100μM Q10によって3、6、12、および24時間処置されたSK−MEL−28細胞を包含していた。
ウェスタンブロットおよび2次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第1の実験を皮膚癌株化細胞SKMEL−28に対して行った。本実験セットは、50または100μM Q10によって3、6、12、および24時間処置されたSK−MEL−28細胞を包含していた。
多種多様の細胞タイプを、Bcl−xLの抗体(図14)、ビメンチンの抗体(図15)、ミトコンドリア酸化的リン酸化機能の一連の抗体(図16〜21)およびミトコンドリア膜完全性に関連する一連の抗体(図22〜27)に対してウェスタンブロット分析によって評価した。これらの実験による結果は、複数の検査されたタンパク質がQ10による細胞処置の結果として上方調節または下方調節されることを証明した。
実施例9:100um Q10による膵臓癌細胞s(PaCa2)の処置によってmRNAレベルが調節されているとして同定された糖尿病関連遺伝子
100uM Q10によって処置された試料に、処置後の各種の時間に糖尿病アレイを実行した。実験は、本質的に上記のように行った。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表23に要約される。結果は、Q10処置によって以下の遺伝子が調節されることを示した:ABCC8、ACLY、ADRB3、CCL5、CEACAM1、CEBRA、FOXG1、FOXP3、G6PD、GLP1R、GPD1、HNF4A、ICAM1、IGFBP5、INPPL1、IRS2、MAPK14、ME1、NFKB1、PARP1、PIK3C2B、PIK3CD、PPARGC1B、PRKAG2、PTPN1、PYGL、SLC2A4、SNAP25、HNF1B、TNRFSF1A、TRIB3、VAPA、VEGFA、IL4RおよびIL6。
100uM Q10によって処置された試料に、処置後の各種の時間に糖尿病アレイを実行した。実験は、本質的に上記のように行った。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表23に要約される。結果は、Q10処置によって以下の遺伝子が調節されることを示した:ABCC8、ACLY、ADRB3、CCL5、CEACAM1、CEBRA、FOXG1、FOXP3、G6PD、GLP1R、GPD1、HNF4A、ICAM1、IGFBP5、INPPL1、IRS2、MAPK14、ME1、NFKB1、PARP1、PIK3C2B、PIK3CD、PPARGC1B、PRKAG2、PTPN1、PYGL、SLC2A4、SNAP25、HNF1B、TNRFSF1A、TRIB3、VAPA、VEGFA、IL4RおよびIL6。
実施例10:100μM Q10を用いる膵臓癌細胞(PaCa2)の処理によってmRNAレベルが調節されるとして同定される血管新生関連遺伝子
処理後の様々な時点において100μM Q10で処理された試料について血管新生アレイが実行された。実験は、本質的に上記のように行った。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表24に要約される。結果は、Q10処置によって以下の遺伝子が調節されることを示した:AKT1、ANGPTL4、ANGPEP、CCL2、CDH4、CXCL1、EDG1、EFNA3、EFNB2、EGF、FGF1、ID3、IL1B、IL8、KDR、NRP1、PECAM1、PROK2、SERPINF1、SPHK1、STAB1、TGFB1、VEGFA、およびVEGFB。
処理後の様々な時点において100μM Q10で処理された試料について血管新生アレイが実行された。実験は、本質的に上記のように行った。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表24に要約される。結果は、Q10処置によって以下の遺伝子が調節されることを示した:AKT1、ANGPTL4、ANGPEP、CCL2、CDH4、CXCL1、EDG1、EFNA3、EFNB2、EGF、FGF1、ID3、IL1B、IL8、KDR、NRP1、PECAM1、PROK2、SERPINF1、SPHK1、STAB1、TGFB1、VEGFA、およびVEGFB。
実施例11:100μM Q10を用いる膵臓癌細胞(PaCa2)の処理によってmRNAレベルで調節されるとして同定されるアポトーシス関連遺伝子
処理後の様々な時点において100μM Q10で処理された試料についてアポトーシスアレイが実行された。実験は、本質的に上記のように行った。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表25に要約される。結果は、Q10処置によって以下の遺伝子が調節されることを示した:ABL1、AKT1、Bcl2L1、BclAF1、CASP1、CASP2、CASP6、CIDEA、FADD、LTA、TNF、TNFSF10A、およびTNFSF10。
処理後の様々な時点において100μM Q10で処理された試料についてアポトーシスアレイが実行された。実験は、本質的に上記のように行った。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表25に要約される。結果は、Q10処置によって以下の遺伝子が調節されることを示した:ABL1、AKT1、Bcl2L1、BclAF1、CASP1、CASP2、CASP6、CIDEA、FADD、LTA、TNF、TNFSF10A、およびTNFSF10。
実施例12:肝臓癌(HepG2)細胞上でのPCR糖尿病アレイ
HepG2(肝臓癌)細胞は、24時間ビヒクルで、または様々な時間の間100μM Q10のいずれかで処理された。処理は、PaCa2細胞において利用された手順に従って(上記、実施例9〜11)、ウェルあたり1×105細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたRNAの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、1μgの総RNA(260nmにおける測定によって決定される)を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は8μlである。RNA濃度が低いので、ビヒクル、ならびに16時間および48時間Q10処理された試料を使用するRT−PCRアレイ分析が、0.44μgのRNAを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表26において要約されるように、100μM Q10処理を用いる、HepG2遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。結果は、遺伝子PPARGC1A、PRKAA1、およびSNAP25の各々が処理の16時間後に下方調節されたことを示した(それぞれ、約20倍、6倍、および5倍)。処理後48時間において、PPARGC1AおよびPRKAA1は正常化され、またはわずかに上方調節されたのに対して、SNAP25は約2倍下方調節された。
HepG2(肝臓癌)細胞は、24時間ビヒクルで、または様々な時間の間100μM Q10のいずれかで処理された。処理は、PaCa2細胞において利用された手順に従って(上記、実施例9〜11)、ウェルあたり1×105細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたRNAの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、1μgの総RNA(260nmにおける測定によって決定される)を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は8μlである。RNA濃度が低いので、ビヒクル、ならびに16時間および48時間Q10処理された試料を使用するRT−PCRアレイ分析が、0.44μgのRNAを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表26において要約されるように、100μM Q10処理を用いる、HepG2遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。結果は、遺伝子PPARGC1A、PRKAA1、およびSNAP25の各々が処理の16時間後に下方調節されたことを示した(それぞれ、約20倍、6倍、および5倍)。処理後48時間において、PPARGC1AおよびPRKAA1は正常化され、またはわずかに上方調節されたのに対して、SNAP25は約2倍下方調節された。
実施例13:肝臓癌(HEPG2)細胞上のPCR血管新生アレイ
HepG2(肝臓癌)細胞は、24時間ビヒクルで、または様々な時間の間100μM Q10のいずれかで処理された。処理は、PaCa2細胞において利用された手順に従って(上記、実施例9〜11)、ウェルあたり1×105細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたRNAの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、1μgの総RNA(260nmにおける測定によって決定される)を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は8μlである。RNA濃度が低いので、ビヒクル、ならびに16時間および48時間Q10処理された試料を使用するRT−PCRアレイ分析が、0.44μgのRNAを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表27において要約されるように、100μM Q10処理を用いる、HepG2遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表27に要約される。結果は、遺伝子ANGPTL3、ANGPTL4、CXCL1、CXCL3、CXCL5、ENG、MMP2、およびTIMP3の各々が処理の16時間後に上方調節されたことを示した(それぞれ、対照のそれよりも、約5.5倍、3倍、3倍、3.2倍、3倍、3倍、1倍、および6.5倍、6倍および5倍)。ID3は、Q10処理の16時間後に、対照の約5倍下方調節された。処理の48時間後に、ANGPTL3、CXCL1、CXCL3、ENG、およびTIMP3はまだ上方調節されたのに対して(それぞれ、対照よりも約3.5倍、1.5倍、3.175倍、2倍、および3倍)、ANGPTL4、CXCL5、ID3、およびMMP2は、対照よりも、それぞれ、約1倍、1倍、2倍、および18倍下方調節された。
HepG2(肝臓癌)細胞は、24時間ビヒクルで、または様々な時間の間100μM Q10のいずれかで処理された。処理は、PaCa2細胞において利用された手順に従って(上記、実施例9〜11)、ウェルあたり1×105細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたRNAの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、1μgの総RNA(260nmにおける測定によって決定される)を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は8μlである。RNA濃度が低いので、ビヒクル、ならびに16時間および48時間Q10処理された試料を使用するRT−PCRアレイ分析が、0.44μgのRNAを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表27において要約されるように、100μM Q10処理を用いる、HepG2遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表27に要約される。結果は、遺伝子ANGPTL3、ANGPTL4、CXCL1、CXCL3、CXCL5、ENG、MMP2、およびTIMP3の各々が処理の16時間後に上方調節されたことを示した(それぞれ、対照のそれよりも、約5.5倍、3倍、3倍、3.2倍、3倍、3倍、1倍、および6.5倍、6倍および5倍)。ID3は、Q10処理の16時間後に、対照の約5倍下方調節された。処理の48時間後に、ANGPTL3、CXCL1、CXCL3、ENG、およびTIMP3はまだ上方調節されたのに対して(それぞれ、対照よりも約3.5倍、1.5倍、3.175倍、2倍、および3倍)、ANGPTL4、CXCL5、ID3、およびMMP2は、対照よりも、それぞれ、約1倍、1倍、2倍、および18倍下方調節された。
血管新生のプロセスに関与していることが知られているタンパク質は、RT−PCRアレイの構成要素であった。血管新生は、癌細胞が悪性になる決定的なプロセスである。これらのタンパク質のいくつかは糖尿病にも関わりがある。
ANGPTL3およびANGPTL4:ANGPTL3に関連する文献は、このタンパク質を脂質代謝の調節に関連付けている。特に、この文献(Li,C.Curr Opin Lipidol.2006 Apr;17(2):152−6)は、アンジオポエチンとアンジオポエチン様タンパク質の両方が類似のドメイン構造を共有することを教示している。ANGPTL3および4は、リポタンパク質リパーゼ活性を阻害するこのスーパーファミリーの2つのみのメンバーである。しかし、ANGPTL3および4は、複数のレベルで示差的に調節されており、インビボでの冗長でない機能を示唆している。ANGPTL3および4は、タンパク質分解的に2つの半分にプロセスされ、核受容体によって示差的に調節されている。ANGPTL4のトランスジェニック過剰発現ならびにANGPTL3または4のノックアウトは、これらの2つのタンパク質が脂質タンパク質代謝において本質的な役割を果たしていることを実証している:肝臓由来のANGPTL3は食事を与えられた状態で主にリポタンパク質リパーゼ活性を阻害するのに対して、ANGPTL4は、食事を与えられた状態と絶食状態の両方で重要な役割を果たしている。加えて、ANGPTL4は、リポタンパク質誘導脂肪酸の組織特異的送達を調節する。このように、ANGPTL4は、発現のその部位に依存して、リポタンパク質リパーゼのエンドクリンまたはオートクリン/パラクリン阻害剤である。
リポタンパク質リパーゼは、キロミクロンおよび超低密度リポタンパク質(VLDL)において見い出されるものなどのリポタンパク質中の脂質を、3つの遊離脂肪酸と1つのグリセロール分子に加水分解する酵素である。所定の組織中でのリポタンパク質リパーゼ活性は、トリグリセリド誘導脂肪酸の取り込みのための律速段階である。脂肪酸の分配のバランスの悪さは、大きな代謝的な結果を有する。高脂肪食はLPLの組織特異的過剰発現を引き起こすことが示されており、これは、組織特異的インスリン抵抗性および結果としての2型糖尿病の発症に関わってきた。
本実施例の結果は、Q10が脂質代謝に関わっている調節タンパク質であり、従って、ANGPTL3/ANGPTL4およびそれらの関連する経路のさらなる研究を正当化することを示す。例えば、ANGPTL3/ANGPTL4は、以下の経路において役割を果たすことに関わっている:。Akt、コレステロール、脂肪酸、HDL−コレステロール、HNF1A、ITGA5、ITGA5、ITGAV、ITG83、L−トリヨードチロニン(trilodothynonine)、LIPG、LPL、Mapk、Nrth、NR1H3、PPARD、PTK2、RXRA、トリアシルグリセロール(triacylglerol)、および9−シス−レチノイン酸
実施例14:肝臓癌(HEPG2)細胞上のPCRアポトーシスアレイ
アポトーシスアレイは、上記のように、16時間および48時間、100μM Q10で処理された試料について実行された。しかし、48時間のアレイは、SYBRの代わりに蛍光団としてFAMを選んで実行された。FAMとSYBRの両方は同じ波長で蛍光を発する。
アポトーシスアレイは、上記のように、16時間および48時間、100μM Q10で処理された試料について実行された。しかし、48時間のアレイは、SYBRの代わりに蛍光団としてFAMを選んで実行された。FAMとSYBRの両方は同じ波長で蛍光を発する。
Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表28に要約される。これらの結果は、CASP9がQ10処理の16時間後に対照の約61倍上方調節されたのに対し、BAG1およびTNFRSF1Aは、処理の16時間後に対照よりもそれぞれ約6倍および4倍下方調節されたことを示す。処理後48時間では、CASP9、BAG1、およびTNFRSF1Aは、対照よりもそれぞれ約55倍、1倍、および1倍上方調節された。
実施例15:腫瘍性障害を治療するためのMIMまたはエピシフターの能力の評価
選択されたMIMまたはエピシフター、例えば、CoQ10が、腫瘍性障害、例えば、黒色腫を治療する能力は、マウスモデルにおいて評価される。黒色腫腫瘍は皮下層へのSK−MEL28注射によってマウスの中で誘導される。動物研究は、各々が4匹のマウスを含む対照群と治療群の両方からなる。これらのマウスは2つの腫瘍を接種される。MIMまたはエピシフターの局所製剤は、30日間の期間にわたって毎日処置群中の腫瘍に適用され、その後、腫瘍は切除され、重量が測定される。MIMまたはエピシフターは、処置群の全体の平均重量の差異が対照と比較して顕著であるときに、腫瘍を処置する際に有効であると同定される。
選択されたMIMまたはエピシフター、例えば、CoQ10が、腫瘍性障害、例えば、黒色腫を治療する能力は、マウスモデルにおいて評価される。黒色腫腫瘍は皮下層へのSK−MEL28注射によってマウスの中で誘導される。動物研究は、各々が4匹のマウスを含む対照群と治療群の両方からなる。これらのマウスは2つの腫瘍を接種される。MIMまたはエピシフターの局所製剤は、30日間の期間にわたって毎日処置群中の腫瘍に適用され、その後、腫瘍は切除され、重量が測定される。MIMまたはエピシフターは、処置群の全体の平均重量の差異が対照と比較して顕著であるときに、腫瘍を処置する際に有効であると同定される。
実施例16:腫瘍性障害と関連するMIMの同定
潜在的なMIMとしての候補分子(例えば、環境影響因子)を評価するために、選択された候補MIMが、疾患(癌)細胞系統と正常対照細胞系統の両方を含む細胞系統のパネルに外因的に加えられ、パネル中の各細胞系統の細胞微少環境プロフィールに対して誘導された変化が評価される。例えば、mRNAおよびタンパク質のレベルを含む、細胞形態学、生理学、および/または細胞組成に対する変化が評価され、正常細胞との比較と同様に、疾患細胞について比較される。
潜在的なMIMとしての候補分子(例えば、環境影響因子)を評価するために、選択された候補MIMが、疾患(癌)細胞系統と正常対照細胞系統の両方を含む細胞系統のパネルに外因的に加えられ、パネル中の各細胞系統の細胞微少環境プロフィールに対して誘導された変化が評価される。例えば、mRNAおよびタンパク質のレベルを含む、細胞形態学、生理学、および/または細胞組成に対する変化が評価され、正常細胞との比較と同様に、疾患細胞について比較される。
細胞形態学/生理学の変化は、候補MIMに対する細胞の感受性およびアポトーシス性応答を調べることによって評価される。これらの実験は、実施例3に詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、少なくとも1つの対照細胞系統および少なくとも1つの癌細胞系統からなる細胞系統のパネルが、種々の濃度の候補MIMで処理される。潜在的なMIMに対する細胞系統の感受性は、様々な時間、および適用される濃度の範囲にわたって細胞生存を監視することによって評価される。潜在的MIMに対する細胞系統のアポトーシス性応答は、例えば、フローサイトメトリー方法論と組み合わせたネキシン試薬を使用することによって評価される。ネキシン試薬は、2種の染料、7AADおよびアネキシン−V−PEの組み合わせを含み、初期および後期のアポトーシスにおける細胞集団の定量化を可能にする。例えば、Apostrand(商標)ELISA方法論を使用する、一本鎖DNAを測定するさらなるアポトーシスアッセイが使用されてもよい。疾患および対照の細胞系統の感受性およびアポトーシス性応答が評価および比較される。正常細胞と比較されるような疾患細胞において、示差的な細胞傷害性を表示し、および/またはアポトーシス性応答を示差的に誘導する分子がMIMとして同定される。
候補MIMを用いる下の処置後の細胞の組成の変化が評価される。mRNAレベルでの遺伝子発現の変化がリアルタイムPCRアレイ方法論を使用して分析される。これらの実験は、実施例6および9〜13において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補MIMは、例えば、疾患細胞系統および正常対照細胞系統を含む1種以上の細胞系統に外因的に加えられ、mRNAは処置後の様々な時点で細胞から抽出される。特定の経路に関与する遺伝子のmRNAのレベルは、例えば、アポトーシス、酸化ストレスおよび自己酸化防御、血管新生、熱ショック、または糖尿病に特異的なアレイを含む、標的とされる経路アレイを使用することによって評価される。2倍レベル以上でmRNA転写が変化される遺伝子が同定および評価される。細胞中でmRNAレベルの変化を誘導し、および/または正常細胞と比較して疾患細胞において1種以上のmRNAのレベルの示差的な変化を誘導する分子はMIMとして同定される。
相補実験において、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化は、抗体マイクロアレイ方法論、二次元ゲル電気泳動、続いて質量分析による特徴付けを使用するタンパク質の同定を使用することによって、およびウェスタンブロット分析によって分析される。これらの実験は、それぞれ、実施例7、4、および8において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補MIMは、例えば、疾患細胞系統および正常対照細胞系統を含む1種以上の細胞系統に外因的に加えられ、可溶性タンパク質が、処置後の様々な時点、例えば、6時間または24時間で細胞から抽出される。タンパク質レベルで誘導された候補MIMによる変化が、広い範囲のタンパク質型および潜在的な経路マーカーをサンプリングしている700種を超えるタンパク質に対する抗体を含む抗体マイクロアレイを使用することによって評価される。さらなる相補プロテオーム分析は、質量分析方法論と連動した二次元(2−D)ゲル電気泳動を利用することによって実行できる。候補MIMは、例えば、疾患細胞および正常対照細胞系統を含む1種以上の細胞系統に外因的に加えられ、細胞ペレットは溶解され、二次元ゲル電気泳動に供される。ゲルは、未処置試料である対照と比べて処置試料でのタンパク質レベルの変化を同定するために分析される。ゲルは、レベルの増加、レベルの減少、または翻訳後修飾に起因する、処置の時間経過にわたるスポット変化の同定について分析される。統計学的に有意な変化を示すスポットは、トリプシン消化および質量分析による特徴付けによるタンパク質同定のために、切り出され、提出される。特徴付けされたペプチドは、例えば、MascotおよびMSRATソフトウェア分析を用いて、タンパク質データベースに対して検索され、タンパク質を同定する。前述の二次元ゲル分析および抗体マイクロアレイ実験に加えて、候補MIMによって誘導される特定のタンパク質のレベルに対する潜在的な変化が、ウェスタンブロット分析によって評価されてもよい。すべてのプロテオーム実験において、種々の細胞系統におけるレベルの増加または減少を伴うタンパク質が同定および評価される。細胞中でタンパク質レベルの変化を誘導し、および/または正常細胞と比較して疾患細胞において1種以上のタンパク質のレベルの示差的な変化を誘導する分子がMIMとして同定される。
前述の実験から候補MIMを用いる処置によって調節されることが見い出された遺伝子は、細胞および生化学的経路分析に供され、それによって、例えば、アポトーシス、癌生物学、および細胞増殖、解糖および代謝、分子輸送、ならびに細胞シグナル伝達を含む種々の細胞経路に分類できる。
候補MIMの細胞への侵入を確認するため、候補MIMが細胞内に局在化されるようになるか否かを決定するため、ならびに細胞中に存在する候補MIMのレベルおよび型を決定するための実験が実行される。これらの実験は、例えば、実施例5に詳細に記載されているように実行される。例えば、ミトコンドリアに存在する候補MIMのレベルおよび型を決定するために、候補MIMで処置された細胞からのミトコンドリア富化調製物が調製および分析される。ミトコンドリアに存在する候補MIMのレベルは、それによって、外因性候補MIMの添加に伴って、時間および用量依存的な様式で増加することが確認できる。加えて、ミトコンドリア富化試料からのタンパク質のレベルの変化は、全体の細胞タンパク質試料のために上記に記載されたように、二次元ゲル電気泳動および質量分析の特徴付けによるタンパク質同定を使用することによって分析される。細胞に侵入することが見い出され、例えば、ミトコンドリアにおいて増加レベルで存在することが見い出された候補MIMは、MIMとして同定される。試験された時間経過にわたる細胞中の、または例えば、具体的には、ミトコンドリア中の候補MIMのレベルは、例えば、特定のタンパク質のmRNAおよびタンパク質レベルの調節によって証明されるように、他に観察される細胞の変化と相関できる。
細胞組成の変化を誘導すること、例えば、mRNAまたはタンパク質レベルでの遺伝子発現の変化を誘導することが観察された候補MIMは、MIMとして同定される。正常(例えば、非癌性)状態と比較して疾患状態(例えば、癌)において、細胞の形態学、生理学、または細胞組成の示差的な変化(例えば、mRNAまたはタンパク質レベルにおける遺伝子発現の示差的な変化)を誘導することが観察された候補MIMは、MIMとして、特に多次元性質を有するとして同定される。細胞に入ることが可能であることが見い出された候補MIMは、候補MIMがそれによって治療効果に加えてキャリア効果を提示するので、MIMとして、特に、多次元性質を有するとして同定される。
実施例17:腫瘍性障害に付随するエピシフターとしてのCoQ10の同定
対照細胞系統(ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養)およびいくつかの皮膚癌細胞系統(非転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−28;転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−2;または扁平上皮細胞癌であるSCC;膵臓癌細胞系統であるPaCa2;または肝臓癌細胞系統であるHEP−G2)からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルのコエンザイムQ10で処置された。癌細胞系統は、対照細胞系統と比較したときに、用量依存的応答の変化を示し、癌細胞においてのみ、アポトーシスおよび細胞死の誘導を伴った。詳細な例示的な実験は、例えば、本明細書の実施例3に提示される。
対照細胞系統(ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養)およびいくつかの皮膚癌細胞系統(非転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−28;転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−2;または扁平上皮細胞癌であるSCC;膵臓癌細胞系統であるPaCa2;または肝臓癌細胞系統であるHEP−G2)からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルのコエンザイムQ10で処置された。癌細胞系統は、対照細胞系統と比較したときに、用量依存的応答の変化を示し、癌細胞においてのみ、アポトーシスおよび細胞死の誘導を伴った。詳細な例示的な実験は、例えば、本明細書の実施例3に提示される。
アッセイは、CoQ10を用いる処置後に上記に同定される細胞のmRNAおよびタンパク質レベルでの組成の変化を評価するために利用される。mRNA発現の変化は、アポトーシス、酸化ストレスおよび抗酸化剤、血管新生、および糖尿病の各々について特異的であるリアルタイムPCRマイクロアレイを使用して分析された。タンパク質発現の変化は、抗体マイクロアレイ分析およびウェスタンブロット分析を使用して分析された。これらのアッセイからの結果は、mRNAとタンパク質の両方のレベルで、コエンザイムQ10の添加に起因して、細胞系統中で、遺伝子発現の有意な変化が起こっていたことを実証した。細胞の代謝プロセスに付随するか、またはそれに関与することが知られている多数の遺伝子が、CoQ10を用いる処置の結果として、調節されるものとして観察された。例えば、核受容体タンパク質HNF4Aの発現は、Q10処置後に細胞中で上方調節されていることが見い出された。トランスアルドラーゼ1(TAL)の発現もまた、Q10で処置された細胞中で調節された。TALはNADPHおよび反応性酸素中間体のレベルのバランスをとり、それによって、ミトコンドリアの膜電位を調節し、これは、ATP合成および細胞生存の決定的なチェックポイントである。腫瘍性障害への特定の関連性の中でも、例えば、アポトーシス、癌生物学、および細胞増殖に付随することが知られている多数の遺伝子が、Q10によって調節されるとして同定された。詳細な例示的な実験が、例えば、本明細書の実施例4、6、7、8、および9に提示されている。
Q10は、エネルギー産生のためにミトコンドリアの中での酸化的(exidative)リン酸化プロセスのための必須のコファクターである。ミトコンドリア中に存在するコエンザイムCoQ10のレベルは、CoQ10の型と同様に、CoQ10で処置された細胞からミトコンドリアが富化された調製物を分析することによって決定される。ミトコンドリア中に存在するコエンザイムQ10のレベルは、外因性Q10の添加に伴って、時間および用量依存的な様式で増加することが確認された。時間経過は、代謝およびアポトーシス経路と関連する特定のタンパク質についてmRNAおよびタンパク質レベルの調節において観察されるような広範な種々の細胞の変化と相関した。詳細な例示的な実験は、例えば、本明細書の実施例5に提示される。
本明細書に記載された結果は、エピシフターとして内因性分子CoQ10を同定した。特に、結果は、細胞中で、代謝状態のシフト、および部分的にミトコンドリア機能の回復を誘導するとしてCoQ10を同定した。これらの結論は、本明細書に記載されているデータの以下の解釈、および関連分野における現在の知見に基づいている。
Q10は、合成され、ミトコンドリア内膜に能動輸送され、そこで富化され、およびそこで利用されることが知られている。Q10はまた、エネルギー産生のためのミトコンドリアにおける酸化的リン酸化のプロセスのための必須のコファクターであることも知られている。しかし、多くの癌細胞は、多くの正常細胞のようにミトコンドリアにおいてピルビン酸の酸化によるのではなく、解糖とその後の細胞質ゾル中での乳酸発酵によって、優勢にエネルギーを生産する。酸化的リン酸化は、電子伝達系およびシトクロムcを含む。アポトーシスはミトコンドリアの破壊を含み、アポトーシス促進性因子によるミトコンドリア内膜の浸透能(permiabilization)を伴う。様々な代謝エネルギー合成経路を利用することによって、癌細胞は、細胞中の異常に対する通常のアポトーシス性応答を軽減することが可能である。理論によって束縛されることを望まないが、出願人は、酸化的リン酸化経路のタンパク質を上方調節すること、従って、発癌の欠陥を認識し、アポトーシスの引き金を引く状態に戻るようにミトコンドリアの機能にスイッチを入れることによってQ10が機能していることを提案する。したがって、Q10は、細胞の代謝状態をシフトすることによってエピシフターとして作用している。
実施例18:腫瘍性障害に付随するエピシフターの同定
対照細胞系統(例えば、ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養)および癌細胞系統(例えば、非転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−28;転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−2;または扁平上皮細胞癌であるSCC;膵臓癌細胞系統であるPaCa2;または肝臓癌細胞系統であるHEP−G2)からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルの候補エピシフターで処置された。細胞形態学/生理学の変化は、候補エピシフターに対する細胞の感受性およびアポトーシス性応答を調べることによって評価される。これらの実験は、実施例3に詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補エピシフターに対する細胞系統の感受性は、様々な時間、および適用される濃度の範囲にわたって細胞生存を監視することによって評価される。候補エピシフターに対する細胞系統のアポトーシス性応答は、例えば、フローサイトメトリー方法論と組み合わせたネキシン試薬を使用することによって評価される。ネキシン試薬は、2種の染料、7AADおよびアネキシン−V−PEの組み合わせを含み、初期および後期のアポトーシスにおける細胞集団の定量化を可能にする。例えば、Apostrand(商標)ELISA方法論を使用する、一本鎖DNAを測定するさらなるアポトーシスアッセイが使用されてもよい。疾患および対照の細胞系統の感受性およびアポトーシス性応答が評価および比較される。候補エピシフターは、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的に細胞増殖を阻害するそれらの能力に基づいて評価される。候補エピシフターはさらに、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的にアポトーシスを誘導するそれらの能力に基づいて評価される。
対照細胞系統(例えば、ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養)および癌細胞系統(例えば、非転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−28;転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−2;または扁平上皮細胞癌であるSCC;膵臓癌細胞系統であるPaCa2;または肝臓癌細胞系統であるHEP−G2)からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルの候補エピシフターで処置された。細胞形態学/生理学の変化は、候補エピシフターに対する細胞の感受性およびアポトーシス性応答を調べることによって評価される。これらの実験は、実施例3に詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補エピシフターに対する細胞系統の感受性は、様々な時間、および適用される濃度の範囲にわたって細胞生存を監視することによって評価される。候補エピシフターに対する細胞系統のアポトーシス性応答は、例えば、フローサイトメトリー方法論と組み合わせたネキシン試薬を使用することによって評価される。ネキシン試薬は、2種の染料、7AADおよびアネキシン−V−PEの組み合わせを含み、初期および後期のアポトーシスにおける細胞集団の定量化を可能にする。例えば、Apostrand(商標)ELISA方法論を使用する、一本鎖DNAを測定するさらなるアポトーシスアッセイが使用されてもよい。疾患および対照の細胞系統の感受性およびアポトーシス性応答が評価および比較される。候補エピシフターは、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的に細胞増殖を阻害するそれらの能力に基づいて評価される。候補エピシフターはさらに、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的にアポトーシスを誘導するそれらの能力に基づいて評価される。
候補エピシフターを用いる処置後に上記に同定された細胞のmRNAおよびタンパク質レベルでの組成物の変化を評価するためのアッセイが利用される。mRNAレベルの変化はリアルタイムPCRマイクロアレイを使用して分析される。これらの実験は、実施例6および9−13において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、mRNAは、処置後の様々な時点で細胞から抽出される。特定の経路に関与する遺伝子のmRNAのレベルは、アポトーシス、酸化ストレスおよび自己酸化防御、血管新生、熱ショック、または糖尿病に特異的なアレイを含む、標的とされる経路アレイを使用することによって評価される。2倍レベル以上でmRNA転写が変化される遺伝子が同定および評価される。
タンパク質発現の変化は、抗体マイクロアレイ分析、質量分析特徴付けと連動した二次元ゲル電気泳動分析、およびウェスタンブロット分析を使用して分析される。これらの実験は、それぞれ、実施例7、4、および8において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、可溶性タンパク質は、候補エピシフターを用いる処置後の様々な時間、例えば、6時間または24時間で細胞から抽出される。候補エピシフターによってタンパク質レベルまで誘導された変化は、広い範囲のタンパク質型および潜在的な経路マーカーをサンプリングしている700種を超えるタンパク質に対する抗体を含む抗体マイクロアレイを使用することによって評価される。さらなる相補プロテオーム分析は、質量分析方法論と連動した二次元(2−D)ゲル電気泳動を利用することによって実行できる。候補エピシフターは、細胞系統に外因的に加えられ、細胞ペレットは溶解され、2−Dゲル電気泳動に供される。ゲルは、未処置試料である対照と比べて処置試料でのタンパク質レベルの変化を同定するために分析される。ゲルは、レベルの増加、レベルの減少、または翻訳後修飾に起因する、処置の時間経過にわたるスポット変化の同定について分析される。統計学的に有意な変化を示すスポットは、トリプシン消化および質量分析による特徴付けによるタンパク質同定のために、切り出され、提出される。特徴付けされたペプチドは、例えば、MascotおよびMSRATソフトウェア分析を用いて、タンパク質データベースに対して検索され、タンパク質を同定する。前述の二次元ゲル分析および抗体マイクロアレイ実験に加えて、候補MIMによって誘導される特定のタンパク質のレベルに対する潜在的な変化が、ウェスタンブロット分析によって評価されてもよい。すべてのプロテオーム実験において、種々の細胞系統におけるレベルの増加または減少を伴うタンパク質が同定および評価される。
候補エピシフターは、候補エピシフターの添加に起因して、細胞系統中で、mRNAおよび/またはタンパク質レベルで遺伝子発現に誘導される変化に基づいて評価される。特に、候補エピシフターは、細胞代謝プロセスに付随するかまたはそれに関与することが知られている遺伝子を調節するそれらの能力に基づいて評価される。腫瘍性障害に特に関連するものとして、候補エピシフターは、例えば、アポトーシス、癌生物学、および細胞増殖に付随することが知られている遺伝子を調節するそれらの能力に基づいて評価される。
細胞または特定の細胞位置に存在する候補エピシフターのレベル、ならびに候補エピシフターの型は、当業者に公知である日常的な方法を使用して決定される。例えば、経時的かつ一定の範囲の用量にわたるミトコンドリアにおける候補エピシフターのレベルは、候補エピシフターを用いて処置された細胞からのミトコンドリア富化調製物を分析することによって決定される。時間経過にわたってのミトコンドリアにおける候補エピシフターのレベルは、観察された他の細胞の変化、例えば、代謝経路およびアポトーシス経路に関連する特定のタンパク質のmRNAおよびタンパク質のレベルの調節と比較および相関できる。
前述の実験から得られた結果に基づいて細胞の代謝状態のシフトを誘導することが観察された候補エピシフターは、エピシフターとして同定される。例えば、細胞傷害性を表示し、および/または細胞中でアポトーシスを誘導する候補エピシフターは、エピシフターとして同定される。好ましくは、正常細胞と比較して、疾患(癌)細胞において示差的な細胞傷害性を表示し、および/またはアポトーシス性応答を示差的に誘導する候補エピシフター(例えば、正常細胞と比較して、癌細胞においてアポトーシスに関与しているタンパク質の発現を示差的に調節するエピシフター)は、エピシフターとして同定される。
実施例19:エピシフターとしてのビタミンD3の同定
ビタミンD3、すなわち、1α、25−ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオールとしてもまた知られる)は、ビタミンDから2段階酵素プロセスによって合成されるビタミンD代謝物である。ビタミンD3はその遍在性核ビタミンD受容体(VDR)と相互作用し、カルシウムおよびリン酸の恒常性ならびに細胞分裂および分化に関与する遺伝子の広範なスペクトルの転写を調節する。ビタミンD3は、扁平上皮細胞癌、前立腺腺癌、卵巣癌、乳癌、および肺癌を含む多数のモデル系において抗癌効果を有することが報告されている(Deeb et al.2007 Nature Reviews Cancer 7:684−700に概説されている)。
ビタミンD3、すなわち、1α、25−ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオールとしてもまた知られる)は、ビタミンDから2段階酵素プロセスによって合成されるビタミンD代謝物である。ビタミンD3はその遍在性核ビタミンD受容体(VDR)と相互作用し、カルシウムおよびリン酸の恒常性ならびに細胞分裂および分化に関与する遺伝子の広範なスペクトルの転写を調節する。ビタミンD3は、扁平上皮細胞癌、前立腺腺癌、卵巣癌、乳癌、および肺癌を含む多数のモデル系において抗癌効果を有することが報告されている(Deeb et al.2007 Nature Reviews Cancer 7:684−700に概説されている)。
ビタミンD3の抗癌効果は、細胞周期のG1期での増殖停止、アポトーシス、腫瘍細胞分化、増殖因子媒介性細胞生存シグナルの破壊、ならびに血管新生および細胞接着の阻害を含む、複数のメカニズムを含むことが報告されている(Deeb et al.2007 Nature Reviews Cancer 7:684−700に概説されている)。例えば、特にアポトーシスに関して、ビタミンD3は、アポトーシスの鍵となる媒介因子を調節すること、例えば、抗アポトーシス性の、生存促進性タンパク質BCL−2およびBCL−XLの発現を逆行すること、またはアポトーシス促進性タンパク質(例えば、BAX、BAK、およびBAD)の発現を誘導することによってアポトーシスを誘導することが報告されている(Deeb et al.2007)。さらなる例において、特に血管新生に関連して、ビタミンD3は、いくつかの腫瘍由来内皮細胞の増殖を阻害すること、および腫瘍において血管新生を誘導する血管内皮増殖因子(VEGF)の発現を阻害することが報告されてきた(Masuda and Jones,2006 Mol.Cancer Ther.5(4):797−8070に概説されている)。別の例において、特に細胞周期停止に関して、ビタミンD3は、サイクリン依存性キナーゼインヒビターp21WAFI/CIPIの遺伝子転写を誘導すること、ならびにサイクリン依存性キナーゼインヒビターp27KIPIタンパク質の合成および/または安定化を誘導することが報告されており、これらの両方とも、G1停止の誘導のために決定的である(Deeb et al.2007)。
上述の観察に基づいて、すなわち、細胞の代謝状態をシフトされるその能力により、ビタミンD3はエピシフターとして同定される。ビタミンD3は、細胞中でアポトーシスを誘導するその能力により、特に、正常細胞と比較した場合に、疾患(癌)細胞において示差的に細胞増殖を阻害し、およびアポトーシス性応答を誘導するその能力に基づいて、エピシフターである(例えば、正常細胞と比較した場合に、癌細胞においてアポトーシスに関与する、BCL−2、BCL−XL、およびBAXなどのタンパク質の発現を示差的に調節する)。
実施例20:コエンザイムQ10に対する発癌性細胞および正常細胞の相対的感受性
種々の発癌性および正常細胞系統に対するコエンザイムQ10処置の効果が試験および比較された。コエンザイムQ10に対する細胞の感度は、アポトーシスの誘導を監視することによって評価された。細胞のCoQ10処置は、材料および方法において以下に詳細に記載されるように実行された。アポトーシスの誘導は、以下に記載されるように、早期アポトーシスの指標(例えば、Bcl−2発現、カスパーゼ活性化、およびアネキシンVアッセイを使用することによって)を監視することによって処置された細胞中で評価された。これらの研究から、細胞系統のパネルにおいてアポトーシスを誘導するために必要である最小限のCoQ投薬量、例えば、CoQ10の濃度および処置の時間が決定された。
種々の発癌性および正常細胞系統に対するコエンザイムQ10処置の効果が試験および比較された。コエンザイムQ10に対する細胞の感度は、アポトーシスの誘導を監視することによって評価された。細胞のCoQ10処置は、材料および方法において以下に詳細に記載されるように実行された。アポトーシスの誘導は、以下に記載されるように、早期アポトーシスの指標(例えば、Bcl−2発現、カスパーゼ活性化、およびアネキシンVアッセイを使用することによって)を監視することによって処置された細胞中で評価された。これらの研究から、細胞系統のパネルにおいてアポトーシスを誘導するために必要である最小限のCoQ投薬量、例えば、CoQ10の濃度および処置の時間が決定された。
予測されずかつ驚くべき結果において、データは、コエンザイムQ10処置の効力が、発癌性の増加および/またはより大きな転移の潜在能力を示した細胞型、すなわち、より攻撃的な癌または腫瘍から誘導された細胞型においてより大きかったことを実証した。これらの研究の結果は、表29において以下に要約されている。このデータは、CoQが、より攻撃的な癌の状態にある細胞に対して、時間と濃度の両方に依存的な様式でより有効であることを実証する。さらに、驚くべき相違する効果が、発癌性細胞と比較した場合に、正常細胞に対して観察された。具体的には、コエンザイムQ10は、正常組織環境においてわずかに支持的な役割を示すことが予想に反して見い出され、ここで、増殖および移動の増加が、ケラチン形成細胞および皮膚線維芽細胞を含む正常細胞において観察された。
癌における遺伝子調節およびタンパク質メカニズムに対するコエンザイムQ10の効果は、正常細胞においては異なっている。膜の流動性、輸送メカニズム、免疫調節、血管新生、細胞周期制御、ゲノム安定性、酸化制御、解糖流量、代謝制御、および細胞外マトリックスタンパク質の完全性などの、鍵となる細胞の機構および構成要素は、異常調節され、従って、細胞の遺伝的および分子的な指紋が変化している。疾患環境は、細胞制御プロセスの支配が優勢である。本明細書に提供されるデータは、アポトーシス能力の回復を可能にする様式で鍵となる上述のプロセスのいくつかを正常化することによって、CoQ10が、より高いレベルの効力を発揮していることを示唆する(例えば、正常細胞に対する癌細胞において、およびより攻撃的でなくまたは非攻撃的な癌状態の細胞と比較した場合のより攻撃的な癌状態の細胞において)。
材料および方法
細胞の調製および処置
ディッシュまたはフラスコで調製された細胞
細胞は、37℃インキュベーター中、5%CO2レベルで、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%PSA(ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンB)(InvitrogenおよびCellgro)を補充した関連培地を有するT−75フラスコ中で、70〜80%コンフルエンスに達するまで培養された。処置のために細胞を収穫するために、フラスコに1mLトリプシンが加えられ、吸引され、さらに3mLでトリプシン処置され、そして37℃で3〜5分間インキュベートされた。次いで、細胞は、等量の培地で中和され、その結果生じた溶液は10,000rpmで8分間遠心分離された。上清は吸引され、細胞は8.5mlの培地で再懸濁された。500μlの再懸濁物と9.5mlのイソプロパノールの混合物が、コールターカウンターによって2回読み取られ、各ディッシュに播種される適切な細胞の数が決定された。対照および0〜200μMの濃度範囲の群が3連で試験された。500μM CoQ−10ストック溶液から段階希釈が実施されて、適切なディッシュ中での所望の実験濃度を達成した。ディッシュは、細胞型および実験プロトコールに依存して、5%CO2レベルで0〜72時間の間、37℃インキュベーター中でインキュベートされた。
細胞の調製および処置
ディッシュまたはフラスコで調製された細胞
細胞は、37℃インキュベーター中、5%CO2レベルで、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%PSA(ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンB)(InvitrogenおよびCellgro)を補充した関連培地を有するT−75フラスコ中で、70〜80%コンフルエンスに達するまで培養された。処置のために細胞を収穫するために、フラスコに1mLトリプシンが加えられ、吸引され、さらに3mLでトリプシン処置され、そして37℃で3〜5分間インキュベートされた。次いで、細胞は、等量の培地で中和され、その結果生じた溶液は10,000rpmで8分間遠心分離された。上清は吸引され、細胞は8.5mlの培地で再懸濁された。500μlの再懸濁物と9.5mlのイソプロパノールの混合物が、コールターカウンターによって2回読み取られ、各ディッシュに播種される適切な細胞の数が決定された。対照および0〜200μMの濃度範囲の群が3連で試験された。500μM CoQ−10ストック溶液から段階希釈が実施されて、適切なディッシュ中での所望の実験濃度を達成した。ディッシュは、細胞型および実験プロトコールに依存して、5%CO2レベルで0〜72時間の間、37℃インキュベーター中でインキュベートされた。
タンパク質の単離および定量
ディッシュ中で調製される細胞
細胞処置インキュベーション時間が完了後、タンパク質の単離が実施された。すべての処置群のディッシュは、2mlの氷冷1×リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で2回、1mlで1回洗浄された。PBSは最初の2回の洗浄後のみ、ディッシュから吸引された。細胞は穏やかにかき取られ、3回目の洗浄からの最終量を使用して微量遠心分離チューブに収集され、10,000rpmで10分間遠心分離された。遠心分離後、上清は吸引され、ペレットは50μLの溶解緩衝液(100μLの溶解緩衝液毎に1μLのプロテアーゼおよびホスファターゼ(phosphotase)インヒビター)で溶解された。次いで、試料は−20℃で一晩凍結された。
ディッシュ中で調製される細胞
細胞処置インキュベーション時間が完了後、タンパク質の単離が実施された。すべての処置群のディッシュは、2mlの氷冷1×リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で2回、1mlで1回洗浄された。PBSは最初の2回の洗浄後のみ、ディッシュから吸引された。細胞は穏やかにかき取られ、3回目の洗浄からの最終量を使用して微量遠心分離チューブに収集され、10,000rpmで10分間遠心分離された。遠心分離後、上清は吸引され、ペレットは50μLの溶解緩衝液(100μLの溶解緩衝液毎に1μLのプロテアーゼおよびホスファターゼ(phosphotase)インヒビター)で溶解された。次いで、試料は−20℃で一晩凍結された。
フラスコ中で調製される細胞
細胞処置インキュベーション時間が完了後、タンパク質の単離が実施された。すべての処置群のフラスコは、5mlの氷冷1×PBSで2回、3mlで1回洗浄された。PBSは最初の2回の洗浄後のみ、フラスコから吸引された。細胞は穏やかにかき取られ、3回目の洗浄からの最終量を使用して15mL遠心分離チューブに収集され、10,000rpmで10分間遠心分離された。遠心分離後、上清は吸引され、ペレットは適切な量の溶解緩衝液(100μLの溶解緩衝液毎に1μLのプロテアーゼおよびホスファターゼ(phosphotase)インヒビター)で溶解された。溶解緩衝液の量はペレットサイズに依存した。試料は微量遠心チューブに移され、−20℃で一晩凍結された。
細胞処置インキュベーション時間が完了後、タンパク質の単離が実施された。すべての処置群のフラスコは、5mlの氷冷1×PBSで2回、3mlで1回洗浄された。PBSは最初の2回の洗浄後のみ、フラスコから吸引された。細胞は穏やかにかき取られ、3回目の洗浄からの最終量を使用して15mL遠心分離チューブに収集され、10,000rpmで10分間遠心分離された。遠心分離後、上清は吸引され、ペレットは適切な量の溶解緩衝液(100μLの溶解緩衝液毎に1μLのプロテアーゼおよびホスファターゼ(phosphotase)インヒビター)で溶解された。溶解緩衝液の量はペレットサイズに依存した。試料は微量遠心チューブに移され、−20℃で一晩凍結された。
タンパク質の定量
試料は−4℃で融解し、超音波処理して、タンパク質単離の翌日における均質化を確実にした。タンパク質の定量は、マイクロBCAタンパク質アッセイキット(Pierce)を使用して実施された。免疫ブロッティングのための試料を調製するために、βメルカプトエタノール(Sigma)対試料緩衝液(Bio−Rad)1:19溶液が調製された。試料は、βメルカプトエタノール−試料緩衝液を用いて1:1に希釈され、95℃で5分間煮沸し、そして−20℃で一晩凍結させた。
試料は−4℃で融解し、超音波処理して、タンパク質単離の翌日における均質化を確実にした。タンパク質の定量は、マイクロBCAタンパク質アッセイキット(Pierce)を使用して実施された。免疫ブロッティングのための試料を調製するために、βメルカプトエタノール(Sigma)対試料緩衝液(Bio−Rad)1:19溶液が調製された。試料は、βメルカプトエタノール−試料緩衝液を用いて1:1に希釈され、95℃で5分間煮沸し、そして−20℃で一晩凍結させた。
免疫ブロッティング
Bcl−2、カスパーゼ、9、シトクロムc
ウェルあたりロードするための試料の量は、BCAタンパク質アッセイから得られたそのままの平均タンパク質濃度を使用して決定された。約30〜60μgのタンパク質が各処置の時点のためにロードされた。タンパク質は、12%Tris−HClレディーゲル(Bio−Rad)またはハンドキャストゲル上で、1×泳動緩衝液中で、85および100ボルトにて3連で泳動された。次いで、タンパク質は、100ボルトで1時間、ニトロセルロースペーパーに転写され、5%ミルク溶液中でさらに1時間ブロッキングされた。膜は、一晩、−4℃で一次抗体(1μL Ab:1000μL TBST)(Cell Signaling)中に配置された。翌日、膜は、10分間を3回、各々Tris緩衝化生理食塩水Tween−20(TBST)で洗浄され、および二次抗体(抗ウサギ;1μL Ab:1000μL TBST)が−4℃で1時間適用された。膜は、再度、10分間を3回、TBSTで洗浄され、ピコまたはフェムト基質を使用する化学発光が完了した(Pierce)。次いで、膜は、最良の視覚的結果を生じる時間間隔で発色された。発色後、膜は、アクチンレベルが測定可能になるまで、TBST中で−4℃に維持された。
Bcl−2、カスパーゼ、9、シトクロムc
ウェルあたりロードするための試料の量は、BCAタンパク質アッセイから得られたそのままの平均タンパク質濃度を使用して決定された。約30〜60μgのタンパク質が各処置の時点のためにロードされた。タンパク質は、12%Tris−HClレディーゲル(Bio−Rad)またはハンドキャストゲル上で、1×泳動緩衝液中で、85および100ボルトにて3連で泳動された。次いで、タンパク質は、100ボルトで1時間、ニトロセルロースペーパーに転写され、5%ミルク溶液中でさらに1時間ブロッキングされた。膜は、一晩、−4℃で一次抗体(1μL Ab:1000μL TBST)(Cell Signaling)中に配置された。翌日、膜は、10分間を3回、各々Tris緩衝化生理食塩水Tween−20(TBST)で洗浄され、および二次抗体(抗ウサギ;1μL Ab:1000μL TBST)が−4℃で1時間適用された。膜は、再度、10分間を3回、TBSTで洗浄され、ピコまたはフェムト基質を使用する化学発光が完了した(Pierce)。次いで、膜は、最良の視覚的結果を生じる時間間隔で発色された。発色後、膜は、アクチンレベルが測定可能になるまで、TBST中で−4℃に維持された。
