CN102482713A - 利用表观代谢转变剂、多维细胞内分子或环境影响剂诊断肿瘤障碍的方法 - Google Patents

利用表观代谢转变剂、多维细胞内分子或环境影响剂诊断肿瘤障碍的方法 Download PDF

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Abstract

描述了用于使用表观代谢转变剂诊断人的肿瘤障碍的方法和制剂、多维细胞内分子或环境影响剂。

Description

利用表观代谢转变剂、多维细胞内分子或环境影响剂诊断肿瘤障碍的方法
相关申请：
本申请要求2009年5月11日提交的标题为“Methods forTreatment of Oncological Disorders Using an表观代谢转变剂(Coenzyme Q10)”的第61/177,241号美国临时申请(律师代理申请案编号(Attorney Docket No.)：117732-00601)、2009年5月11日提交的标题为“Methods for Treatment of Oncological Disorders Using表观代谢转变剂，Multidimensional Intracellular Molecules or EnvironmentalInfluencers”第61/177,243号美国临时申请(律师代理申请案编号：117732-00701)、2009年5月11日提交的标题为“Methods for theDiagnosis of Oncological Disorders Using表观代谢转变剂，Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”的第61/177,244号美国临时申请(律师代理申请案编号：117732-00801)、2009年5月11日提交的标题为“Methods for Treatmentof Metabolic Disorders Using表观代谢转变剂，MultidimensionalIntracellular Molecules or Environmental Influencers”的第61/177,245号美国临时申请(律师代理申请案编号：117732-00901)和2009年5月11日提交的标题为“Methods for the Diagnosis of Metabolic DisordersUsing表观代谢转变剂，Multidimensional Intracellular Molecules orEnvironmental Influencers”的第61/177,246号美国临时申请(律师代理申请案编号：117732-01001)的优先权。上述申请的每一个的全部内容通过引用并入本文。
发明背景：
癌症目前是发达国家死亡的首要原因之一并且对现代社会具有严重威胁。癌症可在任何年龄在任何器官的任何组织中发生。世界上，每年有1000多万人被诊断患有癌症并且据估计该数目到2020年前将增长至每年1500万例新病例。癌症据认为每年导致600万人死亡或世界上12％的死亡。
癌症的病因学还不十分清楚。癌症与多年来进行中的研究的许多因素(包括遗传易感性，染色体断裂障碍，病毒，环境因素和免疫学障碍)相关或相关。癌症包括一大类医学病患。癌细胞可在身体的几乎任何器官和/或组织中产生。当身体的一部分开始不受控制地生长或分化时癌症发生。
虽然最近的研究已极大地增加我们对许多肿瘤发生的分子机制的理解并且已提供了许多用于治疗癌症的新途径，但用于大多数恶性肿瘤的标准治疗仍然是全切除术(gross resection)、化学疗法和放射疗法。虽然日益成功，但此类疗法的每一种可引起许多不希望的副作用。例如，手术可导致疼痛、对健康组织造成外伤性损伤和结瘢。放射疗法具有杀伤癌细胞的有利方面但其同时也损伤非癌组织。化学疗法包括给患者施用多种抗癌药物。此类标准治疗通常伴随不利的副作用，例如，恶心、免疫抑制、胃溃疡和继发性肿瘤发生。
多年来，许多个人和公司已进行广泛研究，寻找用于一大批癌症的治疗的改进。公司正在开发生物活性剂，包括化学实体例如小分子和生物制品(biologics)例如抗体，期望为癌症提供更有益的疗法。测试的生物活性剂中的一些在某些个体或癌症类型中有效并且提供有益的治疗效应，其他则在它们的测试方案中无效或具有最低的治疗效应。迄今为止研究的其他生物活性剂具有未被完全理解的作用机制。
辅酶Q10，在本文中也称为CoQ10、Q10、泛醌或泛癸利酮，是大众营养补充剂并且以胶囊形式见于在营养品店(nutritional store)、保健食品店、药房等中，如通过泛醇(CoQ10的还原形式)的抗氧化性质帮助保护免疫系统的维生素样补充剂。CoQ10是本领域公认的并且进一步描述于第WO 2005/069916号国际公布，将该国际公布的完整公开内容通过引用并入本文。
CoQ10经发现遍布人体的大部分组织和其他哺乳动物的组织。CoQ10在人中的组织分布和氧化还原状态已由Bhagavan HN等人，Coenzyme Q10：Absorption，tissue uptake，metabolism andpharmacokinetic，Free Radical Research 40(5)，445-453(2006)(在下文中，Bhagavan等人)在综述论文中进行了综述。作者报导“作为一般法则，具有高能需要或代谢活性的组织例如心脏、肾、肝和肌肉包含相对高的浓度的CoQ10”。作者还报导“[a]组织中的大部分CoQ10以还原形式如氢醌或泛醇(uniquinol)存在，除了脑和肺例外”，这“似乎是这两个组织中增加的氧化性应激的反映”。具体地，Bhagavan等人报导在心脏、肾、肝、肌肉、肠和血液(血浆)中，分别约61％、75％、95％、65％、95％和96％的CoQ10以还原形式存在。类似地，Ruiz-Jiminez等人，Determination of the ubiquinol-10 andubiquinone-10(coenzyme Q10)in human serum by liquidchromatography tandem mass spectrometry to evaluate the oxidativestress，J.Chroma A 1175(2)，242-248(2007)(在下文中，Ruiz-Jiminez等人)报导，当估量人血浆的Q10和Q10的还原形式(Q10H2)时，大部分(90％)所述分子以还原形式被发现。
CoQ10是极亲脂的并且对于大部分CoQ10，是不溶于水的。由于其在水中的不溶性、脂质中有限的溶解性和相对大的分子量，因此口服施用的CoQ10的吸收效率很低。Bhagavan等人报导“在一项利用大鼠的研究中，报导了只有约2-3％的口服施用的CoQ10被吸收”。Bhagavan等人还报导“大鼠研究的数据表明在肠的吸收过程中和之后CoQ10被还原成泛醇”。
多年来在文献中CoQ10与癌症相关。在下文中描述了某些代表性的但非全部包括在内的文献中报导的相关性的实例。Karl Folkers等人，Survival of Cancer Patients on Therapy with Coenzyme Q10，Biochemical and Biophysical Research Communication 192，241-245(1993)(在下文中，“Folkers等人”)描述了8个“利用CoQ10治疗”的癌症患者的病历和它们的“为期5-15年”的存活故事。给8个具有不同类型的癌症(包括胰腺癌、腺癌、喉癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌)的患者口服施用CoQ10。Folkers等人提出“这些结果现证明全身性方案是合理的”。Lockwood等人，Progress on Therapy ofBreast Cancer with Vitamin Q10 and the Regression of Metastases，Biochemical and Biophysical Research Communication  212，172-177(1995)(在下文中，“Lockwood等人”)是报告“利用维生素Q10进行的乳腺癌的治疗的进展”的另一篇综述论文。Lockwood等人参考Folkers等人，其“覆盖35年的关于动物和人的国际研究(所述研究揭示非肿瘤和肿瘤组织中维生素Q10的可变水平)并且包括对于宿主防御系统是固有的关于维生素Q10的数据(如基于增加的经治疗的具有肿瘤的小鼠的存活者)”。Lockwood等人还提出“人癌症的维生素Q10疗法的潜能在1961开始显示出来”依赖于测定199个瑞典和美国癌症患者的CoQ10血液水平的研究，该研究揭示了乳腺癌的病例中缺陷的可变水平。2002年7月9日发布的美国专利No.6,417,233(在下文中，Sears等人)描述了用于预防和/或治疗线粒体病的包含脂溶性苯醌类例如辅酶Q10的组合物。Sears等人提出“已报导CoQ10治疗在癌症患者中提供了一些有益方面(参见第2栏，第30-31行)”。
至本申请提交的日期为止，国家癌症研究所报导：从未在癌症治疗中进行包括大量的CoQ10患者的良好设计的临床试验，因为“进行研究的方式和报导的信息的量不能明确益处是由辅酶Q10引起的还是由其他某些试剂引起的”。参见国家癌症研究所(NCI)，可在www.cancer.Gov/cancertopics/pdq/cam/coenzymeQ10/patient/allpages(2008年9月29日)上获得。具体地，NCI引用了3个关于CoQ10用作乳腺癌患者的标准治疗后的辅助治疗的用途的小研究，其中某些患者似乎得到该治疗的帮助，并且重申“然而，研究设计和报告的弱点使得不能确定益处是由辅酶Q10引起的还是由其他物质引起的”。NCI明确指出“这些研究具有下列弱点：研究未进行标准化或未设对照；患者除了辅酶Q10外还使用其他补充剂；患者在辅酶Q10治疗之前或期间接受标准治疗；以及在研究中未报导全部患者的详情”。NCI还报告了“辅酶Q10帮助某些癌症患者(包括患有胰腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌和前列腺癌的患者)活得更长的轶事性报道”，但也说明“然而，这些报告中描述的患者还接受了除辅酶Q10外的治疗，包括化学疗法、放射疗法和手术”。
2006年2月16日公布的第2006/0035981号美国专利申请公布(在下文中，“Mazzio 2006”)描述了使用组合物治疗或预防人和动物癌症的方法和制剂，所述组合物利用癌症在其进行葡萄糖的非氧化磷酸化以获得能量的无氧要求(这与宿主相反)方面的脆弱性。Mazzio 2006的制剂包含一种或多种协同促进氧化代谢和/或阻止乳酸脱氢酶或无氧葡萄糖代谢的化合物并且更特别地被描述为包含“2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌(在本文中也称为″DMBQ″)(醌型碱)和整个泛醌系列的选项(包括相应的氢醌类、泛色烯醇、泛色满醇或合成/天然衍生物和类似物)。参见Mazzio 2006，第3页，第0010段。Mazzio 2006确证“短链泛醌(CoQ＜3)作为抗癌剂并且甚至进一步确证“2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌(DMBQ)作为抗癌剂效力为CoQ10的1000倍以上”。参见Mazzio 2006，第3页，第0011段。Mazzio 2006还提出该研究“未发现CoQ10是如所预期的致死性的”，并且有可能“使用CoQ10抗癌的先前研究有些矛盾”。关于支持该声明的引证的详细列表，参见Mazzio 2006，第3-4页。
2007年10月25日公布的第2007/0248693号美国专利申请公布(在下文中称为“Mazzio 2007”)也描述了营养食品组合物及它们用于治疗或预防癌症的用途。而且，该公布的专利申请聚焦在短链泛醌上并且明确提出CoQ10不是本发明的至关重要的成分。根据Mazzio2007“虽然CoQ10可增加癌细胞中线粒体复合物II活性的Vmax(Mazzio和Soliman，Biochem Pharmacol.67：1167-84，2004)，但这不能控制通过复合物IV进行的线粒体呼吸或O2利用的速率。并且，CoQ10并非如所预期的为致死性的。同样地，CoQ10抗癌的结果是矛盾的”。参见Mazzio 2007，第5页，第0019段。
发明概要：
申请人以前已描述了CoQ10的局部制剂和用于降低动物受试者中肿瘤生长的速率的方法(Hsia等人，2005年8月4日公布的WO2005/069916)。在Hsia等人描述的实验中，已显示CoQ10增加皮肤癌细胞但非正常细胞的培养物的细胞凋亡速率。此外，已显示利用CoQ10的局部制剂治疗荷瘤动物显著降低动物中肿瘤生长的速率。
本发明至少部分基于对CoQ10在人和/或细胞中的作用的更全面的理解。具体地，本发明的方法和制剂至少部分基于获得的关于CoQ10对于肿瘤障碍的治疗活性的知识，所述知识是通过设计和执行人临床试验和/或通过给人受试者施用CoQ10并且观察在这些试验和/或治疗方案过程中发生的令人惊讶和意外的结果获悉的。本发明的方法和制剂还至少部分基于从细胞的体外CoQ10处理的广泛研究获得的对CoQ10的治疗机制的洞察。
具体地，在至少一个实施方案中，本发明的方法和制剂至少部分基于令人惊讶的发现：辅酶Q10(在本中也称为CoQ10或Q10)至细胞的应用导致癌细胞的细胞凋亡反应的选择性诱导，对正常细胞的生长不具有效应或在某些情况下具有正效应。此外，在至少一个另外的实施方案中，意外地发现与来源于不太具有侵袭性或非侵袭性癌症的细胞系相比较，来源于侵袭性癌的细胞系对CoQ10更敏感(例如，对于细胞毒性和/或细胞凋亡的诱导需要更低浓度的CoQ10和/或更少的处理时间)。观察到线粒体Q10水平的时间和剂量反应，其中在48小时后，细胞线粒体中Q10的水平增加至6倍。在至少一个另外的实施方案中，本发明还基于令人惊讶和意外的发现：Q10以提供的氧化形式(促氧化剂)维持并且不以任何显著的量转化成Q10H2的还原(抗氧化剂)形式。在另一个实施方案中，本发明仍然进一步基于发现：大量基因的表达在利用Q10的氧化形式处理的细胞中受到调节。发现此类被调节的蛋白质簇集在几种细胞途径中，包括细胞凋亡、癌症生物学和细胞生长、糖酵解和代谢、分子运输和细胞信号转导。
综合起来，本文中描述的结果已对Q10的治疗机制提供了见解。例如，然而不希望受理论束缚，申请人的发现表明Q10，特别地Q10的氧化形式诱导至细胞微环境的代谢转移。已知差异代谢在癌细胞中发生(Warburg效应)，其中大多数癌细胞主要通过糖酵解，然后细胞溶胶中通过乳酸发酵而非在线粒体中通过氧化磷酸化(丙酮酸盐的氧化)产生能量。申请人的发现表明Q10能够将癌细胞的代谢状态从糖酵解的无氧使用转换成线粒体氧化磷酸化。
基于本文中提供的申请人的数据，CoQ10已被鉴定为多维细胞内分子(Multidimensional Intracellular Molecular)(MIM)和表观代谢转变剂(Epi-Shifter)。本发明提供了MIM、表观代谢转变剂和用于通过使用所述物质诊断或预后癌症障碍的方法。
因此，在某些方面，本发明涉及评估受试者是否患有肿瘤障碍的方法。此类方法包括(1)测定存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志；和(2)将存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，其中在获自受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是所述受试者患有肿瘤障碍的指征，从而评估所述受试者是否患有肿瘤阻碍。
在某些方面，本发明涉及评估受试者是否患有肿瘤障碍的方法。此类方法包括(1)测定存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志的表达在肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；和(2)将存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，其中在获自受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是所述受试者患有肿瘤障碍的指征，从而评估所述受试者是否患有肿瘤阻碍。
在某些方面，本发明涉及预后受试者是否易发生肿瘤障碍的方法。此类方法包括(1)测定存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志；和(2)将存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，其中在获自受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是所述受试者易发生肿瘤障碍的指征，从而评预后述受试者是否易发生肿瘤阻碍。
在某些方面，本发明涉及预后受试者是否易发生肿瘤障碍的方法。此类方法包括(1)测定存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志的表达在肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；和(2)将存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，其中在获自受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是所述受试者易发生肿瘤障碍的指征，从而预后所述受试者是否易发生肿瘤阻碍。
在某些方面，本发明涉及预后受试者中肿瘤障碍的复发的方法。此类方法包括(1)测定存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志；和(2)将存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，其中在获自受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是肿瘤障碍的复发的指征，从而预后所述受试者的肿瘤障碍的复发。
在某些方面，本发明涉及预后受试者中肿瘤障碍的复发的方法。此类方法包括(1)测定存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志的表达在肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；和(2)将存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，其中在获自受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是肿瘤障碍的复发的指征，从而预后所述受试者的肿瘤阻碍的复发。
在某些方面，本发明涉及预后患有肿瘤障碍的受试者的存活的方法。此类方法包括(1)测定存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志；和(2)将存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，其中在获自受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是所述受试者的存活的指征，从而预后患有肿瘤障碍的所述受试者的存活。
在某些方面，本发明涉及预后患有肿瘤障碍的受试者的存活的方法。此类方法包括(1)测定存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志的表达在肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；和(2)将存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，其中在获自受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是所述受试者的存活的指征，从而预后所述患有肿瘤障碍的受试者的存活。
在某些方面，本发明涉及预后关于受试者的肿瘤障碍的侵袭性的方法。此类方法包括(1)测定存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志；和(2)将存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，其中在获自受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节指示所述肿瘤障碍具有侵袭性，从而预后关于所述受试者的肿瘤阻碍的侵袭性。
在某些方面，本发明涉及预后关于受试者的肿瘤障碍的侵袭性的方法。此类方法包括(1)测定存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志的表达在肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；和(2)将存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，其中在获自受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节指示所述受肿瘤障碍具有侵袭性，从而预后关于所述受试者的肿瘤阻碍的侵袭性。
在某些方面，本发明涉及监测受试者的肿瘤障碍的进展的方法。此类方法包括：将存在于在给所述受试者施用至少一部分治疗方案之前获自所述受试者的第一样品中的标志的表达水平与存在于在施用至少一部分治疗方案后获自所述受试者的第二样品中的所述标志的表达水平相比较，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志，从而监测所述受试者的肿瘤障碍的进展。
在某些方面，本发明涉及监测受试者的肿瘤障碍的进展的方法。此类方法包括：将存在于在给所述受试者施用至少一部分治疗方案之前获自所述受试者的第一样品中的标志的表达水平与存在于在施用至少一部分治疗方案后获自所述受试者的第二样品中的所述标志的表达水平相比较，其中所述标志的表达在所述肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变，从而监测所述受试者的肿瘤障碍的进展。
在某些方面，本发明涉及用于评估疗法治疗受试者的肿瘤障碍的功效的方法。此类方法包括：将存在于在给所述受试者施用至少一部分治疗方案之前获自所述受试者的第一样品中的标志的表达水平与存在于在施用至少一部分治疗方案后获自所述受试者的第二样品中的所述标志的表达水平相比较，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志，其中所述第二样品中所述标志的表达水平相对于所述第一样品的调节是所述疗法对于治疗受试者的肿瘤障碍是有效的指征。
在某些方面，本发明涉及用于评估疗法治疗受试者的肿瘤障碍的功效的方法。此类方法包括：将存在于在给所述受试者施用至少一部分治疗方案之前获自所述受试者的第一样品中的标志的表达水平与存在于在施用至少一部分治疗方案后获自所述受试者的第二样品中的所述标志的表达水平相比较，其中所述标志的表达在肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变，其中第二样品中所述标志的表达水平相对于第一样品的调节是所述疗法对于治疗所述受试者的肿瘤障碍是有效的指征。
在某些方面，本发明涉及评估环境影响剂化合物治疗有此需要的受试者的肿瘤障碍的功效的化合物的方法。此类方法包括(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的一个或多个标志的表达水平，其中将所述生物样品暴露于环境影响剂化合物，并且其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的具有正倍数改变和/或具有负倍数改变的标志；(2)测定存在于获自所述受试者的第二生物样品中的一个或多个标志的表达水平，其中不将所述样品暴露于环境影响剂化合物；和(3)将暴露于环境影响剂化合物的生物样品中一个或多个标志的表达水平与未暴露于环境影响剂化合物的生物样品中一个或多个标志的表达水平相比较，其中存在于暴露于环境影响剂化合物的生物样品中的具有负倍数改变的一个或多个标志的表达水平相对于存在于所述第二样品中的一个或多个标志的表达水平的降低是所述环境影响剂化合物对于治疗患有肿瘤障碍的受试者的肿瘤障碍是有效的指征，和其中存在于暴露于环境影响剂化合物的生物样品中的具有正倍数改变的一个或多个标志的表达水平相对于存在于所述第二样品中的一个或多个标志的表达水平的升高是所述环境影响剂化合物对于治疗患有肿瘤障碍的受试者的肿瘤障碍是有效的指征，从而评估环境影响剂化合物用于治疗患有肿瘤障碍的受试者的肿瘤障碍的功效。
在某些方面，本发明涉及评估环境影响剂化合物治疗有此需要的受试者的肿瘤障碍的功效的化合物的方法。此类方法包括(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的一个或多个标志的表达水平，其中将所述生物样品暴露于环境影响剂化合物，并且其中所述标志的表达在所述肿瘤障碍的癌细胞中被上调或下调，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；(2)测定存在于获自所述受试者中的第二生物样品中的一个或多个标志的表达水平，其中未将所述样品暴露于所述环境影响剂化合物；和(3)将暴露于环境影响剂化合物的生物样品中一个或多个标志的表达水平与未暴露于环境影响剂化合物的生物样品中一个或多个标志的表达水平相比较，其中在暴露于环境影响剂化合物的生物样品中一个或多个下调的标志的表达水平相对于存在于所述第二样品中的所述一个或多个标志的表达水平的降低是所述环境影响剂化合物对于治疗患有肿瘤障碍的受试者的肿瘤障碍是有效的指征，和其中在暴露于环境影响剂化合物的生物样品中一个或多个上调的标志的表达水平相对于存在于所述第二样品中的所述一个或多个标志的表达水平的升高是所述环境影响剂化合物对于治疗患有肿瘤障碍的受试者的肿瘤障碍是有效的指征，从而评估环境影响剂化合物用于治疗患有肿瘤障碍的受试者的肿瘤障碍的功效。
在某些方面，本发明涉及鉴定用于治疗受试者的肿瘤障碍的化合物的方法。此类方法包括(1)从所述受试者获得生物样品；(2)将所述生物样品与测试化合物接触；(3)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的一个或多个标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的具有正倍数改变和/或具有负倍数改变的标志；(4)将所述生物样品中多个标志之一的表达水平与未接触所述测试化合物的对照样品相比较；和(5)选择测试化合物，所述测试化合物降低存在于生物样品中的具有负倍数改变的一个或多个标志的表达水平和/或升高存在于所述生物样品中的具有正倍数改变的一个或多个标志的表达水平，从而鉴定用于治疗受试者的肿瘤障碍的化合物。
在某些方面，本发明涉及鉴定用于治疗受试者的肿瘤障碍的化合物的方法。此类方法包括(1)从所述受试者获得生物样品；(2)将所述生物样品与测试化合物接触；(3)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的一个或多个标志的表达水平，其中所述标志的表达在所述肿瘤障碍的癌细胞中被上调或下调，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；(4)将所述生物样品中多个标志之一的表达水平与未接触所述测试化合物的对照样品相比较；和(5)选择测试化合物，所述测试化合物降低一个或多个下调的标志在生物样品中的表达水平，和/或升高一个或多个上调的标志在生物样品中的表达水平，从而鉴定用于治疗受试者的肿瘤障碍的化合物。
在某些实施方案中，术语糖酵解任选地包括相关乳酸盐生物合成。
在某些实施方案中，所述肿瘤障碍是选自：白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤的肿瘤障碍。
在某些实施方案中，所述标志在哺乳动物的癌细胞中选择性地引发朝向在正常生理条件下在所述哺乳动物的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变。
在某些实施方案中，所述样品包含获自所述受试者的液体，例如选自血液液体、呕吐物、唾液、淋巴、膀胱液、尿、通过支气管灌洗收集的液体、通过腹膜漂洗收集的液体和妇科洗液(gynecological fluid)的液体。在某些实施方案中，所述样品是血液样品或其成分。在某些实施方案中，所述样品包含获自所述受试者的组织或其成分，例如选自骨、结缔组织、软骨、肺、肝、肾、肌肉组织、心脏、胰腺和皮肤的组织。
在某些实施方案中，所述受试者是人。
在某些实施方案中，通过测定生物样品中转录的多核苷酸或其部分来测定所述样品中所述标志的表达水平。在某些实施方案中，测定所述转录的多核苷酸包括扩增所述转录的多核苷酸。在某些实施方案中，通过测定所述样品中蛋白质或其部分来测定所述受试者样品中标志的表达水平。在某些实施方案中，使用特异性结合蛋白质的试剂例如标记的试剂测定所述蛋白质。所述试剂包括例如，抗体和抗原结合抗体片段。
在某些实施方案中，使用选自所述样品的聚合酶链式反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、单链构象多态性分析(SSCP)、错配剪切检测、异源双链分析、Southern印迹分析、Northern印迹分析、Western印迹分析、原位杂交、阵列分析、脱氧核糖核酸测序、限制性片段长度多态性分析和其组合或亚组合的技术测定所述样品中所述标志的表达水平。在某些实施方案中，使用选自免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA和质谱的技术测定所述样品中所述标志的表达水平。
在某些实施方案中，所述标志是选自HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-对羟基苯甲酸酯、嗜中性粒细胞细胞溶胶因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C和Cam激酶II的标志。在某些实施方案中，所述标志是与细胞凋亡相关的标志。在某些实施方案中，所述标志是与氧化性应激相关的标志。在某些实施方案中，所述标志是与热激相关的标志。在某些实施方案中，所述标志是与血管生成相关的标志。在某些实施方案中，测定多个标志的表达水平。
在某些实施方案中，用选自环境影响剂化合物、手术、辐照、激素疗法、抗体疗法、利用生长因子、细胞因子的疗法和化学疗法的疗法治疗所述受试者。在某些实施方案中，所述疗法包括环境影响剂化合物。环境影响剂化合物可以是例如多维细胞内分子(MIM)或表观代谢转变剂(epi-shifter)。在某些实施方案中，所述环境影响剂化合物是CoQ-10。在某些实施方案中，所述环境影响剂化合物是维生素D3。在某些实施方案中，所述环境影响剂化合物是选自乙酰Co-A、棕榈酰基、L-左旋肉碱、酪氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和小分子。在某些实施方案中，所述环境影响剂化合物是选自纤连蛋白、TNF-α、IL-5、IL-12、IL-23、血管生成因子和细胞凋亡因子。在某些实施方案中，所述疗法还包括选自手术、辐照、激素疗法、抗体疗法、利用生长因子、细胞因子的疗法和化学疗法的治疗方案。
在某些方面，本发明涉及用于评估受试者是否患有肿瘤障碍的试剂盒。此类试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于评估所述受试者是否患有肿瘤障碍的使用说明书。
在某些方面，本发明涉及用于预后受试者是否易发生肿瘤障碍的试剂盒。此类试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于预后所述受试者是否易发生肿瘤障碍的使用说明书。
在某些方面，本发明涉及用于预后受试者的肿瘤障碍的复发的试剂盒。此类试剂盒包括用于评估选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于预后所述肿瘤障碍的复发的使用说明书。
在某些方面，本发明涉及用于预后肿瘤障碍的复发的试剂盒。此类试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于预后所述肿瘤障碍的复发的使用说明书。
在某些方面，本发明涉及用于预后患有肿瘤障碍的受试者的存活的试剂盒。此类试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于预后患有所述肿瘤障碍的受试者的存活的使用说明书。
在某些方面，本发明涉及用于预后关于受试者的肿瘤障碍的侵袭性的试剂盒。此类试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于预后关于受试者的肿瘤障碍的侵袭性的使用说明书。
在某些方面，本发明涉及用于监测受试者的肿瘤障碍的进展的试剂盒。此类试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于预后受试者的肿瘤障碍的进展的使用说明书。
在某些方面，本发明涉及用于评估疗法治疗肿瘤障碍的功效的试剂盒。此类试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于评估疗法治疗肿瘤障碍的功效的使用说明书。
在某些方面，本发明涉及用于评估环境影响剂化合物治疗患有肿瘤障碍的受试者的肿瘤障碍的功效的试剂盒。此类试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于评估环境影响剂化合物治疗患有肿瘤障碍的受试者的肿瘤障碍的功效的使用说明书。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于从受试者获得生物样品的方法。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括对照样品。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括环境影响剂化合物。在某些实施方案中，述试剂盒还包括用于测定多个标志的表达水平的试剂。
在某些实施方案中，用于测定至少一个标志的表达水平的方法包括用于测定所述样品中转录的多核苷酸或其部分的方法。在其他实施方案中，用于测定至少一个标志的表达水平的方法包括用于测定所述样品中蛋白质或其部分的方法。
在某些方面，本发明涉及评估受试者是否患有CoQ10反应性状态的方法。此类方法包括(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志；和(2)将存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的所述标志的表达水平相比较，其中获自受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是受试者患有CoQ10反应性状态的指征，从而评估所述受试者是否患有CoQ10反应性状态。在某些实施方案中，所述CoQ10反应性状态是肿瘤障碍。
附图简述：
图1：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的SK-MEL-28对24小时的Q10处理的敏感性。
图2：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的SKBR3对24小时的Q10处理的敏感性。
图3：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的PaCa2对24小时的Q10处理的敏感性。
图4：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的PC-3对24小时的Q10处理的敏感性。
图5：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的HepG2对24小时的Q10处理的敏感性。
图6：通过早期和晚期凋亡细胞的量测量的MCF-7对24小时的Q10处理的敏感性。
图7：在利用Q10处理24小时后凋亡细胞的测量，如通过Apostrand ELISA法测量的。
图8：2-D凝胶电泳的示例性凝胶分析。标记被切取用于鉴定的点。
图9：通过2-D凝胶电泳鉴定的在SK-MEL-28细胞中受Q10调节的蛋白质之间的相互作用的网络。
图10：从Verhoeven等人(Am.J.Hum.Genet.200168(5)：1086-1092)改进的戊糖磷酸途径。
图11：SK-MEL-28细胞的富集线粒体的材料的2-D凝胶。标记要切取的并且通过质谱表征鉴定的点。
图12：在向培养基中外源加入100μM Q10后存在于线粒体中的Q10的相对量的比较曲线。
图13：描绘已知过程的细胞凋亡途径。
图14：Bcl-xl的Western印迹分析。
图15：利用波形蛋白抗体显示的SK-MEL-28样品组的Western印迹分析。
图16：利用5种靶向氧化磷酸化复合物的抗体(MitoSciences#MS601)评估的来自许多细胞系的细胞裂解的Western印迹分析。
图17：F1-α水平的Western印迹比较。
图18：针对C-III-Core 2的Q10反应的Western印迹比较。
图19：针对C-II-30的Q10反应的Western印迹比较。
图20：针对C-IV-COX II的Q10反应的Western印迹比较。
图21：针对C-I-20(ND6)的Q10反应的Western印迹比较。
图22：针对5种线粒体蛋白质的多种细胞类型的Western印迹分析。
图23：针对复合物V蛋白C-V-α的Q10反应的Western印迹比较。
图24：针对C-III-Core1的Q10反应的Western印迹比较。
图25：针对孔蛋白(VDAC1)的Q10反应的Western印迹比较。
图26：针对亲环蛋白(Cyclophilin)的Q10反应的Western印迹比较。
图27：针对细胞色素C的Q10反应的Western印迹比较。
图28：插入螺旋10开放构象中的HNF4α(1M7W.pdb)的脂质结合通道的Q10(球)的理论模型。
图29：在含氧量正常和含氧量低的条件下，HDFa细胞在多种葡萄糖条件下的OCR。
图30：在含氧量正常和含氧量低的条件下，HASMC细胞在多种葡萄糖条件下的OCR。
图31：在CoQ10和应激因子不存在和存在的情况下MCF-7胰腺癌细胞中的OCR值。
图32：在CoQ10和应激因子不存在和存在的情况下PaCa-2胰腺癌细胞中的OCR值。
发明详述：
定义
如本文中所使用的，下列术语的每一个具有在该部分中与其相关的意义。
冠词“一种(a)”和“一个(an)”在本文中是指一个或超过一个(即至至少一个)所述冠词的语法宾语。例如，“一个元素”意指一个元素或超过一个元素。
术语“包括”在本文中用于意指短词“包括但不限于”，并且可与所述短语互换使用。
除非本文中明确地另外指出，否则术语“或”在本文中意指术语“和/或”，并且可与所述术语互换使用。
术语“例如”在本文中用于意指术语“例如但不限于”，并且可与所述术语互换使用。
待通过本发明的方法治疗的“患者”或“受试者”可意指人或非人动物，优选哺乳动物。如本文中所使用的，“受试者”或“患者”包括但不限于任何动物(例如，人)，包括马、狗、猫、猪、山羊、兔、仓鼠、猴、豚鼠、大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、绵羊、牛、鱼和鸟。
如本文中所使用的，“存活”是指已进行肿瘤障碍的治疗的受试者的生命的延续。在一个实施方案中，存活是指肿瘤障碍再发的失败。
如本文中所使用的，术语“再发”或“复发”是指已在其中施用了肿瘤的初步治疗的受试者中肿瘤或癌细胞的再生长。肿瘤可在原初位置或在身体的另一部分再发。在一个实施方案中，再发的肿瘤是与已针对其治疗了受试者的原始肿瘤相同种类的肿瘤。例如，如果受试者患有胰腺肿瘤，被治疗，随后发生另一个胰腺肿瘤，则所述肿瘤已再发。此外，肿瘤障碍可在与其所原始发生的器官或组织不同的器官或组织中再发。例如，如果受试者患有胰腺肿瘤，被治疗，随后发生肝肿瘤，则所述肿瘤也已再发。
如本文中所使用的，术语“侵袭性”，对于肿瘤障碍而言，是指具有在受试者中再发的倾向的肿瘤或衍生自这样的侵袭性肿瘤的细胞。
如本文中所使用的，术语“量”是指(a)如以分子、摩尔或重量/单位体积或细胞测量的绝对量或(b)如例如由0至5的数值指定的相对量。
如本文中所使用的术语“对照量”是指来源于未患有肿瘤障碍的受试者的细胞或样品、来源于非侵袭性肿瘤的细胞或样品中的标志的量。“对照量”可以例如通过计算存在于已知以高水平、中等水平和低水平表达标志例如表达此类蛋白质的细胞或组织中的标志的平均量来测定。
“治疗有效量”意指当给患者施用以治疗疾病时足以对所述疾病实现这样的治疗的化合物的量。当为了预防疾病施用时，所述量足以避免或延迟疾病的发作。“治疗有效量”将视所述化合物、疾病和其严重性以及待治疗的患者的年龄、体重等而变化。
“预防”或“防止”是指获得疾病或障碍的风险(即，引起尚未在可遭受或易患疾病但仍未经历或展示疾病的症状的患者中发生的疾病的至少一个临床症状)的降低。
术语“预防性”或“治疗性”治疗是指给受试者施用一种或多种受试组合物。如果其在不期望的病状(例如，宿主动物的疾病或其他不期望的状态)的临床表现之前施用，则治疗是预防性的，即，其保护宿主免于发生不期望的病状，然而如果在不期望的病状表现之后施用，则治疗是治疗性的(即，其由此旨在减轻、改善或维持既有的不期望的病状或副作用)。
术语“治疗效应”是指由药理活性物质引起的动物，特别是哺乳动物的，更特别是人中的局部或全身性效应。所述术语因此意指意欲用于诊断、治疗、缓和、治疗或预防疾病或用于促进动物或人的期望的身体或心理发展和状态的任何物质。短语“治疗有效量”意指以适用于任何治疗的合理效益风险比产生一定的期望的局部或全身性效应的此种物质的量。在某些实施方案中，化合物的治疗有效量将取决于其治疗指数、溶解度等。例如，可以以足以产生适用于此类治疗的合理效益风险比的量施用通过本发明的方法发现的某些化合物。
术语″表达″在本文中用于表示籍以从DNA产生多肽的过程。所述过程包括基因至mRNA的转录和该mRNA至多肽的翻译。取决于其所用于的背景，“表达”可以指RNA、蛋白质或两者的产生。
术语″细胞中基因的表达水平″或″基因表达水平″是指由细胞中基因编码的mRNA以及前mRNA新生转录物、转录物加工中间体、成熟mRNA和降解物的水平。
术语“调节”是指反应的上调(即，激活或刺激)、下调(即，抑制或遏抑)，或者两者的组合或分开的两者。“调节剂”是起调节作用的化合物或分子，并且可以是例如激动剂、拮抗剂、活化剂、刺激剂、遏抑剂或抑制剂。
“更高的表达水平”、“更高的活性水平”、“升高的表达水平”或“增加的活性水平”是指测试样品中的的表达水平和/或活性，其高于用于估计表达和/或活性的测定的标准差，并且优选为标志在对照样品(例如，来自未患有肿瘤障碍的健康受试者的样品)中的表达水平和/或活性、优选所述标志在几个对照样品中的平均表达水平和/或活性的至少2倍，更优选3、4、5、或10或更多倍。
“更低的表达水平”、“更低的活性水平”、“降低的表达水平”或“减少的活性水平”是指测试样品中的表达水平和/或活性，其高于用于评估表达和/或活性的测定的标准差，但优选低于所述标志在对照样品(例如，利用用作所述标志的预后能力的验证标准的随访信息针对一小组肿瘤障碍直接或间接校准的样品)中的表达水平、优选所述标志在几个对照样品中的平均表达水平和/或活性的至少1/2，更优选1/3、1/4、1/5或1/10或更低。
如本文中所使用的，“抗体”包括，作为例子，天然存在的抗体形式(例如，IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体例如单链抗体、嵌合抗体和人源化抗体以及多特异性抗体，以及所有上述抗体的片段和衍生物，所述片段和衍生物具有至少一个抗原结合位点。抗体衍生物可包括缀合至抗体的蛋白质或化学部分。
如本文中所使用的，“已知的标准”或“对照”是指关于本发明的标志的量/或数学关系的一个或多个(如适用)和肿瘤障碍的存在或不存在。已知的标准优选反映再发性瘤和非再发性瘤和/或侵袭性或非侵袭性肿瘤的这样的量和/或数学关系特征。用于产生已知标准的试剂包括但不限于来自已知具有侵袭性的肿瘤的肿瘤细胞、来自已知不具有侵袭性的肿瘤的肿瘤细胞和任选地标记的抗体。已知的标准还可包括组织培养细胞系，包括但不限于，已被操作来表达特定标志蛋白或不表达特定标志蛋白的细胞系，或组成型地包含恒定量的标志蛋白或可被操作(例如，通过暴露于改变的环境，其中这样的改变的环境可包括但不限于生长因子、激素、类固醇、细胞因子、抗体、各种药物和抗代谢药以及细胞外基质)来表达标志蛋白的肿瘤异种移植物。可将细胞系直接加载在玻璃载玻片上以进行分析，直接作为丸粒固定、包埋在石蜡中，或悬浮于基质例如琼脂糖中，然后固定、包埋在石蜡中，切片和处理为组织样品。必须利用用作所述标志蛋白的预后能力的验证标准的随访信息针对一小组胃肠癌或乳腺癌直接或间接校准标准。
如本文中所使用的“初步治疗”是指患有肿瘤障碍的受试者的初治。初步治疗包括但不限于手术、辐照、激素疗法、化学疗法、免疫疗法、血管生成疗法和通过生物调节剂的疗法。
如果肿瘤障碍的至少一个症状预期被缓和、终止、减缓或阻止，那么肿瘤障碍被“治疗”。如本文中所使用的，如果肿瘤障碍的复发或转移被减少、减缓、延迟或阻止，那么肿瘤障碍也被“治疗”。
试剂盒是包括至少一种用于特异性检测本发明的标志的试剂例如探针的任何制造品(例如，包装或容器)，制造品以单位形式推销、分配或销售用于实施本发明的方法的所述制造品。
“代谢途径”是指酶介导的反应的顺序，所述反应将一种化合物转化成另一种化合物并且为细胞功能提供中间产物和能量。代谢途径可以是线性的或环状的。
“代谢状态”是指如通过多个化学和生物学指标测量的在给定时间点上的特定细胞、多细胞或组织环境的分子含量，它们与健康或疾病的状态相关。
术语“微阵列”是指在基质例如纸、尼龙膜或其他类型的膜、滤纸、芯片、载玻片或任何其他适当的固体载体上合成的不同多核苷酸、寡核苷酸、多肽(例如，抗体)或肽的阵列。
术语“障碍”和“疾病”被包含地使用并且是指与身体的任何部分、器官或系统(或其任何组合)的正常结构或功能的任何偏差。具体的疾病表现在特征性症状和体征(包括生物、化学和物理变化)，并且通常与多个其他因素(包括但不限于人口统计、环境、职业、遗传和医疗史因素)相关。可通过多种方法定量某些特征性体征、症状和相关因素以产生重要诊断信息。
在某些实施方案中，本发明的化合物例如本文中描述的MIM或表观代谢转变剂，可用于治疗有此需要的受试者的辅酶Q10反应性状态。术语“辅酶Q10反应性状态”或“CoQ10反应性状态”包括可通过施用辅酶Q10治疗、预防或改善的疾病、障碍、状态和/或病状。不希望受任何特定理论束缚，并且如本文中进一步描述的，CoQ10被认为至少部分地通过诱导对细胞微环境的代谢转变，例如朝向正常状态细胞中的氧化磷酸化的类型和/或水平的转变来起作用。因此，在某些实施方案中，CoQ10反应性状态是由细胞微环境的改变的代谢引起的状态。辅酶Q10反应性状态包括例如，肿瘤障碍，其例如可以偏向于糖酵解和乳酸盐生物合成。在某些实施方案中，CoQ10反应性肿瘤障碍包括肝癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌或骨癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、黑素瘤和光线性角化病等等。辅酶Q10反应性状态还包括本文中描述的其他肿瘤障碍。
辅酶Q10反应性状态还包括例如代谢障碍例如肥胖症、糖尿病、糖尿病前期(pre-diabete)、代谢综合征、饱满感和内分泌异常。辅酶Q10反应性状态还包括本文中描述的其他代谢障碍。
在某些实施方案中，本发明的化合物例如本文中描述的MIM或表观代谢转变剂与辅酶Q10共有共同的活性。如本文中所使用的，短语“与辅酶Q10共有共同的活性”是指化合物展示与辅酶Q10的相同或相似的至少一部分的活性的化合物。在某些实施方案中，本发明的化合物展示25％或更多的辅酶Q10的活性。在某些实施方案中，本发明的化合物展示达到并且包括约130％的辅酶Q10的活性。在某些实施方案中，本发明的化合物展示约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％或130％的辅酶Q10的活性。应理解，该段落中所列的每一个值可用术语“约”修饰。此外，应理解由该段落中的任何两个值确定的任何范围意被认为包括在本发明中。例如，在某些实施方案中，本发明的化合物展示约50％至约100％的辅酶Q10的活性。在某些实施方案中，辅酶Q10和本发明的化合物所共有的活性是诱导细胞代谢的转变的能力。在某些实施方案中，CoQ10和本发明的化合物所共的活性利用OCR(耗氧率)和/或ECAR(细胞外酸化率)来测量。
