WO2007126086A1 - 還元型補酵素ｑ10の精製方法 - Google Patents

還元型補酵素ｑ10の精製方法 Download PDF

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WO2007126086A1
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reduced coenzyme
coenzyme
cis
reduced
ubichromenol
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Takahiro Ueda
Tadao Ono
Shiro Kitamura
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Kaneka Corporation
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/02—Ethers
    • C07C43/20—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C43/23—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring containing hydroxy or O-metal groups
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Definitions

  • the present invention relates to reduced coenzyme Q of cis (hereinafter referred to as cis-reduced coenzyme Q), reduced coenzyme.
  • the present invention relates to coenzyme Q crystals, compositions, and methods for producing them. Reduced coenzyme Q is
  • Coenzyme Q is mitochondria, lysosome, Golgi apparatus, microsome, peroxisome or
  • Coenzyme Q has both oxidized and reduced forms. Among them, reduced coenzyme Q is synthesized
  • Patent Document 1 oxidized coenzyme Q contained in the reduced coenzyme Q is converted to sodium borohydride, dithione.
  • the reduced form of the reduced coenzyme Q is reduced by crystallization.
  • Patent Documents 2 and 3 Methods for removing coenzyme Q, reduced coenzyme Q, and reduced coenzyme Q are already known.
  • Patent Document 1 JP-A-10-109933
  • Patent Document 2 Pamphlet of WO03 / 6408
  • Patent Document 3 WO03Z6409 pamphlet
  • the present inventors have examined that reduced coenzyme Q according to a conventional method such as a crystallization method.
  • the present invention provides a reduced coenzyme Q that can easily remove the analog.
  • the present invention is as follows.
  • the reduced coenzyme Q crystal according to any one of [1] to [4], which is 3% by weight or less.
  • the reduced coenzyme Q crystal according to [1] which is 1% by weight or less.
  • a reduced coenzyme Q-containing composition A reduced coenzyme Q-containing composition.
  • a method for producing a product comprising a step of removing impurities by chromatography.
  • a cis-oxidized coenzyme Q is removed using a mixed solvent of two or more selected from hexane, 2-propanol, and ethyl acetate as a developing solvent [21]
  • both the oxidized type and reduced type when both are present, represent the entire mixture. If trans or cis is not specified, all-trans type coenzyme Q is indicated.
  • the reduced coenzyme Q used in the present invention is, for example, synthesized, fermented, or extracted from natural products.
  • the reduced coenzyme Q crystal of the present invention (sometimes referred to as the crystal of the present invention) is a cis-reduced coenzyme.
  • Reduced coenzyme Q selected from enzyme Q, reduced coenzyme Q, and ubichromenol
  • the content of cis-reduced coenzyme Q is usually 1% by weight or less
  • cis-reduced coenzyme Q is sufficiently antioxidant due to its three-dimensional structure.
  • the content of reduced coenzyme Q is usually 1% by weight or less, preferably
  • the unexpected effects of ingesting components that are not biosynthesized by humans can be eliminated.
  • the content of ubichromenol is usually 1% by weight or less, preferably 0.8% by weight or less, more preferably 0.5% by weight or less.
  • the total content of chromenol is usually 3% by weight or less, preferably 2% by weight or less, more preferably 1% by weight or less.
  • the content of the analog is in the preferred range, for example, the decrease in the absolute amount of reduced coenzyme Q, which is an active ingredient, is suppressed,
  • the reduced coenzyme Q analog content is low and high.
  • a quality reduced coenzyme Q-containing composition can be obtained.
  • the reduced coenzyme Q-containing composition of the present invention (also referred to as the composition of the present invention) is cis
  • composition of the present invention suppresses a decrease in the absolute amount of reduced coenzyme Q, which is an active ingredient, even when it is contained in a supplement and consumed daily in large amounts, and is generally applied to the human body. Does not exist impure
  • composition of the present invention can be used as it is. Orally administered to capsules (microcapsules, hard capsules, soft capsules), tablets, syrups, beverages, etc. It can be used preferably after being processed into a form, or it can be used after being processed into a parenteral dosage form such as cream, suppository, or toothpaste. Particularly preferred are capsules, especially soft capsules.
  • the capsule base is not particularly limited, and other bases such as gelatin derived from cow bone, cow skin, pig skin, fish skin, etc.
  • thickening stabilizers can be used as food additives
  • Products derived from seaweed such as carrageenan and alginic acid, and plant seed derived products such as locust bean gum and guagam
  • production agents such as celluloses
  • the reduced coenzyme Q-containing composition of the present invention is converted into the above oral dosage form and other forms.
  • Such materials are not particularly limited, and examples thereof include excipients, disintegrants, lubricants, binders, antioxidants, colorants, anti-aggregation agents, absorption enhancers, and active ingredient solubilizers. And stabilizers. Needless to say, it should not interfere with other active ingredients other than coenzyme Q.
  • the excipient is not particularly limited, and examples thereof include sucrose, lactose, glucose, corn starch, mannitol, crystalline cellulose, calcium phosphate, calcium sulfate and the like.
  • the disintegrant is not particularly limited, and examples thereof include starch, agar, calcium citrate, calcium carbonate, sodium bicarbonate, dextrin, crystalline cellulose, carboxymethyl cellulose, tragacanth and the like. .
  • the lubricant is not particularly limited, and examples thereof include talc, magnesium stearate, polyethylene glycol, silica, hydrogenated vegetable oil, and the like.
  • the binder is not particularly limited, and examples thereof include ethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, tragacanth, shellac, gelatin, arabic gum, polybulurpyrrolidone, polybulal alcohol, polyacrylolic acid, poly Methacrylic acid
  • the antioxidant is not particularly limited, but for example, ascorbic acid, tocopherol, vitamin ⁇ , ⁇ -carotene, sodium bisulfite, sodium thiosulfate, sodium pyrosulfite, citrate It is possible to give power S.
  • the colorant is not particularly limited. For example, it may be added to pharmaceuticals and foods. What is allowed can be mentioned.
  • anti-aggregation agent examples include, but are not limited to, stearic acid, talc, light anhydrous caustic acid, hydrous caustic dioxide, and the like.
  • the absorption promoter is not particularly limited, and examples thereof include surfactants such as higher alcohols, higher fatty acids, sucrose fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and the like. it can.
  • the solubilizing agent for the active ingredient is not particularly limited, and examples thereof include organic acids such as fumaric acid, succinic acid and malic acid.
  • the stabilizer is not particularly limited, and examples thereof include benzoic acid, sodium benzoate, and ethyl oxycarboxylate.
  • Examples of active ingredients other than coenzyme Q include amino acids, vitamins, minerals, and
  • Examples include phenol, organic acid, saccharide, peptide, protein and the like.
  • the amount of reduced coenzyme Q contained in the composition of the present invention is not particularly limited.
  • the weight of the reduced coenzyme Q contained in the composition is usually about 0.01% by weight or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is usually about 70% or less, preferably about 60% by weight or less, more preferably about 50% by weight or less in consideration of the viscosity of the composition.
  • the method for producing a crystal or composition of the present invention is a production method characterized by including a step of removing impurities by chromatography.
  • impurities that can be removed by chromatography include cis-reduced coenzyme Q, reduced coenzyme Q, and ubichromenol.
  • the production method of the present invention includes, as impurities, cis-reduced coenzyme Q,
  • 11 1 is a method for producing reduced coenzyme Q, comprising a step of purifying 11 1 by chromatography.
  • the chromatography is not particularly limited, and examples thereof include column chromatography and thin layer chromatography. Preferably, column chromatography It is.
  • the carrier used in the chromatography is not particularly limited, and examples thereof include commercially available silica gel.
  • the silica gel used for the carrier may be chemically modified. Examples of such silica gel include silica gel chemically modified with octadecyl group, silica gel chemically modified with octyl group, silica gel chemically modified with butyl group, silica gel chemically modified with trimethyl group, and chemically with phenyl group. The ability to lift the modified silica gel can be improved. Silica gel chemically modified with octadecinole group is preferable.
  • the removal of oxygen from the developing solvent and the deoxygenation atmosphere can be achieved by substitution with inert gas, reduced pressure, boiling, or a combination thereof. It is preferable to use at least substitution with an inert gas, that is, an inert gas atmosphere.
  • the inert gas include nitrogen gas, helium gas, argon gas, hydrogen gas, carbon dioxide gas, and the like, preferably nitrogen gas.
  • the developing solvent used in the chromatography is not particularly limited, and may be selected according to the analog of reduced coenzyme Q to be removed.
  • Examples of such developing solvents include
  • Examples thereof include hydrocarbons, fatty acid esters, nitriles, ethers, ketones, alcohols, fatty acids, and mixed solvents thereof.
  • Hydrocarbons are not particularly limited, and examples thereof include aliphatic hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, and halogenated hydrocarbons. In particular, aliphatic hydrocarbons and aromatic hydrocarbons are preferred, and aliphatic hydrocarbons are particularly preferred.
  • the aliphatic hydrocarbon is not particularly limited, regardless of whether it is cyclic or non-cyclic, saturated or unsaturated, but usually has 3 to 20 carbon atoms, preferably 5 to 5 carbon atoms: 12 things used It is.
  • Specific examples include, for example, propane, butane, isobutane, pentane, 2-methylbutane, cyclopentane, 2-pentene, hexane, 2-methylpentane, 2,2-dimethylbutane, 2,3-dimethylbutane.
  • the aromatic hydrocarbon is not particularly limited, but usually, an aromatic hydrocarbon having 6 to 20 carbon atoms, particularly 6 to 12 carbon atoms, especially 7 to 10 carbon atoms is preferably used.