アクチン
膜は、−4℃で1時間、一次アクチン抗体(1μL Ab:5000μL TBST)(Cell Signaling)中に配置され、10分間を3回、各々TBSTで洗浄され、二次抗体(抗マウス;1μL Ab:1000μL TBST)が−4℃で1時間適用された。膜は、再度、10分間を3回、各々TBSTで洗浄され、ピコ基質を使用する化学発光が完了した(Pierce)。次いで、膜は、最良の視覚的結果を生じる時間間隔で発色された。
膜は、−4℃で1時間、一次アクチン抗体(1μL Ab:5000μL TBST)(Cell Signaling)中に配置され、10分間を3回、各々TBSTで洗浄され、二次抗体(抗マウス;1μL Ab:1000μL TBST)が−4℃で1時間適用された。膜は、再度、10分間を3回、各々TBSTで洗浄され、ピコ基質を使用する化学発光が完了した(Pierce)。次いで、膜は、最良の視覚的結果を生じる時間間隔で発色された。
アネキシンVアッセイ
細胞は、PBS10X中で2回洗浄し、結合緩衝液(0.1M HEPES、pH7.4;1.4M NaCl;25mM CaCl2)に再懸濁された。100μlの試料が、5μlのアネキシン−PE染料または7−ADDとともに、培養チューブに加えられた。細胞は混合され、遮光して、室温にて15分間インキュベートされた。その後、400μlの1×結合緩衝液が各試料に加えられ、これらはフローサイトメトリーによる分析に供された。
細胞は、PBS10X中で2回洗浄し、結合緩衝液(0.1M HEPES、pH7.4;1.4M NaCl;25mM CaCl2)に再懸濁された。100μlの試料が、5μlのアネキシン−PE染料または7−ADDとともに、培養チューブに加えられた。細胞は混合され、遮光して、室温にて15分間インキュベートされた。その後、400μlの1×結合緩衝液が各試料に加えられ、これらはフローサイトメトリーによる分析に供された。
実施例21〜25は、国際出願WO2008/116135から本明細書に取られたものである。その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。一貫性のために、これらの実施例における表の番号は付け直されていないが、これらの表の番号は、特許請求の範囲に引用されている表とは一致していない。
実施例21:ペンチレングリコールを含むCoQ10 22%濃縮物を調製する方法
脂溶性生物活性剤としてCoQ10を有する濃縮物が製造された。約10キログラム(kg)のポリソルベート80が真空ケトルに配置され、約50℃〜約65℃の温度まで加熱された。約8.8kgのCoQ10がポリソルベート80に加えられ、約50℃〜約65℃に維持された温度で、真空が適用され、内容物が約15分間混合された。得られた材料は、本明細書ではCoQ10相または第1相と称してもよい。真空ケトルを密封し、真空を適用し、そしてポリソルベート/CoQ10の混合物の温度を約50℃〜約55℃にして、CoQ10はポリソルベート80に溶解された。
別個のケトルに、約15.8kgの水を約50℃〜約55℃の温度に加熱し、約0.2kgのフェノキシエタノールおよび約2kgのハイドロライト5(登録商標)ペンチレングリコール、USPが水に加えられ、透明かつ均一になるまで混合された。次いで、約8kgのホスホリポン(登録商標)85Gが、分散されるまで加えられた。得られた材料は、本明細書では、水相または第2相と称してもよい。水相は均一な分散およびホスホリポン型レシチンの水和を達成し、約50℃〜約55℃の温度で、以下に記載されるように、CoQ10/ポリソルベート液体に加えられた。
実験室スケールバッチのために使用されるSilverson L4RTモデルに類似したSilversonインライン製造スケールホモジナイザーが、上記の2つの相(すなわち、CoQ10相および水相)を合わせるために利用された。均質化は、可溶化したCoQ10が完全にカプセル化し、均一に分散され、それによって、濃厚な、均一なリポソーム分散液を生じるまで、Silverson標準エマルジョンヘッドスクリーンを使用し、全能力(約7000rpm〜約10,000rpm)で、計約5分間にわたって、密閉した再循環ループを通して、真空下で(約18mm〜約20mmHg)、約50℃〜約55℃の温度で、ゆったりした撹拌で混合することによって行われた。得られたCoQ10濃縮物は、約22重量%の濃度でCoQ10を有した。ホスホリポン(登録商標)85G濃縮物は、約8重量%の総組成物であったが、これは、上記の2つの相を合わせたものである。
別個の実験において、1kg実験室バッチの上記の22%CoQ10濃縮物が製造され、試料は均質化の間に5分間隔でとられた。様々なサンプリング時間におけるリポソームの粒径は、レーザー回折装置(Malvern 2000)を製造業者の説明書に従って利用して決定された。均質化プロセスおよび均質化の間に得られた粒径の詳細は表1において以下に示される。
表1から見ることができるように、CoQ10濃縮製剤および上記のプロセスは、107nmの平均直径、および約59nm〜約279nmのサイズ内で製造されたすべてのリポソームの85%を含んだ粒子分布を有するリポソームを製造することが可能であった。短い処置時間(約5分間)は、長い処置時間(約45分間)と全く同じ効率でCoQ10のリポソーム分散液を製造した。上記からもまた見ることができるように、CoQ10が約55℃よりも上の温度に曝露されなかった場合に、最適なリポソーム粒子が得られた。
表1から見ることができるように、CoQ10濃縮製剤および上記のプロセスは、107nmの平均直径、および約59nm〜約279nmのサイズ内で製造されたすべてのリポソームの85%を含んだ粒子分布を有するリポソームを製造することが可能であった。短い処置時間(約5分間)は、長い処置時間(約45分間)と全く同じ効率でCoQ10のリポソーム分散液を製造した。上記からもまた見ることができるように、CoQ10が約55℃よりも上の温度に曝露されなかった場合に、最適なリポソーム粒子が得られた。
実施例22:2%カルボマー分散液を調製する方法
架橋アクリル酸ポリマー分散液が、クリーム組成物中の粘性剤としての使用のために調製された。利用されたアクリル酸、カルボマー940は、表2において下記に示される以下の成分を用いて2%分散液中で調製された。
架橋アクリル酸ポリマー分散液が、クリーム組成物中の粘性剤としての使用のために調製された。利用されたアクリル酸、カルボマー940は、表2において下記に示される以下の成分を用いて2%分散液中で調製された。
製造プロセスは以下のように行われた。装置は最初に清掃され、消毒された。実験台の上で、相1成分は、透明かつ均一になるまで混合された。必要とされる量の水(相2)が秤量され、実施例1において上記に記載されるホモジナイザーの相容器ケトルに加えられた。この水は、熱水/蒸気ジャケットを用いて、約60℃〜約65℃の温度に加熱された。次いで、相1は、透明かつ均一になるまで適度な撹拌を行いながら、相2の水に加えられた。相1の容器は処置水ですすがれ、温度は約60℃〜約65℃に維持された。次いで、撹拌機を高出力でオンにし、カルボマー940粉末(相3)が加えられた。
温度は約60℃〜約65℃に維持され、混合は中速から高速である約500rpm〜約800rpmで、すべてのカルボマー940粉末が加えられるまで継続された。カルボマー粉末は、相1および2の混合物のボルテックスにゆっくりと加えられた。粉末は、カルボマーの総量が約10分間以上で加えられるように、ゆっくりと手でふるいにかけるように加えられた。
混合は、すべての粉末が徹底的に分散され、「斑点(fish−eyes)」が存在しなくなるまで、中程度−高度の撹拌で継続された。製造プロセスは、すべての中和されていないカルボマー940粉末が完全に分散されて完全に水和したカルボマーポリマーの滑らかな半透明な分散液を生じるように行われた。このバッチの撹拌は、目に見える渦を作るのに十分に高速であったが、このバッチのしぶきを引き起こすほど高速ではなかった。このバッチの適切な混合は、約60分間〜約90分間の時間の間にわたって、約800rpm〜約1300rpmの高速で行われた。バッチ温度は、混合の開始の時点で約60℃〜約65℃に、混合の間に約55℃〜約65℃に維持された。温度の上昇は、カルボマーポリマーの分散を補助し、凝集を防ぐことを助けた。
このバッチは、約25℃〜約30℃に、冷却水を用いて、ジャケットを通して冷却され、混合は、中程度−高度の撹拌を用いて継続された。次いで、微量品質、pH、比重、および粘度を決定するために試料がとられた。
実施例23:CoQ10 22%濃縮物を使用する、CoQ10クリーム(1.5%、3.0%、および5.0%)を調製する方法
クリームエマルジョンベースは、実施例1のリポソームを有するCoQ10濃縮物との組み合わせのためのいくつかの相を利用して形成された。相A、B、C、およびDが合わされてベースクリームを形成した。相Eは実施例1のCoQ10 22%濃縮物であった(22%w/w CoQ10)。クリームエマルジョンベースの調製および引き続く実施例1のCoQ10 22%濃縮物の付加の詳細は、以下に示される。
クリームエマルジョンベースは、実施例1のリポソームを有するCoQ10濃縮物との組み合わせのためのいくつかの相を利用して形成された。相A、B、C、およびDが合わされてベースクリームを形成した。相Eは実施例1のCoQ10 22%濃縮物であった(22%w/w CoQ10)。クリームエマルジョンベースの調製および引き続く実施例1のCoQ10 22%濃縮物の付加の詳細は、以下に示される。
相A(「油相」)は、軟化および塗布性のための加えられる軽いエステルであるC12−15アルキルベンゾエートを含む。セチルアルコールおよびステアリルアルコールは、粘りまたは質感をクリームに与えるために加えられるワックスであり、ステアリン酸グリセリルおよびPEG−100ステアリン酸混合物は、水中油型(o/w)エマルジョンを形成するために加えられる主要な乳化剤であった。実験台上で、相A成分は真空ケトル中で秤量され、ウォーターバス中で約70℃〜約75℃まで加熱された。
B相(「水相」)は、皮膚に湿気を与えることおよび保湿性のためのグリセリン;皮膚への浸透を補助するため、および微生物学的保存プロフィールを改善するための、保湿性のためのプロピレングリコール;リポソームのCoQ10皮膚浸透を増強するためのエトキシジグリコール;微生物学的保存のためのフェノキシエタノール;相溶媒としての精製水、ならびにクリーム製剤のレオロジー特性を制御するため、および一次エマルジョンに安定性を加えるために、上記の実施例2のカルボマー940分散液を含んだ。
B相成分は、別個の混合ケトル中に配置された。これらの成分は、約70℃〜約75℃に加熱しながら(真空なし)、適度なスウィープ混合で混合された。B相成分が約70℃〜約75℃に到達したとき、A相成分は、適度なスウィープ混合で約70℃〜約75℃で加えられる。A相およびB相の混合物は、実施例1に上記に記載されるようにSilversonホモジナイザーを通して再循環され(標準ヘッド)、次の処理パートに続いた。
C相(「中和および緩衝液相」)において、精製水が、この相における他の成分としての溶媒および希釈剤として働く。トリエタノールアミンは水相(B相)におけるカルボマーアクリル酸コポリマーの主な中和剤であり;乳酸ナトリウム溶液(水中60%w/w)および乳酸が、クリームの最終pHを約5〜約5.5に調整および維持するための緩衝系として加えられ、これは、皮膚の中性pH範囲内にある。
実験台上で、C相成分は、秤量され、均一になるまで混合され、約60℃〜約65℃に加熱された。次いで、C相混合物は、スウィープミキサーを用いて、中速から高速で、A相およびB相を含む真空混合ケトルに加えられた。
相D(「色素相」)。水分散グレードの二酸化チタン粉末が、最終クリーム色の色を明るくする目的のために、唯一、製剤中で使用された。CoQ10によって付与されたクリームの黄色−オレンジ色は、約1%w/w二酸化チタンの添加によって実質的に減少され、美容上改善された。
プロセスのD相のために、秤量されたTiO2がバッチに加えられ(A相、B相、およびC相)、約10分間または完全に均一かつ十分に引き伸ばされるまで(確認するために色がチェックされた)、Silversonホモジナイザー(高剪断ヘッド)を通して混合および再循環された。
スウィープ混合ブレード上で二酸化チタンの凝集または固まりがないことを確実にすることが重要であった;これは目視によって確認される。実施例1において上記に記載されているSilversonインラインホモジナイザーは、最大限の二酸化チタンの脱凝集および粉砕を保証するために高剪断スクリーンとともに使用された。二酸化チタンの最終分散液は、Hegman PH−175粉末度の粉砕ゲージを用いてチェックされた。
再循環は停止され、このバッチは、培地上のスウィープミキサーを用いて、約30rpmの速度で、約50℃〜約55℃に冷却された。実施例1からの以前に秤量されたCoQ10 22%濃縮物(E相)は、約45℃〜約50℃にあたためられ、バッチに加えられた(A相、B相、C相、およびD相)。
すべての相は、均質になるまで、真空を適用しながら、約60rpmのスウィープ撹拌で混合された。温度は約50℃に維持された。
このバッチは、約60rpmで混合し、真空を適用しながら、約35℃〜45℃に冷却された。
得られた材料は保持容器に配置された。
CoQ10 22%濃縮物を3重量%で有するクリーム(「CoQ10クリーム3%」)の調製のために、CoQ10 22%濃縮物を1.5重量%で有するクリーム(「CoQ10クリーム1.5%」)を形成するための上記と正確に同じ手順に従った。各相の材料、および利用される量は、表8〜12において以下に示される。
類似のクリームは、約25重量%の量の実施例1からのCoQ10 22%濃縮物を使用して調製され、約5重量%の濃度のCoQ10 22%濃縮物を有するクリームを生じる。
1.5重量%CoQ10、3重量%CoQ10、および5重量%CoQ10を有するCoQ10クリームの内容物の要約は、以下の表13、14、および15においてそれぞれ示される。CoQ10クリームについての上記および下記に示す製剤の実施例すべてにおいて、使用されたCoQ10 22%濃縮物の量は、標的濃度よりの上の約5%のCoQ10 22%濃縮物の最終理論濃度を実際に生じることに注意のこと。したがって、「CoQ10クリーム1.5%」については、使用された実際のバッチ量は、1.58%w/w CoQ10を生じた、7.5重量%のCoQ10 22%濃縮物であった。「CoQ10クリーム3%」は、3.15重量%CoQ10の理論含量を生じた、15重量%のCoQ10 22%濃縮物で作られた。5%過剰薬物が、全体の製品の有効期間を延長し、ラベルまたは予測される薬物含量約90%〜約110%の薬物含量を維持するために加えられた。
注記:CoQ10 22%濃縮物の5%製造過多量が、CoQ10クリーム1.5%、CoQ10クリーム3.0%、およびCoQ10クリーム5%のバッチに加えられた(1.5%プラス0.075%、3%プラス0.15%、および5%プラス2.5%)。
注記:CoQ10 22%濃縮物の5%製造過多量が、CoQ10クリーム1.5%、CoQ10クリーム3.0%、およびCoQ10クリーム5%のバッチに加えられた(1.5%プラス0.075%、3%プラス0.15%、および5%プラス2.5%)。
実施例24:CoQ10クリーム(1.5%、3.0%、または5.0%)の局所適用 上記の実施例3において製造されたCoQ10を有するクリーム(すなわち、CoQ10クリーム1.5%、CoQ10クリーム3%、およびCoQ10クリーム5%)がブタ皮膚に適用された。局所用量研究が、各々1匹は雄性であり、1匹は雌性である、各2匹ずつのブタに対して行われた。各動物は6つの試験領域;各々の側に3つの試験領域を有した。各ブタについて、1つの側(3部位)に7日間、1日に1回投薬されたのに対し、各ブタについて、逆の試験側(3試験領域)は1日目に1回のみ投薬された。エトキシジグリコールとともに調製された実施例3からのクリームは、雄性動物に対して使用された。雌性動物は、5%エトキシジグリコールの代わりに5%1,3−ブチレングリコールを含んだこと以外は、上記の実施例3において製造された試料と同じ成分を含んだ3つの試験製剤を受容した。1.5重量%CoQ10 22%濃縮物、3重量%CoQ10 22%濃縮物、および5重量%CoQ10 22%濃縮物を有する、1,3−ブチレングリコールで作製されたこれらの製剤の詳細は、それぞれ、表16、17、および18において以下に示される。
すべての動物は、同じ用量の各製剤を受容し、これは、200mgであり、121cm2適用領域に、1回、または毎日7日間適用された。
適用後、皮膚試料は、以下のように入手および分析された。皮膚試験領域は、刺激の少ない石けんと水の混合液(例えば、水中の1%Ivory Soapまたは等価物)で穏やかに洗浄され、いかなる残りの局所試験製剤も除去された。切除されるべき領域が投薬された領域よりも大きい場合、投薬された領域は消えないインクで境界を定め、投薬されなかった皮膚領域を線引きした。十分な厚さの皮膚切片が、約10cm×10cmのサイズで、脂肪層の深さまで、かつそれを含むように、外科用メスによって取り出された。切除後、皮膚切片は平らにして置き、2層のプラスチックラップ(SARAN WRAP(商標)または等価物)に包み、約−70℃以下でタイミングよく凍結させた。各皮膚切片は適切であると同定された(例えば、動物の同定、研究の数、日時など)。試料は、試験するまで、約−70℃以下に維持された。
各皮膚切片は、防水プラスチックバッグ中に配置され、約30℃〜約35℃のウォーターバスの中で融解された。一旦融解すると、各皮膚切片は、蒸留脱イオン水で穏やかにすすがれ、いかなる残りの表面投薬および血液も除去された。すべての皮下組織(例えば、脂肪)は、丘疹性皮膚のレベルまで、外科用メスによって除去された。
次いで、各皮膚切片は、約10〜25%の表面の輝きが観察されるまで、約10〜約20回、テープストリップ(3M製TRANSPORE(商標))を行った。このプロセスは、角質層およびいかなる残りの表面投薬も除去した。
各々の完全皮膚シート上で、6つの領域がインクで境界を定められた。境界を定められた領域は1cm2の面積であった。
各皮膚切片は、防水プラスチックバッグ中に配置し、約65℃(+/−3℃)ウォーターバスに浸漬し、真皮から表皮の分離プロセスを開始した。次いで、試験部位がパンチによって皮膚シートから切除され、表皮がピンセットによって真皮から取り出された。個々の皮膚切片は秤量され、重量が記録された。個々の皮膚切片は外科用メスでみじん切りされ、あらかじめラベルを付けたチューブに配置し、そして引き続く分析のために保管された。
皮膚試料は、イソプロパノール(IPA)中で、シェーカー上で約47時間抽出され、次いで、さらに処理されるまで、約−20℃で保存された。次いで、これらの試料は、約13,500rpmで約10分間、遠心分離され、そして上清は2mL褐色バイアルに収集された。
CoQ10の定量は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC−UV)によって実施された。手短に述べると、HPLCは、Agilent 1100シリーズLC/MSDを伴ったHewlett−Packard 1100シリーズHPLCシステム上で行われた。約65%エタノールおよび約35%メタノールを含む溶媒系が、Aquasil C18カラム(約3mm×約100m、5μ)を通して、約1mL/分の流速で流された。10マイクロリットルの試料が注入された。ピーク面積は、未処理の標準から準備された外部標準曲線を使用して濃度に対して定量された。この曲線は、水中のCoQ10の溶解度の問題に起因して、IPAにスパイクを生じた。
ミニブタ皮膚におけるCoQ10含量についての結果は、図1および2、ならびに以下の表19および20に要約されている。皮膚切片あたり6つの複製が組織重量に対して補正され、そして平均化されて、各投薬部位についての平均が得られた。
このデータは、測定可能な量のCoQ10が、すべての表皮試料および選択された真皮試料において観察されたことを示した。
表皮についてのすべての投薬部位は、非投薬部位よりも有意に高いレベルでCoQ10を含むことが見い出された(p<0.001)。
雄性または雌性のいずれかのブタ皮膚切片において、3つの投薬濃度にわたって、CoQ10表皮含量の間で有意な違いはなかった(p>0.02)。
雄性ブタと雌性ブタの間で、動物の右側からの部位については(1日投与)、雄性皮膚からの1.5%CoQ10および5%CoQ10適用用量についての表皮含量は、雌性皮膚中で見られたものよりも顕著に高かったが(p<0.003)、しかし、3%CoQ10投薬についてはそうではなかった(p=0.0329)。したがって、データから見ることができるように、単回用量ベースでのCoQ10の浸透は、エトキシジグリコール製剤について、ブチレングリコール製剤よりも有意に高かった(1.5%および5%用量についてp<0.003、3%用量についてp=0.0329)。
雄性と雌性の両方の皮膚切片についての表皮レベルは、3つすべての用量適用について、7日間の投薬期間の間(左側)、統計学的に同一であった。
真皮含量は、7日間の投薬期間からの1.5%CoQ10および5%CoQ10用量適用(左側)、ならびに1日間の投薬期間からの1.5%CoQ10用量適用(右側)については、雄性皮膚切片においてのみ観察された。
表21から皮膚の全体の領域までデータを外挿する場合、CoQ10の浸透は表22において以下に示される通りである。
CoQ10クリーム製剤の単回適用は、それぞれ、5%、3%、および1.5%CoQ10クリーム製剤について、適用された用量の平均で12%、17%、または70%を送達した。一般的に、単回用量ベースでのCoQ10の浸透は、エトキシジグリコール製剤について、ブチレングリコール製剤と比較して有意に高かった(1.5%および5%用量についてはp<0.003であり、ならびに3%用量についてはp=0.0329)。データは、3%CoQ10までの適用濃度を用いて、表皮含量の上昇が存在し、5%CoQ10用量は3%CoQ10用量と本質的に等しいことを示した。このことは、3%CoQ10用量において皮膚がCoQ10で飽和されるようになること、またはビヒクルが3%CoQ10濃度より上ではより多くのCoQ10を送達が不可能であったことを示唆する。7日間の局所投与後に皮膚において達成されたレベルは2匹の動物間で同一であったことが見られ得る。
エトキシジグリコール製剤について、および単回適用データについては、それぞれ、1.5%、3%、および5%エトキシジグリコール含有クリームについて、73.8%、16.6%、および13.3%の平均浸透が得られた。
興味深くかつ予測されなかった知見は、試験されたCoQ10の最小用量である1.5%クリームについて、表皮で見い出された不釣り合いな量のCoQ10であった。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、このCoQ10の浸透の増強は、クリーム製剤中のエトキシジグリコールに対するCoQ10の比率の関数であるのかもしれず、または、おそらく、CoQ10およびリン脂質リポソームに対するエトキシジグリコールの比率に関するかもしれない。より低い濃度のCoQ10を含むクリーム中で使用されるCoQ10に対するエトキシジグリコールの比較的高い比率は、表皮で見い出されるより高い量のCoQ10の原因であり得る。
1.5%クリームおよび3%クリームはまた、9週間の加速試験(約35℃および約50℃で保存)を首尾よく完了し;プラスチックジャーと金属チューブパッケージングの両方でパッケージされた5回の凍結−融解サイクルを通過し;そしてUSP微生物学的チャレンジ試験を通過した。結果は、複数の発色バッチを用いて、そしてクリームプロトタイプ製剤ベース中での1.5重量%、3重量%、および5重量%のCoQ10濃度で、同じ系について確認された。
実施例25:CoQ10 21%濃縮物を使用するCoQ10クリーム(1.5%、3.0%、および5.0%)を形成する方法
クリームは、ペンチレングリコール(1,2−ペンタンジオール;ハイドロライト−5,Symrise)の代わりにプロピレングリコールが利用されたこと以外は、上記の実施例3に記載されたのと同様に製造された。濃縮物は、上記の実施例1に記載されたように最初に製造され、成分は表23において以下に列挙されている。
クリームは、ペンチレングリコール(1,2−ペンタンジオール;ハイドロライト−5,Symrise)の代わりにプロピレングリコールが利用されたこと以外は、上記の実施例3に記載されたのと同様に製造された。濃縮物は、上記の実施例1に記載されたように最初に製造され、成分は表23において以下に列挙されている。
得られたCoQ10濃縮物(CoQ10 21%濃縮物)は、約21重量%の濃度でCoQ10を有した。
1.5重量%CoQ10 21%濃縮物を有するクリーム、および3重量%CoQ10 21%濃縮物を有する別のクリームが、実施例3において上記に記載されるように、表25および26において以下に列挙される成分を用いて調製された。
実施例26:プロピレングリコールを含むCoQ10 21%濃縮物を形成する方法
CoQ10 21%濃縮物組成物は、以下に記載されるように、A相およびB相を合わせることによって調製された。A相は、ユビデカレノンUSP(CoQ10)を21%w/wで、およびポリソルベート80NFを25%w/wで含んだ。B相は、プロピレングリコールUSPを10.00%w/wで、フェノキシエタノールNFを0.50%w/wで、レシチンNF(ホスホリポン85G)を8.00%w/wで、および精製水USPを35.50%w/wで含んだ。すべての重量パーセンテージは、全体のCoQ10 21%濃縮物組成物の重量に対してである。それらのパーセンテージおよびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
CoQ10 21%濃縮物組成物は、以下に記載されるように、A相およびB相を合わせることによって調製された。A相は、ユビデカレノンUSP(CoQ10)を21%w/wで、およびポリソルベート80NFを25%w/wで含んだ。B相は、プロピレングリコールUSPを10.00%w/wで、フェノキシエタノールNFを0.50%w/wで、レシチンNF(ホスホリポン85G)を8.00%w/wで、および精製水USPを35.50%w/wで含んだ。すべての重量パーセンテージは、全体のCoQ10 21%濃縮物組成物の重量に対してである。それらのパーセンテージおよびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
フェノキシエタノールおよびプロピレングリコールは、適切な容器に配置され、透明になるまで混合された。必要量の水が第2の容器に加えられた(混合タンク1)。混合タンク1は、混合しながら、45℃〜55℃の間に加熱された。フェノキシエタノール/プロピレングリコール溶液が水に加えられ、これが透明かつ均一になるまで混合された。混合タンク1中の内容物が45〜55℃の範囲内にあるとき、低速〜中速で混合しながら、ホスホリポンGが加えられた。いかなる発泡も回避しながら、混合タンク1の内容物は、ホスホリポン85Gが均質に分散されるまで混合された。ポリソルベート89は適切な容器に加えられ(混合タンク2)、50〜60℃の間に加熱された。次いで、ユビデカレノンが混合タンク2に加えられた。50〜60℃の間の温度を維持しながら、混合タンク2は、すべてのユビデカレノンが溶解されるまで混合された。すべてのユビデカレノンが溶解された後、水相はゆっくりと混合タンク2に移された。すべての材料が合わされたとき、分散液が滑らかかつ均質になるまで、内容物はホモジナイズされた。過熱しないように注意を払いながら、温度は50〜60℃に維持された。次いで、均質化は停止され、混合タンク2の内容物は保存のために適切な容器に移された。
実施例27:プロピレングリコールを含むCoQ10 21%濃縮物の0.5kgバッチを形成する方法
0.5kgのCoQ10 21%濃縮物組成物が、以下に記載されるように、A相およびB相を合わせることによって調製された。A相は、ユビデカレノンUSP(CoQ10)を21%w/wで、およびポリソルベート80NFを25%w/wで含んだ。B相は、プロピレングリコールUSPを10.00%w/wで、フェノキシエタノールNFを0.50%w/wで、レシチンNF(ホスホリポン85G)を8.00%w/wで、および精製水USPを35.50%w/wで含んだ。すべての重量パーセンテージは、全体のCoQ10クリーム21%濃縮物組成物の重量に対してである。それらのパーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
0.5kgのCoQ10 21%濃縮物組成物が、以下に記載されるように、A相およびB相を合わせることによって調製された。A相は、ユビデカレノンUSP(CoQ10)を21%w/wで、およびポリソルベート80NFを25%w/wで含んだ。B相は、プロピレングリコールUSPを10.00%w/wで、フェノキシエタノールNFを0.50%w/wで、レシチンNF(ホスホリポン85G)を8.00%w/wで、および精製水USPを35.50%w/wで含んだ。すべての重量パーセンテージは、全体のCoQ10クリーム21%濃縮物組成物の重量に対してである。それらのパーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
すべての装置は清浄かつ衛生的であった。ポリソルベート80は、PK−2ケトル中で直接的に秤量され、真空ケトルPK−2中で50〜55℃に加熱された。ユビデカレノンUSPは実験台上で秤量され、重量は、風袋付きPK−2容器に加えることによってダブルチェックされた(撹拌機オフ)。PK−2は閉じられ、密封された。閉じられ、密封されたPK−2は、50〜55℃温度および真空オンで15分間維持しながら、低速のスィープミキサーを用いて混合された。すべての粉末がポリソルベートに溶解したことを保証するために、次の段階に移動する前に相が試験された。PK−1において、水の必要量が加えられ、50〜55℃に加熱された。実験台上で、フェノキシエタノールおよびハイドロライト−5が秤量され、透明かつ均一になるまで混合され、そして中速で混合しながら、透明かつ均一になるまで、水が加えられた。上記の水混合液が50〜55℃に到達したとき、レシチンが低速から中速で混合しながら、発泡を回避しながら加えられ、分散するまで混合された。水相はPK−1から5ガロン容器に移された。50〜55℃の水相とCoQ10相の両方を用いて、水相は、中速スウィープ混合を用いてCoQ10相に加えられた。一旦、すべての材料がPK−2に移されると、バッチは、標準剪断ヘッドを用いるSilversonを通して、7000rpmで3〜5分間、閉鎖したPK−2容器および真空オンを用いて、再循環された。温度は50〜55℃に維持され、過熱は許容されなかった。再循環は停止され、バッチは中速スウィープ混合を用いて30〜35℃に冷却された。濃縮液は一次輸送容器にポンプで送られた。
実施例28:プロピレングリコールを含むCoQ10 21%濃縮物の20kgバッチを調製する方法
CoQ10 21%濃縮物の20kgバッチが、A相、B相、およびC相の成分を合わせることによって調製された。A相はポリソルベート80NFを25.00%w/wで、およびユビデカレノンUSPを21.00%w/wで含んだ。B相は、プロピレングリコールUSPを10.00%w/wで、およびフェノキシエタノールNFを0.50%w/wで含んだ。C相は、精製水USPを35.50%w/wで、およびレシチンNFを8.00%w/wで含んだ。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表において提示される。
CoQ10 21%濃縮物の20kgバッチが、A相、B相、およびC相の成分を合わせることによって調製された。A相はポリソルベート80NFを25.00%w/wで、およびユビデカレノンUSPを21.00%w/wで含んだ。B相は、プロピレングリコールUSPを10.00%w/wで、およびフェノキシエタノールNFを0.50%w/wで含んだ。C相は、精製水USPを35.50%w/wで、およびレシチンNFを8.00%w/wで含んだ。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表において提示される。
CoQ10 21%濃縮物の20kgバッチを調製する際に、領域は洗浄され、清浄であることが確認された。すべての装置は洗浄され、有効期限/較正の範囲内にあった。100.0gmフェノキシエタノールが秤量され、清浄なビーカーに配置された。
B相を調製するために、2000グラム(2,000gm)のプロピレングリコールが秤量され、清浄な2−L SSビーカーに配置された。さらに、2000gmの精製水が秤量され、「すすぎ用水」とラベルされた清浄容器に配置された。
あらかじめ秤量した2,000gmプロピレングリコールを含む2−L SSビーカーに、あらかじめ秤量した100gmフェノキシエタノールが加えられた。フェノキシエタノールを含んだビーカーは、すすぎ用水の1/3を用いて2−Lビーカー中にすすがれた。2−Lビーカーの内容物は、透明および均一になるまでスパチュラで混合し、B相とラベルされた。
続く工程において、1,600gmのレシチンが秤量され、5,100gmの精製水が秤量された。適切にラベルされたチャートが、PK−1については温度レコーダーTIC−1に、PK−2についてはTIC−2に配置された。5,100gmの精製水がPK−1に加えられ、そして水は、PK−1においては、手動で50〜55℃に加熱された。撹拌機はオンにされ、わずかなボルテックスが維持された。次いで、B相溶液が、2−L SSビーカーからPK−1にゆっくりと加えられた。次いで、SSビーカーは、すすぎ用水の約1/3を用いてすすがれた。すすぎ液がPK−1にゆっくりと加えられた。温度は手動で50〜55℃に維持された。次いで、レシチンNFがゆっくりと加えられ、これが分散されるまで混合された。温度は手動で50〜55℃に維持され、B相がPK−2への移動のための準備ができるまで、混合は継続された。
A相を調製するために、5,000gmのポリソルベート80が清浄容器に秤量および配置され、一方、4,200gmのユビデカレノンUSPが秤量された。濃縮物を混合するために、設備は、Lee真空タンク(PK−2)、Silversonホモジナイザー(P−2)、およびWaukeshaポンプ(P−1)を備えた。最初に、PK−2のボトムバルブが閉じていることが確認された。次いで、あらかじめ秤量された5,000gmのポリソルベート80が点検窓入り口を通してPK−2に加えられた。点検窓は、添加が完了した後、PK−2上で交換された。
次いで、PK−2撹拌機がオンにされ、ポリソルベート80はPK−2の中で手動で50〜55℃に加熱された。ポリソルベート80の温度がこの温度範囲に達したとき、4,200gmのあらかじめ秤量されたユビデカレノンUSPが、PK−2のアクセス入り口を通して加えられた。スパチュラが使用されて、添加の間に撹拌ブレードにこびりついたいかなるユビデカレノンも除去された。添加が完了されたとき、点検窓は交換された。温度は、50〜55℃の間に手動で維持され、15分間混合された、PK−2の内容物は、点検窓入り口を通して検査され、ユビデカレノンがポリソルベート80に溶解されたか否かが評価された。次いで、PK−1撹拌機(A−1)はオフにされた。
PK−2のアクセス入り口を通して、PK−1の内容物(B相)がPK−2に加えられた。次いで、PK−1は、残りの「すすぎ用水」ですすがれた。PK−2は50〜55℃に手動で加熱された。次いで、PK−2の内容物は、P−1およびP−2を通して、P−2中のSilverson高剪断スクリーンを用いて、最大rpmで5〜10分間、再循環された。真空がオンにされ、発泡を回避するために最大で維持された。温度は手動で50〜55℃に維持された。
4つの試料が取り出された:2つの30gm試料は微量試験のためであり、2つの400gm試料は物理/化学試験のためであった。1つのセットの試料は保管とラベルされた。次いで、生成物は清浄なHDPE上端閉鎖容器に移された。バッチサイズは20,000gmであった。
実施例29:CoQ10クリーム1.5%を調製する方法
CoQ10クリーム1.5%組成物は、以下に記載されるようにA相−E相を合わせることによって調製された。A相は、アルキルC12−15ベンゾエートNFを5.000%w/wで、セチルアルコールNFを2.000%w/wで、ステアリン酸グリセリル/PEG−100ステアリン酸を4.5%w/wで、およびステアリルアルコールNFを1.5%w/wで含んだ。パーセンテージおよび量は以下の表において反映される。
CoQ10クリーム1.5%組成物は、以下に記載されるようにA相−E相を合わせることによって調製された。A相は、アルキルC12−15ベンゾエートNFを5.000%w/wで、セチルアルコールNFを2.000%w/wで、ステアリン酸グリセリル/PEG−100ステアリン酸を4.5%w/wで、およびステアリルアルコールNFを1.5%w/wで含んだ。パーセンテージおよび量は以下の表において反映される。
B相は、ジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルNFを5.000%w/w、グリセリンUSPを2.000%w/w、プロピレングリコールUSPを1.750%w/w、フェノキシエタノールNFを0.463%w/w、精製水USPを11.377%w/w、およびカルボマー分散液2%を50%w/w含んだ。パーセンテージおよび量は以下の表において反映される。
C相は、乳酸USPを0.400%w/w、乳酸ナトリウム溶液USPを2.000%w/w、トロラミンNFを1.300%w/w、および精製水USPを4.210%w/wで含んだ。パーセンテージおよび量は以下の表において反映される。
D相は二酸化チタンUSPを1.000%w/w含んだ。E相はCoQ10 21%濃縮物、21%を7.500%w/wで加えた。すべての重量パーセンテージは全体の1.5%CoQ10クリーム組成物の重量に対してである。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に反映される。
CoQ10クリーム1.5%組成物を調製する際に、A相成分は適切な容器に加えられ、ウォーターバス中で70〜80℃の間に加熱された。カルボマー分散液を除くB相成分はPK−2ケトルに加えられ、70〜80℃の間に加熱されながら中速のスウィープ混合で混合される。C相成分は適切な容器に加えられ、ウォーターバス中で70〜80℃の間に加熱された。E相CoQ10濃縮物は適切な容器中に配置され、均一性を保証するために必要に応じて混合しながら、ウォーターバスを使用して50〜60℃の間で融解された。カルボマー分散液は適切な容器(混合タンク)に加えられ、混合しながら70〜80℃の間に加熱された。混合することを継続しながら、B相成分は、温度を維持しながら、混合タンク中の加熱したカルボマー分散液に加えられた。混合することを継続しながら、C相成分は、温度を維持しながら混合タンクの内容物に加えられた。この混合タンクは、継続的に混合され、ホモジナイズされた。次いで、ミキサーはオフにされたが、混合タンクにD相成分を加えながら、均質化が継続された。次いで、ミキサーはオンにされ、完全に均一かつ十分に引き伸ばされるまで、成分が混合およびホモジナイズされた(色をチェックする)。次いで、均質化が停止され、バッチは50〜60℃の間に冷却された。次いで、ミキサーはオフにされ、融解したCoQ10濃縮物が混合タンクに加えられた。次いで、ミキサーはオンにされ、分散液が滑らかかつ均一になるまで、内容物が混合/再循環された。次いで、混合タンクの内容物は、45〜50℃の間に冷却された。次いで、冷却された内容物は、パッケージングまで、保存のために適切な容器に移された。
実施例30:CoQ10クリーム1.5%の0.5kgバッチを調製する方法
1.5%CoQ10クリーム組成物は以下に記載されるようにA相−E相を合わせることによって調製された。A相は、アルキルC12−15ベンゾエートNFを5.000%w/wで、セチルアルコールNFを2.000%w/wで、ステアリン酸グリセリル/PEG−100ステアリン酸を4.5%w/wで、およびステアリルアルコールNFを1.5%w/wで含んだ。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に反映される。
1.5%CoQ10クリーム組成物は以下に記載されるようにA相−E相を合わせることによって調製された。A相は、アルキルC12−15ベンゾエートNFを5.000%w/wで、セチルアルコールNFを2.000%w/wで、ステアリン酸グリセリル/PEG−100ステアリン酸を4.5%w/wで、およびステアリルアルコールNFを1.5%w/wで含んだ。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に反映される。
B相は、ジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルNFを5.000%w/w、グリセリンUSPを2.000%w/w、プロピレングリコールUSPを1.750%w/w、フェノキシエタノールNFを0.463%w/w、精製水USPを11.377%w/w、およびカルボマー分散液2%を50%w/w含んだ。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に反映される。
C相は、乳酸USPを0.400%w/w、乳酸ナトリウム溶液USPを2.000%w/w、トリエタノールアミンNFを1.300%w/w、および精製水USPを4.210%w/w含んだ。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に反映される。
D相は二酸化チタンUSPを1.000%w/w含んだ。一方E相はCoQ10濃縮物、21%を7.500%w/wで含んだ。すべての重量パーセンテージは全体の1.5%CoQ10クリーム組成物の重量に対してである。パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表に反映される。
1.5%CoQ10クリーム組成物を調製する際に、A相成分は秤量され、ウォーターバス中で70〜75℃の間に加熱された。B相成分はPK−2ケトルに加えられ、70〜75℃の間に加熱されながら、中速のスウィープ混合で混合された。B相が70〜75℃に到達したとき、A相が中速のスウィープ混合で70〜75℃で加えられた。次いで、A相とB相がSilversonを通して再循環された。C相成分は秤量され、均質になるまで混合され、60〜65℃に加熱された。次いで、C相成分は、中速から高速でスウィープミキサーを用いてPK−2ケトルに加えられた。混合することを継続しながら、D相はPK−2ケトル中のバッチに加えられた。このバッチは、10分間または完全に均一になりかつ十分に引き伸ばされるまで、Silversonを通して継続して混合および再循環された。
循環は中断され、バッチは培地上のスウィープミキサーを用いて50〜55℃の間に冷却された。E相成分を45〜50℃の間にあたためた後、これらはバッチに加えられ、バッチは、均一になるまで、中速で真空を用いて混合された。温度は50℃に維持された。次いで、バッチは低速から中速の混合および真空を用いて、30〜35℃まで冷却された。次いで、バッチはポンプで保持容器まで送られた。
実施例31:20kgバッチCoQ10クリーム1.5%を調製する方法
CoQ10クリーム1.5%組成物の20kgバッチは、A相−E相の成分を合わせることによって調製された。各層についての成分の重量パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表において提示される。
CoQ10クリーム1.5%組成物の20kgバッチは、A相−E相の成分を合わせることによって調製された。各層についての成分の重量パーセンテージ、量、およびさらなる詳細は以下の表において提示される。
化学物質は、秤量パンにこぼれることを防ぐよう特別な注意を払いながら秤量された。最初に200gmの二酸化チタン(D相)が秤量された。次いで、600gmの精製水が秤量され、「すすぎ用水−B相」とラベルされた。
A相成分を調製する際に、1000gmのトリカプリン酸グリセリル/トリカプリル酸グリセリル、400gmのセチルアルコールNF、300gmのステアリルアルコールNF、および900gmのステアリン酸グリセリル/PEG−100が秤量された。次いで、これらのあらかじめ秤量されたA相成分は4−L SSビーカーに加えられ、容器はA相とラベルされた。このプレミックスは24時間以内に使用されなければならないことに注意のこと。次いで、A相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
B相を調製する際に、10,000gmのカルボマー分散液2%が、実施例11Aにおけるように秤量された。さらに、400gmのグリセリンUSP、350gmのプロピレングリコール、1,000gmのジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルNF、および93gmフェノキシエタノールNFが秤量された。1675gmの精製水が秤量され、容器は「B相用精製水」とラベルされた。これらのあらかじめ精製されたB相成分は10−L SSビーカーに加えられ、B相とラベルされた。このプレミックスは24時間以内に使用されなければならないことに注意のこと。B相容器の内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。次いで、B相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
C相を調製する際に、260gmのトリエタノールアミンNF、400gmの乳酸ナトリウム溶液USP、60%、842gmの精製水(「C相用精製水」とラベルされた)、および80gmの乳酸USPが秤量された。次いで、これらのあらかじめ秤量されたC相成分は、以下の順番で2−L SSビーカーに加えられた:(1)260gmのトリエタノールアミン、(2)400gm乳酸ナトリウム溶液、60%、(3)842gmC相用精製水USP、および(4)80gm乳酸USP。このプレミックスは24時簡以内に使用されなければならないことに注意のこと。次いで、C相容器の内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。次いで、C相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
E相を調製する際に、1500gmのCoQ10 21%濃縮物が秤量され、E相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
20kgバッチのCoQ10クリーム1.5%を調製する際に、2つのウォーターバスが必要とされた。A相ビーカーは70〜75℃に設定したウォーターバスに配置され、内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。次いで、C相ビーカーは60〜65℃に設定したウォーターバスに配置され、C相ビーカーの内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。同様に、E相ビーカーはウォーターバスに配置され、50〜55℃に設定された。E相容器の内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。
使用されるさらなる設備には、ウォーターバス(E−1)、Lee真空タンク(PK−2)、Waukeshaポンプ(P−1)、およびSilversonホモジナイザー用四角穴高剪断スクリーンが含まれた。
最初に、PK−2のバルブの底が閉じていること、およびPK−2が適切にシールされていることが確認された。次いで、点検窓がPK−2から取り外された。次いで、あらかじめ秤量した10,000gmのカルボマー分散液2.0%が、点検窓入り口を通してPK−2に加えられた。スパチュラが使用されて、カルボマー分散液2.0%がその容器の壁面から移された。次いで、PK−2用のTIC−2(温度記録装置)がオンにされ、適切な操作を保証するためにチェックされた。次いで、PK−2(A−2)用の撹拌機はオンにされ、PK−2中のカルボマー分散液2.0%は蒸気ジャケットを用いて70〜80℃に加熱された。真空がオフにされた。次いで、点検窓がPK−2から取り外され、SSビーカーからのB相は、点検窓入り口を通してPK−2にゆっくりと加えられた。次いで、B相容器は、「B相すすぎ用水」ですすがれた。このすすぎ液は、点検窓入り口を通してPK−2に加えられた。次いで、A相がゆっくりとPK−2に加えられた。スパチュラが使用されて、SSビーカーの壁面からのいかなるA相も移された。PK−2に加えられるとき、A相の温度は70〜80℃の間でなければならないことに注意のこと。次いで、PK−2からの底バルブが開かれた。P−1(Waukeshaポンプ)およびP−2(Silversonホモジナイザー)はオンにされ、PK−2(真空タンク)の内容物がホモジナイズされた。C相は、アクセスポートを通してゆっくりとPK−2に加えられた。PK−2に加えられるとき、温度は70〜80℃の間でなければならないことに注意のこと。次いで、均質化が5分間よりも長く、次いで、A−2(撹拌機)がオフにされたことが確実にされた。あらかじめ秤量した200.0gm二酸化チタンのD相が、100メッシュふるいを通してPK−2にゆっくりとふるい掛けされた。スパチュラが使用されて、PK−2のブレードにこびりついたいかなる二酸化チタンも除去された。
次いで、点検窓が取り外され、A−2がオンにされた。内容物は、P−1(Waukeshaポンプ)およびP−2を通して再循環しながら、継続して混合された。内容物は、10分間、または完全に均質かつ十分に引き伸ばされるまで(色がチェックされた)ホモジナイズされた。P−2は10分後に停止された。PK−2の内容物は50〜60℃に冷却された。点検窓は取り外され、融解したCoQ10 21%濃縮物(E相、実施例7Aにおけるのと同様)がPK−2にゆっくりと加えられた。次いで、点検窓が取り外された。
PK−2の内容物は、均一になるまで混合され、P−1を通して再循環された。温度は50〜60℃に維持された。窒素NFフローが開始され、次いで、C−2(真空ポンプ)はオンにされた。生成物の発泡を回避することが最もよいことに注意のこと。次いで、バッチは45〜50℃に冷却され、真空と窒素NFの両方がオンにされた。生成物がその温度まで冷却されたとき、C−2はオフにされ、窒素NFを用いていかなる真空も取り除かれた。窒素NF流はオンのままであった。次いで、出口バルブは、試料を収集することまたは生成物をパッケージングすることの前に生成物でパージされた。生成物は、あらかじめ秤量し、清浄な、HDPE閉鎖トップ容器に移された。A−2、P−1、および窒素NF流はオフにされ、バッチは完了され、そしてTIC−2チャート上に示された。
2つの30gm(最少)試料が微量試験のために取り出され、2つの400gm(最少)試料が物理/化学試験のために取り出された。1セットの試料が「保持」とラベルされた。満たされた容器は秤量された。生じたバッチサイズは20,000gmであった。
実施例32:18kgバッチのカルボマー分散液2%を調製する方法
18kgバッチのカルボマー分散液2.0%組成物が、以下に記載されるようなA相−C相を合わせることによって調製された。A相は、プロピレングリコールUSPを0.50%w/wおよびフェノキシエタノールNFを5.00%w/wで含んだ。B相は精製水USPを92.50%w/wで含み、一方、C相はカルボマー940NFを2.00%w/wを含んだ。すべての重量パーセンテージは、全体のCoQ10クリーム2.0%組成物の重量に対してである。成分のパーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
18kgバッチのカルボマー分散液2.0%組成物が、以下に記載されるようなA相−C相を合わせることによって調製された。A相は、プロピレングリコールUSPを0.50%w/wおよびフェノキシエタノールNFを5.00%w/wで含んだ。B相は精製水USPを92.50%w/wで含み、一方、C相はカルボマー940NFを2.00%w/wを含んだ。すべての重量パーセンテージは、全体のCoQ10クリーム2.0%組成物の重量に対してである。成分のパーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
適切な容器中で、透明および均一になるまで、A相成分が混合された。第2の容器(混合タンク)に、B相の精製水が加えられた。精製水の一部(「すすぎ用水」)がA相容器をすすぐために保持された。第2の容器中の水が60〜65℃の間に加熱された。A相成分はB相の水に加えられ、「すすぎ用水」はA相容器をすすぐために使用された。次いで、透明かつ均一になるまで、A相容器の内容物は混合された。相Cのカルボマー940を混合タンクにゆっくりと加えながら(振りかけながら)、ミキサースピードは増加された。すべての粉末が徹底的に分散され、「斑点」が存在しなくなるまで、混合は継続された。温度は60〜65℃の間に維持された。次いで、内容物は保存のために適切な容器に移された。
実施例33:3kgバッチのカルボマー分散液2%を調製する方法
3kgバッチのカルボマー分散液2.0%組成物は、以下に記載されるA相−C相を合わせることによって調製された。A相は、プロピレングリコールUSPを5.00%w/wおよびフェノキシエタノールNFを0.50%w/wで含んだ。B相は精製水USPを92.50%w/wで含み、一方、C相はカルボマー940NFを2.00%w/wを含んだ。すべての重量パーセンテージは、全体のCoQ10クリーム2.0%組成物の重量に対してである。パーセンテージ、量およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
3kgバッチのカルボマー分散液2.0%組成物は、以下に記載されるA相−C相を合わせることによって調製された。A相は、プロピレングリコールUSPを5.00%w/wおよびフェノキシエタノールNFを0.50%w/wで含んだ。B相は精製水USPを92.50%w/wで含み、一方、C相はカルボマー940NFを2.00%w/wを含んだ。すべての重量パーセンテージは、全体のCoQ10クリーム2.0%組成物の重量に対してである。パーセンテージ、量およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
すべての設備は清浄化および消毒された。実験台上で、A相成分は透明および均一になるまで混合された。水の必要量は秤量され、ケトルPK−1(相容器)に加えられた。PK−1中の水は、熱水/蒸気ジャケットで60〜65℃に加熱された。A相は透明かつ均一になるまで、中速の撹拌でB相の水に加えられた。A相容器は、60〜65℃の温度を維持しながら、処理水相ですすがれた。混合は、すべての粉末が徹底的に分散され、「斑点」が存在しなくなるまで、中速から高速撹拌で継続された。内容物は、微量品質、pH、比重、および粘度のためにサンプリングされた。次いで、バッチは、明細書内のpH、比重、および粘度に基づいて、清浄かつ消毒された5ガロンの閉鎖トップカーボイにポンプされた。
実施例34:18kgバッチのカルボマー分散液2%を調製する方法
18kgバッチのカルボマー分散液2%は、A相、B相、およびC相の成分を合わせることによって調製された。A相は、フェノキシエタノールNFを0.50%w/w、プロピレングリコールUSPを5.00%w/w、精製水USPを92.50%w/wおよびカルボマー940NFを2.00%w/w含んでいた。
18kgバッチのカルボマー分散液2%は、A相、B相、およびC相の成分を合わせることによって調製された。A相は、フェノキシエタノールNFを0.50%w/w、プロピレングリコールUSPを5.00%w/w、精製水USPを92.50%w/wおよびカルボマー940NFを2.00%w/w含んでいた。
このバッチ調製物中で使用される設備は、Sartorius Balance,Mettler Balance,Chart Recorder,Lee Phase Tank、および2−Lステンレス鋼(SS)ビーカーを含んだ。
成分を秤量する前に、製造領域は清浄化され、清浄であることが確認された。すべての設備は同様に清浄化され、清浄であることが確認され、有効期限/較正の範囲内にあった。はかりの較正はチェックおよび記録された。秤量容器は秤量パンにこぼれることを回避するために風袋が計られた。最初に、1,650gmの精製水が秤量され、「すすぎ用水」とラベルされた容器の中に配置された。別の15,000gmの精製水もまた秤量された。360gmのカルボマー940NFもまた秤量された。