如本文中所使用的，″肿瘤障碍″是在人中发现的所有类型的癌症或赘生物或恶性肿瘤，包括但不限于：白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。如本文中所使用的，术语或短语“肿瘤障碍”、″癌症″、″赘生物″和″肿瘤″可互换使用并且可以以单数或复数形式存在，其是指已经历恶性转化使得它们对于宿主生物来说是病理性的细胞。在某些实施方案中，肿瘤障碍是辅酶Q10反应性状态。。
在某些实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于缺乏细胞凋亡。在其他实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于增加的血管生成。在其他实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于细胞外基质(ECM)降解。在其他实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于细胞周期控制的丧失。在其他实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于代谢管理(metabolic governance)从线粒体氧化磷酸化至增加的对乳酸盐和糖酵解流的利用和/或依赖的转化。在另外的实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于逃避免疫监视的适应原免疫调节机制。在一个实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于至少两个上述特性，例如，增加的血管生成和ECM降解。在一个实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于至少3个上述特性。在一个实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于至少4个上述特性。在一个实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于至少5个上述特性。在一个实施方案中，肿瘤障碍或癌症的特征在于全部6个上述特性。
因此，在某些实施方案中，本发明的化合物通过恢复细胞凋亡或诱导细胞凋亡的能力来起作用。在其他实施方案中，本发明的化合物通过降低、减少或抑制血管生成来起作用。在其他实施方案中，本发明的化合物通过恢复或重建细胞外基质来起作用。在其他实施方案中，本发明的化合物通过恢复细胞周期控制来起作用。在其他实施方案中，本发明的化合物通过将代谢管理从糖酵解转变回线粒体氧化磷酸化来起作用。在另外的实施方案中，本发明的化合物通过恢复免疫监视或恢复身体将癌细胞识别为外来物的能力来起作用。
不希望受任何特定理论限制，据认为通常存在集合在一起发展出癌症的协同事件级联。即，在某些实施方案中，癌症不是单独地取决于1种基因-1种蛋白质-根原因(1gene-1protein-root causality)。在某些实施方案中，癌症是表现为变成肿瘤、改变的组织状态的组织变化和改变(例如，能量学、允许转移潜能的受损的细胞外基因完整性、免疫监视的不存在和/或改变的血管生成的状态)的生理疾病状态。
可利用广为接受的技术特别是组织学检查容易地将原发性肿瘤细胞(即，获自恶性转化位置附近的细胞)与非癌细胞相区别。癌细胞的定义，如本文中所使用的，不仅包括原发性癌细胞，而且还包括癌症干细胞，以及癌症祖细胞或来源于癌症细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞以及来源于癌细胞的体外培养物和细胞系。当提及通常表现为实体瘤的癌症的类型时，“临床上可检测的”肿瘤是在肿瘤团块的基础上可检测的(例如，通过方法例如CAT扫描、MR成像、X-射线、超声或触诊)和/或由于可从患者获得的样品中一个或多个癌症特异性抗原的表达而可被检测的肿瘤。
术语“肉瘤”通常是指由物质如胚性结缔组织组成的和通常由包埋在纤维状或均相物质中的紧密堆积的细胞组成的肿瘤。可利用本发明的环境影响剂治疗的肉瘤包括但不限于例如软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤(melanosarcoma)、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy′s肉瘤、脂肪肉瘤(adipose sarcoma)、脂肪瘤(liposarcoma)、腺泡软组织状肉瘤、成釉细胞肉瘤(ameloblastic sarcoma)、葡萄状肉瘤、绿色瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、肾母细胞瘤(Wilms′tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因肉瘤、筋膜肉瘤、纤维母细胞肉瘤、巨细胞肉瘤(giant cell sarcoma)、粒细胞肉瘤、何杰金氏肉瘤、皮肤特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、晏森肉瘤(Jensen′s sarcoma)、卡波西肉瘤、kupffer细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤(leukosarcoma)、恶性间叶瘤(malignant mesenchymoma sarcoma)、骨周肉瘤(parosteal sarcoma)、网状细胞肉瘤(reticulocytic sarcoma)、劳斯肉瘤(Rous sarcoma)、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛细血管扩张性肉瘤(telangiectaltic sarcoma)。
术语“黑素瘤”被用来表示由皮肤或其他器官的黑素细胞系统引起的肿瘤。可用本发明的环境影响剂治疗的黑素瘤包括但不限于例如肢端黑素瘤(acral-lentiginous melanoma)、无黑色素性黑素瘤(amelanotic melanoma)、良性幼年黑素瘤、克劳德曼黑素瘤(Cloudman′smelanoma)、S91黑素瘤、哈-帕二氏黑素瘤、幼年黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、甲下黑素瘤(subungalmelanoma)和浅表扩散性黑素瘤(superficial spreading melanoma)。
术语“癌”是指由倾向于浸润周围组织并且引起转移的上皮细胞组成的恶性新生物。可利用本发明的环境影响剂治疗的癌包括但不限于例如腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡癌(acinous carcinoma)、囊性腺样癌(adenocystic carcinoma)、腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌(alveolar cell carcinoma)、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinomabasocellulare)、基底细胞样癌(basaloid carcinoma)、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管原癌(bronchogenic carcinoma)、髓样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶体癌(colloid carcinoma)、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌(carcinoma en cuirasse)、皮肤癌、柱状细胞癌(cylindrical carcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cellcarcinoma)、导管癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、鳞状细胞癌(epiermoidcarcinoma)、腺样基底细胞癌(carcinoma epitheliale adenoides)、外植癌(exophytic carcinoma)、溃疡性癌、硬癌、胶样癌(gelatiniformcarcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cellcarcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、颗粒细胞癌(granulosa cell carcinoma)、发母质癌(hair-matrix carcinoma)、多血癌、肝细胞癌、Hurthle细胞癌、胶样癌(hyaline carcinoma)、hypemephroidcarcinoma、中肾瘤II型(infantile embryonal carcinoma)、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、Krompecher肿瘤、Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌(lipomatous carcinoma)、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、髓样癌(carcinoma molle)、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、克鲁肯伯格瘤(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinomamucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans)、骨化性癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌、门脉周癌、浸润前癌(preinvasive carcinoma)、鳞状细胞癌、粉刺癌(pultaceous carcinoma)、肾细胞癌、贮备细胞癌、梭形细胞癌(carcinoma sarcomatodes)、Schneider癌、、硬癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌(solanoid carcinoma)、球状细胞癌(spheroidal cell carcinoma)、梭形细胞癌(spindle cell carcinoma)、髓样癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinomatelangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌和绒毛状癌。
一般而言，环境影响剂可用于预防性或治疗性治疗任何赘生物。在一个实施方案中，本发明的环境影响剂用于治疗实体瘤。在本发明的多个实施方案中，环境影响剂(例如，CoQ10)用于多种类型的皮肤癌(例如，鳞状细胞癌或基底细胞癌)、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌或骨癌的治疗。在一个实施方案中，环境影响剂例如CoQ10用于治疗皮肤肿瘤障碍包括但不限于鳞状细胞癌(包括SCCIS(原位)和更具侵袭性的鳞状细胞癌)、基底细胞癌(包括表皮、结节性和浸润性基底细胞癌)、黑素瘤和光线性角化病。然而，使用环境影响剂的治疗不限于上述类型的癌症。顺从利用环境影响剂的治疗的癌症的实例包括但不限于脑癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、膀胱癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、肉瘤、骨癌、胃癌和髓母细胞瘤。
可利用本发明的环境影响剂治疗的其他癌症包括例如何杰金氏病、非何杰金氏病、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰岛素瘤(malignant pancreatic insulanoma)、恶性类癌(malignantcarcinoid)、膀胱癌、恶化前皮肤病损(premalignant skin lesion)、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌(genitourinary tract cancer)、恶性高钙血症(malignant hypercalcemia)、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。在一个实施方案中，可利用环境影响剂例如CoQ10治疗的肿瘤障碍或癌症不是黑素瘤。
癌细胞的定义，如本文中所使用的，意欲包括通过无氧糖酵解(例如，糖酵解，然后在细胞溶胶中进行乳酸发酵)、有氧糖酵解或线粒体氧化磷酸化(例如，糖酵解，然后在线粒体中进行丙酮酸盐的氧化)或无氧糖酵解和有氧糖酵解的组合产生能量的癌细胞。在一个实施方案中，癌细胞主要通过无氧糖酵解产生能量(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的细胞的能量通过无氧糖酵解产生)。在一个实施方案中，癌细胞主要通过有氧糖酵解产生能量(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的细胞的能量通过无氧糖酵解产生)。癌细胞的定义，如本文中所使用的，也意欲包括癌细胞群体或包括通过无氧糖酵解产生能量的细胞和通过有氧糖酵解产生能量的细胞的癌细胞的混合物。在一个实施方案中，癌细胞群体主要包含通过无氧糖酵解产生能量(例如，群体中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的细胞通过无氧糖酵解产生能量)。在一个实施方案中，癌细胞群体主要包含通过有氧糖酵解产生能量的细胞(例如，群体中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的细胞)。
如本文中所使用的，短语“葡萄糖的无氧使用”或“无氧糖酵解”是指细胞通过糖酵解，然后在细胞溶胶中进行乳酸发酵来产生能量。例如，许多癌细胞通过无氧糖酵解产生能量。
如本文中所使用的，短语“有氧糖酵解”或“线粒体氧化磷酸化”是指细胞通过糖酵解，然后在线粒体中进行丙酮酸盐的氧化来产生能量。
如本文中所使用的，短语“能够阻断糖酵解的无氧使用和增加线粒体氧化磷酸化”是指环境影响剂(例如，表观代谢转变剂)诱导细胞的代谢状态从无氧糖酵解至有氧糖酵解或线粒体氧化磷酸化的转变或改化的能力。
本发明还提供了用于诊断人的侵袭性肿瘤障碍的方法，所述方法包括以比对于不太具有侵袭性或非侵袭性肿瘤障碍所使用的或选择的给药方案更低的选择的剂量给人施用环境影响剂，从而诊断侵袭性肿瘤障碍。在相关方面，本发明提供了用于诊断人的非侵袭性肿瘤障碍，包括以比对于侵袭性肿瘤障碍所使用的或选择的给药方案更高的选择的剂量给人施用环境影响剂，从而诊断非侵袭性肿瘤障碍。
如本文中所使用的，术语“侵袭性肿瘤障碍”是指牵涉快速生长的肿瘤的肿瘤障碍。侵袭性肿瘤障碍通常对治疗性治疗无反应或无明显反应。侵袭性肿瘤障碍的实例包括但不限于胰腺癌、肝细胞癌、尤因肉瘤、转移性乳腺癌、转移性黑素瘤、脑癌(星形细胞瘤，胶质母细胞瘤)，神经内分泌癌、结肠癌、肺癌、骨肉瘤、不依赖于雄激素的前列腺癌、卵巢癌和非何杰金氏淋巴瘤。
如本文中所使用的，术语“非侵袭性肿瘤障碍”是指牵涉缓慢生长的肿瘤的肿瘤障碍。非侵袭性肿瘤障碍通常有利地或适度地对治疗性治疗作出反应。非侵袭性肿瘤障碍的实例包括但不限于非转移性乳腺癌、雄激素依赖性前列腺癌、小细胞肺癌和急性淋巴细胞白血病。在一个实施方案中，非侵袭性肿瘤障碍包括为非侵袭性肿瘤障碍的任何肿瘤障碍。
I.环境影响剂
本发明提供了通过施用环境影响剂治疗癌症障碍的方法。“环境影响剂”(Env-influence)为以允许人疾病环境改变、重建回或维持正常或健康环境(从而导致正常状态)的有益方式影响或调节人的疾病环境。环境影响剂包括如下定义的多维细胞内分子(MIM)和表观代谢转变剂(Epi-shifter)。
1.多维细胞内分子(MIM)
术语“多维细胞内分子(MIM)”是由身体天然产生的和/或存在于人的至少一个细胞中的内源分子的分离形式或合成产生的形式。MIM的特征在于1个或多个、2个或更多个、3个或更多个或全部下列功能。MIM能够进入细胞，进入细胞细胞包括完全或部分进入细胞，只要所述分子的生物活性部分完全进入细胞即可。MIM能够在细胞内诱导信号转导和/或基因表达机制。MIM是多维的，因为所述分子具有治疗和载体例如药物递送作用。MIM也是多维的，因为所述分子在疾病状态中以一种方式作用并且在正常状态中以不同方式作用。例如，在CoQ-10的情况中，在VEGF存在的情况下给黑素瘤细胞施用CoQ-10导致降低的Bcl2水平，这反过来导致减小的黑素瘤细胞的致癌潜能。相反地，在正常成纤维细胞中，CoQ-10和VEFG的共施用对Bcl2的水平无作用。优选，MIM选择性作用于疾病状态的细胞，并且在正常状态的(匹配)细胞中基本上没有作用。优选，MIM选择性地使疾病状态的细胞在表型、代谢状态、基因型、mRNA/蛋白质表达水平等上与正常状态的(匹配)细胞更接近。
在一个实施方案中，MIM也是表观代谢转变剂。在另一个实施方案中，MIM不是表观代谢转变剂。本领域技术人员应理解，本发明的MIM也意欲包括两种或更多种内源分子的混合物，其中所述混合物的特征在于一种或多种上述功能。混合物中的内源分子以以使混合物用作MIM的比率存在。
MIM可以是基于脂质或基于非脂质的分子。MIM的实例包括但不限于CoQ10、乙酰Co-A、棕榈酰Co-A、L-肉毒碱、氨基酸例如酪氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸。在一个实施方案中，MIM为小分子。在本发明的一个实施方案中，MIM不是CoQ10。MIM可由本领域技术人员使用本文中详细描述的任何测定常规地鉴定。
在某些实施方案中，MIM包括维生素B家族中的化合物或包含维生素B家族中的化合物的核苷、单核苷酸或二核苷酸。维生素B家族中的化合物包括例如硫胺素(维生素B1)、尼克酸(也称为烟酸或维生素B3)或吡哆素(维生素B6)以及维生素原例如泛醇(维生素原B5)。在某些实施方案中，MIM选自硫胺素、尼克酸和吡哆素。包含维生素B家族的化合物的核苷、单核苷酸或二核苷酸包括例如包含腺嘌呤或尼克酸(烟酸)分子的核苷、单核苷酸或二核苷酸。在某些实施方案中，MIM选自腺苷、腺苷二磷酸(ADP)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD，其包含部分维生素B2和ADP)和烟酸二核苷酸。
在其他实施方案中，MIM包括氨基酸。氨基酸的实例包括例如酪氨酸(例如，L-酪氨酸)、半胱氨酸、苯丙氨酸(例如，L-苯丙氨酸)和丙氨酸。在某些实施方案中，氨基酸是苯丙氨酸或丙氨酸。在某些实施方案中，MIM包括氨基酸衍生物例如4-羟基苯丙酮酸酯或乙酰甘氨酸。
在某些实施方案中，MIM是葡萄糖类似物，例如，其中一个-OH或-CH2OH取代基已被-COOH、-COO-或-NH2取代基取代的葡萄糖分子。葡萄糖类似物的实例包括葡糖胺、葡糖醛酸、葡糖苷酸和葡糖醛酸酯。
在某些实施方案中，MIM选自式(I)的化合物：
Figure BPA00001497291600341
其中
n为0或1的整数；
R1、R2、R3和R4，当存在时，各自独立地选自氢和羟基或者R1和R2与它们所连接的碳一起形成羰基(C＝O)基团；
W为-COOH或-N(CH3)3 +；和
X为氢、负电荷或碱金属阳离子例如Na+或。
应理解，当n为0时，CHR3基与W取代基连接。
在某些实施方案中，W为-N(CH3)3 +。在某些实施方案中，所述MIM是肉毒碱例如L-肉毒碱。
在某些实施方案中，所述MIM为二羧酸。在某些实施方案中，W为-COOH。在某些实施方案中，R3为氢。在某些实施方案中，n为0。在某些实施方案中，R1和R2各自独立地是氢。在某些实施方案中，W为-COOH，R3为氢，n为0并且R1和R2各自独立地是氢。在某些实施方案中，n为1。在某些实施方案中，R1和R2与它们所连接的碳一起形成羰基(C＝O)基团。在某些实施方案中，R4为氢。在某些实施方案中，R4为羟基。在某些实施方案中，W为-COOH，R3为氢，n为1并且R1和R2与它们所连接的碳一起形成羰基(C＝O)基团。
在某些实施方案中，所述MIM是克雷布斯循环(Krebs Cycle)的中间产物，过量的MIM驱动克雷布斯循环朝向产生性氧化磷酸化。为MIM的示例性克雷布斯循环中间产物包括琥珀酸或琥珀酸盐、苹果酸或苹果酸盐以及α-酮戊二酸或α-酮戊二酸盐。
在某些实施方案中，所述MIM是CoQ10的结构单元，其具有下列结构：
Figure BPA00001497291600361
因此，CoQ10的结构单元包括但不限于苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸酯、乙酸苯酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯，香草酸，4-羟基苯甲酸酯、甲羟戊酸、法呢基、2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌以及其相应的酸或离子。在某些实施方案中，所述MIM选自苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸酯、乙酸苯酯和4-羟基苯甲酸酯。
(i)鉴定MIM的方法
本发明提供了用于鉴定MIM的方法。用于鉴定MIM的方法通常包括向细胞外源加入内源分子和评估该内源分子提供的对细胞的效应，例如，细胞微环境特征谱。以细胞mRNA、蛋白质、脂质和/或代谢水平的一个或多个评估对细胞的效应以鉴定细胞微环境特征谱的改变。在一个实施方案中，所述细胞是例如体外培养的细胞。在一个实施方案中，所述细胞存在于生物中。可以以单个浓度将所述内源分子加入细胞或可以以一系列浓度将其加入细胞。在一个实施方案中，将所述内源分子加入细胞以便细胞中内源分子的水平与对照未处理细胞中所述内源分子的水平相比较升高(例如，升高至1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或更高)。
可进一步评估诱导细胞的变化(如通过例如形态学、生理学和/或组成(例如，mRNA、蛋白质、脂质、代谢产物)的任一项或多项的改变所检测的)的分子以确定诱导的对细胞微环境特征谱的改变在患病细胞状态与正常细胞状态之间是否不同。可评估多种组织来源、细胞类型或疾病状态的细胞(例如，细胞培养系)以进行比较评价。例如，可将诱导的癌细胞的细胞微环境特征谱的变化与对非癌细胞或正常细胞诱导的变化相比较。被观察到诱导细胞的微环境特征谱的变化(例如，诱导细胞的形态学、生理学和/或组成例如mRNA、蛋白质、脂质或代谢产物的变化)和/或差异(例如，优选地)诱导相对于正常细胞患病细胞的微环境特征谱的变化的内源分子被鉴定为MIM。
本发明的MIM可以为基于脂质的MIM或基于非脂质的MIM。用于鉴定基于脂质的MIM的方法包括基于上述细胞的方法，其中向细胞中外源加入基于脂质的内源分子。在优选实施方案中，向细胞中加入基于脂质的内源分子，以便细胞中基于脂质的内源分子的水平升高。在一个实施方案中，基于脂质的内源分子的水平与未处理的对照细胞中的水平相比较增加至1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或更高。基于脂质的分子的配制和至细胞的递送视所测试的每一种分子的性质而定，但许多方法在本领域内是已知的。基于脂质的分子的配制和递送的实例包括但不限于利用共溶剂、载体分子、脂质体、分散体、悬浮剂、纳米颗粒分散体、乳化例如水包油或油包水乳剂、多相乳剂例如水包油-油包水乳剂、聚合物捕获和封装的增溶作用。基于脂质的MIM至细胞的递送可通过提取细胞脂质和利用本领域内已知的常规方法例如质谱法定量MIM来确认。
用于鉴定基于非脂质的MIM的方法包括上述基于细胞的方法，其中将基于非脂质的内源分子加入细胞。在优选实施方案中，将基于非脂质的内源分子加入内源细胞以便细胞中基于非脂质的内源分子的水平升高。在一个实施方案中，基于非脂质的内源分子的水平与未处理的对照细胞中的水平相比较升高至1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或更高。基于非脂质的分子的配制和至细胞的递送取决于每一种测试的分子的性质，但许多方法本领域内是已知的。基于非脂质的分子的配制和递送模式的实例包括但不限于利用共溶剂、载体分子的增溶作用、主动运输、聚合物捕获或吸附、聚合物接枝(polymergrafting)、脂质体封装和利用靶向递送系统的配制。基于非脂质的MIM至细胞的递送可通过提取细胞内容物和利用本领域内已知的常规方法例如质谱法定量MIM来确认。
2.表观代谢转变剂(Epi-shifter)
如本文中所使用的，“表观代谢转变剂”(epi-shifter)是调节从健康(或正常)状态至疾病状态以及反之亦然的代谢转变，从而维持或重建人的组织、器官、系统和/或宿主健康的分子(内源或外源的)。表观代谢转变剂能够实现组织微环境的标准化。例如，表观代谢转变剂包括当加入细胞或从细胞去除时能够影响细胞的微环境(例如，代谢状态)的任何分子。本领域技术人员应理解本发明的表观代谢转变剂也意在包括两种或更多种分子的混合物，其中所述混合物的特征在于上述功能的一个或多个功能。混合物中的分子以使混合物用作表观代谢转变剂的比率存在。表观代谢转变剂的实例包括但不限于coQ-10；维生素D3；ECM成分例如纤连蛋白；免疫调节剂例如TNFa或白细胞介素例如IL-5、IL-12、IL-23的任一个；血管生成因子；和细胞凋亡因子。
在某些实施方案中，所述表观代谢转变剂为酶，例如直接参与催化克雷布斯循环中的一个或多个反应或产生克雷布斯循环中间产物的酶，其的过量驱动克雷布斯循环。在某些实施方案中，所述酶为戊糖磷酸途径的非氧化相的酶，例如转醛醇酶或转酮醇酶。在其他实施方案中，所述酶为促进克雷布斯循环的组分酶或酶复合物例如合酶或连接酶。示例性酶包括琥珀酰CoA合酶(克雷布斯循环)或丙酮酸羧化酶(催化丙酮酸的可逆羧化以形成草酰乙酸盐(OAA)(克雷布斯循环的中间产物)的连接酶)。
在某些实施方案中，所述表观代谢转变剂为CoQ10的结构单元。CoQ10的结构单元包括但不限于苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸酯、乙酸苯酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯、香草酸、4-羟基苯甲酸酯、甲羟戊酸、法呢基、2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌以及其相应的酸或离子。在某些实施方案中，所述表观代谢转变剂选自苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸酯、乙酸苯酯和4-羟基苯甲酸酯。
在某些实施方案中，所述表观代谢转变剂是维生素B家族中的化合物。维生素B家族中的化合物包括例如核黄素(维生素B2)或其类似物。表观代谢转变剂也包括可在体内被代谢成任何内源MIM例如本文中描述的MIM的任何类似物或前体药物。
在一个实施方案中，所述表观代谢转变剂也是MIM。在一个实施方案中，所述表观代谢转变剂不是CoQ10。表观代谢转变剂可由本领域技术人员使用本文中详细描述的任何测定法来常规地鉴定。
(i)鉴定表观代谢转变剂的方法
表观代谢转变剂(epi-shifter)是能够调节细胞的代谢状态，例如诱导健康(或正常)状态至疾病状态的代谢转变和反之亦然，从而能够在人中维持或建立细胞、组织、器官、系统和/或宿主健康的分子。本发明的表观代谢转变剂从而在患病状态的诊断评估中具有效用。本发明的表观代谢转变剂还在治疗应用中具有效用，其中表观代谢转变剂的应用或施用(或利用其他治疗性分子调节表观代谢转变剂)实现了组织微环境和疾病状态的正常化。
表观代谢转变剂的鉴定通常包括建立展示差异疾病状态、进展或侵袭性的一组细胞或组织的代谢产物、脂质、蛋白质或RNA的分子特征谱(以单个特征谱或组合形式存在)。根据特征谱对于其水平的变化(例如，升高的或下降的水平)与疾病状态、进展或侵袭性相关的分子被鉴定为潜在的表观代谢转变剂。
在一个实施方案中，表观代谢转变剂也为MIM。可通过使用本领域内已知的许多常规技术和通过使用本文中描述的任何方法评估潜在的表观代谢转变剂在外源加入细胞后进入细胞的能力。例如，潜在的表观代谢转变剂至细胞内的进入可通过提取细胞内容物和通过本领域内已知的常规方法例如质谱法定量潜在的表观代谢转变剂来确认。能够进入细胞的潜在的表观代谢转变剂从而被鉴定为MIM。
为了鉴定表观代谢转变剂，随后评估潜在的表观代谢转变剂转变细胞的代谢状态的能力。通过将潜在的表观代谢转变剂引入(例如，外源加入)细胞，然后监控细胞中如下的一项或多项：基因表达的变化(例如，mRNA或蛋白质表达的变化)、脂质或代谢产物水平的浓度变化、生物能分子水平的变化、细胞能量的变化和/或线粒体功能或数量的变化。能够转变细胞微环境的代谢状态的潜在的表观代谢转变剂可由本领域技术人员利用本文中详细描述的任何测定法来常规鉴定。还评估了潜在的表观代谢转变剂将患病细胞的代谢状态向正常健康状态转变的能力(或相反地，将正常细胞的代谢状态向患病细胞转变的能力)。能够将患病细胞的代谢状态向正常健康状态转变(或将健康正常细胞的代谢状态向患病状态转变)的潜在的表观代谢转变剂从而被鉴定为表观代谢转变剂。在优选实施方案中，所述表观代谢转变剂对正常细胞的健康和/或生长没有负面影响。
本发明的表观代谢转变剂包括但不限于小分子代谢产物、基于脂质的分子以及蛋白质和RNA。为了在小分子内源代谢产物的种类中鉴定表观代谢转变剂，建立展示差异疾病状态、进展或侵袭性的一组细胞或组织的脂质特征谱。通过从细胞或组织提取代谢产物，然后使用本领域技术人员已知的常规方法(包括液相色谱偶联质谱法或气相色谱偶联质谱法)鉴定和定量代谢产物测定每一种细胞或组织的代谢产物特征谱。对于其水平的改变(例如，升高或降低的水平)与疾病状态、进展或侵袭性相关的代谢产物被鉴定为潜在的表观代谢转变剂。
为了在基于内源性脂质的分子的种类中鉴定表观代谢转变剂，建立展示差异疾病状态、进展或侵袭性的一组细胞或组织的脂质特征谱。通过使用脂质提取法，然后使用对于本领域技术人员来说是已知的常规方法(包括例如，液相色谱偶联质谱法或气相色谱偶联质谱法)鉴定和定量脂质来测定每一种细胞或组织的脂质特征谱。对于其水平的改变(例如，大量或痕量水平的升高或降低)与疾病状态、进展或侵袭性相关的脂质被鉴定为潜在的表观代谢转变剂。
为了在蛋白质和RNA的种类中鉴定表观代谢转变剂，建立展示差异疾病状态、进展或侵袭性的一组细胞或组织的基因表达特征谱。利用标准蛋白质组学、mRNA阵列或基因组阵列方法，例如本文中详细描述的方法在mRNA和/或蛋白质水平上测定每一种细胞或组织的表达特征谱。对于其表达的改变(例如在mRNA或蛋白质水平上表达的增加或减少)与疾病状态、进展或侵袭性相关的基因被鉴定为潜在的表观代谢转变剂。
一旦建立上述分子的特征谱(例如，对于可溶性代谢产物、基于脂质的分子、蛋白质、RNA或组合物的其他生物学种类)，就可进行细胞和生物化学途径分析以阐明细胞环境中已鉴定的潜在的表观代谢转变剂之间的已知联系。通过这样的细胞和/或生物化学途径分析获得的该信息可用于分类所述途径和潜在的表观代谢转变剂。
可由本领域技术人员使用本领域内已知或本文中详细描述的许多测定法来评估和确认表观代谢转变剂调节疾病状态的效用。可通过表观代谢转变剂至细胞或至生物体的直接外源递送来评估表观代谢转变剂调节疾病状态的效用。可选地可通过直接调节表观代谢转变剂(例如，表观代谢转变剂的水平或活性)的分子的产生来评估表观代谢转变剂调节疾病状态的效用。还可通过经由调控位于与所述表观代谢转变剂相同的途径中的其他分子例如基因(例如，以RNA或蛋白质水平被调控的)间接调节表观代谢转变剂(例如，表观代谢转变剂的水平或活性)的分子的产生来评估表观代谢转变剂调节疾病状态的效用。，
本文中描述的表观代谢法促进存在于细胞微环境中并且其水平通过基于遗传学、mRNA或蛋白质的机制来感知和控制的内源分子的鉴定。正常细胞中发现的受本发明的表观代谢转变剂触发的调控反应途径可在失调的(misregulated)或患病的细胞环境中提供治疗价值。此外，本文中描述的表观代谢途径鉴定了可提供用于临床患者选择、疾病诊断试剂盒的诊断指示或作为预后指标的表观代谢转变剂。
II.用于鉴定MIM/表观代谢转变剂的测定法
用于分离和鉴定目的分子和化合物的本发明的技术和方法包括但不限于：液相色谱法(LC)、高压液相色谱法(HPLC)、质量光谱法(MS)、气相色谱法(GC)、液相色谱/质谱法(LC-MS)、气相色谱/质谱法(GC-MS)、核磁共振(NMR)、磁共振成像(MRI)、傅里叶变换红外法(Fourier Transform InfraRed)(FT-IR)和电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry)(ICP-MS)。还应理解，质谱技术包括但不限于扇形磁场和双聚焦仪、传输四极子仪(transmission quadrapole instrument)、四极离子阱仪(quadrupoleion-trap instrument)、飞行时间仪(time-of-flight instrument)(TOF)、傅里叶变换离子回旋共振仪(Fourier transform ion cyclotron resonanceinstrument)(FT-MS)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的使用。
生物能分子水平的定量：
环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)可利用候选表观代谢转变剂所施用至的细胞的细胞生物能分子水平(例如，ATP、丙酮酸盐、ADP、NADH、NAD、NADPH、NADP、乙酰CoA、FADH2)的变化来鉴定。生物能分子水平的示例性测定使用基于比色、荧光和/或生物发光的方法。下面提供此类测定法的实例。
利用本领域内已知的许多测定法和系统测量细胞内的ATP水平。例如，在一个系统中，从裂解的细胞释放的细胞质ATP与萤光素和荧光素酶反应以产生光。利用生物发光计测量该生物发光，并且可计算裂解细胞的细胞内ATP浓度(EnzyLightTM ATP Assay试剂盒(EATP-100)，BioAssay Systems，Hayward，CA)。在另一个系统中，例如，通过生物发光计算ATP和其脱磷酸化形式；在计算ATP水平后，将ADP转化成ATP，随后使用相同的荧光素酶系统(ApoSENSORTM ADP/ATP Ratio Assay试剂盒，BioVision Inc.，Mountain View，CA)进行检测和计算。
丙酮酸盐是细胞代谢途径中的重要中间产物。取决于细胞的代谢状态，丙酮酸盐可通过糖异生作用转化成碳水化合物，通过乙酰CoA转化成脂肪酸或被代谢，或转化成丙酮酸或乙醇。因此丙酮酸盐水平的检测提供了细胞样品的代谢活性和状态的量度。例如，一种检测丙酮酸盐的测定法使用比色法和荧光法检测不同范围内的丙酮酸盐浓度(EnzyChromTM Pyruvate Assay试剂盒(Cat#EPYR-100)，BioAssaySystems，Hayward，CA)。
环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)可影响由细胞的线粒体进行的氧化磷酸化的过程，该过程牵涉生物能分子在细胞中的产生和维持。除了直接检测细胞培养物和样品中细胞能的变化的测定法(下文中描述的)外，存在检测和定量化合物对细胞中线粒体的分离酶和复合物的效应的测定。例如，MT-OXC MitoToxTM CompleteOXPHOS活性测定法(MitoSciences Inc.，Eugene，OR)可检测和定量直接用于从线粒体提取的复合物I至V的化合物的效应。用于检测和定量对单个线粒体复合物例如NADH脱氢酶(复合物I)、细胞色素c氧化酶(复合物IV)和ATP合酶(复合物V)的效应的测定法也是可获得的(MitoSciences Inc.，Eugene，OR)。
细胞能量的测量：
环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)还可通过细胞能量的的变化来鉴定。一个测量细胞能量的实例是分子氧的消耗和/或细胞培养的培养基的pH的变化的实时测量。例如，潜在的表观代谢转变剂调节细胞的代谢状态的能力可使用例如XF24分析仪(Seahorse，Inc.)来进行分析。该技术允许实时检测细胞单层的氧和pH的变化以估计细胞微环境的生物能。XF24分析仪测量和比较氧消耗(OCR)的速率(其为有氧代谢的量度)和细胞外酸化(ECAR)(其为糖酵解的量度)，两者都为细胞能量的至关重要的指示剂。
氧化磷酸化和线粒体功能的测量
氧化磷酸化是籍以通过营养化合物的氧化产生ATP的过程，该过程在真核生物中通过嵌入线粒体的膜中的蛋白质复合物进行。作为大多数生物的细胞中ATP的主要来源，氧化磷酸化活性的变化可强有力地改变细胞内的代谢和能量平衡。在本发明的某些实施方案中，可通过它们对氧化磷酸化的效应来检测和/或鉴定环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。在某些实施方案中，可通过它们对氧化磷酸化的特定方面(包括但不限于电子传递链和ATP合酶)的效应来检测和/或鉴定环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。
进行牵涉氧化磷酸化的过程的线粒体的嵌入膜的蛋白质复合物执行特殊任务并且被编号为I、II、III和IV。这些复合物与跨内膜ATP合酶(也称为复合物V)一起是参与氧化磷酸化过程的至关重要的实体。除了可检查环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)对线粒体总体功能和具体地氧化磷酸化过程的效应的测定法外，可用于检查表观代谢转变剂对与其他复合物分离的单个复合物的效应的测定是可获得的。
复合物I，也称为NADH-辅酶Q氧化还原酶类或NADH脱氢酶是电子传递链中的第一蛋白质。在某些实施方案中，可检测和定量表观代谢转变剂对NAD+的产生的效应。例如，可在96孔板中从样品免疫捕获复合物；NADH至NAD+的氧化与染料分子的还原同时发生，所述染料分子在450nM具有增加的吸光度(复合物I酶活性微量板测定试剂盒，MitoSciences Inc.，Eugene，OR)。
复合物IV，也称为细胞色素c氧化酶(COX)，是电子传递链中的最后一个蛋白质。在某些实施方案中，可检测和定量表观代谢转变剂对细胞色素c的氧化和通过复合物IV进行的氧至水的还原的效应。例如，可在微孔板中免疫捕获COX，利用比色测定法(复合物I酶活性微量板测定试剂盒，MitoSciences Inc.，Eugene，OR)测量COX的氧化。
氧化磷酸化过程中的末端酶为ATP合酶(复合物V)，其使用通过其他复合物产生的质子梯度为从ADP合成ATP提供动力。在某些实施方案中，可检测和定量表观代谢转变剂对ATP合酶的活性的影响。例如，可对已被免疫捕获在微量板孔中的ATP合酶测量ATP合酶的活性和样品中ATP合酶的量。所述酶还可在某些条件下用作ATP酶，从而在该测定中对于ATP合酶活性，通过检测NADH至NAD+的同时氧化测量来测量ATP被还原成ADP的速率。使用针对ATP酶的标记的抗体(ATP合酶双重(活性+数量)微量板测定试剂盒，MitoSciencesInc.，Eugene，OR)计算ATP的量。用于氧化磷酸化的另外的测定包括测试对复合物II和III的活性的影响的测定法。例如，MT-OXCMitoToxTM Complete OXPHOS系统(MitoSciences Inc.，Eugene，OR)可用于评估化合物对复合物II和III以及复合物I、IV和V的效应，以提供关于化合物对整个氧化磷酸化系统的效应的数据。
如上所述，可使用探针就氧耗量和细胞培养基的pH的变化进行完整细胞样品的实时观察。细胞能量的这些测定提供了线粒体功能和潜在的环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)对样品的细胞内的线粒体的活性的影响的全面纵览。
环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)还可影响线粒体透性转变(MPT)，其中线粒体膜因线粒体透性转变孔(MPTP)的形成而经历通透性的增加的现象。线粒体通透性的增加可导致线粒体肿胀，不能进行氧化磷酸化和ATP产生并且导致细胞死亡。MPT可参与细胞凋亡的诱导。(参见，例如，Halestrap，A.P.，Biochem.Soc.Trans.34：232-237(2006)和Lena，A.等人Journal of Translational Med.7：13-26(2009)，通过引用将其整体并入本文)。
在某些实施方案中，测量环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)对MPT和MPTP的形成、中止和/或效应的作用的检测和定量。例如，测定法可通过使用专门的染料分子(钙黄绿素)检测MPT，所述MPT位于线粒体的内膜和其他细胞溶胶区室中。另一种分子CoCl2的施用用于猝灭细胞溶胶中的钙黄绿素染料的荧光。然而CoCl2不能进入线粒体的内部，从而除非MPT已发生并且CoCl2可通过MPTP进入线粒体的内部，否则线粒体中的钙黄绿素荧光不被猝灭。线粒体特异性荧光的消失表示MPT已发生。流式细胞术可用于评估细胞和细胞器荧光(MitoProbeTM Transition Pore Assay试剂盒，MolecularProbes，Eugene，OR)。其他测定法利用荧光显微镜评估实验结果(Image-iTTM LIVE线粒体Transition Pore Assay试剂盒，MolecularProbes，Eugene，OR)。
细胞增殖和炎症的测量
在本发明的某些实施方案中，可通过它们对与细胞增殖和/或炎症相关的分子的产生或活性鉴定和评估环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。此类分子包括但不限于细胞因子、生长因子、激素、细胞外基质的成分、趋化因子、神经肽类、神经递质、神经营养素和参与细胞信号转导的其他分子，以及细胞内分子例如参与信号转导的细胞内分子。
血管内皮生长因子(VEGF)是具有有效的血管生成、形成血管和促有丝分裂性质的生长因子。VEGF刺激内皮通透性和肿胀，并且VEGF活性牵涉许多疾病和障碍，包括类风湿性关节炎、转移癌、年龄相关性黄斑退化症和糖尿病视网膜病变。
在本发明的某些实施方案中，可通过其对VEGF的产生的效应来鉴定和表征环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。例如，维持在低氧条件或模拟酸中毒的条件中的细胞可展示增加的VEGF产生。可使用ELISA或其他基于抗体的测定法，利用可获得的抗VEGF抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)测定分泌至培养中的VEGF。在本发明的某些实施方案中，可基于其对细胞对VEGF的反应性的效应和/或基于其对VEGF受体的表达或活性的效应鉴定和/或表征表观代谢转变剂。
健康免疫系统功能以及自身免疫性疾病中所牵涉的肿瘤坏死因子(TNF)是炎症和免疫系统活化的至关重要的介体。在本发明的某些实施方案中，表观代谢转变剂可通过其对TNF的产生或活性的效应来鉴定和表征。例如，可通过ELISA和本领域内已知的其他基于抗体的测定法来定量由培养细胞产生的并且分泌至培养基中的TNF。此外，在某些实施方案中，可通过其对TNF的受体的表达的效应来鉴定和表征环境影响剂(Human TNF RI Duoset，R&D Systems，Minneapolis，MN)。
细胞外基质(ECM)的成分在细胞和组织的结构中和在信号转导过程中起着重要作用。例如，潜在的转化生长因子β结合蛋白为在ECM中产生转化生长因子β(TGFβ)的储库的ECM成分。基质结合的TGFβ随后可在基质重塑过程中被释放并且可对附近的细胞发挥生长因子效应(Dallas，S.Methods in Mol.Biol.139：231-243(2000))。
在某些实施方案中，可通过其对ECM的培养细胞产生的作用鉴定或表征环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。研究者已开发了可籍以研究和定量ECM的细胞产生以及ECM的组成的技术。例如，可通过将在温育之前将细胞包埋在水凝胶中来评估ECM的细胞合成。在细胞收获和水凝胶降解后对由细胞产生的ECM进行生物化学和其他分析(Strehin，I.和Elisseeff，J.Methods in Mol.Bio.522：349-362(2009))。
在某些实施方案中，可鉴定或表征环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)对生物体中ECM或其成分之一的产生、状态或缺乏的效应。已开发了用于产生条件敲除(KO)小鼠的技术，所述技术允许只在不连续类型的细胞中或在发育的某些阶段上敲除特定ECM基因(Brancaccio，M.等人Methods in Mol Bio.522：15-50(2009))。从而可在特定组织中或在发育的特定阶段上评估表观代谢转变剂或潜在的表观代谢转变剂的应用或施用对特定ECM成分的活性或不存在的效应。
质膜完整性和细胞死亡的测量
可通过细胞样品的质膜完整性的变化和/或通过经历细胞凋亡、坏死或显示增加的或减少的细胞死亡概率的细胞变化的细胞数量或百分比的变化鉴定环境影响剂(例如，MIM或表观代谢转变剂)。
用于乳酸脱氢酶(LDH)的测定法可提供细胞状态和损伤水平的测量。LDH是稳定的和相对丰富的细胞质酶。当质膜失去物理完整性时，LDH逸出至细胞外区室。更高浓度的LDH与更高水平的质膜损伤和细胞死亡相关。LDH测定法的实例包括使用比色系统检测和定量样品中的LDH水平的测定法，其中四唑盐的还原形式通过LDH酶(QuantiChromTM Lactate Dehydrogenase试剂盒(DLDH-100)，BioAssay Systems，Hayward，CA；LDH Cytotoxicity Detection试剂盒，Clontech，Mountain View，CA)的活性产生。
细胞凋亡是可具有多种不同起始事件的程序化细胞死亡的过程。许多测定法可检测经历细胞凋亡的速度和/或数量的变化。一种用于检测和定量细胞凋亡的测定法是半胱天冬酶(capase)测定法。半胱天冬酶是在细胞凋亡过程中通过蛋白水解切割激活的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。检测激活的半胱天冬酶的测定法的实例包括(OncoImmunin，Inc.，Gaithersburg，MD)和Caspase-
Figure BPA00001497291600492
3/7测定系统(Promega Corp.，Madison，WI)。可检测比较样品中细胞凋亡和经历细胞凋亡的细胞的百分比或数量的变化的另外的测定法包括TUNEL/DNA片段化测定。此类测定检测在细胞凋亡的执行阶段由核酸酶产生的180至200个碱基对的DNA片段。示例性TUNEL/DNA片段化测定包括In Situ Cell Death Detection试剂盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)和DeadEndTM比色及荧光TUNEL系统(Promega Corp.，Madison，WI)。
某些细胞凋亡测定法检测和定量与细胞凋亡和/或非细胞凋亡状态相关的蛋白质。例如，MultiTox-Fluor Multiplex细胞毒性测定法(Promega Corp.，Madison，WI)利用单一底物荧光系统检测和定量特异于活细胞和死亡细胞的蛋白酶，从而提供细胞或组织样品中活细胞对已经历细胞凋亡的细胞的比率。
可获得用于检测和定量细胞凋亡的另外的测定法包括检测细胞通透性的测定法(例如，APOPercentageTM APOPTOSIS测定，Biocolor，UK)和用于钙磷脂结合蛋白V的测定法(例如，Annexin V-BiotinApoptosis Detection试剂盒，BioVision Inc.，Mountain View，CA)。
III.本发明的用途
本发明提供了用于诊断肿瘤障碍的方法。可将本发明的方法与由本领域技术人员用于预后肿瘤障碍的复发和/或正在进行肿瘤障碍治疗的受试者的存活的任何其他方法结合实施。例如，可结合获自受试者的样品的形态学或细胞学分析实施本发明的方法。细胞学方法可包括任何其他分子标志(其本身、与其他标志结合和/或与Sshc标志结合)的免疫组织化学或免疫荧光检测(以及在适当的情况下定量)。其他方法可包括通过原位PCR或通过提取组织，然后通过实时PCR定量其他标志进行的其他标志的检测。PCR定义为聚合酶链式反应。
