CN102481269A - 利用表观代谢转变剂(辅酶q10)治疗疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了利用辅酶Q10治疗人的肿瘤障碍的方法和制剂。

Description

利用表观代谢转变剂(辅酶Q10)治疗疾病的方法
相关申请：
本申请要求2009年5月11日提交的标题为“Methods forTreatment of Oncological Disorders Using an EpimetabolicShifter(Coenzyme Q10)”的第61/177,241号美国临时申请(律师代理申请案编号(Attorney Docket No.)：117732-00601)、2009年5月11日提交的标题为“Methods for Treatment of Oncological Disorders UsingEpimetabolic Shifters，Multidimensional Intracellular Molecules orEnvironmental Influencers”第61/177,243号美国临时申请(律师代理申请案编号：117732-00701)、2009年5月11日提交的标题为“Methodsfor the Diagnosis of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters，Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”的第61/177,244号美国临时申请(律师代理申请案编号：117732-00801)、2009年5月11日提交的标题为“Methods for Treatmentof Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters，MultidimensionalIntracellular Molecules or Environmental Influencers”的第61/177,245号美国临时申请(律师代理申请案编号：117732-00901)和2009年5月11日提交的标题为“Methods for the Diagnosis of Metabolic DisordersUsing Epimetabolic Shifters，Multidimensional Intracellular Molecules orEnvironmental Influencers”的第61/177,246号美国临时申请(律师代理申请案编号：117732-01001)的优先权。上述申请的每一个的全部内容通过引用并入本文。
发明背景：
癌症目前是发达国家死亡的首要原因之一并且对现代社会具有严重威胁。癌症可在任何年龄在任何器官的任何组织中发生。世界上，每年有1000多万人被诊断患有癌症并且据估计该数目到2020年前将增长至每年1500万例新病例。癌症据认为每年导致600万人死亡或世界上12％的死亡。
癌症的病因学还不十分清楚。癌症与多年来进行中的研究的许多因素(包括遗传易感性，染色体断裂障碍，病毒，环境因素和免疫学障碍)相关或相关。癌症包括一大类医学病患。癌细胞可在身体的几乎任何器官和/或组织中产生。当身体的一部分开始不受控制地生长或分化时癌症发生。
虽然最近的研究已极大地增加我们对许多肿瘤发生的分子机制的理解并且已提供了许多用于治疗癌症的新途径，但用于大多数恶性肿瘤的标准治疗仍然是全切除术(gross resection)、化学疗法和放射疗法。虽然日益成功，但此类疗法的每一种可引起许多不希望的副作用。例如，手术可导致疼痛、对健康组织造成外伤性损伤和结瘢。放射疗法具有杀伤癌细胞的有利方面但其同时也损伤非癌组织。化学疗法包括给患者施用多种抗癌药物。此类标准治疗通常伴随不利的副作用，例如，恶心、免疫抑制、胃溃疡和继发性肿瘤发生。
多年来，许多个人和公司已进行广泛研究，寻找用于一大批癌症的治疗的改进。公司正在开发生物活性剂，包括化学实体例如小分子和生物制品(biologics)例如抗体，期望为癌症提供更有益的疗法。测试的生物活性剂中的一些在某些个体或癌症类型中有效并且提供有益的治疗效应，其他则在它们的测试方案中无效或具有最低的治疗效应。迄今为止研究的其他生物活性剂具有未被完全理解的作用机制。
辅酶Q10，在本文中也称为CoQ10、Q10、泛醌或泛癸利酮，是大众营养补充剂并且以胶囊形式见于在营养品店(nutritional store)、保健食品店、药房等中，如通过泛醇(CoQ10的还原形式)的抗氧化性质帮助保护免疫系统的维生素样补充剂。CoQ10是本领域公认的并且进一步描述于第WO 2005/069916号国际公布，将该国际公布的完整公开内容通过引用并入本文。
CoQ10经发现遍布人体的大部分组织和其他哺乳动物的组织。CoQ10在人中的组织分布和氧化还原状态已由Bhagavan HN等人，Coenzyme Q10：Absorption，tissue uptake，metabolism andpharmacokinetic，Free Radical Research 40(5)，445-453(2006)(在下文中，Bhagavan等人)在综述论文中进行了综述。作者报导“作为一般法则，具有高能需要或代谢活性的组织例如心脏、肾、肝和肌肉包含相对高的浓度的CoQ10”。作者还报导“[a]组织中的大部分CoQ10以还原形式如氢醌或泛醇(uniquino1)存在，除了脑和肺例外”，这“似乎是这两个组织中增加的氧化性应激的反映”。具体地，Bhagavan等人报导在心脏、肾、肝、肌肉、肠和血液(血浆)中，分别约61％、75％、95％、65％、95％和96％的CoQ10以还原形式存在。类似地，Ruiz-Jiminez等人，Determination of the ubiquinol-10 andubiquinone-10(coenzyme Q10)in human serum by liquidchromatography tandem mass spectrometry to evaluate the oxidativestress，J.Chroma A 1175(2)，242-248(2007)(在下文中，Ruiz-Jiminez等人)报导，当估量人血浆的Q10和Q10的还原形式(Q10H2)时，大部分(90％)所述分子以还原形式被发现。
CoQ10是极亲脂的并且对于大部分CoQ10，是不溶于水的。由于其在水中的不溶性、脂质中有限的溶解性和相对大的分子量，因此口服施用的CoQ10的吸收效率很低。Bhagavan等人报导“在一项利用大鼠的研究中，报导了只有约2-3％的口服施用的CoQ10被吸收”。Bhagavan等人还报导“大鼠研究的数据表明在肠的吸收过程中和之后CoQ10被还原成泛醇”。
多年来在文献中CoQ10与癌症相关。在下文中描述了某些代表性的但非全部包括在内的文献中报导的相关性的实例。Karl Folkers等人，Survival of Cancer Patients on Therapy with Coenzyme Q10，Biochemical and Biophysical Research Communication 192，241-245(1993)(在下文中，“Folkers等人”)描述了8个“利用CoQ10治疗”的癌症患者的病历和它们的“为期5-15年”的存活故事。给8个具有不同类型的癌症(包括胰腺癌、腺癌、喉癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌)的患者口服施用CoQ10。Folkers等人提出“这些结果现证明全身性方案是合理的”。Lockwood等人，Progress on Therapy ofBreast Cancer with Vitamin Q10 and the Regression of Metastases，Biochemical and Biophysical Research Communication 212，172-177(1995)(在下文中，“Lockwood等人”)是报告“利用维生素Q10进行的乳腺癌的治疗的进展”的另一篇综述论文。Lockwood等人参考Folkers等人，其“覆盖35年的关于动物和人的国际研究(所述研究揭示非肿瘤和肿瘤组织中维生素Q10的可变水平)并且包括对于宿主防御系统是固有的关于维生素Q10的数据(如基于增加的经治疗的具有肿瘤的小鼠的存活者)”。Lockwood等人还提出“人癌症的维生素Q10疗法的潜能在1961开始显示出来”依赖于测定199个瑞典和美国癌症患者的CoQ10血液水平的研究，该研究揭示了乳腺癌的病例中缺陷的可变水平。2002年7月9日发布的美国专利No.6,417,233(在下文中，Sears等人)描述了用于预防和/或治疗线粒体病的包含脂溶性苯醌类例如辅酶Q10的组合物。Sears等人提出“已报导CoQ10治疗在癌症患者中提供了一些有益方面(参见第2栏，第30-31行)”。
至本申请提交的日期为止，国家癌症研究所报导：从未在癌症治疗中进行包括大量的CoQ10患者的良好设计的临床试验，因为“进行研究的方式和报导的信息的量不能明确益处是由辅酶Q10引起的还是由其他某些试剂引起的”。参见国家癌症研究所(NCI)，可在www.cancer.Gov/cancertopics/pdq/cam/coenzymeQ10/patient/allpages(2008年9月29日)上获得。具体地，NCI引用了3个关于CoQ10用作乳腺癌患者的标准治疗后的辅助治疗的用途的小研究，其中某些患者似乎得到该治疗的帮助，并且重申“然而，研究设计和报告的弱点使得不能确定益处是由辅酶Q10引起的还是由其他物质引起的”。NCI明确指出“这些研究具有下列弱点：研究未进行标准化或未设对照；患者除了辅酶Q10外还使用其他补充剂；患者在辅酶Q10治疗之前或期间接受标准治疗；以及在研究中未报导全部患者的详情”。NCI还报告了“辅酶Q10帮助某些癌症患者(包括患有胰腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌和前列腺癌的患者)活得更长的轶事性报道”，但也说明“然而，这些报告中描述的患者还接受了除辅酶Q10外的治疗，包括化学疗法、放射疗法和手术”。
2006年2月16日公布的第2006/0035981号美国专利申请公布(在下文中，“Mazzio 2006”)描述了使用组合物治疗或预防人和动物癌症的方法和制剂，所述组合物利用癌症在其进行葡萄糖的非氧化磷酸化以获得能量的无氧要求(这与宿主相反)方面的脆弱性。Mazzio 2006的制剂包含一种或多种协同促进氧化代谢和/或阻止乳酸脱氢酶或无氧葡萄糖代谢的化合物并且更特别地被描述为包含“2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌(在本文中也称为″DMBQ″)(醌型碱)和整个泛醌系列的选项(包括相应的氢醌类、泛色烯醇、泛色满醇或合成/天然衍生物和类似物)。参见Mazzio 2006，第3页，第0010段。Mazzio 2006确证“短链泛醌(CoQ＜3)作为抗癌剂并且甚至进一步确证“2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌(DMBQ)作为抗癌剂效力为CoQ10的1000倍以上”。参见Mazzio 2006，第3页，第0011段。Mazzio 2006还提出该研究“未发现CoQ10是如所预期的致死性的”，并且有可能“使用CoQ10抗癌的先前研究有些矛盾”。关于支持该声明的引证的详细列表，参见Mazzio 2006，第3-4页。
2007年10月25日公布的第2007/0248693号美国专利申请公布(在下文中称为“Mazzio 2007”)也描述了营养食品组合物及它们用于治疗或预防癌症的用途。而且，该公布的专利申请聚焦在短链泛醌上并且明确提出CoQ10不是本发明的至关重要的成分。根据Mazzio2007“虽然CoQ10可增加癌细胞中线粒体复合物II活性的Vmax(Mazzio和Soliman，Biochem Pharmacol.67：1167-84，2004)，但这不能控制通过复合物IV进行的线粒体呼吸或O2利用的速率。并且，CoQ10并非如所预期的为致死性的。同样地，CoQ10抗癌的结果是矛盾的”。参见Mazzio 2007，第5页，第0019段。
发明概要：
申请人以前已描述了CoQ10的局部制剂和用于降低动物受试者中肿瘤生长的速率的方法(Hsia等人，2005年8月4日公布的WO2005/069916)。在Hsia等人描述的实验中，已显示CoQ10增加皮肤癌细胞但非正常细胞的培养物的细胞凋亡速率。此外，已显示利用CoQ10的局部制剂治疗荷瘤动物显著降低动物中肿瘤生长的速率。本发明至少部分基于对CoQ10在人和/或细胞中的作用的更全面的理解。具体地，本发明的方法和制剂至少部分基于获得的关于CoQ10对于肿瘤障碍的治疗活性的知识，所述知识是通过设计和执行人临床试验和/或通过给人受试者施用CoQ10并且观察在这些试验和/或治疗方案过程中发生的令人惊讶和意外的结果获悉的。本发明的方法和制剂还至少部分基于从细胞的体外CoQ10处理的广泛研究获得的对CoQ10的治疗机制的洞察。
具体地，在至少一个实施方案中，本发明的方法和制剂至少部分基于令人惊讶的发现：辅酶Q10(在本中也称为CoQ10或Q10)至细胞的应用导致癌细胞的细胞凋亡反应的选择性诱导，对正常细胞的生长不具有效应或在某些情况下具有正效应。此外，在至少一个另外的实施方案中，意外地发现与来源于不太具有侵袭性或非侵袭性癌症的细胞系相比较，来源于侵袭性癌的细胞系对CoQ10更敏感(例如，对于细胞毒性和/或细胞凋亡的诱导需要更低浓度的CoQ10和/或更少的处理时间)。观察到线粒体Q10水平的时间和剂量反应，其中在48小时后，细胞线粒体中Q10的水平增加至6倍。在至少一个另外的实施方案中，本发明还基于令人惊讶和意外的发现：Q10以提供的氧化形式(促氧化剂)维持并且不以任何显著的量转化成Q10H2的还原(抗氧化剂)形式。在另一个实施方案中，本发明仍然进一步基于发现：大量基因的表达在利用Q10的氧化形式处理的细胞中受到调节。发现此类被调节的蛋白质簇集在几种细胞途径中，包括细胞凋亡、癌症生物学和细胞生长、糖酵解和代谢、分子运输和细胞信号转导。
综合起来，本文中描述的结果已对Q10的治疗机制提供了见解。例如，然而不希望受理论束缚，申请人的发现表明Q10，特别地Q10的氧化形式诱导至细胞微环境的代谢转移。已知差异代谢在癌细胞中发生(Warburg效应)，其中大多数癌细胞主要通过糖酵解，然后细胞溶胶中通过乳酸发酵而非在线粒体中通过氧化磷酸化(丙酮酸盐的氧化)产生能量。申请人的发现表明Q10能够将癌细胞的代谢状态从糖酵解的无氧使用转换成线粒体氧化磷酸化。
因此，本发明在一个方面提供了通过给人局部施用辅酶Q10治疗或预防人的肿瘤障碍以便治疗或预防发生的方法。在某些实施方案中，CoQ10诱导肿瘤障碍的癌细胞的细胞凋亡或细胞死亡机制。在其他实施方案中，CoQ10抑制肿瘤障碍的癌细胞的血管生成。在某些其他实施方案中，CoQ10在肿瘤障碍的癌细胞的微环境中诱导免疫相关成分的调节，然而在其他实施方案中，CoQ10诱导肿瘤障碍的癌细胞的细胞周期控制的改变。在一个实施方案中，局部施用是通过经选择在人中对待治疗的特定障碍提供治疗效力的剂量。在某些实施方案中，通过施用辅酶Q10的氧化形式进行障碍的治疗或预防。
在一个实施方案中，治疗一群人，并且群体的至少25％具有如通过本领域内公认的终点(包括癌症的组织病理学、临床观察、照相分析、CT扫描、MRI成像、血液、血清或血浆标志)测量的症状的减少。在一个实施方案中，治疗一群人，并且该群体的至少50％具有如通过本领域内公认的终点(包括癌症的组织病理学、临床观察、照相分析、CT扫描、MRI成像、血液、血清或血浆标志以及治疗前后被治疗的位置的物理测量)测量的症状的减少。在其他实施方案中，治疗一群人，并且该群体的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多具有如通过本领域内公认的终点(包括癌症的组织病理学、临床观察、照相分析、CT扫描、MRI成像、血液、血清或血浆标志)测量的症状的减少。应当理解，具有这些值之任一作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如，10％至25％、15％至35％、25％至50％、35％至60％、40％至70％、50％至75％、60％至85％或70％至90％。
在多个实施方案中，被治疗的人群体可以为约3个患者、约5个患者、约10个患者、约15个患者、约20个患者、约25个患者、约30个患者、约35个患者、约40个患者、约50个患者、约60个患者、约70个患者、约80个患者、约90个患者、约100个患者、约125个患者、约150个患者、约160个患者、约175个患者、约200个患者、约250个患者、约300个患者、约400个患者或更多。在一个实施方案中，被治疗的人群体为，应当理解具有这些值之任一个作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如，约10至约25个、约15至约35个、约25至约50个或约20至约160个患者。
应理解，本领域技术人员能够在检查一个或多个本领域公认的终点后基于本领域内常识来识别症状减轻的患者。例如，本领域技术人员能够检查和比较治疗前后皮肤癌损伤例如原位皮肤鳞状细胞癌的照片(例如，在本文实施例中提供的照片)并且能够基于例如损伤的尺寸、损伤的颜色或通常表示癌症的损伤的任何其他视觉特征的减小来识别病症的减轻。在另一个实例中，本领域技术人员能够检查和比较例如治疗前后皮肤癌的组织病理学，并且能够基于表示例如癌症的致癌性或严重性的减轻的组织病理学的变化识别症状的减轻。在另一个实例中，本领域技术人员能够检查和比较治疗前后肿瘤的CT扫描或MRI图像或转移病灶的位置，并且能够基于例如原发性肿瘤尺寸的减小或转移病灶尺寸或数目的减小识别症状的减轻。
在一个实施方案中，利用安慰剂乳膏(0％CoQ10)、安慰剂+按重量计1.5％的CoQ10(于局部膏基中)、1.5％CoQ10乳膏+按重量计3％的CoQ10乳膏或单独的按重量计3％的CoQ10治疗一群具有浅表基底细胞癌的人患者(例如，约160个患者)，并且总患者群体的至少25％具有如通过本领域内公认的终点(包括癌症的组织病理学、经训练的专家的临床观察、照相分析、CT扫描、MRI成像、血液、血清或血浆标志、治疗前后被治疗的位置的物理测量、治疗前后SCCIS的病理学检查和数字高分辨率临床照相)测量的症状的减少。
在一个实施方案中，利用含有按重量计3％的辅酶Q10的乳膏治疗一群患有鳞状细胞原位癌(SCCIS)的人患者(例如，约25个患者)，进行相对短的疗程(6周对16-20周的标准治疗)，并且群体的至少50％具有如通过本领域内公认的终点(包括癌症的组织病理学、经训练的专家的临床观察、照相分析、CT扫描、MRI成像、血液、血清或血浆标志、治疗前后被治疗的位置的物理测量、治疗前后SCCIS的病理学检查和数字高分辨率临床照相)测量的症状的减少。
在一个实施方案中，治疗一群人，并且群体的至少25％具有对于被治疗的障碍具有治疗性的全身性辅酶Q10水平。在其他实施方案中，治疗一群人，并且群体的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多具有对于被治疗的障碍具有治疗性的全身性辅酶Q10水平。应当理解，具有这些值的任一个值作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如，10％至25％、15％至35％、25％至50％、35％至60％、40％至70％、50％至75％、60％至85％或70％至90％。
在某些实施方案中，待治疗的肿瘤障碍不是通常通过局部施用而是预期以治疗有效水平全身性递送活性剂来治疗或预防的障碍。
在一个实施方案中，待治疗的人的组织中的辅酶Q10的浓度与代表健康或正常状态的人组织的对照标准的辅酶Q10的浓度不同。
在某些其他实施方案中，给人施用的辅酶Q10的形式与在人的全身性循环中发现的主要形式不同。
在本发明的某些实施方案中，提供了用于通过给人局部施用辅酶Q10(以便治疗或预防发生)来治疗或预防人的肿瘤障碍的方法，其中给人施用在局部媒介物中的局部剂量的辅酶Q10，其中将辅酶Q10以约0.01至约0.5毫克的辅酶Q10/平方厘米的皮肤的范围用于靶组织。在一个实施方案中，将辅酶Q10以约0.09至约0.15mg CoQ10/平方厘米的皮肤的范围用于靶组织。在不同实施方案中，将辅酶Q10以约0.001至约5.0、约0.005至约1.0、约0.005至约0.5、约0.01至约0.5、约0.025至约0.5、约0.05至约0.4、约0.05至约0.30、约0.10至约0.25或约0.10至0.20mg CoQ10/平方厘米的皮肤的范围用于靶组织。在其他实施方案中，将辅酶Q10以约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5mg CoQ10/平方厘米的皮肤的剂量用于靶组织。在一个实施方案中，将辅酶Q10以约0.12mg CoQ10/平方厘米的皮肤的剂量用于靶组织。应当理解，以这些值的任一个作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如约0.03至约0.12mg、约0.05至约0.15、约0.1至约0.20或约0.32至约0.49mg CoQ10/平方厘米的皮肤。
在本发明的另一个实施方案中，以0.5至10毫克的CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量以CoQ10乳膏的形式施用辅酶Q10，其中所述CoQ10乳膏包含1至5％的辅酶Q10。在一个实施方案中，所述CoQ10乳膏包含约3％的辅酶Q10。在其他实施方案中，所述CoQ10乳膏包含约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％的辅酶Q10。在多个实施方案中，以约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10毫克的CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量施用所述CoQ10乳膏。应当理解，以这些值的任一个作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如，约0.5至约5.0，约1.5至2.5或约2.5至5.5mg CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤。
在另一个实施方案中，以3至5毫克CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量以CoQ10乳膏的形式施用所述辅酶Q10，其中所述CoQ10乳膏包含1至5％的辅酶Q10。在一个实施方案中，所述CoQ10乳膏包含约3％的辅酶Q10。在其他实施方案中，所述CoQ10乳膏包含约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％的辅酶Q10。在多个实施方案中，以约3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0毫克CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量施用所述CoQ10乳膏。应当理解，以这些值的任一个作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如，约3.0至约4.0，约3.3至5.3或约4.5至4.9mg CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤。
在本发明的某些实施方案中，被治疗或预防的肿瘤障碍是鳞状细胞癌。在某些其他实施方案中，被治疗或预防的肿瘤障碍是基底细胞癌。本发明的其他实施方案，被预防的肿瘤障碍是SCC，并且所述方法防止癌前期损伤光化性角化病进展成SCC。在其他实施方案中，被治疗或预防的肿瘤障碍是黑素瘤。
本发明的某些方面提供了用于通过给人局部施用辅酶Q10(以便治疗或预防发生)来治疗或预防人的肿瘤障碍的方法，其中通常每24小时局部施用辅酶Q10一次或多次，进行6周或更长时间。
本发明在另一个方面还提供了用于治疗或预防人的侵袭性肿瘤障碍的方法。此类方法包括以选择的比对于不太具有侵袭性或非侵袭性肿瘤障碍所使用或选择的给药方案更低的剂量给人施用辅酶Q10，从而治疗或预防侵袭性肿瘤障碍。在某些实施方案，所述侵袭性肿瘤障碍包括胰腺癌、肝细胞癌、尤因肉瘤、转移性乳腺癌、转移性黑素瘤、脑癌(星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、神经内分泌癌、结肠癌、肺癌、骨肉瘤、非雄激素依赖型前列腺癌、卵巢癌和非何杰金氏淋巴瘤。在相关方面，本发明提供了用于治疗或预防人的非侵袭性肿瘤障碍的方法，所述方法包括以选择的比对于侵袭性肿瘤障碍所使用或选择的给药方案更高的剂量给人施用辅酶Q10，从而治疗或预防非侵袭性肿瘤障碍。在某些实施方案中，所述非侵袭性肿瘤障碍包括非转移性乳腺癌、雄激素依赖型前列腺癌、小细胞肺癌、急性淋巴细胞白血病。在某些实施方案中，中间产物包括：苯醌或至少一种促进苯醌环的生物合成的分子，和(b)至少一种促进类异戊二烯单元的合成和/或类异戊二烯单元至苯醌环的连接的分子。在其他实施方案中，所述至少一种促进苯醌环的生物合成的分子包括：L-苯丙氨酸、DL-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-酪氨酸、DL-酪氨酸、D-酪氨酸、4-羟基-苯丙酮酸酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯(香草扁桃酸酯或VMA)、香草酸、吡哆素或泛醇。在其他实施方案中，所述至少一种促进类异戊二烯单元的合成和/或类异戊二烯单元至苯醌环的连接的分子包括：乙酸苯酯、4-羟基-苯甲酸酯、甲羟戊酸、乙酰甘氨酸、乙酰-CoA或法呢基。在其他实施方案中，所述中间产物包括：(a)L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和4-羟基苯丙酮酸的一种或多种；和(b)4-羟基苯甲酸酯、乙酸苯酯和苯醌的一种或多种。在其他实施方案中，所述中间产物：(a)抑制Bcl-2表达和/或促进半胱天冬酶-3表达；和/或(b)抑制细胞增殖。意料之外地，这些更低的剂量对于侵袭性肿瘤障碍具有治疗性并且更高的剂量对于非侵袭性肿瘤障碍具有治疗性。
用于治疗侵袭性肿瘤障碍的CoQ10的所选择的更低剂量意欲包括低于对于不太具有侵袭性或非侵袭性肿瘤障碍通常所使用的或选择的给药方案的剂量。在多个实施方案中，对于不太具有侵袭性或非侵袭性肿瘤障碍通常所使用的或选择的给药方案为CoQ10的所选择的更低剂量的约1.5倍以上、约2倍以上、约3倍以上、约4倍以上、约5倍以上或约10-倍以上。应理解，CoQ10的所选择的更低剂量包括与对于不太具有侵袭性或非侵袭性肿瘤障碍通常所使用的或选择的治疗时间或施用方案相比较更短的CoQ10的治疗时间(例如，为2/3、1/2、1/3、1/4、1/5或1/10的更短时间)或更低频率的施用(例如，以1/2的频率常见，其次以1/3、1/4、1/5、1/10、1/20或1/24的频率)。在多个实施方案中，用于治疗侵袭性肿瘤障碍的辅酶Q10的所选择的更低剂量包括约0.0001至约5.0、约0.001至约1.0、约0.001至约0.5、约0.001至约0.4、约0.001至约0.30、约0.001至约0.25、约0.001至0.20、约0.001至约0.12或约0.001至约0.09mg CoQ10/平方厘米的皮肤。在其他实施方案中，将辅酶Q10以约0.0001、0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5mg CoQ10/平方厘米的皮肤的剂量用于靶组织。应当理解，以这些值的任一个作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如约0.005至约0.09mg CoQ10/平方厘米的皮肤。
用于治疗非侵袭性肿瘤障碍的CoQ10的所选择的更高剂量意欲包括比对于侵袭性肿瘤障碍通常所使用或选择的给药方案更高的剂量。在多个实施方案中，CoQ10的所选择的更高剂量为通常用于或选择用于侵袭性肿瘤障碍的给药方案的约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或约10倍。应理解，CoQ10的所选择的更低剂量还包括与对于侵袭性肿瘤障碍通常所使用或选择的治疗时间或施用方案相比较更长的CoQ10的治疗时间(例如，1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍的更长治疗时间)或更频繁的CoQ10的施用(例如，频率增加至1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或24倍)。在多个实施方案中，用于治疗侵袭性肿瘤障碍的辅酶Q10的所选择的更高剂量包括约0.001至约10.0、约0.005至约10.0、约0.01至约10.0、约0.05至约5.0、约0.05至约2.0、约0.05至约1.0、约0.05至约0.7、约0.10至约0.50或约0.12至0.5mg CoQ10/平方厘米的皮肤。在其他实施方案中，以约0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5mg、0.6mg、0.7mg.、0.8mg、0.9mg或1.0mg CoQ10/平方厘米的皮肤的剂量将辅酶Q10施用于靶组织。应当理解，具有这些值的任一个作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如，约0.15至约0.5mg CoQ10/平方厘米的皮肤。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防人的肿瘤障碍的方法，包括以使辅酶Q10在肿瘤障碍的治疗过程中维持其氧化形式的方式给所述人施用辅酶Q10。在一个实施方案中，待治疗的肿瘤障碍不是通常通过局部施用治疗的障碍，例如，乳腺癌或前列腺癌，预期以治疗有效水平全身性递送活性剂来进行治疗。
在另一个方面，本发明提供了用于在人中阻断葡萄糖的无氧使用并且提高线粒体氧化磷酸化的方法，所述方法包括：选择或治疗患有肿瘤障碍的人受试者，和给所述人施用治疗有效量的辅酶Q10或辅酶Q10生物合成途径中的中间产物，从而阻断葡萄糖的无氧使用和增加线粒体氧化磷酸化。在某些实施方案中，所述方法还包括上调一个或多个基因的表达，所述基因选自HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-羟基苯甲酸酯、中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、CptlC、钙调蛋白激酶II和表2-4和6-28中所列的任何一个或多个基因，和/或下调一个或多个基因的表达，所述基因选自HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-羟基苯甲酸酯、中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C、钙调蛋白激酶II，从而阻断葡萄糖的无氧使用并且提高线粒体氧化磷酸化。
在相关方面，本发明提供了用于在人中阻断葡萄糖的无氧使用并且提高线粒体氧化磷酸化的方法，所述方法包括：选择患有侵袭性肿瘤障碍的人受试者，和给所述人施用治疗有效量的辅酶Q10或辅酶Q10生物合成途径中的中间产物，从而阻断葡萄糖的无氧使用和增加线粒体氧化磷酸化。在某些实施方案中，所述肿瘤障碍选自胰腺癌、肝细胞癌、尤因肉瘤、转移性乳腺癌、转移性黑素瘤、脑癌(星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、神经内分泌癌、结肠癌、肺癌、骨肉瘤、非雄激素依赖型前列腺癌、卵巢癌和非何杰金氏淋巴瘤。
在相关方面，本发明提供了用于在人中阻断葡萄糖的无氧使用并且提高线粒体氧化磷酸化的方法。此类方法包括：选择患有非侵袭性肿瘤障碍的人受试者，和给所述人施用治疗有效量的辅酶Q10或辅酶Q10生物合成途径中的中间产物，从而阻断葡萄糖的无氧使用和增加线粒体氧化磷酸化。在某些实施方案中，所述肿瘤障碍选自非转移性乳腺癌、雄激素依赖型前列腺癌、小细胞肺癌、急性淋巴细胞白血病。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗人的肿瘤障碍的方法。该方法包括以给药方案给有此需要的人施用辅酶Q10以使人的细胞膜的通透性受到调节并且治疗发生。
在本发明的某些实施方案中，肿瘤障碍的治疗或预防通过CoQ10与蛋白质的相互作用发生，所述蛋白质选自HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-羟基苯甲酸酯、中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C、钙调蛋白激酶II和/或表2-4和6-28中所列的任一个或多个基因。在某些实施方案中，所述肿瘤障碍选自白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。
在本发明的某些实施方案中，所述肿瘤障碍选自白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。
在本发明的某些实施方案中，所述方法还包括治疗方案，所述治疗方案包括手术、放射疗法、激素疗法、抗体疗法、利用生长因子、细胞因子的疗法和化学疗法的任一种或其组合。
本发明的某些方面提供了用于制备辅酶Q10乳膏3％的方法，其包括制备A、B、C、D和E相以及组合所有相以便形成3％CoQ10乳膏的水包油乳剂的步骤。
在某些实施方案中，A相成分包含4.00％w/w的烷基C12-15苯甲酸盐NF、2.00％w/w的鲸蜡醇NF、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯/PEG-100和1.5％w/w的硬脂醇NF，而B相成分包括5.00％w/w的二甘醇单乙醚NF、2.00％w/w的甘油USP、1.50％w/w的丙二醇USP、0.475％w/w的苯氧乙醇NF、16.725％w/w的纯化水USP和40.00％w/w的卡波姆分散体2％，C相成分包括0.50％w/w的乳酸USP、2.00％w/w的乳酸钠溶液USP、1.30％w/w的三乙醇胺NF和2.50％w/w的纯化水USP。此外，在这些实施方案中，D相成分包括1.00％w/w的二氧化钛USP，而E相成分包括15％w/w的CoQ10 21％浓缩物。
在某些其他实施方案中，A相成分包括4.00％w/w的辛酸/癸酸甘油三酯、2.00％w/w的鲸蜡醇NF、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯/PEG-100和1.5％w/w的硬脂醇NF，而B相成分包括5.00％w/w的二甘醇单乙醚NF、2.00％w/w的甘油USP、1.50％w/w的丙二醇USP、0.475％w/w的苯氧乙醇NF、16.725％w/w的纯化水USP和40.00％w/w的卡波姆分散体2％，C相成分包括0.50％w/w的乳酸USP、2.00％w/w的乳酸钠溶液USP、1.30％w/w的三乙醇胺NF和2.50％w/w的纯化水USP。此外在这些实施方案中，D相成分包括1.00％w/w的二氧化钛USP，而E相成分包括15％w/w的CoQ10 21％浓缩物。
在本发明的某些实施方案中，提供了用于制备辅酶Q10乳膏3％的方法，所述方法包括以下步骤：(1)向适当的容器中加入A相成分并且在水浴中加热至70-80℃；(2)向适当的容器中加入B相成分(不包括卡波姆分散体)并且混合以形成混合B相；(3)将E相成分加入适当的容器并且利用水浴在50-60℃下熔化以形成熔化的E相；(4)向搅拌罐中加入卡波姆分散体，并且在混合下加热至70-80℃；(5)向搅拌罐中加入混合的B相同时将温度维持在70-80℃；(6)向搅拌罐中加入C相成分同时将温度维持在70-80℃；(7)向搅拌罐中加入D相成分，随后继续混合和匀化搅拌罐的内容物；然后(8)停止匀化并且将搅拌罐的内容物冷却至50-60℃；随后(9)中止混合，向搅拌罐中加入熔化的E相以形成分散体；(10)随后重新开始混合直至分散体变得光滑和均匀；随后(11)将搅拌罐的内容物冷却至45-50℃。
在本发明的某些其他实施方案中，提供了包含CoQ10乳膏3％的药物组合物。所述乳膏包含具有4.00％w/w组合物的C12-15烷基苯甲酸盐、2.00％w/w组合物的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100的A相；具有2.00％w/w的甘油、1.5％w/w的丙二醇、5.000％w/w的乙氧基二甘醇、0.475％w/w的苯氧乙醇、40.00％w/w的卡波姆分散体、16.725％w/w的纯化水的B相；具有1.300％w/w的三乙醇胺、0.500％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液和2.5％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有15.000％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。在某些实施方案中，卡波姆分散体包括水、苯氧乙醇、丙二醇和卡波姆940。
在本发明的某些其他实施方案中，提供了包含CoQ10乳膏3％的药物组合物。所述乳膏包含具有4.00％w/w组合物的辛酸/癸酸甘油三酯、2.00％w/w组合物的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100的A相；具有2.00％w/w的甘油、1.5％w/w的丙二醇、5.0％w/w的乙氧基二甘醇、0.475％w/w的苯氧乙醇、40.00％w/w的卡波姆分散体、16.725％w/w的纯化水的B相；具有1.300％w/w的三乙醇胺、0.500％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液、2.5％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有15.000％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。在某些实施方案中，卡波姆分散体包括水、苯氧乙醇、丙二醇和卡波姆940。
在本发明的某些其他实施方案中，提供了包含CoQ10乳膏1.5％的药物组合物。所述乳膏包括具有5.000％w/w的C12-15烷基苯甲酸盐、2.000％w/w的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.500％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100硬脂酸酯的A相；具有2.000％w/w的甘油、1.750％w/w的丙二醇、5.000％w/w的乙氧基二甘醇、0.463％w/w的苯氧乙醇、50％w/w的卡波姆分散体和11.377％w/w的纯化水的B相；具有1.3％w/w的三乙醇胺、0.400％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液和4.210％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧乙化钛的D相；和具有1.500％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。
在本发明的某些其他实施方中，提供了包含CoQ10乳膏1.5％的药物组合物。所述乳膏包含具有5.000％w/w的辛酸/癸酸甘油三酯、2.000％w/w的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.500％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100硬脂酸酯的A相；具有2.000％w/w的甘油、1.750％w/w的丙二醇、5.000％w/w的乙氧基二甘醇、0.463％w/w的苯氧乙醇、50％w/w的卡波姆分散体和11.377％w/w的纯水的B相；具有1.3％w/w的三乙醇胺、0.400％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液和4.210％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有1.500％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。在某些实施方案中，卡波姆分散体包含水、苯氧乙醇和丙二醇。
在某些实施方案中，提供了用于治疗或预防人的CoQ10反应性障碍的方法，包括：通常给人局部施用辅酶Q10(CoQ10)以便治疗或预防发生。在某些其他实施方案中，所述CoQ10反应性障碍是肿瘤障碍。
附图简述：
参照附图在下文中描述本发明的公开内容的多个实施方案，其中：
图1：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的SK-MEL-28对24小时的Q10处理的敏感性。
图2：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的SKBR3对24小时的Q10处理的敏感性。
图3：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的PaCa2对24小时的Q10处理的敏感性。
图4：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的PC-3对24小时的Q10处理的敏感性。
图5：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的HepG2对24小时的Q10处理的敏感性。
图6：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的MCF-7对24小时的Q10处理的敏感性。
图7：在利用Q10处理24小时后凋亡细胞的测量，如通过Apostrand ELISA法测量的。
图8：2-D凝胶电泳的示例性凝胶分析。标记被切取用于鉴定的点。
图9：通过2-D凝胶电泳鉴定的在SK-MEL-28细胞中受Q10调节的蛋白质之间的相互作用的网络。
图10：从Verhoeven等人(Am.J.Hum.Genet.200168(5)：1086-1092)改进的戊糖磷酸途径。
图11：SK-MEL-28细胞的富集线粒体的材料的2-D凝胶。标记要切取的并且通过质谱表征鉴定的点。
图12：在向培养基中外源加入100μM Q10后存在于线粒体中的Q10的相对量的比较曲线。
图13：描绘已知过程的细胞凋亡途径。
图14：Bcl-xl的Western印迹分析。
图15：利用波形蛋白抗体显示的SK-MEL-28样品组的Western印迹分析。
图16：利用5种靶向氧化磷酸化复合物的抗体(MitoSciences#MS601)评估的来自许多细胞系的细胞裂解的Western印迹分析。
图17：F1-α水平的Western印迹比较。
图18：针对C-III-Core 2的Q10反应的Western印迹比较。
图19：针对C-II-30的Q10反应的Western印迹比较。
图20：针对C-IV-COX II的Q10反应的Western印迹比较。
图21：针对C-I-20(ND6)的Q10反应的Western印迹比较。
图22：针对5种线粒体蛋白质的多种细胞类型的Western印迹分析。
图23：针对复合物V蛋白C-V-α的Q10反应的Western印迹比较。
图24：针对C-III-Core 1的Q10反应的Western印迹比较。
图25：针对孔蛋白(VDAC1)的Q10反应的Western印迹比较。
图26：针对亲环蛋白(Cyclophilin)的Q10反应的Western印迹比较。
图27：针对细胞色素C的Q10反应的Western印迹比较。
图28：插入螺旋10开放构象中的HNF4α(1M7W.pdb)的脂质结合通道的Q10(球)的理论模型。
图29：描述利用本公开内容的具有渗透促进剂的组合物处理后雄性猪的表皮CoQ10浓度的曲线图。
图30：描述利用对照组合物处理后雌性猪的表皮CoQ10浓度曲线图。
图31：处理前的靶损伤1的照相描述。
图32：处理后的靶损伤1的照相描述。
图33：处理前的靶损伤2的照相描述。
图34：处理后的靶损伤2的照相描述。
图35：处理前的靶损伤3的照相描述。
图36：处理后的靶损伤3的照相描述。
图37：在含氧量正常和含氧量低的条件下，HDFa细胞在多种葡萄糖条件下的OCR。
图38：在含氧量正常和含氧量低的条件下，HASMC细胞在多种葡萄糖条件下的OCR。
图39：在CoQ10和应激因子不存在和存在的情况下MCF-7胰腺癌细胞中的OCR值。
图40：在CoQ100和应激因子不存在和存在的情况下PaCa-2胰腺癌细胞中的OCR值。
发明详述：
I.定义
如本文中所使用的，下列术语的每一个具有在该部分中与其相关的意义。
冠词“一种(a)”和“一个(an)”在本文中是指一个或超过一个(即至至少一个)所述冠词的语法宾语。例如，“一个元素”意指一个元素或超过一个元素。
术语“包括”在本文中用于意指短词“包括但不限于”，并且可与所述短语互换使用。
除非本文中明确地另外指出，否则术语“或”在本文中意指术语“和/或”，并且可与所述术语互换使用。
术语“例如”在本文中用于意指术语“例如但不限于”，并且可与所述术语互换使用。
待通过本发明的方法治疗的“患者”或“受试者”可意指人或非人动物，优选哺乳动物。应当指出，本文中描述的临床观察是利用人受试者产生的，并且在至少某些实施方案中，所述受试者是人。
“治疗有效量”意指当给患者施用以治疗疾病时足以对所述疾病实现这样的治疗的化合物的量。当为了预防疾病施用时，所述量足以避免或延迟疾病的发作。“治疗有效量”将视所述化合物、疾病和其严重性以及待治疗的患者的年龄、体重等而变化。
“预防”或“防止”是指获得疾病或障碍的风险(即，引起尚未在可遭受或易患疾病但仍未经历或展示疾病的症状的患者中发生的疾病的至少一个临床症状)的降低。
术语“预防性”或“治疗性”治疗是指给受试者施用一种或多种受试组合物。如果其在不期望的病状(例如，宿主动物的疾病或其他不期望的状态)的临床表现之前施用，则治疗是预防性的，即，其保护宿主免于发生不期望的病状，然而如果在不期望的病状表现之后施用，则治疗是治疗性的(即，其由此旨在减轻、改善或维持既有的不期望的病状或副作用)。
术语“治疗效应”是指由药理活性物质引起的动物，特别是哺乳动物的，更特别是人中的局部或全身性效应。所述术语因此意指意欲用于诊断、治疗、缓和、治疗或预防疾病或用于促进动物或人的期望的身体或心理发展和状态的任何物质。短语“治疗有效量”意指以适用于任何治疗的合理效益风险比产生一定的期望的局部或全身性效应的此种物质的量。在某些实施方案中，化合物的治疗有效量将取决于其治疗指数、溶解度等。例如，可以以足以产生适用于此类治疗的合理效益风险比的量施用通过本发明的方法发现的某些化合物。
“患者”是指任何动物(例如，人)，包括马、狗、猫、猪、山羊、兔、仓鼠、猴、豚鼠、大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、绵羊、牛、鱼和鸟。
“代谢途径”是指酶介导的反应的顺序，所述反应将一种化合物转化成另一种化合物并且为细胞功能提供中间产物和能量。代谢途径可以是线性的或环状的。
“代谢状态”是指如通过多个化学和生物学指标测量的在给定时间点上的特定细胞、多细胞或组织环境的分子含量，它们与健康或疾病的状态相关。
术语“微阵列”是指在基质例如纸、尼龙膜或其他类型的膜、滤纸、芯片、载玻片或任何其他适当的固体载体上合成的不同多核苷酸、寡核苷酸、多肽(例如，抗体)或肽的阵列。
术语“障碍”和“疾病”被包含地使用并且是指与身体的任何部分、器官或系统(或其任何组合)的正常结构或功能的任何偏差。具体的疾病表现在特征性症状和体征(包括生物、化学和物理变化)，并且通常与多个其他因素(包括但不限于人口统计、环境、职业、遗传和医疗史因素)相关。可通过多种方法定量某些特征性体征、症状和相关因素以产生重要诊断信息。
术语“表达”在本文中用于表示籍以从DNA产生多肽的过程。所述过程包括基因至mRNA的转录和该mRNA至多肽的翻译。取决于其所应用的背景，“表达”可以指RNA、蛋白质或两者的产生。
术语“基因的表达水平”或“基因表达水平”是指细胞中mRNA以及前mRNA新生转录物、转录物加工中间体、成熟mRNA和降解物的水平或由所述基因编码的蛋白质的水平。
术语“调节”是指反应的上调(即，激活或刺激)、下调(即，抑制或遏抑)，或者两者的组合或分开的两者。“调节剂”是起调节作用的化合物或分子，并且可以是例如激动剂、拮抗剂、活化剂、刺激剂、遏抑剂或抑制剂。
本文中所使用的术语“三乙醇胺”是指三乙醇胺(Trolamine)NF、三乙醇胺、
Figure BPA00001497260600241
TEAlan 99％、三乙醇胺99％、三乙醇胺NF或三乙醇胺99％NF。这些术语在本文中可互换使用。
本文中所使用的术语“辅酶生物合成途径的中间产物”表征了在酪氨酸和乙酰-CoA至泛醌的化学/生物转化之间形成的那些化合物。辅酶生物合成途径的中间产物包括3-六异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯、3-六异戊二烯基-4，5-二羟基苯甲酸酯、3-六异戊二烯基-4-羟基-5-甲氧基苯甲酸酯、2-六异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-六异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-六异戊二烯基-3-甲基-5-羟基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯、2-八异戊二烯基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-5-羟基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-十异戊二烯基-3-甲基-5-羟基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-十异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-十异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-十异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、3-十异戊二烯基-4-羟基-5-甲氧基苯甲酸酯、3-十异戊二烯基-4，5-二羟基苯甲酸酯、3-十异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯、4-羟基苯丙酮酸酯、4-羟基苯基乳酸酯、4-羟基-苯甲酸酯、4-羟基苯乙烯和六异戊二烯二磷酸酯。
现将更详细地参考本发明的优选实施方案。虽然结合优选实施方案描述本发明，但应理解其无意将本发明限定于此类优选实施方案。相反地，其意欲覆盖选择、变化和等同物，这可包括在通过所附权利要求定义的本发明的精神和范围内。
II.环境影响剂
本发明提供了通过施用环境影响剂治疗癌症障碍的方法。“环境影响剂(Env-influence)”为以允许人(或非人哺乳动物的)疾病环境改变、重建回或维持正常或健康环境(从而导致正常状态)的有益方式影响或调节人或非人哺乳动物的疾病环境。环境影响剂包括如下定义的多维细胞内分子(MIM)和表观代谢转变剂(Epi-shitfter)。
如本文中所使用的，″肿瘤障碍″是在人中发现的所有类型的癌症或赘生物或恶性肿瘤，包括但不限于：白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。如本文中所使用的，术语或短语“肿瘤障碍”、″癌症″、″赘生物″和″肿瘤″可互换使用并且可以以单数或复数形式存在，其是指已经历恶性转化使得它们对于宿主生物来说是病理性的细胞。在某些实施方案中，肿瘤障碍是辅酶Q10反应性状态。
在某些实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于缺乏细胞凋亡。在其他实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于增加的血管生成。在其他实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于细胞外基质(ECM)降解。在其他实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于细胞周期控制的丧失。在其他实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于代谢管理(metabolic governance)从线粒体氧化磷酸化至增加的对乳酸盐和糖酵解流的利用和/或依赖的转化。在另外的实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于逃避免疫监视的适应原免疫调节机制。在一个实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于至少两个上述特性，例如，增加的血管生成和ECM降解。在一个实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于至少3个上述特性。在一个实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于至少4个上述特性。在一个实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于至少5个上述特性。在一个实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于全部6个上述特性。
因此，在某些实施方案中，本发明的化合物通过恢复细胞凋亡或诱导细胞凋亡的能力来起作用。在其他实施方案中，本发明的化合物通过降低、减少或抑制血管生成来起作用。在其他实施方案中，本发明的化合物通过恢复重建细胞外基质来起作用。在其他实施方案中，本发明的化合物通过恢复细胞周期控制来起作用。在其他实施方案中，本发明的化合物通过将代谢管理从糖酵解转变回线粒体氧化磷酸化来起作用。在另外的实施方案中，本发明的化合物通过恢复免疫监视或恢复身体将癌细胞识别为外来物的能力来起作用。
不希望受任何特定理论限制，据认为通常存在集合在一起发展出癌症的协同事件级联。即，在某些实施方案中，癌症不是单独地取决于1种基因-1种蛋白质-根原因(1 gene-1 protein-root causality)。在某些实施方案中，癌症是表现为变成肿瘤、改变的组织状态的组织变化和改变(例如，能量学、允许转移潜能的受损的细胞外基因完整性、免疫监视的不存在和/或改变的血管生成的状态)的生理疾病状态。
可利用广为接受的技术特别是组织学检查容易地将原发性肿瘤细胞(即，获自恶性转化位置附近的细胞)与非癌细胞相区别。癌细胞的定义，如本文中所使用的，不仅包括原发性癌细胞，而且还包括癌症干细胞，以及癌症祖细胞或来源于癌症细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞以及来源于癌细胞的体外培养物和细胞系。当提及通常表现为实体瘤的癌症的类型时，“临床上可检测的”肿瘤是在肿瘤团块的基础上可检测的(例如，通过方法例如CAT扫描、MR成像、X-射线、超声或触诊)和/或由于可从患者获得的样品中一个或多个癌症特异性抗原的表达而可被检测的肿瘤。
1.多维细胞内分子(MIM)
术语“多维细胞内分子(MIM)”是由身体天然产生的和/或存在于人的至少一个细胞中的内源分子的分离形式或合成产生的形式。MIM的特征在于1个或多个、2个或更多个、3个或更多个或全部下列功能。MIM能够进入细胞，进入细胞细胞包括完全或部分进入细胞，只要所述分子的生物活性部分完全进入细胞即可。MIM能够在细胞内诱导信号转导和/或基因表达机制。MIM是多维的，因为所述分子具有治疗和载体例如药物递送作用。MIM也是多维的，因为所述分子在疾病状态中以一种方式作用并且在正常状态中以不同方式作用。例如，在CoQ-10的情况中，在VEGF存在的情况下给黑素瘤细胞施用CoQ-10导致降低的Bcl2水平，这反过来导致减小的黑素瘤细胞的致癌潜能。相反地，在正常成纤维细胞中，CoQ-10和VEFG的共施用对Bcl2的水平无作用。优选，MIM选择性作用于疾病状态的细胞，并且在正常状态的(匹配)细胞中基本上没有作用。优选，MIM选择性地使疾病状态的细胞在表型、代谢状态、基因型、mRNA/蛋白质表达水平等上与正常状态的(匹配)细胞更接近。
在一个实施方案中，MIM也是表观代谢转变剂。在另一个实施方案中，MIM不是表观代谢转变剂。本领域技术人员应理解，本发明的MIM也意欲包括两种或更多种内源分子的混合物，其中所述混合物的特征在于一种或多种上述功能。混合物中的内源分子以以使混合物用作MIM的比率存在。
MIM可以是基于脂质或基于非脂质的分子。MIM的实例包括但不限于CoQ10、乙酰Co-A、棕榈酰Co-A、L-肉毒碱、氨基酸例如酪氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸。在一个实施方案中，MIM为小分子。在本发明的一个实施方案中，MIM不是CoQ10。MIM可由本领域技术人员使用本文中详细描述的任何测定常规地鉴定。
在某些实施方案中，MIM包括维生素B家族中的化合物或包含维生素B家族中的化合物的核苷、单核苷酸或二核苷酸。维生素B家族中的化合物包括例如硫胺素(维生素B1)、尼克酸(也称为烟酸或维生素B3)或吡哆素(维生素B6)以及维生素原例如泛醇(维生素原B5)。在某些实施方案中，MIM选自硫胺素、尼克酸和吡哆素。包含维生素B家族的化合物的核苷、单核苷酸或二核苷酸包括例如包含腺嘌呤或尼克酸(烟酸)分子的核苷、单核苷酸或二核苷酸。在某些实施方案中，MIM选自腺苷、腺苷二磷酸(ADP)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD，其包含部分维生素B2和ADP)和烟酸二核苷酸。
在其他实施方案中，MIM包括氨基酸。氨基酸的实例包括例如酪氨酸(例如，L-酪氨酸)、半胱氨酸、苯丙氨酸(例如，L-苯丙氨酸)和丙氨酸。在某些实施方案中，氨基酸是苯丙氨酸或丙氨酸。在某些实施方案中，MIM包括氨基酸衍生物例如4-羟基苯丙酮酸酯或乙酰甘氨酸。
在某些实施方案中，MIM是葡萄糖类似物，例如，其中一个-OH或-CH2OH取代基已被-COOH、-COO-或-NH2取代基取代的葡萄糖分子。葡萄糖类似物的实例包括葡糖胺、葡糖醛酸、葡糖苷酸和葡糖醛酸酯。
在某些实施方案中，MIM选自式(I)的化合物：
Figure BPA00001497260600291
其中
n为0或1的整数；
R1、R2、R3和R4，当存在时，各自独立地选自氢和羟基或者R1和R2与它们所连接的碳一起形成羰基(C＝O)基团；
W为-COOH或-N(CH3)3 +；和
X为氢、负电荷或碱金属阳离子例如Na+或。
应理解，当n为0时，CHR3基与W取代基连接。
在某些实施方案中，W为-N(CH3)3 +。在某些实施方案中，所述MIM是肉毒碱例如L-肉毒碱。
在某些实施方案中，所述MIM为二羧酸。在某些实施方案中，W为-COOH。在某些实施方案中，R3为氢。在某些实施方案中，n为0。在某些实施方案中，R1和R2各自独立地是氢。在某些实施方案中，w为-COOH，R3为氢，n为0并且R1和R2各自独立地是氢。在某些实施方案中，n为1。在某些实施方案中，R1和R2与它们所连接的碳一起形成羰基(C＝O)基团。在某些实施方案中，R4为氢。在某些实施方案中，R4为羟基。在某些实施方案中，W为-COOH，R3为氢，n为1并且R1和R2与它们所连接的碳一起形成羰基(C＝O)基团。
在某些实施方案中，所述MIM是克雷布斯循环(Krebs Cycle)的中间产物，过量的MIM驱动克雷布斯循环朝向产生性氧化磷酸化。为MIM的示例性克雷布斯循环中间产物包括琥珀酸或琥珀酸盐、苹果酸或苹果酸盐以及α-酮戊二酸或α-酮戊二酸盐。
在某些实施方案中，所述MIM是CoQ10的结构单元，其具有下列结构：
Figure BPA00001497260600301
因此，CoQ10的结构单元包括但不限于苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸酯、乙酸苯酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯、香草酸、4-羟基苯甲酸酯、甲羟戊酸、法呢基、2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌以及其相应的酸或离子。在某些实施方案中，所述MIM选自苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸酯、乙酸苯酯和4-羟基苯甲酸酯。
2.表观代谢转变剂(Epi-shifter)
如本文中所使用的，“表观代谢转变剂”(epi-shifter)是调节从健康(或正常)状态至疾病状态以及反之亦然的代谢转变，从而维持或重建人的组织、器官、系统和/或宿主健康的分子(内源或外源的)。表观代谢转变剂能够实现组织微环境的标准化。例如，表观代谢转变剂包括当加入细胞或从细胞去除时能够影响细胞的微环境(例如，代谢状态)的任何分子。本领域技术人员应理解本发明的表观代谢转变剂也意在包括两种或更多种分子的混合物，其中所述混合物的特征在于上述功能的一个或多个功能。混合物中的分子以使混合物用作表观代谢转变剂的比率存在。表观代谢转变剂的实例包括但不限于CoQ-10；维生素D3；ECM成分例如纤连蛋白；免疫调节剂例如TNFa或白细胞介素例如IL-5、IL-12、IL-23的任-个；血管生成因子；和细胞凋亡因子。
在某些实施方案中，所述表观代谢转变剂为酶，例如直接参与催化克雷布斯循环中的一个或多个反应或产生克雷布斯循环中间产物的酶，其的过量驱动克雷布斯循环。在某些实施方案中，所述酶为戊糖磷酸途径的非氧化相的酶，例如转醛醇酶或转酮醇酶。在其他实施方案中，所述酶为促进克雷布斯循环的组分酶或酶复合物例如合酶或连接酶。示例性酶包括琥珀酰CoA合酶(克雷布斯循环)或丙酮酸羧化酶(催化丙酮酸的可逆羧化以形成草酰乙酸盐(OAA)(克雷布斯循环的中间产物)的连接酶)。
在某些实施方案中，所述表观代谢转变剂为CoQ10的结构单元。CoQ10的结构单元包括但不限于苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸酯、乙酸苯酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯、香草酸、4-羟基苯甲酸酯、甲羟戊酸、法呢基、2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌以及其相应的酸或离子。在某些实施方案中，所述表观代谢转变剂选自苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸酯、乙酸苯酯和4-羟基苯甲酸酯。
在某些实施方案中，所述表观代谢转变剂是维生素B家族中的化合物。维生素B家族中的化合物包括例如核黄素(维生素B2)或其类似物。表观代谢转变剂也包括可在体内被代谢成任何内源MIM例如本文中描述的MIM的任何类似物或前体药物。
在一个实施方案中，所述表观代谢转变剂也是MIM。在一个实施方案中，所述表观代谢转变剂不是CoQ10。表观代谢转变剂可由本领域技术人员使用本文中详细描述的任何测定法来常规地鉴定。