  • Specific examples include, for example, benzene, toluene, xylene, o-xylene, m-xylene, p-xylene, ethyl benzene, tamen, mesitylene, tetralin, butynolebenzene, p-cymene, cyclohexenolebenzene, jetylbenzene, pentyl.
  • Examples include benzene, dipentylbenzene, dodecylbenzene, and styrene.
  • Toluene, xylene, o-xylene, m-xylene, p-xylene, tamen and tetralin most preferably cumene.
  • the halogenated hydrocarbon is not particularly limited, regardless of whether it is cyclic or non-cyclic, or saturated or unsaturated. In general, non-cyclic hydrocarbons are preferably used. Usually, chlorinated hydrocarbons and fluorinated hydrocarbons are preferred, and chlorinated hydrocarbons are particularly preferred. One having 1 to 6 carbon atoms, particularly carbon number:! To 4 and especially 1 to 2 carbon atoms is preferably used.
  • Specific examples include, for example, dichloromethane, chlorophenol, carbon tetrachloride, 1,1-dichloroethane, 1,2-dichlorodiethane, 1,1,1 trichlorodiethane, 1,1,2-tricrox Ethane, 1, 1, 1, 1, 2-tetrachloroethane, 1, 1, 2, 2-tetrachloroethane, pentachloroethane, hexachloroethane, 1,1-dichloroethylene, 1,2-dichloro Ethylene, trichloroethylene, tetrachloroethylene, 1,2 dichloroph. Ronokun, 1, 2, 3 _ trichloro port Purono ⁇ 0 down, click chlorobenzene, 1, 1, 1, and 2-tetrafluoropropoxy O Roe Tan like.
  • dichloromethane chlorophenol, carbon tetrachloride, 1,1-dichloroethane, 1,2-dichlorodiethane, 1,1,1_trichloroethane, 1,1,2_trichloroethane, 1, 1-dichloroethylene, 1,2-dichloroethylene, trichloroethylene, blackened benzene, 1,1,1,2-tetrafluoroethane, more preferably dichloromethane, chlorophenol, 1,2-dichloro Methyl ethylene, trichlorethylene, black benzene, 1,1,1,2,2-tetrafunoleoethane.
  • the fatty acid esters are not particularly limited, and examples thereof include propionic acid esters, acetic acid esters, formic acid esters and the like. In particular, acetates and ester formate are preferred, and acetates are particularly preferred.
  • the ester group includes an alkyl ester or aralkyl ester having 1 to 8 carbon atoms, preferably an alkyl ester having 1 to 6 carbon atoms, more preferably an alkyl ester having 1 to 4 carbon atoms. Tell is preferably used.
  • propionic acid ester examples include methyl propionate, ethyl propionate, butyl propionate, and isopentyl propionate.
  • Examples of the acetate ester include methyl acetate, ethyl acetate, propyl acetate, isopropyl acetate, butyl acetate, isobutyl acetate, sec butyl acetate, pentyl acetate, isopentyl acetate, sec hexyl acetate, cyclohexyl acetate, Examples thereof include benzyl acetate.
  • Methyl, ethyl acetate, propyl acetate, isopropyl acetate, butyl acetate, and isobutyl acetate are the most preferred, and ethyl acetate is most preferred.
  • Examples of the formic acid ester include methyl formate, ethyl formate, propyl formate, isopropyl formate, butyl formate, isobutyl formate, sec-butyl formate, pentyl formate, and the like. Preferred are methyl formate, ethyl formate, propyl formate, butyl formate, isobutyl formate, pentyl formate, and most preferred is ethyl formate.
  • the nitriles are not particularly limited, but are not particularly limited regardless of whether they are cyclic or non-cyclic, and saturated or unsaturated. In general, saturated ones are preferably used. Usually, those having 2 to 20 carbon atoms, particularly 2 to 12 carbon atoms, especially 2 to 8 carbon atoms are preferably used.
  • Specific examples include, for example, acetonitrile, propionitol, malononitrile, butyronitrile, isobutyronitrile, succinonitrile, noronitrile, glutaronitrile, hexanenitrile, heptyl cyanide, octyl cyanide, undecane Tolyl, dodecane nitritol, tridecane nitrile, pentadecane nitrile, stearonitrile, chloroacetonitrile, bromoacetonitrile, black propionitol, bromopropionitol, methoxyacetonitrile, methyl cyanoacetate, ethyl cyanoacetate, toritolyl, Benzonitrile, chlorobenzonitrile, bromobenzonitrile, cyanobenzoic acid, nitrobenzonitrile, anisonitrinole, phthalonitrile, bromotolunitryl
  • acetonitrile, propionitryl, succinonitrile, butyronitrile, isobutyronitrile, valeronitrile, methyl cyanoacetate, cyanoacetyl, benzonitrile, trinitrile, and black-propionic nitrile are more preferable.
  • Acetonitrile, propiononitrile, butyronitrile, and isobutyronitrile most preferably acetonitrile.
  • the ethers are not particularly limited, and are not particularly limited regardless of whether they are cyclic or non-cyclic, and saturated or unsaturated, but saturated ones are generally preferably used. Ordinary Generally, those having 3 to 20 carbon atoms, particularly 4 to 12 carbon atoms, particularly 4 to 8 carbon atoms are preferably used.
  • Specific examples include, for example, jetyl ether, methyl tert-butyl ether, dipropino enoate, diisopropino enoate, dibutino enoate, dihexino enoate, ethino levinino ethenore, butino levy Ninorethenore, Anisinore, Phenenolenole, Butinolephenylether, Methoxytoluene, Dioxane, Furan, 2-Methylfuran, Tetrahydrofuran, Tetrahydropyran, Ethyleneglycolinoresimethinoreethenole, Ethyleneglycolole Jetinoreetenore And ethylene glyconoresino chinenoate, ethylene glycomono methino enoate, ethylene glycol eno mino enoate ether, ethylene glycono lesino butylate ether and
  • ketones those having no particular limitation and those having 3 to 6 carbon atoms are preferably used. Specific examples include acetone, methyl ethyl ketone, methyl butyl ketone, methyl isobutyl ketone and the like, preferably acetone and methyl ethyl ketone, and most preferably acetone.
  • the alcohol is not particularly limited regardless of whether it is cyclic or non-cyclic, or saturated or unsaturated, but saturated alcohol is generally preferably used. Usually 1 to 20 carbon atoms, especially 1 to 12 carbon atoms, especially 1 to 6 carbon atoms, especially 1 to 5 carbon atoms, especially carbon numbers:! To 3, moreover, monovalent carbon number 2 to 3 Alcohol is also preferred. Triol is preferred, and trihydric alcohols with 3 carbon atoms are preferred.
  • Examples of monohydric alcohols include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutyl alcohol, tert-butyl anolenoure, 1_pentanomonoure, 2_pentanomonoole, 3_pentanol monole, 2-methinole _1 —butanol, isopentyl alcohol, tert pentyl alcohol, 3_methyl _2 —butanol, neopentyl alcohol, 1_hexanol, 2_methyl _1_pentanol, 4_methyl _2_ Pentanol, 2_ethyl _1—butanol, 1_heptanol, 1_heptanol, 3_heptanol, 1-octanol, 2-octanol, 2-ethyl 1_hexanol, 1-nonanol
  • Examples of the divalent alcohol include 1,2_ethanediol, 1,2_propanediol, 1,3 Examples thereof include propanediol, 1,2-butanediol, 1,3-butanediol, 1,4 butanediol, 2,3 butanediol, 1,5 pentanediol and the like. Preferred are 1,2-ethanediol, 1,2-propanediol and 1,3-propanediol, and most preferred is 1,2-ethanediol.
  • glycerin As the trivalent alcohol, glycerin and the like can be preferably used.
  • Examples of fatty acids include formic acid, acetic acid, propionic acid, and the like. Preferred are formic acid and acetic acid, and most preferred is acetic acid.
  • a mixed solvent of at least two kinds selected from coals and fatty acids it is particularly preferable to use a mixed solvent containing one each of hydrocarbons, alcohols and fatty acids. preferable. Most preferred is a mixed solvent of hexane, 2_propanol and acetic acid.
  • the solvent ratio of the mixed solvent is determined based on the silica gel used, the resolvability between the reduced coenzyme Q and the impurities to be removed, etc.
  • the proportion of 2-propanol in the total solvent is preferably 5% or less, preferably 3% or less. Is more preferably 1% or less, and the ratio of acetic acid in the total solvent is preferably 5% or less, more preferably 3% or less. It is particularly preferable that it is not more than%.
  • a mixed solvent of hydrocarbons and alcohols among which it is preferable to use a mixed solvent of at least two selected from hydrogens, fatty acid esters and ethers.
  • a mixed solvent of at least two selected from hydrogens, fatty acid esters and ethers it is preferable to use any one of hexane, methanol and ethanol, and most preferable is a mixed solvent composed of hexane and methanol, or a mixed solvent composed of methanol and ethanol.
  • the solvent ratio of the mixed solvent depends on the silica gel used, reduced coenzyme Q and impurities to be removed.
  • the ratio of methanol in the total solvent is 80 by volume. 85 / ⁇ or more is preferred 85. / More than 0 is more preferable 90% or more It is particularly preferred.
  • the proportion of methanol in the total solvent is preferably 40% or more as a volume ratio, more preferably 45% or more, and more preferably 50% or more. Is particularly preferred.
  • the method for producing a crystal or composition of the present invention contains at least one of cis-oxidized coenzyme Q, oxidized coenzyme Q, or ubichromenol as an impurity.
  • Type coenzyme Q (including the mixture of oxidized coenzyme Q and reduced coenzyme Q)
  • chromatographic carriers examples include the same carriers as described above.
  • the developing solvent the developing solvents described above can be used. eyes that remove cis-oxidized coenzyme Q
  • a combination of hydrogens and fatty acid esters is preferred.