还提供了用于评估治疗方案例如化学疗法、放射疗法、辐照疗法、手术、激素疗法或任何其他治疗方法用于治疗受试者的肿瘤障碍的功效的方法。在这些方法中，评估一对样品(未经历治疗方案的第一样品和经历至少一部分治疗方案的第二样品)中标志的量。
本发明还提供了用于确定肿瘤障碍是否具有侵袭性的方法。所述方法包括测定存在于细胞中的标志的量并且将该量与存在于对照样品中的标志的对照量(定义于定义中)相比较，从而确定肿瘤障碍是否具有侵袭性。
本发明的方法还可用于选择能够调节即减弱肿瘤障碍的侵袭性的化合物。在该方法中，将癌细胞与测试化合物接触，测定所述测试化合物在癌细胞中调节本发明的标志的表达和/或活性的能力，从而选择能够调节肿瘤障碍的侵袭性的化合物。
通过使用本文中描述的方法，可筛选许多分子，特别地包括小至足以能够穿过细胞膜的分子，以鉴定调节例如增加本发明的标志的表达和/或活性的分子。可给受试者提供所鉴定的化合物以抑制肿瘤障碍在受试者中的侵袭性，从而防止受试者的肿瘤障碍的复发，或治疗受试者的肿瘤障碍。
IV.本发明的标志
本发明涉及列于表2-4和6-29中的标志(在下文中称为“生物标志”、“标志”或“本发明的标志”)。本发明提供了由标志编码的或相应于标志(在下文中分别称为“标志核酸”和“标志蛋白质”)的核酸和蛋白质。此类标志在筛查肿瘤障碍的存在中，在评估肿瘤障碍的侵袭性和转移潜能中，在评估受试者是否患有肿瘤障碍中，鉴定用于治疗肿瘤障碍的组合物中，评估用于环境影响剂治疗肿瘤障碍的功效中，监测肿瘤障碍的进展中，预后肿瘤障碍的侵袭性中，预后患有肿瘤障碍的受试者的存活中，预后肿瘤障碍的复发中和预后受试者是否对发生肿瘤障碍易感中是特别有用的。
在本发明的某些实施方案中，将一个或多个生物标志与本发明的方法组合使用。如本文中所使用的，术语“一个或多个生物标志”意欲表示测定公开的生物标志的列表中的至少一个生物标志，和在多个实施方案中，可测定列表中所示的一个以上的生物标志，例如可测定2、3、4、5、10、20、30、40、50、50个以上或全部生物标志。
“标志”是其在组织或细胞中相对于其在正常或健康组织或细胞中的表达水平改变的表达水平与疾病状态例如肿瘤障碍相关的基因。“标志核酸”是由本发明的标志编码的核酸或相应于所述标志的核酸(例如，mRNA、cDNA)。此类标志核酸包括包含SEQ ID NO(nts)的任一个的完整或部分序列或这样的核酸的互补序列的DNA(例如，cDNA)。所述标志核酸还包括包含任何SEQ ID NO(nts)的完整或部分序列或此类序列的补体的RNA，其中所有胸苷残基被尿苷残基替代。“标志蛋白”是由本发明的标志编码的或相应于所述标志的蛋白质。标志蛋白包含SEQ ID NO(AA)的任一个的完整或部分序列。术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。
“与细胞凋亡相关的标志”是参与细胞凋亡途径的标志。例如，与细胞凋亡相关的标志包括但不限于表6A、6B、7-9、25和28中所列的标志。具体地，与细胞凋相关的标志包括Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA和cMyc。
“与氧化性应激相关的标志”是参与氧化性氧化性应激途径的标志。例如，与氧化性应激相关的标志包括但不限于表10-12中所列的标志。具体地，与氧化性应激相关的标志包括嗜中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A和超氧化物歧化酶2(线粒体)。
“与热激相关的标志”是参与热激的标志。例如，与热激相关的标志包括但不限于表13中所列的标志。
“与血管生成相关的标志”是参与血管生成途径的标志。例如，与血管生成相关的标志包括但不限于表24和27中所列的标志。
“肿瘤障碍相关的”体液是当在患者的身体中时接触或通过肿瘤细胞，或者从肿瘤细胞脱落的细胞或蛋白质能够通过进入其中的液体。示例性肿瘤障碍相关体液包括血液(例如，全血、血清、从其除去血小板的血液)，并且更详细地描述于下文中。许多肿瘤障碍相关体液可在其中具有肿瘤细胞，特别地当所述细胞转移时。可包含肿瘤细胞的含细胞液体包括但不限于全血、已从其除去血小板的血液、淋巴、前列腺液、尿和精液。
标志的表达的“正常”水平是标志在未患有肿瘤障碍的人受试者或患者的细胞中的表达水平。
标志的“过表达”或“更高的表达水平”是指测试样品中的表达水平，所述表达水平高于用于评估表达的测试的标准差，并且优选为所述标志在对照样品(例如，来自未患有所述标志相关疾病即肿瘤障碍的健康受试者的样品)中的表达水平、优选所述标志在几个对照样品中的平均表达水平的至少2倍，更优选3、4、5、6、7、8、9、或10倍。
标志的“更低的表达水平”是指测试样品中的表达水平，所述表达水平低于所述标志在对照样品(例如，来自未患有所述标志相关疾病即肿瘤障碍的健康受试者的样品)中的表达水平、优选所述标志在几个对照样品中的平均表达水平的至少1/2，更优选1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10。
“转录的多核苷酸”或“核苷酸转录物”是与通过本发明的标志的转录和所述RNA转录物的正常转录后加工(例如剪接)(如果有的话)以及RNA转录物的逆转录产生的成熟mRNA的全长或部分互补或同源的多核苷酸(例如mRNA、hnRNA、cDNA或此类RNA或cDNA的类似物)。
Figure BPA00001497291600531
互补”是指两个核酸链的区域之间或相同核酸链的两个区域之间的序列互补的广义概念。已知第一核酸区域的腺嘌呤残基能够与与所述第一区域反向平行的第二核酸区域的残基(如果所述残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶的话)形成特定氢键(“碱基配对”)。类似地，已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够与与所述第一链反向平行的第二核酸链的残基(如果所述残基是鸟嘌呤的话)形成特定氢键(“碱基配对”)。如果当核酸的第一区域与相同或不同核酸的第二区域以反向平行方式排列时，第一区域的至少一个核苷酸残基能够与第二区域的残基碱基配对的话，这两个核酸的所述区域互补。优选，所述第一区域包含第一部分并且所述第二区域包含第二部分，其中，当所述第一和第二部分以反向平行方式排列时，所述第一部分的至少约50％，优选至少约75％，至少约90％或至少约95％的核苷酸残基能够与所述第二部分中的核苷酸碱基配对。更优选，所述第一部分的所有核苷酸残基能够与所述第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
如本文中所使用的“同源的”，是指相同核酸链的两个区域之间或两个不同核酸链的区域之间的核苷酸序列相似性。当两个区域中的核苷酸残基被相同核苷酸残基占据时，则所述区域在该位置上同源。如果每一个区域的至少一个核苷酸残基位置被相同残基占据，则第一区域与第二区域同源。两个区域之间的同源性表示为两个区域的被相同核苷酸残基占据的核苷酸位置的比例。例如，具有核苷酸序列5′-ATTGCC-3′的区域与具有核苷酸序列5′-TATGGC-3′的区域共有50％的同源性。优选，所述第一区域包含第一部分并且所述第二区域包含第二区域，其中，每一个部分的至少约50％，优选至少约75％，至少约90％或至少约95％的核苷酸残基位置被相同核苷酸残基占据。更优选，每一个部分的全部核苷酸残基部分被相同核苷酸残基占据。
“本发明的蛋白质”包括标志蛋白和它们的片段；变异标志蛋白和它们的片段；包含标志或变异标志蛋白的至少15个氨基酸区段的肽和多肽；和包含标志或变异标志蛋白或者标志或变异标志蛋白的至少15个氨基酸的区段的融合蛋白。
本发明还提供了与本发明的标志蛋白或所述标志蛋白的片段特异性结合的抗体、抗体衍生物和抗体片段。除非在其中另外指出，否则术语“抗体”广义地包括天然存在的抗体形式(例如，IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体例如单链抗体、嵌合抗体和人源化抗体以及多特异性抗体，以及所有上述抗体的片段和衍生物，所述片段和衍生物具有至少一个抗原结合位点。抗体衍生物可包括缀合至抗体的蛋白质或化学部分。
在某些实施方案中，所述生物标志参与细胞凋亡，例如，促细胞凋亡或抗细胞凋亡。在某些实施方案中，所述生物标志是细胞凋亡相关基因。细胞凋亡相关基因包括例如表24中所列的基因。在某些实施方案中，所述生物标志是转录因子。在某些实施方案中，所述生物标志参与氧化性应激。在某些实施方案中，所述生物标志是半胱天冬酶调节剂例如半胱天冬酶激活剂或半胱天冬酶抑制剂。在某些实施方案中，所述生物标志参与细胞生长。在其他实施方案中，所述生物标志参与细胞周期调控和DNA合成。在其他实施方案中，所述生物标志参与糖酵解和代谢，例如，戊糖磷酸途径和线粒体氧化磷酸化。在其他实施方案中，所述生物标志参与分子运输。在某些实施方案中，所述生物标志参与细胞信号转导。在其他实施方案中，所述生物标志参与14-3-3介导的信号转导。在其他实施方案中，所述生物标志参与神经酰胺信号转导。在某些实施方案中，所述生物标志参与线粒体蛋白质运输。在其他实施方案中，所述生物标志参与脂肪细胞分化。在其他实施方案中，所述生物标志参与脂肪和胆固醇代谢。在其他实施方案中，所述生物标志参与血管生成。在某些实施方案中，所述生物标志参与膜流动性。在其他实施方案中，所述生物标志参与免疫调节。在其他实施方案中，所述生物标志牵涉基因组稳定性。在其他实施方案中，所述生物标志牵涉细胞外基质蛋白质完整性。在某些实施方案中，所述生物标志参与膜运输。在其他实施方案中，所述生物标志参与氧化控制。在某些实施方案中，所述生物标志参与戊糖磷酸途径。在某些实施方案中，所述生物标志是肿瘤坏死因子受体超家族的成员。在某些实施方案中，所述生物标志参与花生四烯酸代谢。在某些实施方案中，所述生物标志参与上文中所示的途径的两个或多个途径。在某些实施方案中，所述生物标志参与上文中所示的途径的3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个途径等。在某些实施方案中，将超过一个的生物标志与本发明结合使用。在这些实施方案中，所述生物标志可各自单个地参与上文中所示的途径的一个或多个，2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个途径等。
在某些实施方案中，当特定列出的基因与超过一种处理条件(例如在处理后不同的时间段上，或利用不同浓度的潜在环境影响剂(例如，CoQ10)的处理)相关时，该特定基因的倍数变化是指最长的记录的处理时间。在其他实施方案中，该特定基因的倍数变化是指最短的记录的处理时间。在其他实施方案中，该特定基因的倍数变化是指利用最高浓度的环境影响剂(例如，CoQ10)的处理。在其他实施方案中，该特定基因的倍数变化是指利用最低浓度的环境影响剂(例如，CoQ10)的处理。在其他实施方案中，该特定基因的倍数变化是指以与所述环境影响剂的治疗效应一致的方式进行的调节(例如，上调或下调)。
在某些实施方案中，正或负倍数改变是指表2-4和6-29的任一个中所列的任何基因的倍数改变。在某些实施方案中，正或负倍数改变是指除了所述表之一(例如，除了表1，除了表5等)外的表2-4和6-29的任一个中所列的任何基因的倍数改变。在某些实施方案中，正或负倍数改变是指除了表的任何2个表(例如，除了表1和5，除了表2和16，等)外的表2-4和6-29的任何表中所列的任何基因的正或负倍数改变。在某些实施方案中，正或负倍数改变是指除了表的任何3个表外、或除了表的任何4个表外或除了表的任何5、6、7、8、9、10或更多个表外的表2-4和6-29的任何表中所列的任何基因的正或负倍数改变。在某些实施方案中，正或负倍数改变是指除表1、5、9、12外的表2-4和6-29的任何表中所列的任何基因的正或负倍数改变。
如本文中所使用的，“正倍数改变”是指相关表中所列的基因的“上调”或“(表达的)增加”。
如本文中所使用的，“负倍数改变”是指相关表中所列的基因的“下调”或“(表达的)减少”。
本发明的不同方面更详细地描述于下列小节中。
1.分离的核酸分子
本发明的一个方面涉及分离的核酸分子，包括编码标志蛋白或其部分的核酸。本发明的分离的核酸还包括足以用作杂交探针以鉴定标志核酸分子和标志核酸分子的片段的核酸分子，例如适合用作用于扩增或突变标志核酸分子的PCR引物的那些核酸分子。如本文中所使用的，术语“核酸分子”意欲包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。所述核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。
“分离的”核酸分子是与存在于所述核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。在一个实施方案中，“分离的”核酸分子不含在所述核酸所源自的生物体的基因组DNA中天然地侧翼连接所述核酸(即，位于核酸的5′和3′末端的序列)的序列(优选蛋白质编码序列)。例如，在不同实施方案中，所述分离的核酸分子可包含少于约5kB、4kB、3kB、2kB、1kB、0.5kB或0.1kB的核苷酸序列，所述核苷酸序列在所述核酸所源自的细胞的基因组DNA中天然侧翼连接所述核酸分子。在另一个实施方案中，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，当通过重组技术产生时，可基本上不含其他细胞材料，或培养基，或当通过化学合成时，基本上不含化学药品前体或其他化学药品。基本上不含细胞材料的核酸分子包括具有少于约30％、20％、10％或5％的异源核酸(在本文中也称为“污染核酸”)的制剂。
本发明的核酸分子可使用本文中描述的标准分子生物学技术和数据库记录中的序列信息来分离。通过使用此类核酸序列的全长或部分，可使用标准杂交和克隆技术(例如，如Sambrook等人编辑，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中所描述的)分离本发明的核酸分子。
可按照标准PCR扩增技术，使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和适当的寡核苷酸引物扩增本发明的核酸分子。将所扩增的核酸克隆进入适当的载体并且通过DNA序列分析进行表征。此外，相应于本发明的核酸分子的全长或部分的核苷酸可利用标准合成技术例如，使用自动化DNA合成仪来制备。
在另一个优选实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括具有与标志核酸的核苷酸序列或与编码标志蛋白的核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸分子。与给定的核苷酸序列互补的核酸分子是与所述给定的核苷酸序列充分互补(这样其可与所述给定的核苷酸序列杂交，从而形成稳定的双链体)的核酸分子。
此外，本发明的核酸分子可只包含核酸序列的部分，其中所述全长核酸序列包含标志核酸或其编码标志蛋白。此类核酸可以例如用作探针或引物。探针/引物通常用作一个或多个基本上纯化的寡核苷酸。所述寡核苷酸通常包含核苷酸序列的区域，所述区域在严格条件下与本发明的核酸的至少约7格，优选约15个，更优选约25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个或更多个连续核苷酸杂交。
基于本发明的核酸分子的序列的探针可用于检测相应于本发明的一个或多个标志的转录物或基因组序列。所述探针包含与其连接的标志基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可用作诊断测试试剂盒的部分，所述试剂盒用于例如通过测量编码蛋白质的核酸分子在来自受试者的细胞的样品中的水平，例如，检测mRNA水平或确定编码所述蛋白质的基因是被突变还是缺失来鉴定错表达(mis-express)所述蛋白质的细胞或组织。
本发明还包括因遗传密码的简并性而与编码标志蛋白(例如具有SEQ ID NO(AA)的序列的蛋白质)的核酸的核苷酸序列不同并且从而编码相同的蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员应理解，导致氨基酸序列的改变的DNA序列多态性可存在于群体(例如，人群体)中。此类遗传多态性可因天然等位基因的变异而存在于群体的个体之间。等位基因是可选地存在于给定的遗传基因座上的一组基因之一。此外，应理解，影响RNA表达水平的DNA多态性也可存在，其可影响该基因的总体表达水平(例如，通过影响调控或降解)。
如本文中所使用的，术语“等位基因变体”是指存在于给定基因座上的核酸序列或指由所述核苷酸序列编码的多肽。
如本文中所使用的，术语“基因”和“重组基因”是指包含编码相应于本发明的标志的多肽的开放阅读框架的核酸分子。此类天然等位基因变异通常可导致给定的基因的核苷酸序列的1-5％的变异。等位基因变体可通过测定许多不同个体中的目的基因的序列来鉴定。这可通过使用杂交探针鉴定多个个体中的相同遗传基因座来容易地进行。作为天然等位基因变异的结果并且不改变功能活性的任何和所有此类核苷酸变异和所得的氨基酸多态性或变异意欲包括在本发明的范围内。
在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子在长度上为至少7、15、20、25、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、550、650、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3500、4000、4500或更多个核苷酸并且在严格条件下与标志核酸或与编码标志蛋白的核酸杂交。如本文中所使用的，术语“在严格条件下杂交”意欲描述用于杂交和洗涤的条件，在所述条件下，彼此具有至少60％(65％，70％，优选75％)的同一性的核苷酸序列通常保持彼此杂交。此类严格条件对于本领域技术人员来说是已知的并且可见于CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)的小节6.3.1-6.3.6中。严格杂交条件的优选的非限定实例为在约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50-65℃下在0.2X SSC，0.1％SDS中进行1或多次洗涤。
除了可存在于群体中的本发明的核酸分子的天然存在的等位基因变体外，本领域技术人员还应理解，可通过突变引入序列改变，从而导致编码的蛋白质的氨基酸序列的改变，而不改变由其编码的蛋白质的生物活性。例如，可产生核苷酸置换，从而在“非必需”氨基酸残基上导致氨基酸置换。“非必需”氨基酸残基是可从野生型序列改变而不改变生物活性的残基，然而“必需”氨基酸残基是生物活性所必需的。例如，在不同物种的同源物之间不保守的或只是半保守的氨基酸残基对于活性可以是非必需的，从而可能是用于改变的靶。可选择地，在不同物种(例如，鼠和人)的同源物之间保守的氨基酸残基对于活性可以是必需的，从而不可能为用于改变的靶。
因此，本发明的另一个方面涉及编码变异标志蛋白的核酸分子，所述蛋白质包含对于活性不是必需的氨基酸残基的改变。此类变异标志蛋白与天然存在的标志蛋白相异在于氨基酸序列，但仍保留生物活性。在一个实施方案中，此类变异标志蛋白具有与标志蛋白的氨基酸序列具有至少约40％的同一性，50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
可通过向标志核酸的核苷酸序列引入一个或多个核苷酸置换、添加或缺失以便将一个或多个氨基酸残基置换、添加或缺失引入编码的蛋白质中来产生编码变异标志蛋白的分离的核酸分子。可通过标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变来引入突变。优选，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上产生保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。本领域内已鉴定了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。可选地，可沿着编码序列的全部或部分，例如通过饱和诱变随机引入突变，并且可就生物活性筛选所得的突变体以鉴定保留活性的突变体。在诱变后，可重组表达编码的蛋白质并且可测定所述蛋白质的活性。
本发明包括反义核酸分子，即与本发明的有义核酸互补，例如与双链标志cDNA分子的编码链互补或与标志mRNA序列互补的分子。因此，本发明的反义核酸可与本发明的有义核酸氢键合(即，用其退火)。反义核酸可与完整编码链或仅与其部分，例如蛋白质编码区(或开放阅读框架)的全部或部分互补。反义核酸分子不定期可以是针对编码标志蛋白的核苷酸序列的编码链的非编码区的全部或部分的反义链。非编码区(“5′和3′非翻译区″)是侧翼连接编码区并且不被翻译成氨基酸的5′和3′序列。
反义寡核苷酸在长度上可以为例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个或更多个核苷酸。可利用本领域内已知的方法，使用化学合成和酶促连接反应构建本发明的反义核酸。例如，可使用天然存在的核苷酸或经设计用以增加分子的稳定性或增加反义与有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸化学合成反义核酸(例如，反义寡核苷酸)，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的经修饰的核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、假尿苷、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。可选择地，可使用已以反义定向(即，从插入的核酸转录的RNA相对目的靶核酸呈反义定向，在下面分部分中进一步描述)亚克隆核酸的表达载体生物学地产生反义核酸。
通常给受试者施用本发明的反义核酸分子或原位产生所述核酸分子以便它们与编码标志蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译来抑制标志的表达。杂交可以通过常规核苷酸互补性形成稳定的双链体来产生，或例如，在结合DNA双链体的反义核酸分子的情况下，通过在双螺旋的大沟中的特异性相互作用来产生。本发明的反义核酸分子的施用的途径的实例包括在组织位置直接注射反义核酸或将其输注入肿瘤障碍相关体液。可选择地，可修饰反义核酸分子以靶向所选择的细胞，随后全身性施用所述反义核酸分子。例如，为了全身性施用，可修饰反义分子以便它们特异性结合在所选择的细胞表面上表达的受体或抗原，例如通过将所述反义核酸分子与结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体连接来进行。还可使用本文中描述的载体将反义核酸分子递送至细胞。为了获得充足的反义分子的细胞内浓度，其中反义核酸分子被置于强polII或pol III启动子的控制之下的载体构建体是优选的。
本发明的反义核酸分子可以是α-异头物核酸分子。α-异头物核酸分子与互补RNA形成特定双链杂交体，在所述双链杂交体中，与常见的a-单位相反，所述链彼此平行(Gaultier等人，1987，Nucleic Acids.Res.15：6625-6641)。反义核酸分子还可包含2′-o-甲基核醣核苷酸(Inoue等人，1987，Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人，1987，FEBS Lett.215：327-330)。
本发明还包括核酶。核酶是具有核酸酶活性的催化性RNA分子，其能够切割与它们具有互补区的单链核酸例如mRNA。因此，核酶(例如，如Haselhoff和Gerlach，1988，Nature 334：585-591中描述的锤头核酶)可用于催化切割mRNA转录物，从而抑制由所述mRNA编码的蛋白质的翻译。可基于相应的标志的cDNA的核苷酸序列设计具有对于编码标志蛋白的核酸分子的特异性的核酶。例如，可构建四膜虫L-19IVS RNA的衍生物，其中活性部位的核苷酸序列与待切割的核苷酸序列互补(参见Cech等人美国专利No.4,987,071；和Cech等人美国专利No.5,116,742)。可选择地，编码本发明的多肽的mRNA可用于从RNA分子库选择具有特定核酸酶活性的催化性RNA(参见，例如，Bartel和Szostak，1993，Science 261：1411-1418)。
本发明还包括形成三螺旋结构的核酸分子。例如，本发明的标志的表达可通过靶向与编码所述标志核酸或蛋白质的基因的调控区(例如，启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列以形成三螺旋结构来抑制，所述三螺旋结构在靶细胞中阻止基因的转录。通常参见Helene(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；和Maher(1992)Bioassays 14(12)：807-15。
在不同的实施方案中，可在碱基部分、糖部分或磷酸主链上修饰本发明的核酸分子以提高例如所述分子的稳定性、杂交或可溶性。例如，可修饰核酸的脱氧核糖磷酸主链以产生肽核酸(参见Hyrup等人，1996，Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1)：5-23)。如本文中所使用的，术语“肽核酸”或“PNA”是指核酸模拟物，例如DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸主链被假肽主链替代并且只有4个天然核碱基被保留。已显示PNA的中性主链允许在低离子强度的条件下与DNA和RNA特异性杂交。可使用如Hyrup等人(1996)，同上；Perry-O′Keefe等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14670-675中描述的标准固相肽合成方案进行PNA寡聚物的合成。
PNA可用于治疗和诊断应用。例如，PNA可用作用于通过例如诱导转录或翻译阻滞或抑制复制来序列特异性调节基因表达的反义或抗基因(antigene)试剂。还可将PNA用于例如基因的单碱基对突变的分析，通过例如PNA指导的PCR钳制；当与其他酶例如S1核酸酶组合使用时，用作人造限制性内切酶(Hyrup(1996)，同上)；或用作用于DNA测序和杂交的探针或引物(Hyrup，1996，同上；Perry-O′Keefe等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14670-675)。
在另一个实施方案中，可修饰PNA例如以通过将亲脂或其他辅助基团连接至PNA，通过形成PNA-DNA嵌合体或通过使用脂质体或本领域内已知的其他药物递送技术来增强它们的稳定性或细胞摄入。例如，可产生可组合PNA和DNA的有利性质的PNA-DNA嵌合体。此类嵌合体允许DNA识别酶例如RNA酶H和DNA聚合酶与DNA部分相互作用，而所述PNA部分可提供高结合亲和力和特异性。可使用根据碱基堆积、核碱基之间键的数目以及方向选择的适当长度的连接体连接PNA-DNA嵌合体(Hyrup，1996，同上)。可如Hyrup(1996)，同上，和Finn等人(1996)Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63中所述进行PNA-DNA嵌合体的合成。例如，可使用标准亚磷酰胺偶联化学药品和修饰的核苷类似物在固体支持物上合成DNA链。化合物例如5′-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5′-脱氧-胸苷亚磷酰胺可用作PNA与DNA的5′末端之间的连接(Mag等人，1989，Nucleic Acids Res.17：5973-88)。随后以分步方式偶联PNA单体以产生具有5′PNA区段和3′DNA区段的嵌合分子(Finn等人1996，NucleicAcids Res.24(17)：3357-63)。可选择地，可利用5′DNA区段和3′PNA区段合成嵌合分子(Peterser等人，1975，Bioorganic Med.Chem.Lett.5：1119-11124)。
在其他实施方案中，寡核苷酸可包括其他悬挂基团例如肽(例如，以在体内靶向宿主细胞受体)或促进穿过细胞膜(参见，例如，Letsinger等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-6556；Lemaitre等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：648-652；第WO 88/09810号PCT公布)或血脑屏障(参见，例如，第WO 89/10134号PCT公布)的运输的试剂。此外，寡核苷酸可用杂交-触发的切割试剂(参见，例如，Krol等人，1988，Bio/Techniques 6：958-976)或嵌入剂(参见，例如，Zon，1988，Pharm.Res.5：539-549)进行修饰。为此，可将寡核苷酸缀合至另一个分子，例如，肽、杂交触发的交联剂、运输试剂、杂交触发的切割试剂等。
本发明还包括分子信标核酸，其具有至少一个与本发明的核酸互补以便所述分子信标用于定量本发明的核酸在样品中存在的区域。“分子信标”核酸是包含一对互补区域并且具有荧光基团和与其结合的荧光猝灭剂的核酸。荧光基团和猝灭剂以这样的方向与核酸的不同部分结合以便当互补区域彼此退火时，荧光基团的荧光被猝灭剂猝灭。当核酸的互补区不彼此退火时，荧光基团的荧光被猝灭的程度较低。在例如美国专利5,876,930中描述了分子信标核酸。
2.分离的蛋白质和抗体
本发明的一个方面涉及分离的蛋白质和其生物活性部分，以及适合用作免疫原以引发抗标志蛋白或其片段的抗体的多肽片段。在一个实施方案中，可使用标准蛋白质纯化技术，通过适当的纯化方案从细胞或组织来源分离天然标志蛋白。在另一个实施方案中，包含标志的全部分或区段的蛋白质或肽通过重组技术产生。作为重组表达的另一选择，可使用标准肽合成技术化学合成这样的蛋白质或肽。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含来自所述蛋白质所源自的细胞或组织来源的细胞材料或其他污染性蛋白质，或当化学合成时，基本上不含化学药品前体或其他化学药品。语言“基本上不含细胞材料”包括其中蛋白质与所述蛋白质从其分离或从其重组产生的细胞的细胞成分分离的蛋白质的制剂。因此，基本上不含细胞材料的蛋白质包括与具有低于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的异源蛋白质(在本文中也称为“污染性蛋白质”)的蛋白质制剂。当蛋白质或其生物活性部分通过重组产生时，其还优选地基本上不含培养基，即培养基代表少于约20％、10％或5％的蛋白质制剂的体积。当所述蛋白质通过化学合成时，其优选基本上不含化学药品前体或其他化学药品，即，其与参与蛋白质的合成的化学药品前体或其他化学药品分离。因此，这样的蛋白质制剂具有少于约30％、20％、10％、5％(按干重计)的除了目的多肽外的化学药品前体或化合物。
标志蛋白的生物活性部分包括包含与标志蛋白的氨基酸序列充分同一或从其衍生的氨基酸序列的多肽，所述多肽包含比全长蛋白质更少的氨基酸，并且展示相应全长蛋白质的至少一种活性。通常，生物活性部分包含具有相应的全长蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。本发明的标志蛋白的生物活性部分可以是在长度上为例如10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。此外，其中标志蛋白的其他区域被缺失的其他生物活性部分可通过重组技术来制备并且可对其评估所述标志蛋白的天然形式的一种或多种功能活性。
优选的标志蛋白由包含SEQ ID NO(nts)的任一个的序列的核苷酸序列编码。其他有用的蛋白质与这些序列之一基本上是同一的(例如，至少约40％，优选50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)并且保留相应的天然存在的标志蛋白的功能活性，然而因天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上相异。
为了测定两个氨基酸序列或两个核酸的百分比同一性，将序列为了最佳比较目的进行比对(例如，可将缺口引入第一氨基酸或核酸序列的序列中以与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。随后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置上是同一的。优选，使用总体比对来计算两个序列之间的百分比同一性。可选择地，使用局部比对来计算两个序列之间的百分比同一性。两个序列之间的百分比同一性是由序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置的数目/位置的总数(例如，重叠部分)×100)。在一个实施方案中，两个序列具有相同长度。在另一个实施方案中，两个序列长度不相同。
两个序列之间的百分比同一性的测定可使用数学算法来完成。用于两个序列的比较的数学算法的优选非限定性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268的算法，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中改进的。将这样的算法整合入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的BLASTN和BLASTX程序。利用BLAST程序(评分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸检索以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可利用BLASTP程序(评分＝50，字长＝3)进行BLST蛋白质检索以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的空位比对(gapped alignment)，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所述，利用称为GappedBLAST的BLAST算法的更新版本，其能够进行程序BLASTN、BLASTP和BLASTX的空位局部比对。可选择地，PSI-Blast可用于进行检测分子之间的远缘关系迭代搜索。当使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast算法时，可使用各程序(例如，BLASTX和BLASTN)的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列的比较的数学算法的另一个优选非限定性实例是Myers和Miller，(1988)CABIOS 4：11-17的算法。将这样的算法整合入ALIGN程序(2.0版)，所述程序是GCG序列比对软件包的部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表，12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。用于鉴定局部序列相似性和比对的区域的另一个有用的算法是如Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444-2448中描述的FASTA算法。当使用FASTA算法比较核苷酸或氨基酸序列时，可以将PAM120权重残基表与例如为2的k-元组值一起使用。
可使用与上述技术相似的技术，在允许缺口或不允许缺口的情况下测定两个序列之间的百分比同一性。在计算百分比同一性中，只有精确匹配才被计数。
本发明还提供了包含标志蛋白或其区段的嵌合或融合蛋白质。如本文中所使用的，“嵌合蛋白质”或“融合蛋白”包含与异源多肽(即，除了所述标志蛋白外的多肽)有效连接的标志蛋白的全部或部分(优选生物活性部分)。在融合蛋白质内，术语“有效连接的”意欲表示所述标志蛋白或其区段与异源多肽彼此框内融合。可将异源多肽融合至标志蛋白或区段的氨基端或羧基端。
一个有用的融合蛋白质其中将标志蛋白或区段融合至GST序列的羧基端的GST融合蛋白。这样的融合蛋白质可有助于本发明的重组多肽的纯化。
在另一个实施方案中，融合蛋白质在其氨基端包含异源信号序列。例如，标志蛋白的天然信号序列可被除去并且被来自另一种蛋白质的信号序列替代。例如，杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌信号可用作异源信号序列(Ausubel等人编辑，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，NY，1992)。真核生物异源信号序列的其他实例包括蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；La Jolla，California)。在另一个实例中，有用的原核异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等人，同上)和蛋白A分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway，New Jersey)。
在另一个实施方案中，融合蛋白是其中标志蛋白的全部或部分被融合至从免疫球蛋白家族的成员衍生的序列的免疫球蛋白融合蛋白。可将本发明的免疫球蛋白融合蛋白掺入药物组合物并且给受试者施用以抑制配体(可溶性的或膜结合的)与细胞表面上的蛋白质(受体)之间的相互作用，从而在体内抑制信号转导。免疫球蛋白融合蛋白可用于影响标志蛋白的同源配体的生物利用度。配体/受体相互作用的抑制对于治疗增生性障碍和分化性障碍以及调节(例如，促进或抑制)细胞存活在治疗上是有用的。此外，本发明的免疫球蛋白融合蛋白可用作免疫原以在受试者中产生针对标志蛋白的抗体，纯化配体和用于筛选测定以鉴定抑制标志蛋白与配体的相互作用的分子。
本发明的嵌合和融合蛋白可通过标准重组DNA技术产生。在另一个实施方案中，通过常规技术包括自动化DNA合成仪合成融合基因。可选择地，可使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述引物在两个连续基因片段之间产生互补的悬突，所述基因片段随后可退火并且再扩增以产生嵌合基因序列(参见，例如，Ausubel等人，同上)。此外，已编码融合部分(例如，GST多肽)的许多表达载体是商购可得的。可将编码本发明的多肽的核酸克隆入这样的表达载体以便融合部分框内连接至本发明的多肽。
信号序列可用于帮助标志蛋白的分泌和分离。信号序列的特征通常在于在分泌过程中在一个或多个切割事件中通常从成熟蛋白质切割的疏水氨基酸的核心。此类信号肽包含允许当成熟蛋白通过分泌途径时将信号序列从成熟蛋白质切除的加工位点。因此，本发明涉及具有信号序列的标志蛋白、融合蛋白或其区段以及涉及所述信号序列已从其蛋白水解性切割的此类蛋白质(即，切割产物)。在一个实施方案中，编码信号序列的核酸序列可在表达载体中有效地连接至目的蛋白质，例如标志蛋白或其区段。信号序列指导蛋白质例如从已将表达载体转化至其中的真核生物宿主分泌，并且随后或同时切割信号序列。随后通过本领域公认的方法从细胞外培养基容易地纯化所述蛋白质。可选择地，可使用有助于纯化的序列，例如利用GST结构域将信号序列连接至目的蛋白质。
本发明还涉及标志蛋白的变体。此类变体具有改变的氨基酸序列，其可用作激动剂(模拟物)或用作拮抗剂。可通过诱变例如不连续点突变或截断产生变体。激动剂可基本上保留全部或部分天然存在的蛋白质形式的生物活性。蛋白质的拮抗剂可通过例如对包括目的蛋白质的细胞信号级联的下游或上游成员的竞争性结合来抑制天然存在的蛋白质形式的一种或多种活性。因此，可通过利用有限功能的变体的处理来引发特定生物效应。利用具有一个亚组的天然存在形式的蛋白质的生物活性的变体治疗受试者相对于利用天然存在形式的蛋白质的处理在受试者中可具有更少的副作用。
用作激动剂(模拟物)或拮抗剂的标志蛋白的变体可通过筛选本发明的蛋白质的突变体(例如截断突变体)的组合文库的激动剂或拮抗剂活性来鉴定。在一个实施方案中，变体的多样性文库利用核酸水平上的组合诱变来产生，并且由多样性基因文库编码。可通过例如将合成寡核苷酸的混合物酶促连接至基因序列来产生变体的多样性文库，以便一个简并组的潜在蛋白质序列可作为单个多肽或可选择地作为一组更大的融合蛋白质(例如，用于噬菌体展示)表达。存在许多可用于从简并寡核苷酸序列产生标志蛋白的潜在变体的文库的方法。用于合成简并寡核苷酸的方法在本领域内是已知的(参见，例如，Narang，1983，Tetrahedron 39：3；Itakura等人，1984，Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，1984，Science 198：1056；Ike等人，1983NucleicAcid Res.11：477)。
此外，可使用标志蛋白的区段的文库来产生多肽的多样性群体以筛选和随后选择变异标志蛋白或其区段。例如，可通过在其中每分子仅存在约一个切口的条件下用核酸酶处理目的编码序列的双链PCR片段，使双链DNA变性，使DNA复性以形成可包括来自不同带切口的产物的有义/反义对的双链DNA，通过用S1核酸酶处理从改造的双链体除去单链部分，将所得的片段文库连接进入表达载体来产生编码序列片段的文库。通过该方法，可产生编码目的蛋白质的不同大小的氨基末端和内部片段的表达文库。
用于筛选由点突变或截断产生的组合文库的基因产物和用于筛选具有选择性质的基因产物的cDNA文库的几种技术在本领域内是已知的。易于高通量分析以筛选大基因文库的最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆进入可复制的表达载体，用所得的载体文库转化适当的细胞，在其中所需活性的检测有助于编码其产物被检测到的基因的载体的分离的条件下表达组合基因。递归总体诱变(REM)(一种增加文库中功能突变体的频率的技术)可与鉴定本发明的蛋白质的变体的筛选测定组合使用(Arkin和Yourvan，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave等人，1993，Protein Engineering 6(3)：327-331)。
本发明的另一个方面涉及抗本发明的蛋白质的抗体。在优选实施方案中，抗体特异性结合标志蛋白或其片段。如本文可互换使用的术语“抗体”和“抗体”是指免疫球蛋白分子以及其包含免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即，这样的部分包含特异性结合抗原例如标志蛋白，例如标志蛋白的表位的抗原结合位点)的片段和衍生物。特异性结合本发明的蛋白质的抗体是结合所述蛋白质但基本上不结合样品例如生物样品中的其他分子的抗体，所述样品天然包含所述蛋白质。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括但不限于单链抗体(scAb)、F(ab)和F(ab′)2片段。
本发明的分离的蛋白质或其片段可用作免疫原来产生抗体。可使用全长蛋白质或可选择地，本发明提供抗原性肽片段以用作免疫原。本发明的蛋白质的抗原性肽包含本发明的蛋白质之一的氨基酸序列的至少8个(优选10、15、20或30或更多个)氨基酸残基，并且包含蛋白质的至少一个表位，以便针对所述肽产生的抗体与所述蛋白质形成免疫复合物。由抗原性肽包括的优选表位是位于蛋白质的表面上的区域，例如，亲水性区域。疏水性序列分析、亲水性序列分析或相似分析可用于鉴定亲水性区域。在优选实施方案中，分离的标志蛋白或其片段用作免疫原。
免疫原通常用于通过免疫适当(即，具有免疫能力的)受试者例如兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物或脊椎动物来制备抗体。适当的免疫原性制剂可包含例如重组表达的或化学合成的蛋白质或肽。所述制剂还可包括佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂或相似的免疫调节剂。优选免疫原组合物是不包含其他人蛋白质的免疫原组合物，例如使用非人宿主细胞重组合表达本发明的蛋白质产生的免疫原组合物。这样，所得的抗体组合物对除本发明的蛋白质外的人蛋白质具有减弱的结合或对其不结合。
本发明提供了多克隆和单克隆抗体。术语″单克隆抗体″或″单克隆抗体组合物″，如本文中所使用的，是指仅包含一个种类的能够与特定表位免疫反应的抗原结合位点的抗体分子的群体。优选多克隆和单克隆抗体组合物是已针对抗本发明的蛋白质的抗体选择的组合物。特别优选多克隆和单克隆抗体制剂是仅包含抗标志蛋白或其片段的抗体的组合物。
多克隆抗体可通过用本发明的蛋白质作为免疫原免疫适当的受试者来制备。经免疫的受试者的抗体滴度可通过标准技术例如利用酶联免疫吸附测定(ELISA)，使用固定的多肽来随时间的过去进行监测。在免疫后适当的时间上，例如，当特定抗体滴度最高时，可从受试者获得抗体产生性细胞，利用标准技术例如最初由Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人，1983，Immunol.Today 4：72)、EBV-杂交瘤技术(参见Cole等人，pp.77-96Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，1985)或三源杂交瘤技术将其用于制备单克隆抗体(mAb)。用于产生杂交瘤的技术是公知的(通常参见CurrentProtocols in Immunology，Coligan等人编辑，John Wiley & Sons，NewYork，1994)。通过例如使用标准ELISA测定，针对结合目的多肽的抗体筛选杂交瘤培养物上清液来检测产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
作为对制备单克隆抗体分泌型杂交瘤的另外选择，可通过用目的多肽筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)来鉴定和分离抗本发明的蛋白质的单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体文库的试剂盒是商购可得的(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，产品编号27-9400-01；和Stratagene SurfZAP噬菌体展示试剂盒，产品编号240612)。此外，特别易于用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可见于美国专利No.5,223,409；第WO 92/18619号PCT公布；第WO 91/17271号PCT公布；第WO 92/20791号PCT公布；第WO 92/15679号PCT公布；第WO 93/01288号PCT公布；第WO92/01047号PCT公布；第WO 92/09690号PCT公布；第WO 90/02809号PCT公布；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85；Huse等人(1989)Science246：1275-1281；Griffiths等人(1993)EMBO J.12：725-734。
本发明还提供了特异性结合本发明的蛋白质的重组抗体。在优选实施方案中，重组抗体特异性结合标志蛋白或其片段。重组抗体包括但不限于嵌合抗体和人源化单克隆抗体(其包含人和非人部分)、单链抗体和多特异性抗体。嵌合抗体是其中不同部分来源于不同动物种类的分子，例如具有来源于鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些分子。(参见，例如，Cabilly等人，美国专利No.4,816,567；和Boss等人，美国专利No.4,816,397，通过引用将其整体并入本文)。单链抗体具有抗原结合位点并且由单个多肽组成。它们可通过本领域已知的技术，例如使用Ladner等人美国专利No.4,946,778(通过引用将其整体并入本文)；Bird等人，(1988)Science 242：423-426；Whitlow等人，(1991)Methods in Enzymology 2：1-9；Whitlow等人，(1991)Methods in Enzymology 2：97-105；和Huston等人，(1991)Methods inEnzymology Molecular Design and Modeling：Concepts and Applications203：46-88中描述的方法来产生。多特异性抗体是具有至少两个特异性结合不同抗原的抗原结合位点的抗体分子。此类分子可通过本领域已知的技术，例如使用Segal，美国专利No.4,676,980(将其公开内容通过引用整体并入本文)；Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Whitlow等人，(1994)Protein Eng.7：1017-1026和美国专利No.6，121,424中描述的方法来产生。