在某些实施方案中，本发明的化合物例如本文中描述的MIM或表观代谢转变剂，可用于治疗有此需要的受试者的辅酶Q10反应性状态。术语“辅酶Q10反应性状态”或“CoQ10反应性状态/疾病”包括可通过施用辅酶Q10治疗、预防或改善的疾病、障碍、状态和/或病状。不希望受任何特定理论束缚，并且如本文中进一步描述的，CoQ10被认为至少部分地通过诱导对细胞微环境的代谢转变，例如朝向正常状态细胞中的氧化磷酸化的类型和/或水平的转变来起作用。因此，在某些实施方案中，CoQ10反应性状态是由细胞微环境的改变的代谢引起的状态。辅酶Q10反应性状态包括例如，肿瘤障碍，其例如可以偏向于糖酵解和乳酸盐生物合成。在某些实施方案中，CoQ10反应性肿瘤障碍包括肝癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌或骨癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、黑素瘤和光线性角化病等等。辅酶Q10反应性状态还包括本文中描述的其他肿瘤障碍。
辅酶Q10反应性状态还包括例如代谢障碍例如肥胖症、糖尿病、糖尿病前期(pre-diabete)、代谢综合征、饱满感和内分泌异常。辅酶Q10反应性状态还包括本文中描述的其他代谢障碍。
在某些实施方案中，本发明的化合物例如本文中描述的MIM或表观代谢转变剂与辅酶Q10共有共同的活性。如本文中所使用的，短语“与辅酶Q10共有共同的活性”是指化合物展示与辅酶Q10的相同或相似的至少一部分的活性的化合物。在某些实施方案中，本发明的化合物展示25％或更多的辅酶Q10的活性。在某些实施方案中，本发明的化合物展示达到并且包括约130％的辅酶Q10的活性。在某些实施方案中，本发明的化合物展示约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％或130％的辅酶Q10的活性。应理解，该段落中所列的每一个值可用术语“约”修饰。此外，应理解由该段落中的任何两个值确定的任何范围意被认为包括在本发明中。例如，在某些实施方案中，本发明的化合物展示约50％至约100％的辅酶Q10的活性。在某些实施方案中，辅酶Q10和本发明的化合物所共有的活性是诱导细胞代谢的转变的能力。在某些实施方案中，CoQ10和本发明的化合物所共的活性利用OCR(耗氧率)和/或ECAR(细胞外酸化率)来测量。
III.用于鉴定MIM/表观代谢转变剂的测定法
用于分离和鉴定目的分子和化合物的本发明的技术和方法包括但不限于：液相色谱法(LC)、高压液相色谱法(HPLC)、质量光谱法(MS)、气相色谱法(GC)、液相色谱/质谱法(LC-MS)、气相色谱/质谱法(GC-MS)、核磁共振(NMR)、磁共振成像(MRI)、傅里叶变换红外法(Fourier Transform InfraRed)(FT-IR)和电感耦合等离子体质谱法(inductively CoUpled plasma mass spectrometry)(ICP-MS)。还应理解，质谱技术包括但不限于扇形磁场和双聚焦仪、传输四极子仪(transmission quadrapole instrument)、四极离子阱仪(quadrupoleion-trap instrument)、飞行时间仪(time-of-flight instrument)(TOF)、傅里叶变换离子回旋共振仪(Fourier transform ion cyclotron resonanceinstrument)(FT-MS)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的使用。
生物能分子水平的定量：
环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)可利用候选表观代谢转变剂所施用至的细胞的细胞生物能分子水平(例如，ATP、丙酮酸盐、ADP、NADH、NAD、NADPH、NADP、乙酰CoA、FADH2)的变化来鉴定。生物能分子水平的示例性测定使用基于比色、荧光和/或生物发光的方法。下面提供此类测定法的实例。
利用本领域内已知的许多测定法和系统测量细胞内的ATP水平。例如，在一个系统中，从裂解的细胞释放的细胞质ATP与萤光素和荧光素酶反应以产生光。利用生物发光计测量该生物发光，并且可计算裂解细胞的细胞内ATP浓度(EnzyLightTM ATP Assay试剂盒(EATP-100)，BioAssay Systems，Hayward，CA)。在另一个系统中，例如，通过生物发光计算ATP和其脱磷酸化形式；在计算ATP水平后，将ADP转化成ATP，随后使用相同的荧光素酶系统(ApoSENSORTM ADP/ATP Ratio Assay试剂盒，BioVision Inc.，Mountain View，CA)进行检测和计算。
丙酮酸盐是细胞代谢途径中的重要中间产物。取决于细胞的代谢状态，丙酮酸盐可通过糖异生作用转化成碳水化合物，通过乙酰CoA转化成脂肪酸或被代谢，或转化成丙酮酸或乙醇。因此丙酮酸盐水平的检测提供了细胞样品的代谢活性和状态的量度。例如，一种检测丙酮酸盐的测定法使用比色法和荧光法检测不同范围内的丙酮酸盐浓度(EnzyChromTM Pyruvate Assay试剂盒(Cat#EPYR-100)，BioAssaySystems，Hayward，CA)。
环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)可影响由细胞的线粒体进行的氧化磷酸化的过程，该过程牵涉生物能分子在细胞中的产生和维持。除了直接检测细胞培养物和样品中细胞能的变化的测定法(下文中描述的)外，存在检测和定量化合物对细胞中线粒体的分离酶和复合物的效应的测定。例如，MT-OXC MitoToxTM CompleteOXPHOS活性测定法(MitoSciences Inc.，Eugene，OR)可检测和定量直接用于从线粒体提取的复合物I至V的化合物的效应。用于检测和定量对单个线粒体复合物例如NADH脱氢酶(复合物I)、细胞色素c氧化酶(复合物IV)和ATP合酶(复合物V)的效应的测定法也是可获得的(MitoSciences Inc.，Eugene，OR)。
细胞能量的测量：
环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)还可通过细胞能量的的变化来鉴定。一个测量细胞能量的实例是分子氧的消耗和/或细胞培养的培养基的pH的变化的实时测量。例如，潜在的表观代谢转变剂调节细胞的代谢状态的能力可使用例如XF24分析仪(Seahorse，Inc.)来进行分析。该技术允许实时检测细胞单层的氧和pH的变化以估计细胞微环境的生物能。XF24分析仪测量和比较氧消耗(OCR)的速率(其为有氧代谢的量度)和细胞外酸化(ECAR)(其为糖酵解的量度)，两者都为细胞能量的至关重要的指示剂。
氧化磷酸化和线粒体功能的测量
氧化磷酸化是籍以通过营养化合物的氧化产生ATP的过程，该过程在真核生物中通过嵌入线粒体的膜中的蛋白质复合物进行。作为大多数生物的细胞中ATP的主要来源，氧化磷酸化活性的变化可强有力地改变细胞内的代谢和能量平衡。在本发明的某些实施方案中，可通过它们对氧化磷酸化的效应来检测和/或鉴定环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。在某些实施方案中，可通过它们对氧化磷酸化的特定方面(包括但不限于电子传递链和ATP合酶)的效应来检测和/或鉴定环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。
进行牵涉氧化磷酸化的过程的线粒体的嵌入膜的蛋白质复合物执行特殊任务并且被编号为I、II、III和IV。这些复合物与跨内膜ATP合酶(也称为复合物V)一起是参与氧化磷酸化过程的至关重要的实体。除了可检查环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)对线粒体总体功能和具体地氧化磷酸化过程的效应的测定法外，可用于检查表观代谢转变剂对与其他复合物分离的单个复合物的效应的测定是可获得的。
复合物I，也称为NADH-辅酶Q氧化还原酶类或NADH脱氢酶是电子传递链中的第一蛋白质。在某些实施方案中，可检测和定量表观代谢转变剂对NAD+的产生的效应。例如，可在96孔板中从样品免疫捕获复合物；NADH至NAD+的氧化与染料分子的还原同时发生，所述染料分子在450nm具有增加的吸光度(复合物I酶活性微量板测定试剂盒，MitoSciences Inc.，Eugene，OR)。
复合物IV，也称为细胞色素c氧化酶(COX)，是电子传递链中的最后一个蛋白质。在某些实施方案中，可检测和定量表观代谢转变剂对细胞色素c的氧化和通过复合物IV进行的氧至水的还原的效应。例如，可在微孔板中免疫捕获COX，利用比色测定法(复合物I酶活性微量板测定试剂盒，MitoSciences Inc.，Eugene，OR)测量COX的氧化。
氧化磷酸化过程中的末端酶为ATP合酶(复合物V)，其使用通过其他复合物产生的质子梯度为从ADP合成ATP提供动力。在某些实施方案中，可检测和定量表观代谢转变剂对ATP合酶的活性的影响。例如，可对已被免疫捕获在微量板孔中的ATP合酶测量ATP合酶的活性和样品中ATP合酶的量。所述酶还可在某些条件下用作ATP酶，从而在该测定中对于ATP合酶活性，通过检测NADH至NAD+的同时氧化测量来测量ATP被还原成ADP的速率。使用针对ATP酶的标记的抗体(ATP合酶双重(活性+数量)微量板测定试剂盒，MitoSciencesInc.，Eugene，OR)计算ATP的量。用于氧化磷酸化的另外的测定包括测试对复合物II和III的活性的影响的测定法。例如，MT-OXCMitoToxTM Complete OXPHOS系统(MitoSciences Inc.，Eugene，OR)可用于评估化合物对复合物II和III以及复合物I、IV和V的效应，以提供关于化合物对整个氧化磷酸化系统的效应的数据。
如上所述，可使用探针就氧耗量和细胞培养基的pH的变化进行完整细胞样品的实时观察。细胞能量的这些测定提供了线粒体功能和潜在的环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)对样品的细胞内的线粒体的活性的影响的全面纵览。
环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)还可影响线粒体透性转变(MPT)，其中线粒体膜因线粒体透性转变孔(MPTP)的形成而经历通透性的增加的现象。线粒体通透性的增加可导致线粒体肿胀，不能进行氧化磷酸化和ATP产生并且导致细胞死亡。MPT可参与细胞凋亡的诱导。(参见，例如，Halestrap，A.P，Biochem.Soc.Trans.34：232-237(2006)和Lena，A.等人Journal of Translational Med.7：13-26(2009)，通过引用将其整体并入本文)。
在某些实施方案中，测量环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)对MPT和MPTP的形成、中止和/或效应的作用的检测和定量。例如，测定法可通过使用专门的染料分子(钙黄绿素)检测MPT，所述MPT位于线粒体的内膜和其他细胞溶胶区室中。另一种分子CoCl2的施用用于猝灭细胞溶胶中的钙黄绿素染料的荧光。然而CoCl2不能进入线粒体的内部，从而除非MPT已发生并且CoCl2可通过MPTP进入线粒体的内部，否则线粒体中的钙黄绿素荧光不被猝灭。线粒体特异性荧光的消失表示MPT已发生。流式细胞术可用于评估细胞和细胞器荧光(MitoProbeTM Transition Pore Assay试剂盒，MolecularProbes，Eugene，OR)。其他测定法利用荧光显微镜评估实验结果(Image-iTTM LIVE线粒体Transition Pore Assay试剂盒，MolecularProbes，Eugene，OR)。
细胞增殖和炎症的测量
在本发明的某些实施方案中，可通过它们对与细胞增殖和/或炎症相关的分子的产生或活性鉴定和评估环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。此类分子包括但不限于细胞因子、生长因子、激素、细胞外基质的成分、趋化因子、神经肽类、神经递质、神经营养素和参与细胞信号转导的其他分子，以及细胞内分子例如参与信号转导的细胞内分子。
血管内皮生长因子(VEGF)是具有有效的血管生成、形成血管和促有丝分裂性质的生长因子。VEGF刺激内皮通透性和肿胀，并且VEGF活性牵涉许多疾病和障碍，包括类风湿性关节炎、转移癌、年龄相关性黄斑退化症和糖尿病视网膜病变。
在本发明的某些实施方案中，可通过其对VEGF的产生的效应来鉴定和表征环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。例如，维持在低氧条件或模拟酸中毒的条件中的细胞可展示增加的VEGF产生。可使用ELISA或其他基于抗体的测定法，利用可获得的抗VEGF抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)测定分泌至培养中的VEGF。在本发明的某些实施方案中，可基于其对细胞对VEGF的反应性的效应和/或基于其对VEGF受体的表达或活性的效应鉴定和/或表征表观代谢转变剂。
健康免疫系统功能以及自身免疫性疾病中所牵涉的肿瘤坏死因子(TNF)是炎症和免疫系统活化的至关重要的介体。在本发明的某些实施方案中，表观代谢转变剂可通过其对TNF的产生或活性的效应来鉴定和表征。例如，可通过ELISA和本领域内已知的其他基于抗体的测定法来定量由培养细胞产生的并且分泌至培养基中的TNF。此外，在某些实施方案中，可通过其对TNF的受体的表达的效应来鉴定和表征环境影响剂(Human TNF RI Duoset，R&D Systems，Minneapolis，MN)。
细胞外基质(ECM)的成分在细胞和组织的结构中和在信号转导过程中起着重要作用。例如，潜在的转化生长因子β结合蛋白为在ECM中产生转化生长因子β(TGFβ)的储库的ECM成分。基质结合的TGFβ随后可在基质重塑过程中被释放并且可对附近的细胞发挥生长因子效应(Dallas，S.Methods in Mol.Biol.139：231-243(2000))。
在某些实施方案中，可通过其对ECM的培养细胞产生的作用鉴定或表征环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。研究者已开发了可籍以研究和定量ECM的细胞产生以及ECM的组成的技术。例如，可通过将在温育之前将细胞包埋在水凝胶中来评估ECM的细胞合成。在细胞收获和水凝胶降解后对由细胞产生的ECM进行生物化学和其他分析(Strehin，I.和Elisseeff，J.Methods in Mol.Bio.522：349-362(2009))。
在某些实施方案中，可鉴定或表征环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)对生物体中ECM或其成分之一的产生、状态或缺乏的效应。已开发了用于产生条件敲除(KO)小鼠的技术，所述技术允许只在不连续类型的细胞中或在发育的某些阶段上敲除特定ECM基因(Brancaccio，M.等人Methods in Mol Bio.522：15-50(2009))。从而可在特定组织中或在发育的特定阶段上评估表观代谢转变剂或潜在的表观代谢转变剂的应用或施用对特定ECM成分的活性或不存在的效应。
质膜完整性和细胞死亡的测量
可通过细胞样品的质膜完整性的变化和/或通过经历细胞凋亡、坏死或显示增加的或减少的细胞死亡概率的细胞变化的细胞数量或百分比的变化鉴定环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。
用于乳酸脱氢酶(LDH)的测定法可提供细胞状态和损伤水平的测量。LDH是稳定的和相对丰富的细胞质酶。当质膜失去物理完整性时，LDH逸出至细胞外区室。更高浓度的LDH与更高水平的质膜损伤和细胞死亡相关。LDH测定法的实例包括使用比色系统检测和定量样品中的LDH水平的测定法，其中四唑盐的还原形式通过LDH酶(QuantiChromTM Lactate Dehydrogenase试剂盒(DLDH-100)，BioAssay Systems，Hayward，CA；LDH Cytotoxicity Detection试剂盒，Clontech，Mountain View，CA)的活性产生。
细胞凋亡是可具有多种不同起始事件的程序化细胞死亡的过程。许多测定法可检测经历细胞凋亡的速度和/或数量的变化。一种用于检测和定量细胞凋亡的测定法是半胱天冬酶(capase)测定法。半胱天冬酶是在细胞凋亡过程中通过蛋白水解切割激活的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。检测激活的半胱天冬酶的测定法的实例包括(OncoImmunin，Inc.，Gaithersburg，MD)和半胱天冬酶
Figure BPA00001497260600402
3/7测定系统(Promega Corp.，Madison，WI)。可检测比较样品中细胞凋亡和经历细胞凋亡的细胞的百分比或数量的变化的另外的测定法包括TUNEL/DNA片段化测定。此类测定检测在细胞凋亡的执行阶段由核酸酶产生的180至200个碱基对的DNA片段。示例性TUNEL/DNA片段化测定包括In Situ Cen Death Detection试剂盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)和DeadEndTM比色及荧光TUNEL系统(Promega Corp.，Madison，WI)。
某些细胞凋亡测定法检测和定量与细胞凋亡和/或非细胞凋亡状态相关的蛋白质。例如，MultiTox-Fluor Multiplex细胞毒性测定法(Promega Corp.，Madison，WI)利用单一底物荧光系统检测和定量特异于活细胞和死亡细胞的蛋白酶，从而提供细胞或组织样品中活细胞对已经历细胞凋亡的细胞的比率。
可获得用于检测和定量细胞凋亡的另外的测定法包括检测细胞通透性的测定法(例如，APOPercentageTM APOPTOSIS测定，Biocolor，UK)和用于钙磷脂结合蛋白V的测定法(例如，Annexin V-BiotinApoptosis Detection试剂盒，BioVision Inc.，Mountain View，CA)。
IV.肿瘤障碍的治疗
本发明提供了治疗或预防人的肿瘤障碍的方法，包括以足以治疗或预防所述肿瘤障碍的量给人施用CoQ10，从而治疗或预防所述肿瘤障碍。
本发明提供了CoQ10组合物和制备所述组合物的方法。优选，所述组合物包含至少约1％至约25％CoQ10w/w。CoQ10可以泛癸利酮(UBIDECARENONE)(USP)形式从Asahi Kasei N&P(Hokkaido，Japan)获得。CoQ10还可以粉剂形式的Kaneka Q10(USPUBIDECARENONE)(Pasadena，Texas，USA)从Kaneka Q10获得。本文中举例说明的方法中使用的CoQ10具有下列特征：残留溶剂满足USP 467要求；水含量低于0.0％、低于0.05％或低于0.2％；炽灼残渣为0.0％，低于0.05％或低于0.2％；重金属含量低于0.002％或低于0.001％；98-100％或99.9％或99.5％的纯度。在下列实施例部分提供了制备组合物的方法。
如本文中所使用的，“肿瘤障碍”是指在人中发现的所有类型的癌症或赘生物或恶性肿瘤，包括但不限于：白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。如本文中所使用的，术语或短语“肿瘤障碍”、“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”可互换使用并且可以以单数或复数形式存在，是指已经历使得它们对于宿主生物体是病理性的恶性转化的细胞。可利用广为接受的技术、特别是组织学检查容易地将原发性肿瘤细胞(即，获自恶性转化位置附近的细胞)与非癌细胞相区别。癌细胞的定义，如本文中所使用的，不仅包括原发性癌细胞，而且还包括癌症干细胞，以及癌症祖细胞或来源于癌症细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞以及来源于癌细胞的体外培养物和细胞系。当提及通常表现为实体瘤的癌症的类型时，“临床上可检测的”肿瘤是在肿瘤团块的基础上可检测的(例如，通过方法例如CAT扫描、MR成像、X-射线、超声或触诊)和/或由于可从患者获得的样品中一个或多个癌症特异性抗原的表达而可被检测的肿瘤。
术语“肉瘤”通常是指由物质如胚性结缔组织组成的和通常由包埋在纤维状或均相物质中的紧密堆积的细胞组成的肿瘤。可利用本发明的环境影响剂治疗的肉瘤包括但不限于例如软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤(melanosarcoma)、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy′s肉瘤、脂肪肉瘤(adipose sarcoma)、脂肪瘤(liposarcoma)、腺泡软组织状肉瘤、成釉细胞肉瘤(ameloblastic sarcoma)、葡萄状肉瘤、绿色瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、肾母细胞瘤(Wilms′tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因肉瘤、筋膜肉瘤、纤维母细胞肉瘤、巨细胞肉瘤(giant cell sarcoma)、粒细胞肉瘤、何杰金氏肉瘤、皮肤特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、晏森肉瘤(Jensen′s sarcoma)、卡波西肉瘤、kupffer细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤(leukosarcoma)、恶性间叶瘤(malignant mesenchymoma sarcoma)、骨周肉瘤(parosteal sarcoma)、网状细胞肉瘤(reticulocytic sarcoma)、劳斯肉瘤(Rous sarcoma)、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛细血管扩张性肉瘤(telangiectaltic sarcoma)。
术语“黑素瘤”被用来表示由皮肤或其他器官的黑素细胞系统引起的肿瘤。可用本发明的环境影响剂治疗的黑素瘤包括但不限于例如肢端黑素瘤(acral-lentiginous melanoma)、无黑色素性黑素瘤(amelanotic melanoma)、良性幼年黑素瘤、克劳德曼黑素瘤(Cloudman′smelanoma)、S91黑素瘤、哈-帕二氏黑素瘤、幼年黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、甲下黑素瘤(subungalmelanoma)和浅表扩散性黑素瘤(superficial spreading melanoma)。
术语“癌”是指由倾向于浸润周围组织并且引起转移的上皮细胞组成的恶性新生物。可利用本发明的环境影响剂治疗的癌包括但不限于例如腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡癌(acinous carcinoma)、囊性腺样癌(adenocystic carcinoma)、腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌(alveolar cell carcinoma)、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinomabasocellulare、)、基底细胞样癌(basaloid carcinoma)、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管原癌(bronchogenic carcinoma)、髓样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶体癌(colloid carcinoma)、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌(carcinoma en cuirasse)、皮肤癌、柱状细胞癌(cylindrical carcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cellcarcinoma)、导管癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、鳞状细胞癌(epiermoidcarcinoma)、腺样基底细胞癌(carcinoma epitheliale adenoides)、外植癌(exophytic carcinoma)、溃疡性癌、硬癌、胶样癌(gelatiniformcarcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cellcarcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、颗粒细胞癌(granulosa cell carcinoma)、发母质癌(hair-matrix carcinoma)、多血癌、肝细胞癌、Hurthle细胞癌、胶样癌(hyaline carcinoma)、hypemephroidcarcinoma、中肾瘤II型(infantile embryonal carcinoma)、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、Krompecher肿瘤、Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌(lipomatous carcinoma)、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、髓样癌(carcinoma molle)、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、克鲁肯伯格瘤(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinomamucosum、)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans)、骨化性癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌、门脉周癌、浸润前癌(preinvasive carcinoma)、鳞状细胞癌、粉刺癌(pultaceous carcinoma)、肾细胞癌、贮备细胞癌、梭形细胞癌(carcinoma sarcomatodes)、Schneider癌、、硬癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌(solanoid carcinoma)、球状细胞癌(spheroidal cell carcinoma)、梭形细胞癌(spindle cell carcinoma)、髓样癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinomatelangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌和绒毛状癌。
一般而言，CoQ10可用于预防性或治疗性治疗任何赘生物。在一个实施方案中，本发明的CoQ10用于治疗实体瘤。在本发明的多个实施方案中，CoQ10用于多种类型的皮肤癌(例如，鳞状细胞癌或基底细胞癌)、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌或骨癌的治疗。在一个实施方案中，CoQ10用于治疗皮肤肿瘤障碍包括但不限于鳞状细胞癌(包括SCCIS(原位)和更具侵袭性的鳞状细胞癌)、基底细胞癌(包括表皮、结节性和浸润性基底细胞癌)、黑素瘤和光线性角化病。然而，使用CoQ10的治疗不限于上述类型的癌症。顺从利用CoQ10的治疗的癌症的实例包括但不限于脑癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、膀胱癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、肉瘤、骨癌、胃癌和髓母细胞瘤。
可利CoQ10治疗的其他癌症包括例如何杰金氏病、非何杰金氏病、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰岛素瘤(malignantpancreatic insulanoma)、恶性类癌(malignant carcinoid)、膀胱癌、恶化前皮肤病损(premalignant skin lesion)、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌(genitourinary tract cancer)、恶性高钙血症(malignant hypercalcemia)、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。在一个实施方案中，可利用CoQ10治疗的肿瘤障碍或癌症不是黑素瘤。
癌细胞的定义，如本文中所使用的，意欲包括通过无氧糖酵解(例如，糖酵解，然后在细胞溶胶中进行乳酸发酵)、有氧糖酵解(例如，糖酵解，然后在线粒体中进行丙酮酸盐的氧化)或无氧糖酵解和有氧糖酵解的组合产生能量的癌细胞。在一个实施方案中，癌细胞主要通过无氧糖酵解产生能量(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的细胞的能量通过无氧糖酵解产生)。在一个实施方案中，癌细胞主要通过有氧糖酵解产生能量(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的细胞的能量通过无氧糖酵解产生)。癌细胞的定义，如本文中所使用的，也意欲包括癌细胞群体或包括通过无氧糖酵解产生能量的细胞和通过有氧糖酵解产生能量的细胞的癌细胞的混合物。在一个实施方案中，癌细胞群体主要包含通过无氧糖酵解产生能量(例如，群体中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的细胞通过无氧糖酵解产生能量)。在一个实施方案中，癌细胞群体主要包含通过有氧糖酵解产生能量的细胞(例如，群体中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的细胞)。
如本文中所使用的，短语“葡萄糖的无氧使用”或“无氧糖酵解”是指细胞通过糖酵解，然后在细胞溶胶中进行乳酸发酵来产生能量。例如，许多癌细胞通过无氧糖酵解产生能量。
如本文中所使用的，短语“有氧糖酵解”或“线粒体氧化磷酸化”是指细胞通过糖酵解，然后在线粒体中进行丙酮酸盐的氧化来产生能量。
如本文中所使用的，短语“能够阻断糖酵解的无氧使用和增加线粒体氧化磷酸化”是指环境影响剂(例如，表观代谢转变剂)诱导细胞的代谢状态从无氧糖酵解至有氧糖酵解或线粒体氧化磷酸化的转变或变化的能力。
在本发明的某些实施方案中，被治疗的肿瘤障碍不是通常通过局部施用而是希望以治疗有效水平全身性递送活性剂来治疗的障碍。如本文中所使用的，短语“通常不通过局部施用治疗的障碍”是指通常或常规地不通过局部施用来利用治疗剂治疗而是通过例如静脉内施用来利用治疗剂治疗的肿瘤障碍。通常不通过局部施用治疗的肿瘤障碍包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌和骨癌。
本发明还提供了用于治疗或预防人的侵袭性肿瘤障碍的方法，所述方法包括以比对于不太具有侵袭性或非侵袭性肿瘤障碍所使用的或选择的给药方案更低的选择的剂量给人施用CoQ10，从而治疗或预防侵袭性肿瘤障碍。在相关方面，本发明提供了用于治疗或预防人的非侵袭性肿瘤障碍，包括以比对于侵袭性肿瘤障碍所使用的或选择的给药方案更高的选择的剂量给人施用环境影响剂，从而治疗或预防非侵袭性肿瘤障碍。
如本文中所使用的，术语“侵袭性肿瘤障碍”是指牵涉快速生长的肿瘤的肿瘤障碍。侵袭性肿瘤障碍通常对治疗性治疗无反应或无明显反应。侵袭性肿瘤障碍的实例包括但不限于胰腺癌、肝细胞癌、尤因肉瘤、转移性乳腺癌、转移性黑素瘤、脑癌(星形细胞瘤，胶质母细胞瘤)，神经内分泌癌、结肠癌、肺癌、骨肉瘤、不依赖于雄激素的前列腺癌、卵巢癌和非何杰金氏淋巴瘤。
如本文中所使用的，术语“非侵袭性肿瘤障碍”是指牵涉缓慢生长的肿瘤的肿瘤障碍。非侵袭性肿瘤障碍通常有利地或适度地对治疗性治疗作出反应。非侵袭性肿瘤障碍的实例包括但不限于非转移性乳腺癌、雄激素依赖性前列腺癌、小细胞肺癌和急性淋巴细胞白血病。在一个实施方案中，非侵袭性肿瘤障碍包括不为侵袭性肿瘤障碍的任何肿瘤障碍。
在一个实施方案中，CoQ10减小肿瘤尺寸，抑制肿瘤生长和/或延长荷瘤受试者的存活时间。因此，本发明还涉及通过给人或动物施用有效的、无毒性的量的CoQ10治疗这样的人或动物的肿瘤的方法。本领域技术人员将能够通过常规实验确定用于治疗恶性肿瘤的CoQ10的有效的、无毒性的量。例如，CoQ10的在治疗上有活性的量可根据因素例如受试者的疾病分期(例如，I期对IV期)、年龄、性别、医学并发症(例如，免疫抑制状态或疾病)和体重以及CoQ10在受试者中引发期望的反应的能力而变化。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可以每天施用几个分份剂量，或可根据治疗状况的紧急性所需要的，按比例减小剂量。
V.肿瘤障碍的治疗靶
本发明提供了用于鉴定肿瘤障碍的治疗靶的方法。本发明还提供了通过此类方法鉴定的治疗靶。治疗靶的鉴定通常包括对一组细胞或细胞系外源施用环境影响剂或候选环境影响剂，和随后评估与对照未处理的细胞相比较对处理的细胞诱导的变化。被监控的诱导的细胞变化包括但不限于对形态学、生理学或组成的改变，例如细胞的RNA、蛋白质、脂质或代谢产物的水平。作为利用候选环境影响剂的治疗的结果的诱导的细胞变化可通过使用本文中描述的任何测定法来监控。例如，可利用实时PCR阵列评估基因表达在mRNA水平上的变化，而基因表达在蛋白质水平上的变化可通过使用抗体微阵列和2-D凝胶电泳来监控。随后使用途径分析(Ingenuity IPA软件)以及通过回顾已知文献从系统生物学角度评估被鉴定为受候选环境影响剂调节(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上)的基因。接着将被鉴定为潜在治疗靶的基因经历验证测定法例如Western印迹分析、siRNA敲低或重组蛋白质的产生和表征方法。随后将筛选测定法用于鉴定靶的调节剂。治疗靶的调节剂用作肿瘤障碍的新型治疗剂。可使用本文中详细描述的筛选测定法或通过使用本领域技术人员已知的常规方法常规地鉴定治疗靶的调节剂。
在本文中被鉴定为被MIM/表观代谢转变剂，CoQ10调节的(例如，在mRNA或蛋白质水平上被上调或下调的)基因是本发明的药物靶。本发明的药物靶包括但不限于随后列于本文中的表1-28(例如，表2-4和6-28)中的基因。基于本文中由申请人描述的实验的结果，受Q10调节的至关重要的蛋白质与包括转录因子、细胞凋亡反应、戊糖磷酸途径、生物合成途径、氧化性应激(促氧化剂)、膜改变和氧化磷酸化代谢的不同途径或分子组相关或可被分类不同途径或分子组。基于本文中提供的结合，如下概述受CoQ10调节的至关重要的蛋白质。受CoQ10调节的并且为转录因子的至关重要的蛋白质为HNF4α。受CoQ10调控并且与细胞凋亡反应相关的至关重要的蛋白质包括Bcl-xl、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA和cMyc。受CoQ10调控并且与戊糖磷酸途径相关的至关重要的蛋白质为转醛醇酶1。受CoQ10调控并且与生物合成途径相关的至关重要的蛋白质包括COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶和4-羟基苯甲酸酯。受CoQ10调控并且与氧化性应激(促氧化剂)相关的至关重要的蛋白质包括中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A和超氧化物歧化酶2(线粒体)。受CoQ10调控并且与氧化磷酸化代谢相关的至关重要的蛋白质包括细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III和复合物IV。受CoQ10直接或间接调控的其他至关重要的蛋白质包括Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C、钙调蛋白激酶II。
因此，在本发明的一个实施方案中，药物靶可包括HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-羟基苯甲酸酯、中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C、钙调蛋白激酶II。在优选实施方案中，药物靶可包括HNF4A、转醛醇酶、NM23和BSCv。在一个实施方案中，所述药物靶为TNF4A。在一个实施方案中，药物靶是转醛醇酶。在一个实施方案中，所述药物靶为NM23。在一个实施方案中，所述药物靶为BSCv。下面描述用于鉴定已鉴定的药物靶的调节剂的筛选测定法。
VI.筛选测定法
本发明还提供了用于鉴定调节剂即调节本发明的已鉴定的治疗靶的表达和/或活性的候选或测试化合物或试剂(例如，蛋白质、肽、肽模拟物、类肽、小分子或其他药物)的方法(在本文中也称为“筛选测定法”)。此类测定法通常包括本发明的治疗靶与一种或多种测定成分之间的反应。其他成分可以是测试化合物本身或测试化合物与本发明的标记物的天然结合伴侣的组合。通过测定法例如本文中描述的测定法鉴定的化合物可以例如对于治疗或预防肿瘤障碍是有用的。
用于本发明的筛选测定法的测试化合物可从任何可获得的来源(包括天然和/或合成化合物的系统文库)获得。还可在本领域内已知的组合文库法中利用许多方法的任何方法获得测试化合物，所述组合文库法包括：生物文库；类肽文库(具有肽的功能性但具有抗酶促降解然而仍保持生物活性的新型非肽主链的分子的文库)；参见，例如，Zuckermann等人，1994，J.Med.Chem.37：2678-85)；空间可寻址的平行固相或液相文库；需要重叠合(deconvolution)的合成文库法；′一珠一化合物′文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。生物学文库和类肽文库法限定于肽文库，然而所述其他4个方法适用于化合物的肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam，1997，Anticancer DrugDes.12：145)。
用于分子文库的合成的方法的实例可见于本领域中，例如见于：DeWitt等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Zuckermann等人(1994)。J.Med.Chem.37：2678；Cho等人(1993)Science 261：1303；Carrell等人(1994)Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.33：2059；Carell等人(1994)Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.33：2061中；和Gallop等人(1994)J.Med.Chem.37：1233中。
化合物的文库存在于溶液中(例如，Houghten，1992，Biotechniques13：412-421)或珠粒(Lam，1991，Nature 354：82-84)、芯片(Fodor，1993，Nature 364：555-556)、细菌和/或孢子(Ladner，USP 5,223,409)、质粒(Cull等人，1992，Proc Natl Acad Sci USA 89：1865-1869)上或噬菌体上(Scott和Smith，1990，Science 249：386-390；Devlin，1990，Science249：404-406；Cwirla等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382；Felici，1991，J.Mol.Biol.222：301-310；Ladner，同上)。
本发明的筛选方法包括将细胞与测试化合物接触和测定所述测试化合物调节本发明的治疗靶在细胞中的表达和/或活性的能力。本发明的治疗靶的表达和/或活性可如本文中所描述的进行测定。本发明的治疗靶的表达和/或活性还可利用使用本领域技术人员已知的常规方法来测定。在一个实施方案中，基于其增加本发明的治疗靶的表达和/或活性的能力筛选化合物。在一个实施方案中，基于其增加选自表1-28(例如，表2-4和6-28)中所列的蛋白质的治疗靶的表达和/或活性的能力选择化合物，其中所述治疗靶被CoQ10上调(例如，展示正倍数改变)。在一个实施方案中，基于其减少本发明的治疗靶的表达和/或活性的能力选择化合物。在一个实施方案中，基于其减少选自表1-28(例如，表2-4和6-28)中所列的蛋白质的治疗靶的表达和/或活性的能力选择化合物，其中所述治疗靶被CoQ10下调(例如，展示负倍数改变)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于筛选为本发明的治疗靶或其生物活性部分的底物的候选或测试化合物的测定法。在另一个实施方案中，本发明提供了用于筛选结合本发明的治疗靶或其生物活性部分的候选或测试化合物的测定法。测定测试化合物直接结合治疗靶的能力可以例如通过将所述化合物与放射性同位素或酶促标记偶联(以便化合物与药物靶的结合可通过检测复合物中标记的标记化合物来测定)来实现。例如，可直接或间接地用131I、125I、35S、14C或3H标记化合物(例如，标记底物)，并且通过射电辐射(radioemission)的直接计数或通过闪烁计数检测放射性同位素。可选择地，可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶酶促标记测定成分，并且通过测定适当的底物至产物的转化来检测所述酶促标记。
本发明还涉及通过上述筛选测定法鉴定的新型试剂。因此，进一步在适当的动物模型中使用本文中描述的鉴定的试剂在本发明的范围内。例如，可将能够调节本文中描述的鉴定的本发明的标记的表达和/或活性的试剂用于动物模型以测定利用这样的试剂进行的治疗的功效、毒性或副作用。可选地，可将本文中描述的鉴定的试剂用于动物模型以确定这样的试剂的作用机制。此外，本发明涉及通过上述筛选测定法鉴定的新型试剂用于上述治疗的用途。
VII.药物组合物和药物施用
本发明提供了包含CoQ10的组合物。可将CoQ10整合入适合用于给受试者施用的药物组合物中。通常，所述药物组合物包含CoQ10和药学上可接受的载体。如本文中所使用的，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等的一种或多种以及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可接受的载体还可包含少量辅助物质例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，所述辅助物质增强环境影响剂的贮存期(shelf life)或功效。
本发明的组合物可以以多种形式存在。此类形式包括例如液体、半固体和固体剂型例如液体溶液(例如，可注射和不溶性溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、乳膏剂、洗剂、搽剂、软膏剂或糊剂、用于给眼、耳或鼻施用的滴剂、脂质体和栓剂。优选形式取决于所需的施用模式和治疗应用。
可通过本领域内已知的多种方法施用CoQ10。对于许多治疗应用，优选施用途径/模式是局部皮下注射、静脉内注射或输注。正如本领域技术人员所理解的，施用的途径和/或模式可取决于所需结果而变化。在某些实施方案中，可用将保护化合物避免快速释放的载体制备所述活性化合物，例如控制释放制剂，包括埋植剂、皮肤贴剂和微型胶囊化的递送系统。可使用生物可降解的、生物相容性聚合物例如乙烯-醋酸乙烯聚合物、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯类和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利或通常对于本领域技术人员来说是已知的。参见，例如，Sustained和Controlled Release DrugDelivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。在一个实施方案中，施用模式是胃肠外途径(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个实施方案中，通过静脉内输注或注射施用环境影响剂。在另一个实施方案中，通过肌内或皮下注射施用环境影响剂。在优选实施方案中，局部施用环境影响剂。
治疗组合物通常在制造和贮存条件下必须是无菌且稳定的。可将组合物配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。可通过将活性化合物(即，环境影响剂)以所需量与上文中列举的成分之一或组合一起掺入适当的溶剂中，根据需要然后过滤灭菌来制备无菌可注射液。通常，通过将活性化合物掺入包含基本分散介质和来自上文中列举的成分的所需其他成分的媒介物来制备分散体。在用于制备无菌可注射液的无菌冻干粉剂的情况下，优选制备方法是真空干燥法和喷雾干燥法，所述干燥法产生活性成分加来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外所需成分的粉剂。溶液的适当流动性可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，通过维持所需颗粒大小(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持。可注射组合物的延长的吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸酯和明胶来产生。
技术和制剂通常可见于雷明顿药物科学(Remmington′sPharmaceutical Sciences)，Meade Publishing Co.，Easton，Pa。对于全身性施用，注射是优选的，包括肌内、静脉内、腹膜内和皮下注射。为了进行注射，可将本发明的化合物配制于液体溶液中，优选生理上相容的缓冲液例如Hank′s液或林格氏液中。此外，可以以固体形式配制化合物，在临用前将其重新溶解或悬浮。也包括冻干形式。
为了口服施用，所述药物组合物可采取例如片剂或胶囊剂的形式，所述片剂或胶囊剂可通过常规方法利用药学上可接受的赋形剂例如粘合剂(例如，预胶化玉蜀黍淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)或湿润剂(例如，月桂基硫酸钠)制备。可利用本领域内公知的方法包被片剂。用于口服施用的液体制剂可采取例如溶液、糖浆剂或悬浮剂的形式，或它们可以以干燥产品(在使用前用水或其他适当的媒介物构建)形式提供。此类液体制剂可通过常规方法利用药学上可接受的添加剂例如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆剂、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如，ationd油、油酯、乙醇或分级分离的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯丙酸或山梨酸)来制备。必要时所述制剂还可包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
可适当地配制用于口服施用的制剂以提供活性化合物的控制释放。为了颊部给药，所述组合物可采取以常规方式配制的片剂或锭剂形式。为了通过吸入施用，可以通过使用适当的喷射剂例如二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当的气体，以气雾喷雾呈递的形式从加压包装或雾化器方便地递送根据本发明使用的化合物。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门以递送按计量的量来确定单位剂量。可配制例如用于吸入器或吹入器的明胶的胶囊和药筒(cartridge)，其包含化合物和适当的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
可配制化合物以用于通过注射，例如通过单次快速静脉注射(bolus injection)或连续输注进行胃肠外施用。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如，存在于加入了防腐剂的安瓿中或多剂量容器中。所述组合物可采取这样的形式如油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可包含配方剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选择，所述活性成分可以以粉剂形式存在，在使用前利用适当的媒介物例如无菌无热原水构建。
还可将组合物配制在直肠组合物例如栓剂或保留灌肠剂(例如包含常规栓剂基质，例如可可脂或其他甘油酯)中。
除了先前描述的制剂外，还可将所述化合物配制为贮库制剂。这样的长效制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此，例如，可用适当的聚合物或疏水物质(例如以可接受的油中的乳液形式)或离子交换树脂(或以微溶的衍生物形式例如以微溶的盐形式)配制所述化合物。
全身性施用也可以是透粘膜或经皮肤方式。为了进行透粘膜或经皮肤施用，将适合于待穿过的屏障的穿透剂用于制剂。此类穿透剂在本领域内通常是已知的，包括例如用于透粘膜施用的胆汁盐和夫西地酸衍生物，此外可使用去垢剂来促进渗透。透粘膜施用可以通过鼻腔喷雾或使用栓剂进行。为了进行局部施用，将本发明的化合物配制在如本领域内通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶或软膏剂中。可局部使用洗涤液以治疗损伤或炎症，从而加速愈合。
如果需要，可将组合物置于可包含一个或多个含有所述活性剂的单位剂型的包装或分配器装置中。所述包装可以例如包含金属或塑料箔例如泡罩包装。包装和分配器装置可附带施用说明书。
对于包括核酸的施用的治疗，可配制本发明的化合物以用于多种施用模式包括全身性和局部或局域施用。技术和配制通常可见于雷明顿药物科学，Meade Publishing Co.，Easton，Pa中。为了全身性施用，注射是优选的，包括肌内、静脉内、腹膜内、结内和皮下施用。为了进行注射，可将本发明的化合物配制于液体溶液，优选生理上相容的缓冲液例如例如Hank′s液或林格氏液中。此外，可以以固体形式配制组合物，在临用时将其再溶解或悬浮。还包括冻干形式。
在本发明的优选实施方案中，局部施用包含CoQ10的组合物。优选以药物制剂的形式提供活性成分即CoQ10。对于局部施用，活性成分可在终产品中包含按制剂的重量计算约0.001％至约20％w/w的制剂，虽然其可包含多至30％w/w，优选约1％至约20％w/w的制剂。本发明的局部制剂由此包含活性剂与一种或多种可接受的载体以及任选地任何其他治疗成分。载体在与制剂的其他成分相容的意义上应当是“可接受的”并且对其受者是无害的。
在治疗展示目的障碍的患者中，施用治疗有效量的试剂例如此类试剂。治疗有效剂量是指导致患者的症状的改善或存活的延长的化合物的量。
此类化合物的毒性和治疗功效可在细胞培养物或实验动物中利用例如用于测定LD50(对于50％的群体致死的剂量)和ED50(对于50％的群体治疗上有效的剂量)的标准制药方法(pharmaceutical procedure)来测定。毒效应与治疗效应之间的剂量比为治疗指数并且其可表示为比率LD50/ED50。展示大治疗指数的化合物是优选的。获自此类细胞培养测定和动物研究的数据可用于配制多种用于人的剂量。此类化合物的剂量优选在循环浓度的范围内，包括几乎不具有或不具有毒性的ED50。取决于使用的剂量形式和使用的施用途径，剂量可在该范围内变化。
对于本发明的方法中所使用的任何化合物，可根据细胞培养测定初步估计治疗有效量。例如，可在动物模型中配制剂量以获得包含如在细胞培养中测定的IC50的循环血浆浓度范围。这样的信息可用于更精确地确定在人中有用的剂量。可以例如利用HPLC测量血浆中的水平。
可根据患者的状况由个别医生选择确切的制剂、施用途径和剂量。(参见例如Fingl等人，在The Pharmacological Basis ofTherapeutics，1975，Ch.1p.1中)。应当指出，主治医生知道如何和何时因毒性或因器官功能障碍而结束、中止或调整施用。相反地，如果临床反应不充分(排除毒性)，主治医生也知道如何毒性将治疗调整至更高的水平。在目标肿瘤障碍治疗中施用的剂量的量可视待治疗的状况的严重度和施用途径而变化。可以例如部分地利用标准预后评估方法来评估状况的严重度。此外，剂量和可能的给药频率也可根据个别患者的年龄、体重和反应而变化。与上面论述的程序相当的程序也可用于兽医学。
取决于将治疗的具体状况，可配制此类试剂和全身性或局部施用此类试剂。用于配制和施用的技术可见于雷明顿药物科学，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1990)中。适当的途径可包括口服、经直肠、经皮肤、经阴道、经粘膜或经肠施用；胃肠外递送，包括肌内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射，仅举几例。
可以以任何适当的制剂给受试者施用上述组合物。除了利用CoQ10的局部制剂治疗肿瘤障碍外，在本发明的其他方面，可利用其他方法递送CoQ10。例如，可配制用于胃肠外递送例如用于皮下、静脉内、肌内或瘤内注射的CoQ10。可使用通过充满组合物的装置递送例如脂质体递送或扩散的其他方法。可以以单次快速浓注、多次注射或通过连续输注(例如，静脉内或通过腹膜透析)施用组合物。为了进行胃肠外施用，优选以无菌无热原形式配制组合物。还可通过将组合物简单地加入其中包含细胞的液体来给细胞体外施用本发明的组合物(例如，以诱导体外培养物中癌细胞的细胞凋亡)。
为了进行注射，可将本发明的试剂配制于水溶液中，优选生理上相容的缓冲液例如Hanks′s液、林格氏液或生理盐水缓冲液中。为了进行这样的透粘膜施用，将适合于待穿过的屏障碍的穿透剂用于制剂中。此类穿透剂在本领域内通常是已知的。
药学上可接受的载体用于将本文中公开的用于实施本发明的化合物配制成适合于全身性施用的药剂(dosage)的用途在本发明的范围内。通过适当选择载体和适当的生产实践，可胃肠外例如通过静脉内施用本发明的组合物，特别地配制为溶液的那些组合物。可利用本领域内公知的药学上可接受的载体将化合物配制成适合用于口服施用的药剂。此类载体使得能够将本发明的化合物配制为片剂、丸剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆体、混悬剂等以用于待治疗的患者口服摄入。
意欲细胞内施用的试剂可使用本领域技术人员公知的技术来施用。例如，可将此类试剂封装在脂质体内，随后如下所述进行施用。脂质体是具有水性内部的球状脂双层。可将在脂质体形成时存在于水溶液中的所有分子掺入水性内部。脂质体内容物被保护免受外部微环境的破坏并且，因为脂质体与细胞膜融合，从而所述内容物被有效地递送进入细胞的细胞质。此外，由于它们的疏水性，可直接细胞内递送小有机分子。
适合用于本发明的药物组合物包括其中以有效地获得其期望的目的的量包含活性成分的组合物。特别地根据本文中提供的详细公开内容，有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内。除了活性成分外，此类药物组合物可包含含有赋形剂和辅助剂的适当的药学上可接受的载体，所述赋形剂和辅助剂促进活性化合物加工成可药用的制剂。经配制用于口服施用的制剂可以以片剂、糖丸、胶囊剂或溶液的形式存在。本发明的药物组合物可以以本身已知的方式例如通过常规混合、溶解、制粒、制备糖丸、悬浮(levitating)、乳化、封装、捕获或冻干法来制备。
适合用于局部施用的制剂包括适合用于穿过皮肤至需要治疗的位置的液体或半液体制剂，例如搽剂、洗剂、乳膏剂或糊剂以及适合给眼、耳或鼻施用的滴剂。根据本发明的滴剂可包含无菌水性或油性溶液或悬浮液并且可通过将活性成分溶解在杀菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其他适当的防腐剂的适当水溶液(优选包含表面活性剂)中来制备。随后可澄清所得的溶液，过滤灭菌，利用无菌技术转移至容器中。适合用于包含在滴剂中的杀菌剂和杀真菌剂的实例为硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和醋酸氯己定(0.01％)。用于制备油性溶液的适当溶剂包括甘油、稀醇和丙二醇。
根据本发明的洗剂包括适合用于皮肤或眼睛的洗剂。洗眼剂可包含任选地含有杀菌剂的无菌水溶液并且可通过与用于制备滴剂的方法相似的方法制备。用于皮肤的洗剂或搽剂还可包含促进干燥和使皮肤凉爽的试剂，例如醇或丙酮，和/或增湿剂例如甘油或油例如蓖麻油或花生油。
根据本发明的乳膏剂、软膏剂或糊剂是用于外敷的活性成分的半固体制剂。可通过借助于适当的机器，将以细末或粉末形式存在的活性成分单独地或于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液中与油脂性或非油脂性基质混合来制备它们。所述基质可包含烃类例如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂；胶浆剂；天然来源的油例如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或与醇例如丙二醇或大粒凝胶一起的脂肪酸例如硬脂酸或油酸。所述制剂可包含任何适当的表面活性剂例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂例如脱水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。还可包括悬浮剂例如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料例如二氧化硅硅酸盐(silicaceous silicas)和其他成分例如羊毛脂。
胃肠外施用的药物制剂包括以水溶性形式存在的活性化合物的水溶液。此外，可将活性化合物的悬浮液制备为适当的油状注射悬浮液。适当的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油或合成脂肪酸酯类例如油酸乙酯或甘油三酯类，或脂质体。水性注射悬浮液可包含增加悬浮液的粘度的物质例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可包含适当的稳定剂或增加化合物的稳定性以允许制备高浓缩液的试剂。
可通过将活性化合物与固体赋形剂组合，任选地研磨所得的混合物，和需要时在加入适当的辅助物质后，加工颗粒的混合物以获得片剂或锭剂核心来获得用于口服施用的药物制剂。适当的赋形剂具体地为填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。
提供具有适当包衣的糖丸核心。为此，可使用浓缩糖溶液，其可任选地包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、卡波普和/或二氧化钛、漆溶液(lacquer solution)和适当的有机溶液或溶剂混合物。可将染料或色素加入片剂或糖丸包衣以标识或表征活性化合物剂剂量的不同组成。
可口服施用的药物制剂包括由明胶制备的推入配合(push-fit)胶囊以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨醇制备的软密封胶囊。推入配合胶囊可包含与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可将活性化合物溶解或悬浮于适当的液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可加入稳定剂。
如果需要，组合物可包含缓冲系统。选择缓冲系统以在所需的范围内维持或缓冲组合物的pH。如本文中所使用的术语“缓冲系统”或“缓冲剂”是这样的溶质试剂，所述试剂，当存在于水溶液中时，当向其中加入酸或碱时稳定该溶液抵抗pH(或氢离子浓度或活性)的较大变化。溶质试剂或因此而负责在上文中指定的范围内的起始缓冲pH值的pH的抵抗或变化的试剂是公知的。虽然存在不计其数的适当缓冲剂，但磷酸钾一水合物是优选缓冲剂。
药物组合物的终pH值可在生理相容性范围内变化。必要时，终pH值是不刺激人皮肤并且优选以便促进活性化合物即CoQ10的经皮肤运输的pH值。不违反该限制，可选择pH以提高CoQ10化合物的稳定性和需要时调节稠度。在一个实施方案中，优选pH值为约3.0至约7.4，更优选约3.0至约6.5，最优选约3.5至约6.0。
对于优选局部递送媒介物，组合物的其余成分是水，其必需是纯化的，例如，去离子水。此类递送媒介组合物包含在超过约50％至约95％(基于组合物的总重量)的范围的水。然而，水存在的具体量不是至关重要的，可调整其含量以获得其他成分的所需粘度(通常约50cps至约10,000cps)和/或浓度。局部递送媒介物优选具有至少约30厘泊的粘度。
其他已知的经皮肤的透皮吸收促进剂还可用于促进CoQ10的递送。实例为亚砜类例如二甲基亚砜(DMSO)等；环酰胺例如1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮(Azone.TM.，Nelson Research，Inc.的注册商标)等；酰胺例如N，N-二甲基乙酰胺(DMA)N，N-二乙基甲苯酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基辛酰胺、N，N-二甲基十二酰胺等；吡咯烷酮衍生物例如N-甲基-2-吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、2-吡咯烷酮-5-羧酸、N-(2-羟乙基)-2-吡咯烷酮或其脂肪酸酯、1-月桂基-4-甲氧基羰基-2-吡咯烷酮、N-牛脂烷基吡咯烷酮等；多元醇例如丙二醇、乙二醇、聚乙二醇、双丙二醇、甘油、己三醇等；线性和支链脂肪酸例如油酸、亚油酸、月桂酸、缬草酸、庚酸、己酸、肉豆蔻酸、异戊酸、新戊酸、三甲基己酸、异硬脂酸等；醇类例如乙醇、丙醇、丁醇、辛醇、油醇、硬脂醇、亚油醇等；阴离子表面活性剂例如月桂酸钠、十二烷基硫酸钠等；阳离子表面活性剂例如苯扎氯铵、十二烷基三甲基氯化铵、溴化十六烷基三甲铵等；非离子表面活性剂例如丙氧基化聚氧乙烯醚、例如，泊洛沙姆231、泊洛沙姆182、泊洛沙姆184等、乙氧基化脂肪酸、例如，Tween 20、Myjr 45等，脱水山梨糖醇衍生物例如，Tween 40、Tween 60、Tween 80、Span 60等、乙氧基化醇，例如，聚氧乙烯(4)月桂基醚(Brij 30)、聚氧乙烯(2)油醇醚(Brij 93)等、卵磷脂和卵磷脂衍生物等；萜类例如D-柠檬烯、α-蒎烯、β-蒈烯、α-松油醇、葛缕醇、香芹酮、薄荷酮、氧化柠檬烯、α-蒎烷氧化物、桉叶油等。还适合作为透皮吸收促进剂的是有机酸和酯例如水杨酸、水杨酸甲酯、柠檬酸、琥珀酸等。
在一个实施方案中，本发明提供了CoQ10组合物和制备所述组合物的方法。优选，所述组合物包含至少约1％至约25％CoQ10w/w。CoQ10可以泛癸利酮(UBIDECARENONE)(USP)形式从Asahi KaseiN&P(Hokkaido，Japan)获得。CoQ10还可以粉剂形式的KanekaQ10(USP UBIDECARENONE)(Pasadena，Texas，USA)从Kaneka Q10获得。本文中举例说明的方法中使用的CoQ10具有下列特征：残留溶剂满足USP 467要求；水含量低于0.0％、低于0.05％或低于0.2％；炽灼残渣为0.0％，低于0.05％或低于0.2％；重金属含量低于0.002％或低于0.001％；98-100％或99.9％或99.5％的纯度。在下列实施例部分提供了制备组合物的方法。
