KR101860294B1 - 외대사성 변환인자, 다차원적 세포내 분자, 또는 환경 요인을 사용한 종양적 장애의 진단 방법 - Google Patents

외대사성 변환인자, 다차원적 세포내 분자, 또는 환경 요인을 사용한 종양적 장애의 진단 방법 Download PDF

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Abstract

외대사성 변환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경 영향인자를 사용한 인간의 종양적 장애를 진단하기 위한 방법 및 제형이 기재되어 있다.

Description

외대사성 변환인자, 다차원적 세포내 분자, 또는 환경 요인을 사용한 종양적 장애의 진단 방법{METHOD FOR THE DIAGOSIS OF ONCOLOGICAL DISORDERS USING EPIMETABOLIC SHIFTERS, MULTIDIMENTIONAL INTRACELLULAR MOLECULES, OR ENVIRONMENTAL INFLUENCERS}
본 출원은 "외대사 변환인자(코엔자임 Q10)을 사용하여 종양성 장애를 치료하는 방법(Attorney docket no.: 117732-00601)"이란 명칭으로 2009년 5월 11일자에 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/177,241호, "외대사 변환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경 영향인자를 사용하여 종양성 장애를 치료하는 방법(Attorney docket no.: 117732-00701)"이란 명칭으로 2009년 5월 11일자에 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/177,243호, "외대사 변환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경 영향인자를 사용하여 종양성 장애를 진단하는 방법(Attorney docket no.: 117732-00801)"이란 명칭으로 2009년 5월 11일자에 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/177,244호, "외대사 변환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경 영향인자를 사용하여 대사성 장애를 치료하기 위한 방법(Attorney docket no.: 117732-00901)"이란 명칭으로 2009년 5월 11일자에 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/177,245호 및 "외대사 변환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경 영향인자를 사용하여 대사성 장애를 진단하기 위한 방법(Attorney docket no.: 117732-01001)"이란 명칭으로 2009년 5월 11일자에 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/177,246호에 대하여 우선권을 주장한다. 상기 출원 각각의 모든 내용은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
현재 암은 선진국에서 주요 사망원인 중 하나이고, 현대 사회에 심각한 위협요소이다. 암은 모든 나이에서 모든 기관의 모든 조직에서 발생할 수 있다. 전세계에서 천만 명 이상의 사람들이 매년 암으로 진단받고, 이러한 인구는 2020년까지 천오백만 명으로 증가할 것으로 예상된다. 암은 매년 육백만의 죽음을 야기하거나 전세계 사망원인의 12%를 차지한다고 알려져 있다.
암의 원인은 명확하게 이해되지 않았다. 암은 유전적 민감도, 염색체 절단 이상, 바이러스, 환경요소, 면역이상을 포함하여 다년간에 걸쳐 진행중인 연구의 많은 요소들과 관련되어있거나 연관이 있다. 암은 질병의 큰 범주를 망라한다. 암세포는 신체의 모든 기관 및/또는 조직의 대부분에서 발생할 수 있다. 암은 신체 일부 세포가 통제불능으로 성장하거나 분화하기 시작할 때 발생한다.
최근 연구들이 종양형성의 분자생물학적 기전에 대한 이해를 대단히 높였고 암의 치료를 위한 새롭고도 다양한 길을 제시해 왔으나, 대부분 종양에 대한 표준 치료요법은 여전히 절제술, 항암화학요법, 방사선요법이다. 치료법이 성공적일수록, 각 치료법들은 의도하지 않은 다양한 부작용을 야기할 수 있다. 예를 들어, 수술로 인해 통증, 건강한 조직에 대한 외상성 손상, 흉터가 생길 수 있다. 방사선 요법은 암세포를 사멸시킨다는 장점이 있지만 동시에 비-암성 세포에도 손상을 준다.
항암화학요법은 여러 항암제를 환자에게 주입하는 것을 포함한다. 이러한 표준 치료요법은 때때로 오심, 면역억제, 위궤양, 이차 종양형성과 같은 부작용을 수반한다.
몇 년 동안 많은 개인과 회사들은 방대한 암 치료법을 개선하기 위해 대규모 연구를 수행해왔다. 회사들은 암에 좀 더 효과적인 치료법을 제공하고자 하는 바람으로 저분자 화합물등의 화합물과 항체 등의 생물제제를 포함한 생리활성 물질을 개발해 왔다. 시험된 일부 생리활성 물질들은 효과가 있었고 일부 개인 또는 암종에서 유익한 치료효과를 보였고, 나머지는 시험 프로토콜에서 효과를 입증하지 못하거나 최소의 효과를 보였다. 현재까지 연구된 다른 생리활성 물질들은 기전이 명백하게 이해되지 않았다.
여기에서 CoQ10, Q10, 유비퀴논 또는 유비데카레논이라고도 칭해지는 코엔자임 Q10은 인기 있는 영양보조제이고, CoQ10의 환원형인 유비퀴놀의 항산화 특성을 통해 면역 체계를 보호하도록 도와주는 비타민 유사 보조식품으로 영양제품 전문점, 건강식품점, 약국 및 유사 상점에서 캡슐 형태로 찾을 수 있다. CoQ10은 잘 알려진 물질이고 여기에서 참고문헌으로 포함된 것의 전체 공개내용은 국제 공개번호 WO2005/069916에서 좀 더 자세하게 설명되었다.
CoQ10은 인체 대부분 조직과 기타 포유류의 조직에서 발견된다. 인체에서 CoQ10의 조직분포와 산화환원상태는 Bhagavan HN 등이 작성한 리뷰 아티클(종설)인 Coenzyme Q10: Absorption, tissue uptake, metabolism and pharmacokinetic, Free Radical Research 40(5), 445-453 (2006) (이하 Bhagavan, et al.이라 칭함)에서 검토되었다. 저자들은 "일반적으로 심장, 신장, 간, 근육 등 고에너지를 요하거나 대사활동이 있는 조직은 상대적으로 고농도의 CoQ10을 함유한다"라고 발표했다. 또한 저자들은 "[a]뇌와 폐를 제외하고는 조직에서 CoQ10이 환원형인 하이드로퀴논 또는 유비퀴놀로 대부분 존재하고" "이것은 뇌와 폐 조직에서 증가된 산화 스트레스가 반영되었음을 알 수 있다."고 발표했다. 특히, Bhagavan et al.은 심장, 신장, 간, 근육, 소장 및 혈액(혈장)에서 각각 75%, 95%, 65%, 95%, 96%의 CoQ10이 환원형이라고 발표했다. 이와 유사하게 Ruiz-Jiminez, et al., Determination of the ubiquinol-10 and ubi퀴논-10 (coenzyme Q10) in human serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry to evaluate the oxidative stress, J. Chroma A 1175(2), 242-248 (2007) (이하 Ruiz-Jiminez, et al.이라 칭함)는 인간 혈장의 Q10과 Q10 환원형(Q10H2)를 분석했을 때 분자의 대부분(90%)이 환원형이었다고 발표했다.
CoQ10은 상당히 지용성이고 보통 물에 녹지 않는다. 물에서의 불용해성과 지질에서의 제한된 용해성 그리고 상대적으로 큰 분자량 때문에 CoQ10의 경구 투여 흡수율은 낮다. Bhagavan, et al.은 "쥐에서 한 어떠한 실험에서, 경구 투여된 CoQ10의 2-3%만이 흡수되었다"고 밝혔다. Bhagavan, et al.은 또한 "쥐 실험에서의 데이터가 Co10이 소장에서 흡수 중 또는 그 후 유비퀴놀로 환원됨을 보여준다"고 밝혔다.
CoQ10은 수년간의 문헌에서 암과 연관 지어졌다. 문헌에서 보고된 연관성의 전체 예는 아니지만 대표적인 문헌들이 하기 나열되었다. Karl Folkers, et al., Survival of Cancer Patients on Therapy with Coenzyme Q10, Biochemical and Biophysical Research Communication 192, 241-245 (1993) (이하 "Folkers, et al."이라 칭함)은 "CoQ10으로 치료받는" 암환자와 그들의 "5-15년간" 생존에 대한 여덟 가지 사례를 설명했다. CoQ10은 처음 췌장암, 선암, 후두암, 유방암, 대장암, 폐암, 전립선암을 포함하여 서로 다른 암을 가진 여덟 명의 환자에게 투여되었다. Folkers, et al.은 "이러한 결과가 프로토콜이 체계적임을 정당화한다"고 발표했다. Lockwood, et al., Progress on Therapy of Breast Cancer with Vitamin Q10 and the Regression of Metastases, Biochemical and Biophysical Research Communication 212, 172-177 (1995) (이하 "Lockwood, et al."이라 칭함)은 "비타민 Q10 유방암 치료요법의 진전"에 대해 발표한 또 다른 리뷰 아티클이다. Lockwood, et al.은 "비암종 조직과 암조직에서 비타민 Q10의 다양한 수준을 밝힌 동물과 인간에 대한 35년간의 국제적 연구를 다루고 암이 있는 쥐에서 Q10 처리가 생존을 증가시킨다는 점에 기초하여 숙주방어 체계에 본질적인 비타민 Q10에 대한 데이터를 포함하는" Folkers, et al.을 인용했다.뿐만 아니라 Lockwood, et al.은 199명의 스웨덴과 미국의 암 환자에서 혈액 내 CoQ10의 수준을 밝히고 유방암의 경우 CoQ10이 다양하게 결핍되었음을 밝혀낸 연구를 바탕으로 "인간의 암을 비타민 Q10으로 치료하는 것에 대한 가능성이 1961년 명백해졌다"고 발표했다. 2002년 7월 9일 발행된 미국 특허번호 6.417.233 (이하 Sears, et al)은 코엔자임 Q10과 같은 지용성 벤조퀴논을 포함한 조성물의 사립체병증(mitochondriophathy)의 예방 및/또는 치료법에 대해 설명했다. Sears, et al.은 "CoQ10 치료법이 암환자에게 효과가 있다고 보고되었다."고 발표했다. (2단 30-31줄 참고)
본 출원의 출원일자에, 국립 암 연구소(NCI)는 "시험이 수행된 방식과 현재까지 보고된 정보의 양이 코엔자임 Q10이 치료적 유익을 야기하는지 아니면 다른 무언가 때문인지 불분명하게 했기" 때문에 제대로 디자인된 CoQ10으로 암 치료를 받는 환자들을 대규모 포함한 임상시험이 수행된 적이 없다고 밝혔다. www.cancer.gov/cancertopics/pdq/cam/coenzymeQ10/patient/allpages (2008년 9월 29일)에서 국림 암 연구소(NCI) 참고. 특히 NCI는 유방암 환자의 표준 치료요법에 보조치료로 CoQ10을 사용한 세 개의 소규모 시험에서 일부 환자가 그 치료법에 도움을 받았으나 "시험 디자인과 보도에서의 약점이 치료적 유익이 코엔자임 Q10때문인지 아니면 다른 무언가 때문인지 불분명하게 만들었다."고 말했다. NCI는 "세 개의 시험에 다음의 약점이 있었다: 시험이 무작위 배정되지 않았거나 대조군이 없었다; 환자들이 코엔자임 Q10외에 다른 보조제품을 사용했다; 코엔자임 Q10 치료 전 또는 그 중간에 환자들은 표준 치료요법을 받고 있었다; 시험의 모든 환자에 대한 세부사항이 보고되지 않았다"고 밝혔다. 또한 NCI는 "코엔자임 Q10이 췌장, 폐, 대장, 직장, 전립선에 암이 있는 환자를 포함하여 일부 암환자가 오래 살기를 도왔다는 일화성 기록"을 발표했으나 '이러한 보고서에 설명된 환자들은 코엔자임 Q10외에도 화학치료요법, 방사선 요법 및 수술을 포함한 다른 치료 역시 받았다.'라고 말했다.
2006년 2월 16일에 공개된 미국 특허 출원공개공보 2006/0035981 (이하 "Mazzio 2006"라 칭함)는 숙주와는 정반대의 에너지를 생산하기 위해 포도당의 비-산화성 인산화과정에 필요한 혐기성에 관련된 암의 취약성을 이용하는 구성요소를 이용하여 인간과 동물의 암을 치료하거나 억제하는 방법과 제조물을 설명하고 있다. Mazzio 2006의 제조법은 상승적으로 산화대사를 촉진 및/또는 유당 탈수소효소 또는 무산소성(혐기성) 당대사를 지연시키며 더 세부적으로는 "2,3-디메톡시-5-메칠-1,4-벤조퀴논(이하 "DBMQ"라 칭함)(quinoid base)"과 전체 하이드로퀴논, 유비크로메놀, 유비크로마놀 또는 합성/천연 유도체 및 유사체를 포함한 전체 유비퀴논군의 옵션을 포함하는 하나 또는 그 이상의 물질을 함유한다. Mazzio 2006의 단락 0010 참고. Mazzio 2006은 "항암 물질로서의 저급 유비퀴논(CoQ<3)과 2,3-디메톡시-5-메칠-1,4-벤조퀴논(DMBQ)이 항암물질로서 CoQ10에 비해 1,000배 이상 강력하다"고 밝혔다. Mazzio 2006 3쪽 0011단락 참고. 추가적으로 Mazzio 2006은 연구에서 "CoQ10이 기대한만큼 치명적이지 않았고" "암에 CoQ10을 사용한 이전 연구와 대조적이었다."라고 밝혔다. 본 설명을 뒷받침하는 인용목록에 대해 Mazzio 2006 3-4쪽 참고.
2007년 10월 25일에 발행된 미국 특허 공개번호 2007/0248693(이하 "Mazzio 2007"이라 칭함)에서 암을 치료하거나 예방하는 영양학적 조성물과 그것의 이용에 대해 설명했다. 또한, 본 공개된 특허 출원은 저급 유비퀴논을 집중적으로 다루고 있고 특히 CoQ10이 본 발명의 중요한 요소가 아님을 밝혔다. Mazzio 2007에 따르면 "CoQ10이 암세포에서 미토콘드리아 복합체 2 활성의 최대속도(Vmax)를 증가시킬 수 있는 반면에(Mazzio and Soliman, Biochem Pharmacol. 67:1167-84, 2004), CoQ10이 미토콘드리아 호흡 또는 복합체 4를 통한 O2 이용을 통제하지 않았다. 그리고 CoQ10은 기대한만큼 치사적이지 않았다. 마찬가지로, CoQ10의 항암효과는 모순적이었다." Mazzio 2007 5쪽 0019단락 참고.
본 출원인은 이전에 CoQ10 제형과 동물 대상 암 성장률을 감소시키기 위한 방법(Hsia et al ., 2005년 8월 4일 공개한 WO 2005/069916)을 기재하였었다. Hsia et al .에서 기재한 실험에서, CoQ10은 정상 세포가 아닌 표피 암 세포 배양에서 세포 사멸률을 증가시켰다. 게다가, CoQ10의 국소 제형으로의 암 투병 동물 치료는 동물의 암 성장률을 현저히 감소시켰다.
본 발명은 적어도 일부로서 인간 및/또는 세포내 CoQ10 역할의 더욱 완벽한 이해에 기반한다. 특히, 본 발명의 방법과 제형은, 적어도 일부로서 인간 임상 실험을 설계 및 시행하고/하거나 인간을 대상으로 CoQ10을 투여하고 이러한 실험 및/또는 치료 요법 동안 발생하는 놀랍고 기대치 않은 결과를 관찰함으로써 얻어지는 종양성 장애를 위한 CoQ10의 치료학적 활성에 대하여 습득된 지식에 기반한다. 또한, 본 발명의 방법과 제형은 적어도 일부로서, in vitro적으로 세포내 CoQ10 치료에 대한 광범위한 연구로부터 얻어지는 CoQ10의 치료학적 기전에 대한 통찰에 기반한다.
특별히, 적어도 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법과 제형은 적어도 일부로서, 세포에 대한 코엔자임 Q10(본 명세서에서, CoQ10 또는 Q10으로 지칭됨)의 적용이 정상 세포의 성장에는 효과가 없거나, 일부 긍정적인 효과를 주면서도 암 세포에는 세포 사멸적 반응의 선택적 유도를 초래한다는 놀라운 발견에 기반한다. 게다가, 적어도 하나의 추가적인 구체예에서는, 뜻밖에도 공격적인 암으로부터 유도되는 세포주가 비-공격적 암 또는 덜 공격적인 암으로부터 유도되는 세포주와 비교하여, CoQ10에 더 민감하다(예를 들어, 세포 독성 및/또는 세포 사멸 유도에 있어 더 낮은 CoQ10의 농도 및/또는 CoQ10의 치료 시간을 요구함)는 것을 알게 되었다. 미토콘드리아성 Q10 시간 및 복용 응답 수준이 관찰되었는데, 48시간 이후, 세포 미토콘드리아 내 Q10의 수준이 6배로 증가하였다. 적어도 하나의 구체예에서, 추가적으로 본 발명은 Q10이 공급된 산화 형태(pro-oxidant)로 유지되며 의미있는 양으로서 Q10H2의 환원된 형태로는 변환되지 않는다는 놀랍고도 기대치 않은 발견에 기반한다. 또 다른 구체예에서, 추가적으로 본 발명은 Q10의 산화 형태로 처리된 세포내에서 중요한 유전자 수의 발현이 조절된다는 발견에 여전히 기반한다. 이러한 조절된 단백질은 세포 사멸, 종양 생물학 및 세포 성장, 당분해 및 대사, 분자 이동, 그리고 세포 신호법(signalling)을 포함하는 여러 세포 경로로 묶여질 수 있음을 발견하였다.
종합해보면, 본원에서 기술하는 결과는 Q10의 치료학적 기전에 대한 통찰을 제공한다. 이론에 구속되는 것을 바라지는 않으나, 예를 들면, 본 출원인의 발견은 Q10 및 특히, Q10의 산화 형태는 세포 미소환경의 대사적 변환을 유도한다. 암 세포내 차별화되는 대사로서, 암 세포는 미토콘드리아 내 산화적 인산화(피루베이트의 산화)보다 시토졸 내 당분해와 이어지는 젖산 발효에 의한 에너지 생산이 더 우선적으로 일어난다고 알려져 있다. 본 출원인의 발견은 Q10이 글루코스의 혐기적 사용으로부터 미토콘드리아성 산화적 인산화로 암세포의 대사 상태를 변환시킬 수 있음을 지적한다.
본원에서 나타내는 본 출원인의 데이터에 기반하여, Q10은 다차원 세포내 분자(MIM) 및 외-변환인자(Epi-shifter)로서 확인된다. 본 발명은 MIM, 외-변환인자 및 이들을 사용하여 종양성 장애를 진단 또는 예측하는 방법을 제공한다.
따라서, 특정 측면에서, 본 발명은 한 개체가 종양적 장애를 가졌는지 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 상기 마커는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커들로 구성된 군으로부터 선택된 것이며; 및 (2) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 시료에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 대조군 시료에 있는 마커의 발현 수준에 관하여, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준에서 조절(modulation)은 개체가 종양적 장애를 가지고 있다는 지표이고, 따라서 상기 개체는 종양적 장애를 가지고 있는지 평가된다.
특정 측면에서, 본 발명은 한 개체가 종양적 장애를 가지고 있는지 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 정상 생리학적 조건하에서 개체의 정상 세포에서 관찰된 수준에 비하여, 당분해(glycolysis)로부터 미토콘드리아 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation)로 세포의 대사 에너지의 이동(shiht)을 겪도록 유도된 종양학적 질환의 암성 세포(cancerous cell)에서, 상기 마커의 발현은 조절되며; 및 (2) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 시료에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 대조군 시료에 있는 마커의 발현 수준에 관하여, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준에서의 조절은 개체가 종양적 장애를 가지고 있다는 지표이고, 따라서 상기 개체는 종양적 장애를 가지고 있다는 것으로 평가된다.
특정 실시예에서, 본 발명은 개체가 종양적 장애를 발달시키는 성향이 있는지 예측하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 상기 마커는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성되는 군으로부터 선택된 것이며; 및 (2) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준을 대조군 시료에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 대조군 시료에 있는 마커의 발현 수준에 관하여, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준에서의 조절은 개체가 종양적 장애를 발달시키는 성향이 있다는 지표이고, 따라서 상기 개체는 종양적 장애를 발달시키는 성향이 있는 것으로 예측된다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체가 종양적 장애를 발달시키는 성향이 있는지 예측하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 정상 생리학적 조건하에서 개체의 정상 세포에서 관찰된 수준에 비하여, 당분해(glycolysis)로부터 미토콘드리아 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation)로 세포의 대사 에너지의 이동(shiht)을 겪도록 유도된 종양학적 질환의 암성 세포(cancerous cell)에서, 상기 마커의 발현은 조절되며; 및 (2) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 시료에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 대조군 시료에 있는 마커의 발현 수준에 관하여, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준에서의 조절은 개체가 종양적 장애를 발달시키는 성향이 있다는 지표이고, 따라서 상기 개체는 종양적 장애를 발달시키는 성향을 가지고 있는 것으로 예측된다.
특정 실시예에서, 본 발명은 개체에서 종양적 장애의 재발을 예측하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 상기 마커는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성되는 군으로부터 선택된 것이며; 및 (2) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준을 대조군 시료에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 대조군 시료에 있는 마커의 발현 수준에 관하여, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준에서의 조절은 개체가 종양적 장애 재발의 지표이고, 따라서 상기 개체에서 종양적 장애의 재발이 예측된다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 종양적 장애 재발을 예측하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 정상 생리학적 조건하에서 개체의 정상 세포에서 관찰된 수준에 비하여, 당분해(glycolysis)로부터 미토콘드리아 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation)로 세포의 대사 에너지의 이동(shiht)을 겪도록 유도된 종양학적 질환의 암성 세포(cancerous cell)에서, 상기 마커의 발현은 조절되며; 및 (2) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 시료에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 대조군 시료에 있는 마커의 발현 수준에 관하여, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준에서의 조절은 개체가 종양적 장애 재발의 지표이고, 따라서 상기 개체에서 종양적 장애의 재발이 예측된다.
특정 실시예에서, 본 발명은 종양적 장애를 가지는 개체의 생존을 예측하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 상기 마커는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성되는 군으로부터 선택된 것이며; 및 (2) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준을 대조군 시료에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 대조군 시료에 있는 마커의 발현 수준에 관하여, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준에서의 조절은 종양적 장애를 갖는 개체 생존의 지표이고, 따라서 상기 개체의 생존이 예측된다.
특정 측면에서, 본 발명은 종양적 질병을 갖는 생존을 예측하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 정상 생리학적 조건하에서 개체의 정상 세포에서 관찰된 수준에 비하여, 당분해(glycolysis)로부터 미토콘드리아 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation)로 세포의 대사 에너지의 이동(shiht)을 겪도록 유도된 종양학적 질환의 암성 세포(cancerous cell)에서, 상기 마커의 발현은 조절되며; 및 (2) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 시료에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 대조군 시료에 있는 마커의 발현 수준에 관하여, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준에서의 조절은 종양적 장애를 갖는 개체 생존의 지표이고, 따라서 상기 개체의 생존이 예측된다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서의 종양적 장애의 공격성(aggressiveness)을 예측하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 상기 마커는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성되는 군으로부터 선택된 것이며; 및 (2) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준을 대조군 시료에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 대조군 시료에 있는 마커의 발현 수준에 관하여, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준에서의 조절은 종양적 장애가 공격적이라는 지표이고, 따라서 상기 개체에서 종양적 장애의 공격성이 예측된다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 종양적 장애의 공격성을 예측하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 정상 생리학적 조건하에서 개체의 정상 세포에서 관찰된 수준에 비하여, 당분해(glycolysis)로부터 미토콘드리아 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation)로 세포의 대사 에너지의 이동(shiht)을 겪도록 유도된 종양학적 질환의 암성 세포(cancerous cell)에서, 상기 마커의 발현은 조절되며; 및 (2) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 시료에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 대조군 시료에 있는 마커의 발현 수준에 관하여, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준에서의 조절은 종양적 장애가 공격적이라는 지표이고, 따라서 상기 개체에서 종양적 장애의 공격성이 예측된다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 종양적 장애의 진행(progression)을 모니터하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 개체에 치료 요법(treatment regimen)의 최소 한 부분을 투여하기 이전에 개체로부터 수득한 첫 시료에 존재하는 마커의 발현 수준과 치료 요법의 최소 한 부분을 투여한 후 개체로부터 수득한 두 번째 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 상기 마커는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커들로 구성된 군으로부터 선택됨으로써, 개체내에서 종양적 장애의 진행을 모니터한다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체내에서 종양적 장애의 진행을 모니터하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 개체에 치료 요법의 최소 한 부분을 투여하기 이전에 개체로부터 수득한 첫 시료에 존재하는 마커의 발현 수준과 치료 요법의 최소 한 부분을 투여한 후 개체로부터 수득한 두 번째 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 정상 생리학적 조건하에서 개체의 정상 세포에서 관찰된 수준에 비하여, 당분해(glycolysis)로부터 미토콘드리아 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation)로 세포의 대사 에너지의 이동(shiht)을 겪도록 유도된 종양학적 질환의 암성 세포(cancerous cell)에서, 상기 마커의 발현 수준은 조절됨으로써, 개체내에서 종양적 장애의 진행을 모니터한다.
특정 측면에서. 본 발명은 개체내에서 종양적 장애를 치료하는 치료법(therapy)의 효능을 평가하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 개체에 치료 요법(treatment regimen)의 최소 한 부분을 투여하기 이전에 개체로부터 수득한 첫 시료에 존재하는 마커의 발현 수준, 여기에서 상기 마커는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커들로 구성된 군으로부터 선택되고; 및 치료 요법의 최소 한 부분을 투여 한 후 개체로부터 선택된 두 번째 시료에 존재하는 마커들의 발현 수준을 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 첫 번째 시료와 비교하여 두 번째 시료에 있는 마커의 발현 수준 조절은 치료법(therapy)이 개체에서 종양적 장애를 치료하기 위해 효과적이라는 지표이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 종양적 장애를 치료하기 위한 치료법의 효능을 평가하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 개체에 치료 요법(treatment regimen)의 최소 한 부분을 투여하기 이전에 개체로부터 수득한 첫 시료에 존재하는 마커의 발현 수준, 여기에서 정상 생리학적 조건하에서 개체의 정상 세포에서 관찰된 수준에 비하여, 당분해(glycolysis)로부터 미토콘드리아 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation)로 세포의 대사 에너지의 이동(shiht)을 겪도록 유도된 종양학적 질환의 암성 세포(cancerous cell)에서, 상기 마커의 발현 수준을 조절되고; 및 치료 요법의 최소 한 부분을 투여한 후 개체로부터 수득한 두 번째 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 비교하는 것을 포함하며, 여기에서 첫 번째 시료와 비교하여 두 번째 시료에 있는 마커의 발현 수준 조절은 치료법(therapy)이 개체에서 종양적 장애를 치료하기 위해 효과적이라는 지표이다.
특정 측면에서, 본 발명은 필요한 개체내에 종양적 장애를 치료하기 위한 환경 영향제 화합물(environmental influencer compound)의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 상기 생물학적 시료는 환경 영향제 화합물에 노출된 것이며, 그리고 여기에서 상기 마커는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커들로 구성된 군으로부터 양성(positive) 배수(fold) 변화 및/또는 음성(negative) 배수 변화와 함께 선택되고; (2) 개체로부터 수득한 두 번째 생물학적 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 상기 시료는 환경 영향제 화합물에 노출되지 않으며, 그리고 (3) 환경 영향제 화합물에 노출된 생물학적 시료에 있는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준과 환경 영향제 화합물에 노출되지 않은 생물학적 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준을 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 두 번째 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준에 대하여, 환경 영향제 화합물에 노출된 생물학적 시료에 존재하고 음성 배수 변화를 갖는, 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준의 감소는 환경 영향제 화합물이 종양적 장애를 갖는 개체에서 상기 종양적 장애를 치료하기 위해 효과적이라는 지표이고, 그리고 여기에서 두 번째 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준에 대하여, 환경 영향제 화합물에 노출된 생물학적 시료에 존재하고 양성 배수 변화를 갖는, 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준의 증가는 환경 영향제 화합물이 종양적 장애를 갖는 개체에서 상기 종양적 장애를 치료하기 위해 효과적이라는 지표이고, 따라서 종양적 빌환을 갖는 개체에 종양적 장애를 치료하기 위한 환경 영향제 화합물의 효능을 평가한다.
특정 측면에서, 본 발명은 그것이 필요한 개체에서 종양적 장애를 치료하기 위한 환경 영향제 화학물의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현을 경정하는 것을 포함하고, 여기에서 상기 생물학적 시료는 환경 영향제 화합물에 노출되며, 그리고 여기에서 정상 생리학적 조건하에서 개체의 정상 세포에서 관찰된 수준에 비하여, 당분해(glycolysis)로부터 미토콘드리아 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation)로 세포의 대사 에너지의 이동(shiht)을 겪도록 유도된 종양학적 질환의 암성 세포(cancerous cell)에서, 상기 마커의 발현은 상향(up-) 또는 하향(down-) 조절되고; (2) 개체로부터 수득한 두 번째 생물학적 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 시료는 환경 영향제 화합물에 노출되지 않았고; 및 (3) 환경 영향제 화합물에 노출된 생물학적 시료에 있는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준과 환경 영향제 화합물에 노출되지 않은 생물학적 시료에 있는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준을 비교하는 것을 포함하며, 여기에서 두 번째 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준에 대하여, 환경 영향제 화합물에 노출된 생물학적 시료에서, 하나 또는 그 이상의 하향 조절된 마커의 발현 수준에서의 감소는 상기 화학적 영향제 화합물이 종양적 장애를 갖는 개체에서 종양적 장애를 치료하는데 효과적이라는 지표이고, 그리고 여기에서 두 번째 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준에 대하여, 환경 영향제 화합물에 노출된 생물학적 시료에서, 하나 또는 그 이상의 상향 조절된 마커의 발현 수준에서의 증가는 상기 화학적 영향제 화합물이 종양적 장애를 갖는 개체에서 종양적 장애를 치료하는데 효과적이라는 지표이고, 따라서 종양적 장애를 갖는 개체에서 종양적 장애를 치료하기 위한 환경 영향제 화합물의 효능을 평가한다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 종양적 장애를 치료하기 위한 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 것을 포함하고; (2) 상기 생물학적 시료와 검사 화합물을 접촉시키는 것을 포함하며; (3) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 상기 마커는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커들로 구성된 군으로부터 양성 배수 변화 및/또는 음성 배수 변화를 갖는 것이 선택되며; (4) 생물학적 시료에 있는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준을, 상기 검사 화합물에 의해 접촉되지 않은 대조군 시료와 비교하는 것을 포함하고; 및 (5) 상기 생물학적 시료에 존재하는, 음성 배수 변화를 갖는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준을 감소시키거나 및/또는 생물학적 시료에 존재하는, 양성 배수 변화를 갖는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준을 증가시키는 검사 화합물을 선택하는 것을 포함함으로써, 개체에서 종양적 장애를 치료하기 위한 화합물을 동정한다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 종양적 장애를 치료하기 위한 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 것을 포함하고; (2) 상기 생물학적 시료를 검사 화합물과 접촉시키는 것을 포함하며; (3) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 정상 생리학적 조건하에서 개체의 정상 세포에서 관찰된 수준에 비하여, 당분해(glycolysis)로부터 미토콘드리아 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation)로 세포의 대사 에너지의 이동(shiht)을 겪도록 유도된 종양학적 질환의 암성 세포(cancerous cell)에서, 상기 마커의 발현은 상향 또는 하향 조절되며; (4) 상기 생물학적 시료에 있는 하나 또는 그 이상의 마커의 발현 수준을 검사 화합물에 의해 접촉하지 않은 대조군 시료와 비교하는 것을 포함하고; 및 (5) 생물학적 시료에서, 하나 또는 그 이상의 하향 조절되는 마커의 발현 수준을 감소시키는 및/또는 생물학적 시료에서, 하나 또는 그 이상의 상향 조절된 마커의 발현 수준을 증가시키는 화합물을 선택하는 것을 포함함으로써, 개체에서 종양적 장애를 치료하는 화합물을 동정한다.
특정 실시예에서, 당분해(glysolysis)라는 용어는 선택적으로 관련된 젖산 생합성(lactate biosynthesis)을 포함한다.
어떤 실시예에서, 종양적 장애는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 종양적 장애가다: 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 흑색종(melanoma), 상피성암(carcinoma) 및 육종(sarcoma).
어떤 실시예에서, 상기 마커는 포유류의 암성 세포(cancerous cell)에서, 정상 생리학적 조건하에서 개체의 정상 세포에서 관찰된 수준에 비하여, 당분해(glycolysis)로부터 미토콘드리아 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation)로 세포의 대사 에너지의 이동(shiht)을 선택적으로 유도한다.
어떤 실시예에서, 시료(sample)는 개체로부터 수득된 액체(fluid), 예를 들면 혈액, 구토(vomit), 림프(lymph), 포낭액(cystic fluid), 요(urine), 기관지 세척(bronchial lavage)에 의해 수거된 액체, 복막 세척(peritoneal rinsing)에 의해 수거된 액체, 그리고 부인과 액체(gynecological fluid)로부터 선택된 액체를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 시료는 혈액 시료 또는 그것의 구성요소(component)이다. 어떤 실시예에서, 상기 시료는 개체로부터 수득한 조직(tissue) 또는 그것의 구성요소, 예를 들면 뼈, 연결조직(connective tissue), 연골(cartilage), 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 그리고 피부로부터 선택된 조직을 포함한다.
어떤 실시예에서, 개체는 인간이다.
어떤 실시예에서, 생물학적 시료에 있는 마커의 발현 수준은 시료에 있는 전사된 폴리뉴클레오티드(transcribed polynucleotide) 또는 그것의 일부를 검사함으로써 결정된다. 어떤 실시예에서, 전사된 폴리뉴클레오티드를 검사하는 것은 상기 전사된 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 것을 포함한다. 어떤 실시예에서, 개체 시료에 있는 마커의 발현 수준은 시료에 있는 단백질이나 그것의 부분을 검사함으로써 결정한다. 어떤 실시예에서, 상기 단백질은 시약, 예를 들면 단백질과 특이적으로 결합하는, 표지된 시약을 사용하여 검사된다. 시약은 예를 들면 항체 및 항원-결합 항체 단편을 포함할 수 있다.
어떤 실시예에서, 시료에 있는 마커의 발현 수준은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR) 증폭 반응, 역전사효소 PCR 분석(reverse-transcriptase PCR analysis), 단일가닥 구조 다형성(single-strand conformation polymorphism; SSCP), 미스매치절단 탐지(mismatch cleavage detection), 이형이중체 분석(heteroduplex analysis), 서던 블롯 분석(Southern blot analysis), 노던 블롯 분석(Nothern blot analysis), 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis), 인시추 혼성화(in situ hybridization), 어레이 분석(array analysis), 데옥시리보핵산 서열 시퀀싱(deoxyribonucleic acid sequencing), 제한 단편 길이 다형성 분석(restriction fragment length polymorphism analysis), 그리고 이들의 조합(combination) 또는 서브조합(sub-combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정된다. 어떤 실시예에서, 시료에 있는 마커의 발현 수준은 면역조직 화학(immunohistochemistry), 면역세포 화학(immunocytochemistry), 세포 유동 검사(flow cytometry), ELISA 및 질량 분석(mass spectrometry)로 구성된 군으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정된다.
어떤 실시예에서, 마커는 HNF4-알파(alpha), Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11(Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, cMyc, 알돌전이효소(transaldolase 1), COQ1, COQ3, COQ6, 프레닐전이효소(prenyltransferase), 4-하이드로벤조에이트(hydrobenzoate), 호중구 시토졸 인자 2(neutrophil cytosolic factor 2), 산화 질소 합성효소 2A(nitric oxide synthase 2A), 과산화 디스무타아제 2(superoxide dismutase 2), VDAC, Bax 채널(channel), ANT, 시토크롬 c(Cytochrome c), 복합체 1(complex 1), 복합체 II(complex II), 복합체 III(complex III), 복합체(complex IV), Foxo 3a, DJ-1, IDH-1, Cpt1C 및 Cam 키나아제(Kinase) II로 구성된 군으로부터 선택된다. 어떤 실시예에서, 마커는 세포자멸사(apoptosis)와 관련된 마커이다. 어떤 실시예에서, 마커는 산화 스트레스(oxidative stress)와 관련된 마커이다. 어떤 실시예에서, 마커는 열충격(heat shock)과 관련된 마커이다. 어떤 실시예에서, 마커는 혈관형성(angiogenesis)와 관련된 마커이다. 어떤 실시예에서, 마커의 많은 수의 발현 수준은 결정된다.