  • a mixed solvent of two or more selected from hexane, 2-propanol, and ethyl acetate is more preferable, more preferably a mixed solvent composed of hexane and 2-propanol, or hexane.
  • a mixed solvent consisting of ethyl acetate is determined based on the silica gel used, the resolvability between the reduced coenzyme Q and the impurities to be removed, etc. If it is set appropriately, it is not particularly limited.
  • the ratio of 2-propanol in the total solvent is preferably 5% or less, more preferably 3% or less. It is particularly preferred that it is 1% or less.
  • the ratio of ethyl acetate in the total solvent is preferably 5% or less as a volume ratio. It is more preferably 3% or less, and particularly preferably 1% or less.
  • a mixed solvent of hydrocarbons or alcohols preferably a mixed solvent of at least two kinds selected from hydrogen, fatty acid esters and ethers.
  • a mixed solvent of hydrocarbons or alcohols preferably a mixed solvent of at least two kinds selected from hydrogen, fatty acid esters and ethers.
  • the solvent ratio of the mixed solvent can be set as appropriate based on the silica gel used, the separation between the reduced coenzyme Q and the impurities to be removed, etc.
  • the ratio of methanol in the total solvent is preferably 80% or more in volume ratio, more preferably 85% or more, and more preferably 90% or more. Further, in the case of the above-mentioned solvent consisting of methanol and ethanol, the ratio of methanol in the total solvent is preferably 40% or more, more preferably 45% or more, and more preferably 50% or more as a volume ratio. Is particularly preferred.
  • the mixture of type 10 coenzyme Q is reduced by, for example, the method described in WO03 / 6408.
  • Type coenzyme Q crystals Ease of handling and further quality improvement
  • the above-described non- It is preferred to carry out the method of the invention in a deoxygenated atmosphere such as an active gas atmosphere, and it is also preferred to prepare and / or store the composition of the invention.
  • the above processing and storage after processing are preferably performed in a deoxygenated atmosphere such as the above inert gas atmosphere.
  • Cis-reduced coenzyme Q 2.1% reduced coenzyme Q (5g) dissolved in 10g hexane
  • 10 10 contained 0.4% of ubichromenol.
  • 50 g of a 10% aqueous sodium hyposulfite solution was added, and a reduction reaction was performed in a nitrogen atmosphere. After 2 hours, the aqueous phase was removed from the reaction solution, and the hexane phase was washed with 50 g of degassed saturated brine. A series of operations from the reduction reaction to water washing of the hexane phase was performed under a nitrogen atmosphere. The hexane phase was concentrated and dried to obtain reduced coenzyme Q crystals. This reduced coenzyme Q has ubichromeno
  • Reduced coenzyme Q 1. Add reduced coenzyme Q (5 g) containing 2% to 83 g of ethanol.

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Abstract

　食品、栄養機能食品、特定保健用食品、栄養剤、栄養補助剤、動物薬、飲料、飼料、化粧品、医薬品、治療薬、予防薬等として有用な、還元型補酵素Ｑ10類縁体含量の低い還元型補酵素Ｑ10、並びに当該還元型補酵素Ｑ10の製造方法を提供することを目的とする。 　還元型補酵素Ｑ10を酸化から防護された条件下にクロマトグラフィーに供するか、酸化型補酵素Ｑ10をクロマトグラフィーで精製した後に、還元型補酵素Ｑ10に変換することを特徴とする還元型補酵素Ｑ10の製造方法を提供する。当該方法により、cis-還元型補酵素Ｑ10、還元型補酵素Ｑ11、およびユビクロメノールから選択される少なくとも１種の含有量が１重量％以下である、高品質な還元型補酵素Ｑ10を提供できる。

Description

明 細 書
還元型補酵素 Q の精製方法
10
技術分野
[0001] 本発明は、 cis体の還元型補酵素 Q (以下、 cis-還元型補酵素 Q )、還元型補酵
10 10
素 Q 、およびュビクロメノール等の還元型補酵素 Q 類縁体の含有量が低い還元型
11 10
補酵素 Q 結晶、組成物、並びにこれらの製造方法に関する。還元型補酵素 Q は、
10 10 酸化型補酵素 Q と比較して高い経口吸収性を示し、優れた、食品、栄養機能食品、
10
特定保健用食品、栄養補助剤、栄養剤、動物薬、飲料、飼料、ペットフード、化粧品 、医薬品、治療薬、予防薬等として有用な化合物である。
背景技術
[0002] 補酵素 Q はミトコンドリア、リソゾーム、ゴルジ体、ミクロソーム、ペルォキシソーム或
10
いは細胞膜などに局在し、ミトコンドリアでは電子伝達系の構成成分として ATP産生 賦活、生体内での抗酸化作用、膜安定ィヒに関与していることが知られている生体の 機能維持に不可欠な物質であり、食品、医薬品、化粧品等に使用されている。また、 補酵素 Q には酸化型と還元型が存在する。そのうち、還元型補酵素 Q は、合成、
10 10 発酵、天然物からの抽出等の方法により得られた補酵素 Q 中から公知の方法で精
10
製することにより得られることが知られている（特許文献 1)。この場合には、上記還元 型補酵素 Q 中に含まれる酸化型補酵素 Q を、水素化ホウ素ナトリウム、亜ジチオン
10 10
酸ナトリウム（次亜硫酸ナトリウム)等の一般的な還元剤を用レ、て還元した後、精製を 行っても良いこと、また、還元型補酵素 Q は、既存の高純度補酵素 Q に上記還元
10 10
剤を作用させる方法によっても得られることが、該特許公報中に記載されている。
[0003] 上述した合成、発酵、天然物からの抽出等により還元型補酵素 Q を得た場合には
10
、種々の還元型補酵素 Q の類縁体（例えば、 cis _還元型補酵素 Q 、ュビクロメノー
10 10
ノレ、還元型補酵素 Q 等）が含まれている。一般に不純物の除去には、不純物と目的
11
物の混合物を溶媒に溶解させた後、 目的物をその溶液から結晶化する方法（晶析法
)が有効である。例えば、晶析法により還元型補酵素 Q よりその類縁体である還元
10
型補酵素 Q、還元型補酵素 Q、還元型補酵素 Qを除去する方法は既に知られて いる (特許文献 2、 3)。
特許文献 1 :特開平 10— 109933号公報
特許文献 2： WO03/6408号パンフレット
特許文献 3： WO03Z6409号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明者らが検討したところ、晶析法などの従来の方法によると還元型補酵素 Q
10 類縁体のうち、 cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、ュビクロメノール等は容易
10 11
に除去できないことが判明した。
本発明は、上記に鑑み、上記類縁体を簡便に除去できる還元型補酵素 Q の製造
10 方法ならびに該類縁体の含有量が低い高品質の還元型補酵素 Q を提供することを
10
目的とする。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、特定のクロマトグラフィ 一条件において、通常除去しにくい還元型補酵素 Q の類縁体を、効率よく除去でき
10
、 cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールの含有量の低い
10 11
実質的に純粋な還元型補酵素 Q 結晶などが得られることを見出し、本発明を完成さ
10
せるに至った。