在本发明的某些实施方案中，提供了通过给人局部施用辅酶Q10(以便治疗或预防发生)来治疗或预防人的肿瘤障碍的方法，其中给所述人施用局部剂量的局部媒介物中的辅酶Q10，其中以约0.01至约0.5毫克的辅酶Q10/平方厘米的皮肤的范围给靶组织施用辅酶Q10。在一个实施方案中，以约0.09至约0.15mg CoQ10/平方厘米的皮肤的范围给靶组织施用辅酶Q10。在多个实施方案中，以约0.001至约5.0、约0.005至约1.0、约0.005至约0.5、约0.01至约0.5、约0.025至约0.5、约0.05至约0.4、约0.05至约0.30、约0.10至约0.25或约0.10至0.20mg CoQ10/平方厘米的皮肤的范围给靶组织施用辅酶Q10。在其他实施方案中，以约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5mgCoQ10/平方厘米的皮肤的剂量给靶组织施用辅酶Q10。在一个实施方案中，以约0.12mg CoQ10/平方厘米的皮肤的剂量给靶组织施用辅酶Q10。应当理解，具有这些值的任一个作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如，约0.03至约0.12，约0.05至约0.15，约0.1至约0.20或约0.32至约0.49mg CoQ10/平方厘米的皮肤。
在本发明的另一个实施方案中，以0.5至10毫克的CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量以CoQ10乳膏的形式施用辅酶Q10，其中所述CoQ10乳膏包含1至5％的辅酶Q10。在一个实施方案中，所述CoQ10乳膏包含约3％的辅酶Q10。在其他实施方案中，所述CoQ10乳膏包含约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％的辅酶Q10。在多个实施方案中，以约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10毫克的CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量施用所述CoQ10乳膏。应当理解，以这些值的任一个作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如，约0.5至约5.0，约1.5至2.5或约2.5至5.5mg CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤。
在另一个实施方案中，以3至5毫克CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量以CoQ10乳膏的形式施用所述辅酶Q10，其中所述CoQ10乳膏包含1至5％的辅酶Q10。在一个实施方案中，所述CoQ10乳膏包含约3％的辅酶Q10。在其他实施方案中，所述CoQ10乳膏包含约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％的辅酶Q10。在多个实施方案中，以约3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0毫克CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量施用所述CoQ10乳膏。应当理解，以这些值的任一个作为上限或下限的范围也意欲为本发明的部分，例如，约3.0至约4.0，约3.3至5.3或约4.5至4.9mg CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤。
本发明的某些方面提供了用于通过给人局部施用辅酶Q10(以便治疗或预防发生)来治疗或预防肿瘤障碍的方法，其中每24小时1次或多次局部施用所述辅酶Q10，进行6周或更长时间。
本发明的某些方面提供了用于制备辅酶Q10乳膏3％的方法，所述方法包括制备A、B、C、D及E相和组合所有相以便形成3％CoQ10乳膏的水包油乳剂的步骤。
在某些实施方案中，本文中公开的MIMS和表观代谢转变剂包括常规用作食品补充剂的MIMS和表观代谢转变剂。在某些实施方案中，本文中公开的此类MIMS和/或表观代谢转变剂为药物级的。在某些实施方案中，药物级的MIMS和/或表观代谢转变剂具有约95％至约100％的纯度并且包括95％与100％之间的所有值。在某些实施方案中，MIMS和/或表观代谢转变剂之间的纯度为95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.9或100％。在某些实施方案中，MIMS和/或表观代谢转变剂不含或基本上不含内毒素。在其他实施方案中，MIMS和/或表观代谢转变剂不含内毒素(end toxin)。在其他实施方案中，MIMS和/或表观代谢转变剂不含外源蛋白质材料。在某些实施方案中，MIMS和/或表观代谢转变剂为CoQ10。
在某些实施方案中，A相成分包含4.00％w/w的烷基C12-15苯甲酸盐NF、2.00％w/w的鲸蜡醇NF、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯/PEG-100和1.5％w/w的硬脂醇，而B相成分包括5.00％w/w的二甘醇单乙醚NF、2.00％w/w的甘油USP、1.50％w/w的丙二醇USP、0.475％w/w的苯氧乙醇NF、16.725％w/w的纯化水USP和40.00％w/w的卡波姆分散体2％，C相成分包括0.50％w/w的乳酸USP、2.00％w/w的乳酸钠溶液USP、1.30％w/w的三乙醇胺NF和2.50％w/w的纯化水USP。此外，在这些实施方案中，D相成分包括1.00％w/w的二氧化钛USP，而E相成分包括15％w/w的CoQ10 21％浓缩物。
在某些其他实施方案中，A相成分包括4.00％w/w的辛酸/癸酸甘油三酯、2.00％w/w的鲸蜡醇NF、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯/PEG-100和1.5％w/w的硬脂醇，而B相成分包括5.00％w/w的二甘醇单乙醚NF、2.00％w/w的甘油USP、1.50％w/w的丙二醇USP、0.475％w/w的苯氧乙醇NF、16.725％w/w的纯化水USP和40.00％w/w的卡波姆分散体2％，C相成分包括0.50％w/w的乳酸USP、2.00％w/w的乳酸钠溶液USP、1.30％w/w的三乙醇胺NF和2.50％w/w的纯化水USP。此外在这些实施方案中，D相成分包括1.00％w/w的二氧化钛USP，而E相成分包括15％w/w的CoQ10 21％浓缩物。
在本发明的某些实施方案中，提供了用于制备辅酶Q10乳膏3％的方法，所述方法包括步骤：(1)向适当的容器中加入A相成分并且在水浴中加热至70-80℃；(2)向适当的容器中加入B相成分(不包括卡波姆分散体)并且混合以形成混合B相；(3)将E相成分加入适当的容器并且利用水浴在50-60℃下熔化以形成熔化的E相；(4)向搅拌罐中加入卡波姆分散体，并且在搅拌下加热至70-80℃；(5)向搅拌罐中加入混合物B相同时将温度维持在70-80℃；(6)向搅拌罐中加入C相成分同时将温度维持在70-80℃；(7)向搅拌罐中加入D相成分，随后继续混合和匀化搅拌罐的内容物；然后(8)停止匀化并且将搅拌罐的内容物冷却至50-60℃；随后(9)中止混合，向搅拌罐中加入熔化的E相以形成分散体；(10)随后重新开始混合直至分散体变得光滑和均匀；随后(11)将搅拌罐的内容物冷却至45-50℃。
在本发明的某些其他实施方案中，提供了包含CoQ10乳膏3％的药物组合物。所述乳膏包含具有4.00％w/w组合物的C12-15烷基苯甲酸盐、2.00％w/w组合物的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100的A相；具有2.00％w/w的甘油、1.5％w/w的丙二醇、5.000％w/w的乙氧基二甘醇、0.475％w/w的苯氧乙醇、40.00％w/w的卡波姆分散体、16.725％w/w的纯化水的B相；具有1.300％w/w的三乙醇胺、0.500％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液和2.5％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有1.5000％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。在某些实施方案中，卡波姆分散体包括水、苯氧乙醇、丙二醇和卡波姆940。
在本发明的某些实施方案中，提供了包含CoQ10乳膏3％的药物组合物。所述乳膏包含具有具有4.00％w/w组合物的辛酸/癸酸甘油三酯、2.00％w/w组合物的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100的A相；具有2.00％w/w的甘油、1.5％w/w的丙二醇、5.0％w/w的乙氧基二甘醇、0.475％w/w的苯氧乙醇、40.00％w/w的卡波姆分散体、16.725％w/w的纯化水的B相；具有1.300％w/w的三乙醇胺、0.500％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液、2.5％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有15.000％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。在某些实施方案中，卡波姆分散体包括水、苯氧乙醇、丙二醇和卡波姆940。
在本发明的某些其他实施方案中，提供了包含1.5％的CoQ10乳膏的药物组合物。所述乳膏包括具有5.000％w/w的C12-15烷基苯甲酸盐、2.000％w/w的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.500％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100硬脂酸酯的A相；具有2.000％w/w的甘油、1.750％w/w的丙二醇、5.000％w/w的乙氧基二甘醇、0.463％w/w的苯氧乙醇、50％w/w的卡波姆分散体和11.377％w/w的纯化水的B相；具有1.3％w/w的三乙醇胺、0.400％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液和4.210％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有1.500％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。
在本发明的某些其他实施方中，提供了包含1.5％的CoQ10乳膏的药物组合物。所述乳膏包含具有5.000％w/w的辛酸/癸酸甘油三酯、2.000％w/w的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.500％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100硬脂酸酯的A相；具有2.000％w/w的甘油、1.750％w/w的丙二醇、5.000％w/w的乙氧基二甘醇、0.463％w/w的苯氧乙醇、50％w/w的卡波姆分散体和11.377％w/w的纯水的B相；具有1.3％w/w的三乙醇胺、0.400％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液和4.210％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有1.500％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。在某些实施方案中，卡波姆分散体包含水、苯氧乙醇和丙二醇。
1.联合治疗
在某些实施方案中，CoQ10和/或其药物组合物可用于使用至少一种其他治疗剂的联合治疗。CoQ10和/或其药物组合物和其他治疗剂可累加地或更优选协同地作用。在一个实施方案中，将CoQ10和/或其药物组合物与另一种治疗剂的施用同时施用。在另一个实施方案中，在施用另一种治疗剂之前或之后，施用化合物和/或其药物组合物。
在一个实施方案中，本发明的治疗方法包括另外的试剂。例如，在一个实施方案中，用于本发明的治疗方法的另外试剂为化学治疗剂。
化学治疗剂通常属于不同种类，包括例如：1.拓扑异构酶II抑制剂(细胞毒性抗生素类)，例如蒽环类/蒽二酮(anthracenediones)，例如，多柔比星、表柔比星、伊达比星和奈莫柔比星，蒽醌类，例如，米托蒽醌和洛索蒽醌以及鬼臼毒素，例如，依托泊甙和替尼泊甙；2.影响微管形成的试剂(有丝分裂抑制剂)，例如植物生物碱(例如，属于碱家族的化合物，来源于植物的具有生物活性和细胞毒性的含氮分子)，例如，紫杉烷类，例如，紫杉醇和多西他赛、以及长春花生物碱(vinka alkaloid)例如长春碱、长春新碱和长春瑞滨以及鬼臼毒素的衍生物；3.烷化剂例如氮芥、乙烯亚胺化合物、烷基磺酸盐(alkylsulphonates)和具有烷化作用的其他化合物例如亚硝基脲、达卡巴嗪、环磷酰胺、异环磷酰胺和美法仑；4.抗代谢药(核苷抑制剂)例如，叶酸类，例如叶酸、氟嘧啶(fiuropyrimidine)、嘌呤或嘧啶类似物例如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、甲氨蝶呤和依达曲沙；5.拓扑异构酶I抑制剂，例如托泊替康、伊立替康和9-硝基喜树碱及喜树碱衍生物；和6.铂化合物/复合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂。用于本发明的方法的示例性化学治疗剂包括但不限于阿米福汀(氨磷汀)、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)(氮芥)、链脲佐菌素、环磷酰胺、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、多柔比星脂质体(doxil)、吉西他滨(健择(gemzar))、柔红霉素、柔红霉素脂质体(daunoxome)、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊甙、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇(泰素)、多西他赛(泰素帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT-I1、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、达卡巴嗪、S-I卡培他滨、替加氟、5′脱氧氟尿嘧啶、UFT、恩尿嘧啶(eniluracil)、脱氧胞苷、5-氮杂胞嘧啶、5-氮杂脱氧胞嘧啶、别嘌醇、2-氯腺苷、三甲曲沙、氨基蝶呤、亚甲基-10-脱氮氨基喋呤(MDAM)、奥沙利铂(oxaplatin)、皮卡铂(picoplatin)、四铂(tetraplatin)、沙铂(satraplatin)、铂-DACH、奥马铂、CI-973、JM-216及其类似物、表柔比星、磷酸依托泊苷、9-氨基喜树碱、10，11-亚甲基二氧基喜树碱、karenitecin、9-硝基喜树碱、TAS 103、长春地辛、L-苯丙氨酸氮芥、异环磷酰胺(ifosphamide)、马磷酰胺(mefosphamide)、培磷酰胺、氯乙环磷酰胺、卡莫司汀、司莫司汀、埃博霉素(epothilones)A-E、雷替曲塞、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、安吖啶、磷酸依托泊苷、karenitecin、阿昔洛韦(acyclovir)、伐昔洛韦(valacyclovir)、更昔洛韦、金刚烷胺、金刚乙胺、拉米夫定、齐多夫定、贝伐单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、喷司他丁、三甲曲沙、克拉屈滨、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、伊立替康、米托蒽醌、托泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链脲佐菌素、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替哌、乌拉莫司汀(uracil mustard)、长春瑞滨、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、多柔比星、紫杉醇(泰素)和博来霉素及其组合，基于对于特定肿瘤或癌症的适当护理标准，所述化学治疗剂对于本领域技术人员来说是显而易见的。
在另一个实施方案中，用于本发明的组合治疗的另外的试剂是生物制剂。
生物试剂(也称为生物制剂)是生物系统例如生物体、细胞或重组系统的产物。此类生物制剂的实例包括核酸分子(例如，反义核酸分子)、干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、抗体，例如，单克隆抗体，抗血管生成试剂和细胞因子。在下面更详细地论述了示例性生物制剂，其通常属于不同种类，包括例如：1.激素、激素类似物和激素复合物例如雌激素和雌激素类似物、黄体酮、黄体酮类似物和孕激素、雄激素、肾上腺皮质类固醇、抗雌激素药、抗雄激素、抗睾酮、肾上腺类固醇(adrenal steroid)抑制剂以及抗促黄体生成激素；和2.酶、蛋白质、肽、多克隆和/或单克隆抗体例如白细胞介素、干扰素、集落刺激因子等。
在一个实施方案中，生物制剂是干扰素。干扰素(IFN)是一种天然存在于体内的生物制剂。也可在实验室中产生干扰素并且将其在生物治疗中提供给癌症患者。已显示它们改善癌症患者的免疫系统抗癌细胞的方式。
干扰素可直接作用于癌细胞以减缓它们的生长，或它们可引起癌细胞改变成具有更正常行为的细胞。某些干扰素还可刺激天然杀伤细胞(NK)细胞、T细胞和巨噬细胞，所述细胞是在血流中帮助抵抗癌细胞的白细胞的类型。
在一个实施方案中，生物制剂是白细胞介素。白细胞介素(IL)刺激许多免疫细胞的生长和活性。它们是天然存在于体内但也可在实验室中制造的蛋白质(细胞因子和趋化因子)。
某些白细胞介素刺激免疫细胞例如淋巴细胞的生长或活性，所述免疫细胞破坏癌细胞。
在另一个实施方案中，生物制剂是集落刺激因子。
集落刺激因子(CSF)是提供给患者以促进骨髓内的干细胞产生更多血细胞的蛋白质。身体一直需要新的白细胞、红细胞和血小板，特别是当癌症存在时。将CSF与化学疗法一起提供以帮助加强免疫系统。当癌症患者接受化学疗法时，骨髓产生新血细胞的能力被抑制，从而使得患者更易于发生感染。部分免疫系统在无血细胞的情况下不能发挥功能，从而集落刺激因子促进骨髓干细胞产生白细胞、血小板和红细胞。
由于适当的细胞产生，其他癌症治疗可继续使得患者能够完全接受更高剂量的化学疗法。
在另一个实施方案中，生物制剂是抗体。抗体例如单克隆抗体是实验室中产生的结合癌细胞的试剂。
当将癌症破坏剂引进体内时，它们搜出抗体并且杀伤癌细胞。单克隆抗体试剂不破坏健康细胞。单克隆抗体通过多个机制获得它们的治疗效应。它们可在产生细胞凋亡或程序化细胞死亡中具有直接效应。它们可阻断生长因子受体，有效地阻止肿瘤细胞的增殖。在表达单克隆抗体的肿瘤细胞中，它们可产生抗独特型抗体。
可用于本发明的联合治疗的抗体的实例包括抗CD20抗体，例如但不限于西妥昔单抗、托西莫单抗、利妥昔单抗和替伊莫单抗。还可将抗HER2抗体与环境影响剂组合用于治疗癌症。在一个实施方案中，抗HER2抗体是曲妥珠单抗(赫赛汀)。可与环境影响剂组合用于治疗癌症的抗体的其他实例包括抗CD52抗体(例如，阿仑珠单抗)，抗CD-22抗体(例如，依帕珠单抗)和抗CD33抗体(例如，吉妥珠单抗奥佐米星)。还可将抗VEGF抗体与环境影响剂组合用于治疗癌症。在一个实施方案中，抗VEGF抗体是贝伐单抗。在其他实施方案中，生物制剂是作为抗EGFR抗体的抗体，例如，西妥昔单抗。另一个实例是抗糖蛋白17-1A抗体依决洛单抗。
在另一个实施方案中，生物制剂是细胞因子。细胞因子治疗利用蛋白质(细胞因子)帮助受试者的免疫系统识别和破坏为癌性的那些细胞。细胞因子在体内由免疫系统天然地产生，但也可在实验室中产生。该疗法用于晚期黑素瘤和与辅助治疗(主癌症治疗之后或除了主癌症治疗以外提供的治疗)一起使用。细胞因子疗法到达身体的所有部分以杀伤癌细胞并且阻止肿瘤不断生长。
在另一个实施方案中，生物制剂是融合蛋白。例如，重组人Apo2L/TRAIL(Genentech)可用于联合治疗。Apo2/TRAIL是第一个被设计用以激活促细胞凋亡受体DR4和DR5的双重促细胞凋亡受体激动剂，其参与细胞凋亡(程序化细胞死亡)的调控。
在一个实施方案中，生物制剂是反义核酸分子。
如本文中所使用的，“反义”核酸包含与编码蛋白质的“有义”核酸互补，例如与双链cDNA分子的编码链互补，与mRNA序列互补或与基因的编码链互补的核苷酸序列。因此，反义核酸可以与有义核酸氢键合。
在一个实施方案中，生物制剂为例如促进血管生成的分子例如bFGF、VEGF和EGFR的siRNA分子。在一个实施方案中，抑制血管生成的生物制剂介导RNAi。RNA干扰(RNAi)是使用双链RNA(dsRNA)降解包含与dsRNA相同的序列的信使RNA(mRNA)的转录后靶向基因沉默技术(Sharp，P.A.和Zamore，P.D.287，2431-2432(2000)；Zamore，P.D.等人Cell 101，25-33(2000)。Tuschl，T.等人Genes Dev.13，3191-3197(1999)；Cottrell TR和Doering TL.2003.Trends Microbiol.11：37-43；Bushman F.2003.MoI Therapy.7：9-10；McManus MT和Sharp PA.2002.Nat Rev Genet.3.737-47)。当内源核糖核酸酶将更长的dsRNA切割成更短的例如21-或22-个核苷酸长的RNA(称为小干扰RNA或siRNA)时该过程发生。随后更小的RNA区段介导靶mRNA的降解。用于RNAi合成的试剂盒可从例如New England Biolabs或Ambion商购获得。在一个实施方案中，用于反义RNA的一种或多种化学药品可用于介导RNAi的分子。
反义核酸下调特定蛋白质在细胞中的表达的用途在本领域内是公知的(参见例如，Weintraub，H.等人，Antisense RNA as a moleculartool for genetic analysis，Reviews-Trends in Genetics，第1卷(1)1986；Askari，F.K.和McDonnell，W.M.(1996)N.Eng.J.Med.334：316-318；Bennett，M.R.和Schwartz，S.M.(1995)Circulation 92：1981-1993；Mercola，D.和Cohen，J.S.(1995)Cancer Gene Ther.2：47-59；Rossi，JJ.(1995)Br.Med.Bull.51.217-225；Wagner，R.W.(1994)Nature372：333-335)。反义核酸分子包含与另一个核酸分子的编码链(例如，mRNA序列)互补，从而能够与另一个核酸分子的编码链氢键合的核苷酸序列。与mRNA的序列互补的反义序列可与mRNA的编码区、mRNA的5′或3′翻译区或桥连编码区与非翻译区的区域(例如，在5′非翻译区与编码区的连接处)中发现的序列互补。此外，反义核酸在序列上可与编码mRNA的基因的调控区例如转录起始序列或调控元件互补。优选，设计反义核酸以使其与编码链上起始密码子之前的区域或覆盖密码子的区域或mRNA的3′非翻译区中的区域互补。
给定促进血管生成的分子的编码链序列，可根据沃尔森和克里克碱基配对法则设计本发明的反义核酸。反义核酸分子可与mRNA的完整编码区互补，但更优选是只与所述mRNA的编码或非编码区的部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可与围绕mRNA的翻译起始位点的区域互补。反义寡核苷酸在长度上可以例如为约5，10，15，20，25，30，35，40，45或50个核苷酸。
可利用本领域内已知的方法，使用化学合成和酶促连接反应构建本发明的反义核酸。例如，可使用天然存在的核苷酸或经设计用以增加分子的稳定性或增加反义与有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸化学合成反义核酸(例如，反义寡核苷酸)，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的经修饰的核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、假尿苷、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(V)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。为了抑制细胞中的表达，可使用一种或多种反义寡核苷酸。可选择地，可使用已以反义定向(即，从插入的核酸转录的RNA相对目的靶核酸呈反义定向，在下面分部分中进一步描述)亚克隆核酸的表达载体生物学地产生反义核酸)。
在另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子为a-异头物核酸分子。a-异头物核酸分子与互补RNA形成特定双链杂交体，在所述双链杂交体中，与常见的a-单位相反，所述链彼此平行(Gaultier等人(1987)Nucleic Acids.Res.15：6625-6641)。反义核酸分子还可包含2′-o-甲基核醣核苷酸(Inoue等人(1987)Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人(1987)FEBS Lett.215：327-330)。
在另一个实施方案中，本发明的反义核酸是介导RNAi的化合物。RNA干扰剂包括但不限于核酸分子，包括与靶基因或基因组序列同源的RNA分子、″短干扰RNA″(siRNA)、″短发夹″或″小发夹RNA″(shRNA)以及通过RNA干扰(RNAi)干扰或抑制靶基因的表达的小分子。RNA干扰是使用双链RNA(dsRNA)降解包含与所述dsRNA相同的序列的信使RNA(mRNA)的转录后靶向基因沉默技术(Sharp，P.A.和Zamore，P.D.287，2431-2432(2000)；Zamore，P.D.等人Cell 101，25-33(2000)。Tuschl，T.等人Genes Dev.13，3191-3197(1999))。当内源核酸酶将更长的dsRNA切割成更短的21或22个核苷酸长的RNA(称为小干扰RNA或siRNA)时，该过程发生。随后更小的RNA区段介导靶mRNA的降解。用于RNAi的合成的试剂盒可从例如NewEngland Biolabs和Ambion商购获得。在一个实施方案中，可使用一种或多种上述用于反义RNA的化学药品。
可将编码例如抑制血管生成的分子的核酸分子以适合于在受试者的细胞中表达编码的蛋白质的形式引入受试者，其也可用于本发明的方法。抑制血管生成的示例性分子包括但不限于TSP-I、TSP-2、IFN-g、IFN-a、血管他丁、内皮他丁、tumastatin、canstatin、VEGI、PEDF、vasohibin和催乳素2-甲氧基雌二醇的16kDa片段(关于综述，参见，Kerbel(2004)J.Clin Invest 114：884)。
例如，使用标准分子生物学技术将全长或部分cDNA序列克隆入重组表达载体并且将所述载体转染进入细胞。可以例如通过使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增或通过筛选适当的cDNA文库来获得cDNA。cDNA的核苷酸序列可用于设计允许利用标准PCR法扩增cDNA的PCR引物或用于设计可用于使用标准杂交法筛选cDNA文库的杂交探针。在分离或扩增cDNA后，将所述DNA片段引入适当的表达载体。
用于本发明的方法的示例性生物制剂包括但不限于吉非替尼(易瑞沙)、阿那曲唑、己烯雌酚、雌二醇、倍美力、雷洛昔芬、黄体酮、异炔诺酮、炔孕酮(esthisterone)、dimesthisterone、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、炔诺酮、甲睾酮、睾酮、地塞米松(dexamthasone)、泼尼松、皮质醇(Cortisol)、甲强龙(solumedrol)、他莫昔芬、氟维司群、托瑞米芬、氨鲁米特、睾内酯、屈洛昔芬)、阿那曲唑、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、戈舍瑞林、氟他胺、亮丙瑞林、曲普瑞林、氨鲁米特、米托坦、戈舍瑞林、西妥昔单抗、厄洛替尼(erlotinib)、伊马替尼、托西莫单抗、阿仑珠单抗(Alemtuzumab)、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、替伊莫单抗、贝伐珠单抗、地尼白介素2(Denileukin diftitox)、达克珠单抗、干扰素α、干扰素β、抗4-1BB、抗4-lBBL、抗CD40、抗CD 154、抗OX40、抗OX40L、抗CD28、抗CD80、抗CD86、抗CD70、抗CD27、抗HVEM、抗LIGHT、抗GITR、抗GITRL、抗CTLA-4、可溶性OX40L、可溶性4-IBBL、可溶性CD154、可溶性GITRL、可溶性LIGHT、可溶性CD70、可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CTLA4-Ig、和其组合，基于针对特定肿瘤或癌症的适当的护理标准，所述生物制剂对于本领域技术人员来说是显而易见的。可通过将试剂与例如Ig-Fc区域有效连接来将所述试剂的可溶性形式制备为例如融合蛋白。
应当指出，可将超过一种另外的试剂例如1、2、3、4、5种试剂与CoQ10组合施用。例如，在一个实施方案中，可将两种化学治疗剂与CoQ10组合施用。在另一个实施方案中，可施用化学治疗剂、生物制剂和CoQ10。
可使用生物制剂的不同形式。此类形式包括但不限于这样的形式如形式原(proform)分子、不带电荷的分子、分子复合物、盐、醚、酯、酰胺等，当被植入、注射或以其它形式插入肿瘤中时，所述形式被生物激活。
本发明通过下列实施例进一步举例说明，所述实施例不应当解释为限制。在整个本申请中引用的所有参考资料和公布的专利和专利申请的内容通过引用并入本文。
发明实施例
实施例1：CoQ10被鉴定为MIM
为了将CoQ10评估为潜在MIM，向一组细胞系(包括癌细胞系和正常对照细胞系)中外源加入以氧化形式存在的CoQ10，然后评估诱导的组中每一个细胞系的细胞微环境特征谱的变化。评估细胞形态学/生理学以及细胞组成(包括mRNA和蛋白质水平)的变化，并且比较患病细胞相对于正常细胞的所述变化。这些实验的结果将CoQ10，特别是CoQ10的氧化形式鉴定为MIM。
在第一组实验中，通过检查细胞对CoQ10的敏感性和细胞凋亡反应来评估细胞形态学/生理学的变化。用不同水平的辅酶Q10处理一组皮肤细胞系，包括对照细胞系(解质细胞和黑素细胞的原代培养物)和几个皮肤癌细胞系(SK-MEL-28，非转移性皮肤黑素瘤；SK-MEL-2，转移性皮肤黑素瘤；或SCC，鳞状细胞癌；PaCa2，胰腺癌细胞系；或HEP-G2，肝癌细胞系)。这些实验的结果显示癌细胞系展示了与对照细胞系相比较改变的剂量依赖性反应，只在癌细胞中诱导了细胞凋亡和细胞死亡。示例性实验详细地描述于下面的实施例3中。
然后使用测定评估用CoQ10处理后的细胞的组成的变化。使用实时PCR阵列法在mRNA水平上分析基因表达的变化。在下面的实施例6和9-13中详细描述了示例性实验。在互补实验中，通过使用抗体微阵列法、双向凝胶电泳，然后使用质谱表征法进行的蛋白质鉴定，以及通过western印迹分析法来在蛋白质水平上分析基因表达的变化。示例性实验分别在下面详细地描述于实施例4、7和8中。这些测定的结果显示在被检查的细胞系中mRNA和蛋白质水平上的基因表达的变化因CoQ10的氧化形式的加入而被诱导。发现被CoQ10处理调节的基因集簇在几个细胞途径中，包括细胞凋亡、癌生物学和细胞生长、糖酵解和代谢、分子运输和细胞信号转导。
进行实验以确认CoQ10进入细胞并且测定存在于细胞中的CoQ10的水平和形式。具体地，通过分析来自用CoQ10处理的细胞的富集线粒体的制剂来测定存在于线粒体中的辅酶Q10的水平以及CoQ10的形式(即氧化的或还原的)。对于外源Q10的添加，存在于线粒体中的辅酶Q10的水平被确认以时间和剂量依赖性的方式增加。在令人惊讶和意外的结果中，CoQ10经确定主要以氧化形式存在于线粒体中。此外，通过使用2-D凝胶电泳和利用质谱表征的蛋白质鉴定来分析来自富集线粒体的样品的蛋白质的水平的变化。这些实验的结果显示在检查的时间过程中线粒体中的CoQ10的氧化形式的水平与许多细胞变化相关，如由与代谢和细胞凋亡途径相关的特定蛋白质的mRNA和蛋白质水平的调节所证明的。示例性实验详细地描述于下面实施例5中。
由本申请人描述的结果将内源分子CoQ10，具体地CoQ10的氧化形式鉴定为MIM。例如，所述结果将CoQ10鉴定为MIM，因为观察到CoQ10在mRNA和蛋白质水平上都诱导基因表达的变化。所述结果将CoQ10鉴定为具有多维特征，因为CoQ10诱导了疾病状态(例如，癌症)相对于正常(例如，非癌)状态的细胞形态学/生理学和细胞组成(例如，mRNA和蛋白质水平上的基因表达的差异变化)的差异变化。此外，所述结果将CoQ10鉴定为具有多维特征，因为CoQ10能够进入细胞，从而展示治疗和载体效应。
实施例2：用于鉴定肿瘤障碍的疾病相关进程和生物标志的方法
根据其中用目的分子处理细胞系的基于细胞的测定，利用mRNA阵列、蛋白质抗体阵列和2D凝胶电泳评估处理的细胞对未处理的细胞的差异。利用途径分析(Ingenuity IPA软件)和已知文献的综述从系统生物学角度评估受MIM或表观代谢转变剂调节的通过比较样品分析鉴定的蛋白质。将被鉴定为潜在治疗剂或生物标记靶的蛋白质经历确认测定例如Western印迹分析、siRNA敲低或重组蛋白质产生和表达法。
用于实施例3-8的材料和方法
辅酶Q10原液
如下制备500μM辅酶Q10(5％异丙醇于细胞生长培养基中)。每一次都新配制10mL 500μM辅酶Q10原液。分子量：863.34
(0.0005mol/L)(0.010L)(863.34g/mol)＝0.004317g
为了制备10mL 500μM原液，称取4.32mg辅酶Q10置于15mLfalcon管中，加入500μL异丙醇。在50-60℃水浴中温热溶液，同时涡旋以完全溶解。向该溶液中加入9.5mL培养基(在其中培养细胞的相同培养基)。
细胞培养
细胞获自美国典型培养物保藏中心或Gibco。将细胞培养在补充有5％胎牛血清、0.25ug/mL两性霉素，100ug/mL链霉素和100UmL-1青霉素的DMEM/F-12培养基中。将细胞在37℃下维持在95％空气和5％CO2的大气中。
辅酶Q10处理和总蛋白质分离
在接触Q10之前使细胞生长至85％的汇合。利用Q10将补充的培养基条件化至50和100微摩尔浓度。以一式三份用对照、50μM Q10和100kμM Q10处理培养瓶。在4、8、12和24小时后从处理的培养瓶和对照培养瓶分离蛋白质。为了分离蛋白质，用5mL pH为7.4的冰冷PBS洗涤细胞3次。随后将细胞刮入3mL PBS中，通过离心沉淀，重悬浮于pH 7.4的裂解缓冲液(80mM TRIS-HCl，1％SDS，具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中。使用BCA法定量蛋白质浓度。
细胞系
繁殖下面所列的细胞系，建立每一个细胞系的细胞库。大规模产生用于不同测定的细胞，收获材料以进行分析。一般而言，当不需要细胞特异性培养基来维持细胞系时，用于细胞生长的培养基是具有5％血清的DMEMF-12。在破裂之前通常使细胞生长至75-80％汇合(清楚的间隔)，将其用于细胞测定，进行标准操作方法。建立用于实验的下列细胞系：
SK-MEL-28(非转移性皮肤黑素瘤)
SK-MEL-2(转移性皮肤黑素瘤)
HEKa(角质细胞，皮肤对照)
HEMa(黑素细胞，皮肤对照)
nFIB(新生成纤维细胞)
HEP-G2(肝癌)[SBH细胞系]
SkBr-3(Her2过表达的乳腺癌)
MCF-7(乳腺癌，p53突变)
PC-3(前列腺癌)[SBH细胞系]
SkBr-3(人乳腺腺癌)
NCI-ES-0808
SCC(鳞状细胞癌)
PaCa-2
NIH-3T3
细胞培养：
细胞获自美国典型培养物保藏中心或Gibco。将细胞培养在补充有5％胎牛血清、0.25ug/mL两性霉素、100ug/mL链霉素和100UmL-1青霉素的DMEM/F-12培养基中。将细胞在37℃下维持在95％空气和5％CO2的大气中。
在具有Glutamax(Invitrogen，Carlsbad CA)的补充有5％FBS、两性霉素和青霉素/链霉素的DMEM/F12中培养和维持皮肤恶性黑素瘤SK-MEL28细胞。将细胞于37℃、5％CO2下进行培养。另外的细胞系和生长条件的细节概述于下表中。
表1.就对Q10的敏感性分析的细胞系
Figure BPA00001497260600791
SKMEL28细胞的Q10治疗：
用100μM Q1或对照媒介物处理SK-MEL28细胞。如下配制Q10。在15mL加帽的试管中，转移4.32mg Q10(由Cytotech提供)，随后通过加入500μL异丙醇将其溶解。将所得的溶液在65℃水浴中加温，以高速涡旋。通过加入平衡的细胞培养基将Q10/异丙醇溶液变成10mL的体积。随后涡旋原液以确保Q10的最大溶解度。稀释原液(2mL原液用8mL培养基)以获得100μM Q10的终浓度。对于对照媒介物，将9.5mL的培养基加入500μL的异丙醇。用8mL培养基进一步稀释对照原液(2mL的原液)。在处理开始后第6、16、24、48或72小时收获细胞。
SCC细胞的Q10处理：
利用100μM Q10(如上所述制备的)处理SCC细胞6小时或24小时。对照细胞是未处理的细胞。在处理后不同的时间点收获和沉淀细胞，快速冷冻沉淀，于-80℃下贮存直至如下所述在XTAL下分离RNA。
RNA分离：
按照制造商的说明书利用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia CA)在不同的处理时间上裂解细胞以进行RNA分离。通过测量260nm处的光密度定量RNA。
第一链合成：
按照制造商的说明书利用RT2 First Strand Synthesis试剂盒(SABiosciences.，Frederick MD)从1μg总RNA合成第一链cDNA。
实时PCR：
用水稀释来自第一链合成的产物，将其与SYBR green mastermix(SABiosciences.，Frederick MD)混合，加载至PCR阵列上。在Biorad CFX96上于PCR阵列(细胞凋亡阵列、糖尿病阵列、氧化性应激和抗氧化剂防御阵列和热激蛋白阵列)(SABiosciences，FrederickMD)上进行实时PCR。
利用用于细胞凋亡的连接蛋白测定法测定细胞系对辅酶Q10的 敏感性：
在24小时的辅酶Q10处理后定量早期和晚期细胞凋亡中的细胞的百分比。早期和晚期细胞凋亡用作理解不同癌细胞系对辅酶Q10的敏感性的差异的标志。所测试的不同细胞系为PaCa2、HepG2、PC-3、SKBr3、MCF-7和SK-MEL28。使细胞在96孔板中粘着过夜。用对照媒介物、50μM Q10或100μM辅酶Q10处理这些细胞。24小时后，在PCA96流式细胞仪(Guava Technologies，Hayward，CA)上估计凋亡细胞的存在。此外，用4μM星状孢子素处理一些细胞2小时作为细胞凋亡的阳性对照。首先用PBS洗涤细胞，然后用50μLAccumax(Innovative Cell Technologies，San Diego，CA)在室温下解离细胞。通过加入含有1％Pluronic F-68(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的培养基终止解离。随后向每一个孔中加入100μL连接蛋白试剂(Guava Technologies，Hayward，CA)。在于黑暗中温育20分钟后，在低结合板中进行测定以使细胞对底物的再附着减少至最低程度。连接蛋白试剂包含两种染料。检测细胞外表面上的磷脂酰丝氨酸的膜联蛋白-V-PE；早期凋亡细胞的特征。第二染料7-AAD只渗透晚期凋亡细胞，然而被从活(健康)和早期凋亡细胞排出。使用Cytosoft 2.5.7软件(Guava Technologies，Hayward，CA)测定4个细胞群体：活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和碎片的百分比。
免疫印迹分析
通过免疫印迹分析测定每样品约50μg的蛋白质。在有对照的情况下，以一式三份进行所有处理。将蛋白质在12％TRIS-HCl凝胶上进行分离，通过电泳转移至硝酸纤维素膜上，使用5％牛奶和TBST溶液进行封闭，然后用一抗温育。将一抗在4℃下于5％BSA和TBST溶液中温育过夜。将二抗在4℃下温育1小时。所有抗体购自CellSignaling Technology。除β肌动蛋白以1∶5000的比率使用外，以1∶1000的比率使用抗体。使印迹显影，利用基于NIH Java的密度计分析软件Image J定量结果。还探测所有印迹，并且针对它们各自的β肌动蛋白的表达进行标准化。
双向电泳
在等电聚焦(IEF)之前，将样品溶解在40mM Tris、7M脲、2M硫脲和1％C7两性离子去污剂中，用三丁基膦还原，用10mM丙烯酰胺在室温下烷基化90分钟。之后，利用至少3倍体积的重悬浮缓冲液(由7M脲，2M硫脲和2％CHAPS组成)使样品通过10-kDa截断值的Amicon Ultra装置以减少样品的电导率。将100微克蛋白质在11-em pH3至10，pH4至7或pH6至11的固定pH梯度胶条(GE，Amersham，USA)上经历IEF至100,000伏小时。在IEF后，将固定DH梯度胶条于6M脲、2％SDS、50mM Tris-醋酸盐缓冲液、pH 7.0和0.01％溴酚蓝中进行平衡，然后在8至16％Tris-HCl Precast凝胶、1mm(Bio-Rad，USA)上经历SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。以一式三份进行凝胶电泳。将它们固定，于SYPRO Ruby，80mL/凝胶(InVitrogen，USA)中染色，在Fuji FLA-5100激光扫描仪上成像或转移至PVDF膜上。
获得对照样品的其他信息以通过使用方法测试蛋白质鉴定的效用，所述方法利用dPC(Protein Forest Inc.)选择性pI分级分离，然后对dPC plug进行胰蛋白酶降解，利用质谱法进行鉴定和半定量(Nanomate或LC/LTQ/MS)。利用对照样品进行的dPC分析证明了其在鉴定一大亚组蛋白质中的效用。将在研究过程中产生的物质归档以便将来需要出现时它们可用作来源。
2D凝胶成像分析：
使用Progenesis Discovery和Pro(Nonlinear Dynamics Inc.，Newcastle upon Tyne，UK)进行所有凝胶成像的分析。在点检测、匹配、本底扣除、标准化和滤过后，输出SYPRO Ruby凝胶图像的数据。在Progenesis Discovery中使用学生t检验进行组之间的成对比较以鉴定其表达被显著改变的点(p＞0.05)。
抗体阵列：
利用抗体微阵列(Panorama XP725抗体阵列，Sigma)筛选700多种蛋白质抗体以评估Q10处理的细胞(SK-MEL-28，SCC)中蛋白质浓度水平的变化。当蛋白质被点在载玻片上的相应抗体结合时，蛋白质在细胞提取物中的表达获得检测。在结合之前，将用于荧光可视化和定量分析的荧光染料直接标记蛋白质。将所述阵列用于比较两个样品(测试样品对参照样品)的蛋白质表达特征谱，每一个样品用不同的CyDye(Cy3或Cy5)标记，将两个样品以相同的蛋白质浓度同时用于阵列上。随后在相应于样品的染料标记的波长上分别记录每一个样品的荧光信号强度，然后比较所述荧光信号强度。
高剂量的辅酶Q10在培养的SKMEL-28细胞中调节细胞凋亡、糖尿病和氧化性应激途径中牵涉的基因的表达。
实验内容：SKMEL-28细胞(ATCC目录号HTB-72)是培养在含有Glutamax(Invitrogen Cat#10565-042)的补充有5％FBS、青霉素、链霉素和两性霉素的DMEM-F12中的非转移性皮肤黑素瘤细胞，利用媒介物或100uM辅酶Q10处理，进行不同的时间量。使用实时PCR阵列(细胞凋亡目录号PAHS-12，糖尿病目录号PAHS-023和氧化性应邀目录号PAHS-065)(SABiosciences，Fredenck，MD)定量辅酶Q10处理后基因表达的任何变化。
通过将4.32mg溶解在500ul异丙醇中来制备500uM辅酶Q10的原液浓度，随后通过加入培养基将其进一步稀释。交替涡旋和加热至65℃，溶解辅酶Q10。用培养基将2mL原液稀释至10mL以获得含有100uM Q10的培养基，将其用于处理细胞。利用相似的方案(除不加入辅酶Q10外)平行制备媒介物。
将SKMEL-28细胞以1×105个细胞/孔的密度涂铺在6孔板中。24小时后，当细胞已附着并且处于50％汇合时，加入所述媒介物或100uM Q10。在Q10处理后第16、24、48或72小时收获细胞，而媒介物处理的细胞在24小时后收获。按照制造商的说明书，利用RNeasyMini试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia CA Cat#74104)试剂盒，使用离心柱(spin column)和柱上DNA酶处理(on-column DNase treatment)在不同的处理时间上裂解细胞以进行RNA分离。通过测量RNA 260nm处的吸光度定量RNA。
按照制造商的推荐，利用具有基因组DNA消除步骤的RT2 FirstStrand Synthesis试剂盒(SABiosciences.，Fredenck MD Cat#C-03)，将0.4-1ug总RNA用作模板，通过第一链cDNA合成来进行实时PCR。用水稀释来自第一链合成的产物，将其与SYBR green mastermix(SABiosciences.，Frederick MD Cat#PA-010-12)混合，加载至PCR阵列上，所述阵列包含用于共同途径中关联的84个不同基因、用于标准化的5个管家基因、逆转录和PCR对照的引物测定。在BioradCfx96上进行实时PCR。利用热启动激活酶来起始扩增，然后进行40个循环(每个循环：95℃-15秒变性步骤和60℃-1分钟退火和延伸步骤)，然后进行解链曲线程序。在excel电子表格中组织Ct值，来自PCR热循环仪的所有处理组的输出，将其加载至可在http://www.Sabiosciences.Com/pcr/arrayanalysis.php上获得的比较分析软件。
富集线粒体的样品的纯化：
实验内容：通过洗涤和刮取从T160培养瓶收获用100μM Q10处理24或48小时的SKMEL-28，NCI-ES0808和NIH-3T3细胞连同在t＝0时收获的细胞。将细胞离心，沉淀，快速冷冻并且于-80℃下贮存直至分离线粒体。将细胞解冻，重悬浮并且于杜恩斯匀浆器中进行破碎。将匀浆离心，使用由用于培养细胞的线粒体分离试剂盒(MitoSciences，Eugene OR，Cat#MS852)推荐的试剂和方案分离线粒体。将线粒体级分等分并且于-80℃贮存。
辅酶Q10和泛醇-10定量法：
基于最近公布的方法(Ruiz-Jimenez，2007，J.Chromatogr.A，1175，242-248)通过使用在阳离子模式中利用电喷射离子化(ESI)的LC-MS/MS执行用于同时测定辅酶Q10(Q10)和还原形式泛醇-10(Q10H2)的方法。Q10和Q10H2的高选择性鉴定和灵敏性定量连同其他选择的脂质的鉴定是可能的。将来自用100μM Q10处理的SK-MEL-28的富集线粒体的样品的等分经历常规预处理，所述预处理基于蛋白质沉淀(100μL于300μL的1-丙醇中超声处理的压紧细胞)、液体-液体提取(向上清液中加入100μL水并且用200μL正己烷提取X3)、蒸发混合的己烷提取物至干燥和于50μL的95∶5甲醇/己烷(v/v)中重建。在利用Prism RP 1 X 100mm、5μM粒度的柱子的WatersQuattro II三重四极杆质谱仪上(Keystone Scientific)通过LC-MS/MS进行分析。以50μL/分钟的流速用4mM的20％异丙醇80％甲醇中的甲酸铵进行等度洗脱。每一个样品注射10μL。使用m/z882.7＞197.00(Q10H2)和m/z 880.80＞197.00(Q10)的跃迁(transition)，利用为40的锥孔电压和为30的碰撞能量进行MRM分析。
实施例3：细胞系对CoQ10的敏感性
在24小时的施用后，通过使用包含两种染料7AAD和膜联蛋白-V-PE的组合的试剂(连接蛋白试剂)测试许多细胞系对Q10的敏感性。7AAD染料经透性化细胞膜进入细胞；主要是处于细胞凋亡后期的那些细胞。膜联蛋白-V-PE是结合在早期凋亡细胞的质膜的外表面上表达的磷脂酰丝氨酸的染料。因此连接蛋白试剂可在流式细胞仪中用于区分不同凋亡细胞群体。
在24小时的Q10施用后，对于50μM Q10和100μM Q10，PaCa2细胞都显示早期和晚期凋亡细胞(5-10％的门控细胞)的增加。对于50μM和100μM Q10，PC-3细胞也显示早期和晚期凋亡群体的增加，虽然当与PaCa2细胞比较时，增加较少。对于50μM和100μM Q10，MCF-7和SK-MEL28细胞只显示早期凋亡群体的增加。HepG2细胞也对50μM Q10处理敏感，其中在晚期细胞凋亡和早期细胞凋亡阶段存在约20％的门控群体的增加。SKBr3是对于50μM和100μM Q10处理未显示早期和晚期细胞凋亡的任何显著增加的唯一测试的细胞系。结果描述于图1-6中。
为了提供Q10处理引起HepG2肝癌细胞的细胞凋亡反应的其他信息，使用测量单链DNA的基于ApoStrandTM ELISA的方法评估第二细胞凋亡测定。ApoStrandTM ELISA基于凋亡细胞中DNA对甲酰胺变性的敏感性和利用针对单链DNA(ssDNA)的单克隆抗体对变性DNA的检测。利用50和100μM Q10对肝癌细胞系HepG2的处理导致可检测的细胞凋亡，分别具有17％和32％的剂量反应(图7)。这些结果与Q10诱导来自其他组织的其他癌细胞系(例如，SCC、SKMEL-28、MCF-7和PC-3)的细胞凋亡的观察相符。
实施例4：利用Q10处理的细胞的蛋白质组学分析
使用蛋白质组学方法分析利用Q10处理的样品的细胞沉淀。裂解和处理细胞沉淀以用于2-D凝胶和Western印迹分析。利用Q10处理3个细胞类型(SKMEL-28、SCC和nFib)，将其经历利用2-D凝胶电脉进行的蛋白质组学表征。
利用Q10处理的SKMEL-28细胞的蛋白质组学分析
利用Western印迹和2-D凝胶电泳处理和评估的第一实验组是皮肤癌细胞系SKMEL-28。该实验组包括在第3、6、12和24小时用0、50或100μM Q10处理的SK-MEL-28细胞。
将一组Q10处理的SK-MEL-28样品经历2-D凝胶电泳(图8)并且进行分析以鉴定相对于对照样品蛋白质水平的变化。进行跨全部24块凝胶的943个点的比较分析，将对照样品与全部处理的样品相比较。分析包括鉴定因增加、减少或翻译后修饰而在时间过程中产生的点变化。
分析发现32个统计上显著的差异点变化。根据该分析，切取20个非冗余点并且通过胰蛋白酶消化和质谱表征进行蛋白质鉴定。利用Mascot和MSRAT软件分析针对蛋白质数据库搜索已表征的肽以鉴定蛋白(表2)。
表2.SKMEL-28细胞中经鉴定具有对Q10处理的差异反应的蛋白质
Figure BPA00001497260600871
Figure BPA00001497260600881
本实验的重要发现是转醛醇酶1的减少，这支持Q10通过改变癌细胞内的代谢状态起作用的假定。转醛醇酶1是戊糖磷酸途径(也称为单磷酸己糖支路)中的酶。转醛醇酶(EC：2.2.1.2)催化三碳酮醇单位从7-磷酸景天庚酮糖至甘油醛3-磷酸酯的可逆转移以形成赤鲜糖-4-磷酸和果糖-6-磷酸。该酶与转酮醇酶一起提供了糖酵解与戊糖磷酸途径之间的联系。这与核苷酸和NADPH合成，促进生物合成反应的还原当量的产生和还原环境的维持。
最近的出版物(Basta，P.等人August 2008，Cancer DetectPrevention，32，200-208)提供了转醛醇酶的遗传多态性的证据并且将其与头颈部鳞状细胞癌相联系。另一个相关出版物(Qian，Y.等人May2008，Biochem J，415，123-134)将转醛醇酶缺乏鉴定为线粒体动态平衡、Ca2+流动和细胞凋亡的调节剂。
根据这些初始结果，就已知的关系分析通过2-D凝胶电泳鉴定为在SK-MEL-28中受Q10调节的其他蛋白质(图9)。此类蛋白质的功能评估显示存在参与14-3-3-介导的信号转导的一组蛋白(PDCP6IP，YWHAZ和VIM)以及与许多过程[细胞周期；戊糖磷酸途径(TALDO1)；神经酰胺信号转导(CTSD)；氨酰-tRNA生物合成(GARS)和线粒体蛋白质输入(TOM22)]关联的个别蛋白质。
用Q10处理的SCC细胞的蛋白质组学分析
也制备了另一种皮肤癌细胞系鳞状细胞癌(SCC)，利用2-D凝胶电脉进行分析，作为先前SK-MEL-28分析的随访实验。在收获之前用100μM Q10处理SCC细胞，进行6小时或24小时。也收获未处理的对照细胞。裂解细胞沉淀，将样品经历2-D电泳(以一式三份)。在比较研究中分析600多个蛋白质点，将对照样品与6小时和24小时的处理相比较。
根据2-D电泳凝胶的比较分析评估前25个统计学上显著的差异点变化。根据该评估，切取12个点，通过胰蛋白酶消化和质谱表征进行鉴定(结果概述于下面表3中)。
表3.SCC细胞中在第6和24小时被鉴定为对100μM Q10处理具有差异反应的蛋白质
Figure BPA00001497260600891
Figure BPA00001497260600901
转醛醇酶1：如先前在用Q10处理的SKMEL-28细胞中观察到的，酶转醛醇酶1被调节，水平下降。这提供了先前对Q10与转醛醇酶(和从而细胞的代谢状态)的改变之间的联系的观察的独立验证。
转醛醇酶是戊糖磷酸途径的非氧化相中的酶(图10)。戊糖磷酸途径在用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原型NADH)的产生，用于还原生物合成的细胞的代谢状态中和为ATP，DNA和RNA的必需成分的核糖的形成中是至关重要的。转醛醇酶还使戊糖磷酸途径与糖酵解发生关联。糖酵解是癌细胞籍以获得细胞存活所必需的能量的代谢途径，因为氧化磷酸化的线粒体过程未被利用。Q10是氧化磷酸化和线粒体ATP产生所需的必需辅酶因子。
BSCv：Spot 23是称为BSCv的来自染色体20的新型人蛋白质。BSCv蛋白也称为脂肪细胞质膜相关蛋白(基因名称：APMAP或C20orf3)并且被预测为与蛋白质的异胡豆苷合酶家族具有序列相似性的单向II型膜蛋白。Q10处理引起该蛋白质的水平降低。该蛋白质未得到充分表征，其与异胡豆苷合酶的同源性也未获得确认。有趣地，该蛋白与在脂肪细胞分化中的作用相关(Albrektsen等人，2001)。人网膜脂肪组织的最近蛋白质组学研究将BSCv鉴定为对于病态肥胖妇女的多囊卵巢综合征(PCOS)具有差异表达的9种蛋白质之一(Corton，2008Hum.Reprod.23：651-661)。作为对Q10反应的细胞表面蛋白质，抗BSCv抗体可用作生物标志。基于目前的结果和可获得的文献，BSCv可在癌症和糖尿病中具有潜在作用。
NM23A：非转移细胞1，蛋白质(NM23A，也称为NME1)被认为是转移抑制剂。该基因(NME1)因其在高转移性细胞中降低的mRNA转录水平而被鉴定。所述蛋白具有作为二磷酸核苷激酶(NDK)的活性并且以由′A′(由该基因编码)和′B′(由NME2编码)同种型组成的六聚体存在。已在侵袭性神经母细胞瘤中鉴定了该基因的突变。NDK活性维持不同三磷酸核苷的浓度之间的平衡，例如，当将柠檬酸(克雷布斯)循环中产生的GTP转化成ATP时。NDK复合通过与STRAP相互作用而与p53关联。值得注意的是，STRAP与HNF4A关联。因此，NM23A是参与对于细胞控制和疾病治疗重要的途径的潜在蛋白。
Rho GDP解离抑制因子(GDI)α：GDI通过抑制调节GDP从它们解离和随后GTP与它们的结合来调节Rho蛋白的GDP/GTP交换反应。所述蛋白在癌细胞中被上调。
实施例5：线粒体富集分析
几条证据线索表明对线粒体蛋白质和癌症生物学的作用以及Q10反应的更近一步评估是理所当然的。首先，Q10在用于正常细胞的能量产生的线粒体氧化磷酸化过程中具有必不可少的作用。然而，癌细胞中发生的代谢转变是通过可选择的糖酵解途径进行的能量产生，该途径不需要Q10。其次，细胞的细胞凋亡反应需要线粒体蛋白质存在。Q10已被确定为刺激癌细胞的细胞凋亡(Bcl-2家族蛋白质，细胞色素c)。最后，新型线粒体蛋白质被鉴定为受Q10处理调节，如通过线粒体输入受体蛋白TOM22的蛋白质水平举例说明的(参见本文中描述的实验)。
富集线粒体的样品的产生
用100μM Q10或模拟媒介物处理皮肤癌SKMEL-28细胞6、19或48小时。通过洗涤和刮取从T160培养瓶(每一个时间点4个)收获用细胞。通过离心，沉淀收集细胞，快速冷冻沉淀并且于-80℃下贮存。重悬浮细胞，使用2mL杜恩斯匀浆器破碎细胞。试剂和方法获自用于培养细胞的线粒体分离试剂盒(MitoSciences，Eugene OR，Cat#MS852)。将所得的线粒体样品分成75μL的等分(4-5个等分/样品)并且于-80℃下贮存。
从用Q10处理的SK-MEL-28细胞分离的富集线粒体的样品的蛋 白质组学分析
对来自用100μM Q10处理6、19和48小时的SK-MEL-28的富集线粒体的样品的两个等分(连同相应的模拟媒介物对照)的溶解的蛋白质进行2-D凝胶电泳。将样品经历2-D电泳(以一式三份)。在比较研究中分析525个蛋白质点，将对照样品与其他时间点样品相比较(图11)。
9个统计学上显著的差异点变化选自2-D电泳凝胶的比较分析。从这些凝胶切取9个点，通过胰蛋白酶消化和质谱表征进行鉴定。
表4.SKMEL-28线粒体中经鉴定对Q10处理具有差异反应的蛋白质
酰基CoA硫酯酶7：酰基CoA硫酯酶7(ACOT7)是催化脂酰CoA水解成游离脂肪酸和CoA的酶家族的成员。从而该酶在脂质代谢和细胞信号转导中具有作用。ACOT7偏受具有8-16个碳原子(C8-C16)的脂肪酸链的长链酰基CoA底物。ACOT7的确切细胞功能还不完全清楚。该基因的转录被固醇调控元件结合蛋白2激活，从而表明在胆固醇代谢中的功能。
该实施例的结果表明ACOT7潜在地直接或间接参与Q10的代谢。因此，靶向ACOT7可促进Q10的细胞内水平的调节，从而影响细胞Q10的效应。
丙酮酸激酶：丙酮酸激酶是参与糖酵解的最后一步的酶。其催化磷酸基团从磷酸烯醇丙酮酸(PEP)至ADP的转移，从而产生一个分子的丙酮酸盐和一个分子的ATP。
Figure BPA00001497260600941
所述蛋白质假定为PKM2的蛋白质，2型同种型，因为该蛋白是从富集线粒体的SK-MEL-28样品被鉴定的。众所周知该同种型参与肿瘤细胞形成和调控。
线粒体中Q10水平的定量
基于最近公布的方法(Ruiz-Jimenez，2007，J.Chromatogr.A，1175，242-248)通过使用在阳性模式中利用电喷射离子化(ESI)的LC-MS-MS执行用于同时测定辅酶Q10(Q10)和还原形式泛醇-10(Q10H2)的方法。Q10和Q10H2的高选择性鉴定和灵敏性定量连同其他选择的脂质的鉴定是可能的。将来自用100μM Q10处理的SK-MEL-28的富集线粒体的样品的等分经历常规预处理，所述预处理基于蛋白质沉淀、液体-液体提取、蒸发至干燥和利用95∶5甲醇/己烷(v/v)的重建。
在该分析中，定量Q10、Q10H2和Q9(表5)。相关分子Q9的水平较低，并且接近检测的水平。未处理的样品的水平相对恒定，6小时Q10处理的样品具有该相同的水平。为了控制总材料的样本方差，也测量胆固醇的水平以确认差异并非因样本容量误差而导致。当针对通过蛋白质提取相同线粒体制剂的其他等分获得的总蛋白质的值校正Q10水平时，相对比率是相当的。因此，在第19小时获得Q10水平的显著增加(约3倍)，在第48小时时间点甚至获得更大的增加(约6倍)(图12)。
表5.存在于来自用100uM的培养基中的Q10处理的SK-MEL-28细胞的富集
线粒体的样品中的Q10的水平的HPLC-MS定量结果
Figure BPA00001497260600951
来自该研究的令人惊讶的结果是发现Q10以氧化形式提供给细胞。对于48小时的样品，也测量还原形式Q10H2，并且发现其以显著更低的量(CoQ10H2的0.28ng/样品相对于CoQ10的46.63ng/样品)存在。在Q10处理48小时的样品中存在Q10H2的水平的总体增加(3倍)，虽然所述水平接近假定的测定检测限。有趣地，氧化形式(Q10)可用作生物系统中的促氧化剂。根据文献，当估量人血浆的Q10和Q10H2时，发现大部分(90％)分子以可用作抗氧化剂的还原形式Q10H2存在(Ruiz-Jimenez，2007，J.Chroma A，1175，242-248)。
因此，这些结果确认和定量了在向培养基中外源加入Q10后，Q10的水平在线粒体中增加。令人惊讶和意外的发现是Q10以提供的氧化形式(促氧化剂)维持并且不以任何显著的量转化成还原(抗氧化剂)形式Q10H2。
实施例6：实时PCR阵列
实验1：细胞凋亡阵列
如在上文实施例3中所述，癌细胞与Q10的接触诱导此类细胞的一部分因细胞凋亡过程而死亡。为了鉴定参与Q10反应的蛋白质，应用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)法来鉴定参与细胞凋亡的靶向途径阵列的基因/蛋白质的mRNA水平的变化。
通过将PCR阵列用作筛选工具，从而可评估可潜在地为Q10在细胞内的生物学作用模式提供见解的一系列分子靶。使用实时PCR定量评估mRNA水平的变化以估量包含80个途径特异性靶的预先选择的亚组中的miRNA水平。
为了解释mRNA结果，鉴定和评估在它们的mRNA转录中改变2倍水平的基因。产生mRNA的基因转录的水平只提供表达的蛋白质的水平的潜在变化的大致估计。本领域技术人员应理解，每一种mRNA可具有不同的被降解的速率或其不能被有效翻译，从而导致不同量的蛋白质。
用50um Q10处理SkBr-3细胞24小时
RT-PCR的测定法用于测量总共84个细胞凋亡途径相关蛋白的mRNA水平变化。对使用Q10处理的(24小时)SkBr3进行的利用实时PCR细胞凋亡分析的实验将下列mRNA鉴定为受到影响：Bcl2，Bcl2L1，Bcl2L11，Birc6，Bax，Xiap，Hprtl，Apafl，Abll，Braf。这些结果再次提供了癌细胞对Q10处理的细胞凋亡反应的支持证据。
表6A
Figure BPA00001497260600961
Figure BPA00001497260600971
来自3个通过SK-MEL-28细胞进行的独立实验的一致的结果概述于下面表6B中。同样地，许多基因在SCC细胞中受100μM Q10处理调节。在SCC细胞中显示被调节的细胞凋亡阵列中的基因描述于表7中。我们发现在SK-MEL-28细胞和SCC细胞中许多基因在第6小时都被调节。24小时时，所述调节减弱。在SK-MEL-28细胞和SCC细胞中都显示被调节的基因描述于表8中。
表6B.当利用细胞凋亡测定法分析时，SK-MEL-28细胞中被100μM Q10处理调节的基因.