어떤 실시예에서, 개체는 환경 영향제 화합물(environmental influencer compound), 수술, 방사선, 호르몬 치료법, 항체 치료법, 성장 인자(growth factor)를 사용한 치료법, 사이토카인(cytokines), 화학요법(chemotherapy)으로부터 선택된 치료법으로 치료된다. 어떤 실시예에서, 치료법(therapy)은 환경 영향제 화합물을 포함한다. 환경 영향제 화합물은 예를 들면 다차원 세포내 분자(multidimensional intracellular molecules; MIMs) 또는 외대사성 변환인자(epimetabolic shifters; epi-shifters)일 수 있다. 어떤 실시예에서, 환경 영향제 화합물은 CoQ-10이다. 어떤 실시예에서, 환경 영향제 화합물은 비타민 D3(vitamine D3)이다. 어떤 실시예에서, 환경 영향제 화합물은 아세틸(acetyl) Co-A, 팔미틸(palmityl), L-카르니틴(carnitine), 티로신(tyrosine), 페닐알라닌(phenylalanine), 시스테인(cysteine) 및 작은 분자(small molecule)로부터 선택된 화합물이다. 어떤 실시예에서, 환경 영향제 화합물은 피브로넥틴(fibronectin), TNF-알파(alpha), IL-5, IL-12, IL-23, 혈관형성 인자(angiogenic factor) 및 세포자멸사 인자(apoptotic factor)로부터 선택된 화합물이다. 어떤 실시예에서, 나아가 치료법은 수술, 방사선, 호르몬 치료법, 항체 치료법, 성장 인자를 사용한 치료법, 사이토카인, 그리고 화학요법으로부터 선택된 치료 요법(treatment regimen)를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체가 종양적 장애를 갖는지 평가하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된, 최소 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 개체가 종양적 장애를 갖는지 평가하기 위해, 키트의 사용을 위한 설명서(instruction)를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체가 종양적 장애를 발달시키는 성향이 있는지 예측하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된, 최소 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 개체가 종양적 장애를 발달시키는 성향이 있는지 예측하기 위해, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명은 개체에서 종양적 장애의 재발을 예측하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된, 최소 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 개체가 종양적 장애의 재발을 예측하기 위해, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 종양적 장애의 재발을 예측하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된, 최소 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 개체가 종양적 장애의 재발을 예측하기 위해, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 종양적 장애를 갖는 개체의 생존(survival)을 예측하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된, 최소 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 개체가 종양적 장애를 갖는 개체의 생존을 예측하기 위해, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 종양적 장애의 공격성(aggressiveness)를 예측하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된, 최소 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 개체에서 종양적 장애의 공격성을 예측하기 위해, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 종양적 장애의 진행(progression)을 모니터하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된, 최소 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 개체에서 종양적 장애의 진행을 예측하기 위해, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 종양적 장애를 치료하기 위한 치료법의 효능을 평가하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된, 최소 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 종양적 장애를 치료하기 위한 치료법의 효능을 평가하기 위해, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 종양적 장애를 갖는 개체에서 종양적 장애를 치료하기 위한 환경 영향제 화합물의 효능을 판단하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된, 최소 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 종양적 장애를 갖는 개체에서 종양적 장애를 치료하기 위한 환경 영향제 화합물의 효능을 평가하기 위해, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함한다.
어떤 실시예에서, 키트는 나아가 개체로부터 생물학적 시료를 수득하기 위한 수단을 포함한다. 어떤 실시예에서, 키트는 나아가 대조군 시료를 포함한다. 어떤 실시예에서, 키트는 나아가 환경 영향제 화합물을 포함한다. 어떤 실시예에서, 키트는 마커 다수(plurality)의 발현 수준을 결정하기 위한 시약을 포함한다.
어떤 실시예에서, 최소 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 수단은 시료에 있는 전사된 폴리뉴클레오티드(trancribed polynulceotide) 또는 그것의 부분을 검사하기 위한 수단을 포함한다. 다른 실시예에서, 최소 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 수단은 시료에 있는 단백질 또는 그것의 부분을 검사하기 위한 수단을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체가 CoQ10 반응 상태(responsive state)를 갖는지 판단하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기에서 상기 마커는 표 2-4 & 6-29에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택되며; 및 (2) 개체로부터 수득된 생물학적 시료에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 시료에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 대조군 시료에 있는 마커의 발현 수준에 비하여, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 있는 마커의 발현수준의 조절은 개체가 CoQ10 반응 상태를 갖고 있다는 지표이고, 따라서 개체가 CoQ10 반응 상태를 갖는다는 것으로 평가된다. 어떤 실시예에서, 상기 CoQ10 반응 상태는 종양적 장애이다.
도 1: 초기 및 후기 사멸세포의 양에 의해 측정되는 Q10 처리후 24시간째에서의 SK-MEL-28의 민감도.
도 2: 초기 및 후기 사멸세포의 양에 의해 측정되는 Q10 처리후 24시간째에서의 SKBR3의 민감도.
도 3: 초기 및 후기 사멸세포의 양에 의해 측정되는 Q10 처리후 24시간째에서의 PaCa2의 민감도.
도 4: 초기 및 후기 사멸세포의 양에 의해 측정되는 Q10 처리후 24시간째에서의 PC-3의 민감도.
도 5: 초기 및 후기 사멸세포의 양에 의해 측정되는 Q10 처리후 24시간째에서의 HepG2의 민감도.
도 6: 초기 및 후기 사멸세포의 양에 의해 측정되는 Q10 처리후 24시간째에서의 MCF-7의 민감도.
도 7: 아포스트랜드 ELISA 방법에 의해 측정되는, Q10으로 24시간 처리한 후, 사멸세포의 측정.
도 8: 2-D 겔 전기영동로의 예시적 겔 분석. 검출용 스팟은 표시되어있음.
도 9: SK-MEL-28 세포에서, Q10에 의해 조절됨으로써 2-D 겔 전기영동에 의해 검출된 단백질 사이의 상호결합 네트워크.
도 10: Verhoeven et al. (Am. J. Hum. Genet. 2001 68(5):1086-1092)로부터 적용되는 펜토오즈 포스페이트 경로.
도 11: SK-MEL-28 세포의 미토콘드리아 풍부 물질의 2-D 겔. 질량분석기(mass spectrometry) 특성에 의해 표시되고 검출된 스팟은 표시되어 있음.
도 12: 100 μM의 Q10을 배양액에 외생적으로 첨가함에 따른, SK-MEL-28 세포 미토콘드리아에 존재하는 Q10의 상대적 양의 비교 그래프.
도 13: 알려진 과정을 맵핑한 세포사멸 경로.
도 14: Bcl-티의 웨스턴 블랏 분석.
도 15: 비멘틴 항체로 증명되는 SK-MEL-28 샘플 세트의 웨스턴 블랏 분석.
도 16: 산화적 인산화 복합체(oxidative phosphorylation complexes (MitoSciences #MS601))를 표적화하는 다섯 개 항체로 평가되는, 다수 세포주로부터 세포 용해의 웨스턴 블랏 분석.
도 17: F1-알파 수준의 웨스턴 블랏 비교.
도 18: C-III-Core 2와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 19: C-II-30와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 20: C-IV-COX II 와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 21: C-I-20 (ND6)와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 22: 다섯 개 미토콘드리아 단백질에 대항하는 다양한 세포형의 웨스턴 블랏 분석.
도 23: 복합체 V 단백질 C-V-α와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 24: C-III-Core 1과 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 25: 포린(Porin, VDAC1)과 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 26: 사이클로필린 D와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 27: 사이토크롬 C와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 28: 힐릭스(Helix) 10 열린 형태에서 HNF4알파 (1M7W.pdb)의 지질 결합 채널로 삽입되는 Q10(구)의 이론적 모델.
도 29: 정상산소 및 산소결핍 상태에서 다양한 글루코스 상태에 있어서의 HDFa 세포의 OCR.
도 30: 정상산소 및 산소결핍 상태에서 다양한 글루코스 상태에 있어서의 HASMC 세포의 OCR.
도 31: CoQ10 및 스트레스 인자의 부존재 및 존재하에서의 MCF-7 유방암 세포의 OCR 값.
도 32: CoQ10 및 스트레스 인자의 부존재 및 존재하에서의 PaCa-2 췌장암 세포의 OCR 값.
정의
여기 사용된 바와 같이, 하기 각 용어는 이번 부분에서 이와 관련된 의미를 갖는다.
여기에서 "a" "an"은 하나 또는 하나 이상의 (즉, 최소 1개)를 나타내는 문법적 목적을 갖는 용어이다. 예컨대 "구성요소"는 하나의 구성요소 또는 하나 이상의 구성요소를 의미한다.
"포함하는"이라는 용어는 여기에서 "제한되지 않으나, 포함되는"이라는 의미이며, 이와 상호변경가능하게 사용된다.
용어 "또는"은 만약 문맥에서 명백히 다르게 지적하지 않는 한 "및/또는"을 의미하며 이와 상호변경가능하게 사용된다.
용어 "예컨대"는 "제한되지 않으나, 예컨대"의 의미이며, 이와 상호변경가능하게 사용된다.
본 발명의 방법에 의해 치료되기 위한 "환자" 또는 "개체"는 인간 또는 비-인간 동물을 의미할 수 있고, 바람직하게는 포유류이다. 여기서 사용되는 것과 같이, "개체(subject)" 또는 "환자(patient)"는 제한 없이, 말, 개, 고양이, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 원숭이, 기니피그(guinea pig), 쥐(rat), 생쥐(mice), 도마뱀, 뱀, 양, 소, 생선, 그리고 새를 포함한 모든 동물(예를 들면 인간)을 포함한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "생존(survival)"은 종양적 장애를 위해 치료된 적 있는 개체의 삶의 지속을 의미한다. 하나의 실시예에서, 생존은 재발하는 종양적 장애의 실패를 의미한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "재발한다(recur)" 또는 "재발(recurrence)"이라는 용어는 종양에 대한 원치료(primary treatment)가 투여되었던 개체에서 종양 또는 암성(cancerous) 세포의 재성장을 의미한다. 종양은 신체의 원래 위치 또는 다른 부분에서 재발할 수 있다. 하나의 실시예에서, 치료되었던 개체에 대해, 재발한 종양이 원종양(primary tumor)과 동일한 종류이다. 예를 들면 만약 개체가 췌장 종양을 갖고 있었고, 치료되었으나 후에 또 다른 췌장 종양이 발달하였다면, 상기 종양은 재발한 것이다. 또한, 종양적 장애는 원래 발생했던 한 장소보다는 상이한 기관 또는 조직에서 재발할 수 있다. 예를 들면, 만약 개체가 췌장 종양을 갖고 있었고, 치료되었으나 그 후 간 종양(liver tumor)이발달되었다면, 상기 종양은 또한 재발된 것이다.
여기서 사용된 것과 같이, 종양적 장애에 관하여 "공격성(aggressiveness)"이라는 용어는 개체에서 재발하려는 성향 또는 상기 공격적 종양으로부터 유래된 세포를 갖는 종양을 의미한다.
여기서 사용된 것과 같이, "양(amount)"는 분자, 몰(moles) 또는 유닛 부피(unit volume)당 무게 또는 세포에서 측정된 절대량(absolute amount), 또는 상대량(relative amount), 예를 들면 0 내지 5로 숫자 순위에 의한 것 중 하나를 의미한다.
여기에서 사용된 "대조군 양(control amount)"은 종양적 장애를 갖지 않는 개체로부터 유래된 세포 또는 시료에 있는, 또는 비-공격적(non-aggressive) 종양으로부터 유래된 세포 또는 시료에 있는 마커의 양을 의미한다. 예를 들면, "대조군 양(control amount)"은 마커를 발현하는, 예를 들면 높은 수준, 중간 수준, 낮은 수준으로 상기 단백질이 발현하는 것으로 알려진 세포 또는 조직에 존재하는 마커의 평균량을 산촐함으로써 결정될 수 있다.
"치료적 유효량"은 질환 치료를 위해 환자에 투여하였을 때 질환에 대한 치료 효과가 충분한 화합물의 양을 의미한다. 질환을 예방하기 위해 투여하였을 때, 질환의 발생을 늦추거나 피하는데 충분한 양을 의미한다. "치료적 유효량"은 화합물, 투여되는 개체의 질환 및 그 심각도 및 나이, 중량 등에 따라 달라질 것이다.
"예방하는" 또는 "예방"은 질환 또는 장애 (즉, 질환에 노출되거나 질환의 성향을 갖게 될 수 있으나 질환을 아직 경험하지 않았거나 질환의 증후를 나타내지 않는 환자에게 있어 질환이 발달하지 않도록 질환의 최소 하나의 임상 증후를 야기하는)가 일어나는 위험성을 감소시키는 것을 말한다.
"예방하는(prophylactic)" 또는 "치료적(therapeutic)" 처치라는 용어는 하나 또는 그 이상의 본 발명 조성물을 개체에 투여하는 것을 말한다. 만약 원치않는 상태의 임상적 증후에 앞서 투여되었다면 (예컨대 숙주동물의 질환 또는 기타 원치않는 상태), 그 처치는 예방적일 것이고, 즉 그것은 숙주에게 원치않는 상태로 발달하는 것을 막을 것이고, 반면 만약 원치않는 상태의 증후가 나타난 후 투여된다면, 그 처치는 치료적일 것이다(즉, 존재하는 원치않는 상태 또는 그로부터의 부작용을 감소, 완화 또는 유지시키는 것을 의도한다).
용어 "치료 효과"는 약학적으로 활성있는 물질에 의해 야기되는 동물, 특히 포유류 및 더욱 특이적으로는 인간에서의 국소 또는 전신 효과를 말한다. 상기 용어는 따라서 질환의 진단, 치유(cure), 완화, 치료 또는 예방에 사용되거나 동물 또는 바람직한 인간의 신체적 또는 정신적 발달 및 상태의 증진에 사용되는 것을 의도하는 임의의 물질을 의미한다. "치료적-유효량"이라는 용어는 임의의 처치에 사용되는 적정 이익/위험 비율에서 임의의 바람직한 국소 또는 전신 효과를 나타내는 물질의 양을 의미한다. 어떤 실시양태에서, 화합물의 치료적-유효량은 치료지수, 용해도 및 기타 등에 의존할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 의해 발견된 어떤 화합물은 이러한 처치에 사용되는 적정 이익/위험 비율을 낳기 위하여 충분한 양으로 투여될 수 있다.
"발현(expression)"은 여기서 폴리펩티드(polypeptide)가 DNA로부터 생산되는 과정의 의미로 사용된다. 상기 과정은 유전자가 mRNA로의 전사(transcription) 및 상기 mRNA가 폴리펩티드로의 번역(translation)과 관련이 있다. 사용되는 문맥에 따라서, "발현"은 RNA, 단백질 또는 그 2가지 모두의 생산물을 의미할 수 있다.
"세포에서 유전자의 발현 수준(level of expression of a gene in a cell)" 또는 "유전자 발현 수준(gene expression level)"의 용어는 mRNA, 전-mRNA 초기 전사체(nascent trancript(s)), 전사체 처리 중간체(transcript precessing intermediates), 성숙 mRNA(mature mRNA(s)) 및 세포에서 유전자에 의해 암호화된 생산물의 분해(degradation)의 수준을 의미한다.
"조절(modulation)"이라는 용어는 반응의 상향 조절(upregulation) (즉, 활성화 또는 자극), 하향 조절(downregulation) (즉, 억제(inhibition) 또는 진압(supression)), 또는 그 둘의 조합 또는 각각을 의미한다. "조절자(modulator)"는 조절하는 화합물 또는 분자이고, 그리고 예를 들면 작용제(agonist). 길항제(antagonist), 활성제(activator), 자극제(stimulator), 진압제(suppressor), 또는 억제제(inhibitor)이다.
"발현의 더욱 높은 수준(higher level of expression)", "활성의 더욱 높은 수준(higher level of activity)", "발현의 감소된 수준(decreased level of expression)" 또는 "활성의 감소된 수준(decreased level of activity)"은 발현 및/또는 활성을 평가하기 위해 적용된 검사의 표준 오차(standrad error) 더욱 큰, 검사 시료에서의 발현 수준 및/또는 활성을 의미하고, 바람직하게는 대조군 시료(예를 들면 종양적 장애를 갖지 않는 건강한 개체로부터의 시료)에 있는 마커의 발현 수준 및/또는 활성 및 바람직하게는 여러 대조군 시료에 있는 마커의 평균 발현 수준 및/또는 활성의 최소 2 배, 그리고 더욱 바람직하게는 3 배, 4 배, 5 배, 또는 10 배 또는 그 이상의 발현 수준 및/또는 활성이다.
"발현의 더욱 낮은 수준(lower level of expression)", "활성의 더욱 낮은 수준(lower level of activity)", "발현의 감소된 수준(decreased level of expression)" 또는 "활성의 감소된 수준(decreased level of activity)"은 발현 및/또는 활성을 평가하기 위해 적용된 검사의 표준 오차(standrad error) 더욱 큰, 검사 시료에서의 발현 수준 및/또는 활성을 의미하지만, 바람직하게는 대조군 시료(예를 들면 마커의 예측 능력을 위한 타당 표준(validation standard)으로 기능하는 후속 정보(follow-up infomation)과 함께 종양적 장애의 패널(panel)에 대해 직접적으로 또는 간접적으로 보정된 시료)에 있는 마커의 발현 수준, 그리고 바람직하게는 여러 대조군 시료에 있는 마커의 평균 발현 수준 및/또는 활성의 최소 2배, 그리고 더욱 바람직하게는 3배, 4배, 5배, 또는 10배 또는 그 이하이다.
여기서 사용되듯이, "항체(antibody)"는 예를 들면 항체의 자연적으로 존재하는 형태(예를 들면 IgG, IgA, IgM, IgE) 및 단일 사슬 항체(single-chain antibody)와 같은 재조합 항체 키메라(chimeric) 및 인간화된 항체(humanized antibody), 그리고 다중 특이적 항체(multi-specific antibody)뿐만 아니라 최소 항원 결합 부위(antigenic binding site)를 갖는 상기 모든 것들의 단편 및 유도체를 포함한다. 항체 유도체는 단백질 또는 항체에 결합된 화학적 모이어티(chemical moiety)를 포함할 수 있다.
여기서 사용되는 것과 같이, "알려진 표준(known standard)" 또는 "대조군(control)"은 하나 또는 그 이상의 양 및/또는 본 발명의 마커와 관련하여 적용될 수 있는 수학적 관계, 그리고 종양적 장애의 존재 또는 부재를 의미한다. 바람직하게, 알려진 표준은 상기 양 및/또는 재발성 종양 및 비재발성 종양의 수학적 관계 특성 및/또는 공격적 또는 비공격적 종양을 반영한다. 알려진 표준을 생산하기 위한 시약은 제한 없이, 공격적이라고 알려진 종양으로부터의 종양 세포, 비공격적이라고 알려진 종양으로부터의 종양 세포, 그리고 선택적으로 표지된 항체를 포함한다. 또한, 알려진 표준은 조직 배양 세포주[특이적 마커 단백질을 발현하도록 조작되거나 또는 특이적 마커 단백질을 발현하지 않도록 조작한 세포주, 또는 마커 단백질의 일정한 양을 항상 포함하거나 또는 마커 단백질을 발현하기 하도록 조작될 수 있는(예를 들면, 성장 인자, 호르몬, 스테로이드, 사이토카인, 항체, 다양한 약물 및 항-대사물질, 그리고 세포외 매트릭스를 포함하지만 이로 제한되지 않은 변화된 환경에 노출시킴으로써) 종양 이종이식(xenograft)을 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않음]를 포함할 수 있다. 세포주는 분석을 위해 직접적으로 슬라이드 글라스에 올릴 수 있고, 고정시킬수 있으며 펠렛(pellet)으로서 직접적으로 파라핀(paraffin)에 함몰(embed)시킬 수 있고, 또는 아가로오즈(agarose)와 같은 매트릭스(matrix)에 현탁시킨 후, 고정시키고 파라핀에 함침시켜 절편화하고 조직 시료(tissue sample)로서 처리할 수 있다. 표준은 마커 단백질의 예측 능력에 대한 타당 표준으로서 기능을 하는 후속 정보돠 함께, 위장(gastrointestinal) 또는 유방암에 대하여 직접적으로 또는 간접적으로 보정(calibration)되어야만 한다.
여기서 사용되는 "원치료(primary treatment)"는 종양적 장애를 갖는 개체의 처음의 치료를 의미한다. 원치료는 제한없이, 수술, 방사선, 호르몬 치료법, 화학치료법, 면역치료법, 혈관형성 치료법, 그리고 생조절제(biomodulator)를 통한 치료법을 포함한다.
만약 종양적 장애의 최소 한개의 증상이 경감, 종결, 둔화 또는 예방되거나, 또는 그렇게 되기를 기대할 때, 종양적 장애는 "치료(treat)"되는 것이다. 또한, 여기서 사용되는 것과 같이, 만약 종양적 장애가 재발 또는 전이가 감소, 둔화, 지연, 또는 예방된다면, 상기 종양적 장애는 "치료(treat)"되는 것이다.
키트는 최소 하나의 시약, 예를 들면 본 발명의 마커를 특이적으로 탐지하기 위한 탐침(probe)을 포함하는 어떠한 제품, 또는 홍보되거나, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유닛(unit)으로서 분배되거나 또는 팔린 제품이다.
"대사 경로"는 한 화합물이 다른 것으로 변형되어 세포 기능을 위한 중간체를 제공하고 에너지를 내는 효소-매개 반응의 과정을 말한다. 대사 경로는 선형 또는 사이클일 수 있다.
"대사 상태(metabolic state)"는 그들이 건강 또는 질병의 상태와 관련된 다양한 화학 및 생물 학적 지표에 의한 측정되는, 주어진 시간 지점에서의 특정 세포성, 다중세포성 또는 조직 환경의 분자적 내용을 말한다.
"마이크로어레이"라는 용어는 기질, 예컨대 종이, 나일론 또는 기타 타입의 막, 필터, 칩, 유리 슬라이드 또는 임의의 다른 적절한 고체 지지체상에서 합성되는 구분되는 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드(예컨대 항체) 또는 펩티드에 대한 어레이를 말한다.
용어 "장애" 및 "질환"은 신체의 임의의 부분, 기관 또는 시스템(또는 이들의 임의의 조합)의 정상 구조 또는 기능으로부터의 임의의 일탈을 말하며 이들을 포함하는 의미로 사용된다. 특정 질환은 생물학적, 화학적 및 물리적 변화를 포함하여 특징적 증상 및 증후에 의해 표명되며, 이로 제한되지는 않으나 인구, 환경, 고용, 유전 및 의학적 히스토리와 같은 요인들을 포함하는 보통 다양한 다른 인자들과 연관된다. 임의의 특징적 증후, 증상 및 관련 요인들은 중요한 진단 정보를 얻기 위하여 다양한 방법을 통해 정량될 수 있다.
어떤 실시양태에서, 본 발명의 화합물, 예컨대 여기에 기재된 MIM 또는 외-변환 인자(epi-shifter)는 그들을 필요로 하는 개체에서 코엔자임 Q10 반응성 상태를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. "코엔자임 Q10 반응성 상태" 또는 "CoQ10 반응성 상태"는 코엔자임 Q10의 투여로 인해 치료, 예방 또는 완화될 수 있는 질환, 장애, 상태(state) 및/또는 상태(condition)을 포함한다. 임의의 특정 이론에 구속될 필요 없이, 여기에 기재된 바와 같이 CoQ10은 최소한 부분적으로, 세포 미소환경에서 대사적 쉬프트를 유도함으로써, 예컨대 정상 상태 세포에서 산화적 인산화의 형태 및/또는 수준을 향해 쉬프트됨으로써 기능한다고 여겨진다. 따라서, 어떤 실시양태에서, CoQ10 반응성 상태는 세포 미소환경의 변화된 대사로부터 일어나는 상태이다. 코엔자임 Q10 반응성 상태는 예를 들면, 종양학적 장애, 예를 들면 해당과정 및 락테이트 생합성 과정을 향해 편향될 수 있는 것을 포함한다.
어떤 실시양태에서, CoQ10 반응성 종양학적 장애는 다른 것들 중 간암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 간암 또는 뼈암, 편평상피세포암, 기저세포암, 흑색종(melanomas) 및 광선각화증(actinic keratosis)을 포함한다. 코엔자임 Q10 반응성 상태는 또한 여기 기재된 바와 같은 다른 종양학적 장애를 포함한다.
코엔자임 Q10 반응성 상태는 또한 예를 들면 대사장애도 포함하는데, 예컨대 비만, 당뇨, 전-당뇨, 대사성 증후군, 포만감(satiety) 및 내분비성 장애를 포함한다. 코엔자임 Q10 반응성 상태는 여기 기재된 바와 같은 기타 대사성 장애를 또한 포함한다.
어떤 실시양태에서, 본 발명의 화합물, 여기 기재된 예컨대 MIM 또는 외-변환 인자는 코엔자임 Q10과 공통된 활성을 공유한다. 여기 기재된 바와 같이, "코엔자임 Q10과 공통된 활성을 공유한다"는 문장은 코엔자임 Q10과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 최소한의 부분이 나타내는 화합물의 활성을 말한다. 어떤 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 코엔자임 Q10 활성의 25% 또는 그 이상의 활성을 나타낸다. 어떤 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 코엔자임 Q10 활성의 약 130%를 포함하고, 그보다 높은 활성을 나타낸다. 어떤 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 코엔자임 Q10활성의 약 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 또는 130%의 활성을 나타낸다. 상기 문단에 열거된 각 값들은 용어 "약"에 의해 조정될 수 있을 것으로 이해된다. 또한, 상기 문단에 열거된 임의의 두 값에 의해 정의되는 임의의 범위가 본 발명에 포함되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들면, 어떤 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 코엔자임 Q10 활성의 약 50% 및 약 100% 사이의 활성을 나타낸다. 어떤 실시양태에서, 코엔자임 Q10 및 본 발명의 화합물에 의해 공유되는 활성은 세포 대사에서 쉬프트를 유도하기 위한 활성이다. 어떤 실시양태에서, CoQ10 및 본 발명의 화합물에 의해 공유되는 활성은 OCR(Oxygen ConsμMption Rate) 및/또는 ECAR (ExtraCellular Acidification Rate)에 의해 측정된다.
여기에 사용된 바와 같은 "종양학적 장애"는 인간에서 발견되는 모든 종류의 암 또는 종양 또는 악성 종양을 말하며, 이로 제한되는 것은 아니나 백혈병, 림프종, 흑색종, 상피성암(carcinomas) 및 육종(sarcomas)을 포함한다. 여기에 사용된 바와 같은 "종양학적 장애," "암," "종양(neoplasm)," 및 "종양(tμMor)"은 상호교환가능하고, 단수 또는 복수형으로 사용되며, 숙주 기관에서 병을 일으키는, 악성 변형이 된 세포를 말한다. 어떤 실시양태에서, 종양학적 장애는 코엔자임 Q10 반응성 상태이다.
어떤 실시양태에서, 종양학적 장애 또는 암은 세포사멸의 부족에 의해 특징지워진다. 다른 실시양태에서, 종양학적 장애 또는 암은 신생혈관신생의 증대로 특징지워진다. 다른 실시양태에서, 종양학적 장애 또는 암은 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 분해에 의해 특징지워진다. 또 다른 실시양태에서, 종양학적 장애 또는 암은 세포 주기 컨트롤의 손실에 의해 특징지워진다. 또 다른 실시양태에서, 종양학적 장애 또는 암은 미토콘드리아의 산화적 인산화로부터 락테이트 및 해당과정의 플럭스에 대한 이용 및/또는 의존성이 증진되는 것으로의 대사 체계에 있어서의 쉬프트에 의해 특징지워진다. 또 다른 실시양태에서 종양학적 장애 또는 암은 면역감시를 피하는 면역조정 메커니즘에 적응되는 것으로 특징지워진다. 일 실시양태에서, 종양학적 장애 또는 암은 최소 두 개의 상기 특징, 예컨대 증가된 신생혈관신생 및 ECM 분해에 의해 특징지워진다. 일 실시양태에서, 종양학적 장애 또는 암은 최소 3가지의 상기 특징들로 특징지워진다. 일 실시양태에서, 종양학적 장애 또는 암은 최소 네 가지의 상기 특징들로 특징지워진다. 일 실시양태에서, 종양학적 장애 또는 암은 최소 다섯 가지의 상기 특징들로 특징지워진다. 일 실시양태에서, 종양학적 장애 또는 암은 최소 여섯 가지의 상기 모든 특징들로 특징지워진다.
따라서, 어떤 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 세포사멸에 대한 능력을 회복하거나 세포사멸을 유도함으로써 기능한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 신생혈관신생을 감소, 억제 또는 저해함으로써 기능한다. 또 다른 실시양태에서 본 발명의 화합물은 세포외기질을 회복시키거나 재-확립화함으로써 기능한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 세포주기 컨트롤을 회복함으로써 기능한다. 또 다른 실시양태에서 본 발명의 화합물은 해당과정으로부터 미토콘드리아 산화적 인산화로 대사 체계를 역 쉬프팅함으로써 기능한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 암 세포를 외부인자(foreign)로 인지하는 신체 능력을 회복하거나 면역-감시능을 회복함으로써 기능한다.
임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 이는 암으로 발달하기 위하여 종합되는 전형적으로 조직화되는 캐스케이드라고 여겨진다. 즉, 어떤 실시양태에서, 암은 1 유전자-1 단백질-루트 인과관계에 특이하게 의존하지 않는다. 어떤 실시양태에서, 암은 종양, 변화된 조직 상태, 예컨대 조직 변화 및 변형으로 나타내지는 생리학적 질환 상태이다.
어떤 실시양태에서, 암은 종양으로 되는 조직 변화 및 변형, 변형된 조직 상태, 예컨대 전이적 잠재성, 면역감시의 결핍 및/또는 신생혈관신생의 변형된 상태로 되는, 에너지가 소요되며, 면역반응이 발휘되지 못하는(compromised) 세포외 기질의 보존(integrity) 상태로 나타내지는 생리학적 질환 상태이다. 1차 암세포 (즉, 악성 변형 부위 근처로부터 수득된 세포)는 잘-확립된 기술, 특히 조직학적 시험으로 비-암화 세포와 쉽게 구별할 수 있다. 여기에서 사용되는 바와 같은, 암 세포의 정의는 1차 암 세포뿐만 아니라 암 줄기 세포뿐만 아니라 암 전구체 세포(cancer progenitor cells) 또는 암 세포 조상으로부터 유래한 임의의 세포를 포함한다. 전이된 암 세포 및 in vitro 배양 및 암 세포로부터 유래한 세포주를 포함한다. 정상적으로 고형종양으로 나타내지는 암의 종류를 말할 때, "임상적으로 검출가능한" 종양은 종괴 기준으로 검출가능한 것이며; 예컨대 CAT 스캔, MR 영상화, X-선, 초음파 또는 촉진(palpation)에 의해 검출가능하며/거나 환자로부터 수득될 수 있는 샘플에서 하나 또는 그 이상의 암-특이적 항원이 발현함으로 인하여 검출가능하다.
"육종(sarcoma)"라는 용어는 일반적으로 배아 연결 조직(embronic connective tissue)와 같은 물질로 만들어진 종양을 의미하고, 그리고 일반적으로 미소섬유(fibrillar)에 함몰된, 긴밀하게 충전(packed)된 세포로 구성되어 있다. 환경 영향제로 치료될 수 있는 육종의 예는 연골육종(chondrosarcoma), 섬유육종(fibrosarcoma), 림프육종(lymphosarcoma), 흑색육종(melanosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 골육종(osteosarcoma), 아베메티 육종(Abemethy's sarcoma), 지방질 육종(adipose sarcoma), 지질육종(liposarcoma), 포상 연부 육종(aveolar soft part sarcoma), 법랑아 육종(ameloblastic sarcoma), 포도육종(botryoid sarcoma), 녹색 육종(chloroma sarcoma), 융모암종(chorio carcinoma), 배아 육종(embryonal sarcoma), 윌름 종양 육종(Wilms' tumor sarcoma), 자궁내막버팀 육종(endometrial sarcoma), 기질육종(stromal sarcoma), 유윙 육종(Ewing's sarcoma), 근막 육종(fascial sarcoma), 섬유아세포 육종(fibroblastic sarcoma), 거대 세포 육종(giant cell sarcoma), 과립구성 육종(granulocytic sarcoma), 호지킨 육종(Hodgkin's sarcoma), 특발성 다색소 용혈성 육종(idiopathic multiple pigmented hemorrhagic sarcoma), B 세포 면역아세포 육종(immunoblastic sarcoma of B cells), 림프종(lymphoma), T 세포 면역아세포 육종(immunoblastic sarcoma of T-cells), 젠슨 육종(Jensen's sarcoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 쿠퍼 세포 육종(Kupffer cell sarcoma), 혈관육종(angiosarcoma), 백혈육종(leukosarcoma), 악성 간엽세포 육종(malignant mesenchymoma sarcoma), 골주위 육종(parosteal sarcoma), 망상 적혈구 육종(reticulocytic sarcoma), 라우스 육종(Rous sarcoma), 혈청 육종(serocystic sarcoma), 활액막 육종(synovial sarcoma), 그리고 모세혈관확장성 육종(telangiectaltic sarcoma)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
"흑색종(melanoma)"라는 용어는 피부 및 다른 기관의 색소 시스템(melanocytic system)으로부터 나타나는 종양을 의미한다. 본 발명의 환경 영향제로 치료될 수 있는 흑색종은, 예를 들면, 말단흑자 흑색종(acral-lentiginous melanoma), 무색소 흑색종(amelanotic melanoma), 양성 소아 흑색종(benign juvenile melanoma), 클라우드만 흑색종(Cloudman's melanoma), S91 흑색종(S91 melanoma), 하딩-파세이 흑색종(Harding-Passey melanoma), 소아 흑색종(juvenile melanoma), 악성 흑자 흑색종(lentigo maligna melanoma), 악성 흑색종(malignant melanoma), 결정성 흑색종(nodular melanoma), 손발톱밑 흑색종(subungal melanoma), 그리고 얕은 확산 흑색종(superficial spreading melanoma)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
"상피성 암(carcinoma)"는 주변 조직으로 투과하려는 경향이 있어 전이를 야기하는 상피세포로부터 만들어진, 새로운 악성 성장을 의미한다. 본 발명의 환경 영향제로 치료될 수 있는 상피성 암은, 예를 들면, 샘꽈리세포 암종(acinar carcinoma), 선방상 암종(acinous carcinoma), 샘낭 암종(adenocystic carcinoma), 선낭 암종(adenoid cystic carcinoma), 선 암종(carcinoma adenomatosum), 부신 피질 암종(carcinoma of adrenal cortex), 폐포성 암종(alveolar carcinoma), 폐세포 암종(alveolar cell carcinoma), 기저세포 암종(basal cell carcinoma), 염기성 세포 암종(carcinoma basocellulare), 기저 암종(basaloid carcinoma), 기저 세포 암종(basosquamous cell carcinoma), 기관지폐포 암종(bronchioalveolar carcinoma), 세기관지성 암종(bronchiolar carcinoma), 기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma), 대뇌양 암종(cerebriform carcinoma), 쓸개관 세포 암종(cholangiocellular carcinoma), 융모성 암종(chorionic carcinoma), 콜로이드질 암종(colloid carcinoma), 면포성 암(comedo carcinoma), 자궁체부암(corpus carcinoma), 소공질 암종(cribriform carcinoma), 갑옷 암(carcinoma en cuirasse), 피각 암종(carcinoma cutaneum), 원주성 암(cylindrical carcinoma), 원주상피세포 암(cylindrical cell carcinoma), 도관암(duct carcinoma), 듀럼 암종(carcinoma durum), 배아 암종(embryonal carcinoma), 뇌종양(encephaloid carcinoma), 표피암(epiermoid carcinoma), 선양 상피성 암(carcinoma epitheliale adenoides), 외장성 선암(exophytic carcinoma), 궤양성 선암(carcinoma ex ulcere), 섬유 선암(carcinoma fibrosum), 젤라틴 모양 선암(gelatiniform carcinoma), 젤라틴성 암(gelatinous carcinoma), 거대세포 선암(giant cell carcinoma), 거대적혈구 선암(carcinoma gigantocellulare), 샘 암종(glandular carcinoma), 과립막 세포 암(granulosa cell carcinoma), 털기질암종(hair-matrix carcinoma), 혈액 암종(hematoid carcinoma), 간암세포 암종(hepatocellular carcinoma), 허슬세포 암종(Hurthle cell carcinoma), 히알린 암종(hyaline carcinoma), 히알린성 암종(hypemephroid carcinoma), 유아 배아 암종(infantile embryonal carcinoma), 인시추 암종(carcinoma in situ), 표피내 암종(intraepidermal carcinoma), 상피내 암종(intraepithelial carcinoma), 크로페처 암종(Krompecher's carcinoma), 쿨치스키 암종(Kulchitzky-cell carcinoma), 큰 세포 암종(large-cell carcinoma), 수정체 암종(lenticular carcinoma), 수정체양 암종(carcinoma lenticulare), 지방성 암종(lipomatous carcinoma), 림프상피세포성 암종(lymphoepithelial carcinoma), 수질 암종(carcinoma medullare), 수질성 암종(medullary carcinoma), 흑색 암종(melanotic carcinoma), 연성 암종(carcinoma molle), 점성 암종(mucinous carcinoma), 점액분비 암종(carcinoma muciparum), 점액분비성 암종(carcinoma mucocellulare), 점막표피 암종(mucoepidermoid carcinoma), 점막암(carcinoma mucosum), 점액질 암종(mucous carcinoma), 점액종(carcinoma myxomatodes), 상인두암(nasopharyngeal carcinoma), 귀리세포 암(oat cell carcinoma), 화골성 암종(carcinoma ossificans), 유골 선암(osteoid carcinoma), 유두암(papillary carcinoma), 문맥주위 선암(periportal carcinoma), 자궁경부상피내암(preinvasive carcinoma), 극세포 암(prickle cell carcinoma), 반액성 암종(pultaceous carcinoma), 신장의 신세포 암종(renal cell carcinoma of kidney), 저장세포 암종(reserve cell carcinoma), 육종성 암종(carcinoma sarcomatodes), 쉬나이더리안 암종(schneiderian carcinoma), 경암(scirrhous carcinoma), 음낭암(carcinoma scroti), 인환세포 암(signet-ring cell carcinoma), 단순암(carcinoma simplex), 작은 세포 선암(small-cell carcinoma), 원통형 암종(solanoid carcinoma), 타원형 세포 암종(spheroidal cell carcinoma), 방추세포 암종(spindle cell carcinoma), 해면 암종(carcinoma spongiosum), 편평상피암(squamous carcinoma), 편평상피세포 암종(squamous cell carcinoma), 스트링 암종(string carcinoma), 혈관확장 선암(carcinoma telangiectaticum), 혈관확장성 선암(carcinoma telangiectodes), 이행상피 암(transitional cell carcinoma), 결정성 암종(carcinoma tuberosum), 결절성 암종(tuberous carcinoma), 우상암(verrucous carcinoma), 그리고 융모암(carcinoma villosum)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일반적으로, 환경 영향제(environmental influencer)는 어떤한 종양(neoplasm)을 예방적으로 또는 치료적으로 치료하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시예에서, 본 발명의 환경 영향제는 고체 종양을 치료하기 위해 사용된다. 본 발명의 다양한 실시예에서, 환경 영향제(예를 들면 CoQ10)은 피부암[예를 들면, 편평상피세포 암종(squamous cell carcinoma) 또는 기저세포 암종(basal cell carcinoma)], 간암 또는 췌장암, 유방암, 전립선암, 간암 또는 골암(bone cancer)의 다양한 종류를 치료하기 위해 사용된다. 한 실시예에서, 환경 영향제, 예를 들면 CoQ10은, 편평상피세포 암종(SCCIS(in situ) 및 더욱 공격적인 편평상피세포 암종을 포함), 기저세포 암종(얕은, 결정성 및 투과성 기저세포 암종을 포함), 흑색종 및 자외선 각화증(actinic keratosis)을 포함하지만 이로 제한되지 않은 피부 종양적 장애를 치료하기 위해 사용된다. 하지만, 환경 영향제를 사용한 치료는 상기 암으로 제한되지 않는다. 환경 영향제를 사용한 치료를 받아들일 수 있는 암의 예는 뇌, 머리 및 목, 전립선, 유방, 고환, 췌장, 간, 결장(colon), 방광, 신장, 폐, 비소세포성 폐, 흑색종, 중피종(mesothelioma), 자궁, 자궁 경관(cervix), 난소, 육종, 뼈, 위 및 수모세포종(Medulloblastoma)의 암을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 환경 영향제를 사용하여 치료될 수 있는 추가적 암은, 예를 들면 호지킨 질병(Hodgkin's Disease), 비호지킨 림프종(Non-Hodgkin's Lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 신경아종(neuroblastoma), 유방암(breast cancer), 난소암(ovarian cancer), 폐암(lung cancer), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 원발성 혈소판증가증(primary thrombocytosis), 원발성 고분자 글로불린혈증(primary macroglobulinemia), 소세포 폐 종양(small-cell lung tumors), 원발성 뇌종양(primary brain tumors), 위암(stomach cancer), 결장암(colon cancer), 악성 췌장 인슐린종(malignant pancreatic insulanoma), 악성 암양종(malignant carcinoid), 비뇨기 방광암(urinary bladder cancer), 전암 피부 병변(premalignant skin lesions), 고환암(testicular cancer), 림프종(lymphomas), 갑상선 암(thyroid cancer), 신경아종(neuroblastoma), 식도암(esophageal cancer), 요생식로암(genitourinary tract cancer), 악성 고칼슘혈증(malignant hypercalcemia), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 부신피질암(adrenal cortical cancer), 그리고 전립선암(prostate cancer)을 포함한다. 한 실시예에서, 환경 영향제, 예를 들면 CoQ10을 사용하여 치료될 수 있는 종양적 장애 또는 암은 흑색종이 아니다.