人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。(参见，例如，Queen，美国专利No.5,585,089，通过引用将其整体并入本文)。人源化单克隆抗体可通过本领域已知的重组DNA技术，例如使用第WO 87/02671号PCT公布；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利申请173,494；第WO 86/01533号PCT公布；美国专利No.4,816,567；欧洲专利申请125,023；Better等人(1988)Science 240：1041-1043；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3439-3443；Liu等人(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura等人(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood等人(1985)Nature 314：446-449；和Shaw等人(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559)；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等人(1986)Bio/Techniques 4：214；美国专利5,225,539；Jones等人(1986)Nature 321：552-525；Verhoeyan等人(1988)Science 239：1534；和Beidler等人(1988)J.Immunol.141：4053-4060中描述的方法来产生。
更具体地，可以例如使用不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因但可表达人重链和轻链基团的转基因小鼠来产生人源化抗体。以通常方式用选择的抗原例如相应于本发明的标志的多肽的所有或部分免疫所述转基因小鼠。抗所述抗原的单克隆抗体可使用常规杂交瘤技术来获得。转基因小鼠所具有的人免疫球蛋白基因在B细胞分化期间重排，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，通过使用这样的技术，有可能产生治疗上有用的IgG、IgA和IgE抗体。关于用于产生人抗体的该技术的概述，参见Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13：65-93)。关于用于产生人抗体和人单克隆抗体的该技术以及用于产生此类抗体的方案的详细论述，参见，例如，美国专利5,625,126；美国专利5,633,425；美国专利5,569,825；美国专利5,661,016和美国专利5,545,806。此外，可与公司例如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)签约以使用与上述技术相似的技术提供抗所选择的抗原的人抗体。
识别选择的表位的完全人抗体可使用称为“定向选择(guidedselection)”的技术来产生。在该方法中，将选择的非人单克隆抗体例如鼠抗体用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers等人，1994，Bio/technology 12：899-903)。
可在产生(例如，从受试者的血液或血清)或合成后分离本发明的抗体，然后利用公知的技术进一步纯化。例如，可使用蛋白A层析纯化IgG抗体。可通过例如亲和层析来选择或(例如，部分纯化)或纯化特异于本发明的蛋白质的抗体。例如，如本文中所述产生本发明的重组表达的和纯化的(或部分纯化的)蛋白质，并且将其共价或非共价地偶联至固体支持物例如层析柱。随后可将柱子用于从包含抗许多不同表位的抗体的样品亲和纯化特异于本发明的蛋白质的抗体，从而产生基本上纯化的抗体组合物，即基本上不含污染性抗体的组合物。基本上纯化的抗体组合物在本说明书中意指抗体样品包含至多仅30％(按重量计)的抗除期望的本发明的蛋白质的表位外的表位的污染性抗体，优选至多20％，更优选至多10％，最优选至多5％(按干重计)的样品是污染性抗体。纯化的抗体组合物意指组合物中至少99％的抗体是抗本发明的期望的蛋白质的。
在优选实施方案中，本发明的基本上纯化的抗体可特异性结合本发明的蛋白质的信号肽、分泌序列、细胞外结构域、跨膜结构域或细胞质结构域或胞质膜(cytoplasmic membrane)。在特别优选实施方案中，本发明的基本上纯化的抗体特异性结合本发明的蛋白质的氨基酸序列的分泌序列或细胞外结构域。在更优选实施方案中，本发明的基本上纯化的抗体特异性结合标志蛋白的氨基酸序列的分泌序列或细胞外结构域。
抗本发明的蛋白质的抗体可用于通过标准技术例如亲和层析或免疫沉淀分离蛋白质。此外，这样的抗体可用于检测标志蛋白或其片段(例如，在细胞裂解物或细胞上清液中)以评估所述标志的表达水平和模式。还可在诊断上将抗体用于监测组织或体液(例如在肿瘤障碍相关体液中)中的蛋白质水平(作为临床检测程序的部分)，例如以例如测定给定的治疗方案的功效。可通过使用抗体衍生物来帮助检测，所述抗体衍生物包含偶联至可检测物质的本发明的抗体。可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。适当的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适当的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母荧光蛋白(aequorin)以及适当的放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
本发明的抗体还可用作治疗癌症的治疗剂。在优选实施方案中，本发明的完全人抗体用于治疗性治疗人癌症患者，特别是患有癌症的患者。在另一个优选实施方案中，特异性结合标志蛋白或其片段的抗体对于治疗性治疗是有用的。此外，此类治疗性抗体可以是包含缀合至治疗部分例如细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子的抗体的抗体衍生物或免疫毒素。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(anthracindione)、米托蒽醌、米拉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢药(例如，氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、烷化剂(例如，氮芥、thioepa chlorambucil、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二氨合铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、米拉霉素和氨茴霉素(AMC))以及抗有丝分裂试剂(例如，长春新碱和长春碱)。
本发明的缀合的抗体可用于修饰给定的生物反应，因为药物部分不被解释为限定于经典化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可包括例如毒素例如核糖体抑制蛋白(参见Better等人，美国专利No.6,146,631，将其公开内容通过引用整体并入本文)、相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织型纤溶酶原激活物；或生物反应调节剂例如淋巴因子、白细胞介素-1(″IL-1″)、白细胞介素-2(″IL-2″)、白细胞介素-6(″IL-6″)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)或其他生长因子。
用于将这样的治疗部分缀合至抗体的技术是公知的，参见，例如，Arnon等人，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(编辑)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，″Antibodies For Drug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(编辑)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(编辑)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人(编辑)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等人，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
因此，在一个方面，本发明提供了基本上纯化的抗体、抗体片段和衍生物，其全部特异性结合本发明的蛋白质，优选标志蛋白。在不同的实施方案中，本发明的基本上纯化的抗体或其片段或衍生物可以是人、非人、嵌合和/或人源化抗体。在另一个方面，本发明提供了非人抗体、抗体片段和衍生物，其全部特异性结合本发明的蛋白质，优选标志蛋白。此类非人抗体可以是山羊、小鼠、绵羊、马、鸡、兔或大鼠抗体。可选择地，本发明的非人抗体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。此外，本发明的非人抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在其他方面，本发明提供了单克隆抗体、抗体片段和衍生物，其全部特异性结合本发明的蛋白质，优选标志蛋白。单克隆抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和/或非人抗体。
本发明还提供了包括缀合至可检测物质的本发明的抗体和使用说明书的试剂盒。本发明的另一个方面是包含本发明的抗体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含本发明的抗体和药学上可接受的载体。
3.预后医学
本发明涉及预后医学领域，其中诊断测定、预后测定、药物基因组学和监测临床试验用于预后(预测)目的，从而预防性治疗个体。因此，本发明的一个方面涉及用于测定一个或多个标志蛋白或核酸的表达水平，以确定个体是否处于发生肿瘤障碍的风险中的诊断测试。此类测定可用于预后或预测目的，从而在障碍发作之前预防性治疗个体。
本发明的另一个方面涉及在临床试验中监测试剂(例如，经施用以抑制肿瘤障碍或治疗或预防任何其他障碍(即以便理解此类治疗可具有的任何致癌效应)的药物或其他化合物)对本发明的标志的表达或活性的影响。此类和其他试剂更详细地描述于下面部分中。
A.诊断测定
用于检测标志蛋白或核酸在生物样品中的存在或不存在的示例性方法包括从测试受试者获得生物样品(例如，肿瘤障碍相关体液)，将所述生物样品与能够检测多肽或核酸(例如，mRNA、基因组DNA或cDNA)的化合物或试剂接触。本发明的检测方法从而可用于在体外以及体内检测例如生物样品中的mRNA、蛋白质、cDNA、或基因组DNA。例如，用于检测mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于检测标志蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹法、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。用于检测mRNA的体内技术包括聚合酶链式反应(PCR)、Northern杂交和原位杂交。此外，用于检测标志蛋白的体内技术包括向受试者中引入标记的抗所述蛋白质或其片段的抗体。例如，抗体可用其在受试者中的存在和定位可利用标准成像技术来检测的放射性标志来进行标记。
此类诊断和预后测定的一般原理包括制备可包含标志的样品或包含标志和探针的反应混合物，在适当的条件下并且进行足以允许标志和探针相互作用和结合的时间，从而形成可从反应混合物中除去和/或在反应混合物中被检测到的复合物。可以以多种方式进行此类测定。
例如，进行这样的测定的一个方法可包括将标志或探针锚定在固相支持物(也称为基底(substrate))上，在反应结束时检测锚定在固相上的靶标志/探针复合物。在这样方法的一个实施方案中，可将被测定标志的存在和/或浓度的受试者的样品锚定在载体或固相支持物上。在另一个实施方案中，其中可将探针锚定至固相上并且可使受试者的样品用作测定的非锚定成分的相反情况是可能的。
存在许多用于将测定成分锚定至固相的已建立的方法。这些方法包括但不限于通过生物素和链霉抗生物素蛋白的缀合固定的标志或探针分子。此类生物素化测定成分可使用本领域内已知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备而来，并且将其固定在链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。在某些实施方案中，可预先制备具有固定的测定成分的表面，并且将其贮存。
用于此类测定法的其他适当的载体或固相支持物包括能够结合所述标志或探针所属于的分子种类的任何物质。公知的支持物或载体包括但不限于玻璃、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯、尼龙、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶类、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁。
为了利用上述方法进行测定，向将第二成分锚定在其上的固相加入非固定成分。在反应完成后，可在以使任何形成的复合物将保持固定在固相上的条件下除去(例如，通过洗涤)未复合的成分。锚定至固相的标志/探针复合物的检测可以用本文中概述的许多方法来完成。
在优选实施方案中，探针，当其是非锚定测定成分时，可以为了测试的检测和读数目的而用本文中论述的和本领域技术人员公知的可检测标记来直接或间接地标记。
还可能直接检测标志/探针复合物的形成而无需进一步操作或标记任一成分(标志或探针)，例如通过利用荧光能量转移的技术(参见，例如，Lakowicz等人，美国专利No.5,631,169；Stavrianopoulos等人，美国专利No.4,868,103)来进行。选择第一‘供体’分子上的荧光基团标记以便在用适当波长的入射光激发时，其发射的荧光能量可被第二‘受体’分子上的荧光标记吸收，该受体分子从而因吸收的能量而能够发荧光。可选择地，‘供体’蛋白质分子可简单地利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长的光的标记，以便‘受体’分子标记可与‘供体’的发射的光相区别。由于标志之间的能量转移的效率与分子分离的距离相关，因此可评估分子之间的空间关系。在其中分子之间存在结合的情况下，测定中‘受体’分子的荧光发射应当是最大的。可通过本领域内公知的标准荧光计检测方法(例如，使用荧光计)常规地测量FET结合事件。
在另一个实施方案中，探针识别标志的能力的测定可通过使用技术例如实时生物分子相互作用分析例如(real-time BiomolecularInteraction Analysis)(BIA)(参见，例如，Sj olander，S.和Urbaniczky，C.，1991，Anal.Chem.63：2338-2345和Szabo等人，1995，Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705)来完成而无需标记任一测定成分(探针或标志)。如本文中所使用的，“BIA”或“表面等离子共振”是用于实时研究生物特异性相互作用而无需标记任何相互作用物质的技术(例如，BIAcore)。结合表面上质量的改变(表示结合事件)导致表面附近的光的折射率的改变(表面等离子共振(SPR)的光学现象)，从而导致可检测的信号，该信号可用作生物分子之间实时反应的指示。
可选择地，在另一个实施方案中，可利用标志和探针(在液相中作为溶质)进行类似的诊断和预后测定。在这样的测定中，利用许多标准技术的任何技术将复合的标志和探针与未复合的成分分离，所述技术包括：差速离心、层析、电泳和免疫沉淀。在差速离心中，归因于复合物基于它们的不同大小和密度的不同沉降平衡，可通过一系列离心步骤将标志/探针与未复合的测定成分分离(参见，例如，Rivas，G，和Minton，A.P.，1993，Trends Biochem Sci.18(8)：284-7)。也可利用标准层析技术将复合的分子与未复合的分子分离。例如，凝胶过滤层析基于大小并且通过以柱子的形式利用适当的凝胶过滤树脂分离分子，例如，可将相对更大的复合物与相对更小的未复合的成分分离。类似地，标志/探针复合物相对于未复合的成分的相对不同的电荷性质可被利用来区分复合物与未复合物的成分，例如通过利用离子交换层析树脂。此类树脂和层析技术对于本领域技术人员来说是公知的(参见，例如，Heegaard，N.H.，1998，J.Mol.Recognit.Winter 11(1-6)：141-8；Hage，D.S.，和Tweed，S.A.J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997Oct10；699(1-2)：499-525)。凝胶电脉也被用来将复合的测试成分与未结合的成分分离(参见，例如，Ausubel等人编辑，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1987-1999)。在该技术中，例如基于大小或电荷分离蛋白质或核酸复合物。为了在电泳过程中维持结合相互作用，非变性凝胶基质材料和还原剂不存在的条件通常是优选的。用于具体测定和其成分的适当条件对于本领域技术人员来说是公知的。
在具体的实施方案中，可使用本领域内已知的方法通过原位和通过体外形式测定生物样品中标志mRNA的水平。术语“生物样品”意欲包括从受试者分离的组织、细胞、生物液体和其分离物以及存在于受试者内的组织、细胞和液体。许多表达检测法使用分离的RNA。对于体外方法，可利用不对mRNA的分离进行选择的任何RNA分离技术来从细胞纯化RNA(参见，例如，Ausubel等人编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York1987-1999)。此外，大量组织样品可使用本领域技术人员公知的技术例如Chomczynski(1989，美国专利No.4,843,155)的单步RNA分离法来容易地处理。
分离的mRNA可用于杂交或扩增测定，包括但不限于Southern或Northern分析、聚合酶链式反应分析和探针阵列。用于检测mRNA水平的一个优选诊断方法包括将分离的mRNA与可由待检测的基因编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是例如全长cDNA或其部分，例如在长度上至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸并且足以在严格条件下与编码本发明的标志的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。用于本发明的诊断测定的其他适当探针描述于本文中。mRNA与探针的杂交表示所述标志正被表达。
在一个形式中，例如通过在琼脂糖凝胶上电泳分离的mRNA，将所述mRNA从凝胶转移至膜，例如硝酸纤维素，来将mRNA固定在固体表面并且将其与探针接触。在可选择的形式中，将探针固定在固体表面上，将mRNA与例如Affymetrix基因芯片阵列中的探针接触。本领域技术人员可容易地改造已知的mRNA检测法以适合用于检测由本发明的标志编码的mRNA的水平。
用于测定样品的mRNA标志的水平的可选择的方法包括例如利用RT-PCR(Mullis，1987，美国专利No.4,683,202中所示的实验性实施方案)、连接酶链式反应(Barany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：189-193)、自主序列复制(Guatelli等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人，1988，Bio/Technology6：1197)、滚环复制(Lizardi等人，美国专利No.5,854,033)或任何其他核酸扩增法进行核酸扩增，然后使用本领域技术人员公知的技术检测扩增的分子的过程。这些检测方案对于核酸分子的检测是特别有用的，如果此类分子以非常低的数量存在的话。如本文中所使用的，扩增引物被定义为可退火至基因的5’或3’区域(分别地正链和负链，或反之亦然)并且包含之间的短区域的一对核酸分子。通常，扩增引物在长度上为约10至30个核苷酸并且侧翼连接在长度上为约50至200个核苷酸的区域。在适当的条件下和利用适当的试剂，此类引物允许扩增包含被引物侧翼连接的核苷酸序列的核酸分子。
关于原位方法，在检测之前不必分离mRNA。在这样的方法中，使用已知的组织学方法制备/处理细胞或组织样品。随后将样品固定在支持物(通常为玻璃)上，随后将其与可与编码标志的mRNA杂交的探针接触。
作为对基于标志的绝对表达水平进行测定的另外选择，测定可基于标准化的标志的表达水平。可通过将其表达与不是标志的基因(例如组成型表达的持家基因)的表达相比较修正标志的绝对表达水平来标准化表达水平。用于标准化的适当基因包括持家基因例如肌动蛋白基因或上皮细胞特异性基因。该标准化允许一种样品例如患者样品与另一种样品例如非癌样品，或来自不同来源的样品之间的表达水平的比较。
可选择地，表达水平可以以相对表达水平提供。为了测定标志的相对表达水平，可在测定所述样品的表达水平之前，测定10个或更多个正常细胞相对癌细胞分离株的样品，优选50或更多个样品的标志的表达水平。测定在更大量的样品中测定的每一个基因的平均表达水平，该平均水平可用作标志的基线表达水平。随后将针对测试样品测定的标志的表达水平(绝对表达水平)除以获得的该标志的平均表达值。这提供了相对表达水平。
优选，用于基线测定的样品来自非癌细胞。细胞来源的选择依赖于相对表达水平的使用。通过将正常组织中发现的表达用作平均表达评分有助于确认所测试的标志是否是癌症特异性的(相对正常细胞)。此外，随着更多数据积累，可修正平均表达值，从而基于积累的数据提供改进的相对表达值。癌细胞的表达数据提供了用于给癌症状态的严重度分级的方法。
在本发明的另一个实施方案中，检测标志蛋白。用于检测本发明的标志蛋白的优选试剂是能够结合这样的蛋白质或其片段的抗体，优选具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆的或更优选单克隆的。可使用完整抗体或其片段或衍生物(例如，Fab或F(ab′)2)。术语″标记的″，对于探针或抗体来说，意欲包括通过将可检测的物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体进行的探针或抗体的直接标记，以及通过与被直接标记的另一种试剂的反应性来进行的探针或抗体的间接标记。间接标记的实例包括使用荧光标记的二抗对一抗的检测以及利用生物素对DNA探针的末端标记，以便其可利用荧光标记的链霉抗生物素蛋白来检测。
可使用本领域技术人员公知的技术分离来自细胞的蛋白质。所使用的蛋白质分离方法可以例如是例如Harlow和Lane中描述的方法(Harlow和Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。
可将多种形式用于确定样品是否包含结合给定的抗体的蛋白质。此类形式的实例包括但不限于酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、Western印迹分析和酶联免疫吸附测定(ELISA)。本领域技术人员可容易地改造已知的蛋白质/抗体检测方法以使其适用于确定细胞是否表达本发明的标志。
在一种形式中，抗体或抗体片段或衍生物可用于方法例如Western印迹或免疫荧光技术以检测表达的蛋白质。在此为用途中，通常优选地将抗体或蛋白质固定在固体支持物上。适当的固相支持物或载体包括能够结合抗原或抗体的任何支持物。公知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶类、天然和改性纤维、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁。
本领域技术人员应知道许多其他用于结合抗体或抗原的适当载体，并且能够改造这样的支持物以适合用于与本发明的一起使用。例如，可在聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行从癌细胞分离的蛋白质电泳，将其固定在固相支持物例如硝酸纤维素上。随后可用适当的缓冲液洗涤支持物，然后用可检测地标记的抗体处理。随后用缓冲液第二次洗涤固相支持物以除去未结合的抗体。随后可利用常规方法检测固体支持物上结合的标记的量。
本发明还包括用于检测标志蛋白或核酸在生物样品中的存在的试剂盒。此类试剂盒可用于确定受试者是患有肿瘤障碍还是处于增加的发生所述疾病的风险中。例如，试剂盒可包括能够检测生物样品中的标志蛋白或核酸的标记的化合物或试剂和用于测定样品中所述蛋白质或mRNA的量的工具(例如，结合所述蛋白质或其片段的抗体，或结合编码的所述蛋白质的DNA或mRNA的寡核苷酸探针)。试剂盒还可包括解释使用该试剂盒获得的结果的说明书。
关于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可包括例如：(1)结合标志蛋白的第一抗体(例如，连接至固相的)；和，任选地(2)第二不同的抗体，其结合所述蛋白质或第一抗体并且被缀合至可检测的标记。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒可包括例如：(1)寡核苷酸，例如可检测地标记的寡核苷酸，其与编码标志蛋白的核酸序列杂交或(2)用于扩增标志核酸分子的一对引物。试剂盒还可包括，例如，缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可包括检测可检测标记所必需的成分(例如，酶或底物)。试剂盒还可包括可被测定并且被与测试样品相比较的对照样品或一系列对照样品。可将试剂盒的每一个成分封装在单个容器内并且将所有不同的容器连同说明书(用于解释使用该试剂盒进行的测试的结果)装在单个包装中。
B.药物基因组学
本发明的标志也用作药物基因组学标志。如本文中所使用的，“药物基因组学标志”是其表达水平与患者的特定临床药物反应或易感性相关的目标生物化学标志(参见，例如，McLeod等人(1999)Eur.J.Cancer 35(12)：1650-1652)。药物基因组学标志表达的存在或量与患者，更具体地患者的肿瘤障碍对利用特定药物或药物种类的治疗的预测的反应相关。通过评估一个或多个药物基因组学标志在患者中的存在或量，可选择对于患者是最适合的或经预测具有更大程度的成功的药物疗法。例如，基于由特定肿瘤标志编码的RNA或蛋白质在患者中的存在或量，可选择对于可能存在于患者中的特定肿瘤的治疗最优化的药物或治疗过程。从而药物基因组学标志的使用允许选择或设计每一个癌症患者的最适当的治疗而需尝试不同的药物或方案。
药物基因组学的另一个方面涉及改变身体对药物的作用方式的遗传状况。此类药物基因组学状况可以罕见的缺陷或以多态型形式存在。例如，6-磷酸葡糖脱氢酶(G6PD)缺乏是常见遗传酶病，其中主要临床并发症是在摄入氧化剂药物(抗疟疾药、磺胺类、镇痛药、硝基呋喃类药)和消费蚕豆后发生的溶血。
作为举例说明性实施方案，药物代谢酶的活性是药物作用的强度和持续时间的主要决定因素。药物代谢酶(例如，N-乙酰转移酶2(NAT2)和细胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)的遗传多态性的发现已提供了关于为什么某些患者在服用标准和安全剂量的药物后未获得预期的药物效应或显示过度的药物反应和严重毒性的解释。这些多态性在群体中以两种表型表现，强代谢者(EM)和弱代谢者(PM)。PM的盛行在不同群体间是不同的。例如，编码CYP2D6的基因是高度多态性的并且在PM中已鉴定了数个突变，所述突变全都导致功能性CYP2D6的不存在。CYP2D6和CYP2C19的弱代谢者，当它们接受标准剂量时，相当频繁地经历过度的药物反应和副作用。如果代谢产物是活性治疗性部分，那么PM将不显示治疗反应，如对于通过其CYP2D6-形成的代谢产物吗啡介导的可待因的镇痛作用所证明的。其他极端是所谓的超速代谢者(ultra-rapid metabolizer)，其对标准剂量不反应。最近，超速代谢的分子基础被确定为因CYP2D6基因扩增而引起。
因此，可测定本发明的标志的表达水平，从而选择适当的试剂用于个体的治疗性或预防性治疗。此外，药物基因组学研究可用于对编码药物代谢酶的多态性等位基因进行基因分型，以鉴定个体的药物反应表型。该知识，当用于给药或药物选择时，可避免不利反应或治疗失败，从而当用本发明的标志的表达的调节剂治疗受试者时，增强治疗或预防功效。
C.监测临床试验
监测试剂(例如，药物化合物)对本发明的标志的表达水平的影响可以不仅用于基本药物筛选，而且还可用于临床试验。例如，可在进行肿瘤障碍治疗的受试者的临床试验中监测试剂影响标志表达的效力。在优选实施方案中，本发明提供了用于监测利用试剂(例如，激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他药物候选物)治疗受试者的功效的方法，其包括步骤：(i)在施用所述试剂之前从受试者获得施用前样品；(ii)检测一个或多个所选择的本发明的标志在施用前样品中的表达水平；(iii)从受试者获得一个或多个施用后样品；(iv)检测所述标志在施用后样品中的表达水平；(v)将所述标志在施用前样品中的表达水平与所述标志在施用后样品中的表达水平相比较；和(vi)相应地改变试剂至受试者的施用。例如，治疗过程中标志基因的增加的表达可表示无效剂量，从而需要增加剂量。相反地，标志基因的减少的表达可表示有效治疗，从而不需要改变剂量。
D.阵列
本发明还包括包含本发明的标志的阵列。所述阵列可用于在阵列中测定一个或多个基因的表达。在一个实施方案中，所述阵列可用于在阵列中测定基因在组织中的表达以确定基因的组织特异性。这样，可同时测定多至约7600个基因的表达。这允许产生显示一系列在一个或多个组织中特异性表达的基因的特征谱。
除了这样的定性测定外，本发明还允许定量基因表达。因此，不仅可确定一系列基因的组织特异性而且还可确定其在组织中的表达水平。因此，可基于它们本身的组织表达和在该组织中的表达水平对基因进行分类。这在例如确定组织之间基因表达的关系中是有用的。因此，可扰乱一个组织，然后可测定对第二组织的基因表达的效应。在本说明书中，可测定一个细胞类型响应生物刺激而对另一个细胞类型的效应。这样的测定例如对于在基因表达的水平上了解细胞间相互作用的效应是有用的。如果治疗性施用试剂以治疗一种细胞类型但对另一种细胞类型具有不期望的效应，那么本发明提供了测定所述不期望的效应的分子基础的测定，从而提供了共施用拮抗剂或否则治疗不期望的效应的机会。类似地，即使在单个细胞类型中，可在分子水平上测定不期望的生物效应。因此，可确定和抵消试剂对除了靶基因外的基因的表达的效应。
在另一个实施方案中，所述阵列可用于监测阵列中一个或多个基因表达的时间过程。这可在不同生物背景中发生，如本文中所公开的，例如肿瘤障碍的发生，肿瘤障碍的进展和过程，与肿瘤障碍相关的这样的细胞转化。
所述阵列对于确定基因的表达对相同细胞或不同细胞中其他基因的表达的效应也是有用的。如果最终的或下游靶不能被调控，那么这提供了例如用于治疗干预的备选分子靶的选择。
所述阵列对于确定正常和异常细胞中一个或多个基因的差异表达模式也是有用的。这提供了一系列可用作用于诊断或治疗干预的分子靶的基因。
V.用于获得样品的方法
用于本发明的方法的样品包括表达本发明的标志的任何组织、细胞、活检组织或体液样品。在一个实施方案中，样品可以是组织、细胞、全血、血清、血浆、口腔刮取物(buccal scrape)、唾液、脑脊髓液、尿、粪便或支气管肺泡灌洗。在优选实施方案中，所述组织样品是肿瘤障碍样品，包括肿瘤样品。
可通过本领域内已知的多种技术包括例如，通过使用活组织检查或通过刮取或擦抹表面或通过使用针抽吸体液来从受试者获取身体样品。用于收集各种身体样品的方法在本领域内是公知的。
适合用于检测和定量本发明的标志的组织样品可以是新鲜的、按照本领域技术人员已知的方法冷冻或固定的。优选将适当的组织样品切片和置于显微镜载玻片上以用于进一步分析。可选择地，可溶解和/或匀浆固体样品即组织样品，随后将其作为可溶性提取物进行分析。
在一个实施方案中，使用例如液氮或二氯二氟甲烷冷冻新获得的活检样品。使用例如OCT支撑冷冻的样品以用于切片，在低温保持器(cryostat)中连续切片。将连续切片收集在玻璃显微镜载玻片上。为了进行免疫组织化学染色，可用例如铬明矾、明胶或多聚-L-赖氨酸涂铺载玻片以确保切片粘在载玻片上。在另一个实施方案中，在切片之前将样品固定和包埋。例如，可将组织样品固定在例如福尔马林中，系列脱水，包埋在例如石蜡中。
一旦获得样品，可使用本领域已知的适合于检测和定量本发明的标志的任何方法(在核酸或在蛋白质水平上)。此类方法本领域内是公知的并且包括但不限于western印迹、northern印迹、southern印迹、免疫组织化学、ELISA例如扩增ELISA、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞术、免疫细胞化学、质谱分析例如MALDI-TOF和SELDI-TOF、核酸杂交技术、核酸逆转录法和核酸扩增法。在具体的实施方案中，使用例如特异性结合此类蛋白的抗体在蛋白质水平上检测本发明的标志的表达。
样品可能需要进行修饰以使本发明的标志易于接近以便抗体结合。在免疫细胞化学或免疫组织化学法的具体方面，可将载玻片转移至预处理的缓冲液和任选地加热以增加抗原可及性。在预处理缓冲液中加热样品快速地破坏细胞的脂质双层，并且使抗原(可以是在新鲜样本中的情况，但通常不是在固定的样本中发生的情况)更易于接近以便抗体结合。术语″预处理缓冲液″和″制备缓冲液″在本文中可互换使用，是指用于制备细胞学或组织学样品以用于免疫染色(特别地通过增加本发明的标志对抗体结合的可及性)的缓冲液。预处理缓冲液可包含pH-特异性盐溶液、聚合物、去垢剂或非离子或阴离子表面活性剂例如乙氧基化的阴离子或非离子表面活性剂、链烷酸酯或烷氧基化物或甚至此类表面活性剂的混合物或甚至胆汁盐的使用。预处理缓冲液可以例如是0.1％至1％的脱氧胆酸、钠盐的溶液或聚乙二醇单十二醚-13-羧酸钠(例如，Sandopan LS)或/和乙氧基化阴离子复合物的溶液。在某些实施方案中，预处理缓冲液还可用作载玻片保存缓冲液。
用于使本发明的标志蛋白更易于接近以便抗体结合的任何方法可用于本发明的实施，包括本领域内已知的抗原修复法。参见，例如，Bibbo，等人(2002)Acta.Cytol.46：25-29；Saqi，等人(2003)Diagn.Cytopathol.27：365-370；Bibbo，等人(2003)Anal.Quant.Cytol.Histol.25：8-11，每一篇所述文献的全部内容通过引用并入本文。
在预处理以增加标志蛋白的可及性后，可使用适当的封闭试剂例如过氧化物酶封闭试剂例如过氧化氢封闭样品。在某些实施方案中，使用蛋白质封闭试剂封闭样品以防止抗体的非特异性结合。蛋白质封闭试剂可包含例如纯化的酪蛋白。随后将特异性结合本发明的标志的抗体，特别是单克隆或多克隆抗体与样品一起温育。本领域技术人员应理解，可在一些情况下通过在患者样品中检测本发明的标志蛋白上的多个表位来获得更准确的预后或诊断。因此，在具体的实施方案中，使用至少两个针对本发明的标志的不同表位的抗体。其中使用超过一个抗体，可将此类抗体以单个抗体试剂的形式顺次加入至单个样品，或以抗体混合物的形式同时加入至单个样品。可选择地，可将每一种单个抗体加入至来自相同患者的分开的样品，并且将所得的数据集合在一起。
用于检测抗体结合的技术在本领域内是公知的。可通过使用化学试剂来检测结合本发明的标志的抗体，所述化学试剂产生相应于抗体结合的水平从而相应于标志蛋白表达的水平的可检测信号。在本发明的免疫组织化学或免疫细胞化学法之一中，通过使用缀合至标记的聚合物的二抗检测抗体结合。标记的聚合物的实例包括但不限于聚合物-酶缀合物。通常将此类复合物中的酶用于催化色原在抗原-抗体结合位置的沉积，从而导致相应于目的生物标志的表达水平的细胞染色。具体的目的酶包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。
在本发明的一个具体的免疫组织化学或免疫细胞化学方法中，通过使用缀合至二抗的HRP-标记的聚合物来检测结合本发明的标志的抗体。还可通过使用结合单克隆或多克隆抗体的物种特异性探针试剂和缀合至HRP的聚合物(其结合物种特异性探针试剂)检测抗体结合。使用任何色原例如色原3，3-二氨基联苯(DAB)针对抗体结合对载玻片进行染色，然后用苏木精以及任选地蓝色剂例如氢氧化铵或TBS/Tween-20进行复染。其他适当的色原包括例如3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)。在本发明的某些方面，由细胞技术员和/或病理学家用显微镜观察载玻片以评估细胞染色，例如荧光染色(即，标志表达)。可选择地，可通过自动化显微术或通过人员借助帮助鉴定阳性染色细胞的计算机软件来评论样品。
可通过将抗标志抗体偶联至可检测物质来帮助抗体结合的检测。可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。适当的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适当的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母荧光蛋白(aequorin)以及适当的放射性物质的实例包括125I、131I、35S、14C或3H。
在本发明的一个实施方案中，如上所述制备冷冻的样品，随后用使用例如三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(TBS)稀释至适当浓度的抗本发明的标志的抗体染色。可通过在生物素化的抗免疫球蛋白中温育载玻片来检测一抗。可任选地放大该信号，使用抗原的二氨基联苯胺沉淀使该信号可视。此外，可任选地用例如苏木精对载玻片进行复染以使细胞可视。
在另一个实施方案中，如上文中对于冷冻切片所描述的，用抗本发明的标志的抗体染色被固定并且包埋的样品和对所述样品进行复染。此外，可以任选地用放大信号的试剂处理样品以使抗体染色可视。例如，可使用生物素基-酪胺的过氧化物酶催化的沉积，所述生物素基-酪胺然后与过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白反应(CatalyzedSignal Amplification(CSA)System，DAKO，Carpinteria，CA)。
基于组织的测定(即，免疫组织化学)是检测和定量本发明的标志的优选方法。在一个实施方案中，本发明的标志的存在或不存在可通过免疫组织化学来检测。在一个实施方案中，免疫组织化学分析使用低浓度的抗标志抗体以便缺乏所述标志的细胞不染色。在另一个实施方案中，本发明的标志的存在或不存在可使用免疫组织化学法来测定，所述免疫组织化学法使用高浓度的抗标志抗体以便缺乏所述标志蛋白的细胞染色加重。不染色的细胞包含突变的标志并且不能产生抗原上可识别的标志蛋白，或为其中调节标志水平的途径失调，从而导致可忽略的标志蛋白的稳态表达的细胞。
本领域技术人员应当知道，用于实施本发明的方法的特定抗体的浓度将取决于这样的因素如结合的时间、抗体对于本发明的标志的特异性和样品制备的方法而变化。此外，当使用多个抗体时，可按照其中将抗体用于样品的顺序，例如作为混合物同时施用或作为单个抗体试剂顺次地施用来获得所需浓度。此外，用于使抗体对本发明的标志的结合可视的检测化学必须也进行最优化以产生所需信噪比。
在本发明的另一个实施方案中，蛋白质组学方法例如质谱法对于检测和定量本发明的标志蛋白是有用的。例如，基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)或表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry)(SELDI-TOF MS)(其包括将生物样品例如血清用于蛋白质-结合芯片)(Wright，G L.，Jr.等人(2002)Expert Rev Mol Diagn 2：549；Li，J.等人(2002)Clin Chem 48：1296；Laronga，C.，et al.(2003)DisMarkers 19：229；Petricoin，E.F.等人(2002)359：572；Adam，B.L.等人(2002)Cancer Res 62：3609；Tolson，J.等人(2004)Lab Invest 84：845；Xiao，Z.等人(2001)Cancer Res 61：6029)可用于检测和定量PY-Shc和/或p66-Shc蛋白。质谱法描述于例如美国专利5,622,824、5,605,798和5,547,835中，每一篇所述专利的全部内容通过引用并入本文。
在其他实施方案中，在核酸水平上检测本发明的标志的表达。用于评估表达的基于核酸的技术在本领域内是公知的，包括例如测定受试者的样品的标志mRNA的水平。许多表达检测方法使用分离的RNA。不针对mRNA的分离进行选择的任何RNA分离技术可用于从表达本发明的标志的细胞纯化RNA(参见，例如，Ausubel等人编辑(1987-1999)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，New York)。此外，可使用本领域技术人员公知的技术例如Chomczynski的单步RNA分离法(1989，美国专利No.4,843,155)容易地处理大量组织样品。
术语“探针”是指能够选择性结合本发明的标志例如核苷酸转录物和/或蛋白质的任何分子。可由本领域技术人员合成探针，或可从适当的生物制剂衍生探针。探针可被特殊设计以被标记。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
分离的mRNA可用于杂交或扩增测定，所述测定包括但不限于Southern或Northern分析、聚合酶链式反应分析和探针阵列。用于检测mRNA水平的一个方法包括将分离的mRNA与可与所述标志mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是例如全长cDNA或其部分，例如在长度上至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸并且足以在严格条件下与标志基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。
在一个实施方案中，通过例如将分离的mRNA在琼脂糖凝胶上电泳并且将所述mRNA从凝胶转移至膜例如硝酸纤维素上来将所述mRNA固定在固体表面上，然后将其与探针接触。在可选择的实施方案中，将探针固定在固体表面上，然后将mRNA与例如Affymetrix基因芯片阵列中的探针接触。本领域技术人员可容易地改造已知的mRNA检测法以使之适合用于检测标志mRNA的水平。
用于测定样品中标志mRNA水平的可选择的方法包括例如利用RT-PCR(Mullis，1987，美国专利No.4,683,202中所示的实验性实施方案)、连接酶链式反应(Barany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：189-193)、自主序列复制(Guatelli等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人，1988，Bio/Technology6：1197)、滚环复制(Lizardi等人，美国专利No.5,854,033)或任何其他核酸扩增法进行核酸扩增，然后使用本领域技术人员公知的技术检测扩增的分子的过程。这些检测方案对于核酸分子的检测是特别有用的，如果此类分子以非常低的数量存在的话。在本发明的具体方面，利用定量荧光RT-PCR(即，TaqManTM系统)评估标志表达。此类方法通过使用成对的特异于本发明的标志的寡核苷酸引物。用于设计特异于已知序列的寡核苷酸引物的方法在本领域内是公知的。
本发明的标志的表达水平可使用膜印迹(例如杂交分析例如Northern、Southern、点杂交分析等中使用的)或微孔、样品管、凝胶、珠粒或纤维(或包含结合的核酸的任何固体支持物)来监测。参见美国专利5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，将其通过引用并入本文。标志表达的检测还可包括使用溶液中的核酸探针。
在本发明的一个实施方案中，使用微阵列检测本发明的标志的表达。微阵列因不同实验之间的可重现性而特别适合于该目的。DNA微阵列提供了一种用于同时测量大量基因的表达水平的方法。每一个阵列由连接至固体支持物的捕获探针的可重复模式组成。将标记的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，然后通过激光扫描进行检测。测定阵列上每一个探针的杂交强度，将其转换成代表相对基因表达水平的数值。参见美国专利6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316，将其通过引用并入本文。高密度寡核苷酸阵列对于测定样品中大量RNA的基因表达特征谱是特别有用的。
通过使用本发明的方法(其可包括对于本领域技术人员来说是已知的回归分析方法)，磷酸化标志的量，和/或本发明的标志的量的数据关系可用于计算正在进行肿瘤障碍的治疗的受试者的肿瘤障碍的复发的风险、正在进行肿瘤障碍的治疗的受试者的存活率、肿瘤障碍是否具有侵袭性、治疗方案治疗肿瘤障碍的功效等。例如，适当的回归模型包括但不限于CART(例如，Hill，T，和Lewicki，P.(2006)“STATISTICS Methods and Applications”StatSoft，Tulsa，OK)、Cox(例如，www.evidence-based-medicine.co.uk)、指数、正态和对照正态(例如，www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html)、逻辑(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression或http://faculty.chass.ncsu.edu/garson/PA765/logistic.htm)、参数、非参数、半参数(例如，www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion)、线性(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression或http://www.curvefit.com/linear_regression.htm)或累加模型(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model或http://support.sas.com/rnd/app/da/new/dagam.html)。
在一个实施方案中，回归分析包括磷酸化标志的量。在另一个实施方案中，回归分析包括标志数学关系。在另一个实施方案中，磷酸化标志的量的回归分析和/或标志的数学关系可包括其他临床和/或分子协变量(co-variate)。此类临床协变量包括但不限于结节状态、肿瘤分期、肿瘤分级、肿瘤尺寸、治疗方案例如化学疗法和/或放射疗法、临床结果(例如，复发、疾病特异性存活、治疗失败)和/或作为诊断后时间、治疗起始后时间和/或治疗完成后时间的函数的临床结果。