Figure BPA00001497260600972
Figure BPA00001497260600981
Figure BPA00001497260600991
表7.当利用细胞凋亡阵列分析时SCC细胞中被100μM Q10处理调节的基因
Figure BPA00001497260601011
表8.SK-MEL-28和SCC细胞中利用100μM Q10处理调控的细胞凋亡阵列的基因
  符号   描述
  BCL2   B-细胞CLL/淋巴瘤2
  BCL2L1   BCL2-样1(Bcl-xl)
  BIRC3   含杆状病毒IAP重复的3
  FADD   Fas(TNFRSF6)相关死亡结构域
  GADD45A   生长停止和DNA-损伤-诱导的，α
  TNFRSF21   肿瘤坏死因子受体超家族，成员21
  CD27   CD27分子
  TNFRSF9   肿瘤坏死因子受体超家族，成员9
  TNFSF10   肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员10
  TP73   肿瘤蛋白p73
  TRAF2   TNF受体相关因子2
有趣地，改变的mRNA水平显示一系列细胞凋亡蛋白质的显著上调，Bcl-xl是上调最高的蛋白质之一。在SK-MEL-28细胞的蛋白质阵列实验中也观察到该结果。
Bcl-xl是线粒体中的跨膜分子(Bcl-xl表示“基细胞淋巴瘤-加大型”)。其参与FAS-L的信号转导途径并且是作为蛋白质的Bcl-2家族的成员的几种抗细胞凋亡蛋白之一。其牵涉癌细胞的存活。然而，已知人Bcl-x mRNA的选择性剪接可导致至少两种不同的Bcl-x mRNA种类Bcl-xL和Bcl-xS。主要的蛋白质产物(233个氨基酸)是更大的Bcl-x mRNA，Bcl-xL，其在生长因子撤除时抑制细胞死亡(Boise等人，1993.Cell 74，597-608)。在另一方面，Bcl-xS抑制Bcl-2抑制细胞死亡的能力并且使细胞对细胞凋亡细胞死亡易感。所利用的使用的测定法不能区分Bcl-x的哪个同种型被上调。在这些研究中被CoQ10上调的Bcl-x同种型可利用本领域内已知的常规方法例如，通过使用估计两种mRNA剪接同种型的比率(Bcl-xL对Bcl-sL)的RT-PCR法来确定。
根据细胞凋亡相关蛋白的观察，观察到多个促细胞凋亡和抗细胞凋亡因子在BCL-2家族中或与这些因子相互作用调节表达水平(BCL2L11、BNIP2、BAG1、HRK、BAK1、BCL2、BCL2L1)。此类蛋白质控制线粒体外膜的透化。
对于半胱天冬酶-9的上调(16小时)观察到与先前对于半胱天冬酶3/7蛋白观察到的细胞凋亡一致的细胞凋亡反应的早期标志。应激信号转导途径的诱导引起细胞色素c从线粒体释放以及apaf-1(凋亡体)的激活，这反过来将半胱天冬酶-9的酶原切割成活性形式。一旦被启动，半胱天冬酶-9持续切割半胱天冬酶原-3和半胱天冬酶原-7以触发另外的细胞凋亡途径。
也存在与待调节的蛋白质的肿瘤坏死因子家族的一致联系。
还指出了肿瘤蛋白p73的强下调。通常见于人中的许多肿瘤(包括乳腺癌和卵巢癌)的分析显示p73的高表达(当与相应区域中的正常组织相比较时)。最近的发现表明牵涉哺乳动物细胞的细胞周期调控和DNA合成的转录因子(即：E2F-1)在体内的失调过表达诱导p73的表达。暗示着p73可能是癌蛋白质，但其可牵涉相关p53蛋白的不同机制。显示细胞凋亡途径的描绘的示意图提供于图13中。
SKMEL-28细胞
根据细胞凋亡相关蛋白质的调查，观察到多个促细胞凋亡因子和抗细胞凋亡因子存在于BCL-2家族中，或与此类因子的相互作用调节表达水平(BCL2L11、BNIP2、BAG1、HRK、BAK1、BCL2、BCL2L1)。此类蛋白质控制线粒体外膜的透化。随着半胱天冬酶-9的上调(16小时)，观察到细胞凋亡反应的早期标志，其与先前观察到的通过半胱天冬酶3/7蛋白产生的细胞凋亡相符。应激信号转导途径的诱导引起细胞色素c从线粒体释放和apaf-1(凋亡体)的激活，这反过来将半胱天冬酶-9的酶原切割成活性形式。一旦启始，半胱天冬酶-9继续切割半胱天冬酶原-3和半胱天冬酶原-7以触发其他细胞凋亡途径。
表9.通过聚焦在细胞凋亡途径上的RT-PCR阵列评估的用100μM A10处理的SKMEL-28细胞的mRNA水平的变化
Figure BPA00001497260601031
Figure BPA00001497260601041
被调节的蛋白质与肿瘤坏死因子受体家族存在的恒定联系。
也注意到肿瘤蛋白p73的强下调。通常在人中发现的许多肿瘤(包括乳腺癌和卵巢癌)的分析显示p73的高表达(当与相应区域中的正常组织比较时)。最近的发现表明参与哺乳动物细胞的细胞周期调控和DNA合成的转录因子(即：E2F-1)在体内的失调过表达诱导p73的表达。暗示着p73可能是癌蛋白质，但可牵涉相关p53蛋白作用的不同机制。
实验2：使用氧化性应激和抗氧化剂防御阵列的实时PCR阵列
为了鉴定参与Q10反应的蛋白质，应用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)法鉴定参与氧化性应激和抗氧化剂防御的靶向途径阵列的基因/蛋白质的mRNA水平的变化。
下表10列出了在用100μM Q10处理的SK-MEL28细胞中被调节的基因。只给出了在两个独立实验中被调节的那些基因的结果。虽然在第6小时看到显著量的基因调节，但在第48小时才看到RNA水平的最显著变化。
表10.如氧化性应激和抗氧化剂防御阵列中看到的SK-MEL-28细胞中被 100uM Q10处理调节的基因
Figure BPA00001497260601051
Figure BPA00001497260601061
Figure BPA00001497260601071
Figure BPA00001497260601081
嗜中性粒细胞胞质因子2(NCF2，65kDa，慢性肉芽肿病，常染色体2)是最先诱导的mRNA之一(在第6小时观察到的)。随后在第16小时时间点和以后，嗜中性粒细胞胞质因子1(NCF1)(慢性肉芽肿病，常染色体1)在初始迟滞期后以极高水平被诱导。
嗜中性粒细胞胞质因子2是通常见于中性粒细胞的称为NADPH氧化酶的多蛋白复合物的细胞溶胶亚基。该氧化酶骤然产生大量被递送至嗜中性粒细胞吞噬体的腔中的过氧化物。
NADPH氧化酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-氧化酶)是膜结合酶复合物。其可见于质膜以及吞噬体膜中。其由6个亚基组成。这些亚基是：
Rho鸟苷三磷酸酶(GTP酶)，通常Rac1或Rac2(Rac表示Rho相关C3肉毒毒素底物)
●5个″phox″单位。(Phox表示噬菌细菌氧化酶.)
○P91-PHOX(包含血红素)
○p22phox
○p40phox
○p47phox(NCF1)
○p67phox(NCF2)
应指出，另一种NADPH氧化酶水平不改变。所述酶是NOX5，其是产生过氧化物并且以Ca(2+)-依赖性方式用作H+通道的新型NADPH氧化酶。
此外，磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸-依赖性RAC交换剂1(PREX1)也被上调。该蛋白用作小GTP结合蛋白(RAC)的RHO家族的鸟嘌呤核苷酸交换因子。已显示其结合RAC1并且通过将结合的GDP与游离GTP交换来激活RAC1。主要在细胞质中发现的所述编码的蛋白质被磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸和异三聚体G蛋白的β-γ亚基激活。
第二主要早期诱导的蛋白质是一氧化氮合酶2A(可诱导的，肝细胞)(NOS2A)。一氧化氮是在几个过程(包括神经传递以及抗微生物和抗肿瘤活性)中用作生物介体的自由基。该基因编码在肝中表达并且可由脂多糖和某些细胞因子的组合诱导的一氧化氮合酶。
超氧化物歧化酶2(线粒体(SOD2))是铁/锰超氧化物歧化酶家族的成员。其编码形成同四聚体并且每亚基结合一个锰离子的线粒体蛋白。该蛋白结合氧化磷酸化的过氧化物副产品并且将它们转化成过氧化氢和二价氧。该基因的突变与特发性心肌病(IDC)、过早衰老、散发型运动神经元病和癌症相关。
下调的蛋白质的实例是叉头框M1(FOXM1)，已知其在细胞周期进展中起着至关重要的作用，在所述周期中内源FOXM1表达在S和G2/M期达到峰值。最近的研究已显示FOXM1调节一大批G2/M-特异性基因例如Plk1、细胞周期蛋白B2、Nek2和CENPF的表达，并且在染色体分离和基因组稳定性的维持中起着重要作用。FOXM1基因现被称为人原癌基因。FOXM1的异常上调牵涉基底细胞癌(BCC)的肿瘤发生。随后在大部分人实体癌(包括肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、子宫颈癌、结肠癌、胰腺癌和脑癌)中发现FOXM1上调。利用BCC和Q10的其他研究可估计FOXM1水平。
SKMEL-28细胞
使用SKMEL-28细胞进行其他实验。在不同的时间点，利用实时PCR法(RT-PCR)将存在于用100μM Q10处理的细胞中的mRNA水平与未处理的细胞中的水平相比较。PCR阵列(SABiosciences)是在96孔板上进行的用于途径或疾病聚焦的基因经及适当的RNA质量控制的一组最优化的实时PCR引物测定法。所述PCR阵列利用实时PCR的灵敏性和微阵列的多个基因表征能力来进行基因表达分析。
表11.氧化性应激和抗氧化剂防御PCR阵列中评估的mRNA水平的列表和分类。在利用100μM Q10对SKMEL-28细胞处理6小时后，mRNA水平的最大变化通过突显蛋白质编码(增加的-粗体；减少的-下划线标示；或无变化-灰色)来标示。
Figure BPA00001497260601111
表12.SKMEL-28的100μM处理的时程评估。利用RT-PCR法监控mRNA水平变化并且评估氧化性应激和抗氧化剂防御蛋白
嗜中性粒细胞胞质因子2(NCF2，65kDa，慢性肉芽肿病，常染色体2)是最先诱导的mRNA(在第6小时观察到的)之一。随后在第16小时时间点和以后，嗜中性粒细胞胞质因子1(NCF1)(慢性肉芽肿病，常染色体1)在初始迟滞期后以极高水平被诱导。
嗜中性粒细胞胞质因子2是通常见于中性粒细胞的称为NADPH氧化酶的多蛋白复合物的细胞溶胶亚基。该氧化酶骤然产生大量被递送至嗜中性粒细胞吞噬体的腔中的过氧化物。NADPH氧化酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-氧化酶)是膜结合酶复合物。其可见于质膜以及吞噬体膜中。其由6个亚基组成。这些亚基是：
●Rho鸟苷三磷酸酶(GTP酶)，通常地Rac1或Rac2(Rac表示Rho相关C3肉毒毒素底物)
●5个“phox”(吞噬细胞氧化酶)亚基.
P91-PHOX(包含血红素)
p22phox
p40phox
p47phox(NCF1)
p67phox(NCF2)
应指出，另一种NADPH氧化酶水平不改变。所述酶是NOX5，其是产生过氧化物并且以Ca(2+)-依赖性方式用作H+通道的新型NADPH氧化酶。
此外，磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸-依赖性RAC交换剂1(PREX1)也被上调。该蛋白用作小GTP结合蛋白(RAC)的RHO家族的鸟嘌呤核苷酸交换因子。已显示其结合RAC1并且通过将结合的GDP与游离GTP交换来激活RAC1。主要在细胞质中发现的所述编码的蛋白质被磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸和异三聚体G蛋白的β-γ亚基激活。
第二主要早期诱导的蛋白质是一氧化氮合酶2A(可诱导的，肝细胞)(NOS2A)。一氧化氮是在几个过程(包括神经传递以及抗微生物和抗肿瘤活性)中用作生物介体的自由基。该基因编码在肝中表达并且可由脂多糖和某些细胞因子的组合诱导的一氧化氮合酶。
下调的蛋白质的实例是FOXM1，已知其在细胞周期进展中起着至关重要的作用，在所述周期中内源FOXM1表达在S和G2/M期达到峰值。最近的研究已显示FOXM1调节一大批G2/M-特异性基因例如Plk1、细胞周期蛋白B2、Nek2和CENPF的表达，并且在染色体分离和基因组稳定性的维持中起着重要作用。FOXM1基因现被称为人原癌基因。FOXM1的异常上调牵涉基底细胞癌(BCC)的肿瘤发生。随后在大部分人实体癌(包括肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、子宫颈癌、结肠癌、胰腺癌和脑癌)中发现FOXM1上调。
实验3：使用热激阵列的实时PCR阵列
运行SCC细胞的热激阵列并且被调节的基因的数据概述于下面表13中。
表13.SCC细胞中来自被100μM Q10处理调节的热激蛋白的基因
Figure BPA00001497260601141
Figure BPA00001497260601151
实施例4：使用糖尿病阵列的实时PCR阵列
进行本实施例中描述的实验以测试总体假说：Q10可影响多个基因并且改变细胞的代谢状态。利用针对一组参与糖尿病和相关途径的靶蛋白的RT-PCR评估用100μM Q10处理的SKMEL-28细胞的mRNA。该实验的结果显示参与糖酵解途径和胰岛素加工的几种蛋白质在它们的mRNA表达水平上被改变(概述于表14中)。
表14.用100μM Q10处理16小时的SKMEL-28细胞的主要mRNA水平的变化
Figure BPA00001497260601161
该初步实验的结果显示多种胰岛素相关蛋白的mRNA水平在两个方向上都被调节。所述结果表明Q10可影响糖尿病的治疗和/或评估。
接下来进行其他实验以确认从用Q10处理的SK-MEL-28细胞获得的上述结果。SK-MEL-28细胞中的许多基因早在Q10处理后6小时被调节。然而，该初始调节在16和24小时时变得不太明显。在大约48小时时，我们发现糖尿病阵列中的许多基因再次被强烈调节。与两个或更多个独立实验一致的结果概述于下面表15中。SCC细胞似乎在Q10处理后第6和24小时显示某些基因的调节。来自SCC细胞的这些结果概述于表16中，而在SK-MEL-28细胞和SCC细胞中都被调节的基因概述于表17中。
表15.当通过糖尿病阵列分析时SK-MEL-28细胞中被100μM Q10处理调节的基因
表16.当通过糖尿病阵列分析时SCC细胞中被100μM Q10调节的基因
Figure BPA00001497260601182
表17.对于SK-MEL-28和SCC细胞被100μM Q10处理调节的来自糖尿病阵列的基因.
  符号   描述.
  G6PD   6-磷酸葡糖脱氢酶
  ICAM1  细胞间粘附分子1(CD54)，人鼻病毒受体
  PIK3CD   磷酸肌醇-3-激酶，催化的，δ多肽
  SREBF1   固醇调节元件结合转录因子1
  TNF   肿瘤坏死因子(TNF超超家族，成员2)
  TNFRSF1A   肿瘤坏死因子受体超家族，成员1A
  VEGFA   血管内皮生长因子A
多种胰岛素相关蛋白的mRNA水平在两个方向上都被调节。Q10影响细胞代谢的调节，从而影响代谢失调疾病例如糖尿病。下面进一步论述显著被调节的两个患者。
促分裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)：促分裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)是MAP激酶家族的成员。MAP激酶用作多个生物化学信号的整合点，并且参与许多细胞过程例如增殖、分化、转录调控和发育。该实验的结果显示MAPK14被显著下调。
肝细胞核因子4，α(HNF4A)：HNF4(肝细胞核因子4)主要在肝、肠、肾和胰腺β细胞中表达的细胞核受体蛋白质，其对于肝发育是至关重要的。在人中，存在分别由两个分开的基因HNF4A和HNF4G编码的NHF4的两个同种型α和γ。(参见，例如，Chartier FL，BossuJP，Laudet V，Fruchart JC，Laine B(1994)。″Cloning and sequencing ofcDNAs encoding the human hepatocyte nuc1ear factor 4 indicate thepresence of two isoforms in human liver″.Gene 147(2)：269-72.)。
HNF4最初被分类为孤儿受体。然而，后来发现HNF4因持续结合多种脂肪酸而具有组成型活性。(参见，例如，Sladek F(2002)。″Desperately seeking...something″.Mol Cell 10(2)：219-221和JumpDB，Botolin D，Wang Y，Xu J，Christian B，Demeure O(2005)。″Fattyacid regulation of hepatic gene transcription″.J Nutr 135(11))。HNF4的配体结合结构域，与其他细胞核受体一样，采用规范的α螺旋夹心折叠(参见，例如，Wisely GB，Miller AB，Davis RG，Thornquest AD Jr，Johnson R，Spitzer T，Sefler A，Shearer B，Moore JT，Miller AB，Willson TM，Williams SP(2002)。″Hepatocyte nuclear factor 4 is atranscriptional factor that constitutively binds fatty acids″.Structure10(9)：1225-34和Dhe-Paganon S，Duda K，Iwamoto M，Chi YI，Shoelson SE(2002)。″Crystal structure of the HNF4αligand bindingdomain in complex with endogenous fatty acid ligand″.J Biol Chem277(41)：37973-6)以及与辅激活因子蛋白相互作用(参见，例如，DudaK，Chi YI，Shoelson SE(2004)。″Structural basis for HNF-4alphaactivation by ligand and coactivator binding″.J Biol Chem 279(22)：23311-6)。
HNF4-α基因的突变与青春晚期糖尿病(MODY)关联。(参见，例如，Fajans SS，Bell GI，Polonsky KS(2001)。″Molecular mechanisms andclinical pathophysiology of maturity-onset diabetes of the young″.N EnglJ Med 345(13)：971-80.)
肝细胞核因子4(HNF4)是已知在肝细胞和胰腺细胞中调节许多基因的组织特异性转录因子。虽然HNF4在肾的某些部分中高度表达，但关于其在该区域中的作用和关于HNF4调节的基因在肾细胞中的作用知之甚少。HNF4的丰度和活性在肾细胞癌(RCC)中频繁减少，这表明某些肿瘤在肾细胞中抑制HNF4的功能。有趣地，已显示许多受HNF4调节的基因在RCC微阵列研究中失调。这些基因(ACY1、WT1、SELENBP1、COBL、EFHD1、AGXT2L1、ALDH5A1、THEM2、ABCB1、FLJ14146、CSPG2、TRIM9和HEY1)是当HNF4在RCC中减少时其活性被改变的基因的良好候选者。
在HNF4α的配体结合结构域的结构中(1M7W.pdb；Dhe-Paganon(2002)JBC，277，37973)；观察到从大肠杆菌(E.coli)产物共纯化的小的脂质。晶体包含括蛋白质的两个构象，其中长的螺旋10和短螺旋12具有可选择的构象。当检查脂质结合区域时，有趣地观察到存在2个出口区域(exits region)。一个出口区域具有小的脂质头基，应当注意，几个口袋区与该出口共定位。可假定Q10特异性结合该转录因子。当Q10被塑造到该脂质结合隧道中时，Q10环正好适合该表面口袋(图28)。已知的功能缺失突变(E276Q)可具有使残基排布在该表面口袋的内表面的潜能，从而对假定的Q10结合具有负面影响。
此外，通过该Q10结合模型，疏水性尾可延伸至内腔外部，随后可与延伸的螺旋10相互作用。因此，该相互作用可潜在地改变螺旋10/12组的构象。然后这可改变转录因子活性的激活/失活平衡。
实施例7：抗体微阵列分析
通过利用抗体微阵列法就Q10的存在评估蛋白质浓度。微阵列包含700多种蛋白质的抗体，采集许多蛋白质类型和潜在的途径标志作为样品。
利用抗体阵列(Panorama XP725抗体阵列，Sigma)和处理了6或24个小时的SK-MEL-28进行评估用Q10处理的细胞中蛋白质浓度水平的变化的初步实验。收获细胞，提取细胞以获得可溶性蛋白质上清液。用荧光染料(分别地Cy3和Cy5)各自标记来自每一个样品(以1mg/mL的浓度)的蛋白质(总共约1mg)的两部分。从蛋白质除去过量染料，将材料用于微阵列温育。为了比较两个时间点的样品，混合等量的蛋白质，每一个样品具有不同的标记类型(例如，将用Cy3标记的3小时提取物与用Cy5标记的24小时提取物混合)。在与微阵列芯片温育(按照制造商推荐的方案)后，洗涤芯片，进行干燥。利用荧光激光扫描仪扫描微阵列以测量Cy3和Cy5染料的相对荧光强度。
表18.在用50uM Q10处理24小时后在SK-MEL-28细胞中具有升高的水平的蛋白质
Figure BPA00001497260601221
Figure BPA00001497260601231
表19.在用50μM Q10处理24小时后在SK-MEL-28细胞中具有升高的水平的蛋白质
Figure BPA00001497260601232
Figure BPA00001497260601241
为了确认先前观察到的细胞凋亡蛋白质，和将评估扩展至更大量的促细胞凋亡和抗细胞凋亡蛋白质，选择能够筛选潜在包括的蛋白质的广泛家族的两个测定法。
首先，利用抗体微阵列(Panorama XP725抗体阵列，Sigma)筛选700多种蛋白质抗体以评估用50μM Q10处理24小时的SK-MEL-28细胞中蛋白质浓度水平上的变化。
根据对使用Q10(24小时)的SKMEL-28的抗体阵列实验，下列是一些具有改变的水平的已鉴定的蛋白质：Bcl-xl、Bmf、BTK、BLK、cJun(pSer63)、连接蛋白32、PUMA bbc3、BID、Par4、cCbl。该初步研究的主要结论是预期的促细胞凋亡蛋白质被改变。
用于SK-MEL-28的抗体微阵列
利用抗体微阵列(Panorama XP725抗体阵列，Sigma)筛选700多种蛋白质抗体以评估用50μM Q10处理24小时的SK-MEL-28细胞中蛋白质浓度水平上的变化。
表20.用50nM Q10处理的SKMEL-28中蛋白质水平的变化
Figure BPA00001497260601251
根据对利用Q10(24小时)的SKMEL-28进行的抗体阵列实验，下列是具有改变的水平的已鉴定的蛋白质中的一些蛋白质：Bcl-xl、Bmf、BTK、BLK、cJun(pSer63)、连接蛋白32、PUMA bbc3、BID、Par4、cCbl。这些数据确认了促细胞凋亡蛋白的水平在与升高的水平的外源加入的Q10一起温育后被改变。
Bcl-xl(“基细胞淋巴瘤-加大型”)是线粒体中的跨膜分子。其参与FAS-L的信号转导途径并且是作为蛋白质的Bcl-2家族的成员的几种抗细胞凋亡蛋白之一。其牵涉癌细胞的存活。然而，已知人Bcl-xmRNA的选择性剪接可导致至少两种不同的Bcl-x mRNA种类Bcl-xL和Bcl-xS。主要的蛋白质产物(233个氨基酸)是更大的Bcl-x mRNA，Bcl-xL，其在生长因子撤除进抑制细胞死亡(Boise等人，1993.Cell74，597-608)。在另一方面，Bcl-xS抑制Bcl-2抑制细胞死亡的能力并且使细胞对细胞凋亡细胞死亡易感。
表21.在用100μM Q10处理24小时后在SCC细胞中具有升高的水平的蛋白质
Figure BPA00001497260601252
Figure BPA00001497260601261
Figure BPA00001497260601271
表22.在用100μM Q10处理24小时后在SCC细胞中具有降低的水平的蛋白质
  名称   比率
  AP1   0.68
  中心体蛋白(Centrin)   0.55
  CUGBP1   0.67
  Cystatin A   0.69
  细胞角蛋白CK5   0.60
  纤连蛋白   0.63
  gParvin   0.70
  独立生长因子1   0.63
  神经生长因子b   0.60
  半胱天冬酶原8   0.72
  Rab7   0.62
  Rab9   0.73
  苏氨酸蛋白磷酸酶1gl   0.71
  丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶2ABg   0.73
  SKM1   0.70
  SLIPR MAGI3   0.67
  膜收缩蛋白a和b   0.70
  Spred2   0.66
  TRF1   0.74
实施例8：Western印迹分析
对皮肤癌细胞系SKMEL-28进行利用Western印迹和2-D凝胶电泳进行处理和评估的第一实验。该实验设置包括在第3、6、12和24小时用50或100μM Q10处理的SK-MEL-28细胞。
利用针对Bcl-xL的抗体(图14)、波形蛋白的抗体(图15、线粒体氧化磷酸化功能的一系列抗体(图16-21)以及针对一系列与线粒体膜完整性相关的抗体(图22-27)的Western印迹分析评估多种细胞类型。这些实验的结果显示几种检查的蛋白质作为利用Q10的细胞处理的结果被上调或下调。
实施例9：通过用100uM Q10处理胰腺癌细胞(PaCa2)被鉴定为在mRNA水平上受调节的糖尿病相关基因
在处理后不同的时间上对利用100uM Q10处理的样品进行糖尿病测定。基本上如上所述进行实验。经发现当Q10处理时被调节的不同基因概述于下面表23中。所述结果显示下列基因被Q10处理调节：ABCC8、ACLY、ADRB3、CCL5、CEACAM1、CEBRA、FOXG1、FOXP3、G6PD、GLP1R、GPD1、HNF4A、ICAM1、IGFBP5、INPPL1、IRS2、MAPK14、ME1、NFKB1、PARP1、PIK3C2B、PIK3CD、PPARGC1B、PRKAG2、PTPN1、PYGL、SLC2A4、SNAP25、HNF1B、TNRFSF1A、TRIB3、VAPA、VEGFA、IL4R和IL6。
表23：其表达被100μM Q10调节的来自糖尿病阵列的基因和它们在细胞中的可能功能
上调(灰色)和下调(白色)
Figure BPA00001497260601281
Figure BPA00001497260601291
实施例10：通过利用100μM Q10处理胰腺癌细胞(PaCa2)被鉴定为在mRNA水平上被调节的血管生成相关基因
在处理后不同的时间上对利用100uM Q10处理的样品进行血管生成测定。基本上如上所述进行实验。经发现当Q10处理时被调节的不同基因概述于下面表24中。所述结果显示下列基因被Q10处理调节：AKT1、ANGPTL4、ANGPEP、CCL2、CDH4、CXCL1、EDG1、EFNA3、EFNB2、EGF、FGF1、ID3、IL1B、IL8、KDR、NRP1、PECAM1、PROK2、SERPINF1、SPHK1、STAB1、TGFB1、VEGFA和VEGFB。
表24：其表达被100μM Q10调节的来自血管生成阵列的基因和它们在细胞中的可能功能的列表
上调(灰色)和下调(白色)
Figure BPA00001497260601301
Figure BPA00001497260601311
实施例11：通过用100μM Q10处理胰腺癌细胞(PaCa2)被鉴定为在mRNA水平上被调节的细胞凋亡相关基因
在处理后不同的时间上对利用100uM Q10处理的样品进行细胞凋亡测定。基本上如上所述进行实验。经发现当Q10处理时被调节的不同基因概述于下面表25中。所述结果显示下列基因被Q10处理调节：ABL1、AKT1、Bcl2L1、BclAF1、CASP1、CASP2、CASP6、CIDEA、FADD、LTA、TNF、TNFSF10A和TNFSF10。
表25：其表达被100μM Q10调节的来自细胞凋亡阵列的基因和它们在细胞中的可能功能的列表
上调(灰色)和下调(白色)
Figure BPA00001497260601312
Figure BPA00001497260601321
实施例12：关于肝癌(HepG2)细胞的PCR糖尿病阵列
利用媒介物处理HepG2(肝癌)细胞进行24小时或利用100μMQ10处理所述细胞进行不同的时间。按照用于PaCa2细胞的方法(上文中，实施例9-11)以1×105个细胞/孔起始处理。然而，从这些样品提取的RNA的总量低于预期。通常使用1μg的总RNA(通过260nm处的测量测定的)进行逆转录。每逆转录可使用的最大体积为8μL。由于RNA浓度较低，所以使用0.44μg的RNA进行利用媒介物和来自16小时和48小时的Q10处理的样品的RT-PCR阵列分析。所述阵列提供了利用100μM Q10处理进行的HepG2基因调节的趋势和模式的初步分析，如下面表26中概述的。所述结果显示基因PPARGC1A、PRKAA1和SNAP25中的每一个在处理后第16小时被下调(分别约1/20、1/6和1/5)。在处理后第48小时，PPARGC1A和PRKAA1已标准化或被略微上调，然而SNAP25被下调约1/2。
表26：当用100μM Q10处理HepG2细胞时在糖尿病阵列中被调节的基因的列表
Figure BPA00001497260601322
Figure BPA00001497260601331
实施例13：关于肝癌(HEPG2)细胞的PCR血管生成阵列
利用媒介物处理HepG2(肝癌)细胞进行24小时或利用100μMQ10处理所述细胞进行不同的时间。按照用于PaCa2细胞的方法(上文中实施例9-11)以1×105个细胞/孔起始处理。然而，从这些样品提取的RNA的总量低于预期。通常使用1μg的总RNA(通过在260nm处的测量测定的)进行逆转录。每逆转录可使用的最大体积为8μL。由于RNA浓度较低，所以使用0.44μg的RNA进行利用媒介物和来自16小时和48小时的Q10处理的样品的RT-PCR阵列分析。所述阵列提供了利用100μM Q10处理进行的HepG2基因调节的趋势和模式的初步分析，如下面表27中概述的。经发现在Q10处理时被调节的不同基因概述于下面表27中。所述结果显示基因ANGPTL3、ANGPTL4、CXCL1、CXCL3、CXCL5、ENG、MMP2和TIMP3中的每一个在处理后第16小时被上调(分别达到对照的约5.5、3、3、3.2、3、3、1和6.5倍、6倍和5倍)。在Q10处理后第16小时ID3被下调至对照的约1/5。在处理后第48小时，ANGPTL3、CXCL1、CXCL3、ENG和TIMP3仍然被上调(分别达到对照的约3.5、1.5、3.175、2和3倍)，然而ANGPTL4、CXCL5、ID3和MMP2分别被下调至对照的约1/1、1/1、1/2和1/18。
表27：当用100μM Q10处理HepG2细胞时在血管生成阵列中被调节的基因的列表
Figure BPA00001497260601332
Figure BPA00001497260601341
已知参与血管生成的过程的蛋白质是所述RT-PCR阵列中的成分。血管生成是癌细胞籍以变成恶性的至关重要的过程。此类蛋白质中的一些也牵涉糖尿病。
ANGPTL3和ANGPTL4：涉及ANGPTL3的文献将该蛋白与脂质代谢的调节相联系。具体地，文献(Li，C.Curr Opin Lipidol.2006Apr；17(2)：152-6)教导血管生成素和血管生成素-样蛋白共有相似的结构域结构。ANGPTL3和4是抑制脂蛋白脂酶活性的该超家族的仅有的两个成员。然而，ANGPTL3和4在多个水平上被差异调节，表明体内非冗余功能。ANGPTL3和4被蛋白水解加工成两个半部分并且被细胞核受体差异调节。ANGPTL4的转基因过表达以及ANGPTL3或4的敲除证明这两个蛋白质在脂蛋白代谢中起着必不可少的作用：肝来源的ANGPTL3主要在进食状态中抑制脂蛋白脂酶活性，而ANGPTL4在进食和禁食状态中起着重要作用。此外，ANGPTL4调节脂蛋白来源的脂肪酸的组织特异性递送。从而取决于其表达位置，ANGPTL4是脂蛋白脂酶的内分泌或自分泌/旁分泌抑制剂。
脂蛋白脂酶是将脂蛋白中的脂质例如乳糜微粒和极低密度脂蛋白(VLDL)中发现的脂质水解成3个游离脂肪酸和1个甘油分子的酶。给定的组织中的脂蛋白脂酶的活性是吸收甘油三酯来源的脂肪酸的限速步骤。脂肪酸分配中的不平衡具有重大代谢后果。已显示高脂肪饮食引起LPL的组织特异性过表达，这牵涉组织特异性胰岛素抗性和作为结果2型糖尿病的发展。
本实施例的结果表明Q10调节参与脂质代谢的蛋白质，从而使得ANGPTL3/ANGPTL4和它们的相关途径的研究理所当然。例如，ANGPTL3/ANGPTL4被认为在下列途径中起着重要作用：Akt、胆固醇、脂肪酸、HDL-胆旦固醇、HNF1A、ITGA5、ITGA5、ITGAV、ITG83、L-三碘甲腺原氨酸(trilodothynonine)、LIPG、LPL、Mapk、Nrth、NR1H3、PPARD、PTK2、RXRA、三酰甘油和9-顺-视黄酸。
实施例14：关于肝癌(HEPG2)细胞的PCR细胞凋亡阵列
如上所述对用100uM Q10处理16和48小时的样品进行细胞凋亡测定。然而，通过选择FAM而非SYBR作为荧光基团来进行48小时的测定。FAM和SYBR在相同波长上发荧光。
发现当Q10处理时被调节的不同基因概述于下表28中。所述结果显示在Q10处理后第16小时CASP9被上调，约为对照的61倍，而BAG1和TNFRSF1A在处理后第16小时被分别下调至对照的约1/6和1/4。在处理后第48小时，CASP9、BAG1和TNFRSF1A被分别上调至对照的约55、1和1倍。
表28：当用100μM Q10处理HepG2细胞时在凋亡阵列中被调节的基因的列表
Figure BPA00001497260601361
实施例15：评估MIM或表观代谢转变剂治疗肿瘤障碍的能力
在鼠模型中评估所选择的MIM或表观代谢转变剂例如CoQ10治疗肿瘤障碍例如黑素瘤的能力。通过将SK-MEL28注射入皮下层来在小鼠中诱导黑素瘤肿瘤。动物研究由对照组和处理组组成，每组包括4只小鼠。用两种肿瘤接种小鼠。每天将MIM或表观代谢转变剂的局部制剂用于处理组的肿瘤一次，进行30天的时段，之后，切取肿瘤，测定质量。当处理组相对于对照组的总平均质量的差异显著时，MIM或表观代谢转变剂被鉴定为在治疗肿瘤中是有效的。
实施例16：与肿瘤障碍相关的MIM的鉴定
为了将候选分子(例如，环境影响剂)评估为潜在的MIM，向一组细胞系外源地加入选择的候选MIM，所述小组由患病(癌症)细胞系和正常对照细胞系组成，并且评估组中每一个细胞系的诱导的细胞微环境特征谱的变化。评估和比较患病细胞相对于正常细胞的细胞形态学、生理学和/或细胞组成(包括例如mRNA和蛋白质水平)的变化。
通过检查细胞对候选MIM的敏感性和细胞凋亡反应来评估细胞形态学/生理学的变化。如实施例3中详细描述的进行这些实验。简而言之，用不同浓度的候选MIM处理由至少一种对照细胞系和至少一种癌细胞系组成的一组细胞系。通过在不同的时间上和在一系列应用的浓度上监控细胞存活率来评估细胞系对潜在的MIM的敏感性。通过使用例如与流式细胞术方法组合的连接蛋白试剂来评估细胞对潜在的MIM的细胞凋亡反应。连接蛋白试剂包含两种染料7AAD和膜联蛋白-V-PE的组合，并且允许定量处于早期和晚期细胞凋亡的细胞群体。可利用例如ApostrandTM ELISA法，使用测量单链DNA的另外的细胞凋亡测定法。评估和比较患病细胞系和对照细胞系的敏感性和细胞凋亡反应。显示差异细胞毒性和/或差异地诱导患病细胞相对于正常细胞的细胞凋亡反应的分子被鉴定为MIM。
评估利用候选MIM处理后细胞的组成的变化。使用实时PCR阵列法分析基因表达在mRNA水平上的变化。如实施例6和9-13中详细描述的进行这些实验。简而言之，向一个或多个细胞系(包括例如患病细胞和正常对照细胞系)外源地加入候选MIM，在处理后不同时间上从细胞提取mRNA。通过使用靶向途径阵列(包括例如特异于细胞凋亡、氧化性应激和抗氧化防御、血管生成、热激或糖尿病的阵列)来评估参与特定途径的基因的mRNA的水平。鉴定和评估了在它们的mRNA转录上改变2倍水平或更高水平的基因。诱导细胞的mRNA水平的变化和/或诱导患病细胞相对于正常细胞的一种或多种mRNA的水平的差异变化的分子被鉴定为MIM。
在互补实验中，通过使用抗体微阵列法、双向凝胶电泳，然后使用质谱表征进行的蛋白质鉴定以及利用western印迹分析法来分析基因表达在蛋白质水平上的变化。分别如实施例7、4和8中所述进行这些实验。简而言之，向一个或多个细胞系外源地加入候选MIM，所述细胞系包括例如患病细胞和正常对照细胞系，在处理后不同时间点例如6小时或24小时从细胞提取可溶性蛋白质。由候选MIM诱导的蛋白质水平的变化通过使用包含700多种蛋白质的抗体的抗体微阵列，获取许多蛋白质种类的样品和潜在的途径标志来评估。可通过使用与质谱法偶联的双向(2-D)凝胶电泳进行其他互补蛋白质组学分析。向一个或多个细胞系外源地加入候选MIM，所述细胞系包括例如患病细胞和正常对照细胞系，裂解细胞沉淀，将其经历2-D凝胶电泳。分析凝胶以鉴定处理的样品相对于对照未处理的样品的蛋白质水平的变化。分析凝胶以鉴定在处理的时间过程中因升高的水平、降低的水平或翻译后修饰而引起的点变化。切取显示统计上显著的变化的点，利用胰蛋白酶消化和质谱表征对其进行蛋白质鉴定。利用例如Mascot和MSRAT软件分析针对蛋白质数据库搜索表征的肽，以鉴定所述蛋白质。除了上述2-D凝胶分析和抗体微阵列实验外，还可通过Western印迹分析评估由候选MIM诱导的特定蛋白质的水平的潜在变化。在所有蛋白质组学实验中，鉴定和评估了在不同细胞系中具有升高或下降的水平的蛋白质。诱导细胞的蛋白质水平的变化和/或诱导患病细胞相对于正常细胞的一种或多种蛋白质的水平的差异变化的分子被鉴定为MIM。
将从上述实验发现的被利用候选MIM的处理调节的基因经历细胞和生物化学途径分析，从而可将其分类至不同的细胞途径中，包括例如细胞凋亡、癌症生长学和细胞生长、糖酵解和代谢、分子运输和细胞信号转导。
进行实验以确认候选MIM进入细胞，以确定候选MIM是否定位在细胞内，以及测定存在细胞中的候选MIM的水平和形式。例如如实施例5中详细描述的，进行这些实验。例如，为了测定存在于线粒体中的候选MIM的水平和形式，制备和分析来自用候选MIM处理的细胞的富集线粒体的制剂。从而可确认存在于线料体中的候选MIM的水平在添加外源候选MIM后以时间和剂量依赖性的方式增加。此外，通过使用2-D凝胶电泳分析来自富集线粒体的样品的蛋白质水平的变化，并且利用质谱表征进行蛋白质鉴定，如上文中对于总细胞蛋白质样品所描述的。将经发现进入细胞并且以升高的水平存在于例如线粒体中的候选MIM鉴定为MIM。可使在时间过程中被检查的细胞中或例如特别地线粒体中的候选MIM的水平与如通过例如特定蛋白质的mRNA和蛋白质水平的调节所证明的其他观察到的细胞变化发生关系。
将被观察到诱导细胞组成的变化，例如在mRNA或蛋白质水平上诱导基因表达的变化的候选MIM鉴定为MIM。将被观察到相对于正常(例如，非癌)状态诱导细胞形态学、生理学或细胞组成的差异变化(例如，mRNA或蛋白质水平上的基因表达的差异变化)的候选MIM鉴定为MIM和特别地具有多维特征。经发现能够进入细胞的候选MIM被鉴定为MIM和特别地具有多维特征，因为所述候选MIM从而除了治疗效应外还展示载体效应。
实施例17：CoQ10被鉴定为与肿瘤障碍相关的表观代谢转变剂
利用不同水平的辅酶Q10处理一组皮肤细胞系，其由对照细胞系(例如，角质细胞和黑素细胞的原代培养物)和几种皮肤癌细胞系(例如，SK-MEL-28，非转移性皮肤黑素瘤；SK-MEL-2，转移性皮肤黑素瘤；或SCC，鳞状细胞癌；PaCa2，胰腺癌细胞系；或HEP-G2，肝癌细胞系)组成。当与对照细胞系相比较时，癌细胞系显示和改变剂量依赖性反应，只在癌细胞中诱导细胞凋亡和细胞死亡。详细的示例性实验示于例如本文中的实施例3中。
应用测定法评估利用CoQ10处理后的上文中鉴定的细胞的mRNA和蛋白质水平组成的变化。使用特异于细胞凋亡、氧化性应激和抗氧化剂、血管生成和糖尿病的每一个的实时PCR微阵列分析mRNA表达的变化。使用抗体微阵列分析和western印迹分析法分析蛋白质表达的变化。这些实验的结果显示mRNA和蛋白质水平上的基因表达的变化因辅酶Q10的添加而在细胞系中发生。观察到已知与细胞代谢过程相关或参与其中的许多基因作为利用CoQ10处理的结果而被调节。例如，发现细胞核受体蛋白HNF4A的表达在Q10处理后在细胞中被上调。转醛醇酶1(TAL)的表达在用Q10处理的细胞中也被调节。TAL平衡NADPH和活性氧中间体的水平，从而调节线粒体跨膜电位，所述跨膜电位是ATP合成和细胞存活的关键检查点。已知与例如细胞凋亡、癌症生物学和细胞生长相关(特别是与肿瘤障碍的相关性)的许多基因被鉴定为受Q10调节。详细的示例性实验示于例如本文中的实施例4、6、7、8和9中。
Q10是线粒体中用于能量产生的氧化磷酸化过程的必需辅因子。通过分析来自用CoQ10处理的细胞的富集线粒体的制剂来测定存在于线粒体中的辅酶Q10的水平以及CoQ10的形式。存在于线粒体中的辅酶Q10的水平经确定在添加外源Q10后以时间和剂量依赖性方式增加。时间过程与如在与代谢和细胞凋亡途径相关的特定蛋白质的mRNA和蛋白质水平的调节中观察到的许多细胞变化相关。详细的示例性实验示于例如本文中的实施例5中。
本文中描述的结果将内源分子CoQ10鉴定为表观代谢转变剂。具体地，所述结果将CoQ10鉴定为诱导细胞中代谢状态的转变和线粒体功能的部分恢复。这些结论基于本文中描述的数据的下列解释和本领域内的现有知识。
已知Q10在线粒体内膜中合成，被主动运输至其中，富集在其中和用于其中。还已知Q10是线粒体中用于能量产生的氧化磷酸化过程的必需辅因子。然而，大多数癌细胞主要通过糖酵解，然后在细胞溶胶中进行乳酸发醇(而非如大多数正常细胞一样在线粒体中通过丙酮酸的氧化)来产生能量。氧化磷酸化包括电子传递复合物和细胞色素c。细胞凋亡包括线粒体的破裂，促细胞凋亡因子对线粒体内膜的透化。通过利用不同的代谢能量合成途径，癌细胞能够缓解对细胞的异常情况的正常细胞凋亡反应。然而不希望受理论束缚，本申请人提出Q10通过上调氧化磷酸化途径的蛋白质，从而使线粒体功能转换回可识别致癌缺陷和触发细胞凋亡的状态来起作用。因此，Q10通过转变细胞的代谢状态发挥表观代谢转变剂的作用。
实施例18：与肿瘤障碍相关的表观代谢转变剂的鉴定
利用不同水平的候选表观代谢转变剂处理一组皮肤细胞系，其由对照细胞系(例如，角质细胞和黑素细胞的原代培养物)和癌细胞系(例如，SK-MEL-28，非转移性皮肤黑素瘤；SK-MEL-2，转移性皮肤黑素瘤；或SCC，鳞状细胞癌；PaCa2，胰腺癌细胞系；或HEP-G2，肝癌细胞系)组成。通过检查细胞对候选表观代谢转变剂的敏感性和细胞凋亡反应来评估细胞形态学/生理学的变化。如实施例3中详细描述的进行这些实验。简而言之，通过在不同时间上和在一系列应用的浓度上监控细胞存活率来评估细胞系对候选表观代谢转变剂的敏感性。通过使用例如与流式细胞术方法组合的连接蛋白试剂来评估细胞对候选表观代谢转变剂的细胞凋亡反应。连接蛋白试剂包含两种染料7AAD和膜联蛋白-V-PE的组合，并且允许定量处于早期和晚期细胞凋亡的细胞群体。可利用例如ApostrandTM ELISA法，使用测量单链DNA的另外的细胞凋亡测定法。评估和比较患病细胞系和对照细胞系的敏感性和细胞凋亡反应。基于相对于正常或对照细胞它们优先或选择性抑制在癌细胞中的细胞生长的能力评估候选表观代谢转变剂。还基于相对于正常或对照细胞它们优先或选择性诱导癌细胞中的细胞凋亡的能力评估候选表观代谢转变剂。
应用测定法评估利用候选表观代谢转变剂处理后的上文中鉴定的细胞的mRNA和蛋白质水平组成的变化。使用实时PCR微阵列分析mRNA水平的变化。如实施例6和9-13中详细描述的进行这些实验。简而言之，在处理后不同时间上从细胞提取mRNA。通过使用靶向途径阵列(包括特异于细胞凋亡、氧化性应激和抗氧化防御、血管生成、热激或糖尿病的阵列)评估参与特定途径的基因的mRNA的水平。鉴定和评估了在它们的mRNA转录上被改变2倍水平或更高水平的基因。
使用抗体微阵列分析、与质谱表征偶联的2-D凝胶电泳分析和western印迹分析法分析蛋白质表达的变化。分别如实施例7、4和8中详细描述的进行这些实验。简而言之，在利用候选表观代谢转变剂处理后不同的时间上例如6小时或24小时，从细胞提取可溶性蛋白质。由候选表观代谢转变剂诱导的蛋白质水平的变化通过使用包含700多种蛋白质的抗体的抗体微阵列，获取许多蛋白质种类样品和潜在的途径标志来评估。通过使用偶联质谱技术的双向(2-D)凝胶电泳进行进一步的互补蛋白质组学分析。向细胞系中外源加入候选表观代谢转变剂，裂解细胞沉淀，将其经历2-D凝胶电泳。分析凝胶以鉴定经处理的样品相对于对照未处理的样品的蛋白质水平的变化。分析凝胶以鉴定因升高的水平、降低的水平或翻译后修饰而在处理的时间过程中引起的点变化。切取显示统计上显著的变化的点，利用胰蛋白酶消化和质谱表征对其进行蛋白质鉴定。利用例如Mascot和MSRAT软件分析针对蛋白质数据库搜索表征的肽，以鉴定所述蛋白质。除了上述2-D凝胶分析和抗体微阵列实验外，还可通过Western印迹分析评估由候选MIM诱导的特定蛋白质的水平的潜在变化。在所有蛋白质组学实验中，鉴定和评估了在不同细胞系中具有升高或下降的水平的蛋白质。
基于细胞系中因候选表观代谢转变剂的添加而诱导的基因表达在mRNA和/或蛋白质水平上的变化评估所述候选表观代谢转变剂。具体地，基于它们调节已知与细胞代谢过程相关或参与其中的基因的能力评估候选表观代谢转变剂。基于它们调节已知与例如细胞凋亡、癌症生物学和细胞生长相关的基因的能力评估候选表观代谢转变剂，特别是与肿瘤障碍的相关性。
使用本领域技术人员已知的常规方法测定候选表观代谢转变剂的水平以及候选表观代谢转变剂存在于细胞中的形式或具体的细胞定位。例如，通过分析来自用候选表观代谢转变剂处理的细胞的富集线粒体的制剂来测定线粒体中候选表观代谢转变剂随时间过去和在一系列剂量上的水平。可比较线粒体中候选表观代谢转变剂的水平和使该水平与观察到其他细胞变化例如，与代谢和细胞凋亡途径相关的特定蛋白质的mRNA和蛋白质水平的调节发生关系。
将基于获自上述实验的结果观察到诱导细胞的代谢状态的转变的候选表观代谢转变剂鉴定为表观代谢转变剂。例如，展示细胞毒性和/或诱导细胞的细胞凋亡的候选表观代谢转变剂被鉴定为表观代谢转变剂。优选，展示差异细胞毒性和/或差异诱导患病(癌症)细胞相对于正常细胞的细胞凋亡反应的候选表观代谢转变剂(例如，差异调节参与癌细胞相对于正常细胞的细胞凋亡的蛋白质的表达的表观代谢转变剂)被鉴定为表观代谢转变剂。
实施例19：维生素D3被鉴定为表观代谢转变剂
维生素D3或1α，25-二羟基维生素D3(也称为骨化三醇)是通过两步酶促法从维生素D合成的维生素D代谢产物。维生素D3与其遍在细胞核维生素D受体(VDR)相互作用以调节一系列参与钙和磷酸体内平衡以及细胞分裂和分化的基因的转录。已报导维生素D3在许多模型系统(包括鳞状细胞癌、前列腺腺癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌)中具有抗癌效应(综述于Deeb等人2007 Nature Reviews Cancer7：684-700)。
维生素D3的抗癌效应据报导牵涉多个机制，包括在细胞周期的G1期生长停止、细胞凋亡、肿瘤细胞分化、生长因子介导的细胞存活信号的中断和血管生成和细胞粘附的抑制(综述于Deeb等人2007Nature Reviews Cancer 7：684-700中)。例如，具体地在细胞凋亡方面，已报导维生素D3通过调节细胞凋亡的至关重要的介体，例如抑制抗细胞凋亡、促存活蛋白BCL2和BCL-XL的表达或诱导促细胞凋亡蛋白(例如，BAX、BAK和BAD)的表达来诱导细胞凋亡(Deeb等人2007)。在其他实例中，具体地在血管生成方面，已报导维生素D3抑制某些肿瘤来源的内皮细胞的增殖和抑制诱导肿瘤的血管生成的血管内皮生长因子(VEGF)的表达(综述于Masuda和Jones，2006 Mol.Cancer Ther.5(4)：797-8070中)。在另一个实例中，具体地在细胞周期停滞方面，已报导维生素D3诱导细胞周期依赖性激酶抑制剂p21WAFI/CIPI的基因表达和诱导细胞周期依赖性激酶抑制剂p27KIPI蛋白的合成和/或稳定，所述两者对于G1阻滞的诱导是至关重要的。(Deeb等人2007)。
基于上述观察，维生素D3被鉴定为表观代谢转变剂，即归因于其转变细胞的代谢状态。维生素D3是归因于其诱导细胞的细胞凋亡的能力，特别地基于其在患病的(癌症)细胞相对于正常细胞中差异性抑制细胞生长和诱导细胞凋亡反应(例如，差异性调节参与相对于正常细胞的癌细胞的细胞凋亡的蛋白质例如BCL-2、BCL-XL和BAX的表达)的能力的表观代谢转变剂。
实施例20：致癌和正常细胞对辅酶Q10的相对敏感性
检查和比较辅酶Q10处理对多种致癌和正常细胞系的效应。通过监控细胞凋亡的诱导评估细胞对辅酶Q10的敏感性。如下面在材料和方法中所述进行细胞的CoQ10处理。通过监控如下所述的早期细胞凋亡的指标(例如，Bcl-2表达、半胱天冬酶激活和通过使用膜联蛋白V测定法)评估被处理的细胞中细胞凋亡的诱导。根据这些研究，确定诱导在一组细胞系中诱导细胞凋亡所需的最少CoQ10剂量例如CoQ10的浓度和处理时间。
在意外的令人惊讶的结果中，数据显示辅酶Q10处理的功效在展示增加的致癌性和/或更大的转移潜能的细胞类型，即来源于更具侵袭性的癌症或肿瘤的细胞类型中更大。这些研究的结果概述于下表29中。数据显示CoQ10以时间和浓度依赖性方式对处于更具侵袭性的癌症状态中的细胞更有效。此外，在正常细胞(相对于致癌细胞)上观察到令人惊讶的差异效应。特别地，意外地发现辅酶Q10在正常组织环境中展示轻微的支持作用，其中在正常细胞(包括角质细胞和真皮成纤维细胞)中观察到增加的增殖和迁移。
辅酶Q10对基因调控和蛋白质机制的效应在癌症中与在正常细胞中不同。至关重要的细胞机制和组成例如膜流动性、转运机制、免疫调节、血管生成、细胞周期控制、基因组稳定性、氧化控制、糖酵解流、代谢控制和细胞外基质蛋白质的完整性失调，从而细胞的遗传和分子指纹被改变。疾病环境有利于细胞控制过程的管理。本文中提供的数据表明CoQ10通过以允许恢复细胞凋亡潜能的方式标准化一些关键的上述过程来发挥更大水平的功效(例如，在癌细胞和正常细胞中，和在与不太具有侵袭性或非侵袭性癌症状态的细胞相比较更具侵袭性癌症状态的细胞中)。
表29：在不同细胞类型中诱导早期细胞凋亡所需的最低CoQ10浓度和处理时间
Figure BPA00001497260601451
Figure BPA00001497260601461
材料和方法
细胞的制备和处理
培养皿或培养瓶中制备的细胞
将细胞于37℃、5％CO2水平的培养箱中培养在具有补充有10％胎牛血清(FBS)、1％PSA(青霉素、链霉素、两性霉素B)(Invitrogen和Cellgro)的相关培养基的T-75培养瓶中直至达到70-80％的汇合。为了收获细胞用于处理，用1mL胰蛋白酶预处理培养瓶，吸出，利用另外3mL进行胰蛋白酶处理，然后在37℃下温育3-5分钟。随后用等体积的培养基中和细胞，以10,000rpm离心随后的溶液8分钟。吸出上清液，利用8。5ml培养基重悬浮细胞。利用库耳特计数器读取500ul重悬浮液和9.5ml异丙醇的混合物2次，确定待接种至每一个培养皿中的细胞的适当数量。以一式三份检查对照组和浓度为0-200μM的组。从500μM CoQ-10原液进行系列稀释以在适当的培养皿中获得所需的实验浓度。取决于细胞类型和实验方案，将培养皿在37℃、5％的CO2水平的培养箱中温育0至72小时。
蛋白质的分离和定量
培养皿中制备的细胞
在细胞处理温育期结束后，进行蛋白质分离。用2ml冰冷的1x磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤所有处理组的培养皿2次，再用1ml该溶液洗涤1次。仅在初始2次洗涤后从培养皿吸出PBS。轻轻地括取细胞，使用来自第三次洗涤的终体积将其收集入微量离心管中，以10,000rpm离心10分钟。离心后，吸出上清液，利用50uL裂解缓冲液(对于每100uL裂解缓冲液而言1uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂)裂解沉淀。随后在-20℃下冷冻样品过夜。
培养瓶中制备的细胞
在细胞处理温育期结束后，进行蛋白质分离。用5ml冰冷的1xPBS洗涤所有处理组的培养瓶2次，再用3mL该溶液洗涤1次。仅在初始2次洗涤后从培养皿吸出PBS。轻轻地括取细胞，使用来自第三次洗涤的终体积将其收集入15mL离心管中，以10,000rpm离心10分钟。离心后，吸出上清液，利用适当量的裂解缓冲液(对于每100uL裂解缓冲液而言1uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂)裂解沉淀。裂解缓冲液体积取决于沉淀大小。将样品转移至微量离心管中，在-20℃下冷冻样品过夜。
蛋白质定量
将样品在-4℃下解冻，超声处理以确保在蛋白质分离后当天匀化。使用微BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)进行蛋白质定量。为了制备用于免疫印迹分析的样品，制备1∶19的β巯基乙醇(Sigma)对样品缓冲液(Bio-Rad)的溶液。利用β巯基乙醇-样品缓冲液以1∶1稀释样品，于95℃下煮沸5分钟，然后在-20℃下冷冻过夜。
免疫印迹分析
Bcl-2，半胱天冬酶，9，细胞色素c
使用从BAC蛋白质测定获得的蛋白质的原始平均浓度确定每孔加载的样品的体积。对于每一个处理时间点加载约30-60μg蛋白质。以一式三份在85和100伏下，在12％Tris-HCl预制胶(Bio-Rad)或手动浇注胶上于1x电泳缓冲液中进行蛋白质电泳。随后在100伏下将蛋白质转移至硝酸纤维素纸上，进行1小时，然后在5％牛奶溶液再封闭1小时。将膜在-4℃下置于一抗(1uL Ab：1000uL TBST)(CellSignaling)中过夜。第2天，用Tris-缓冲的盐溶液Tween-20(TBST)洗涤膜3次，每次10分钟，然后在-4℃下应用二抗(抗兔；1uL Ab：1000uLTBST)，进行1小时。再用TBST洗涤膜3次，每次10分钟，完成使用Pico或Femto底物的化学发光(Pierce)。随后以产生最佳视觉结果的时间间隔使膜显影。在显影后，将膜于-4℃下保持在TBST中直至可测量肌动蛋白水平。
肌动蛋白
将膜在-4℃下置于肌动蛋白一抗(1uL Ab：5000uL TBST)(CellSignaling)中进行1小时，用TBST洗涤3次，每次10分钟，然后在-4℃下应用二抗(抗小鼠；1uL Ab：1000uL TBST)，进行1小时。再用TBST洗涤膜3次，每次10分钟，完成使用Pico底物的化学发光(Pierce)。随后以产生最佳视觉结果的时间间隔使膜显影。
钙磷脂结合蛋白V测定法
将细胞于PBS10X中洗涤2次，重悬浮于结合缓冲液(0.1MHEPES，pH 7.4；1.4M NaCl；25mM CaCl2)中。向具有5μL膜联蛋白-PE染料或7-ADD的培养管中加入100μL的样品。混合细胞，将其在室温下无光温育15分钟。之后，向每一个样品中加入400μL 1X结合缓冲液，将它们经历利用流式细胞术的分析。
本文中的实施例21-25获自第WO 2008/116135号国际公布。将其内容通过引用整体并入本文。
实施例21：制备包含戊二醇的CoQ10 22％浓缩物的方法
利用CoQ10作为亲脂性生物活性剂产生浓缩物。将约10千克(kg)聚山梨醇酯80置于真空锅中，加热至约50℃至约65℃的温度。将约8.8kg CoQ10加入至聚山梨醇酯80，施加真空，温度维持在约50℃至约65℃，然后混合内容物进行约15分钟。在本文中可将所获得的物质称为CoQ10相或第一相。将CoQ10溶解在聚山梨醇酯80中，使真空锅密封，真空打开，聚山梨酯/CoQ10的混合物的温度为约50℃至约55℃。
在分开的锅中，将约15.8kg的水加热至约50℃至约55℃的温度，将约0.2kg苯氧乙醇和约2kg戊二醇、USP加入水中并且混合直至澄清和均匀。随后加入8kg85G直至被分散。在本文中可将所获得的物质称为水相或第二相。水相实现氢化卵磷脂(Phospholipon)型卵磷脂的均匀分散和水合并且在约50℃至约55℃的温度下被加入至下述CoQ10/聚山梨酯液体中。
Silverson在线生产规模均浆器与用于实验室规模批量的Silverson L4RT型相似，被用于组合上述两相(即，CoQ10相和水相)。使用Silverson标准乳剂头筛(standard emulsion head screen)，通过在快速搅拌的条件下在约50℃至约55℃的温度下，通过闭合再循环环(closed recirculating loop)和在真空(从约18mM至约20mM Hg)下以全容量(从约7000rpm至约10,000rpm)混合总共约5分钟进行匀化，直至溶解的CoQ10完全被封装和均匀地分散，从而产生浓稠的均匀脂质体分散体。所获得的CoQ10浓缩物具有按重量计浓度为约22％的CoQ10。
Figure BPA00001497260601493
85G的浓度按重量计为约8％的总组合物(即上述两相的组合)。
在分开的实验中，产生1kg实验室批量的上述22％CoQ10浓缩物，在匀化过程中以5分钟的间隔获取样品。按照制造商的指导，利用激光衍射设备(Malvern 2000)测定脂质体不同取样时间时的粒度。匀化过程的详细内容和在匀化过程中获得的粒度示于下面表30中。
表30
Figure BPA00001497260601501
如可从表30看到的，上述CoQ10浓缩物配方和方法能够产生具有107nm的平均直径和在约59nm至约279nm的大小范围内包括85％的所有产生的脂质体的粒径分布的脂质体。短处理时间(约5分钟)正好像长处理时间(约45分钟)一样有效地产生CoQ10的脂质体分散体。如可从上文看到的，当不将CoQ10暴露于约55℃以上的温度时获得最佳的脂质体颗粒。
实施例22：制备2％卡波姆分散体的方法
制备交联的丙烯酸聚合物以用作乳膏组合物中的粘稠剂(viscosity agent)。将所使用的丙烯酸卡波姆940配制于具有下面表31中所示的下列成分的2％分散体中：
表31
  相   商品名称   DTFA名称   百分比   量(Kg)
  1   苯氧乙醇   苯氧乙醇   0.500   0.0750
  1   Hydrolite-5   戊二醇   5.000   0.7500
  2   纯化水，USP   水   92.500   13.8750
  3   ACRITAMER 940   卡波姆940   2.000   0.3000
  总计   100.000   15.0000