[0006] すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔1〕 cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールよりなる群から
10 11
選択される還元型補酵素 Q 類縁体のうち、少なくとも 1種の含有量力 ^1重量％以下
10
である実質的に純粋な還元型補酵素 Q 結晶。
10
〔2〕 cis-還元型補酵素 Q の含有量が 1重量％以下である〔1〕記載の還元型補酵素
10
Q 結晶。
10
〔3〕還元型補酵素 Q の含有量が 1重量％以下である〔1〕記載の還元型補酵素 Q
11 10 結晶。
〔4〕ュビクロメノールの含有量が 1重量％以下である〔1〕記載の還元型補酵素 Q 結
10 晶。 〔5〕cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールの総含有量が
10 11
3重量％以下である〔1〕〜〔4〕のいずれ力 1項に記載の還元型補酵素 Q 結晶。
10
〔6〕cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールの含有量が各
10 11
々1重量％以下である〔1〕記載の還元型補酵素 Q 結晶。
10
〔7〕cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールよりなる群から
10 11
選択される還元型補酵素 Q 類縁体のうち、少なくとも 1種の含有量力 ^1重量％以下
10
である還元型補酵素 Q 含有組成物。
10
〔8〕cis-還元型補酵素 Q の含有量が 1重量％以下である〔7〕記載の還元型補酵素
10
Q 含有組成物。
10
〔9〕還元型補酵素 Q の含有量が 1重量％以下である〔7〕記載の還元型補酵素 Q
11 10 含有組成物。
〔10〕ュビクロメノールの含有量が 1重量％以下である〔7〕記載の還元型補酵素 Q
10 含有組成物。
〔l l〕cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールの総含有量
10 11
が 3重量％以下である、〔7〕〜〔： 10〕のいずれ力 1項に記載の還元型補酵素 Q 含有
10 組成物。
〔12〕 3-還元型補酵素(3 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールの含有量が
10 11
各々 1重量％以下である〔7〕記載の還元型補酵素 Q 含有組成物。
10
〔13〕〔1〕記載の還元型補酵素 Q 結晶または〔7〕記載の還元型補酵素 Q 含有組成
10 10 物の製造方法であって、クロマトグラフィーにて不純物を除去する工程を含むことを 特徴とする製造方法。
〔14〕前記クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーである〔13〕記載の製造方法。 〔15〕クロマトグラフィーの担体がシリカゲルまたは化学修飾されたシリカゲルであるこ とを特徴とする〔13〕または〔14〕記載の製造方法。
〔16〕化学修飾されたシリカゲルがォクタデシル基で修飾されたシリカゲルであること を特徴とする〔15〕記載の製造方法。
〔17〕不純物として、 cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、またはュビクロメノー
10 11
ルの少なくとも 1種を含有する還元型補酵素 Q を、クロマトグラフィーで精製するェ 程を含む、 〔13〕〜〔16〕のレ、ずれか 1項に記載の製造方法。
〔18〕クロマトグラフィーが、還元型補酵素 Q が酸化から防護された環境下に行われ
10
る〔17〕記載の製造方法。
〔19〕展開溶媒としてへキサン、 2 _プロパノール、および酢酸の混合溶媒を用い、 ci s -還元型補酵素 Q を除去することを特徴とする〔17〕または〔18〕記載の製造方法。
10
〔20〕展開溶媒としてへキサン、メタノールもしくはエタノールまたはその混合溶媒の いずれか用い、還元型補酵素 Q および/またはュビクロメノールを除去することを
11
特徴とする〔17〕または〔18〕記載の製造方法。
〔21〕不純物として cis-酸化型補酵素 Q 、酸化型補酵素 Q 、またはュビクロメノール
10 11
の少なくとも 1種を含む酸化型補酵素 Q をクロマトグラフィーで精製し、精製された酸
10
化型補酵素 Q を還元型補酵素 Q へと変換することを特徴とする、〔13〕〜〔： 16〕の
10 10
いずれか 1項に記載の製造方法。
〔22〕展開溶媒としてへキサン、 2—プロパノール、および酢酸ェチルから選ばれる 2 種以上の混合溶媒を用い、 cis-酸化型補酵素 Q を除去することを特徴とする〔21〕
10
記載の製造方法。
〔23〕展開溶媒としてへキサン、メタノールもしくはエタノールまたはその混合溶媒の いずれか用い、酸化型補酵素 Q および/またはュビクロメノールを除去することを
11
特徴とする〔21〕記載の製造方法。
発明の効果
本発明によれば、通常除去しにくい還元型補酵素 Q の類縁体を簡便に除去し、
10
高品質の還元型補酵素 Q を作業性および経済性良く得ることができる。
10
特に還元型補酵素 Q を食品や医薬品等に含有する場合は、 cis-還元型補酵素 Q
10
、還元型補酵素 Q 、および、ュビクロメノール等の還元型補酵素 Q 類縁体の含量
10 11 10
を低くすることにより、有効成分である還元型補酵素 Q の絶対量の低下を抑制し、
10
一般的にヒトの生体には存在しない不純物の摂取による予期し得ない影響を排除す ること力 Sできる。さらに、従来、還元型補酵素 Q を食品等として長期間大量に摂取す
10
ることは知られていなかつたが、そのような場合において、特に上述したような不純物 の悪影響を排除することは非常に有効となる。 発明を実施するための最良の形態
[0008] 以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において、補酵素 Q とのみ記載
10 した場合は、酸化型、還元型を問わず、両者が混在する場合には混合物全体を表 すものである。また、 trans、 cisの記載がない場合は、 all—trans型の補酵素 Q を表す
10 ものである。
[0009] 本発明に使用する還元型補酵素 Q は、例えば、合成、発酵、天然物からの抽出
10
等の従来公知の方法により得ることができる。好ましくは、合成、発酵、天然物からの 抽出等から得られる還元型補酵素 Q 中に含まれる酸化型補酵素 Q 、或いは、酸化
10 10
型補酵素 Q を還元することにより得られたものであり、より好ましくは、ァスコルビン酸
10
類およびそのエステルまたは塩、ハイドロサルファイトナトリウム（次亜硫酸ナトリウム） 等の還元剤により酸化型補酵素 Q を還元して得られたものである。
10
[0010] 本発明の還元型補酵素 Q 結晶（本発明の結晶ということもある）は、 cis-還元型補
10
酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールから選択される還元型補酵素 Q
10 11
類縁体のうち、少なくとも 1種の含有量が 1重量％以下である実質的に純粋な還元
10
型補酵素 Q 結晶である。
10
[0011] 本発明の結晶においては、 cis -還元型補酵素 Q の含有量は、通常 1重量％以下、
10
好ましくは 0. 8重量％以下、より好ましくは 0. 5重量％以下である。 cis-還元型補酵 素 Q を除去することにより、有効成分である還元型補酵素 Q の絶対量の低下を抑
10 10
制し、一般的にヒトの生体には存在しない不純物の摂取による予期し得ない影響を 排除すること力 Sできる。特に cis-還元型補酵素 Q はその立体構造から充分に抗酸化
10
活性を発揮しにくい可能性があり、また、プロオキシダントとして働く可能性もあること から、 cis-還元型補酵素 Q を除去することにより、酸化ストレスの発生という危険性を
10
お除することちでさる。
[0012] 本発明の結晶においては、還元型補酵素 Q の含有量は、通常 1重量％以下、好
11
ましくは 0. 8重量％以下、より好ましくは 0. 5重量％以下である。還元型補酵素 Q を
11 除去することにより、有効成分である還元型補酵素 Q の絶対量の低下を抑制し、一
10
般的にヒトでは生合成されない成分の摂取による予期し得ない影響を排除することが できる。 [0013] 本発明の結晶においては、ュビクロメノールの含有量力 通常 1重量％以下、好ま しくは 0. 8重量％以下、より好ましくは 0. 5重量％以下である。ュビクロメノールを除 去することにより、有効成分である還元型補酵素 Q の絶対量の低下を抑制し、一般
10
的にヒトの生体には存在しない不純物の摂取による予期し得ない影響を排除すること ができる。
[0014] 本発明の結晶においては、 cis_還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビ
10 11
クロメノールの総含有量は、通常 3重量％以下、好ましくは 2重量％以下、より好ましく は 1重量％以下である。上記類縁体の含有量が上記好適範囲にある場合おいて、例 えば、有効成分である還元型補酵素 Q の絶対量の低下を抑制し、一般的にヒトの生
10
体には存在しない不純物の摂取による予期し得ない影響を排除することができる。し たがって、上記類縁体の含有量が上記好適範囲にある場合においては、例えば、食 品やサプリメント等として、毎日大量に消費する場合においても、長期間、安全に使 用すること力 Sできる。
[0015] また、後述する製造方法により得られる高品質の還元型補酵素 Q 、もしくはその結
10
晶を有効成分として使用することにより、還元型補酵素 Q 類縁体含量の少ない、高
10
品質な還元型補酵素 Q 含有組成物を得ることができる。
10
すなわち本発明の還元型補酵素 Q 含有組成物（本発明の組成物ともいう）は、 cis
10
-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールから選択される還元
10 11
型補酵素 Q 類縁体のうち、少なくとも 1種の含有量が 1重量％以下である還元型補
10
酵素 Q (結晶）を含む。
10
[0016] cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールの好適範囲は、
10 11
上記本発明の結晶において述べた範囲と同じである。同様に本発明の組成物は、例 えばサプリメントに含有して毎日大量に消費する場合においても有効成分である還 元型補酵素 Q の絶対量の低下を抑制し、一般的にヒトの生体には存在しない不純
10
物の摂取による予期し得ない影響を排除することができるので安全で長期間服用で きる。
[0017] 本発明の上記組成物は、そのまま使用することもできる力 それをカプセル剤（マイ クロカプセル、ハードカプセル、ソフトカプセル）、錠剤、シロップ、飲料等の経口投与 形態に加工して好ましく使用しうるし、クリーム、坐薬、練り歯磨き等の非経口投与形 態に加工しても使用しうる。特に好ましくは、カプセル剤であり、とりわけ、ソフトカプセ ノレである。カプセル基材としては特に制限されず、牛骨、牛皮、豚皮、魚皮等を由来 とするゼラチンをはじめとして、他の基材 (例えば、増粘安定剤（食品添加物として使 用しうるカラギーナン、アルギン酸等の海藻由来品やローカストビーンガム、グァーガ ム等の植物種子由来品等)や製造用剤 (セルロース類など)など)も使用しうる。