在一个实施方案中，通过使用本发明的方法(其可包括对于本领域技术人员来说是已知的回归分析方法)，磷酸化标志的量，和/或本发明的标志的量的数据关系可用于计算正在进行肿瘤障碍的治疗的受试者的肿瘤障碍的复发的风险、正在进行肿瘤障碍的治疗的受试者的存活率、肿瘤障碍是否具有侵袭性、治疗方案治疗肿瘤障碍的功效等。例如，适当的回归模型包括但不限于CART(例如，Hill，T，和Lewicki，P.(2006)“STATISTICS Methods and Applications”StatSoft，Tulsa，OK)、Cox(例如，www.evidence-based-medicine.co.uk)、指数、正态和对照正态(例如，www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html)、逻辑(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression或http://faculty.chass.ncsu.edu/garson/PA765/logistic.htm)、参数、非参数、半参数(例如，www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion)、线性(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression或http://www.curvefit.com/linear_regression.htm)或累加模型(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model或http://support.sas.com/rnd/app/da/new/dagam.html)。
在某些实施方案中，回归分析包括磷酸化标志的量。在另一个实施方案中，回归分析包括标志的数学关系。在另一个实施方案中，磷酸化标志的量的回归分析和/或标志的数学关系可包括其他临床和/或分子协变量。此类临床协变量包括但不限于结节状态、肿瘤分期、肿瘤分级、肿瘤尺寸、治疗方案例如化学疗法和/或放射疗法、临床结果(例如，复发、疾病特异性存活、治疗失败)和/或作为诊断后时间、治疗起始后时间和/或治疗完成后时间的函数的临床结果。
VI.试剂盒
本发明还提供了用于预后肿瘤障碍、肿瘤障碍的复发或进行肿瘤障碍治疗的受试者的存活率的药物组合物和试剂盒。这些试剂盒包括如下的一项或多项：特异性结合本发明的标志的可检测抗体、特异性结合本发明的标志的可检测抗体、用于获得和/或制备用于染色的受试者组织样品的试剂以及使用说明书。
本发明的试剂盒可任选地包括用于进行本发明的方法的其他成分。作为例子，试剂盒可包括适合用于使互补核酸退火或用于使抗体与与其特异性结合的蛋白质结合的液体(例如，SSC缓冲液)、一个或多个样品区室、描述本发明的方法的性能的说明材料以及组织特异性对照/标准。
VII.筛选测定
本发明的靶包括但不限于随后列于本文中的表1-28中的基因。基于本文中由申请人描述的实验的结果，受Q10调节的至关重要的蛋白质与包括转录因子、细胞凋亡反应、戊糖磷酸途径、生物合成途径、氧化性应激(促氧化剂)、膜改变和氧化磷酸化代谢的不同途径或分子组相关或可被分类不同途径或分子组。基于本文中提供的结合，如下概述受CoQ10调节的至关重要的蛋白质。受CoQ10调节的并且为转录因子的至关重要的蛋白质为HNF4α。受CoQ10调控并且与细胞凋亡反应相关的至关重要的蛋白质包括Bcl-xl、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA和cMyc。受CoQ10调控并且与戊糖磷酸途径相关的至关重要的蛋白质为转醛醇酶1。受CoQ10调控并且与生物合成途径相关的至关重要的蛋白质包括COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶和4-羟基苯甲酸酯。受CoQ10调控并且与氧化性应激(促氧化剂)相关的至关重要的蛋白质包括中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A和超氧化物歧化酶2(线粒体)。受CoQ10调控并且与氧化磷酸化代谢相关的至关重要的蛋白质包括细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III和复合物IV。受CoQ10直接或间接调控的其他至关重要的蛋白质包括Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C、钙调蛋白激酶II。
因此，在本发明的一个实施方案中，靶可包括HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-羟基苯甲酸酯、中性粒细胞胞质因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C、钙调蛋白激酶II。在优选实施方案中，药物靶可包括HNF4A、转醛醇酶、NM23和BSCv。在一个实施方案中，所述靶为TNF4A。在一个实施方案中，靶是转醛醇酶。在一个实施方案中，所述靶为NM23。在一个实施方案中，所述靶为BSCv。下面描述用于鉴定已鉴定的靶的调节剂的筛选测定法。
本发明还提供了用于鉴定通过调节本发明的标志的表达和/或活性调节癌细胞的侵袭性的调节剂，即候选或测试化合物或试剂(例如，蛋白质、肽、肽模拟物、类肽、小分子或其他药物)的方法(在本文中也称为“筛选测定法”)。此类测定法通常包括本发明的标志与一种或多种测定成分之间的反应。其他成分可以是测试化合物本身或测试化合物与本发明的标记物的天然结合伴侣的组合。通过测定法例如本文中描述的测定法鉴定的化合物可以对于例如调节，例如抑制、缓和、治疗或预防癌细胞的侵袭性是有用的。
用于本发明的筛选测定法的测试化合物可从任何可获得的来源(包括天然和/或合成化合物的系统文库)获得。还可在本领域内已知的组合文库法中利用许多方法的任何方法获得测试化合物，所述组合文库法包括：生物文库；类肽文库(具有肽的功能性但具有抗酶促降解然而仍保持生物活性的新型非肽主链的分子的文库)；参见，例如，Zuckermann等人，1994，J.Med.Chem.37：2678-85)；空间可寻址的平行固相或液相文库；需要重叠合(deconvolution)的合成文库法；′一珠一化合物′文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。生物学文库和类肽文库法限定于肽文库，然而所述其他4个方法适用于化合物的肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam，1997，Anticancer DrugDes.12：145)。
用于分子文库的合成的方法的实例可见于本领域中，例如见于：DeWitt等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Zuckermann等人(1994)。J.Med.Chem.37：2678；Cho等人(1993)Science 261：1303；Carrell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061中；和Gallop等人(1994)J.Med.Chem.37：1233中。
化合物的文库存在于溶液中(例如，Houghten，1992，Biotechniques13：412-421)或珠粒(Lam，1991，Nature 354：82-84)、芯片(Fodor，1993，Nature 364：555-556)、细菌和/或孢子(Ladner，USP 5,223,409)、质粒(Cull等人，1992，Proc Natl Acad Sci USA 89：1865-1869)上或噬菌体上(Scott和Smith，1990，Science 249：386-390；Devlin，1990，Science249：404-406；Cwirla等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382；Felici，1991，J.Mol.Biol.222：301-310；Ladner，同上)。
本发明的筛选方法包括将癌细胞与测试化合物接触和测定所述测试化合物调节本发明的标志在细胞中的表达和/或活性的能力。本发明的标志的表达和/或活性可如本文中所描述的进行测定。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于筛选为本发明的标志或其生物活性部分的底物的候选或测试化合物的测定法。在另一个实施方案中，本发明提供了用于筛选结合本发明的标志或其生物活性部分的候选或测试化合物的测定法。测定测试化合物直接结合标志的能力可以例如通过将所述化合物与放射性同位素或酶促标记偶联(以便化合物与标志的结合可通过检测复合物中标记的标记化合物来测定)来实现。例如，可直接或间接地用131I、125I、35S、14C或3H标记化合物(例如，标记底物)，并且通过射电辐射(radioemission)的直接计数或通过闪烁计数检测放射性同位素。可选择地，可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶酶促标记测定成分，并且通过测定适当的底物至产物的转化来检测所述酶促标记。
本发明还涉及通过上述筛选测定法鉴定的新型试剂。因此，进一步在适当的动物模型中使用本文中描述的鉴定的试剂在本发明的范围内。例如，可将能够调节本文中描述的鉴定的本发明的标记的表达和/或活性的试剂用于动物模型以测定利用这样的试剂进行的治疗的功效、毒性或副作用。可选地，可将本文中描述的鉴定的试剂用于动物模型以确定这样的试剂的作用机制。此外，本发明涉及通过上述筛选测定法鉴定的新型试剂用于上述治疗的用途。
本发明通过下列实施例进一步举例说明，所述实施例不应当解释为限制。在整个本申请中引用的所有参考资料和公布的专利和专利申请的内容通过引用并入本文。
发明实施例：
实施例1：CoQ10被鉴定为MIM
为了将CoQ10评估为潜在MIM，向一组细胞系(包括癌细胞系和正常对照细胞系)中外源加入以氧化形式存在的CoQ10，然后评估诱导的组中每一个细胞系的细胞微环境特征谱的变化。评估细胞形态学/生理学以及细胞组成(包括mRNA和蛋白质水平)的变化，并且比较患病细胞相对于正常细胞的所述变化。这些实验的结果将CoQ10，特别是CoQ10的氧化形式鉴定为MIM。
在第一组实验中，通过检查细胞对CoQ10的敏感性和细胞凋亡反应来评估细胞形态学/生理学的变化。用不同水平的辅酶Q10处理一组皮肤细胞系，包括对照细胞系(解质细胞和黑素细胞的原代培养物)和几个皮肤癌细胞系(SK-MEL-28，非转移性皮肤黑素瘤；SK-MEL-2，转移性皮肤黑素瘤；或SCC，鳞状细胞癌；PaCa2，胰腺癌细胞系；或HEP-G2，肝癌细胞系)。这些实验的结果显示癌细胞系展示了与对照细胞系相比较改变的剂量依赖性反应，只在癌细胞中诱导了细胞凋亡和细胞死亡。示例性实验详细地描述于下面的实施例3中。
然后使用测定评估用CoQ10处理后的细胞的组成的变化。使用实时PCR阵列法在mRNA水平上分析基因表达的变化。在下面的实施例6和9-13中详细描述了示例性实验。在互补实验中，通过使用抗体微阵列法、双向凝胶电泳，然后使用质谱表征法进行的蛋白质鉴定，以及通过western印迹分析法来在蛋白质水平上分析基因表达的变化。示例性实验分别在下面详细地描述于实施例4、7和8中。这些测定的结果显示在被检查的细胞系中mRNA和蛋白质水平上的基因表达的变化因CoQ10的氧化形式的加入而被诱导。发现被CoQ10处理调节的基因集簇在几个细胞途径中，包括细胞凋亡、癌生物学和细胞生长、糖酵解和代谢、分子运输和细胞信号转导。
进行实验以确认CoQ10进入细胞并且测定存在于细胞中的CoQ10的水平和形式。具体地，通过分析来自用CoQ10处理的细胞的富集线粒体的制剂来测定存在于线粒体中的辅酶Q10的水平以及CoQ10的形式(即氧化的或还原的)。对于外源Q10的添加，存在于线粒体中的辅酶Q10的水平被确认以时间和剂量依赖性的方式增加。在令人惊讶和意外的结果中，CoQ10经确定主要以氧化形式存在于线粒体中。此外，通过使用2-D凝胶电泳和利用质谱表征的蛋白质鉴定来分析来自富集线粒体的样品的蛋白质的水平的变化。这些实验的结果显示在检查的时间过程中线粒体中的CoQ10的氧化形式的水平与许多细胞变化相关，如由与代谢和细胞凋亡途径相关的特定蛋白质的mRNA和蛋白质水平的调节所证明的。示例性实验详细地描述于下面实施例5中。
由本申请人描述的结果将内源分子CoQ10，具体地CoQ10的氧化形式鉴定为MIM。例如，所述结果将CoQ10鉴定为MIM，因为观察到CoQ10在mRNA和蛋白质水平上都诱导基因表达的变化。所述结果将CoQ10鉴定为具有多维特征，因为CoQ10诱导了疾病状态(例如，癌症)相对于正常(例如，非癌)状态的细胞形态学/生理学和细胞组成(例如，mRNA和蛋白质水平上的基因表达的差异变化)的差异变化。此外，所述结果将CoQ10鉴定为具有多维特征，因为CoQ10能够进入细胞，从而展示治疗和载体效应。
实施例2：用于鉴定肿瘤障碍的疾病相关进程和生物标志的方法
根据其中用目的分子处理细胞系的基于细胞的测定，利用mRNA阵列、蛋白质抗体阵列和2D凝胶电泳评估处理的细胞对未处理的细胞的差异。利用途径分析(Ingenuity IPA软件)和已知文献的综述从系统生物学角度评估受MIM或表观代谢转变剂调节的通过比较样品分析鉴定的蛋白质。将被鉴定为潜在治疗剂或生物标记靶的蛋白质经历确认测定例如Western印迹分析、siRNA敲低或重组蛋白质产生和表达法。
用于实施例3-8的材料和方法
辅酶Q10原液
如下制备500μM辅酶Q10(5％异丙醇于细胞生长培养基中)。每一次都新配制10mL 500μM辅酶Q10原液。分子量：863.34(0.0005mol/L)(0.010L)(863.34g/mol)＝0.004317g为了制备10mL 500μM原液，称取4.32mg辅酶Q10置于15mL falcon管中，加入500μL异丙醇。在50-60℃水浴中温热溶液，同时涡旋以完全溶解。向该溶液中加入9.5mL培养基(在其中培养细胞的相同培养基)。
细胞培养
细胞获自美国典型培养物保藏中心或Gibco。将细胞培养在补充有5％胎牛血清、0.25ug/mL两性霉素，100ug/mL链霉素和100UmL-1青霉素的DMEM/F-12培养基中。将细胞在37℃下维持在95％空气和5％CO2的大气中。
辅酶Q10处理和总蛋白质分离
在接触Q10之前使细胞生长至85％的汇合。利用Q10将补充的培养基条件化至50和100微摩尔浓度。以一式三份用对照、50μM Q10和100μM Q10处理培养瓶。在4、8、12和24小时后从处理的培养瓶和对照培养瓶分离蛋白质。为了分离蛋白质，用5mL pH为7.4的冰冷PBS洗涤细胞3次。随后将细胞刮入3mL PBS中，通过离心沉淀，重悬浮于pH 7.4的裂解缓冲液(80mM TRIS-HCl，1％SDS，具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中。使用BCA法定量蛋白质浓度。
细胞系
繁殖下面所列的细胞系，建立每一个细胞系的细胞库。大规模产生用于不同测定的细胞，收获材料以进行分析。一般而言，当不需要细胞特异性培养基来维持细胞系时，用于细胞生长的培养基是具有5％血清的DMEMF-12。在破裂之前通常使细胞生长至75-80％汇合(清楚的间隔)，将其用于细胞测定，进行标准操作方法。建立用于实验的下列细胞系：
SK-MEL-28(非转移性皮肤黑素瘤)
SK-MEL-2(转移性皮肤黑素瘤)
HEKa(角质细胞，皮肤对照)
HEMa(黑素细胞，皮肤对照)
nFIB(新生成纤维细胞)
HEP-G2(肝癌)[SBH细胞系]
SkBr-3(Her2过表达的乳腺癌)
MCF-7(乳腺癌，p53突变)
PC-3(前列腺癌)[SBH细胞系]
SkBr-3(人乳腺腺癌)
NCI-ES-0808
SCC(鳞状细胞癌)
PaCa-2
NIH-3T3
细胞培养：
细胞获自美国典型培养物保藏中心或Gibco。将细胞培养在补充有5％胎牛血清、0.25ug/mL两性霉素、100ug/mL链霉素和100UmL-1青霉素的DMEM/F-12培养基中。将细胞在37℃下维持在95％空气和5％CO2的大气中。
在具有Glutamax(Invitrogen，Carlsbad CA)的补充有5％FBS、两性霉素和青霉素/链霉素的DMEM/F12中培养和维持皮肤恶性黑素瘤SK-MEL28细胞。将细胞于37℃、5％CO2下进行培养。另外的细胞系和生长条件的细节概述于下表中。
表1.就对Q10的敏感性分析的细胞系
Figure BPA00001497291601041
Figure BPA00001497291601051
SKMEL28细胞的Q10治疗：
用100μM Q1或对照媒介物处理SK-MEL28细胞。如下配制Q10。在15mL加帽的试管中，转移4.32mg Q10(由Cytotech提供)，随后通过加入500μL异丙醇将其溶解。将所得的溶液在65℃水浴中加温，以高速涡旋。通过加入平衡的细胞培养基将Q10/异丙醇溶液变成10mL的体积。随后涡旋原液以确保Q10的最大溶解度。稀释原液(2mL原液用8mL培养基)以获得100μM Q10的终浓度。对于对照媒介物，将9.5mL的培养基加入500μL的异丙醇。用8mL培养基进一步稀释对照原液(2mL的原液)。在处理开始后第6、16、24、48或72小时收获细胞。
SCC细胞的Q10处理：
利用100μM Q10(如上所述制备的)处理SCC细胞6小时或24小时。对照细胞是未处理的细胞。在处理后不同的时间点收获和沉淀细胞，快速冷冻沉淀，于-80℃下贮存直至如下所述在XTAL下分离RNA。
RNA分离：
按照制造商的说明书利用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia CA)在不同的处理时间上裂解细胞以进行RNA分离。通过测量260nm处的光密度定量RNA。
第一链合成：
按照制造商的说明书利用RT2First Strand Synthesis试剂盒(SABiosciences.，Frederick MD)从1μg总RNA合成第一链cDNA。
实时PCR：
用水稀释来自第一链合成的产物，将其与SYBR green mastermix(SABiosciences.，Frederick MD)混合，加载至PCR阵列上。在Biorad CFX96上于PCR阵列(细胞凋亡阵列、糖尿病阵列、氧化性应激和抗氧化剂防御阵列和热激蛋白阵列)(SABiosciences，FrederickMD)上进行实时PCR。
利用用于细胞凋亡的连接蛋白测定法测定细胞系对辅酶010的 敏感性：
在24小时的辅酶Q10处理后定量早期和晚期细胞凋亡中的细胞的百分比。早期和晚期细胞凋亡用作理解不同癌细胞系对辅酶Q10的敏感性的差异的标志。所测试的不同细胞系为PaCa2、HepG2、PC-3、SKBr3、MCF-7和SK-MEL28。使细胞在96孔板中粘着过夜。用对照媒介物、50μM Q10或100μM辅酶Q10处理这些细胞。24小时后，在PCA96流式细胞仪(Guava Technologies，Hayward，CA)上估计凋亡细胞的存在。此外，用4μM星状孢子素处理一些细胞2小时作为细胞凋亡的阳性对照。首先用PBS洗涤细胞，然后用50μLAccumax(Innovative Cell Technologies，San Diego，CA)在室温下解离细胞。通过加入含有1％Pluronic F-68(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的培养基终止解离。随后向每一个孔中加入100μL连接蛋白试剂(Guava Technologies，Hayward，CA)。在于黑暗中温育20分钟后，在低结合板中进行测定以使细胞对底物的再附着减少至最低程度。连接蛋白试剂包含两种染料。检测细胞外表面上的磷脂酰丝氨酸的膜联蛋白-V-PE；早期凋亡细胞的特征。第二染料7-AAD只渗透晚期凋亡细胞，然而被从活(健康)和早期凋亡细胞排出。使用Cytosoft 2.5.7软件(Guava Technologies，Hayward，CA)测定4个细胞群体：活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和碎片的百分比。
免疫印迹分析
通过免疫印迹分析测定每样品约50μg的蛋白质。在有对照的情况下，以一式三份进行所有处理。将蛋白质在12％TRIS-HCl凝胶上进行分离，通过电泳转移至硝酸纤维素膜上，使用5％牛奶和TBST溶液进行封闭，然后用一抗温育。将一抗在4℃下于5％BSA和TBST溶液中温育过夜。将二抗在4℃下温育1小时。所有抗体购自CellSignaling Technology。除β肌动蛋白以1∶5000的比率使用外，以1∶1000的比率使用抗体。使印迹显影，利用基于NIH Java的密度计分析软件Image J定量结果。还探测所有印迹，并且针对它们各自的β肌动蛋白的表达进行标准化。
双向电泳
在等电聚焦(IEF)之前，将样品溶解在40mM Tris、7M脲、2M硫脲和1％C7两性离子去污剂中，用三丁基膦还原，用10mM丙烯酰胺在室温下烷基化90分钟。之后，利用至少3倍体积的重悬浮缓冲液(由7M脲，2M硫脲和2％CHAPS组成)使样品通过10-kDa截断值的Amicon Ultra装置以减少样品的电导率。将100微克蛋白质在11-cm pH 3至10，pH 4至7或pH 6至11的固定pH梯度胶条(GE，Amersham，USA)上经历IEF至100,000伏小时。在IEF后，将固定pH梯度胶条于6M脲、2％SDS、50mM Tris-醋酸盐缓冲液、pH 7.0和0.01％溴酚蓝中进行平衡，然后在8至16％Tris-HCl Precast凝胶、1mm(Bio-Rad，USA)上经历SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。以一式三份进行凝胶电泳。将它们固定，于SYPRO Ruby，80mL/凝胶(Invitrogen，USA)中染色，在Fuji FLA-5100激光扫描仪上成像或转移至PVDF膜上。
获得对照样品的其他信息以通过使用方法测试蛋白质鉴定的效用，所述方法利用dPC(Protein Forest Inc.)选择性pI分级分离，然后对dPC plug进行胰蛋白酶降解，利用质谱法进行鉴定和半定量(Nanomate或LC/LTQ/MS)。利用对照样品进行的dPC分析证明了其在鉴定一大亚组蛋白质中的效用。将在研究过程中产生的物质归档以便将来需要出现时它们可用作来源。
2D凝胶成像分析：
使用Progenesis Discovery和Pro(Nonlinear Dynamics Inc.，Newcastle upon Tyne，UK)进行所有凝胶成像的分析。在点检测、匹配、本底扣除、标准化和滤过后，输出SYPRO Ruby凝胶图像的数据。在Progenesis Discovery中使用学生t检验进行组之间的成对比较以鉴定其表达被显著改变的点(p＞0.05)。
抗体阵列：
利用抗体微阵列(Panorama XP725抗体阵列，Sigma)筛选700多种蛋白质抗体以评估Q10处理的细胞(SK-MEL-28，SCC)中蛋白质浓度水平的变化。当蛋白质被点在载玻片上的相应抗体结合时，蛋白质在细胞提取物中的表达获得检测。在结合之前，将用于荧光可视化和定量分析的荧光染料直接标记蛋白质。将所述阵列用于比较两个样品(测试样品对参照样品)的蛋白质表达特征谱，每一个样品用不同的CyDye(Cy3或Cy5)标记，将两个样品以相同的蛋白质浓度同时用于阵列上。随后在相应于样品的染料标记的波长上分别记录每一个样品的荧光信号强度，然后比较所述荧光信号强度。
高剂量的辅酶Q10在培养的SKMEL-28细胞中调节细胞凋亡、糖尿病和氧化性应激途径中牵涉的基因的表达。
实验内容：SKMEL-28细胞(ATCC目录号HTB-72)是培养在含有Glutamax(Invitrogen Cat#10565-042)的补充有5％FBS、青霉素、链霉素和两性霉素的DMEM-F12中的非转移性皮肤黑素瘤细胞，利用媒介物或100uM辅酶Q10处理，进行不同的时间量。使用实时PCR阵列(细胞凋亡目录号PAHS-12，糖尿病目录号PAHS-023和氧化性应邀目录号PAHS-065)(SABiosciences，Frederick，MD)定量辅酶Q10处理后基因表达的任何变化。
通过将4.32mg溶解在500ul异丙醇中来制备500uM辅酶Q10的原液浓度，随后通过加入培养基将其进一步稀释。交替涡旋和加热至65℃，溶解辅酶Q10。用培养基将2mL原液稀释至10mL以获得含有100uM Q10的培养基，将其用于处理细胞。利用相似的方案(除不加入辅酶Q10外)平行制备媒介物。
将SKMEL-28细胞以1×105个细胞/孔的密度涂铺在6孔板中。24小时后，当细胞已附着并且处于50％汇合时，加入所述媒介物或100uM Q10。在Q10处理后第16、24、48或72小时收获细胞，而媒介物处理的细胞在24小时后收获。按照制造商的说明书，利用RNeasyMini试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia CA Cat#74104)试剂盒，使用离心柱(spin column)和柱上DNA酶处理(on-column DNase treatment)在不同的处理时间上裂解细胞以进行RNA分离。通过测量RNA 260nm处的吸光度定量RNA。
按照制造商的推荐，利用具有基因组DNA消除步骤的RT2FirstStrand Synthesis试剂盒(SABiosciences.，Frederick MD Cat#C-03)，将0.4-1ug总RNA用作模板，通过第一链cDNA合成来进行实时PCR。用水稀释来自第一链合成的产物，将其与SYBR green mastermix(SABiosciences.，Frederick MD Cat#PA-010-12)混合，加载至PCR阵列上，所述阵列包含用于共同途径中关联的84个不同基因、用于标准化的5个管家基因、逆转录和PCR对照的引物测定。在BioradCfx96上进行实时PCR。利用热启动激活酶来起始扩增，然后进行40个循环(每个循环：95℃-15秒变性步骤和60℃-1分钟退火和延伸步骤)，然后进行解链曲线程序。在excel电子表格中组织Ct值，来自PCR热循环仪的所有处理组的输出，将其加载至可在http://www.Sabiosciences.Com/pcr/arrayanalysis.php上获得的比较分析软件。
富集线粒体的样品的纯化：
实验内容：通过洗涤和刮取从T160培养瓶收获用100μM Q10处理24或48小时的SKMEL-28，NCI-ES0808和NIH-3T3细胞连同在t＝0时收获的细胞。将细胞离心，沉淀，快速冷冻并且于-80℃下贮存直至分离线粒体。将细胞解冻，重悬浮并且于杜恩斯匀浆器中进行破碎。将匀浆离心，使用由用于培养细胞的线粒体分离试剂盒(MitoSciences，Eugene OR，Cat#MS852)推荐的试剂和方案分离线粒体。将线粒体级分等分并且于-80℃贮存。
辅酶Q10和泛醇-10定量法：
基于最近公布的方法(Ruiz-Jimenez，2007，J.Chromatogr.A，1175，242-248)通过使用在阳离子模式中利用电喷射离子化(ESI)的LC-MS/MS执行用于同时测定辅酶Q10(Q10)和还原形式泛醇-10(Q10H2)的方法。Q10和Q10H2的高选择性鉴定和灵敏性定量连同其他选择的脂质的鉴定是可能的。将来自用100μM Q10处理的SK-MEL-28的富集线粒体的样品的等分经历常规预处理，所述预处理基于蛋白质沉淀(100μL于300μL的1-丙醇中超声处理的压紧细胞)、液体-液体提取(向上清液中加入100μL水并且用200μL正己烷提取X3)、蒸发混合的己烷提取物至干燥和于50μL的95∶5甲醇/己烷(v/v)中重建。在利用Prism RP 1X100mm、5μM粒度的柱子的WatersQuattro II三重四极杆质谱仪上(Keystone Scientific)通过LC-MS/MS进行分析。以50μL/分钟的流速用4mM的20％异丙醇80％甲醇中的甲酸铵进行等度洗脱。每一个样品注射10μL。使用m/z882.7＞197.00(Q10H2)和m/z 880.80＞197.00(Q10)的跃迁(transition)，利用为40的锥孔电压和为30的碰撞能量进行MRM分析。
实施例3：细胞系对CoQ10的敏感性
在24小时的施用后，通过使用包含两种染料7AAD和膜联蛋白-V-PE的组合的试剂(连接蛋白试剂)测试许多细胞系对Q10的敏感性。7AAD染料经透性化细胞膜进入细胞；主要是处于细胞凋亡后期的那些细胞。膜联蛋白-V-PE是结合在早期凋亡细胞的质膜的外表面上表达的磷脂酰丝氨酸的染料。因此连接蛋白试剂可在流式细胞仪中用于区分不同凋亡细胞群体。
在24小时的Q10施用后，对于50μM Q10和100μM Q10，PaCa2细胞都显示早期和晚期凋亡细胞(5-10％的门控细胞)的增加。对于50μM和100μM Q10，PC-3细胞也显示早期和晚期凋亡群体的增加，虽然当与PaCa2细胞比较时，增加较少。对于50μM和100μM Q10，MCF-7和SK-MEL28细胞只显示早期凋亡群体的增加。HepG2细胞也对50μM Q10处理敏感，其中在晚期细胞凋亡和早期细胞凋亡阶段存在约20％的门控群体的增加。SKBr3是对于50μM和100μM Q10处理未显示早期和晚期细胞凋亡的任何显著增加的唯一测试的细胞系。结果描述于图1-6中。
为了提供Q10处理引起HepG2肝癌细胞的细胞凋亡反应的其他信息，使用测量单链DNA的基于ApoStrandTM ELISA的方法评估第二细胞凋亡测定。ApoStrandTM ELISA基于凋亡细胞中DNA对甲酰胺变性的敏感性和利用针对单链DNA(ssDNA)的单克隆抗体对变性DNA的检测。利用50和100μM Q10对肝癌细胞系HepG2的处理导致可检测的细胞凋亡，分别具有17％和32％的剂量反应(图7)。这些结果与Q10诱导来自其他组织的其他癌细胞系(例如，SCC、SKMEL-28、MCF-7和PC-3)的细胞凋亡的观察相符。
实施例4：利用Q10处理的细胞的蛋白质组学分析
使用蛋白质组学方法分析利用Q10处理的样品的细胞沉淀。裂解和处理细胞沉淀以用于2-D凝胶和Western印迹分析。利用Q10处理3个细胞类型(SKMEL-28、SCC和nFib)，将其经历利用2-D凝胶电脉进行的蛋白质组学表征。
利用Q10处理的SKMEL-28细胞的蛋白质组学分析
利用Western印迹和2-D凝胶电泳处理和评估的第一实验组是皮肤癌细胞系SKMEL-28。该实验组包括在第3、6、12和24小时用0、50或100μM Q10处理的SK-MEL-28细胞。
将一组Q10处理的SK-MEL-28样品经历2-D凝胶电泳(图8)并且进行分析以鉴定相对于对照样品蛋白质水平的变化。进行跨全部24块凝胶的943个点的比较分析，将对照样品与全部处理的样品相比较。分析包括鉴定因增加、减少或翻译后修饰而在时间过程中产生的点变化。
分析发现32个统计上显著的差异点变化。根据该分析，切取20个非冗余点并且通过胰蛋白酶消化和质谱表征进行蛋白质鉴定。利用Mascot和MSRAT软件分析针对蛋白质数据库搜索已表征的肽以鉴定蛋白(表2)。
表2.SKMEL-28细胞中经鉴定具有对Q10处理的差异反应的蛋白质
Figure BPA00001497291601141
本实验的重要发现是转醛醇酶1的减少，这支持Q10通过改变癌细胞内的代谢状态起作用的假定。转醛醇酶1是戊糖磷酸途径(也称为单磷酸己糖支路)中的酶。转醛醇酶(EC：2.2.1.2)催化三碳酮醇单位从7-磷酸景天庚酮糖至甘油醛3-磷酸酯的可逆转移以形成赤鲜糖-4-磷酸和果糖-6-磷酸。该酶与转酮醇酶一起提供了糖酵解与戊糖磷酸途径之间的联系。这与核苷酸和NADPH合成，促进生物合成反应的还原当量的产生和还原环境的维持。
最近的出版物(Basta，P.等人August 2008，Cancer DetectPrevention，32，200-208)提供了转醛醇酶的遗传多态性的证据并且将其与头颈部鳞状细胞癌相联系。另一个相关出版物(Qian，Y.等人May2008，Biochem J，415，123-134)将转醛醇酶缺乏鉴定为线粒体动态平衡、Ca2+流动和细胞凋亡的调节剂。
根据这些初始结果，就已知的关系分析通过2-D凝胶电泳鉴定为在SK-MEL-28中受Q10调节的其他蛋白质(图9)。此类蛋白质的功能评估显示存在参与14-3-3-介导的信号转导的一组蛋白(PDCP6IP，YWHAZ和VIM)以及与许多过程[细胞周期；戊糖磷酸途径(TALDO1)；神经酰胺信号转导(CTSD)；氨酰-tRNA生物合成(GARS)和线粒体蛋白质输入(TOM22)]关联的个别蛋白质。
用Q10处理的SCC细胞的蛋白质组学分析
也制备了另一种皮肤癌细胞系鳞状细胞癌(SCC)，利用2-D凝胶电脉进行分析，作为先前SK-MEL-28分析的随访实验。在收获之前用100μM Q10处理SCC细胞，进行6小时或24小时。也收获未处理的对照细胞。裂解细胞沉淀，将样品经历2-D电泳(以一式三份)。在比较研究中分析600多个蛋白质点，将对照样品与6小时和24小时的处理相比较。
根据2-D电泳凝胶的比较分析评估前25个统计学上显著的差异点变化。根据该评估，切取12个点，通过胰蛋白酶消化和质谱表征进行鉴定(结果概述于下面表3中)。
表3.SCC细胞中在第6和24小时被鉴定为对100μM Q10处理具有差异反应的蛋白质
Figure BPA00001497291601151
Figure BPA00001497291601161
转醛醇酶1：如先前在用Q10处理的SKMEL-28细胞中观察到的，酶转醛醇酶1被调节，水平下降。这提供了先前对Q10与转醛醇酶(和从而细胞的代谢状态)的改变之间的联系的观察的独立验证。
转醛醇酶是戊糖磷酸途径的非氧化相中的酶(图10)。戊糖磷酸途径在用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原型NADH)的产生，用于还原生物合成的细胞的代谢状态中和为ATP，DNA和RNA的必需成分的核糖的形成中是至关重要的。转醛醇酶还使戊糖磷酸途径与糖酵解发生关联。糖酵解是癌细胞籍以获得细胞存活所必需的能量的代谢途径，因为氧化磷酸化的线粒体过程未被利用。Q10是氧化磷酸化和线粒体ATP产生所需的必需辅酶因子。
BSCv：Spot 23是称为BSCv的来自染色体20的新型人蛋白质。BSCv蛋白也称为脂肪细胞质膜相关蛋白(基因名称：APMAP或C20orf3)并且被预测为与蛋白质的异胡豆苷合酶家族具有序列相似性的单向II型膜蛋白。Q10处理引起该蛋白质的水平降低。该蛋白质未得到充分表征，其与异胡豆苷合酶的同源性也未获得确认。有趣地，该蛋白与在脂肪细胞分化中的作用相关(Albrektsen等人，2001)。人网膜脂肪组织的最近蛋白质组学研究将BSCv鉴定为对于病态肥胖妇女的多囊卵巢综合征(PCOS)具有差异表达的9种蛋白质之一(Corton，2008Hum.Reprod.23：651-661)。作为对Q10反应的细胞表面蛋白质，抗BSCv抗体可用作生物标志。基于目前的结果和可获得的文献，BSCv可在癌症和糖尿病中具有潜在作用。
NM23A：非转移细胞1，蛋白质(NM23A，也称为NME1)被认为是转移抑制剂。该基因(NME1)因其在高转移性细胞中降低的mRNA转录水平而被鉴定。所述蛋白具有作为二磷酸核苷激酶(NDK)的活性并且以由′A′(由该基因编码)和′B′(由NME2编码)同种型组成的六聚体存在。已在侵袭性神经母细胞瘤中鉴定了该基因的突变。NDK活性维持不同三磷酸核苷的浓度之间的平衡，例如，当将柠檬酸(克雷布斯)循环中产生的GTP转化成ATP时。NDK复合通过与STRAP相互作用而与p53关联。值得注意的是，STRAP与HNF4A关联。因此，NM23A是参与对于细胞控制和疾病治疗重要的途径的潜在蛋白。
Rho GDP解离抑制因子(GDI)α：GDI通过抑制调节GDP从它们解离和随后GTP与它们的结合来调节Rho蛋白的GDP/GTP交换反应。所述蛋白在癌细胞中被上调。
实施例5：线粒体富集分析
几条证据线索表明对线粒体蛋白质和癌症生物学的作用以及Q10反应的更近一步评估是理所当然的。首先，Q10在用于正常细胞的能量产生的线粒体氧化磷酸化过程中具有必不可少的作用。然而，癌细胞中发生的代谢转变是通过可选择的糖酵解途径进行的能量产生，该途径不需要Q10。其次，细胞的细胞凋亡反应需要线粒体蛋白质存在。Q10已被确定为刺激癌细胞的细胞凋亡(Bcl-2家族蛋白质，细胞色素c)。最后，新型线粒体蛋白质被鉴定为受Q10处理调节，如通过线粒体输入受体蛋白TOM22的蛋白质水平举例说明的(参见本文中描述的实验)。
富集线粒体的样品的产生
用100μM Q10或模拟媒介物处理皮肤癌SKMEL-28细胞6、19或48小时。通过洗涤和刮取从T160培养瓶(每一个时间点4个)收获用细胞。通过离心，沉淀收集细胞，快速冷冻沉淀并且于-80℃下贮存。重悬浮细胞，使用2mL杜恩斯匀浆器破碎细胞。试剂和方法获自用于培养细胞的线粒体分离试剂盒(MitoSciences，Eugene OR，Cat#MS852)。将所得的线粒体样品分成75μL的等分(4-5个等分/样品)并且于-80℃下贮存。
从用Q10处理的SK-MEL-28细胞分离的富集线粒体的样品的蛋 白质组学分析
对来自用100μM Q10处理6、19和48小时的SK-MEL-28的富集线粒体的样品的两个等分(连同相应的模拟媒介物对照)的溶解的蛋白质进行2-D凝胶电泳。将样品经历2-D电泳(以一式三份)。在比较研究中分析525个蛋白质点，将对照样品与其他时间点样品相比较(图11)。
9个统计学上显著的差异点变化选自2-D电泳凝胶的比较分析。从这些凝胶切取9个点，通过胰蛋白酶消化和质谱表征进行鉴定。
表4.SKMEL-28线粒体中经鉴定对Q10处理具有差异反应的蛋白质
Figure BPA00001497291601191
酰基CoA硫酯酶7：酰基CoA硫酯酶7(ACOT7)是催化脂酰CoA水解成游离脂肪酸和CoA的酶家族的成员。从而该酶在脂质代谢和细胞信号转导中具有作用。ACOT7偏受具有8-16个碳原子(C8-C16)的脂肪酸链的长链酰基CoA底物。ACOT7的确切细胞功能还不完全清楚。该基因的转录被固醇调控元件结合蛋白2激活，从而表明在胆固醇代谢中的功能。
该实施例的结果表明ACOT7潜在地直接或间接参与Q10的代谢。因此，靶向ACOT7可促进Q10的细胞内水平的调节，从而影响细胞Q10的效应。
丙酮酸激酶：丙酮酸激酶是参与糖酵解的最后一步的酶。其催化磷酸基团从磷酸烯醇丙酮酸(PEP)至ADP的转移，从而产生一个分子的丙酮酸盐和一个分子的ATP。
Figure BPA00001497291601201
所述蛋白质假定为PKM2的蛋白质，2型同种型，因为该蛋白是从富集线粒体的SK-MEL-28样品被鉴定的。众所周知该同种型参与肿瘤细胞形成和调控。
线粒体中Q10水平的定量
基于最近公布的方法(Ruiz-Jimenez，2007，J.Chromatogr.A，1175，242-248)通过使用在阳性模式中利用电喷射离子化(ESI)的LC-MS-MS执行用于同时测定辅酶Q10(Q10)和还原形式泛醇-10(Q10H2)的方法。Q10和Q10H2的高选择性鉴定和灵敏性定量连同其他选择的脂质的鉴定是可能的。将来自用100μM Q10处理的SK-MEL-28的富集线粒体的样品的等分经历常规预处理，所述预处理基于蛋白质沉淀、液体-液体提取、蒸发至干燥和利用95∶5甲醇/己烷(v/v)的重建。
在该分析中，定量Q10、Q10H2和Q9(表5)。相关分子Q9的水平较低，并且接近检测的水平。未处理的样品的水平相对恒定，6小时Q10处理的样品具有该相同的水平。为了控制总材料的样本方差，也测量胆固醇的水平以确认差异并非因样本容量误差而导致。当针对通过蛋白质提取相同线粒体制剂的其他等分获得的总蛋白质的值校正Q10水平时，相对比率是相当的。因此，在第19小时获得Q10水平的显著增加(约3倍)，在第48小时时间点甚至获得更大的增加(约6倍)(图12)。
表5.存在于来自用100μM的培养基中的Q10处理的SK-MEL-28细胞的富集线粒体的样品中的Q10的水平的HPLC-MS定量结果
Figure BPA00001497291601211
来自该研究的令人惊讶的结果是发现Q10以氧化形式提供给细胞。对于48小时的样品，也测量还原形式Q10H2，并且发现其以显著更低的量(CoQ10H2的0.28ng/样品相对于CoQ10的46.63ng/样品)存在。在Q10处理48小时的样品中存在Q10H2的水平的总体增加(3倍)，虽然所述水平接近假定的测定检测限。有趣地，氧化形式(Q10)可用作生物系统中的促氧化剂。根据文献，当估量人血浆的Q10和Q10H2时，发现大部分(90％)分子以可用作抗氧化剂的还原形式Q10H2存在(Ruiz-Jimenez，2007，J.ChromaA，1175，242-248)。
因此，这些结果确认和定量了在向培养基中外源加入Q10后，Q10的水平在线粒体中增加。令人惊讶和意外的发现是Q10以提供的氧化形式(促氧化剂)维持并且不以任何显著的量转化成还原(抗氧化剂)形式Q10H2。
实施例6：实时PCR阵列
实验1：细胞凋亡阵列
如在上文实施例3中所述，癌细胞与Q10的接触诱导此类细胞的一部分因细胞凋亡过程而死亡。为了鉴定参与Q10反应的蛋白质，应用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)法来鉴定参与细胞凋亡的靶向途径阵列的基因/蛋白质的mRNA水平的变化。
通过将PCR阵列用作筛选工具，从而可评估可潜在地为Q10在细胞内的生物学作用模式提供见解的一系列分子靶。使用实时PCR定量评估mRNA水平的变化以估量包含80个途径特异性靶的预先选择的亚组中的miRNA水平。
为了解释mRNA结果，鉴定和评估在它们的mRNA转录中改变2倍水平的基因。产生mRNA的基因转录的水平只提供表达的蛋白质的水平的潜在变化的大致估计。本领域技术人员应理解，每一种mRNA可具有不同的被降解的速率或其不能被有效翻译，从而导致不同量的蛋白质。
用50um Q10处理SkBr-3细胞24小时
RT-PCR的测定法用于测量总共84个细胞凋亡途径相关蛋白的mRNA水平变化。对使用Q10处理的(24小时)SkBr3进行的利用实时PCR细胞凋亡分析的实验将下列mRNA鉴定为受到影响：Bcl2，Bcl2L1，Bcl2L11，Birc6，Bax，Xiap，Hprt1，Apaf1，Abl1，Braf。这些结果再次提供了癌细胞对Q10处理的细胞凋亡反应的支持证据。
表6A
Figure BPA00001497291601221
Figure BPA00001497291601231
来自3个通过SK-MEL-28细胞进行的独立实验的一致的结果概述于下面表6B中。同样地，许多基因在SCC细胞中受100μM Q10处理调节。在SCC细胞中显示被调节的细胞凋亡阵列中的基因描述于表7中。我们发现在SK-MEL-28细胞和SCC细胞中许多基因在第6小时都被调节。24小时时，所述调节减弱。在SK-MEL-28细胞和SCC细胞中都显示被调节的基因描述于表8中。
表6B.当利用细胞凋亡测定法分析时，SK-MEL-28细胞中被100μM Q10处理调节的基因.
Figure BPA00001497291601232
Figure BPA00001497291601241
Figure BPA00001497291601251
表7.当利用细胞凋亡阵列分析时SCC细胞中被100μM Q10处理调节的基因
Figure BPA00001497291601261
Figure BPA00001497291601271
表8.SK-MEL-28和SCC细胞中利用100μM Q10处理调控的细胞凋亡阵列的基因
  符号   描述
  BCL2   B-细胞CLL/淋巴瘤2
  BCL2L1   BCL2-样1(Bcl-xl)
  BIRC3   含杆状病毒IAP重复的3
  FADD   Fas(TNFRSF6)相关死亡结构域
  GADD45A   生长停止和DNA-损伤-诱导的，α
  TNFRSF21   肿瘤坏死因子受体超家族，成员21
  CD27   CD27分子
  TNFRSF9   肿瘤坏死因子受体超家族，成员9
  TNFSF10   肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员10
  TP73   肿瘤蛋白p73
  TRAF2   TNF受体相关因子2
有趣地，改变的mRNA水平显示一系列细胞凋亡蛋白质的显著上调，Bcl-xl是上调最高的蛋白质之一。在SK-MEL-28细胞的蛋白质阵列实验中也观察到该结果。
Bcl-xl是线粒体中的跨膜分子(Bcl-xl表示“基细胞淋巴瘤-加大型”)。其参与FAS-L的信号转导途径并且是作为蛋白质的Bcl-2家族的成员的几种抗细胞凋亡蛋白之一。其牵涉癌细胞的存活。然而，已知人Bcl-x mRNA的选择性剪接可导致至少两种不同的Bcl-x mRNA种类Bcl-xL和Bcl-xS。主要的蛋白质产物(233个氨基酸)是更大的Bcl-x mRNA，Bcl-xL，其在生长因子撤除时抑制细胞死亡(Boise等人，1993.Cell 74，597-608)。在另一方面，Bcl-xS抑制Bcl-2抑制细胞死亡的能力并且使细胞对细胞凋亡细胞死亡易感。所利用的使用的测定法不能区分Bcl-x的哪个同种型被上调。在这些研究中被CoQ10上调的Bcl-x同种型可利用本领域内已知的常规方法例如，通过使用估计两种mRNA剪接同种型的比率(Bcl-xL对Bcl-sL)的RT-PCR法来确定。
根据细胞凋亡相关蛋白的观察，观察到多个促细胞凋亡和抗细胞凋亡因子在BCL-2家族中或与这些因子相互作用调节表达水平(BCL2L11、BNIP2、BAG1、HRK、BAK1、BCL2、BCL2L1)。此类蛋白质控制线粒体外膜的透化。
对于半胱天冬酶-9的上调(16小时)观察到与先前对于半胱天冬酶3/7蛋白观察到的细胞凋亡一致的细胞凋亡反应的早期标志。应激信号转导途径的诱导引起细胞色素c从线粒体释放以及apaf-1(凋亡体)的激活，这反过来将半胱天冬酶-9的酶原切割成活性形式。一旦被启动，半胱天冬酶-9持续切割半胱天冬酶原-3和半胱天冬酶原-7以触发另外的细胞凋亡途径。
也存在与待调节的蛋白质的肿瘤坏死因子家族的一致联系。
还指出了肿瘤蛋白p73的强下调。通常见于人中的许多肿瘤(包括乳腺癌和卵巢癌)的分析显示p73的高表达(当与相应区域中的正常组织相比较时)。最近的发现表明牵涉哺乳动物细胞的细胞周期调控和DNA合成的转录因子(即：E2F-1)在体内的失调过表达诱导p73的表达。暗示着p73可能是癌蛋白质，但其可牵涉相关p53蛋白的不同机制。显示细胞凋亡途径的描绘的示意图提供于图13中。
SKMEL-28细胞
根据细胞凋亡相关蛋白质的调查，观察到多个促细胞凋亡因子和抗细胞凋亡因子存在于BCL-2家族中，或与此类因子的相互作用调节表达水平(BCL2L11、BNIP2、BAG1、HRK、BAK1、BCL2、BCL2L1)。此类蛋白质控制线粒体外膜的透化。
随着半胱天冬酶-9的上调(16小时)，观察到细胞凋亡反应的早期标志，其与先前观察到的通过半胱天冬酶3/7蛋白产生的细胞凋亡相符。应激信号转导途径的诱导引起细胞色素c从线粒体释放和apaf-1(凋亡体)的激活，这反过来将半胱天冬酶-9的酶原切割成活性形式。一旦启始，半胱天冬酶-9继续切割半胱天冬酶原-3和半胱天冬酶原-7以触发其他细胞凋亡途径。
表9.通过聚焦在细胞凋亡途径上的RT-PCR阵列评估的用100μM A10处理的SKMEL-28细胞的mRNA水平的变化
Figure BPA00001497291601301
被调节的蛋白质与肿瘤坏死因子受体家族存在的恒定联系。
也注意到肿瘤蛋白p73的强下调。通常在人中发现的许多肿瘤(包括乳腺癌和卵巢癌)的分析显示p73的高表达(当与相应区域中的正常组织比较时)。最近的发现表明参与哺乳动物细胞的细胞周期调控和DNA合成的转录因子(即：E2F-1)在体内的失调过表达诱导p73的表达。暗示着p73可能是癌蛋白质，但可牵涉相关p53蛋白作用的不同机制。
实验2：使用氧化性应激和抗氧化剂防御阵列的实时PCR阵列
为了鉴定参与Q10反应的蛋白质，应用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)法鉴定参与氧化性应激和抗氧化剂防御的靶向途径阵列的基因/蛋白质的mRNA水平的变化。
下表10列出了在用100μM Q10处理的SK-MEL28细胞中被调节的基因。只给出了在两个独立实验中被调节的那些基因的结果。虽然在第6小时看到显著量的基因调节，但在第48小时才看到RNA水平的最显著变化。
表10.如氧化性应激和抗氧化剂防御阵列中看到的SK-MEL-28细胞中被100μM Q10处理调节的基因
Figure BPA00001497291601311
Figure BPA00001497291601321
Figure BPA00001497291601331
Figure BPA00001497291601341
嗜中性粒细胞胞质因子2(NCF2，65kDa，慢性肉芽肿病，常染色体2)是最先诱导的mRNA之一(在第6小时观察到的)。随后在第16小时时间点和以后，嗜中性粒细胞胞质因子1(NCF1)(慢性肉芽肿病，常染色体1)在初始迟滞期后以极高水平被诱导。
嗜中性粒细胞胞质因子2是通常见于中性粒细胞的称为NADPH氧化酶的多蛋白复合物的细胞溶胶亚基。该氧化酶骤然产生大量被递送至嗜中性粒细胞吞噬体的腔中的过氧化物。
NADPH氧化酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-氧化酶)是膜结合酶复合物。其可见于质膜以及吞噬体膜中。其由6个亚基组成。这些亚基是：
Rho鸟苷三磷酸酶(GTP酶)，通常Rac1或Rac2(Rac表示Rho相关C3肉毒毒素底物)
●5个″phox″单位。(Phox表示噬菌细菌氧化酶.)