如下进行制造过程。首先清洁和消毒设备。在实验台上，混合相1成分直至澄清和均匀。称取所需量的水(相2)，加入至上文实施例1中所述的匀浆器的相容器锅中。用热水/蒸汽套将水加热至约60℃至约65℃的温度。随后在缓慢搅拌的条件下将相1加入至相2水直至澄清和均匀。用工艺用水漂洗相1容器，使温度维持在约60℃至约65℃。然后将搅拌器在高档上打开，加入卡波姆940粉剂(相3)。
将温度维持在约60℃至约65℃并且以约500rpm至约800rpm的中-高速连续混合直至加入全部卡波姆940粉剂。将卡波姆粉剂缓慢地加入相1和2的混合的涡旋中。用手缓慢地筛粉剂以便在不短于约10分钟的时间加入卡波姆的总量。
以中-高速搅拌继续混合直至所有粉剂完全分散并且无“鱼眼(fish-eyes)”存在。这样进行制备过程以便所有未中和的卡波姆940粉剂完全分散，以产生完全水合的卡波姆聚合物的纯净半透明分散体。批量的搅拌高至足以产生可见涡旋，但并未高至引起批量飞溅。在约60分钟至约90分钟的时间段内以约800rpm至约1300rpm的高速度进行批量的充分混合。在混合开始时将批量温度维持在约60℃至约65℃，在混合过程维持在约55℃至约65℃。升高的温度有助于卡波姆聚合物分散和帮助防止团聚。
利用冷冻的水通过夹套将批量冷却至约25℃至约30℃，继续以中高速混合来进行混合。取出样品以测定微质量(microquality)、pH、比重和粘度。
实施例23：使用CoQ10 22％浓缩物制备CoQ10乳膏(1.5％、3.0％和5.0％)的方法
利用几个相与具有实施例1的脂质体的CoQ10浓缩物组合来形成乳膏乳液基质。组合A、B、C和D相以形成基质乳膏。E相是实施例的CoQ10 22％浓缩物(22％w/w CoQ10)。乳膏乳液基质的制备和随后实施例1的CoQ10 22％浓缩物的添加的细节示于下面。
为了制备具有按重量计1.5％的CoQ10 22％浓缩物的乳膏(“CoQ10乳膏1.5％”)，用于组合多个相的方法如下，成分示于下面表32-37中：
表32
CoQ10乳膏1.5％
相A(“油相”)包含C12-15烷基苯甲酸盐，其是为了柔润性(emolliency)和铺展性能(spreadability)而添加的光酯(1ight ester)。鲸蜡醇和硬脂醇是为了赋予乳膏实体或质地而添加的蜡类，并且硬脂酸甘油酯和PEG-100硬脂酸酯混合物是为了形成水包油(o/w)乳剂而包含的主要乳化剂。在实验台上，在真空锅中称取A相成分的重量，将其在水浴中加热至约70℃至约75℃。
表33
Figure BPA00001497260601531
B相(“水相”)包含用于皮肤湿润和保湿(humectancy)的甘油；用于保湿的丙二醇，以促进皮肤穿透和改善微生物防腐特征；增强脂质体的CoQ10皮肤穿透的乙氧基二甘醇；用于微生物防腐的苯氧乙醇；作为溶剂相的纯化水和上述实施例2的控制乳膏制剂的流变性质和增加初乳稳定性的卡波姆940分散体。
将B相成分置于单独的混合锅中。通过适度的扫掠式混合来混合成分，同时加热至约与70℃至约75℃(非真空)。当B相成分达到约70℃至约75℃时，在适度的扫掠式混合的情况下，在约70℃至约75℃下加入A相成分。将A和B相的混合物通过上文实施例1中所述的Silverson匀化器(标准头)再循环，然后继续所述方法的下一部分。
表34
  相   商品名称   CTFA名称   百分比   量(g)
  C   TEALAN 99％   三乙醇胺   1.300   0.2600
  C   RITALAC LA USP   乳酸   0.300   0.0600
  C   RITALAC NAL   乳酸钠，水   2.000   0.4000
  C   蒸馏水   水   3.312   0.6624
在C相(“中和和缓冲相”)中，纯化水用作该相中其他成分的溶剂和稀释剂。三乙醇胺是水相(B相)中的卡波姆丙烯酸共聚物的主要中和剂；将乳酸钠溶液(60％w/w于水中)和乳酸作为缓冲系统加入以将乳膏的终pH从约5调整至约5.5并且维持终pH，所述pH在皮肤的天然pH范围内。
在实验台上，称取C相成分的重量，混合，直到均匀，并且加热至约60℃至约65℃。随后将C相成分加入装有A和B相的真空混合锅中，将扫掠式混合器(扫描搅拌器)置于中高档。
持续混合，同时移至方法的下一部分。
表35
  相   商品名称   CTFA名称   百分比   量(g)
  D  二氧化钛，#3328   二氧化钛   1.00   0.2000
D相(“色素相”)。将水可分散级的二氧化钛粉剂用于制剂，目的仅是减褪终乳膏颜色的色泽。通过加入约1％w/w二氧化钛，由CoQ10赋予的乳膏的橘黄色大大减褪并且在美学上得到改观。
关于D相的处理，向批量(A、B和C相)加入已称重的TiO2，混合，将其通过Silverson匀化器(高剪切头)再循环，进行约10分钟或直至完全均匀并且完全散开(检查颜色以进行确认)。
重要地要确保二氧化钛不在扫掠式混合叶片上团聚或团集；这通过目视检查来确认。将上文实施例1中所述的Silverson在线匀化器与高剪切筛一起用于确保使二氧化钛最大程度地松团和研磨。用Hegman PH-175研磨细度计量器检查二氧化钛的终分散体。
表36
Figure BPA00001497260601541
终止再循环，将批量冷却至约50℃至约55℃，扫掠式搅拌器被设置在中档，速度约30rpm。将来自实施例1的先前已称重的CoQ1022％浓缩物(E相)升温至约45℃至约50℃，然后加入至批量(A、B、C和D相)中。
应用真空，通过扫掠式搅拌以约60rpm混合将所有相直至均匀。将温度维持在约50℃。
以约60rpm的速度混合并且应用真空，将批量冷却至约35℃至约45℃。
将所得的材料置于贮藏容器中。
为了制备具有按重量计3％(“CoQ10乳膏3％”)的CoQ10 22％浓缩物的乳膏，按照与对于形成具有按重量计1.5％的CoQ10 22％浓缩物的乳膏(“CoQ10乳膏1.5％”)所述方法完全相同的方法进行。用于各相的材料和使用的量示于下面表37-41中：
表37
表38
Figure BPA00001497260601561
表39
  相   商品名称   CTFA名称   百分比   量(g)
  C   TEALAN 99％   三乙醇胺   1.300   0.2600
  C   RITALAC LA   乳酸   0.500   0.1000
  C   RITALAC NAL   乳酸钠，水   2.000   0.4000
  C   纯化水，USP   水   2.487   0.4974
表40
  相   商品名称   CTFA名称   百分比   量(g)
  D  二氧化钛，#3328   二氧化钛   1.000   0.2000
表41
Figure BPA00001497260601562
通过使用按重量计约25％的量的来自实施例1的CoQ10 22％浓缩物制备相似的乳膏，以产生具有按重量计约5％的浓度的CoQ1022％浓缩物的乳膏。
具有按重量计1.5％CoQ10、按重量计3％CoQ10和按重量计5％CoQ10的CoQ10乳膏的含量的概述分别示于下面表42、43和44中。应注意，在所有上面和下面给出的关于CoQ10乳膏的制剂实例中，所使用的CoQ10 22％浓缩物的量实际上可产生高于目标浓度约5％的CoQ10 22％浓缩物的终理论浓度。因此，对于“CoQ10乳膏1.5％”，所使用的实际批量量为按重量计7.5％的CoQ10 22％浓缩物，其产生1.58％w/w CoQ10。“CoQ10乳膏3％”利用按重量计15％的CoQ10 22％浓缩物来制备，其产生按重量计3.15％CoQ10的理论含量。加入5％的过量药物以延长产品的总贮存期并且维持约90％至约110％的标签或期望的药物含量的药物含量。
表42
CoQ10乳膏，1.5％
Figure BPA00001497260601571
Figure BPA00001497260601581
表43
Figure BPA00001497260601582
Figure BPA00001497260601583
Figure BPA00001497260601591
表44
CoQ10乳膏5％
Figure BPA00001497260601592
注意：向CoQ10乳膏1.5％、CoQ10乳膏3.0％和CoQ10乳膏5％批量中加入5％制备过量的CoQ10 22％浓缩物(1.5％+0.075％、3％+0.15％以及5％+2.5％)。
实施例24：CoQ10乳膏(1.5％、3.0％或5.0％)的局部施用
将上面实施例3中产生的具有CoQ10的乳膏(即，CoQ10乳膏1.5％、CoQ10乳膏3％和CoQ10乳膏5％)用于猪皮肤。对两头猪(一头雄性和一头雌性)各自进行局部剂量研究，每一个动物具有6个测试区域；每一侧上3个测试区域。对于每一头猪，每天一次对一侧(3个位置)给药，进行7天，然而仅在第1天对每头猪的相对测试侧(3个测试区域)给药1次。将利用乙氧基二甘醇制备的来自实施例3的乳膏用于雄性动物上。雌性动物接受3个测试制剂，除了它们包含5％1，3-丁二醇而非5％乙氧基二甘醇外，所述制剂包含与上面实施例3中产生的样品相同的成分。用1，3-丁二醇制备的这些制剂(其具有按重量计1.5％的CoQ10 22％浓缩物、按重量计3％的CoQ10 22％浓缩物和按重量计5％的CoQ10 22％浓缩物)的细节分别示于表45、46和47中。
表45
CoQ10乳膏1.5％标称活性
丁二醇基质
Figure BPA00001497260601601
Figure BPA00001497260601611
Figure BPA00001497260601612
表46
CoQ10乳膏3％标称活性
丁二醇基质
Figure BPA00001497260601613
Figure BPA00001497260601621
表47
CoQ10乳膏5％标称活性
丁二醇基质
Figure BPA00001497260601622
Figure BPA00001497260601631
使所有动物接受为200mg的相同剂量的每一种制剂(达到121cm2施用面积)一次或每天一次进行7天。
在施用后，如下获得和分析皮肤样品。用中性肥皂和水的混合物(例如，1％Ivory肥皂水或等同物)轻轻清洗皮肤测试区域以除去任何残留局部测试制剂。如果待切取的区域大于给药区域，那么用消不去的墨水给给药区域划界以描绘出给药的皮肤区域的轮廓。利用解剖刀切取具有大小约10cm×10cm、深度包括脂肪层的全层皮肤切片。在切取后，将皮肤切片平放，用两层保鲜膜(plastic wrap)(SARANWRAP.TM.或等同物)包裹，及时冷冻至约-70℃或更冷。每一个皮肤切片被鉴定为合适的(例如，动物身份验证、研究编号、日期等)。将样品维持在约-70℃或更低直至检查。
将每一个皮肤切片置于不透水的塑料袋中并且于约30℃至约35℃的水浴中解冻。解冻后，用蒸馏去离子水轻轻漂洗每一个皮肤切片以除去任何残留表面剂量和血液。利用解剖刀除去所有皮下组织(例如，脂肪)至丘疹真皮的水平。
随后用胶带(TRANSPORE.TM.，来自3M)剥脱每一个皮肤切片约10次至约20次直至观察到约10-25％的表面闪烁。该过程除去了角质层和任何残留表面剂量。
在每一个全层皮肤片上，用墨水给6个区域划界。划界的区域面积为1cm2。
将每一个皮肤切片置于防水塑料袋中并且浸没于约65℃(.+/-.3℃)水浴中以开始表皮与真皮的分离过程。随后利用打孔器(punch)从皮肤切取测试位置，用摄子从真皮除去表皮。称取单个皮肤切片的重量，记录重量。用解剖刀切碎单个皮肤切片，将其置于预标记的管内，保存以用于随后分析。
在振荡器上于异丙醇(IPA)中提取皮肤样品，进行约47小时，随后于约-20℃下贮存直至进一步处理。随后以约13,500rpm离心样品约10分钟，将上清液收集入2mL琥珀小瓶(amber vials)中。
利用高效液相色谱(HPLC-UV)定量CoQ10。简而言之，在Hewlett-Packard 1100 Series HPLC系统上，利用Agilent 1100 SeriesLC/MSD进行HPLC。将包含约65％乙醇和约35％甲醇的溶剂系统以约1mL/分钟的流速通过Aquasil C18柱子(约3mm.×约100mm，5.mu.)。注射10微升的样品。使用从净标准制作的外标准曲线将峰面积定量为浓度。曲线因CoQ10在水中的溶解度问题而被搀入IPA。
迷你猪皮肤中CoQ10的含量的结果概述于图1和2以及下列表48和49中。针对组织重量校正每皮肤切片6个重复，求其平均数以获得每一个给药位置的平均值。
表48：平均值±SD组织重量(n＝42)
  供体#   表皮(克)   真皮(gm)
  5061873(雄性)   0.037±0.012   0.382±0.129
  5061521(雌性)   0.026±0.007   0.603±0.090
表49：猪皮肤中测量的CoQ10的浓度的平均值±SD(n＝6/部分)
  供体#   性别   侧面   剂量(mg)   表皮(μg/gm)   真皮(μg/gm)
  5061873   雄性   左   1.5   137.7±58.2   0.72±1.12
  5061873   雄性   左   3.0   188.7±40.3   ＜LLQ
  5061873   雄性   左   5.0   163.4±39.1   0.16±0.39
  5061873   雄性   右   1.5   519.3±101.2   0.93±0.81
  5061873   雄性   右   3.0   315.0±227.0   ＜LLQ
  5061873   雄性   右   5.0   331.2±128.7   ＜LLQ
  5061873   雄性   中   0   24.6±11.5   ＜LLQ
  5061521   雌性   左   1.5   135.6±39.2   ＜LLQ
  5061521   雌性   左   3.0   211.8±60.5   ＜LLQ
  5061521   雌性   左   5.0   211.9±67.8   ＜LLQ
  5061521   雌性   右   1.5   118.4±32.6   ＜LLQ
  5061521   雌性   右   3.0   84.7±24.6   ＜LLQ
  5061521   雌性   右   5.0   118.1±26.6   ＜LLQ
  5061521   雌性   中   0   25.7±21.8   ＜LLQ
＜LLQ＝低于质量验证范围的下水平(即，未检测到)
所述数据显示在所有表皮样品和所选择的真皮样品中观察到可检测量的CoQ10。
发现表皮的所有给药位置以显著高于非给药位置的水平包含CoQ10(p＜0.001)。
在雄性或雌性猪皮肤切片中在3个给药浓度之间CoQ10的表皮含量之间不存在显著差异(p＞0.02)。
在雄性与雌性猪之间，对于来自动物的右侧的位置(第一天给药)，来自雄性皮肤的1.5％CoQ10和5％CoQ10的施用剂量的表皮含量显著高于在雌性皮肤中看到的含量(p＜0.003)，但对于3％CoQ10剂量却并非如此(p＝0.0329)。因此，如可从数据中看到的，乙氧基二甘醇制剂相对于丁二醇制剂的基于单次剂量的CoQ10的透入性显著更大(p＜0.003，对于1.5％和5％剂量，以及p＝0.0329，对于3％剂量)。
对于全部3个剂量施用，对于7天的给药期(左侧)，雄性和雌性皮肤切片的表皮水平在统计上是相同的。
对于来自7天的给药期(左侧)的1.5％CoQ10和5％CoQ10剂量施用，和来自1天的给药期(右侧)的1.5％CoQ10剂量施用，只在雄性皮肤切片中观察到真皮含量。
数据的概述如下提供了于表50中：
表50
Figure BPA00001497260601661
Figure BPA00001497260601671
如果要将表50的数据外推至皮肤的总面积，那么CoQ10的透入性可如下面表51中所示的。
表51
Figure BPA00001497260601672
Figure BPA00001497260601673
对于5％、3％和1.5％CoQ10乳膏制剂，CoQ10乳膏制剂的单次施用分别递送平均12％、17％或70％的施用的剂量。一般而言，乙氧基二甘醇制剂相对于丁二醇制剂的基于单次剂量的CoQ10的透入性显著更高(p＜0.003，对于1.5％和5％剂量，以及p＝0.0329，对于3％剂量)。数据显示随着施用浓度达到3％CoQ10，表皮含量存在上升，5％CoQ10剂量基本上等同于3％CoQ10剂量。这意味着皮肤被3％CoQ10剂量的CoQ10饱和，或媒介物不能递送更多高于3％CoQ10浓度的CoQ10。可看到在7天的局部施用后皮肤中达到的水平在2个动物之间是相同的。
关于乙氧基二甘醇制剂和关于单次施用数据，获得对于各自含1.5％、3％和5％乙氧基二甘醇的乳膏获得73.8％、16.6％和13.3％的平均透入性。
有趣且意外的发现是对于1.5％乳膏在表皮中发现的CoQ10的不成比例的量，测试的CoQ10的最低剂量。不希望受任何理论束缚，CoQ10的该增强的透入性可以是乳膏制剂中CoQ10对乙氧基二甘醇的比率的函数，或可能与乙氧基二甘醇对CoQ10和磷脂脂质体的比率相关。乙氧基二甘醇对包含更低浓度的CoQ10的乳膏中使用的CoQ10的相对更高的比率可以是表皮中发现的CoQ10的更高量的原因。
1.5％乳膏和3％乳膏也成功地完成了9周的加速测试(在约35℃和约50℃下贮存)；经历了5次包装在塑料罐和金属管包装中的冻融循环；和经历了USP微生物诱发试验。利用多个产生的批量和以按重量计1.5％、3％和5％的CoQ10在乳膏原型制剂基质中的浓度验证相同系统的结果。
实施例25：使用CoQ10 21％浓缩物形成CoQ10乳膏(1.5％、3.0％和5.0％)的方法
如上面实施例3中所述(除了利用丙二醇而非戊二醇(1，2-戊二醇；Hydrolite-5，Symrise)外)产生乳膏。如上面实施例1中所述首先产生浓缩物，成分列于下面表52中：
表52：批量制剂-CoQ 10浓缩物
Figure BPA00001497260601691
所得的CoQ10浓缩物(CoQ10 21％浓缩物)具有按重量计约21％的浓度的CoQ10。
如上面实施例2中所述制备卡波姆分散体以用于形成具有下面表53中所列的成分的乳膏：
表53：批量制剂-卡波姆分散体
Figure BPA00001497260601692
如上面实施例3中所述制备具有按重量计1.5％的CoQ10 21％浓缩物的乳膏和具有按重量计3％的CoQ10 21％浓缩物的另一种乳膏，成分列于下表54和55中：
表54：批量制剂-CoQ10乳膏1.5％
Figure BPA00001497260601701
表55：批量制剂-CoQ10乳膏3％
Figure BPA00001497260601702
Figure BPA00001497260601711
实施例26：形成包含丙二醇的CoQ10 21％浓缩物的方法
通过将下述A相和B相组合制备CoQ10 21％浓缩物合物。A相包含21％w/w的泛癸利酮USP(CoQ10)和25％w/w的聚山梨醇酯80NF。B相包含10.00％w/w的丙二醇USP、0.50％w/w的苯氧乙醇NF、8.00％w/w的卵磷脂NF(PHOSPHOLIPON 85G)和35.50％w/w的纯化水USP。所有重量百分比是相对于整个CoQ10 21％浓缩组合物的重量的。百分比和其他细节列于下表中。
表56
  相   商品名称   INCI名称   百分比
  A   RITABATE 80   聚山梨醇酯80   25.000
  A   泛癸利酮   泛醌   21.000
  B   纯化水   水   35.500
  B   丙二醇   丙二醇   10.000
  B   苯氧乙醇   苯氧乙醇   0.500
  B   PHOSPHOLIPON 85G   卵磷脂   8.000
  总计   100.000
将苯氧乙醇和丙二醇置于适当的容器中并且混合直至澄清。向第二容器(搅拌罐1)中加入需要量的水。在混合的条件下，将搅拌罐1加热至45至55℃。向水中加入苯氧乙醇/丙二醇溶液并且混合直至其变澄清和均匀。当搅拌罐1中水相的内容物在45至55℃的范围内时，在低速或中速混合的条件下加入Phospholipon G。同时为了避免任何起泡，混合搅拌罐1的内容物直至将Phospholipon 85G均匀分散。将聚山梨醇酯89加入适当的容器(搅拌罐2)并且加热至50至60℃。随后将泛癸利酮加入搅拌罐2。同时将温度保持在50至60℃之间，混合搅拌罐2直至全部泛癸利酮溶解。在全部泛癸利酮溶解后，缓慢地将水相转移至搅拌罐2。当混合所有材料时，使内容物匀化直至分散体纯净且均匀。同时必须小心不要过热，使温度维持在50至60℃。随后终止匀化，将搅拌罐2的内容物转移至适当的容器中贮存。
实施例27：形成0.5kg批量的包含丙二醇的CoQ10 21％浓缩物的方法
通过如上所述组合A相和B相来制备0.5kg CoQ10 21％浓缩物。A相包含21％w/w的泛癸利酮USP(CoQ10)和25％w/w的聚山梨醇酯80NF。B相包含10.00％w/w的丙二醇USP、0.50％w/w的苯氧乙醇NF、8.00％w/w的卵磷脂NF(PHOSPHOLIPON 85G)和35.50％w/w的纯化水USP。所有重量百分比是相对于整个CoQ10乳膏21％浓缩物组合物的重的百分比。百分比、量和其他细节列于下列表。
表57
  相   商品名称   INCI名称   百分比   量(Kg)
  A   RITABATE 80   聚山梨醇酯80   25.000   0.1250
  A   泛癸利酮   泛醌   21.000   0.1050
  B   纯化水   水   35.500   0.1775
  B   丙二醇   丙二醇   10.000   0.0500
  B   苯氧乙醇   苯氧乙醇   0.500   0.0025
  B   PHOSPHOLIPON 85G   卵磷脂   8.000   0.0400
  总计   100.000   0.5000
所有设备是干净和清洁的。将聚山梨醇酯80在PK-2锅中直接称重，在真空锅PK-2中加热至50-55℃。在实验台上称取泛癸利酮USP的重量，在加入配衡的PK-2容器(搅拌器关闭)后再次检查重量。关闭并且密封PK-2。利用底部的快速混合器混合关闭且封闭的PK-2，同时维持50-55℃的温度和真空，进行15分钟。检查所述相以确保在移至下一步骤之前所有粉剂已溶解在聚山梨醇酯中。在PK-1中，加入所需量的水，加热至50-55℃。在实验台上，称取苯氧乙醇和Hydrolite-5的重量，进行混合直至澄清和均匀，在缓慢混合的条件下加入水直至澄清和均匀。当上述水混合物达到50-55℃时，在以低中速混合的条件下加入卵磷脂，避免起泡，混合直至分散。将水相从PK-1转移至5加仑的容器。将水相和CoQ10相维持在50-55℃，在适度的扫掠式混合的条件下将水相加入CoQ10相。在将所有材料转移至PK-2后，将批量以7000rpm通过具有标准剪切头的Silverson再循环，进行3-5分钟，使PK-2容器关闭并且打开真空。将温度维持在50-55℃，并且不让其过夜。终止循环，在适度的扫掠式混合的条件下将批量冷却至30-35℃。将浓缩物泵入临时转移容器。
实施例28：制备20kg批量的包含丙二醇的CoQ10 21％浓缩物的方法
通过将A、B和C相的成分组合来制备20kg批量的CoQ10 21％浓缩物。A相包含25.00％w/w的聚山梨醇酯80NF和21.00％w/w的泛癸利酮USP。B相包含10.00％w/w的丙二醇USP和0.50％w/w的苯氧乙醇NF。C相包含35.50％w/w的纯化水USP和8.00％w/w的卵磷脂NF。百分比、量和其他细节示于下表中。
表58
Figure BPA00001497260601741
在制备20kg批量的CoQ10 21％浓缩物中，清洁区域并且验证其清洁。使所有设备清洁并且在校准期内。称取100.0gm苯氧乙醇，将其置于干净的烧杯中。
为了制备B相，称取2000克(2,000gm)的丙二醇，置于干净的2-LSS烧杯中。此外，称取2000gm的纯化水，置于标记有“漂洗用水”的容器中。
向装有预称重的2,000gm丙二醇的2-L SS烧杯中加入预称重的100gm苯氧乙醇。用1/3漂洗用水将装有苯氧乙醇的烧杯漂洗入2-L烧杯。用抹刀混合2-L烧杯的内容物直至澄清和均匀，将其标记为B相。
在下一步骤中，称取1,600gm的卵磷脂和称取5,100gm的纯化水。将适当标记的字符置于PK-1的温度记录器TIC-1和PK-2.5的TIC-2中，将100gm纯化水加入PK-1，将水在PK-1中手动加热至50-55℃。打开搅拌器，维持微小涡旋。随后将B相溶液从2-L SS烧杯缓慢地加入PK-1中。随后用约1/3的漂洗用水漂洗SS烧杯。将漂洗液缓慢地加入PK-1。手动将温度维持在50-55℃。随后缓慢地加入卵磷脂，混合直至其分散。手动将温度维持在50-55℃，混合直至B相准备转移至PK-2。
为了制备A相，称取5,000gm聚山梨醇酯80，将其置于干净的容器中，称取4,200gm泛癸利酮USP。为了混合浓缩物，设备包括Lee具空箱(PK-2)、Silverson匀化器(P-2)和Waukesha泵(P-1)。首先，确认PK-2的底阀关闭。随后通过观察镜口将预称重的5,000gm聚山梨醇酯80加入PK-2。在添加完成后将观察镜放回PK-2上。
随后打开PK-2搅拌器，手动将聚山梨醇酯80于PK-2中加热至50-55℃。当聚山梨醇酯80的温度达到该温度范围时，通过PK-2上的入口加入4,200gm预称重的泛癸利酮USP。使用抹刀除去在添加期间粘结在搅拌器叶片上的任何泛癸利酮。当完成添加后，施加观察镜。手动将温度维持在50-55℃并且混合15分钟。通过观察镜入口检查PK-2的内容物以评估泛癸利酮是否溶解在聚山梨醇酯80中。随后关闭PK-1搅拌器(A-1)。
通过PK-2的入口，将PK-1(B相)的内容物加入PK-2。随后用剩余的“漂洗用水”漂洗PK-1。手动将PK-2加热至50-55℃。随后将PK-2的内容物通过P-1和P-2进行再循环，P-2中的Silverson高剪切筛以最大rpm进行5-10分钟。打开真空，将其维持在最大值以防止起泡。手动将温度维持在50-55℃。
取出4个样品：2个30gm样品(用于显微检验)和2个400gm样品(用于物理/化学检验)。将一组样品标记为保留。随后将产物转移至干净的HDPE闭顶容器。批量大小为20,000gm。
实施例29：制备CoQ10乳膏1.5％的方法
如下所述通过组合A-E相制备CoQ10乳膏1.5％组合物。A相包含5.000％w/w的烷基C12-15苯甲酸盐、2.000％w/w的鲸蜡醇NF、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯/PEG-100硬脂酸酯和1.5％w/w的硬脂醇NF。百分比和量示于下表中。
表59
Figure BPA00001497260601761
B相包含5.000％w/w的二甘醇单乙醚NF、2.000％w/w的丙三醇USP、1.750％w/w的丙二醇USP和50％w/w的卡波姆分散体2％。百分比和量示于下表中。
表60
Figure BPA00001497260601762
Figure BPA00001497260601771
C相包含0.400％w/w的乳酸USP、2.000％w/w的乳酸钠溶液USP、1.300％w/w的三乙醇胺NF和4.210w/w的纯化水USP。百分比和量示于下表中。
表61
  相   商品名称   CTFA名称   百分比
  C   TEAlan 99％   三乙醇胺   1.300
  C   RITALAC LA USP   乳酸   0.400
  C   RITALAC NAL   乳酸钠，水   2.000
  C   蒸馏水   水   4.210
D相包含1.000％w/w的二氧化钛USP、7.500％w/w的CoQ10 21％浓缩物，21％。所有重量百分比都是相对整个1.5％CoQ10乳膏组合物的重量的。百分比、量和其他细节于下表中。
表62
  相   商品名称   CTFA名称   百分比
  D  二氧化钛，#3328   二氧化钛   1.000
表63
在制备CoQ10乳膏1.5％组合物中，将A相成分加入适当的容器中，水浴加热至70至80℃。将B相成分(不包含卡波姆分散体)加入PK-2锅并且通过适度的扫掠式混合来混合，同时加热至70至80℃。将C相成分加入适当的容器中，水浴加热至70至80℃。将E相CoQ10浓缩物置于适当的容器中，使用水浴于50至60℃下熔化，同时必需混合以确保均匀性。将卡波姆分散体加入适当的容器(搅拌罐)，在混合的条件下加热至70至80℃。在继续混合的同时，将B相成分加入于搅拌罐中加热的卡波姆分散体中，同时维持该温度。在继续混合的同时，将C相成分加入至搅拌罐的内容物，同时维持该温度。继续混合和匀化搅拌罐。随后关闭搅拌器，但继续匀化，同时将D相成分加入搅拌罐。然后打开搅拌器，使成分混合和匀化直至完全均匀和完全散开(检查颜色)。随后停止匀化，将批量冷却至50至60℃。随后关闭搅拌器，将熔化的CoQ10浓缩物加入至搅拌罐。随后打开搅拌器，混合/再循环内容物直至分散体纯净且均匀。随后使搅拌罐的内容物冷却至45至50℃。随后将冷却的内容物转移至适当的容器中贮存直至开箱取物。
实施例30：制备0.5kg批量的CoQ10乳膏1.5％的方法
如下所述通过组合A-E相制备CoQ10乳膏1.5％组合物。A相包含5.000％w/w的烷基C12-15苯甲酸盐、2.000％w/w的鲸蜡醇NF、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯/PEG-100硬脂酸酯和1.5％w/w的硬脂醇NF。百分比、量和其他细节示于下表中。
表64
Figure BPA00001497260601781
B相包含5.000％w/w的二甘醇单乙醚NF、2.000％w/w的丙三醇USP、1.750％w/w的丙二醇USP、0.463％w/w的苯氧乙醇NF、11.377％w/w的纯化水USP。百分比、量和其他细节示于下表中。
表65
C相包含0.400％w/w的乳酸USP、2.000％w/w的乳酸钠溶液USP、1.300％w/w的三乙醇胺NF和4.210w/w的纯化水USP。百分比、量和其他细节示于下表中。
表66
  相   商品名称   CTFA名称   百分比   量(kg)
  C   TEAlan 99％   三乙醇胺   1.300   0.0065
  C   RITALAC LA USP   乳酸   0.400   0.0020
  C   RITALAC NAL   乳酸钠，水   2.000   0.0100
  C   蒸馏水   水   4.210   0.0211
D相包含1.000％w/w的二氧化钛USP。而E相包含7.500％w/w的CoQ10浓缩物21％。所有重量百分比都是相对于整个1.5％CoQ10乳膏组合物重量。百分比、量和其他细节示于下表中。
表67
在制备1.5％CoQ10乳膏组合物中，称取A相成分的重量，水浴加热至70-75℃。将B相成分加入PK-2锅并且通过适度的扫掠式混合来混合，同时加热至70-75℃。当B相达到70-75℃时，在适度的扫掠式混合的条件下在70-75℃下加入A相。随后将A和B相通过Silverson再循环。称取C相成分重量，混合直至均匀并且加热至60-65℃。将C相成分加入PK-2锅，将扫掠式搅拌器置于中高档。在继续混合的同时，将D相成分加入至PK-2锅中的批量。继续混合批量，通过Silverson再循环10分钟或直至完全均匀和完全散开。
中断循环，将批量冷至50-55℃，将扫描搅拌器置于中档。在将E相成分加温至45至50℃后，将它们加入批量，利用真空，以缓慢速度混合批量直至均匀。将温度维持在50℃。随后将批量冷却至30-35℃，使用低中速混合和真空。随后将批量泵入贮藏容器。
实施例31：制备20kg批量的CoQ10乳膏1.5％的方法
通过组合A-E相的成分制备20kg批量的CoQ10乳膏1.5％组合物。每一个相的成分的重量百分比、量和其他细节示于下表中。
表68
Figure BPA00001497260601802
Figure BPA00001497260601811
称取化学药品的重量，必需特别小心以避免溢至称量盘上。首先称取200gm的二氧化钛(D相)。随后称取600gm的纯化水并且标记为“漂洗用-B相”。
在制备A相中，称取1000gm辛酸/癸酸甘油三酯、400gm鲸蜡醇NF、300gm硬脂醇NF和900gm硬脂酸甘油酯/PEG-100。随后将这些预称重的A相成分加入至4-L SS烧杯，该容器被标记为A相。应注意，必须在24小时内使用该预混合物。随后盖上A相容器，搁在一旁以待以后使用。
在制备B相中，如实施例11A中一样，称取10,000gm卡波姆分散体2％。此外，称取400gm丙三醇USP、350gm丙二醇、1,000gm二甘醇单乙醚NF和93gm苯氧乙醇NF。称取1675gm纯化水，将该容器标记为“用于B相的纯化水”。将这些预称重的B相成分加入至10-L SS烧杯，该容器被标记为B相。应注意，必须在24小时内使用该预混合物。用抹刀手动混合B相容器的内容物直至澄清和均匀。随后盖上B相容器，搁在一旁以待以后使用。
在制备C相中，称取260gm三乙醇胺NF、400gm乳酸钠溶液USP60％、842gm纯化水(标记为“用于C相的纯化水”)和80gm乳酸USP。随后按下列顺序将这些预称重的C相成分加入至2-L SS烧杯：(1)260gm三乙醇胺、(2)400gm乳酸钠溶液60％，(3)842gm用于C相的纯化水USP和(4)80gm乳酸USP。应注意，必须在24小时内使用该预混合物。用抹刀手动混合C相容器的内容物直至澄清和均匀。随后盖上C相容器，搁在一旁以待以后使用。
在制备E相中，称取1500gm CoQ10 21％浓缩物，置于E相容器中，盖上盖子，搁在一旁以待以后使用。
在制备20kg批量的CoQ10乳膏1.5％中，需要2次水浴。将A相烧杯置于设置至70-75℃的水浴中，用抹刀手动混合内容物直至澄清和均匀。随后将C相烧杯置于设置在60-65℃的水浴中，用抹刀手动混合C相烧杯的内容物直至澄清和均匀。类似地，将E相烧杯置于水浴中，并且设置至50-55℃。用抹刀手动混合E相容器的内容物直至澄清和均匀。
所使用的其他设备包括水浴锅(E-1)、Lee真空箱(PK-2)、Waukesha泵(P-1)和Silverson匀化器的方孔高剪切筛。
首先，确认PK-2的阀门的底部关闭以及PK-2被正确密封。随后从PK-2移开观察镜。随后通过观察镜入口将预称重的10,000gm卡波姆分散体2.0％加入至PK-2。使用抹刀从其容器壁转移卡波姆分散体2.0％。随后打开PK-2的TIC-2(温度记录器)，对其进行检查以确保正确操作。随后打开PK-2(A-2)的搅拌器，用蒸气套将PK-2中的卡波姆分散体2.0％加热至70-80℃。关闭真空。随后从PK-2移开观察镜，缓慢地将B相从SS烧杯通过观察镜入口加入至PK-2。随后用“B相漂洗用水”漂洗B相容器。将漂洗液经观察镜入口加入至PK-2。随后将A相缓慢加入PK-2。使用抹刀从SS烧杯壁转移任何A相。应注意，当加入至PK-2时，A相的温度必须在70至80℃之间。随后打开PK-2的底阀。打开P-1(Waukesha泵)和P-2(Silverson匀化器)，匀化PK-2(真空箱)的内容物。将C相通过进入口缓慢加入PK-2。应注意，当加入PK-2时，温度必须在70至80℃之间。随后确保匀化进行超过5分钟，然后关闭A-2(搅拌器)。随后通过100目筛子缓慢地将D相的预称重的200.0gm二氧化钛筛入PK-2。使用抹刀取出粘附至PK-2的叶片的任何二氧化钛。
随后使观察镜复位，打开A-2。继续混合内容物，同时通过P-1(Waukesha泵)和P-2再循环。匀化内容物10分钟或直至完全均匀和完全散开(检查颜色)。10分钟后关停P-2。将PK-2的内容物冷却至50-60℃。移开观察镜，将熔化的CoQ10 21％浓缩物(E相，如实施例7A中的)缓慢地加入PK-2。随后使观察镜复位。
混合PK-2的内容物直至均匀并且通过P-1进行再循环。使温度维持在50-60℃。起始氮NF流，随后打开C-2(真空泵)。应注意，最好避免产物泛起泡沫。随后将批量冷却至45-50℃，同时打开真空和氮NF。当产物已冷却至所述温度时，关闭C-2，用氮NF解除任何真空。氮NF流保持打开。随后用产物净化排出阀，然后收集样品或包装产物。将产物转移至预称重的干净的HDPE顶闭容器中。关闭A-2、P-1和氮NF，完成批量，并且在TIC-2图纸上标明。
取出两份30gm(最少)样品用于显微检验，取出两份400gm(最少)样品用于进行物理/化学检验。一组样品标记为“保留”。称取充满的容器的重量。所产生的批量大小为20,000gm。
实施例32：制备18kg批量的卡波姆分散体2％的方法
如下所述通过组合A-C相制备18kg批量的卡波姆分散体2.0％组合物。A相包含0.50％w/w的丙二醇USP和5.00％w/w的苯氧乙醇NF。B相包含92.50％w/w的纯化水USP而C相包含2.00％w/w的卡波姆940NF。所有重量百分比都是相对于整个CoQ10乳膏2.0％组合物的重量的。成分的百分比和量示于下表中。
表69
  相   商品名称   CTFA名称   百分比   量(kg)
  A   苯氧乙醇   苯氧乙醇   5.00   0.9
  A   丙二醇   丙二醇   0.500   0.09
  B   纯化水，USP   纯化水   92.500   16.65
  C   ACRITAMER 940  卡波姆940NF   2.000   0.3600
  总计   100.000   18.00
在适当的容器中，混合A相成分直至澄清和均匀。向第二容器(搅拌罐)加入B相的纯化水。将一部分该纯化水(“漂洗用水”)保留用于漂洗A相容器。将第二容器中的水加热至60至65℃。将A相成分加入至B相的水中，使用“漂洗用水”漂洗A相容器。随后混合A相容器的内容物直至澄清和均匀。增加搅拌器速度，同时将C相的卡波姆940缓慢加入(喷洒)搅拌罐。继续混合直至所有粉剂充分分散并且无“鱼眼”存在。将温度维持在60至65℃之间。随后将内容物转移至适当的容器中贮存。
实施例33：制备3kg批量的卡波姆分散体2％的方法
如下所述通过组合A-C相制备3kg批量的卡波姆分散体2.0％组合物。A相包含5.00％w/w的丙二醇USP和0.50％w/w的苯氧乙醇NF。B相包含92.50％w/w的纯化水USP而C相包含2.00％w/w的卡波姆940NF。所有重量百分比都是相对于整个CoQ10乳膏2.0％组合物的重量的。百分比、量和其他细节列于下表中。
表70
  相   商品名称   CTFA名称   百分比   量(kg)
  A   苯氧乙醇   苯氧乙醇   0.500   0.0150
  A   丙二醇   丙二醇   5.000   0.1500
  B   纯化水，USP   水   92.500   2.7750
  C   ACRITAMER 940  卡波姆940   2.000   0.0600
  总计   100.000   3.0000
首先清洁和消毒所有设备。在实验台上，混合A相成分直至澄清和均匀。称取所需量的水，加入至上Kettle PK-1(相容器锅)中。用热水/蒸汽套将水加热至60℃-65℃。在缓慢搅拌的条件下将A相加入至B相水中直至澄清和均匀。用工艺用水相漂洗容器，使温度维持在约60-65℃的温度。以中高速搅拌继续混合直至全部粉剂完全分散并且无“鱼眼”存在。获取内容物的样品以进行显微质量、pH、比重和粘度检验。随后将批量泵入清洁且消过毒的5加仑的闭顶酸坛中(基于说明书中的pH、比重和粘度)。
实施例34：制备18kg批量的卡波姆分散体2％的方法
通过组合A、B和C相的成分制备18kg批量的卡波姆分散体2.0％。A相包含0.50％w/w的苯氧乙醇NF、5.00％w/w的丙二醇USP、92.50％w/w的纯化水USP和2.00％w/w的卡波姆940NF。
表71
Figure BPA00001497260601851
该批量制剂中使用的设备包括赛多利斯天平、梅特勒天平、图表记录仪以及Lee相箱(Phase Tank)和2-L不锈钢(SS)烧杯。
在称取成分重量之前，清洁生物区域并且验证其为清洁的。同样地清洁所有设备，验证其为清洁的并且在校准期内。检查天平校准并且进行记录。除去称重容器的皮重以避免溢至称量盘上。首先，称取1,650gm纯化水，置于标记为“漂洗用水”的容器中。还称取另一份15,000gm的纯化水。还称取360gm卡波姆940NF。
通过称取90gm苯氧乙醇于烧杯中来制备A相。随后称取900gm丙二醇USP于2-L SS烧杯中。随后将预称重的苯氧乙醇NF加入装有预称重的丙二醇的2-L SS烧杯中。用约1/3的“漂洗用水”漂洗残留在烧杯的苯氧乙醇。随后将容器标记为A相。应注意，必须在24小时内使用所述预混合物。
用抹刀混合A相直至澄清和均匀。取出抹刀，同时用1/3的“漂洗用水”漂洗。
在制备A相后，使用Lee相箱(PK-1)混合分散体。将适当标记的图纸置于TIC-1(温度记录器)中。打开TIC-1(温度记录器)，确保正确操作。当确认PK-1上的底阀关闭时，向PK-1中加入预称重的纯化水USP。使用剩下的“漂洗用水”将SS烧杯漂洗至PK-1中。
将搅拌器打开至中挡，用热水/蒸气套将PK-1的内容物加热至60-65℃。可接受的范围还包括55-70℃。将搅拌器设置至最高速度而不引起飞溅。在至少15分钟的时段(但超过20分钟)内将预称重的卡波姆940NF通过50目筛子平衡地筛入PK-1中。目标温度为60-65℃，然而可接受范围为55-70℃。随后将搅拌器打开至高档。以高速混合继续混合至少1小时直至全部粉剂完全分散并且无“鱼眼”存在。使用抹刀将可捕获在边缘的任何粉剂分散至涡旋中。
取出两份30gm分散体的样品用于显微检验，两份400gm销售用于物理/化学检验。一组标记为“保留”。随后将产物转移至干净的HDPE顶闭容器中。所得的分批大小为18,000gm。
实施例35：制备包含CoQ10 21％浓缩物和烷基苯甲酸盐的CoQ10乳膏3％的方法
通过组合下列相制备CoQ10乳膏3.0％组合物。A相包含4.00％w/w的C12-15烷基苯甲酸盐NF、2.00％w/w的鲸蜡醇NF、4.50％w/w的硬脂酸甘油酯/PEG-100硬脂酸酯和1.5％w/w的硬脂醇NF。百分比、量和其他细节列于下表中。
表72
Figure BPA00001497260601871
B相包含5.00％w/w的二甘醇单乙醚NF、2.00％w/w的丙三醇USP、1.50％w/w的丙二醇USP、0.475％w/w的苯氧乙醇NF、16.725％w/w的纯化水USP和40％w/w的卡波姆分散体，2％。成分的百分比和量列于下表中。
表73
Figure BPA00001497260601881
C相包含0.50％w/w的乳酸USP、2.00％w/w的乳酸钠溶液USP、1.30％w/w的三乙醇胺NF和2.50％w/w的纯化水USP。成分的百分比和量列于下表中。
表74
  相   商品名称   CTFA名称   百分比
  C   TEALAN 99％   三乙醇胺   1.300
  C   RITALAC LA   乳酸   0.500
  C   RITALAC NAL   乳酸钠，水   2.000
  C   纯化水，USP   水   2.500
D相包含1.00％w/w的二氧化钛USP而E相包含15.00％w/w的CoQ10 21％浓缩物。成分的百分比和量列于下表中。
表75
Figure BPA00001497260601882
所有重量百分比都是相对于整个CoQ10乳膏3.0％组合物的重量的。
将A相成分加入适当的容器，水浴加热至70至80℃。将B相成分(不包含卡波姆分散体)加入PK-2锅并且混合。还将C相成分加入适当的容器中，随后水浴加热至70至80℃。将E相CoQ10浓缩物置于适当的容器中，使用水浴于50至60℃下熔化。必要时混合成分以确保均匀性。随后将卡波姆分散体加入适当的容器(搅拌罐)，在混合的条件下加热至70至80℃。在混合各成分的同时，将B相成分加至搅拌罐的内容物，同时维持该温度。继续混合和匀化内容物。然而，随后关闭搅拌器，但继续匀化。在继续匀化的同时，将D相的二氧化钛加入搅拌罐。然后打开搅拌器，混合和进一步匀化内容物直至完全均匀和完全散开(检查颜色)。随后停止匀化，将批量冷却至50至60℃。随后关闭搅拌器，将熔化的CoQ10浓缩物加入至搅拌罐。随后打开搅拌器，混合/再循环内容物直至分散体纯净且均匀。随后使搅拌罐的内容物冷却至45至50℃。然后将内容物转移至适当的容器贮存直至开箱取物。
实施例36：制备0.5kg批量的包含CoQ10 21％浓缩物和烷基苯甲酸盐的的CoQ10乳膏的方法
通过组合下列相制备0.5kg批量的CoQ10乳膏3.0％组合物。A相包含4.00％w/w的C12-15烷基苯甲酸盐、2.00％w/w的鲸蜡醇NF、4.50％w/w的硬脂酸甘油酯/PEG-100硬脂酸酯和1.5％w/w的硬脂醇NF。百分比和量列于下表中。
表76
Figure BPA00001497260601891
B相包含5.00％w/w的二甘醇单乙醚NF、2.00％w/w的丙三醇USP、1.50％w/w的丙二醇USP、0.475％w/w的苯氧乙醇NF、16.725％w/w的纯化水USP和40％w/w的卡波姆分散体，2％。百分比和量列于下面相应的相表中。
表77
Figure BPA00001497260601901
C相包含0.50％w/w的乳酸USP、2.00％w/w的乳酸钠溶液USP、1.30％w/w的三乙醇胺NF和2.50％w/w的纯化水USP。百分比、量和其他细节列于下表中。
表78
  相   商品名称   CTFA名称   百分比   量(kg)
  C   TEALAN 99％   三乙醇胺   1.300   0.0065
  C   RITALAC LA   乳酸   0.500   0.0025
  C   RITALAC NAI   乳酸钠，水   2.000   0.0100
  C   纯化水，USP   水   2.500   0.0125
D相包含1.00％w/w的二氧化钛USP而E相包含15.00％w/w的CoQ10 21％浓缩物。分比、量和其他细节列于下表中。
表79
Figure BPA00001497260601902
Figure BPA00001497260601911
所有重量百分比都是相对于整个CoQ10乳膏3.0％组合物的重量的。
将A相成分加入适当的容器，水浴加热至70至80℃。将B相成分(不包含卡波姆分散体)加入适当的容器并且混合。还将C相成分加入适当的容器中，随后水浴加热至70至80℃。将E相的CoQ10 21％浓缩物置于适当的容器中，使用水浴于50至60℃下熔化。必要时混合成分以确保均匀性。随后将卡波姆分散体加入适当的容器(搅拌罐)，在混合的条件下加热至70至80℃。在混合成分的同时，将B相成分加入至搅拌罐的内容物，同时维持该温度。继续混合和匀化内容物。随后关闭搅拌器，然而持续匀化。在继续匀化的同时，将D相的二氧化钛加入搅拌罐。然后打开搅拌器，混合和进一步匀化内容物直至完全均匀和完全散开(检查颜色)。随后停止匀化，将批量冷却至50至60℃。随后关闭搅拌器，将熔化的CoQ10 21％浓缩物加入至搅拌罐。随后打开搅拌器，混合/再循环内容物直至分散体纯净且均匀。随后使搅拌罐的内容物冷却至45至50℃。随后将冷却的内容物转移至适当的容器中贮存直至开箱取物。
实施例37：制备0.5kg批量的包含CoQ10 21％浓缩物和辛酸/癸酸甘油三酯的CoQ10乳膏3％的方法
通过组合下列相制备0.5kg批量的CoQ10乳膏3.0％组合物。A相包含4.00％w/w的辛酸/癸酸甘油三酯、2.00％w/w的鲸蜡醇NF、4.50％w/w的硬脂酸甘油酯/PEG-100硬脂酸酯和1.5％w/w的硬脂醇NF的。百分比和量列于下表中。
表80
Figure BPA00001497260601912
Figure BPA00001497260601921
B相包含5.00％w/w的二甘醇单乙醚NF、2.00％w/w的丙三醇USP、0.475％w/w的苯氧乙醇NF、16.725％w/w的纯化水USP和40％w/w的卡波姆分散体，2％。百分比和量列于下列相应的相表中。
表81
C相包含0.50％w/w的乳酸USP、2.00％w/w的乳酸钠溶液USP、1.30％w/w的三乙醇胺NF和2.50％w/w的纯化水USP。百分比、量和其他细节列于下表中。
表82
  相   商品名称   CTFA名称   百分比   量(kg)
  C   TEALAN 99％   三乙醇胺   1.300   0.0065
  C   RITALAC LA   乳酸   0.500   0.0025
  C   RITALAC NAL   乳酸钠，水   2.000   0.0100
  C   纯化水，USP   水   2.500   0.0125
D相包含1.00％w/w的二氧化钛USP而E相包含15.00％w/w的CoQ10 21％浓缩物。百分比、量和其他细节列于下表中。
表83
Figure BPA00001497260601931
所有重量百分比都是相对于整个CoQ10乳膏3.0％组合物的重量的。
将A相成分加入适当的容器，水浴加热至70至80℃。将B相成分(不包含卡波姆分散体)加入适当的容器并且混合。还将C相成分加入适当的容器中，随后水浴加热至70至80℃。将E相的CoQ10 21％浓缩物置于适当的容器中，使用水浴于50至60℃下熔化。必要时混合成分以确保均匀性。随后将卡波姆分散体加入适当的容器(搅拌罐)，在混合的条件下加热至70至80℃。在混合成分的同时，将B相成分加入至搅拌罐的内容物，同时维持该温度。继续混合和匀化内容物。随后关闭搅拌器，然而持续匀化。在继续匀化的同时，将D相的二氧化钛加入搅拌罐。然后打开搅拌器，混合和进一步匀化内容物直至完全均匀和完全散开(检查颜色)。随后停止匀化，将批量冷却至50至60℃。随后关闭搅拌器，将熔化的CoQ10 21％浓缩物加入至搅拌罐。随后打开搅拌器，混合/再循环内容物直至分散体纯净且均匀。随后使搅拌罐的内容物冷却至45至50℃。随后将内容物转移至适当的容器中贮存直至开箱取物。
实施例38：制备20kg批量的包含CoQ10 21％浓缩物和辛酸/癸酸甘油三酯的CoQ10乳膏3％的方法
通过组合A-E相的成分制备20kg批量的CoQ10乳膏3.0％组合物。每一个相的成分的重量百分比、量和其他细节示于下表中。
表84
Figure BPA00001497260601941
在制备20kg批量的CoQ10乳膏3％中，按照下列方法进行。在称取化学成分的重量之前，必需特别小心以确保区域和所有设备是干净的。首先称取化学成分的重量，必需特别小心以避免任何至称量盘上的溢漏。
首先称取200gm二氧化钛USP(D相)。然后称取600gm纯化水(标记为“B相漂洗用水”)。
在制备A相中，称取800gm辛酸/癸酸甘油三酯、400gm鲸蜡醇NF、300gm硬脂醇NF、900gm硬脂酸甘油酯/PEG-100硬脂酸酯。随后将这些预称重的A相成分加入至4-L SS烧杯，将其标记为A相。应注意，必须在24小时内使用该预混合物。随后盖上A相容器，搁在一旁以待以后使用。
在制备B相中，称取8,000gm卡波姆分散体2.0％、400gm丙三醇USP、300gm丙二醇、1,000gm二甘醇单乙醚、95gm苯氧乙醇NF和2,745gm纯化水USP(标记为“用于B相的纯化水”)。将这些预称重的B相成分加入至10-L SS烧杯。应注意，必须在24小时内使用该预混合物。用抹刀手动混合B相容器的内容物直至澄清和均匀。随后盖上B相容器，搁在一旁以待以后使用。
在制备C中，称取260gm三乙醇胺NF、400gm乳酸钠溶液USP、60％、500gm纯化水(标记为“用于C相的纯化水”)和100gm乳酸USP。随后按下列顺序将这些预称重的C相成分加入至2-L SS烧杯：(1)260gm三乙醇胺，(2)400gm乳酸钠溶液，60％，(3)500gm用于C相的纯化水USP和(4)100gm乳酸USP。容器标记为C相。应注意，必须在24小时内使用该预混合物。用抹刀手动混合C相容器的内容物直至澄清和均匀。随后盖上C相容器，搁在一旁以待以后使用。
在制备E相中，称取3,000gm CoQ10 21％浓缩物，置于标记为E相的容器中。盖上E相容器，搁在一旁以待以后使用。
为了混合CoQ10乳膏3％，使用2次水浴加热A、C和E相。首先，将A相烧杯置于设置至70-75℃的水浴中，用抹刀手动混合内容物直至澄清和均匀。随后将C相烧杯置于设置在60-65℃的水浴中，用抹刀手动混合C相烧杯的内容物直至澄清和均匀。类似地，将E相烧杯置于水浴中，并且设置至50-55℃。用抹刀手动混合E相烧杯的内容物直至澄清和均匀。
为了混合乳膏，使用水浴(E-1)、Lee真空箱(PK-2)、Waukesha泵(P-1)和Silverson匀化器的方孔高剪切筛。
首先，确认PK-2的底阀关闭以及PK-2被正确密封。随后从PK-2移开观察镜，通过观察镜入口将预称重的10,000gm卡波姆分散体2.0％加入至PK-2罐。使用抹刀从其容器壁转移卡波姆分散体2.0％。随后打开PK-2的TIC-2(温度记录器)，对其进行检查以确保正确操作记录器。
随后打开PK-2的搅拌器(A-2)，用蒸气套将卡波姆分散体2.0％加热至70-80℃。关闭真空。随后从PK-2移开观察镜，缓慢地将B相从SS烧杯通过观察镜入口加入至PK-2。随后用“B相漂洗用水”漂洗B相容器。将漂洗液经观察镜入口加入至PK-2。
随后将A相缓慢加入PK-2。使用抹刀从SS烧杯壁转移任何A相。应注意，当加入至PK-2时，A相的温度必须在70至80℃之间。
随后打开PK-2的底阀，打开P-1(Waukesha泵)和P-2(Silverson匀化器)，匀化PK-2(真空箱)的内容物。
将C相通过进入口缓慢加入PK-2。应注意，当加入时，温度必须在70至80℃之间。确保匀化进行超过至少5分钟，然后关闭A-2搅拌器。随后通过100目筛子缓慢地将预称重的200gm二氧化钛USP筛入PK-2。使用抹刀取出粘附至PK-2的叶片的任何二氧化钛。
随后使观察镜复位，打开A-2搅拌器。继续混合内容物，同时通过P-1和P-2再循环。使匀化继续进行10分钟或直至完全均匀和完全散开。10分钟后关停P-2。将PK-2的内容物冷却至50-60℃。移开观察镜，通过进入口缓慢地加入E相的熔化的CoQ10 21％浓缩物。随后使观察镜复位。
随后混合PK-2的内容物直至均匀。使温度维持在50-60℃，通过P-1再循环内容物。随后起始氮NF流，打开C-2真空泵。应注意，最好避免产物泛起泡沫。随后将批量冷却至45-50℃，同时打开真空和氮NF。当产物已冷却至所述温度时，关闭C-2(真空泵)，用氮NF解除任何真空。氮NF流保持打开。随后用产物净化排出阀，然后收集样品或包装产物。
将产物转移至预称重的干净的HDPE顶闭容器中。关闭A-2搅拌器、P-1 Waukesha泵和氮NF流。完成批量，并且在TIC-2图纸上标明。
取出两份30gm(最少)样品用于显微检验，两份400gm(最少)样品用于进行物理/化学检验。一组样品标记为“保留”。称取充满的容器的重量。获得20kg的批量大小。
实施例39：通过局部施用CoQ10乳膏3％治疗SCCIS的方法
将如上所述(例如，实施例15和16)的CoQ10乳膏3.0％组合物局部施用于原位皮肤鳞状细胞癌(SCCIS)。利用3.0％CoQ10油包水乳剂乳膏基质药剂局部治疗35个受试者。将药剂在室温下于避光容器中运输和贮存。
将分析群体定义为(1)意向治疗(Intent-to-Treat)(ITT)群体，(2)安全群体和(3)符合方案(Per Protocol)(PP)的群体。ITT群体包括被施予调研药物(CoQ10 3％)的所有受试者的群体。安全群体包括服用至少一个剂量的调研产品的所有受试者。PP群体包括患有经基线组织学结果确认的SCCIS，经历6周的组织学检查并且未错过了任何中间随访(interim visit)的所有受试者。
受试者要不然是具有至少一个组织学上确认的非面部(non-facial)SCCIS损伤的男性或女性成人。适合切除的SCCIS损伤具有0.5cm2的最小面积和2.0cm的最大直径，并且位于在研究过程中可通过衣服保护免受日光照射的位置。在每天上午几乎相同的时间，受试者清洗损伤位置，随后将小豌豆大小的(50-100mg)量的局部用乳膏药剂分配在-张蜡纸或涂药器上。然后受试者使用棉签或敷药棒将适当量的乳膏施用至损伤和周围区域。施用后至少8小时内不要清洗治疗区域。每天晚上在几乎相同的时间，重复该过程。用衣服保护损伤和周围区域免受日光照射。
在治疗的第一天，测量损伤的直径，计算面积。还对损伤照相。在第1、2、3、4和5周，评估受试者，记录他们的生命体征：血压、脉率、呼吸速率、口腔温度。也将基于下表的皮肤刺激的下列临床症候/症状分级为CoQ10 3％治疗的安全性的量度：红斑、起皮(peeling)、干燥、搔痒、灼热(buming)/刺痛(stinging)。
表85：红斑
  0   无可见红斑
  1   淡粉色，局限于小面积
  2   在大部分治疗的区域上中度发红
  3   在大部分治疗的区域上明显发红
  4   严重发红，存在水肿，可能的糜烂
表86：起皮/脱皮
  0   无可见脱皮或起皮
  1   微小脱落或偶尔小的浮起的鳞屑可存在于分离的区域
  2   中度脱落/脱皮。裂痕显眼。鳞屑边缘在大部分治疗区域浮起
  3   明显的脱皮，轻度龟裂，在大部分治疗区域上破裂和浮起鳞屑
  4   大片脱离的表皮存在
表87：干燥
  0   在许多治疗区域上油光发亮
  1   正常，无干燥，无可察觉的光亮
  2   小部分治疗区域上轻微干燥、暗淡外观
  3   大部分治疗区域上中度干燥、极暗淡的外观
  4   在整个治疗区域上严重干燥、开裂
表88：瘙痒
  0   无瘙痒
  1   偶尔轻度瘙痒，对每日活动无影响
  2   大多数时间轻度瘙痒，对每日活动或睡眠无影响
  3   中度瘙痒，偶尔干扰每日活动和睡眠
  4   干扰每日活动或睡眠的强烈瘙痒
表89：灼热/刺痛
  0   无灼热/刺痛
  1   偶尔轻度灼热/刺痛，对每日活动无影响
  2   大多数时间轻度灼热/刺痛，对每日活动或睡眠无影响
  3   中度灼热/刺痛，偶尔干扰每日活动或睡眠
  4   干扰每日活动或睡眠的强烈灼热/刺痛
根据红斑进行的安全性评估：在基线上，32个受试者(91.4％)具有一定程度的红斑。该症候在大多数受试者(28个受试者，80％)中被认为是轻度至中度的，4个受试者(11.4％)具有显著的(3级)发红。在第6周，在4个受试者(11.8％)中不存在红斑，在30个受试者(88.2％)中存在轻度或中度红斑，然而未观察到3级红斑。在研究过程中观察到的最大红斑评分相对于基线在7个受试者中得到改善，在15个受试者中未改变，在13个受试者恶化。终红斑评分相对于基线在11个受试者中得到改善，在22个受试未改变，在2个受试者中恶化。
根据起皮/脱皮进行的安全性评估：在基线上，27个受试者(77.1％)具有一定程度的起皮或脱皮，8个受试者(22.9％)无该症状。在第6周，在16个受试者(47.1％)中不存在可见的起皮或脱皮，在7个受试者(50％)中存在轻度起皮或脱皮，并且只在1个受试者(2.9％)存在中度起皮或脱皮。在研究过程中观察到的最大起皮或脱皮评分相对于基线在7个受试者中得到改善，在20个受试者中未改变，在8个受试者中恶化。终起皮/脱皮评分相对于基线在16个受试者中得到改善，在14个受试者中未改变，在5个受试者中恶化。