여기서 사용되는 암세포의 정의는 혐기성 당분해(anaerobic glycolysis) (예를 들면, 당분해 후 시토졸에서 젖산 발효가 일어남), 호기성 당분해(aerobic glycolysis) (예를 들면 당분해 후 미토콘드리아에서 피루브산(pyruvate)의 산화가 일어남), 또는 혐기성 당분해 및 호기성 당분해의 혼합에 의해 에너지를 생산하는 암세포를 포함하려는 의도를 갖는다. 하나의 실시예에서, 암세포는 우선적으로 혐기성 당분해에 의해서 에너지를 생산한다(예를 들면, 세포 에너지의 최소 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상은 혐기성 당분해에 의해 생산된다). 하나의 실시예에서, 암세포는 우선적으로 호기성 당분해에 의해 에너지를 생산한다(예를 들면, 세포 에너지의 최소 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상은 호기성 당분해에 의해 생산된다). 또한, 여기서 사용되는 암세포의 정의는 암세포 집단 및 혐기성 당분해에 의해 에너지를 생산하는 세포 및 호기성 당분해에 의해 에너지를 생산하는 세포를 포함하는 암세포의 혼합물을 포함한다. 하나의 실시예에서, 암세포 집단은 우선적으로 혐기성 당분해에 의해서 에너지를 생산한다(예를 들면, 상기 집단에서 최소 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 세포는 혐기성 당분해에 의해 에너지를 생산한다). 하나의 실시예에서, 암세포 집단은 우선적으로 호기성 당분해에 의해 에너지를 생산한다(예를 들면, 상기 집단의 최소 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 세포).
여기서 사용되는 것과 같이, "포도당의 혐기성 사용(anaerobic use of glucose)" 또는 "혐기성 당분해(anaerobic glycolysis)"는 당분해 후 시토졸(cytosol)에서의 젖산 발효에 의한 세포의 에너지 생산을 의미한다. 예를 들면, 많은 암세포는 혐기성 당분해에 의해 에너지를 생산한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "포도당의 호기성 사용(aerobic use of glucose)" 또는 "미토콘드리아 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation)"는 당분해 후 미토콘드리아에서 피루브산의 산화과정에 의한 세포 에너지 생산을 의미한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "포도당의 혐기성 사용을 차단할 수 있는(capable of blocking anaerobic use of glucose) 및 미토콘드리아 산화적 인산화의 증가(augmentating mitochondiral oxidative phosphorylation)"의 표현은 혐기성 당분해로부터 호기성 당분해 또는 미토콘드리아 산화적 인산화로 세포의 대사상태를 옮기거나 또는 변화시키도록 유도하는, 환경 영향제(예를 들면, 외대사성 변환인자; epimetabolic shifter)의 능력을 의미한다.
또한, 본 발명은 인간에서 공격적인 종양적 장애(aggressive oncological disorder)을 진단하기 위한 방법을 제공하고, 이는 덜 공격적인 또는 비공격적인 종양적 장애에 대해 사용되거나 또는 선별된 용량 용법(dosage regimen)보다 낮게 선별된 복용량(dose)으로 환경 영향제를 인간에게 투여하는 것을 포함함으로써, 공격적인 종양적 장애를 진단한다. 관련된 측면에서, 본 발명은 인간에서 비공격적인 종양적 장애(non-aggressive oncological disorder)을 진단하는 방법을 제공하고, 이는 공격적인 종양적 장애에 대해 사용되거나 또는 선별된 용량 용법(dosage regimen)보다 높게 선별된 복용량(dose)으로 환경 영향제를 인간에게 투여하는 것을 포함함으로써, 비공격적인 종양적 장애를 진단한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "공격적(인) 종양적 장애(aggressive oncological disorder)"은 빠르게 성장하는 종양과 연관된 종양적 장애를 의미한다. 전형적으로, 공격적인 종양적 장애는 치료적 치료(therapeutic treatment)에 대해 반응하지 않거나 또는 매우 낮은 수준으로 반응한다. 공격적인 종양적 장애의 예는 췌장암종(pancreatic carcinoma), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 유윙 육종(Ewing's sarcoma), 전이성 유방암(metastatic breast cancer), 전이성 흑색종(metastatic melanoma), 뇌암[성상세포종(astrocytoma), 교아세포종(glioblastoma)], 신경 내분비 암(neuroendocrine cancer), 결장암(colon cancer), 폐암(lung cancer), 골육종(osteosarcoma), 안드로겐-비의존적 전립선암(androgen-independent prostate cancer), 난소암(ovarian cancer) 및 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's Lymphoma)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
여기서 사용되는 것과 같이, "비공격적(인) 종양적 장애(non-aggressive disorder)"이라는 용어는 천천히 성장하는 종양에 연관된 종양적 장애를 의미한다. 전형적으로, 비공격적인 종양적 장애는 치료적 치료에 대해 순조롭게(favorably) 또는 중간 수준으로(moderately) 반응한다. 비공격적인 종양적 장애의 예는 비전이성 유방암(non-metastatic breast cancer), 안드로겐-의존적 전립선암(androgen-dependent prostate cancer), 소세포성 폐암(small cell lung cancer) 및 급성 림프구 백혈병(acute lymphocytic leukemia)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 하나의 실시예에서, 비공격적인 종양적 장애는 공격적인 종양적 장애가 아닌 모든 종양적 장애를 포함한다.
I . 환경 영향인자
본 발명은 환경 영향인자의 투여로 종양학적 장애를 치료하는 방법을 제공한다. "환경 영향인자"(env-영향인자)는 인간의 질병 환경에 유익한 방향으로 영향을 주거나 조절하는 분자로서 인간의 질병 환경을 정상 또는 건강한 환경으로 전환, 원래대로 재확립 또는 유지하여 정상 상태를 유도한다. env-영향인자는 하기 정의된 바와 같은 다차원 세포내 분자(Multidimensional Intracellular Molecules, MIMs) 및 외대사성 변환 인자(Epimetabolic shifters, Epi-shifters)를 포함한다.
1. 다차원 세포내 분자( MIM )
용어 "다차원 세포내 분자(MIM)"은 인간의 최소 하나의 세포에 존재하고/거나 신체에 의해 자연적으로 생성되는 내생 분자의 분리된 형태 또는 합성을 통해 생산된 형태이다. MIM은 하나 또는 그 이상의, 둘 또는 그 이상의, 셋 또는 그 이상의, 또는 하기 기능 모두에 의해 특징지워진다. MIM은 세포로 들어갈 수 있고, 분자의 생물학적으로 활성이 있는 부분이 모두 세포로 들어가는 한, 세포로의 도입은 세포내로의 완전한 또는 부분적 도입을 포함한다. MIM은 세포내에서 신호 전달 및/또는 유전자 발현 메커니즘을 유도할 수 있다. MIM은 분자가 치료적 및 담체, 예컨대 약물 전달, 효과 모두를 갖는 점에서 다차원적이다. MIM은 또한 분자가 질병 상태에서 한 방향으로 작용하고, 정상 상태에서 상이한 방향으로 작용하는 면에서 다차원적이다. 예를 들면, CoQ10의 경우, VEGF 존재하에 CoQ10을 흑색종 세포에 투여하면 Bcl2의 수준이 감소하게 되며, 결국 흑색종 세포에 대해서 종양발생의 잠재력이 감소하게 된다. 반대로, 정상 섬유아세포에서, CoQ10 및 VEGF를 공동 투여하면 Bcl2 수준에 영향을 미치지 않는다. 바람직하게는, MIM은 질병 상태의 세포에 선택적으로 작용하고, 정상 상태의 (매칭) 세포에 실질적으로 영향을 주지 않는다. 바람직하게는, MIM은 표현형, 대사 상태, 유전형, mRNA/단백질 발현 수준 등에 있어서 질병 상태의 세포기 (매칭) 정상 상태 세포에 근접하게 만든다.
일 실시양태에서, MIM은 외-변환 인자일 수도 있다. 또 다른 실시양태에서, MIM은 외-변환 인자가 아니다. 기술자는 본 발명의 MIM이 두 개 또는 그 이상의 내싱 분자의 혼합물을 포함하는 것을 의도한다는 점을 또한 이해할 것이며, 여기에서 혼합물은 하나 또는 그 이상의 앞서 언급한 기능에 의해 특징지워진다. 혼합물 중의 내생 분자는 혼합물이 MIM으로서 기능하는 비율로 존재한다.
MIM은 지질 기반 또는 비-지질 기반 분자일 수 있다. MIM의 예로는, 이로 제한되는 것은 아니나, CoQ10, 아세틸 Co-A, 팔미틸 Co-A, L-카르니틴, 아미노산, 예컨대 티로신, 페닐알라닌 및 시스테인을 포함한다. 일 실시양태에서, MIM은 소분자이다. 본 발명의 일 실시양태에서, MIM은 CoQ10이 아니다. MIM은 이 기술분야의 기술자가 여기에 상세히 기재된 임의의 분석방법을 사용하여 루틴하게 확인할 수 있다.
어떤 실시양태에서, MIM은 비타민 B 패밀리의 화합물, 또는 비타민 B 패밀리의 화합물을 포함하는 뉴클레오사이드, 모노뉴클레오티드 또는 디뉴클레오티드를 포함한다. 비타민 B 패밀리의 화합물은, 예를 들면 티아민(비타민 B1), 니아신(티코틴 산 또는 비타민 B3로도 알려진), 또는 피리독신(비타민 B6)뿐만 아니라 프로비타민 예컨대 판테놀(프로비타민 B5)를 포함한다. 어떤 실시양태에서, MIM은 티아민, 니아신 및 피리독신으로부터 선택된다. 비타민 B 패밀리의 화합물을 포함하는 뉴클레오사이드, 모노뉴클레오티드 또는 디뉴크렐오티드는 예를 들면, 아데닌 또는 니아신(니코틴산) 분자를 포함하는 뉴클레오사이드, 모노뉴클레오티드 또는 디뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 실시양태에서, MIM은 아데노신, 아데노신 디포스페이트(ADP), 플라빈 아데노신 디뉴클레오티드(FAD, 비타민 B 및 ADP의 부분을 포함하는) 및 니코틴산 디뉴클레오티드로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, MIM은 아미노산을 포함한다. 아미노산의 예로는, 예컨대 티로신(예컨대 L-티로신), 시스테인, 페닐알라닌(예컨대 L-페닐알라닌) 및 알라닌을 포함한다. 어떤 실시양태에서, 아미노산은 페닐알라닌 또는 알라닌이다. 어떤 실시양태에서, MIM은 아미노산 유도체 예컨대 4-히드록시페닐피루베이트 또는 아세틸글리신을 포함한다.
어떤 실시양태에서, MIM은 글루코스 아날로그이며, 예컨대 글루코스 분자에서 한 -OH 또는 -CH2OH 치환체가 -COOH, -COO- 또는 -NH2 치환체로 대체된 글루코스 분자이다. 글루코스 아날로그의 예로는 글루코사민, 글루큐론산, 글루큐로니드 및 글루큐로네이트를 포함한다.
어떤 실시양태에서, MIM은 화학식 (I)의 화합물로부터 선택된다:
Figure 112011097936842-pct00001
(I)
여기에서
n은 0 또는 1의 정수이고;
R1, R2, R3 및 R4은 만약 존재한다면, 각각 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되거나, R1 및 R2는 그들이 부착된 곳 상의 탄소와 함께 카르보닐 (C=O)기를 형성하며;
W는 -COOH 또는 -N(CH3)3 +이고;
X는 수소이며, 음전하 또는 알칼리 금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 이다.
n이 0일 때, CHR3기는 W 치환기에 결합되는 것으로 이해된다.
어떤 실시양태에서, W는 -N(CH3)3 +이다. 어떤 실시양태에서, MIM은 카르니틴, 예컨대 L-카르니틴이다.
어떤 실시양태에서, MIM은 디카르복실산이다. 어떤 실시양태에서 W는 -COOH이다. 어떤 실시양태에서 R3은 수소이다. 어떤 실시양태에서 n은 0이다. 어떤 실시양태에서 R1 및 R2은 각각 독립적으로 수소이다. 어떤 실시양태에서, W는 -COOH이고, R3는 수소이며, n은 0이고, R1 및 R2은 각각 독립적으로 수소이다. 어떤 실시양태에서 n은 1이다. 어떤 실시양태에서 R1 및 R2은 그것들이 부착된 탄소와 함께 카르보닐(C=O)기를 형성한다. 어떤 실시양태에서, R4는 수소이다. 어떤 실시양태에서, R4는 히드록실이다. 어떤 실시양태에서, W는 -COOH이고, R3는 수소이며, n은 1이고, R1 및 R2는 그것들이 부착된 탄소와 함께 카르보닐(C=O)기를 형성한다.
어떤 실시양태에서, MIM은 크렙 사이클의 중간체이고, 과량은 크렙 사이클이 생산적인 산화적 인산화로 가도록 한다. MIM인 예시적 크렙 사이클 중간체로는 숙신산 또는 숙시네이트, 말산 또는 말레이트 및 α-케토글루타르산 또는 α-케토글루타레이트를 포함한다.
어떤 실시양태에서, MIM은 CoQ10의 생체 단위체(building block)이며, 하기 구조를 갖는다:
Figure 112011097936842-pct00002
.
따라서, CoQ10의 생체 단위체는 이로 제한되는 것은 아니나, 페닐알라닌, 티로신, 4-히드록시페닐피루베이트, 페닐아세테이트, 3-메톡시-4-히드록시만델레이트, 바닐산, 4-히드록시벤조에이트, 메발론산, 파네실, 2,3-디메톡시-5-메틸-p-벤조퀴논뿐만 아니라 이들의 상응하는 산 또는 이온을 포함한다. 어떤 구체예에서, MIM은 페닐알라닌, 티로신, 4-히드록시페닐피루베이트, 페닐아세테이트 및 4-히드록시벤조에이트로부터 선택된다.
(i) MIM 을 감별하는 방법
본 발명은 MIM을 확인하기 위한 방법을 제공한다. MIM을 확인하기 위한 방법은 일반적으로 내생 분자의 세포로 외생적 첨가 및 세포에서, 내생 분자가 제공하는, 예컨대 세포 미소환경 프로파일에서의 효과의 평가를 포함한다. 세포 미소환경 프로파일에서의 변화를 확인하기 위하여 세포에서의 효과가 하나 또는 그 이상의 세포성, mRNA, 단백질, 지질, 그리고/또는 대사성 수준에서 평가된다. 일 실시양태에서, 세포는 배양된 세포, 예컨대 in vitro이다. 일 실시양태에서, 세포는 기관에 존재한다. 내생 분자는 단일 농도로 세포에 첨가될 수 있거나 농도 범위 이상으로 세포에 첨가될 수 있다. 일 실시양태에서, 미처리된 세포, 대조군의 내생 분자 수준과 비교하였을 때 내생 분자는 세포에 첨가되어 세포에서 내생 분자의 수준이 (예컨대 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배 또는 그 이상까지) 증가한다.
예컨대 임의의 하나 또는 그 이상의 형태적, 생리적, 그리고/또는 조성물 (예컨대 mRNA, 단백질, 지질, 대사성)의 변화에 의해 검출되는 세포에서 변화를 유도하는 분자는 만약 세포 미소환경 프로파일에 대해 유도된 변화가 질병이 있는 세포 상태 및 정상 세포 상태에서 상이한지를 결정하기 위하여 또한 평가될 수 있다. 다양한 조직 기원의 세포(예컨대 세포 배양 주), 세포 형태 또는 질병이 있는 상태는 비교 평가로 평가될 수 있다. 예를 들면, 암 세포의 세포 미소환경 프로파일에서 유도된 변화는 비-암화 또는 정상 세포에서 유도된 변화와 비교될 수 있다. 정상 세포와 비교하였을 때, 세포의 미소환경 프로파일에 있어서 변화를 유도하는 것 및/또는 질병이 있는 세포의 미소환경 프로파일에 있어 별도로 (예컨대, 우선적으로) 변화를 유도하는 것으로 관찰되는 내생 분자 (예컨대 세포의 형태적, 생리적 및/또는 조성물, 예컨대 mRNA, 단백질, 지질 또는 대사성의 변화를 유도하는 것)은 MIM으로 구분된다.
본 발명의 MIM은 지질 기반 MIM 또는 비-지질 기반 MIM일 수 있다. 지질 기반 MIM을 확인하기 위한 방법으로 상기-기재된 세포 기반 방법을 포함하며, 지질 기반 내생 분자가 세포로 외생적으로 첨가된다. 바람직한 실시양태에서, 지질 기반 내생 분자는 지질 기반 내생 분자가 세포에서 상승하는 수준으로 세포에 첨가된다. 일 실시양태에서, 지질 기반 내생 분자의 수준은 미처치 대조군 세포에서의 수준에 비하여 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배 또는 그 이상까지 증가된다. 지질 기반 분자의 세포로의 제형화 및 전달은 각 테스트 분자의 특성에 달려있으나, 이 기술분야에 많은 방법이 알려져 있다. 지질 기반 분자의 제형화 및 전달 모드의 예로는, 이로 제한되는 것은 아니나, 공동-용매(co-solvent), 담체 분자, 리포좀, 분산제제, 현탁화제, 나노입자 분산제제, 에멀젼, 예컨대 수중유형 또는 유중수형 에멀젼, 다중상 에멀젼, 예컨대 유중수중유형 에멀젼, 폴리머 포착 및 캡슐화에 의한 가용화를 포함한다. 지질 기반 MIM의 세포로의 전달은 세포 지질의 추출 및 이 기술분야에 알려진 루틴한 방법, 예컨대 질량 분석기로 MIM을 정량함으로써 확인될 수 있다.
비-지질 기반 MIM을 확인하기 위한 방법은 상기-기재된 세포 기반 방법을 포함하며, 비-지질 기반 내생 분자는 세포로 외생적으로 첨가된다. 바람직한 실시양태에서, 비-지질 기반 내생 분자는 비-지질 기반 내생 분자 수준이 세포에서 상승되는 수준으로 세포에 첨가된다. 일 실시양태에서 비-지질 기반 내생 분자의 수준은 미처리 대조군 세포에서의 수준에 비하여 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배 또는 그 이상까지 상승한다. 비-지질 기반 분자의 세포로의 제형화 및 전달은 각 테스트 분자의 특성에 달려있으나, 이 기술분야에 많은 방법이 알려져 있다. 비-지질 기반 분자의 제형화 및 전달 모드의 예로는, 이로 제한되는 것은 아니나, 공동-용매(co-solvent), 담체 분자, 능동수송, 폴리머 포착 또는 흡착, 폴리머 이식, 리포조말 캡슐화로 로 가용화하는 것 및 표적화된 전달 시스템과 함께 제형화하는 것을 포함한다. 비-지질 기반 MIM의 세포로의 전달은 세포 내용물의 추출 및 이 기술분야에 알려진 루틴한 방법, 예컨대 질량 분석기로 MIM을 정량함으로써 확인될 수 있다.
2. 외대사성 변환 인자( Epimetabolic Shifters , Epi - shifters )
여기 사용된 바와 같은 "외대사성 변환 인자"(외-변환 인자)는 건강(또는 정상) 상태로부터 질병이 있는 상태로의 대사 변환 및 그 반대를 조절하는 (내생적 또는 외생적) 분자이며, 그럼으로써 인간의 세포성, 조직, 기관, 시스템 및/또는 숙주 건강을 유지 또는 재확립할 수 있다. 외-변환 인자는 조직 미소환경의 정상화를 유발할 수 있다. 예를 들면, 외-변환 인자는 세포에 첨가되거나 세포로부터 고갈될 때, 세포의 미소환경(예컨대 대사 상태)에 영향을 줄 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 기술자는 본 발명의 외-변환 인자가 두 개 또는 그 이상의 분자의 혼합물을 포함하는 것을 또한 의도한다는 점을 이해할 것이며, 여기에서 혼합물은 앞서 언급한 하나 또는 그 이상의 기능에 의해 특징지워진다. 혼합물에 있어서 분자는 혼합물이 외-변환 인자로 기능하는 비율로 존재한다. 외-변환 인자의 예로는, 이로 제한되는 것은 아니나 CoQ10; 비타민 D3; ECM 구성요소 예컨대 피브로넥틴; 면역조절자, 예컨대 TNFα 또는 임의의 인터루킨, 예컨대 IL-5, IL-12, IL-23; 신생혈관신생 인자(angiogenic factors); 및 세포사멸 인자를 포함한다.
어떤 실시양태에서, 외-변환 인자는 예컨대 크렙 사이클에서 하나 또는 그 이상의 반응을 촉매하는데 직접적으로 참여하거나 과량인 경우 크렙 사이클로 가도록 만드는 크렙 사이클 대사성을 생성하는 효소와 같은 효소이다. 어떤 실시양태에서, 효소는 펜토오즈 포스페이트 경로, 예컨대 트랜스알돌라아제, 또는 트랜스케톨라아제의 비-산화 상(non-oxidative phase)의 효소이다. 다른 실시양태에서, 효소는 크렙 사이클을 촉진하는 구성성분 효소 또는 효소 복합체이며, 예컨대 합성효소 또는 리가아제이다. 예시적 효소로는 숙시닐 CoA 합성효소 (크렙 사이클 효소) 또는 피루베이트 카르복실라아제 (피루베이트의 가역적 카르복실화를 촉매하여 올살로아세테이트(OAA), 크렙 사이클의 대사성을 형성하는 리가아제)를 포함한다.
어떤 실시양태에서, 외-변환 인자는 CoQ10의 생체 단위체이다. CoQ10의 생체 단위체는, 이로 제한되는 것은 아니나, 페닐알라닌, 티로신, 4-히드록시페닐피루베이트, 페닐아세테이트, 3-메톡시-4-히드록시 만엘레이트, 바닐산, 4-히드록시벤조에이트, 메발론산, 파네실, 2,3-디메톡시-5-메틸-p-벤조퀴논뿐만 아니라 이들의 상응하는 산 또는 이온을 포함한다. 어떤 실시양태에서, 외-변환 인자는 페닐알라닌, 티로신, 4-히드록시페닐피루베이트, 페닐아세테이트 및 4-히드록시벤조에이트로부터 선택된다.
어떤 실시양태에서, 외-변환 인자는 비타민 B 패밀리의 화합물이다. 비타민 B 패밀리의 화합물로는, 예를 들면 리보플라빈(비타민 B2), 또는 이들의 아날로그를 포함한다. 외-변환 인자는 또한 임의의 아날로그 또는 프로-드럭을 포함하는데, 이들은 in vivo에서 여기 기재된 것과 같은 임의의 내생적 MIM으로 대사될 수 있다.
일 실시양태에서, 외-변환 인자는 또한 MIM이다. 일 실시양태에서, 외-변환 인자는 CoQ10이 아니다. 외-변환 인자는 이 기술분야의 기술자에 의해 여기 상세히 기재된 임의의 분석방법을 사용하여 루틴하게 확인될 수 있다.
(i) 외-변환 인자를 확인하는 방법
외대사성 변환 인자(외-변환 인자)는 세포의 대사 상태를 조절할 수 있는 분자이며, 예컨대 건강(또는 정상) 상태로부터 질병이 있는 상태로의 대사 변환 및 그 반대를 유도하며, 그럼으로써 인간의 세포성, 조직, 기관, 시스템 및/또는 숙주 건강을 유지 또는 재확립할 수 있다. 본 발명의 외-변환 인자는 따라서 질병이 있는 상태의 진단학적 평가에 있어 유용성을 갖는다. 본 발명의 외-변환 인자는 또한 치료적 적용에 있어 유용성을 갖는데, 여기에서 외-변환 인자의 적용 또는 투여 (또는 다른 치료적 분자에 의한 외-변환 인자의 조정)는 조직의 미소환경 및 질병이 있는 상태의 정상화에 영향을 준다.
외대사성 변환 인자의 확인은 일반적으로 차별적인 질환 상태, 진행 또는 공격성을 나타내는 세포 또는 조직의 패널에 대한 예컨대 대사성, 지질, 단백질 또는 RNA (개개의 프로파일로서 또는 배합으로서)의 분자 프로파일의 확립을 포함한다. 수준의 변화 (예컨대, 증가되거나 감소된 수준)가 질환 상태, 진행 또는 공격성과 관련되어 있는 분자가 잠재적 외-변환 인자로 구분된다.
일 실시양태에서, 외-변환 인자는 또한 MIM이다. 잠재적 외-변환 인자는 이 기술분야에 알려진 임의의 다수의 루틴한 기술을 사용함으로써, 그리고 여기에 기재된 임의의 방법을 사용함으로써, 세포로 외생적으로 첨가하여 세포로 들어가는 능력을 평가할 수 있다. 예를 들면, 잠재적 외-변환 인자의 세포로의 도입은 세포 내용물의 추출 및 이 기술분야에 알려진 루틴한 방법, 예컨대 질량 분석기에 의한 잠재적 외-변환 인자의 정량에 의해 확인될 수도 있다. 세포로 들어갈 수 있는 잠재적 외-변환 인자는 그럼으로써 MIM으로서 확인된다.
외-변환 인자를 확인하기 위하여, 잠재적 외-변환 인자는 그 다음으로 세포의 대사 상태를 변환시키는 능력에 대해 평가된다. 잠재적 외-변환 인자의 세포 미소환경의 대사 상태를 변환시키는 능력은 잠재적 외-변환 인자를 세포로 도입함으로써(예컨대 외생적으로 첨가) 및 하나 또는 그 이상의 유전자 발현에 있어서의 변화(예컨대 mRNA 또는 단백질 발현상의 변화), 지질 또는 대사성 수준에 있어서의 농도 변화, 그리고/또는 미토콘드리아 기능 또는 개수에 있어서의 변화를 모니터링함으로써 평가된다. 세포 미소환경의 대사 상태를 변환시킬 수 있는 잠재적 외-변환 인자는 여기 상세히 기재된 임의의 분석방법을 사용하여 이 기술분야의 기술자에 의해 루틴하게 확인될 수 있다. 잠재적 외-변환 인자는 또한 정상 건강 상태쪽으로 (또는 역으로, 질병이 있는 상태쪽으로 정상 세포의 대사 상태가 변환되는 능력에 대하여) 질병이 있는 세포의 대사 상태가 변환되는 능력이 측정된다. 정상 건강 상태쪽으로 질병이 있는 세포의 대사 상태가 변환될 수 있는 (또는 질병이 있는 상태쪽으로 건강한 정상 세포의 대사 상태가 변환될 수 있는) 잠재적 외-변환 인자는 따라서 외-변환 인자로 확인된다. 바람직한 실시양태에서, 외-변환 인자는 정상 세포의 건강 및/또는 성장에 부정적으로 영향을 주지 않는다.
본 발명의 외대사성 변환 인자는, 이로 제한되는 것은 아니나, 소분자 대사성, 지질-기반 분자 및 단백질 및 RNA를 포함한다. 소분자 내생 대사성 클래스에서 외대사성 변환 인자를 확인하기 위하여, 차별적 질환 상태, 진행 또는 공격성을 나타내는 세포 또는 조직의 패널에 대한 대사성 프로파일이 확립된다. 각 세포 또는 조직에 대한 대사성 프로파일은 세포 또는 조직으로부터 대사성을 추출하고, 그 후 예를 들면 질량분석기와 결합된 액상-크로마토그래피 또는 질량분석방법과 결합된 가스-크로마토그래피를 포함하는, 기술자에게 알려진 루틴한 방법을 사용하여 대사성을 확인하고 정량함으로써 결정된다. 수준의 변화(예컨대 증가되거나 감소된 수준)가 질환 상태, 진행 또는 공격성과 관련되어 있는 대사성이 잠재적 외-변환 인자로 구분된다.
내생 지질-기반 분자 클래스에서 외대사성 변환 인자를 확인하기 위하여, 차별적 질환 상태, 진행 또는 공격성을 나타내는 세포 또는 조직의 패널에 대한 지질 프로파일이 확립된다. 각 세포 또는 조직에 대한 지질 프로파일은 지질 추출 방법, 그 후 기술자에게 알려진 루틴한 방법, 예를 들면 질량분석기와 결합된 액상-크로마토그래피 또는 질량분석 방법과 결합된 가스-크로마토그래피를 사용하여 지질을 확인 및 정량함으로써 결정된다. 수준의 변화(예컨대, 벌크 또는 트레이스 수준에 있어서의 증가 또는 감소)가 질환 상태, 진행 또는 공격성과 관련되어 있는 지질이 잠재적 외-변환 인자로 구분된다.
단백질 및 RNA 클래스에서 외대사성 변환 인자를 확인하기 위하여, 차별적 질환 상태, 진행 또는 공격성을 나타내는 세포 또는 조직의 패널에 대한 유전자 발현 프로파일이 확립된다. 각 세포 또는 조직에 대한 발현 프로파일은 표준 프로테오믹스, mRNA 어레이, 또는 유전적 어레이 방법, 예컨대 여기 상세히 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 mRNA 및/또는 단백질 수준에서 결정된다. 발현의 변화(예컨대, mRNA 또는 단백질 수준에 있어서의 발현의 증가 또는 감소)가 질환 상태, 진행 또는 공격성과 관련되어 있는 유전자가 잠재적 외-변환 인자로 구분된다.
일단 (예컨대 용해되는 대사성, 지질-기반 분자, 단백질, RNA 또는 기타 조성물의 생물학적 클래스에 대해) 상기 기재된 분자 프로파일이 확립되면 세포 환경에서 확인된 잠재적 외-변환 인자 사이의 알려진 관련성을 설명하기 위하여 세포성 및 생화학적 경로 분석이 수행된다. 이러한 세포성 및/또는 생화학적 경로 분석을 통해 수득된 정보는 경로 및 잠재적 외-변환 인자를 카테고리화하기 위하여 사용될 수 있다.
질환 상태를 조절하기 위한 외-변환 인자의 사용은 여기 상세히 기재되거나 이 기술분야에 알려진 임의의 많은 수의 분석방법을 사용하여 이 기술분야의 기술자에 의해 더욱 평가되고 확인될 수 있다. 질환 상태를 조절하기 위한 외-변환 인자의 사용은 외-변환 인자를 세포 또는 기관으로 직접적으로 외생적으로 전달함으로써 평가될 수 있다. 질환 상태를 조절하기 위한 외-변환 인자의 사용은 외-변환 인자(예컨대 외-변환 인자의 수준 또는 활성)를 직접 조절하는 분자의 발달로써 선택적으로 평가될 수 있다. 질환 상태를 조절하기 위한 외-변환 인자의 사용은 다른 분자들, 예컨대 외-변환 인자와 동일한 경로에 위치하는 유전자(예컨대 RNA 또는 단백질 수준에서 조절되는)와 같은 다른 분자를 조절함으로써 외-변환 인자(예컨대 외-변환 인자의 수준 또는 활성)를 간접적으로 조절하는 분자의 발달에 의해 측정될 수도 있다.
여기 기재된 외대사성(Epimetabolomic)적 접근은 세포 미소환경에 존재하는 내생 분자의 확인을 촉진하며, 그 수준은 유전적, mRNA 또는 단백질-기반 메커니즘을 통해 감지되고 컨트롤된다. 본 발명의 외-변환 인자에 의해 촉발되는 정상 세포에서 발견되는 조절 반응 경로는 불완전 조절(misregulated) 또는 질병에 걸린 세포 환경에서 치료적 값을 제공할 것이다. 또한, 여기 기재된 외대사성 접근은 임상 환자 선택, 질환 진단 키트에 사용되기 위한 진단 지표 또는 예후 지표로서 제공될 수 있는 외-변환 인자를 확인한다.
II . MIM / Epi -변환 인자를 확인하기에 유용한 시험법
관심있는 분자 및 화합물을 분리하고 확인하기 위해 사용된 본 발명의 기술과 방법은 액체 크로마토그래피(LC), 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 질량 분석법(MS), 가스 크로마토그래피(GC), 액체 크로마토그래피/질량 분석법(LC-MS), 가스 크로마토그래피/질량 분석법(GC-MS), 핵자기 공명법(NMR), 자기공명 이미지(MRI), 푸리에 트랜스폼 적외선법(FT-IR) 및 유도 결합 플라즈마 분석기(ICP-MS)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 질량 분석 기술은 자기 섹터 및 이중 초점 기기, 4중 극자 투과 기기, 4중 극자 이온-트랩 기기, 비행-시간 기기(TOF), 푸리에 트랜스폼 이온 사이클로트론 공명 기기(FT-MS) 및 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행-시간 질량 분석기(MALDI-TOF MS)의 사용을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
생체에너지 분자 수준의 정량화
환경 영향 인자(예를 들면, MIMs 또는 Epi-변환 인자)는 후보 epi-변환 인자가 적용되었을 때, 세포의 세포내 생체에너지 분자(예를 들면, ATP, 피루베이트, ADP, NADH, NAD, NADPH, NADP, 아세틸CoA, FADH2)의 수준 변화에 의해 확인될 수 있다. 생체에너지 분자 수준의 예시화된 시험법으로 발색, 형광 및/또는 생체인광(biolμMinescent)에 기반한 방법을 사용한다. 그러한 시험법의 예는 하기에 제공된다.
세포내 ATP의 수준은 다양한 시험법 및 공지의 시스템에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 한 시스템에서 용해된 세포로부터 나오는 세포질 ATP은 루시페린과 효소 루시퍼라제와 반응하여 빛을 생산한다. 이러한 생체 인광은 생체인광분석기에 의해 측정되며, 용해된 세포의 세포내 ATP 농도는 계산될 수 있다 (EnzyLightTM ATP Assay Kit (EATP-100), BioAssay Systems, Hayward, CA). 또 다른 시스템에서, 예를 들어, ATP와 이의 탈인산화된 형태인 ADP 모두는 생체 인광법에 의해 계산될 수 있는데; ATP 수준이 계산된 후에, ADP는 ATP로 변환되고 이후 검출되며 동일한 루시퍼라제 시스템(ApoSENSORTM ADP/ATP Ratio Assay Kit, BioVision Inc., Mountain View, CA)을 사용하여 계산된다.
피루베이트는 세포내 대사 경로에서 중요한 중간체이다. 피루베이트는 글루코스신생합성(glucogenesis)을 거쳐 탄수화물로 변환될 수 있으며, 세포내 대사 상태에 의존하여, 지질산으로 변환되거나 아세틸 CoA를 거쳐 대사되거나 또는 알라닌 또는 에탄올로 변환된다. 따라서, 피루베이트 수준의 검출은 세포 표본의 대사 활성과 상태 측정에 제공된다. 피루베이트를 검출하는 하나의 시험법은, 예를 들면, 발색 및 형광 모두를 사용하여 다른 범위 내의 피루베이트 농도를 검출하는 것(EnzyChromTM 피루베이트 분석 키트 (Cat# EPYR-100), BioAssay Systems, Hayward, CA)이다.