○P91-PHOX(包含血红素)
○p22phox
○p40phox
○p47phox(NCF1)
○p67phox(NCF2)
应指出，另一种NADPH氧化酶水平不改变。所述酶是NOX5，其是产生过氧化物并且以Ca(2+)-依赖性方式用作H+通道的新型NADPH氧化酶。
此外，磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸-依赖性RAC交换剂1(PREX1)也被上调。该蛋白用作小GTP结合蛋白(RAC)的RHO家族的鸟嘌呤核苷酸交换因子。已显示其结合RAC1并且通过将结合的GDP与游离GTP交换来激活RAC1。主要在细胞质中发现的所述编码的蛋白质被磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸和异三聚体G蛋白的β-γ亚基激活。
第二主要早期诱导的蛋白质是一氧化氮合酶2A(可诱导的，肝细胞)(NOS2A)。一氧化氮是在几个过程(包括神经传递以及抗微生物和抗肿瘤活性)中用作生物介体的自由基。该基因编码在肝中表达并且可由脂多糖和某些细胞因子的组合诱导的一氧化氮合酶。
超氧化物歧化酶2(线粒体(SOD2))是铁/锰超氧化物歧化酶家族的成员。其编码形成同四聚体并且每亚基结合一个锰离子的线粒体蛋白。该蛋白结合氧化磷酸化的过氧化物副产品并且将它们转化成过氧化氢和二价氧。该基因的突变与特发性心肌病(IDC)、过早衰老、散发型运动神经元病和癌症相关。
下调的蛋白质的实例是叉头框M1(FOXM1)，已知其在细胞周期进展中起着至关重要的作用，在所述周期中内源FOXM1表达在S和G2/M期达到峰值。最近的研究已显示FOXM1调节一大批G2/M-特异性基因例如Plk1、细胞周期蛋白B2、Nek2和CENPF的表达，并且在染色体分离和基因组稳定性的维持中起着重要作用。FOXM1基因现被称为人原癌基因。FOXM1的异常上调牵涉基底细胞癌(BCC)的肿瘤发生。随后在大部分人实体癌(包括肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、子宫颈癌、结肠癌、胰腺癌和脑癌)中发现FOXM1上调。利用BCC和Q10的其他研究可估计FOXM1水平。
SKMEL-28细胞
使用SKMEL-28细胞进行其他实验。在不同的时间点，利用实时PCR法(RT-PCR)将存在于用100μM Q10处理的细胞中的mRNA水平与未处理的细胞中的水平相比较。PCR阵列(SABiosciences)是在96孔板上进行的用于途径或疾病聚焦的基因经及适当的RNA质量控制的一组最优化的实时PCR引物测定法。所述PCR阵列利用实时PCR的灵敏性和微阵列的多个基因表征能力来进行基因表达分析。
表11.氧化性应激和抗氧化剂防御PCR阵列中评估的mRNA水平的列表和分类。在利用100μM Q10对SKMEL-28细胞处理6小时后，mRNA水平的最大变化通过突显蛋白质编码(增加的-粗体；减少的-下划线标示；或无变化-灰色)来标示。
Figure BPA00001497291601371
表12.SKMEL-28的100μM处理的时程评估。利用RT-PCR法监控mRNA水平变化并且评估氧化性应激和抗氧化剂防御蛋白
Figure BPA00001497291601381
嗜中性粒细胞胞质因子2(NCF2，65kDa，慢性肉芽肿病，常染色体2)是最先诱导的mRNA(在第6小时观察到的)之一。随后在第16小时时间点和以后，嗜中性粒细胞胞质因子1(NCF1)(慢性肉芽肿病，常染色体1)在初始迟滞期后以极高水平被诱导。
嗜中性粒细胞胞质因子2是通常见于中性粒细胞的称为NADPH氧化酶的多蛋白复合物的细胞溶胶亚基。该氧化酶骤然产生大量被递送至嗜中性粒细胞吞噬体的腔中的过氧化物。NADPH氧化酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-氧化酶)是膜结合酶复合物。其可见于质膜以及吞噬体膜中。其由6个亚基组成。这些亚基是：
●Rho鸟苷三磷酸酶(GTP酶)，通常地Rac1或Rac2(Rac表示Rho相关C3肉毒毒素底物)
●5个“phox”(吞噬细胞氧化酶)亚基.
P91-PHOX(包含血红素)
p22phox
p40phox
p47phox(NCF1)
p67phox(NCF2)
应指出，另一种NADPH氧化酶水平不改变。所述酶是NOX5，其是产生过氧化物并且以Ca(2+)-依赖性方式用作H+通道的新型NADPH氧化酶。
此外，磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸-依赖性RAC交换剂1(PREX1)也被上调。该蛋白用作小GTP结合蛋白(RAC)的RHO家族的鸟嘌呤核苷酸交换因子。已显示其结合RAC1并且通过将结合的GDP与游离GTP交换来激活RAC1。主要在细胞质中发现的所述编码的蛋白质被磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸和异三聚体G蛋白的β-γ亚基激活。
第二主要早期诱导的蛋白质是一氧化氮合酶2A(可诱导的，肝细胞)(NOS2A)。一氧化氮是在几个过程(包括神经传递以及抗微生物和抗肿瘤活性)中用作生物介体的自由基。该基因编码在肝中表达并且可由脂多糖和某些细胞因子的组合诱导的一氧化氮合酶。
下调的蛋白质的实例是FOXM1，已知其在细胞周期进展中起着至关重要的作用，在所述周期中内源FOXM1表达在S和G2/M期达到峰值。最近的研究已显示FOXM1调节一大批G2/M-特异性基因例如Plk1、细胞周期蛋白B2、Nek2和CENPF的表达，并且在染色体分离和基因组稳定性的维持中起着重要作用。FOXM1基因现被称为人原癌基因。FOXM1的异常上调牵涉基底细胞癌(BCC)的肿瘤发生。随后在大部分人实体癌(包括肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、子宫颈癌、结肠癌、胰腺癌和脑癌)中发现FOXM1上调。
实验3：使用热激阵列的实时PCR阵列
运行SCC细胞的热激阵列并且被调节的基因的数据概述于下面表13中。
表13.SCC细胞中来自被100μM Q10处理调节的热激蛋白的基因
Figure BPA00001497291601401
Figure BPA00001497291601411
实施例4：使用糖尿病阵列的实时PCR阵列
进行本实施例中描述的实验以测试总体假说：Q10可影响多个基因并且改变细胞的代谢状态。利用针对一组参与糖尿病和相关途径的靶蛋白的RT-PCR评估用100μM Q10处理的SKMEL-28细胞的mRNA。该实验的结果显示参与糖酵解途径和胰岛素加工的几种蛋白质在它们的mRNA表达水平上被改变(概述于表14中)。
表14.用100μM Q10处理16小时的SKMEL-28细胞的主要mRNA水平的变化
Figure BPA00001497291601412
Figure BPA00001497291601421
该初步实验的结果显示多种胰岛素相关蛋白的mRNA水平在两个方向上都被调节。所述结果表明Q10可影响糖尿病的治疗和/或评估。
接下来进行其他实验以确认从用Q10处理的SK-MEL-28细胞获得的上述结果。SK-MEL-28细胞中的许多基因早在Q10处理后6小时被调节。然而，该初始调节在16和24小时时变得不太明显。在大约48小时时，我们发现糖尿病阵列中的许多基因再次被强烈调节。与两个或更多个独立实验一致的结果概述于下面表15中。SCC细胞似乎在Q10处理后第6和24小时显示某些基因的调节。来自SCC细胞的这些结果概述于表16中，而在SK-MEL-28细胞和SCC细胞中都被调节的基因概述于表17中。
表15.当通过糖尿病阵列分析时SK-MEL-28细胞中被100μM Q10处理调节的基因
Figure BPA00001497291601441
表16.当通过糖尿病阵列分析时SCC细胞中被100μM Q10调节的基因
Figure BPA00001497291601442
Figure BPA00001497291601451
表17.对于SK-MEL-28和SCC细胞被100μM Q10处理调节的来自糖尿病阵列的基因.
  符号  描述.
  G6PD  6-磷酸葡糖脱氢酶
  ICAM1  细胞间粘附分子1(CD54)，人鼻病毒受体
  PIK3CD  磷酸肌醇-3-激酶，催化的，δ多肽
  SREBF1  固醇调节元件结合转录因子1
  TNF  肿瘤坏死因子(TNF超超家族，成员2)
  TNFRSF1A  肿瘤坏死因子受体超家族，成员1A
  VEGFA  血管内皮生长因子A
多种胰岛素相关蛋白的mRNA水平在两个方向上都被调节。Q10影响细胞代谢的调节，从而影响代谢失调疾病例如糖尿病。下面进一步论述显著被调节的两个患者。
促分裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)：促分裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)是MAP激酶家族的成员。MAP激酶用作多个生物化学信号的整合点，并且参与许多细胞过程例如增殖、分化、转录调控和发育。该实验的结果显示MAPK14被显著下调。
肝细胞核因子4，α(HNF4A)：HNF4(肝细胞核因子4)主要在肝、肠、肾和胰腺β细胞中表达的细胞核受体蛋白质，其对于肝发育是至关重要的。在人中，存在分别由两个分开的基因HNF4A和HNF4G编码的NHF4的两个同种型α和γ。(参见，例如，Chartier FL，BossuJP，Laudet V，Fruchart JC，Laine B(1994)。″Cloning and sequencing ofcDNAs encoding the human hepatocyte nuclear factor 4indicate thepresence of two isoforms in human liver″.Gene 147(2)：269-72.)。
HNF4最初被分类为孤儿受体。然而，后来发现HNF4因持续结合多种脂肪酸而具有组成型活性。(参见，例如，Sladek F(2002)。″Desperately seeking...something″.Mol Cell 10(2)：219-221和JumpDB，Botolin D，Wang Y，Xu J，Christian B，Demeure O(2005)。″Fattyacid regulation of hepatic gene transcription″.J Nutr 135(11))。HNF4的配体结合结构域，与其他细胞核受体一样，采用规范的α螺旋夹心折叠(参见，例如，Wisely GB，Miller AB，Davis RG，Thomquest AD Jr，Johnson R，Spitzer T，Sefler A，Shearer B，Moore JT，Miller AB，Willson TM，Williams SP(2002)。″Hepatocyte nuclear factor 4is atranscriptional factor that constitutively binds fatty acids″.Structure10(9)：1225-34和Dhe-Paganon S，Duda K，Iwamoto M，Chi YI，Shoelson SE(2002)。″Crystal structure of the HNF4αligand bindingdomain in complex with endogenous fatty acid ligand″.J Biol Chem277(41)：37973-6)以及与辅激活因子蛋白相互作用(参见，例如，DudaK，Chi YI，Shoelson SE(2004)。″Structural basis for HNF-4alphaactivation by ligand and coactivator binding″.J Biol Chem 279(22)：23311-6)。
HNF4-α基因的突变与青春晚期糖尿病(MODY)关联。(参见，例如，Fajans SS，Bell GI，Polonsky KS(2001)。″Molecular mechanisms andclinical pathophysiology of maturity-onset diabetes of the young″.N EnglJ Med 345(13)：971-80.)
肝细胞核因子4(HNF4)是已知在肝细胞和胰腺细胞中调节许多基因的组织特异性转录因子。虽然HNF4在肾的某些部分中高度表达，但关于其在该区域中的作用和关于HNF4调节的基因在肾细胞中的作用知之甚少。HNF4的丰度和活性在肾细胞癌(RCC)中频繁减少，这表明某些肿瘤在肾细胞中抑制HNF4的功能。有趣地，已显示许多受HNF4调节的基因在RCC微阵列研究中失调。这些基因(ACY1、WT1、SELENBP1、COBL、EFHD1、AGXT2L1、ALDH5A1、THEM2、ABCB1、FLJ14146、CSPG2、TRIM9和HEY1)是当HNF4在RCC中减少时其活性被改变的基因的良好候选者。
在HNF4α的配体结合结构域的结构中(1M7W.pdb；Dhe-Paganon(2002)JBC，277，37973)；观察到从大肠杆菌(E.coli)产物共纯化的小的脂质。晶体包含括蛋白质的两个构象，其中长的螺旋10和短螺旋12具有可选择的构象。当检查脂质结合区域时，有趣地观察到存在2个出口区域(exits region)。一个出口区域具有小的脂质头基，应当注意，几个口袋区与该出口共定位。可假定Q10特异性结合该转录因子。当Q10被塑造到该脂质结合隧道中时，Q10环正好适合该表面口袋(图28)。已知的功能缺失突变(E276Q)可具有使残基排布在该表面口袋的内表面的潜能，从而对假定的Q10结合具有负面影响。
此外，通过该Q10结合模型，疏水性尾可延伸至内腔外部，随后可与延伸的螺旋10相互作用。因此，该相互作用可潜在地改变螺旋10/12组的构象。然后这可改变转录因子活性的激活/失活平衡。
实施例7：抗体微阵列分析
通过利用抗体微阵列法就Q10的存在评估蛋白质浓度。微阵列包含700多种蛋白质的抗体，采集许多蛋白质类型和潜在的途径标志作为样品。
利用抗体阵列(Panorama XP725抗体阵列，Sigma)和处理了6或24个小时的SK-MEL-28进行评估用Q10处理的细胞中蛋白质浓度水平的变化的初步实验。收获细胞，提取细胞以获得可溶性蛋白质上清液。用荧光染料(分别地Cy3和Cy5)各自标记来自每一个样品(以1mg/mL的浓度)的蛋白质(总共约1mg)的两部分。从蛋白质除去过量染料，将材料用于微阵列温育。为了比较两个时间点的样品，混合等量的蛋白质，每一个样品具有不同的标记类型(例如，将用Cy3标记的3小时提取物与用Cy5标记的24小时提取物混合)。在与微阵列芯片温育(按照制造商推荐的方案)后，洗涤芯片，进行干燥。利用荧光激光扫描仪扫描微阵列以测量Cy3和Cy5染料的相对荧光强度。
表18.在用50μM Q10处理24小时后在SK-MEL-28细胞中具有升高的水平的蛋白质
Figure BPA00001497291601481
Figure BPA00001497291601491
表19.在用50μM Q10处理24小时后在SK-MEL-28细胞中具有升高的水平的蛋白质
Figure BPA00001497291601492
Figure BPA00001497291601501
为了确认先前观察到的细胞凋亡蛋白质，和将评估扩展至更大量的促细胞凋亡和抗细胞凋亡蛋白质，选择能够筛选潜在包括的蛋白质的广泛家族的两个测定法。
首先，利用抗体微阵列(Panorama XP725抗体阵列，Sigma)筛选700多种蛋白质抗体以评估用50μM Q10处理24小时的SK-MEL-28细胞中蛋白质浓度水平上的变化。
根据对使用Q10(24小时)的SKMEL-28的抗体阵列实验，下列是一些具有改变的水平的已鉴定的蛋白质：Bcl-xl、Bmf、BTK、BLK、cJun(pSer63)、连接蛋白32、PUMA bbc3、BID、Par4、cCbl。该初步研究的主要结论是预期的促细胞凋亡蛋白质被改变。
用于SK-MEL-28的抗体微阵列
利用抗体微阵列(Panorama XP725抗体阵列，Sigma)筛选700多种蛋白质抗体以评估用50μM Q10处理24小时的SK-MEL-28细胞中蛋白质浓度水平上的变化。
表20.用50μM Q10处理的SKMEL-28中蛋白质水平的变化
Figure BPA00001497291601511
根据对利用Q10(24小时)的SKMEL-28进行的抗体阵列实验，下列是具有改变的水平的已鉴定的蛋白质中的一些蛋白质：Bcl-xl、Bmf、BTK、BLK、cJun(pSer63)、连接蛋白32、PUMA bbc3、BID、Par4、cCbl。这些数据确认了促细胞凋亡蛋白的水平在与升高的水平的外源加入的Q10一起温育后被改变。
Bcl-xl(“基细胞淋巴瘤-加大型”)是线粒体中的跨膜分子。其参与FAS-L的信号转导途径并且是作为蛋白质的Bcl-2家族的成员的几种抗细胞凋亡蛋白之一。其牵涉癌细胞的存活。然而，已知人Bcl-xmRNA的选择性剪接可导致至少两种不同的Bcl-x mRNA种类Bcl-xL和Bcl-xS。主要的蛋白质产物(233个氨基酸)是更大的Bcl-x mRNA，Bcl-xL，其在生长因子撤除进抑制细胞死亡(Boise等人，1993.Cell74，597-608)。在另一方面，Bcl-xS抑制Bcl-2抑制细胞死亡的能力并且使细胞对细胞凋亡细胞死亡易感。
表21.在用100μM Q10处理24小时后在SCC细胞中具有升高的水平时蛋白质
Figure BPA00001497291601512
Figure BPA00001497291601521
Figure BPA00001497291601531
表22.在用100μM Q10处理24小时后在SCC细胞中具有降低的水平的蛋白质
Figure BPA00001497291601532
Figure BPA00001497291601541
实施例8：Western印迹分析
对皮肤癌细胞系SKMEL-28进行利用Western印迹和2-D凝胶电泳进行处理和评估的第一实验。该实验设置包括在第3、6、12和24小时用50或100μM Q10处理的SK-MEL-28细胞。
利用针对Bcl-xL的抗体(图14)、波形蛋白的抗体(图15、线粒体氧化磷酸化功能的一系列抗体(图16-21)以及针对一系列与线粒体膜完整性相关的抗体(图22-27)的Western印迹分析评估多种细胞类型。这些实验的结果显示几种检查的蛋白质作为利用Q10的细胞处理的结果被上调或下调。
实施例9：通过用100uM Q10处理胰腺癌细胞(PaCa2)被鉴定为在mRNA水平上受调节的糖尿病相关基因
在处理后不同的时间上对利用100uM Q10处理的样品进行糖尿病测定。基本上如上所述进行实验。经发现当Q10处理时被调节的不同基因概述于下面表23中。所述结果显示下列基因被Q10处理调节：ABCC8、ACLY、ADRB3、CCL5、CEACAM1、CEBRA、FOXG1、FOXP3、G6PD、GLP1R、GPD1、HNF4A、ICAM1、IGFBP5、INPPL1、IRS2、MAPK14、ME1、NFKB1、PARP1、PIK3C2B、PIK3CD、PPARGC1B、PRKAG2、PTPN1、PYGL、SLC2A4、SNAP25、HNF1B、TNRFSF1A、TRIB3、VAPA、VEGFA、IL4R和IL6。
表23：其表达被100μM Q10调节的来自糖尿病阵列的基因和它们在细胞中的可能功能
上调(灰色)和下调(白色)
  基因名称   基因功能
  ADRB   cAMP信号转导，G蛋白信号转导
  CCL5   CCR5的天然配体并且被TNF调节
  CEACAM1   抗细胞凋亡，血管生成的正调节
  GLPR1   增加胰岛素和减少胰腺分泌胰高血糖素
  GPD1   碳水化合物代谢，NADH氧化
  ICAM1   被阿托伐他汀调节，加工某些半胱天冬酶.
  MAPK14   DNA损伤检查点，血管生成，葡萄糖代谢过程
  PARP1   DNA修复，调节TP53，NOS2A，NFKB，端粒维持
PIK3C2B 磷酸肌醇介导的信号转导，调节AKT和AKT1
  PIK3CD   激酶
  PYGL   碳水化合物代谢，调节糖原和糖原合成
  SLC2A4   调节葡萄糖并且被INS和胰岛素调节
  SNAP25   胰岛素分泌、神经递质摄入的调节
  CEBPA   糖皮质激素受体信号转导，VDR/RXR激活
  FOXP3   调节IL4，IL2.
  G6PD   戊糖磷酸途径，谷胱甘肽代谢
  IGFBP5   细胞生长的调节，被IGF1调节
  INPPL1   调节Akt和糖原
  IRS2   IGF-1信号转导
  ME1   调节苹果酸并且受T3调节.
  NFKB1   调节IL6和TNF.
  PPARGC1B   受MAPK14调节
  PRKAG2   脂肪酸，胆固醇生物合成
  PTPN1   脱磷酸JAK2和EGF受体激酶.
  VEGFA   激酶，血管生成
  IL4R   被TP73上调，结合IRS1和IRS2
  HNF1B   HNF4A
  TNFRSF1A   促细胞凋亡
  TRIB3   调节AKT1和NFkB的负调节剂
  VAPA   调节NFkB，小囊泡运输
实施例10：通过利用100μM Q10处理胰腺癌细胞(PaCa2)被鉴定为在mRNA水平上被调节的血管生成相关基因
在处理后不同的时间上对利用100uM Q10处理的样品进行血管生成测定。基本上如上所述进行实验。经发现当Q10处理时被调节的不同基因概述于下面表24中。所述结果显示下列基因被Q10处理调节：AKT1、ANGPTL4、ANGPEP、CCL2、CDH4、CXCL1、EDG1、EFNA3、EFNB2、EGF、FGF1、ID3、IL1B、IL8、KDR、NRP1、PECAM1、PROK2、SERPINF1、SPHK1、STAB1、TGFB1、VEGFA和VEGFB。
表24：其表达被100μM Q10调节的来自血管生成阵列的基因和它们在细胞中的可能功能的列表
上调(灰色)和下调(白色)
Figure BPA00001497291601571
实施例11：通过用100μM Q10处理胰腺癌细胞(PaCa2)被鉴定为在mRNA水平上被调节的细胞凋亡相关基因
在处理后不同的时间上对利用100uM Q10处理的样品进行细胞凋亡测定。基本上如上所述进行实验。经发现当Q10处理时被调节的不同基因概述于下面表25中。所述结果显示下列基因被Q10处理调节：ABL1、AKT1、Bcl2L1、BclAF1、CASP1、CASP2、CASP6、CIDEA、FADD、LTA、TNF、TNFSF10A和TNFSF10。
表25：其表达被100μM Q10调节的来自细胞凋亡阵列的基因和它们在细胞中的可能功能的列表
上调(灰色)和下调(白色)
Figure BPA00001497291601572
Figure BPA00001497291601581
实施例12：关于肝癌(HepG2)细胞的PCR糖尿病阵列
利用媒介物处理HepG2(肝癌)细胞进行24小时或利用100μMQ10处理所述细胞进行不同的时间。按照用于PaCa2细胞的方法(上文中，实施例9-11)以1×105个细胞/孔起始处理。然而，从这些样品提取的RNA的总量低于预期。通常使用1μg的总RNA(通过260nm处的测量测定的)进行逆转录。每逆转录可使用的最大体积为8μL。由于RNA浓度较低，所以使用0.44μg的RNA进行利用媒介物和来自16小时和48小时的Q10处理的样品的RT-PCR阵列分析。所述阵列提供了利用100μM Q10处理进行的HepG2基因调节的趋势和模式的初步分析，如下面表26中概述的。所述结果显示基因PPARGC1A、PRKAA1和SNAP25中的每一个在处理后第16小时被下调(分别约1/20、1/6和1/5)。在处理后第48小时，PPARGC1A和PRKAA1已标准化或被略微上调，然而SNAP25被下调约1/2。
表26：当用100μM Q10处理HepG2细胞时在糖尿病阵列中被调节的基因的列表
Figure BPA00001497291601582
Figure BPA00001497291601591
实施例13：关于肝癌(HEPG2)细胞的PCR血管生成阵列
利用媒介物处理HepG2(肝癌)细胞进行24小时或利用100μMQ10处理所述细胞进行不同的时间。按照用于PaCa2细胞的方法(上文中实施例9-11)以1×105个细胞/孔起始处理。然而，从这些样品提取的RNA的总量低于预期。通常使用1μg的总RNA(通过在260nm处的测量测定的)进行逆转录。每逆转录可使用的最大体积为8μL。由于RNA浓度较低，所以使用0.44μg的RNA进行利用媒介物和来自16小时和48小时的Q10处理的样品的RT-PCR阵列分析。所述阵列提供了利用100μM Q10处理进行的HepG2基因调节的趋势和模式的初步分析，如下面表27中概述的。经发现在Q10处理时被调节的不同基因概述于下面表27中。所述结果显示基因ANGPTL3、ANGPTL4、CXCL1、CXCL3、CXCL5、ENG、MMP2和TIMP3中的每一个在处理后第16小时被上调(分别达到对照的约5.5、3、3、3.2、3、3、1和6.5倍、6倍和5倍)。在Q10处理后第16小时ID3被下调至对照的约1/5。在处理后第48小时，ANGPTL3、CXCL1、CXCL3、ENG和TIMP3仍然被上调(分别达到对照的约3.5、1.5、3.175、2和3倍)，然而ANGPTL4、CXCL5、ID3和MMP2分别被下调至对照的约1/1、1/1、1/2和1/18。
表27：当用100μM Q10处理HepG2细胞时在血管生成阵列中被调节的基因的列表
Figure BPA00001497291601592
已知参与血管生成的过程的蛋白质是所述RT-PCR阵列中的成分。血管生成是癌细胞籍以变成恶性的至关重要的过程。此类蛋白质中的一些也牵涉糖尿病。
ANGPTL3和ANGPTL4：涉及ANGPTL3的文献将该蛋白与脂质代谢的调节相联系。具体地，文献(Li，C.Curr Opin Lipidol.2006Apr；17(2)：152-6)教导血管生成素和血管生成素-样蛋白共有相似的结构域结构。ANGPTL3和4是抑制脂蛋白脂酶活性的该超家族的仅有的两个成员。然而，ANGPTL3和4在多个水平上被差异调节，表明体内非冗余功能。ANGPTL3和4被蛋白水解加工成两个半部分并且被细胞核受体差异调节。ANGPTL4的转基因过表达以及ANGPTL3或4的敲除证明这两个蛋白质在脂蛋白代谢中起着必不可少的作用：肝来源的ANGPTL3主要在进食状态中抑制脂蛋白脂酶活性，而ANGPTL4在进食和禁食状态中起着重要作用。此外，ANGPTL4调节脂蛋白来源的脂肪酸的组织特异性递送。从而取决于其表达位置，ANGPTL4是脂蛋白脂酶的内分泌或自分泌/旁分泌抑制剂。
脂蛋白脂酶是将脂蛋白中的脂质例如乳糜微粒和极低密度脂蛋白(VLDL)中发现的脂质水解成3个游离脂肪酸和1个甘油分子的酶。给定的组织中的脂蛋白脂酶的活性是吸收甘油三酯来源的脂肪酸的限速步骤。脂肪酸分配中的不平衡具有重大代谢后果。已显示高脂肪饮食引起LPL的组织特异性过表达，这牵涉组织特异性胰岛素抗性和作为结果2型糖尿病的发展。
本实施例的结果表明Q10调节参与脂质代谢的蛋白质，从而使得ANGPTL3/ANGPTL4和它们的相关途径的研究理所当然。例如，ANGPTL3/ANGPTL4被认为在下列途径中起着重要作用：Akt、胆固醇、脂肪酸、HDL-胆固醇、HNF1A、ITGA5、ITGA5、ITGAV、ITG83、L-三碘甲腺原氨酸(trilodothynonine)、LIPG、LPL、Mapk、Nrth、NR1H3、PPARD、PTK2、RXRA、三酰甘油和9-顺-视黄酸。
实施例14：关于肝癌(HEPG2)细胞的PCR细胞凋亡阵列
如上所述对用100uM Q10处理16和48小时的样品进行细胞凋亡测定。然而，通过选择FAM而非SYBR作为荧光基团来进行48小时的测定。FAM和SYBR在相同波长上发荧光。
发现当Q10处理时被调节的不同基因概述于下表28中。所述结果显示在Q10处理后第16小时CASP9被上调，约为对照的61倍，而BAG1和TNFRSF1A在处理后第16小时被分别下调至对照的约1/6和1/4。在处理后第48小时，CASP9、BAG1和TNFRSF1A被分别上调至对照的约55、1和1倍。
表28：当用100μM Q10处理HepG2细胞时在凋亡阵列中被调节的基因的列表
Figure BPA00001497291601621
实施例15：评估MIM或表观代谢转变剂治疗肿瘤障碍的能力
在鼠模型中评估所选择的MIM或表观代谢转变剂例如CoQ10治疗肿瘤障碍例如黑素瘤的能力。通过将SK-MEL28注射入皮下层来在小鼠中诱导黑素瘤肿瘤。动物研究由对照组和处理组组成，每组包括4只小鼠。用两种肿瘤接种小鼠。每天将MIM或表观代谢转变剂的局部制剂用于处理组的肿瘤一次，进行30天的时段，之后，切取肿瘤，测定质量。当处理组相对于对照组的总平均质量的差异显著时，MIM或表观代谢转变剂被鉴定为在治疗肿瘤中是有效的。
实施例16：与肿瘤障碍相关的MIM的鉴定
为了将候选分子(例如，环境影响剂)评估为潜在的MIM，向一组细胞系外源地加入选择的候选MIM，所述小组由患病(癌症)细胞系和正常对照细胞系组成，并且评估组中每一个细胞系的诱导的细胞微环境特征谱的变化。评估和比较患病细胞相对于正常细胞的细胞形态学、生理学和/或细胞组成(包括例如mRNA和蛋白质水平)的变化。
通过检查细胞对候选MIM的敏感性和细胞凋亡反应来评估细胞形态学/生理学的变化。如实施例3中详细描述的进行这些实验。简而言之，用不同浓度的候选MIM处理由至少一种对照细胞系和至少一种癌细胞系组成的一组细胞系。通过在不同的时间上和在一系列应用的浓度上监控细胞存活率来评估细胞系对潜在的MIM的敏感性。通过使用例如与流式细胞术方法组合的连接蛋白试剂来评估细胞对潜在的MIM的细胞凋亡反应。连接蛋白试剂包含两种染料7AAD和膜联蛋白-V-PE的组合，并且允许定量处于早期和晚期细胞凋亡的细胞群体。可利用例如ApostrandTM ELISA法，使用测量单链DNA的另外的细胞凋亡测定法。评估和比较患病细胞系和对照细胞系的敏感性和细胞凋亡反应。显示差异细胞毒性和/或差异地诱导患病细胞相对于正常细胞的细胞凋亡反应的分子被鉴定为MIM。
评估利用候选MIM处理后细胞的组成的变化。使用实时PCR阵列法分析基因表达在mRNA水平上的变化。如实施例6和9-13中详细描述的进行这些实验。简而言之，向一个或多个细胞系(包括例如患病细胞和正常对照细胞系)外源地加入候选MIM，在处理后不同时间上从细胞提取mRNA。通过使用靶向途径阵列(包括例如特异于细胞凋亡、氧化性应激和抗氧化防御、血管生成、热激或糖尿病的阵列)来评估参与特定途径的基因的mRNA的水平。鉴定和评估了在它们的mRNA转录上改变2倍水平或更高水平的基因。诱导细胞的mRNA水平的变化和/或诱导患病细胞相对于正常细胞的一种或多种mRNA的水平的差异变化的分子被鉴定为MIM。
在互补实验中，通过使用抗体微阵列法、双向凝胶电泳，然后使用质谱表征进行的蛋白质鉴定以及利用western印迹分析法来分析基因表达在蛋白质水平上的变化。分别如实施例7、4和8中所述进行这些实验。简而言之，向一个或多个细胞系外源地加入候选MIM，所述细胞系包括例如患病细胞和正常对照细胞系，在处理后不同时间点例如6小时或24小时从细胞提取可溶性蛋白质。由候选MIM诱导的蛋白质水平的变化通过使用包含700多种蛋白质的抗体的抗体微阵列，获取许多蛋白质种类的样品和潜在的途径标志来评估。可通过使用与质谱法偶联的双向(2-D)凝胶电泳进行其他互补蛋白质组学分析。向一个或多个细胞系外源地加入候选MIM，所述细胞系包括例如患病细胞和正常对照细胞系，裂解细胞沉淀，将其经历2-D凝胶电泳。分析凝胶以鉴定处理的样品相对于对照未处理的样品的蛋白质水平的变化。分析凝胶以鉴定在处理的时间过程中因升高的水平、降低的水平或翻译后修饰而引起的点变化。切取显示统计上显著的变化的点，利用胰蛋白酶消化和质谱表征对其进行蛋白质鉴定。利用例如Mascot和MSRAT软件分析针对蛋白质数据库搜索表征的肽，以鉴定所述蛋白质。除了上述2-D凝胶分析和抗体微阵列实验外，还可通过Western印迹分析评估由候选MIM诱导的特定蛋白质的水平的潜在变化。在所有蛋白质组学实验中，鉴定和评估了在不同细胞系中具有升高或下降的水平的蛋白质。诱导细胞的蛋白质水平的变化和/或诱导患病细胞相对于正常细胞的一种或多种蛋白质的水平的差异变化的分子被鉴定为MIM。
将从上述实验发现的被利用候选MIM的处理调节的基因经历细胞和生物化学途径分析，从而可将其分类至不同的细胞途径中，包括例如细胞凋亡、癌症生长学和细胞生长、糖酵解和代谢、分子运输和细胞信号转导。
进行实验以确认候选MIM进入细胞，以确定候选MIM是否定位在细胞内，以及测定存在细胞中的候选MIM的水平和形式。例如如实施例5中详细描述的，进行这些实验。例如，为了测定存在于线粒体中的候选MIM的水平和形式，制备和分析来自用候选MIM处理的细胞的富集线粒体的制剂。从而可确认存在于线料体中的候选MIM的水平在添加外源候选MIM后以时间和剂量依赖性的方式增加。此外，通过使用2-D凝胶电泳分析来自富集线粒体的样品的蛋白质水平的变化，并且利用质谱表征进行蛋白质鉴定，如上文中对于总细胞蛋白质样品所描述的。将经发现进入细胞并且以升高的水平存在于例如线粒体中的候选MIM鉴定为MIM。可使在时间过程中被检查的细胞中或例如特别地线粒体中的候选MIM的水平与如通过例如特定蛋白质的mRNA和蛋白质水平的调节所证明的其他观察到的细胞变化发生关系。
将被观察到诱导细胞组成的变化，例如在mRNA或蛋白质水平上诱导基因表达的变化的候选MIM鉴定为MIM。将被观察到相对于正常(例如，非癌)状态诱导细胞形态学、生理学或细胞组成的差异变化(例如，mRNA或蛋白质水平上的基因表达的差异变化)的候选MIM鉴定为MIM和特别地具有多维特征。经发现能够进入细胞的候选MIM被鉴定为MIM和特别地具有多维特征，因为所述候选MIM从而除了治疗效应外还展示载体效应。
实施例17：CoQ10被鉴定为与肿瘤障碍相关的表观代谢转变剂
利用不同水平的辅酶Q10处理一组皮肤细胞系，其由对照细胞系(例如，角质细胞和黑素细胞的原代培养物)和几种皮肤癌细胞系(例如，SK-MEL-28，非转移性皮肤黑素瘤；SK-MEL-2，转移性皮肤黑素瘤；或SCC，鳞状细胞癌；PaCa2，胰腺癌细胞系；或HEP-G2，肝癌细胞系)组成。当与对照细胞系相比较时，癌细胞系显示和改变剂量依赖性反应，只在癌细胞中诱导细胞凋亡和细胞死亡。详细的示例性实验示于例如本文中的实施例3中。
应用测定法评估利用CoQ10处理后的上文中鉴定的细胞的mRNA和蛋白质水平组成的变化。使用特异于细胞凋亡、氧化性应激和抗氧化剂、血管生成和糖尿病的每一个的实时PCR微阵列分析mRNA表达的变化。使用抗体微阵列分析和western印迹分析法分析蛋白质表达的变化。这些实验的结果显示mRNA和蛋白质水平上的基因表达的变化因辅酶Q10的添加而在细胞系中发生。观察到已知与细胞代谢过程相关或参与其中的许多基因作为利用CoQ10处理的结果而被调节。例如，发现细胞核受体蛋白HNF4A的表达在Q10处理后在细胞中被上调。转醛醇酶1(TAL)的表达在用Q10处理的细胞中也被调节。TAL平衡NADPH和活性氧中间体的水平，从而调节线粒体跨膜电位，所述跨膜电位是ATP合成和细胞存活的关键检查点。针对与肿瘤障碍的特别相关性，已知与例如细胞凋亡、癌症生物学和细胞生长相关的许多基因被鉴定为受Q10调节。详细的示例性实验示于例如本文中的实施例4、6、7、8和9中。
Q10是线粒体中用于能量产生的氧化磷酸化过程的必需辅因子。通过分析来自用CoQ10处理的细胞的富集线粒体的制剂来测定存在于线粒体中的辅酶Q10的水平以及CoQ10的形式。存在于线粒体中的辅酶Q10的水平经确定在添加外源Q10后以时间和剂量依赖性方式增加。时间过程与如在与代谢和细胞凋亡途径相关的特定蛋白质的mRNA和蛋白质水平的调节中观察到的许多细胞变化相关。详细的示例性实验示于例如本文中的实施例5中。
本文中描述的结果将内源分子CoQ10鉴定为表观代谢转变剂。具体地，所述结果将CoQ10鉴定为诱导细胞中代谢状态的转变和线粒体功能的部分恢复。这些结论基于本文中描述的数据的下列解释和本领域内的现有知识。
已知Q10在线粒体内膜中合成，被主动运输至其中，富集在其中和用于其中。还已知Q10是线粒体中用于能量产生的氧化磷酸化过程的必需辅因子。然而，大多数癌细胞主要通过糖酵解，然后在细胞溶胶中进行乳酸发醇(而非如大多数正常细胞一样在线粒体中通过丙酮酸的氧化)来产生能量。氧化磷酸化包括电子传递复合物和细胞色素c。细胞凋亡包括线粒体的破裂，促细胞凋亡因子对线粒体内膜的透化。通过利用不同的代谢能量合成途径，癌细胞能够缓解对细胞的异常情况的正常细胞凋亡反应。然而不希望受理论束缚，本申请人提出Q10通过上调氧化磷酸化途径的蛋白质，从而使线粒体功能转换回可识别致癌缺陷和触发细胞凋亡的状态来起作用。因此，Q10通过转变细胞的代谢状态发挥表观代谢转变剂的作用。
实施例18：与肿瘤障碍相关的表观代谢转变剂的鉴定
利用不同水平的候选表观代谢转变剂处理一组皮肤细胞系，其由对照细胞系(例如，角质细胞和黑素细胞的原代培养物)和癌细胞系(例如，SK-MEL-28，非转移性皮肤黑素瘤；SK-MEL-2，转移性皮肤黑素瘤；或SCC，鳞状细胞癌；PaCa2，胰腺癌细胞系；或HEP-G2，肝癌细胞系)组成。通过检查细胞对候选表观代谢转变剂的敏感性和细胞凋亡反应来评估细胞形态学/生理学的变化。如实施例3中详细描述的进行这些实验。简而言之，通过在不同时间上和在一系列应用的浓度上监控细胞存活率来评估细胞系对候选表观代谢转变剂的敏感性。通过使用例如与流式细胞术方法组合的连接蛋白试剂来评估细胞对候选表观代谢转变剂的细胞凋亡反应。连接蛋白试剂包含两种染料7AAD和膜联蛋白-V-PE的组合，并且允许定量处于早期和晚期细胞凋亡的细胞群体。可利用例如ApostrandTM ELISA法，使用测量单链DNA的另外的细胞凋亡测定法。评估和比较患病细胞系和对照细胞系的敏感性和细胞凋亡反应。基于相对于正常或对照细胞它们优先或选择性抑制在癌细胞中的细胞生长的能力评估候选表观代谢转变剂。还基于相对于正常或对照细胞它们优先或选择性诱导癌细胞中的细胞凋亡的能力评估候选表观代谢转变剂。
应用测定法评估利用候选表观代谢转变剂处理后的上文中鉴定的细胞的mRNA和蛋白质水平组成的变化。使用实时PCR微阵列分析mRNA水平的变化。如实施例6和9-13中详细描述的进行这些实验。简而言之，在处理后不同时间上从细胞提取mRNA。通过使用靶向途径阵列(包括特异于细胞凋亡、氧化性应激和抗氧化防御、血管生成、热激或糖尿病的阵列)评估参与特定途径的基因的mRNA的水平。鉴定和评估了在它们的mRNA转录上被改变2倍水平或更高水平的基因。
使用抗体微阵列分析、与质谱表征偶联的2-D凝胶电泳分析和western印迹分析法分析蛋白质表达的变化。分别如实施例7、4和8中详细描述的进行这些实验。简而言之，在利用候选表观代谢转变剂处理后不同的时间上例如6小时或24小时，从细胞提取可溶性蛋白质。由候选表观代谢转变剂诱导的蛋白质水平的变化通过使用包含700多种蛋白质的抗体的抗体微阵列，获取许多蛋白质种类样品和潜在的途径标志来评估。通过使用偶联质谱技术的双向(2-D)凝胶电泳进行进一步的互补蛋白质组学分析。向细胞系中外源加入候选表观代谢转变剂，裂解细胞沉淀，将其经历2-D凝胶电泳。分析凝胶以鉴定经处理的样品相对于对照未处理的样品的蛋白质水平的变化。分析凝胶以鉴定因升高的水平、降低的水平或翻译后修饰而在处理的时间过程中引起的点变化。切取显示统计上显著的变化的点，利用胰蛋白酶消化和质谱表征对其进行蛋白质鉴定。利用例如Mascot和MSRAT软件分析针对蛋白质数据库搜索表征的肽，以鉴定所述蛋白质。除了上述2-D凝胶分析和抗体微阵列实验外，还可通过Western印迹分析评估由候选MIM诱导的特定蛋白质的水平的潜在变化。在所有蛋白质组学实验中，鉴定和评估了在不同细胞系中具有升高或下降的水平的蛋白质。
基于细胞系中因候选表观代谢转变剂的添加而诱导的基因表达在mRNA和/或蛋白质水平上的变化评估所述候选表观代谢转变剂。具体地，基于它们调节已知与细胞代谢过程相关或参与其中的基因的能力评估候选表观代谢转变剂。针对与肿瘤障碍的特别相关性，基于它们调节已知与例如细胞凋亡、癌症生物学和细胞生长相关的基因的能力评估候选表观代谢转变剂。
使用本领域技术人员已知的常规方法测定候选表观代谢转变剂的水平以及候选表观代谢转变剂存在于细胞中的形式或具体的细胞定位。例如，通过分析来自用候选表观代谢转变剂处理的细胞的富集线粒体的制剂来测定线粒体中候选表观代谢转变剂随时间过去和在一系列剂量上的水平。可比较线粒体中候选表观代谢转变剂的水平和使该水平与观察到其他细胞变化例如，与代谢和细胞凋亡途径相关的特定蛋白质的mRNA和蛋白质水平的调节发生关系。
将基于获自上述实验的结果观察到诱导细胞的代谢状态的转变的候选表观代谢转变剂鉴定为表观代谢转变剂。例如，展示细胞毒性和/或诱导细胞的细胞凋亡的候选表观代谢转变剂被鉴定为表观代谢转变剂。优选，展示差异细胞毒性和/或差异诱导患病(癌症)细胞相对于正常细胞的细胞凋亡反应的候选表观代谢转变剂(例如，差异调节参与癌细胞相对于正常细胞的细胞凋亡的蛋白质的表达的表观代谢转变剂)被鉴定为表观代谢转变剂。
实施例19：维生素D3被鉴定为表观代谢转变剂
维生素D3或1α，25-二羟基维生素D3(也称为骨化三醇)是通过两步酶促法从维生素D合成的维生素D代谢产物。维生素D3与其遍在细胞核维生素D受体(VDR)相互作用以调节一系列参与钙和磷酸体内平衡以及细胞分裂和分化的基因的转录。已报导维生素D3在许多模型系统(包括鳞状细胞癌、前列腺腺癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌)中具有抗癌效应(综述于Deeb等人2007Nature Reviews Cancer7：684-700)。
维生素D3的抗癌效应据报导牵涉多个机制，包括在细胞周期的G1期生长停止、细胞凋亡、肿瘤细胞分化、生长因子介导的细胞存活信号的中断和血管生成和细胞粘附的抑制(综述于Deeb等人2007Nature Reviews Cancer 7：684-700中)。例如，具体地在细胞凋亡方面，已报导维生素D3通过调节细胞凋亡的至关重要的介体，例如抑制抗细胞凋亡、促存活蛋白BCL2和BCL-XL的表达或诱导促细胞凋亡蛋白(例如，BAX、BAK和BAD)的表达来诱导细胞凋亡(Deeb等人2007)。在其他实例中，具体地在血管生成方面，已报导维生素D3抑制某些肿瘤来源的内皮细胞的增殖和抑制诱导肿瘤的血管生成的血管内皮生长因子(VEGF)的表达(综述于Masuda和Jones，2006Mol.Cancer Ther.5(4)：797-8070中)。在另一个实例中，具体地在细胞周期停滞方面，已报导维生素D3诱导细胞周期依赖性激酶抑制剂p21WAFI/CIPI的基因表达和诱导细胞周期依赖性激酶抑制剂p27KIPI蛋白的合成和/或稳定，所述两者对于G1阻滞的诱导是至关重要的。(Deeb等人2007)。
基于上述观察，维生素D3被鉴定为表观代谢转变剂，即归因于其转变细胞的代谢状态。维生素D3是归因于其诱导细胞的细胞凋亡的能力，特别地基于其在患病的(癌症)细胞相对于正常细胞中差异性抑制细胞生长和诱导细胞凋亡反应(例如，差异性调节参与相对于正常细胞的癌细胞的细胞凋亡的蛋白质例如BCL-2、BCL-XL和BAX的表达)的能力的表观代谢转变剂。
实施例20：重要蛋白质的概述
概括而言，基于上述实施例中描述的实验的结果，被Q10调节的重要蛋白质概述于下表中。
表29.被Q10调节的重要蛋白质
Figure BPA00001497291601701
实施例21：致癌和正常细胞对辅酶Q10的相对敏感性
检查和比较辅酶Q10处理对多种致癌和正常细胞系的效应。通过监控细胞凋亡的诱导评估细胞对辅酶Q10的敏感性。如下面在材料和方法中所述进行细胞的CoQ10处理。通过监控如下所述的早期细胞凋亡的指标(例如，Bcl-2表达、半胱天冬酶激活和通过使用膜联蛋白V测定法)评估被处理的细胞中细胞凋亡的诱导。根据这些研究，确定诱导在一组细胞系中诱导细胞凋亡所需的最少CoQ10剂量例如CoQ10的浓度和处理时间。
在意外的令人惊讶的结果中，数据显示辅酶Q10处理的功效在展示增加的致癌性和/或更大的转移潜能的细胞类型，即来源于更具侵袭性的癌症或肿瘤的细胞类型中更大。这些研究的结果概述于下表30中。数据显示CoQ10以时间和浓度依赖性方式对处于更具侵袭性的癌症状态中的细胞更有效。此外，在正常细胞(相对于致癌细胞)上观察到令人惊讶的差异效应。特别地，意外地发现辅酶Q10在正常组织环境中展示轻微的支持作用，其中在正常细胞(包括角质细胞和真皮成纤维细胞)中观察到增加的增殖和迁移。
辅酶Q10对基因调控和蛋白质机制的效应在癌症中与在正常细胞中不同。至关重要的细胞机制和组成例如膜流动性、转运机制、免疫调节、血管生成、细胞周期控制、基因组稳定性、氧化控制、糖酵解流、代谢控制和细胞外基质蛋白质的完整性失调，从而细胞的遗传和分子指纹被改变。疾病环境有利于细胞控制过程的管理。本文中提供的数据表明CoQ10通过以允许恢复细胞凋亡潜能的方式标准化一些关键的上述过程来发挥更大水平的功效(例如，在癌细胞和正常细胞中，和在与不太具有侵袭性或非侵袭性癌症状态的细胞相比较更具侵袭性癌症状态的细胞中)。
表30：在不同细胞类型中诱导早期细胞凋亡所需的最低CoQ10浓度和处理时间
Figure BPA00001497291601711
Figure BPA00001497291601721
Figure BPA00001497291601731
材料和方法
细胞的制备和处理
培养皿或培养瓶中制备的细胞
将细胞于37℃、5％CO2水平的培养箱中培养在具有补充有10％胎牛血清(FBS)、1％PSA(青霉素、链霉素、两性霉素B)(Invitrogen和Cellgro)的相关培养基的T-75培养瓶中直至达到70-80％的汇合。为了收获细胞用于处理，用1mL胰蛋白酶预处理培养瓶，吸出，利用另外3mL进行胰蛋白酶处理，然后在37℃下温育3-5分钟。随后用等体积的培养基中和细胞，以10,000rpm离心随后的溶液8分钟。吸出上清液，利用8.5ml培养基重悬浮细胞。利用库耳特计数器读取500ul重悬浮液和9.5ml异丙醇的混合物2次，确定待接种至每一个培养皿中的细胞的适当数量。以一式三份检查对照组和浓度为0-200μM的组。从500μM CoQ-10原液进行系列稀释以在适当的培养皿中获得所需的实验浓度。取决于细胞类型和实验方案，将培养皿在37℃、5％的CO2水平的培养箱中温育0至72小时。
蛋白质的分离和定量
培养皿中制备的细胞
在细胞处理温育期结束后，进行蛋白质分离。用2ml冰冷的1x磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤所有处理组的培养皿2次，再用1ml该溶液洗涤1次。仅在初始2次洗涤后从培养皿吸出PBS。轻轻地括取细胞，使用来自第三次洗涤的终体积将其收集入微量离心管中，以10,000rpm离心10分钟。离心后，吸出上清液，利用50uL裂解缓冲液(对于每100uL裂解缓冲液而言1uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂)裂解沉淀。随后在-20℃下冷冻样品过夜。
培养瓶中制备的细胞
在细胞处理温育期结束后，进行蛋白质分离。用5ml冰冷的1xPBS洗涤所有处理组的培养瓶2次，再用3mL该溶液洗涤1次。仅在初始2次洗涤后从培养皿吸出PBS。轻轻地括取细胞，使用来自第三次洗涤的终体积将其收集入15mL离心管中，以10,000rpm离心10分钟。离心后，吸出上清液，利用适当量的裂解缓冲液(对于每100uL裂解缓冲液而言1uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂)裂解沉淀。裂解缓冲液体积取决于沉淀大小。将样品转移至微量离心管中，在-20℃下冷冻样品过夜。
蛋白质定量
将样品在-4℃下解冻，超声处理以确保在蛋白质分离后当天匀化。使用微BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)进行蛋白质定量。为了制备用于免疫印迹分析的样品，制备1∶19的β巯基乙醇(Sigma)对样品缓冲液(Bio-Rad)的溶液。利用β巯基乙醇-样品缓冲液以1∶1稀释样品，于95℃下煮沸5分钟，然后在-20℃下冷冻过夜。
免疫印迹分析
Bcl-2，半胱天冬酶，9，细胞色素c