根据干燥进行的安全性评估：8个受试者(22.9％)具有基线上的轻度或中度干燥，而77.1％在治疗区域上不具有干燥(1级)或油光发亮(0级)。在第6周，除了1个受试者外所有受试者具0级或1级干燥(97.1％)。在研究过程中观察到的最大干燥评分相对于基线在7个受试者中得到改善，在23个受试者中未改变，在5个受试者中恶化。终干燥评分相对于基线在13个受试者中得到改善，在21个受试者中未改变，在1个受试者中恶化。
根据搔痒进行的安全性评估：大部分基线受试者报告无搔痒(74.3％)或轻度偶然搔痒(20％)，而2个受试者(5.7％)报导2或3级搔痒。在第6周，搔痒得到改善以便94.1％不具有搔痒，并且只有2个受试者(5.9％)具有轻度搔痒。从第1周至第6周，无受试者具有高于1级(轻微，偶然搔痒)的搔痒。在研究过程中观察到的最大干燥评分相对于基线在5个受试者中得到改善，在24个受试者中未改变，在6个受试者中恶化。终搔痒评分相对于基线在9个受试者中得到改善，在24个受试者中未改变，在2个受试者中恶化。
根据灼热/刺痛进行的安全性评估：在基线上，在大多数受试者(94.3％)中不存在灼热或刺痛，在2个受试者(5.7％)中具有轻度症状。在治疗过程中这些评分实际上保持未变。没有受试者具有高于1级(轻度)的评分，不超过2个受试者在从第1天(基线)至第6周的任何随访中具有1级评分。在研究过程中观察到的灼热或刺痛的最大评分相对于基线在2个受试者中得到改善，在28个受试者中与“无灼热/刺痛”相比无改变，在5个受试者中恶化(从无至轻度)。终灼热或刺痛评分相对于基线在2个受试者中得到改善，在31个受试者中未改变，在2个受试者中恶化。
还测量损伤的直径，计算面积以评估CoQ10 3％治疗的功效。在6周治疗期结束时，存在中断随访，其中记录生命体征，给临床症候/症状分级。也在6周中断随访时进行体检查。在中断随访时，也在终乳膏施用的3小时内收集空腹血液样品以测定CoQ10血浆浓度。给损伤照相，测量直径并且计算面积。
使用CoQ10乳膏3％局部治疗SCCIS的结果显示如图4-9的照片之前和之后描述的功效。主要疗效终点是在第6周具有定义为靶损伤的阴性组织学评估的完全反应的受试者的百分比。第二疗效终点(Secondary efficacy endpoint)反映在在第6周具有定义为被治疗的损伤的面积(两个主直径的乘积)的至少50％减少的受试者的百分比。所述结果显示23.5％的ITT群体在第6周具有完全反应，而18.5％的PP群体在第6周具有完全反应。
第二疗效结果显示ITT群体在第6周具有26.5％的部分50％反应，并且2.9％具有75％的部分反应。在2个受试者中在早至第1周以及在8个受试者中在早至第2周观察到部分反应。在第4和5周产生最高部分反应率。有趣地，在8个在第6周具有完全反应的8个受试者中，4个受试者不具有基于可见观察的部分反应，并且没有一个具有75％的反应。在PP群体中，22.2％具有50％的部分反应，而0％具有75％的部分反应。在ITT群体中，在第6周，损伤面积的平均变化和平均百分比变化分别为-0.3cm2和-26.1％，并且在PP群体中分别为-0.3cm2和-23.4％。
总体上，CoQ10 3％乳膏是安全的并且可被良好耐受。ITT群体中约25％的受试者获得完全治愈。
实施例40：通过局部施用CoQ10乳膏3％治疗BCC的方法
基底细胞癌(BCC)是皮肤恶性肿瘤的最常见形式，在美国总体上是癌症的最常见形式。美国癌症学会估计每年有800,000多例基底细胞癌新病例被诊断。表浅性基底细胞癌(sBCC)极少转移并且通常可通过手术切除或局部试剂治愈。
将如上面实施例15-16中所述的CoQ10乳膏3.0％组合物局部施用至160个不同的具有一个或多个组织学确认的表浅性基底细胞癌(sBCC)损伤的健康男性或女性成人。指定治疗一个具有0.5m2的最小面积和2.0cm的最大直径的靶损伤。sBCC损伤是非面部的并且能够在研究过程被保护免受日光照射。
该研究是随机的、双盲媒介物对照的平行研究。将每一个受试者随机分入4个研究组群之一：1.5％CoQ10乳膏qd(每天一次)+媒介物乳膏qd(每天一次)、3.0％CoQ10乳膏qd(每天一次)+媒介物乳膏qd(每天一次)、3.0％CoQ10乳膏bid(每天二次)或媒介物乳膏bid(每天二次)。每一个组群具有40个患者。
表90
  AM   PM
  1.   3％CoQ10   3％CoQ10
  2.   媒介物B   3％CoQ10
  3.   媒介物A*   1.5％CoQ10
  4.   媒介物A   媒介物A
在初期筛检随访中，测量损伤直径并且计算面积。通过测量两个最大垂直直径并且相乘来测定面积，结果以cm2表示。测量和记录受试者的生命体征，并且进行体检。收集空腹血液样品，并且进行全血细胞计数(CBC)测试以及脂质组试验的临床化学。收集血液样吕以测定基线CoQ10血浆浓度，收集和包装一式二份样品。还进行尿分析并且对于具有分娩可能性的妇女进行尿妊娠试验。随后对受试者的下列皮肤刺激的临床症候/症状：红斑、起皮、干燥、搔痒和灼热/刺痛进行分级。
在研究的第一天(第1天)，再次记录受试者的生命体征，如在筛检随访中一样对皮肤刺激的临床症候/症状进行分级。还就不利事件、并发局部用产品的使用和并发药物的使用询问受试者。随后给靶sBCC损伤照相，如在筛检随访中一样测量直径和面积。随后给受试者提供包括CoQ10药剂的药物试剂盒。每日由患者给sBCC损伤和1cm的周围皮肤施用CoQ10乳膏2次，进行6周。
给药方案由如下步骤组成：每天上午在几乎相同的时间清洗损伤位置，将小豌豆大小的(50-100mg)的量局部用乳膏从AM tub分配至一张蜡纸和涂药器上。随后受试者使用棉条(Q-tip)或敷药棒将适当量的乳膏施用至损伤和周围区域。在至少8小时内不要清洗治疗的区域。在每天晚上几乎相同的时间，从PM管使用局部用乳膏重复该过程。
在第1、2、3、4和5周进行对受试者的中间随访。在这些随访的每一次随访时，如初次治疗随访一样记录生命体征，给临床症候/症状分级。测量损伤直径并且计算面积。随后就不利事件、并发局部用产品的使用和并存药剂的使用询问受试者。每周一次进行临床评价。
在6周的治疗期结束时，如在初次治疗随访中一样记录生命体征，给临床症候/症状分级。测量损伤直径并且计算面积。还进行体检。在终乳膏施用后还收集空腹血液样品。在终乳膏施用后3小时内收集血液样品用以测定CoQ10血浆浓度。进行全血细胞计数(CBC)测试和进行脂质组试验的临床化学。
在治疗后第4周(第10研究周)，受试者返回以进行sBCC损伤位置的最终评价和切除。测量和记录生命体征，给与初次筛检随访中的临床症候/症状相似的临床症候/症状分级。
在考察110个受试者的病理学后，治疗结果显示至少20％的利用CoQ10乳膏3％局部治疗的患者显示症状的消退，如通过本领域内公认的终点测量的。具体地，基于第8周损伤位置的活组织检查，110个患者中有24个无sBCC的证据。
实施例41：CoQ10局部治疗的药物代谢动力学结果
将72只BALB/c小鼠随机分配至8个组(组I-IX)，每组8只小鼠。组I未进行处理。在第0天，以5mg/cm2的速率用0.1g供试品(包含搀有C-14放射性标记的API 31510的3％w/w CoQ10乳膏的水包油乳膏乳剂)局部处理组II-VIII。将放射性API 31510加入3％乳膏批量以产生具有约50μCi/g产品或5μCi/施用剂量的比活性的实验性乳膏制剂。用玻璃棒给组II-IX的每一只小鼠的背部皮肤局部施用供试品。给药后立即处死组II动物，收集测量量的血液、尿、粪便和靶器官(肝、胰腺和脾)并且称重。处理血液以获取血清，将每一个器官匀浆化。分别在给药后第2、4、8、12、18和24小时处死组III-VIII，收集相同的样品。用0.1g供试品局部处理组IX，进行7天(第0-6天)。在第7天，在最终施用供试品后24小时，处死组I和IIX，如对于先前的组一样收集相同的样品。测量每一个样品的每分衰变数(DPM)并且计算每一个组的平均DPM/样品种类。
在不同时间点基于血清、尿、粪便和靶器官(肝、胰腺和脾)的放射性水平的测量值进行评价，目的在于测定供试品在24小时内的经皮透入的相对水平和测定对于所述施用方法药物积累的位置。
每一个组的以克表示的平均样品重的概述示于下面图表中。
表92
Figure BPA00001497260602051
每分衰变数(DPM)示于表63中，并且在闪烁计数器上测量了每一只动物的每一种类型的组织样品的每分衰变数。计算每一个样品类型的平均DPM。在将结果转变成1mL量后，随后将平均值除以平均器官重量以获得DPM/克组织的结果。随后从其他组的每一个组扣除对照(组I)结果以除去本底辐射量并且获得组中每一个样品的平均DPM/克组织的实际数量。通过除以2,220,000的常数，将结果转变成微居里/克组织。最终结果表示皮居里(微居里×1000)/克组织。器官的结果示于下面的图表中。
表93
Figure BPA00001497260602052
表94
Figure BPA00001497260602061
所述数据反映了在给药后8小时供试品主要在胰腺中积累，以及在给药后8小时以较少的量在肝中积累。在给药后18小时，脾和胰腺中皮居里/克组织的量减少至几乎为0。第0小时的肝脏结果因单个动物在给药后第0小时具有格外高量的DPM而为异常的。该异常高的结果的一个可能的解释是所述动物通过舔其自己的皮肤或在抓擦给药位置后舔其自己的爪子而设法直接摄入供试品。该可能性可将供试品比经皮吸收更快得多地送至肝脏。在第8小时达到峰值后，肝的量在第12小时稍微减少，但随后在第18小时略微增加并且在整个24小时中保持恒定。
表95
靶嚣官结果(计数)
在于组II-VIII的全部动物的每一个靶器官中积累的供试品的量中，皮居里/克组织的百分比示于下列图表中。
Figure BPA00001497260602071
利用4.112微居里的供试品给组II-VIII给药。下面的图表显示了每一个时段上每一个靶器官中微居里的量。
表96
Figure BPA00001497260602072
通过将这些数目除以4.112(每一个剂量中的微居里的量)，表示每一个时间段存在于每一个器官中的供试品的量的百分比结果。下面的图表显示这些百分比。
表97
Figure BPA00001497260602073
到达靶器官的以微居里表示的供试品的平均百分比对于胰腺、肝和脾分别为0.03％、0.07％和0.01％。
对于身体废物样品，最终结果以皮居里/mL表示。该量通过将DPM转化成1mL，扣除组I结果，然后除以常数2,220,000以获得微居里/mL来获得。通过将该结果乘以1000，获得皮居里/mL。粪便和尿的平均皮居里/mL示于下面图表中。
表98
Figure BPA00001497260602081
表99
所述数据反映了在给药后8小时供试品主要在粪便中积累，在给药后第12小时继续存在，但在给药后18小时显著降低。没有供试品在研究过程中在任何时间点上在尿中积累的指征。
以与计算废物样品结果的方式相同的方式计算血液结果。血液中皮居里/mL的计算因组I中DPM的高量-对照的血液结果而导致负数。这是两只动物在血液中具有比预期DPM读数更高的读数的结果。血液的结果示于下面图表中。
表100
Figure BPA00001497260602091
表101
Figure BPA00001497260602092
所述数据显示供试品未在血液中积累；除了供试品可在给药后第18小时已存在于血液中。奇怪的是在血液中未发现显著量的供试品，尤其是自在肝和胰腺中观察到供试品以后。一个解释是供试品通过皮肤直接至器官的经皮吸收；然而，供试品不可能在穿过皮肤后不进入血液。另一个可能性是血液迅速识别外来物质并且将所述供试物质储存在肝中。组II的最后给药是在上午10:23并且组II的第一个处死是在上午10:45。22分钟可以是足以让血液消除外来物质的时间。
当给组IX中的动物重复给药而非一次给药并且允许7天吸收供试品时，分别计算组IX数据。组IX数据示于下面的图表中。
表102
Figure BPA00001497260602101
组II-VIII的平均皮居里/克组织对于胰腺、肝和脾分别为1.24、2.83和0.38。器官的组IX结果比胰腺的平均值低，接近肝的平均值并且高于脾的平均值。所述数据显示到第7天在脾中存在不断增加的量的供试品并且第7天肝中供试品的量可与在给药后第18和24小时在肝中发现的相同量相当。
表103
Figure BPA00001497260602102
组II-VIII的粪便的平均皮居里/mL为7.55，对于尿为0.0064。组IX粪便和尿是正常的并且在粪便中只显示供试品的最小迹象。
表104
Figure BPA00001497260602111
与其他组一样，组IX血液结果显示供试品不存在于血液。
总体结果表明在组之间在靶器官、粪便、尿或血液量的重量内不存在显著差异。在尿中未检测到显著量的供试品。未从组I(对照)、II(第0小时)或VI(第12小时)收集尿。除了组VII(给药后18小时)外，在研究过程中在任何时间上未在血液中检测到显著量的供试品。对于组V(给药后8小时)，记录到皮居里/克组织和皮居里/mL的最高量，发现该量在该时间上在粪便和胰腺中最集中。也在组V的肝中发现增加的皮居里水平/克组织。在肝中，在第12小时微降后，水平在第18和24小时维持恒定并且对于组IX(第7天的动物)在肝中发现相当的水平。在给药后第8小时达到峰值后，胰腺量降至接近0水平，包括组IX结果。脾量在第4小时上升，随后到第18小时时下降至接近0水平。然而对于组IX这些量增加，表明在第7天供试品在脾中积累。存在供试品或供试材料的代谢产物的经皮吸收，因为在肝和胰腺中发现所述化合物。奇怪的是血液中不存在显著量的供试材料，因为预期的运输路径是血流。可能的解释是供试品通过肝和胰腺从血液中快速清除。另一种可能是是供试品可被动物直接摄入(通过舔药剂本身或舔已在给药位置抓擦过的爪)。
实施例42：Western印迹分析
在过去50年中，已产生了大量牵涉影响特定过程的内源/外源因素(如恶性转化的根本原因)的信息。临床和基础文献提供提供了DNA结构和功能的变化在癌症的起始和进展中起重要作用的证据，从而将癌症确定为遗传性疾病(Wooster，2010；Haiman，2010)。在1920年代初期，参与表征肿瘤发生的病因学中的基本变化的Otto Warburg和其他研究人员描述了两个主要观察(a)细胞在氧存在的情况下在ATP的产生中运输和利用葡萄糖进行能量生产的能力-也称为Warburg效应和(b)线粒体结构和功能的改变-包括电子传递的改变导致线粒体ATP产生的减少。过去数年中已看到研究细胞生物能学在癌症病因学中的中心作用(即，将癌症视为代谢疾病)的复兴。
历史上，虽然曾经认为基因的突变是导致基因表达的改变的原因，但不断积累的文献支持表观遗传学过程在影响支持癌发生的基因表达中起着至关重要的作用。这被大多数基因的突变很低并且不能解释在癌细胞中发现的许多(一系列)突变的观察所证明。表观遗传学改变受组蛋白尾部的甲基化和修饰调控，两个变化都与细胞的能量(营养物)状态具有内在联系，因为它们需要辅因子例如组蛋白乙酰化所需的乙酰CoA的可获得性(文献)。乙酰CoA的生物合成依赖于糖酵解和克雷布斯循环，从而直接使细胞内能量状态与基因表达和活性的调控相关联。
在正常细胞中，线粒体氧化磷酸化产生足够的ATP来满足维持正常生理活性和细胞存活的能量需要。线粒体能量产生的结果是活性氧(ROS)的产生，其的异常产生导致线粒体的损害(文献)。已良好地确定由线粒体引起的慢性ROS产生导致基因突变的累进积累，牵涉癌发生的病因学的现象。已有人提出癌细胞减少线粒体呼吸以使ROS产生减少至最低限度，并且转换至糖酵解以维持能量产生。因此，能量产生从氧化磷酸化至糖酵解的渐进转变是细胞维持能量产生以维持生理功能所必需的并且可与正常细胞表型向癌细胞表型的进展相关。与线粒体基因组成的累进改变(突变)协同的细胞能量(生物能)特征谱的渐进转变改变了细胞代谢组(metabolome)。因线粒体磷酸化至糖酵解转换而导致的整个细胞的代谢组特征谱的变化相应于异常生物能学诱导的代谢组特征谱并且是支持癌发生的根本原因。使用内源分子诱发朝向与细胞生物能状态相关的非癌正常线粒体氧化磷酸化的状态的细胞代谢组转变的靶向干预代表了癌症治疗的治疗终点。
作为引起表观代谢转变的MIM的辅酶Q10
本文中提供的数据显示利用辅酶Q10对正常和癌细胞的治疗与调节糖酵解-线粒体氧化性应激连续谱(continuum)内的至关重要的生物化学终端的蛋白质的表达的变化相关。描述通过western印迹分析和耗氧率评估蛋白质表达的数据的组合显示在正常细胞中，在暴露于辅酶Q10后不存在正常的糖酵解和线粒体呼吸速率的显著改变。因此，正常细胞例如HDFa(正常人成体成纤维细胞)、HASMC(正常人主动脉平滑肌细胞)、nFib(正常成纤维细胞)和HeKa(正常人角质细胞)中蛋白质的表达和线粒体呼吸速率的值可被认为是基线生理状态的代表。癌细胞系例如HepG2(肝癌)、PaCa-2(胰腺癌)、MCF7(乳腺癌)、SK-MEL(黑素瘤)和SCC-25(鳞状细胞癌)中蛋白质表达和线粒体呼吸速率的任何偏差代表了因疾病(在该情况下癌症)的起始/进展而产生的改变。实验证据支持癌细胞暴露于辅酶Q10与代表正常细胞的细胞病理生理学重组(reorganization)相关的假说。具体地，本文中提供的数据显示癌细胞的辅酶Q10暴露与负责诱导细胞结构的全局性重组的糖酵解途径和线粒体氧化磷酸化至正常细胞中观察到的所述途径的转变相关。
在正常细胞中，糖酵解输出的终点与线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)连接，即通过糖酵解途径从葡萄糖产生的丙醇酸盐进入克雷布斯循环(也称为三羧酸循环、TCA或柠檬酸循环)以产生还原当量来支持用于ATP产生的线粒体OXPHOS。因此，在正常细胞中，参与糖酵解的基因产物的表达和功能方向被引向丙酮酸盐的充足产生和其至克雷布斯循环的进入。癌细胞中参与糖酵解和克雷布斯循环途径的至关重要的蛋白质的表达和功能失调导致伴随线粒体功能的显著降低的增强的糖酵解。癌细胞对辅酶Q10(一种选择性影响线粒体呼吸链的内源分子)的暴露改变(正常化)糖酵解和克雷布斯循环途径的蛋白质的表达以促进生物能学转变，以便使能量产生(即，ATP产生)恢复至线粒体。
实验方法
Western印迹实验1
用于本实验的细胞是HDFa和MCF-7细胞，以2个不同浓度50μM和100μM的辅酶Q10处理或不处理所述细胞，在24小时的处理后收获所述细胞。将完整细胞沉淀一次一个地重悬浮于1mL C7缓冲液中并且转移至标记的15mL管中。随后在冷室中在冰上使用6个声波脉冲(设置在#14)对样品进行超声处理。超声处理后将样品短暂离心至2500g，将样品转移至2mL管中。使用保持在50mL样品管中的泡沫验证每一个样品的pH(pH应当为9.0)。
通过加入10ul 1M丙烯酰胺，25ul三丁基膦并且在间歇性混合的条件下温育90分钟对每一个样品进行样品的烷基化和还原。在温育后，加入10u1 1M DTT，将试管在20℃下以20,000g离心10分钟，将上清液转移至标记的Amicon Ultra离心过滤器(具有10k截断值)(Millipore catalog#UFC 801024)。将样品以2500g离心15分钟，间隔2次。使用电导仪测量单独的Chap以及样品的电导率。如果样品的电导率很高，则加入1ml chap用于缓冲液更换，以2500g再次离心直至体积减少至250ul。当电导率为200或更少时，以5分钟的间隔以2500g离心样品直至上清液的体积为150-100ul。将样品上清液转移至eppendorf管中，使用BSA作为标准进行Bradford测定。
按照上述标准方案处理样品，利用Bradford测定法测定每一个样品的蛋白质量。如下所示利用Lamelli上样染料(Loading dye)(LDS)和MilliQ水制备等同于10ug蛋白质的样品体积，在4-12％Bis-TrisNovex NuPAGE凝胶(Invitrogen，cat#NP0323Box)上进行电泳。
使用NOVEX Xcell Surelock系统在200V下利用1X MOPS缓冲液进行凝胶电泳，进行50分钟。随后使用NOVEX Xcell Surelock湿转移方案(wet transfer protocol)在30V下转移凝胶，进行1小时。用来自Invitrogen的Simply Blue Safestain(LC6065)对印迹染色。
HDFa和MCF-7样品的IDH1和ATP柠檬酸裂解酶水平
在转移后，将每一个印迹置于2张Whatman滤纸之间，干燥15-20分钟。在干燥后，使用HB铅笔给印迹标明日期、样品类型以及印迹或印迹2。用铅笔勾勒出分子量标记的轮廓，单线代表蓝色，双线表示有色的标记。用甲醇活化印迹，进行5秒，用水洗涤5分钟，用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，15分钟；2次，每次5分钟)。通过在振荡的条件下，利用含有5％BSA的TBST中的IDH1的一抗(Cell Signaling#3997)(以1∶1000稀释的)在4℃下温育过夜来探测印迹1，利用以1∶1000稀释的5％BSA中的ATP柠檬酸裂解酶的兔多克隆抗体(Cell Signaling#4332)探测印迹2。在利用一抗过夜温育后，利用TBS-T洗涤印迹3次(1次，15分钟；2次，5分钟)，然后在室温下于轨道倾斜振荡器上利用二抗(抗兔；1∶10,000稀释度)温育1小时来探测该印迹。在用二抗温育1小时后，用TBS-T(1次，15分钟；2次，每次5分钟)洗涤印迹3次，随后利用ECF试剂温育5分钟，然后利用5100Fuji激光扫描仪(以25uM的分辨率，16bit，绿色激光，于400V和500V下)扫描各个印迹。
HDFa和MCF-7样品的肌动蛋白水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描2个印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在振荡的条件下用以1∶5000稀释的5％BSA中的肌动蛋白的抗体(Sigma catalog#A5316，克隆AC-74)在室温下探测1小时。在用肌动蛋白的一抗温育1小时后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗小鼠；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
Western印迹实验2
本实验中所使用的细胞为SKMEL28、SCC-25、nFib和Heka细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在3、6和/或24小时的处理后收获所述细胞。处理样品，如上所述将其在4-12％Bis-Tris Novex NuPAGE凝胶上进行电泳。基本上如上所述进行凝胶电泳，转移和染色。
4个细胞系的IDH1的水平
转移后，使印迹干燥15-20分钟，用甲醇活化5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST进行15分钟。用5％的TBS-T中的封闭试剂在室温下封闭印迹1小时，随后用TBS-T(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)洗涤3次。随后在振荡的条件下，通过在4℃下温育过夜，用具有5％BSA的TBST中的IDH1的一抗(Cell Signaling#3997)(以1∶1000稀释)探测该印迹。在用IDH1的一抗过夜温育后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在室温下用二抗(抗兔；1∶10,000的稀释度)探测，进行1小时。在与二抗温育1小时后，用TBS-T(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)洗涤印迹3次，然后与ECF试剂一起温育，进行5分钟，随后用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM的分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
4个不同细胞系的ATP柠檬酸裂解酶水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离异柠檬酸脱氢酶印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)。然后在振荡的条件下用以1∶5000稀释的5％BSA中的ATP柠檬酸裂解酶的兔多克隆抗体(Cell Signaling#4332)在4℃下探测该印迹，进行过夜。在用ATP柠檬酸裂解酶的一抗温育过夜后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗兔；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500 V下)扫描每一个印迹。
4个不同细胞系的肌动蛋白水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离ATP柠檬酸裂解酶。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在振荡的条件下用以1∶5000稀释的5％BSA中的肌动蛋白的抗体(Sigma catalog#A5316，克隆AC-74)在室温下探测1小时。在用肌动蛋白的一抗温育1小时后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗小鼠；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
Western印迹实验3
本实验中所使用的细胞为HepG2、HASMC和PACA2细胞，用或不用2个不同浓度(50μm或100μm)的辅酶Q10处理所述细胞，在48小时的处理后收获所述细胞。在本实验(western印迹实验3)中和在下面描述的所有实验(即，western印迹实验4至9)中，用5mM葡萄糖(“5G”)或22mM葡萄糖(“22G”)额外地处理所述细胞。如上所述处理来源于所述细胞的样品，在4-12％Bis-Tris Novex NuPAGE凝胶上进行电泳。基本上如上所述进行凝胶电泳，转移和染色。
HASMC相对PACA2和HepG2的IDH1、ATP柠檬酸裂解酶和肌动蛋白水平
基本上如上所述，通过用IDH1、ATP柠檬酸裂解酶和肌动蛋白的一抗探测印迹来测定IDH1、ATP柠檬酸裂解酶的水平和肌动蛋白水平。
Western印迹实验4
本实验中所使用的细胞为HepG2细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在24或48小时的处理后收获所述细胞。在本实验中，额外地用5mM葡萄糖(“5G”)或22mM葡萄糖(“22G”)处理细胞。处理来源于细胞的样品，如上所述将其在4-12％Bis-Tris Novex NuPAGE凝胶上进行电泳。基本上如上所述进行凝胶电泳，转移和染色。
HepG2细胞的乳酸脱氢酶水平
转移后，使印迹干燥15-20分钟，用甲醇活化5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST进行15分钟。用5％的TBS-T中的封闭试剂在室温下封闭印迹1小时，随后用TBS-T(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)洗涤3次，在振荡的条件下，通过在4℃下温育过夜，用5％BSA中的乳酸脱氢酶的一抗(abcam ab2101；多克隆)(以1∶1000稀释的)探测该印迹。在用乳酸脱氢酶的一抗过夜温育后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，次5分钟)，然后在室温下用二抗(兔抗山羊；1∶10,000的稀释度)探测，进行1小时。在与二抗温育1小时后，用TBS-T(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)洗涤印迹3次，然后与ECF试剂一起温育，进行5分钟，随后用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM的分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
HepG2细胞的丙酮酸激酶肌肉形式(PKM2)的水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离乳酸脱氢酶印迹。在激光扫描仪中扫描2个印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，在振荡的条件下用以1∶500稀释的5％BSA中的丙酮酸激酶的兔多克隆抗体(NOVUS BIOLOGICALS catalog#H00005315-D01P)在4℃下探测该印迹，进行过夜。在用丙酮酸激酶M2的一抗温育过夜后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗兔；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
HepG2细胞的丙酮酸脱氢酶β水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离丙酮酸脱激酶印迹。在激光扫描仪中扫描2个印迹以检查完全剥离。在确保抗体和ECF试剂的剥离已完成后，用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，在振荡的条件下用5％BSA中的丙酮酸脱氢酶的抗体(ABNOVA catalog#H00005162-M03)(以1∶500稀释的)在4℃下探测该印迹，进行过夜。在用丙酮酸脱氢酶的一抗温育过夜后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗小鼠；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
HepG2细胞的肌动蛋白水平
基本上如上所述剥离丙酮酸脱氢酶印迹，随后探测肌动蛋白。
Western印迹实验5
本实验中所使用的细胞为MIAPACA2(PACA2)细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在24或48小时的处理后收获所述细胞。在本实验中，用5mM葡萄糖(“5G”)或22mM葡萄糖(“22G”)额外地处理细胞。处理来源于细胞的样品，并且基本上如上所述进行凝胶电泳，转移，染色和扫描。
PaCa2细胞的乳酸脱氢酶(LDH)和丙酮酸脱氢酶(PDH)水平
基本上如上所述，通过用LDH和PDH的一抗成功地探测印迹来测定LDH和PDH的水平。
PaCa2细胞的半胱天冬酶3水平.
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离印迹。在激光扫描仪中扫描2个印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在振荡的条件下用5％BSA中的半胱天冬酶3的抗体(Santacruz Biotechnology#sc7272)(以1∶200稀释的)在4℃探测过夜。在用半胱天冬酶3的一抗温育过夜后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗小鼠；1∶10,000稀释)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
Western印迹实验6
用于本Westem印迹实验的细胞是用或未用辅酶Q10 IV制剂处理的并且在24小时的处理后收获的PC-3、HepG2、MCF-7、HDFa和PACA2。在本实验中，用5mM葡萄糖(“5G”)或22mM葡萄糖(“22G”)额外地处理细胞。基本上如上所述，处理来源于细胞的样品，转移，染色和扫描。
不同细胞类型中的半胱天冬酶3和肌动蛋白水平
基本上如上所述的，通过用半胱天冬酶3和肌动蛋白的一抗成功地探测印迹来测定半胱天冬酶3和肌动蛋白的水平。
Western印迹实验7
本实验中所使用的细胞为人主动脉平滑肌(HASMC)细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在24或48小时的处理后收获所述细胞。处理HASMC样品，并且基本上如上所述进行凝胶电泳，转移，染色和扫描。
用于肌动蛋白的实验方案：
基本上如上所述的，通过用肌动蛋白的一抗成功地探测印迹来测定肌动蛋白的水平。
用于Hif 1α、半胱天冬酶3和PDHB的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离肌动蛋白印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的Hif 1α、半胱天冬酶3或PDHB的一抗(以1∶200)在4℃下温育过夜来进行探测。将Hif 1α的一抗(Abcam ab2185；抗兔)以1∶500稀释于5％BSA中。将半胱天冬酶3的一抗(Santacruz sc7272；抗兔)以1∶200稀释于5％BSA中。将丙酮酸脱氢酶β的一抗(PDHB)(Novus BiologicalsH00005162-M03；抗小鼠)以1∶500稀释于5％BSA中。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在室温下用二抗(PDHB抗小鼠；Hif 1a和半胱天冬酶3抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
PKM2、SDHB和SDHC的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的PKM2、SDHB或SDHC的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。将SDHC的一抗(ABNOVA H00006391-M02；抗小鼠)以1∶500稀释。SDHB的一抗来自Abcam ab4714-200；抗小鼠；以1∶1000稀释。丙酮酸激酶M2(PKM2)的一抗来自Biologicals H00005315-D0IP；抗兔；以1∶500稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(SDHB&C抗小鼠；和PKM2抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
LDH和Bik的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA(于TBS-T中)中的LDH或Bik的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。LDH的一抗来自Abcam ab2101；抗山羊；以1∶1000稀释。Bik的一抗来自CellSignaling#9942；抗兔；以1∶1000稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(LDH抗山羊；Jackson Laboratories)和Bik抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
Western印迹实验9
本实验中所使用的细胞为HepG2细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在24或48小时的处理后收获所述细胞。在本实验中，用5mM葡萄糖(“5G”)或22mM葡萄糖(“22G”)额外地处理细胞。处理来源于细胞的样品，并且基本上如上所述进行凝胶电泳，转移，染色和扫描。
肌动蛋白的实验方案：
基本上如上所述的，通过用肌动蛋白的一抗成功地探测印迹来测定肌动蛋白的水平。
半胱天冬酶3和MMP-6的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离肌动蛋白印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的半胱天冬酶3或MMP-6的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。将半胱天冬酶3的一抗(Abcam ab44976-100；抗兔)以1∶500稀释于5％BSA中。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在室温下用二抗(MMP-6抗小鼠；半胱天冬酶3抗兔；1∶10,000稀释)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
LDH的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA或5％牛奶中的LDH的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。将LDH 080309b1的一抗(Abcam ab2101；抗山羊)以1∶1000稀释于5％BSA中。将LDH080309b2的一抗(Abcam ab2101；抗山羊)以1∶1000稀释于5％牛奶中。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在室温下用二抗(Jackson Immuno Research抗山羊；1∶10,000的稀释度；305-055-045)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
转醛醇酶和Hif1a的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的转醛醇酶或Hif1a的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。转醛醇酶的一抗(Abcam ab67467；抗小鼠)以1∶1000稀释。将Hif1a的一抗(Abcamab2185；抗兔)以1∶5000稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(抗小鼠或抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
IGFBP3和TP53的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的IGFBP3或TP53的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。IGFBP3的一抗(Abcam ab76001；抗兔)以1∶1000稀释。将TP53的一抗(Sigma Aldrich AV02055；抗兔)以1∶100稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100 Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
转醛醇酶和PDHB的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的转醛醇酶或PDHB的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。转醛醇酶的一抗(Santacruz sc51440；抗山羊)以1∶200稀释。将PDHB的一抗(Novus Biologicals H00005162-M03；抗小鼠)以1∶500稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(抗山羊或抗小鼠；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
结论
异柠檬酸脱氢酶-1(IDH-1)
异柠檬酸脱氢酶是作为通常在线粒体基质中发生的TCA循环的部分的酶之一。然而，IDH1是催化异柠檬酸盐至α-酮戊二酸的氧化脱羧并且在两步骤过程中产生二氧化碳的酶的细胞溶胶形式。IDH1是存在细胞溶胶和过氧化物酶体中的NADP+依赖性形式。IDH1被Ser113磷酸化灭活并且在许多种类(包括不具有柠檬酸循环的种类)中表达。IDH1似乎通常用作肿瘤抑制剂，当失活时其通过HIF-1途径的活化部分促成肿瘤发生(Bayley 2010；Reitman，2010)。最近的研究在胶质母细胞瘤的病因学中涉及IDH1的灭活突变(Bleeker，2009；Bleeker，2010)。
利用辅酶Q10的治疗增加IDH1在癌细胞系(包括MCF-7、SKMEL28、HepG2和PaCa-2细胞)中的表达。在SCC25细胞系中存在表达的适度增加。相反地，原代人源性成纤维细胞HDFa、nFIB和主动脉平滑肌细胞HASMC的培养物未显示IDH1响应辅酶Q10的表达模式的显著改变。α-酮戊二酸(α-KG)是TCA循环中的至关重要的中间产物，其从异柠檬酸盐生物化学合成并且最终转化成琥珀酰coA并且为可药用的MIM和表观代谢转变剂。α-KG的产生用作TCA循环中的关键接合点(juncture)，因为其可被细胞用于再补充循环的中间产物，从而导致还原等当量的产生以增强氧化磷酸化。因此，辅酶Q10介导的IDH1表达的增加可导致可被线粒体TCA循环用于增强癌细胞的氧化磷酸化的中间产物的形成。结果概述于下表中。
表105：HDFa和MCF-7中的IDH1
  组成   归一化的平均强度
  HDF，培养基   346
  HDF24-50-辅酶Q10   519
  HDF24-100-辅酶Q10   600
  MCF，培养基   221
  MCF24-50-辅酶Q10   336
  MCF24-100-辅酶Q10   649
表106：治疗后HASMC相对HepG2中的IDH1
  量-组成   归一化的强度
  HAS5g48-培养基   20
  HAS5g48-50-辅酶Q10   948
  HAS5g48-100-辅酶Q10   1864
  HAS22G48-培养基   1917
  HAS22G48-50-辅酶Q10   1370
  HAS22G48-100-辅酶Q10   1023
  Hep5g48-培养基   14892
  Hep5g48-50-辅酶Q10   14106
  Hep5g48-100-辅酶Q10   15774
  Hep22G48-培养基   16558
  Hep22G48-50-辅酶Q10   15537
  Hep22G48-100-辅酶Q10   27878
表107：处理后HASMC相对PACA2的IDH1
  量-组成   归一化的强度
  HAS5g48-培养基   562
  HAS5g48-50-辅酶Q10   509
  HAS5g48-100-辅酶Q10   627
  HAS22G48-培养基   822
  HAS22G48-50-辅酶Q10   1028
  HAS22G48-100-辅酶Q10   1015
  PACA5g48-培养基   1095
  PACA5g48-50-辅酶Q10   1095
  PACA5g48-100-辅酶Q10   860
  PACA22G48-培养基   1103
  PACA22G48-50-辅酶Q10   1503
  PACA22G48-100-辅酶Q10   1630
ATP柠檬酸裂解酶(ACL)
ATP柠檬酸裂解酶(ACL)是在细胞溶胶中催化乙酰-CoA和草酰乙酸盐的形成的同源四聚体(～126kd)。该反应是脂肪酸、胆固醇和乙酰胆碱的生物合成以及糖生成的非常重要的第一步骤(Towle等人，1997)。营养物和激素调节该关键酶的表达水平和磷酸化状态。已报导了Akt和PKA对ACK的Ser454磷酸化(Berwick.，DC MW等人，2002；Pierce MW等人，1982)。
数据描述了辅酶Q10在正常和癌细胞中对ATP柠檬酸裂解酶的效应。始终观察到在癌细胞中存在ACL酶的表达的剂量依赖性减少。相反地，在正常细胞中似乎存在朝向增加的ACL表达的趋势。已证明细胞溶胶ACL是在生长因子刺激过程中和在分化过程中组蛋白乙酰化所必需的。ACL利用细胞溶胶葡萄糖衍生的柠檬酸盐产生组蛋白乙酰化所必需的乙酰CoA(在瘤形成过程中是非常重要的过程)的事实证明辅酶Q10诱导的ACL表达在影响癌细胞功能中的作用。通过细胞溶胶ACL从柠檬酸盐产生的乙酰CoA在细胞分裂过程中用作新脂质和胆固醇的生物合成的来源。因此，辅酶Q10诱导的ACL表达的变化改变正常细胞相对癌细胞的用于脂质和胆固醇的合成的乙酰CoA的可获得性。结果概述于下表中。
表108：HDFa和MCF-7中的ATPCL
  组成   平均归一化的强度
  HDF-培养基   ～15000
  HDF-50-辅酶Q10   ～17500
  HDF-100-辅酶Q10   ～25000
  MCF-培养基   ～7500
  MCF-50-辅酶Q10   ～7500
  MCF-100-辅酶Q10   ～12500
表109：HASMC相对HepG2中的ATP柠檬酸裂解酶～kd条带
  量-组成   归一化的强度
  HAS5g48-培养基   24557
  HAS5g48-50-辅酶Q10   23341
  HAS5g48-100-辅酶Q10   25544
  HAS22G48-培养基   27014
  HAS22G48-50-辅酶Q10   21439
  HAS22G48-100-辅酶Q10   19491
  Hep5g48-培养基   28377
  Hep5g48-50-辅酶Q10   24106
  Hep5g48-100-辅酶Q10   22463
  Hep22G48-培养基   24262
  Hep22G48-50-辅酶Q10   31235
  Hep22G48-100-辅酶Q10   50588
表110：HASMC相对PACA2中的ATP柠檬酸酶～kd的条带
  量-组成   归一化的强度
  HAS5g48-培养基   11036
  HAS5g48-50-辅酶Q10   12056
  HAS5g48-100-辅酶Q10   15265
  HAS22G48-培养基   18270
  HAS22G48-50-辅酶Q10   15857
  HAS22G48-100-辅酶Q10   13892
  PACA5g48-培养基   11727
  PACA5g48-50-辅酶Q10   8027
  PACA5g48-100-辅酶Q10   4942
  PACA22G48-培养基   8541
  PACA22G48-50-辅酶Q10   9537
  PACA22G48-100-辅酶Q10   14901
表111：以CTR的％表示的HepG2和PACA2中的ATP柠檬酸裂解酶
  量-组成   归一化的强度
  PACA5g48-培养基   1.00
  PACA5g48-50-辅酶Q10   0.68
  PACA5g48-100-辅酶Q10   0.42
  PACA22G48-培养基   1.00
  PACA22G48-50-辅酶Q10   1.12
  PACA22G48-100-辅酶Q10   1.74
  Hep5g48-培养基   1.00
  Hep5g48-50-辅酶Q10   0.85
  Hep5g48-100-辅酶Q10   0.79
  Hep22G48-培养基   1.00
  Hep22G48-50-辅酶Q10   1.29
  Hep22G48-100-辅酶Q10   2.09
丙酮酸激酶M2(PKM2)
丙酮酸激酶是参与糖酵解途径的酶。其负责将磷酸从磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转移至二磷酸腺苷(ADP)的转移，以产生ATP和丙酮酸盐。PKM2是糖酵解性丙酮酸激酶的同工酶，其表达的特征在于组织的代谢功能，即M2同工酶在正常快速增殖的具有高能量需要的细胞例如胚胎细胞中表达并且也在少数正常的已分化组织(所述组织需要高速率的核酸合成)例如肺和胰岛细胞中表达。PKM2因肿瘤对糖酵解途径的依赖(以满足细胞能量需要)而在肿瘤细胞中高度表达。通常被认为被限制于胚胎的PKM2的同工酶在癌细胞中重新表达。表达PKM2的细胞偏爱具有增加的乳酸盐产量和减少的氧化磷酸化的更强的有氧糖酵解表型(显示代谢表型的转变)。因此，癌细胞中PKM2表达的减少可转变或下调通过糖酵解途径进行的能量产生，在癌症的治疗中是有用的策略。数据显示正常和癌细胞中PKM2的可变表达模式，癌细胞相对于正常细胞显示更高的表达水平。利用辅酶Q10对细胞的处理改变了正常细胞和癌细胞中PKM2上条带和下条带水平的表达模式(图81-85)。在测试的癌细胞中，存在PKM2表达的剂量依赖性减少，并且未在正常细胞中观察到显著变化。这些结果概述于下表中。
表112：HepG2中的丙酮酸激酶肌肉形式2上条带
Figure BPA00001497260602331
表113：HepG2中丙酮酸激酶肌肉形式2下条带(58KD)
表114：处理后HASMC细胞中丙酮酸激酶肌肉形式2上条带
  量-组成   归一化的强度
  5g48-培养基   608
  5g48-50-辅酶Q10   811
  5g48-100-辅酶Q10   611
  22G48-培养基   516
  22G48-50-辅酶Q10   595
  22G48-100-辅酶Q10   496
  22G24-培养基   301
  22G24-50-辅酶Q10   477
  22G24-100-辅酶Q10   701
乳酸脱氢酶(LDH)
LDH是催化丙酮酸盐与乳酸盐的互变同时伴随NADH与NAD+的互变的酶。其具有在低细胞氧张力下将丙酮酸转化成乳酸盐以在牺牲线粒体氧化磷酸化的情况下产生还原当量和产生ATP的能力。癌细胞通常显示增加的LDH的表达以维持糖酵解流来产生ATP以及还原当量和还原线粒体氧化磷酸化酶系(0XPHOS)。因此，减少细胞中LDH的表达可使代谢从乳酸盐的产生转变成促进丙酮酸盐进入TCA循环。利用辅酶Q10的治疗减少癌细胞的乳酸脱氢酶(LDH)表达并且对正常细胞影响最小，从而支持辅酶Q10在通过使细胞质丙酮酸盐至乳酸的转化最小化而引发从糖酵解产生ATP的癌细胞生物能学至线粒体氧化磷酸化酶系来源的转变中的作用。结果概述于下表中。
表115：HepG2中的乳酸脱氢酶
Figure BPA00001497260602341
表116：来自2个实验的以对照％表示的HepG2中的乳酸脱氢酶
Figure BPA00001497260602342
Figure BPA00001497260602351
表117：PACA2中的乳酸脱氢酶
Figure BPA00001497260602352
丙酮酸脱氢酶-B(PDH-E1)
丙酮酸脱氢酶β(PDH-E1)是作为将丙酸酸盐转化成乙酰CoA的丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)的部分的第一个酶成分。PDH-E1需要硫胺素作为其活性的辅因子，进行丙酮酸盐至乙酰CoA的转化以进入线粒体的TCA循环所必需的PDC复合物中的前两个生物化学反应。因此，癌细胞中PKM2和LDH表达的同时减少连同PDH-E1表达的增加可增加丙酮酸盐朝向促进线粒体氧化磷酸化酶系产生ATP的进入速率。所述数据显示对于正常和癌细胞系中PDH-E1的表达，该酶的基线表达在癌细胞中相对于正常细胞减少。利用辅酶Q10的处理与癌细胞中PDH-E1蛋白的表达的递增相关并且在正常细胞中变化最小。所述结果概述于下表中。
表118：HepG2中的丙酮酸脱氢酶β
Figure BPA00001497260602353
Figure BPA00001497260602361
表119：PACA2中的丙酮酸脱氢酶β
表120：处理后HASMC中的丙酮酸脱氢酶β
  量-组成   归一化的体积
  5g48-培养基   140
  5g48-50-辅酶Q10   147
  5g48-100-辅酶Q10   147
  22G48-培养基   174
  22G48-50-辅酶Q10   149
  22G48-100-辅酶Q10   123
  22G24-培养基   140
  22G24-50-辅酶Q10   145
  22G24-100-辅酶Q10   150
半胱天冬酶3
细胞凋亡起始的控制通常表现在起始因子半胱天冬酶、半胱天冬酶-2、-9和-8/10的水平。在细胞凋亡的外部途径中，半胱天冬酶-8，当被激活时，直接切割和激活执行者半胱天冬酶(例如半胱天冬酶-3)。活性半胱天冬酶-3切割并且激活其他半胱天冬酶(6、7和9)以及细胞中的相关靶(例如PARP和DFF)。在这些研究中，测量癌细胞系和正常细胞系中响应酶Q10的效应子半胱天冬酶-3蛋白的水平。应当指出，虽然细胞凋亡的控制通过起始因子半胱天冬酶来进行，但许多信号转导途径相反通过直接抑制效应子半胱天冬酶而中断细胞凋亡信号的传递。例如，P38 MAPK磷酸化半胱天冬酶-3并且抑制其活性(Alvarado-Kristensson等人，2004)。有趣地，相同研究中蛋白磷酸酶(PP2A)或蛋白激酶Cδ(PKCδ)(Voss等人，2005)的激活可抵消38MAPK的效应，从而增加半胱天冬酶-3活化并且支持细胞凋亡信号的传递。因此，半胱天冬酶-3激活的水平上或半胱天冬酶3激活后的事件可在一些情况下决定细胞的最终命运。
半胱天冬酶-3是在细胞凋亡的执行阶段起中枢作用的半胱氨酸-天冬氨酸激酶。辅酶Q10处理增加癌细胞的半胱天冬酶3的水平。相反地，在正常细胞中，半胱天冬酶-3在正常细胞中的表达被适度减少。所述结果概述于下表中。
表121：PACA2中的半胱天冬酶3
  量-组成   归一化的体积(24小时)   归一化的体积(48小时)
  5g-培养基   324   300
  5g-50-辅酶Q10   325   701
  5g-100-辅酶Q10   374   291
  22G-培养基   344   135
  22G-50-辅酶Q10   675   497
  22G-100-辅酶Q10   842   559
表122：来自2个实验的以对照％表示的HepG2细胞中的半胱天冬酶3
  量-组成   以对照％表示的归一化的体积
  5g24-培养基   1..00
  5g24-50-辅酶Q10   1.08
  5g24-100-辅酶Q10   1.76
  5g48-培养基   1.00
  5g48-50-辅酶Q10   1.44
  5g48-100-辅酶Q10   0.95
  22G24-培养基   1.00
  22G24-50-辅酶Q10   1.39
  22G24-100-辅酶Q10   1.78
  22G48-培养基   1.00
  22G48-50-辅酶Q10   1.50
  22G48-100-辅酶Q10   1.45
表123：处理后HASMC中的半胱天冬酶3
  量-组成   归一化的体积
  5g48-培养基   658
  5g48-50-辅酶Q10   766
  5g48-100-辅酶Q10   669
  22G48-培养基   846
  22G48-50-辅酶Q10   639
  22G48-100-辅酶Q10   624
  22G24-培养基   982
  22G24-50-辅酶Q 10   835
  22G24-100-辅酶Q10   865
琥珀酸脱氢酶(SDH)
琥珀酸脱氢酶，也称为琥珀酸-辅酶Q还原酶，是参与TCA和电子传递链的线粒体内膜的复合物。在TCA中，该复合物催化琥珀酸至延胡索酸的氧化同时伴随泛醌至泛醇的还原。(Baysal等人，Science2000；和Tomlinson等人，Nature Genetics 2002)。发现SDH B、C和D亚基的种系突变为家族性副神经节瘤或平滑肌瘤的起始事件(Baysal等人，Science 2000)。
利用Western印迹分析表征用辅酶Q10处理的癌细胞的线粒体制剂中SDH亚基B的表达。所述结果表明辅酶Q10处理与细胞的线粒体中增加的SDH蛋白水平相关。这些结果表明辅酶Q10的作用机制之一是通过增加线粒体酶例如SDHB的水平来使细胞的代谢向TCA循环和线粒体转变。所述结合概述于下表中。
表124：NCIE0808 Mitopreps中的琥珀酸脱氢酶B
  组成-时间   平均归一化的体积
  培养基   531
  50uM辅酶Q10，3小时   634
  100uM辅酶Q10，3小时   964
  50uM辅酶Q10，6小时   1077
  100uM辅酶Q10，6小时   934
低氧诱导因子-1
低氧诱导因子(Hif)是由α和β亚基组成的转录因子。在常氧条件下，Hif1α的蛋白质水平因其通过一系列翻译后事件的连续降解而非常低。糖酵解与氧化磷酸化之间的转变通常被认为受两个酶PDH和LDH的相对活性控制，所述相对活性决定丙酮酸盐的代谢命运。Hif通过诱导LDH水平并且通过刺激PDK抑制PDH活性来控制该至关重要的歧点。由于这种使丙酮酸代谢从线粒体转向细胞溶胶的能力，Hif被认为是癌细胞中生物能量转换的至关重重的调节者。
利用辅酶Q10的处理减少了癌细胞的线粒体制剂的Hif1α蛋白水平。在正常细胞的全细胞裂解产物中，观察到Hif1的下条带，其也显示减少。所述结果概述于下表中。
表125：处理后HASMC细胞中的Hif1α下条带
  量-组成   归一化的体积
  5g48-3培养基   22244
  5g48-50-辅酶Q10   21664
  5g48-100-辅酶Q10   19540
  22G48-培养基   14752
  22G48-50-辅酶Q10   17496
  22G48-100-辅酶Q10   23111
  22G24-培养基   21073
  22G24-50-辅酶Q10   18486
  22G24-100-辅酶Q10   17919
表126：处理后HepG2的Hif1α上条带
  量-组成   归一化的体积
  5g24-培养基   12186
  5g24-50-辅酶Q10   8998
  5g24-100-辅酶Q10   9315
  5g48-培养基   8868
  5g48-50-辅酶Q10   8601
  5g48-100-辅酶Q10   10192
  22G24-培养基   11748
  22G24-50-辅酶Q10   14089
  22G24-100-辅酶Q10   8530
  22G48-培养基   8695
  22G48-50-辅酶Q10   9416
  22G48-100-辅酶Q10   5608
实施例43用CoQ10处理的正常和癌细胞中耗氧率(OCR)和细胞外酸化(ECAR)的分析
本实施例显示在应激因子(例如，高血糖症、低氧、乳酸)不存在和/或存在的情况下细胞对于利用本发明的代表性MIM/表观代谢转变剂-CoQ10的处理的暴露与朝向代表在正常生理条件下在正常细胞中观察到的值的糖酵解/乳酸盐生物合成和线粒体氧化磷酸化(如通过ECAR和OCR值测量的)的转变相关。
本申请人已在先前的部分中显示：癌细胞中利用CoQ10的处理与增强线粒体氧化磷酸化(同时伴随糖酵解和乳酸盐生物合成的减少)的特定蛋白质的表达的变化相关。该实例显示线粒体氧化磷酸化的直接量度可通过使用SeaHorse XF分析仪(在体外实验模型中测量溶解氧和细胞外pH水平的仪器)测量细胞系的耗氧率(OCR)来获得。(SeaHorse Biosciences Inc，North Billerica，MA).