환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-변환 인자)는 세포내 미토콘드리아에 의해 수행되는, 세포내 생체에너지 분자의 생성 및 유지와 관련된 산화적 인산화 과정에 영향을 줄 수 있다. 세포 배양물 및 표본에서 직접적으로 세포 에너지의 변화를 검출하는 시험법(이하 기술)에 더하여, 세포내 미토콘드리아 복합체와 효소에 별개로 미치는 화합물의 영향을 검출하고 정량화하는 시험법이 존재한다. 예를 들어, MT-OXC MitoToxTM완전 OXPHOS 활성 시험법 (MitoSciences Inc., Eugene, OR) 은 미토콘드리아로부터 추출된 복합체 I 내지 V에 직접적으로 적용된 화합물의 영향을 검출하고 정량화할 수 있다. NADH 탈수소효소(복합체 I), 시토크롬 c 산화효소(복합체 IV) 및 ATP 합성효소(복합체 V)와 같은 개별적인 미토콘드리아 복합체에 미치는 영향의 검출 및 정량화를 위한 시험법이 또한 활용될 수 있다 (MitoSciences Inc., Eugene, OR).
세포 에너지의 측정
환경 변환 인자(예를 들면, MIM 또는 epi-변환 인자)는 또한 세포 에너지의 변화에 의해 확인될 수 있다. 세포 에너지 측정의 한 예는 분자성 산소의 소비 및/또는 세포 배양 배지의 pH 변화를 실시간으로 측정하는 것이다. 예를 들어, 잠재적인 epi-변환 인자가 세포의 대사 상태를 조절하는 능력은 예를 들면, XF24 분석기(Seahorse, Inc.)을 사용하여 분석될 수 있다. 이러한 기술은 세포 미소환경의 생체 에너지를 평가하기 위하여, 세포 단일층 내 산소 및 pH 변화의 실시간 검출을 허용한다. XF24 분석기는 세포 에너지에 있어 주요 지시자에 해당하는, 호기성 대사의 측정값인 산소 소비율(OCR)과 당분해의 측정값인 세포외 산성화(ECAR) 모두를 측정하고 비교한다.
산화적 인산화와 미토콘드리아 기능의 측정
산화적 인산화는 미토콘드리아 막 내 묻혀진 단백질 복합체를 거쳐 진핵 세포내에서 수행되는 영양 화합물의 산화를 거쳐 ATP가 생성되는 과정이다. 대부분의 유기체의 세포내에서 ATP의 주요 원천으로서, 산화적 인산화 활성의 변화는 강력하게 세포내 대사 및 에너지 균형을 변화시킬 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-변환 인자)는 산화적 인산화에 대한 이들의 영향에 의해 검출되고/되거나 확인될 수 있다. 일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-변환 인자)는 이에 제한되는 것은 아니나, 전자 전달 사슬 및 ATP 합성을 포함하는 산화적 인산화의 구체적인 측면에 대한 이들의 영향을 검출되거/되거나 확인될 수 있다.
산화적 인산화와 관련된 과정을 수행하는 미토콘드리아의 막 내 단백질 복합체는 특별한 작업을 수행하고, 이는 I, II, III 및 IV로 번호 붙여진다. 이들 복합체는 트래스-내부 막 ATP 합성효소(복합체 V로 알려짐)를 따르는, 산화적 인산화 과정과 관련된 주요 대상(entity)이다. 일반적으로 미토콘드리아 기능, 특히 산화적 인산화 과정에 미치는 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-변환 인자)의 효과를 조사할 수 있는 시험법에 추가하여, 다른 복합체로부터 분리되어 개별적인 복합체에 epi-변환 인자가 미치는 영향을 조사하는데 사용될 수 있는 시험법이 활용될 수 있다.
NADH-코엔자임 Q 산화환원효소 또는 NDAH 탈수소효소로서 알려진 복합체 I은 전자 전달 사슬 내에서의 첫 번째 단백질이다. 일부 구체예에서, 복합체 I에 의한 NAD+ 생산에 있어 epi-변환 인자가 미치는 영향의 검출 및 정량화가 수행될 수 있다. 예를 들어, 복합체는 96-웰 플레이트에서 표본으로부터 면역포획될 수 있고; NADH에서 NAD+로의 산화는 450 nM에서의 증가된 흡수를 나타내는 염색 분자의 환원과 함께 동시에 일어난다(복합체 I 효소 활성 마이크로플레이트 시험 키트, MitoSciences Inc., Eugene, OR).
시토크롬 c 산화효소(COX)로 알려진 복합체 IV는 전자 전달 사슬에서 마지막 단백질이다. 일부 구체예에서, 복합체 IV에 의한 시토크롬 c의 산화와 산소에서 물로의 환원에 미치는 epi-변환 인자의 효과 검출 및 정량화가 수행될 수 있다. 예를 들어, COX는 마이크로웰 플레이트에서 면역포획되어 COX의 산화는 발색 시험법으로 측정된다 (복합체 IV 효소 활성 마이크로플레이트 시험 키트, MitoSciences Inc., Eugene, OR).
산화적 인산화 과정에서의 첫 번째 효소는 ATP 합성효소(복합체 V)로, 다른 복합체에 의해 생성된 양성자 구배를 사용하여 ATP를 ADP로 합성하는 동력으로 한다. 일부 구체예에서, ATP 합성효소의 활성에 미치는 epi-변환 인자의 효과 검출 및 정량화가 수행될 수 있다. 예를 들어, 표본 내 ATP 합성 효소의 활성과 ATP 합성 효소의 양은 마이크로웰 플레이트의 웰 내 면역포획된 ATP 합성 효소에 의해 측정될 수 있다. 효소는 또한 어떤 특정 조건에서 ATP아제로서 기능할 수도 있으며, 따라서 ATP 합성효소 활성에 대한 시험법에서, ATP를 ADP로 환원하는 비율은 NADH를 NAD+로 산화하는 것을 동시에 검출함으로써 측정된다. ATP의 함량은 ATP아제 에 표식화된 항체를 사용하여 계산된다(ATP 합성효소 Duplexing (Activity + Quantity) Microplate Assay Kit, MitoSciences Inc., Eugene, OR). 산화적 인산화를 위한 추가적인 시험법은 복합체 II 및 III의 활성에 미치는 영향을 시험하는 시험법을 포함한다. 예를 들면, MT-OXC MitoToxTM Complete OXPHOS System (MitoSciences Inc., Eugene, OR)은 복합체 I, IV 및 V뿐만 아니라 복합체 II 및 III에 화합물이 미치는 영향을 평가하는데 사용될 수 있고, 전체적인 산화적 인산화 시스템에 화합물이 미치는 영향에 대한 데이터를 제공한다.
상기 기술한 바와 같이, 온전한 세포 표본의 실시간 관찰은 세포 배양 배지 내 산소 소비 및 pH의 변화에 대한 탐침기를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 세포 에너지의 시험법은 미토콘드리아 기능 및 잠재적인 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-변환 인자)가 표본 세포내 미토콘드리아 활성에 미치는 영향에 대한 광범위한 개요를 제공한다.
환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-변환 인자)는 또한 미토콘드리아 투과성 전이(MPT), 즉, 미토콘드리아 투과 전이 공극(MPTP)의 형성에 의해 미토콘드리아 막의 투과성이 향상되는 현상에 영향을 미칠 수 있다. 미토콘드리아 투과성의 향상은 미토콘드리아가 부풀어 오르게 하며(swelling), 산화적 인산화 및 ATP 재생을 어렵게 하고 결국 세포사로 이끈다. MPT는 세포 사멸 유도와 관련될 수 있다 (참조, 예를 들어 본원에서 전체가 참조로서 도입되는 Halestrap, A.P., Biochem. Soc. Trans. 34:232-237 (2006) 및 Lena, A. et al . Journal of Translational Med. 7:13-26 (2009) )
일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-변환 인자)가 MPT 및 MPTP의 형성, 중단 및/또는 효과에 미치는 영향의 검출 및 정량화가 측정될 수 있다. 예를 들어, 시험법은 미토콘드리아 내부 막과 다른 시토졸 구획(compartment)을 구분시키는 구체적인 염료 분자(칼세인)의 사용을 통해 MPT를 측정할 수 있다. 또 다른 분자, CoCl2의 적용은 시토졸 내 칼세인 염료의 형광을 억누르는(squelch) 역할을 한다. 그러나 CoCl2는, 미토콘드리아의 내부에 접속하지는 못하므로 따라서, 미토콘드리아 내 칼세인 형광은 MPT가 일어나고 CoCl2가 MPTP를 거쳐 미토콘드리아 내부로 접속하지 않는 한, 억눌러지지 않는다. 미토콘드리아-특정 형광의 손실은 MPT가 일어날 때, 표시된다. 유동세포 분석법(Flow cytometry)이 세포 및 세포 기관 형광을 평가하는데 사용될 수 있다((MitoProbeTM Transition Pore Assay Kit, Molecular Probes, Eugene, OR). 실험적인 결과를 평가하기 위하여, 추가적인 시험법은 형광 현미경을 사용한다(Image-iTTM LIVE Mitochondrial Transition Pore Assay Kit, Molecular Probes, Eugene, OR).
세포 증식 및 염증 측정
본 발명의 일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-변환 인자)는 세포 증식 및/또는 염증과 관련된 분자의 생산 또는 활성에 미치는 효과에 의해 확인되고 평가된다. 이들 분자는 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 세포 외 매트릭스 성분, 케포카인, 뉴로펩타이드, 뉴로트랜스미터, 뉴로트로핀 및 신호 전달과 관련되는 것들과 같은 세포내 분자뿐만 아니라 세포 신호와 관련되는 기타 분자를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
혈관내피 성장인자(VEGF)는 잠재적인 혈관신생, 혈관형성(vasculogenic) 및 분열촉진(mitogenic) 특성을 갖는 성장 인자이다. VEGF는 내피 투과성 및 스웰링을 자극하며 VEGF 활성은 류마티스 관절염, 전이성 암, 노인 황반변성 및 당뇨망막병증을 포함하는 다양한 질병 및 장애와 연루된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-변환 인자)는 그것이 VEGF의 생산에 미치는 영향에 의해 확인되고 특징지어진다. 예를 들어, 혈중 산소 감소 조건 또는 산성증 유사 조건 하에서 유지되는 세포는 증가된 VEGF 생산을 나타낼 것이다. 배지로 유출되는 VEGF는 활용가능한 항-VEGF 항체 (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하는 ELISA 또는 다른 항체-기반 시험법에 의해 시험될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, Epi-변환 인자는 그것이 VEGF에 대한 세포 반응성에 미치는 영향에 기반하고/하거나, VEGF 수용체의 발현 또는 활성에 미치는 영향에 기반하여 확인되고/되거나 특징지어진다.
자가 면역 질환뿐만 아니라 건강한 면역 시스템 기능 둘 다에 연루되어, 종양 괴사 인자(TNF)는 염증과 면역 시스템 활성의 주요 매개체이다. 본 발명의 일부 구체예에서, Epi-변환 인자는 그것이 TNF의 생산 또는 활성에 미치는 영향에 의해 확인되고 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 배양된 세포에 의해 생산되고 배지로 유출되는 TNF는 ELISA 또는 당업계에 알려진 다른 항체-기반 시험법을 거쳐 정량화될 수 있다. 또한 일부 구체예에서, 환경 영향 인자는 그것이 TNF에 대한 수용체 발현에 미치는 영향에 의해 확인되고 특징지어질 수 있다 (HμMan TNF RI Duoset, R&D Systems, Minneapolis, MN).
세포외 매트릭스 성분(ECM)은 세포와 조직의 구조 및 신호 전달 과정 모두에 있어 역할을 수행할 수 있다. 예를 들어, 잠복성 형질 전환 성장 인자 베타 결합 단백질은 ECM 성분으로, 이는 ECM과 함께 형질 전환 성장 인자 베타(TGFβ)의 저장소를 생성한다. 매트릭스-결합된 TGFβ는 이후에 매트릭스 리모델링 과정 동안 방출될 수 있고, 근처의 세포에 성장 인자 효과를 발휘할 수 있다 (Dallas, S. Methods in Mol. Biol. 139:231-243 (2000)).
일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-변환 인자)는 그것이 배양 세포에 의한 ECM 생성에 미치는 영향에 의해 확인되거나 특징지어진다. 연구자들은 지속적으로 기술을 개발하여, ECM의 조성뿐만 아니라 세포에 의한 ECM 생성을 연구하고 정량화할 수 있었다. 예를 들어, 세포에 의한 ECM 합성은 배양 전에 하이드로겔 내에 세포를 묻음(embed)으로서 평가될 수 있다. 생화학 분석 및 기타 분석은 세포 수확 및 하이드로겔 소화 이후에 세포에 의해 생성되는 ECM에 대해 수행될 수 있다 (Strehin, I. and Elisseeff, J. Methods in Mol. Bio. 522:349-362 (2009)).
일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 epi-환경 인자)가 유기체 내 ECM의 생산, 상태 또는 부족, 또는 그것의 성분 중 하나에 미치는 영향을 확인하거나 특징지을 수 있다. 조건부 넉-아웃(knock-out(KO))된 쥐가 개발되어 왔는데, 그 개발의 특정 단계 또는 별개의 세포 형태 내에서 단지 특히, ECM 유전자를 넉-아웃하는 것이 허용되었다 (Brancaccio, M. et al. Methods in Mol Bio. 522:15-50 (2009)). 특정 조직 내 특정 ECM 성분의 부재시 또는 개발의 특정 단계에서의 활성에 대하여 epi-변환 인자 또는 잠재적인 epi-변환 인자를 적용 또는 투여한 효과가 따라서 평가되었다.
형질막 보존과 세포사의 측정
환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-변환 인자)는 세포 표본의 형질막 보존 변화 및/또는 세포 사멸, 괴사 또는 증가되거나 감소되는 세포사와 유사한 세포적 변화를 겪는 세포의 수 또는 백분율 변화에 의해 확인될 수 있다.
락테이트 탈수소효소(LDH)에 대한 시험법은 세포 상태 및 손상 수준의 측정을 제공한다. LDH는 안정적이고 상대적으로 풍부한 세포질 효소이다. 형질막이 물리적 보존을 잃었을 때, LDH는 외부 구획으로 달아난다. 더 높은 LDH의 농도는 더 높은 형질막 손상 및 세포사의 수준과 연관성을 갖는다. LDH 시험법의 예는 표본 내 LDH의 수준을 검출하고 정량화하는 발색 시스템을 사용하는 시험법을 포함하며, 여기서 테트라졸리움 염의 산화 형태는 LDH 효소의 활성을 거쳐 생산된다 (QuantiChromTM 락테이트 Dehydrogenase Kit (DLDH-100), BioAssay Systems, Hayward, CA; LDH Cytotoxicity Detection Kit, Clontech, Mountain View, CA).
세포 사멸은 다양하게 다른 개시 이벤트를 갖는 프로그램화된 세포사 과정이다. 다양한 시험법으로 세포 사멸을 겪는 세포의 수와 비율 변화를 측정할 수 있다. 세포 사멸을 검출하고 정량화하는데 사용되는 시험법의 한 형태는 카스파아제 시험법이다. 카스파아제는 세포 사멸 동안 단백질 가수 분해성 절단을 거쳐 활성화되는 아스파르트산-특정 시스테인 프로테아제이다. 활성화된 카스파아제를 검출하는 시험법의 예는 PhiPhiLux®(OncoImmunin, Inc., Gaithersburg, MD) 및 카스파아제-Glo®3/7 Assay Systems (Promega Corp., Madison, WI)을 포함한다. 세포 사멸 및 비교 표본 내 세포 사멸을 겪는 세포 백분율 또는 수 변화를 검출할 수 있는 추가적인 시험법은 TUNEL/DNA 절편 시험법을 포함한다. 이 시험법은 세포 사멸의 실행 시기 동안 뉴클라아제에 의해 생성되는 180 내지 200 염기쌍 DNA 절편을 검출한다. 예시적인 TUNEL/DNA 절편 시험법은 In Situ Cell Death Detection Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 및 the DeadEndTMColorimetric and Fluorometric TUNEL Systems (Promega Corp., Madison, WI)을 포함한다.
일부 세포 사명 시험법은 세포 사멸성 및/또는 비-세포 사멸성 상태와 관련된 단백질을 검출하고 정량화한다. 예를 들어, MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay (Promega Corp., Madison, WI)은 단일 기질, 형광 검출 시스템을 사용하여, 살아있는 세포와 사멸한 세포에 특징적인 프로테아제를 검출하고 정량화하며, 그로 인해 세포 또는 조직 표본 내 세포 사멸을 겪는 세포에 대한 살아있는 세포의 비율을 제공한다.
세포 사멸을 검출하고 정량화하는 데 활용될 수 있는 추가적인 시험법은 세포 투과율을 검출하는 시험법(예를 들어, APOPercentageTM APOPTOSIS Assay, Biocolor, UK) 및 아넥신 V용 시험법(예를 들어, Annexin V-Biotin Apoptosis Detection Kit, BioVision Inc., Mountain View, CA)을 포함한다.
III . 본 발명의 용도
본 발명은 종양적 장애를 진단하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 종양적 장애의 재발 및/또는 종양적 장애를 위해 치료되는 개체의 생존을 예측하기 위해서 숙련된 의사에 의해 사용되는 다른 방법과 병합되어 시행될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 개체로부터 수득한 시료의 형태학적 또는 세포학적 분석과 함께 병용되어 수행될 수 있다. 세포학적 방법은 어떠한 다른 분자 마커 자체 또는 다른 마커와 병용, 그리고/또는 Shc 마커와 병용하여 면역조직학적(immunohistochemical) 또는 면역형광적(immunofluorescence) 탐지(및 적절하다면 정량)를 포함할 수 있다. 다른 방법은 인 시추(in situ) PCR, 또는 조직을 추출에 의한 다른 마커의 탐지 및 실시간 PCR(real time PCR)에 의한 다른 마커의 정량를 포함할 수 있다. PCR은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)으로서 정의된다.
치료 요법(treatment regimen), 예를 들면 화학요법, 방사선 요법, 수술, 호르몬 요법, 또는 개체에서 종양적 장애를 치료하기 위해 유용한, 다른 치료적 접근의 효능을 평가하기 위한 방법도 제공된다. 이러한 방법에서, 시료의 쌍(치료 요법을 받지 않은 첫 번째 시료 및 치료 요법의 최소 한 부분을 받은 두 번째 시료)에 있는 마커의 양은 평가된다.
또한, 본 발명은 종양적 장애가 공격적인지 결정하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포에 존재하는 마커의 양을 결정하는 것을 포함하고, 정의(definition)부분에 정의된 것과 같이, 상기 양을 대조군에 존재하는 마커의 대조군 양과 비교하는 것을 포함함으로써, 종양적 장애가 공격적인지 결정한다.
또한, 본 발명의 방법은 종양적 장애의 공격성을 조절, 즉 감소시킬 수 있는 화합물을 선택하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법에서, 암세포는 검사 화합물과 접촉되고, 그리고 암세포에서 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조절하는, 상기 검사 화합물의 능력이 결정됨으로써, 종양적 장애의 공격설을 조절할 수 있는 화합물을 선별한다.
여기서 기술되는 방법을 사용하여, 다양한 분자, 특히 세포막을 건널 수 있을 만큼 작은 분자를 포함하는 분자는, 조절하는, 예를 들면 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 분자를 동정하기 위해서 스크리닝될 수 있다. 그렇게 동정된 화합물은 개체에 종양적 장애의 공격성을 억제시키기 위해, 개체에서 종양적 장애의 재발을 예방하기 위해, 또는 개체내 종양적 장애를 치료하기 위해 개체에게 제공될 수 있다.
IV . 본 발명의 마커
본 발명은 마커(이후로 "생물학적 마커(biomarker)", "마커" 또는 "본 발명의 마커"라고 함)에 관한 것이고, 이것은 표 2-4 & 6-29에 나열되어 있다. 본 발명은 마커에 의해 암호화되거나 또는 마커와 상응하는 핵산 및 단백질(각각, 이후 "마커 핵산" 및 "마커 단백질"이라고 함)을 제공한다. 상기 마커는 특히, 종양적 장애의 존재를 스크리닝하고, 종양적 장애의 공격성 및 전이 잠재력을 판단하며, 개체가 종양적 장애를 갖고 있는지 판단하고, 종양적 장애를 치료하기 위한 조성물을 동정하며, 종양적 장애를 치료하기 위한 환경 영향제 화합물의 효능을 판단하고, 종양적 장애의 진행(progression)을 모니터하며, 종양적 장애의 공격성을 예측하고, 종양적 장애를 갖는 개체의 생존을 예측하며, 종양적 장애의 재발을 예측하고, 그리고 개체가 종양적 장애를 발달시키는 성향이 있는지 예측하는데 유용하다.
본 발명의 어떤 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 생물학적 마커는 본 발명의 방법와 함께 병용되어 사용될 수 있다. 여기서 사용되는 것과 같이, "하나 또는 그 이상의 생물학적 마커"란 용어는 공개된 생물학적 마커 목록에서, 최소 하나의 생물학적 마커가 검사되고, 다양한 실시예에서, 상기 목록에 개시된 하나 이상의 생물학적 마커가 검사될 수 있으며, 예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 50개 이상, 또는 목록에 있는 모든 생물학적 마커가 검사될 수 있다는 것을 의미하는 의도를 갖는다.
"마커(marker)"는 정상적이거나 또는 건강한 조직, 또는 세포에서의 발현 수준으로부터, 조직 또는 세포에서 변화된 발현 수준이 질병 상태, 예를 들면 종양적 장애와 관련된 유전자이다. "마커 핵산(marker nucleic acid)"은 본 발명의 마커에 의해 암호화되거나 또는 이와 상응하는 핵산(예를 들면 mRNA, cDNA)이다. 그러한 마커 핵산은 서열 번호(nts) 어떤 것의 전체적 또는 부분적 서열 또는 상기 서열의 상보적인 것을 포함하는 DNA(예를 들면, cDNA)를 포함한다. 또한, 마커 핵산은 서열 번호(nts) 어떤 것의 전체적 또는 부분적 서열 또는 상기 서열의 상보적인 것을 포함하는 RNA를 포함하고, 여기에서 모든 티미딘 잔기(thymidine residue)는 우리딘(uridine) 잔기로 대체된다. "마커 단백질"은 본 발명의 마커에 의해 암호화되거나 또는 그에 상응하는 단백질이다. 마커 단백질은 서열 번호(AAs) 어떤 것의 전체적 또는 부분적 서열을 포함한다. "단백질" 및 "폴리펩티드(polypeptide)"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
"세포자멸사(apoptosis)"와 관련된 마커는 세포자멸사 경로에 관련된 마커이다. 예를 들면, 세포자멸사와 관련된 마커는 표 6A, 6B, 7-9, 25 및 28에 열거된 마커를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 구체적으로, 세포 자멸사와 관련된 마커는 Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11 (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, 그리고 cMyc을 포함한다.
"산화적 스트레스(oxidative stress)와 관련된 마커"는 산화적 스트레스 경로와 관련된 마커이다. 예를 들면, 산화적 스트레스와 관련있는 마커는 표 10-12에 열거된 마커를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 구체적으로, 산화적 스트레스와 관련된 마커는 호중구 시토졸 인자(Neutrophil cytosolic factor 2), 산화 질소 합성효소(nitric oxide synthase 2A), 그리고 과산화 디스뮤타아제(superoxide dismutase 2, 미토콘드리아)를 포함한다.
"열충격(heat shock)과 관련된 마커"는 열충격과 관련된 마커이다. 예를 들면, 열충격과 관련된 마커는 표 13에 열거된 마커를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"혈관신생(angiogenesis)와 관련된 마커"는 혈관신생 경로에 관련된 마커이다. 예를 들면, 혈관신생과 관련된 마커는 표 24 및 27에 열거된 마커를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
"종양적 장애-관련" 체액은 환자의 몸에 있을 때, 종양적 세포(oncological cell)에 접촉하거나 또는 그것을 통과하는 체액, 또는 종양적 세포로부터 분리된 세포 또는 단백질이 흡수될 수 있는 체액이다. 예시적인 종양적 장애-관련 체액은 혈액(예를 들면, 전체 혈액, 혈청, 혈소판이 제거된 혈액)을 포함하고, 하기에 더욱 더 상세히 기술되어 있다. 많은 종양적 장애-관련 체액은 특히 세포가 전이될 때, 그 안에 종양적 세포를 가질 수 있다. 종양적 세포를 포함할 수 있는 세포-접촉 체액은 전체 혈액, 혈소판이 제거된 혈액, 림프액, 전립샘 분비액(prostatic fluide), 요(urine) 및 정액(semen)을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
마커의 "정상" 발현 수준은 인간 개체 또는 종양적 장애를 갖는 환자에서의 마커의 발현 수준이다.
마커의 "과발현" 또는 "보다 높은 발현"은 발현을 판단하기 위해 적용된 검사의 표준 오차보다 높은, 검사 시료에서 발현 수준을 의미하고, 이것은 대조군 시료(예를 들면, 상기 마커 관련 질병, 즉 종양적 장애를 갖지 않는 건강한 개체로부터의 시료)에서 마커 발현 수준, 그리고 더욱 바람직하게는 여러 대조군 시료에서 마커의 평균 발현 수준의 바람직하게는 2배, 더욱 바람직하게는 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배가 높은 검사 시료에서의 발현 수준이다.
마커의 "보다 낮은 수준의 발현"은 대조군 시료(예를 들면, 상기 마커 관련 질병, 즉 종양적 장애를 갖지 않는 건강한 개체로부터의 시료)에서 마커 발현 수준, 그리고 더욱 바람직하게는 여러 대조군 시료에서 마커의 평균 발현 수준의 바람직하게는 2배, 더욱 바람직하게는 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배가 낮은 검사 시료에서의 발현 수준이다.
"전사된 폴리뉴클레오티드(transcribed polynucleotides)" 또는 "뉴클레오티드 전사체(nucleotide transcript)"는 본 발명의 마커의 전사 및, 만약 있다면, RNA 전사체의 정상적인 전사후 처리[post-transcription processing, 예를 들면 스플라이싱(splicing)], 그리고 RNA 전사체의 역전사에 의해 만들어진 성숙 mRNA의 전체 또는 부분과 상동성을 갖거나 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예를 들면, mRNA, hnRNA, cDNA, 또는 상기 RNA 또는 cDNA의 유사체)이다.
"상보적(complementary)"는 두 핵산 가닥의 부위 사이 또는 동일한 핵산 가닥의 두 부위 사이에서의 서열 상보성의 넓은 개념을 의미한다. 첫 핵산 부위의 아데닌(adenine) 잔기는 첫 번째 부위와 역평행한 두 번째 핵산 부위의 잔기와, 만약 상기 두 번째 잔기가 티민(thymine) 또는 우라실(uracil)이라면 특이적 수소 결합["염기 짝(base pairing)"]을 형성할 수 있다는 것이 알려져 있다. 유사하게, 첫 핵산 부위의 시토신(cytosine) 잔기는 첫 번째 부위와 역평행한 두 번째 핵산 부위의 잔기와, 만약 상기 두 번째 잔기가 구아닌(guanine)이라면 특이적 수소 결합["염기 짝(base pairing)"]을 형성할 수 있다는 것이 알려져 있다. 만약 두 부위가 역평행한 방법으로 배열될 때, 첫 부위의 최소 하나의 뉴클레오티드 잔기가 두 번째 부위의 잔기와 염기쌍을 이룰 수 있다면, 핵산의 첫 부위는 동일하거나 또는 상이한 핵산의 두 번째 부위와 상보적이다. 바람직하게, 첫 부위(region)는 첫 번째 부분(portion)을 포함하고, 두 번째 부위는 두 번째 부분을 포함하며, 여기에서 첫 번째 및 두 번째 부분이 역평행 방법으로 배열될 때, 첫 부위의 뉴클레오티드 잔기의 최소 약 50%, 그리고 바람직하게는 최소 약 75%, 최고 약 90%, 또는 최소 약 95%가 두 번째 부분에서의 뉴클레오티드 잔기와 염기쌍을 이룰 수 있다. 더욱 바람직하게, 첫 번째 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기는 두 번째 부분에서의 뉴클레오티드 잔기와 염기쌍을 이룰 수 있다.
여기서 사용하는 "상동성(Homologous)"은 동일한 핵산 가닥의 두 부위 사이 또는 두 개의 상이한 핵산 가닥의 부위 사이에서의 뉴클레오티드 서열 유사성을 의미한다. 두 부위에서 뉴클레오티드 잔기 위치가 동일한 뉴클레오티드 잔기로 채워졌을 때, 상기 부위는 그 위치에서 상동성을 가진다. 만약 각 부위의 최소 하나의 뉴클레오티드 잔기 위치에서 동일한 잔기로 채워져 있으면, 첫 부위는 두 번째 부위에 상동성을 갖는다. 동일한 뉴클레오티드 잔기에 의해 채워진 두 부위의 뉴클레오티드 잔기 위치의 부분에 있어서, 두 부위사이에서의 상동성은 발현된다. 예를 들면, 뉴클레오티드 서열 5'-ATTGCC-3'를 갖는 부위 및 뉴클레오티드 서열 5'-TATGGC-3'를 갖는 부위는 50%의 상동성을 공유한다. 바람직하게, 첫 부위는 첫 번째 부분을 포함하고, 두 번째 부위는 두 번째 부분을 포함하며, 여기에서 각 부분의 뉴클레오티드 잔기 위치의 최소 약 50%, 그리고 바람직하게는 최소 약 75%, 최소 약 90%, 또는 최소 약 95%가 동일한 뉴클레오티드 잔기로 채워진다. 더욱 바람직하게는, 각 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기 위치(position)는 동일한 뉴클레오티드 잔기로 채워진다.
"본 발명의 단백질"은 마커 단백질 및 그들의 단편; 변이 마커 단백질 및 그들의 단편; 펩티드 및 마커 또는 변이 마커 단백질의 최소 15개의 아미노산 부분을 포함하는 폴리펩티드; 및 마커 또는 변이 마커 단백질, 또는 마커 또는 변이 마커 단백질의 최소 15개의 아미노산 부분을 포함하는 융합 단백질을 포함한다
나아가, 본 발명은 본 발명의 마커 단백질 또는 상기 마커 단백질의 단편과 특이적으로 결합하는 항체, 항체 유도체, 그리고 항체 단편을 제공한다. 여기서 따로 구체화되지 않는 한, "항체" 및 "항체들"이라는 용어는 넓게 항체의 자연적으로 존재하는 형태(예를 들면, IgG, IgA, IgM, IgE) 및 단일 사슬 항체와 같은 재조합 항체, 키메라 및 인간화된 항체 및 다중 특이적 항체뿐만 아니라 최소한 항원 결합 부위를 갖고 있는, 상기 모든 것의 단편 및 유도체를 포함한다. 항체 유도체는 단백질 또는 항체에 결합된 화학적 모이어티를 포함할 수 있다.
어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 세포자멸사, 예를 들면 프로(pro-) 또는 항(anti-) 세포 자멸사와 관련된다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 세포자멸사와 관련된 유전자이다. 세포자멸사와 관련된 유전자는, 예를 들면 표 24에 열거된 유전자를 포함한다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 전사인자이다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 산화적 스트레스와 관련된다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 캐스페이즈 조절(caspase modulator), 예를 들면 캐스페이즈 활성제 또는 캐스페이즈 억제제이다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 세포 성질과 관련된다. 다른 실시예에서, 생물학적 마커는 세포 주기 조절 및 DNA 합성과 관련된다. 다른 실시예에서, 생물학적 마커는 당분해 및 대사, 예를 들면 펜토즈 포스페이트 경로(pentose phosphate pathway) 및 미토콘드리아 산화적 대사와 관련된다. 또 다른 실시예에서, 생물학적 마커는 분자 수송과 관련된다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 세포 신호와 관련된다. 다른 실시예에서, 생물학적 마커는 14-3-3 매개 신호와 관련된다. 또 다른 실시예에서, 생물학적 마커는 세라미드 신호(ceramide signaling)과 관련있다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 미토콘드리아 단백질 수송에 관련된다. 다른 실시예에서, 생물학적 마커는 지방세포 분화와 관련있다. 다른 실시예에서, 생물학적 마커는 지질 및 콜레스테롤 대사와 관련있다. 또 다른 실시예에서, 생물학적 마커는 혈관신생과 관련있다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 막유동성(membrane fluidity)와 관련있다. 다른 실시예에서, 생물학적 마커는 면역 조절과 관련있다. 다른 실시예에서, 생물학적 마커는 유전체 안정성과 관련있다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 세포외 기질 단백질 통합(extracellular matrix protein integrity)과 관련있다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 막 수송과 관련있다. 다른 실시예에서, 생물학적 마커는 산화 조절(oxidative control)과 관련있다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 펜토즈 포스페이트 경로와 관련있다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(tumor necrosis factor receptor superfamily)의 멤버이다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 아라키돈산 대사(arachidonic metabolism)과 관련이 있다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 상기 둘 또는 그 이상의 경로와 관련이 있다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 상기 셋 또는 그 이상, 넷 또는 그 이상, 다섯 또는 그 이상의 경로와 관련이 있다. 어떤 실시예에서, 생물학적 마커는 하나 이상의 생물학적 마커가 본 발명과 연결되어 이용된다. 이러한 실시예에서, 생물학적 마커는 각각 개별적으로 상기의 하나 또는 그 이상, 둘 또는 그 이상, 셋 또는 그 이상, 넷 또는 그 이상, 다섯 또는 그 이상의 경로와 관련이 있다.
특정 실시예에서, 열거된 특정 유전자는 치료 후 상이한 시간대에서, 또는 잠재적 환경 영향제(예를 들면, CoQ10)의 상이한 농도에 의한 치료와 같은, 하나 이상의 치료 조건과 관련이 있는 곳에서, 상기 특정 유전자의 배수 변화는 가장 긴 것으로 기록된 치료 시간을 의미한다. 다른 실시예에서, 상기 특정 유전자에 대한 배수 변화는 가장 짧은 것으로 기록되는 치료 시간을 의미한다. 다른 실시예에서, 상기 유전자에 대한 배수 변화는 가장 높은 농도의 환경 영향제(예를 들면 CoQ110)에 의한 치료를 의미한다. 다른 실시예에서, 상기 특정 유전자에 대한 배수 변화는 가장 낮은 농도의 환경 영향제(예를 들면 CoQ10)에 의한 치료를 의미한다. 또 다른 실시예에서, 상기 특정 유전자에 대한 배수 변화는 환경 영향제의 치료적 효과와 일관성있는 방법으로 조절하는(예를 들면 상향 또는 하향 조절)을 의미한다.
특정 실시예에서, 양성 또는 음성 배수 변화는 표 2-4 & 6-29에 열거된 어떤 유전자의 것을 의미한다. 특정 실시예에서, 양성 또는 음성 배수 변화는 표 하나를 제외한, 표 2-4 & 6-29(예를 들면 표 1을 제외, 표 5를 제외 등)에 열거된 어떤 유전자의 것을 의미한다. 특정 실시예에서, 양성 또는 음성 배수 변화는 어떠한 표 2개를 제외한, 표 2-4 & 6-29(예를 들면 표 1 및 5를 제외, 표 2 및 16을 제외 등)에 열거된 어떤 유전자의 것을 의미한다. 특정 실시예에서, 양성 또는 음성 배수 변화는 어떠한 표 3개를 제외한; 또는 어떠한 표 4개를 제외한; 또는 어떠한 표 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 그 이상을 제외한, 표 2-4 & 6-29에 열거된 어떤 유전자의 것을 의미한다. 특정 실시예에서, 양성 또는 음성 배수 변화는 표 1, 5, 9, 12를 제외한, 표 2-4 & 6-29에 열거된 어떤 유전자의 것을 의미한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "양성 배수 변화(positive fold change)"는 관련된 표에 나열되어 있는 유전자의 "상향 조절" 또는 "증가(발현의)"를 의미한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "음성 배수 변화(negative fold change)"는 관련된 표에 나열되어 있는 유전자의 "하향 조절" 또는 "감소(발현의)"를 의미한다.
본 발명의 다양한 측면은 하기의 세부항목에 더욱 자세하게 기술되어 있다.
1. 분리된 핵산 분자
본 발명의 한 측면은 마커 단백질 또는 그것의 부분을 암호화하는 핵산을 포함하는 분리된 핵산 분자와 관련된 것이다. 또한, 본 발명의 분리된 핵산은 마커 핵산 분자, 그리고 마커 핵산 분자의 단편을 동정하기 위한 혼성화 탐침(예를 들면, 마커 핵산 분자의 증폭 또는 돌연변이를 위한 PCR 프라이머로서 사용하기 위해 적절한 것)으로서 사용하기에 충분한 핵산 분자를 포함한다. 여기서 사용되는 것과 같이, "핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자(예를 들면, cDNA 또는 유전체 DNA) 및 RNA 분자(mRNA), 그리고 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 만들어진 DNA 또는 RNA를 포함하려는 의도를 갖는다. 상기 핵산 분자는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중가닥 DNA이다.