[0018] 本発明の還元型補酵素 Q 含有組成物を、上記の経口投与形態、その他の形態に
10
加工するに際しては、その目的に応じて他の素材を適宜添カ卩してもよい。このようなも のとしては、特に制限されず、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止 剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、有効成分の溶解補助剤、安定化剤等が挙 げられる。言うまでもなぐ補酵素 Q 以外の他の活性成分を共存させることを妨げな
10
レ、。
[0019] 上記賦形剤としては特に制限されなレ、が、例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、コーンス ターチ、マンニトール、結晶セルロース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム等を挙げ ること力 Sできる。
[0020] 上記崩壊剤としては特に制限されなレ、が、例えば、でんぷん、寒天、クェン酸カル シゥム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン、結晶セルロース、カルボ キシメチルセルロース、トラガント等を挙げることができる。
[0021] 上記滑沢剤としては特に制限されなレ、が、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシゥ ム、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等を挙げることができる。
[0022] 上記結合剤としては特に制限されなレ、が、例えば、ェチルセルロース、メチルセル ロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、トラガント、シェラック、ゼラチン、ァラビ ァゴム、ポリビュルピロリドン、ポリビュルアルコール、ポリアクリノレ酸、ポリメタクリル酸
、ソルビトール等を挙げることができる。
[0023] 上記酸化防止剤としては特に制限されなレ、が、例えば、ァスコルビン酸、トコフエ口 ール、ビタミン Α、 β—カロチン、亜硫酸水素ナトリウム、チォ硫酸ナトリウム、ピロ亜硫 酸ナトリウム、クェン酸等を挙げること力 Sできる。
[0024] 上記着色剤としては特に制限されないが、例えば、医薬品、食品に添加することが 許可されているもの等を挙げることができる。
[0025] 上記凝集防止剤としては特に制限されなレ、が、例えば、ステアリン酸、タルク、軽質 無水ケィ酸、含水二酸化ケィ酸等を挙げることができる。
[0026] 上記吸収促進剤としては特に制限されないが、例えば、高級アルコール類、高級 脂肪酸類、ショ糖脂肪酸エステルゃソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソ ルビタン脂肪酸エステル等の界面活性剤等を挙げることができる。
[0027] 上記有効成分の溶解補助剤としては特に制限されなレ、が、例えば、フマル酸、コハ ク酸、リンゴ酸等の有機酸等を挙げることができる。
[0028] 上記安定化剤としては特に制限されないが、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウ ム、パラォキシ安息香酸ェチル等が挙げられる。
[0029] 上記補酵素 Q 以外の活性成分としては、例えば、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、ポリ
10
フエノール、有機酸、糖類、ペプチド、タンパク質等を挙げることができる。
[0030] 本発明の組成物中に含まれる還元型補酵素 Q の量は特に制限されないが、全組
10
成物中に含まれる還元型補酵素 Q の重量として、通常約 0.01重量％以上、好まし
10
くは約 0.1重量％以上、より好ましくは約 1重量％以上、特に好ましくは約 2重量％以 上、さらに好ましくは約 3重量％以上である。上限は特に制限されないが、組成物の 粘性等も考慮して通常約 70%以下、好ましくは約 60重量％以下、より好ましくは約 5 0重量％以下である。
[0031] 本発明の結晶または組成物の製造方法は、クロマトグラフィーにて不純物を除去す る工程を含むことを特徴とする製造方法である。クロマトグラフィーで除去できる不純 物としては、 cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、ュビクロメノール等を挙げるこ
10 11
とができる。言うまでもなぐ上記以外の不純物を該クロマトグラフィーにて除去するこ とも妨げない。
[0032] 別の態様として、本発明の製造方法は、不純物として、 cis-還元型補酵素 Q 、還
10 元型補酵素 Q 、またはュビクロメノールの少なくとも 1種を含有する還元型補酵素 Q
11 1 を、クロマトグラフィーで精製する工程を含む、還元型補酵素 Q の製造方法である。
0 10
[0033] クロマトグラフィーとしては、特に制限されないが、例えば、カラムクロマトグラフィー 、薄層クロマトグラフィー等を挙げることができる。好ましくは、カラムクロマトグラフィー である。
[0034] クロマトグラフィーに使用する担体としては特に制限されないが、市販のシリカゲル 等を挙げることができる。担体に使用されるシリカゲルは化学修飾されていてもよい。 このようなシリカゲルとしては、例えば、ォクタデシル基で化学修飾されたシリカゲル、 ォクチル基で化学修飾されたシリカゲル、ブチル基で化学修飾されたシリカゲル、トリ メチル基で化学修飾されたシリカゲル、フヱニル基で化学修飾されたシリカゲル等を あげること力 Sできる。好ましくは、ォクタデシノレ基で化学修飾されたシリカゲルである。
[0035] 尚、還元型補酵素 Q は空気中でシリカゲルと接触させると、容易に酸化される。し
10
たがって、クロマトグラフィーは、還元型補酵素 Q が酸化から防護された環境下で行
10
うことが望ましい。
[0036] 一例として、展開溶媒中に含まれる酸素を除去し、かつ、脱酸素雰囲気下にて実 施することが挙げられる。展開溶媒からの酸素の除去や脱酸素雰囲気は、不活性ガ スによる置換、減圧、沸騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。少なくとも、 不活性ガスによる置換、即ち、不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。上記不 活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水素ガス、炭酸ガ ス等を挙げることができ、好ましくは窒素ガスである。
[0037] また、展開溶媒に pKaが 2. 5以下の強酸、クェン酸類、またはァスコルビン酸類等 を共存させることにより、還元型補酵素 Q の酸化を防護することもできる。上記の脱
10
酸素雰囲気下と上記酸類の共存とを組み合わせるのが、より好ましい。
[0038] クロマトグラフィーに使用する展開溶媒としては特に制限されず、除去すべき還元 型補酵素 Q の類縁体に合わせて選択すればよい。このような展開溶媒としては、例
10
えば、炭化水素類、脂肪酸エステル類、二トリル類、エーテル類、ケトン類、アルコー ル類、脂肪酸類、および、これらの混合溶媒等を挙げることができる。
[0039] 炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭 化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。特に、脂肪族炭化水素、芳香 族炭化水素が好ましぐとりわけ、脂肪族炭化水素が好ましい。
[0040] 脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特 に制限されないが、通常、炭素数 3〜20、好ましくは、炭素数 5〜： 12のものが用いら れる。
[0041] 具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、 2 メチルブタン 、シクロペンタン、 2—ペンテン、へキサン、 2—メチルペンタン、 2, 2—ジメチルブタ ン、 2， 3—ジメチルブタン、メチルシクロペンタン、シクロへキサン、 1—へキセン、シク 口へキセン、ヘプタン、 2 メチルへキサン、 3 メチルへキサン、 2、 3 _ジメチルペン タン、 2， 4 _ジメチルペンタン、メチルシクロへキサン、 1 _ヘプテン、オクタン、 2, 2, 3 _トリメチルペンタン、イソオクタン、ェチルシクロへキサン、 1—オタテン、ノナン、 2 , 2, 5 トリメチルへキサン、 1—ノネン、デカン、 1—デセン、 p メンタン、ゥンデカン 、ドデカン等を挙げることができる。
[0042] 中でもペンタン、 2 メチルブタン、シクロペンタン、へキサン、 2 メチルペンタン、 2, 2—ジメチルブタン、 2, 3—ジメチルブタン、メチルシクロペンタン、シクロへキサン 、ヘプタン、 2 メチルへキサン、 3 メチルへキサン、 2， 3 _ジメチルペンタン、 2， 4 ジメチルペンタン、メチルシクロへキサン、オクタン、 2, 2, 3 トリメチルペンタン、 イソオクタン、ェチルシクロへキサンが好ましく用いられる。
[0043] 芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、通常、炭素数 6〜20、特に炭素 数 6〜： 12、とりわけ炭素数 7〜： 10のものが好適に用いられる。具体例としては、例え ば、ベンゼン、トルエン、キシレン、 o キシレン、 m—キシレン、 p キシレン、ェチル ベンゼン、タメン、メシチレン、テトラリン、ブチノレベンゼン、 p シメン、シクロへキシノレ ベンゼン、ジェチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルべ ンゼン、スチレン等を挙げることができる。好ましくは、トルエン、キシレン、 o キシレ ン、 m—キシレン、 p キシレン、ェチルベンゼン、タメン、メシチレン、テトラリン、ブチ ノレベンゼン、 p—シメン、シクロへキシルベンゼン、ジェチルベンゼン、ペンチルベン ゼンであり、より好ましくは、トルエン、キシレン、 o—キシレン、 m—キシレン、 p—キシ レン、タメン、テトラリンであり、最も好ましくは、クメンである。
[0044] ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず 、特に制限されないが、一般に、非環状のものが好ましく用レ、られる。普通、塩素化 炭化水素、フッ素化炭化水素が好ましぐ特に塩素化炭化水素が好ましい。炭素数 1 〜6、特に炭素数:!〜 4、とりわけ炭素数 1〜2のものが好適に用いられる。 [0045] 具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホノレム、四塩化炭素、 1 , 1—ジクロロ ェタン、 1 , 2—ジクロ口ェタン、 1 , 1 , 1 トリクロ口ェタン、 1 , 1 , 2—トリクロ口ェタン、 1 , 1 , 1 , 2—テトラクロロェタン、 1 , 1 , 2, 2—テトラクロロェタン、ペンタクロロェタン、 へキサクロロェタン、 1， 1—ジクロ口エチレン、 1， 2—ジクロ口エチレン、トリクロロェチ レン、テトラクロロエチレン、 1， 2 ジクロロフ。ロノくン、 1， 2, 3 _トリクロ口プロノヽ0ン、ク ロロベンゼン、 1， 1， 1 , 2—テトラフルォロェタン等を挙げることができる。