使用从BAC蛋白质测定获得的蛋白质的原始平均浓度确定每孔加载的样品的体积。对于每一个处理时间点加载约30-60μg蛋白质。以一式三份在85和100伏下，在12％Tris-HCl预制胶(Bio-Rad)或手动浇注胶上于1x电泳缓冲液中进行蛋白质电泳。随后在100伏下将蛋白质转移至硝酸纤维素纸上，进行1小时，然后在5％牛奶溶液再封闭1小时。将膜在-4℃下置于一抗(1uL Ab：1000uL TBST)(CellSignaling)中过夜。第2天，用Tris-缓冲的盐溶液Tween-20(TBST)洗涤膜3次，每次10分钟，然后在-4℃下应用二抗(抗兔；1uLAb：1000uLTBST)，进行1小时。再用TBST洗涤膜3次，每次10分钟，完成使用Pico或Femto底物的化学发光(Pierce)。随后以产生最佳视觉结果的时间间隔使膜显影。在显影后，将膜于-4℃下保持在TBST中直至可测量肌动蛋白水平。
肌动蛋白
将膜在-4℃下置于肌动蛋白一抗(1uL Ab：5000uL TBST)(CellSignaling)中进行1小时，用TBST洗涤3次，每次10分钟，然后在-4℃下应用二抗(抗小鼠；1uL Ab：1000uL TBST)，进行1小时。再用TBST洗涤膜3次，每次10分钟，完成使用Pico底物的化学发光(Pierce)。随后以产生最佳视觉结果的时间间隔使膜显影。
钙磷脂结合蛋白V测定法
将细胞于PBS10X中洗涤2次，重悬浮于结合缓冲液(0.1MHEPES，pH 7.4；1.4M NaCl；25mM CaCl2)中。向具有5μL膜联蛋白-PE染料或7-ADD的培养管中加入100μL的样品。混合细胞，将其在室温下无光温育15分钟。之后，向每一个样品中加入400μL 1X结合缓冲液，将它们经历利用流式细胞术的分析。
实施例21：用辅酶Q10处理的细胞的Western分析
在过去50年中，已产生了大量牵涉影响特定过程的内源/外源因素(如恶性转化的根本原因)的信息。临床和基础文献提供提供了DNA结构和功能的变化在癌症的起始和进展中起重要作用的证据，从而将癌症确定为遗传性疾病(Wooster，2010；Haiman，2010)。在1920年代初期，参与表征肿瘤发生的病因学中的基本变化的Otto Warburg和其他研究人员描述了两个主要观察(a)细胞在氧存在的情况下在ATP的产生中运输和利用葡萄糖进行能量生产的能力-也称为Warburg效应和(b)线粒体结构和功能的改变-包括电子传递的改变导致线粒体ATP产生的减少。过去数年中已看到研究细胞生物能学在癌症病因学中的中心作用(即，将癌症视为代谢疾病)的复兴。
历史上，虽然曾经认为基因的突变是导致基因表达的改变的原因，但不断积累的文献支持表观遗传学过程在影响支持癌发生的基因表达中起着至关重要的作用。这被大多数基因的突变很低并且不能解释在癌细胞中发现的许多(一系列)突变的观察所证明。表观遗传学改变受组蛋白尾部的甲基化和修饰调控，两个变化都与细胞的能量(营养物)状态具有内在联系，因为它们需要辅因子例如组蛋白乙酰化所需的乙酰CoA的可获得性(文献)。乙酰CoA的生物合成依赖于糖酵解和克雷布斯循环，从而直接使细胞内能量状态与基因表达和活性的调控相关联。
在正常细胞中，线粒体氧化磷酸化产生足够的ATP来满足维持正常生理活性和细胞存活的能量需要。线粒体能量产生的结果是活性氧(ROS)的产生，其的异常产生导致线粒体的损害(文献)。已良好地确定由线粒体引起的慢性ROS产生导致基因突变的累进积累，牵涉癌发生的病因学的现象。已有人提出癌细胞减少线粒体呼吸以使ROS产生减少至最低限度，并且转换至糖酵解以维持能量产生。因此，能量产生从氧化磷酸化至糖酵解的渐进转变是细胞维持能量产生以维持生理功能所必需的并且可与正常细胞表型向癌细胞表型的进展相关。与线粒体基因组成的累进改变(突变)协同的细胞能量(生物能)特征谱的渐进转变改变了细胞代谢组(metabolome)。因线粒体磷酸化至糖酵解转换而导致的整个细胞的代谢组特征谱的变化相应于异常生物能学诱导的代谢组特征谱并且是支持癌发生的根本原因。使用内源分子诱发朝向与细胞生物能状态相关的非癌正常线粒体氧化磷酸化的状态的细胞代谢组转变的靶向干预代表了癌症治疗的治疗终点。
作为引起表观代谢转变的MIM的辅酶Q10
本文中提供的数据显示利用辅酶Q10对正常和癌细胞的治疗与调节糖酵解-线粒体氧化性应激连续谱(continuum)内的至关重要的生物化学终端的蛋白质的表达的变化相关。描述通过western印迹分析和耗氧率评估蛋白质表达的数据的组合显示在正常细胞中，在暴露于辅酶Q10后不存在正常的糖酵解和线粒体呼吸速率的显著改变。因此，正常细胞例如HDFa(正常人成体成纤维细胞)、HASMC(正常人主动脉平滑肌细胞)、nFib(正常成纤维细胞)和HeKa(正常人角质细胞)中蛋白质的表达和线粒体呼吸速率的值可被认为是基线生理状态的代表。癌细胞系例如HepG2(肝癌)、PaCa-2(胰腺癌)、MCF7(乳腺癌)、SK-MEL(黑素瘤)和SCC-25(鳞状细胞癌)中蛋白质表达和线粒体呼吸速率的任何偏差代表了因疾病(在该情况下癌症)的起始/进展而产生的改变。实验证据支持癌细胞暴露于辅酶Q10与代表正常细胞的细胞病理生理学重组(reorganization)相关的假说。具体地，本文中提供的数据显示癌细胞的辅酶Q10暴露与负责诱导细胞结构的全局性重组的糖酵解途径和线粒体氧化磷酸化至正常细胞中观察到的所述途径的转变相关。
在正常细胞中，糖酵解输出的终点与线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)连接，即通过糖酵解途径从葡萄糖产生的丙醇酸盐进入克雷布斯循环(也称为三羧酸循环、TCA或柠檬酸循环)以产生还原当量来支持用于ATP产生的线粒体OXPHOS。因此，在正常细胞中，参与糖酵解的基因产物的表达和功能方向被引向丙酮酸盐的充足产生和其至克雷布斯循环的进入。癌细胞中参与糖酵解和克雷布斯循环途径的至关重要的蛋白质的表达和功能失调导致伴随线粒体功能的显著降低的增强的糖酵解。癌细胞对辅酶Q10(一种选择性影响线粒体呼吸链的内源分子)的暴露改变(正常化)糖酵解和克雷布斯循环途径的蛋白质的表达以促进生物能学转变，以便使能量产生(即，ATP产生)恢复至线粒体。
实验方法
Western印迹实验1
用于本实验的细胞是HDFa和MCF-7细胞，以2个不同浓度50μM和100μM的辅酶Q10处理或不处理所述细胞，在24小时的处理后收获所述细胞。将完整细胞沉淀一次一个地重悬浮于1mL C7缓冲液中并且转移至标记的15mL管中。随后在冷室中在冰上使用6个声波脉冲(设置在#14)对样品进行超声处理。超声处理后将样品短暂离心至2500g，将样品转移至2mL管中。使用保持在50mL样品管中的泡沫验证每一个样品的pH(pH应当为9.0)。
通过加入10ul 1M丙烯酰胺，25ul三丁基膦并且在间歇性混合的条件下温育90分钟对每一个样品进行样品的烷基化和还原。在温育后，加入10ul 1M DTT，将试管在20℃下以20,000g离心10分钟，将上清液转移至标记的Amicon Ultra离心过滤器(具有10k截断值)(Millipore catalog#UFC 801024)。将样品以2500g离心15分钟，间隔2次。使用电导仪测量单独的Chap以及样品的电导率。如果样品的电导率很高，则加入1ml chap用于缓冲液更换，以2500g再次离心直至体积减少至250ul。当电导率为200或更少时，以5分钟的间隔以2500g离心样品直至上清液的体积为150-100ul。将样品上清液转移至eppendorf管中，使用BSA作为标准进行Bradford测定。
按照上述标准方案处理样品，利用Bradford测定法测定每一个样品的蛋白质量。如下所示利用Lamelli上样染料(Loading dye)(LDS)和MilliQ水制备等同于10ug蛋白质的样品体积，在4-12％Bis-TrisNovex NuPAGE凝胶(Invitrogen，cat#NP0323Box)上进行电泳。
使用NOVEX Xcell Surelock系统在200V下利用1X MOPS缓冲液进行凝胶电泳，进行50分钟。随后使用NOVEX Xcell Surelock湿转移方案(wet transfer protocol)在30V下转移凝胶，进行1小时。用来自Invitrogen的Simply Blue Safestain(LC6065)对印迹染色。
HDFa和MCF-7样品的IDH1和ATP柠檬酸裂解酶水平
在转移后，将每一个印迹置于2张Whatman滤纸之间，干燥15-20分钟。在干燥后，使用HB铅笔给印迹标明日期、样品类型以及印迹或印迹2。用铅笔勾勒出分子量标记的轮廓，单线代表蓝色，双线表示有色的标记。用甲醇活化印迹，进行5秒，用水洗涤5分钟，用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，15分钟；2次，每次5分钟)。通过在振荡的条件下，利用含有5％BSA的TBST中的IDH1的一抗(Cell Signaling#3997)(以1∶1000稀释的)在4℃下温育过夜来探测印迹1，利用以1∶1000稀释的5％BSA中的ATP柠檬酸裂解酶的兔多克隆抗体(Cell Signaling#4332)探测印迹2。在利用一抗过夜温育后，利用TBS-T洗涤印迹3次(1次，15分钟；2次，5分钟)，然后在室温下于轨道倾斜振荡器上利用二抗(抗兔；1∶10,000稀释度)温育1小时来探测该印迹。在用二抗温育1小时后，用TBS-T(1次，15分钟；2次，每次5分钟)洗涤印迹3次，随后利用ECF试剂温育5分钟，然后利用5100Fuji激光扫描仪(以25uM的分辨率，16bit，绿色激光，于400V和500V下)扫描各个印迹。
HDFa和MCF-7样品的肌动蛋白水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描2个印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在振荡的条件下用以1∶5000稀释的5％BSA中的肌动蛋白的抗体(Sigma catalog#A5316，克隆AC-74)在室温下探测1小时。在用肌动蛋白的一抗温育1小时后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗小鼠；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
Western印迹实验2
本实验中所使用的细胞为SKMEL28、SCC-25、nFib和Heka细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在3、6和/或24小时的处理后收获所述细胞。处理样品，如上所述将其在4-12％Bis-Tris Novex NuPAGE凝胶上进行电泳。基本上如上所述进行凝胶电泳，转移和染色。
4个细胞系的IDH1的水平
转移后，使印迹干燥15-20分钟，用甲醇活化5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST进行15分钟。用5％的TBS-T中的封闭试剂在室温下封闭印迹1小时，随后用TBS-T(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)洗涤3次。随后在振荡的条件下，通过在4℃下温育过夜，用具有5％BSA的TBST中的IDH1的一抗(Cell Signaling#3997)(以1∶1000稀释)探测该印迹。在用IDH1的一抗过夜温育后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在室温下用二抗(抗兔；1∶10,000的稀释度)探测，进行1小时。在与二抗温育1小时后，用TBS-T(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)洗涤印迹3次，然后与ECF试剂一起温育，进行5分钟，随后用5100Fuji激光扫描仪(以25uM的分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
4个不同细胞系的ATP柠檬酸裂解酶水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离异柠檬酸脱氢酶印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)。然后在振荡的条件下用以1∶5000稀释的5％BSA中的ATP柠檬酸裂解酶的兔多克隆抗体(Cell Signaling#4332)在4℃下探测该印迹，进行过夜。在用ATP柠檬酸裂解酶的一抗温育过夜后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗兔；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
4个不同细胞系的肌动蛋白水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离ATP柠檬酸裂解酶。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在振荡的条件下用以1∶5000稀释的5％BSA中的肌动蛋白的抗体(Sigma catalog#A5316，克隆AC-74)在室温下探测1小时。在用肌动蛋白的一抗温育1小时后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗小鼠；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
Western印迹实验3
本实验中所使用的细胞为HepG2、HASMC和PACA2细胞，用或不用2个不同浓度(50μm或100μm)的辅酶Q10处理所述细胞，在48小时的处理后收获所述细胞。在本实验(western印迹实验3)中和在下面描述的所有实验(即，western印迹实验4至9)中，用5mM葡萄糖(“5G”)或22mM葡萄糖(“22G”)额外地处理所述细胞。如上所述处理来源于所述细胞的样品，在4-12％Bis-Tris Novex NuPAGE凝胶上进行电泳。基本上如上所述进行凝胶电泳，转移和染色。
HASMC相对PACA2和HepG2的IDH1、ATP柠檬酸裂解酶和肌动蛋白水平
基本上如上所述，通过用IDH1、ATP柠檬酸裂解酶和肌动蛋白的一抗探测印迹来测定IDH1、ATP柠檬酸裂解酶的水平和肌动蛋白水平。
Western印迹实验4
本实验中所使用的细胞为HepG2细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在24或48小时的处理后收获所述细胞。处理样品，如上所述将其在4-12％Bis-Tris NovexNuPAGE凝胶上进行电泳。基本上如上所述进行凝胶电泳，转移和染色。
HepG2细胞的乳酸脱氢酶水平
转移后，使印迹干燥15-20分钟，用甲醇活化5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST进行15分钟。用5％的TBS-T中的封闭试剂在室温下封闭印迹1小时，随后用TBS-T(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)洗涤3次，在振荡的条件下，通过在4℃下温育过夜，用5％BSA中的乳酸脱氢酶的一抗(abcam ab2101；多克隆)(以1∶1000稀释的)探测该印迹。在用乳酸脱氢酶的一抗过夜温育后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，次5分钟)，然后在室温下用二抗(兔抗山羊；1∶10,000的稀释度)探测，进行1小时。在与二抗温育1小时后，用TBS-T(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)洗涤印迹3次，然后与ECF试剂一起温育，进行5分钟，随后用5100Fuji激光扫描仪(以25uM的分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
HepG2细胞的丙酮酸激酶肌肉形式(PKM2)的水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离乳酸脱氢酶印迹。在激光扫描仪中扫描2个印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，在振荡的条件下用以1∶500稀释的5％BSA中的丙酮酸激酶的兔多克隆抗体(NOVUS BIOLOGICALS catalog#H00005315-D01P)在4℃下探测该印迹，进行过夜。在用丙酮酸激酶M2的一抗温育过夜后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗兔；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
HepG2细胞的丙酮酸脱氢酶β水平
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多的TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离丙酮酸脱激酶印迹。在激光扫描仪中扫描2个印迹以检查完全剥离。在确保抗体和ECF试剂的剥离已完成后，用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹，进行1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，在振荡的条件下用5％BSA中的丙酮酸脱氢酶的抗体(ABNOVA catalog#H00005162-M03)(以1∶500稀释的)在4℃下探测该印迹，进行过夜。在用丙酮酸脱氢酶的一抗温育过夜后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗小鼠；1∶10,000的稀释度)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
HepG2细胞的肌动蛋白水平
基本上如上所述剥离丙酮酸脱氢酶印迹，随后探测肌动蛋白。
Western印迹实验5
本实验中所使用的细胞为MIAPACA2(PACA2)细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在24或48小时的处理后收获所述细胞。处理PACA2样品，并且基本上如上所述进行凝胶电泳，转移，染色和扫描。
PaCa2细胞的乳酸脱氢酶(LDH)和丙酮酸脱氢酶(PDH)水平
基本上如上所述，通过用LDH和PDH的一抗成功地探测印迹来测定LDH和PDH的水平。
PaCa2细胞的半胱天冬酶3水平.
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离印迹。在激光扫描仪中扫描2个印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在振荡的条件下用5％BSA中的半胱天冬酶3的抗体(Santacruz Biotechnology#sc7272)(以1∶200稀释的)在4℃探测过夜。在用半胱天冬酶3的一抗温育过夜后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上用二抗(抗小鼠；1∶10,000稀释)在室温下探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
Western印迹实验6
用于本Western印迹实验的细胞是用或未用辅酶Q10IV制剂处理的并且在24小时的处理后收获的PC-3、HepG2、MCF-7、HDFa和PACA2。基本上如上所述，处理样品，转移，染色和扫描。
不同细胞类型中的半胱天冬酶3和肌动蛋白水平
基本上如上所述的，通过用半胱天冬酶3和肌动蛋白的一抗成功地探测印迹来测定半胱天冬酶3和肌动蛋白的水平。
Western印迹实验7
本实验中所使用的细胞为人主动脉平滑肌(HASMC)细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在24或48小时的处理后收获所述细胞。处理HASMC样品，并且基本上如上所述进行凝胶电泳，转移，染色和扫描。
用于肌动蛋白的实验方案：
基本上如上所述的，通过用肌动蛋白的一抗成功地探测印迹来测定肌动蛋白的水平。
用于Hif1α、半胱天冬酶3和PDHB的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离肌动蛋白印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的Hif1α、半胱天冬酶3或PDHB的一抗(以1∶200)在4℃下温育过夜来进行探测。将Hif1α的一抗(Abcam ab2185；抗兔)以1∶500稀释于5％BSA中。将半胱天冬酶3的一抗(Santacruz sc7272；抗兔)以1∶200稀释于5％BSA中。将丙酮酸脱氢酶β的一抗(PDHB)(Novus BiologicalsH00005162-M03；抗小鼠)以1∶500稀释于5％BSA中。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在室温下用二抗(PDHB抗小鼠；Hif 1a和半胱天冬酶3抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
PKM2、SDHB和SDHC的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的PKM2、SDHB或SDHC的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。将SDHC的一抗(ABNOVA H00006391-M02；抗小鼠)以1∶500稀释。SDHB的一抗来自Abcam ab4714-200；抗小鼠；以1∶1000稀释。丙酮酸激酶M2(PKM2)的一抗来自Biologicals H00005315-D0IP；抗兔；以1∶500稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(SDHB&C抗小鼠；和PKM2抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
LDH和Bik的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA(于TBS-T中)中的LDH或Bik的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。LDH的一抗来自Abcam ab2101；抗山羊；以1∶1000稀释。Bik的一抗来自CellSignaling#9942；抗兔；以1∶1000稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(LDH抗山羊；Jackson Laboratories)和Bik抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
Western印迹实验9
本实验中所使用的细胞为HepG2细胞，用或不用2个不同浓度50μm或100μm的辅酶Q10处理所述细胞，在24或48小时的处理后收获所述细胞。处理HepG2样品，并且基本上如上所述进行凝胶电泳，转移，染色和扫描。
肌动蛋白的实验方案：
基本上如上所述的，通过用肌动蛋白的一抗成功地探测印迹来测定肌动蛋白的水平。
半胱天冬酶3和MMP-6的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离肌动蛋白印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的半胱天冬酶3或MMP-6的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。将半胱天冬酶3的一抗(Abcam ab44976-100；抗兔)以1∶500稀释于5％BSA中。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在室温下用二抗(MMP-6抗小鼠；半胱天冬酶3抗兔；1∶10,000稀释)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
LDH的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA或5％牛奶中的LDH的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。将LDH 080309b1的一抗(Abcam ab2101；抗山羊)以1∶1000稀释于5％BSA中。将LDH080309b2的一抗(Abcam ab2101；抗山羊)以1∶1000稀释于5％牛奶中。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在室温下用二抗(Jackson Immuno Research抗山羊；1∶10,000的稀释度；305-055-045)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
转醛醇酶和Hif1a的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。在激光扫描仪中扫描印迹以检查完全剥离。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的转醛醇酶或Hif1a的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。转醛醇酶的一抗(Abcam ab67467；抗小鼠)以1∶1000稀释。将Hif1a的一抗(Abcamab2185；抗兔)以1∶5000稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(抗小鼠或抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
IGFBP3和TP53的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的IGFBP3或TP53的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。IGFBP3的一抗(Abcam ab76001；抗兔)以1∶1000稀释。将TP53的一抗(Sigma Aldrich AV02055；抗兔)以1∶100稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(抗兔；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
转醛醇酶和PDHB的实验方案：
通过用甲醇温育30分钟，然后用TBS-T洗涤2次(每次10分钟)，随后用蛋白印迹膜剥离缓冲液于50℃下温育30分钟，然后用100ml或更多TBS-T洗涤2次(每次30分钟)来剥离上述印迹。用甲醇活化印迹5秒，用水洗涤5分钟，然后用TBST洗涤15分钟。在室温下用5％的TBS-T中的封闭试剂封闭印迹1小时，随后用TBS-T洗涤3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后通过在轻轻振荡的条件下用5％BSA中的转醛醇酶或PDHB的一抗在4℃下温育过夜来进行探测。转醛醇酶的一抗(Santacruz sc51440；抗山羊)以1∶200稀释。将PDHB的一抗(Novus Biologicals H00005162-M03；抗小鼠)以1∶500稀释。在用一抗温育后，用TBS-T洗涤膜3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，然后在轨道倾斜振荡器上在室温下用二抗(抗山羊或抗小鼠；1∶10,000的稀释度)探测1小时。在用二抗温育1小时后，用TBS-T洗涤印迹3次(1次，约15分钟；2次，每次5分钟)，随后用ECF试剂温育5分钟，然后，用5100Fuji激光扫描仪(以25uM分辨率，16bit，绿色激光，在400V和500V下)扫描每一个印迹。
结论
异柠檬酸脱氢酶-1(IDH-1)
异柠檬酸脱氢酶是作为通常在线粒体基质中发生的TCA循环的部分的酶之一。然而，IDH1是催化异柠檬酸盐至α-酮戊二酸的氧化脱羧并且在两步骤过程中产生二氧化碳的酶的细胞溶胶形式。IDH1是存在细胞溶胶和过氧化物酶体中的NADP+依赖性形式。IDH1被Serl13磷酸化灭活并且在许多种类(包括不具有柠檬酸循环的种类)中表达。IDH1似乎通常用作肿瘤抑制剂，当失活时其通过HIF-1途径的活化部分促成肿瘤发生(Bayley 2010；Reitman，2010)。最近的研究在胶质母细胞瘤的病因学中涉及IDH1的灭活突变(Bleeker，2009；Bleeker，2010)。
利用辅酶Q10的治疗增加IDH1在癌细胞系(包括MCF-7、SKMEL28、HepG2和PaCa-2细胞)中的表达。在SCC25细胞系中存在表达的适度增加。相反地，原代人源性成纤维细胞HDFa、nFIB和主动脉平滑肌细胞HASMC的培养物未显示IDH1响应辅酶Q10的表达模式的显著改变。α-酮戊二酸(α-KG)是TCA循环中的至关重要的中间产物，其从异柠檬酸盐生物化学合成并且最终转化成琥珀酰coA并且为可药用的MIM和表观代谢转变剂。α-KG的产生用作TCA循环中的关键接合点(juncture)，因为其可被细胞用于再补充循环的中间产物，从而导致还原等当量的产生以增强氧化磷酸化。因此，辅酶Q10介导的IDH1表达的增加可导致可被线粒体TCA循环用于增强癌细胞的氧化磷酸化的中间产物的形成。结果概述于下表31-33中。
表31HDFa和MCF-7中的IDH1
  组成   归一化的平均强度
  HDF，培养基   346
  HDF24-50-辅酶Q10   519
  HDF24-100-辅酶Q10   600
  MCF，培养基   221
  MCF24-50-辅酶Q10   336
  MCF24-100-辅酶Q10   649
表32：治疗后HASMC相对HepG2中的IDH1
  量-组成   归一化的强度
  HAS5g48-培养基   20
  HAS5g48-50-辅酶Q10   948
  HAS5g48-100-辅酶Q10   1864
  HAS22G48-培养基   1917
  HAS22G48-50-辅酶Q10   1370
  HAS22G48-100-辅酶Q10   1023
  Hep5g48-培养基   14892
  Hep5g48-50-辅酶Q10   14106
  Hep5g48-100-辅酶Q10   15774
  Hep22G48-培养基   16558
  Hep22G48-50-辅酶Q10   15537
  Hep22G48-100-辅酶Q10   27878
表33：处理后HASMC相对PACA2的IDH1
  量-组成   归一化的强度
  HAS5g48-培养基   562
  HAS5g48-50-辅酶Q10   509
  HAS5g48-100-辅酶Q10   627
  HAS22G48-培养基   822
  HAS22G48-50-辅酶Q10   1028
  HAS22G48-100-辅酶Q10   1015
  PACA5g48-培养基   1095
  PACA5g48-50-辅酶Q10   1095
  PACA5g48-100-辅酶Q10   860
  PACA22G48-培养基   1103
  PACA22G48-50-辅酶Q10   1503
  PACA22G48-100-辅酶Q10   1630
ATP柠檬酸裂解酶(ACL)
ATP柠檬酸裂解酶(ACL)是在细胞溶胶中催化乙酰-CoA和草酰乙酸盐的形成的同源四聚体(～126kd)。该反应是脂肪酸、胆固醇和乙酰胆碱的生物合成以及糖生成的非常重要的第一步骤(Towle等人，1997)。营养物和激素调节该关键酶的表达水平和磷酸化状态。已报导了Akt和PKA对ACK的Ser454磷酸化(Berwick.，DC MW等人，2002；Pierce MW等人，1982)。
数据描述了辅酶Q10在正常和癌细胞中对ATP柠檬酸裂解酶的效应。始终观察到在癌细胞中存在ACL酶的表达的剂量依赖性减少。相反地，在正常细胞中似乎存在朝向增加的ACL表达的趋势。已证明细胞溶胶ACL是在生长因子刺激过程中和在分化过程中组蛋白乙酰化所必需的。ACL利用细胞溶胶葡萄糖衍生的柠檬酸盐产生组蛋白乙酰化所必需的乙酰CoA(在瘤形成过程中是非常重要的过程)的事实证明辅酶Q10诱导的ACL表达在影响癌细胞功能中的作用。通过细胞溶胶ACL从柠檬酸盐产生的乙酰CoA在细胞分裂过程中用作新脂质和胆固醇的生物合成的来源。因此，辅酶Q10诱导的ACL表达的变化改变正常细胞相对癌细胞的用于脂质和胆固醇的合成的乙酰CoA的可获得性。结果概述于下表34-37中。
表34：HDFa和MCF-7中的ATPCL
  组成   平均归一化的强度
  HDF-培养基   ～15000
  HDF-50-辅酶Q10   ～17500
  HDF-100-辅酶Q10   ～25000
  MCF-培养基   ～7500
  MCF-50-辅酶Q10   ～7500
  MCF-100-辅酶Q10   ～12500
表35：HASMC相对HepG2中的ATP柠檬酸裂解酶～kd条带
  量-组成   归一化的强度
  HAS5g48-培养基   24557
  HAS5g48-50-辅酶Q10   23341
  HAS5g48-100-辅酶Q10   25544
  HAS22G48-培养基   27014
  HAS22G48-50-辅酶Q10   21439
  HAS22G48-100-辅酶Q10   19491
  Hep5g48-培养基   28377
  Hep5g48-50-辅酶Q10   24106
  Hep5g48-100-辅酶Q10   22463
  Hep22G48-培养基   24262
  Hep22G48-50-辅酶Q10   31235
  Hep22G48-100-辅酶Q10   50588
表36：HASMC相对PACA2中的ATP柠檬酸酶～kd的条带
  量-组成   归一化的强度
  HAS5g48-培养基   11036
  HAS5g48-50-辅酶Q10   12056
  HAS5g48-100-辅酶Q10   15265
  HAS22G48-培养基   18270
  HAS22G48-50-辅酶Q10   15857
  HAS22G48-100-辅酶Q10   13892
  PACA5g48-培养基   11727
  PACA5g48-50-辅酶Q10   8027
  PACA5g48-100-辅酶Q10   4942
  PACA22G48-培养基   8541
  PACA22G48-50-辅酶Q 10   9537
  PACA22G48-100-辅酶Q10   14901
表37：以CTRL的％表示的HepG2和PACA2中的ATP柠檬酸裂解酶
  量-组成   归一化的强度
  PACA5g48-培养基   1.00
  PACA5g48-50-辅酶Q10   0.68
  PACA5g48-100-辅酶Q10   0.42
  PACA22G48-培养基   1.00
  PACA22G48-50-辅酶Q10   1.12
  PACA22G48-100-辅酶Q10   1.74
  Hep5g48-培养基   1.00
  Hep5g48-50-辅酶Q10   0.85
  Hep5g48-100-辅酶Q10   0.79
  Hep22G48-培养基   1.00
  Hep22G48-50-辅酶Q10   1.29
  Hep22G48-100-辅酶Q10   2.09
丙酮酸激酶M2(PKM2)
丙酮酸激酶是参与糖酵解途径的酶。其负责将磷酸从磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转移至二磷酸腺苷(ADP)的转移，以产生ATP和丙酮酸盐。PKM2是糖酵解性丙酮酸激酶的同工酶，其表达的特征在于组织的代谢功能，即M2同工酶在正常快速增殖的具有高能量需要的细胞例如胚胎细胞中表达并且也在少数正常的已分化组织(所述组织需要高速率的核酸合成)例如肺和胰岛细胞中表达。PKM2因肿瘤对糖酵解途径的依赖(以满足细胞能量需要)而在肿瘤细胞中高度表达。通常被认为被限制于胚胎的PKM2的同工酶在癌细胞中重新表达。表达PKM2的细胞偏爱具有增加的乳酸盐产量和减少的氧化磷酸化的更强的有氧糖酵解表型(显示代谢表型的转变)。因此，癌细胞中PKM2表达的减少可转变或下调通过糖酵解途径进行的能量产生，在癌症的治疗中是有用的策略。数据显示正常和癌细胞中PKM2的可变表达模式，癌细胞相对于正常细胞显示更高的表达水平。利用辅酶Q10对细胞的处理改变了正常细胞和癌细胞中PKM2上条带和下条带水平的表达模式。在测试的癌细胞中，存在PKM2表达的剂量依赖性减少，并且未在正常细胞中观察到显著变化。这些结果概述于下表38-40中。
表38：HepG2中的丙酮酸激酶肌肉形式2上条带
Figure BPA00001497291601961
表39：HepG2中丙酮酸激酶肌肉形式2下条带(58KD)
  量-组成  归一化的体积(24  归一化的体积(48
  小时)  小时)
  5g-培养基   10483   310
  5g-50-辅酶Q10   11197   185
  5g-100-辅酶Q10   7642   122
  22G-培养基   9150   306
  22G-50-辅酶Q10   6302   344
  22G-100-辅酶Q10   6904   465
表40：处理后HASMC细胞中丙酮酸激酶肌肉形式2上条带
  量-组成   归一化的强度
  5g48-培养基   608
  5g48-50-辅酶Q10   811
  5g48-100-辅酶Q10   611
  22G48-培养基   516
  22G48-50-辅酶Q10   595
  22G48-100-辅酶Q10   496
  22G24-培养基   301
  22G24-50-辅酶Q10   477
  22G24-100-辅酶Q10   701
乳酸脱氢酶(LDH)
LDH是催化丙酮酸盐与乳酸盐的互变同时伴随NADH与NAD+的互变的酶。其具有在低细胞氧张力下将丙酮酸转化成乳酸盐以在牺牲线粒体氧化磷酸化的情况下产生还原当量和产生ATP的能力。癌细胞通常显示增加的LDH的表达以维持糖酵解流来产生ATP以及还原当量和还原线粒体氧化磷酸化酶系(OXPHOS)。因此，减少细胞中LDH的表达可使代谢从乳酸盐的产生转变成促进丙酮酸盐进入TCA循环。利用辅酶Q10的治疗减少癌细胞的乳酸脱氢酶(LDH)表达并且对正常细胞影响最小，从而支持辅酶Q10在通过使细胞质丙酮酸盐至乳酸的转化最小化而引发从糖酵解产生ATP的癌细胞生物能学至线粒体氧化磷酸化酶系来源的转变中的作用。结果概述于下表41-43中。
表41：HepG2中的乳酸脱氢酶
Figure BPA00001497291601981
表42：来自2个实验的以对照％表示的HepG2中的乳酸脱氢酶
Figure BPA00001497291601982
表43：PACA中的乳酸脱氢酶
  量-组成  归一化的体积(24  归一化的体积(48
  小时)  小时)
  5g-培养基   2122   2360
  5g-50-辅酶Q10   5068   2978
  5g-100-辅酶Q10   3675   2396
  22G-培养基   4499   2332
  22G-50-辅酶Q10   10218   2575
  22G-100-辅酶Q10   7158   3557
丙酮酸脱氢酶-B(PDH-E1)
丙酮酸脱氢酶β(PDH-E1)是作为将丙酸酸盐转化成乙酰CoA的丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)的部分的第一个酶成分。PDH-E1需要硫胺素作为其活性的辅因子，进行丙酮酸盐至乙酰CoA的转化以进入线粒体的TCA循环所必需的PDC复合物中的前两个生物化学反应。因此，癌细胞中PKM2和LDH表达的同时减少连同PDH-E1表达的增加可增加丙酮酸盐朝向促进线粒体氧化磷酸化酶系产生ATP的进入速率。所述数据显示对于正常和癌细胞系中PDH-E1的表达，该酶的基线表达在癌细胞中相对于正常细胞减少。利用辅酶Q10的处理与癌细胞中PDH-E1蛋白的表达的递增相关并且在正常细胞中变化最小。所述结果概述于下表44-46中。
表44：HepG2中的丙酮酸脱氢酶β
Figure BPA00001497291601991
表45：ACA2中的丙酮酸脱氢酶β
表46：处理后HASMC中的丙酮酸脱氢酶β
  量-组成   归一化的体积
  5g48-培养基   140
  5g48-50-辅酶Q10   147
  5g48-100-辅酶Q10   147
  22G48-培养基   174
22G48-50-辅酶Q 10 149
  22G48-100-辅酶Q10   123
  22G24-培养基   140
  22G24-50-辅酶Q10   145
  22G24-100-辅酶Q10   150
半胱天冬酶3
细胞凋亡起始的控制通常表现在起始因子半胱天冬酶、半胱天冬酶-2、-9和-8/10的水平。在细胞凋亡的外部途径中，半胱天冬酶-8，当被激活时，直接切割和激活执行者半胱天冬酶(例如半胱天冬酶-3)。活性半胱天冬酶-3切割并且激活其他半胱天冬酶(6、7和9)以及细胞中的相关靶(例如PARP和DFF)。在这些研究中，测量癌细胞系和正常细胞系中响应酶Q10的效应子半胱天冬酶-3蛋白的水平。应当指出，虽然细胞凋亡的控制通过起始因子半胱天冬酶来进行，但许多信号转导途径相反通过直接抑制效应子半胱天冬酶而中断细胞凋亡信号的传递。例如，P38MAPK磷酸化半胱天冬酶-3并且抑制其活性(Alvarado-Kristensson等人，2004)。有趣地，相同研究中蛋白磷酸酶(PP2A)或蛋白激酶Cδ(PKCδ)(Voss等人，2005)的激活可抵消38MAPK的效应，从而增加半胱天冬酶-3活化并且支持细胞凋亡信号的传递。因此，半胱天冬酶-3激活的水平上或半胱天冬酶3激活后的事件可在一些情况下决定细胞的最终命运。
半胱天冬酶-3是在细胞凋亡的执行阶段起中枢作用的半胱氨酸-天冬氨酸激酶。辅酶Q10处理增加癌细胞的半胱天冬酶3的水平。相反地，在正常细胞中，半胱天冬酶-3在正常细胞中的表达被适度减少。所述结果概述于下表47-49中。
表47：PACA2中的半胱天冬酶3
  量-组成   归一化的体积(24小时)   归一化的体积(48小时)
  5g-培养基   324   300
  5g-50-辅酶Q10   325   701
  5g-100-辅酶Q10   374   291
  22G-培养基   344   135
  22G-50-辅酶Q10   675   497
  22G-100-辅酶Q10   842   559
表48：来自2个实验的以对照％表示的HepG2细胞中的半胱天冬酶3
  量-组成   以对照％表示的归一化的体积
  5g24-培养基   1..00
  5g24-50-辅酶Q10   1.08
  5g24-100-辅酶Q10   1.76
  5g48-培养基   1.00
  5g48-50-辅酶Q10   1.44
  5g48-100-辅酶Q10   0.95
  22G24-培养基   1.00
  22G24-50-辅酶Q10   1.39
  22G24-100-辅酶Q10   1.78
  22G48-培养基   1.00
  22G48-50-辅酶Q10   1.50
  22G48-100-辅酶Q10   1.45
表49：处理后HASMC中的半胱天冬酶3
  量-组成   归一化的体积
  5g48-培养基   658
  5g48-50-辅酶Q10   766
  5g48-100-辅酶Q10   669
  22G48-培养基   846
  22G48-50-辅酶Q10   639
  22G48-100-辅酶Q10   624
  22G24-培养基   982
  22G24-50-辅酶Q10   835
  22G24-100-辅酶Q10   865
琥珀酸脱氢酶(SDH)
琥珀酸脱氢酶，也称为琥珀酸-辅酶Q还原酶，是参与TCA和电子传递链的线粒体内膜的复合物。在TCA中，该复合物催化琥珀酸至延胡索酸的氧化同时伴随泛醌至泛醇的还原。(Baysal等人，Science2000；和Tomlinson等人，Nature Genetics 2002)。发现SDH B、C和D亚基的种系突变为家族性副神经节瘤或平滑肌瘤的起始事件(Baysal等人，Science 2000)。
利用Western印迹分析表征用辅酶Q10处理的癌细胞的线粒体制剂中SDH亚基B的表达。所述结果表明辅酶Q10处理与细胞的线粒体中增加的SDH蛋白水平相关。这些结果表明辅酶Q10的作用机制之一是通过增加线粒体酶例如SDHB的水平来使细胞的代谢向TCA循环和线粒体转变。所述结合概述于下表50中。
表50：NCIE0808Mitopreps中的琥珀酸脱氢酶B
  组成-时间   平均归一化的体积
  培养基   531
  50uM辅酶Q10，3小时   634
  100uM辅酶Q10，3小时   964
  50uM辅酶Q10，6小时   1077
  100uM辅酶Q10，6小时   934
低氧诱导因子-1
低氧诱导因子(Hif)是由α和β亚基组成的转录因子。在常氧条件下，Hif1α的蛋白质水平因其通过一系列翻译后事件的连续降解而非常低。糖酵解与氧化磷酸化之间的转变通常被认为受两个酶PDH和LDH的相对活性控制，所述相对活性决定丙酮酸盐的代谢命运。Hif通过诱导LDH水平并且通过刺激PDK抑制PDH活性来控制该至关重要的歧点。由于这种使丙酮酸代谢从线粒体转向细胞溶胶的能力，Hif被认为是癌细胞中生物能量转换的至关重重的调节者。
利用辅酶Q10的处理减少了癌细胞的线粒体制剂的Hif1α蛋白水平。在正常细胞的全细胞裂解产物中，观察到Hif1的下条带，其也显示减少。所述结果概述于下表51-52中。
表51：处理后HASMC细胞中的Hif1α下条带
  量-组成   归一化的体积
  5g48-培养基   22244
  5g48-50-辅酶Q10   21664
  5g48-100-辅酶Q10   19540
  22G48-培养基   14752
  22G48-50-辅酶Q10   17496
  22G48-100-辅酶Q10   23111
  22G24-培养基   21073
  22G24-50-辅酶Q10   18486
  22G24-100-辅酶Q10   17919
表52：处理后HepG2的Hif1α上条带
  量-组成   归一化的体积
  5g24-培养基   12186
  5g24-50-辅酶Q10   8998
  5g24-100-辅酶Q10   9315
  5g48-培养基   8868
  5g48-50-辅酶Q10   8601
  5g48-100-辅酶Q10   10192
  22G24-培养基   11748
  22G24-50-辅酶Q10   14089
  22G24-100-辅酶Q10   8530
  22G48-培养基   8695
  22G48-50-辅酶Q10   9416
  22G48-100-辅酶Q10   5608
实施例22用CoQ10处理的正常和癌细胞中耗氧率(OCR)和细胞外酸化(ECAR)的分析
本实施例显示在应激因子(例如，高血糖症、低氧、乳酸)不存在和/或存在的情况下细胞对于利用本发明的代表性MIM/表观代谢转变剂-CoQ10的处理的暴露与朝向代表在正常生理条件下在正常细胞中观察到的值的糖酵解/乳酸盐生物合成和线粒体氧化磷酸化(如通过ECAR和OCR值测量的)的转变相关。
本申请人已在先前的部分中显示：癌细胞中利用CoQ10的处理与增强线粒体氧化磷酸化(同时伴随糖酵解和乳酸盐生物合成的减少)的特定蛋白质的表达的变化相关。该实例显示线粒体氧化磷酸化的直接量度可通过使用SeaHorse XF分析仪(在体外实验模型中测量溶解氧和细胞外pH水平的仪器)测量细胞系的耗氧率(OCR)来获得。(SeaHorse Biosciences Inc，North Billerica，MA).