A相は、90gmのフェノキシエタノールをビーカーに秤量することによって調製された。次いで、900gmのプロピレングリコールUSPが、2−L SSビーカーに秤量された。次いで、あらかじめ秤量されたフェノキシエタノールNFが、あらかじめ秤量されたプロピレングリコールを含有する2−L SSビーカーに加えられた。ビーカー中に残るフェノキシエタノール残渣は、「すすぎ用水」の約1/3ですすがれた。次いで、容器はA相とラベルされた。プレミックスは24時間以内に使用されなければならばいことに注意のこと。
A相は、透明かつ均一になるまでスパチュラで混合された。スパチュラは、「すすぎ用水」の1/3ですすぎながら取り出した。
A相の調製後、分散液は、Lee Phase Tank(PK−1)を使用して混合された。適切なラベルされたチャートがTIC−1(温度レコーダー)に配置された。TIC−1(Honeywell Temperature Recorder)がオンにされ、適切に操作することを確実にした。一旦、PK−1の底バルブが閉じていることが確認されたら、あらかじめ秤量した精製水USPがPK−1に加えられた。SSビーカーは、残りの「すすぎ用水」でPK−1にすすがれた。
撹拌機が中速までオンにされ、PK−1の内容物が、熱水/蒸気ジャケットを用いて60〜65℃まで加熱された。受容可能な範囲には、55〜70℃もまた含まれる。撹拌機は、しぶきを引き起こすことない最高速に設定された。あらかじめ秤量したカルボマー940NFは、少なくとも15分間、しかし20分間を超えないような時間の間にわたって、50メッシュふるいを通して、PK−1に均一にふるい掛けされた。標的とされた温度は60〜65℃であったが、しかし、受容可能な範囲は55〜70℃であった。次いで、撹拌機は高速までオンにされた。すべての粉末が徹底的に分散されかつ「斑点」が存在しなくなるまで、少なくとも1時間、高速撹拌で、混合が継続された。スパチュラが使用されて、端に付着されたいかなる粉末も分散してボルテックスした。
分散液の2つの30gm試料が微量試験のために、2つの400gmセールス(sales)が物理/化学試験のために取り出された。1つのセットは「保持」とラベルされた。次いで、生成物は清浄なHDPE閉鎖トップ容器に移された。得られたバッチサイズは18,000gmであった。
実施例35:CoQ10 21%濃縮物およびアルキルベンゾエートを含むCoQ10クリーム3%を調製する方法
CoQ10クリーム3.0%組成物は、以下の相を合わせることによって調製された。A相は、アルキルC12−15ベンゾエートNFを4.00%w/wで、セチルアルコールNFを2.00%w/wで、ステアリン酸グリセリル/PEG−100ステアリン酸を4.50%w/wで、およびステアリルアルコールNFを1.5%w/wで含んだ。パーセンテージ、量およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
CoQ10クリーム3.0%組成物は、以下の相を合わせることによって調製された。A相は、アルキルC12−15ベンゾエートNFを4.00%w/wで、セチルアルコールNFを2.00%w/wで、ステアリン酸グリセリル/PEG−100ステアリン酸を4.50%w/wで、およびステアリルアルコールNFを1.5%w/wで含んだ。パーセンテージ、量およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
B相は、ジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルNFを5.00%w/w、グリセリンUSPを2.00%w/w、プロピレングリコールUSPを1.50%w/w、フェノキシエタノールNFを0.475%w/w、精製水USPを16.725%w/w、およびカルボマー分散液、2%を40%w/w含んだ。成分のパーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
C相は乳酸USPを0.50%w/w、乳酸ナトリウム溶液USPを2.00%w/w、トリエタノールアミンNFを1.30%w/w、および精製水USPを2.50%w/w含んだ。成分のパーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
すべての重量パーセントは、全体のCoQ10クリーム3.0%組成物の重量に対してである。
A相成分は適切な容器に加えられ、ウォーターバス中で70〜80℃の間に加熱された。カルボマー分散液を含まないB相成分は、適切な容器に加えられ、混合された。C相成分もまた、適切な容器に加えられ、次いでウォーターバス中で70〜80℃の間に加熱された。E相のCoQ10濃縮物は適切な容器に配置され、ウォーターバスを使用して、50〜60℃の間で融解された。これらの成分は、必要に応じて均一性を確実にするために混合された。次いで、カルボマー分散液は、適切な容器(混合タンク)に加えられ、混合されながら、70〜80℃の間に加熱された。成分が混合されながら、B相成分は、温度を維持しながら混合タンクの内容物に加えられた。内容物は、継続して混合され、ホモジナイズされた。次いで、ミキサーがオフにされ、しかし、均質化は持続された。均質化が継続されながら、D相の二酸化チタンが混合タンクに加えられた。次いで、ミキサーがオンにされ、内容物は混合され、完全に均一かつ十分に引き伸ばされるまでさらにホモジナイズされた(色がチェックされた)。次いで、均質化が停止され、バッチは50〜60℃の間に冷却された。次いで、ミキサーはオフにされ、融解したCoQ10濃縮物が混合タンクに加えられた。続いてミキサーはオンにされ、分散液が滑らかかつ均一になるまで、内容物は混合/再循環された。次いで、混合タンクの内容物は45〜50℃の間に冷却された。次いで、内容物は開封まで、保存のために適切な容器に移された。
実施例36:CoQ10 21%濃縮物およびアルキルベンゾエートを含む0.5kgバッチのCoQ10クリーム3%を調製する方法
0.5kgバッチのCoQ10クリーム3.0%組成物は、以下の相を合わせることによって調製された。A相は、C12−15アルキルベンゾエートを4.00%w/w、セチルアルコールNFを2.00%w/w、ステアリン酸グリセリル/PEG−100ステアリン酸を4.50%w/w、およびステアリルアルコールNFを1.5%w/w含んだ。パーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
0.5kgバッチのCoQ10クリーム3.0%組成物は、以下の相を合わせることによって調製された。A相は、C12−15アルキルベンゾエートを4.00%w/w、セチルアルコールNFを2.00%w/w、ステアリン酸グリセリル/PEG−100ステアリン酸を4.50%w/w、およびステアリルアルコールNFを1.5%w/w含んだ。パーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
B相は、ジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルNFを5.00%w/w、グリセリンUSPを2.00%w/w、プロピレングリコールUSPを1.50%w/w、フェノキシエタノールNFを0.475%w/w、精製水USPを16.725%w/w、およびカルボマー分散液、2%を40%w/w含んだ。パーセンテージおよび量は以下の対応する相の表に列挙されている。
C相は、乳酸USPを0.50%w/w、乳酸ナトリウム溶液USPを2.00%w/w、トリエタノールアミンNFを1.30%w/w、および精製水USPを2.50%w/w含んだ。パーセンテージ、量およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
すべての重量パーセントは、全体のCoQ10クリーム3.0%組成物の重量に対してである。
A相成分は適切な容器に加えられ、ウォーターバス中で70〜80℃の間に加熱された。カルボマー分散液を含まないB相成分は、適切な容器に加えられ、混合された。C相成分もまた、適切な容器に加えられ、次いでウォーターバス中で70〜80℃の間に加熱された。E相のCoQ10 21%濃縮物は、適切な容器に配置され、ウォーターバスを使用して50〜60℃の間で融解された。これらの成分は、必要に応じて均一性を確実にするために混合された。次いで、カルボマー分散液は、適切な容器(混合タンク)に加えられ、混合されながら、70〜80℃の間に加熱された。成分が混合されながら、B相成分は、温度を維持しながら混合タンクの内容物に加えられた。内容物は、継続して混合され、ホモジナイズされた。次いで、ミキサーがオフにされ、しかし、均質化は持続された。均質化が継続されながら、D相の二酸化チタンが混合タンクに加えられた。次いで、ミキサーがオンにされ、内容物は混合され、完全に均一かつ十分に引き伸ばされるまでさらにホモジナイズされた(色がチェックされた)。次いで、均質化が停止され、バッチは50〜60℃の間に冷却された。次いで、ミキサーはオフにされ、融解したCoQ10 21%濃縮物が混合タンクに加えられた。続いてミキサーはオンにされ、分散液が滑らかかつ均一になるまで、内容物は混合/再循環された。次いで、混合タンクの内容物は45〜50℃の間に冷却された。次いで、内容物は開封まで、保存のために適切な容器に移された。
実施例37:CoQ10 21%濃縮物およびトリカプリル酸グリセリル/トリカプリン酸グリセリルを含む0.5kgバッチCoQ10クリーム3%を調製する方法
0.5kgバッチのCoQ10クリーム3.0%組成物は、以下の相を合わせることによって調製された。A相は、トリカプリル酸グリセリル/トリカプリン酸グリセリルを4.00%w/w、セチルアルコールNFを2.00%w/w、ステアリン酸グリセリル/PEG−100ステアリン酸を4.50%w/w、およびステアリルアルコールNFを1.5%w/wを含んだ。パーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
0.5kgバッチのCoQ10クリーム3.0%組成物は、以下の相を合わせることによって調製された。A相は、トリカプリル酸グリセリル/トリカプリン酸グリセリルを4.00%w/w、セチルアルコールNFを2.00%w/w、ステアリン酸グリセリル/PEG−100ステアリン酸を4.50%w/w、およびステアリルアルコールNFを1.5%w/wを含んだ。パーセンテージおよび量は以下の表に列挙されている。
B相は、ジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルNFを5.00%w/w、グリセリンUSPを2.00%w/w、プロピレングリコールUSPを1.50%w/w、フェノキシエタノールNFを0.475%w/w、精製水USPを16.725%w/w、およびカルボマー分散液、2%を40%w/w含んだ。パーセンテージおよび量は以下の対応する相の表に列挙されている。
C相は、乳酸USPを0.50%w/w、乳酸ナトリウム溶液USPを2.00%w/w、トリエタノールアミンNFを1.30%w/w、および精製水USPを2.50%w/w含んだ。パーセンテージ、量およびさらなる詳細は以下の表に列挙されている。
すべての重量パーセントは、全体のCoQ10クリーム3.0%組成物の重量に対してである。
A相成分は適切な容器に加えられ、ウォーターバス中で70〜80℃の間に加熱された。カルボマー分散液を含まないB相成分は、適切な容器に加えられ、混合された。C相成分もまた、適切な容器に加えられ、次いでウォーターバス中で70〜80℃の間に加熱された。E相のCoQ10 21%濃縮物は、適切な容器に配置され、ウォーターバスを使用して50〜60℃の間で融解された。これらの成分は、必要に応じて均一性を確実にするために混合された。次いで、カルボマー分散液は、適切な容器(混合タンク)に加えられ、混合されながら、70〜80℃の間に加熱された。成分が混合されながら、B相成分は、温度を維持しながら混合タンクの内容物に加えられた。内容物は、継続して混合され、ホモジナイズされた。次いで、ミキサーがオフにされ、しかし、均質化は持続された。均質化が継続されながら、D相の二酸化チタンが混合タンクに加えられた。次いで、ミキサーがオンにされ、内容物は混合され、完全に均一かつ十分に引き伸ばされるまでさらにホモジナイズされた(色がチェックされた)。次いで、均質化が停止され、バッチは50〜60℃の間に冷却された。次いで、ミキサーはオフにされ、融解したCoQ10 21%濃縮物が混合タンクに加えられた。続いてミキサーはオンにされ、分散液が滑らかかつ均一になるまで、内容物は混合/再循環された。次いで、混合タンクの内容物は45〜50℃の間に冷却された。次いで、内容物は開封まで、保存のために適切な容器に移された。
実施例38:CoQ10 21%濃縮物およびトリカプリル酸グリセリル/トリカプリン酸グリセリルを含む20kgバッチのCoQ10クリーム3%を調製する方法
20kgバッチのCoQ10クリーム3%を調製する際に、以下の手順に従った。化学成分が秤量される前に、領域およびすべての設備が清浄であることを確実にするように特別な注意が払われた。最初に、化学成分が秤量され、秤量パンへのいかなるこぼれも防ぐよう特別な注意が払われた。
最初に200gmの二酸化チタン(D相)が秤量された。次いで、600gmの精製水が秤量された(「すすぎ用水−B相」とラベルされた)。
A相成分を調製する際に、800gmのトリカプリン酸グリセリル/トリカプリル酸グリセリル、400gmのセチルアルコールNF、300gmのステアリルアルコールNF、および900gmのステアリン酸グリセリル/PEG−100ステアリン酸が秤量された。次いで、これらのあらかじめ秤量されたA相成分は4−L SSビーカーに加えられ、A相とラベルされた。このプレミックスは24時簡以内に使用されなければならないことに注意のこと。次いで、A相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
B相を調製する際に、8,000gmのカルボマー分散液2.0%、400gmのグリセリンUSP、300gmのプロピレングリコール、1,000gmのジエチレングリコールグリコールモノエチルエーテルNF、95gmのフェノキシエタノールNF、および2,745gmの精製水USP(「B相用精製水」とラベルされた)が秤量された。次いで、これらのあらかじめ精製されたB相成分は10−L SSビーカーに加えられた。このプレミックスは24時簡以内に使用されなければならないことに注意のこと。B相容器の内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。次いで、B相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
C相を調製する際に、260gmのトリエタノールアミンNF、400gmの乳酸ナトリウム溶液USP、60%、500gmの精製水(「C相用精製水」とラベルされた)、および100gmの乳酸USPが秤量された。次いで、これらのC相成分は、以下の順番で2−L SSビーカーに加えられた:(1)260gmのトロラミン、(2)400gmの乳酸ナトリウム溶液、60%、(3)500gmのC相用精製水、および(4)100gmの乳酸USP。この容器はC相とラベルされた。このプレミックスは24時簡以内に使用されなければならないことに注意のこと。次いで、C相容器の内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。次いで、C相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
E相を調製する際に、3,000gmのCoQ10 21%濃縮物が秤量され、E相とラベルされた容器に配置された。E相容器はカバーされ、後の使用のために確保された。
CoQ10クリーム3%を混合する際に、A相、C相、およびE相を加熱するために2つのウォーターバスが使用された。最初に、A相ビーカーは70〜75℃に設定したウォーターバスに配置され、内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。C相ビーカーは60〜65℃に設定したウォーターバスに配置された。C相ビーカーの内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。E相ビーカーはウォーターバスに配置され、50〜55℃の温度に設定された。E相ビーカーの内容物は、透明かつ均一になるまで、スパチュラを用いて手で混合された。
クリームを混合するために、ウォーターバス(E−1)、Lee真空タンク(PK−2)、Waukeshaポンプ(P−1)、およびSilversonホモジナイザー用四角穴高剪断スクリーンが使用された。
最初に(Fist)、PK−2の底バルブが閉じていること、およびPK−2が適切にシールされていることが確認された。次いで、点検窓がPK−2から取り外され、あらかじめ秤量した10,000gmのカルボマー分散液2.0%が、点検窓入り口を通してPK−2タンクに加えられた。スパチュラが使用されて、いかなるカルボマー分散液2.0%もその容器の壁面から移された。次いで、PK−2用のTIC−2(温度記録装置)がオンにされ、この記録装置が適切に操作するのを保証ことを確実にした。
PK−2のための撹拌機(A−2)はオンにされ、カルボマー分散液2.0%は蒸気ジャケットを用いて70〜80℃に加熱された。次いで、点検窓はPK−2から取り外され、B相が、SSビーカーからPK−2まで、点検窓入り口を通してゆっくりと加えられた。次いで、B相容器は、「B相すすぎ用水」ですすがれた。次いで、すすぎ液が、点検窓入り口を通してPK−2に加えられた。
次いで、A相がゆっくりとPK−2に加えられた。スパチュラが使用されて、SSビーカーの壁面からのいかなるA相も移された。PK−2に加えられるとき、A相の温度は70〜80℃の間でなければならないことに注意のこと。
次いで、PK−2の底バルブが開かれ、P−1ポンプおよびP−2(Silversonホモジナイザー)はオンにされた。PK−2の内容物がホモジナイズされた。
次いで、C相は、アクセスポートを通してゆっくりとPK−2に加えられた。加えられるときに、温度は70〜80℃の間でなければならないことに注意のこと。均質化が少なくとも5分間持続され、次いで、A−2攪拌機がオフにされたことが確実にされた。次いで、あらかじめ秤量した200gm二酸化チタンUSPが、100メッシュふるいを通してPK−2にゆっくりとふるい掛けされた。スパチュラが使用されて、PK−2のブレードにこびりついたいかなる二酸化チタンも除去された。
次いで、点検窓が取り外され、A−2撹拌機がオンにされた。内容物は、P−1およびP−2を通して再循環しながら、継続して混合された。均質化は、10分間、または完全に均質かつ十分に引き伸ばされるまで継続させられた。10分後にP−2は停止された。次いで、PK−2の内容物は50〜60℃に冷却された。次いで、点検窓は取り外され、E相の融解したCoQ10 21%濃縮物)がアクセスポートを通してゆっくりと加えられた。次いで、点検窓が取り外された。
次いで、PK−2の内容物は、均一になるまでA−2と混合された。温度は50〜60℃に維持され、内容物はP−1を通して再循環された。次いで、窒素NFフローが開始され、C−2真空ポンプはオンにされた。生成物の発泡の回避が好ましいことに注意のこと。次いで、バッチは45〜50℃に冷却され、真空と窒素の両方がオンにされた。生成物がその温度まで冷却されたとき、C−2(真空ポンプ)はオフにされ、窒素NFを用いていかなる真空も取り除かれた。窒素NF流はオンのままであった。出口バルブは、試料を収集することまたは生成物をパッケージングすることの前に生成物でパージされた。
次いで、生成物は、あらかじめ秤量し、清浄な、HDPE閉鎖トップ容器に移された。A−2撹拌機、P−1 Waukeshaポンプ、および窒素NF流はオフにされた。バッチは完了され、TIC−2チャート上に示された。
2つの30gm(最少)試料が微量試験のために取り出され、2つの400gm(最少)試料が物理/化学試験のために取り出された。1セットの試料が「保持」とラベルされた。満たされた容器は秤量された。20kgのバッチサイズが得られた。
実施例39:CoQ10クリーム3%の局所適用によってSCCISを処置する方法
上記のような(例えば、実施例15および16)CoQ10クリーム3.0%組成物は、インサイチュで皮下扁平上皮細胞癌(SCCIS)に局所適用された。35例の対象が、3.0%CoQ10油中水型エマルジョンクリームベース医薬で局所処置された。この医薬品は、遮光容器中、室温にて出荷および保存された。
上記のような(例えば、実施例15および16)CoQ10クリーム3.0%組成物は、インサイチュで皮下扁平上皮細胞癌(SCCIS)に局所適用された。35例の対象が、3.0%CoQ10油中水型エマルジョンクリームベース医薬で局所処置された。この医薬品は、遮光容器中、室温にて出荷および保存された。
分析集団は、(1)処置意図集団(ITT)、(2)安全性集団、(3)プロトコールによる(PP)集団と定義された。ITT集団は、治験薬(CoQ10 3%)を投薬されたすべての対象を含んだ。安全性集団は、少なくとも1回用量の治験薬を取り込んだすべての対象を含んだ。PP集団は、ベースラインにおける組織学的結果を介して確認されたSCCISを有し、6週間目の組織学的試験を有し、そしていかなる暫定訪問も欠席しなかったすべての対象を含む。
対象は、組織学的に確定された少なくとも1つの非顔面SCCIS病変を有する、その他の点では健常な雄性または雌性成体であった。切除のために適切なSCCIS病変は、最小面積0.5cm2および最大直径2.0cmを有し、研究の間に衣類によって日光から保護できる位置にあった。各々朝のほぼ同時刻に、対象は病変部位を洗浄し、次いで、1枚のワックス紙またはアプリケーターに小さなエンドウマメサイズの(50〜100mg)量の局所クリーム医薬を調剤した。次いで、対象は、コットンスワブまたはアプリケータースティックを使用して、適切な量のクリームを病変およびその周囲の領域に適用した。処置領域は、適用後少なくとも8時間、洗浄されなかった。各々夕方のほぼ同時刻に、手順が反復された。病変および周囲の領域は、衣類を用いて日光から保護された。
処置の最初の日に、疾患の直径が測定され、面積が計算された。病変は写真も撮られた。1週目、2週目、3週目、4週目、および5週目において、対象が評価され、記録が彼らのバイタルサイン:血圧、脈拍数、呼吸数、口腔体温が取られた。以下の表に基づいて、以下の皮膚炎症の臨床的徴候/症候:紅斑、剥離、乾燥、掻痒、灼熱/刺される痛みもまた、CoQ10 3%処置の安全性の尺度として等級付けされた。
紅斑による安全性評価:ベースラインにおいて、32例の対象(91.4%)がある程度の紅斑を有した。この徴候は、多くの対象(28例の対象、80%)においてわずかから軽度と考えられ、4例の対象(11.4%)は顕著な(グレード3)赤みを有した。6週目において、紅斑は4例の対象(11.8%)において存在せず、30例の対象(88.2%)においてわずかまたは軽度であったのに対して、グレード3紅斑は観察されなかった。7例の対象において研究の間に観察され、ベースラインと比較して改善された最大紅斑スコアは、15例の対象において変化しなかったが、13例の対象において悪化した。最終紅斑スコアは、11例の対象において、ベースラインに対して改善されたが、22例の対象においては変化がなく、そして2例の対象において悪化した。
剥離/スケーリングによる安全性評価:ベースラインにおいて、27例の対象(77.1%)はある程度の剥離またはスケーリングを有し、8例の対象(22.9%)は有さなかった。6週目において、目に見える剥離またはスケーリングは16例の対象(47.1%)について存在せず、17例の対象(50%)においてわずかであり、そして1例のみの対象(2.9%)で中度であった。研究の間に観察された剥離/スケーリングについての最大スコアは、7例の対象においてベースラインと比較して改善され、20例の対象において変化せず、8例の対象において悪化した。最終剥離/スケーリングスコアは、16例の対象においてベースラインと比較して改善され、14例の対象において変化せず、そして5例の対象において悪化した。
乾燥による安全性評価:8例の対象(22.9%)は、ベースラインにおいてわずかまたは中度の乾燥を有したのに対して、77.1%は、処置領域において乾燥なしであるか(グレード1)または油状光沢(グレード0)を有した。6週目において、1例の対象以外は、グレード0またはグレード1の乾燥を有した(97.1%)。研究の間に観察された最大乾燥スコアは、7例の対象においてベースラインと比較して改善され、23例の対象において変化せず、そして5例の対象において悪化した。最終乾燥スコアは、13例の対象においてベースラインと比較して改善され、21例の対象において変化せず、そして1例の対象において悪化した。
掻痒による安全性評価:ベースラインにおいて対象の大部分は、掻痒なし(74.3%)または軽度、たまの掻痒(20%)と報告されたのに対し、2例の対象(5.7%)がグレード2または3の掻痒と報告された。6週目において、掻痒は、94.1%が掻痒を有さないように改善され、2例の対象(5.9%)のみが、軽度、たまの掻痒を有した。1週目〜6週目まで、どの対象もグレード1(軽度、たまの掻痒)よりも悪化した掻痒を有さなかった。研究の間に観察された最大掻痒スコアは、5例の対象においてベースラインと比較して改善され、24例の対象において変化せず、そして6例の対象において悪化した。最終掻痒スコアは、9例の対象においてベースラインと比較して改善され、24例の対象において変化せず、そして2例の対象において悪化した。
灼熱/刺される痛みによる安全性評価:ベースラインにおいて、灼熱または刺される痛みは大部分の対象(94.3%)において存在せず、2例の対象(5.7%)において軽度であった。これらのスコアは、研究の間、実質的に変化しないままであった。どの対象もグレード1(軽度)より上のスコアを有さず、2例を超えない対象が1日目(ベースライン)〜6週目までの任意の訪問の際にグレード1スコアを有した。研究の間に観察された灼熱/刺される痛みの最大スコアは、2例の対象においてベースラインと比較して改善され、28例の対象において「灼熱/刺される痛みなし」から変化せず、そして5例の対象において悪化した(なしから軽度まで)。最終灼熱/刺される痛みスコアは、2例の対象においてベースラインと比較して改善され、31例の対象において変化せず、そして2例の対象において悪化した。
病変の直径もまた測定され、面積がCoQ10 3%処置の効力を評価するために計算された。6週間の処置期間の最後に、中断訪問があり、ここでは、バイタルサインの記録が取られ、臨床徴候/症候が等級付けされた。身体検査もまた、6週間の中断訪問の際に実施された。中断訪問において、絶食血液試料もまた、最終クリーム適用の3時間以内に収集されて、CoQ10血漿濃度を決定した。病変は写真に撮られ、直径は測定され、そして面積が計算された。
CoQ10クリーム3%を用いるSCCISの局所処置の結果は、図4〜9の前後の写真に示されるような効力を示した。第1の効力の終点は、6週目の標的病変のネガティブ組織学的評価として規定される完全な応答を有する対象のパーセンテージであった。第2の効力の終点は、6週目の処置病変の面積(2つの主要な直径の積)の少なくとも50%減少として規定される部分的な応答を有する対象のパーセンテージに反映される。結果は、ITT集団の23.5%が6週目に完全な応答を有したのに対して、PP集団の18.5%が6週目に完全な応答を有したことを示した。
第2の効力の結果は、6週目にITT集団が26.5%が部分的な50%応答を有し、2.9%が75%の部分的な応答を有したことを示した。部分的な応答は、2例の対象において1週目に、8例の対象において2週目まで初期に観察された。最高の部分的応答割合は4週目および5週目であった。興味深いことに、6週目に完全な応答を有した8例の対象のうち、4例の対象は、目視検査に基づく部分応答を有さず、どの対象も75%応答を有さなかった。PP集団においては、22.2%が50%部分応答を有したのに対して、0%が75%部分応答を有した。病変領域における平均変化および平均パーセンテージ変化は、6週目のITT集団において、それぞれ−0.3cm2および−26.1%であり、PP集団において、それぞれ−0.3cm2および−23.4%であった。
全体として、CoQ10 3%クリームは安全であり、十分に耐容性があった。完全な治癒は、ITT集団の対象の約25%によって達成された。
実施例40:CoQ10クリーム3%の局所適用によってBCCを治療する方法
基底細胞癌(BCC)は、最も一般的な型の皮膚悪性腫瘍であり、米国において全体として最も一般的な型の癌である。米国癌協会(The American Cancer Society)は、800,000を超える基底細胞癌の新規な症例が毎年診断されていると見積もっている。表在性基底細胞癌(sBCC)はまれに転移し、通常は外科的切除または局所製剤を通して治癒可能である。
基底細胞癌(BCC)は、最も一般的な型の皮膚悪性腫瘍であり、米国において全体として最も一般的な型の癌である。米国癌協会(The American Cancer Society)は、800,000を超える基底細胞癌の新規な症例が毎年診断されていると見積もっている。表在性基底細胞癌(sBCC)はまれに転移し、通常は外科的切除または局所製剤を通して治癒可能である。
実施例35〜36において上記に記載されるようなCoQ10クリーム3.0%組成物は、1つ以上の組織学的に確認された表在性基底細胞癌(sBCC)病変を有し、他の点では健常である160例の雄性または雌性成体に局所適用された。0.5cm2の最小面積および2.0cmの最大直径を有する1つの標的病変が、治療のために指定された。sBCC病変は非顔面であり、研究の間に日光から防御可能であった。
本研究は、ランダム化された、二重盲検ビヒクル対照を設けた、並行研究であった。各対象は、4つの研究アーム:1.5%CoQ10クリーム1日1回(毎日1回)+ビヒクルクリーム1日1回(毎日1回)、3.0%CoQ10クリーム1日1回(毎日1回)+ビヒクルクリーム1日1回(毎日1回)、3.0%CoQ10クリーム1日2回(毎日2回)、またはビヒクルクリーム1日2回(毎日2回)のうちの1つにランダム化された。各アームは40例の患者を有した。
最初のスクリーニング訪問において、病変直径が測定され、面積が計算された。この面積は、2つの最大の垂直な直径を測定すること、およびcm2の結果のために乗算することによって決定される。対象のバイタルサインが取られ、記録され、そして身体検査が実施された。絶食血液試料が収集され、完全血液計数(CBC)テストが、脂質パネルテストを伴う臨床化学と同様に実施された。血液試料は、ベースラインCoQ10血漿濃度の決定のために収集され、2連試料が収集され、パッケージングされた。尿検査もまた実施され、出産可能な女性については、尿妊娠検査が実施された。次いで、対象は、以下の皮膚炎症の臨床徴候/症候:紅斑、剥離、乾燥、掻痒、および灼熱/刺される痛みについて等級付けされた。
研究の最初の日に(1日目)、対象のバイタルサインが再度記録され、皮膚炎症の臨床徴候/症候がスクリーニング訪問において等級付けされた。対象はまた、有害な事象、併用局所製剤の使用、および併用医薬の使用についてインタビューを受けた。次いで、標的sBCC病変は写真撮影され、スクリーニング訪問においてと同様に直径および面積について測定された。次いで、対象は、CoQ10医薬を含む医薬キットを与えられた。CoQ10クリームは、6週間の間、1日2回、患者によってsBCC病変および1cmの周囲の皮膚に適用された。
投薬レジメンは、各朝のほぼ同じ時刻に病変部位を洗浄すること、AMタブから1枚のワックス紙またはアプリケーターに、小さなエンドウマメサイズ(50〜100mg)の量の局所クリームを分配することからなった。次いで、対象は、Qチップまたはアプリケータースティックを使用して、病変および周囲の領域に適切な量のクリームを適用した。処置領域は、少なくとも8時間の間、洗浄されなかった。各夕方のほぼ同じ時刻に、PMチューブからの局所クリームを使用して手順は反復された。
対象による暫定的な訪問があり、これは、1週目、2週目、3週目、4週目、および5週目に行われた。これらの訪問の各々において、初期処置訪問におけるのと同様にバイタルサインが記録され、臨床徴候/症候が等級付けされた。病変直径が測定され、面積が計算された。次いで、対象は、有害な事象、併用局所製剤の使用、および併用医薬の使用についてインタビューを受けた。臨床評価は毎週行われた。
処置期間、6週間の最後に、初期処置訪問におけるのと同様にバイタルサインが記録され、臨床徴候/症候が等級付けされた。病変直径が測定され、面積が計算された。身体検査もまた実施された。最終クリーム適用後に、絶食血液試料もまた収集された。CoQ10血漿濃度の決定のための最終クリーム適用後3時間を超えないうちに、血液試料が収集された。完全血液計数(CBC)テストが実施され、脂質パネル試験を伴う臨床化学が実施された。
処置後4週間で(研究10週目)、対象は最終評価およびsBCC病変部位の切除のために戻った。バイタルサインが取られ、記録され、そして初期のスクリーニング訪問におけるものと類似である臨床徴候/症候が等級付けされた。
処置結果は、110例の対象の病理を再検討後、CoQ10クリーム3%を用いて局所処置された患者の少なくとも20%が、当該分野で認められる終点によって測定されるような徴候の減少を実証したことを示した。特に、110例の対象のうちの24例で、8週目の病変部位の生検に基づくsBCCの証拠がなかった。
実施例41:CoQ10局所処置の薬物動態学的結果
72例のBALB/cマウスが、各8匹のマウスの9グループにランダムに分けられた(グループI〜IX)。グループIは未処置であった。0日目に、グループII〜VIIIは、0.1gの試験物品(C−14放射性標識API31510でスパイクした3%w/wCoQ10クリームを含む水中油型クリームエマルジョン)で、5mg/cm2の速度で局所処置された。放射活性API31510は3%クリームバッチに加えられ、約50μCi/gの生成物または5μCi/適用用量の比活性を有する実験クリーム製剤を生じた。試験物品は、ガラス棒を用いて、グループII〜IXの各マウスの背の皮膚に局所適用された。投薬直後にグループII動物は屠殺され、測定された量の血液、尿、糞便、および標的器官(肝臓、膵臓、および脾臓)が収集され、秤量された。血液は血清について処理され、各器官はホモジナイズされた。グループIII〜VIIIは、投薬後、それぞれ、2、4、8、12、18、および24時間後に屠殺され、同じ試料が収集された。グループIXは、7日間の間(0日目〜6日目)、0.1gの試験物品を用いて局所的に処置された。6日目の試験物品の最終適用の24時間後である7日目に、グループIおよびIXが屠殺され、同じ試料が以前の群と同様に収集された。各試料は、1分間あたりの崩壊(DPM)について測定され、平均DPM/試料型が各グループについて計算された。
72例のBALB/cマウスが、各8匹のマウスの9グループにランダムに分けられた(グループI〜IX)。グループIは未処置であった。0日目に、グループII〜VIIIは、0.1gの試験物品(C−14放射性標識API31510でスパイクした3%w/wCoQ10クリームを含む水中油型クリームエマルジョン)で、5mg/cm2の速度で局所処置された。放射活性API31510は3%クリームバッチに加えられ、約50μCi/gの生成物または5μCi/適用用量の比活性を有する実験クリーム製剤を生じた。試験物品は、ガラス棒を用いて、グループII〜IXの各マウスの背の皮膚に局所適用された。投薬直後にグループII動物は屠殺され、測定された量の血液、尿、糞便、および標的器官(肝臓、膵臓、および脾臓)が収集され、秤量された。血液は血清について処理され、各器官はホモジナイズされた。グループIII〜VIIIは、投薬後、それぞれ、2、4、8、12、18、および24時間後に屠殺され、同じ試料が収集された。グループIXは、7日間の間(0日目〜6日目)、0.1gの試験物品を用いて局所的に処置された。6日目の試験物品の最終適用の24時間後である7日目に、グループIおよびIXが屠殺され、同じ試料が以前の群と同様に収集された。各試料は、1分間あたりの崩壊(DPM)について測定され、平均DPM/試料型が各グループについて計算された。
評価は、種々の時点において、24時間にわたる試験物品の皮膚浸透の相対レベルを決定すること、および適用の方法に伴って薬物が蓄積する場所を決定することの目的を用いて、血清、尿、糞便、および標的器官(肝臓、膵臓、および脾臓)の放射能レベルの測定に基づいた。
各グループについての平均試料重量グラムの要約は以下のチャートに提示される。
1分間あたりの崩壊(DPM)は表63に提示され、各動物からの組織試料の各型についてシンチレーションカウンター上で測定された。各試料型についての平均DPMが計算された。結果が1mL量に転換された後、次いで、平均が平均器官重量によって除算され、組織グラムあたりのDPMの結果が得られた。次いで、対照(グループI)の結果は、バックグラウンド放射量を取り除くため、およびグループ内での各試料についての組織グラムあたりの平均DPMの実際の数値を得るために、他のグループの結果の各々から減算された。2,220,000の定数で除算することによって、結果は、組織グラムあたりのマイクロキュリーに転換された。最終結果は、組織グラムあたりのピコキュリー(マイクロキュリー×1000)を表す。器官についての結果は、以下のチャートおよびグラフに提示された。
このデータは、試験物品が投薬後約8時間で膵臓中に実質的に蓄積したこと、およびまた、投薬後約8時間で肝臓中により少ない量で蓄積したことを反映している。脾臓および膵臓における組織グラムあたりのピコキュリーの量は、投薬後18時間までにほぼゼロまで減少した。時間0の肝臓結果は、投薬後ゼロ時間での指数関数的に高い量のDPMを有する単一の動物のために異常であった。この異常に高い結果のための1つの可能な説明は、動物が、それ自体の皮膚をなめること、または投薬部位の摩擦後にその肢をなめることのいずれかによって、試験物品を直接に消化してしまったことである。この可能性は、試験物品を、皮下吸収よりもはるかに迅速に肝臓に送達する。8時間ピークの後、肝臓量は12時間でわずかに減少したが、しかし、次いで、18時間でわずかに増加し、そして24時間を通して一貫したままであった。
標的器官の結果(続き)
グループII〜VIIIのすべての動物についての標的器官の各々において蓄積した試験物品の量のうち、組織グラムあたりのピコキュリーのパーセンテージが以下のチャートに提示される。
グループII〜VIIIのすべての動物についての標的器官の各々において蓄積した試験物品の量のうち、組織グラムあたりのピコキュリーのパーセンテージが以下のチャートに提示される。
グループII〜VIIIは、4.112マイクロキュリーの試験物品を投薬された。以下のチャートは、各時間において各標的器官におけるマイクロキュリーの量を提示している。
4.112(各用量中のマイクロキュリーの量)でこれらの数値を除算することによって、パーセンテージ結果は、各時間における各器官中にある試験物品の量を表す。以下のチャートはこれらのパーセンテージを提示する。
標的器官に到達するマイクロキュリーでの試験物品の平均パーセントは、膵臓、肝臓、および脾臓について、それぞれ、0.03%、0.07%、および0.01%である。
体内の老廃物サンプルについては、最終結果はmLあたりピコキュリーで提示された。この量は、DPMを1mLに転換すること、グループI結果を減算すること、次いで定数2,220,000によって除算し、mLあたりのマイクロキュリーを得ることによって得られた。この結果に1000を掛けることによって、mLあたり1000mLが得られた。糞便および尿あたりのmLあたり平均ピコキュリーが、以下のチャートおよびグラフに提示される。
このデータは、投薬の8時間後に糞便中に実質的に蓄積した試験物品が、投与後12時間において存在し続けていたが、投与後18時間までに実質的に低下したことを反映している。研究の間のある時点で試験物品が尿に蓄積するという兆候はなかった。
血液の結果は、老廃物試料結果が計算されたのと同じ方法で計算された。グループI−対照の血液結果における大量のDPMのために、血液中mLあたりピコキュリーの計算は負の数を生じた。これは、血中の予測されたDPM読みとりよりも多くを有する2匹の動物の結果であった。血液についての結果は以下のチャートおよびグラフに提示されている。
このデータは、試験物品が投薬の18時間後に血液中に存在しなかったかもしれないことを例外として、試験物品が血液中に蓄積しなかったことを示す。とりわけ、試験物品が肝臓および膵臓において観察されたので、血液中で見い出された有意な量の試験物品が存在しなかったことは奇異であった。1つの説明は、皮膚を通して器官への直接的な試験物品の経皮吸収である;しかし、試験物品が皮膚への浸透後に血液に入らないという可能性は低い。別の可能性は、血液が外来物質をすぐに認識し、肝臓中に試験物質を蓄積したことである。グループIIの最後の投薬は10:23amであり、グループIIが最初に屠殺されたのは10:45amであった。22分間は、血液がそれ自体から外来物質を取り除くための十分な時間であり得る。
グループIXの動物が1回の代わりに反復して投薬されたので、グループIXデータは別々に投与され、試験物品を7日間吸収することが許容された。グループIXデータは以下のチャートに提示される。
グループII〜VIIIの組織グラムあたりの平均ピコキュリーは、膵臓、肝臓、および脾臓について、それぞれ、1.24、2.83、および0.38であった。器官についてのグループIXの結果は、膵臓については平均よりも低く、肝臓については平均に近接し、そして脾臓については平均よりも高かった。データは、7日目までに脾臓において試験物品の量が増加していることを示し、7日目において肝臓中で試験物品の量が、投薬後に18時間および24時間において肝臓中で見い出された同じ量に匹敵したことを示す。
グループII〜VIIIについての糞便の平均ピコキュリーは27.55であり、尿については0.0064であった。グループIXの糞便および尿の結果は異常ではなく、糞便における試験物品の最小徴候のみを示した。
他のグループと同様に、グループIXの血液の結果は、試験物品が血液中に存在しなかったことを示す。
全体の結果は、グループ間での標的器官、糞便、尿、または血液の量の重量の違いの中で有意な違いがなかったことを示す。有意な量の試験物品が尿中で検出されなかった。グループI(対照)、II(0時間)、またはVI(12時間)からは尿が収集されなかった。グループVII(投薬の18時間後)を別として、試験物品は、研究の間の任意の時点で血液中の有意な量では検出されなかった。組織グラムあたりのピコキュリーおよびmLあたりのピコキュリーの最高量がグループVについて記録され(投薬8時間後)、その時点で大部分が糞便および膵臓に濃縮されたことが見い出された。グループVにおいてもまた、組織グラムあたりのピコキュリーのレベルの増加が肝臓において見い出された。肝臓の中で、12時間のわずかな浸漬後、レベルは18時間および24時間で一貫したままであり、比較し得るレベルがグループIX(7日目動物)において見い出された。投薬8時間後のピークの後、膵臓量はほぼゼロレベルまで低下し、これにはグループIX結果が含まれた。脾臓量は4時間で上昇し、次いで、18時間までにほぼゼロレベルまで減少した。しかし、これらの動物は、グループIXについては増加し、7日目における脾臓における試験物品の蓄積を示す。この化合物は肝臓および膵臓において見い出されたので、試験物品または試験物質の代謝物の経皮吸収が存在した。輸送の予想経路は血流であるので、試験物質が血液中に有意な量で存在しなかったことは奇妙である。可能性のある説明は、肝臓および膵臓による血液からの試験物品の迅速なクリアランスであり得る。別の可能性は、試験物品が、投薬それ自体をなめること、または投薬部位上で摩擦された肢をなめることのいずれかによって、動物によって直接消化できたことである。
実施例42:コエンザイムQ10を用いて処置された細胞のウェスタン分析
過去50年にわたって、悪性形質転換の根底にある原因としての特定のプロセスに影響を与える内因性/外因性因子に関わりがある膨大な量の情報が生じてきた。臨床的および基礎的文献は、DNA構造および機能の変化が、癌を遺伝病として規定する、癌の開始および進行において顕著な役割を果たすという証拠を提供している(Wooster,2010;Haiman,2010)。1920年代初頭、発癌の病因論の根本的な変化を特徴付けることに従事していたOtto Warburgおよび他の研究者は、2つの主要な観察(a)Warburg効果としてもまた知られる、酸素の存在下でのエネルギー産生のためのATPの生成においてグルコースを輸送および利用する細胞の能力、ならびに(b)ミトコンドリアATPの産生の減少に導く電子伝達の変化を含む、ミトコンドリアの構造および機能の変動を記述した。過去数年間は、癌の病因論、すなわち、癌を転移性疾患として見ることにおける細胞バイオエネルギーの中心的な役割の再調査であった。
過去50年にわたって、悪性形質転換の根底にある原因としての特定のプロセスに影響を与える内因性/外因性因子に関わりがある膨大な量の情報が生じてきた。臨床的および基礎的文献は、DNA構造および機能の変化が、癌を遺伝病として規定する、癌の開始および進行において顕著な役割を果たすという証拠を提供している(Wooster,2010;Haiman,2010)。1920年代初頭、発癌の病因論の根本的な変化を特徴付けることに従事していたOtto Warburgおよび他の研究者は、2つの主要な観察(a)Warburg効果としてもまた知られる、酸素の存在下でのエネルギー産生のためのATPの生成においてグルコースを輸送および利用する細胞の能力、ならびに(b)ミトコンドリアATPの産生の減少に導く電子伝達の変化を含む、ミトコンドリアの構造および機能の変動を記述した。過去数年間は、癌の病因論、すなわち、癌を転移性疾患として見ることにおける細胞バイオエネルギーの中心的な役割の再調査であった。
歴史的には、遺伝子の変異が遺伝子発現の変化の原因であると考えられてきたけれども、発癌を支持する遺伝子発現に影響を与える際に決定的な役割を果たす後成的プロセスを支持している文献が蓄積しつつある。これは、多くの遺伝子の突然変異率が低く、癌細胞において見い出される多数の(スペクトルの)変異を説明できないという観察によって証明されている。後成的変化は、ヒストンテールのメチル化および修飾によって調節され、両方の変化は、ヒストンアセチル化のために、コファクター、例えば、アセチルCoA要求の利用性を必要とするので、細胞のエネルギー(栄養)状態に固有に連関している(参照)。アセチルCoAの生合成は、解糖とクレブス回路に依存し、細胞内エネルギー状態を遺伝子の発現および活性の調節に直接連関させる。
正常細胞において、ミトコンドリアの酸化的リン酸化は、十分なATPを生成して、正常な生理学的活性および細胞生存を維持するためのエネルギー要求に合致している。ミトコンドリアのエネルギー産生の結果は、反応性酸素種(ROS)の生成であり、その異常な産生はミトコンドリアの損傷に導く(参照)。発癌の病因論に関わりがある現象である、ミトコンドリアによる長期ROS生成は、遺伝子の変異の累積的蓄積をもたらすことが十分に確立されている。癌細胞はROS生成を最小化するようにミトコンドリア呼吸を減少し、エネルギー産生を維持するために解糖に切り替わることが示唆されてきた。したがって、酸化的リン酸化から解糖へのエネルギー産生の進行的シフトは、生理学的機能を維持するためにエネルギー産生を維持するために細胞にとって必須であり、正常細胞の表現型から癌細胞の表現型への進行に付随し得る。ミトコンドリアの遺伝的構成における変化(変異)の蓄積と連携した細胞のエネルギー(生体エネルギー)プロフィールの進行性シフトは、細胞メタボロームを変化させる。解糖の推移に対するミトコンドリアのリン酸化の結果としての全細胞メタボロームプロフィールの変化は、異常な生体エネルギー誘導性メタボロームプロフィールに対応し、発癌を支持する根底にある原因である。非癌性正常ミトコンドリア酸化的リン酸化関連細胞生体エネルギーの状態に向かって細胞メタボロームシフトを誘発するために内因性分子を使用する標的化介入は、癌の処置における治療の評価項目を表す。
エピ−メタボロームシフトを引き起こすMIMとしてのコエンザイムQ10
本明細書に提示されるデータは、コエンザイムQ10を用いた正常および癌細胞の処置が、解糖−ミトコンドリア酸化ストレス連続体の中で鍵となる生化学的末端を調節するタンパク質の発現の変化に関与することを実証する。ウェスタンブロッティングおよび酸素消費によるタンパク質発現の評価を説明するデータの組み合わせは、正常細胞において、コエンザイムQ10の曝露後に、正常な解糖およびミトコンドリア速度の有意な変化がないことを実証する。したがって、正常細胞系統、例えば、HDFa(正常ヒト成体線維芽細胞)、HASMC(正常ヒト大動脈平滑筋細胞)、nFib(正常線維芽細胞)、およびHeKa(正常ヒトケラチン生成細胞)におけるタンパク質の発現の値およびミトコンドリア呼吸速度は、ベースライン生理学的状態を表すと見なすことができる。癌細胞系統、例えば、HepG2(肝臓癌)、PaCa−2(膵臓癌)、MCF7(乳癌)、SK−MEL(黒色腫)、およびSCC−25(扁平上皮細胞癌)におけるタンパク質の発現およびミトコンドリア呼吸速度の何らかの逸脱は、この場合は、癌における疾患の開始/進行に起因する変化を表す。実験的証拠は、癌細胞に対するコエンザイムQ10の曝露が、正常細胞を彷彿とさせる細胞の病態生理学的再組織化と関わりがあるという仮説に対するサポートを提供する。具体的には、本明細書に提供されるデータは、癌細胞中でのコエンザイムQ10曝露は、正常細胞において観察される細胞構造に対する、細胞構造の全体的な再組織化の誘導の原因である、解糖経路におけるシフトおよびミトコンドリアの酸化的リン酸化と関わりがあることを実証する。
本明細書に提示されるデータは、コエンザイムQ10を用いた正常および癌細胞の処置が、解糖−ミトコンドリア酸化ストレス連続体の中で鍵となる生化学的末端を調節するタンパク質の発現の変化に関与することを実証する。ウェスタンブロッティングおよび酸素消費によるタンパク質発現の評価を説明するデータの組み合わせは、正常細胞において、コエンザイムQ10の曝露後に、正常な解糖およびミトコンドリア速度の有意な変化がないことを実証する。したがって、正常細胞系統、例えば、HDFa(正常ヒト成体線維芽細胞)、HASMC(正常ヒト大動脈平滑筋細胞)、nFib(正常線維芽細胞)、およびHeKa(正常ヒトケラチン生成細胞)におけるタンパク質の発現の値およびミトコンドリア呼吸速度は、ベースライン生理学的状態を表すと見なすことができる。癌細胞系統、例えば、HepG2(肝臓癌)、PaCa−2(膵臓癌)、MCF7(乳癌)、SK−MEL(黒色腫)、およびSCC−25(扁平上皮細胞癌)におけるタンパク質の発現およびミトコンドリア呼吸速度の何らかの逸脱は、この場合は、癌における疾患の開始/進行に起因する変化を表す。実験的証拠は、癌細胞に対するコエンザイムQ10の曝露が、正常細胞を彷彿とさせる細胞の病態生理学的再組織化と関わりがあるという仮説に対するサポートを提供する。具体的には、本明細書に提供されるデータは、癌細胞中でのコエンザイムQ10曝露は、正常細胞において観察される細胞構造に対する、細胞構造の全体的な再組織化の誘導の原因である、解糖経路におけるシフトおよびミトコンドリアの酸化的リン酸化と関わりがあることを実証する。
正常細胞において、解糖アウトプットの終点は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化(OXPHOS)、すなわち、クレブスサイクル(トリカルボン酸回路、TCA、またはクエン酸回路としても知られる)に入るための解糖経路を経由したグルコースからピルビン酸の生成に連関しており、還元当量を生成して、ATP産生のためにOXPHOSをサポートする。したがって、正常細胞において、解糖に関与する遺伝子産物の発現および機能的な方向付けは、ピルビン酸の十分な生成およびそれがクレブスサイクルに入ることに向けて準備される。癌細胞における解糖およびクレブスサイクルに関与する鍵となるタンパク質の発現および機能の異常調節は、ミトコンドリア機能の顕著な減少に伴う解糖の増強を生じる。ミトコンドリア呼吸鎖に選択的に影響を与える内因性分子であるコエンザイムQ10への癌細胞の曝露は、解糖およびクレブスサイクル経路のタンパク質の発現を変化させ(正常化し)、エネルギー産生(すなわち、ATP生成)がミトコンドリアに回復されるように、生体エネルギーシフトを容易にする。
実験手順
ウェスタンブロット実験1
実験のために使用された細胞はHDFa細胞およびMCF−7細胞であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24時間後に収穫された。全細胞ペレットが1mLのC7緩衝液中で一度に再懸濁され、ラベルされた15mLチューブに移された。次いで、試料は、低温室にて、氷上で、番号14の設定で6回の超音波パルスを使用して超音波処理された。超音波処理後、試料は2500gで短時間遠心分離し、試料は2mlチューブに移された。50mL試料チューブに残っている泡を使用して、各試料のpHが確認された(pHは9.0である)。
ウェスタンブロット実験1
実験のために使用された細胞はHDFa細胞およびMCF−7細胞であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24時間後に収穫された。全細胞ペレットが1mLのC7緩衝液中で一度に再懸濁され、ラベルされた15mLチューブに移された。次いで、試料は、低温室にて、氷上で、番号14の設定で6回の超音波パルスを使用して超音波処理された。超音波処理後、試料は2500gで短時間遠心分離し、試料は2mlチューブに移された。50mL試料チューブに残っている泡を使用して、各試料のpHが確認された(pHは9.0である)。
試料のアルキル化および還元は、10μlの1Mアクリルアミド、25μlのトリブチルホスフィン(tributylphoshene)を加えること、および断続的に混合しながらの90分間のインキュベーションによって、各試料について実施された。インキュベーション後、10μlの1M DTTが加えられ、チューブは20,000gで20℃にて10分間遠心分離され、そして10kカットオフを有するラベルしたAmicon Ultra遠心フィルターユニット(Milliporeカタログ番号UFC801024)に上清が移された。試料は、2分間隔で、2500gで15分間遠心分離された。電気伝導度は、Chaps単独ならびに試料について、電気伝導度メーターを使用して測定された。試料の電気伝導度が高い場合、1mlのchapsが緩衝液交換のために加えられ、体積が250μlに下がるまで、2500gで再度遠心分離された。電気伝導度が200以下であったとき、試料は、上清の体積が150〜100μlの間になるまで、5分間隔で2500gで遠心分離された。試料上清はエッペンドルフチューブに移され、BSAを標準として使用してBradfordアッセイが実施された。
試料は上記のような標準のプロトコールに従って処置され、各試料中のタンパク質の量はBradfordアッセイによって決定された。10μgタンパク質に等価な試料体積が、以下に示されるように、Lamelliローディング染料(LDS)およびMilliQ水を用いて調製され、4〜12%Bis−Tris Novex NuPAGEゲル(Invitrogen,カタログ番号NP0323Box)上で泳動された。
ゲルは、1×MOPS緩衝液を使用し、NOVEX Xcell Surelockシステムを使用して、200Vで50分間泳動された。次いで、ゲルは、NOVEX Xcell Surelock湿式転写プロトコールを使用して、30Vで1時間転写された。ブロットは、InvitrogenからのSimply Blue Safestain(LC6065)で染色された。
HDFaおよびMCF−7試料におけるIDH1およびATPクエン酸リアーゼレベル 転写後、各ブロットは、2枚のWhatman濾紙の間に配置され、15〜20分間乾燥された。乾燥後、ブロットは、日付、試料の型、およびブロット1かブロット2のいずれかをHB鉛筆でラベルされた。分子量マーカーは、鉛筆で輪郭が描かれ、1本線は青色であり、2本線は着色マーカーであった。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で1時間室温でブロッキングされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄された。ブロット1は5%BSAを有するTBST中のIDH1に対する一次抗体(Cell Signaling番号3997)(1:1000希釈)でプローブされ、ブロット2は、振盪しながら4℃で一晩のインキュベーションによって、1:1000希釈の5%BSA中のATPクエン酸リアーゼについてのウサギポリクローナル抗体(Cell Signaling番号4332)を用いた。一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