细胞外微环境的pH在肿瘤中相比于细胞内(细胞质)pH和周围正常组织呈相对酸性。肿瘤的该特征起着多个目的，包括侵入细胞外基质(ECM)的能力、肿瘤转移的标志属性，所述属性随后启动信号转导级联，所述级联进一步调节：
●肿瘤血管生成
●增加的控制细胞周期周转的阻滞机制的激活
●促进抗免疫监视的细胞逃脱系统的免疫调节机制
●增加对糖酵解流和乳酸盐利用的依赖性的代谢控制元件
●用于增加致癌性的至关重要的细胞凋亡基因家族例如Bcl-2、IAP、EndoG、AIF的失调
然而不希望受任何特定理论束缚，肿瘤的外部微环境的酸性pH是从肿瘤细胞挤出的氢离子浓度(因来自改变的糖酵解表型的增加的乳酸盐产生而导致)的增加的结果。
在本实验中，在CoQ10存在和不存在的情况下获得正常细胞系的OCR和细胞外酸化率(ECAR)以测定基线值。观察到在其天然营养环境，正常细胞系的基线OCR率不同，并且通常为细胞在体内的生理作用的函数。
例如，使用非癌细胞系HDFa进行一组实验，所述非癌细胞系是成年人真皮成纤维细胞细胞系。成纤维细胞是主要合成和分泌形成组织的结构构架(基质(stroma))的细胞外基质(ECM)成分和胶原的细胞。此外，已知成纤维细胞用作许多功能例如伤口愈合和局部免疫调节的组织代表(ambassador)。在正常生理条件下，使用糖酵解和氧化磷酸化的组合满足正常成纤维细胞的能量需要-糖酵解提供ECM的合成所必需的营养物。
与HDFa相反，HASMC(人主动脉平滑肌细胞)发现于动脉、静脉、淋巴管、胃肠道、呼吸道、膀胱和具有经历受调控的兴奋-收缩偶联的其他组织中。平滑肌例如HASMC细胞经历收缩的能力需要由ATP提供的能量。这些组织从其中可从线粒体提供ATP的低能模式转换至其中通过转换至糖酵解以快速产生ATP来提供能量的高能模式(在运动/应激过程中)。因此，正常平滑肌细胞可使用线粒体OXPHOS和糖酵解的组合来满足它们在正常生理环境下的能量需要。
在使用SeaHorse XF分析仪在这些这些细胞系中测量的其余OCR值中观察到它们各自的生理作用(即，HDFa和HASMC)的差异。下面的图37和38描述了在生理上正常的葡萄糖(约4.6mM)和高葡萄糖(血糖过多的)条件下生长的HDFa和HASMC细胞的OCR。
在5.5mM葡萄糖存在的情况下，在正常氧可用度下在任何处理不存在的情况下HDFa的基线OCR值为约40皮摩尔/分钟(图37)。当将细胞维持在22mM葡萄糖上时，该值略微升高。相反地，在HASMC细胞中，5.5mM葡萄糖上的OCR值为约90皮摩尔/分钟，然而在22mM葡萄糖上，OCR值下降至约40皮摩尔/分钟。因此，在血糖过多的条件下，HDFa与HASMC之间存在差异反应，这进一步证明它们各自的生理组成和功能的固有差异。
细胞中利用CoQ10的处理与代表在正常(5mM)葡萄糖条件下观察到的条件的OCR的变化相关。在低氧张力存在的情况下，生理反应的复杂性变得更复杂。因此，CoQ10暴露与正常细胞中朝向对于特定细胞是天然的生理状态的OCR率的变化相关。
下表127描述了在5.5mM和22mM的葡萄糖上，在常氧和低氧条件下，在CoQ10存在或不存在的情况下HDFa细胞的ECAR值(mpH/分钟)。可观察到在正常细胞中，利用CoQ10的处理对ECAR值具有最小的影响，即使其影响这些细胞的OCR。在高葡萄糖低氧条件下，利用CoQ10的处理与升高的ECAR至在未处理的常氧条件下观察到的值的下降相关。
表127：在5.5mM和22mM的葡萄糖上，在常氧和低氧条件下，在CoQ10存在或不存在的情况下HDFa细胞的ECAR值
Figure BPA00001497260602431
在表128中，HASMC中测量的基线ECAR值(mpH/分钟)比HDFa的基线ECAR值高。低氧条件的诱导引起最可能与继发于增加的糖酵解的细胞内低氧诱导的酸中毒相关的ECAR的增加。
表128：在5.5mM和22mM的葡萄糖上，在常氧和低氧条件下，在CoQ10存在或不存在的情况下HASMC细胞的ECAR值
Figure BPA00001497260602432
Figure BPA00001497260602441
观察到利用CoQ10的处理与低氧条件下血糖过多的HASMC细胞的ECAR率朝向可在常氧正常葡萄糖条件下观察到的值的下降趋势相关。这些数据显示对于特定类型的细胞的生理作用是固有的生理变量的存在，当用CoQ10处理时，观察到的异常条件(例如，高血糖症)的改变向正常转变。
相反地，癌细胞(例如，MCF-7、PaCa-2)因它们在培养中维持的糖酵解表型而相对于正常细胞固有地倾向于在更高水平的葡萄糖下培养。利用CoQ10的处理引起OCR值的一致减少(图39和图40)。
CoQ10对MCF-7和PaCa-2细胞的0CR值的效应与CoQ10对正常HDFa和HASMC细胞的效应相似，其中可变反应暗示着基于癌细胞系的个别代谢特征谱的治疗反应。
表129：在5.5mM和22mM的葡萄糖上，在常氧和低氧条件下，在CoQ10存在或不存在的情况下PaCa-2细胞的ECAR值
表129描述了PaCa-2细胞的ECAR值。与正常细胞相反，癌细胞在表型上倾向于使用高葡萄糖进行ATP产生(增强的糖酵解)，从而导致21mpH/分钟的更高的ECAR(表129，未处理的常氧17mM的ECAR)。利用CoQ10的处理在这些条件下产生ECAR率的显著减少，最可能地与糖酵解产生的乳酸的减少关联。这些细胞中OCR的相关减少可能与增加的线粒体氧化磷酸化酶系的功效相关。
在许多其他正常和癌细胞系中测定OCR和ECAR值的相似比较(数据未显示)，所述细胞系包括：HAEC(正常人主动脉内皮细胞)、MCF-7(乳腺癌)、HepG2(肝癌)和高度转移性PC-3(前列腺癌)细胞系。在所有测试的细胞系中，在应激因子(例如，高血糖症、低氧、乳酸)不存在和/或存在的情况下对CoQ10的暴露与代表在正常生理条件下正常细胞中观察到的值的OCR和ECAR值的转变相关。因此，CoQ10在癌症治疗中的总体效应(包括细胞死亡)是其与细胞生物能学从糖酵解至线粒体氧化磷酸化酶系的转变协作的对蛋白质组学、基因组学、代谢组学结果的整体影响的下游效应。
实施例44用于CoQ10的生物合成的结构单元分子
本实验显示用于CoQ10生物合成的某些前体，例如用于苯醌环的生物合成的某些前体和用于类异戊二烯重复的生物合成以及用于它们与苯醌环(“结构单元成分”)的连接的某些前体，可被单独地或组合地施用至靶细胞，并且导致细胞凋亡抑制剂Bcl-2的下调和/或细胞凋亡促进剂半胱天冬酶-3的上调。某些前体或其组合还可抑制细胞增殖。数据显示此类CoQ10前体可用于取代CoQ10来获得与CoQ10施用基本上相同的结果。
用于本实验的某些示例性实验条件列于下面。
将Skmel-28黑素瘤细胞培养在补充有5％胎牛血清(FBS)和1X终浓度的抗生素的DMEM/F12中。将细胞培养至85％汇合，用结构单元成分处理3、6、12和24小时。随后将细胞沉淀，进行Western印迹分析。
测试结构单元成分包括L-苯丙氨酸、DL-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-酪氨酸、DL-酪氨酸、D-酪氨酸、4-羟基-苯丙酮酸酯、乙酸苯酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯(香草扁桃酸酯或VMA)、香草酸、4-羟基-苯甲酸酯、吡哆素、泛醇、甲羟戊酸、乙酰甘氨酸、乙酰-CoA、法呢基和2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌。
在Western印迹分析中，将细胞沉淀在冷PBS中，裂解，使用BCA蛋白质测定定量蛋白质水平。将全细胞裂解物加载入4％上样12％电泳Tris-HCl凝胶。随后将蛋白质转移至硝酸纤维素纸，然后用5％牛奶Tris-缓冲液封闭1小时。随后将蛋白质暴露于一抗(Bcl-2和半胱天冬酶-3)，进行过夜。随后将硝酸纤维素纸暴露于Pico化学发光剂进行5分钟，记录蛋白质表达。在暴露后，使用相同的方法定量肌动蛋白。通过使用ImageJ，定量蛋白质表达的水平。使用t检验分析统计学显著性。
所述实验的举例说明性结果概述于下在面。
结构单元成分L-苯丙氨酸的Western印迹分析：在进行醌环结构的合成途径之前，将L-苯丙氨酸转化成酪氨酸。进行western印迹分析以定量黑素瘤细胞中细胞凋亡蛋白质的表达的任何变化。测试的浓度为5μm、25μm和100μm。最初研究将L-苯丙氨酸加入DMEM/F12培养基，所述培养基包含0.4M的浓度的苯丙氨酸。对于5μm、25μm和100μm，培养基中L-苯丙氨酸的终浓度分别为0.405M、0.425M和0.500M。对Skmel-28细胞测试这些终浓度，进行3、6、12和24小时的温育期。在加入处理培养基之前将细胞培养至80％的汇合，如上所述使用印迹分析法收获细胞。在3小时和12小时温育后对于100μmL-苯丙氨酸观察到Bcl-2的统计上显著的增加。对于5μm L-苯丙氨酸，在6小时的温育后观察到Bcl-2的统计上显著的减少。对于25μm L-苯丙氨酸，在12小时的温育后观察到Bcl-2的统计上显著的减少和半胱天冬酶-3的统计上显著的增加。Bcl-2的统计让显著的减少表示细胞凋亡潜能的变化并且半胱天冬酶-3的统计上显著的增加确认细胞正在经历细胞凋亡。与对照相比较，总是存在Bcl-2减少的趋势，即使由于样本容量和标准偏差的原因，这些时间点在本实验中不是统计上显著的。
结构单元成分D-苯丙氨酸的Western印迹分析：测试D-苯丙氨酸(生物活性L-苯丙氨酸的化学合成形式)以与L-苯丙氨酸比较。对于全部3个浓度(5μm、25μm和100μm)的D-苯丙氨酸，在6小时的温育后Bcl-2表达显著减少。此外对于5μm和25μm，在3小时的温育存在显著的减少。对于5μM和100μm浓度，在6小时的温育后观察到半胱天冬酶-3表达的显著增加。
结构单元成分DL-苯丙氨酸的Western印迹分析：也测试DL-苯丙氨酸以与L-苯丙氨酸比较。再次地，对Skmel-28细胞测试5μm、25μm和100μm的浓度。温育期为3、6、12和24小时。在3小时的温育后观察到半胱天冬酶-3的统计上显著的增加。在24小时的温育后观察到Bcl-2的统计上显著的减少。虽然在所有其他浓度和温育时间点上存在不断减少的Bcl-2和不断增加的半胱天冬酶-3趋势，但它们在本实验中不是统计上显著的。
结构单元成分L-酪氨酸的Western印迹分析：L-酪氨酸是用于合成CoQ10的醌环结构的结构单元成分。L-酪氨酸的初步测试不导致高至足以进行western印迹分析的蛋白质浓度。根据本研究，对于Western印迹分析测试25μm以下的浓度。所使用的DMEM/F12培养基包含0.398467M的浓度的L-酪氨酸二钠盐。使初始浓度增加500nm、5μm和15μm。在12小时的温育后对于500nm浓度观察到半胱天冬酶-3的统计上显著的增加。对于5A也观察到半胱天冬酶-3的统计上显著的增加。在24小时的温育后对于5μm的浓度观察到Bcl-2的统计上显著的减少。在24小时的温育后对于500μm和5μm浓度观察到Bcl-2的统计上显著的减少。
结构单元成分D-酪氨酸的Western印迹分析：测试D-酪氨酸(L-酪氨酸的合成形式)以与L-酪氨酸对melanonal细胞的细胞凋亡效应相比较。基于利用L-酪氨酸的初步研究，选择低于25μm的浓度进行western印迹分析。测试的浓度为1μm、5μm和15μm。对于12和24小时的时间段，对于5μm和15μm浓度，D-酪氨酸显示Bcl-2表达的减少。对于3、12和24小时的时间段，对于5μm的浓度，半胱天冬酶-3显著增加。对于12和24小时的时间段，对于1μm也存在半胱天冬酶-3表达的增加。此外，对于12小时的时间段，对于5μm存在半胱天冬酶-3表达的增加。
结构单元成分DL-酪氨酸的Western印迹分析：也测试DL-酪氨酸(L-酪氨酸的合成形式)以与L-酪氨酸对细胞的细胞凋亡效应相比较。在12小时温育后在1μm和15μm浓度上和在24小时的温育后对于5μm看到Bcl-2表达的统计上的减少。在12小时的温育后对于5μm和15μm也观察到半胱天冬酶-3表达的增加。
结构单元成分4-羟基-苯丙酮酸的Western印迹分析：4-羟基-苯丙酮酸来源于酪氨酸和苯丙氨酸并且可在环结构的合成中起着重要作用。对于Bcl-2和半胱天冬酶-3表达测试1μm、5μm和15μm的浓度。对于5μm和15μm浓度，在24小时的温育后存在Bcl-2表达的显著减少以及在12小时的温育后存在半胱天冬酶-3表达的显著增加。
结构单元成分乙酸苯酯的Western印迹分析：乙酸苯酯具有被转化成4-羟基-苯甲酸酯的潜能，其在侧链至环结构的连接中起着重要作用。测试的浓度为1μm、5μm和15μm。对于乙酸苯酯，在12小时和24小时的温育后，对于5μm和15μm的浓度存在Bcl-2表达的减少。在12小时和24小时的温育后对于5μm和15μm的浓度观察到半胱天冬酶-3表达的增加。
结构单元成分3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯(香草扁桃酸酯或VMA)的Western印迹分析：VMA是用于CoQ10醌环结构的合成的另外成分。测试的浓度为100nm、250nm、500nm、1μm、25μm、50μm和100μm。虽然在本实验中未观察到统计上显著的细胞凋亡效应，但数据显示Bcl-2表达的下调趋势。
结构单元成分香草酸的Western印迹分析：香草酸是用于醌环的合成的前体并且在500nm、5μm和15μm的浓度上对其进行测试。Western印迹分析测量Bcl-2和半胱天冬酶-3的表达。已显示对于500nm和5μm的浓度，在24小时的温育时间点上香草酸显著减少Bcl-2的表达。对于15μm的浓度，在3小时的温育后，存在Bcl-2表达的减少。对于用15μm温育24小时的细胞，半胱天冬酶-3的表达存在显著的增加。
结构单元成分4-羟基苯甲酸酯的Western印迹分析：4-羟基苯甲酸在类异戊二烯侧链至环结构的连接中起着重要作用。测试的浓度为500nm、1μm和50μm。在24小时的温育后对于15μm的浓度存在Bcl-2浓度的显著减少。
结构单元成分4-吡哆素的Western印迹分析：吡哆素是用于CoQ10的醌环结构的合成的另一种前体结构单元。对于该化合物的测试的浓度为5μM、25μM和100μm。测定细胞的Bcl-2和半胱天冬酶-3的水平。吡哆素显示在24小时的温育后黑素瘤细胞中Bcl-2的显著减少。
结构单元成分泛醇的Western印迹分析：泛醇在CoQ10的醌环结构的合成起着重要作用。对黑素瘤细胞测试的浓度为5μm、25μm和100μm。对于25μm的浓度，该化合物显示Bcl-2表达的显著减少。
结构单元成分甲羟戊酸的Western印迹分析：甲羟戊酸是用于CoQ10的合成的主要成分之一。在500nm、1μm、25μm和50μm的浓度上测试该化合物。在本实验中不存在Bcl-2表达的显著减少或半胱天冬酶-3表达的显著增加。
结构单元成分乙酰甘氨酸的Western印迹分析：用于CoQ10的合成的另一个途径是类异戊二烯(侧链)合成。乙酰甘氨酸的添加将辅酶A转化成乙酰CoA，所述乙酰CoA进入甲羟戊酸途径以进行类异戊二烯的合成。测试的浓度为5μm、25μm和100μm。在12小时的温育后对于5μm和25μm的浓度，乙酰甘氨酸的测试显示Bcl-2表达的显著减少。在24小时的温育时间点上记录对于100μm浓度的Bcl-2的显著减少。
结构单元成分乙酰-CoA的Western印迹分析：乙酰-CoA是用于CoQ10的合成的甲羟戊酸途径的前体。测试的浓度为500nm、1μm、25μm和50μm。对于测试的时间点和浓度未观察到Bcl-2的显著减少或半胱天冬酶-3表达的显著增加。
与法呢基组合的结构单元成分L-酪氨酸的Western印迹分析：L-酪氨酸是用于CoQ10醌环结构的合成的前体之一。先前的实验测试L-酪氨酸在具有L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的介质中的反应。在本研究中，在不添加L-丙氨基酸和L-酪氨酸的介质中检查L-酪氨酸。在本研究中，测试的L-酪氨酸的终浓度为500nm、5μm和15μm。以50μm的浓度测试法呢基。对于3和6小时的时间点未观察到显著的反应。
结构单元成分与法呢基组合的L-苯丙氨酸的Western印迹分析：在不含L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的介质中检查与法呢基组合的L-苯丙氨酸，一种用于醌环结构的合成的前体。进行western印迹分析以测定Bcl-2和半胱天冬酶-3的表达。L-苯丙氨酸的终浓度为：5μm、25μm和100μm。以50μm的浓度加入法呢基。本研究显示对于大多数测试的浓度和组合Bcl-2表达减少，如下表中所描述的。
表130
Figure BPA00001497260602511
4-羟基-苯甲酸酯与苯醌的组合的细胞增殖测定：本组实验使用细胞增殖测定法评估组合不同结构单元分子对细胞增殖的效应。
第一研究检查组合4-羟基-苯甲酸酯与苯醌的效应。将细胞温育48小时，之后对活细胞进行细胞计数。将每一个测试组与对照相比较，并且将每一个组合组与苯醌对照相比较。针对苯醌的添加统计分析化合物。下表概述了细胞计数结果，其中X标记表示细胞数目的统计上的减少。
表131
Figure BPA00001497260602512
Figure BPA00001497260602521
对于用4-羟基苯甲酸酯和苯醌以及组合温育的细胞存在细胞数目的显著减少。对于与70μm苯醌组合的50μm 4-羟基苯甲酸酯的组合，存在相对于苯醌对照的细胞数目的显著减少。这表明对于该摩尔比的协同效应。
进行另外的研究，测试另外的摩尔比。对于第一测试，在500nm、1μm和50μm的浓度上测试4-羟基苯甲酸酯。测试与2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌(Benzo)组合的这些浓度。测试的Benzo的浓度为25μm、50μm和100μm。将黑素瘤细胞培养至80％汇合，以40K个细胞/孔的浓度接种在6孔板中。用CoQ10、4-羟基苯甲酸酯、Benzo以及4-羟基苯甲酸酯/Benzo的组合处理细胞。
进行T-检验，以p＜0.05作为统计上显著的。X表示细胞数目的统计上的减少。
表132
  对照vs Benzo 25μm   X
  对照vs Benzo(B)50μm
  对照vs Benzo(B)100uM   X
  对照vs 4-羟基苯甲酸酯(HB)500nm   X
  对照vs HB 1μm   X
  对照vs HB 50μm   X
  500nm HB vs 500nm HB w/25B   X
  500nm HB vs 500nm HB w/50B   X
  500nm HB vs 500nm HB w/100B   X
  1uM HB vs 1μm HB w/25B   X
  1uM HB vs 1μm HB w/50B   X
  1uM HB vs 1μm HB w/100B
  50uM HB vs 50μm HB w/25B   X
  50uM HB vs 50μm HB w/50B   X
  50uM HB vs 50μm HB w/100B
  500nm HB w/25B vs 25B   X
  500nm HB w/50B vs 50B   X
  500nm HB w/100B vs 100B   X
  1μm HB w/25B vs 25B   X
  1μm HB w/50B vs 50B   X
  1μm HB w/100B vs 100B
  50μm HB w/25B vs 25B   X
  50μm HB w/50B vs 50B   X
  50μm HB w/100B vs 100B
对于含有HB的处理培养基存在细胞增殖的显著增加。此外，HB与苯醌的组合显示与用相应的苯苯醌浓度温育的细胞相比较细胞数目的显著减少。
还对新生成纤维细胞进行细胞增殖测定。测试的HB的浓度为500nm、5μm和25μm。还在25μm、50μm和100μm上测试HB与苯醌的组合。以40k个细胞/孔接种黑素瘤细胞，将其处理24小时。利用胰蛋白酶处理细胞，使用库耳特计数器进行定量。
统计分析未显示成纤维细胞的显著减少。这显示在正常细胞中具有最低毒性至无毒性。
乙酸苯酯和苯醌的组合的细胞增殖测定：乙酸苯酯是4-羟基苯甲酸的合成的前体(促进环结构的接合)。进行细胞增殖测定以测定温育与CoQ10和苯醌组合的乙酸苯酯的效应。
表133
  对照和25/25μm Ben   X
  对照和25/50μm Ben   X
  对照和25/100μm Ben   X
  对照和25/25μm Q-10   X
  对照和25/25μm Q-10   X
  对照和25/50μm Q-10   X
  对照和25/100μm Q-10   X
  对照和Ben 25   X
  对照和Ben 50   X
  对照和Ben 100   X
  对照和Q-10 25
  对照和Q-10 50
  对照和Q-10 100   X
  Ben 25μm和500nm/25μm Ben   X
  Ben 25μm和5nm/25μm Ben   X
  Ben 25μm和25nm/25μm Ben   X
  Ben 50μm和500nm/50μm Ben   X
  Ben 50μm和5nm/50μm Ben   X
  Ben 50μm和25nm/50μm Ben   X
  Ben 100μm和500nm/100μm Ben
  Ben 100μm和5nm/100μm Ben
  Ben 100μm和25nm/100μm Ben
  Q-10 25μm和500nm/25μm Q-10   X
  Q-10 25μm和5nm/25μm Q-10   X
  Q-10 25μm和25nm/25μm Q-10   X
  Q-10 50μm和500nm/50μm Q-10   X
  Q-10 50μm知5nm/50μm Q-10   X
  Q-10 50μm和25nm/50μm Q-10   X
  Q-10 100μm和500nm/100μm Q-10   X
  Q-10 100μm和5nm/100μm Q-10   X
  Q-10 100μm和25nm/100μm Q-10   X
数据显示乙酸苯酯与苯醌的组合的添加显著减少细胞增殖。与CoQ10和乙酸苯酯的组合与单独利用CoQ10和苯醌的温育相比较显著减少细胞数目。
4-羟基-苯甲酸酯与法呢基的组合的细胞增殖测定：将4-羟基-苯甲酸酯与法呢基组合温育。结果的概述列于下面。将4-羟基苯甲酸酯组与对照和法呢基对照组相比较。X表示细胞数目的统计上的减少。
表134
Figure BPA00001497260602551
Figure BPA00001497260602561
L-苯丙氨酸与苯醌的组合的细胞增殖测定：进行细胞增殖测定以测试与苯醌组合的L-苯丙氨酸的组合。下面是L-苯丙氨酸相对于对照和苯醌对照的结果的概述。X表示统计上的减少。
表135
Figure BPA00001497260602562
对于与苯醌组合的L-苯丙氨酸看到相似的协同作用。
L-苯丙氨酸与法呢基的组合的细胞增殖测定：与法呢基组合温育的L-苯丙氨酸的组合细胞增殖研究的初步结果。将L-苯丙氨酸与对照和法呢基对照组相比较。X表示细胞数目的统计上的减少。
表136
Figure BPA00001497260602571
L-酪氨酸与苯醌的组合的细胞增殖测定：将L-酪氨酸与苯醌组合温育，之后进行细胞计数。将所述组合与对照组和苯醌对照组相比较。
表137
Figure BPA00001497260602572
Figure BPA00001497260602581
苯醌的添加不增强L-酪氨酸对细胞数目的影响。
L-酪氨酸与苯醌的组合的细胞增殖测定：本研究检查L-酪氨酸与法呢基的组合。将所述组与对照和法呢基对照组相比较。
表138
Figure BPA00001497260602582
Figure BPA00001497260602591
组合L-酪氨酸与法呢基在本实验中似乎对减少细胞的数目不具有协同效应。
将CoQ10的合成分成两个主要部分，所述部分由环结构的合成和侧链结构的合成组成。此处，致癌细胞补充有作为用于侧链和环结构成分的合成的前体的化合物。我们的结果将所述研究聚焦至参与环结构的合成的3种主要成分和在环结构至侧链结构的连接中起着重要作用的2种化合物。已显示Bcl-2的显著减少和半胱天冬酶-3表达的显著增加的3种化合物为：1)L-苯丙氨酸、2)L-酪氨酸和3)4-羟基苯丙酮酸酯。牵涉侧链至环结构的连接的2种化合物为：1)4-羟基苯甲酸盐和2)乙酸苯酯。
我们的结果还显示与2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌(苯醌)组合的这些化合物的外源递送显著抑制细胞增殖。这表明给环结构补充用于将侧链连接至苯醌环的化合物可补足受损的CoQ10合成机制。这也可有助于稳定分子以维持细胞过程所需的功能性质。乙酸苯酯是4-羟基苯甲酸酯的合成的前体，将其与苯醌组合外源递送在致癌细胞中具有相似效应。
实施例45：辅酶Q10施用对胰腺癌的体内效应
在动物模型中评估辅酶Q10的静脉内施用制剂治疗胰腺癌的功效。将具有诱导的胰腺癌的大鼠随机分组并且使之接受下列9种处理之一：
●组A：对照
●组B：盐溶液
●组C：媒介物
●组D：5mg/kg辅酶Q10
●组E：10mg/kg辅酶Q10
●组F：25mg/kg辅酶Q10
●组G：50mg/kg辅酶Q10
●组H：5mg/kg多柔比星
●组I：50mg/kg辅酶Q10和5mg/kg多柔比星
28天后，组A和B中的所有动物和组C中的大部分动物死亡。相反地，组D、E和F中的大多数动物仍然活着，接受更高剂量的辅酶Q10的那些动物活得更长。事实上，所有接受最高剂量的辅酶Q10(组G)的动物在第28天仍然活着。这些数据论证了其中接受更高剂量的那些动物具有更高的存活率的总剂量反应曲线。
为了评估辅酶Q10与多柔比星的组合在治疗胰腺癌中的功效，给组H施用单独的多柔比星，然而给组I施用多柔比星与辅酶Q10的组合。28天后，组H中许多动物因多柔比星的毒性而死亡，然而组I中的动物具有增加的存活率。这些数据表明：除了增加与胰腺癌相关的存活率外，辅酶Q10还可减轻化学治疗方案的毒副作用。
等同方案：
本领域技术人员将承认，或能够确定通过只使用常规实验，许多方面等同于本文中描述的特定实施方案和方法。此类等同物旨在包括在下列权利要求的范围内。

Claims (57)

1.一种用于治疗或预防人的肿瘤障碍的方法，包括：给人局部施用辅酶Q10(CoQ10)以便治疗或预防发生。
2.权利要求1所述的方法，其中CoQ10诱导肿瘤障碍的癌细胞的细胞凋亡或细胞死亡机制。
3.权利要求1所述的方法，其中CoQ10抑制肿瘤障碍的癌细胞的血管生成。
4.权利要求1所述的方法，其中CoQ10在肿瘤障碍的癌细胞的微环境中诱导免疫相关成分的调节。
5.权利要求1所述的方法，其中CoQ10诱导肿瘤障碍的癌细胞的细胞周期控制的改变。
6.权利要求1所述的方法，其中所述局部施用是通过经选择在人中对待治疗的障碍提供治疗效力的剂量。
7.权利要求1或6所述的方法，其中通过施用辅酶Q10的氧化形式进行障碍的治疗或预防。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中治疗一群人，并且所述群体的至少25％经历如通过本领域公认的终点，包括癌症的组织病理学、临床观察、照相分析、CT扫描、MRI成像、血液、血清或血浆标志，所测量的症状的减少。
9.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中治疗一群人并且所述群体的至少25％对于被治疗的障碍具有治疗性的全身性辅酶Q10水平。
10.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中待治疗的肿瘤障碍不是通常通过局部施用而是预期以治疗有效水平全身性递送活性剂来治疗的障碍。
11.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中待治疗的人的组织中的辅酶Q10的浓度与代表健康或正常状态的人组织的对照标准的辅酶Q10的浓度不同。
12.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中给人施用的辅酶Q10的形式与在人的全身性循环中发现的主要形式不同。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中治疗通过CoQ10与蛋白质的相互作用发生，所述蛋白质选自HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-羟基苯甲酸酯、中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C、钙调蛋白激酶II和表2-4和6-28中所列的任一个或多个基因。
14.权利要求6所述的方法，其中将辅酶Q10于局部媒介物中以约0.01至约0.5毫克的辅酶Q10/平方厘米的皮肤的范围内的剂量用于靶组织。
15.权利要求6所述的方法，其中将辅酶Q10于局部媒介物中以约0.09至约0.15毫克的辅酶Q10/平方厘米的皮肤的范围内的剂量用于靶组织。
16.权利要求6所述的方法，其中将辅酶Q10于局部媒介物中以约0.12毫克的辅酶Q10/平方厘米的皮肤的剂量用于靶组织。
17.权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述肿瘤障碍是鳞状细胞癌。
18.权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述肿瘤障碍是基底细胞癌。
19.权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述肿瘤障碍是SCC，并且其中所述方法防止癌前期损伤光化性角化病进展成SCC。
20.权利要求6所述的方法，其中所述肿瘤障碍是黑素瘤。
21.权利要求14-20中任一项所述的方法，其中通常每24小时局部施用辅酶Q10一次或多次，进行6周或更长时间。
22.权利要求6所述的方法，其中以0.5至10毫克的CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量以CoQ10乳膏的形式施用辅酶Q10，其中所述CoQ10乳膏包含1至5％的辅酶Q10。
23.权利要求22所述的方法，其中所述CoQ10乳膏包含约3％的辅酶Q10。
24.权利要求6所述的方法，其中以3至5毫克的CoQ10乳膏/平方厘米的皮肤的剂量以CoQ10乳膏的形式施用辅酶Q10，其中所述CoQ10乳膏包含1至5％的辅酶Q10。
25.权利要求24所述的方法，其中所述CoQ10乳膏包含约3％的辅酶Q10。
26.一种用于治疗或预防人的侵袭性肿瘤障碍的方法，包括：以选择的比对于不太具有侵袭性或非侵袭性肿瘤障碍所使用或选择的给药方案更低的剂量给人施用辅酶Q10，从而治疗或预防侵袭性肿瘤障碍。
27.权利要求26所述的方法，其中所述侵袭性肿瘤障碍包括胰腺癌、肝细胞癌、尤因肉瘤、转移性乳腺癌、转移性黑素瘤、脑癌(星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、神经内分泌癌、结肠癌、肺癌、骨肉瘤、非雄激素依赖型前列腺癌、卵巢癌和非何杰金氏淋巴瘤。
28.一种用于治疗或预防人的非侵袭性肿瘤障碍的方法，包括：以选择的比对于侵袭性肿瘤障碍所使用或选择的给药方案更高的剂量给人施用辅酶Q10，从而治疗或预防非侵袭性肿瘤障碍。
29.权利要求28所述的方法，其中所述非侵袭性肿瘤障碍包括非转移性乳腺癌、雄激素依赖型前列腺癌、小细胞肺癌、急性淋巴细胞白血病。
30.一种用于治疗或预防人的肿瘤障碍的方法，包括：给人施用辅酶Q10以便所述肿瘤障碍的治疗发生，其中以使辅酶Q10在治疗过程中维持其氧化形式的方式施用辅酶Q10。
31.一种用于在人中阻断葡萄糖的无氧使用并且提高线粒体氧化磷酸化的方法，所述方法包括：
(1)选择患有肿瘤障碍的人受试者，和
(2)给所述人施用治疗有效量的辅酶Q10或辅酶Q10生物合成途径中的中间产物，从而阻断葡萄糖的无氧使用和增加线粒体氧化磷酸化。
32.权利要求31所述的方法，其还包括：
(1)上调一个或多个基因的表达，所述基因选自HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-羟基苯甲酸酯、中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C、钙调蛋白激酶II和/或
(2)下调一个或多个基因的表达，所述基因选自HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-羟基苯甲酸酯、中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C、钙调蛋白激酶II，
从而阻断葡萄糖的无氧使用并且提高线粒体氧化磷酸化。
33.一种用于在人中阻断葡萄糖的无氧使用并且提高线粒体氧化磷酸化的方法，所述方法包括：
(1)选择患有侵袭性肿瘤障碍的人受试者，和
(2)给所述人施用治疗有效量的辅酶Q10或辅酶Q10生物合成途径中的中间产物，从而阻断葡萄糖的无氧使用和增加线粒体氧化磷酸化。
34.权利要求27所述的方法，其中所述肿瘤障碍选自胰腺癌、肝细胞癌、尤因肉瘤、转移性乳腺癌、转移性黑素瘤、脑癌(星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、神经内分泌癌、结肠癌、肺癌、骨肉瘤、非雄激素依赖型前列腺癌、卵巢癌和非何杰金氏淋巴瘤。
35.一种用于在人中阻断葡萄糖的无氧使用并且提高线粒体氧化磷酸化的方法，所述方法包括：
(1)选择患有非侵袭性肿瘤障碍的人受试者，和
(2)给所述人施用治疗有效量的辅酶Q10或辅酶Q10生物合成途径中的中间产物，从而阻断葡萄糖的无氧使用和增加线粒体氧化磷酸化。
36.权利要求29所述的方法，其中所述肿瘤障碍选自非转移性乳腺癌、雄激素依赖型前列腺癌、小细胞肺癌、急性淋巴细胞白血病。
37.权利要求31、33或35所述的方法，其中所述中间产物包括：
(a)苯醌或至少一种促进苯醌环的生物合成的分子，和
(b)至少一种促进类异戊二烯单元的合成和/或类异戊二烯单元至苯醌环的连接的分子。
38.权利要求37所述的方法，其中所述至少一种促进苯醌环的生物合成的分子包括：L-苯丙氨酸、DL-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-酪氨酸、DL-酪氨酸、D-酪氨酸、4-羟基-苯丙酮酸酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯(香草扁桃酸酯或VMA)、香草酸、吡哆素或泛醇。
39.权利要求37所述的方法，其中所述至少一种促进类异戊二烯单元的合成和/或类异戊二烯单元至苯醌环的连接的分子包括：乙酸苯酯、4-羟基-苯甲酸酯、甲羟戊酸、乙酰甘氨酸、乙酰-CoA或法呢基。
40.权利要求31、33或35所述的方法，其中所述中间产物包括：
(a)L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和4-羟基苯丙酮酸的一种或多种；和，
(b)4-羟基苯甲酸酯、乙酸苯酯和苯醌的一种或多种。
41.权利要求31、33或35所述的方法，其中所述中间产物：
(a)抑制Bcl-2表达和/或促进半胱天冬酶-3表达；和/或，
(b)抑制细胞增殖。
42.一种用于治疗人的肿瘤障碍的方法，包括：以给药方案给有此需要的人施用辅酶Q10以使人的细胞膜的通透性受到调节并且治疗发生。
43.权利要求26、28、30、31、33和42中任一项所述的方法，其中所述治疗通过CoQ10与蛋白质的相互作用发生，所述蛋白质选自HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-羟基苯甲酸酯、中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C、钙调蛋白激酶II和表2-4和6-28中所列的任一个或多个基因。
44.权利要求1、26、28、30、31、33和42中任一项所述的方法，其中所述肿瘤障碍选自白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。
45.权利要求1-44中任一项所述的方法，其还包括选自手术、放射疗法、激素疗法、抗体疗法、利用生长因子、细胞因子的疗法和化学疗法的治疗方案。
46.一种用于制备辅酶Q10乳膏3％的方法，包括步骤：
(1)制备A相、B相、C相、D相和E相；和
(2)将A、B、C、D和E相组合以便形成3％CoQ10乳膏的水包油乳剂。
47.权利要求46所述的方法，其中：
(1)A相成分包含4.00％w/w的烷基C12-15苯甲酸盐NF、2.00％w/w的鲸蜡醇NF、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯/PEG-100和1.5％w/w的硬脂醇NF；
(2)B相成分包括5.00％w/w的二甘醇单乙醚NF、2.00％w/w的甘油USP、1.50％w/w的丙二醇USP、0.475％w/w的苯氧乙醇NF、16.725％w/w的纯化水USP和40.00％w/w的卡波姆分散体2％；
(3)C相成分包括0.50％w/w的乳酸USP、2.00％w/w的乳酸钠溶液USP、1.30％w/w的三乙醇胺NF和2.50％w/w的纯化水USP；
(4)D相成分包括1.00％w/w的二氧化钛USP；
(5)E相成分包括15％w/w的CoQ10 21％浓缩物；
其中所述重量百分比是相对整个CoQ10乳膏3％的。
48.权利要求46所述的方法，其中：
(1)A相成分包括4.00％w/w的辛酸/癸酸甘油三酯、2.00％w/w的鲸蜡醇NF、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯/PEG-100和1.5％w/w的硬脂醇；
(2)B相成分包括5.00％w/w的二甘醇单乙醚NF、2.00％w/w的甘油USP、1.50％w/w的丙二醇USP、0.475％w/w的苯氧乙醇NF、16.725％w/w的纯化水USP和40.00％w/w的卡波姆分散体2％；
(3)C相成分包括0.50％w/w的乳酸USP、2.00％w/w的乳酸钠溶液USP、1.30％w/w的三乙醇胺NF和2.50％w/w的纯化水USP；
(4)D相成分包括1.00％w/w的二氧化钛USP；
(5)E相成分包括15％w/w的CoQ10 21％浓缩物；
其中所述重量百分比是相对整个CoQ10乳膏3％的。
49.权利要求47或48中任一项所述的方法，其中：
(1)向适当的容器中加入A相成分并且在水浴中加热至70-80℃；
(2)向适当的容器中加入不包括卡波姆分散体的B相成分，并且混合以形成混合B相；
(3)将C相成分加入至适当容器中并且在水浴中加热至70-80℃；
(4)将E相成分置于适当的容器并且利用水浴在50-60℃下熔化以形成熔化的E相；
(5)向搅拌罐中加入卡波姆分散体，并且在混合下加热至70-80℃；
(6)向搅拌罐中加入混合的B相同时将温度维持在70-80℃；
(7)向搅拌罐中加入C相成分同时将温度维持在70-80℃；
(8)向搅拌罐中加入D相成分，随后混合并匀化；其中，所述方法还包括以下步骤：
(a)停止匀化并且将搅拌罐的内容物冷却至50-60℃；
(b)中止混合，向搅拌罐中加入熔化的E相以形成分散体；
(c)随后重新开始混合直至分散体变得光滑和均匀；和
(d)将搅拌罐的内容物冷却至45-50℃。
50.一种包含CoQ10乳膏3％的药物组合物，其中所述乳膏包含：
(1)具有4.00％w/w组合物的C12-15烷基苯甲酸盐、2.00％w/w组合物的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100的A相；
(2)具有2.00％w/w的甘油、1.5％w/w的丙二醇、5.0％w/w的乙氧基二甘醇、0.475％w/w的苯氧乙醇、40.00％w/w的卡波姆分散体、16.725％w/w的纯化水的B相；
(3)具有1.300％w/w的三乙醇胺、0.500％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液和2.5％w/w的水的C相；
(4)具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和
(5)具有15.000％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。
51.权利要求50所述的药物组合物，其中卡波姆分散体包括水、苯氧乙醇、丙二醇和卡波姆940。
52.一种包含CoQ10乳膏3％的药物组合物，其中所述乳膏包含：
(1)具有4.00％w/w组合物的辛酸/癸酸甘油三酯、2.00％w/w组合物的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100的A相；
(2)具有2.00％w/w的甘油、1.5％w/w的丙二醇、5.0％w/w的乙氧基二甘醇、0.475％w/w的苯氧乙醇、40.00％w/w的卡波姆分散体、16.725％w/w的纯化水的B相；
(3)具有1.300％w/w的三乙醇胺、0.500％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液、2.5％w/w的水的C相；
(4)具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和
(5)具有15.000％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。
53.一种包含CoQ10乳膏1.5％的药物组合物，其中所述乳膏包含：
(1)具有5.000％w/w的C12-15烷基苯甲酸盐、2.000％w/w的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.500％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100硬脂酸酯的A相；
(2)具有2.000％w/w的甘油、1.750％w/w的丙二醇、5.000％w/w的乙氧基二甘醇、0.463％w/w的苯氧乙醇、50％w/w的卡波姆分散体和11.377％w/w的纯化水的B相；
(3)具有1.3％w/w的三乙醇胺、0.400％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液和4.210％w/w的水的C相；
(4)具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和
(5)具有1.500％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。
54.一种包含CoQ10乳膏1.5％的药物组合物，其中所述乳膏包含：
(1)具有5.000％w/w的辛酸/癸酸甘油三酯、2.000％w/w的鲸蜡醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.500％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100硬脂酸酯的A相；
(2)具有2.000％w/w的甘油、1.750％w/w的丙二醇、5.000％w/w的乙氧基二甘醇、0.463％w/w的苯氧乙醇、50％w/w的卡波姆分散体和11.377％w/w的纯水的B相；
(3)具有1.3％w/w的三乙醇胺、0.400％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液和4.210％w/w的水的C相；
(4)具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和
(5)具有1.500％w/w的CoQ10 21％浓缩物的E相。
55.权利要求53所述的药物组合物，其中所述卡波姆分散体包含水、苯氧乙醇和丙二醇。
56.一种用于治疗或预防人的CoQ10反应性障碍的方法，包括：通常给人局部施用辅酶Q10(CoQ10)以便治疗或预防发生。
57.权利要求56所述的方法，其中所述CoQ10反应性障碍是肿瘤障碍。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103585619A (zh) * 2013-10-31 2014-02-19 浙江大学 Dj-1蛋白在制备骨肉瘤诊断和治疗产品中的应用
CN105338973A (zh) * 2013-04-08 2016-02-17 博格有限责任公司 使用辅酶q10联合疗法治疗癌症
CN112924681A (zh) * 2019-12-05 2021-06-08 张曼 尿液krt10蛋白及其多肽片段在正常妊娠中的应用

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0809164B8 (pt) * 2007-03-22 2023-02-28 Berg Llc Composição para administração tópica e composição farmacêutica compreendendo a referida composição
WO2010132502A2 (en) * 2009-05-11 2010-11-18 Cytotech Labs, Llc Methods for treatment of metabolic disorders using epimetabolic shifters, multidimensional intracellular molecules, or environmental influencers
WO2011112900A2 (en) 2010-03-12 2011-09-15 Cytotech Labs, Llc Intravenous formulations of coenzyme q10 (coq10) and methods of use thereof
CA2810746A1 (en) * 2010-06-30 2012-01-05 Galderma Research & Development Method for preventing or treating skin tumor
SG182016A1 (en) * 2010-12-14 2012-07-30 Univ Singapore Method of detecting resistance to cancer therapy
US9783785B2 (en) 2010-12-20 2017-10-10 Cameron K. Tebbi Screening methods for detection of susceptibility to leukemia and lymphomas
EP2656076B1 (en) * 2010-12-20 2017-11-01 Cameron K. Tebbi Methods of detecting leukemia/ lymphoma and induction of the same
JP6046053B2 (ja) * 2011-01-13 2016-12-14 エクスプレッション、パソロジー、インコーポレイテッドＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． Ｂｃｌ−２様タンパク質１１のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ
WO2012104834A1 (en) * 2011-02-03 2012-08-09 Pharmedica Ltd. New oral dissolving films for insulin administration, for treating diabetes
US9886545B2 (en) 2011-03-02 2018-02-06 Berg Llc Interrogatory cell-based assays and uses thereof
RU2453849C1 (ru) * 2011-03-11 2012-06-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" Способ определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях
AU2012240222B2 (en) 2011-04-04 2017-04-27 Berg Llc Methods of treating central nervous system tumors
EP2720689A4 (en) 2011-06-14 2014-11-26 Edison Pharmaceuticals Inc CATÉCHOL DERIVATIVES FOR THE TREATMENT OF OXIDATIVE STRESS DISEASES
EA201490047A1 (ru) 2011-06-17 2014-08-29 Берг Ллк Ингаляционные фармацевтические композиции
CN102453769A (zh) * 2011-12-27 2012-05-16 芮屈生物技术（上海）有限公司 白血病病变前期mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用
RU2659936C2 (ru) 2012-03-06 2018-07-04 Зэ Борд оф Трастиз оф зэ Юниверсити оф Иллинойс Активация прокаспазы-3 с помощью комбинированной терапии
CN108048521B (zh) 2012-04-02 2022-05-27 博格有限责任公司 基于细胞的探询式分析及其应用
KR20200118233A (ko) 2012-06-01 2020-10-14 버그 엘엘씨 조효소 q10을 이용한 고형 종양의 치료
CA2883810C (en) * 2012-09-06 2017-10-31 Hitachi Chemical Co., Ltd. Methods for assessment of peptide-specific immunity
AU2013318686B2 (en) 2012-09-19 2017-11-30 Grespo Ab Compositions for improvement of brain function
JP6194003B2 (ja) 2012-10-09 2017-09-06 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 有益剤及びこれを含む組成物の特定又は評価方法
JP6189962B2 (ja) 2012-10-09 2017-08-30 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 相乗作用する美容成分の組み合わせを特定する方法
US9144538B2 (en) 2013-02-08 2015-09-29 The Procter & Gamble Company Cosmetic compositions containing substituted azole and methods for alleviating the signs of photoaged skin
US9138393B2 (en) 2013-02-08 2015-09-22 The Procter & Gamble Company Cosmetic compositions containing substituted azole and methods for improving the appearance of aging skin
WO2014144346A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Use of inhibitors of mtor to improve vascular functions in apoe4 carriers
EP2976002A1 (en) * 2013-03-19 2016-01-27 The Procter & Gamble Company Method of measuring the metabolic indicators of hair follicles
WO2014181968A1 (ko) * 2013-05-09 2014-11-13 가톨릭대학교 산학협력단 메트포민과 코엔자임 q10을 유효성분으로 함유하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물
CN105682688A (zh) * 2013-06-26 2016-06-15 雷特综合征研究信托 Rett综合征及其治疗
EP3730131A1 (en) 2013-09-04 2020-10-28 Berg LLC Methods of treatment of cancer by continuous infusion of coenzyme q10
MX2016006623A (es) 2013-11-22 2017-03-10 Pharmakea Inc Compuestos de inhibidor de autotaxina.
US20160310572A1 (en) * 2013-12-02 2016-10-27 Wayne State University Compositions and methods to diagnose diabetes and/or to treat negative effects of diabetes
EP3089737B1 (en) 2013-12-31 2021-11-03 Rapamycin Holdings, LLC Oral rapamycin nanoparticle preparations and use
WO2015109116A1 (en) * 2014-01-15 2015-07-23 The Regents Of The University Of California Metabolic screening for gestational diabetes
US11203739B2 (en) 2014-04-07 2021-12-21 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Modulating cell proliferation and pluripotency
CN106458868A (zh) 2014-04-17 2017-02-22 伊谬诺米特医疗有限公司 胍化合物及其用途
US9051320B1 (en) 2014-08-18 2015-06-09 Pharmakea, Inc. Methods for the treatment of metabolic disorders by a selective small molecule autotaxin inhibitor
EP3828547A1 (en) * 2014-08-26 2021-06-02 Keio University Anti-cancer agent sensitivity-determining marker
AU2015314956A1 (en) 2014-09-11 2017-04-06 Berg Llc Bayesian causal relationship network models for healthcare diagnosis and treatment based on patient data
EA036337B1 (ru) 2015-05-27 2020-10-28 Сабре Терапьютикс Ллс Ингибиторы аутотаксина и их применения
WO2017040520A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Hitachi Chemical Co., Ltd. Molecular methods for assessing urothelial disease
EP3387430A4 (en) * 2015-12-11 2019-08-14 Expression Pathology, Inc. SRM / MRM DOSINGS
US20190376142A1 (en) * 2016-11-25 2019-12-12 Koninklijke Philips N.V. Method to distinguish tumor supressive foxo activity from oxidative stress
WO2018116307A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 The National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd. Methods for treating diabetes using vdac1 inhibitors
RU2761873C2 (ru) 2016-12-23 2021-12-13 Кэйо Юниверсити Композиции и способы для индукции cd8+ t-клеток
CA3063916A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Berg Llc Use of coenzyme q10 formulations in the treatment and prevention of epidermolysis bullosa
CN113684275B (zh) * 2017-06-22 2024-02-27 北海康成（北京）医药科技有限公司 预测食管癌对抗erbb3抗体治疗的应答的方法和试剂盒
JP7209951B2 (ja) * 2017-10-30 2023-01-23 日本メナード化粧品株式会社 白髪予防及び改善剤
CA3082575A1 (en) 2017-11-17 2019-05-23 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Cancer therapy by degrading dual mek signaling
AU2019217041B2 (en) * 2018-02-09 2022-09-15 Keio University Compositions and methods for the induction of CD8+ T-cells
AU2019350699B2 (en) 2018-09-25 2024-05-23 Ponce De Leon Health Designated Activity Company Process of making calcium alpha-ketoglutarate
US11845989B2 (en) 2019-01-23 2023-12-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of ophthalmic conditions with angiopoietin-like 7 (ANGPTL7) inhibitors
CA3126476A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of ophthalmic conditions with angiopoietin-like 7 (angptl7) inhibitors
US11216742B2 (en) 2019-03-04 2022-01-04 Iocurrents, Inc. Data compression and communication using machine learning
WO2021102356A1 (en) 2019-11-20 2021-05-27 Berg Llc Combination therapy of a coenzyme q10 compound and radiation therapy for treatment of glioma
JP2021084891A (ja) * 2019-11-28 2021-06-03 株式会社ノエビア 抗老化剤
KR102383788B1 (ko) * 2020-06-12 2022-04-05 이화여자대학교 산학협력단 신체적 스트레스 상태를 평가하는 방법
CA3188646A1 (en) * 2020-07-02 2022-01-06 Ponce De Leon Health Designated Activity Company Compositions and methods for treating crp-mediated diseases
US11938152B2 (en) 2020-08-06 2024-03-26 Kedar N Prasad High-dose antioxidants in cancer treatment
JP2024502282A (ja) 2020-12-23 2024-01-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 細胞死誘導ｄｆｆａ様エフェクターｂ（ｃｉｄｅｂ）阻害剤での肝疾患の治療
KR20230148819A (ko) 2021-02-26 2023-10-25 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 글루코코르티코이드 및 안지오포이에틴-유사 7 (angptl7) 억제제를 이용한 염증의 치료
CN114306608B (zh) * 2022-01-04 2024-01-16 上海科技大学 一类适应低氧或缺氧微环境的肿瘤的治疗靶点及其应用
CN116486916A (zh) * 2022-11-03 2023-07-25 杭州联川生物技术股份有限公司 一种单细胞转录组濒死细胞和多细胞过滤方法、介质和设备
CN117347643B (zh) * 2023-12-05 2024-02-06 成都泰莱生物科技有限公司 用于判断肺部结节良恶性的代谢标志物组合及其筛选方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1953743A (zh) * 2004-01-22 2007-04-25 迈阿密大学 局部辅酶q10制剂及其使用方法
CN101015524A (zh) * 2007-02-15 2007-08-15 沈阳药科大学 辅酶q10口服乳剂及其制备方法

Family Cites Families (390)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4525350A (en) 1975-02-20 1985-06-25 The New England Institute, Inc. Methods of stimulating host defense system with coenzymes Q4 to Q.sub.1
JPS5775916A (en) 1980-10-29 1982-05-12 Nippon Chemiphar Co Ltd Coenzyme q pharmaceutical and its preparation
JPS58113127A (ja) 1981-12-28 1983-07-05 Ajinomoto Co Inc ユビデカレノン含有水性液
IT1157269B (it) 1982-03-19 1987-02-11 Seuref Ag Nuove formulazioni farmaceutiche contenenti il coenzima q10 adatte per la somministrazione topica
JPS58201711A (ja) 1982-05-19 1983-11-24 Eisai Co Ltd ユビデカレノン含有リポソ−ム被覆体
US4515736A (en) 1983-05-12 1985-05-07 The Regents Of The University Of California Method for encapsulating materials into liposomes
US4833128A (en) 1984-12-28 1989-05-23 Neil Solomon Dietary supplement
US4824669A (en) 1985-04-11 1989-04-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Formulations of coenzyme Q10 for intravenous use
US4895727A (en) * 1985-05-03 1990-01-23 Chemex Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical vehicles for exhancing penetration and retention in the skin
JPS62123113A (ja) 1985-11-22 1987-06-04 Green Cross Corp:The ユビデカレノン含有脂肪乳剤
US4843071A (en) 1986-12-05 1989-06-27 Serotonin Industries Of Charleston Method and composition for treating obesity, drug abuse, and narcolepsy
US5651991A (en) 1987-10-28 1997-07-29 Nippon Shinyaku Co. Ltd. Drug carriers
JP2600726B2 (ja) 1987-11-30 1997-04-16 大正製薬株式会社 微粒子脂肪乳剤
GB8811410D0 (en) 1988-05-13 1988-06-15 Unilever Plc Treatment of skin disorders
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5015483A (en) * 1989-02-09 1991-05-14 Nabisco Brands, Inc. Liposome composition for the stabilization of oxidizable substances
JP2828655B2 (ja) 1989-04-14 1998-11-25 エーザイ株式会社 脂溶性薬物含有水性液
US5580575A (en) * 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5585112A (en) 1989-12-22 1996-12-17 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres
US5962243A (en) 1990-04-18 1999-10-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for the identification of farnesyltransferase inhibitors
JP3008131B2 (ja) 1990-11-14 2000-02-14 ロレアル グリセリンから誘導される非イオン両親媒性化合物、その調製方法、相応する中間体化合物及び前記化合物を含有する組成物
SE502569C2 (sv) * 1991-05-31 1995-11-13 British Tech Group Användning av en immunologiskt inert matris av en sterol och saponiner som kan bilda sfäriska nanopartiklar med snäv storleksfördelning som läkemedelsbärare, partiklar, komposition samt kit
US5378461A (en) * 1991-07-12 1995-01-03 Neigut; Stanley J. Composition for the topical treatment of skin damage
US5605930A (en) 1991-10-21 1997-02-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Compositions and methods for treating and preventing pathologies including cancer
US6461593B1 (en) 1992-02-19 2002-10-08 Biomedical And Clinical Research Therapy with coenzyme Q10 to reduce subgingival microorganisms in patients with periodontal disease
EP0627921B1 (en) 1992-02-24 2000-05-31 East Carolina University Method of inhibiting carcinogenesis by treatment with dehydroepiandrosterone and analogs thereof
US6093706A (en) 1992-03-04 2000-07-25 Bioresponse, L.L.C. Combined dehydroepiandrosterone and retinoid therapy for epithelial disorders
FR2697841B1 (fr) 1992-11-12 1995-01-13 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux dérivés du taxane, leur préparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
US5602184A (en) 1993-03-03 1997-02-11 The United States Of America As Represented By Department Of Health And Human Services Monoterpenes, sesquiterpenes and diterpenes as cancer therapy
HUT72307A (en) 1993-03-08 1996-04-29 Eisai Co Ltd Phosphonic acid derivatives
DE59406065D1 (de) 1993-03-24 1998-07-02 Ciba Geigy Ag Verfahren zur Herstellung einer Liposomendispersion im Hochdruckbereich
DE4327063A1 (de) 1993-08-12 1995-02-16 Kirsten Dr Westesen Ubidecarenon-Partikel mit modifizierten physikochemischen Eigenschaften
US7083572B2 (en) 1993-11-30 2006-08-01 Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. Therapeutic delivery systems
DE4410238A1 (de) 1994-03-25 1995-09-28 Beiersdorf Ag Hautpflegemittel
US20020049422A1 (en) * 1994-03-31 2002-04-25 Brewitt Barbara A. Homeopathic preparations
EP0796108A2 (en) 1994-12-06 1997-09-24 Ryan Pharmaceuticals, Inc. Water soluble ubiquinone compositions, prodrugs, and methods relating thereto
US6958150B2 (en) 1994-12-15 2005-10-25 Advance Biofactures Of Curacao, N.V. Reduction of adipose tissue
US6005086A (en) * 1995-01-13 1999-12-21 The Salk Institute For Biological Studies Farnesoid activated receptor polypeptides, and nucleic acid encoding the same
DE19537027A1 (de) 1995-10-05 1997-04-10 Beiersdorf Ag Hautpflegemittel für alte Haut
WO1997014740A1 (en) 1995-10-19 1997-04-24 Receptagen Corporation Discrete-length polyethylene glycols
US5944012A (en) 1996-03-25 1999-08-31 Pera; Ivo E. Method for dispensing antioxidant vitamins by inhalation background of the invention
DE19615577A1 (de) * 1996-04-19 1997-10-23 Beiersdorf Ag Verwendung von Salicin als antiirritativer Wirkstoff in kosmetischen und topischen dermatologischen Zubereitungen
US5891465A (en) * 1996-05-14 1999-04-06 Biozone Laboratories, Inc. Delivery of biologically active material in a liposomal formulation for administration into the mouth
GB9625895D0 (en) 1996-12-13 1997-01-29 Riley Patrick A Novel compound useful as therapeutic agents and assay reagents
ES2159938T3 (es) 1997-02-11 2001-10-16 Mse Pharmazeutika Gmbh Preparados transdermicos, orales e intravenosos de 2,3-dimetoxi-5-metil-6-decaprenil-1,4-benzoquinona.