"분리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 자연 근원(natural source)에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 하나의 실시예에서, "분리된" 핵산 분자는 핵산이 유래된 생물(organism)의 유전체 DNA(genomic DNA)에 있는 핵산의 측면에 자연적으로 위치한(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열) 자유로운 서열(바람직하게는 단백질 암호화 서열)이다. 예를 들면, 다양한 실시예에서, 분리된 핵산 분자는 핵산이 유래된 유전체 DNA에 있는 핵산의 측면에 자연적으로 위치한 뉴클레오티드 서열의 5 kB, 4 kB, 3 kB, 2 kB, 1 kB, 0.5 kB 또는 0.1 kB이하를 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, cDNA와 같은 "분리된" 핵산 분자는 재조합 기술에 의해 생산되었을 때 상당히 자유로운 다른 세포 물질 또는 배지, 또는 화학적으로 합성되었을 때 상당히 자유로운 화학적 전구체 또는 다른 화학물질일 수 있다. 상당히 자유로운 세포 물질인 핵산 분자는 약 30%, 20%, 10% 또는 5% 이하인 이형 핵산(heterologous nucleic acid) [또는 여기에서 "오염된 핵산(contaminating nucleic acid)"이라고도 한다]를 갖는 제조를 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 일반적인 분자 생물학 기술 및 여기에 기술된 데이터베이스 기록에 있는 서열 정보을 사용하여 분리될 수 있다. 상기 핵산 서열의 모든 또는 일부분을 이용하여, 본 발명의 핵산 분자를 일반적인 혼성화 및 클로닝 기술(예를 들면, Sambrook et al., ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989에 기술)을 사용하여 분리할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 주형으로서 cDNA, mRNA, 또는 유전체 DNA 및 일반적인 PCR 증폭 기술에 따른 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킬수 있다. 그렇게 증폭된 핵산은 적절한 벡터로 클로닝될 수 있고 DNA 서열 분석에 의해 특징화될 수 있다. 나아가, 본 발명의 핵산 분자의 모든 또는 일부분과 상응하는 뉴클레오티드는 일반적인 합성 기술, 예를 들면 자동 DNA 합성기(automated DNA synthesizer)를 사용하여 제조될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 마커 핵산의 뉴클레오티드 서열 및 마커 단백질을 암호화하는 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함한다. 주어진 뉴클레오티드 서열에 상보적인 핵산 분자는 주어진 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 서열에 대해 충분히 상보적인 것으로써, 안정적인 이중체(duplex)를 형성한다.
게다가, 본 발명의 핵산 분자는 핵산 서열의 오직 일부분을 포함할 수 있고, 여기에서 전장(full length) 핵산 서열은 마커 핵산을 포함하거나 또는 마커 단백질을 암호화할 수 있다. 상기 핵산은, 예를 들면, 탐침 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 상기 탐침/프라이머는 일반적으로 하나 또는 그 이상의, 충분히 정제된 올리고뉴클레오티드로서 사용된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 일반적으로, 엄중한 조건하에서, 본 발명 핵산의 최소 약 7개, 바람직하게는 약 15개, 더욱 바람직하게는 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 또는 400개, 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 혼성화되는 뉴클레오티드 서열의 부위를 포함한다.
본 발명의 핵산 분자의 서열에 기초한 탐침은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 마커에 상응하는 전사체 또는 유전체 서열을 탐지하는데 사용될 수 있다. 상기 탐침은 그것에 결합한 표지기(label group), 예를 들면 방사선동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 조효소(enzyme co-factor)를 포함한다. 상기 탐침은 개체로부터의 세포 시료에 있는 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 수준을 측정함으로써, 예를 들면 mRNA를 탐지하거나 또는 단백질을 암호화하는 유전자가 돌연변이되거나 또는 결실되었는지 결정함으로써, 단백질을 미스-발현된(mis-express) 세포 또는 조직을 동정하는 진단 검사 키트의 일부로서 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 유전적 코드(genetic code)의 축퇴성(degeneracy) 때문에 마커 단백질(예를 들면 서열 번호(AAs)의 서열을 갖는 단백질)을 암호화하는 핵산의 뉴클레오티드 서열과 상이한 핵산 분자를 포함하고, 그러므로 동일한 단백질을 암호화한다.
당업자에 의해 아미노산 서열에 변화를 야기시키는 DNA 서열 다형성(polymorphism)은 집단(예를 들면, 인간 집단)내에 존재할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 상기 유전적 다형성은 자연적 대립유전자 변형(natural allelic variation)에 의해 집단 내에서도 개인 사이에서 존재할 수 있다. 대립 유전자는 주어진 유전자 위치에서 선택적으로 일어나는 유전자 군의 하나이다. 또한, RNA 발현 수준에 영향을 끼치는 DNA 다형성은 존재할 수 있고, 이것은 그 유전자의 전체적 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다(예를 들면, 조절 또는 분해에 영향을 끼침으로써)는 것이 이해될 것이다.
여기서 사용되는 것과 같이, "대립 유전자(형질) 변이(allelic variant)"의 용어는 주어진 위치에서 일어나는 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 의미한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "유전자" 및 "재조합 유전자"는 본 발명의 마커에 상응하는 폴리펩티드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 상기 자연적 대립유전자 변이는 일반적으로 주어진 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 1-5% 변이를 야기한다. 다른 선택적 대립 유전자(alternative allele)는 다수의 상이한 개인에서 관심있는 유전자를 시퀀싱(sequencing)함으로써 동정될 수 있다. 이것은 다양한 개개인에서 동일한 유전적 위치(genetic locus)를 동정하기 위한 혼성화 탐침을 사용함으로써 쉽게 수행될 수 있다. 자연적인 대립 유전자 변이의 결과이고 기능적 활성은 변화시키지 않은, 어떤 및 모든 상기 뉴클레오티드 변이 및 그 결과의 아미노산 다형성 또는 변이는 본 발명의 범위내에 있는 의도를 갖는다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 길이가 최소 7, 15, 20, 25, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 550, 650, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3500, 4000, 4500개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 갖고 엄격한 조건 하에서, 마커 핵산 또는 마커 단백질을 암호화하는 핵산과 혼성화된다. 여기서 사용하는 것과 같이, "엄격한 조건하에서 혼성화한다(hybridizes under stringent conditions)"라는 용어는 각각의 다른 것과 최소 60% (65%, 70%, 바람직하게는 75%) 동일한 뉴클레오티드 서열이 서로 혼성화되어 남아있는 조건 하에서, 혼성화 및 세척을 위한 조건을 기술하려는 의도를 갖는다. 상기 엄격한 조건은 당업자에게 알려져 있고 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)의 6.3.1.-6.3.6 부분에서 찾을 수 있다. 바람직하게, 엄격한 혼성화 조건의 제한 없는 예는 약 45℃에서 6X 소듐 클로라이드(sodium chloride)/소듐 시트레이트(sodium citrate; SSC) 혼성화 한 후, 50-65℃, 0.2X SSC, 0.1% SDS 에서 한번 또는 그 이상 세척한다.
집단내에 존재할 수 있는 본 발명의 핵산 분자의 자연적으로 존재하는 대립 유전자 변이뿐만 아니라, 당업자는 서열 변화가 돌연변이에 의해 도입이 됨으로써, 그에 의하여 암호화된 단백질의 생물학적 활성의 변화없이, 암호화된 단백질의 아미노산 서열에 변화가 야기될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 당업자는 "비필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 야기하는 뉴클레오티그 치환을 만들 수 있다. "비필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성의 변화없이, 야생형(wild-type) 서열로부터 변화될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성에 필수적이다. 예를 들면, 다양한 종(species)의 상동성 중에서 보존되지 않거나 또는 오직 반보존된 아미노산 서열은 활성에 비필수적일 수 있고 따라서 변형의 표적이 될 가능성이 크다. 또는, 다양한 종(예를 들면, 생쥐 및 인간)의 상동성 중에서 보존된 아미노산 잔기는 활성에 필수적일 수 있고 따라서 변형의 표적이 되지 않을 가능성이 크다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기 내에서 변화를 포함하는 변이 마커 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 변이 마커 단백질은 자연적으로 존재하는 마커 단백질로부터 아미노산 서열에 있어서 상이하지만, 생물학적 활성을 보유한다. 하나의 실시예에서, 상기 변이 마커 단백질은 마커 단백질의 아미노산 서열에 대해 최소 약 40% 동일한, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
변이 마커 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실을 마커 핵산의 뉴클레오티드에 도입함으로써, 만들어질 수 있고, 즉 이는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환, 첨가, 결실이 암호화괸 단백질로 도입된 것이다. 돌연변이는 위치 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이(PCR-mediated mutagenesis)와 같은 일반적인 기술에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게, 보존적 아미노산 치환은 하나 또는 그 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기에서 만들어진다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄(side chain)를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리(family)는 당업계에서 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄[예를 들면, 리신(lysine), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine)], 산성 측쇄[예를 들면 아스파르트산(aspartic acid), 글루타민산(glutamic acid)], 비전하 극성(uncharged polar) 측쇄[예를 들면, 글리신(glycine), 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 티로신(tyrosine, 시스테인(cysteine)], 비극성 측쇄[예를 들면, 알라닌(alanine), 발린(valine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 프롤린(proline), 페닐알라닌(phenylalanine), 메티오닌(methionine)], 베타 가지 측쇄(beta-branched side chain) [예를 들면, 트레오닌(threonine), 발린(valine), 이소루신(isoleucine)] 및 방향족 측쇄(aromatic side chain) [예를 들면, 티로신(tyrosine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 히스티딘(histidine)]이 있는 아민노산을 포함한다. 또는 돌연변이는 포화 돌연변이과정(saturation mutagenesis)에 의해 암호화된 서열의 모든 또는 일부를 따라 임의적으로 도입될 수 있고, 그 결과물인 돌연변이는 활성을 보유한 돌연변이를 동정하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 돌연변이과정 후, 암호화된 단백질은 재조합적으로 발현될 수 있고 상기 단백질의 활성이 결정될 수 있다.
본 발명은 안티센스 핵산 분자, 즉 본 발명의 센스(sense) 핵산에 상보적인 분자, 예를 들면 마커 mRNA 서열에 대해 상보적이거나 또는 이중 가닥 마커 cDNA의 암호화 가닥에 상보적인 분자를 포함한다. 따라서, 본 발명의 안티센스 핵산은 본 발명의 센스 핵산와 수소 결합될 수 있다(즉, 어닐링(anneal)된다). 안티센스 핵산은 전체 암호화 가닥에 또는 그것의 일부에만, 예를 들어 단백질 암호화 부위(또는 오픈리딩 프레임)의 전부 또는 부분에 상보적일 수 있다. 또한, 안티센스 핵산 분자는 마커 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 암호화 가닥의 비암호화부위의 전체 또는 부분에 안티센스일 수 있다. 비암호화부위("5' 및 3' 비번역부위")는 암호화부위 측면에 있는 5' 및 3' 서열이고 아미노산으로 번역되지 않는다.
예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그 길이가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 당업계에 알려진 화학적 합성 및 효소적 연결 반응(enzymatic ligation reaction)을 사용하여 만들 수 있다. 예를 들면, 안티센스 핵산(예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드)은 자연적으로 존재하는 뉴클레오티드를 사용하거나, 또는 분자의 생물학적 안정성이 증가되도록 또는 안티센스 및 센스 핵산 사이에서 형성된 이중체(duplex)의 물리적 안정성이 증가되도록 고안된, 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있고, 예를 들면 포스포로티오에이트 유도체(phosphorothioated derivatives) 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드(acridine substituted nucleotide)가 사용될 수 있다. 안티센스 핵산을 만들기 위해 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예는 5-플루오로우라실(fluorouracil), 5-브로모우라실(bromouracil), 5-클로로우라실(chlorouracil), 5-이오도우라실(iodouracil), 하이포잔틴(hypoxanthine), 잔틴(xanthine), 4-아세틸시토신(acetylcytosine), 5-(카르복시하이드록시메틸)우라실[(carboxyhydroxylmethyl) uracil], 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘(5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine), 5-카르복시메틸아미노메틸우라실(carboxymethylaminomethyluracil), 디하이드로우라실(dihydrouracil), 베타-D-갈락토실퀴오신(beta-D-galactosylqueosine), 이노신(inosine), N6-이소펜테닐아데닌(isopentenyladenine), 1-메틸구아닌(methylguanine), 1-메틸이노신(methylinosine), 2,2-디메틸구아닌(dimethylguanine), 2-메틸아데닌(methyladenine), 2-메틸구아닌(methylguanine), 3-메틸시토신(methylcytosine), 5-메틸시토신(methylcytosine), N6-아데닌(adenine), 7-메틸구아닌(methylguanine), 5-메틸아미노메틸우라실(methylaminomethyluracil), 5-메톡시아미노메틸-2-티오두라실(5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil), 베타-D-만노실퀴오신(beta-D-mannosylqueosine), 5'-메톡시카르복시메틸우라실(methoxycarboxymethyluracil), 5-메톡시우라실(methoxyuracil), 2-메톡실티오-N6-이소펜테닐아데닌(2-methylthio-N6-isopentenyladenine), 우라실-5-옥시아세트산(uracil-5-oxyacetic acid (v)), 위부톡소신(wybutoxosine), 수도우라실(pseudouracil), 퀴오신(queosine), 2-티오시토신(thiocytosine), 5-메틸-2-티오우라실(5-methyl-2-thiouracil), 2-티오우라실(thiouracil), 4-티오우라실(thiouracil), 5-메틸우라실(methyluracil), 우라실-5-옥시아세틱산 메틸 에스테르(uracil-5-oxyacetic acid methylester), 우라실-5-옥시아세틱산(uracil-5-oxyacetic acid (v)), 5-메틸-2-티오우라실(5-methyl-2-thiouracil), 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실[3-(3-amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil(acp3)w], 그리고 2,6-디아미노퓨린(diaminopurine)을 포함한다. 또는, 안티센스 핵산은 안티센스 방향으로 핵산이 서브클론된 발현 벡터(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 관심있는 표적 핵산에 대해 안티센스 방향이며, 이는 하기 세부항목에 기술되어 있다)를 이용하여 생물학적으로 생산될 수 있다.
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 일반적으로 개체에 투여되거나 또는 인시추(in situ)에서 만들어지고, 즉 그들은 세포 mRNA 및/또는 마커 단백질을 암호화하는 유전체 DNA와 혼성화되거나 또는 그에 결합함으로써, 예를 들면 전사 및/또는 번역을 억제함으로써 마커의 발현을 억제한다. 혼성화는 안정적인 이중체를 형성하기 위한, 또는 예를 들면 DNA 이중체와 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에, 이중 나선(double helix)의 깊은 홈(major groove)에서 특이적 상호결합을 통한 일반적인 핵산의 상보성에 의한 것일 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자의 투여 경로의 예는 조직 부위에 직접 투여 또는 종양적 장애-관련 체액으로 안티센스 핵산의 인퓨젼(infusion)을 포함한다. 또는, 안티센스 핵산 분자는 선별된 세포를 표적하기 위해 변형될 수 있고, 그 후 전신적으로(systemically) 투여될 수 있다. 예를 들면, 전신 투여(systemic administration)을 위해, 안티센스 분자는 선별된 세포 표면에 발현하는 수용체 또는 항원과 특이적으로 결합하도록, 예를 들면, 안티센스 핵산 분자를 세포 표면의 수용체 또는 항원에 결합하는, 펩티드 또는 항체에 연결시킴으로써 변형될 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 여기서 기술된 벡터를 사용하여 세포로 운반될 수 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 달성하기 위하여, 안티센스 핵산 분자가 강력한 pol II 또는 pol III 프로모터의 조절하에 놓이도록 만들어진 벡터 구조물이 바람직하다.
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머(anomeric) 핵산 분자일 수 있다. α-아노머 핵산 분자는 일반적인 α-유닛과 대조적으로, 가닥이 서로 평행한, 상보적 RNA와 함께 특이적 이중 가닥 하이브리드(hybrid)를 형성한다(Gaultier et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). 또한, 안티센스 핵산 분자는 2'-O-메틸리보뉴클레오티드(methylribonucleotide) (Inoue et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148)또는 키메라 RNA-DNA 유사체(Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 리보자임(ribozyme)을 포함할 수 있다. 리보자임은 상보적 부위를 갖는 단일 가닥 핵산, 예를 들면 mRNA와 같은 것을 절단할 수 있는 리보뉴클레아제(ribonuclease) 활성을 갖는, 촉매적(catalytic) RNA 분자이다. 따라서, 리보자임[예를 들면, Haselhoff and Gerlach, 1988, Nature 334:585-591에 기술되어 있는 해머헤드 리보자임(hammerhead ribozyme)]은 촉매적으로 mRNA 전사체를 절단하는데 사용될 수 있음으로써, mRNA에 의해 암호화된 단백질의 번역을 억제한다. 마커 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 대해 특이성을 갖는 리보자임은 상기 마커에 상응하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 고안될 수 있다. 예를 들면, 테트라하이메나(Tetrahymena) L-19 IVS RNA의 유도체는 활성 부위(active site)의 뉴클레오티드 서열이 절단될 뉴클레오티드 서열에 상보적인 곳에서 만들어질 수 있다(Cech et al. U.S. Patent No. 4,987,071; 및 Cech et al. U.S. Patent No. 5,116,742 참조). 또는, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA는 RNA 분자의 풀(pool)로부터 특이적 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA를 선별하는데 사용될 수 있다(예를 들면, Bartel and Szostak, 1993, Science 261:1411-1418 참조).
또한, 본 발명은 삼중 나선 구조(triple helical structure)를 형성하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 마커의 발현은 마커 핵산 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 조절부위[예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서(enhancer)]에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 표적하여 표적 세포에서 유전자의 전사를 차단하는 삼중 나선 구조를 형성하게 함으로써 억제될 수 있다. 일반적으로, Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; 및 Maher (1992) Bioassays 14(12):807-15를 참조한다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 핵산 분자는 예를 들면 안정성, 혼성화, 또는 분자의 용해성(solubility)을 개선시키기 위하여 염기 모이어티(base moiety), 당(sugar) 모이어티 또는 포스페이트 뼈대(phosphate backbone)에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 핵산의 데옥시리보오즈 포스페이트 뼈대(deoxyribose phosphate backbone)은 펩티드 핵산을 만들기 위해 변형될 수 있다(Hyrup et al., 1996, Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23를 참조). 여기서 사용되는, "펩티드 핵산" 또는 "PNA"는 데옥시리보오즈 포스페이트 뼈대가 수도펩티드 뼈대(pseudopeptide backbone)로 치환되고 오직 4개의 자연적 뉴클레오염기가 남아있는 핵산 모방체(mimic), 예를 들면 DNA 모방체를 의미한다. PNA의 중성 뼈대(neutral backbone)은 낮은 이온 강도의 조건하에서 DNA 및 RNA와 특이적 혼성화를 허용하는 것으로 나타난다. PNA 올리고머의 합성은 Hyrup et al. (1996), supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675에 기술된 것과 같은 일반적인 고체상 펩티드 합성 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다.
PNA는 치료적 및 진단적 적용에 사용될 수 있다. 예를 들면, PNA는 예를 들면, 전사 또는 번역 정지(arrest)를 유도하거나 또는 복제를 억제함으로써 유전자 발현의 서열-특이적 조절을 위해 안티센스 또는 안티유전자 제제(agent)로서 사용될 수 있다. 또한, PNA는 예를 들면, 유전자에서 단일 염기쌍 돌연변이의 분석에서, 예를 들면 PNA 지정 PCR 클램핑(PNA directed PCR clamping)에 의해서; 다른 효소, 예를 들면 S1 뉴클레아제와 병용되어 사용될 때, 인공적인 제한 효소로서(상기 Hyrup, 1996)); DNA 서열 및 혼성화를 위한 탐침 또는 프라이머로서(상기 Hyrup, 1996; Perry-O'Keefe et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675) 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서, PNA는 예를 들면 그들의 안정성 또는 세포 흡수(cellular uptake)를 증진시키기 위해서 지질친화기(lipophilic group) 또는 다른 도움기(helper group)를 PNA에 결합시킴으로써, PNA-DNA 키메라를 형성함으로써, 또는 리포좀(liposome) 또는 당업계에 알려진 다른 약물 전달 기술을 사용함으로써 변형될 수 있다. 예를 들면, PNA-DNA 키메라는 생성될 수 있는데, 이것은 PNA 및 DNA의 이로운 특징을 결합시킬 수 있는 것이다. 상기 키메라는 DNA 인지 효소, 예를 들면 RNase H 및 DNA 중합효소(polymerase)가 DNA 부분과 상호작용하도록 허용하는 반면, PNA 부분은 높은 결합 친화력 및 특이성을 제공한다. PNA-DNA 키메라는 염기 스태킹(base stacking), 뉴클레오염기 사이의 결합 수, 그리고 방향의 측면에서 선별된 적절한 길이의 링커(linker)를 사용하여 연결될 수 있다(상기 Hyrup, 1996). PNA-DNA 키메라의 합성은 상기 Hyrup (1996), 그리고 Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63에 기술된 것과 같이 수행될 수 있다. 예를 들면, DNA 사슬은 일반적인 포스포라이디트 커플링 화학(standard phosphoramidite coupling chemistry) 및 변형된 뉴클레오티드 유사체를 사용하여, 고체 지지대에서 합성될 수 있다. PNA 및 DNA의 5' 말단 사이의 연결로서 5'-(4-메톡시트리틸)아미노-5'-데옥시-티미딘 포스포라미디트(5'-(4-methoxytrityl)amino-5'-deoxy-thymidine phosphoramidite)와 같은 화합물을 사용할 수 있다(Mag et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:5973-88). 그 후 PNA 모노머는 단계적으로 결합되어 5' PNA 부분 및 3' DNA 부분을 갖는 키메라 분자를 생산한다(Finn et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63). 또는, 키메라 분자는 5' DNa 부분 및 3' PNA 부분으로 합성될 수 있다(Peterser et al., 1975, Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124).
다른 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 펩티드(예를 들면, 생체내에서 숙주 세포 수용체를 표적하기 위한), 또는 세포막 통과를 촉진시키는 제제(예를 들면, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT Publication No. WO 88/09810 참조)와 같은 다른 첨부기(appended group) 또는 혈액 뇌관문(blood-brain barrier) (예를 들면, PCT Publication No. WO 89/10134를 참조)를 포함할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 혼성화-야기 절단 제제(hybridization-triggered cleavage agents) (예를 들면, Krol et al., 1988, Bio/Techniques 6:958-976 참조) 또는 끼어들기 약물(intercalating agents) (예를 들면, Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549 참조)와 함께 변형될 수 있다. 마지막으로, 올리고뉴클레오티드는 또 다른 분자, 예를 들면 펩티드, 혼성화 매개 연결 제제(hybridization triggered cross-linking agent), 수송 제제(transport agent), 혼성화-야기 절단 제제 등과 결합될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산에 상보적인 최소 하나를 갖는 분자 표지 핵산(molecular beacon nucleic acid)을 포함하고, 즉 상기 분자 표지는 시료에 있는 핵산의 존재를 정량하는데 유용하다. "분자 표지(molecular beacon)" 핵산은 상보적인 부위를 포함하고 형광단(fluorophore) 및 그와 결합된 형광 정지제(fluorescent quencher)를 가진다. 형광단 및 정지제는 상보적 부위가 또 다른 부위와 어닐링될 때, 형광단의 형광은 정지제에 의해 정지된다는 방향(orientation)에서 핵산의 상이한 부분과 관련이 있다. 핵산의 상보적 부위가 또 다른 부위와 어닐링되지 않을 때, 형광단의 형광은 더욱 낮은 수준으로 정지된다. 분자 표지 핵산은, 예를 들면 U.S. Patent 5,876,930에 기술되어 있다.
2. 분리된 단백질 및 항체
본 발명의 한 측면은 분리된 마커 단백질 및 그것의 생물학적 활성 부위(biologically acitve portion)뿐만 아니라 마커 단백질 및 그의 단편에 대한 항체를 생상하기 위해 면역원(immunogen)으로서 사용하기에 적절한 폴리펩티드 단편에 관한 것이다. 한 실시예에서, 원형 마커 단백질(native marker protein)은 일반적인 단백질 정제 기술을 사용하여 적절한 정제 개요에 의해 세포 또는 조직 출처로부터 분리될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 마커 단백질의 전제 또는 부분을 포함하는 단백질 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 재조합 발현에 대안적으로, 상기 단백질 또는 펩티드는 일반적인 펩티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
"분리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 그것의 생물학적 활성 부분은 상당히 자유로운 세포 물질 또는 상기 단백질이 유래된, 세포 또는 조직 출처로부터 다른 오염된 단백질, 또는 화학적으로 합성되었을 때 상당히 자유로운 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이다. "상당히 자유로운 세포 물질"이라는 말은 단백질을 분리하거나 또는 재조합적으로 생산한 세포의 세포 구성성분으로부터 분리된 상기 단백질의 준비를 포함한다. 따라서, 상당히 자유로운 세포 물질인 단백질은 이형 단백질(heterologous protein)의 약 30%, 20%, 10%, 또는 5%이하(건조 무게에 의한)를 갖는 단백질의 준비를 포함한다(또는 여기에서 "오염된 단백질(contaminating protein)"이라고 명명). 상기 단백질 또는 그것의 생물학적 활성 부분이 재조합적으로 생산되었을 때, 상당히 자유로운 배양액도 바람직하고, 즉 배양액은 단백질 제조부피의 약 20%, 10%, 또는 5% 이하인 것을 나타낸다. 상기 단백질이 화학적 합성에 의해 생산되었을 때, 상당히 자유로운 화학적 전구체 또는 다른 화학물질인 것은 바람직하고, 즉 상기 단백질의 합성에 관련된 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 상기 단백질의 제조는 관심있는 폴리펩티드 이외의 화학적 전구체 및 화합물의 약 30%, 20%, 10%, 5% 이하를 갖는다.
마커 단백질의 생물학적 활성 부분은 마커 단백질의 아미노산 서열로부터 유래되거나 또는 그와 충분히 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 이것은 전장 단백질보다 적은 아미노산을 포함하고, 그에 상응하는 전장 단백질의 최소 하나의 활성을 나타낸다. 일반적으로, 생물학적 활성 부분은 그에 상응하는 전장 단백질의 최소 하나의 활성을 갖는 도메인(domain) 또는 모티프(motif)를 포함한다. 본 발명의 마커 단백질의 생물학적 활성 부분은 폴리펩티드일 수 있으며, 그 길이는 예를 들면 10, 25, 50, 100 또는 그 이상의 아미노산을 갖는다. 또한, 마커 단백질의 다른 부위가 결실된, 다른 생물학적 활성 부분은 재조합 기술에 의해 준비될 수 있고 마커 단백질의 원형(native form)의 기능적 활성의 하나 또는 그 이상에 대해 조사할 수 있다.
바람직한 마커 단백질은 서열 번호(nts)의 어떠한 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 다른 유용한 단백질은 상기 서열의 하나와 상당히 동일하고(예를 들면, 최소 약 40%, 바람직하게 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%), 그에 상응하는 자연적으로 존재하는 마커 단백질의 기능적 활성을 보유하지만, 자연적 대립유전자 변이 또는 돌연변이과정에 의해 아미노산 서열이 상이하다.
두 개의 아미노산 서열 또는 핵산의 상동성 퍼센트를 결정하기 위하여, 서열을 최적 비교(optimal comparison) 목적을 위해 배열하였다(align) (예를 들면, 갭은 최적 배열을 위해 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열과 함께 첫 번째 아미노산의 서열 또는 핵산 서열에 도입될 수 있다). 그 후, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드는 비교된다. 첫 번째 서열에서 위치는 두 번째 서열에서 그와 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산에 의해 채워질 때, 그 후 상기 분자는 그 위치에서 동일하다. 바람직하게, 두 서열 사이의 상동성 퍼센트는 전반적 배열(global alignment)을 사용하여 산출된다. 또는, 두 서열 사이의 상동성 퍼센트는 국지적 배열(local alignment)를 사용하여 산출된다. 두 서열 사이의 상동성 퍼센트는 상기 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 기능이다[즉, 상동성 % = 동일한 위치의 수(#) / 전체 위치의 #(예를 들면, 겹쳐진 위치) x 100]. 하나의 실시예에서, 두 서열은 길이가 동일하다. 또 다른 실시예에서는, 두 서열의 길이가 동일하지 않다.
두 서열 사이의 상동성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 산출될 수 있다. 두 서열의 비교를 위한 수학적 알고리즘의 바람직한, 비제한적 예는 Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877에서의 변형의 알고리즘이다. 상기 알고리즘은 Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410의 BLASTN 및 BLASTX 프로그램으로 통합되었다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 BLASTN 프로그램, 점수(score)=100, 글자 길이(wordlength)=12와 함께 수행되어 본 발명의 핵산 분자와 동일한 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 BLASTN 프로그램, 점수(score)=50, 글자 길이(wordlength)=3과 함께 수행되어 본 발명의 단백질 분자와 동일한 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위해 갭이 있는 배열(gapped alignment)을 얻기 위해서, Gapped BLAST라고 불리는 새로운 BLAST 알고리즘의 신규 버젼을 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에서 기술된 것과 같이 이용할 수 있고, 이것은 BLASTN, BLASTP 및 BLASTX 프로그램을 위한 갭이 있는 국지적 배열(gapped local sequence)을 수행할 수 있다. 또는, PSI-Blast는 분자 사이의 떨어진 관계를 탐지하는 반복 검색을 수행하기 위해 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST, 그리고 PSI-Blast 프로그램이 사용될 때, 각 프로그램의 디폴츠 변수(default parameter) (예를 들면, BLASTX 및 BLASTN)는 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다. 서열의 비교를 위해 사용하는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직하고 비제한적인 예는 Myers and Miller, (1988) CABIOS 4:11-17의 알고리즘이다. 상기 알고리즘은 GCG 서열 배열 소프트웨어 팩키지(package)의 부분인 ALIGN 프로그램(2.0 버젼)으로 통합되었다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM120 무게 잔기 표(weight residue table), 12의 갭 길이 페널티(gap length penalty), 그리고 갭 페널티(gap penalty)를 사용할 수 있다. 국지적 서열 유사성 및 배열의 부위를 동정하기 위한 또 다른 유용한 알고리즘은 Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448에 기술된 FASTA 알고리즘이다. 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 비교하기 위해 FASTA 알고리즘을 사용할 때, 예를 들면, PAM120 주게 잔기 표를 2의 κ-튜블값(tuple value)와 함께 사용할 수 있다.
두 서열 사이의 상동성 퍼센트는 상기 기술된 것과 유사한 기술을 사용하여 허용되는 갭의 존재 여부와 상관없이, 결정될 수 있다. 상동성 퍼센트는 산출할 때, 오직 정확한 배치만을 센다.
또한, 본 발명은 마커 단백질 또는 그것의 부분을 포함하는 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 여기서 사용된 것과 같이, "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 이형 폴리펩티드(즉, 마커 단백질이 아닌 다른 폴리펩티드)와 작동되도록 연결된 마커 단백질의 전체 또는 부분(바람직하게는 생물학적 활성 부분)을 포함한다. 융합 단백질 내에서, "작동 가능한 연결(operably linked)"의 용어는 마커 단백질 또는 그것의 부분 및 이형 폴리펩티드가 인프레임(in-frame)에서 서로 융합되었다는 것을 의미하려는 의도를 가진다. 이형 폴리펩티드는 마커 단백질 또는 부분의 아미노 말단 또는 카르복실 말단에 융합될 수 있다.
하나의 유용한 융합 단백질은 마커 단백질 또는 그 부분이 GST 서열의 카르복실 말단에 융합된 GST 융합 단백질이다. 상기 융합 단백질은 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 정제를 촉진시킨다.
또 다른 실시예에서, 상기 융합 단백질은 그 아미노 말단에서 이형 신호 서열(heterologous signal sequence)을 포함한다. 예를 들면, 마커 단백질의 원형 신호 서열(native signal sequence)는 제거되고 다른 단백질로부터의 신호서열로 치환될 수 있다. 예를 들면, 바큘로바이러스 외피 단백질(baculovirus envelope protein)의 gp67 분비 서열(secretory sequence)은 이형 신호 서열로서 사용될 수 있다(Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1992). 진핵세포 이형 신호 서열의 다른 예는 멜리틴(melittin) 및 인간 태반 알칼리성 포스파타아제(human placental alkaline phosphatase)의 분비 서열을 포함한다(Stratagene; La Jolla, California). 또 다른 실시예에서, 유용한 원핵세포 이형 신호 서열은 phoA 분비 서열(상기 Sambrook et al.) 및 단백질 분비 서열(Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey)을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 융합 단백질은 마커 단백질의 전체 또는 부분이 면역글로불린 단백질 패밀리의 멤버로부터 유래된 서열에 융합된 면역글로불린 융합 단백질이다. 본 발명의 면역글로불린 융합 단백질은 약학적 조성물에 통합될 수 있고, 개체에 투여되어 리간드(ligand) [녹는 형태(soluble form) 또는 막결합 형태(membrane-bound form)] 및 세포 표면에 있는 단백질(수용체) 사이의 상호결합을 억제할 수 있음으로써, 생체내에서 신호 전달을 억제한다. 면역 글로불린 융합 단백질은 마커 단백질의 동계 리간드(cognate ligand)의 생물학적 이용가능성에 영향을 주기 위해 사용될 수 있다. 리간드/수용체 상호결합의 억제는 증식성 또는 분화성 질환 모두를 치료하고 및 세포 생존을 조절(예를 들면, 증진 또는 억제)하기 위해 치료적으로 유용할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역글로불린 융합 단백질은 개체에서 마커 단백질에 대한 항체를 생산하고, 리간드와 마커 단백질의 상호결합을 억제하는 분자를 동정하기 위한 스크리닝 검사에서 리간드를 정제하기 위해 면역원으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 키메라 및 융합 단백질은 일반적인 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 융합 유전자는 자동 DNA 합성기를 포함한 일반적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 또는, 키메라 유전자 서열을 생성하기 위해 연속적으로 어닐링되고 재증폭될 수 있는 두 개의 연속적인 유전자 단편 사이에서 상보적 돌출(complementary overhang)을 야기하는 앵커 프라이머(anchor primer)를 사용하여, 유전자 단편의 PCR 증폭을 수행할 수 있다(예를 들면, 상기 Ausubel et al. 참조). 또한, 이미 융합 모이어티(예를 들면, GST 폴리펩티드)를 암호화하는 많은 발현 벡터는 상업적으로 이용가능하다. 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 본 발명의 폴리펩디드에 인프레임으로 융합 모이어티가 연결된 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
신호 서열은 마커 단백질의 분비 및 분리를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 신호 서열은 일반적으로 하나 또는 그 이상의 절단(cleavage event)에서, 분비되는 동안 성숙 단백질로부터 일반적으로 절단된 소수성 아미노산의 중심(core)에 의해 특징화될 수 있다. 상기 신호 펩티드는 그들이 분비 경로(secretory pathway)를 통과하는, 성숙 단백질로부터의 신호 서열을 허용하는 처리될 부위를 포함한다. 따라서, 본 발명은 마커 단백질, 융합 단백질 또는 신호 서열을 갖는 그것의 부분뿐만 아니라 신호 서열이 단백질가수분해적(proteolytically)으로 절단된 상기 단백질(즉, 절단된 생산물)을 포함한다. 하나의 실시예에서, 신호서열을 암호화하는 핵산 서열은 발현 벡터에서, 마커 단백질 또는 그것의 부분과 같은 관심있는 단백질과 작동가능하도록 연결될 수 있다. 신호 서열은 예를 들면 발현 벡터가 형질도입된 진핵세포 숙주로부터 상기 단백질의 분비의 방향을 알려주고, 상기 신호 서열은 그 후에 또는 동시에 절단된다. 그 후, 상기 단백질은 당업계에 알려진 방법에 의해 세포외 배지로부터 용이하게 정제될 수 있다. 또는, 상기 신호 서열은 정제를 촉진시키는 서열, 예를 들면 GST 도메인과 같은 것을 사용하여 관심있는 단백질과 연결될 수 있다.
또한, 본 발명은 마커 단백질의 변이에 관한 것이다. 상기 변이는 작용제(모방체) 또는 길항제 중 하나로 기능을 하는, 변화된 아미노산 서열을 갖는다. 변이는 돌연변이과정, 예를 들면 구별된 점 돌연변이(point mutation) 또는 끊기(truncation)에 의해 만들어질 수 있다. 작용제(agonist)는 자연적으로 존재하는 단백질 형태의 생물학적 활성과 상당히 동일하거나 또는 그 부분을 보유할 수 있다. 단백질의 길항제(antagonist)는 예를 들면 관심있는 단백질을 포함하는 세포내 신호 캐스케이드(cascade)의 하부(downstream) 또는 상부(upstream) 멤버와의 경쟁적 결합에 의해 자연적으로 존재하는 단백질의 활성의 하나 또는 그 이상을 억제할 수 있다. 따라서, 특이적 생물학적 효과는 제한된 기능의 변이를 처리함으로써 유도될 수 있다. 자연적으로 존재하는 단백질의 생물학적 활성의 부분을 갖는 변이를 개체에 처리하는 것은 자연적으로 존재하는 상기 단백질을 처리하는 것과 비교하여, 개체내에서 더욱 적은 부작용을 가진다.
작용제(모방체) 또는 길항제로서 기능을 하는 마커 단백질의 변이는 작용제 또는 길항제 활성에 대한, 본 발명의 단백질의 돌연변이의 결합 라이브러리(combinatorial library), 예를 들면 끊기 돌연변이(truncation mutants)를 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 하나의 실시예에서, 변이의 다양한 라이브러리는 핵산 수준에서 결합적 돌연변이과정(combinatorial mutagenesis)에 의해 생산되고 다양한 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. 변이의 다양한 라이브러리는, 예를 들면 화학적 올리고뉴클레오티드의 혼합물이, 잠재적 단백질 서열의 축퇴 세트(degenerate set)가 각각의 폴리펩티드, 또는 그렇지 않으면 더욱 큰 융합 단백질[예를 들면, 페이지 디스플레이(phage display)]로서 발현될 수 있는 유전자 서열에 효소적으로 연결됨으로써 생산될 수 있다. 축퇴적(degenerate) 올리고뉴클레오티드 서열로부터 마커 단백질의 잠재적 변이의 라리브러리를 생산하는데 이용될 수 있는 여러 가지 방법이 있다. 축퇴적 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들면, Narang, 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura et al., 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., 1984, Science 198:1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acid Res. 11:477 참조).
또한, 마커 단백질의 부분 라이브러리는 스크리닝을 위한 폴리펩티드의 다양한 집단을 생성하고 및 그 후 다양한 마커 단백질 및 그것의 단편의 선별하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 암호화하는 서열 단편의 라이브러리는, 흠내기(nicking)가 분자당 약 한 번만 일어나고, 이중가닥 DNA가 변성(denaturation)되며, 상기 DNA가 상이하게 흠이 난 생산물로부터 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중가닥 DNA를 형성하도록 복원(renaturation)되고, 단일가닥 부분이 재형성된 이중체로부터 S1 뉴클레아제 처리에 의해 제거되고, 그리고 그 결과 단편 라이브러리가 발현 벡터로 연결되는 조건하에서, 관심있는 암호화하는 서열의 이중가닥 PCR 단편을 뉴클레아제로 처리함으로써 생성될 수 있다. 이 방법에 의해, 발현 라이브러리는 유도될 수 있고, 이는 아미노 말단 및 관심있는 단백질의 다양한 크기의 내부 단편을 암호화한다.