HDFaおよびMCF−7試料におけるアクチンレベル
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。次いで、ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして1:5000希釈の5%BSA中のアクチンに対する抗体(Sigmaカタログ番号A5316、クローンAC−74)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との1時間のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。次いで、ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして1:5000希釈の5%BSA中のアクチンに対する抗体(Sigmaカタログ番号A5316、クローンAC−74)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との1時間のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ウェスタンブロット実験2
この実験において使用された細胞は、SKMEL28、SCC−25、nFib、およびHekaであり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の3、6、および/または24時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、4〜12%Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
この実験において使用された細胞は、SKMEL28、SCC−25、nFib、およびHekaであり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の3、6、および/または24時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、4〜12%Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
4つの細胞系統についてのIDH1のレベル
転写後、ブロットは15〜20分間乾燥され、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄された。次いで、これは、5%BSAを有するTBST中のIDH1に対する一次抗体(Cell Signaling番号3997)(1:1000希釈)を用いて、振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。IDH1に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)を用いて、室温で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
転写後、ブロットは15〜20分間乾燥され、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄された。次いで、これは、5%BSAを有するTBST中のIDH1に対する一次抗体(Cell Signaling番号3997)(1:1000希釈)を用いて、振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。IDH1に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)を用いて、室温で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
4つの異なる細胞系統におけるATPクエン酸リアーゼレベル
イソクエン酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄された。次いで、これは、1:1000希釈の5%BSA中のATPクエン酸リアーゼについてのウサギポリクローナル抗体(Cell Signaling番号4332)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。ATPクエン酸リアーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた
イソクエン酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄された。次いで、これは、1:1000希釈の5%BSA中のATPクエン酸リアーゼについてのウサギポリクローナル抗体(Cell Signaling番号4332)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。ATPクエン酸リアーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた
異なる4つの細胞系統におけるアクチンレベル
ATPクエン酸リアーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:5000希釈の5%BSA中のアクチンに対する抗体(Sigmaカタログ番号A5316、クローンAC−74)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との1時間のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ATPクエン酸リアーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:5000希釈の5%BSA中のアクチンに対する抗体(Sigmaカタログ番号A5316、クローンAC−74)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との1時間のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ウェスタンブロット実験3
この実験において使用された細胞は、HepG2細胞、HASMC細胞、およびPACA2細胞であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の48時間後に収穫された。この実験において(ウェスタンブロット実験3)、および本実施例において以下に記載される実験のすべてにおいて(すなわち、ウェスタンブロット実験4〜9)、細胞は、5mMグルコース(「5G」)または22mMグルコース(「22G」)のいずれかでさらに処置された。細胞に由来する試料は処理され、そして上記のように4〜12%Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
この実験において使用された細胞は、HepG2細胞、HASMC細胞、およびPACA2細胞であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の48時間後に収穫された。この実験において(ウェスタンブロット実験3)、および本実施例において以下に記載される実験のすべてにおいて(すなわち、ウェスタンブロット実験4〜9)、細胞は、5mMグルコース(「5G」)または22mMグルコース(「22G」)のいずれかでさらに処置された。細胞に由来する試料は処理され、そして上記のように4〜12%Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
HASMC対PACA2およびHepG2におけるIDH1、ATPクエン酸リアーゼ、およびアクチンレベル
IDH1、ATPクエン酸リアーゼ、およびアクチンのレベルは、本質的に、上記のように、IDH1、ATPクエン酸リアーゼ、およびアクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
IDH1、ATPクエン酸リアーゼ、およびアクチンのレベルは、本質的に、上記のように、IDH1、ATPクエン酸リアーゼ、およびアクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
ウェスタンブロット実験4
この実験において使用された細胞はHepG2であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、4〜12%Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
この実験において使用された細胞はHepG2であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、4〜12%Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
HepG2細胞における乳酸デヒドロゲナーゼレベル
転写後、各ブロットは15〜20分間乾燥され、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。次いで、このブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で、室温で1時間ブロッキングされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、5%BSA中の乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体(abcam ab2101;ポリクローナル)(1:1000希釈)を用いて、振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(ウサギ抗ヤギ;1:10,000希釈)を用いて、室温で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
転写後、各ブロットは15〜20分間乾燥され、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。次いで、このブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で、室温で1時間ブロッキングされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、5%BSA中の乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体(abcam ab2101;ポリクローナル)(1:1000希釈)を用いて、振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(ウサギ抗ヤギ;1:10,000希釈)を用いて、室温で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
HepG2細胞における筋肉型ピルビン酸キナーゼ(PKM2)レベル
乳酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:500希釈の5%BSA中のピルビン酸キナーゼM2に対するウサギポリクローナル抗体(NOVUS BIOLOGICALSカタログ番号H00005315−D01P)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。ピルビン酸キナーゼM2に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
乳酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:500希釈の5%BSA中のピルビン酸キナーゼM2に対するウサギポリクローナル抗体(NOVUS BIOLOGICALSカタログ番号H00005315−D01P)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。ピルビン酸キナーゼM2に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
HepG2細胞におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼβレベル
ピルビン酸キナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。抗体が剥がされたことおよびECF試薬が働いたことを確認した後、ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:5000希釈の5%BSA中のピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する抗体(ABNOVAカタログ番号H00005162−M03)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。ピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ピルビン酸キナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。抗体が剥がされたことおよびECF試薬が働いたことを確認した後、ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:5000希釈の5%BSA中のピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する抗体(ABNOVAカタログ番号H00005162−M03)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。ピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
HepG2細胞におけるアクチンレベル
ピルビン酸デヒドロゲナーゼブロットは、本質的に上記のように、剥がされ、次いで、アクチンについて再プローブされた。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼブロットは、本質的に上記のように、剥がされ、次いで、アクチンについて再プローブされた。
ウェスタンブロット実験5
この実験において使用された細胞はMIAPACA2(PACA2)であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。PACA2試料は、本質的に上記のように、処理され、そしてゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
この実験において使用された細胞はMIAPACA2(PACA2)であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。PACA2試料は、本質的に上記のように、処理され、そしてゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
PaCa2細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)レベル
LDHおよびPDHのレベルは、本質的に上記のように、LDHおよびPDHに対する一次抗体でブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
LDHおよびPDHのレベルは、本質的に上記のように、LDHおよびPDHに対する一次抗体でブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
PaCa2細胞におけるカスパーゼ3レベル
ブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5%BSA中のカスパーゼ3に対する抗体(Santacruz Biotechnology番号sc7272、1:200希釈)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。カスパーゼ3に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5%BSA中のカスパーゼ3に対する抗体(Santacruz Biotechnology番号sc7272、1:200希釈)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。カスパーゼ3に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ウェスタンブロット実験6
このウェスタンブロット実験において使用された細胞はPC−3、HepG2、MCF−7、HDFa、およびPACA2であり、これらは、2コエンザイムQ10 IV製剤で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24時間後に収穫された。本質的に上記のように、試料は処理され、ゲルは泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
このウェスタンブロット実験において使用された細胞はPC−3、HepG2、MCF−7、HDFa、およびPACA2であり、これらは、2コエンザイムQ10 IV製剤で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24時間後に収穫された。本質的に上記のように、試料は処理され、ゲルは泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
異なる細胞型におけるカスパーゼ(Capase)3およびアクチンレベル
カスパーゼ3およびアクチンのレベルは、本質的に上記に記載されるように、カスパーゼ3およびアクチンに対する一次抗体を用いて、ブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
カスパーゼ3およびアクチンのレベルは、本質的に上記に記載されるように、カスパーゼ3およびアクチンに対する一次抗体を用いて、ブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
ウェスタンブロット実験7
この実験において使用された細胞はヒト大動脈平滑筋(HASMC)細胞であり、これは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。本質的に上記のように、HASMC試料は処置され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
この実験において使用された細胞はヒト大動脈平滑筋(HASMC)細胞であり、これは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。本質的に上記のように、HASMC試料は処置され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
アクチンのための実験プロトコール:
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
Hif 1α、カスパーゼ3、およびPDHBのための実験プロトコール:
アクチンブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:200希釈の5%BSA中のHif 1α、カスパーゼ3、またはPDHBに対する抗体で、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。Hif 1αに対する一次抗体(Abcam ab2185;抗ウサギ)は、5%BSA中で1:500希釈であった。カスパーゼ3に対する一次抗体(Santacruz sc7272;抗ウサギ)は、5%BSA中で1:200希釈であった。ピルビン酸デヒドロゲナーゼβ(PDHB)に対する一次抗体(Novus Biologicals H00005162−M03;抗マウス)は、5%BSA中で1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、室温にて1時間、二次抗体(PDHB抗マウス;Hif 1a、およびカスパーゼ3抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
アクチンブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:200希釈の5%BSA中のHif 1α、カスパーゼ3、またはPDHBに対する抗体で、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。Hif 1αに対する一次抗体(Abcam ab2185;抗ウサギ)は、5%BSA中で1:500希釈であった。カスパーゼ3に対する一次抗体(Santacruz sc7272;抗ウサギ)は、5%BSA中で1:200希釈であった。ピルビン酸デヒドロゲナーゼβ(PDHB)に対する一次抗体(Novus Biologicals H00005162−M03;抗マウス)は、5%BSA中で1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、室温にて1時間、二次抗体(PDHB抗マウス;Hif 1a、およびカスパーゼ3抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
PKM2、SDHB、およびSDHCのための実験プロトコール:
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、TBS−T中の5%BSA中のPKM2、SDHB、またはSDHCに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。SDHCに対する一次抗体(ABNOVA H00006391−M02;抗マウス)は1:500希釈であった。SDHBに対する一次抗体は、Abcam ab4714−200から;抗マウス;1:1000希釈であっった。ピルビン酸キナーゼM2(PKM2)に対する一次抗体は、Novus Biologicals H00005315−D0IPから;抗ウサギ;1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(SDHB&C抗マウス;およびPKM2抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、TBS−T中の5%BSA中のPKM2、SDHB、またはSDHCに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。SDHCに対する一次抗体(ABNOVA H00006391−M02;抗マウス)は1:500希釈であった。SDHBに対する一次抗体は、Abcam ab4714−200から;抗マウス;1:1000希釈であっった。ピルビン酸キナーゼM2(PKM2)に対する一次抗体は、Novus Biologicals H00005315−D0IPから;抗ウサギ;1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(SDHB&C抗マウス;およびPKM2抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
LDHおよびBikのための実験プロトコール:
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5%BSA中のLDHまたはBikに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。LDHに対する一次抗体はAbcam ab2101から;抗ヤギ;1:1000希釈であった。Bikに対する一次抗体は、Cell Signaling番号9942から;抗ウサギ;1:1000希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(LDH抗ヤギ;Jackson LaboratoriesおよびBik抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5%BSA中のLDHまたはBikに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。LDHに対する一次抗体はAbcam ab2101から;抗ヤギ;1:1000希釈であった。Bikに対する一次抗体は、Cell Signaling番号9942から;抗ウサギ;1:1000希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(LDH抗ヤギ;Jackson LaboratoriesおよびBik抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ウェスタンブロット実験9
使用された細胞はHepG2細胞であり、これは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。本質的に上記のように、HepG2試料は処理され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
使用された細胞はHepG2細胞であり、これは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。本質的に上記のように、HepG2試料は処理され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
アクチンのための実験プロトコール:
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
カスパーゼ3およびMMP−6のための実験プロトコール:
アクチンブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5%BSA中のカスパーゼ3またはMMP−6に対する抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。カスパーゼ3に対する一次抗体(Abcam ab44976−100;抗ウサギ)は5%BSA中1:500希釈であった。MMP−6に対する一次抗体(Santacruz scMM0029−ZB5;抗マウス)は5%BSA中1:100希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、室温にて1時間、二次抗体(MMP−6抗マウス;カスパーゼ3抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
アクチンブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5%BSA中のカスパーゼ3またはMMP−6に対する抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。カスパーゼ3に対する一次抗体(Abcam ab44976−100;抗ウサギ)は5%BSA中1:500希釈であった。MMP−6に対する一次抗体(Santacruz scMM0029−ZB5;抗マウス)は5%BSA中1:100希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、室温にて1時間、二次抗体(MMP−6抗マウス;カスパーゼ3抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
LDHのための実験プロトコール:
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪を伴う、5%BSA中または5%ミルク中のLDHに対する一次抗体とのインキュベーションによって、4℃で一晩プローブされた。LDH080309b1に対する一次抗体(Abcam ab2101;抗ヤギ)は5%BSA中1:1000希釈であった。LDH080309b2に対する一次抗体(Abcam ab2101;抗ヤギ)は5%ミルク中1:1000希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(Jackson Immuno Research 抗ヤギ;1:10,000希釈;305−055−045)で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪を伴う、5%BSA中または5%ミルク中のLDHに対する一次抗体とのインキュベーションによって、4℃で一晩プローブされた。LDH080309b1に対する一次抗体(Abcam ab2101;抗ヤギ)は5%BSA中1:1000希釈であった。LDH080309b2に対する一次抗体(Abcam ab2101;抗ヤギ)は5%ミルク中1:1000希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(Jackson Immuno Research 抗ヤギ;1:10,000希釈;305−055−045)で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
トランスアルドラーゼおよびHif1aのための実験プロトコール:
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5%BSA中のトランスアルドラーゼまたはHif1aに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する抗体(Abcam ab67467;抗マウス)は1:500希釈であった。Hif1aに対する抗体(Abcam ab2185;抗ウサギ)は1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウスまたは抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5%BSA中のトランスアルドラーゼまたはHif1aに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する抗体(Abcam ab67467;抗マウス)は1:500希釈であった。Hif1aに対する抗体(Abcam ab2185;抗ウサギ)は1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウスまたは抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
IGFBP3およびTP53のための実験プロトコール:
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5%BSA中のIGFBP3またはTP53に対する一次抗体で一晩プローブされた。IGFBP3に対する一次抗体(Abcam ab76001;抗ウサギ)は1:100希釈であった。TP53に対する一次抗体(Sigma Aldrich AV02055;抗ウサギ)は1:100希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5%BSA中のIGFBP3またはTP53に対する一次抗体で一晩プローブされた。IGFBP3に対する一次抗体(Abcam ab76001;抗ウサギ)は1:100希釈であった。TP53に対する一次抗体(Sigma Aldrich AV02055;抗ウサギ)は1:100希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
トランスアルドラーゼおよびPDHBのための実験プロトコール:
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5%BSA中のトランスアルドラーゼまたはPDHBに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する一次抗体(Santacruz sc51440;抗ヤギ)は1:200希釈であった。PDHBに対する一次抗体(Novus Biologicals H00005162−M03;抗マウス)は1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ヤギまたは抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットはメタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5%BSA中のトランスアルドラーゼまたはPDHBに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する一次抗体(Santacruz sc51440;抗ヤギ)は1:200希釈であった。PDHBに対する一次抗体(Novus Biologicals H00005162−M03;抗マウス)は1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ヤギまたは抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
結果
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−1−(IDH−1)
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−1−(IDH−1)は、ミトコンドリア基質の中に通常存在するTCA回路の一部である酵素の1つである。しかし、IDH1は、イソクエン酸からα−ケトグルタル酸への酸化的脱カルボキシル化を触媒し、2段階工程で二酸化炭素を生成する細胞質ゾル型の酵素である。IDH1は、細胞質ゾルおよびペルオキシソームに存在するNADP+依存性型である。IDH1はSer113リン酸化によって不活性化され、クエン酸回路がないものを含む多くの種において発現される。IDH1は、部分的にHIF−1の活性化を通して、不活性化が腫瘍形成に寄与する腫瘍抑制因子として通常は機能しているようである(Bayley2010;Reitman,2010)。最近の研究は、膠芽細胞腫の病因学におけるIDH1の不活性化変異に関わっている(Bleeker,2009;Bleeker,2010)。
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−1−(IDH−1)
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−1−(IDH−1)は、ミトコンドリア基質の中に通常存在するTCA回路の一部である酵素の1つである。しかし、IDH1は、イソクエン酸からα−ケトグルタル酸への酸化的脱カルボキシル化を触媒し、2段階工程で二酸化炭素を生成する細胞質ゾル型の酵素である。IDH1は、細胞質ゾルおよびペルオキシソームに存在するNADP+依存性型である。IDH1はSer113リン酸化によって不活性化され、クエン酸回路がないものを含む多くの種において発現される。IDH1は、部分的にHIF−1の活性化を通して、不活性化が腫瘍形成に寄与する腫瘍抑制因子として通常は機能しているようである(Bayley2010;Reitman,2010)。最近の研究は、膠芽細胞腫の病因学におけるIDH1の不活性化変異に関わっている(Bleeker,2009;Bleeker,2010)。
コエンザイムQ10での処置は、MCF−7、SKMEL28、HepG2、およびPaCa−2細胞を含む癌細胞株におけるIDH1の発現を増加した。SCC25細胞系統においては中程度の発現の増加が存在した。ヒト由来初代線維芽細胞HDFaとは対照的に、nFIBおよびヒト大動脈平滑筋細胞HASMCは、コエンザイムQ10に応答して、IDH1の発現パターンの有意な変化を実証しなかった。α−ケトグルタル酸(α−KG)は、TCA回路における鍵となる中間体であり、イソクエン酸から生化学的に合成され、最終的にはスクシニルCoAに転換され、薬物となり得るMIMおよびエピシフターである。α−KGはTCA回路の中間体を補充するために細胞によって使用でき、酸化的リン酸化を増加するための還元当量の生成を生じるので、α−KGの生成はTCA回路における決定的な岐路として働く。したがって、コエンザイムQ10媒介性のIDH1発現の増加は、癌細胞における酸化的リン酸化を増強するためにミトコンドリアのTCA回路によって使用できる中間体の形成を生じる。結果は以下の表に要約される。
ATPクエン酸リアーゼ(ACL)
ATPクエン酸リアーゼ(ACL)は、細胞質ゾル中でアセチル−CoAおよびオキサロ酢酸の形成を触媒するホモテトラマー(〜126kd)酵素である。この反応は、糖生成と同様に、脂肪酸、コレステロール、およびアセチルコリンの生合成のための最初の非常に重要なステップである(Towle et al.,1997)。栄養およびホルモンがこの鍵となる酵素の発現レベルおよびリン酸化状態を調節している。AktおよびPKAによるACLのSer454リン酸化が報告されている(Berwick.,DC MW et al.,2002;Pierce MW et al.,1982)。
ATPクエン酸リアーゼ(ACL)は、細胞質ゾル中でアセチル−CoAおよびオキサロ酢酸の形成を触媒するホモテトラマー(〜126kd)酵素である。この反応は、糖生成と同様に、脂肪酸、コレステロール、およびアセチルコリンの生合成のための最初の非常に重要なステップである(Towle et al.,1997)。栄養およびホルモンがこの鍵となる酵素の発現レベルおよびリン酸化状態を調節している。AktおよびPKAによるACLのSer454リン酸化が報告されている(Berwick.,DC MW et al.,2002;Pierce MW et al.,1982)。
データは、正常細胞および癌細胞におけるATPクエン酸リアーゼに対するコエンザイムQ10の効果を説明している。癌細胞において、ACL酵素の発現の用量依存的な減少が存在することが一貫して観察されている。対照的に、正常細胞においては、ACLの発現の増加に向かう傾向が存在するようである。細胞質ゾルACLは、増殖因子刺激の間および分化の間に、細胞におけるヒストンアセチル化のために必須であることが実証されてきた。新生物プロセスにおいて重要なプロセスであるヒストンアセチル化のために必須であるアセチルCoAを生成するために、ACLが細胞質ゾルのグルコース由来のクエン酸を利用するという事実は、癌細胞機能に影響を与える際のコエンザイムQ10誘導ACL発現の役割を実証する。細胞質ゾルACLによってクエン酸から生成されたアセチル−CoAは、細胞分裂の間の新たな脂質およびコレステロールの生合成のための供給源として働く。したがって、コエンザイムQ10で誘導されるACL発現の変化は、癌細胞に対して正常細胞における脂質およびコレステロールの合成のためのアセチルCoAの利用可能性を変化させる。結果は以下の表に要約される。
ピルビン酸キナーゼM2(PKM2)
ピルビン酸キナーゼは、解糖経路に関わる酵素である。これは、ホスホエノールピルビン酸(PEP)からアデノシン二リン酸(ADP)へのリン酸の転移の原因であり、ATPおよびピルビン酸を生成する。PKM2は、解糖のピルビン酸キナーゼのアイソザイムであり、その発現は組織の代謝機能によって特徴付けられ、すなわち、M2アイソザイムは、胚細胞などの高いエネルギーの必要性を伴う正常細胞を迅速に増殖させる際に発現され、高い率の核酸合成を必要とする肺細胞および膵島細胞などの少数の分化した正常細胞においてもまた発現される。PKM2は、細胞のエネルギーの要求に合致するために解糖経路に対するそれらの依存性に起因して、腫瘍細胞中で高度に発現されている。通常は胚に限定されていると考えられているPKM2アイソフォームは、癌性細胞中で再発現されている。PKM2を発現する細胞は、より強力な好気性解糖表現型を好み(代謝表現型のシフトを示す)、乳酸産生の増加および酸化的リン酸化の減少を伴う。従って、癌細胞におけるPKM2の発現の減少は、解糖経路を経由してエネルギー生成をシフトまたは下方調節し、これは、癌の処置において有用であるストラテジーである。データは、正常細胞および癌細胞におけるPKM2の変動する発現パターンを実証し、癌細胞は正常と比較してより高いレベルの発現を実証する。コエンザイムQ10での細胞の処置は、正常細胞および癌細胞において、PKM2のより上側のおよびより下側のバンドレベルの発現パターンを変化させた(図81〜85)。試験された癌細胞においてPKM2発現の用量依存的な減少が存在し、および癌細胞において大きな変化は観察されなかった。結果は以下の表に要約される。
ピルビン酸キナーゼは、解糖経路に関わる酵素である。これは、ホスホエノールピルビン酸(PEP)からアデノシン二リン酸(ADP)へのリン酸の転移の原因であり、ATPおよびピルビン酸を生成する。PKM2は、解糖のピルビン酸キナーゼのアイソザイムであり、その発現は組織の代謝機能によって特徴付けられ、すなわち、M2アイソザイムは、胚細胞などの高いエネルギーの必要性を伴う正常細胞を迅速に増殖させる際に発現され、高い率の核酸合成を必要とする肺細胞および膵島細胞などの少数の分化した正常細胞においてもまた発現される。PKM2は、細胞のエネルギーの要求に合致するために解糖経路に対するそれらの依存性に起因して、腫瘍細胞中で高度に発現されている。通常は胚に限定されていると考えられているPKM2アイソフォームは、癌性細胞中で再発現されている。PKM2を発現する細胞は、より強力な好気性解糖表現型を好み(代謝表現型のシフトを示す)、乳酸産生の増加および酸化的リン酸化の減少を伴う。従って、癌細胞におけるPKM2の発現の減少は、解糖経路を経由してエネルギー生成をシフトまたは下方調節し、これは、癌の処置において有用であるストラテジーである。データは、正常細胞および癌細胞におけるPKM2の変動する発現パターンを実証し、癌細胞は正常と比較してより高いレベルの発現を実証する。コエンザイムQ10での細胞の処置は、正常細胞および癌細胞において、PKM2のより上側のおよびより下側のバンドレベルの発現パターンを変化させた(図81〜85)。試験された癌細胞においてPKM2発現の用量依存的な減少が存在し、および癌細胞において大きな変化は観察されなかった。結果は以下の表に要約される。
乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)
LDHは、NADHおよびNAD+の同時相互変換を伴う、ピルビン酸および乳酸の相互交換を触媒する酵素である。これは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を負担して、還元当量の生成およびATP生成のための低い細胞酸素の緊張の下で、ピルビン酸をラクテート(乳酸)に転換する能力を有する。癌細胞は、典型的には、ATPおよび還元当量および還元ミトコンドリアOXPHOSを生成するために解糖流入を維持するためにLDHの発現の増加を実証する。したがって、癌細胞における還元当量は、TCA回路にピルビン酸が入ることを容易にするための乳酸の生成から代謝をシフトする。コエンザイムQ10を用いる処置は、癌における乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)発現を減少させ、これは正常細胞においては最小の効果を伴うものであり、細胞質ピルビン酸から乳酸への転換を最小化することによって、解糖からミトコンドリアOXPHOSへのATPの生成のための癌細胞の生体エネルギーのシフトを誘発する際のコエンザイムQ10の役割を支持する。結果は以下の表に要約される。
LDHは、NADHおよびNAD+の同時相互変換を伴う、ピルビン酸および乳酸の相互交換を触媒する酵素である。これは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を負担して、還元当量の生成およびATP生成のための低い細胞酸素の緊張の下で、ピルビン酸をラクテート(乳酸)に転換する能力を有する。癌細胞は、典型的には、ATPおよび還元当量および還元ミトコンドリアOXPHOSを生成するために解糖流入を維持するためにLDHの発現の増加を実証する。したがって、癌細胞における還元当量は、TCA回路にピルビン酸が入ることを容易にするための乳酸の生成から代謝をシフトする。コエンザイムQ10を用いる処置は、癌における乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)発現を減少させ、これは正常細胞においては最小の効果を伴うものであり、細胞質ピルビン酸から乳酸への転換を最小化することによって、解糖からミトコンドリアOXPHOSへのATPの生成のための癌細胞の生体エネルギーのシフトを誘発する際のコエンザイムQ10の役割を支持する。結果は以下の表に要約される。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ−B(PDH−E1)
ピルビン酸デヒドロゲナーゼベータ(PDH−E1)は、ピルビン酸をアセチルCoAに転換するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体(PDC)の一部である第1の酵素成分である。PDH−E1は、その活性のためにチアミンをコファクターとして必要とし、ミトコンドリアにおけるTCAサイクルに入るためにピルビン酸からアセチルCoAへの転換のために必須であるPDC複合体における最初の2つの生化学反応を実施する。したがって、癌細胞におけるPDH−E1の発現の増加に伴って、同時に起こるPKM2およびLDHの発現の減少は、ATPの生成のためにミトコンドリアOXPHOSを増強することに向けてピルビン酸が入ることの速度を増強する。データは、正常細胞および癌細胞系統におけるPDH−E1の発現のために、この酵素のベースライン発現が、正常細胞と比較して、癌細胞で減少されていることを示す。コエンザイムQ10を用いる処置は、癌細胞におけるPDH−E1タンパク質の発現の進行的な増加に関連し、正常細胞においては最小限の変化を伴う。結果は以下の表に要約される。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼベータ(PDH−E1)は、ピルビン酸をアセチルCoAに転換するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体(PDC)の一部である第1の酵素成分である。PDH−E1は、その活性のためにチアミンをコファクターとして必要とし、ミトコンドリアにおけるTCAサイクルに入るためにピルビン酸からアセチルCoAへの転換のために必須であるPDC複合体における最初の2つの生化学反応を実施する。したがって、癌細胞におけるPDH−E1の発現の増加に伴って、同時に起こるPKM2およびLDHの発現の減少は、ATPの生成のためにミトコンドリアOXPHOSを増強することに向けてピルビン酸が入ることの速度を増強する。データは、正常細胞および癌細胞系統におけるPDH−E1の発現のために、この酵素のベースライン発現が、正常細胞と比較して、癌細胞で減少されていることを示す。コエンザイムQ10を用いる処置は、癌細胞におけるPDH−E1タンパク質の発現の進行的な増加に関連し、正常細胞においては最小限の変化を伴う。結果は以下の表に要約される。
カスパーゼ3
アポトーシスの開始の制御は、しばしば、開始因子のカスパーゼである、カスパーゼ−2、−9、および−8/10のレベルで発揮される。外部のアポトーシスの経路において、カスパーゼ−8は、一旦活性になると、実行因子のカスパーゼ(例えば、カスパーゼ−3)を直接切断し、活性化する。活性型カスパーゼ−3は、他のカスパーゼ(6、7、および9)ならびに細胞中の関連する標的(例えば、PARPおよびDFF)を活性化する。これらの研究において、エフェクターカスパーゼ−3タンパク質のレベルは、コエンザイムQ10に応答して、癌細胞系統および正常細胞系統において測定された。アポトーシスの制御は開始因子カスパーゼを通してであり、その代わりに、多数のシグナル伝達経路が、エフェクターカスパーゼの直接阻害を通してアポトーシスシグナルの伝達を遮断することが注目されるべきである。例えば、P38MAPKは、カスパーゼ−3をリン酸化し、その活性を抑制する(Alvarado−Kristensson et al.,2004)。興味深いことに、同じ研究におけるタンパク質ホスファターゼ(PP2A)またはプロテインキナーゼCデルタ(PKCデルタ)の活性化(Voss et al.,2005)は、カスパーゼ−3活性化を増幅し、そしてアポトーシスシグナルの伝達を強化するように、p38MAPKの効果と反対に作用できる。それゆえに、カスパーゼ−3活性化のレベルにおける事象またはカスパーゼ3活性化後の事象は、いくつかの場合において細胞の究極の運命を決定するかもしれない。
アポトーシスの開始の制御は、しばしば、開始因子のカスパーゼである、カスパーゼ−2、−9、および−8/10のレベルで発揮される。外部のアポトーシスの経路において、カスパーゼ−8は、一旦活性になると、実行因子のカスパーゼ(例えば、カスパーゼ−3)を直接切断し、活性化する。活性型カスパーゼ−3は、他のカスパーゼ(6、7、および9)ならびに細胞中の関連する標的(例えば、PARPおよびDFF)を活性化する。これらの研究において、エフェクターカスパーゼ−3タンパク質のレベルは、コエンザイムQ10に応答して、癌細胞系統および正常細胞系統において測定された。アポトーシスの制御は開始因子カスパーゼを通してであり、その代わりに、多数のシグナル伝達経路が、エフェクターカスパーゼの直接阻害を通してアポトーシスシグナルの伝達を遮断することが注目されるべきである。例えば、P38MAPKは、カスパーゼ−3をリン酸化し、その活性を抑制する(Alvarado−Kristensson et al.,2004)。興味深いことに、同じ研究におけるタンパク質ホスファターゼ(PP2A)またはプロテインキナーゼCデルタ(PKCデルタ)の活性化(Voss et al.,2005)は、カスパーゼ−3活性化を増幅し、そしてアポトーシスシグナルの伝達を強化するように、p38MAPKの効果と反対に作用できる。それゆえに、カスパーゼ−3活性化のレベルにおける事象またはカスパーゼ3活性化後の事象は、いくつかの場合において細胞の究極の運命を決定するかもしれない。
カスパーゼ−3はシステイン−アスパラギン酸プロテアーゼであり、これは、細胞アポトーシスの実行フェーズで中心的な役割を果たす。癌細胞におけるカスパーゼ3のレベルは、コエンザイムQ10処置に伴って増加される。対照的に、正常細胞におけるカスパーゼ−3の発現は、正常細胞において中程度に減少された。結果は以下の表に要約される。
コハク酸デヒドロゲナーゼ(SDH)
コハク酸−コエンザイムQ還元酵素としてもまた知られるコハク酸デヒドロゲナーゼは、TCAと電子伝達系の両方に関わるミトコンドリア内膜の複合体である。TCAにおいては、この複合体は、ユビキノンからユビキノールへの同時に起こる還元に伴って、コハク酸からフマル酸への酸化を触媒する(Baysal et al.,Science 2000;およびTomlinson et al.,Nature Genetics 2002)。SDHのB、C、およびDサブユニットにおける生殖系列突然変異は、家族性傍神経節腫または平滑筋腫の開始事象であることが見い出された(Baysal et al.,Science 2000)。
コハク酸−コエンザイムQ還元酵素としてもまた知られるコハク酸デヒドロゲナーゼは、TCAと電子伝達系の両方に関わるミトコンドリア内膜の複合体である。TCAにおいては、この複合体は、ユビキノンからユビキノールへの同時に起こる還元に伴って、コハク酸からフマル酸への酸化を触媒する(Baysal et al.,Science 2000;およびTomlinson et al.,Nature Genetics 2002)。SDHのB、C、およびDサブユニットにおける生殖系列突然変異は、家族性傍神経節腫または平滑筋腫の開始事象であることが見い出された(Baysal et al.,Science 2000)。
ウェスタンブロッティング分析は、コエンザイムQ10で処置された癌細胞のミトコンドリア調製物においてSDHサブユニットBの発現を特徴付けるために使用された。結果は、コエンザイムQ10処置が、細胞のミトコンドリアにおけるSDHタンパク質レベルの増加に関連することを示唆する。これらの結果は、コエンザイムQ10の作用のメカニズムの1つがTCA回路およびミトコンドリアに向かう細胞の代謝を、SDHBなどのミトコンドリア酵素のレベルを増加することによってシフトされることを示唆する。結果は以下の表に要約される。
低酸素誘導因子−1
低酸素誘導因子(Hif)は、αおよびβサブユニットから構成される転写因子である。酸素正常状態下では、Hif1αのタンパク質レベルは、翻訳後事象の結果を介するその連続的な分解により、非常に低い。解糖と酸化的リン酸化の間のシフトは、一般的には、ピルビン酸の異化的な運命を決定する2つの酵素PDHおよびLDHの相対的な活性によって制御されると考えられる。Hifは、PDKを刺激することによって、LDHレベルを誘導し、PDH活性を阻害することによって、この決定的な分岐(bifurgation)点を制御する。ミトコンドリアから細胞質ゾルにピルビン酸代謝を迂回させるこの能力により、Hifは、癌細胞における生体エネルギーのスイッチの決定的な媒介因子であると考えられる。
低酸素誘導因子(Hif)は、αおよびβサブユニットから構成される転写因子である。酸素正常状態下では、Hif1αのタンパク質レベルは、翻訳後事象の結果を介するその連続的な分解により、非常に低い。解糖と酸化的リン酸化の間のシフトは、一般的には、ピルビン酸の異化的な運命を決定する2つの酵素PDHおよびLDHの相対的な活性によって制御されると考えられる。Hifは、PDKを刺激することによって、LDHレベルを誘導し、PDH活性を阻害することによって、この決定的な分岐(bifurgation)点を制御する。ミトコンドリアから細胞質ゾルにピルビン酸代謝を迂回させるこの能力により、Hifは、癌細胞における生体エネルギーのスイッチの決定的な媒介因子であると考えられる。
コエンザイムQ10での処置は、癌細胞のミトコンドリア調製物において、後でのHif1αタンパク質レベルを減少させた。正常細胞の全細胞溶解物において、Hif1aの下側のバンドが観察され、同様に減少を示した。結果は以下の表に要約される。
実施例43 CoQ10で処置された正常細胞および癌細胞における酸素消費速度(OCR)および細胞外酸性化(ECAR)の分析
この実施例は、ストレッサー(例えば、高血糖、低酸素、乳酸)の非存在下および/または存在下で、本発明の代表的なMIM/エピシフター−CoQ10−による処置への細胞の曝露が、正常な生理学的条件下での正常細胞において観察される値を代表する解糖/乳酸生合成およびミトコンドリア酸化的リン酸化(ECARおよびOCR値によって測定されるような)へのシフトと関連することを実証する。
この実施例は、ストレッサー(例えば、高血糖、低酸素、乳酸)の非存在下および/または存在下で、本発明の代表的なMIM/エピシフター−CoQ10−による処置への細胞の曝露が、正常な生理学的条件下での正常細胞において観察される値を代表する解糖/乳酸生合成およびミトコンドリア酸化的リン酸化(ECARおよびOCR値によって測定されるような)へのシフトと関連することを実証する。
出願人は、癌細胞中のCoQ10での処置が、解糖および乳酸生合成の同時に起こる減少を伴う、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を増強する特定のタンパク質の発現の変化と関連することを先のセクションで実証した。この実施例は、インビトロ実験モデルにおける溶存酸素および細胞外pHレベルを測定する機器であるSeaHorse XF分析装置(SeaHorse Biosciences Inc,North Billerica,MA)を使用して細胞系統において酸素消費速度(OCR)を測定することによって、ミトコンドリアの酸化的リン酸化の直接測定を得ることができることを示す。
細胞外微小環境のpHは、腫瘍中では、細胞内(細胞質)および周囲の正常組織のpHと比較して、比較的酸性である。この腫瘍の特徴は、細胞外マトリックス(ECM)に侵入する能力、続いてシグナル伝達カスケードを開始する腫瘍転移の代表的な特質を含む複数の目的に役立ち、このシグナル伝達カスケードは、以下をさらに調節する:
・腫瘍の血管新生
・細胞周期のターンオーバーを制御する停止メカニズムの活性化の増加
・免疫学的監視に対する細胞の回避システムを容易にする免疫調節メカニズム
・解糖流入および乳酸利用への依存性を増加する代謝制御エレメント
・発癌性を増加させるように働く、Bcl−2、IAP、EndoG、AIFなどの鍵となるアポトーシス遺伝子ファミリーの異常調節。
・腫瘍の血管新生
・細胞周期のターンオーバーを制御する停止メカニズムの活性化の増加
・免疫学的監視に対する細胞の回避システムを容易にする免疫調節メカニズム
・解糖流入および乳酸利用への依存性を増加する代謝制御エレメント
・発癌性を増加させるように働く、Bcl−2、IAP、EndoG、AIFなどの鍵となるアポトーシス遺伝子ファミリーの異常調節。
任意の特定の理論に束縛されることは望まないが、腫瘍における外部微小環境の酸性pHは、解糖表現型の変化からの乳酸産生の増加に起因する、腫瘍細胞から押し出された水素イオン濃度の増加の結果である。
この実験において、正常細胞系統におけるOCRおよび細胞外酸性化速度(ECAR)は、ベースラインの値を決定するために、CoQ10の存在下および非存在下で得られた。そのネイティブな栄養環境において、正常細胞系統における基礎OCR速度は異なっており、通常は、身体中の細胞の生理学的役割の関数であることが観察された。
例えば、1つのセットの実験は、ヒト成体皮膚線維芽細胞系統である、非癌性細胞系統HDFaを使用して実施された。線維芽細胞は、最初に合成され、組織のために構造フレームワーク(ストロマ)を形成する、細胞外マトリックス(ECM)成分およびコラーゲンを分泌する。加えて、線維芽細胞は、創傷治癒および局所的免疫調節などの多数の機能の組織の使節(ambassadors)として働くことが知られている。正常な生理学的条件下では、正常な線維芽細胞におけるエネルギー要求は、解糖と酸化的リン酸化の組み合わせを使用することに合致する−解糖はECMの合成のための必要な栄養を提供する。
HDFaと対照的に、HASMC(ヒト大動脈平滑筋細胞)は、動脈、静脈、リンパ管、胃腸管、呼吸管、膀胱、および興奮−収縮結合の調節を受ける能力を有する他の組織において見い出される。HASMC細胞などの平滑筋の収縮を受ける能力はATPによって提供されるエネルギーを要求する。これらの組織は、ATPがミトコンドリアから供給され得る低いエネルギーモードから、迅速なATPの生成のために解糖に切り換えることによってエネルギーが提供される高エネルギーモード(運動/ストレスの間)に移行する。したがって、正常平滑筋細胞は、ミトコンドリアOXPHOSと解糖の組み合わせを使用でき、正常な生理学的環境下でのそれらのエネルギー要求を満たす。
それらのそれぞれの生理学的役割(すなわち、HDFaおよびHASMC)の違いは、SeaHorse XF分析装置を使用してこれらの細胞系統において測定される休止状態のOCR値で観察された。以下の図37および38は、生理学的に正常なグルコース(約4.6mM)状態および高グルコース(高血糖)状態において増殖されたHDFaおよびHASMC細胞におけるOCRを説明している。
正常な酸素利用能下でのいかなる処置も存在しないHDFaについてのベースラインOCR値は、5.5mMグルコースの存在下で約40ピコモル/分(図37;上記)である。この値は、細胞が22mMグルコースに維持されたときにわずかに上昇された。対照的に、HASMC細胞において、5.5mMグルコースにおけるOCR値は約90ピコモル/分であり、OCR値は、22mMグルコースの間に約40ピコモル/分まで下降した。したがって、高血糖条件下では、HDFaとHASMCの間の示差的な応答が存在し、それらのそれぞれの生理学的な構成および機能における固有の違いをさらに実証する。
細胞におけるCoQ10での処置は、正常(5mM)グルコース条件において観察された状態に代表的であるOCRの変化と関連する。生理学的応答の複雑性は、低酸素緊張の存在下で混合される。したがって、CoQ10曝露は、特定の細胞に対して固有である生理学的状態に向かう正常細胞中のOCR速度の変化と関連する。
以下の表97は、5.5mMおよび22mMグルコースにおける正常酸素および低酸素条件下でのCoQ10の存在下および非存在下でのHDFa細胞中のECAR値(mpH/分)を説明する。正常細胞において、CoQ10での処置は、それがたとえこれらの細胞においてOCRに影響を与えたとしても、ECAR値に対して最小限の影響を有したことが観察できる。高グルコース低酸素条件において、CoQ10での処置は、未処置の正常酸素条件において観察された値までの、上昇したECARの低下に関連した。
表98において、HASMCにおける測定されたベースラインECAR値(mpH/分)はHDFaのそれと比較して高かった。低酸素状態の誘導は、解糖の増加に続いて起こる細胞内低酸素誘導性アシドーシスと関連する可能性が最も高いECARの増加を引き起こした。
CoQ10での処置は、正常酸素での正常グルコース条件において観察される値に向けた低酸素条件における高血糖HASMC細胞におけるECAR速度の下向きの傾向と関連することが観察された。これらのデータは、特定の細胞の型の生理学的役割に固有である生理学的変数、異常な状態において観察される変化(例えば、高血糖)の存在が、CoQ10で処置されたときに正常に向けてシフトされることを実証する。
対照的に、癌細胞(例えば、MCF−7、PaCa−2)は、培養中の維持のための解糖表現型に起因して、正常細胞と比較してより高いレベルのグルコースでの培養に固有に準備されている。CoQ10での処置は、OCR値の一貫した減少を引き起こした(図39および図40)。
MCF−7およびPaCa−2細胞におけるOCR値に対するCoQ10の効果は、正常HDFaおよびHASMC細胞のそれと類似しており、この変動性応答は、癌細胞系統の個々の代謝プロフィールに基づいて治療応答を示唆するものであった。
表99は、PaCa−2細胞におけるECAR値を記載する。正常細胞と比較して、癌細胞は、ATP生成のために高グルコースを使用するように表現型的に準備されており(解糖の増強)、21mpH/分でより高いECARを生じる(表99、未処置正常酸素についてのECAR17mM)。CoQ10での処置は、解糖で生成された乳酸の減少に付随する可能性が最も高い、これらの条件下でのECAR速度の有意な減少を生じる。これらの細胞におけるOCRの関連する減少は、ミトコンドリアOXPHOSの効率の増加と最も関連したようであった。
OCRおよびECARの同様の比較(データ示さず)は、HAEC(正常ヒト大動脈内皮細胞)、MCF−7(乳癌)、HepG2(肝臓癌)、および高度に転移性のPC−3(前立腺癌)細胞系統を含む多数の他の正常細胞および癌細胞において決定された。試験された細胞系統のすべてにおいて、ストレッサー(例えば、高血糖、低酸素、乳酸)の非存在下および/または存在下でのCoQ10への曝露は、正常の生理学的条件下での正常細胞において観察される値に代表的なOCRおよびECARの値のシフトと関連した。したがって、細胞死を含む、癌の処置におけるCoQの全体的な効果は、解糖からミトコンドリアOXPHOSへの細胞の生体エネルギーのシフトと協調した、プロテオミクス的、ゲノム的、代謝学な結果に対するその集合的な影響の下流の効果である。
実施例44 CoQ10の生合成のためのビルディングブロック分子
この実施例は、CoQ10生合成の特定の前駆体、例えば、ベンゾキノン環の生合成のためのもの、およびイソプレノイド反復の生合成のためのもの、ならびにベンゾキノン環へのそれらの付属物(「ビルディングブロック成分」)が、単独で投与でき、もしくは標的細胞と組み合わせて投与でき、ならびにアポトーシス阻害剤Bcl−2の下方調節、および/またはアポトーシス促進因子カスパーゼ−3の上方調節をもたらすことを実証する。特定の前駆体またはそれらの組み合わせは、細胞増殖もまた阻害し得る。データは、CoQ10投与と実質的に同じ結果を達成するために、CoQ10前駆体がCoQ10の代わりに使用されてもよいことを示唆する。
この実施例は、CoQ10生合成の特定の前駆体、例えば、ベンゾキノン環の生合成のためのもの、およびイソプレノイド反復の生合成のためのもの、ならびにベンゾキノン環へのそれらの付属物(「ビルディングブロック成分」)が、単独で投与でき、もしくは標的細胞と組み合わせて投与でき、ならびにアポトーシス阻害剤Bcl−2の下方調節、および/またはアポトーシス促進因子カスパーゼ−3の上方調節をもたらすことを実証する。特定の前駆体またはそれらの組み合わせは、細胞増殖もまた阻害し得る。データは、CoQ10投与と実質的に同じ結果を達成するために、CoQ10前駆体がCoQ10の代わりに使用されてもよいことを示唆する。
実験において使用された特定の例示的な実験条件は以下に列挙される。
Skmel−28黒色腫細胞は、5%ウシ胎仔血清(FBS)および1×最終濃度の抗生物質を補充したDMEM/F12中で培養された。細胞は、85%コンフルエンシーまで増殖され、3、6、12、および24時間の間、ビルディングブロック成分で処置された。次いで、細胞はペレット化され、ウェスタンブロット分析が実施された。
試験ビルディングブロック成分は、L−フェニルアラニン、DL−フェニルアラニン、D−フェニルアラニン、L−チロシン、DL−チロシン、D−チロシン、4−ヒドロキシ−フェニルピルビン酸、フェニル酢酸、3−メトキシ4−ヒドロキシマンデル酸(バニリルマンデル酸またはVMA)、バニリン酸、4−ヒドロキシ−ベンゾエート、ピリドキシン、パンテノール、メバロン酸、アセチルグリシン、アセチル−CoA、ファルネシル、および2,3−ジメトキシ−5−メチル−p−ベンゾキノンを含んだ。
ウェスタンブロット分析において、細胞は冷PBS中でペレット化され、溶解され、そしてタンパク質レベルはBCAタンパク質アッセイを使用して定量された。全細胞溶解物は、4%ローディング12%泳動Tris−HClゲルにロードされた。次いで、タンパク質はニトロセルロースペーパーに転写され、次いで、5%ミルクTris緩衝液で1時間ブロックされた。次いで、タンパク質は、一次抗体(Bcl−2およびカスパーゼ−3)に一晩曝露された。次いで、ニトロセルロースペーパーは、Pico Chemilluminescentに5分間曝露され、タンパク質発現が記録された。曝露後、アクチンが同じ方法を使用して定量された。ImageJを使用して、タンパク質発現のレベルが定量された。t検定が使用されて統計学的有意さについて分析した。
実験の例証的な結果は以下に要約される。
ビルディングブロック成分L−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析:キノン環構造についての合成経路に着手する前に、L−フェニルアラニンがチロシンに転換される。ウェスタンブロット分析は、黒色腫細胞におけるアポトーシスタンパク質の発現の任意の変化を定量するように実施された。試験された濃度は5μM、25μM、および100μMであった。初期の研究は、0.4Mの濃度のフェニルアラニンを含んだDMEM/F12培地にL−フェニルアラニンを加えた。5μM、25μM、および100μMについては、培地中のL−フェニルアラニンの最終濃度は、それぞれ、0.405M、0.425M、および0.500Mであった。これらの最終濃度は、3、6、12、および24時間のインキュベーション時間の間、Skmel−28細胞に対して試験された。細胞は、80%コンフルエンシーまで増殖され、その後、処置培地を加え、上記のようにウェスタンブロット分析手順を使用して収穫された。統計学的に有意なBcl−2の減少は、3時間および12時間のインキュベーション後に、100μM L−フェニルアラニンについて観察された。5μM L−フェニルアラニンについては、統計学的に有意なBcl−2の減少は、インキュベーションの6時間後に観察された。25μM L−フェニルアラニンについては、統計学的に有意なBcl−2の減少、および統計学的に有意なカスパーゼ−3の増加が12時間のインキュベーション後に観察された。統計学的に有意なBcl−2の減少は、アポトーシス能力の変化を示し、統計学的に有意なカスパーゼ−3の増加は細胞がアポトーシスを受けていることを確認する。たとえ試料サイズおよび標準偏差に起因して、この実験においてこれらの時点は統計学的に有意ではないとしても、対照と比較してBcl−2の減少の一定の傾向が存在した。
ビルディングブロック成分D−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析:生物活性L−フェニルアラニンの化学合成型であるD−フェニルアラニンは、L−フェニルアラニンに対する比較のために試験された。3つすべての濃度について(5μM、25μM、および100μMのD−フェニルアラニン)、インキュベーションの6時間後にBcl−2発現の有意な減少が存在した。加えて、5μMおよび25μMについては、インキュベーションの3時間後に有意な減少が存在した。5μMおよび100μM濃度については、カスパーゼ−3発現の有意な増加が、6時間のインキュベーション後に観察された。
ビルディングブロック成分DL−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析:DL−フェニルアラニンもまた、L−フェニルアラニンとの比較のために試験された。再度、5μM、25μM、および100μMの濃度がSkmel−28細胞に対して試験された。インキュベーション時間は、3、6、12、および24時間であった。統計学的に有意なカスパーゼ−3の増加が3時間のインキュベーション後に観察された。統計学的に有意なBcl−2の減少が24時間のインキュベーション後に観察された。Bcl−2の減少およびカスパーゼ−3の増加の傾向が、すべての他の濃度およびインキュベーション時点であるが、これらは、この実験においては統計学的に有意ではなかった。
ビルディングブロック成分L−チロシンのウェスタンブロット分析:L−チロシンはCoQ10のキノン環構造の合成のためのビルディングブロック成分である。L−チロシンの初期の試験は、ウェスタンブロット分析のために十分に高いタンパク質濃度を生じなかった。この研究から25μMより下の濃度がウェスタンブロット分析のために試験された。使用されたDMEM/F12培地は、0.398467MのL−チロシン二ナトリウム塩を含んだ。初期濃度は500nM、5μM、および15μM増加された。統計学的に有意なカスパーゼ−3の増加は、12時間のインキュベーション後に500nM濃度について観察された。統計学的に有意なカスパーゼ−3の増加もまた、5Aについて観察され、統計学的に有意なBcl−2の減少は、24時間のインキュベーション後に5μM濃度について観察された。統計学的に有意なBcl−2の減少は、24時間のインキュベーション後に500μMおよび5μM濃度について観察された。
ビルディングブロック成分D−チロシンのウェスタンブロット分析:L−チロシンの合成型であるD−チロシンは、黒色腫(melanonal)細胞に対するL−チロシンのアポトーシス性効果に対しての比較のために試験された。L−チロシンを用いる初期の研究に基づいて、ウェスタンブロット分析のために25μMより下の濃度が選ばれた。試験された濃度は1μM、5μM、および15μMであった。D−チロシンは、12および24時間の期間の間、5μMおよび15μM濃度についてBcl−2発現の減少を示した。カスパーゼ−3は、3、12、および24時間の期間で、5μM濃度について有意に増加された。12および24時間の期間で、1μMについてカスパーゼ−3発現の増加もまた存在した。加えて、12時間の期間で、5μMについてカスパーゼ−3発現の増加が存在する。
ビルディングブロック成分DL−チロシンのウェスタンブロット分析:L−チロシンの合成型であるDL−チロシンもまた、細胞に対するL−チロシンのアポトーシス効果に対する比較のために試験された。12時間のインキュベーション後に1μMおよび15μM濃度において、ならびに24時間のインキュベーション後に5μMについて見られたBcl−2発現の統計学的な減少が存在する。カスパーゼ−3発現の増加もまた、12時間のインキュベーション後に5μMおよび15μMについて観察された。
ビルディングブロック成分4−ヒドロキシ−フェニルピルビン酸のウェスタンブロット分析:4−ヒドロキシ−フェニルピルビン酸は、アミノ酸であるチロシンおよびフェニルアラニンから誘導され、環構造の合成において役割を果たす可能性がある。1μM、5μM、および15μMの濃度がBcl−2およびカスパーゼ−3発現のために試験された。5μMおよび15μM濃度について、24時間のインキュベーション後にBcl−2発現の有意な減少が存在し、12時間のインキュベーション後にカスパーゼ−3発現の有意な増加が存在した。
ビルディングブロック成分フェニル酢酸のウェスタンブロット分析:フェニル酢酸は、4−ヒドロキシ−ベンゾエートに転換される能力を有し、これは、環構造への側鎖の結合において役割を果たす。試験された濃度は、1μM、5μM、および15μMであった。フェニル酢酸については、12時間および24時間のインキュベーション後に5μMおよび15μMの濃度についてBcl−2発現の減少が存在した。カスパーゼ−3発現の増加は、12時間および24時間のインキュベーション後に5μMおよび15μMの濃度について観察された。
ビルディングブロック成分3−メトキシ4−ヒドロキシマンデル酸(バニリルマンデル酸またはVMA)のウェスタンブロット分析:VMAは、CoQ10キノン環構造の合成のためのさらなる成分である。試験された濃度は100nM、250nM、500nM、1μM、25μM、50μM、および100μMであった。統計学的に有意なアポトーシス効果はこの実験において観察されなかったが、データはBcl−2発現の下向きの傾向を示した。
ビルディングブロック成分バニリン酸のウェスタンブロット分析:バニリン酸(Vanillic)はキノン環の合成のための前駆体であり、500nm、5μM、および15μMの濃度で試験された。ウェスタンブロット分析は、Bcl−2およびカスパーゼ−3発現を測定した。バニリン酸は24時間インキュベーション時点での500nMおよび5μMの濃度についてBcl−2発現を有意に減少することが示された。15μM濃度について、3時間のインキュベーション後にBcl−2発現の減少が存在した。24時間、15μMとともにインキュベートした細胞において、カスパーゼ−3発現の有意な増加が存在した。
ビルディングブロック成分4−ヒドロキシベンゾエートのウェスタンブロット分析:4−ヒドロキシベンゾエートは、環構造へのイソプレノイド側鎖の結合において役割を果たす。試験された濃度は、500nM、1μM、および50μMであった。24時間のインキュベーション後、15μM濃度でBcl−2発現の有意な減少が存在した。
ビルディングブロック成分4−ピリドキシンのウェスタンブロット分析:ピリドキシンはCoQ10のキノン環構造の合成のための別の前駆体ビルディングブロックである。この化合物のために試験された濃度は、5μM、25μM、および100μMである。細胞はBcl−2およびカスパーゼ−3のそれらのレベルについてアッセイされた。ピリドキシンは黒色腫細胞中での24時間のインキュベーション後にBcl−2の有意な減少を示した。
ビルディングブロック成分パンテノールのウェスタンブロット分析:パンテノールはCoQ10のキノン環構造の合成において役割を果たす。黒色腫細胞に対して試験された濃度は5μM、25μM、および100μMである。この化合物は、25μM濃度についてBcl−2発現の有意な減少を示した。
ビルディングブロック成分メバロン酸(Mevalonic)のウェスタンブロット分析:メバロン酸はCoQ10の合成のための主要な成分の1つである。この化合物は、500nM、1μM、25μM、および50μMの濃度で試験された。この実験において、Bcl−2発現の有意な減少またはカスパーゼ−3発現の有意な増加は存在しなかった。
ビルディングブロック成分アセチルグリシンのウェスタンブロット分析:CoQ10の合成のための別の経路は、イソプレノイド(側鎖)合成である。アセチルグリシンの付加は、コエンザイムAをアセチル−CoAに転換し、これは、イソプレノイド合成のためのメバロン酸経路に入る。試験された濃度は5μM、25μM、および100μMであった。アセチルグリシンの試験は、5μMおよび25μMの濃度についての12時間のインキュベーション後にBcl−2発現の有意な減少を示した。Bcl−2の有意な減少は、24時間インキュベーションの時点で100μM濃度について記録された。
ビルディングブロック成分アセチル−CoAのウェスタンブロット分析:アセチル−CoAはCoQ10の合成のためのメバロン酸経路のための前駆体である。試験された濃度は500nm、1μM、25μM、および50μMであった。試験された時点および濃度について、Bcl−2発現の有意な減少またはカスパーゼ−3発現の有意な増加は観察されなかった。
ファルネシルと組み合わせたビルディングブロック成分L−チロシンのウェスタンブロット分析:L−チロシンは、CoQ10のキノン環構造の合成のための前駆体の1つである。以前の実験は、L−フェニルアラニンおよびL−チロシンとの、培地中のL−チロシンの反応を試験した。本研究において、L−チロシンは、L−フェニルアラニンおよびL−チロシンの添加なしの培地中で試験された。本研究において、試験されたL−チロシンの最終濃度は、500nM、5μM、および15μMであった。ファルネシルは、50μMの濃度で試験された。3時間および6時間の時点について、有意な応答は観察されなかった。
ファルネシルと組み合わせたビルディングブロック成分L−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析:キノン環構造の合成のための前駆体であるL−フェニルアラニンは、L−チロシンおよびL−フェニルアラニンを含まない培地中でファルネシルと組み合わせて試験された。ウェスタンブロット分析は、Bcl−2およびカスパーゼ−3の発現をアッセイするために実施された。L−フェニルアラニンの最終濃度は、5μM、25μM、および100μMであった。ファルネシルは50μMの濃度で加えられた。本研究は、以下の表に示されるような試験された濃度および組み合わせの多くについてBcl−2発現の減少を示した。
4−ヒドロキシ−ベンゾエートのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ:この実験のセットは、細胞増殖に対する異なるビルディングブロック分子を組み合わせることの効果を評価するための細胞増殖アッセイを使用した。
最初の研究は、4−ヒドロキシ−ベンゾエートをベンゾキノンと組み合わせる効果を試験した。細胞は48時間インキュベートされ、その後、細胞の計数が生細胞について実施された。各試験群は対照と比較され、各組み合わせ群はベンゾキノン対照と比較された。化合物はベンゾキノンの付加のために統計学的に分析された。以下の表は細胞計数結果を要約し、ここで、X印は細胞数の統計学的な減少を示す。
4−ヒドロキシベンゾエート(4−hydroxybenzoic)およびベンゾキノンおよび組み合わせとともにインキュベートされた細胞の細胞数の有意な減少が存在した。70μMベンゾキノンと組み合わせた50μM 4−ヒドロキシベンゾエートの組み合わせについて、ベンゾキノン対照と比較して細胞数の有意な減少が存在した。これは、このモル比についての相乗効果を示唆する。
さらなるモル比を試験するさらなる研究が実施された。最初の試験において、4−ヒドロキシベンゾエート(4−hydroxybenzoic)は、500nM、1μM、および50μMの濃度で試験された。これらの濃度は、2,3−ジメトキシ−5−メチル−p−ベンゾキノン(Benzo)との組み合わせで試験された。試験されたBenzoの濃度は25μM、50μM、および100μMであった。黒色腫細胞は80%コンフルエンシーまで増殖され、ウェルあたり40K細胞の濃度で、6ウェルプレートに播種された。細胞は、CoQ10、4−ヒドロキシベンゾエート、Benzo、および4−ヒドロキシベンゾエート/Benzoの組み合わせで処置された。
T−検定が、p<0.05を統計学的に有意であるとして実施された。Xは細胞数の統計学的減少を意味する。
HBを含有する処置培地について細胞増殖の有意な減少が存在する。さらに、ベンゾキノンとのHBの組み合わせは、対応するベンゾキノン濃度とともにインキュベートされた細胞と比較して、細胞数の有意な減少を示した。
細胞増殖アッセイもまた、新生児線維芽細胞に対して実施された。試験されたHBの濃度は、500nM、5μM、および25μMであった。HBはまた、25μM、50μM、および100μMの濃度でベンゾキノンと組み合わせて試験された。黒色腫細胞は、ウェルあたり40k細胞で播種され、24時間の間処置された。細胞はトリプシン処理され、コールターカウンターを使用して定量された。
統計学的分析は、線維芽細胞の有意な減少を示さなかった。このことは、正常細胞における毒性は、最小限から全くないまでであることを示す。
フェニル酢酸とベンゾキノンの組み合わせの細胞増殖アッセイ:フェニル酢酸は、4−ヒドロキシ安息香酸(環構造の結合を容易にする)の合成の前駆体である。細胞増殖アッセイが、CoQ10およびベンゾキノンと組み合わせてフェニル酢酸をインキュベートすることの効果をアッセイするために実施された。
データは、ベンゾキノンと組み合わせたフェニル酢酸の付加が、細胞増殖を有意に減少したことを示す。CoQ10とフェニル酢酸の組み合わせは、CoQ10およびベンゾキノンの単独とのインキュベーションと比較して、細胞数を有意に減少する。
4−ヒドロキシ−ベンゾエートのファルネシルとの組み合わせの細胞増殖アッセイ:4−ヒドロキシ−ベンゾエートは、ファルネシルと組み合わせてインキュベートされた。結果の要約は以下に列挙される。4−ヒドロキシベンゾエートグループは対照およびファルネシル対照グループと比較された。Xは細胞数の統計学的減少を意味する。
L−フェニルアラニンのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ:細胞増殖アッセイは、ベンゾキノンと組み合わせたL−フェニルアラニンの組み合わせを試験するために実施された。以下は、対照およびベンゾキノン対照と比較されたL−フェニルアラニンの結果の要約である。Xは統計学的な減少を意味する。
同様の相乗作用的役割は、ベンゾキノンと組み合わせたL−フェニルアラニンについて見られる。
L−フェニルアラニンのファルネシルとの組み合わせの細胞増殖アッセイ:ファルネシルと組み合わせてインキュベートされたL−フェニルアラニンの組み合わせ細胞増殖研究の予備的結果。L−フェニルアラニンは、対照およびファルネシル対照グループに対して比較された。Xは細胞数の統計学的減少を意味する。
L−チロシンのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ:L−チロシンはベンゾキノンと組み合わせてインキュベートされ、その後、細胞計数が実施された。グループは、対照グループおよびベンゾキノン対照グループと比較された。
ベンゾキノンの付加は、細胞数に対するL−チロシンの効果を増幅しなかった。
L−チロシンのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ:本研究は、L−チロシンのファルネシルとの組み合わせを試験した。グループは対照およびファルネシル対照グループと比較された。
L−チロシンおよびファルネシルを組み合わせることは、この実験において細胞数を減少させることに対して相乗作用を有するようには見えない。
CoQ10の合成は2つの主要部分に分けられ、これは、環構造の合成および側鎖構造の合成からなる。ここで、発癌性細胞は、側鎖および環構造の構成要素の合成のための前駆体である化合物が補充された。本発明者らの結果は、環構造、および側鎖構造への環構造の結合において役割を果たす2つの化合物の合成に関与する3つの主要な構成要素に研究の焦点を当ててきた。Bcl−2の有意な減少を示し、カスパーゼ−3発現を増加するこれら3つの化合物は、1)L−フェニルアラニン、2)L−チロシン、および3)4−ヒドロキシフェニルピルビン酸である。側鎖の環構造への結合に関与する2つの化合物は、1)4−ヒドロキシベンゾエートおよび2)フェニル酢酸である。
本発明者らの結果はまた、2,3ジメトキシ5−メチル−p−ベンゾキノン(ベンゾキノン)と組み合わせたこれらの化合物の外因性送達が、細胞増殖を有意に阻害することを示した。このことは、ベンゾキノン環への側鎖の結合のための化合物での環構造の補充は、損なわれたCoQ10合成メカニズムを補充し得ることを示す。このことはまた、細胞プロセスによって必要とされる機能的特性を維持するために分子の安定化を補助し得る。フェニル酢酸は、4−ヒドロキシベンゾエートの合成のための前駆体であり、ベンゾキノンと組み合わせたこの外因性送達は、発癌性細胞において同様の効果を有する。
実施例45 糖尿病のための細胞モデルにおけるコエンザイムQ10による遺伝子発現の調節
コエンザイムQ10は、酸化的リン酸化に直接的に影響を与えることによって正常なミトコンドリア機能の維持において確立された役割を有する内因性分子である。糖尿病などの代謝性障害の鍵となる指標として治療の終点を示す様式で働く細胞内標的を調節する際のコエンザイムQ10の能力を実証する実験的な証拠が提示されている。
糖尿病の原因または処置に関連する遺伝子の発現をコエンザイムQ10がいかにして調節するかを理解するために、ヒト腎臓由来の不死化初代腎臓近位尿細管細胞系統(HK−2)およびヒト大動脈平滑筋細胞(HASMC)の初代培養が実験モデルとして使用された。HK−2およびHASMC細胞は、5.5mMグルコースで培養中に正常に維持され、これは、ヒト血液中で正常と考えられる範囲に対応する濃度である。しかし、糖尿病環境を刺激するために、両方の細胞系統は、続いて、22mMグルコースに維持され、これは、慢性高血糖に関連するヒト血液中で観察される範囲に対応する。続いて、細胞内調節プロセスが糖尿病状態を模倣するように機能的に適合されるように、細胞は3継代にわたり増殖させた。細胞系統の選択は、損なわれた心臓血管機能の進行性の病態生理学に加えて、腎機能不全および末期の腎臓病(ESRD)への進行に対する糖尿病の生理学的影響に基づいた。
糖尿病PCRアレイを使用するHK−2細胞における遺伝子発現に対するコエンザイムQ10の効果
糖尿病PCRアレイ(SABiosciences)は、同時に84種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された4種の処置は以下の通りである。
・HK−2;
・HK−2 H維持された22mMグルコース;
・HK2(H)+50μMコエンザイムQ10;および
・HK2(H)+100μMコエンザイムQ10。
糖尿病PCRアレイ(SABiosciences)は、同時に84種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された4種の処置は以下の通りである。
・HK−2;
・HK−2 H維持された22mMグルコース;
・HK2(H)+50μMコエンザイムQ10;および
・HK2(H)+100μMコエンザイムQ10。
糖尿病アレイ(カタログ番号PAHS−023E,SABiosciences Frederick MD)に対するHK−2試料のリアルタイムPCRデータのストリンジェント分析は、遺伝子調節がHK−2正常未処置細胞よりも少なくとも2倍の調節ではなく、0.05未満のp値であるすべての結果を排除するように行われた。慢性高血糖またはコエンザイムQ10のいずれかによって調節されることが観察された遺伝子が表100に列挙され、それらの機能および細胞下局在(Ingenuity Pathway Analysis由来)は表101に列挙される。
調節されたレベルを用いて検出されたRNA転写物の中で、癌胎児性抗原関連細胞接着分子1(CEACAM1)が、特に、100μMコエンザイムQ10処置を用いて、HK2(H)細胞において高度に上方調節されているとして同定された。CD66aおよびBGP−Iとしてもまた知られているCEACAM−1は、CEAスーパーファミリーの膜結合CEAサブファミリーに属する、115−200 KD I型膜貫通糖タンパク質である。細胞の表面上で、これは非共有結合性のホモ−およびヘテロダイマーを形成する。細胞外領域は、3つのC2型Ig様ドメインおよび1つのN末端V型Ig様ドメインを含む。C末端から第2のC2型ドメイン(aa320およびその向こう)を含む複数のスプライシング変異体が存在する。インタクトなマウスにおけるCEACAM1発現の欠如は、糖尿病に関連する代謝症候群を促進することが提案されているのに対して、CEACAM1発現の増加はインスリンの内部化と関連し、これは、インスリン感受性の増加およびグルコースの利用(例えば、血液から細胞へのグルコースの移動)を示唆し、従って、2型糖尿病に特徴的な特質であるインスリン抵抗性を軽減する。
表100に示されるように、インスリン受容体(INSR)発現もまた、コエンザイムQ10で処置された糖尿病性HK−2細胞中で変化された。理論によって束縛されることは望まないが、コエンザイムQ10処置に伴うINSRの発現の増加は、インスリン感受性を増強し(単独でまたはCEACAM1の発現に加えてのいずれかで)、糖尿病に関連する主要な生理学的/代謝的合併症を逆転する潜在能力を有する。
ミトコンドリアアレイを使用するHK−2細胞における遺伝子発現に対するコエンザイムQ10の効果
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ(カタログ番号PAHS 087E、SABisociences Frederick MD)を使用してアッセイされた。慢性高血糖および/またはコエンザイムQ10処置によって調節された遺伝子は表102に列挙され、一方それらの機能は表103に含まれる。
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ(カタログ番号PAHS 087E、SABisociences Frederick MD)を使用してアッセイされた。慢性高血糖および/またはコエンザイムQ10処置によって調節された遺伝子は表102に列挙され、一方それらの機能は表103に含まれる。
研究2:糖尿病PCRアレイを使用するHASMC細胞における遺伝子発現に対するコエンザイムQ10の効果
糖尿病PCRアレイ(SABiosciences)は、同時に84種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された4種の処置は以下の通りである。
・HASMC;
・HASMC H維持された22mMグルコース;
・HASMC(H)+50μMコエンザイムQ10;および
・HASMC(H)+100μMコエンザイムQ10。
糖尿病PCRアレイ(SABiosciences)は、同時に84種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された4種の処置は以下の通りである。
・HASMC;
・HASMC H維持された22mMグルコース;
・HASMC(H)+50μMコエンザイムQ10;および
・HASMC(H)+100μMコエンザイムQ10。
糖尿病アレイ(カタログ番号PAHS−023E,SABiosciences Frederick MD)に対する HASMC試料のリアルタイムPCRデータのストリンジェント分析は、遺伝子調節がHASMC正常未処置細胞よりも少なくとも2倍の調節ではなく、0.05未満のp値であるすべての結果を排除するように行われた。慢性高血糖またはコエンザイムQ10のいずれかによって調節されることが観察された遺伝子が表104に列挙される。
HASMC細胞において、コエンザイムQ10での高血糖細胞の処置は、血管機能の調節に関与する遺伝子(AGT)、インスリン感受性の調節に関与する遺伝子(CEACAM1、INSR、SELL)、および炎症/免疫機能の調節に関与する遺伝子(IL−6、TNF、CCL5)の発現の変化を生じた。理論によって束縛されることは望まないが、INSRの発現の増加は、HASMC細胞におけるインスリン感受性の増加と関する可能性があり、これは、糖尿病の処置において有益である生理学的特性であり、一方、IL−6は、その免疫調節特性に加えて、骨格筋細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵臓β細胞、および神経内分泌細胞に対する作用によって、直接的と間接的の両方で、グルコースの恒常性および代謝に影響を与えることが提案されてきた。活性化の際に、正常T細胞は、RANTESおよびケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド(CCL5)を発現および分泌する。CCL5は脂肪細胞によって発現され、血清レベルのRANTESは肥満および2型糖尿病において増加される。しかし、表104において示されるように、コエンザイムQ10でのHASMC細胞の処置は、CCL5の発現の有意な減少を引き起こす。前述のデータに基づいて、コエンザイムQ10の投与が、糖尿病の管理における処置的な利点を有することが予測される。
ミトコンドリアアレイを使用するHASMC細胞中での遺伝子発現に対するコエンザイムQ10の効果
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ(カタログ番号PAHS 087E、SABisociences Frederick MD)を使用してアッセイされた。慢性高血糖および/またはコエンザイムQ10処置によって調節された遺伝子は表105に示される。
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ(カタログ番号PAHS 087E、SABisociences Frederick MD)を使用してアッセイされた。慢性高血糖および/またはコエンザイムQ10処置によって調節された遺伝子は表105に示される。
コエンザイムQ10でのHASMC細胞の処置は、プログラムされた細胞死、すなわち、アポトーシスを調節する遺伝子(BCL2L1、NOXAとしても知られるPMIAP1)、トランスポータータンパク質(SLC25A1[クエン酸トランスポーター]、SLC25A13[アスパラギン酸−グルタミン酸エクスチェンジャー]、SLC25A19[チアミンピロリン酸トランスポーター]、およびSLC25A22[グルタミン酸−水素同時トランスポーター])、およびミトコンドリアマトリックス輸送タンパク質(MFN1、TIMM44、およびTOMM40)の発現の変化を生じた。これらのトランスポーターの活性は、クレブス回路のために必須の前駆体の調節、およびミトコンドリアの酸化的リン酸化の維持において重要な役割を果たしている。これらの結果は、コエンザイムQ10への糖尿病性HASMC細胞の曝露は、細胞質およびミトコンドリアの遺伝子の発現の変化と関連し、これは次には、コエンザイムQ10と一致しており、糖尿病の処置における治療の利点を提供する。
コエンザイムQ10でHASMC細胞およびHK−2細胞を処置することによって、または高血糖性環境において得られたデータの比較は、4種の遺伝子が両方の細胞系統(例えば、遺伝子発現アッセイにおけるPIK3C2BおよびSELLならびにミトコンドリアアレイアッセイにおけるTOMM40およびTSPO)においてコエンザイムQ10によって共通して調節されることを明らかにする。これらの結果は、糖尿病環境におけるコエンザイムQ10での細胞の処置が、糖尿病の原因または処置に関与することが知られている遺伝子の発現の変化に関連することを実証する。
実施例46膵臓癌に対するコエンザイムQ10投与のインビボ効果
静脈内投与されたコエンザイムQ10の製剤が、動物モデルにおける膵臓癌を処置するために評価された。誘導された膵臓癌を有するラットが、グループにランダム分けされ、以下の9の処置のいずれかを受けた。
・グループA:対照
・グループB:生理食塩水溶液
・グループC:ビヒクル
・グループD:5mg/kgコエンザイムQ10
・グループE:10mg/kgコエンザイムQ10
・グループF:25mg/kgコエンザイムQ10
・グループG:50mg/kgコエンザイムQ10
・グループH:5mg/kgドキソルビシン
・グループI50mg/kgコエンザイムQ10および5mg/kgドキソルビシン
静脈内投与されたコエンザイムQ10の製剤が、動物モデルにおける膵臓癌を処置するために評価された。誘導された膵臓癌を有するラットが、グループにランダム分けされ、以下の9の処置のいずれかを受けた。
・グループA:対照
・グループB:生理食塩水溶液
・グループC:ビヒクル
・グループD:5mg/kgコエンザイムQ10
・グループE:10mg/kgコエンザイムQ10
・グループF:25mg/kgコエンザイムQ10
・グループG:50mg/kgコエンザイムQ10
・グループH:5mg/kgドキソルビシン
・グループI50mg/kgコエンザイムQ10および5mg/kgドキソルビシン
28日後、グループAおよびBのすべての動物、ならびにグループCの大多数の動物が死亡した。対照的に、グループD、E、およびFの大部分の動物は生きたままであり、より高用量のコエンザイムQ10を受容した動物はより長く生きたままであった。確かに、最高用量のコエンザイムQ10(グループG)を受容した動物は28日目においても生きたままであった。これらのデータは全体の用量応答曲線を実証し、ここでは、より高用量を受容した動物がより長い生存割合を有した。
ドキソルビシンと組み合わせた、膵臓癌を処置する際のコエンザイムQ10の有効性を評価するために、グループHはドキソルビシン単独で投与され、一方グループIはドキソルビシンおよびコエンザイムQ10の組み合わせを投与された。28日後、有意な数のグループHの動物がドキソルビシンの毒性に起因して死亡したのに対して、グループIの動物は生存割合の増加を有した。これらのデータは、膵臓癌と関連する生存率を増加させることに加えて、コエンザイムQ10は、化学療法レジメンの毒性副作用を軽減することもできることを示唆する。
等価物
当業者は、日常的な範囲を超えない実験を使用して、本明細書に記載された特定の実施形態および方法の多くの等価物を認識し、またはそれを確認することが可能である。このような等価物は、添付の特許請求の範囲の範囲に包含されることが意図される。
当業者は、日常的な範囲を超えない実験を使用して、本明細書に記載された特定の実施形態および方法の多くの等価物を認識し、またはそれを確認することが可能である。このような等価物は、添付の特許請求の範囲の範囲に包含されることが意図される。
Claims (44)
- 哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症状を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防する方法であって、少なくとも1つの環境影響因子(env影響因子)を含む製薬組成物の治療的有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、環境影響因子が哺乳動物の癌性細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察されたレベルに向かって、解糖からミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、方法。
- 環境影響因子が哺乳動物の非癌性細胞において、解糖からミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを実質的に誘発しない、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物がヒト(または非ヒト哺乳動物)である、請求項1に記載の方法。
- 環境影響因子が、コエンザイムQ10、またはその代謝産物またはイソプレニル反復を有さないもしくは少なくとも1つのイソプレニル反復を有する類似体を含むその類似体ではない、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍性障害がコエンザイムQ10またはその代謝産物もしくはその類似体による処置に応答性または感受性である、請求項1に記載の方法。
- 環境影響因子が癌性細胞中でアポトーシスまたは細胞死機構を誘導する、請求項1に記載の方法。
- 環境影響因子が癌性細胞中で血管新生を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 環境影響因子が癌性細胞中の微小環境内で免疫関連要素の調節を誘導する、請求項1に記載の方法。
- 環境影響因子が癌性細胞中で細胞周期制御の変化を誘導する、請求項1に記載の方法。
- 環境影響因子が:
(a)ベンゾキノンまたはベンゾキノン環の生合成を容易にする少なくとも1つの分子、ならびに
(b)イソプレノイドユニットの合成および/またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする少なくとも1つの分子を含む、請求項1に記載の方法。 - ベンゾキノン環の生合成を容易にする前記少なくとも1つの分子が:L−フェニルアラニン、DL−フェニルアラニン、D−フェニルアラニン、L−チロシン、DL−チロシン、D−チロシン、4−ヒドロキシ−フェニルピルビン酸、3−メトキシ−4−ヒドロキシマンデル酸(バニリンマンデル酸またはVMA)、バニリン酸、ピリドキシン、またはパンテノールを含む、請求項10に記載の方法。
- イソプレノイドユニットの合成および/またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする前記少なくとも1つの分子が:酢酸フェニル、4−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、アセチルグリシン、アセチル−CoA、またはファルネシルを含む、請求項10に記載の方法。
- 環境影響因子が:
(a)L−フェニルアラニン、L−チロシン、および4−ヒドロキシフェニルピルビン酸の1つ以上;ならびに
(b)4−ヒドロキシベンゾエート、酢酸フェニル、およびベンゾキノンの1つ以上;を含む、請求項1に記載の方法。 - 環境影響因子が:
(a)Bcl−2発現を阻害するおよび/もしくはカスパーゼ−3発現を増進する;ならびに/または
(b)細胞増殖を阻害する、請求項1に記載の方法。 - 環境影響因子が多次元細胞内分子(MIM)である、請求項1に記載の方法。
- MIMが:アルファケトグルタル酸塩/アルファケトグルタル酸、リンゴ酸塩/リンゴ酸、コハク酸塩/コハク酸、グルコサミン、アデノシン、アデノシン2リン酸、グルクロニド/グルクロン酸、ニコチン酸、ニコチン酸ジヌクレオチド、アラニン/フェニルアラニン、ピリドキシン、チアミン、またはフラビンアデニンジヌクレオチドから選択される、請求項15に記載の方法。
- 環境影響因子がエピメタボリックシフターである、請求項1に記載の方法。
- エピメタボリックシフターが:トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、スクシニルCoAシンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、またはリボフラビンから選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの環境影響因子の治療的有効量がグルコースの嫌気的使用を下方調節して、ミトコンドリア酸化的リン酸化を上方調節する、請求項1に記載の方法。
- ヒトに投与される環境影響因子の型が、ヒトにおける全身循環中で見出される優勢型とは異なる、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍性障害が白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物に追加の治療剤または処置レジメンを投与することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍性障害の処置を必要とする哺乳動物の癌性細胞においてグルコースの嫌気的使用(解糖)を選択的に遮断して、ミトコンドリア酸化的リン酸化を増強する方法であって、少なくとも1つの環境影響因子の治療的有効量を前記哺乳動物に投与することにより、前記哺乳動物の癌性細胞においてグルコースの嫌気的使用を選択的に遮断して、ミトコンドリア酸化的リン酸化を正常な生理学的条件下で哺乳動物の正常細胞において観察されるレベルに向かって増強することを含む、方法。
- (1)正の倍率変化を有する表2〜4および6〜28に示す遺伝子から成る群より選択される1つ以上の遺伝子の発現を上方調節すること;ならびに/または
(2)負の倍率変化を有する表2〜4および6〜28に示す遺伝子から成る群より選択される1つ以上の遺伝子の発現を下方調節することをさらに含む、請求項23に記載の方法。 - HNF4−アルファ、Bcl−xl、Bcl−xS、BNIP−2、Bcl−2、Birc6、Bcl−2−L11、XIAP、BRAF、Bax、c−Jun、Bmf、PUMA、cMyc、トランスアルドラーゼ1、COQ1、COQ3、COQ6、プレニルトランスフェラーゼ、4−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子2、一酸化窒素シンターゼ2A、スーパーオキシドディスムターゼ2、VDAC、Baxチャネル、ANT、シトクロムc、複合体1、複合体II、複合体III、複合体IV、Foxo3a、DJ−1、IDH−1、Cpt1CおよびカムキナーゼIIから成る群より選択される1つ以上の遺伝子の発現を調節することをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 腫瘍性障害が白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫および肉腫から成る群より選択される、請求項23〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 外科手術、放射線療法、ホルモン療法、抗体療法、成長因子を用いた療法、サイトカイン、および化学療法から成る群より選択される処置レジメンをさらに含む、請求項23〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防するために有効な環境影響因子を同定する方法であって:
(1)腫瘍性障害の癌細胞を含む罹患した生物試料、および癌細胞を含まない正常な生物試料を取得すること;
(2)罹患した生物試料および正常な生物試料を候補環境影響因子と接触させること; (3)罹患した生物試料および正常な生物試料中に存在する、正の倍率変化を有するおよび/または負の倍率変化を有する、表2〜4および6〜28に挙げられたマーカーから成る群より選択される、1つ以上のマーカーの発現レベルを決定すること;
(4)罹患した生物試料および正常な生物試料中の1つ以上のマーカーの発現レベルを比較すること;
を含み、
有効な環境影響因子が、罹患した生物試料中で正の倍率変化を有する1つ以上のマーカーの発現レベルを上昇させるおよび/または負の倍率変化を有する1つ以上のマーカーの発現レベルを低下させるが、正常な生物試料中では実質的に上昇/低下させない候補環境影響因子として同定される、方法。 - 哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防する方法であって:
(1)腫瘍性障害の癌細胞を含む罹患した生物試料、および癌細胞を含まない正常な生物試料を取得すること;
(2)罹患した生物試料および正常な生物試料を候補環境影響因子と接触させること; (3)罹患した生物試料および正常な生物試料中に存在する1つ以上のマーカーの発現レベルを決定すること、ここでマーカーは正の倍率変化を有するおよび/または負の倍率変化を有する、表1〜28に挙げられたマーカーから成る群より選択される;
(4)罹患した生物試料および正常な生物試料中の1つ以上のマーカーの発現レベルを比較すること、ここで有効な環境影響因子が、罹患した生物試料中で正の倍率変化を有する1つ以上のマーカーの発現レベルを上昇させるおよび/または負の倍率変化を有する1つ以上のマーカーの発現レベルを低下させるが、正常な生物試料中では実質的に上昇/低下させない候補環境影響因子として同定される;
(5)有効な環境影響因子を哺乳動物に投与すること;
を含み、これにより哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、方法。 - 哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防するために有効な環境影響因子を同定する方法であって:
(1)腫瘍性障害の癌細胞を含む罹患した生物試料、および癌細胞を含まない正常な生物試料を取得すること;
(2)罹患した生物試料および正常な生物試料を候補環境影響因子と接触させること; (3)候補環境影響因子との接触前後の罹患した生物試料および正常な生物試料中の解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルを決定すること;
を含み、
有効な環境影響因子が、罹患した生物試料中でミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルを上昇させるおよび/または解糖のレベルを低下させるが、正常な生物試料中では実質的に上昇および/または低下させない候補環境影響因子として同定される、方法。 - 哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、腫瘍性障害の症候を緩和する、腫瘍性障害の進行を阻害する、または腫瘍性障害を予防する方法であって:
(1)腫瘍性障害の癌細胞を含む罹患した生物試料、および癌細胞を含まない正常な生物試料を取得すること;
(2)罹患した生物試料および正常な生物試料を候補環境影響因子と接触させること; (3)候補環境影響因子との接触前後の罹患した生物試料および正常な生物試料中の解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルを決定すること、ここで有効な環境影響因子が、罹患した生物試料中でミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルを上昇させるおよび/または解糖のレベルを低下させるが、正常な生物試料中では実質的に上昇/低下させない候補環境影響因子として同定される;
(4)有効な環境影響因子を哺乳動物に投与すること;
を含み、これにより哺乳動物の腫瘍性障害を処置する、方法。 - 解糖のレベルがECARとして測定され、および/またはミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルがOCRとして測定される、請求項30または31に記載の方法。
- env影響因子がコエンザイムQ10でない、請求項23に記載の方法。
- 多次元細胞内分子を同定する方法であって:
(1)細胞を内因性分子と接触させること;
(2)細胞微小環境プロフィールに対する内因性分子の効果を監視すること;
(3)細胞微小環境プロフィールに対して変化を誘導する内因性分子を同定すること;を含み、これにより多次元細胞内分子を同定する、方法。 - (1)罹患した細胞および正常な対照細胞の細胞微小環境プロフィールに対する内因性分子の効果を比較すること;
(2)罹患した細胞の細胞微小環境プロフィールに対する変化を、正常な対照細胞と比較して示差的に発する内因性分子を同定すること;
をさらに含む、請求項34に記載の方法。 - 細胞微小環境プロフィールに対する効果がmRNA、タンパク質、脂質および代謝産物から成る群より選択される細胞分子のレベルまたは活性の変化を測定することによって監視される、請求項34または35に記載の方法。
- エピメタボリックシフターを同定する方法であって:
(1)示差的疾患状態を提示する2つ以上の細胞または組織の分子プロフィールを比較すること;
(2)レベルの変化が疾患状態に相関する分子プロフィールから分子を同定すること; (3)分子を細胞に導入すること;
(4)細胞の代謝性状態をシフトさせる分子の能力を評価すること;
を含み、細胞の代謝性状態をシフトすることができる分子がエピメタボリックシフターとして同定される、方法。 - 分子プロフィールが代謝産物プロフィール、脂質プロフィール、タンパク質プロフィールまたはRNAプロフィールから成る群より選択される、請求項37に記載の方法。
- 分子が正常な細胞の健康または増殖に悪影響を及ぼさない、請求項38に記載の方法。
- 腫瘍性障害の処置に有効である薬剤を同定する方法であって:
(1)候補環境影響因子を提供すること;
(2)細胞の代謝状態をシフトさせる候補環境影響因子の能力を決定すること;
(3)候補環境影響因子が腫瘍性障害の処置に有効か否かを決定すること;