[0046] 好ましくは、ジクロロメタン、クロロホノレム、四塩化炭素、 1， 1—ジクロロェタン、 1， 2 —ジクロ口ェタン、 1， 1， 1 _トリクロロェタン、 1， 1， 2 _トリクロロェタン、 1 , 1—ジクロ 口エチレン、 1， 2—ジクロ口エチレン、トリクロロエチレン、クロ口ベンゼン、 1， 1， 1 , 2 —テトラフルォロェタンであり、より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホノレム、 1， 2—ジ クロ口エチレン、トリクロロエチレン、クロ口ベンゼン、 1， 1 , 1 , 2—テトラフノレォロェタン である。
[0047] 脂肪酸エステル類としては、特に制限されないが、例えば、プロピオン酸エステル、 酢酸エステル、ギ酸エステル等を挙げることができる。特に、酢酸エステル、ギ酸エス テルが好ましぐとりわけ、酢酸エステルが好ましい。特に制限されないが、一般に、 エステル基としては、炭素数 1〜8のアルキルエステルまたはァラルキルエステル、好 ましくは炭素数 1〜6のアルキルエステル、より好ましくは炭素数 1〜4のアルキルエス テルが好ましく用いられる。
[0048] プロピオン酸エステルとしては、例えば、プロピオン酸メチル、プロピオン酸ェチル、 プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペンチルを挙げることができる。
[0049] 酢酸エステルとしては、例えば、酢酸メチル、酢酸ェチル、酢酸プロピル、酢酸イソ プロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸 sec ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソ ペンチル、酢酸 sec へキシル、酢酸シクロへキシル、酢酸ベンジル等を挙げること ができる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸ェチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢 酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸 sec—ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、 酢酸 see へキシル、酢酸シクロへキシルであり、より好ましくは、酢酸メチル、酢酸ェ チル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチルであり、最も好 ましくは、酢酸ェチルである。 [0050] ギ酸エステルとしては、例えば、ギ酸メチル、ギ酸ェチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプ 口ピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸 sec—ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げるこ とができる。好ましくは、ギ酸メチル、ギ酸ェチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸ィ ソブチル、ギ酸ペンチルであり、最も好ましくは、ギ酸ェチルである。
[0051] 二トリル類としては、特に制限されないが、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽 和を問わず、特に制限されないが、一般に飽和のものが好ましく用いられる。普通、 炭素数 2〜20、特に炭素数 2〜： 12、とりわけ炭素数 2〜8のものが好適に用いられる
[0052] 具体例としては、例えば、ァセトニトリル、プロピオ二トリル、マロノ二トリル、ブチロニ トリノレ、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、ノ レロニトリル、グルタロニトリル、へキサ ンニトリル、へプチルシアニド、ォクチルシアニド、ゥンデカン二トリル、ドデカン二トリ ノレ、トリデカン二トリル、ペンタデカン二トリル、ステアロニトリル、クロロアセトニトリル、 ブロモアセトニトリル、クロ口プロピオ二トリル、ブロモプロピオ二トリル、メトキシァセトニ トリル、シァノ酢酸メチル、シァノ酢酸ェチル、トル二トリル、ベンゾニトリル、クロ口ベン ゾニトリル、ブロモベンゾニトリル、シァノ安息香酸、ニトロべンゾニトリル、ァニソ二トリ ノレ、フタロニトリル、ブロモトル二トリル、メチルシアノベンゾエート、メトキシベンゾニトリ ノレ、ァセチルベンゾニトリル、ナフトニトリル、ビフエニルカルボ二トリル、フエニルプロ ピオ二トリル、フエ二ルブチロニトリル、メチルフエ二ルァセトニトリル、ジフエニルァセト 二トリル、ナフチルァセトニトリル、ニトロフエ二ルァセトニトリル、クロ口べンジルシア二 ド、シクロプロパンカルボ二トリル、シクロへキサンカルボ二トリル、シクロヘプタンカル ボニトリル、フエニルシクロへキサンカルボ二トリル、トリルシクロへキサンカルボ二トリ ル等を挙げることができる。
[0053] 好ましくは、ァセトニトリル、プロピオ二トリル、スクシノニトリル、ブチロニトリル、イソブ チロニトリル、バレロ二トリル、シァノ酢酸メチル、シァノ酢酸ェチル、ベンゾニトリル、ト ルニトリル、クロ口プロピオ二トリルであり、より好ましくは、ァセトニトリル、プロピオ二トリ ノレ、ブチロニトリル、イソブチロニトリルであり、最も好ましくは、ァセトニトリルである。
[0054] エーテル類としては、特に制限されないが、環状、非環状を問わず、又、飽和、不 飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。普 通、炭素数 3〜20、特に炭素数 4〜： 12、とりわけ炭素数 4〜8のものが好適に用いら れる。
[0055] 具体例としては、例えば、ジェチルエーテル、メチル tert—ブチルエーテル、ジプロ ピノレエーテノレ、ジイソプロピノレエーテノレ、ジブチノレエーテノレ、ジへキシノレエーテノレ、 ェチノレビニノレエーテノレ、ブチノレビニノレエーテノレ、ァニソ一ノレ、フエネト一ノレ、ブチノレフ ェニルエーテル、メトキシトルエン、ジォキサン、フラン、 2—メチルフラン、テトラヒドロ フラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコーノレジメチノレエーテノレ、エチレングリコーノレ ジェチノレエーテノレ、エチレングリコーノレジブチノレエーテノレ、エチレングリコーノレモノメ チノレエーテノレ、エチレングリコーノレモノェチノレエーテノレ、エチレングリコーノレジブチノレ エーテル等を挙げることができる。
[0056] 好ましくは、ジェチルエーテル、メチル tert—ブチルエーテル、ジプロピルエーテル 、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジへキシルエーテル、ァニソール、フ エネトール、ブチルフエニルエーテル、メトキシトルエン、ジォキサン、 2—メチルフラン 、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、ェチレ ングリコールジェチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリ コールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノェチルエーテルであり、より好まし くは、ジェチルエーテル、メチル tert—ブチルエーテル、ァニソール、ジォキサン、テ トラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノェチ ノレエーテルであり、さらに好ましくは、ジェチルエーテノレ、メチル tert—ブチルエーテ ノレ、ァニソール等であり、最も好ましくは、メチル tert—ブチルエーテルである。
[0057] ケトン類としては、特に制限されなレ、が、普通炭素数 3〜6のものが好適に用いられ る。具体例としては、例えば、アセトン、メチルェチルケトン、メチルブチルケトン、メチ ルイソブチルケトン等を挙げることができ、好ましくは、アセトン、メチルェチルケトンで あり、最も好ましくは、アセトンである。
[0058] アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に 制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。普通、炭素数 1〜20、 特に炭素数 1〜： 12、とりわけ炭素数 1〜6、なかでも炭素数 1〜5、なかんずく炭素数 ：!〜 3、更には、炭素数 2〜3の 1価アルコールが好ましぐ又、炭素数 2〜5の 2価ァ ルコールが好ましぐ又、炭素数 3の 3価アルコールが好ましい。
[0059] 1価のアルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、 1—プロパノール、 2— プロパノール、 1ーブタノール、 2—ブタノール、イソブチルアルコール、 tert ブチル ァノレコーノレ、 1_ペンタノ一ノレ、 2_ペンタノ一ノレ、 3_ペンタノ一ノレ、 2—メチノレ _1 —ブタノール、イソペンチルアルコール、 tert ペンチルアルコール、 3_メチル _2 —ブタノール、ネオペンチルアルコール、 1_へキサノール、 2_メチル _1_ペンタ ノール、 4_メチル _2_ペンタノール、 2_ェチル _1—ブタノール、 1_ヘプタノ一 ノレ、 2_ヘプタノール、 3_ヘプタノール、 1—ォクタノール、 2—ォクタノール、 2—ェ チル一 1_へキサノール、 1—ノナノール、 1—デカノール、 1_ゥンデ力ノール、 1_ ドデカノーノレ、 ァリノレアノレコーノレ、プロパノレギノレアノレコーノレ、ベンジノレアノレコーノレ、シ クロへキサノーノレ、 1_メチノレシクロへキサノーノレ、 2 メチノレシクロへキサノーノレ、 3 —メチルシクロへキサノール、 4—メチルシクロへキサノール等を挙げることができる。