점 돌연변이 또는 끊기에 의해 만들어진 결합 라이브러리의 유전자 생산물을 스크리닝 및 선별된 특징을 갖는 유전자 생산물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 여러 가지 기술이 당업계에 알려져 있다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한, 빠르고 정확한 분석(high through-put analysis)에 적합한, 가장 광범위하게 사용되는 기술은 일반적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터에 클로닝하는 것, 적절한 세포에 상기 결과의 벡터 라이브러리를 형질전환시키는 것, 그리고 생산물이 탐지되는 유전자를 암호화하는 벡터의 분리를 촉진시키는 바람직한 활성을 갖는 조건하에서 조합 유전자(combinatorial gene)를 발현시키는 것을 포함한다. 라이브러리에서 기능적 돌연변이의 빈도를 증진시키는 반복 집단 돌연변이(recursive ensemble mutagenesis; REM)를 본 발명의 단백질의 변이를 동정하기 위한 스크리닝 검사화 병용하여 사용할 수 있다(Arkin and Yourvan, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993, Protein Engineering 6(3):327- 331).
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 단백질에 대한 항체에 관한 것이다. 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 특이적으로 마커 단백질 또는 그것의 단편에 결합한다. 여기서 상호 교환적으로 사용되는, "항체" 및 " 항체들"이란 용어는 면역글로불린 분자뿐만 아니라 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분(즉, 마커 단백질과 같은 항원, 예를 들면 마커 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 부분)을 포함하는, 그것의 단편 및 유도체를 의미한다. 본 발명의 단백질과 특이적으로 결합하는 항체는 상기 단백질과 결합하지만, 상기 단백질을 자연적으로 포함하는 시료, 예를 들면 생물학적 시료에 있는 다른 분자와 거의 결합하지 않는다. 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 예는 단일 사슬 항체(single-chain antibodies; scAb), F(ab) 및 F(ab')2 단편을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 분리된 단백질 또는 그것의 단편은 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 전장(full-length) 단백질이 사용될 수 있고, 또는 그렇지 않으면 본 발명은 면역원으로서의 용도를 위한 항원 펩티드 단편을 제공한다. 본 발명의 단백질의 항원 펩티드는 본 발명의 단백질 하나의 아미노산 서열의 최소 8(바람직하게는 10, 15, 20, 또는 30 또는 그 이상)개 아미노산 잔기를 포함하고, 그리고 상기 단백질의 최소 하나의 에피토프를 포함하며, 즉 상기 펩티드에 대하여 생산된 항체는 상기 단백질과의 특이적 면역 복합체를 형성한다. 항원 펩티드에 의해 포함되는, 바람직한 에피토프는 상기 단백질의 표면에 위치한 부위, 예를 들면 친수성 부위이다. 소수성 서열 분석, 친수성 서열 분석, 또는 유사한 분석은 친수성 부위를 동정하는데 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 분리된 마커 단백질 또는 그것은 단편은 면역원으로서 사용된다.
면역원은 일반적으로 토끼, 염소, 생쥐, 또는 다른 포유류 또는 척추동물과 같은 적절한[즉 면역능력이 있는(immunocompetent)] 개체를 면역화시킴으로써 항체를 제조하기 위해 사용된다. 적절한 면역원 제조는, 예를 들면 재조합적으로 발현되거나 또는 화학적으로 합성된 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 제조는 나아가 프로인트 완전면역보강제(Freund's complete adjuvant) 또는 불완전면역보강제(Freund's incomplete adjuvant)와 같은 보강제(adjuvant), 또는 유사한 면역자극제제를 포함한다. 바람직한 면역원 조성물(immunogen composition)은 인간 단백질이 아닌 것을 포함하는 것, 예를 들면 본 발명의 단백질의 재조합 발현을 위한 비인간 숙주 세포를 사용하여 만들어진 면역원 조성물과 같은 것이다. 상기와 같은 방법에서, 그 결과인 항체 조성물은 본 발명의 단백질이 아닌 다른 인간 단백질에 결합하지 않거나 또는 감소한 결합을 가진다.
본 발명은 다중클론(polycolnal) 및 단일클론(monoclonal) 항체를 제공한다. 여기서 사용하는 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"이란 용어는 특정 에피토프와 면역반응을할 수 있는 항원 결합 부위의 단 하나의 종(species)를 포함하는 항원 분자의 집단을 의미한다. 바람직한 다중클론 및 단일클론 항체 조성물은 본 발명의 단백질에 대한 항체를 위해 선별된 것이다. 특히, 바람직한 다중클론 및 단일클론 항체 준비는 마커 단백질 또는 그것의 단편에 대한 항체만을 포함한 것이다.
다중클론 항체는 면역원으로서 본 발명의 단백질로 적절한 개체를 면역화시킴으로써 제조될 수 있다. 면역화된 개체에서 항체 타이터(titer)는 고정된 폴리펩티드를 사용한 효소결합면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA)과 같은 일반적인 기술에 의해 시간에 따라 모니터될 수 있다. 면역화 후 적절한 시간대에, 예를 들면 특이적 항체 타이터가 가장 높을 때, 항체-생산 세포를 개체로부터 수거할 수 있고, Kohler 및 Milstein (1975) Nature 256:495-497에 원래 기술된 하이브리도마(hybridoma) 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72 참조), the EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., pp. 77-96 In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985 참조) 또는 트리오마 기술(trioma techniques)과 같은 일반적인 기술에 의해 단일클론 항체를 생산하기 위해 사용할 수 있다. 하이브리도마를 생산하기 위한 기술은 잘 알려져 있다(일반적으로, Current Protocols in Immunology, Coligan et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994 참조). 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 예를 들면 일반적인 ELISA검사를 사용하여, 관심있는 폴리펩티드에 결합하는 항체를 위해 하이브리도마 배양 상층액을 스크리닝함으로써 탐지된다.
단일클론 항체-분비 하이브리도마를 제조하는 다른 방법으로, 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리(recombinant combinatorial immunoglobulin library) [예를 들면, 항체 페이지 디스플레이 라이브러리(antibody phage display library)]를 관심있는 폴리펩티드와 함께 스크리닝함으로써, 본 발명의 단백질에 대한 단일클론 항체를 동정할 수 있고 분리할 수 있다. 페이지 디스플레이 라이브러리를 만들고 스크리닝하기 위한 키트는 상업적으로 이용가능하다(예를 들면, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Catalog No. 240612를 참조). 추가적으로, 특히 항체 디스플레이 라이브러리를 만들고 스크리닝하는 용도를 위해 적절한 방법 및 시약의 예는, 예를 들면 U.S. Patent No. 5,223,409; PCT Publication No. WO 92/18619; PCT Publication No. WO 91/17271; PCT Publication No. WO 92/20791; PCT Publication No. WO 92/15679; PCT Publication No. WO 93/01288; PCT Publication No. WO 92/01047; PCT Publication No. WO 92/09690; PCT Publication No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275- 1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734에서 찾아볼 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 제공한다. 바람직한 실시예에서, 재조합 항체는 특이적으로 마커 단백질 또는 그것의 단편과 결합한다. 재조합 항체는 키메라 및 인간 및 비인간 부분, 단일 사슬 항체 및 다중 특이적 항체를 포함한 인간화된 단일클론 항체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종(species)로부터 유래된 분자이고, 예를 들면 생쥐의 mAb로부터 유래된 가변부위 및 인간 면역글로불린의 불변 부위를 갖는다(예를 들면, Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; 및 그 전문이 여기서 참고문헌으로 통합된 Boss et al., U.S. Patent No. 4,816,397을 참조). 단일 사슬 항체는 항원 결합 부위를 갖고 단일 폴리펩티드로 구성된다. 그들은 당업계에 알려진 기술, 예를 들면 Ladner et. al U.S. Pat. No. 4,946,778(전문이 여기서 참고문헌으로 통합); Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Whitlow et al., (1991) Methods in Enzymology 2:1-9; Whitlow et al., (1991) Methods in Enzymology 2:97-105; 및 Huston et al., (1991) Methods in Enzymology Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications 203:46-88에 기술된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 다중 특이적 항체는 특이적으로 상이한 항원에 결합하는, 최소 2개의 항원 결합 부위를 갖는 분자이다. 상기 분자는 당업계에 알려진 기술, 예를 들면 Segal, U.S. Patent No. 4,676,980(전문이 참고문헌으로서 여기에 통합됨); Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Whitlow et al., (1994) Protein Eng. 7:1017-1026 및 U.S. Pat. No. 6,121,424.에 기술된 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
인간화된 항체는 비인간종으로부터의, 하나 또는 그 이상 상보성 결정 부위(complementarity determining regions; CDRs) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 부위(framework regions)를 갖는, 비인간종으로부터의 항체 분자이다(예를 들면, 그 전문이 여기에서 참고문헌으로 통합된 Queen, U.S. Patent No. 5,585,089 참조). 인간화된 단일클론 항체는 당업계에 알려진 재조합 GNA 기술, 예를 들면 PCT Publication No. WO 87/02671; European Patent Application 184,187; European Patent Application 171,496; European Patent Application 173,494; PCT Publication No. WO 86/01533; U.S. Patent No. 4,816,567; European Patent Application 125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521- 3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; 그리고 Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214; U.S. Patent 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; 및 Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060에 기술된 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
보다 구체적으로, 인간화된 항체는, 예를 들면 내생적인(endogeneous) 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 발현할 수 없지만, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 형질전환 생쥐를 사용하여 생산될 수 있다. 상기 형질전환 생쥐는 선별된 항원, 예를 들면 본 발명의 마커에 상응하는 전체 또는 일부의 폴리펩티드를 사용하여 정상적인 방법으로 면역화되었다. 상기 항원에 대한 단일클론 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 형질전환 생쥐에 의해 생산된 인간 면역글로불린 이식유전자(transgene)는 B 세포가 분화되는 동안 재조합되고, 그 후 클래스 전환(class switching) 및 체성 돌연변이(somatic mutation)를 겪는다. 따라서, 상기 기술을 이용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA IgE 항체를 생산할 수 있다. 인간 항체를 생산하기 위한 이 기술의 개요는 Lonberg 및 Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93를 참조한다. 인간 항체 및 인간 단일클론 항체를 생산하기 위한 기술 및 상기 항체들을 생산하기 위한 프로토콜의 상세한 내용은, 예를 들면 U.S. Patent 5,625,126; U.S. Patent 5,633,425; U.S. Patent 5,569,825; U.S. Patent 5,661,016; 및 U.S. Patent 5,545,806을 참조한다. 또한 Abgenix, Inc. (Freemont, CA)와 같은 회사는 상기 기술된 것과 유사한 기술을 이용하여 선별된 항원에 대한 인간 항체를 제공을 약속할 수 있다.
선별된 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체는 "안내된 선별(guided selection)"이라는 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 이 접근에서는, 선별된 비인간 단일클론 항체, 예를 들면 생취 항체가 동일한 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체의 선별을 안내하기 위해 사용된다(Jespers et al., 1994, Bio/technology 12:899-903).
본 발명의 항체는 생산 또는 합성 후에 분리될 수 있고(예를 들면, 개체의 혈액 또는 혈청으로부터), 나아가 잘 알려진 방법으로 정제될 수 있다. 예를 들면, IgG 항체는 단백질 A크로마토그래피(protein A chromatography)를 사용하여 정제될 수 있다. 본 발명의 단백질에 대해 특이적인 항체는 선별될 수 있거나 또는, 예를 들면 친화력(affinity) 크로마토그래피에 의해 정제(예를 들면 부분적으로 정제)될 수 있다. 예를 들면, 재조합적으로 발현되고 정제된(또는 부분적으로 정제된), 본 발명의 단백질은 여기세어 기술된 것과 같이 생산될 수 있고, 고체 지지대, 예를 들면 크로마토그래피 컬럼(colmun)에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된다. 그 후, 상기 컬럼은 상이한 에피토프로부터 본 발명의 단백질에 특이적인 항체를 친화력 정제(affiinity purify)하기 위해 사용될 수 있음으로써, 상당히 정제된 항체 조성물, 즉 상당히 자유로운 오염된 항체(contaminating antibody)를 생산한다. 이 문맥에서, 상당히 정제된 항체 조성물은 항체 시료가 본 발명의 바람직한 단백질의 에피토프 이외의 것에 대한 오염된 항체의 최대 30%(건조 중량의), 바람직하게는 최대 20%, 더욱 더 바람직하게는 최대 10%, 가장 바람직하게는 최대 5%(건조 중량의)를 포함한다는 것을 의미한다. 정제된 항체 조성물은 상기 조성물에 있는 항체의 최소 99%가 본 발명의 바람직한 단백질에 대한 것이라는 것을 의미한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 상당히 정제된 항체는 본 발명의 단백질의 단일 펩티드, 분비 서열(secreted sequence), 세포외 도메인, 막관통 또는 세포질 도메인 또는 세포질 막과 특이적으로 결합할 수 있다. 특히 바람직한 실시예에서, 본 발명의 상당히 정제된 항체는 본 발명 단백질의 아미노산의 분비 서열 또는 세포외 도메인과 특이적으로 결합한다. 더욱 바람직한 실시예에서, 본 발명의 상당히 정제된 항체는 마커 단백질의 아미노산 서열의 분비 서열 또는 세포외 도메인과 특이적으로 결합한다.
본 발명의 단백질에 대한 항체는 일반적인 기술, 예를 들면 친화력 크로마토그래피 또는 면역침전(immunoprecipitation)에 의하려 상기 단백질을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체는 마커 단백질 발현 패턴 및 수준을 조사하기 위해 상기 마커 단백질 또는 그것의 단편[예를 들면, 세포 용해물(cellular lysate) 또는 세포 상층액(supernatant)] 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체는 임상적인 검사 과정의 하나로서, 예를 들면 주어진 치료 요법의 사용의 효능을 결정하기 위하여, 조직 또는 체액(종양적 장애-관련 체액)에서 단백질 수준을 모니터하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 탐지는 항체 유도체의 사용에 의해 촉진될 수 있고, 이는 탐지 가능한 물질과 연결된, 본 발병의 항체를 포함한다. 탐지 가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결 분자단(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생물학적 발광물질, 그리고 방사성 물질을 포함한다. 적절한 효소의 예는 홀스라디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 또는 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase)를 포함하고; 적절한 보결 분자단의 예는 스트렙토아비딘/바이오틴(streptavidin/biotin) 및 아비딘/바이오틴(avidin/biotin)을 포함하며; 적절한 형광 물질의 예는 엄벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실 클로라이드(dansyl chloride) 또는 피코에리트린(phycoerythrin)를 포함하며, 그리고 적절한 방사성 물질은 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
또한, 본 발명의 항체는 암을 치료하는데 치료적 제제로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 완전 인간 항체는 인간 암 환자, 구체적으로 암을 가진 인간의 치료적 치료를 위해 사용될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 마커 단백질 또는 그것의 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 치료적 치료를 위해 사용된다. 나아가, 상기 치료적 항체는 항체 유도체 또는 세포 독소(cytotoxin)와 같은 치료적 모이어티와 결합된 항체를 포함하는 면역독소(immunotoxin), 치료적 제제 또는 방사성 금속 이온일 수 있다. 세포독소(cytotoxin) 또는 세포독성 제제는 세포에 치명적인 모든 제제를 포함한다. 그 예는 탁솔(taxol), 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시단 D(gramicidin D), 에티듐 브로마이드(ethidium bromide), 에메타인(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스타인(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미토산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 액티노마이신 D(actinomycin D), 1-데하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로판올올(propranolol), 그리고 푸로마이신(puromycin) 및 그들의 유사체 또는 동종체를 포함한다. 치료적 제제는 항대사성 물질(antimetabolites) [예를 들면, 메토트렉사트(methotrexate), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 시타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실 데카르바진(5-fluorouracil decarbazine)], 알킬화 제제(alkylating agent) [메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파 클로람부실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine; BSNU) 및 로무스틴(lomustine; CCNU), 사이클로스파미드(cyclothosphamide), 부술판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신 C(mitomycin C), 그리고 시스-디클로로디아민 플라티늄(cis-dichlorodiamine platinum (II); DDP) 시스플라틴(cisplatin)], 안트라사이클린 물질(anthracycline) [예를 들면, 다우노루비신(daunorubicin) (예전에는 daunomycin) 및 독소비신(doxorubicin)], 항생제(예를 들면, 다크티노마이신(dactinomycin) (예전에는 actinomycin), 블레오마이신(bleomycin), 미트라마이신(mithramycin)], 그리고 항세포분열 제제(anti-mitotic agents) [예를 들면, 빈크리스틴(vincristine) 및 빈블라스틴(vinblastine)]을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 결합된 항체는 약물 모이어티가 일반적인 화학 치료 제제로 제한되는 것으로 이해되지 않기 때문에, 주어진 생물학적 반응을 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 약물 모이어티는 바람직한 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 단백질은, 예를 들면 리보좀-억제 단백질(여기서 그 전문이 참고문헌으로 통합된 Better et al., U.S. Patent No. 6,146,631를 참조)와 같은 독소, 아브린(abrin), 리신 A(ricin A), 수도모나스 외독소(pseudomonas exotoxin), 또는 디프테리아 독소(diphteria toxin); 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 알파-인터페론(interferon), β-인터페론, 신경 성장 인자(nerve growth factor), 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor), 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator)와 같은 단백질; 또는 예를 들면, 림포카인(lymphokine), 인터루킨-1(interleukin-1; "IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과립대식세포집락자극인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor; "GM-CSF"), 과립집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor; "G-CSF"), 또는 다른 성장인자와 같은 생물학적 반응 조절제를 포함할 수 있다.
상기 치료적 모이어티를 항체에 결합시키는 기술은 잘 알려져 있고, 예를 들면 Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 그리고 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)를 참조한다.
따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 상당히 정제된 항체들, 항체 단편 및 유도체를 제공하고, 상기 모든 것은 본 발명의 단백질, 바람직하게는 마커 단백질과 특이적으로 결합한다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 상당히 정제된 항체, 또는 그것의 단편 또는 유도체는 인간, 비인간, 키메라 및/또는 인간화된 항체일 수 있다. 또 다른 측면에서 본 발명은 비인간 항체, 항체 단편 및 유도체를 제공하고, 상기 모든 것은 본 발명의 단백질, 바람직하게는 마커 단백질과 특이적으로 결합한다. 상기 비인간 항체는 염소, 원숭이, 양, 말, 닭, 토끼, 또는 쥐(rat) 항체일 수 있다. 또는 본 발명의 비인간 항체는 키메라 및/또는 인간화된 항체일 수 있다. 또한, 본 발명의 비인간 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 단일클론 항체, 항체 단편 및 유도체를 제공하고, 상기 모든 것은 본 발명의 단백질, 바람직하게는 마커 단백질과 특이적으로 결합한다. 단일클론 항체는 인간, 인간화, 키메라 및/또는 비인간 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 탐지 가능한 물질에 결합된, 본 발명의 항체, 그리고 사용을 위한 설명서를 포함한 키트를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 하나의 실시예에서, 약학적 조성물은 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
3. 예측 약물( predictive medicine )
본 발명은 진단 검사, 예측 검사, 약리유전체학, 그리고 임상 모니터가 예측적(예견적) 목적을 위해 사용되는 예측 약물의 분야에 관한 것으로써, 개개인을 예방적으로 치료한다. 따라서, 본 발명의 한 측면은, 개개인이 종양적 장애를 발달시키는 위험에 있는지 결정하기 위하여, 하나 또는 그 이상의 마커 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 결정하는 진단 검사에 관한 것이다. 상기 검사는 예측적 또는 예견적 목적을 위해 사용될 수 있음으로서 상기 질환이 시작되기 전에 개개인을 예방적으로 치료한다.
본 발명의 또 다른 측면은 임상 시험에서 본 발명의 마커의 발현 또는 활성에서 제제(예를 들면, 종양적 장애를 억제하기 위하여, 또는 어떤 다른 질환을 치료 또는 예방하기 위한{즉 상기 치료가 가질 수 있는 어떠한 발암적 효과를 이해하기 위한} 약물 또는 다른 화합물)의 영향을 모니터하는 것에 관한 것이다. 이러한 및 다른 제제는 하기의 세부사항에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
A. 진단 검사
생물학적 시료에 있는 마커 단백질 또는 핵산의 존재 또는 부재를 탐지하기 위한 예시적 방법은 검사 개체로부터 생물학적 시료(예를 들면, 종양적 장애-관련 체액)를 수득하는 것, 그리고 상기 생물학적 시료를 폴리펩티드 또는 핵산(예를 들면, mRNA, 유전체 DNA 또는 cDNA)를 탐지할 수 있는 화합물 또는 제제와 접촉시키는 것과 관련이 있다. 따라서, 본 발명의 탐지 방법은, 예를 들면 시험관내(in vitro)뿐만 아니라 생체내(in vivo)의 생물학적 시료에서 mRNA, 단백질, cDNA, 또는 유전제 DNA(genomic DNA)를 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, mRNA를 탐지하기 위한 시험관내 기술은 노던 혼성화(Nothern hybridization) 및 인시추 혼성화(in situ hybridization)를 포함한다. 마커 단백질의 탐지를 위한 시험관내 기술은 효소결합면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역침전법(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)을 포함한다. 유전체 DNA를 탐지하기 위한 시험관내 기술은 서던 혼성화(Southern hybridization)을 포함한다. mRNA를 탐지하기 위한 생체내 기술은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR), 노던 혼성화 및 인시추 혼성화를 포함한다. 또한, 단백질을 탐지하기 위한 생체내 기술은 개체로 상기 단백질 및 그것의 단편에 대한, 표지된 항체를 도입시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 항체는, 개체에서 그 존재와 위치가 일반적인 이미지 기술에 의해 탐지될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다.
상기 진단적 및 예측적 검사의 일반적인 원칙은, 상호결합하고 및 결합하는 마커 및 탐침을 허용하도록 충분한 시간동안, 적절한 조건 하에서, 마커 및 탐침을 포함할 수 있는 시료 또는 반응 혼합물을 준비하는 것과 관련이 있음으로써, 반응 혼합물에서 제거된거나 및/또는 탐지될 수 있는 복합체를 형성한다. 상기 검사는 다양한 방법으로 수행될 수 있다.
예를 들면, 상기 검사를 수행하는 하나의 방법은 상기 마커 또는 탐침을 고체 지지대에 부착시키는 것과 관련있고, 또한 기질(substrate)이라고 불리며, 그리고 상기 반응의 끝에 고체 지지대에 부착된 표적 마커/탐침 복합체를 탐지하는 것과 관련있다. 상기 방법의 하나의 실시예에서, 마커의 존재 및/또는 농도에 대해 검사되기 위하여, 개체로부터의 시료는 담체(carrier) 또는 고체상 지지대(solid phase support)에 부착될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 탐침이 고체상에 부착되는, 역상황(reverse situation)이 가능하고, 그리고 개체로부터의 시료는 상기 검사의 부착되지 않은 구성요소로서 반응될 수 있다.
고체상에 검사 구성요소를 부착시키기 위한, 수립된 많은 방법이 있다. 이것들은 제한없이, 바이오틴(biotin) 및 스트렙토아비딘(streptoavidin)의 결합을 통해 고정되는 마커 또는 탐침 분자를 포함한다. 상기 바이오틴화된 검사 구성요소는, 당업계에 알려진 기술(예를 들면, 바이오틴화 키트, Pierce Chemicals, Rockford, IL)을 이용하여 바이오틴-NHS[N-하이드록시-숙시니미드(N-hydroxy-succinimide)]로부터 준비되고, 그리고 스트렙토아비딘이 코팅된 96웰 플레이트(Pierce Chemical)의 웰에 고정될 수 있다. 특정 실시예에서, 고정된 검사 구성요소를 갖는 표면은 앞서 준비 및 저장될 수 있다.
상기 검사를 위한 다른 적절한 담체 또는 고체상 지지대는 상기 마커 및 탐침이 속하는 분자 종류에 결합할 수 있는 어떠한 물질을 포함한다. 잘 알려진 지지대 또는 담체는 유리, 폴리스티렌(polystyrene), 나일론(nylon), 폴리프로필렌(polypropylene), 나일론, 폴리에틸렌(polypropylene), 덱스트란(dextran), 아밀라아제(amylases), 자연 및 변형 셀룰로오즈(natural and modified celluloses), 폴리아크릴아미드(polyacrylamides), 반려암(gabbros), 그리고 자철석(magnetite)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
상기 언급한 접근을 사용한 검사를 수행하기 위해, 비고정(non-immobilized) 구성 요소를, 두 번째 구성요소가 부착된 고체상에 첨가한다. 상기 반응이 완료된 후에, 비복합체 구성요소를 형성된 어떠한 복합체는 고체상에 고정된 채로 남아있는 조건하에서, 제거할 수 있다(예를 들면, 세척에 의해). 고체상에 부착된 마커/탐침 복합체의 탐지는 여기서 개요된 많은 방법에서 완성될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 탐침이 검사 구성요소에 부착되지 않았을 때, 상기 탐침은 검사의 탐지 및 판독(readout)의 목적을 위해, 당업계에 잘 알려지고 및 여기서 논의된 탐지 가능한 표지물질을 사용하여 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다.
또한, 마커/탐침 복합체 형성을, 구성요소(마커 또는 탐침)의 어떤 것의 추가적 조작 또는 표지하는 것 없이, 예를 들면 형광 에너지 전이(fluorescence energy transfer)의 기술을 이용함으로써 직접적으로 탐지하는 것이 가능하다(예를 들면, Lakowicz et al., U.S. Patent No. 5,631,169; Stavrianopoulos, et al., U.S. Patent No. 4,868,103 참조). 첫 번째에서 "공여체(donor)" 분자인 형광단 표지(fluorophore label)는 적절한 파장의 입사광에 의해 흥분(excitation)된 상태에서 그것의 방출되는 형광에너지가 두 번째 "수용체(acceptor)" 분자에 있는 형광 표지에 의해 흡수될 것이 선별되고, 두 번째 분자는 흡수된 에너지 때문에 다시 형광을 낼 수 있다. 또는 공여체 단백질은 단순하게 트립토판 잔기의 자연적 형광 에너지를 이용할 수 있다. "수용체" 분자 표지가 "공여체"의 것으로부터 구별될 수 있는, 빛의 상이한 파장에서 방출되는 표지가 선택된다. 상기 표지 사이의 에너지 전이의 효능은 두 분자의 분리된 거리와 관련이 있기 때문에, 상기 분자 사이의 공간적 관계(spatial relationship)가 검사될 수 있다. 두 분자 사이에 결합이 일어날 수 있는 상황에서, 검사에서의 "수용체" 분자 표지의 형광 방출은 최대이어야 한다. FET 결합은, 당업계에 잘 알려진 일반적인 형광계 탐지(fluorometric detection) 수단(예를 들면, 형광측정계)을 통해서 편리하게 측정될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 마커를 인지하는 탐침 능력의 결정은 어떠한 검사 구성요소(탐침 또는 마커)없이, 실시간 생분자 상호결합 분석(Biomolecular Interaction Analysis; BIA)와 같은 기술을 이용하여 이루어질 수 있다(예를 들면, Sjolander, S. and Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 및 Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 참조). 여기서 사용되는 "BIA" 또는 "표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)는 어떠한 상호결합물질의 표지없이, 생체특이적 상호결합을 실시간으로 연구하기 위한 기술(예를 들면, BIAcore)이다. 결합 표면에서의 질량 변화(결합의 지표)는 표면 근처의 굴절률의 변화를 야기하고(표면 플라스몬 공명의 빛 현상), 이는 생물학적 분자 사이의 실시간 반응의 표지로서 사용될 수 있는, 탐지 가능한 신호를 야기한다.
또는, 또 다른 실시예에서, 유사한 진단 및 예측 검사는 액체상에서 용질(solute)로서 마커 또는 탐침과 함께 수행될 수 있다. 상기 검사에서, 복합체인 마커 및 탐침은 하기를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 많은 일반적인 기술에 의해 비복합체 구성요소로부터 분리된다: 분별 원심분리법(differential centrifugation), 크로마토그래피(chromatography), 전기영동(electrophoresis) 및 면역침전법(immunoprecipitation). 분별 원심분리법에서, 마커/탐침 복합체는, 그들의 상이한 크기 및 밀도에 기초하여 평형된 복합체의 상이한 침강(sedimentation)에 의해, 연속적인 원심분리 단계를 통하여 비복합체인 검사 구성요소로부터 분리될 수 있다(예를 들면, Rivas, G., and Minton, A.P., 1993, Trends Biochem Sci. 18(8):284-7 참조). 또한, 일반적인 크로마토그래피 기술은 비복합체인 것으로부터 복합체인 분자를 분리하는데 이용할 수 있다. 예를 들면, 겔 여과 크로마토그래피는 크기에 기초하여 분자를 구별하고, 예를 들면 컬럼 형태에서, 적절한 겔 여과 레진(resin)의 이용을 통하여, 상대적으로 큰 복합체는 상대적으로 작은 비복합체 구성요소로부터 분리될 수 있다. 유사하게, 비복합체 구성요소와 비교하여, 상대적으로 마커/탐침 복합체의 상이한 극성(charged properties)에 의해, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 레진의 이용을 통하여, 비복합체인 구성요소로부터 상기 복합체가 구별될 수 있다. 상기 레진 및 크로마토그래피 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들면, Heegaard, N.H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6):141-8; Hage, D.S., 그리고 Tweed, S.A. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(1-2):499-525). 또한, 겔 전기영동은 복합체인 검사 구성요소를 결합하지 않은 구성요소로부터 분리하기 위해 적용될 수 있다(예를 들면, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999 참조). 이 기술에서, 단백질 또는 핵산 복합체는 예를 들면, 크기 및 극성에 기초하여 분리된다. 전기영동 과정 동안에 결합 상호작용을 유지하기 위하여, 비변성(non-denaturation) 겔 매트릭스 물질 및 환원제가 없는 조건이 일반적으로 바람직하다. 특정 검사 및 그것의 구성요소에 대한 적절한 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다.
특정 실시예에서, 마커 mRNA의 수준은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 생물학적 시료에 있는 인시추(in situ)에 의해 및 시험관내(in vitro) 형태에 의해 결정될 수 있다. "생물학적 시료"는 개체뿐만 아니라 개체내에 존재하는 조직, 세포 및 체액으로부터 분리된 조직, 세포, 생물학적 액체 및 그것의 분리물(isolate)를 포함하려는 의도를 가진다. 많은 발현 탐지 방법은 분리된 RNA를 사용한다. 시험관내 방법에서, mRNA의 분리에 대해 선별적이지 않은, 어떤 RNA 분리 기술은 세포로부터 RNA의 정제를 위해 사용될 수 있다(예를 들면, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999 참조). 추가적으로 많은 조직 시료는, 예를 들면 Chomczynski (1989, U.S. Patent No. 4,843,155)의 단일 단계 RNA 분리 과정과 같은, 당업계에 잘 알려진 기술을 이용하여 용이하게 처리될 수 있다.
분리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 중합효소 연쇄 반응 분석 및 탐침 어레이를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 혼성화 또는 증폭 검사에서 사용될 수 있다. mRNA 수준의 탐지를 위한 하나의 바람직한 진단 방법은, 탐지된 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 혼성화될 수 있는, 분리된 mRNA를 핵산 분자(탐침)와 접촉시키는 것과 관련이 있다. 핵산 탐침은, 예를 들면 전장 cDNA, 또는 엄격한 조건하에서, 본 발명의 마커를 암호화하는 mRNA 또는 유전체 RNA에 특이적으로 혼성화될 수 있도록 충분하고, 그리고 길이가 최소 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드와 같은, 전장 cDNA의 일부분일 수 있다. 본 발명의 진단 검사에서 사용하기 위한, 다른 적절한 탐침은 여기에 기술되어 있다. mRNA와 상기 탐침의 혼성화는 관심있는 마커가 발현되었다는 것을 가리킨다.
하나의 형태에서, mRNA는 예를 들면 분리된 mRNA를 아가로오즈 겔(agarose gel)에 러닝(running)시키고 겔로부터 니트로셀룰로오즈(nitrocellulose)와 같은 막에 이동시킴으로써, 고체 표면에 고정되고 및 탐침과 접척된다. 또 다른 형태에서, 상기 탐침은, 예를 들면 Affymetrix 유전자 칩 어레이에서, 고체 표면에 고정되고 및 mRNA는 상기 탐침과 접촉된다. 당업자는 사용하기 위한, 알려진 mRNA 탐지 방법을 본 발명의 마커에 의해 암호화된 mRNA의 수준을 탐지하는데 용이하게 적용할 수 있다.
시료에 있는 mRNA 마커의 수준을 결정하기 위한 다른 대안적 방법은, 예를 들면 RT-PCR(Mullis, 1987, U.S. Patent No. 4,683,202에서 실험예에 개시), 연결 연쇄 반응(ligatin chain reaction) (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템(transcriptional amplification system) (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 복제효소(Q-Beta Replicase) (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), 회전환형 복제(rolling circle replication) (Lizardi et al., U.S. Patent No. 5,854,033) 또는 다른 핵산 증폭 방법, 그 후 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여, 증폭시킨 분자의 탐지에 의한 핵산 증폭 과정과 관련이 있다. 이러한 탐지 개요(scheme)는 특히 상기 분자가 매우 낮은 수로 존재할 때, 핵산 분자의 탐지에 유용하다. 여기서 사용되는 증폭 프라이머는 유전자(플러스 및 마이너스 가닥, 또는 그 반대)의 5' 또는 3' 부위에 어닐링할 수 있고 및 그 사이에 짧은 부위를 포함하는 핵산 분자의 쌍으로 정의된다. 일반적으로 증폭 프라이머는 길이가 약 10 내지 30 뉴클레오티드이고, 길이가 약 50 내지 200 뉴클레오티드인 부위가 측면에 있다. 적절한 조건 하에서 및 적절한 시약과 함께, 상기 프라이머는 상기 프라이머가 측면에 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한 핵산 분자의 증폭을 가능하게 한다.
인시추(in situ) 방법에 대하여, mRNA는 탐지 이전으로부터 분리될 필요가 없다. 상기 방법에서, 세포 또는 조직 시료는 알려진 조직학적 방법을 사용하여 준비/처리된다. 그 후 상기 시료는 지지대, 일반적으로 유리 슬라이드에 고정되고, 그 후 상기 마커를 암호화하는 mRNA와 혼성화될 수 있는 탐침과 접촉된다.
상기 마커의 절대적 발현 수준에 기초한 결정에 대한 다른 방법으로서, 결정은 상기 마커의 평준화된 발현 수준에 기초할 수 있다. 발현 수준은 마커가 아닌 유전자, 예를 들면 항상 발현하는 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)의 발현과 마커의 발현을 비교함으로써 상기 마커의 절대적 발현 수준을 보정하여 평준화시킨다. 평준화에 적절한 유전자는 액틴 유전자와 같은 하우스키핑 유전자, 또는 세포 특이적 유전자를 포함한다. 상기 평준화는 다른 시료에 대한, 예를 들면 암이 아닌 시료에 대한 하나의 시료, 예를 들면 환자 시료에서의, 또는 상이한 기원으로부터의 시료 사이의 발현 수준을 비교하는 것을 가능하게 한다.
또는, 발현 수준은 상대적 발현 수준으로서 제공될 수 있다. 마커의 상대적 잘현 수준을 결정하기 위해서, 상기 마커의 발현 수준은 관심있는 시료에 대해 발현 수준을 결정하기 전에, 암 세포 분리체(isolates)에 대한, 정상적인 10 또는 그 이상의 시료, 바람직하게는 50 또는 그 이상의 시료에 대해 결정된다. 시료의 더욱 큰 수에서 검사된 유전자 각각의 평균 발현 수준을 결정하고 그리고 이것을 마커에 대한 기본 발현 수준으로서 사용한다. 검사 시료에 대해 결정된 마커의 발현 수준(절대적 발현 수준)은 상기 마커에 대해 수득된 평균 발현 값으로 나누어진다. 이것은 상대적 발현 수준을 제공한다.
바람직하게, 기본 결정에 사용된 시료는 암이 아닌 세포로부터 온 것이다. 상기 세포 근원의 선택은 상대적 발현 수준의 사용에 의존한다. 평균 발현 점수로서 정상적인 조직에서 발견된 발현을 사용하여 검사되는 마커가 암 특이적인지(정상 세포에 대해) 확정하는 것을 돕는다. 또한, 더욱 많은 데이터가 축적됨에 따라, 상기 평균 발현 값은 수정될 수 있고, 이는 축적된 데이터에 기초하여 개선된 상대 발현 값을 제공한다. 암 세포로부터 발현 데이터는 암 상태의 심각성 등급을 판단하는 수단을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 마커 단백질은 탐지된다. 본 발명의 단백질을 탐지하기 위한 바람직한 제제는 상기 단백질 또는 그것의 단편에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 탐지가능한 표지가 있는 항체이다. 항체는 다중클론 또는 더욱 바람직하게는 단일클론일 수 있다. 온전한 항체, 또는 그것의 단편 또는 유도체(예를 들면, Fab 또는 F(ab')2)는 사용될 수 있다. 탐침 또는 항체와 관련하여, "표지된(labeled)"이란 용어는 탐침이나 또는 항체에 탐지가능한 물질을 결합시킴으로써(즉, 물리적으로 연결) 탐침 또는 항체의 직접적 표지뿐만 아니라 직접적으로 표지된 또 다른 시약과의 반응성에 의한, 탐침 또는 항체의 간접적인 표지를 포함하려는 의도를 가진다. 간접적인 표지의 예는 형광적으로 표지된 2차 항체를 사용한 1차 항체 및, 형광적으로 표지된 스트렙토아비딘으로 탐지될 수 있는 바이오틴으로 DNA 탐침의 말단 표지를 탐지하는 것을 포함한다.