を含み、細胞の代謝状態をシフトすることができ、腫瘍性障害の処置に有効である候補環境影響因子が腫瘍性障害の処置に有効な薬剤として同定される、方法。 - 細胞の代謝状態のシフトがmRNA発現、タンパク質発現、脂質レベル、代謝産物レベル、生体エネルギー分子のレベル、細胞エネルギー特性、ミトコンドリア機能およびミトコンドリア数の1つ以上の変化を測定することによって決定される、請求項40に記載の方法。
- 請求項34〜41のいずれか1項に記載の方法によって同定された薬剤を含む組成物。
- 哺乳動物のCoQ10反応性障害を処置する、CoQ10反応性障害の症状を緩和する、CoQ10反応性障害の進行を阻害する、またはCoQ10反応性障害を予防する方法であって、少なくとも1つの環境影響因子(env影響因子)を含む製薬組成物の治療的有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察された解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルに向かって、細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、方法。
- CoQ10反応性障害が腫瘍性障害である、請求項43に記載の方法。
Applications Claiming Priority (10)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US17724509P | 2009-05-11 | 2009-05-11 | |
US17724309P | 2009-05-11 | 2009-05-11 | |
US17724109P | 2009-05-11 | 2009-05-11 | |
US17724409P | 2009-05-11 | 2009-05-11 | |
US17724609P | 2009-05-11 | 2009-05-11 | |
US61/177,241 | 2009-05-11 | ||
US61/177,244 | 2009-05-11 | ||
US61/177,243 | 2009-05-11 | ||
US61/177,246 | 2009-05-11 | ||
US61/177,245 | 2009-05-11 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015151900A Division JP6254979B2 (ja) | 2009-05-11 | 2015-07-31 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する腫瘍性障害の処置方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018048125A true JP2018048125A (ja) | 2018-03-29 |
Family
ID=43085533
Family Applications (13)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012510948A Expired - Fee Related JP6169846B2 (ja) | 2009-05-11 | 2010-05-11 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する代謝性障害の診断のための方法 |
JP2012510951A Expired - Fee Related JP6081195B2 (ja) | 2009-05-11 | 2010-05-11 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する腫瘍性障害の診断のための方法 |
JP2012510958A Pending JP2012526828A (ja) | 2009-05-11 | 2010-05-11 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する代謝性障害の治療方法 |
JP2012510959A Expired - Fee Related JP5903735B2 (ja) | 2009-05-11 | 2010-05-11 | エピメタボリックシフター(コエンザイムq10)を使用した疾患の処置方法 |
JP2012510932A Active JP5903734B2 (ja) | 2009-05-11 | 2010-05-11 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する腫瘍性障害の処置方法 |
JP2015113220A Pending JP2015199746A (ja) | 2009-05-11 | 2015-06-03 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する代謝性障害の治療方法 |
JP2015151893A Pending JP2016023189A (ja) | 2009-05-11 | 2015-07-31 | エピメタボリックシフター(コエンザイムq10)を使用した疾患の処置方法 |
JP2015151900A Expired - Fee Related JP6254979B2 (ja) | 2009-05-11 | 2015-07-31 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する腫瘍性障害の処置方法 |
JP2016181707A Pending JP2017018134A (ja) | 2009-05-11 | 2016-09-16 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する代謝性障害の診断のための方法 |
JP2016199136A Pending JP2017074038A (ja) | 2009-05-11 | 2016-10-07 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する腫瘍性障害の診断のための方法 |
JP2017141826A Pending JP2017214413A (ja) | 2009-05-11 | 2017-07-21 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する代謝性障害の治療方法 |
JP2017172972A Pending JP2018021064A (ja) | 2009-05-11 | 2017-09-08 | エピメタボリックシフター(コエンザイムq10)を使用した疾患の処置方法 |
JP2017172885A Pending JP2018048125A (ja) | 2009-05-11 | 2017-09-08 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する腫瘍性障害の処置方法 |
Family Applications Before (12)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012510948A Expired - Fee Related JP6169846B2 (ja) | 2009-05-11 | 2010-05-11 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する代謝性障害の診断のための方法 |
JP2012510951A Expired - Fee Related JP6081195B2 (ja) | 2009-05-11 | 2010-05-11 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する腫瘍性障害の診断のための方法 |
JP2012510958A Pending JP2012526828A (ja) | 2009-05-11 | 2010-05-11 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する代謝性障害の治療方法 |
JP2012510959A Expired - Fee Related JP5903735B2 (ja) | 2009-05-11 | 2010-05-11 | エピメタボリックシフター(コエンザイムq10)を使用した疾患の処置方法 |
JP2012510932A Active JP5903734B2 (ja) | 2009-05-11 | 2010-05-11 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する腫瘍性障害の処置方法 |
JP2015113220A Pending JP2015199746A (ja) | 2009-05-11 | 2015-06-03 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する代謝性障害の治療方法 |
JP2015151893A Pending JP2016023189A (ja) | 2009-05-11 | 2015-07-31 | エピメタボリックシフター(コエンザイムq10)を使用した疾患の処置方法 |
JP2015151900A Expired - Fee Related JP6254979B2 (ja) | 2009-05-11 | 2015-07-31 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する腫瘍性障害の処置方法 |
JP2016181707A Pending JP2017018134A (ja) | 2009-05-11 | 2016-09-16 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する代謝性障害の診断のための方法 |
JP2016199136A Pending JP2017074038A (ja) | 2009-05-11 | 2016-10-07 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する腫瘍性障害の診断のための方法 |
JP2017141826A Pending JP2017214413A (ja) | 2009-05-11 | 2017-07-21 | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する代謝性障害の治療方法 |
JP2017172972A Pending JP2018021064A (ja) | 2009-05-11 | 2017-09-08 | エピメタボリックシフター(コエンザイムq10)を使用した疾患の処置方法 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (15) | US9205064B2 (ja) |
EP (5) | EP2429511B1 (ja) |
JP (13) | JP6169846B2 (ja) |
KR (7) | KR20180056816A (ja) |
CN (7) | CN102481270A (ja) |
AU (9) | AU2010247800A1 (ja) |
BR (5) | BRPI1010908A2 (ja) |
CA (5) | CA2763347C (ja) |
EA (5) | EA201101519A1 (ja) |
IL (5) | IL216297A0 (ja) |
MX (6) | MX357528B (ja) |
SG (10) | SG10201402293SA (ja) |
WO (5) | WO2010132486A2 (ja) |
Families Citing this family (66)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2680825C (en) * | 2007-03-22 | 2013-10-29 | Cytotech Labs, Llc | Topical formulations having enhanced bioavailability |
CN102481270A (zh) | 2009-05-11 | 2012-05-30 | 博格生物系统有限责任公司 | 利用表观代谢转变剂、多维细胞内分子或环境影响剂治疗肿瘤障碍的方法 |
WO2015103447A1 (en) | 2013-12-31 | 2015-07-09 | Rapamycin Holdings, Llc | Oral rapamycin nanoparticle preparations and use |
EP2544663B1 (en) | 2010-03-12 | 2018-01-03 | Berg LLC | Intravenous formulations of coenzyme q10 (coq10) and methods of use thereof |
CA2810746A1 (en) * | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Galderma Research & Development | Method for preventing or treating skin tumor |
SG182016A1 (en) * | 2010-12-14 | 2012-07-30 | Univ Singapore | Method of detecting resistance to cancer therapy |
EP2656076B1 (en) * | 2010-12-20 | 2017-11-01 | Cameron K. Tebbi | Methods of detecting leukemia/ lymphoma and induction of the same |
US9783785B2 (en) | 2010-12-20 | 2017-10-10 | Cameron K. Tebbi | Screening methods for detection of susceptibility to leukemia and lymphomas |
CA2824752C (en) | 2011-01-13 | 2018-08-14 | Expression Pathology, Inc. | Bcl-2-like protein 11 srm/mrm assay |
WO2012104834A1 (en) * | 2011-02-03 | 2012-08-09 | Pharmedica Ltd. | New oral dissolving films for insulin administration, for treating diabetes |
CN103501859B (zh) | 2011-03-02 | 2017-08-25 | 博格有限责任公司 | 基于细胞的探询式分析及其应用 |
RU2453849C1 (ru) * | 2011-03-11 | 2012-06-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Способ определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях |
AU2012240222B2 (en) * | 2011-04-04 | 2017-04-27 | Berg Llc | Methods of treating central nervous system tumors |
WO2012174286A1 (en) * | 2011-06-14 | 2012-12-20 | Edison Pharmaceuticals, Inc. | Catechol derivatives for treatment of oxidative stress diseases |
EA201490047A1 (ru) | 2011-06-17 | 2014-08-29 | Берг Ллк | Ингаляционные фармацевтические композиции |
CN102453769A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-05-16 | 芮屈生物技术(上海)有限公司 | 白血病病变前期mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用 |
BR112014022103B1 (pt) | 2012-03-06 | 2022-04-19 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Composições e seus usos |
EA038600B1 (ru) * | 2012-04-02 | 2021-09-21 | Берг Ллк | Основанные на клетках перекрестные анализы и их применение |
NZ702369A (en) * | 2012-06-01 | 2016-12-23 | Berg Llc | Treatment of solid tumors using coenzyme q10 |
MX2015002915A (es) * | 2012-09-06 | 2015-07-06 | Hitachi Chemical Co Ltd | Metodos para estimacion de la inmunidad especifica de peptido. |
WO2014046603A1 (en) | 2012-09-19 | 2014-03-27 | Grespo Ab | Compositions for improvement of brain function |
US10302630B2 (en) | 2012-10-09 | 2019-05-28 | The Procter & Gamble Company | Method of identifying or evaluating beneficial actives and compositions containing the same |
WO2014059009A1 (en) | 2012-10-09 | 2014-04-17 | The Procter & Gamble Company | Method of identifying synergistic cosmetic combinations |
US9138393B2 (en) | 2013-02-08 | 2015-09-22 | The Procter & Gamble Company | Cosmetic compositions containing substituted azole and methods for improving the appearance of aging skin |
US9144538B2 (en) | 2013-02-08 | 2015-09-29 | The Procter & Gamble Company | Cosmetic compositions containing substituted azole and methods for alleviating the signs of photoaged skin |
EP2967058A4 (en) * | 2013-03-15 | 2017-03-01 | The Board of Regents of The University of Texas System | Use of inhibitors of mtor to improve vascular functions in apoe4 carriers |
WO2014152086A1 (en) * | 2013-03-19 | 2014-09-25 | The Procter & Gamble Company | Method of measuring the metabolic indicators of hair follicles |
AU2014251045B2 (en) * | 2013-04-08 | 2019-06-13 | Berg Llc | Treatment of cancer using coenzyme Q10 combination therapies |
WO2014181968A1 (ko) * | 2013-05-09 | 2014-11-13 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 메트포민과 코엔자임 q10을 유효성분으로 함유하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
EP3013371A4 (en) * | 2013-06-26 | 2017-04-26 | Rett Syndrome Research Trust | Rett syndrome and treatments therefore |
SG10201907816RA (en) | 2013-09-04 | 2019-09-27 | Berg Llc | Methods of treatment of cancer by continuous infusion of coenzyme q10 |
CN103585619A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-02-19 | 浙江大学 | Dj-1蛋白在制备骨肉瘤诊断和治疗产品中的应用 |
LT3071561T (lt) | 2013-11-22 | 2021-08-25 | Sabre Therapeutics Llc | Autotaksino inhibitorių junginiai |
US20160310572A1 (en) * | 2013-12-02 | 2016-10-27 | Wayne State University | Compositions and methods to diagnose diabetes and/or to treat negative effects of diabetes |
EP3094968B1 (en) * | 2014-01-15 | 2020-12-09 | The Regents of The University of California | Metabolic screening for gestational diabetes |
EP3129466B1 (en) * | 2014-04-07 | 2020-08-05 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Modulating cell proliferation and pluripotency |
CN111848494B (zh) | 2014-04-17 | 2023-08-01 | 伊谬诺米特医疗有限公司 | 胍化合物及其用途 |
US9051320B1 (en) | 2014-08-18 | 2015-06-09 | Pharmakea, Inc. | Methods for the treatment of metabolic disorders by a selective small molecule autotaxin inhibitor |
EP3187878B1 (en) * | 2014-08-26 | 2019-07-31 | Keio University | Anti-cancer agent sensitivity-determining marker |
WO2016040725A1 (en) | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Berg Llc | Bayesian causal relationship network models for healthcare diagnosis and treatment based on patient data |
US10632104B2 (en) | 2015-05-27 | 2020-04-28 | Sabre Therapeutics Llc | Autotaxin inhibitors and uses thereof |
DE112016003948T5 (de) | 2015-08-31 | 2018-05-09 | City Of Sapporo | Molekulare verfahren zum beurteilen einer urothelialen erkrankung |
US20170168055A1 (en) * | 2015-12-11 | 2017-06-15 | Expression Pathology, Inc. | SRM/MRM Assays |
EP3763732A1 (en) * | 2016-11-25 | 2021-01-13 | Koninklijke Philips N.V. | Method to distinguish tumor suppressive foxo activity from oxidative stress |
WO2018116307A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | The National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd. | Methods for treating diabetes using vdac1 inhibitors |
CN110191946A (zh) | 2016-12-23 | 2019-08-30 | 学校法人庆应义塾 | 诱导cd8+t细胞的组合物及方法 |
EP3634391A4 (en) | 2017-05-17 | 2021-02-24 | Berg LLC | USE OF COENZYME Q10 FORMULATIONS IN THE TREATMENT AND PREVENTION OF BUBBLE EPIDERMOLYSIS |
CN109111522B (zh) * | 2017-06-22 | 2022-02-01 | 北海康成(北京)医药科技有限公司 | 预测食管癌对抗erbb3抗体治疗的应答的方法和试剂盒 |
JP7209951B2 (ja) * | 2017-10-30 | 2023-01-23 | 日本メナード化粧品株式会社 | 白髪予防及び改善剤 |
WO2019099873A1 (en) | 2017-11-17 | 2019-05-23 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Cancer therapy by degrading dual mek signaling |
AU2019217041B2 (en) * | 2018-02-09 | 2022-09-15 | Keio University | Compositions and methods for the induction of CD8+ T-cells |
SG11202102204PA (en) | 2018-09-25 | 2021-04-29 | Ponce De Leon Health Designated Activity Company | Process of making calcium alpha-ketoglutarate |
EP3914711A2 (en) | 2019-01-23 | 2021-12-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of ophthalmic conditions with angiopoietin-like 7 (angptl7) inhibitors |
US11845989B2 (en) | 2019-01-23 | 2023-12-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of ophthalmic conditions with angiopoietin-like 7 (ANGPTL7) inhibitors |
JP2022523564A (ja) | 2019-03-04 | 2022-04-25 | アイオーカレンツ, インコーポレイテッド | 機械学習を使用するデータ圧縮および通信 |
WO2021102356A1 (en) | 2019-11-20 | 2021-05-27 | Berg Llc | Combination therapy of a coenzyme q10 compound and radiation therapy for treatment of glioma |
JP2021084891A (ja) * | 2019-11-28 | 2021-06-03 | 株式会社ノエビア | 抗老化剤 |
CN112924681B (zh) * | 2019-12-05 | 2023-01-17 | 张曼 | 尿液krt10蛋白及其多肽片段在正常妊娠中的应用 |
KR102383788B1 (ko) * | 2020-06-12 | 2022-04-05 | 이화여자대학교 산학협력단 | 신체적 스트레스 상태를 평가하는 방법 |
US20230255912A1 (en) * | 2020-07-02 | 2023-08-17 | Ponce De Leon Health Designated Activity Company | Compositions and methods for treating crp-mediated diseases |
US11938152B2 (en) | 2020-08-06 | 2024-03-26 | Kedar N Prasad | High-dose antioxidants in cancer treatment |
CA3201624A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of liver diseases with cell death inducing dffa like effector b (cideb) inhibitors |
CA3210480A1 (en) | 2021-02-26 | 2022-09-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of inflammation with glucocorticoids and angiopoietin-like 7 (angptl7) inhibitors |
CN114306608B (zh) * | 2022-01-04 | 2024-01-16 | 上海科技大学 | 一类适应低氧或缺氧微环境的肿瘤的治疗靶点及其应用 |
CN116486916A (zh) * | 2022-11-03 | 2023-07-25 | 杭州联川生物技术股份有限公司 | 一种单细胞转录组濒死细胞和多细胞过滤方法、介质和设备 |
CN117347643B (zh) * | 2023-12-05 | 2024-02-06 | 成都泰莱生物科技有限公司 | 用于判断肺部结节良恶性的代谢标志物组合及其筛选方法和应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007518805A (ja) * | 2004-01-22 | 2007-07-12 | ユニバーシティー・オブ・マイアミ | 局所用コエンザイムq10製剤および使用方法 |
Family Cites Families (391)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4525350A (en) * | 1975-02-20 | 1985-06-25 | The New England Institute, Inc. | Methods of stimulating host defense system with coenzymes Q4 to Q.sub.1 |
JPS5775916A (en) | 1980-10-29 | 1982-05-12 | Nippon Chemiphar Co Ltd | Coenzyme q pharmaceutical and its preparation |
JPS58113127A (ja) | 1981-12-28 | 1983-07-05 | Ajinomoto Co Inc | ユビデカレノン含有水性液 |
IT1157269B (it) * | 1982-03-19 | 1987-02-11 | Seuref Ag | Nuove formulazioni farmaceutiche contenenti il coenzima q10 adatte per la somministrazione topica |
JPS58201711A (ja) * | 1982-05-19 | 1983-11-24 | Eisai Co Ltd | ユビデカレノン含有リポソ−ム被覆体 |
US4515736A (en) * | 1983-05-12 | 1985-05-07 | The Regents Of The University Of California | Method for encapsulating materials into liposomes |
US4833128A (en) | 1984-12-28 | 1989-05-23 | Neil Solomon | Dietary supplement |
US4824669A (en) | 1985-04-11 | 1989-04-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Formulations of coenzyme Q10 for intravenous use |
US4895727A (en) * | 1985-05-03 | 1990-01-23 | Chemex Pharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical vehicles for exhancing penetration and retention in the skin |
JPS62123113A (ja) | 1985-11-22 | 1987-06-04 | Green Cross Corp:The | ユビデカレノン含有脂肪乳剤 |
US4843071A (en) | 1986-12-05 | 1989-06-27 | Serotonin Industries Of Charleston | Method and composition for treating obesity, drug abuse, and narcolepsy |
US5651991A (en) | 1987-10-28 | 1997-07-29 | Nippon Shinyaku Co. Ltd. | Drug carriers |
JP2600726B2 (ja) | 1987-11-30 | 1997-04-16 | 大正製薬株式会社 | 微粒子脂肪乳剤 |
GB8811410D0 (en) | 1988-05-13 | 1988-06-15 | Unilever Plc | Treatment of skin disorders |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5015483A (en) * | 1989-02-09 | 1991-05-14 | Nabisco Brands, Inc. | Liposome composition for the stabilization of oxidizable substances |
JP2828655B2 (ja) | 1989-04-14 | 1998-11-25 | エーザイ株式会社 | 脂溶性薬物含有水性液 |
US5580575A (en) * | 1989-12-22 | 1996-12-03 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Therapeutic drug delivery systems |
US5585112A (en) | 1989-12-22 | 1996-12-17 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres |
US5962243A (en) | 1990-04-18 | 1999-10-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for the identification of farnesyltransferase inhibitors |
ATE117665T1 (de) | 1990-11-14 | 1995-02-15 | Oreal | Amphiphile, nichtionische derivate des glycerins sowie die entsprechenden zwischenprodukte, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende zusammensetzungen. |
SE502569C2 (sv) | 1991-05-31 | 1995-11-13 | British Tech Group | Användning av en immunologiskt inert matris av en sterol och saponiner som kan bilda sfäriska nanopartiklar med snäv storleksfördelning som läkemedelsbärare, partiklar, komposition samt kit |
US5378461A (en) * | 1991-07-12 | 1995-01-03 | Neigut; Stanley J. | Composition for the topical treatment of skin damage |
US5605930A (en) | 1991-10-21 | 1997-02-25 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Compositions and methods for treating and preventing pathologies including cancer |
US6461593B1 (en) | 1992-02-19 | 2002-10-08 | Biomedical And Clinical Research | Therapy with coenzyme Q10 to reduce subgingival microorganisms in patients with periodontal disease |
DE69328771T2 (de) | 1992-02-24 | 2000-12-07 | East Carolina University Green | Verfahren zur hemmung der karzinogenese durch behandlung mit dehydroepiandrosteron und dessen analoge |
US6093706A (en) | 1992-03-04 | 2000-07-25 | Bioresponse, L.L.C. | Combined dehydroepiandrosterone and retinoid therapy for epithelial disorders |
FR2697841B1 (fr) | 1992-11-12 | 1995-01-13 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux dérivés du taxane, leur préparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. |
US5602184A (en) | 1993-03-03 | 1997-02-11 | The United States Of America As Represented By Department Of Health And Human Services | Monoterpenes, sesquiterpenes and diterpenes as cancer therapy |
EP0688325A1 (en) | 1993-03-08 | 1995-12-27 | Eisai Co., Ltd. | Phosphonic acid derivatives |
DE59406065D1 (de) | 1993-03-24 | 1998-07-02 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur Herstellung einer Liposomendispersion im Hochdruckbereich |
DE4327063A1 (de) | 1993-08-12 | 1995-02-16 | Kirsten Dr Westesen | Ubidecarenon-Partikel mit modifizierten physikochemischen Eigenschaften |
US7083572B2 (en) | 1993-11-30 | 2006-08-01 | Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. | Therapeutic delivery systems |
DE4410238A1 (de) * | 1994-03-25 | 1995-09-28 | Beiersdorf Ag | Hautpflegemittel |
US20020049422A1 (en) | 1994-03-31 | 2002-04-25 | Brewitt Barbara A. | Homeopathic preparations |
AU4510596A (en) | 1994-12-06 | 1996-06-26 | National Research Council Of Canada | Water soluble ubiquinone compositions, prodrugs, and methods relating thereto |
US6958150B2 (en) | 1994-12-15 | 2005-10-25 | Advance Biofactures Of Curacao, N.V. | Reduction of adipose tissue |
US6005086A (en) | 1995-01-13 | 1999-12-21 | The Salk Institute For Biological Studies | Farnesoid activated receptor polypeptides, and nucleic acid encoding the same |
DE19537027A1 (de) | 1995-10-05 | 1997-04-10 | Beiersdorf Ag | Hautpflegemittel für alte Haut |
EP0856026A1 (en) | 1995-10-19 | 1998-08-05 | Receptagen Corporation | Discrete-length polyethylene glycols |
US5944012A (en) | 1996-03-25 | 1999-08-31 | Pera; Ivo E. | Method for dispensing antioxidant vitamins by inhalation background of the invention |
DE19615577A1 (de) * | 1996-04-19 | 1997-10-23 | Beiersdorf Ag | Verwendung von Salicin als antiirritativer Wirkstoff in kosmetischen und topischen dermatologischen Zubereitungen |
US5891465A (en) * | 1996-05-14 | 1999-04-06 | Biozone Laboratories, Inc. | Delivery of biologically active material in a liposomal formulation for administration into the mouth |
GB9625895D0 (en) | 1996-12-13 | 1997-01-29 | Riley Patrick A | Novel compound useful as therapeutic agents and assay reagents |
ES2159938T3 (es) | 1997-02-11 | 2001-10-16 | Mse Pharmazeutika Gmbh | Preparados transdermicos, orales e intravenosos de 2,3-dimetoxi-5-metil-6-decaprenil-1,4-benzoquinona. |
US20040228910A1 (en) | 1997-02-11 | 2004-11-18 | Mse Pharmazeutika Gmbh | Transdermal, oral and intravenous formulations of 2, 3-dimethoxy-5-methyl-6-decaprenyl-1, 4-benzoquinone |
EP1007018B1 (de) * | 1997-02-12 | 2003-10-08 | MSE Pharmazeutika GmbH | Verwendung von 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaprenyl-1,4-benzochinon inder behandlung von tinnitus |
IT1291113B1 (it) * | 1997-03-20 | 1998-12-29 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Composizione nutritiva terapeutica per soggetti affetti da diabete mellito |
US6372234B1 (en) | 1997-05-27 | 2002-04-16 | Sembiosys Genetics Inc. | Products for topical applications comprising oil bodies |
US6599513B2 (en) | 1997-05-27 | 2003-07-29 | Sembiosys Genetics Inc. | Products for topical applications comprising oil bodies |
AU9221698A (en) | 1997-09-04 | 1999-03-22 | Biozone Laboratories, Inc. | Oral liposomal delivery system |
US6576660B1 (en) | 1997-10-31 | 2003-06-10 | Arch Development Corporation | Methods and compositions for regulation of 5-α-reductase activity |
US6696484B2 (en) * | 1997-10-31 | 2004-02-24 | University Of Chicago Office Of Technology And Intellectual Property | Method and compositions for regulation of 5-alpha reductase activity |
WO1999026657A1 (en) | 1997-11-25 | 1999-06-03 | Musc Foundation For Research Development | Inhibitors of nitric oxide synthase |
US6372880B1 (en) | 1997-12-25 | 2002-04-16 | Mitsui Chemicals, Inc. | Copolymer and process for preparing the same |
US6048846A (en) | 1998-02-26 | 2000-04-11 | Cochran; Timothy M. | Compositions used in human treatment |
EP1065931A4 (en) | 1998-04-02 | 2006-10-11 | Avicena Group Inc | COMPOSITIONS CONTAINING CREATINE COMBINED WITH A SECOND AGENT |
US6806076B1 (en) | 1998-04-14 | 2004-10-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing isoprenoid compounds by microorganisms and a method for screening compounds with antibiotic or weeding activity |
US6503523B2 (en) | 1998-05-07 | 2003-01-07 | Gs Development A.B. | Skin care agents containing combinations of active agents consisting of vitamin a derivatives and UBI- or plastoquinones |
ATE233549T1 (de) | 1998-06-19 | 2003-03-15 | Skyepharma Canada Inc | Neues verfahren zur herstellung von partikeln wasserunlöslicher komponenten im grössenbereich bis 2000 nm |
US6093743A (en) | 1998-06-23 | 2000-07-25 | Medinox Inc. | Therapeutic methods employing disulfide derivatives of dithiocarbamates and compositions useful therefor |
DE19828081C2 (de) | 1998-06-24 | 2000-08-10 | Cognis Deutschland Gmbh | W/O-Emulsionsgrundlagen |
JP2002520511A (ja) | 1998-07-16 | 2002-07-09 | コグニス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | Pitエマルジョンの使用 |
CA2337690C (en) | 1998-07-27 | 2013-10-01 | Texas Pharmaceuticals, Inc. | Chemically induced intracellular hyperthermia |
WO2000007607A1 (en) | 1998-08-04 | 2000-02-17 | Kosbab, John, V. | Nutrient and therapeutic compositions for the treatment of cancer |
US6417223B1 (en) * | 1998-09-23 | 2002-07-09 | Research Development Foundation | Tocopherols, tocotrienols, other chroman and side chain derivatives and uses therof |
US6048886A (en) * | 1998-10-05 | 2000-04-11 | Neigut; Stanley | Compositions and delivery systems for the topical treatment of psoriasis and other conditions of the skin |
IT1304406B1 (it) * | 1998-10-21 | 2001-03-19 | Danital Italia S R L | Preparazione per la veicolazione di principi attivi basata su acidigrassi polinsaturi del gruppo omega 3. |
US20050123938A1 (en) * | 1999-01-06 | 2005-06-09 | Chondrogene Limited | Method for the detection of osteoarthritis related gene transcripts in blood |
US20040034107A1 (en) * | 1999-02-11 | 2004-02-19 | Mse Pharmazeutika Gmbh | Ubiquinone Qn for the treatment of pain |
US20050019268A1 (en) | 1999-02-11 | 2005-01-27 | Mse Pharmazeutika Gmbh | Spray containing ubiquinone Qn |
US6248363B1 (en) | 1999-11-23 | 2001-06-19 | Lipocine, Inc. | Solid carriers for improved delivery of active ingredients in pharmaceutical compositions |
US20030104048A1 (en) | 1999-02-26 | 2003-06-05 | Lipocine, Inc. | Pharmaceutical dosage forms for highly hydrophilic materials |
US7374779B2 (en) | 1999-02-26 | 2008-05-20 | Lipocine, Inc. | Pharmaceutical formulations and systems for improved absorption and multistage release of active agents |
US6632443B2 (en) | 2000-02-23 | 2003-10-14 | National Research Council Of Canada | Water-soluble compositions of bioactive lipophilic compounds |
US6140067A (en) * | 1999-04-30 | 2000-10-31 | Mitokor | Indicators of altered mitochondrial function in predictive methods for determining risk of type 2 diabetes mellitus |
US6482943B1 (en) | 1999-04-30 | 2002-11-19 | Slil Biomedical Corporation | Quinones as disease therapies |
US6803193B1 (en) | 1999-06-23 | 2004-10-12 | The Penn State Research Foundation | Methods to identify modulators of the mevalonate pathway in sterol synthesis |
US6242491B1 (en) | 1999-06-25 | 2001-06-05 | Rima Kaddurah-Daouk | Use of creatine or creatine compounds for skin preservation |