[0060] 好ましくは、メタノーノレ、エタノール、 1 プロパノール、 2 プロパノール、 1ーブタノ ール、 2—ブタノール、イソブチルアルコール、 tert ブチルアルコール、 1 ペンタ ノーノレ、 2 ペンタノール、 3 ペンタノール、 2—メチルー 1ーブタノール、イソペンチ ノレアルコール、 tert ペンチルアルコール、 3—メチル 2 ブタノール、ネオペンチ ノレアノレコーノレ、 1一へキサノーノレ、 2—メチノレー 1 ペンタノ一ノレ、 4ーメチノレー 2—ぺ ンタノール、 2—ェチルー 1ーブタノール、シクロへキサノールであり、より好ましくは、 メタノーノレ、エタノール、 1 プロパノール、 2—プロパノール、 1ーブタノール、 2—ブ タノール、イソブチルアルコール、 tert ブチルアルコール、 1 ペンタノール、 2— ペンタノール、 3 ペンタノール、 2—メチルー 1ーブタノール、イソペンチルアルコー ノレ、 tert ペンチルアルコール、 3 _メチル _ 2—ブタノール、ネオペンチルアルコー ノレであり、さらに好ましくは、メタノーノレ、エタノール、 1_プロパノール、 2_プロパノ ール、 1—ブタノール、 2—ブタノール、イソブチルアルコール、 2_メチル _1—ブタ ノール、イソペンチルアルコールであり、とりわけ、メタノーノレ、エタノール、 1_プロパ ノーノレ、 2 _プロパノールが好ましぐ更に、エタノール、 1_プロパノール、 2_プロパ ノールが好ましぐ最も好ましくは、エタノールである。
[0061] 2価のアルコールとしては、 1， 2_エタンジオール、 1， 2_プロパンジオール、 1， 3 プロパンジオール、 1 , 2—ブタンジオール、 1 , 3—ブタンジオール、 1 , 4 ブタン ジオール、 2, 3 ブタンジオール、 1 , 5 ペンタンジオール等を挙げることができる。 好ましくは、 1 , 2—エタンジオール、 1 , 2—プロパンジオール、 1 , 3—プロパンジォ ールであり、最も好ましくは、 1 , 2 _エタンジオールである。
[0062] 3価のアルコールとしてはグリセリン等を好適に用いることができる。
[0063] 脂肪酸類としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等を挙げることができる。好ま しくは、ギ酸、酢酸であり、最も好ましくは酢酸である。
[0064] 上記溶媒の中でも、 cis_還元型補酵素 Q を除去する目的には、炭化水素類、アル
10
コール類、脂肪酸類から選ばれる少なくとも 2種以上の混合溶媒を使用するのが好ま しぐ中でも、炭化水素類、アルコール類、脂肪酸類をそれぞれ 1種ずつ使用した混 合溶媒を使用するのが特に好ましい。最も好ましくは、へキサン、 2 _プロパノールお よび酢酸の混合溶媒である。混合溶媒として使用したときには、混合溶媒の溶媒比 は、使用するシリカゲル、還元型補酵素 Q と除去する不純物との分離性等から判断
10
して適宜設定すればよぐ特に制限されなレ、。例えば、上記へキサン、 2—プロパノー ルおよび酢酸の混合溶媒を使用する場合、全溶媒中の 2—プロパノールの割合は容 積比として 5%以下であるのが好ましぐ 3%以下であるのがより好ましぐ 1 %以下で あるのが特に好ましく、また、全溶媒中の酢酸の割合は容積比として 5%以下である のが好ましぐ 3%以下であるのがより好ましぐ 1 %以下であるのが特に好ましい。
[0065] また、ュビクロメノールおよび/または還元型補酵素 Q を除去する目的には、炭化
11
水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類から選ばれる少なくとも 2種以上の混合溶媒 を使用するのが好ましぐ中でも、炭化水素類、アルコール類の混合溶媒を使用する のが特に好ましい。なかでもへキサン、メタノーノレ、エタノールのいずれかを用いるの が好ましぐ最も好ましくは、へキサンおよびメタノールからなる混合溶媒、もしくは、メ タノールおよびエタノールからなる混合溶媒である。混合溶媒として使用したときには 、混合溶媒の溶媒比は、使用するシリカゲル、還元型補酵素 Q と除去する不純物と
10
の分離性等から判断して適宜設定すればよぐ特に制限されない。例えば、上記、へ キサンおよびメタノールからなる溶媒の場合、全溶媒中のメタノールの割合は容積比 として 80。/ο以上であるのが好ましぐ 85。/0以上であるのがより好ましぐ 90%以上で あるのが特に好ましい。メタノールおよびエタノールからなる溶媒の場合、特に制限さ れないが、全溶媒中のメタノールの割合は容積比として 40%以上であるのが好ましく 、 45%以上であるのがより好ましぐ 50%以上であるのが特に好ましい。
[0066] 言うまでもなぐ一度のクロマトグラフィーにて、 2種以上の還元型補酵素 Q の類縁
10 体を除去する態様も本発明に含まれる。
[0067] また、別の態様の本発明の結晶または組成物の製造方法は、不純物として cis-酸 化型補酵素 Q 、酸化型補酵素 Q 、またはュビクロメノールの少なくとも 1種を含む
10 11
酸化型補酵素 Q をクロマトグラフィーで精製し、精製された酸化型補酵素 Q を還元
10 10 型補酵素 Q へと変換することを特徴とする製造方法である。すなわち Cis-酸化型補
10
酵素 Q、酸化型補酵素 Q 、およびュビクロメノールの少なくとも 1種を含有する酸化
11
型補酵素 Q (酸化型補酵素 Q と還元型補酵素 Q の混合物の場合も含む）をクロマ
10 10 10
トグラフィ一に供してこれら不純物を除去し、その後に還元して高品質な還元型補酵 素 Q に導くことによる還元型補酵素 Q 結晶または還元型補酵素 Q 含有組成物の
10 10 10 製造方法である。
[0068] 酸化型補酵素 Q 、もしくは、酸化型補酵素 Q と還元型補酵素 Q をクロマトグラフ
10 10 10
ィ一で精製した後、還元型補酵素 Q へ変換する態様においては、クロマトグラフィー
10
工程を厳密に酸化防護条件に保持する必要がなぐより簡便かつ安価に、高品質の 還元型補酵素 Q を製造し得る。
10
[0069] この場合に使用できるクロマトグラフィーの担体としては、前述と同様の担体を挙げ ること力 Sできる。
[0070] 展開溶媒は、前記の展開溶媒が使用できる。 cis-酸化型補酵素 Q を除去する目
10
的には、炭化水素類、アルコール類、脂肪酸エステル類、脂肪酸類から選ばれる少 なくとも 2種以上の混合溶媒を使用するのが好ましぐ中でも、炭化水素類とアルコー ル類、または、炭化水素類と脂肪酸エステル類の組み合わせが好ましい。具体的に は、へキサン、 2 _プロパノール、および酢酸ェチルから選ばれる 2種以上の混合溶 媒が好ましぐより好ましくは、へキサンおよび 2 _プロパノールからなる混合溶媒、も しくは、へキサンおよび酢酸ェチルからなる混合溶媒である。混合溶媒の溶媒比は、 使用するシリカゲル、還元型補酵素 Q と除去する不純物との分離性等から判断して 適宜設定すればよぐ特に制限されなレ、。例えば、上記へキサンおよび 2—プロパノ ールからなる溶媒の場合、全溶媒中の 2—プロパノールの割合は容積比として 5%以 下であるのが好ましぐ 3%以下であるのがより好ましぐ 1%以下であるのが特に好ま しぐまた、上記へキサンおよび酢酸ェチルからなる溶媒の場合、全溶媒中の酢酸ェ チルの割合は容積比として 5%以下であるのが好ましぐ 3%以下であるのがより好ま しぐ 1 %以下であるのが特に好ましい。
[0071] また、ュビクロメノールおよび/または還元型補酵素 Q を除去する目的には、炭化
11
水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類から選ばれる少なくとも 2種以上の混合溶媒 を使用するのが好ましぐ炭化水素類、アルコール類の混合溶媒を使用するのがより 好ましレ、。具体的にはへキサン、メタノーノレ、エタノールのいずれか用いるのが好まし ぐ最も好ましくは、へキサンおよびメタノールからなる混合溶媒、もしくは、メタノーノレ およびエタノール力 なる混合溶媒である。混合溶媒の溶媒比は、使用するシリカゲ ノレ、還元型補酵素 Q と除去する不純物との分離性等から判断して適宜設定すれば
10
よぐ特に制限されなレ、。例えば、上記へキサンおよびメタノールからなる溶媒の場合
、全溶媒中のメタノールの割合は容積比として 80%以上であるのが好ましぐ 85%以 上であるのがより好ましぐ 90%以上であるのが特に好ましい。また、上記メタノール およびエタノールからなる溶媒の場合、全溶媒中のメタノールの割合は容積比として 40%以上であるのが好ましぐ 45%以上であるのがより好ましぐ 50%以上であるの が特に好ましい。
[0072] クロマトグラフィーで得られた酸化型補酵素 Q 、もしくは、酸化型補酵素 Q と還元
10 10 型補酵素 Q の混合物は、例えば、 WO03/6408記載の方法により還元することに
10
より、高品質の還元型補酵素 Q へと導くことができる。
10
[0073] このようにして得られた還元型補酵素 Q は、そのまま、濃縮'乾固等により、高品質
10
の還元型補酵素 Q としても良いし、 WO03/6408や WO03/6409等に記載の方
10
法により結晶化して、還元型補酵素 Q 類縁体含量の少ない、実質的に純粋な還元
10
型補酵素 Q の結晶とすることができる。取り扱いの容易さや更なる高品質化の観点
10
からは、還元型補酵素 Q の結晶とするのがより好ましい。
10
[0074] 本発明の効果を最大限に発揮するためには、例えば、前述したような窒素等の不 活性ガス雰囲気等の脱酸素雰囲気下において、本発明の方法を実施するのが好ま しぐ又、本発明の組成物を調製および/または保存するのが好ましい。上記の加工 や加工後の保存も上記の不活性ガス雰囲気等の脱酸素雰囲気下に行うのが好まし レ、。
[0075] 本発明により、通常除去しにくい還元型補酵素 Q の類縁体を簡便に除去すること
10
ができ、高品質の還元型補酵素 Q を作業性、経済性良く得ることができる。
10
実施例
[0076] 以下に実施例を揚げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例の みに限定されるものではない。また、実施例中の還元型補酵素 Q の純度、還元型
10
補酵素 Q の類縁体の含量等は、本発明における純度の限界値を規定するものでは
10
なぐその上限値を規定するものでもない。
[0077] (実施例 1)
ュビクロメノーノレ 1. 2%を含む還元型補酵素 Q (5g)を 10gのへキサンに溶解させ
10
た。ォクタデシノレ基で修飾したシリカゲルを充填したカラムに吸着させ、 n キサン /メタノール（3/17)溶液で展開し、還元型補酵素 Q を含む画分を得た。尚、使用
10
した溶媒はすべて、減圧 ·窒素復圧の繰り返しにより溶媒中の酸素を除去したものを 使用し、操作はすべて窒素雰囲気下にて実施した。この溶液を濃縮 *乾固させ、還 元型補酵素 Q の結晶を得た。この還元型補酵素 Q にはュビクロメノーノレ力 3%
10 10
含まれていた。
[0078] (実施例 2)
cis-還元型補酵素 Q 2. 1 %を含む還元型補酵素 Q (5g)を 10gのへキサンに溶
10 10
解させた。シリカゲルを充填したカラムに吸着させ、 n—へキサン Zイソプロパノール /酢酸（95/0. 5/0. 5)溶液で展開し、還元型補酵素 Q を含む画分を得た。尚、
10
使用した溶媒はすべて、減圧 ·窒素復圧の繰り返しにより溶媒中の酸素を除去したも のを使用し、操作はすべて窒素雰囲気下にて実施した。この溶液を濃縮 ·乾固させ、 還元型補酵素 Q の結晶を得た。この還元型補酵素 Q には cis-還元型補酵素 Q が
10 10 10
0. 6%含まれていた。
[0079] (実施例 3) 還元型補酵素 Q 1. 2%を含む還元型補酵素 Q (5g)を 10gのへキサンに溶解さ