세포로부터의 단백질은 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 분리될 수 있다. 적용된 상기 단백질 분리 방법은, 예를 들면 Harlow 및 Lane(Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)에 기술된 것과 같은 것일 수 있다.
다양한 형태는 시료가 주어진 항체에 결합하는 단백질을 포함하는지 결정하기 위해 적용될 수 있다. 상기 형태의 예는 효소 면역검사법(enzyme immunoassay; EIA), 방사선면역검사법(radioimmunoassay; RIA), 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis) 및 효소결합면역흡착검사법(enzyme linked immunoabsorbant assay; ELISA)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 당업자는 세포가 본 발명의 마커를 발현하는지 결정하기 위한 사용을 위해, 알려진 단백질/항체 탐지 방법을 용이하게 적용시킬 수 있다.
하나의 형태에서, 항체, 또는 항체 단편 또는 유도체는 발현된 단백질을 탐지하기 위해 웨스턴 블롯 또는 면역형광기술과 같은 방법에서 사용될 수 있다. 상기 용도에서, 상기 항체 또는 단백질을 고체 지지대에 고정시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 적절한 고체상 지지대 또는 담체는 항원 또는 항체와 결합할 수 있는 어떠한 지지대를 포함한다. 잘 알려진 지지대 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 자연적 및 변형된 셀룰로오즈, 폴리아크릴아마이드, 반려암, 그리고 자철석을 포함한다.
당업자는 항원 또는 항체에 결합하는, 많은 다른 적절한 담체를 알 것이고, 그리고 상기 지지대를 본 발명과 함께 사용을 위해 적용시킬 수 있을 것이다. 예를 들면, 암세포로부터 분리된 단백질은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 러닝(running)될 수 있고 니트로셀룰로오즈와 같은 고체상 지지대로 고정될 수 있다. 상기 지지대는 적절한 버퍼로 씻어줄 수 있고 그 후 탐지가능하게 표지된 항체를 처리한다. 그 후 고체상 지지대를 두 번째로 상기 버퍼를 사용하여 씻어서 결합하지 않은 항체를 제거한다. 그 후 고체 지지대에 결합한 표지의 양은 일반적인 수단에 의해 탐지될 수 있다.
또한, 본 발명은 마커 단백질 또는 핵산의 존재를 탐지할 수 있는 키트를 포함한다. 상기 키트는 만약 개체가 종양적 장애로 고통받고 있거나 또는 종양적 장애를 발달시키는 위험이 증가되었을 경우를 결정하도록 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 생물학적 시료에 있는 표지 단백질 또는 핵산을 탐지할 수 있는, 표지된 화합물 또는 제제 및 시료에 있는 단백질 또는 mRNA의 양을 결정할 수 있는 수단(예를 들면, 상기 단백질 또는 그것의 단편에 결합하는 항체, 또는 상기 단백질을 암호화하는 DNA 또는 mRNA에 결합하는 올리고뉴클레오티드 탐침)을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 상기 키트를 사용하여 얻은 결과를 해석할 수 있는 설명을 포함할 수 있다.
항체-기초 키트에 대하여, 상기 키트는 예를 들면: (1) 마커 단백질에 결합하는 첫 번째 항체(예를 들면 고체 지지대에 결합된); 및, 선택적으로, (2) 상기 단백질 또는 첫 번째 항체 중 하나에 결합하는 두 번째, 다른 항체를 포함할 수 있고 탐지가능한 표지에 결합될 수 있다.
올리고뉴클레오티드-기초 키트에 대하여, 상기 키트는 예를 들면: (1) 마커 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드, 예를 들면 탐지가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 (2) 마커 핵산 분자를 증폭시키기에 유용한 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 상기 키트는, 예를 들면 버퍼링 제제, 방부제, 또는 단백질 안정화 제제를 포함할 수 있다. 나아가, 상기 키트는 탐지가능한 표지를 탐지하기 위해 필요한 구성요소(예를 들면, 효소 또는 기질)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 검사될 수 있는, 대조군 시료 또는 연속적인 대조군 시료를 포함할 수 있고 검사 시료와 비교될 수 있다. 상기 키트의 각각의 구성요소는 개별 용기 내에서 공개될 수 있고 및 모든 다양한 용기는, 상기 키트를 사용하여 수행된 검사의 결과를 해석하기 위한 설명과 함께 단일 패키지 내에 있을 수 있다.
B. 약리유전체학( pharmacogenomics )
또한, 본 발명의 마커는 약리유전체 마커로서 유용하다. 여기서 사용되는 "약리유전체 마커(pharmacogenomic marker)"는 발현 수준이 환자에서 특이적 임상 약물 반응 또는 민감성과 관련있는 목적 생화학적 마커(objective biochemical marker)이다(예를 들면, McLeod et al. (1999) Eur. J. Cancer 35(12): 1650-1652 참조). 약리유전체 마커 발현의 존재 또는 양은 환자의 예측된 반응 및 더욱 구체적으로 환자의 특이적 약물 또는 약물의 종류를 사용한 치료법에 대한 종양적 장애와 관련이 있다. 환자에게 가장 적절한 또는 더욱 큰 성공 정도를 갖는다고 예측되는 약물 치료법이, 환자에서 하나 또는 그 이상의 약리유전체 마커의 발현의 존재 또는 양을 검사함으로써 선별될 수 있다. 예를 들면, 환자에서 특이적 종양 마커에 의해 암호화되는 RNA 또는 단백질의 존재 또는 양에 기초하여, 환자에게 존재할 것 같은 특이적 종양의 치료를 위해 최적화된 약물 또는 치료 코스가 선별될 수 있다. 그러므로, 약리유전체 마커의 사용은 다른 약물 또는 요법의 시도없이, 각각의 암 환자에 대한, 가장 적절한 치료를 선별하고 또는 고안하는 것을 가능하게 한다.
약리유전체학의 또 다른 측면은 신체가 약물에 대해 작용하는 방법을 변화시키는 유전적 조건을 다룬다. 이러한 약리유전체학 조건은 드문 결점으로서 또는 다형성으로서 일어날 수 있다. 예를 들면 글루코오즈-6-포스페이트 데하이드로게나아제(glucose-6-phosphate dehydrogenase; G6PD)의 결핍은 산화 약물[항말라리아(anti-malarials), 술폰아미드(sulfonamides), 진통제, 니트로푸란(nitrofuran)]의 섭취 및 누에콩(fava bean)의 소비 후 나타나는 주요 임상 합병증(clinical complication)이 용혈(hemolysis)인 일반적인 유전적 효소병(enzymopathy)이다.
예시적인 실시예로서, 약물 대사 효소의 활성은 약물 작용의 강도 및 지속의 주요 결정요소이다. 약물 대사 효소[예를 들면, N-아세틸트랜스퍼라아제(N-acetyltransferase 2;NAT 2) 및 시토크롬 P450 효소(cytochrome P450 enzymes) CYP2D6 및 CYP2C19]의 유전적 다형성의 발견은 왜 어떤 환자들은 표준적이고 안전한 약물 용량의 복용 후, 기대되는 약물 효과를 갖지 않거나 또는 과장된 약물 반응 및 심각한 독성을 보이는지에 대한 설명을 제공한다. 상기 다형성은 집단에서 두가지 표현형, 광범위한 대사자(extensive metabolizer; EM) 및 좋지 않은 대사자(poor meetabolizer; PM)으로 발현된다. PM의 보급은 상이한 인구집단마다 다르다. 예를 들면, CYP2D6를 암호화하는 유전자는 매우 다형성이 높고 여러 가지 돌연변이가 PM에서 동정되며, 이 모두는 CYP2D6 기능의 부재를 야기한다. CYP2D6 및 CYP2C19의 좋지 않은 대사자는 그들이 표준 용량을 섭취했을 때, 다소 흔히 과장된 약물 반응 및 부작용을 경험한다. CYP2D6-형성 대사물질 모르핀(morphine)에 의해 매개되는 코데인(codeine)의 진통제 효과에 대해 기술되었던 것과 같이, 만약 대사물질이 활성 치료적 모이어티라면, PM은 치료적 반응을 보이지 않을 것이다. 가장 다른 것은 표준 용량에 대해 반응하지 않는 초급 대사자(ultra-rapid metabolizer)라고 불린다. 최근에, 초급 대사자의 분자적 기본이 CYP2D6 유전자의 증폭 때문이라는 것이 알려졌다.
따라서, 개개인에서 본 발명의 마커 발현 수준이 결정될 수 있음으로써 개개인의 치료적 또는 예방적 치료에 대한 적절한 제제를 선별할 수 있다. 또한, 약리유전학 연구는 개개인의 약물 반응성 표현형을 밝히기 위한 약물-대사 효소를 암호화하는 다형성 대립유전자의 유전형을 적용하기 위해 사용될 수 있다. 이 지식을 용량 또는 약물 선별에 적용할 때, 좋지 않은 반응 또는 치료적 실패를 피할 수 있고, 따라서 본 발명의 마커 발현의 조절과 함께 개체를 치료할 때, 치료적 또는 예방적 효능을 증진시킬 수 있다.
C. 임상 시험의 모니터
본 발명의 마커의 발현 수준에서 제제(예를 들면, 약물 화합물)의 영향을 모니터하는 것은 기본적 약물 스크리닝뿐만 아니라 임상 시험에도 적용될 수 있다. 예를 들면, 마커 발현에 영향을 미치는 제제의 효능은, 종양적 장애에 대해 치료를 받는 개체의 임상 시험에서 모니터될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명은 제제(예를 들면, 작용제, 길항제, 펩티드모방체, 단백질, 펩티드, 핵산, 작은 분자, 또는 다른 후보 약물)를 사용한 개체의 치료의 효능을 모니터하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (i) 제제를 투여하기 전에 개체로부터 투여전 시료를 수득하는 단계; (ii) 투여전 시료에 있는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 선택된 마커의 발현 수준을 탐지하는 단계; (iii) 개체로부터 하나 또는 그 이상의 투여 후 시료를 수득하는 단계; (iv) 투여후 시료에서 상기 마커의 발현 수준을 탐지하는 단계; (v) 투여전 시료에 있는 마커의 발현 수준을 투여 후 또는 시료에 있는 마커의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (vi) 그에 맞추어 개체로 제제의 투여를 변화시키는 단계를 포함한다. 예를 들면, 치료 과정 동안에 마커 유전자의 증가된 발현은 비효과적인 용량임을 의미하고 상기 용량을 증가시키는 것이 바람직하다는 것을 의미한다. 역으로, 마커 유전자의 감소된 발현은 효과적인 치료를 의미하고 용량을 변화시킬 필요가 없음을 의미한다.
D. 어레이( Array )
또한, 본 발명은 본 발명의 마커를 포함하는 어레이(array)를 포함한다. 상기 어레이는 어레이에 있는 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 검사하는데 사용될 수 있다. 하나의 실시예에서, 상기 어레이는 어레이에 있는 유전자의 조직 특이성을 확실히 하기 위해 조직에 있는 유전자 발현을 검사하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법으로, 약 7600개 까지의 유전자는 발현에 대해 동시에 검사될 수 있다. 이것은 하나 또는 그 이상의 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자의 배열을 나타내는 프로파일이 개발되는 것을 가능하게 한다.
상기 질적 결정 이외에, 본 발명은 유전자 발현의 정량화도 가능하게 한다. 따라서, 조직 특이성뿐만 아니라, 조직에서 유전자 배열의 발현 수준도 확인될 수 있다. 따라서, 유전자는 그들의 조직 발현 자체 및 상기 조직에서의 발현수준에 기초하여 군(group)으로 될 수 있다. 예를 들면, 이것은 조직 사이 또는 중에서 유전자 발현 관계를 확인하는데 유용하다. 따라서, 하나의 조직은 혼란스러울 수 있고 두 번째 조직에서의 유전자 발현 효과가 결정될 수 있다. 이러한 문맥에서, 생물학적 자극에 대한 반응에서 또 다른 세포 종류에서의 하나의 세포 종류의 효과는 결정될 수 있다. 상기 결정은, 예를 들면 유전자 발현 수준에서 세포-세포 상호결합의 효과를 아는데 유용하다. 만약 제제가 하나의 세포 종류를 치료하기 위해 치료적으로 투여되었지만, 또 다른 세포 종류에는 바람직하지 않은 효과를 갖는다면, 본 발명은 바람직하지 않은 효과의 분자적 기초를 결정하는 검사법을 제공하고 및 따라서 대응적 제제(counteracting agent)를 함께 투여하는 기회를 제공하거나 또는 그렇지 않으면 바람직하지 않은 효과를 치료한다. 유사하게, 단일 세포 종류 내 조차도, 바람직하지 않은 생물학적 효과는 분자 수준에서 결정될 수 있다. 따라서, 표적 유전자가 아닌 다른 유전자의 발현에서 제제의 효과는 확인되고 대응될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 어레이는 어레이에 있는 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현의 시간대 과정을 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 여기서 공개된 것과 같이, 예를 들면 종양적 장애의 발달, 종양적 장애의 진행, 그리고 종양적 장애와 관련된 세포 형질전환과 같은 과정의 다양한 생물학적 내용에서 일어날 수 있다.
또한 어레이는 동일한 세포 또는 상이한 세포에 있는 다른 유전자의 발현에서 유전자 발현의 효과를 확인하는데 효과적이다. 예를 들면, 만약 최종 또는 하부(downstream) 표적이 조절될 수 없다면, 이것은 치료적 중재(therapeutic intervention)를 위한 대안적 분자 표적의 선별을 제공한다.
또한, 어레이는 정상적인 세포 및 비정상적인 세포에서 하나 또는 그 이상의 유전자의 구별되는 발현 패턴을 확인하는데 유용하다. 이것은 진단 또는 치료적 중재에 대한 분자 표적으로 기능할 수 있는 유전자 배열을 제공한다.
V. 시료를 수득하는 방법
본 발명의 방법에서 유용한 시료는 본 발명의 마커를 표현하는 어떤 조직, 세포, 생체검사(biopsy), 또는 체액 시료를 포함한다. 하나의 실시예에서, 시료는 조직, 세포, 전체 혈액, 혈청, 혈장(plasma), 구강 스크럽(buccal scrape), 침(saliva), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 요(urine), 대변(stool), 또는 기관지세포 세척액(bronchoalveolar lavage)을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 조직 시료는 종양 시료를 포함한, 종양적 장애의 시료이다.
신체 시료는 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해, 예를 들면, 생체검사의 사용에 의해 또는 한 부위를 스크럽하거나 또는 면봉닦기에 의해 또는 체액을 들여마시기 위해 바늘을 사용하는 것에 의해 개체로부터 수득될 수 있다. 다양한 신체 시료를 수거하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 마커를 탐지하고 및 정량하는데 적절한 조직 시료는 새롭거나, 얼어져있거나, 또는 당업자에게 알려진 방법에 따라 고정되어 있을 수 있다. 적절한 조직 시료는 바람직하게 절단(sectioning)되고 추가 분석을 위해 현미경 슬라이드에 놓여진다. 또는, 고체상, 즉 조직 시료는 용해될 수 있고 및/또는 균질화되고 그 후 용해성 추출물로서 분석될 수 있다.
하나의 실시예에서, 새롭게 수득된 생체검사 시료를, 예를 들면 액체 질소 또는 디플루오로디클로로메탄(difluorodichloromethane)을 사용하여 냉동시켰다. 냉동된 시료는, 예를 들면 OCT를 사용하여 부분화를 위해 올려 놓고, 그리고 연속적으로 저온유지장치(cryostat)에서 절단(sectioning)된다. 연속적 부분은 유리 형미경 슬라이드에서 수거된다. 면역조직화학 염색에 대해, 상기 슬라이드는, 상기 부분이 상기 슬라이드에 붙었다는 것을 확인하기 위해서, 예를 들면 크롬-알룸(chrome-alum), 젤라틴(gelatine) 또는 폴리-L-리신(poly-L-lysine)으로 코팅될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 시료는 절단되기 전에 고정되고 끼워넣는다(embed). 예를 들면, 조직 시료는, 예를 들면 포르말린(formalin)에서 고정되고, 연속적으로 탈수되며 및, 예를 들면 파라핀(paraffin)에서 끼워넣을 수 있다.
일단 상기 시료가 수득되었다면, 본 발명의 마커(핵산 수준 또는 단백질 수준)를 탐지하고 정량하기에 적절하다고 당업계에 알려진 어떤 방법이 사용될 수 있다. 상기 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 웨스턴 블롯(western blots), 노던 블롯(northern blots), 서던 블롯(southern blots), 면역조직화학검사(immunohistochemistry), ELISA, 예를 들면, 증폭된 ELISA, 면역침전법(immunoprecipitation), 면역형광법(immunofluorescence), 세포유동계수기(flow cytometry), 면역세포화학검사(immunocytochemistry), 질량 분광계수 분석(mass spectrometrometric analyses), 예를 들면, MALDI-TOF 및 SELDI-TOF, 핵산 혼성화 기술, 핵산 역전사 방법, 그리고 핵산 증폭 방법을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 특정 실시예에서, 본 발명의 마커의 발현은, 예를 들면 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 탐지된다.
항체 결합에 접근 가능한, 본 발명의 마커를 만들기 위해 시료는 변혈될 필요가 있다. 특히 면역세포화학 또는 면역조직화학 방법의 측면에서, 슬라이드는 전처리 버퍼로 이동될 수 있고 선택적으로 항원 접근성을 증가시키기 위하여 열을 가해질 수 있다. 전처리 버퍼에서 시료의 열처리는 세포의 지질 이중층이 급속하게 파괴되고 항원 결합에 대해 더욱 접근가능한 항원을 만든다(새로운 표본에서의 경우일 수 있고, 일반적으로 고정된 표본에서 일어나는 것이 아니다). "전처리 버퍼(pretreatment buffer)" 및 "준비 버퍼(preparation buffer)"는 상호교환적으로 여기에서 사용되고, 특히 항원 결합에 대한 본 발명의 마커의 접근성을 증가시킴으로써, 면역염색을 위한 세포학 또는 조직학 시료를 준비하기 위해 사용되는 버퍼를 의미한다. 전처리 버퍼는 pH-특이적 염 용액, 폴리머, 세제, 또는 비이온 또는 음이온 계면 활성제, 예를 들면 에틸옥시레이트 음이온(ethyloxylated anionic) 또는 비이온 계면 활성제, 알카노에이트(alkanoate) 또는 알콕실레이트(alkoxylate) 또는 이러한 계면 활성제의 혼합 또는 담즙산염의 사용까지 포함한다. 전처리 버퍼는, 예를 들면 데옥시콜릭 산(deoxycholic acid), 소듐 염, 또는 소듐 라우레트-13-카르복실레이트(sodium laureth-13-carboxylate) (예를 들면 산도판(sandopan) LS) 또는 에톡시레이트(ethoxylated) 음이온 복합체 0.1% 내지 1%의 용액일 수 있다. 어떤 실시예에서, 전처리 버퍼는 또한 슬라이드 저장 버퍼로서 사용될 수 있다.
항체 결합에 더욱 접근 가능한 본 발명의 마커 단백질을 만드는 방법은 당업계에 알려진 항원 회수 방법(antigen retriecal method)을 포함하여 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 각각의 전문이 참조문헌으로 통합된, Bibbo, et al. (2002) Acta. Cytol. 46:25-29; Saqi, et al. (2003) Diagn. Cytopathol. 27:365-370; Bibbo, et al. (2003) Anal. Quant. Cytol. Histol. 25:8-11를 참조한다.
마커 단백질의 접근성을 증가시키기 위한 전처리 후, 적절한 차단제를, 예를 들면 하이드로겐 퍼옥시다아제(hydrogen peroxidase)와 같은 퍼옥시다아제 차단제를 사용하여 시료를 차단시킬 수 있다. 어떤 실시예에서, 시료는 항체의 비특이적 결합을 막는 단백질 차단제를 사용하여 차단될 수 있다. 단백질 차단제는, 예를 들면 정제된 카제인(casein)을 포함할 수 있다. 항체, 특히 본 발명의 마커와 특이적으로 결합하는, 단일클론 또는 다중클론 항체는 상기 시료와 함께 배양된다. 당업자는 어떤 경우에는 환자 시료에서 본 발명의 마커 단백질에 있는 다수 에피토프에 의해 더욱 정확한 예측 또는 진단이 얻어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 특정 실시예에서, 본 발명의 마커의 상이한 에피토프에 대한 최소 두 개의 항체가 사용된다. 하나 이상의 항체가 사용될 때, 이러한 항체는 각각의 항체 시약으로서 연속적으로, 또는 항체 칵테일로서 동시적으로 단일 시료에 첨가될 수 있다. 또는, 각각의 항체는 동일한 환자 및 그 결과 얻어진 데이터로부터 분리된 시료에 첨가될 수 있다.
항체 결합을 탐지하기 위한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 마커와 항체 결합은, 항체 결합의 수준 및 그에 따른 마커 단백질 발현 수준과 상응하는 탐지가능한 신호를 생산하는 화학적 시약을 사용하여 탐지될 수 있다. 본 발명의 하나의 면역조직화학 또는 면역세포화학 방법에서는, 항체 결합이 표지된 폴리머와 결합된 2차 항체의 사용을 통해 탐지된다. 표지된 폴리머의 예는 폴리머-효소 결합체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 그러한 복합체에 있는 효소는 일반적으로 항원-항체 결합 부위에서 색원체(chromogen)의 축적을 촉진하는데 이용됨으로써, 관심있는 생물학적 마커의 발현 수준과 상응하는 세포 신호를 야기한다. 특정 관심의 효소는 홀스라디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; HRP) 및 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase; AP)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나의 면역조직화학 또는 면역세포화학 방법에서는, 본 발명의 마커와 항체 결합은 2차 항체와 결합된 HRP-표지 폴리머의 사용을 통해 탐지된다. 또한, 항체 결합은, 단일클론 또는 다중클론 항체와 결합하는 종-특이성 탐침 시약 및 종 특이적 탐침 시약에 결합하는 HRP에 결합된 폴리머의 사용을 통해 탐지될 수 있다. 슬라이드는 어떤 색원체(chromogen), 예를 들면 색원체 3,3-디아미노벤지딘(diaminobenzidine; DAB)을 사용하여 항체 결합을 위해 염색되고, 그 후 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대비염색을 하고, 선택적으로 암모늄 하이드록시드 또는 TBS/Tween-20과 같은 청분제(bluing agent)를 사용한다. 다른 적절한 색원제는 예를 들면 3-아미노-9-에틸카르바졸(3-amino-9-ethylcarbazole; AEC)을 포함한다. 본 발명의 어떤 측면에서, 세포기술자에 의해 및/또는 병리학자에 의해 슬라이드를 현미경으로 다시 보고 세포 염색, 예를 들면 형광 염색(즉, 마커 발현)을 평가한다. 또는, 시료를 자동화 현미경을 통해 또는 양성 염색 세포의 동정을 촉진시키는 컴퓨터 소프트웨어의 도움으로 사암에 의해 다시 볼 수 있다.
항체 결합의 탐지는 항마커 항체를 탐지가능한 물질에 결합시킴으로써 촉진될 수 있다. 탐지가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결분자단(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생물학적 방광물질, 그리고 방사성 물질을 포함한다. 적절한 효소의 예는 홀스라디시 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하다; 적절한 보결원자단 복합체의 예는 스트렙토아비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함한다; 적절한 형광물질의 예는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실 클로라이드(dansyl chloride) 또는 피코에리트린(phycoerythrin)을 포함한다; 발광 물질의 예는 루미놀(luminol)을 포함한다; 생물학적 발광 물질은 루시퍼라아제, 루시페린, 그리고 애쿠오린(aequorin)을 포함한다; 및 적절한 방사성 물질은 125I, 131I, 35S, 14C, 또는 3H를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 기술된 것과 같이 냉동된 시료는 준비되고, 이어서 예를 들면 Tris-버퍼 살린(TBS)을 사용하여 적절한 농도로 희석된, 본 발명의 마커에 대한 항체로 염색한다. 1차 항체는 바이오틴 항 면역글로불린(biotinylated anti-immunoglobulin)에서 슬라이드를 배양함으로써 탐지될 수 있다. 이 신호는 선택적으로 증폭될 수 있고, 항원의 디아미노벤지딘(diaminobenzidine) 침전을 사용하여 가시화될 수 있다. 나아가, 슬라이드는 세포를 가시화하기 위하여, 선택적으로, 예를 들면 헤마톡실린으로 대비염색될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 냉동된 부분에 대해 상기 언급된 것과 같이 고정된 및 끼워넣어진 시료는 본 발명의 마커에 대한 항체로 염색되고 대비염색된다. 또한, 시료는 항체 염색을 가시화하기 위해, 선택적으로 신호를 증폭시키는 제제로 처리될 수 있다. 예를 들면, 후에 다시 퍼옥시다아제-결합된 스트렙토아비딘과 반응하는 퍼옥시다아제-촉매된 바이오틴-티라미드(biotinyl-tyramide)의 축적이 사용될 수 있다(Catalyzed Signal Amplification (CSA) System, DAKO, Carpinteria, CA).
조직-기본 검사(즉, 면역 조직화학법)는 본 발명의 마커를 탐지하고 정량화하는 바람직한 방법이다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 마커의 존재 또는 부재가 면역조직화학법에 의해 결정될 수 있다. 하나의 실시예에서, 면역조직화학 분석은 마커가 없는 세포는 염색이 되지 않도록, 항-마커 항체의 낮은 농도를 사용한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 마커의 존재 또는 부재는, 세포가 상기 마커를 갖지 않아도 강하게 염색되는 고농도의 항마커 항체를 사용한, 면역조직화학 방법을 사용하여 결정된다. 염색되지 않은 세포는 돌연변이 마커를 포함하고 항원적으로 인식 가능한 마커 단백질 생산을 실패하거나, 또는 마커의 수준을 조절하는 경로가 제대로 조절되지 않는 세포이고, 그 결과 미미한 마커 단백질의 발현의 평형상태를 야기하였다.
당업자는 본 발명의 방법을 실행하도록 사용된 특정 항체의 농도가, 결합을 위한 시간, 본 발명의 마커에 대한 항체의 특이성, 그리고 본 발명의 마커에 대한 항체에 특이성 수준, 그리고 시료 준비와 같은 요소에 의존하여 매우 다양할 것임을 인지할 것이다. 또한, 다수 항체가 사용될 때, 요구되는 농도는 항체가 시료에 적용되는 순서, 예를 들면 칵테일로서 동시에 또는 각각의 항체 시약으로서 연속적으로에 의해 영향을 받을 수 있다. 또한, 본 발명의 마커와 항체 결합을 가시화하기 위해 사용된 화학 탐지는 바람직한 신호 대 잡음(noise) 비율을 생산하기 위해 최적화될 수 있다.
본 발명의 한 실시예에서, 단백질 방법, 예를 들면 질량 분광분석(mass spectrometry)은 본 발명의 마커를 탐지하고 정량하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 혈청과 같은 생물학적 시료를 단백질 결합 칩(Wright, G.L., Jr., et al. (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J., et al. (2002) Clin Chem 48:1296; Laronga, C., et al. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., et al. (2002) 359:572; Adam, B.L., et al. (2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., et al. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., et al. (2001) Cancer Res 61:6029) 참조)으로의 적용과 관련있는, 매트릭스-관련 레이저탈착/이온화 비행시간형 질량 분석기(matrix-associated laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; MALDI-TOF MS) 또는 표면-증진 레이저 탈착/이온화 비행시간형 질량 분석기(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; SELDI-TOF MS)는 PY-Shc 및/또는 p66-Shc 단백질을 탐지하고 정량하는데 사용될 수 있다. 질량 분광 분석 방법은, 예를 들면 각각의 전문이 여기에서 참고문헌으로 통합된 U.S. Patent No. 5,622,824, 5,605,798 및 5,547,835에 기술되어 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 마커의 발현은 핵산 수준에서 탐지된다. 발현을 판단하기 위한 핵산-기본 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들면 개체로부터의 시료에 있는 마커 mRNA의 수준을 결정한다. 많은 발현 탐지 방법은 분리된 RNA를 사용한다. mRNA의 분리에 대해 선별하지 않는 어떤 RNA 분리 기술은 본 발명의 마커를 발현하는 세포로부터 RNA의 정제를 위해 이용될 수 있다[예를 들면, Ausubel et al., ed., (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York) 참조]. 또한, 많은 조직 시료는 당업자에게 잘 알려진 기술, 예를 들면 Chomczynski (1989, U.S. Pat. No. 4,843,155)의 단일-단계 RNA 분리 과정을 이용하여, 용이하게 처리될 수 있다.
"탐침"이라는 용어는 본 발명의 마커와 선택적으로 결합할 수 있는 어떤 분자, 예를 들면 뉴클레오티드 전사체 및/또는 단백질을 의미한다. 탐침은 당업자에 의해 합성될 수 있고, 또는 적절한 생물학적 준비로부터 유래될 수 있다. 탐침은 특이적으로 표지되도록 고안될 수 있다. 탐침으로서 사용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체, 그리고 유기분자를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
분리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 중합효소 연쇄 반응 분석 및 탐침 어레이를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 혼성화 또는 증폭 검사에서 사용될 수 있다. mRNA 수준의 탐지를 위한 하나의 방법은 상기 분리된 mRNA를, 마커 mRNA와 혼성화될 수 있는 핵산 분자(탐침)과 접촉시키는 것과 관련이 있다. 핵산 탐침은, 예를 들면 전장 DNA, 또는 엄격한 조건하에서 마커 유전체 DNA와 특이적으로 혼성화를 이루기에 충분하고 및 길이가 최소 7, 15, 30, 50, 100, 250, 또는 500개의 뉴클레오티드가 있는 올리고뉴클레오티드와 같은 전장 DNA의 일부분일 수 있다.
하나의 실시예에서, mRNA는, 예를 들면 분리된 mRNA는 아가로오즈 겔에서 러닝(running)되고 mRNA를 상기 셀로부터 니트로셀룰로오즈와 같은 막으로 이동시키는 것에 의해 고체상에서 고정되고 탐침과 접촉된다. 또 다른 형태에서, 상기 탐침은, 예를 들면 Affymetrix 유전자 칩 어레이에서, 고체 표면에 고정되고 및 mRNA는 상기 탐침과 접촉된다. 당업자는 사용하기 위한, 알려진 mRNA 탐지 방법을 본 발명의 마커에 의해 암호화된 mRNA의 수준을 탐지하는데 용이하게 적용할 수 있다.
시료에 있는 마커 mRNA의 수준을 결정하기 위한 다른 대안 방법은 핵산 증폭 과정, 예를 들면 RT-PCR(Mullis, 1987, U.S. Patent No. 4,683,202에서 실험예에 개시), 연결 연쇄 반응(ligatin chain reaction) (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 자가 지연 서열 복제(self sustained sequence replication) [Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)], 전사 증폭 시스템(transcriptional amplification system) (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 복제효소(Q-Beta Replicase) (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), 회전환형 복제(rolling circle replication) (Lizardi et al., U.S. Patent No. 5,854,033) 또는 다른 핵산 증폭 방법, 그 후 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여, 증폭시킨 분자의 탐지에 의한 핵산 증폭 과정과 관련이 있다. 이러한 탐지 개요(scheme)는 특히 상기 분자가 매우 낮은 수로 존재할 때, 핵산 분자의 탐지에 유용하다. 본 발명의 특정 측면에서, 정량적 플루오제닉 RT-PCR(즉, TaqmanTM 시스템)마커 단백질을 검사하였다. 상기 방법은 일반적으로 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 주로 사용한다. 알려진 서열에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하는 방법이 당업계에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 마커 발현 수준은 멤브레인 블롯(노던, 서던, 닷 및 그와 같은 혼성화 분석에서 사용될 때처럼), 또는 마이크로웰, 시료 튜브, 겔, 비드(beads) 또는 섬유질(fiber) (또는 결합된 핵산을 포함하는 어떤 고체 지지대)을 사용하여 모니터될 수 있다. 여기서 통합에 의해 통합된 U.S. Pat. No. 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 및 5,445,934를 참조한다. 마커 발현의 탐지 또한 용액에서 핵산 탐침을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시예에서, 마이크로어레이는 본 발명의 마커의 발현을 탐지하는데 사용된다. 상이한 실험에서의 재생산성 때문에 마이크로어레이는 이러한 목적에 특히 잘 맞는다. DNA 마이크로어레이는 많은 유전자의 발현 수준을 동시에 측정하기 위한 하나의 방법을 제공한다. 각각의 어레이는 고체 지지대에 결합한 포획 탐침(capture probe)의 재생산할 수 있는 패턴으로 구성된다. 표지된 RNA 또는 DNA는 어레이에서 상보적 탐침과 혼성화되고 그 후 레이저 스캐닝(laser scanning)에 의해 탐지될 수 있다. 어레이에서 각각의 탐침에 대한 혼성화 강도는 결정되고 상대적 유전자 발현을 나타내는 정량값으로 전환된다. 참조문헌으로 통합된, U.S. Pat. No. 6,040,138, 5,800,992 및 6,020,135, 6,033,860, 그리고 6,344,316를 참조한다. 시료에서 고밀도 올리고뉴클레오티드 어레이는 특히 많은 RNA의 유전자 발현 프로파일을 결정하는데 유용하다.
인산화된 마커의 양, 그리고/또는 본 발명 마커의 양의 수학적 관계는 종양적 장애를 위해 치료받는 개체에서 종양적 장애의 재발 위험, 종양적 장애를 위해 치료받는 개체의 생존, 종양적 장애가 공격적인지, 종양적 장애를 치료하기 위한 치료 요법의 효능, 그리고 그와 같은 것을 본 발명의 방법을 사용하여 산출하는데 사용될 수 있고, 이것은 당업자에게 알려진 회귀 분석의 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 적절한 회귀 모델은 CART (예를 들면, Hill, T, 그리고 Lewicki, P. (2006) "STATISTICS Methods and Applications" StatSoft, Tulsa, OK), Cox (예를 들면, www.evidence-based-medicine.co.uk), 지수(exponential), 정상 및 로그 정상(normal and log normal) (예를 들면, www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html), 기초논리(logistic) (예를 들면, www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression 또는 http://faculty.chass.ncsu.edu/garson/PA765/logistic.htm), 매개변수(parametric), 비모수(non-parametric), 반변수(semi-parametric) (예를 들면, www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), 선형(linear) (예를 들면, www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression 또는 http://www.curvefit.com/linear_regression.htm), 또는 추가적(예를 들면, www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model 또는 http://support.sas.com/rnd/app/da/new/dagam.html)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시예에서, 회귀 분석(regression analysis)은 인산화된 마커의 양을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 회귀 분석은 마커 수학적 관계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 인산화된 마커의 양 및/또는 마커 수학적 관계의 회귀 분석은 추가적 임상 및/또는 분자 공변인(co-variates)를 포함할 수 있다. 상기 임상 공변인은 결절 상태(nodal status), 종양 단계(tumor stage), 종양 정도(tumor grade), 종양 크기, 처리요법, 예를 들면 화학요법 및/또는 방사선치료요법, 임상적 결과(예를 들면 재발, 질병-특이적 생존, 치료 실패), 그리고/또는 진단 후 시간, 치료법의 개시 후 시간 및/또는 치료 완료 후 시간 함수로서 임상 결과를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 실시예에서, 인산화된 마커 및/또는 마커의 양의 수학적 관계는 종양적 장애를 위해 치료받는 개체에서 종양적 장애의 재발 위험, 종양적 장애를 위해 치료받는 개체의 생존, 종양적 장애가 공격적인지, 종양적 장애를 치료하기 위한 치료 요법의 효능, 그리고 그와 같은 것을 본 발명의 방법을 사용하여 산출하는데 사용될 수 있고, 이것은 당업자에게 알려진 회귀 분석의 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 적절한 회귀 모델은 CART (예를 들면, Hill, T, 그리고 Lewicki, P. (2006) "STATISTICS Methods and Applications" StatSoft, Tulsa, OK), Cox (예를 들면, www.evidence-based-medicine.co.uk), 지수(exponential), 정상 및 로그 정상(normal and log normal) (예를 들면, www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html), 기초논리(logistic) (예를 들면, www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression 또는 http://faculty.chass.ncsu.edu/garson/PA765/logistic.htm), 매개변수(parametric), 비모수(non-parametric), 반변수(semi-parametric) (예를 들면, www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), 선형(linear) (예를 들면, www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression 또는 http://www.curvefit.com/linear_regression.htm), 또는 추가적(예를 들면, www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model 또는 http://support.sas.com/rnd/app/da/new/dagam.html)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시예에서, 회귀 분석(regression analysis)은 인산화된 마커의 양을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 회귀 분석은 마커 수학적 관계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 인산화된 마커의 양 및/또는 마커 수학적 관계의 회귀 분석은 추가적 임상 및/또는 분자 공변인(co-variates)를 포함할 수 있다. 상기 임상 공변인은 결절 상태(nodal status), 종양 단계(tumor stage), 종양 정도(tumor grade), 종양 크기, 처리요법, 예를 들면 화학요법 및/또는 방사선치료요법, 임상적 결과(예를 들면 재발, 질병-특이적 생존, 치료 실패), 그리고/또는 진단 후 시간, 치료법의 개시 후 시간 및/또는 치료 완료후 시간 함수로서 임상 결과를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
VI 키트
또한, 본 발명은 종양적 장애, 종양적 장애의 재발, 또는 종양적 장애에 대해 치료받는 개체의 생존을 예측하기 위한 조성물 및 키트를 제공한다. 이러한 키트는 하기의 하나 또는 그 이상을 포함한다: 본 발명의 마커와 특이적으로 결합하는 탐지가능한 항체, 본 발명의 마커와 특이적으로 발현하는 탐지 가능한 항체, 염색을 위한 개체 조직 시료를 수득하거나 및/또는 준비하기 위한 시약, 그리고 사용을 위한 설명.