US6960439B2 (en) | 1999-06-28 | 2005-11-01 | Source Precision Medicine, Inc. | Identification, monitoring and treatment of disease and characterization of biological condition using gene expression profiles |
DE59912559D1 (de) | 1999-07-02 | 2005-10-20 | Cognis Ip Man Gmbh | Mikrokapseln - III |
US6630160B1 (en) | 1999-09-07 | 2003-10-07 | Genetic Services Management, Inc. | Process to modulate disease risk with doses of a nutraceutical |
US20030104080A1 (en) | 1999-09-07 | 2003-06-05 | Singh Parashu Ram | Topical urea composition |
US7005274B1 (en) | 1999-09-15 | 2006-02-28 | Migenix Corp. | Methods and compositions for diagnosing and treating arthritic disorders and regulating bone mass |
CN1409637A (zh) | 1999-10-14 | 2003-04-09 | 日清制油株式会社 | 皮肤美化剂、皮肤用抗老化剂、皮肤用增白剂和外用制剂 |
US7309688B2 (en) | 2000-10-27 | 2007-12-18 | Johnson & Johnson Consumer Companies | Topical anti-cancer compositions and methods of use thereof |
US20020049176A1 (en) * | 1999-11-10 | 2002-04-25 | Anderson Christen M. | Modulation of mitochondrial mass and function for the treatment of diseases and for target and drug discovery |
US20030180352A1 (en) | 1999-11-23 | 2003-09-25 | Patel Mahesh V. | Solid carriers for improved delivery of active ingredients in pharmaceutical compositions |
US7083780B2 (en) | 1999-12-11 | 2006-08-01 | Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg | Cosmetic composition containing hydroxyethers |
WO2001045661A2 (de) * | 1999-12-20 | 2001-06-28 | Cognis France, S.A. | Kosmetische und/oder pharmazeutische zubereitungen |
AUPQ515000A0 (en) | 2000-01-19 | 2000-02-10 | Grigg, Geoffrey Walter | Treatment of uv induced immunosuppression |
WO2001056562A1 (fr) | 2000-02-04 | 2001-08-09 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Compositions d'emulsions stables |
NZ509803A (en) | 2000-02-09 | 2001-08-31 | Paul A | Treatment of fibromyalgia with ubiquinone 10 and succinic acid |
US20020044913A1 (en) * | 2000-02-11 | 2002-04-18 | Hamilton Nathan D. | Cosmetics to support skin metabolism |
FR2804864B1 (fr) | 2000-02-11 | 2003-04-04 | Serobiologiques Lab Sa | Extraits de residus issus de la fabrication du vin et leur utilisation en cosmetique ou pharmacologie |
DE50115609D1 (de) * | 2000-02-17 | 2010-10-14 | Basf Se | Wässrige Dispersion wasserunlöslicher organischer UV-Filtersubstanzen |
DE10007322A1 (de) | 2000-02-17 | 2001-08-23 | Cognis Deutschland Gmbh | Perlglanzmittel |
FR2805464B1 (fr) | 2000-02-25 | 2003-02-14 | Serobiologiques Lab Sa | Preparations cosmetiques contenant des extraits de la plante mourera fluviatilis |
DE10009996B4 (de) | 2000-03-02 | 2005-10-13 | Cognis Ip Management Gmbh | Feststoffgranulate mit monodisperser Korngrößenverteilung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung |
US6664287B2 (en) | 2000-03-15 | 2003-12-16 | Bethesda Pharmaceuticals, Inc. | Antioxidants |
US6866864B2 (en) | 2000-03-20 | 2005-03-15 | Ahmed Mousa | Compositions and methods of use in the treatment of angiogenesis and vascular-related disorders |
BR0109603A (pt) | 2000-03-27 | 2004-02-25 | Schott Glas | Novas composições cosméticas, de higiene pessoal, agente de limpeza e de suplemento nutricional e métodos para fabricar e utilizar as mesmas |
US6447760B2 (en) | 2000-05-08 | 2002-09-10 | Playtex Products, Inc. | Sunless tanning compositions |
RU2283098C2 (ru) | 2000-05-09 | 2006-09-10 | Канека Корпорейшн | Кожные композиции, содержащие кофермент q в качестве активного ингредиента |
US6468552B1 (en) | 2000-06-02 | 2002-10-22 | Neutrogena Corporation | Stabilized compositions containing oxygen-labile active agents |
SE0002189D0 (sv) * | 2000-06-09 | 2000-06-09 | Metcon Medicin Ab | New method and assay |
DE10031703A1 (de) | 2000-06-29 | 2002-01-10 | Beiersdorf Ag | Verwendung von Calcium freisetzenden oder bindenden Substanzen zur gezielten Schächung oder Stärkung der Barrierefunktion der Haut |
EP1170015A1 (de) | 2000-07-06 | 2002-01-09 | Laboratoires Serobiologiques(Societe Anonyme) | Verwendung von Extrakten des Pilzes Grifola frondosa |
DE10033022A1 (de) * | 2000-07-07 | 2002-01-17 | Cognis Deutschland Gmbh | Aerosole |
US20030012825A1 (en) | 2000-07-10 | 2003-01-16 | Charles Kapper | Metallized molecule therapies |
US6465517B1 (en) | 2000-07-11 | 2002-10-15 | N.V. Nutricia | Composition for the treatment of migraine |
DE10034619A1 (de) * | 2000-07-17 | 2002-01-31 | Cognis Deutschland Gmbh | Aniontensidfreie niedrigviskose Trübungsmittel |
DE10036655A1 (de) | 2000-07-26 | 2002-02-07 | Basf Ag | Kosmetische oder dermatologische Zubereitungen zur Vermeidung von Hautschädigungen durch Peroxide |
DE10036799A1 (de) | 2000-07-28 | 2002-02-07 | Beiersdorf Ag | Neues Mittel zur Behandlung der Haare und der Kopfhaut |
US7198801B2 (en) | 2000-08-03 | 2007-04-03 | Antares Pharma Ipl Ag | Formulations for transdermal or transmucosal application |
US20020045230A1 (en) | 2000-08-14 | 2002-04-18 | Rosen Craig A. | Nucleic acids, proteins, and antibodies |
FR2813195B1 (fr) | 2000-08-29 | 2003-04-04 | Serobiologiques Lab Sa | Utilisation d'extraits de la plante cassia alata dans des produits de soin |
US6441050B1 (en) | 2000-08-29 | 2002-08-27 | Raj K. Chopra | Palatable oral coenzyme Q liquid |
DE10048260A1 (de) | 2000-09-29 | 2002-04-11 | Beiersdorf Ag | Kosmetische oder dermatologische Zubereitungen mit einem Gehalt an Aminoguanidin und/oder dessen Derivaten und Strukturanaloga zur Hautaufhellung von Altersflecken und/oder zur Verhinderung der Hautbräunung, insbesondere der durch UV-Strahlung hervorgerufenen Hautbräunung |
DE10053328A1 (de) * | 2000-10-27 | 2002-05-08 | Cognis Deutschland Gmbh | Kosmetische Zubereitungen |
US6689385B2 (en) * | 2000-11-03 | 2004-02-10 | Chronorx Llc | Formulations for the treatment of insulin resistance and type 2 diabetes mellitus |
US6403116B1 (en) | 2000-11-03 | 2002-06-11 | Triarco Inductries, Inc. | Coenzyme Q10 formulation |
IT1317938B1 (it) | 2000-11-17 | 2003-07-15 | Sigma Tau Healthscience Spa | Composizione per la prevenzione e/o il trattamento di alterazioni delmetabolismo lipidico, delle forme allergiche e per attivare le difese |
US20070003536A1 (en) | 2000-11-21 | 2007-01-04 | Zimmerman Amy C | Topical skin compositions, their preparation, and their use |
AUPR177300A0 (en) | 2000-11-29 | 2000-12-21 | Centre For Molecular Biology And Medicine | Therapeutic methods |
AU2002221934A1 (en) | 2000-12-16 | 2002-06-24 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Health promoting compositions |
DE10064818A1 (de) | 2000-12-22 | 2002-06-27 | Basf Ag | Verwendung von Chroman-Derivaten in kosmetischen oder dermatologischen Zubreitungen |
US6806069B2 (en) * | 2001-01-09 | 2004-10-19 | Pharmachem Laboratories, Inc. | Ubiquinone composition and methods related thereto |
FR2819414A1 (fr) | 2001-01-15 | 2002-07-19 | Cognis France Sa | Preparations cosmetiques et/ou pharmaceutiques comprenant des extraits de plantes dites a resurrection |
WO2002056823A2 (en) | 2001-01-18 | 2002-07-25 | Arnold Hoffman | Redox therapy for tumors |
HUP0302567A2 (hu) | 2001-01-25 | 2003-12-29 | Bristol-Myers Squibb Co. | Epotilon analógokat tartalmazó parenterális adagolási formák és eljárás az előállításukra |
NL1017205C2 (nl) | 2001-01-26 | 2002-07-29 | Adriaan Emanuel Hendricus Wiel | Medicinale en cosmetische toepassing van hop en co-enzym Q10. |
ITRM20010044A1 (it) | 2001-01-29 | 2002-07-29 | Sigma Tau Healthscience Spa | Integratore alimentare ad effetto dimagrante. |
WO2002060484A1 (en) | 2001-01-31 | 2002-08-08 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Use of cd23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders |
ITMI20010204A1 (it) | 2001-02-02 | 2002-08-02 | Hunza Di Marazzita Maria Carme | Specialita' terapeutiche dotate di attivita' antiossidante ed in grado di controllare l'eccesso del peso corporeo |
FR2821624B1 (fr) | 2001-03-01 | 2004-01-02 | Sod Conseils Rech Applic | Nouveau polynucleotide utilisable pour moduler la proliferation des cellules cancereuses |
EP1372412A2 (en) | 2001-03-09 | 2004-01-02 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Composition improving age-related physiological deficits and increasing longevity |
DE10113050A1 (de) | 2001-03-15 | 2002-09-19 | Beiersdorf Ag | Selbstschäumende oder schaumförmige Zubereitungen organischen Hydrokolloiden |
DE10113046A1 (de) | 2001-03-15 | 2002-09-26 | Beiersdorf Ag | Selbstschäumende schaumförmige Zubereitungen mit organischen Hydrokolliden und partikulären hydrophobisierten und/oder ölabsorbierenden Festkörpersubstanzen |
DE10113053A1 (de) | 2001-03-15 | 2002-09-19 | Beiersdorf Ag | Selbstschäumende oder schaumförmige Zubereitungen mit anorganischen Gelbildnern und organischen Hydrololloiden |
DE60211581D1 (de) | 2001-03-23 | 2006-06-29 | Oreal | Hautbehandlungsmittel enthaltend Fasern und Ubichinone |
US20030031688A1 (en) * | 2001-04-02 | 2003-02-13 | Dipak Ghosh | Cosmetic composition with improved skin moisturizing properties |
US6727234B2 (en) * | 2001-04-03 | 2004-04-27 | University Of Iowa Research Foundation | Isoprenoid analog compounds and methods of making and use thereof |
US6469061B1 (en) | 2001-04-04 | 2002-10-22 | Ramot University Authority For Applied Research And Industrial Development Limited | Jasmonate pharmaceutical composition for treatment of cancer |
DE10118269A1 (de) | 2001-04-12 | 2002-10-17 | Cognis Deutschland Gmbh | Kosmetische Zubereitungen |
US6686485B2 (en) * | 2001-04-19 | 2004-02-03 | Daniel David West | Synthesis of coenzyme Q10, ubiquinone |
AU2002303427A1 (en) | 2001-04-24 | 2002-11-05 | East Carolina University | Compositions and formulations with a non-glucocorticoid steroid and/or a ubiquinone and kit for treatment of respiratory and lung disease |
AU2002256359A1 (en) | 2001-04-24 | 2002-11-05 | Epigenesis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense and anti-inflammatory based compositions to treat respiratory disorders |
US20040049022A1 (en) | 2001-04-24 | 2004-03-11 | Nyce Jonathan W. | Composition & methods for treatment and screening |
US6582723B2 (en) | 2001-05-03 | 2003-06-24 | Wayne F. Gorsek | Cancer immune composition for prevention and treatment of individuals |
JP3742602B2 (ja) | 2001-05-09 | 2006-02-08 | 株式会社カネカ | 還元型補酵素qの安定な溶液 |
JP4603192B2 (ja) | 2001-05-10 | 2010-12-22 | 株式会社カネカ | 毛髪頭皮用組成物 |
US7754205B2 (en) | 2001-05-10 | 2010-07-13 | Kaneka Corporation | Composition for transmucosal administration containing conenzyme Q as the active ingredient |
GB0111279D0 (en) | 2001-05-10 | 2001-06-27 | Nycomed Imaging As | Radiolabelled liposomes |
DE10123771B4 (de) | 2001-05-16 | 2019-01-10 | Beiersdorf Ag | Verwendung von Elektrolyten zur Stärkung der Barrierefunktion der Haut |
EP1260212A1 (de) | 2001-05-21 | 2002-11-27 | Cognis France S.A. | Kosmetische Mittel |
US20050118151A1 (en) * | 2001-05-29 | 2005-06-02 | Syddansk Universitet | Proteins in diabetes proteome anlysis |
NZ529339A (en) | 2001-05-30 | 2004-08-27 | Laxdale Ltd | Coenzyme Q and eicosapentaenoic acid (EPA) |
US20030138792A1 (en) | 2001-05-31 | 2003-07-24 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention and therapy of cervical cancer |
EP1262167A1 (de) | 2001-06-01 | 2002-12-04 | Cognis France S.A. | Kosmetische Zubereitungen enthaltend ein Extrakt von keimenden Pflanzen |
US7091241B2 (en) | 2001-06-01 | 2006-08-15 | Summa Health System | Nontoxic potentiation/sensitization of cancer therapy by supplementary treatment with combined vitamins C and K3 |
US6506915B1 (en) * | 2001-06-14 | 2003-01-14 | Daniel David West | Synthesis of coenzyme Q10 ubiquinone |
US6696060B2 (en) | 2001-06-14 | 2004-02-24 | Clearant, Inc. | Methods for sterilizing preparations of monoclonal immunoglobulins |
FR2826017B1 (fr) | 2001-06-15 | 2004-06-11 | Cognis France Sa | Melanges de tensioactifs |
SE0102380D0 (sv) | 2001-07-02 | 2001-07-02 | Macronova Ab | Kräm för behandling av åldersförändringar i huden hos människa |
DE10133198A1 (de) | 2001-07-07 | 2003-01-23 | Beiersdorf Ag | Kreatin enthaltende kosmetische und dermatologische Zubereitungen zur Behandlung und aktiven Prävention trockener Haut und anderer negativer Veränderungen der physiologischen Homöostase der gesunden Haut |
JP2003020495A (ja) | 2001-07-10 | 2003-01-24 | Cognis Japan Ltd | 油脂組成物 |
EP2351765A3 (en) | 2001-07-10 | 2012-02-22 | Lakewood-Amedex, Inc | Oligonucleotide-containing pharmacological compositions and their use |
CH695085A5 (de) * | 2001-07-13 | 2005-12-15 | Mibelle Ag Cosmetics | Formulierungen zur Pflege der Haut nach Laserbehandlungen und/oder chemischen Peelings und Verwendung der Formulierungen. |
TWI235146B (en) * | 2001-07-16 | 2005-07-01 | Kaneka Corp | Method of stabilizing reduced coenzyme q10 and method of acidic crystallization |
IL159894A0 (en) | 2001-07-17 | 2004-06-20 | Res Dev Foundation | Therapeutic agents comprising pro-apoptotic proteins |
FR2827603B1 (fr) | 2001-07-18 | 2003-10-17 | Oreal | Composes derives de diaminopyrazole substitues par un radical heteroaromatique et leur utilisation en teinture d'oxydation des fibres keratiniques |
EP1411951B2 (en) | 2001-07-27 | 2010-11-10 | N.V. Nutricia | Enteral compositions for the prevention and/or treatment of sepsis |
EP1281392A1 (de) | 2001-08-02 | 2003-02-05 | Cognis France S.A. | Kosmetische und/oder pharmaceutische Zubereitungen enthaltend Pflanzenextrakte |
US6503506B1 (en) | 2001-08-10 | 2003-01-07 | Millenium Biotechnologies, Inc. | Nutrient therapy for immuno-compromised patients |
DE10139580A1 (de) * | 2001-08-10 | 2003-02-20 | Beiersdorf Ag | Kosmetische und dermatologische Zubereitungen in Form von O/W-Emulsionen mit einem Gehalt an Sterinen und/oder C12-C40-Fettsäuren |
DE10143964A1 (de) | 2001-09-07 | 2003-03-27 | Basf Ag | Emulgatorarme oder emulgatorfreie Systeme vom Typ Öl-in-Wasser mit einem Gehalt an Stabilisatoren und einem aminosubstituierten Hydroxybenzophenon |
DE10143962A1 (de) | 2001-09-07 | 2003-03-27 | Basf Ag | Kosmetische und dermatologische Zubereitungen in Form von O/W-Emulsionen, enthaltend ein aminosubstituiertes Hydroxybenzophenon |
DE10143963A1 (de) | 2001-09-07 | 2003-03-27 | Basf Ag | Kosmetische und dermatologische Zubereitungen in Form von W/O-Emulsionen, enthaltend ein aminosubstituiertes Hydroxybenzophenon |
EP1432400A1 (en) * | 2001-09-18 | 2004-06-30 | Ciba SC Holding AG | Use of guaiol for treating the skin |
DE10150725A1 (de) | 2001-10-13 | 2003-04-17 | Cognis Deutschland Gmbh | Aniontensidfreie niedrigviskose Trübungsmittel |
US7247714B2 (en) | 2001-10-16 | 2007-07-24 | Atherogenics, Inc. | Protection against oxidative stress and inflammation by a cytoprotective response element |
US7560123B2 (en) | 2004-08-12 | 2009-07-14 | Everett Laboratories, Inc. | Compositions and methods for nutrition supplementation |
US6723527B2 (en) | 2001-10-26 | 2004-04-20 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for determining toxicity reversing agents |
ES2261760T3 (es) | 2001-10-26 | 2006-11-16 | Cognis Ip Management Gmbh | Solucion impregnante para toallitas cosmeticas. |
ES2320980T3 (es) | 2001-11-03 | 2009-06-01 | Astrazeneca Ab | Derivados de quinazolina como agentes antitumorales. |
US7435725B2 (en) | 2001-11-06 | 2008-10-14 | The Quigly Corporation | Oral compositions and methods for prevention, reduction and treatment of radiation injury |
US20030105027A1 (en) | 2001-11-06 | 2003-06-05 | Rosenbloom Richard A. | Nutritional supplements and methods for prevention, reduction and treatment of radiation injury |
US20030105031A1 (en) | 2001-11-06 | 2003-06-05 | Rosenbloom Richard A. | Methods for the treatment of skin disorders |
US6753325B2 (en) | 2001-11-06 | 2004-06-22 | The Quigley Corporation | Composition and method for prevention, reduction and treatment of radiation dermatitis |
US20030118536A1 (en) | 2001-11-06 | 2003-06-26 | Rosenbloom Richard A. | Topical compositions and methods for treatment of adverse effects of ionizing radiation |
US7527932B2 (en) * | 2001-11-09 | 2009-05-05 | Medstar Research Institute, Inc. | Method of using physiological markers to estimate cardiovascular risk |
DE10155769A1 (de) * | 2001-11-14 | 2003-05-22 | Cognis Deutschland Gmbh | Kosmetische und/oder pharmazeutische Emulsionen |
DE10160682A1 (de) * | 2001-12-11 | 2003-06-18 | Cognis Deutschland Gmbh | Emollients und kosmetische Zusammensetzungen |
US6652891B2 (en) | 2001-12-12 | 2003-11-25 | Herbasway Laboratories, Llc | Co-enzyme Q10 dietary supplement |
DE10162026A1 (de) | 2001-12-18 | 2003-07-03 | Cognis Deutschland Gmbh | Hochkonzentriert fließfähige Perlglanzkonzentrate |
DE10162351A1 (de) * | 2001-12-18 | 2003-07-03 | Cognis Deutschland Gmbh | Kosmetische und/oder pharmazeutische Emulsionen |
ITRM20010755A1 (it) | 2001-12-20 | 2003-06-20 | Simonelli Giuseppe | Uso del chinone q10 per il trattamento delle malattie oculari. |
TWI305547B (en) | 2001-12-27 | 2009-01-21 | Kaneka Corp | Processes for producing coenzyme q10 |
US20030129253A1 (en) | 2002-01-03 | 2003-07-10 | Milley Christopher J. | Stable aqueous suspension |
MXPA04006489A (es) | 2002-01-18 | 2004-10-04 | Basf Ag | Preparaciones cosmeticas y dermatologicas para evitar danos cutaneos causados por peroxidos. |
TW200302056A (en) | 2002-01-18 | 2003-08-01 | Kaneka Corp | Method for stabilizing reduced coenzyme Q10 and composition therefor |
US7357918B2 (en) * | 2002-01-31 | 2008-04-15 | Ciba Specialty Chemicals Corp. | Micropigment mixtures |
DE60307234T2 (de) * | 2002-02-12 | 2007-07-05 | Dsm Ip Assets B.V. | Sonnenschutzzusammensetzungen sowie dihydropyridine und dihydropyrane |
AU2003205738A1 (en) | 2002-02-14 | 2003-09-04 | Dsm Ip Assets B.V. | Water-dispersible coenzyme q10 dry powders |
EP1340486A1 (de) | 2002-03-01 | 2003-09-03 | Cognis France S.A. | Verwendung von Zuckerestern |
US20030167556A1 (en) | 2002-03-05 | 2003-09-11 | Consumers Choice Systems, Inc. | Methods and devices for transdermal delivery of anti-aging compounds for treatment and prevention of facial or neck skin aging |
DE10254315A1 (de) | 2002-03-15 | 2003-10-02 | Cognis Deutschland Gmbh | Emollients und kosmetische Zubereitungen |
EP1490399A2 (en) | 2002-03-20 | 2004-12-29 | Syddansk Universitet | Human diabetes-mediating proteins |
TW200304372A (en) * | 2002-03-20 | 2003-10-01 | Kanegafuchi Chemical Ind | Compositions for diabetes |
DE10212528A1 (de) * | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Cognis Deutschland Gmbh | Ölphasen für kosmetische Mittel |
US7811594B2 (en) * | 2002-03-28 | 2010-10-12 | Beiersdorf Ag | Crosslinked oil droplet-based cosmetic or pharmaceutical emulsions |
DE10213957A1 (de) * | 2002-03-28 | 2003-10-09 | Beiersdorf Ag | Vernetzte kosmetische oder pharmazeutische phospholipidhaltige Gele und Emulsionen auf der Basis von ethylenoxidhaltigen oder propylenoxidhaltigen Emulgatoren |
US20040101874A1 (en) | 2002-04-12 | 2004-05-27 | Mitokor Inc. | Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome |
DE10217474A1 (de) | 2002-04-19 | 2003-11-06 | Cognis Deutschland Gmbh | Sonnenschutzemulsion mit Schaumspender |
US20060193905A1 (en) | 2002-05-14 | 2006-08-31 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Direct cellular energy delivery system |
AU2003233653B2 (en) | 2002-05-23 | 2008-08-07 | Umd, Inc. | Compositions and method for transmucosal drug delivery and cryoprotection |
DE10223486A1 (de) | 2002-05-27 | 2003-12-11 | Beiersdorf Ag | Kosmetische und/oder dermatologische Zubereitung mit 2,3-Dibenzylbutyrolactonen |
ES2269955T3 (es) | 2002-06-03 | 2007-04-01 | Ciba Specialty Chemicals Holding Inc. | Formulaciones para proteccion de uv. |
US7182950B2 (en) | 2002-06-12 | 2007-02-27 | Nutralease Ltd. | Nano-sized self-assembled liquid dilutable vehicles |
DE10226018A1 (de) | 2002-06-12 | 2003-12-24 | Cognis Deutschland Gmbh | Zubereitungen mit konjugiertem Linolalkohol |
US7147841B2 (en) | 2002-06-17 | 2006-12-12 | Ciba Specialty Chemicals Corporation | Formulation of UV absorbers by incorporation in solid lipid nanoparticles |
AU2003246592A1 (en) | 2002-06-26 | 2004-01-19 | Europroteome Ag | Tumour marker and the use thereof for the diagnosis and treatment of tumour diseases |
US7060733B2 (en) | 2002-08-15 | 2006-06-13 | The Regents Of The University Of California | Methods for treating pancreatitis with curcumin compounds and inhibitors of reactive oxygen species |
WO2004028474A2 (en) | 2002-09-25 | 2004-04-08 | University Of Rochester | Caspase inhibitors as anticancer agents |
US6953786B2 (en) * | 2002-10-01 | 2005-10-11 | The Regents Of The University Of California | Compositions comprising plant-derived polyphenolic compounds and inhibitors of reactive oxygen species and methods of using thereof |
FR2845602B1 (fr) * | 2002-10-11 | 2005-07-08 | Servier Lab | Association entre un ligand des recepteurs actives par les proliferateurs de peroxisomes et un agent antioxydant et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent |
US7083813B2 (en) | 2002-11-06 | 2006-08-01 | The Quigley Corporation | Methods for the treatment of peripheral neural and vascular ailments |
EP1421929A3 (de) | 2002-11-21 | 2004-11-24 | Cognis Deutschland GmbH & Co. KG | Emollients und kosmetische Zubereitungen |
DE10256881A1 (de) | 2002-12-05 | 2004-06-24 | Beiersdorf Ag | Neue topische Verwendung von Bis-Arylimidazo[1,2-a]thiolanderivaten |
US20040110848A1 (en) | 2002-12-10 | 2004-06-10 | Peffley Dennis M | Method and kit for treating cancer |
CA2509832A1 (en) | 2002-12-16 | 2004-07-01 | Garvan Institute Of Medical Research | Methods of treatment of feeding disorders or disorders of glucose uptake and for modifying metabolism and identifying therapeutic reagents therefor |
JP2006526140A (ja) | 2002-12-24 | 2006-11-16 | バイオサイト インコーポレイテッド | 鑑別診断のためのマーカーおよびその使用方法 |
AU2003303520A1 (en) | 2003-01-02 | 2004-07-29 | Gerard M. Housey | Irs modulators |
US20090036516A1 (en) | 2003-01-13 | 2009-02-05 | Ctg Pharma S.R.L. | Compounds for treating metabolic syndrome |
JP4671953B2 (ja) | 2003-01-20 | 2011-04-20 | チバ ホールディング インコーポレーテッド | Uv吸収剤としてのトリアジン誘導体 |
JP2006514661A (ja) | 2003-02-03 | 2006-05-11 | デーエスエム アイピー アセッツ ベー. ヴェー. | 新規な安定化されたケイ皮酸エステルサンスクリーン組成物 |
US7258876B2 (en) | 2003-02-05 | 2007-08-21 | Craig Bozzacco | Topical composition for treating infectious conditions of skin and mucosa |
CN1208052C (zh) | 2003-03-20 | 2005-06-29 | 上海家化联合股份有限公司 | 一种辅酶q10前体脂质体及其制备方法 |
EP1606270B1 (en) | 2003-03-24 | 2013-08-14 | Basf Se | Symmetrical triazine derivatives |
EP2465516A1 (en) | 2003-04-08 | 2012-06-20 | Barrie Tan | Annatto extract compositions, including geranyl geraniols and methods of use |
US20050037102A1 (en) | 2003-07-18 | 2005-02-17 | Barrie Tan | Annatto extract compositions including tocotrienols and tocopherols and methods of use |
JP2004321171A (ja) * | 2003-04-11 | 2004-11-18 | Fancl Corp | 飲食品 |
EP1473043A1 (en) | 2003-04-29 | 2004-11-03 | Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG | Pharmaceutical combination for the treatment of diseases involving cell proliferation, migration or apotosis of myeloma cells, or angiogenesis |
JP2004345988A (ja) * | 2003-05-21 | 2004-12-09 | Eisai Co Ltd | リボフラビン系化合物を含む医薬組成物 |
US7438903B2 (en) * | 2003-06-06 | 2008-10-21 | Nbty, Inc. | Methods and compositions that enhance bioavailability of coenzyme-Q10 |
US20040253323A1 (en) | 2003-06-11 | 2004-12-16 | Giles Brian C. | Ionic cancer therapy and methods for using same in the treatment of tumors and metastasis |
US8003094B2 (en) | 2003-06-25 | 2011-08-23 | Charles Erwin | Chemical combination and method for increasing delivery of Coenzyme Q10 |
US20050026879A1 (en) | 2003-07-31 | 2005-02-03 | Robinson Cynthia B. | Combination of dehydroepiandrosterone or dehydroepiandrosterone-sulfate with a tyrosine kinase inhibitor, delta opioid receptor antagonist, neurokinin receptor antagonist, or VCAM inhibitor for treatment of asthma or chronic obstructive pulmonary disease |
US20050026848A1 (en) | 2003-07-31 | 2005-02-03 | Robinson Cynthia B. | Combination of dehydroepiandrosterone or dehydroepiandrosterone-sulfate with a methylxanthine derivative for treatment of asthma or chronic obstructive pulmonary disease |
US8802161B2 (en) | 2003-08-02 | 2014-08-12 | Florida Agricultural And Mechanical University | Herbal composition and method of use for the treatment of cancer |
US20070248693A1 (en) | 2003-08-02 | 2007-10-25 | Elizabeth Mazzio | Nutraceutical composition and method of use for treatment / prevention of cancer |
US20060035981A1 (en) * | 2003-08-02 | 2006-02-16 | Mazzio Elizabeth A | Inhibition of anaerobic glucose metabolism and corresponding composition as a natural non-toxic approach to cancer treatment |
US20080069779A1 (en) * | 2003-08-04 | 2008-03-20 | Foamix Ltd. | Foamable vehicle and vitamin and flavonoid pharmaceutical compositions thereof |
US20050036976A1 (en) * | 2003-08-12 | 2005-02-17 | Joel Rubin | Topical skin care composition |
WO2005020940A1 (de) | 2003-08-27 | 2005-03-10 | Beiersdorf Ag | Kapsel deren kapselhülle bei topischer anwendung nicht mehr gesondert warhnembar ist |
US7169385B2 (en) | 2003-09-29 | 2007-01-30 | Ronald G. Udell | Solubilized CoQ-10 and carnitine |
US8124072B2 (en) | 2003-09-29 | 2012-02-28 | Soft Gel Technologies, Inc. | Solubilized CoQ-10 |
US8105583B2 (en) | 2003-09-29 | 2012-01-31 | Soft Gel Technologies, Inc. | Solubilized CoQ-10 |