11 10
せた。ォクタデシノレ基で修飾したシリカゲルを充填したカラムに吸着させ、エタノーノレ
/メタノール (4/3)溶液で展開し、還元型補酵素 Q を含む画分を得た。尚、使用し
10
た溶媒はすべて、減圧 ·窒素復圧の繰り返しにより溶媒中の酸素を除去したものを使 用し、操作はすべて窒素雰囲気下にて実施した。この溶液を濃縮 ·乾固させ、還元 型補酵素 Q の結晶を得た。この還元型補酵素 Q には還元型補酵素 Q が 0. 3%
10 10 11 含まれていた。
[0080] (実施例 4)
ュビクロメノール 1. 2%、還元型補酵素 Q 1. 2%を含む還元型補酵素 Q (5g)を
11 10
10gのへキサンに溶解させた。ォクタデシル基で修飾したシリカゲルを充填したカラ ムに吸着させ、へキサン Zメタノール（1Z9)溶液で展開し、還元型補酵素 Q を含
10 む画分を得た。尚、使用した溶媒はすべて、減圧 ·窒素復圧の繰り返しにより溶媒中 の酸素を除去したものを使用し、操作はすべて窒素雰囲気下にて実施した。この溶 液を濃縮'乾固させ、還元型補酵素 Q の結晶を得た。この還元型補酵素 Q にはュ
10 10 ビクロメノール力 So. 3%、還元型補酵素 Q が 0. 3%含まれていた。
11
[0081] (実施例 5)
ュビクロメノーノレ 1. 2%を含む還元型補酵素 Q (5g)を 10gのへキサンに溶解させ
10
た。ォクチル基で修飾したシリカゲルを充填したカラムに吸着させ、 n—へキサン/メ タノール（1/9)溶液で展開し、還元型補酵素 Q を含む画分を得た。尚、使用した
10
溶媒はすべて、減圧 ·窒素復圧の繰り返しにより溶媒中の酸素を除去したものを使用 し、操作はすべて窒素雰囲気下にて実施した。この溶液を濃縮'乾固させ、還元型 補酵素 Q の結晶を得た。この還元型補酵素 Q にはュビクロメノールが 0. 8%含ま
10 10
れていた。
[0082] (実施例 6)
ュビクロメノーノレ 1. 4%を含む還元型補酵素 Q (5g)を 10gのへキサンに溶解させ
10
た。ォクタデシノレ基で修飾したシリカゲルを充填したカラムに吸着させ、 n—へキサン /メタノール（1/19)溶液で展開し、還元型補酵素 Q を含む画分を得た。尚、使用
10
した溶媒はすべて、減圧 ·窒素復圧の繰り返しにより溶媒中の酸素を除去したものを 使用し、操作はすべて窒素雰囲気下にて実施した。この溶液を濃縮 ·乾固させ、還 元型補酵素 Q の結晶を得た。この還元型補酵素 Q にはュビクロメノーノレ力 SO. 2%
10 10
含まれていた。
[0083] (実施例 7)
ュビクロメノーノレ 1. 2%を含む酸化型補酵素 Q (5g)を 10gのへキサンに溶解させ
10
た。ォクタデシノレ基で修飾したシリカゲルを充填したカラムに吸着させ、 n—へキサン /メタノール（1/9)溶液で展開し、酸化型補酵素 Q を含む画分を得た後、この画
10
分を濃縮し、酸化型補酵素 Q を 4. 8g含む溶液 50gを得た。この酸化型補酵素 Q
10 10 にはュビクロメノールが 0. 4%含まれていた。この溶液に 10%次亜硫酸ナトリウム水 溶液 50gをカ卩えて、窒素雰囲気下、還元反応を行った。 2時間後、反応液から水相を 除去し、脱気した飽和食塩水 50gでへキサン相を水洗した。還元反応からへキサン 相の水洗までの一連の操作は、窒素雰囲気下にて実施した。このへキサン相を濃縮 •乾固させ、還元型補酵素 Q の結晶を得た。この還元型補酵素 Q にはュビクロメノ
10 10
ールが 0. 4%含まれていた。
[0084] (比較例 1)
晶析による還元型補酵素 Q の除去
11
還元型補酵素 Q 1. 2%を含む還元型補酵素 Q (5g)を 83gのエタノールに加え
11 10
、 50°Cにて溶解させた後、同温を維持しながら、水 5gを加えた。このエタノール溶液 を攪拌しながら、 10°C/時間の冷却速度で 2°Cまで冷却し、白色のスラリーを得た。 得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を冷エタノール、冷水、冷エタノールの順に洗 浄 (洗浄に用いた冷溶媒の温度は 2°C)して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（20〜40°C 、：!〜 30mmHg)することにより、白色の乾燥結晶 4. 85gを得た。なお、以上すベて の操作は窒素雰囲気下で実施した。取得した還元型補酵素 Q には還元型補酵素
10
Q が 1. 2%含まれていた。
11
[0085] (比較例 2)
晶析によるュビクロメノールの除去
ュビクロメノール 1. 4%を含む還元型補酵素 Q (5g)を 83gのエタノールに加え、
10
50°Cにて溶解させた後、同温を維持しながら、水 5gを加えた。このエタノール溶液を 攪拌しながら、 10°C/時間の冷却速度で 2°Cまで冷却し、白色のスラリーを得た。得 られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を冷エタノール、冷水、冷エタノールの順に洗浄 (洗浄に用いた冷溶媒の温度は 2°C)して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（20〜40°C、 1 〜30mmHg)することにより、白色の乾燥結晶 4. 85gを得た。なお、以上すベての 操作は窒素雰囲気下で実施した。取得した還元型補酵素 Q にはュビクロメノーノレ
10
が 1. 1%含まれていた。
[0086] 以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示 された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な 修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正および変更も、すべて後 記の請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
[0087] 本出願は日本で出願された特願 2006— 126900を基礎としており、その内容は本 明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
[1] cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールよりなる群から選
10 11
択される還元型補酵素 Q 類縁体のうち、少なくとも 1種の含有量力 ^1重量％以下で
10
ある実質的に純粋な還元型補酵素 Q 結晶。
10
[2] cis-還元型補酵素 Q の含有量カ^重量％以下である請求項 1記載の還元型補酵素
10
Q 結晶。
10
[3] 還元型補酵素 Q の含有量が 1重量％以下である請求項 1記載の還元型補酵素 Q
[4] ュビクロメノールの含有量が 1重量％以下である請求項 1記載の還元型補酵素 Q 結
10 曰
曰曰
[5] cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールの総含有量が 3重
10 11
量％以下である請求項 1〜4のいずれ力 4項に記載の還元型補酵素 Q 結晶。
10
[6] cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールの含有量が各々 1
10 11
重量％以下である請求項 1記載の還元型補酵素 Q 結晶。
10
[7] cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールよりなる群から選
10 11
択される還元型補酵素 Q 類縁体のうち、少なくとも 1種の含有量力 ^1重量％以下で
10
ある還元型補酵素 Q 含有組成物。
10
[8] cis-還元型補酵素 Q の含有量カ^重量％以下である請求項 7記載の還元型補酵素
10
Q 含有組成物。
10
[9] 還元型補酵素 Q の含有量が 1重量％以下である請求項 7記載の還元型補酵素 Q
11 10 含有組成物。
[10] ュビクロメノールの含有量力 重量％以下である請求項 7記載の還元型補酵素 Q 含
10 有組成物。
[11] cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールの総含有量が 3重
10 11
量％以下である、請求項 7〜： 10のいずれ力 1項に記載の還元型補酵素 Q 含有組成
10 物。
[12] cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、およびュビクロメノールの含有量が各々 1
10 11
重量％以下である請求項 7記載の還元型補酵素 Q 含有組成物。
[13] 請求項 1記載の還元型補酵素 Q 結晶または請求項 7記載の還元型補酵素 Q 含有
10 10 組成物の製造方法であって、クロマトグラフィーにて不純物を除去する工程を含むこ とを特徴とする製造方法。
[14] 前記クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーである請求項 13記載の製造方法。
[15] クロマトグラフィーの担体がシリカゲルまたは化学修飾されたシリカゲルであることを 特徴とする請求項 13または 14記載の製造方法。
[16] 化学修飾されたシリカゲルがォクタデシノレ基で修飾されたシリカゲルであることを特 徴とする請求項 15記載の製造方法。
[17] 不純物として、 cis-還元型補酵素 Q 、還元型補酵素 Q 、またはュビクロメノールの
10 11
少なくとも 1種を含有する還元型補酵素 Q を、クロマトグラフィーで精製する工程を
10
含む、請求項 13〜： 16のいずれ力 4項に記載の製造方法。
[18] クロマトグラフィーが、還元型補酵素 Q が酸化から防護された環境下に行われる請
10
求項 17記載の製造方法。
[19] 展開溶媒としてへキサン、 2—プロパノール、および酢酸の混合溶媒を用い、 cis-還 元型補酵素 Q を除去することを特徴とする請求項 17または 18記載の製造方法。
10
[20] 展開溶媒としてへキサン、メタノールもしくはエタノールまたはその混合溶媒のいずれ か用い、還元型補酵素 Q および/またはュビクロメノールを除去することを特徴とす
11
る請求項 17または 18記載の製造方法。
[21] 不純物として cis-酸化型補酵素 Q 、酸化型補酵素 Q 、またはュビクロメノールの少
10 11
なくとも 1種を含む酸化型補酵素 Q をクロマトグラフィーで精製し、精製された酸化
10
型補酵素 Q を還元型補酵素 Q へと変換することを特徴とする、請求項 13〜： 16の
10 10
いずれか 1項に記載の製造方法。
[22] 展開溶媒としてへキサン、 2 _プロパノール、および酢酸ェチルから選ばれる 2種以 上の混合溶媒を用い、 cis-酸化型補酵素 Q を除去することを特徴とする請求項 21
10
に記載の製造方法。
[23] 展開溶媒としてへキサン、メタノールもしくはエタノールまたはその混合溶媒のいずれ か用い、酸化型補酵素 Q および/またはュビクロメノールを除去することを特徴とす
11
る請求項 21記載の製造方法。
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