US20040228910A1 (en) 1997-02-11 2004-11-18 Mse Pharmazeutika Gmbh Transdermal, oral and intravenous formulations of 2, 3-dimethoxy-5-methyl-6-decaprenyl-1, 4-benzoquinone
EP1007018B1 (de) * 1997-02-12 2003-10-08 MSE Pharmazeutika GmbH Verwendung von 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaprenyl-1,4-benzochinon inder behandlung von tinnitus
IT1291113B1 (it) 1997-03-20 1998-12-29 Sigma Tau Ind Farmaceuti Composizione nutritiva terapeutica per soggetti affetti da diabete mellito
US6599513B2 (en) 1997-05-27 2003-07-29 Sembiosys Genetics Inc. Products for topical applications comprising oil bodies
US6372234B1 (en) 1997-05-27 2002-04-16 Sembiosys Genetics Inc. Products for topical applications comprising oil bodies
WO1999011242A1 (en) 1997-09-04 1999-03-11 Biozone Laboratories, Inc. Oral liposomal delivery system
JP4738592B2 (ja) 1997-10-31 2011-08-03 アーチ・デヴェロップメント・コーポレイション ５α−還元酵素活性を調節するための方法及び組成物
US6696484B2 (en) * 1997-10-31 2004-02-24 University Of Chicago Office Of Technology And Intellectual Property Method and compositions for regulation of 5-alpha reductase activity
WO1999026657A1 (en) * 1997-11-25 1999-06-03 Musc Foundation For Research Development Inhibitors of nitric oxide synthase
US6372880B1 (en) * 1997-12-25 2002-04-16 Mitsui Chemicals, Inc. Copolymer and process for preparing the same
US6048846A (en) 1998-02-26 2000-04-11 Cochran; Timothy M. Compositions used in human treatment
JP2002510604A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 アビセナ グループ， インク． クレアチン化合物及び第二物質の組み合わせを含む組成
CA2736981A1 (en) 1998-04-14 1999-10-21 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Process for producing isoprenoid compounds by microorganisms
US6503523B2 (en) * 1998-05-07 2003-01-07 Gs Development A.B. Skin care agents containing combinations of active agents consisting of vitamin a derivatives and UBI- or plastoquinones
AU755993C (en) 1998-06-19 2003-10-30 Skyepharma Canada Inc. Processes to generate submicron particles of water-insoluble compounds
US6093743A (en) 1998-06-23 2000-07-25 Medinox Inc. Therapeutic methods employing disulfide derivatives of dithiocarbamates and compositions useful therefor
DE19828081C2 (de) 1998-06-24 2000-08-10 Cognis Deutschland Gmbh W/O-Emulsionsgrundlagen
AU4908699A (en) 1998-07-16 2000-02-07 Cognis Deutschland Gmbh Use of pit emulsions
DK1098641T3 (en) 1998-07-27 2016-08-15 St Jude Pharmaceuticals Inc Chemically induced intracellular hyperthermia
CA2339473A1 (en) 1998-08-04 2000-02-17 John V. Kosbab Nutrient and therapeutic compositions for the treatment of cancer
CA2345079C (en) * 1998-09-23 2011-06-21 Research Development Foundation Tocopherols, tocotrienols, other chroman and side chain derivatives and uses thereof
US6048886A (en) 1998-10-05 2000-04-11 Neigut; Stanley Compositions and delivery systems for the topical treatment of psoriasis and other conditions of the skin
IT1304406B1 (it) 1998-10-21 2001-03-19 Danital Italia S R L Preparazione per la veicolazione di principi attivi basata su acidigrassi polinsaturi del gruppo omega 3.
US20050123938A1 (en) * 1999-01-06 2005-06-09 Chondrogene Limited Method for the detection of osteoarthritis related gene transcripts in blood
US20050019268A1 (en) 1999-02-11 2005-01-27 Mse Pharmazeutika Gmbh Spray containing ubiquinone Qn
US20040034107A1 (en) 1999-02-11 2004-02-19 Mse Pharmazeutika Gmbh Ubiquinone Qn for the treatment of pain
US20030104048A1 (en) 1999-02-26 2003-06-05 Lipocine, Inc. Pharmaceutical dosage forms for highly hydrophilic materials
US6248363B1 (en) 1999-11-23 2001-06-19 Lipocine, Inc. Solid carriers for improved delivery of active ingredients in pharmaceutical compositions
US7374779B2 (en) 1999-02-26 2008-05-20 Lipocine, Inc. Pharmaceutical formulations and systems for improved absorption and multistage release of active agents
US6632443B2 (en) 2000-02-23 2003-10-14 National Research Council Of Canada Water-soluble compositions of bioactive lipophilic compounds
US6140067A (en) * 1999-04-30 2000-10-31 Mitokor Indicators of altered mitochondrial function in predictive methods for determining risk of type 2 diabetes mellitus
US6482943B1 (en) 1999-04-30 2002-11-19 Slil Biomedical Corporation Quinones as disease therapies
US6803193B1 (en) 1999-06-23 2004-10-12 The Penn State Research Foundation Methods to identify modulators of the mevalonate pathway in sterol synthesis
US6242491B1 (en) 1999-06-25 2001-06-05 Rima Kaddurah-Daouk Use of creatine or creatine compounds for skin preservation
US6960439B2 (en) 1999-06-28 2005-11-01 Source Precision Medicine, Inc. Identification, monitoring and treatment of disease and characterization of biological condition using gene expression profiles
DE59912559D1 (de) 1999-07-02 2005-10-20 Cognis Ip Man Gmbh Mikrokapseln - III
US20030104080A1 (en) 1999-09-07 2003-06-05 Singh Parashu Ram Topical urea composition
US6630160B1 (en) 1999-09-07 2003-10-07 Genetic Services Management, Inc. Process to modulate disease risk with doses of a nutraceutical
US7005274B1 (en) 1999-09-15 2006-02-28 Migenix Corp. Methods and compositions for diagnosing and treating arthritic disorders and regulating bone mass
CN1409637A (zh) 1999-10-14 2003-04-09 日清制油株式会社 皮肤美化剂、皮肤用抗老化剂、皮肤用增白剂和外用制剂
US7309688B2 (en) 2000-10-27 2007-12-18 Johnson & Johnson Consumer Companies Topical anti-cancer compositions and methods of use thereof
US20020049176A1 (en) * 1999-11-10 2002-04-25 Anderson Christen M. Modulation of mitochondrial mass and function for the treatment of diseases and for target and drug discovery
US20030180352A1 (en) 1999-11-23 2003-09-25 Patel Mahesh V. Solid carriers for improved delivery of active ingredients in pharmaceutical compositions
US7250174B2 (en) 1999-12-07 2007-07-31 Schott Ag Cosmetic, personal care, cleaning agent, and nutritional supplement compositions and methods of making and using same
US7083780B2 (en) 1999-12-11 2006-08-01 Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg Cosmetic composition containing hydroxyethers
WO2001045661A2 (de) 1999-12-20 2001-06-28 Cognis France, S.A. Kosmetische und/oder pharmazeutische zubereitungen
AUPQ515000A0 (en) 2000-01-19 2000-02-10 Grigg, Geoffrey Walter Treatment of uv induced immunosuppression
DE60124504T2 (de) 2000-02-04 2007-09-20 Takeda Pharmaceutical Co. Ltd. Stabile emulsionszubereitungen
AU782564B2 (en) 2000-02-09 2005-08-11 Paul A Sneed Treatment of fibromyalgia with Ubiquinone 10 and succinic acid
FR2804864B1 (fr) 2000-02-11 2003-04-04 Serobiologiques Lab Sa Extraits de residus issus de la fabrication du vin et leur utilisation en cosmetique ou pharmacologie
US20020044913A1 (en) * 2000-02-11 2002-04-18 Hamilton Nathan D. Cosmetics to support skin metabolism
DE10007322A1 (de) * 2000-02-17 2001-08-23 Cognis Deutschland Gmbh Perlglanzmittel
EP1127567B1 (de) 2000-02-17 2010-09-01 Basf Se Wässrige Dispersion wasserunlöslicher organischer UV-Filtersubstanzen
FR2805464B1 (fr) 2000-02-25 2003-02-14 Serobiologiques Lab Sa Preparations cosmetiques contenant des extraits de la plante mourera fluviatilis
DE10009996B4 (de) 2000-03-02 2005-10-13 Cognis Ip Management Gmbh Feststoffgranulate mit monodisperser Korngrößenverteilung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung
US6664287B2 (en) 2000-03-15 2003-12-16 Bethesda Pharmaceuticals, Inc. Antioxidants
US6866864B2 (en) 2000-03-20 2005-03-15 Ahmed Mousa Compositions and methods of use in the treatment of angiogenesis and vascular-related disorders
US6447760B2 (en) 2000-05-08 2002-09-10 Playtex Products, Inc. Sunless tanning compositions
WO2001085156A1 (fr) 2000-05-09 2001-11-15 Kaneka Corporation Compositions dermiques ayant la coenzyme q comme principe actif
US6468552B1 (en) 2000-06-02 2002-10-22 Neutrogena Corporation Stabilized compositions containing oxygen-labile active agents
SE0002189D0 (sv) * 2000-06-09 2000-06-09 Metcon Medicin Ab New method and assay
DE10031703A1 (de) * 2000-06-29 2002-01-10 Beiersdorf Ag Verwendung von Calcium freisetzenden oder bindenden Substanzen zur gezielten Schächung oder Stärkung der Barrierefunktion der Haut
EP1170015A1 (de) 2000-07-06 2002-01-09 Laboratoires Serobiologiques(Societe Anonyme) Verwendung von Extrakten des Pilzes Grifola frondosa
DE10033022A1 (de) * 2000-07-07 2002-01-17 Cognis Deutschland Gmbh Aerosole
US20030012825A1 (en) 2000-07-10 2003-01-16 Charles Kapper Metallized molecule therapies
US6465517B1 (en) 2000-07-11 2002-10-15 N.V. Nutricia Composition for the treatment of migraine
DE10034619A1 (de) * 2000-07-17 2002-01-31 Cognis Deutschland Gmbh Aniontensidfreie niedrigviskose Trübungsmittel
DE10036655A1 (de) 2000-07-26 2002-02-07 Basf Ag Kosmetische oder dermatologische Zubereitungen zur Vermeidung von Hautschädigungen durch Peroxide
DE10036799A1 (de) 2000-07-28 2002-02-07 Beiersdorf Ag Neues Mittel zur Behandlung der Haare und der Kopfhaut
US7198801B2 (en) 2000-08-03 2007-04-03 Antares Pharma Ipl Ag Formulations for transdermal or transmucosal application
US20020045230A1 (en) 2000-08-14 2002-04-18 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US6441050B1 (en) 2000-08-29 2002-08-27 Raj K. Chopra Palatable oral coenzyme Q liquid
FR2813195B1 (fr) 2000-08-29 2003-04-04 Serobiologiques Lab Sa Utilisation d'extraits de la plante cassia alata dans des produits de soin
DE10048260A1 (de) 2000-09-29 2002-04-11 Beiersdorf Ag Kosmetische oder dermatologische Zubereitungen mit einem Gehalt an Aminoguanidin und/oder dessen Derivaten und Strukturanaloga zur Hautaufhellung von Altersflecken und/oder zur Verhinderung der Hautbräunung, insbesondere der durch UV-Strahlung hervorgerufenen Hautbräunung
DE10053328A1 (de) * 2000-10-27 2002-05-08 Cognis Deutschland Gmbh Kosmetische Zubereitungen
US6689385B2 (en) 2000-11-03 2004-02-10 Chronorx Llc Formulations for the treatment of insulin resistance and type 2 diabetes mellitus
US6403116B1 (en) 2000-11-03 2002-06-11 Triarco Inductries, Inc. Coenzyme Q10 formulation
IT1317938B1 (it) 2000-11-17 2003-07-15 Sigma Tau Healthscience Spa Composizione per la prevenzione e/o il trattamento di alterazioni delmetabolismo lipidico, delle forme allergiche e per attivare le difese
US20070003536A1 (en) * 2000-11-21 2007-01-04 Zimmerman Amy C Topical skin compositions, their preparation, and their use
AUPR177300A0 (en) 2000-11-29 2000-12-21 Centre For Molecular Biology And Medicine Therapeutic methods
JP2004515508A (ja) 2000-12-16 2004-05-27 アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 化合物の健康促進組成物
DE10064818A1 (de) 2000-12-22 2002-06-27 Basf Ag Verwendung von Chroman-Derivaten in kosmetischen oder dermatologischen Zubreitungen
US6806069B2 (en) 2001-01-09 2004-10-19 Pharmachem Laboratories, Inc. Ubiquinone composition and methods related thereto
FR2819414A1 (fr) 2001-01-15 2002-07-19 Cognis France Sa Preparations cosmetiques et/ou pharmaceutiques comprenant des extraits de plantes dites a resurrection
WO2002056823A2 (en) 2001-01-18 2002-07-25 Arnold Hoffman Redox therapy for tumors
EP1353667A1 (en) 2001-01-25 2003-10-22 Bristol-Myers Squibb Company Parenteral formulations containing epothilone analogs
NL1017205C2 (nl) 2001-01-26 2002-07-29 Adriaan Emanuel Hendricus Wiel Medicinale en cosmetische toepassing van hop en co-enzym Q10.
ITRM20010044A1 (it) 2001-01-29 2002-07-29 Sigma Tau Healthscience Spa Integratore alimentare ad effetto dimagrante.
WO2002060484A1 (en) 2001-01-31 2002-08-08 Idec Pharmaceuticals Corporation Use of cd23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
ITMI20010204A1 (it) 2001-02-02 2002-08-02 Hunza Di Marazzita Maria Carme Specialita' terapeutiche dotate di attivita' antiossidante ed in grado di controllare l'eccesso del peso corporeo
FR2821624B1 (fr) 2001-03-01 2004-01-02 Sod Conseils Rech Applic Nouveau polynucleotide utilisable pour moduler la proliferation des cellules cancereuses
CA2439078C (en) 2001-03-09 2009-08-25 Societe Des Produits Nestle S.A. Composition improving age-related physiological deficits and increasing longevity
DE10113050A1 (de) 2001-03-15 2002-09-19 Beiersdorf Ag Selbstschäumende oder schaumförmige Zubereitungen organischen Hydrokolloiden
DE10113046A1 (de) 2001-03-15 2002-09-26 Beiersdorf Ag Selbstschäumende schaumförmige Zubereitungen mit organischen Hydrokolliden und partikulären hydrophobisierten und/oder ölabsorbierenden Festkörpersubstanzen
DE10113053A1 (de) 2001-03-15 2002-09-19 Beiersdorf Ag Selbstschäumende oder schaumförmige Zubereitungen mit anorganischen Gelbildnern und organischen Hydrololloiden
ATE327006T1 (de) 2001-03-23 2006-06-15 Oreal Hautbehandlungsmittel enthaltend fasern und ubichinone
US20030031688A1 (en) * 2001-04-02 2003-02-13 Dipak Ghosh Cosmetic composition with improved skin moisturizing properties
US6727234B2 (en) * 2001-04-03 2004-04-27 University Of Iowa Research Foundation Isoprenoid analog compounds and methods of making and use thereof
US6469061B1 (en) 2001-04-04 2002-10-22 Ramot University Authority For Applied Research And Industrial Development Limited Jasmonate pharmaceutical composition for treatment of cancer
DE10118269A1 (de) 2001-04-12 2002-10-17 Cognis Deutschland Gmbh Kosmetische Zubereitungen
US6686485B2 (en) * 2001-04-19 2004-02-03 Daniel David West Synthesis of coenzyme Q10, ubiquinone
WO2002085297A2 (en) 2001-04-24 2002-10-31 East Carolina University Compositions & formulations with a non-glucocorticoid steroid &/or a ubiquinone & kit for treatment of respiratory & lung disease
AU2002256359A1 (en) 2001-04-24 2002-11-05 Epigenesis Pharmaceuticals, Inc. Antisense and anti-inflammatory based compositions to treat respiratory disorders
US20040049022A1 (en) 2001-04-24 2004-03-11 Nyce Jonathan W. Composition & methods for treatment and screening
US6582723B2 (en) 2001-05-03 2003-06-24 Wayne F. Gorsek Cancer immune composition for prevention and treatment of individuals
JP3742602B2 (ja) 2001-05-09 2006-02-08 株式会社カネカ 還元型補酵素ｑの安定な溶液
JP4603192B2 (ja) 2001-05-10 2010-12-22 株式会社カネカ 毛髪頭皮用組成物
GB0111279D0 (en) 2001-05-10 2001-06-27 Nycomed Imaging As Radiolabelled liposomes
EP1388340B1 (en) 2001-05-10 2010-09-08 Kaneka Corporation Compositions for transmucosal administration containing coenzyme q as the active ingredient
DE10123771B4 (de) 2001-05-16 2019-01-10 Beiersdorf Ag Verwendung von Elektrolyten zur Stärkung der Barrierefunktion der Haut
EP1260212A1 (de) 2001-05-21 2002-11-27 Cognis France S.A. Kosmetische Mittel
US20050118151A1 (en) * 2001-05-29 2005-06-02 Syddansk Universitet Proteins in diabetes proteome anlysis
BR0209749A (pt) 2001-05-30 2004-07-27 Laxdale Ltd Coenzima q e epa ou outro ácido graxo essencial
US20030138792A1 (en) 2001-05-31 2003-07-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention and therapy of cervical cancer
US7091241B2 (en) 2001-06-01 2006-08-15 Summa Health System Nontoxic potentiation/sensitization of cancer therapy by supplementary treatment with combined vitamins C and K3
EP1262167A1 (de) 2001-06-01 2002-12-04 Cognis France S.A. Kosmetische Zubereitungen enthaltend ein Extrakt von keimenden Pflanzen
US6506915B1 (en) * 2001-06-14 2003-01-14 Daniel David West Synthesis of coenzyme Q10 ubiquinone
US6696060B2 (en) 2001-06-14 2004-02-24 Clearant, Inc. Methods for sterilizing preparations of monoclonal immunoglobulins
FR2826017B1 (fr) 2001-06-15 2004-06-11 Cognis France Sa Melanges de tensioactifs
SE0102380D0 (sv) 2001-07-02 2001-07-02 Macronova Ab Kräm för behandling av åldersförändringar i huden hos människa
DE10133198A1 (de) 2001-07-07 2003-01-23 Beiersdorf Ag Kreatin enthaltende kosmetische und dermatologische Zubereitungen zur Behandlung und aktiven Prävention trockener Haut und anderer negativer Veränderungen der physiologischen Homöostase der gesunden Haut
US20030207834A1 (en) 2001-07-10 2003-11-06 Dale Roderic M.K. Oligonucleotide-containing pharmacological compositions and their use
JP2003020495A (ja) 2001-07-10 2003-01-24 Cognis Japan Ltd 油脂組成物
CH695085A5 (de) 2001-07-13 2005-12-15 Mibelle Ag Cosmetics Formulierungen zur Pflege der Haut nach Laserbehandlungen und/oder chemischen Peelings und Verwendung der Formulierungen.
TWI235146B (en) * 2001-07-16 2005-07-01 Kaneka Corp Method of stabilizing reduced coenzyme q10 and method of acidic crystallization
JP2004535202A (ja) 2001-07-17 2004-11-25 リサーチ　ディベロップメント　ファンデーション アポトーシス促進性蛋白質を含む治療剤
FR2827603B1 (fr) 2001-07-18 2003-10-17 Oreal Composes derives de diaminopyrazole substitues par un radical heteroaromatique et leur utilisation en teinture d'oxydation des fibres keratiniques
US7758893B2 (en) 2001-07-27 2010-07-20 N.V. Nutricia Enteral compositions for the prevention and/or treatment of sepsis
EP1281392A1 (de) 2001-08-02 2003-02-05 Cognis France S.A. Kosmetische und/oder pharmaceutische Zubereitungen enthaltend Pflanzenextrakte
DE10139580A1 (de) 2001-08-10 2003-02-20 Beiersdorf Ag Kosmetische und dermatologische Zubereitungen in Form von O/W-Emulsionen mit einem Gehalt an Sterinen und/oder C12-C40-Fettsäuren
US6503506B1 (en) 2001-08-10 2003-01-07 Millenium Biotechnologies, Inc. Nutrient therapy for immuno-compromised patients
DE10143962A1 (de) 2001-09-07 2003-03-27 Basf Ag Kosmetische und dermatologische Zubereitungen in Form von O/W-Emulsionen, enthaltend ein aminosubstituiertes Hydroxybenzophenon
DE10143964A1 (de) 2001-09-07 2003-03-27 Basf Ag Emulgatorarme oder emulgatorfreie Systeme vom Typ Öl-in-Wasser mit einem Gehalt an Stabilisatoren und einem aminosubstituierten Hydroxybenzophenon
DE10143963A1 (de) 2001-09-07 2003-03-27 Basf Ag Kosmetische und dermatologische Zubereitungen in Form von W/O-Emulsionen, enthaltend ein aminosubstituiertes Hydroxybenzophenon
AU2002339555B2 (en) * 2001-09-18 2007-03-01 Ciba Specialty Chemicals Holding Inc. Use of guaiol for treating the skin
DE10150725A1 (de) * 2001-10-13 2003-04-17 Cognis Deutschland Gmbh Aniontensidfreie niedrigviskose Trübungsmittel
WO2003033662A2 (en) 2001-10-16 2003-04-24 Atherogenics, Inc. Protection against oxidative stress and inflammation by a cytoprotective response element
US7560123B2 (en) 2004-08-12 2009-07-14 Everett Laboratories, Inc. Compositions and methods for nutrition supplementation
US6723527B2 (en) 2001-10-26 2004-04-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for determining toxicity reversing agents
ES2261760T3 (es) * 2001-10-26 2006-11-16 Cognis Ip Management Gmbh Solucion impregnante para toallitas cosmeticas.
WO2003040108A1 (en) 2001-11-03 2003-05-15 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives as antitumor agents
US20030105027A1 (en) 2001-11-06 2003-06-05 Rosenbloom Richard A. Nutritional supplements and methods for prevention, reduction and treatment of radiation injury
US7435725B2 (en) 2001-11-06 2008-10-14 The Quigly Corporation Oral compositions and methods for prevention, reduction and treatment of radiation injury
US20030118536A1 (en) 2001-11-06 2003-06-26 Rosenbloom Richard A. Topical compositions and methods for treatment of adverse effects of ionizing radiation
US6753325B2 (en) 2001-11-06 2004-06-22 The Quigley Corporation Composition and method for prevention, reduction and treatment of radiation dermatitis
US20030105031A1 (en) 2001-11-06 2003-06-05 Rosenbloom Richard A. Methods for the treatment of skin disorders
KR20040068545A (ko) * 2001-11-09 2004-07-31 메드스타 리서치 인스티튜트 심혈관 위험을 추정하는 생리학적 마커의 사용 방법
DE10155769A1 (de) 2001-11-14 2003-05-22 Cognis Deutschland Gmbh Kosmetische und/oder pharmazeutische Emulsionen
DE10160682A1 (de) * 2001-12-11 2003-06-18 Cognis Deutschland Gmbh Emollients und kosmetische Zusammensetzungen
US6652891B2 (en) 2001-12-12 2003-11-25 Herbasway Laboratories, Llc Co-enzyme Q10 dietary supplement
DE10162026A1 (de) 2001-12-18 2003-07-03 Cognis Deutschland Gmbh Hochkonzentriert fließfähige Perlglanzkonzentrate
DE10162351A1 (de) * 2001-12-18 2003-07-03 Cognis Deutschland Gmbh Kosmetische und/oder pharmazeutische Emulsionen
ITRM20010755A1 (it) 2001-12-20 2003-06-20 Simonelli Giuseppe Uso del chinone q10 per il trattamento delle malattie oculari.
TWI305547B (en) 2001-12-27 2009-01-21 Kaneka Corp Processes for producing coenzyme q10
US20030129253A1 (en) 2002-01-03 2003-07-10 Milley Christopher J. Stable aqueous suspension
CA2471712A1 (en) 2002-01-18 2003-07-24 Basf Aktiengesellschaft Cosmetic or dermatological preparations for preventing damages to skin caused by peroxides
TW200302056A (en) 2002-01-18 2003-08-01 Kaneka Corp Method for stabilizing reduced coenzyme Q10 and composition therefor
KR100966482B1 (ko) * 2002-01-31 2010-06-30 시바 홀딩 인크 미세안료 혼합물
CA2473228C (en) 2002-02-12 2010-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Sunscreen compositions as well as dihydropyridines and dihydropyranes
WO2003068008A1 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Dsm Ip Assets B.V. Water-dispersible coenzyme q10 dry powders
EP1340486A1 (de) 2002-03-01 2003-09-03 Cognis France S.A. Verwendung von Zuckerestern
US20030167556A1 (en) 2002-03-05 2003-09-11 Consumers Choice Systems, Inc. Methods and devices for transdermal delivery of anti-aging compounds for treatment and prevention of facial or neck skin aging
DE10254315A1 (de) 2002-03-15 2003-10-02 Cognis Deutschland Gmbh Emollients und kosmetische Zubereitungen
WO2003078456A2 (en) 2002-03-20 2003-09-25 Syddansk Universitet Human diabetes-mediating proteins
TW200304372A (en) 2002-03-20 2003-10-01 Kanegafuchi Chemical Ind Compositions for diabetes
DE10212528A1 (de) 2002-03-21 2003-10-02 Cognis Deutschland Gmbh Ölphasen für kosmetische Mittel
US7811594B2 (en) 2002-03-28 2010-10-12 Beiersdorf Ag Crosslinked oil droplet-based cosmetic or pharmaceutical emulsions
DE10213957A1 (de) * 2002-03-28 2003-10-09 Beiersdorf Ag Vernetzte kosmetische oder pharmazeutische phospholipidhaltige Gele und Emulsionen auf der Basis von ethylenoxidhaltigen oder propylenoxidhaltigen Emulgatoren
US20040101874A1 (en) 2002-04-12 2004-05-27 Mitokor Inc. Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome
DE10217474A1 (de) 2002-04-19 2003-11-06 Cognis Deutschland Gmbh Sonnenschutzemulsion mit Schaumspender
US20060193905A1 (en) 2002-05-14 2006-08-31 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Direct cellular energy delivery system
EP1509209A1 (en) 2002-05-23 2005-03-02 UMD, Inc. Compositions and method for transmucosal drug delivery and cryoprotection
DE10223486A1 (de) 2002-05-27 2003-12-11 Beiersdorf Ag Kosmetische und/oder dermatologische Zubereitung mit 2,3-Dibenzylbutyrolactonen
ATE334654T1 (de) 2002-06-03 2006-08-15 Ciba Sc Holding Ag Vor uv-strahlen schützende zusammensetzungen
DE10226018A1 (de) * 2002-06-12 2003-12-24 Cognis Deutschland Gmbh Zubereitungen mit konjugiertem Linolalkohol
US7182950B2 (en) 2002-06-12 2007-02-27 Nutralease Ltd. Nano-sized self-assembled liquid dilutable vehicles
US7147841B2 (en) 2002-06-17 2006-12-12 Ciba Specialty Chemicals Corporation Formulation of UV absorbers by incorporation in solid lipid nanoparticles
AU2003246592A1 (en) 2002-06-26 2004-01-19 Europroteome Ag Tumour marker and the use thereof for the diagnosis and treatment of tumour diseases
US7060733B2 (en) 2002-08-15 2006-06-13 The Regents Of The University Of California Methods for treating pancreatitis with curcumin compounds and inhibitors of reactive oxygen species
US20060205771A1 (en) 2002-09-25 2006-09-14 Mark Noble Caspase inhibitors as anticancer agents
US6953786B2 (en) 2002-10-01 2005-10-11 The Regents Of The University Of California Compositions comprising plant-derived polyphenolic compounds and inhibitors of reactive oxygen species and methods of using thereof
FR2845602B1 (fr) 2002-10-11 2005-07-08 Servier Lab Association entre un ligand des recepteurs actives par les proliferateurs de peroxisomes et un agent antioxydant et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US7083813B2 (en) 2002-11-06 2006-08-01 The Quigley Corporation Methods for the treatment of peripheral neural and vascular ailments
EP1421929A3 (de) 2002-11-21 2004-11-24 Cognis Deutschland GmbH & Co. KG Emollients und kosmetische Zubereitungen
DE10256881A1 (de) 2002-12-05 2004-06-24 Beiersdorf Ag Neue topische Verwendung von Bis-Arylimidazo[1,2-a]thiolanderivaten
US20040110848A1 (en) 2002-12-10 2004-06-10 Peffley Dennis M Method and kit for treating cancer
WO2004055181A1 (en) 2002-12-16 2004-07-01 Garvan Institute Of Medical Research Methods of treatment of feeding disorders or disorders of glucose uptake and for modifying metabolism and identifying therapeutic reagents therefor
CA2511501A1 (en) 2002-12-24 2004-07-15 Biosite Incorporated Markers for differential diagnosis and methods of use thereof
EP1581307B1 (en) 2003-01-02 2014-09-24 Gerard M. Housey Irs modulators
US20090036516A1 (en) 2003-01-13 2009-02-05 Ctg Pharma S.R.L. Compounds for treating metabolic syndrome
EP1585493B1 (en) 2003-01-20 2010-09-01 Basf Se Triazine derivatives as uv absorbers
US20060073106A1 (en) 2003-02-03 2006-04-06 Dsm Ip Assets B.V. Novel stabilized cinnamic ester sunscreen compositions
US7258876B2 (en) 2003-02-05 2007-08-21 Craig Bozzacco Topical composition for treating infectious conditions of skin and mucosa
CN1208052C (zh) 2003-03-20 2005-06-29 上海家化联合股份有限公司 一种辅酶q10前体脂质体及其制备方法
WO2004085412A2 (en) 2003-03-24 2004-10-07 Ciba Specialty Chemicals Holding Inc. Symmetrical triazine derivatives
CA2521149C (en) 2003-04-08 2014-03-25 Barrie Tan Annatto extract compositions, including geranyl geraniols and methods of use
US20050037102A1 (en) 2003-07-18 2005-02-17 Barrie Tan Annatto extract compositions including tocotrienols and tocopherols and methods of use
JP2004321171A (ja) 2003-04-11 2004-11-18 Fancl Corp 飲食品
EP1473043A1 (en) 2003-04-29 2004-11-03 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG Pharmaceutical combination for the treatment of diseases involving cell proliferation, migration or apotosis of myeloma cells, or angiogenesis
JP2004345988A (ja) * 2003-05-21 2004-12-09 Eisai Co Ltd リボフラビン系化合物を含む医薬組成物
US7438903B2 (en) 2003-06-06 2008-10-21 Nbty, Inc. Methods and compositions that enhance bioavailability of coenzyme-Q10
US20040253323A1 (en) 2003-06-11 2004-12-16 Giles Brian C. Ionic cancer therapy and methods for using same in the treatment of tumors and metastasis
AU2004251774A1 (en) 2003-06-25 2005-01-06 Charles Erwin Chemical combination and method for increasing delivery of coenzyme Q 10
US20050026848A1 (en) 2003-07-31 2005-02-03 Robinson Cynthia B. Combination of dehydroepiandrosterone or dehydroepiandrosterone-sulfate with a methylxanthine derivative for treatment of asthma or chronic obstructive pulmonary disease
US20050026879A1 (en) 2003-07-31 2005-02-03 Robinson Cynthia B. Combination of dehydroepiandrosterone or dehydroepiandrosterone-sulfate with a tyrosine kinase inhibitor, delta opioid receptor antagonist, neurokinin receptor antagonist, or VCAM inhibitor for treatment of asthma or chronic obstructive pulmonary disease
US20070248693A1 (en) 2003-08-02 2007-10-25 Elizabeth Mazzio Nutraceutical composition and method of use for treatment / prevention of cancer
US8802161B2 (en) 2003-08-02 2014-08-12 Florida Agricultural And Mechanical University Herbal composition and method of use for the treatment of cancer
US20060035981A1 (en) 2003-08-02 2006-02-16 Mazzio Elizabeth A Inhibition of anaerobic glucose metabolism and corresponding composition as a natural non-toxic approach to cancer treatment
US20080069779A1 (en) 2003-08-04 2008-03-20 Foamix Ltd. Foamable vehicle and vitamin and flavonoid pharmaceutical compositions thereof
US20050036976A1 (en) * 2003-08-12 2005-02-17 Joel Rubin Topical skin care composition
WO2005020940A1 (de) 2003-08-27 2005-03-10 Beiersdorf Ag Kapsel deren kapselhülle bei topischer anwendung nicht mehr gesondert warhnembar ist
WO2005032278A1 (en) 2003-09-29 2005-04-14 Soft Gel Technologies, Inc. SOLUBILIZED CoQ-10
US7169385B2 (en) 2003-09-29 2007-01-30 Ronald G. Udell Solubilized CoQ-10 and carnitine
US8124072B2 (en) 2003-09-29 2012-02-28 Soft Gel Technologies, Inc. Solubilized CoQ-10
WO2005030169A1 (en) 2003-10-02 2005-04-07 Sembiosys Genetics Inc. Methods for preparing oil bodies comprising active ingredients
DE10347218A1 (de) 2003-10-10 2005-05-12 Cognis Deutschland Gmbh Sonnenschutzmittel
CN1897950A (zh) 2003-10-14 2007-01-17 惠氏公司 稠合芳基和杂芳基衍生物及其使用方法
DE10347940A1 (de) 2003-10-15 2005-05-19 Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg Selbstemulgierende Zubereitungen
JP4732898B2 (ja) 2003-10-31 2011-07-27 株式会社カネカ 還元型補酵素ｑ含有組成物
KR101008741B1 (ko) 2003-11-05 2011-01-14 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 폴리실록세인계 자외선 여과기를 함유하는 자외선 여과기의총량이 감소된 광보호 조성물
US20050100537A1 (en) 2003-11-10 2005-05-12 Evans Gregory S. Methods and kits for reducing cellular damage, inhibiting free radical production, and scavenging free radicals in mammals
WO2005048925A2 (en) 2003-11-14 2005-06-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for treating a neoplastic disease in a subject using inorganic selenium-containing compounds
DE20320413U1 (de) 2003-11-17 2004-08-26 Beiersdorf Ag Kosmetikum mit empfindlichen Inhaltsstoffen
US20050118235A1 (en) 2003-12-02 2005-06-02 Shiguang Yu Dietary non-essential amino acid tyrosine regulates the body weight of animals through regulating the animal appetite or food intake
PL380446A1 (pl) 2003-12-18 2007-02-05 Nestec S.A. Kompozycja zawierająca flawanony do polepszania stanu zdrowia skóry, włosów lub sierści i futra
JP4742526B2 (ja) * 2003-12-26 2011-08-10 シンフォニアテクノロジー株式会社 Ｉｃチップ実装体の製造方法及び製造装置
US20050226947A1 (en) 2004-02-04 2005-10-13 Dale Kern Agents for sequestering serum aging factors and uses therefore
US20070149618A1 (en) 2004-02-17 2007-06-28 Action Medicines, S.L. Methods of use for 2,5-dihydroxybenzene sulfonic acid compounds for the treatment of cancer, rosacea and psoriasis
JP2007523156A (ja) * 2004-02-19 2007-08-16 ケマファー インコーポレイティッド 皮膚状態の処置用の局所製剤
US7780873B2 (en) 2004-02-23 2010-08-24 Texas A&M University System Bioactive complexes compositions and methods of use thereof
US7118688B2 (en) 2004-02-23 2006-10-10 The Texas A&M University System Antioxidant compositions and methods of use thereof
US20050202521A1 (en) 2004-03-10 2005-09-15 Albert Crum Methods of assessing the need for and the effectiveness of therapy with antioxidants
DE102004014615A1 (de) 2004-03-23 2005-10-13 Beiersdorf Ag Taurinhaltige Zubereitungen zur Verbesserung der Hautbarriere
AU2005236840B9 (en) * 2004-04-06 2009-12-10 Basf Aktiengesellschaft Cosmetic formulations comprising ZnO nanoparticles
US20050226858A1 (en) 2004-04-09 2005-10-13 Kaneka Corporation Compositions containing reduced coenzyme Q10 and carotenoid
US7723569B2 (en) 2004-04-30 2010-05-25 National Institute Of Agrobiological Sciences Method for producing ubiquinone-10 in plant
US7351739B2 (en) 2004-04-30 2008-04-01 Wellgen, Inc. Bioactive compounds and methods of uses thereof
IL161899A0 (en) 2004-05-10 2005-11-20 Hoffman Arnold Kit for treatment of cancer
JP2005323573A (ja) 2004-05-17 2005-11-24 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 遺伝子発現データ解析方法および、疾患マーカー遺伝子の選抜法とその利用
RU2375053C2 (ru) 2004-05-18 2009-12-10 Кемийски Инштитут Новая водорастворимая форма коэнзима q10 в форме комплекса включения с бета-циклодекстрином, способ ее получения и ее применение
WO2005115306A2 (de) * 2004-05-24 2005-12-08 Basf Aktiengesellschaft Keratin-bindende polypeptide
KR20050112942A (ko) 2004-05-28 2005-12-01 주식회사 뉴트렉스테크놀러지 비만 억제용 조성물
US20050288333A1 (en) 2004-06-08 2005-12-29 Kem William R Controlling angiogenesis with anabaseine analogs
WO2006009825A1 (en) 2004-06-17 2006-01-26 Virun, Inc. Compositions comprising a mucoadhesive protein and an active principle for mucosal delivery of said agents
JP4927718B2 (ja) 2004-06-18 2012-05-09 シムライズ・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング・ウント・コンパニー・コマンジツト・ゲゼルシヤフト ブラックベリー抽出物
KR20070032795A (ko) 2004-06-21 2007-03-22 허치슨 메디파르마 엔터프라이즈 리미티드 항암 화학요법
ATE551048T1 (de) 2004-06-28 2012-04-15 Dsm Ip Assets Bv Proteinhydrolysate enthaltende kosmetische zusammensetzungen
WO2006005759A2 (en) 2004-07-13 2006-01-19 Oridis Biomed Forschungs- Und Entwicklungs Gmbh Mitochondrially targeted antioxidants in the treatment of liver diseases and epithelial cancers
US20060069068A1 (en) 2004-07-15 2006-03-30 Nanobac Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of diseases characterized by pathological calcification
US20080057116A1 (en) 2004-07-28 2008-03-06 Pleva Raymond M Emu Oil and Fruit Composition
JP2006070016A (ja) 2004-08-02 2006-03-16 Kaneka Corp 還元型補酵素ｑを含有する美白用組成物
WO2006017494A2 (en) 2004-08-02 2006-02-16 Elizabeth Mazzio Inhibition of anaerobic glucose metabolism
ZA200702216B (en) 2004-08-18 2008-11-26 Ace Aps Cosmetic and pharmaceutical compositions comprising ACE inhibitors and/or angiotensin II receptor antagonists
US20060041017A1 (en) 2004-08-20 2006-02-23 Chopra Raj K Synergistic conjugated linoleic acid (CLA) and carnitine combination
US20060051462A1 (en) * 2004-09-03 2006-03-09 Wang Jimmy X Self emulsifying compositions for delivering lipophilic coenzyme Q10 and other dietary ingredients
US7288263B2 (en) 2004-09-13 2007-10-30 Evera Laboratories, Llc Compositions and methods for treatment of skin discoloration
CN101102768A (zh) 2004-09-17 2008-01-09 中国医学科学院医药生物技术研究所 治疗高脂血症的方法和组合物
US20060062755A1 (en) 2004-09-21 2006-03-23 Woodward John R Method of cancer screening; method of cancer treatment; and method of diabetes treatment
JP5093998B2 (ja) 2004-09-22 2012-12-12 大塚製薬株式会社 色素沈着予防又は改善剤
DE102004046235A1 (de) 2004-09-22 2006-03-30 Altana Pharma Ag Arzneimittelzubereitung
WO2006035417A2 (en) 2004-09-27 2006-04-06 Sigmoid Biotechnologies Limited Dihydropyrimidine microcapsule - formulations
WO2006044738A2 (en) 2004-10-18 2006-04-27 Maroon Biotech Corporation Methods and compositions for treatment of free radical injury
US20060120997A1 (en) 2004-10-29 2006-06-08 Biomune, Inc. Cancer therapeutic compositions
AU2005300835B2 (en) 2004-11-02 2011-01-20 Dsm Ip Assets B.V. Additive for UV-sunscreen preparations
US8349359B2 (en) 2004-11-07 2013-01-08 Your Energy Systems, LLC Liposomal formulation for oral administration of glutathione (reduced)
GB0424891D0 (en) 2004-11-11 2004-12-15 Boots Co Plc Topical compositions
JP2008520563A (ja) 2004-11-16 2008-06-19 バイオアバイラビリティ，インク． 栄養学的に使用するための高濃度自己マイクロエマルジョン化コエンザイムｑ１０調製物
US20060110415A1 (en) 2004-11-22 2006-05-25 Bioderm Research Topical Delivery System for Cosmetic and Pharmaceutical Agents
US20060127384A1 (en) 2004-12-09 2006-06-15 Sergio Capaccioli Coenzyme Q10 as antiapoptotic agent
US7862995B2 (en) 2004-12-10 2011-01-04 Targeted Molecular Diagnostics Methods and materials for predicting responsiveness to treatment with dual tyrosine kinase inhibitor
CA2589135A1 (en) 2004-12-14 2006-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Cd99 as target/marker for insulin resistance
WO2006063402A1 (en) 2004-12-16 2006-06-22 Melvin Mackenzie Stewart Therapeutic compositions based on extracts of plants from the genus plumeria (frangipani)
NO20045674D0 (no) 2004-12-28 2004-12-28 Uni I Oslo Thin films prepared with gas phase deposition technique
US20060286046A1 (en) 2005-01-05 2006-12-21 Haber C Andrew Skin care compositions
US20060188492A1 (en) 2005-01-13 2006-08-24 Chronorx Llc, An Alaska Limited Liability Company Topical management of ocular and periocular conditions
DE102005007980A1 (de) 2005-02-22 2006-02-23 Clariant Gmbh Kosmetische, pharmazeutische oder dermatologische Zubereitungen enthaltend Copolymerwachse
WO2006103750A1 (ja) 2005-03-29 2006-10-05 Nippon Meat Packers, Inc. 肥満改善用組成物、機能性食品及び医薬用組成物
US20060251690A1 (en) 2005-04-01 2006-11-09 Zymes, Llc Skin enrichment using CoQ10 as the delivery system
CN1853507A (zh) * 2005-04-28 2006-11-01 尚宝虎 一种没有副作用的可用于饮料和固体口服制剂或食品添加的减肥新组方
JP2007001922A (ja) 2005-06-23 2007-01-11 Asahi Kasei Pharma Kk 透析患者における腎疾患改善剤、又は機能性食品
WO2007013556A1 (ja) 2005-07-28 2007-02-01 Kaneka Corporation 癌予防用組成物
JP5426165B2 (ja) 2005-07-28 2014-02-26 アイエスピー インヴェストメンツ インコーポレイテッド 優れた生物学的利用能のベンゾキノン類
US20070053985A1 (en) * 2005-08-24 2007-03-08 Kaneka Corporation Coenzyme Q10-containing fine particle with excellent dispersibility
CN1928556A (zh) 2005-09-05 2007-03-14 中国医学科学院基础医学研究所 中国人2型糖尿病血清标志物的检测试剂盒
US20070071779A1 (en) * 2005-09-26 2007-03-29 Leggit Ingenuity, Llc Compositions for delivering lipophilic agents to the intestinal mucosa and method of making thereof
EP1876448A1 (en) 2005-09-30 2008-01-09 DIGILAB BioVisioN GmbH Method and analytical reagents for identifying therapeutics using biomarkers responsive to thiazolidinediones.
US20070092469A1 (en) * 2005-10-26 2007-04-26 Eric Jacobs Topically applied Glucosamine Sulfate and all its related, precursor, and derivative compounds significantly increases the skin's natural produciton of hyaluronic acid for the rejuvenation of healthier younger-looking skin; while PhosphatidylCholine is required to replace its deficiency caused by topical Dimethylaminoethanol (DMAE)
US8506956B2 (en) 2005-10-31 2013-08-13 Kaneka Corporation Method for stabilizing reduced coenzyme Q10
US9265792B2 (en) * 2005-11-16 2016-02-23 Patricia A. Riley Integument cell regeneration formulation
EP1960551A2 (en) 2005-12-01 2008-08-27 Medical Prognosis Institute Methods and devices for identifying biomarkers of treatment response and use thereof to predict treatment efficacy
US20070248590A1 (en) 2005-12-02 2007-10-25 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Modulators of CDC2-like kinases (CLKS) and methods of use thereof
JP2007176804A (ja) * 2005-12-27 2007-07-12 Ｚｍｃ−Ｋｏｕｇｅｎ株式会社 痩身作用を有する医薬又は健康食品
US20070172436A1 (en) 2006-01-23 2007-07-26 Jerry Zhang Nonaqueous ascorbic acid compositions and methods for preparing same
US20070184076A1 (en) 2006-02-07 2007-08-09 Unger Evan C Liquid-filled nanodroplets for anti-cancer therapy
US20070184041A1 (en) 2006-02-09 2007-08-09 Burja Adam M Methods and compositions related to production of coenzyme q10
EP1991701A4 (en) 2006-02-14 2010-03-17 Dana Farber Cancer Inst Inc COMPOSITIONS, KITS, AND METHODS FOR IDENTIFYING, EVALUATING, PREVENTING, AND TREATING CANCER
US8067152B2 (en) 2006-02-27 2011-11-29 The Fred Hutchinson Cancer Research Center Liver cancer biomarkers
US20070203091A1 (en) 2006-02-28 2007-08-30 Eliezer Rapaport Methods and therapeutic compositions for improving liver, blood flow and skeletal muscle functions in advanced diseases and aging
KR101433962B1 (ko) 2006-03-10 2014-08-25 라보스위스 아게 물질의 용해, 분산 및 안정을 위한 방법, 상기 방법에 따라제조된 제품 및 상기 제품의 이용
US7335384B2 (en) 2006-03-17 2008-02-26 4K Nutripharma International Nutrient compositions for the treatment and prevention of inflammation and disorders associated therewith
US8030013B2 (en) * 2006-04-14 2011-10-04 Mount Sinai School Of Medicine Methods and compositions for the diagnosis for early hepatocellular carcinoma
TW200810776A (en) 2006-04-28 2008-03-01 Kaneka Corp Purification method of reduced coenzyme Q10
TW200808344A (en) 2006-04-28 2008-02-16 Kaneka Corp Stabilization method of reduced coenzyme Q10
US8021659B2 (en) 2006-04-28 2011-09-20 Naidu Lp Coenzyme Q10, lactoferrin and angiogenin compositions and uses thereof
MX2008013855A (es) 2006-05-02 2009-01-29 Univ Miami Formulaciones de co-enzima topica q10 y tratamiento de dolor, fatiga y heridas.
WO2007142347A1 (ja) 2006-06-05 2007-12-13 Shimadzu Corporation 腫瘍マーカー及び癌疾病の罹患の識別方法
US20080020022A1 (en) * 2006-06-05 2008-01-24 Udell Ronald G Chewable co-enzyme q-10 capsule
US20080014187A1 (en) 2006-07-15 2008-01-17 Bryant Villeponteau Compositions and Methods for Treating Hypertension and Inflammation
US8894993B2 (en) 2006-08-04 2014-11-25 Natreon Inc. Mitochondria-targeted antioxidants
US7645616B2 (en) 2006-10-20 2010-01-12 The University Of Hong Kong Use of lipocalin-2 as a diagnostic marker and therapeutic target
US20080138326A1 (en) 2006-12-06 2008-06-12 Kaneka Corporation Method for cancer treatment, carcinogenesis suppression or mitigation of adverse reactions of anticancer agents
BRPI0809164B8 (pt) * 2007-03-22 2023-02-28 Berg Llc Composição para administração tópica e composição farmacêutica compreendendo a referida composição
US20090143279A1 (en) 2007-06-15 2009-06-04 Vamsi Krishna Mootha Methods and compositions for treating metabolic disorders
US20090005398A1 (en) 2007-06-27 2009-01-01 Mohammed Dar Methods For The Treatment of Central Nervous System Tumors
US7989007B2 (en) 2007-07-03 2011-08-02 Vincent James Enterprises, Llc Weight loss composition
KR100849537B1 (ko) 2007-07-04 2008-07-31 유효경 코엔자임 큐텐의 나노에멀젼 조성물
EP2164977B1 (en) 2007-07-17 2013-10-30 Metabolon, Inc. Biomarkers for pre-diabetes and methods using the same
CN101091890A (zh) 2007-07-26 2007-12-26 沈阳药科大学 一种复合型乳化剂及用其制备的乳剂及其制备方法
WO2009026163A1 (en) 2007-08-17 2009-02-26 Burnham Institute For Medical Research Compositions and methods for inhibiting growth and metastasis of melanoma
RU2345367C1 (ru) 2007-08-22 2009-01-27 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО НГМУ Росздрава) Способ прогнозирования тяжести течения и эффективности лечения лимфом
JP2009050168A (ja) * 2007-08-23 2009-03-12 Tsujido Kagaku Kk 食品組成物
CN101878229A (zh) 2007-09-28 2010-11-03 巴塞尔大学医院 用于治疗癌症的免疫脂质体
JP2009096757A (ja) * 2007-10-17 2009-05-07 Tsujido Kagaku Kk 脂肪代謝抑制剤
EP2227085A4 (en) * 2007-12-06 2013-10-09 Berg Pharma Llc INGREDIBLE COMPOSITIONS WITH INCREASED BIOLOGICAL AVAILABILITY
WO2009126764A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Cytotech Labs, Llc Methods and use of inducing apoptosis in cancer cells
JP5945096B2 (ja) 2008-07-04 2016-07-05 小野薬品工業株式会社 抗ヒトｐｄ−１抗体の癌に対する治療効果を最適化するための判定マーカーの使用
CA2743255C (en) 2008-12-03 2014-02-18 Andrew Pecora Infarct area perfusion-improving compositions and methods of vascular injury repair
DE102008060773A1 (de) 2008-12-05 2010-06-10 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Verschluss für einen Behälter
US8247435B2 (en) 2009-02-19 2012-08-21 Thornthwaite Jerry T Formulations for treating human and animal diseases
WO2010132502A2 (en) 2009-05-11 2010-11-18 Cytotech Labs, Llc Methods for treatment of metabolic disorders using epimetabolic shifters, multidimensional intracellular molecules, or environmental influencers
EP2470169A4 (en) * 2009-08-25 2013-03-13 Berg Pharma Llc METHOD OF TREATING A SARCOME USING AN EPIMETABLIC SHIFTER (COENZYM Q10)
US8506954B2 (en) 2009-12-01 2013-08-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Tumor vaccination in combination with hematopoietic cell transplantation for cancer therapy
WO2011112900A2 (en) 2010-03-12 2011-09-15 Cytotech Labs, Llc Intravenous formulations of coenzyme q10 (coq10) and methods of use thereof
KR20220000943A (ko) 2010-07-19 2022-01-04 바이오젠 체사피크 엘엘씨 글리부리드 및 다른 약물의 정맥내 투여를 위한 방법
US9125835B2 (en) 2010-11-12 2015-09-08 Rutgers, The State University Of New Jersey Synergistic combinations to reduce particle dose for targeted treatment of cancer and its metastases
AU2012240222B2 (en) 2011-04-04 2017-04-27 Berg Llc Methods of treating central nervous system tumors
KR20200118233A (ko) 2012-06-01 2020-10-14 버그 엘엘씨 조효소 q10을 이용한 고형 종양의 치료
US10933032B2 (en) 2013-04-08 2021-03-02 Berg Llc Methods for the treatment of cancer using coenzyme Q10 combination therapies
EP3730131A1 (en) 2013-09-04 2020-10-28 Berg LLC Methods of treatment of cancer by continuous infusion of coenzyme q10
JP6398212B2 (ja) 2014-02-12 2018-10-03 株式会社Ihi 軸受構造、および、過給機
EP3200811A4 (en) 2014-10-03 2018-05-02 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Use of annexin v as a method to block tumor induced immunosuppression of the innate immune response
KR20170072928A (ko) 2014-10-24 2017-06-27 아스트라제네카 아베 조합물
US9827308B2 (en) 2014-12-10 2017-11-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Mini-intronic plasmid DNA vaccines in combination with LAG3 blockade
US20170189350A1 (en) 2015-11-16 2017-07-06 Berg Llc Methods of treatment of temozolomide-resistant glioma using coenzyme q10
US20180021270A1 (en) 2016-07-21 2018-01-25 Berg Llc Methods for the treatment of cancer using coenzyme q10 in combination with immune checkpoint modulators

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1953743A (zh) * 2004-01-22 2007-04-25 迈阿密大学 局部辅酶q10制剂及其使用方法
CN101015524A (zh) * 2007-02-15 2007-08-15 沈阳药科大学 辅酶q10口服乳剂及其制备方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105338973A (zh) * 2013-04-08 2016-02-17 博格有限责任公司 使用辅酶q10联合疗法治疗癌症
CN113797343A (zh) * 2013-04-08 2021-12-17 博格有限责任公司 使用辅酶q10联合疗法治疗癌症
CN103585619A (zh) * 2013-10-31 2014-02-19 浙江大学 Dj-1蛋白在制备骨肉瘤诊断和治疗产品中的应用
CN112924681A (zh) * 2019-12-05 2021-06-08 张曼 尿液krt10蛋白及其多肽片段在正常妊娠中的应用
CN112924681B (zh) * 2019-12-05 2023-01-17 张曼 尿液krt10蛋白及其多肽片段在正常妊娠中的应用

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AU2010247800A1 (en) 2011-12-15
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BRPI1010576A2 (pt) 2016-03-15
KR101829201B1 (ko) 2018-02-19
EP2429512A2 (en) 2012-03-21
EP2429511A2 (en) 2012-03-21
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US20150023940A1 (en) 2015-01-22
IL216299A0 (en) 2012-01-31
EA201101523A1 (ru) 2012-10-30
EP2429511A4 (en) 2013-08-28
WO2010132507A2 (en) 2010-11-18
EP2430194A4 (en) 2013-09-04
JP2015199746A (ja) 2015-11-12
KR101860294B1 (ko) 2018-07-02
WO2010132502A3 (en) 2011-04-21
SG10201402289VA (en) 2014-07-30
AU2016269471A1 (en) 2016-12-22
US20170137879A1 (en) 2017-05-18
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WO2010132486A3 (en) 2011-03-03
KR20120088555A (ko) 2012-08-08
CA2762213A1 (en) 2010-11-18
EA201101522A1 (ru) 2012-09-28
BRPI1011025A2 (pt) 2016-03-29
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EA201101519A1 (ru) 2012-10-30
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SG10201402287TA (en) 2014-07-30
BRPI1010908A2 (pt) 2016-03-15
EP2429513A4 (en) 2013-08-14
SG175992A1 (en) 2011-12-29
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JP2012526555A (ja) 2012-11-01
EP2430455A4 (en) 2013-09-04
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AU2016222515A1 (en) 2016-09-22
CN105287449A (zh) 2016-02-03

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