BRPI0414858A (pt) | 2003-10-02 | 2006-11-21 | Sembiosys Genetics Inc | métodos para preparação de corpos de óleo compreendendo ingredientes ativos |
DE10347218A1 (de) | 2003-10-10 | 2005-05-12 | Cognis Deutschland Gmbh | Sonnenschutzmittel |
CN1897950A (zh) | 2003-10-14 | 2007-01-17 | 惠氏公司 | 稠合芳基和杂芳基衍生物及其使用方法 |
DE10347940A1 (de) | 2003-10-15 | 2005-05-19 | Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg | Selbstemulgierende Zubereitungen |
KR20060100402A (ko) | 2003-10-31 | 2006-09-20 | 가부시키가이샤 가네카 | 환원형 보효소 q 함유 조성물 |
EP1682228B1 (en) | 2003-11-05 | 2009-12-02 | DSM IP Assets B.V. | Light protecting composition with reduced total amount of uv filter containing a polysiloxane-based uv filter |
US20050100537A1 (en) | 2003-11-10 | 2005-05-12 | Evans Gregory S. | Methods and kits for reducing cellular damage, inhibiting free radical production, and scavenging free radicals in mammals |
US8932649B2 (en) | 2003-11-14 | 2015-01-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for treating a neoplastic disease in a subject using inorganic selenium-containing compounds |
DE10354052A1 (de) | 2003-11-17 | 2005-06-16 | Beiersdorf Ag | Kosmetikum mit empfindlichen Inhaltsstoffen |
US20050118235A1 (en) | 2003-12-02 | 2005-06-02 | Shiguang Yu | Dietary non-essential amino acid tyrosine regulates the body weight of animals through regulating the animal appetite or food intake |
EP1750651B1 (en) | 2003-12-18 | 2017-11-29 | Nestec S.A. | Composition for improving skin, hair and coat health containing flavanones |
JP4742526B2 (ja) * | 2003-12-26 | 2011-08-10 | シンフォニアテクノロジー株式会社 | Icチップ実装体の製造方法及び製造装置 |
US20050226947A1 (en) | 2004-02-04 | 2005-10-13 | Dale Kern | Agents for sequestering serum aging factors and uses therefore |
US20070149618A1 (en) | 2004-02-17 | 2007-06-28 | Action Medicines, S.L. | Methods of use for 2,5-dihydroxybenzene sulfonic acid compounds for the treatment of cancer, rosacea and psoriasis |
NZ549159A (en) | 2004-02-19 | 2011-01-28 | Chemaphor Inc | Topical formulations for the treatment of skin conditions |
US7780873B2 (en) | 2004-02-23 | 2010-08-24 | Texas A&M University System | Bioactive complexes compositions and methods of use thereof |
AU2004316985A1 (en) | 2004-02-23 | 2005-09-15 | The Texas A & M University System | Antioxidant compositions and methods of use thereof |
US20050202521A1 (en) | 2004-03-10 | 2005-09-15 | Albert Crum | Methods of assessing the need for and the effectiveness of therapy with antioxidants |
DE102004014615A1 (de) | 2004-03-23 | 2005-10-13 | Beiersdorf Ag | Taurinhaltige Zubereitungen zur Verbesserung der Hautbarriere |
WO2005104213A2 (en) * | 2004-04-06 | 2005-11-03 | Basf Aktiengesellschaft | COSMETIC FORMULATIONS COMPRISING ZnO NANOPARTICLES |
US20050226858A1 (en) | 2004-04-09 | 2005-10-13 | Kaneka Corporation | Compositions containing reduced coenzyme Q10 and carotenoid |
US7351739B2 (en) | 2004-04-30 | 2008-04-01 | Wellgen, Inc. | Bioactive compounds and methods of uses thereof |
US7723569B2 (en) * | 2004-04-30 | 2010-05-25 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Method for producing ubiquinone-10 in plant |
IL161899A0 (en) | 2004-05-10 | 2005-11-20 | Hoffman Arnold | Kit for treatment of cancer |
JP2005323573A (ja) | 2004-05-17 | 2005-11-24 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 遺伝子発現データ解析方法および、疾患マーカー遺伝子の選抜法とその利用 |
US20070202090A1 (en) | 2004-05-18 | 2007-08-30 | Mirko Prosek | Water Soluble Form Of Coenzyme Q10 In The Form Of An Inclusion Complex With Beta-Cyclodextrin, Process Of Preparing, And Use Thereof |
US20080075684A1 (en) | 2004-05-24 | 2008-03-27 | Basf Aktiengesellschaft | Keratin-Binding Polypeptides |
KR20050112942A (ko) | 2004-05-28 | 2005-12-01 | 주식회사 뉴트렉스테크놀러지 | 비만 억제용 조성물 |
US20050288333A1 (en) | 2004-06-08 | 2005-12-29 | Kem William R | Controlling angiogenesis with anabaseine analogs |
WO2006009825A1 (en) | 2004-06-17 | 2006-01-26 | Virun, Inc. | Compositions comprising a mucoadhesive protein and an active principle for mucosal delivery of said agents |
WO2005123101A1 (en) * | 2004-06-18 | 2005-12-29 | Symrise Gmbh & Co. Kg | Blackberry extract |
RU2007102086A (ru) * | 2004-06-21 | 2008-07-27 | Хатчисон Медифарма Энтерпрайзис Лимитед (Bs) | Химиотерапия рака |
ES2380940T3 (es) | 2004-06-28 | 2012-05-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Composiciones cosméticas que contienen hidrolizados de proteína |
US20070225255A1 (en) | 2004-07-13 | 2007-09-27 | Eleonore Frohlich | Use of Mitochondrially Targeted Antioxidant in the Treatment of Liver Diseases and Epithelial Cancers |
US20060069068A1 (en) | 2004-07-15 | 2006-03-30 | Nanobac Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the treatment of diseases characterized by pathological calcification |
MX2007001098A (es) | 2004-07-28 | 2009-02-11 | Raymond M Pleva | Composicion de aceite de emu y fruta. |
JP2006070016A (ja) | 2004-08-02 | 2006-03-16 | Kaneka Corp | 還元型補酵素qを含有する美白用組成物 |
WO2006017494A2 (en) * | 2004-08-02 | 2006-02-16 | Elizabeth Mazzio | Inhibition of anaerobic glucose metabolism |
EP2377532A1 (en) | 2004-08-18 | 2011-10-19 | Ace ApS | Cosmetic and pharmaceutical compositions comprising ACE inhibitors and/or angiotensin II receptor antagonists for treating dermatological disorders |
WO2006023342A2 (en) | 2004-08-20 | 2006-03-02 | Tishcon Corp | Synergistic conjugated linoleic acid (cla) and carnitine combination |
US20060051462A1 (en) * | 2004-09-03 | 2006-03-09 | Wang Jimmy X | Self emulsifying compositions for delivering lipophilic coenzyme Q10 and other dietary ingredients |
US7288263B2 (en) | 2004-09-13 | 2007-10-30 | Evera Laboratories, Llc | Compositions and methods for treatment of skin discoloration |
CN101102768A (zh) * | 2004-09-17 | 2008-01-09 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 治疗高脂血症的方法和组合物 |
US20060062755A1 (en) | 2004-09-21 | 2006-03-23 | Woodward John R | Method of cancer screening; method of cancer treatment; and method of diabetes treatment |
JP5093998B2 (ja) | 2004-09-22 | 2012-12-12 | 大塚製薬株式会社 | 色素沈着予防又は改善剤 |
DE102004046235A1 (de) | 2004-09-22 | 2006-03-30 | Altana Pharma Ag | Arzneimittelzubereitung |
CA2581775A1 (en) | 2004-09-27 | 2006-04-06 | Sigmoid Biotechnologies Limited | Dihydropyrimidine microcapsule - formulations |
CA2584138A1 (en) | 2004-10-18 | 2006-04-27 | Raphael C. Lee | Methods and compositions for treatment of free radical injury |
US20060120997A1 (en) | 2004-10-29 | 2006-06-08 | Biomune, Inc. | Cancer therapeutic compositions |
BRPI0517930A (pt) | 2004-11-02 | 2008-10-21 | Dsm Ip Assets Bv | aditivo para preparações de protetor solar contra uv |
US8349359B2 (en) | 2004-11-07 | 2013-01-08 | Your Energy Systems, LLC | Liposomal formulation for oral administration of glutathione (reduced) |
GB0424891D0 (en) * | 2004-11-11 | 2004-12-15 | Boots Co Plc | Topical compositions |
US8961958B2 (en) | 2004-11-16 | 2015-02-24 | Bioavailability, Inc | High concentration self-microemulsifying coenzyme Q10 preparations for nutritional use |
US20060110415A1 (en) | 2004-11-22 | 2006-05-25 | Bioderm Research | Topical Delivery System for Cosmetic and Pharmaceutical Agents |
US20060127384A1 (en) | 2004-12-09 | 2006-06-15 | Sergio Capaccioli | Coenzyme Q10 as antiapoptotic agent |
US7862995B2 (en) | 2004-12-10 | 2011-01-04 | Targeted Molecular Diagnostics | Methods and materials for predicting responsiveness to treatment with dual tyrosine kinase inhibitor |
EP1828774A1 (en) | 2004-12-14 | 2007-09-05 | F. Hoffmann-Roche AG | Cd99 as target/marker for insulin resistance |
WO2006063402A1 (en) | 2004-12-16 | 2006-06-22 | Melvin Mackenzie Stewart | Therapeutic compositions based on extracts of plants from the genus plumeria (frangipani) |
NO20045674D0 (no) | 2004-12-28 | 2004-12-28 | Uni I Oslo | Thin films prepared with gas phase deposition technique |
US20060286046A1 (en) | 2005-01-05 | 2006-12-21 | Haber C Andrew | Skin care compositions |
US20060188492A1 (en) | 2005-01-13 | 2006-08-24 | Chronorx Llc, An Alaska Limited Liability Company | Topical management of ocular and periocular conditions |
DE102005007980A1 (de) | 2005-02-22 | 2006-02-23 | Clariant Gmbh | Kosmetische, pharmazeutische oder dermatologische Zubereitungen enthaltend Copolymerwachse |
WO2006103750A1 (ja) | 2005-03-29 | 2006-10-05 | Nippon Meat Packers, Inc. | 肥満改善用組成物、機能性食品及び医薬用組成物 |
JP2008534619A (ja) | 2005-04-01 | 2008-08-28 | ザイムス, エルエルシー | CoQ10を送達システムとして使用する皮膚強化 |
CN1853507A (zh) | 2005-04-28 | 2006-11-01 | 尚宝虎 | 一种没有副作用的可用于饮料和固体口服制剂或食品添加的减肥新组方 |
JP2007001922A (ja) * | 2005-06-23 | 2007-01-11 | Asahi Kasei Pharma Kk | 透析患者における腎疾患改善剤、又は機能性食品 |
JPWO2007013556A1 (ja) * | 2005-07-28 | 2009-02-12 | 株式会社カネカ | 癌予防用組成物 |
US20070026072A1 (en) | 2005-07-28 | 2007-02-01 | Stephen Olsen | Benzoquinones of enhanced bioavailability |
US20070053985A1 (en) | 2005-08-24 | 2007-03-08 | Kaneka Corporation | Coenzyme Q10-containing fine particle with excellent dispersibility |
CN1928556A (zh) | 2005-09-05 | 2007-03-14 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 中国人2型糖尿病血清标志物的检测试剂盒 |
US20070071779A1 (en) | 2005-09-26 | 2007-03-29 | Leggit Ingenuity, Llc | Compositions for delivering lipophilic agents to the intestinal mucosa and method of making thereof |
EP1876448A1 (en) | 2005-09-30 | 2008-01-09 | DIGILAB BioVisioN GmbH | Method and analytical reagents for identifying therapeutics using biomarkers responsive to thiazolidinediones. |
US20070092469A1 (en) * | 2005-10-26 | 2007-04-26 | Eric Jacobs | Topically applied Glucosamine Sulfate and all its related, precursor, and derivative compounds significantly increases the skin's natural produciton of hyaluronic acid for the rejuvenation of healthier younger-looking skin; while PhosphatidylCholine is required to replace its deficiency caused by topical Dimethylaminoethanol (DMAE) |
US8506956B2 (en) * | 2005-10-31 | 2013-08-13 | Kaneka Corporation | Method for stabilizing reduced coenzyme Q10 |
US9265792B2 (en) | 2005-11-16 | 2016-02-23 | Patricia A. Riley | Integument cell regeneration formulation |
JP5984324B2 (ja) * | 2005-12-01 | 2016-09-06 | メディカル プログノシス インスティテュート エー/エス | 治療反応のバイオマーカーを同定するための方法および装置、ならびに治療効果を推定するためのその使用 |
CA2631713A1 (en) | 2005-12-02 | 2007-09-13 | Sirtris Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of cdc2-like kinases (clks) and methods of use thereof |
JP2007176804A (ja) * | 2005-12-27 | 2007-07-12 | Zmc−Kougen株式会社 | 痩身作用を有する医薬又は健康食品 |
US20070172436A1 (en) | 2006-01-23 | 2007-07-26 | Jerry Zhang | Nonaqueous ascorbic acid compositions and methods for preparing same |
US20070184076A1 (en) | 2006-02-07 | 2007-08-09 | Unger Evan C | Liquid-filled nanodroplets for anti-cancer therapy |
US20070184041A1 (en) | 2006-02-09 | 2007-08-09 | Burja Adam M | Methods and compositions related to production of coenzyme q10 |
US8211634B2 (en) * | 2006-02-14 | 2012-07-03 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cancer |
US8067152B2 (en) | 2006-02-27 | 2011-11-29 | The Fred Hutchinson Cancer Research Center | Liver cancer biomarkers |
US20070203091A1 (en) | 2006-02-28 | 2007-08-30 | Eliezer Rapaport | Methods and therapeutic compositions for improving liver, blood flow and skeletal muscle functions in advanced diseases and aging |
DK1993515T3 (da) | 2006-03-10 | 2009-12-07 | Laboswiss Ag | Fremgangsmåde til solubilisering, dispergering og stabilisering af stoffer, produkter, der er fremstillet efter fremgangsmåden og anvendelsen af samme |
US7335384B2 (en) | 2006-03-17 | 2008-02-26 | 4K Nutripharma International | Nutrient compositions for the treatment and prevention of inflammation and disorders associated therewith |
US8030013B2 (en) * | 2006-04-14 | 2011-10-04 | Mount Sinai School Of Medicine | Methods and compositions for the diagnosis for early hepatocellular carcinoma |
WO2007126086A1 (ja) | 2006-04-28 | 2007-11-08 | Kaneka Corporation | 還元型補酵素q10の精製方法 |
AU2007244232B2 (en) | 2006-04-28 | 2012-07-19 | Kaneka Corporation | Method for stabilization of reduced coenzyme Q10 |
US8021659B2 (en) | 2006-04-28 | 2011-09-20 | Naidu Lp | Coenzyme Q10, lactoferrin and angiogenin compositions and uses thereof |
CA2977089A1 (en) | 2006-05-02 | 2007-11-15 | University Of Miami | Topical co-enzyme q10 formulations and treatment of pain, fatigue and wounds |
WO2007142347A1 (ja) | 2006-06-05 | 2007-12-13 | Shimadzu Corporation | 腫瘍マーカー及び癌疾病の罹患の識別方法 |
US20080020022A1 (en) | 2006-06-05 | 2008-01-24 | Udell Ronald G | Chewable co-enzyme q-10 capsule |
US20080014187A1 (en) | 2006-07-15 | 2008-01-17 | Bryant Villeponteau | Compositions and Methods for Treating Hypertension and Inflammation |
US8894993B2 (en) * | 2006-08-04 | 2014-11-25 | Natreon Inc. | Mitochondria-targeted antioxidants |
US7645616B2 (en) * | 2006-10-20 | 2010-01-12 | The University Of Hong Kong | Use of lipocalin-2 as a diagnostic marker and therapeutic target |
WO2008069276A1 (ja) | 2006-12-06 | 2008-06-12 | Kaneka Corporation | 癌治療剤および発癌抑制剤 |
CN101015524B (zh) * | 2007-02-15 | 2011-09-14 | 沈阳药科大学 | 辅酶q10口服乳剂及其制备方法 |
CA2680825C (en) | 2007-03-22 | 2013-10-29 | Cytotech Labs, Llc | Topical formulations having enhanced bioavailability |
WO2008156654A2 (en) * | 2007-06-15 | 2008-12-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Cytoskeleton modulators for treating metabolic disorders |
US20090005398A1 (en) | 2007-06-27 | 2009-01-01 | Mohammed Dar | Methods For The Treatment of Central Nervous System Tumors |
US7989007B2 (en) | 2007-07-03 | 2011-08-02 | Vincent James Enterprises, Llc | Weight loss composition |
KR100849537B1 (ko) | 2007-07-04 | 2008-07-31 | 유효경 | 코엔자임 큐텐의 나노에멀젼 조성물 |
MX341954B (es) | 2007-07-17 | 2016-09-08 | Metabolon Inc | Biomarcadores para prediabetes, enfermedades cardiovasculares y otros transtornos relacionados con sindrome metabolico, y metodos de uso de los mismos. |
CN101091890A (zh) | 2007-07-26 | 2007-12-26 | 沈阳药科大学 | 一种复合型乳化剂及用其制备的乳剂及其制备方法 |
US7776894B2 (en) | 2007-08-17 | 2010-08-17 | Burnham Institute For Medical Research | Compositions and methods for inhibiting growth and metastasis of melanoma |
RU2345367C1 (ru) | 2007-08-22 | 2009-01-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО НГМУ Росздрава) | Способ прогнозирования тяжести течения и эффективности лечения лимфом |
JP2009050168A (ja) * | 2007-08-23 | 2009-03-12 | Tsujido Kagaku Kk | 食品組成物 |
JP2010540498A (ja) | 2007-09-28 | 2010-12-24 | ウニヴェルズィテーツシュピタール バーゼル | 癌の治療のための免疫リポソーム |
JP2009096757A (ja) * | 2007-10-17 | 2009-05-07 | Tsujido Kagaku Kk | 脂肪代謝抑制剤 |
JP5767812B2 (ja) | 2007-12-06 | 2015-08-19 | バーグ リミテッド ライアビリティ カンパニー | 生物学的利用率が向上した吸入可能な組成物 |
US20110136231A1 (en) * | 2008-04-11 | 2011-06-09 | Cytotech Labs, Llc | Methods and use of inducing apoptosis in cancer cells |
US8460886B2 (en) | 2008-07-04 | 2013-06-11 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | Use of an efficacy marker for optimizing therapeutic efficacy of an anti-human PD-1 antibody on cancers |
WO2010065601A1 (en) | 2008-12-03 | 2010-06-10 | Amorcyte, Inc. | Infarct area perfusion-improving compositions and methods of vascular injury repair |
DE102008060773A1 (de) | 2008-12-05 | 2010-06-10 | Sartorius Stedim Biotech Gmbh | Verschluss für einen Behälter |
US8247435B2 (en) | 2009-02-19 | 2012-08-21 | Thornthwaite Jerry T | Formulations for treating human and animal diseases |
CN102481270A (zh) | 2009-05-11 | 2012-05-30 | 博格生物系统有限责任公司 | 利用表观代谢转变剂、多维细胞内分子或环境影响剂治疗肿瘤障碍的方法 |
EA201270325A1 (ru) | 2009-08-25 | 2012-11-30 | Ситотех Лэбс, Ллс | Способы лечения саркомы с использованием эпиметаболической сдвигающей добавки (кофермента q10) |
US8506954B2 (en) | 2009-12-01 | 2013-08-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Tumor vaccination in combination with hematopoietic cell transplantation for cancer therapy |
EP2544663B1 (en) | 2010-03-12 | 2018-01-03 | Berg LLC | Intravenous formulations of coenzyme q10 (coq10) and methods of use thereof |
CA3225438A1 (en) | 2010-07-19 | 2012-01-26 | Remedy Pharmaceuticals, Inc. | Methods of intravenous adminstration of glyburide and other drugs |
US9125835B2 (en) | 2010-11-12 | 2015-09-08 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Synergistic combinations to reduce particle dose for targeted treatment of cancer and its metastases |
AU2012240222B2 (en) | 2011-04-04 | 2017-04-27 | Berg Llc | Methods of treating central nervous system tumors |
NZ702369A (en) | 2012-06-01 | 2016-12-23 | Berg Llc | Treatment of solid tumors using coenzyme q10 |
AU2014251045B2 (en) | 2013-04-08 | 2019-06-13 | Berg Llc | Treatment of cancer using coenzyme Q10 combination therapies |
SG10201907816RA (en) | 2013-09-04 | 2019-09-27 | Berg Llc | Methods of treatment of cancer by continuous infusion of coenzyme q10 |
JP6398212B2 (ja) | 2014-02-12 | 2018-10-03 | 株式会社Ihi | 軸受構造、および、過給機 |
JP2017530130A (ja) | 2014-10-03 | 2017-10-12 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 腫瘍が誘発する自然免疫応答の免疫抑制を阻害する方法としてのアネキシンvの使用 |
CN107106590B (zh) | 2014-10-24 | 2022-10-18 | 阿斯利康(瑞典)有限公司 | 组合 |
US9827308B2 (en) | 2014-12-10 | 2017-11-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Mini-intronic plasmid DNA vaccines in combination with LAG3 blockade |
WO2017087576A1 (en) | 2015-11-16 | 2017-05-26 | Berg Llc | Methods of treatment of temozolomide-resistant glioma using coenzyme q10 |
US20180021270A1 (en) | 2016-07-21 | 2018-01-25 | Berg Llc | Methods for the treatment of cancer using coenzyme q10 in combination with immune checkpoint modulators |
-
2010
- 2010-05-11 CN CN2010800314329A patent/CN102481270A/zh active Pending
- 2010-05-11 KR KR1020187014434A patent/KR20180056816A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-05-11 CA CA2763347A patent/CA2763347C/en active Active
- 2010-05-11 KR KR1020187003732A patent/KR20180018833A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-05-11 US US12/778,029 patent/US9205064B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-05-11 KR KR1020117029548A patent/KR101860294B1/ko active IP Right Grant
- 2010-05-11 MX MX2015007141A patent/MX357528B/es unknown
- 2010-05-11 MX MX2011011947A patent/MX2011011947A/es unknown
- 2010-05-11 SG SG10201402293SA patent/SG10201402293SA/en unknown
- 2010-05-11 EP EP10775396.4A patent/EP2429511B1/en not_active Not-in-force
- 2010-05-11 EA EA201101519A patent/EA201101519A1/ru unknown
- 2010-05-11 CN CN201080031434.8A patent/CN102483419B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-05-11 US US12/778,010 patent/US20110123986A1/en not_active Abandoned
- 2010-05-11 JP JP2012510948A patent/JP6169846B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-05-11 SG SG10201402288RA patent/SG10201402288RA/en unknown
- 2010-05-11 WO PCT/US2010/034427 patent/WO2010132486A2/en active Application Filing
- 2010-05-11 CN CN201510125110.5A patent/CN104825429A/zh active Pending
- 2010-05-11 BR BRPI1010908A patent/BRPI1010908A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-05-11 AU AU2010247800A patent/AU2010247800A1/en not_active Abandoned
- 2010-05-11 AU AU2010247734A patent/AU2010247734B2/en not_active Ceased
- 2010-05-11 WO PCT/US2010/034420 patent/WO2010132479A2/en active Application Filing
- 2010-05-11 WO PCT/US2010/034376 patent/WO2010132440A2/en active Application Filing
- 2010-05-11 JP JP2012510951A patent/JP6081195B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-05-11 AU AU2010247750A patent/AU2010247750B2/en not_active Ceased
- 2010-05-11 CN CN201510556078.6A patent/CN105287449A/zh active Pending
- 2010-05-11 CA CA2763325A patent/CA2763325A1/en not_active Abandoned
- 2010-05-11 CN CN2010800314352A patent/CN102481271A/zh active Pending
- 2010-05-11 AU AU2010247755A patent/AU2010247755B2/en active Active
- 2010-05-11 WO PCT/US2010/034453 patent/WO2010132507A2/en active Application Filing
- 2010-05-11 BR BRPI1010827A patent/BRPI1010827A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-05-11 EA EA201101522A patent/EA201101522A1/ru unknown
- 2010-05-11 US US12/777,902 patent/US10519504B2/en active Active
- 2010-05-11 BR BRPI1010576A patent/BRPI1010576A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-05-11 EP EP10775420.2A patent/EP2430455A4/en not_active Withdrawn
- 2010-05-11 EA EA201101520A patent/EA201101520A1/ru unknown
- 2010-05-11 CA CA2763336A patent/CA2763336C/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-05-11 KR KR1020117029562A patent/KR20120060945A/ko active Search and Examination
- 2010-05-11 MX MX2011011940A patent/MX351083B/es active IP Right Grant
- 2010-05-11 US US12/778,054 patent/US20110020312A1/en not_active Abandoned
- 2010-05-11 JP JP2012510958A patent/JP2012526828A/ja active Pending
- 2010-05-11 SG SG2011082930A patent/SG175996A1/en unknown
- 2010-05-11 BR BRPI1010648A patent/BRPI1010648A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-05-11 MX MX2011011942A patent/MX345044B/es active IP Right Grant
- 2010-05-11 KR KR1020117029583A patent/KR20120034649A/ko active Application Filing
- 2010-05-11 US US12/778,094 patent/US20110027247A1/en not_active Abandoned
- 2010-05-11 AU AU2010247761A patent/AU2010247761A1/en not_active Abandoned
- 2010-05-11 SG SG2011082898A patent/SG175992A1/en unknown
- 2010-05-11 EP EP10775424.4A patent/EP2430194A4/en not_active Withdrawn
- 2010-05-11 SG SG2011082906A patent/SG175993A1/en unknown
- 2010-05-11 CA CA2761717A patent/CA2761717A1/en not_active Abandoned
- 2010-05-11 KR KR1020117029572A patent/KR20120088555A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-05-11 JP JP2012510959A patent/JP5903735B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-05-11 SG SG10201402289VA patent/SG10201402289VA/en unknown
- 2010-05-11 JP JP2012510932A patent/JP5903734B2/ja active Active
- 2010-05-11 EA EA201101523A patent/EA023913B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-05-11 BR BRPI1011025A patent/BRPI1011025A8/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-05-11 KR KR1020117029547A patent/KR101829201B1/ko active IP Right Grant
- 2010-05-11 SG SG2011082880A patent/SG175991A1/en unknown
- 2010-05-11 WO PCT/US2010/034447 patent/WO2010132502A2/en active Application Filing
- 2010-05-11 MX MX2011011949A patent/MX349796B/es active IP Right Grant
- 2010-05-11 CN CN201080031431.4A patent/CN102481269B/zh active Active
- 2010-05-11 CA CA2762213A patent/CA2762213A1/en not_active Abandoned
- 2010-05-11 EP EP10775441.8A patent/EP2429513A4/en not_active Withdrawn
- 2010-05-11 EA EA201101521A patent/EA034552B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-05-11 SG SG2011082914A patent/SG175994A1/en unknown
- 2010-05-11 CN CN201080031433.3A patent/CN102482713B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-05-11 SG SG10201402287TA patent/SG10201402287TA/en unknown
- 2010-05-11 SG SG10201402291QA patent/SG10201402291QA/en unknown
- 2010-05-11 EP EP10775436.8A patent/EP2429512A4/en not_active Withdrawn
- 2010-05-11 MX MX2011011958A patent/MX2011011958A/es active IP Right Grant
-
2011
- 2011-11-10 IL IL216297A patent/IL216297A0/en unknown
- 2011-11-10 IL IL216299A patent/IL216299A0/en unknown
- 2011-11-10 IL IL216298A patent/IL216298A0/en unknown
- 2011-11-10 IL IL216295A patent/IL216295A0/en active IP Right Grant
- 2011-11-10 IL IL216296A patent/IL216296B/en active IP Right Grant
-
2014
- 2014-02-03 US US14/171,419 patent/US9896731B2/en active Active
-
2015
- 2015-06-03 JP JP2015113220A patent/JP2015199746A/ja active Pending
- 2015-07-31 JP JP2015151893A patent/JP2016023189A/ja active Pending
- 2015-07-31 JP JP2015151900A patent/JP6254979B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2015-11-13 US US14/940,614 patent/US20160145693A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-01-29 US US15/011,196 patent/US20170137879A1/en not_active Abandoned
- 2016-07-04 AU AU2016204621A patent/AU2016204621A1/en not_active Abandoned
- 2016-09-01 AU AU2016222422A patent/AU2016222422A1/en not_active Abandoned
- 2016-09-05 AU AU2016222515A patent/AU2016222515A1/en not_active Abandoned
- 2016-09-16 JP JP2016181707A patent/JP2017018134A/ja active Pending
- 2016-10-07 JP JP2016199136A patent/JP2017074038A/ja active Pending
- 2016-12-07 AU AU2016269471A patent/AU2016269471A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-07-21 JP JP2017141826A patent/JP2017214413A/ja active Pending
- 2017-09-08 JP JP2017172972A patent/JP2018021064A/ja active Pending
- 2017-09-08 JP JP2017172885A patent/JP2018048125A/ja active Pending
- 2017-12-11 US US15/837,505 patent/US20190010554A1/en not_active Abandoned
- 2017-12-14 US US15/841,972 patent/US20180334721A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-01-05 US US15/862,856 patent/US10351915B2/en active Active
-
2019
- 2019-05-24 US US16/421,788 patent/US11028446B2/en active Active
-
2020
- 2020-02-28 US US16/805,557 patent/US20210002725A1/en not_active Abandoned
- 2020-03-16 US US16/819,811 patent/US20210332439A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-04-16 US US17/232,795 patent/US20220081720A1/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007518805A (ja) * | 2004-01-22 | 2007-07-12 | ユニバーシティー・オブ・マイアミ | 局所用コエンザイムq10製剤および使用方法 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6254979B2 (ja) | エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する腫瘍性障害の処置方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180911 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20181205 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20190514 |