细胞外微环境的pH在肿瘤中相比于细胞内(细胞质)pH和周围正常组织呈相对酸性。肿瘤的该特征起着多个目的，包括侵入细胞外基质(ECM)的能力、肿瘤转移的标志属性，所述属性随后启动信号转导级联，所述级联进一步调节：
●肿瘤血管生成
●增加的控制细胞周期周转的阻滞机制的激活
●促进抗免疫监视的细胞逃脱系统的免疫调节机制
●增加对糖酵解流和乳酸盐利用的依赖性的代谢控制元件
●用于增加致癌性的至关重要的细胞凋亡基因家族例如Bcl-2、IAP、EndoG、AIF的失调
然而不希望受任何特定理论束缚，肿瘤的外部微环境的酸性pH是从肿瘤细胞挤出的氢离子浓度(因来自改变的糖酵解表型的增加的乳酸盐产生而导致)的增加的结果。
在本实验中，在CoQ10存在和不存在的情况下获得正常细胞系的OCR和细胞外酸化率(ECAR)以测定基线值。观察到在其天然营养环境，正常细胞系的基线OCR率不同，并且通常为细胞在体内的生理作用的函数。
例如，使用非癌细胞系HDFa进行一组实验，所述非癌细胞系是成年人真皮成纤维细胞细胞系。成纤维细胞是主要合成和分泌形成组织的结构构架(基质(stroma))的细胞外基质(ECM)成分和胶原的细胞。此外，已知成纤维细胞用作许多功能例如伤口愈合和局部免疫调节的组织代表(ambassador)。在正常生理条件下，使用糖酵解和氧化磷酸化的组合满足正常成纤维细胞的能量需要-糖酵解提供ECM的合成所必需的营养物。
与HDFa相反，HASMC(人主动脉平滑肌细胞)发现于动脉、静脉、淋巴管、胃肠道、呼吸道、膀胱和具有经历受调控的兴奋-收缩偶联的其他组织中。平滑肌例如HASMC细胞经历收缩的能力需要由ATP提供的能量。这些组织从其中可从线粒体提供ATP的低能模式转换至其中通过转换至糖酵解以快速产生ATP来提供能量的高能模式(在运动/应激过程中)。因此，正常平滑肌细胞可使用线粒体OXPHOS和糖酵解的组合来满足它们在正常生理环境下的能量需要。
在使用SeaHorse XF分析仪在这些这些细胞系中测量的其余OCR值中观察到它们各自的生理作用(即，HDFa和HASMC)的差异。下面的图29和30描述了在生理上正常的葡萄糖(约4.6mM)和高葡萄糖(血糖过多的)条件下生长的HDFa和HASMC细胞的OCR。
在5.5mM葡萄糖存在的情况下，在正常氧可用度下在任何处理不存在的情况下HDFa的基线OCR值为约40皮摩尔/分钟(图29)。当将细胞维持在22mM葡萄糖上时，该值略微升高。相反地，在HASMC细胞中，5.5mM葡萄糖上的OCR值为约90皮摩尔/分钟，然而在22mM葡萄糖上，OCR值下降至约40皮摩尔/分钟。因此，在血糖过多的条件下，HDFa与HASMC之间存在差异反应，这进一步证明它们各自的生理组成和功能的固有差异。
细胞中利用CoQ10的处理与代表在正常(5mM)葡萄糖条件下观察到的条件的OCR的变化相关。在低氧张力存在的情况下，生理反应的复杂性变得更复杂。因此，CoQ10暴露与正常细胞中朝向对于特定细胞是天然的生理状态的OCR率的变化相关。
下表53描述了在5.5mM和22mM的葡萄糖上，在常氧和低氧条件下，在CoQ10存在或不存在的情况下HDFa细胞的ECAR值(mpH/分钟)。可观察到在正常细胞中，利用CoQ10的处理对ECAR值具有最小的影响，即使其影响这些细胞的OCR。在高葡萄糖低氧条件下，利用CoQ10的处理与升高的ECAR至在未处理的常氧条件下观察到的值的下降相关。
表53：在5.5mM和22mM的葡萄糖上，在常氧和低氧条件下，在CoQ10存在或不存在的情况下HDFa细胞的ECAR值
Figure BPA00001497291602071
在表54中，HASMC中测量的基线ECAR值(mpH/分钟)比HDFa的基线ECAR值高。低氧条件的诱导引起最可能与继发于增加的糖酵解的细胞内低氧诱导的酸中毒相关的ECAR的增加。
表54：在5.5mM和22mM的葡萄糖上，在常氧和低氧条件下，在CoQ10存在或不存在的情况下HASMC细胞的ECAR值
Figure BPA00001497291602072
Figure BPA00001497291602081
观察到利用CoQ10的处理与低氧条件下血糖过多的HASMC细胞的ECAR率朝向可在常氧正常葡萄糖条件下观察到的值的下降趋势相关。这些数据显示对于特定类型的细胞的生理作用是固有的生理变量的存在，当用CoQ10处理时，观察到的异常条件(例如，高血糖症)的改变向正常转变。
相反地，癌细胞(例如，MCF-7、PaCa-2)因它们在培养中维持的糖酵解表型而相对于正常细胞固有地倾向于在更高水平的葡萄糖下培养。利用CoQ10的处理引起OCR值的一致减少(图31和图32)。
CoQ10对MCF-7和PaCa-2细胞的OCR值的效应与CoQ10对正常HDFa和HASMC细胞的效应相似，其中可变反应暗示着基于癌细胞系的个别代谢特征谱的治疗反应。
表55：在5.5mM和22mM的葡萄糖上，在常氧和低氧条件下，在CoQ10存在或不存在的情况下PaCa-2细胞的ECAR值
表55描述了PaCa-2细胞的ECAR值。与正常细胞相反，癌细胞在表型上倾向于使用高葡萄糖进行ATP产生(增强的糖酵解)，从而导致21mpH/分钟的更高的ECAR(表55，未处理的常氧17mM的ECAR)。利用CoQ10的处理在这些条件下产生ECAR率的显著减少，最可能地与糖酵解产生的乳酸的减少关联。这些细胞中OCR的相关减少可能与增加的线粒体氧化磷酸化酶系的功效相关。
在许多其他正常和癌细胞系中测定OCR和ECAR值的相似比较(数据未显示)，所述细胞系包括：HAEC(正常人主动脉内皮细胞)、MCF-7(乳腺癌)、HepG2(肝癌)和高度转移性PC-3(前列腺癌)细胞系。在所有测试的细胞系中，在应激因子(例如，高血糖症、低氧、乳酸)不存在和/或存在的情况下对CoQ10的暴露与代表在正常生理条件下正常细胞中观察到的值的OCR和ECAR值的转变相关。因此，CoQ10在癌症治疗中的总体效应(包括细胞死亡)是其与细胞生物能学从糖酵解至线粒体氧化磷酸化酶系的转变协作的对蛋白质组学、基因组学、代谢组学结果的整体影响的下游效应。
实施例23用于CoQ10的生物合成的结构单元分子
本实验显示用于CoQ10生物合成的某些前体，例如用于苯醌环的生物合成的某些前体和用于类异戊二烯重复的生物合成以及用于它们与苯醌环(“结构单元成分”)的连接的某些前体，可被单独地或组合地施用至靶细胞，并且导致细胞凋亡抑制剂Bcl-2的下调和/或细胞凋亡促进剂半胱天冬酶-3的上调。某些前体或其组合还可抑制细胞增殖。数据显示此类CoQ10前体可用于取代CoQ10来获得与CoQ10施用基本上相同的结果。
用于本实验的某些示例性实验条件列于下面。
将Skmel-28黑素瘤细胞培养在补充有5％胎牛血清(FBS)和1X终浓度的抗生素的DMEM/F12中。将细胞培养至85％汇合，用结构单元成分处理3、6、12和24小时。随后将细胞沉淀，进行Western印迹分析。
测试结构单元成分包括L-苯丙氨酸、DL-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-酪氨酸、D L-酪氨酸、D-酪氨酸、4-羟基-苯丙酮酸酯、乙酸苯酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯(香草扁桃酸酯或VMA)、香草酸、4-羟基-苯甲酸酯、吡哆素、泛醇、甲羟戊酸、乙酰甘氨酸、乙酰-CoA、法呢基和2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌。
在Western印迹分析中，将细胞沉淀在冷PBS中，裂解，使用BCA蛋白质测定定量蛋白质水平。将全细胞裂解物加载入4％上样12％电泳Tris-HCl凝胶。随后将蛋白质转移至硝酸纤维素纸，然后用5％牛奶Tris-缓冲液封闭1小时。随后将蛋白质暴露于一抗(Bcl-2和半胱天冬酶-3)，进行过夜。随后将硝酸纤维素纸暴露于Pico化学发光剂进行5分钟，记录蛋白质表达。在暴露后，使用相同的方法定量肌动蛋白。通过使用ImageJ，定量蛋白质表达的水平。使用t检验分析统计学显著性。
所述实验的举例说明性结果概述于下在面。
结构单元成分L-苯丙氨酸的Western印迹分析：在进行醌环结构的合成途径之前，将L-苯丙氨酸转化成酪氨酸。进行western印迹分析以定量黑素瘤细胞中细胞凋亡蛋白质的表达的任何变化。测试的浓度为5μm、25μm和100μm。最初研究将L-苯丙氨酸加入DMEM/F12培养基，所述培养基包含0.4M的浓度的苯丙氨酸。对于5μm、25μm和100μm，培养基中L-苯丙氨酸的终浓度分别为0.405M、0.425M和0.500M。对Skmel-28细胞测试这些终浓度，进行3、6、12和24小时的温育期。在加入处理培养基之前将细胞培养至80％的汇合，如上所述使用印迹分析法收获细胞。在3小时和12小时温育后对于100μmL-苯丙氨酸观察到Bcl-2的统计上显著的增加。对于5μm L-苯丙氨酸，在6小时的温育后观察到Bcl-2的统计上显著的减少。对于25μm L-苯丙氨酸，在12小时的温育后观察到Bcl-2的统计上显著的减少和半胱天冬酶-3的统计上显著的增加。Bcl-2的统计让显著的减少表示细胞凋亡潜能的变化并且半胱天冬酶-3的统计上显著的增加确认细胞正在经历细胞凋亡。与对照相比较，总是存在Bcl-2减少的趋势，即使由于样本容量和标准偏差的原因，这些时间点在本实验中不是统计上显著的。
结构单元成分D-苯丙氨酸的Western印迹分析：测试D-苯丙氨酸(生物活性L-苯丙氨酸的化学合成形式)以与L-苯丙氨酸比较。对于全部3个浓度(5μm、25μm和100μm)的D-苯丙氨酸，在6小时的温育后Bcl-2表达显著减少。此外对于5μm和25μm，在3小时的温育存在显著的减少。对于5μM和100μm浓度，在6小时的温育后观察到半胱天冬酶-3表达的显著增加。
结构单元成分DL-苯丙氨酸的Western印迹分析：也测试DL-苯丙氨酸以与L-苯丙氨酸比较。再次地，对Skmel-28细胞测试5μm、25μm和100μm的浓度。温育期为3、6、12和24小时。在3小时的温育后观察到半胱天冬酶-3的统计上显著的增加。在24小时的温育后观察到Bcl-2的统计上显著的减少。虽然在所有其他浓度和温育时间点上存在不断减少的Bcl-2和不断增加的半胱天冬酶-3趋势，但它们在本实验中不是统计上显著的。
结构单元成分L-酪氨酸的Western印迹分析：L-酪氨酸是用于合成CoQ10的醌环结构的结构单元成分。L-酪氨酸的初步测试不导致高至足以进行western印迹分析的蛋白质浓度。根据本研究，对于Western印迹分析测试25μm以下的浓度。所使用的DMEM/F12培养基包含0.398467M的浓度的L-酪氨酸二钠盐。使初始浓度增加500nm、5μm和15μm。在12小时的温育后对于500nm浓度观察到半胱天冬酶-3的统计上显著的增加。对于5A也观察到半胱天冬酶-3的统计上显著的增加。在24小时的温育后对于5μm的浓度观察到Bcl-2的统计上显著的减少。在24小时的温育后对于500μm和5μm浓度观察到Bcl-2的统计上显著的减少。
结构单元成分D-酪氨酸的Western印迹分析：测试D-酪氨酸(L-酪氨酸的合成形式)以与L-酪氨酸对melanonal细胞的细胞凋亡效应相比较。基于利用L-酪氨酸的初步研究，选择低于25μm的浓度进行western印迹分析。测试的浓度为1μm、5μm和15μm。对于12和24小时的时间段，对于5μm和15μm浓度，D-酪氨酸显示Bcl-2表达的减少。对于3、12和24小时的时间段，对于5μm的浓度，半胱天冬酶-3显著增加。对于12和24小时的时间段，对于1μm也存在半胱天冬酶-3表达的增加。此外，对于12小时的时间段，对于5μm存在半胱天冬酶-3表达的增加。
结构单元成分DL-酪氨酸的Western印迹分析：也测试D L-酪氨酸(L-酪氨酸的合成形式)以与L-酪氨酸对细胞的细胞凋亡效应相比较。在12小时温育后在1μm和15μm浓度上和在24小时的温育后对于5μm看到Bcl-2表达的统计上的减少。在12小时的温育后对于5μm和15μm也观察到半胱天冬酶-3表达的增加。
结构单元成分4-羟基-苯丙酮酸的Western印迹分析：4-羟基-苯丙酮酸来源于酪氨酸和苯丙氨酸并且可在环结构的合成中起着重要作用。对于Bcl-2和半胱天冬酶-3表达测试1μm、5μm和15μm的浓度。对于5μm和15μm浓度，在24小时的温育后存在Bcl-2表达的显著减少以及在12小时的温育后存在半胱天冬酶-3表达的显著增加。
结构单元成分乙酸苯酯的Western印迹分析：乙酸苯酯具有被转化成4-羟基-苯甲酸酯的潜能，其在侧链至环结构的连接中起着重要作用。测试的浓度为1μm、5μm和15μm。对于乙酸苯酯，在12小时和24小时的温育后，对于5μm和15μm的浓度存在Bcl-2表达的减少。在12小时和24小时的温育后对于5μm和15μm的浓度观察到半胱天冬酶-3表达的增加。
结构单元成分3-甲氧基-4-羟基扁桃酸酯(香草扁桃酸酯或VMA)的Western印迹分析：VMA是用于CoQ10醌环结构的合成的另外成分。测试的浓度为100nm、250nm、500nm、1μm、25μm、50μm和100μm。虽然在本实验中未观察到统计上显著的细胞凋亡效应，但数据显示Bcl-2表达的下调趋势。
结构单元成分香草酸的Western印迹分析：香草酸是用于醌环的合成的前体并且在500nm、5μm和15μm的浓度上对其进行测试。Western印迹分析测量Bcl-2和半胱天冬酶-3的表达。已显示对于500nm和5μm的浓度，在24小时的温育时间点上香草酸显著减少Bcl-2的表达。对于15μm的浓度，在3小时的温育后，存在Bcl-2表达的减少。对于用15μm温育24小时的细胞，半胱天冬酶-3的表达存在显著的增加。
结构单元成分4-羟基苯甲酸酯的Western印迹分析：4-羟基苯甲酸在类异戊二烯侧链至环结构的连接中起着重要作用。测试的浓度为500nm、1μm和50μm。在24小时的温育后对于15μm的浓度存在Bcl-2浓度的显著减少。
结构单元成分4-吡哆素的Western印迹分析：吡哆素是用于CoQ10的醌环结构的合成的另一种前体结构单元。对于该化合物的测试的浓度为5μM、25μM和100μm。测定细胞的Bcl-2和半胱天冬酶-3的水平。吡哆素显示在24小时的温育后黑素瘤细胞中Bcl-2的显著减少。
结构单元成分泛醇的Western印迹分析：泛醇在CoQ10的醌环结构的合成起着重要作用。对黑素瘤细胞测试的浓度为5μm、25μm和100μm。对于25μm的浓度，该化合物显示Bcl-2表达的显著减少。
结构单元成分甲羟戊酸的Western印迹分析：甲羟戊酸是用于CoQ10的合成的主要成分之一。在500nm、1μm、25μm和50μm的浓度上测试该化合物。在本实验中不存在Bcl-2表达的显著减少或半胱天冬酶-3表达的显著增加。
结构单元成分乙酰甘氨酸的Western印迹分析：用于CoQ10的合成的另一个途径是类异戊二烯(侧链)合成。乙酰甘氨酸的添加将辅酶A转化成乙酰CoA，所述乙酰CoA进入甲羟戊酸途径以进行类异戊二烯的合成。测试的浓度为5μm、25μm和100μm。在12小时的温育后对于5μm和25μm的浓度，乙酰甘氨酸的测试显示Bcl-2表达的显著减少。在24小时的温育时间点上记录对于100μm浓度的Bcl-2的显著减少。
结构单元成分乙酰-CoA的Western印迹分析：乙酰-CoA是用于CoQ10的合成的甲羟戊酸途径的前体。测试的浓度为500nm、1μm、25μm和50μm。对于测试的时间点和浓度未观察到Bcl-2的显著减少或半胱天冬酶-3表达的显著增加。
与法呢基组合的结构单元成分L-酪氨酸的Western印迹分析：L-酪氨酸是用于CoQ10醌环结构的合成的前体之一。先前的实验测试L-酪氨酸在具有L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的介质中的反应。在本研究中，在不添加L-丙氨基酸和L-酪氨酸的介质中检查L-酪氨酸。在本研究中，测试的L-酪氨酸的终浓度为500nm、5μm和15μm。以50μm的浓度测试法呢基。对于3和6小时的时间点未观察到显著的反应。
结构单元成分与法呢基组合的L-苯丙氨酸的Western印迹分析：在不含L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的介质中检查与法呢基组合的L-苯丙氨酸，一种用于醌环结构的合成的前体。进行western印迹分析以测定Bcl-2和半胱天冬酶-3的表达。L-苯丙氨酸的终浓度为：5μm、25μm和100μm。以50μm的浓度加入法呢基。本研究显示对于大多数测试的浓度和组合Bcl-2表达减少，如下表中所描述的。
Figure BPA00001497291602141
Figure BPA00001497291602151
4-羟基-苯甲酸酯与苯醌的组合的细胞增殖测定：本组实验使用细胞增殖测定法评估组合不同结构单元分子对细胞增殖的效应。
第一研究检查组合4-羟基-苯甲酸酯与苯醌的效应。将细胞温育48小时，之后对活细胞进行细胞计数。将每一个测试组与对照相比较，并且将每一个组合组与苯醌对照相比较。针对苯醌的添加统计分析化合物。下表概述了细胞计数结果，其中X标记表示细胞数目的统计上的减少。
Figure BPA00001497291602152
Figure BPA00001497291602161
对于用4-羟基苯甲酸酯和苯醌以及组合温育的细胞存在细胞数目的显著减少。对于与70μm苯醌组合的50μm 4-羟基苯甲酸酯的组合，存在相对于苯醌对照的细胞数目的显著减少。这表明对于该摩尔比的协同效应。
进行另外的研究，测试另外的摩尔比。对于第一测试，在500nm、1μm和50μm的浓度上测试4-羟基苯甲酸酯。测试与2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌(Benzo)组合的这些浓度。测试的Benzo的浓度为25μm、50μm和100μm。将黑素瘤细胞培养至80％汇合，以40K个细胞/孔的浓度接种在6孔板中。用CoQ10、4-羟基苯甲酸酯、Benzo以及4-羟基苯甲酸酯/Benzo的组合处理细胞。
进行T-检验，以p＜0.05作为统计上显著的。X表示细胞数目的统计上的减少。
  对照vs Benzo 25μm   X
  对照vs Benzo(B)50μm
  对照vs Benzo(B)100uM   X
  对照vs 4-羟基苯甲酸酯(HB)500nm   X
  对照vs HB 1μm   X
  对照vs HB 50μm   X
  500nm HB vs 500nm HB w/25B   X
  500nm HB vs 500nm HBw/50B   X
  500nm HB vs 500nm HB w/100B   X
  1uM HB vs 1μm HB w/25B   X
  1uM HB vs 1μm HB w/50B   X
  1uM HB vs 1μm HBw/100B
  50uM HB vs 50μm HBw/25B   X
  50uM HB vs 50μm HB w/50B   X
  50uM HB vs 50μm HBw/100B
  500nm HBw/25B vs 25B   X
  500nm HBw/50B vs 50B   X
  500nmHB w/100B vs 100B   X
  1μm HB w/25B vs 25B   X
  1μm HB w/50B vs 50B   X
  1μm HBw/100B vs 100B
  50μm HBw/25B vs 25B   X
  50μm HB w/50B vs 50B   X
  50μmHB w/100B vs 100B
对于含有HB的处理培养基存在细胞增殖的显著增加。此外，HB与苯醌的组合显示与用相应的苯苯醌浓度温育的细胞相比较细胞数目的显著减少。
还对新生成纤维细胞进行细胞增殖测定。测试的HB的浓度为500nm、5μm和25μm。还在25μm、50μm和100μm上测试HB与苯醌的组合。以40k个细胞/孔接种黑素瘤细胞，将其处理24小时。利用胰蛋白酶处理细胞，使用库耳特计数器进行定量。
统计分析未显示成纤维细胞的显著减少。这显示在正常细胞中具有最低毒性至无毒性。
乙酸苯酯和苯醌的组合的细胞增殖测定：乙酸苯酯是4-羟基苯甲酸的合成的前体(促进环结构的接合)。进行细胞增殖测定以测定温育与CoQ10和苯醌组合的乙酸苯酯的效应。
  对照和25/25μm Ben   X
  对照和25/50μm Ben   X
  对照和25/100μm Ben   X
  对照和25/25μm Q-10   X
  对照和25/25μm Q-10   X
  对照和25/50μm Q-10   X
  对照和25/100μm Q-10   X
  对照和Ben 25   X
  对照和Ben 50   X
  对照和Ben 100   X
  对照和Q-1025
  对照和Q-1050
  对照和Q-10100   X
  Ben 25μm和500nm/25μm Ben   X
  Ben 25μm和5nm/25μm Ben   X
  Ben 25μm和25nm/25μm Ben   X
  Ben 50μm和500nm/50μm Ben   X
  Ben 50μm和5nm/50μm Ben   X
  Ben 50μm和25nm/50μm Ben   X
  Ben 100μm和500nm/100μm Ben
  Ben 100μm和5nm/100μm Ben
  Ben 100μm和25nm/100μmBen
  Q-10 25μm和500nm/25μm Q-10   X
  Q-10 25μm和5nm/25μm Q-10   X
  Q-10 25μm和25nm/25μm Q-10   X
  Q-10 50μm和500nm/50μm Q-10   X
  Q-10 50μm和5nm/50μm Q-10   X
  Q-10 50μm和25nm/50μm Q-10   X
  Q-10 100μm和500nm/100μm Q-10   X
  Q-10 100μm和5nm/100μm Q-10   X
  Q-10 100μm和25nm/100μm Q-10   X
数据显示乙酸苯酯与苯醌的组合的添加显著减少细胞增殖。与CoQ10和乙酸苯酯的组合与单独利用CoQ10和苯醌的温育相比较显著减少细胞数目。
4-羟基-苯甲酸酯与法呢基的组合的细胞增殖测定：将4-羟基-苯甲酸酯与法呢基组合温育。结果的概述列于下面。将4-羟基苯甲酸酯组与对照和法呢基对照组相比较。X表示细胞数目的统计上的减少。
Figure BPA00001497291602191
L-苯丙氨酸与苯醌的组合的细胞增殖测定：进行细胞增殖测定以测试与苯醌组合的L-苯丙氨酸的组合。下面是L-苯丙氨酸相对于对照和苯醌对照的结果的概述。X表示统计上的减少。
Figure BPA00001497291602201
对于与苯醌组合的L-苯丙氨酸看到相似的协同作用。
L-苯丙氨酸与法呢基的组合的细胞增殖测定：与法呢基组合温育的L-苯丙氨酸的组合细胞增殖研究的初步结果。将L-苯丙氨酸与对照和法呢基对照组相比较。X表示细胞数目的统计上的减少。
Figure BPA00001497291602202
Figure BPA00001497291602211
L-酪氨酸与苯醌的组合的细胞增殖测定：将L-酪氨酸与苯醌组合温育，之后进行细胞计数。将所述组合与对照组和苯醌对照组相比较。
Figure BPA00001497291602212
苯醌的添加不增强L-酪氨酸对细胞数目的影响。
L-酪氨酸与苯醌的组合的细胞增殖测定：本研究检查L-酪氨酸与法呢基的组合。将所述组与对照和法呢基对照组相比较。
Figure BPA00001497291602221
组合L-酪氨酸与法呢基在本实验中似乎对减少细胞的数目不具有协同效应。
将CoQ10的合成分成两个主要部分，所述部分由环结构的合成和侧链结构的合成组成。此处，致癌细胞补充有作为用于侧链和环结构成分的合成的前体的化合物。我们的结果将所述研究聚焦至参与环结构的合成的3种主要成分和在环结构至侧链结构的连接中起着重要作用的2种化合物。已显示Bcl-2的显著减少和半胱天冬酶-3表达的显著增加的3种化合物为：1)L-苯丙氨酸、2)L-酪氨酸和3)4-羟基苯丙酮酸酯。牵涉侧链至环结构的连接的2种化合物为：1)4-羟基苯甲酸盐和2)乙酸苯酯。
我们的结果还显示与2，3-二甲氧基-5-甲基-对-苯醌(苯醌)组合的这些化合物的外源递送显著抑制细胞增殖。这表明给环结构补充用于将侧链连接至苯醌环的化合物可补足受损的CoQ10合成机制。这也可有助于稳定分子以维持细胞过程所需的功能性质。乙酸苯酯是4-羟基苯甲酸酯的合成的前体，将其与苯醌组合外源递送在致癌细胞中具有相似效应。
等同方案：
本领域技术人员将承认，或能够确定通过只使用常规实验，许多方面等同于本文中描述的特定实施方案和方法。此类等同物旨在包括在下列权利要求的范围内。

Claims (65)

1.一种评估受试者是否患有肿瘤障碍的方法，所述方法包括：
(1)测定存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志；和
(2)将存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，
其中在获自受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是所述受试者患有肿瘤障碍的指征，从而评估所述受试者是否患有肿瘤阻碍。
2.一种评估受试者是否患有肿瘤障碍的方法，所述方法包括：
(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志的表达在肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；和
(2)将存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，
其中在获自所述受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是所述受试者患有肿瘤障碍的指征，从而评估所述受试者是否患有肿瘤阻碍。
3.一种预后受试者是否易发生肿瘤障碍的方法，所述方法包括：
(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和5-29中所列的标志；和
(2)将存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，
其中在获自所述受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是所述受试者易发生肿瘤障碍的指征，从而预后所述受试者是否易发生肿瘤阻碍。
4.一种预后受试者是否易发生肿瘤障碍的方法，所述方法包括：
(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志的表达在肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；和
(2)将存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，
其中在获自所述受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是所述受试者易发生肿瘤障碍的指征，从而评预后述受试者是否易发生肿瘤阻碍。
5.一种预后受试者中肿瘤障碍的复发的方法，所述方法包括：
(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志；和
(2)将存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，
其中在获自所述受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是肿瘤障碍的复发的指征，从而预后所述受试者的肿瘤障碍的复发。
6.一种预后受试者中肿瘤障碍的复发的方法，所述方法包括：
(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志的表达在肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；和
(2)将存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，
其中在获自所述受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是肿瘤障碍的复发的指征，从而预后所述受试者的肿瘤阻碍的复发。
7.一种预后患有肿瘤障碍的受试者的存活的方法，所述方法包括：
(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志；和
(2)将存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，
其中在获自所述受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是所述受试者的存活的指征，从而预后患有肿瘤障碍的所述受试者的存活。
8.一种预后患有肿瘤障碍的受试者的存活的方法，所述方法包括：
(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志的表达在肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；和
(2)将存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，
其中在获自所述受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是所述受试者的存活的指征，从而预后所述患有肿瘤障碍的受试者的存活。
9.一种预后关于受试者的肿瘤障碍的侵袭性的方法，所述方法包括：
(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志；和
(2)将存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，
其中在获自所述受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节指示所述肿瘤障碍具有侵袭性，从而预后关于所述受试者的肿瘤阻碍的侵袭性。
10.一种预后关于受试者的肿瘤障碍的侵袭性的方法，所述方法包括：
(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志的表达在肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；和
(2)将存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的标志的表达水平相比较，
其中在获自所述受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节指示所述受肿瘤障碍具有侵袭性，从而预后关于所述受试者的肿瘤阻碍的侵袭性。
11.一种监测受试者的肿瘤障碍的进展的方法，所述方法包括：将存在于在给所述受试者施用至少一部分治疗方案之前获自所述受试者的第一样品中的标志的表达水平与存在于在施用至少一部分治疗方案后获自所述受试者的第二样品中的所述标志的表达水平相比较，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志，从而监测所述受试者的肿瘤障碍的进展。
12.一种监测受试者的肿瘤障碍的进展的方法，所述方法包括：将存在于在给所述受试者施用至少一部分治疗方案之前获自所述受试者的第一样品中的标志的表达水平与存在于在施用至少一部分治疗方案后获自所述受试者的第二样品中的所述标志的表达水平相比较，其中所述标志的表达在所述肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变，从而监测所述受试者的肿瘤障碍的进展。
13.一种用于评估疗法治疗受试者的肿瘤障碍的功效的方法，所述方法包括：将存在于在给所述受试者施用至少一部分治疗方案之前获自所述受试者的第一样品中的标志的表达水平与存在于在施用至少一部分治疗方案后获自所述受试者的第二样品中的所述标志的表达水平相比较，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志，其中所述第二样品中所述标志的表达水平相对于所述第一样品的调节是所述疗法对于治疗所述受试者的肿瘤障碍是有效的指征。
14.一种用于评估疗法治疗受试者的肿瘤障碍的功效的方法，所述方法包括：将存在于在给所述受试者施用至少一部分治疗方案之前获自所述受试者的第一样品中的标志的表达水平与存在于在施用至少一部分治疗方案后获自所述受试者的第二样品中的所述标志的表达水平相比较，其中所述标志的表达在肿瘤障碍的癌细胞中被调节，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变，其中第二样品中所述标志的表达水平相对于第一样品的调节是所述疗法对于治疗所述受试者的肿瘤障碍是有效的指征。
15.一种评估环境影响剂化合物治疗有此需要的受试者的肿瘤障碍的功效的化合物的方法，所述方法包括：
(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的一个或多个标志的表达水平，其中将所述生物样品暴露于环境影响剂化合物，并且其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的具有正倍数改变和/或具有负倍数改变的标志；
(2)测定存在于获自所述受试者的第二生物样品中的一个或多个标志的表达水平，其中不将所述样品暴露于环境影响剂化合物；和
(3)将暴露于环境影响剂化合物的生物样品中多个标志之一的表达水平与未暴露于环境影响剂化合物的生物样品中多个标志之一的表达水平相比较，
其中存在于暴露于环境影响剂化合物的生物样品中的具有负倍数改变的一个或多个标志的表达水平相对于存在于所述第二样品中的一个或多个标志的表达水平的降低是所述环境影响剂化合物对于治疗患有肿瘤障碍的受试者的肿瘤障碍是有效的指征，和
其中存在于暴露于环境影响剂化合物的生物样品中的具有正倍数改变的一个或多个标志的表达水平相对于存在于所述第二样品中的一个或多个标志的表达水平的升高是所述环境影响剂化合物对于治疗患有肿瘤障碍的受试者的肿瘤障碍是有效的指征，从而评估环境影响剂化合物用于治疗患有肿瘤障碍的所述受试者的肿瘤障碍的功效。
16.一种评估环境影响剂化合物治疗有此需要的受试者的肿瘤障碍的功效的化合物的方法，所述方法包括：
(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的一个或多个标志的表达水平，其中将所述生物样品暴露于环境影响剂化合物，并且其中所述标志的表达在所述肿瘤障碍的癌细胞中被上调或下调，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；
(2)测定存在于获自所述受试者中的第二生物样品中的一个或多个标志的表达水平，其中未将所述样品暴露于所述环境影响剂化合物；和
(3)将暴露于环境影响剂化合物的生物样品中多个标志之一的表达水平与未暴露于环境影响剂化合物的生物样品中多个标志之一的表达水平相比较，
其中在暴露于环境影响剂化合物的生物样品中一个或多个下调的标志的表达水平相对于存在于所述第二样品中的所述一个或多个标志的表达水平的降低是所述环境影响剂化合物对于治疗患有肿瘤障碍的所述受试者的肿瘤障碍是有效的指征，和
其中在暴露于环境影响剂化合物的生物样品中一个或多个上调的标志的表达水平相对于存在于所述第二样品中的所述一个或多个标志的表达水平的升高是所述环境影响剂化合物对于治疗患有肿瘤障碍的所述受试者的肿瘤障碍是有效的指征，
从而评估环境影响剂化合物用于治疗患有肿瘤障碍的受试者的肿瘤障碍的功效。
17.一种鉴定用于治疗受试者的肿瘤障碍的化合物的方法，所述方法包括：
(1)从所述受试者获得生物样品；
(2)将所述生物样品与测试化合物接触；
(3)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的一个或多个标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的具有正倍数改变和/或具有负倍数改变的标志；
(4)将所述生物样品中多个标志之一的表达水平与未接触所述测试化合物的对照样品相比较；和
(5)选择测试化合物，所述测试化合物降低存在于生物样品中的具有负倍数改变的一个或多个标志的表达水平和/或升高存在于所述生物样品中的具有正倍数改变的一个或多个标志的表达水平，
从而鉴定用于治疗受试者的肿瘤障碍的化合物。
18.一种鉴定用于治疗受试者的肿瘤障碍的化合物的方法，所述方法包括：
(1)从所述受试者获得生物样品；
(2)将所述生物样品与测试化合物接触；
(3)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的一个或多个标志的表达水平，其中所述标志的表达在所述肿瘤障碍的癌细胞中被上调或下调，所述癌细胞经诱导经历朝向在正常生理条件下在所述受试者的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变；
(4)将所述生物样品中多个标志之一的表达水平与未接触所述测试化合物的对照样品相比较；和
(5)选择测试化合物，所述测试化合物降低一个或多个下调的标志在生物样品中的表达水平，和/或升高一个或多个上调的标志在生物样品中的表达水平；
从而鉴定用于治疗受试者的肿瘤障碍的化合物。
19.权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述肿瘤障碍是选自：白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤的肿瘤障碍。
20.权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述标志选择性地在哺乳动物的癌细胞中引发朝向在正常生理条件下在所述哺乳动物的正常细胞中观察到的水平的从糖酵解至线粒体氧化磷酸化的细胞代谢能量转变。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述样品包含获自所述受试者的液体。
22.权利要求21所述的方法，其中所述液体选自血液液体、呕吐物、唾液、淋巴、膀胱液、尿、通过支气管灌洗收集的液体、通过腹膜漂洗收集的液体和妇科洗液。
23.权利要求22所述的方法，其中所述样品是血液样品或其成分。
24.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述样品包含获自所述受试者的组织或其成分。
25.权利要求24所述的方法，其中所述组织选自骨、结缔组织、软骨、肺、肝、肾、肌肉组织、心脏、胰腺和皮肤。
26.权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
27.权利要求1-26中任一项所述的方法，其中通过测定生物样品中转录的多核苷酸或其部分来测定所述样品中所述标志的表达水平。
28.权利要求27所述的方法，其中测定所述转录的多核苷酸包括扩增所述转录的多核苷酸。
29.权利要求1-26中任一项所述的方法，其中通过测定所述样品中蛋白质或其部分来测定所述受试者样品中标志的表达水平。
30.权利要求1-29中任一项所述的方法，其中使用特异性结合蛋白质的试剂测定所述蛋白质。
31.权利要求30所述的方法，其中所述试剂被标记。
32.权利要求30所述的方法，其中所述试剂选自抗体和抗原结合抗体片段。
33.权利要求1-32中任一项所述的方法，其中使用选自所述样品的聚合酶链式反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、单链构象多态性分析(SSCP)、错配剪切检测、异源双链分析、Southern印迹分析、Northern印迹分析、Western印迹分析、原位杂交、阵列分析、脱氧核糖核酸测序、限制性片段长度多态性分析和其组合或亚组合的技术测定所述样品中所述标志的表达水平。
34.权利要求1-32中任一项所述的方法，其中使用选自免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA和质谱的技术测定所述样品中所述标志的表达水平。
35.权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述标志是选自HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-对羟基苯甲酸酯、嗜中性粒细胞细胞溶胶因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C和Cam激酶II的标志。
36.权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述标志是与细胞凋亡相关的标志。
37.权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述标志是与氧化性应激相关的标志。
38.权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述标志是与热激相关的标志。
39.权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述标志是与血管生成相关的标志。
40.权利要求1-34中任一项所述的方法，其中测定多个标志的表达水平。
41.权利要求5-8、11和12中任一项所述的方法，其中用选自环境影响剂化合物、手术、辐照、激素疗法、抗体疗法、利用生长因子、细胞因子的疗法和化学疗法的疗法治疗所述受试者。
42.权利要求13-14或41中任一项所述的方法，其中所述疗法包括环境影响剂化合物。
43.权利要求42所述的方法，其中所述疗法还包括选自手术、辐照，激素疗法、抗体疗法、利用生长因子、细胞因子的疗法和化学疗法的治疗方案。
44.权利要求41或42所述的方法，其中所述环境影响剂化合物是多维细胞内分子(MIM)或表观代谢转变剂(epi-shifter)。
45.权利要求41或42所述的方法，其中所述环境影响剂化合物是CoQ-10。
46.权利要求41或42所述的方法，其中所述环境影响剂化合物是维生素D3。
47.权利要求41或42所述的方法，其中所述环境影响剂化合物是选自乙酰Co-A、棕榈酰基、L-左旋肉碱、酪氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和小分子。
48.权利要求41或42所述的方法，其中所述环境影响剂化合物是选自纤连蛋白、TNF-α、IL-5、IL-12、IL-23、血管生成因子和细胞凋亡因子。
49.一种用于评估受试者是否患有肿瘤障碍的试剂盒，所述试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于评估所述受试者是否患有肿瘤障碍的使用说明书。
50.一种用于预后受试者是否易发生肿瘤障碍的试剂盒，所述试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于预后所述受试者是否易发生肿瘤障碍的使用说明书。
51.一种用于预后受试者的肿瘤障碍的复发的试剂盒，所述试剂盒包括用于评估选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于预后所述肿瘤障碍的复发的使用说明书。
52.一种用于预后肿瘤障碍的复发的试剂盒，所述试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于预后所述肿瘤障碍的复发的使用说明书。
53.一种用于预后患有肿瘤障碍的受试者的存活的试剂盒，所述试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于预后患有所述肿瘤障碍的受试者的存活的使用说明书。
54.一种用于预后关于受试者的肿瘤障碍的侵袭性的试剂盒，所述试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于预后关于受试者的肿瘤障碍的侵袭性的使用说明书。
55.一种用于监测受试者的肿瘤障碍的进展的试剂盒，所述试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于预后受试者的肿瘤障碍的进展的使用说明书。
56.一种用于评估疗法治疗肿瘤障碍的功效的试剂盒，所述试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于评估疗法治疗肿瘤障碍的功效的使用说明书。
57.一种用于评估环境影响剂化合物治疗患有肿瘤障碍的受试者的肿瘤障碍的功效的试剂盒，所述试剂盒包括用于测定选自表2-4和6-29中所列的标志的至少一个标志的表达水平的试剂和所述试剂盒用于评估环境影响剂化合物治疗患有肿瘤障碍的受试者的肿瘤障碍的功效的的使用说明书。
58.权利要求49-57中任一项所述的试剂盒，其还包括用于从受试者获得生物样品的方法。
59.权利要求49-58中任一项所述的试剂盒，其还包括对照样品。
60.权利要求49-59中任一项所述的试剂盒，其中用于测定至少一个标志的表达水平的方法包括用于测定所述样品中转录的多核苷酸或其部分的方法。
61.权利要求49-59中任一项所述的试剂盒，其中用于测定至少一个标志的表达水平的方法包括用于测定所述样品中蛋白质或其部分的方法。
62.权利要求49-61中任一项所述的试剂盒，其还包括环境影响剂化合物。
63.权利要求49-62中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于测定多个标志的表达水平的试剂。
64.一种评估受试者是否患有CoQ10反应性状态的方法，所述方法包括：
(1)测定存在于获自所述受试者的生物样品中的标志的表达水平，其中所述标志选自表2-4和6-29中所列的标志；和
(2)将存在于获自受试者的生物样品中的标志的表达水平与存在于对照样品中的所述标志的表达水平相比较，
其中获自受试者的生物样品中所述标志的表达水平相对于对照样品中所述标志的表达水平的调节是受试者患有CoQ10反应性状态的指征，从而评估所述受试者是否患有CoQ10反应性状态。
65.权利要求64所述的方法，其中所述CoQ10反应性状态是肿瘤障碍。
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