본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 수행하는데 유용한, 추가적인 구성요소를 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트는 상보적 핵산과 어닐링(annealing)을 위해 또는 특이적으로 결합하는 단백질과 결합하는 항체를 위해 적절한 액체(예를 들면, SSC 버퍼), 하나 또는 그 이상의 시료 부분(compartment), 본 발명의 수행을 기술하는 설명적 자료 및 조직 특이적 대조군/표준을 포함할 수 있다.
VII . 스크리닝 검사( Screening Assays )
본 발명의 표적은 본원의 표 1-28에 뒤이어 목록화된 유전자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 출원인에 의해 기술된 실험 결과에 기반하여, Q10에 의해 조절되는 주요 단백질은 전사 인자, 세포 사멸 반응, 펜토오즈 포스페이트 경로, 생합성 경로, 산화적 스트레스(pro-oxidant), 막 변화 및 산화적 인산화 대사를 포함하는 분자의 다른 경로 또는 그룹과 관련 또는 구분될 수 있다. 본원에서 제공되는 결과에 기반한 CoQ10에 의해 조절되는 주요 단백질은 하기와 같이 요약된다. CoQ10에 의해 조절되는 주요 단백질이면서 전사인자인 HNF4알파이다. CoQ10에 의해 조절되고 세포사멸 반응과 관련되는 주요 단백질은 Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11 (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PμMA 및 cMyc을 포함한다. CoQ10에 의해 조절되고, 펜토오즈 포스페이트 경로와 관련되는 주요 단백질은 트랜스알돌라제 1이다. CoQ10에 의해 조절되고 생합성 경로와 관련되는 주요 단백질은 COQ1, COQ3, COQ6, 프레닐트랜스퍼라제 및 4-하이드로벤조에이트이다. CoQ10에 의해 조절되고 산화적 스트레스(pro-oxidant)와 관련되는 주요 단백질은 호중구 시토졸 인자 2, 산화질소 합성효소 2A 및 과산화물 제거효소 2(미토콘드리아성)이다. CoQ10에 의해 조절되고, 산화적 인산화 대사와 관련되는 주요 단백질은 시토크롬 c, complex 1, complex II, complex III 및 complex IV이다. CoQ10에 의해 직접 또는 간접적으로 조절되는 추가의 주요 단백질은 Foxo 3a, DJ-1, IDH-1, Cpt1C, 그리고 Cam Kinase II를 포함한다.
따라서, 본 발명에 따른 하나의 구체예에서, 마커는 HNF4-α, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11 (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PμMA, cMyc, 트랜스알돌라제 1, COQ1, COQ3, COQ6, 프레닐트랜스퍼라제, 4-하이드로벤조에이트, 호중구 시토졸 인자 2, 산화질소 합성효소 2A, 과산화물 제거효소2, VDAC, Bax 통로, ANT, 시토크롬 c, 복합체 1, 복합체 II, 복합체 III, 복합체 IV, Foxo 3a, DJ-1, IDH-1, Cpt1C, 그리고 Cam 키나아제 II를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예로서, 마커는 HNF4A, 트랜스알돌라제, NM23 및 BSCv를 포함한다. 하나의 구체예로서, 마커는 TNF4A이다. 하나의 구체예에서, 마커는 트랜스알돌라제이다. 하나의 구체예에서, 마커는 NM23이다. 하나의 구체예에서, 마커는 BSCv이다. 확인된 마커의 조절자를 확인하기에 유용한 스크리닝 시험법은 하기에 기술된다.
본 발명은 또한 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조절함으로써 암 세포의 공격성을 조절하는 조절자, 예를 들어 후보 또는 시험 화합물 또는 제제(예를 들어, 단백질, 펩타이트, 펩티드모방체, 펩토이드, 작은 분자 또는 다른 약물)를 확인하기 위한 방법("스크리닝 시험법"으로서 본원에서 또한 지칭됨)을 제공한다. 그러한 시험법은 일반적으로 본 발명의 마커와 하나 이상의 시험법 성분 사이의 반응을 포함한다. 다른 성분은 시험 화합물 그 자체이거나 시험 화합물과 본 발명에 따른 마커의 자연적 결합 파트너의 조합이다. 본원에 기재된 것과 같은 시험법을 거쳐 확인된 화합물은 예를 들면 암 세포의 공격성을 조절하는 것, 예컨대 저해, 완화, 치료 또는 예방하는데 있어 유용할 것이다.
본 발명의 스크리닝 시험법에서 사용되는 시험 화합물은 천연 및/또는 합성 화합물의 체계적인 라이브러리를 포함하는 어떤 활용 가능한 원천으로부터 획득될 수 있다. 시험 화합물은 또한 생물학적 라이브러리; 펩토이드 라이브러리(효소적 분해에 저항성이 있지만 그럼에도 불구하고 생활성으로 남아있는, 신규한 비-펩타이드성 골격이나 펩타이드 기능성을 갖는 분자의 라이브러리; 예를 들면, Zuckermann et al., 1994, J. Med . Chem. 37:2678-85 참조); 공간적으로 다루어질 수 있는 병렬 고체상 또는 용액상 라이브러리; 디콘볼루션(deconvolution)을 요구하는 합성 라이브러리 방법; '하나의 비드 하나의-화합물' 라이브러리법; 및 친화 크로마토그래피 선택을 사용하는 합성 라이브러리법을 포함하는 공지의 조합 라이브러리 법에 따라 수많은 접근법에 의해 획득될 수 있다. 생물학적 라이브러리 및 페토이드 라이브러리 접근법은 펩타이드 라이브러리로 제한되지만, 다른 4가지 접근법은 펩타이드, 비-펩타이드 올리고머 또는 화합물의 작은 분자 라이브러리에 적용가능하다(Lam, 1997, Anticancer Dr μg Des . 12:145).
분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예는 당업계, 예를 들면 DeWitt et al . (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90:6909; Erb et al . (1994) Proc . Natl . Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al . (1994). J. Med . Chem . 37:2678; Cho et al . (1993) Science 261:1303; Carrell et al . (1994) Angew . Chem . Int . Ed . Engl. 33:2059; Carell et al . (1994) Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33:2061; 및 Gallop et al . (1994) J. Med . Chem . 37:1233에서 발견된다.
화합물의 라이브러리는 용액 내 (예를 들면, Hoμghten, 1992, Biotechniques 13:412-421) , 또는 비드 위 (Lam, 1991, Nature 354:82-84), 칩(Fodor, 1993, Nature 364:555-556), 박테리아 및/또는 공극 (Ladner, USP 5,223,409), 플라스미드 (Cull et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) 또는 파지(Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al , 1990, Proc . Natl . Acad . Sci . 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol . 222:301-310; Ladner, supra .) 위에 존재할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은 시험 화합물과 암 세포가 접촉하는 단계 및 시험 화합물이 세포내 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조절하는 능력을 결정하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 마커의 발현 및/또는 활성은 본원에서 기술한 바에 따라 결정될 수 있다.
하나의 구체예로, 본 발명은 본 발명에 따른 마커 또는 이의 생물학적 활성 부분의 기질인, 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 시험법을 제공한다. 아직 또 다른 구체예로, 본 발명은 본 발명의 치료용 항체 또는 이의 생물학적 활성 부분에 결합하는 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 시험법을 제공한다. 시험 화합물이 마커에 직접적으로 결합하는 능력을 결정하는 것은 예를 들면, 화합물을 방사성 동위 원소 또는 효소적 라벨로 커플링함으로써 달성되며, 그러한 화합물의 마커에 대한 결합은 복합체 내 라벨링된 마커 화합물을 검출하는 것에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 화합물(예로서, 마커 기질)은 131I, 125I, 35S, 14C, 또는 3H, 그리고 직접적인 전파 방출의 계산 혹은 신틸레이션 계산에 의해 검출되는 방사성 동위원소로 직접적 혹은 간접적으로 라벨링될 수 있다. 대안적으로, 시험법 성분은 효소적으로, 예를 들면 겨자무과산화요소, 알카리 포스파타아제 또는 루시퍼라제, 그리고 적절한 기질의 제품으로의 변환을 결정함으로써 검출되는 효소적 라벨에 의해 라벨링될 수 있다.
본 발명은 상기 기재된 스크리닝 시험법에 의해 확인된 신규한 제제로 더욱 적용된다. 따라서, 본원에서 기술된 대로 확인된 제제를 적절한 동물 모델에서 더욱 사용하는 것은 본 발명의 범위 내이다. 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이 확인된 본 발명에 따르는 마커의 발현 및/또는 활성을 조절하도록 하는 제제는, 효능, 독성, 또는 그러한 제제로 치료하였을 때의 부작용을 결정하기 위해 동물 모델 내에서 사용될 수 있다. 다르게는, 본원에 기술된 바와 같이 확인된 제제는 그러한 제제의 행동 기전을 결정하기 위하여, 동물 모델 내에서 사용될 수 있다. 더욱이 본 발명은 앞서 기술된 치료를 위해, 상기 기술된 스크리닝 시험법에 의해 확인되는 신규한 제제의 용도에 적용된다.
본 발명은 또한 제한되는 것으로서 이해되지는 않는 하기 실시예에 의해 더욱 설명된다. 본원에서 인용된 모든 참조문헌 및 공개 특허 및 특허 출원의 모든 부분은 참조문헌으로서 여기에 포함된다.
본 발명의 실시예 :
실시예 1: MIM 으로서의 CoQ10 의 구분
CoQ10의 MIM으로의 가능성에 대해 평가하기 위해, 암 세포주와 정상 대조 세포주를 둘 다 포함한 세포주의 집합에 산화형 CoQ10이 외부로부터 추가되었고, 각 세포주의 세포 미세환경 속성에 유도된 변화가 평가되었다. 세포 형태/생리, mRNA와 단백질 수준을 둘 다 포함한 세포 조성에 대한 변화가 분석되었고 정상 세포와 질병 세포에서 그러한 변화가 비교되었다. 이러한 실험의 결과로부터 CoQ10과 특히 MIM으로서 CoQ10의 산화형을 확인했다.
실험의 첫 세트에서 CoQ10에 대한 민감도와 세포의 세포사멸 반응을 측정함으로써 세포 형태/생리 변화를 분석하였다. 대조 세포주 (각질세포와 멜라닌세포의 일차배양)와 여러 피부암 세포주(SK-MEL-28, 비 전이성 피부암; SK-MEL-2, 전이성 피부암; 또는 SCC, 편평세포암; PaCa2, 췌장암 세포주; 또는 HEP-G2, 간암 세포주)를 포함한 피부 세포주군이 다양한 양의 코엔자임 Q10으로 처리되었다. 이러한 실험의 결과는 암세포에서만 세포사멸과 세포 죽음을 유도함과 대조 세포주와 비교 시 암 세포주의 농도 의존적 반응이 변화되었음을 입증했다. 본보기 실험은 아래 실시예 3에 상세하게 설명되어 있다.
다음으로 CoQ10 처리에 따른 세포 조성의 변화를 평가하기 위한 분석을 하였다. mRNA 수준에서 유전자 발현의 변화는 실시간 PCR 분석방법을 이용하여 분석되었다. 본보기 실험이 아래 예 6과 9-13에 상세하게 설명되어 있다. 보완실험에서 단백질 수준에서 유전자 발현의 변화가 항체 마이크로어레이법, 2차원 겔 전기영동 실험을 이용하여 분석되었고, 그 후 질량 분석을 이용해 단백질을 확인한 후 웨스턴 블롯 분석되었다. 본보기 실험이 아래 예 4, 7, 8에 각각 상세히 설명되어 있다. 이러한 분석에서의 결과로 mRNA와 단백질 수준에서 모두 산화형 CoQ10의 추가에 의해 시험된 세포주에서 상당한 유전자 발현의 변화가 유도되었음을 증명하였다. CoQ10 처리에 의해 조절된 유전자는 세포사멸, 암 생물학, 해당작용과 대사, 분자 수송, 세포 신호전달을 포함한 여러 세포 경로 내에서 무리를 이루어 발견된다.
세포내로의 CoQ10 침투를 확인하고 세포에 있는 CoQ10 수준과 형태를 밝히기 위해 실험이 수행되었다. 특히, 미토콘드리아에 코엔자임 Q10의 수준뿐만 아니라 CoQ10의 형태 (예, 산화형 또는 환원형)가 CoQ10 처리된 세포에서 미토콘드리아 농축 샘플(preparations)을 분석함으로서 밝혀졌다. 외부에서 Q10을 추가하면 미토콘드리아 내 존재하는 코엔자임 Q10 수준이 시간과 농도 의존적으로 증가됨을 확인하였다. 놀랍고 예상치 못하게, CoQ10은 미토콘드리아에서 주로 산화형으로 존재함이 확인되었다. 추가적으로, 미토콘드리아 농축 샘플의 단백질 수준의 변화가 2D 겔 전기영동과 질량 분석법을 통한 단백질 식별을 이용해 분석되었다. 이러한 실험의 결과로 대사와 세포사멸 경로와 연관된 특정 단백질에 대한 mRNA와 단백질 수준 조절에 의해 증명된 것 시간에 따라 실시된 미토콘드리아 내 CoQ10 산화형의 수준이 세포 변화의 다양함과 연관성이 있음을 확인했다. 본보기 실험이 아래 실시예 5에 상세히 설명되어 있다.
본 출원에 설명된 결과로 내인성 분자 CoQ10과 특히 산화형 CoQ10이 MIM으로 확인되었다. 예를 들어, CoQ10이 mRNA와 단백질 수준 모두에서 유전자 발현 변화를 유도하는 것이 관찰되었기 때문에 이러한 결과를 통해 CoQ10을 MIM으로 확인했다. 또한 CoQ10이 정상 상태(예, 비 암종)와 비교하였을 때 질병 상태(예, 암)에서 세포 형태/생리와 세포 조성(예, mRNA와 단백질 수준에서 모두 유전자 발현의 변화)에 각기 다른 변화를 유도하였기 때문에 이러한 결과를 통해 CoQ10이 다양한 특징을 가진다고 확인했다. 게다가, 이 실험결과를 통해 CoQ10이 세포를 통과할 수 있고 그에 따라 치료효과와 운반효과를 모두 보였다는 점에서 CoQ10이 다양한 특징을 가짐을 확인하였다.
실시예 2: 질병 관련 과정과 종양학적 장애에 대한 바이오마커를 확인하는 방법
관심있는 물질로 처리된 세포주에서 이루어진 세포기반 분석에서, 처리되고 처리되지 않은 세포의 차이가 mRNA 어레이, 단백질 항체 어레이, 2D 겔 전기영동을 통해 분석되었다. 비교샘플 분석에서 MIM 또는 외-변환 인자에 의해 조절된다고 확인된 단백질은 Systems Biology perspective with pathway analysis (Ingenuity IPA software)와 알려진 문헌의 검토를 통해 분석되었다. 치료적인 또는 바이오 마커 표적 가능성이 있다고 확인된 단백질에 대해 웨스턴 블롯 분석, siRNA 넉-다운 또는 재조합 유전자 생성 또는 특성분석 방법과 같은 확증시험을 하였다.
실시예 3-8에 대한 물질과 방법
코엔자임 Q10 모액
500 μM 코엔자임 Q10 (5% 이소프로파놀 세포성장 배지)가 다음과 같이 준비되었다. 500 μM 코엔자임 Q10 10mL 모액은 항상 새롭게 제조되었다. 분자량:863.34 (0.0005 mol/L)(0.010 L)(863.34 g/mol) = 0.004317 g
500 μM 모액 10mL를 제조하기 위해, 코엔자임 Q10 4.32mg을 측량하여 15mL 팔콘튜브에 넣고 500μL의 이소프로파놀을 추가하였다. 용액은 약 50-60 °C 수조에서 데워졌고 완전히 용해되도록 저었다. 본 용액에 9.5mL 배지(세포성장 배지와 동일)가 추가되었다.
세포배양
세포들은 American Type Culture Collection 또는 Gibco에서 입수하였다. 세포는 5% 소태아혈청(FBS), 0.25 μg/mL 암포테리신, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 100 U mL-1 페니실린이 보강된 DMEM/F-12 배지에서 성장시켰다. 세포들은 섭씨 37도에서 95%공기와 5% 이산화탄소가 있는 공기에서 유지되었다.
코엔자임 Q10치료와 단백질 분리
세포들은 Q10에 노출되기 전에 85% 포화상태(confluency)까지 성장되었다. 보강배지는 Q10으로 농도 50 μM, 100 μM까지 조정되었다. 플라스크는 대조군인 50 μM Q10, 100 μM Q10으로 3회 처리되었다. 단백질은 4, 8, 12, 24시간 후 처리된 플라스크와 대조 플라스크로부터 분리되었다. 단백질 분리를 위해, 세포들은 pH 7.4의 차가운 PBS 5mL로 3회 세척되었다. 그런 후 세포를 3mL PBS에서 긁어 모으고, 원심분리기로 응집시키고, pH 7.4의 용해완충액(80mM TRIS-HCl, 1% SDS, 프로테아제와 포스포타제 저해제와 함께)에서 재부유시켰다. 단백질 농도는 BCA법을 이용하여 정량화되었다.
세포주
아래 열거된 세포주들은 증식되었고 각 세포주에 대한 세포은행(cell bank)이 설립되었다. 다양한 분석을 위한 세포의 대규모 생산이 수행되었고 분석을 위해 물질이 채취되었다. 일반적으로, 세포주 유지를 위해 세포 특이적 배지가 요구되지 않을 때, 세포배양을 위해 사용된 배지는 5% 혈청이 있는 DMEMF-12였다. 세포들은 분열, 세포분석에의 이용, 다음의 표준 실습법 이전에 보통 75-80% 포화상태(confluence, clear spacing)까지 배양되었다. 다음의 세포주들이 실험을 위해 설정되었다:
SK-MEL-28 (비-전이성 피부 흑색종)
SK-MEL-2 (전이성 피부암)
HEKa (각질세포, 피부조절)
HEMa (멜라닌 세포, 피부조절)
nFIB (신생 섬유아세포)
HEP-G2 (간암) [SBH 세포주]
SkBr-3 (유방암, Her2 과발현)
MCF-7 (유방암, p53 돌연변이)
PC-3 (전립선암) [SBH 세포주]
SkBr-3 (인간 유방 선암)
NCI-ES-0808
SCC (편평세포암)
PaCa-2
NIH-3T3
세포 배양:
세포들은 American Type Culture Collection 또는 Gibco에서 입수하였다. 소태아혈청(FBS), 0.25 μg/mL 암포테리신, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 100 U mL-1 페니실린이 보강된 DMEM/F-12 배지에서 성장시켰다. 세포들은 섭씨 37도에서 95%공기와 5% 이산화탄소가 있는 공기에서 유지되었다.
피부 악성 흑색종 SK-MEL 세포들은 5% FBS, 암포테리신, 페니실린/스트렙토마이신이 보강된 글루타맥스가 있는 DMEM/F12에서 배양되었고 유지되었다. 추가 세포주와 성장 조건에 대한 세부사항은 아래 표에 있다.
Figure 112011097936842-pct00003
SKMEL28 세포의 Q10 치료:
SK-MEL 28 세포들은 100 μM Q10 또는 대조 매개체로 처리되었다. Q10의 제조법은 다음과 같다. 15mL 캡튜브안에 Q10 4.32mg (Cytotech사 공급)가 옮겨지고 그 후 이소프로파놀 500 μL를 추가함으로 용해되었다. 그 결과용액은 65℃ 수조에서 데워졌고 빠른 속도로 보텍스 처리되었다. Q10/이소프로파놀 용액은 평형화된 세포배양배지를 추가하여 10mL 부피로 만들어졌다. 모액은 Q10의 최고 용해도에 도달하기 위해 보텍스 처리되었다. 모액은 최종농도 100 μM Q10을 만들기 위해 희석되었다(모액 2mL에 배지 8mL). 대조매개체는 이소프로파놀 500 μL가 9.5mL 배지에 추가되었다. 대조모액은 8mL 배지로 추가 희석되었다(2mL 모액). 세포는 처리시작 후 6, 16, 24, 48 또는 72시간에 채취되었다.
SCC 세포의 Q10처리:
SCC 세포는 100 μM Q10(상기 명시된 것처럼 준비된)으로 6시간 또는 24시간 동안 처리되었다. 대조세포는 처리되지 않은 세포였다. 세포는 처리 후 다른 시간에 수거하여 덩어리화시켰고 응집체는 RNA가 아래 설명된 것처럼 XTAL에서 분리될 때까지 급송 냉동하여 영하 80℃에서 보관되었다.
RNA 분리:
세포는 RNA를 분리하기 위해 제조업체의 설명에 따라 RNeasy Mini Kit (Qiagen사, Valencia CA)키트를 이용하여 각각 다른 처리 시간에 분해되었다. RNA는 260nm에서 광학밀도를 측정하여 정량화되었다.
첫 번째 가닥 합성:
첫 번째 cDNA가닥은 제조업체의 설명에 따라 RT2 First Strnad Synthesis kit (SABiosciences., Frederick MD)을 사용하여 총 RNA 1Xg에서 합성되었다.
실시간 PCR:
첫 번째 가닥 합성에서의 결과물은 물에서 희석되고, SYBR green master mix (SABiosciences., Frederick MD)와 섞이고 PCR 어레이 위에 로딩되었다. 실시간 PCR가 Biorad CFX96 PCR 어레이(세포사멸 어레이, 당뇨 어레이, 산화 스트레스와 항산화 방어 어레이와 열충격 단백질 어레이) 위에서 수행되었다. (SABiosciences, Frederick MD).
아폽토시스에 대한 Nexin 분석에 의해 코엔자임 Q10에 대한 세포주 민감도 파악:
초기와 후기 세포사멸 시 세포의 비율은 코엔자임 Q10 처리 24시간 후에 측정되었다. 초기와 후기 세포사멸은 코엔자임 Q10에 대한 다양한 암 세포주의 민감도의 차이를 이해하기 위한 마커로 이용되었다. 시험된 세포주들은 PaCa2, HepG2, PC-3, SKBr3, MCF-7, SK-MEL28였다. 세포는 96 웰 플레이트에 붙도록 밤새 두었다. 이러한 세포는 대조매개체, 50 μM Q10 또는 100 μM 코엔자임 Q10으로 처리되었다. 24시간 후에, 세포사멸 세포의 존재가 PCA96 유세포 분석기(Guava Technologies, Hayward, CA)에서 측정되었다. 추가로, 일부 세포들은 세포사멸을 위한 양성 대조군으로 4 μM 스타우로스포린으로 2시간 동안 처리되었다. 세포는 처음 PBS로 세척되었고 실온에서 AccμMax (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA) 50 μL로 분리되었다. 분리는 1% Pluronic F-68 (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)을 포함한 배양배지를 추가함으로써 중단되었다. 그런 후 각 웰에 Nexin 시약 (Guava Technologies, Hayward, CA) 100 μL를 첨가하였다. 어두운 곳에서 20분 배양 후, 세포가 기질에 재부착하는 것을 최소화하기 위하여 저결합 플레이트(low binding plate)에서 분석이 수행되었다. Nexin 시약은 두 가지 염료를 함유한다. 세포표면의 포스파티딜 세린을 감지하는 Annexin-V-PE; 초기 세포사멸 세포의 특성. 두 번째 염료, 7-AAD는 살아있고(건강한) 초기 세포사멸 세포에서는 배척되는 반면에 초기 세포사멸 세포에만 침투한다. 세포의 네 시기의 비율; 건강세포, 초기 자가사멸, 후기 자가사멸과 잔해가 Cytosoft 2.5.7 소프트웨어 (Guava Technologies, Hayward, CA)를 이용하여 측정되었다.
면역블롯팅
샘플당 약 50 μg의 단백질이 면역블롯팅을 통해 분석되었다. 모든 처리는 대조군과 함께 3회 수행되었다. 단백질은 12% TRIS-HCl겔에서 분리되었고, 전기영동법을 통해 니트로섬유소 막으로 옮겨졌고 일차 항체와 함께 배양되기 전에 5% 우유와 TBST 용액을 이용하여 저지되었다. 일차 항체는 4℃, 5% BSA와 TBST 용액에서 밤새 배양되었다. 이차 항체는 4도에서 한 시간 동안 배양되었다. 모든 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입되었다. 1:5000 비율로 이용된 β액틴을 제외하고, 항체는 1:1000의 비율로 이용되었다. 점이 발생되었고, 결과는 NIH 자바 기반의 광학농도계 분석 소프트웨어 이미지 J를 이용하여 정량화되었다. 모든 점은 각 β액틴 발현을 위해 탐지되었고 β액틴 발현에 대해 보정되었다.
이차 전기영동
등전위점 초점화(IEF)전, 40mM 트리스, 7M 요소, 2M 티오요소, 1% C7 양쪽성이온 세제에 샘플이 용해되었고, 트리부틸포스핀으로 환원되었고 실온에서 90분간 10mM 아크릴아미드에 알킬화되었다. 샘플의 전도도를 환원시키기 위해 7M 요소, 2M 티오요소, 2% CHAPS으로 구성된 최소 3 볼륨의 재부유 완충액과 함께 샘플이 10-kDA 컷오프 Amicon Ultra 장치를 통해 시험된 후. 단백질 100 마이크로그램이 pH 3에서 10, pH 4에서 7 또는 6에서 11로 pH 기울기가 고정된 11cm 길이의 스트립(GE, Amersham, USA)에서 100,000 volts hour까지 IEF 되었다. IEF 후, pH 기울기가 고정된 스트립은 6 M 요소, 2% SDS, 50 mM 트리스-아세테이트 완충액, pH 7.0, 0.01% 브롬페놀 블루에서 평형화되었고 8-16% 트리스-염산 Precast 겔, 1mm (Invitrogen, USA)에서 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 되었다. 겔은 두 번 시험되었다. 겔은 고정되고 SYPRO Ruby, 80ml/겔, 1mm (Invitrogen, USA)로 염색되었고 후지 FLA-5100 레이저 스캐너에서 이미지화되거나 PVDF 막으로 이동되었다.
dPC(Protein Forest Inc.) 선택적 pI 분류를 이용하는 방법을 통해 단백질 감별의 유용성을 시험하기 위해 대조샘플에 대한 추가 정보를 얻었고, 트립신 가수분해. 단백질의 큰 하부단위를 확인하는데 유용성을 입증한 대조 샘플과 함께 dPC 분석이 수행되었다. 본 시험 동안 생산된 물질들은 향후 필요할 경우 사용할 수 있도록 보관되었다.
2D 겔 이미지 분석:
모든 겔 이미지 분석이 Progenesis Discovery와 Pro Nonlinear Dynamics Inc., Newcastle upon Tyne, UK)를 이용하여 수행되었다. 반점 발견, 정합, 배경 제거, 보정, 여과 후 SYPRO Ruby 겔 이미지에 대한 자료가 도출되었다. 발현이 유의하게 바뀐(p>0.05) 반점을 확인하기 위해 스튜던트 t 시험(Student's t test)( Progenesis Discovery)을 이용하여 그룹간 쌍별 비교가 수행되었다.
항체 어레이:
Q10 처리 세포(SK-MEL-28, SCC)에서의 단백질 농도 수치의 변화를 가늠하기 위해 700개 이상의 단백질 항체를 스크린 하는데 항체 마이크로어레이(Panorama XP725 Antibody Array, Sigma)가 사용되었다. 슬라이드 위의 상응하는 항체 반점에 의해 단백질이 결합될 때 세포 추출물에서의 단백질 발현이 감지되었다. 결합 전에 단백질은 형광 시각화와 정량분석에 이용되는 형광염료로 직접 표지 되었다. 서로 다른 CyDye(Cy3 또는 Cy5)로 각각 표지 된 두 샘플(시험샘플과 대조샘플)의 단백질 발현 프로파일을 비교하는데 어레이가 이용되었고 두 샘플은 자동적으로 어레이의 동일한 단백질 농도에 자동적으로 적용되었다. 각 샘플에 대한 형광 신호 강도는 샘플과 대조군의 염료 표지에 해당하는 파장에서 각각 기록되었다.
고용량의 코엔자임 Q10은 배양된 SKMEL-28 세포의 세포사멸, 당뇨, 산화 스트레스 경로에 연관된 유전자 발현을 조절한다.
실험 세부내용: SKMEL-28 세포 (ATCC Catalog # HTB-72)는 전이성이 없고, 5% FBS, 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신이 보강된 Glutamax (Invitrogen Cat# 10565-042)를 포함하는 DMEM-F12에서 배양된 피부 흑색종 세포는 각기 다른 시간동안 매개체 또는 100 μM 코엔자임 Q10으로 처리되었다. 코엔자임 Q10 처리의 결과인 유전자 발현에서 어떠한 변화는 실시간 PCR 분석(Apoptosis Cat #PAHS-12, Diabetes Cat #PAHS-023 and Oxidative Stress Cat #PAHS-065)을 이용하여 정량화되었다. (SABiosciences, Frederick, MD).
코엔자임 Q10 500μM 모액이 4.32mg을 배지를 이소프로파놀 500ul에 용해하여 준비한 후 배지를 추가하여 10ml로 희석되었다. 코엔자임 Q10을 번갈아가며 보텍스하고 65℃로 가열하여서 녹였다. 모액 2ml는 세포처리에 이용된 배지를 포함한 100μM Q10을 얻기 위하여 배지로 10ml로 희석되었다. 동시에 코엔자임 Q10이 추가되지 않았다는 것을 제외하고는 유사한 프로토콜로 매개체가 준비되었다.
SKMEL-28 세포는 6-웰 플레이트가 1x105 세포/well의 밀도로 심어졌다. 24시간 뒤, 세포가 부착되고 50% 포화상태에 도달했을 때, 매개체 또는 100μM Q10이 첨가되었다. 매개체 처리 세포는 24시간 뒤 채취된 반면, 세포는 Q10 처리 6, 12, 24, 48 또는 72시간에 채취되었다. 세포는 각기 다른 처리 시간에 스핀 컬럼과 온 컬럼 DNase 처리를 이용하여 제조업체의 설명에 따라 RNeasy Mini kit (Qiagen, Inc., Valencia CA Cat #74104) 을 이용하여 RNA 분리를 위해 녹여졌다. RNA는 260nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량화되었다.
총 RNA 0.4-1μg을 이용한 첫 번째 가닥 cDNA 합성에 의해 실시간 PCR이 선행되었다. 첫 번째 가닥 합성의 결과물은 물로 희석되었고 SYBR green master mix(SABiosciences., Frederick MD Cat#PA-010-12)와 섞이고 일반 경로, 보정에 이용되는 5개의 하우스키핑 유전자, 역전사, PCR 컨트롤과 관련된 각기 다른 84개 유전자에 대한 프라이머 분석을 포함하는 PCR 어레이에 로딩되었다. 실시간 PCR은 Biorad Cfx96위에서 진행되었다. 증폭반응은 효소를 활성화시키기 위해 높은 온도에서 시작됐고, 그 후 (95℃ 15초 이차 변성단계와 60℃ 1분 결합 및 연장단계)를 각각 40번을 했고, 융해곡선 프로그램이 그 뒤를 이었다. 모든 처리군에 대한 PCR 증폭기의 결과인 Ct 값은 엑셀 스프레드시트에 정리되었고, www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php에 있는 비교분석 소프트웨어에 로딩되었다.
미토콘드리아 농축 샘플의 정제:
실험 상세내용: t=0에서 모은 세포와 함께 24시간 또는 48시간 동안 100 μM Q10 처리된 SKMEL-28, NCI-ES0808, NIH-3T3 세포는 세척하고 T160 플라스크에서 긁어내어 수거되었다. 세포는 원심분리, 응집, 냉각처리 후 미토콘드리아가 분리될 때까지 영하 80℃에서 보관되었다. 세포 응집체는 해동되고, 재부유시킨 후 Dounce homogenizer에서 파열시켰다. 균질 현탁액은 원심분리되고 미토콘드리아는 시액과 배양세포를 위한 Mitochondria Isolation kit(MitoSciences, Eugene OR, Cat # MS852)에 권고된 프로토콜을 이용하여 분리되었다. 미토콘드리아 분획은 분취되어 영하 80℃에 보관되었다.
코엔자임 Q10과 유비퀴놀-10 정량법:
코엔자임 Q10(Q10)과 환원형인 유비퀴놀-10(Q10H2)의 동시 분석법은 최근 게재된, 양이온 모드에서 LC-MS(액체크로마토그래프 질량분석법)/전자분무 이온화 질량분석법을 통한 방법(Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chromatogr. A, 1175, 242-248)에 기초하여 시행되었다. 위 방법은 기타 선택된 지방의 감별과 동시에 Q10과 Q10H2 모두를 매우 선택적으로 확인하고 민감하게 정량화시킬 수 있다. 100 μM Q10 처리된 SK-MEL-28의 미토콘드리아 농축 샘플 부분표본은 단백질 침전(1-프로파놀 300 μl 에서 초음파처리된 압축세포 100 μl ), 액체-액체 추출(상청액에 물 100 μl 첨가하고 n-헥산 200 μl로 X3추출), 95:5 혼합 헥산 추출물의 건조상태까지 증발과 메탄올/헥산(부피/부피) 50 μl에서 복원에 기반한 일반적인 전처리되었다. 프리즘 RP 1 X 100 mm, 5 μm 입자크기 칼럼(Keystone Scientific)이 있는 Waters Quattro II 삼단계 사중극자형 질량분석기에서 LC-MS/MS 분석이 이루어졌다. 유속 50 μl/min에서 20% 이소프로필 알코올 80% 메탄올에 있는 4mM 포름산 암모늄으로 등용매를 분리하였다. 샘플 10μl가 주입되었다. MRM 분석이 콘전압 40과 충돌에너지 30에서의 m/z 882.7>197.00 (Q10H2)과 m/z 880.80>197.00 (Q10) 전이를 이용하여 수행되었다.
실시예 3. CoQ10 에 대한 세포주의 민감도
여러 세포주들이 Q10 적용 24시간 후 7AAD와 Annexin-V-PE 두 염료를 함유하는 시약 (Nexin 시약)을 이용하여 Q10에 대한 민감도가 테스트되었다. 7AAD 염료는 투과하기 쉬운 세포막이 있는, 주로 후기 세포사멸 시기에 있는, 세포에 들어간다. Annexin-V-PE는 초기 세포사멸 세포의 원형질막 겉표면에 노출된 포스파티딜 세린에 결합하는 염료이다. 그러므로 Nexin 시약은 유세포 분석기(flow cytometer)에서 세포사멸 세포들의 각기 다른 시기를 구분하는 데 사용 가능하다.
PaCa2 세포는 50 μM Q10와 100 μM Q10 적용 24시간 후 초기와 말기 자기사멸 세포(개폐(gating) 세포의 5-10% 사이) 모두에서 증가됨을 보였다. PC-3세포 또한 PaCa2 세포에 비해 증가 폭은 작았지만 50 μM와 100 μM Q10에서 증가하였다. MCF-7과 SK-MEL28 세포들은 50 μM와 100 μM Q10에서 초기 자기사멸 단계에서만 증가함을 보였다. HepG2 세포 역시 50 μM Q10 처리에 민감했다. SKBr3는 50 μM 또는 100 μM Q10 처리에도 초기와 말기 자기사멸 세포에서 어떠한 유의한 증가를 보이지 않은 시험된 유일한 세포주였다. 결과들은 도면 1-6에 묘사되어있다.
Q10 처리가 HepG2 간암 세포에서 세포사멸 반응을 유발한다는 것을 추가 확인하기 위해서, 단일가닥 DNA를 측정하는 ApoStrnad™ ELISA 방법을 이용하여 두 번째 세포사멸 분석이 이루어졌다. ApoStrnad™ ELISA는 포름아미드 변성에 대한 세포사멸 세포 DNA의 민감도와 단일가닥 DNA(ssDNA)에 대한 단일클론 항체로 변성 DNA 감지를 기반으로 한다. 50과 100 μM Q10으로 간암 세포주 HepG2 처리는 각각 17%, 32% 용량반응을 보였고(도면 7) 탐지 가능한 세포사멸을 유발했다. 이러한 결과는 다른 조직(예, SCC, SKMEL-28, MCF-7, PC-3)에서의 기타암 세포주에서 Q10이 유발한 세포사멸의 관찰과 일관된다.
실시예 4: Q10 처리된 세포의 단백질체 분석
Q10 처리된 샘플의 세포 응집체는 단백질체학 분석을 이용하여 분석되었다. 세포 응집체는 2-D 겔과 웨스턴 블롯 분석법으로 분해되고 처리되었다. 세 종류의 세포(SKMEL-28, SCC, nFib)는 Q10으로 처리되었고 2D 겔 전기 영동법으로 단백질체 특징분석 되었다.
Q10 처리된 SKMEL-28세포의 단백질체 분석
웨스턴 블롯과 2D 겔 전기영동에 의해 진행되고 평가된 첫 실험 세트는 피부암 세포주 SKMEL-28이었다. 실험 세트는 0, 50 또는 100 μM Q10으로 3, 6, 12, 24시간에 처리된 SK-MEL-28 세포를 포함했다.
Q10 처리된 SK-MEL-28 샘플 세트는 2D 겔 전기영동(도 8)되었고 대조 샘플 대비 단백질 수치에 차이가 있는지 확인되었다. 대조 샘플을 모든 처리된 샘플과 비교하여 총 24개 겔에 있는 943개 점을 비교분석 하였다. 분석에서 시간에 따른 증가, 감소 또는 번역 후 변이에 의한 점 변화를 확인하였다.
분석을 통해 통계적으로 유의한 점(spot)의 변화 32개를 확인했다. 이것을 통해, 20개의 비중복 지점은 트립신 가수분해(digestion)와 질량분석 특성을 통한 단백질 분석을 위해 절단되고 수득되었다. 특징 있는 펩타이드는 단백질을 확인하기 위해 Mascot과 MSRAT 소프트웨어 분석이 있는 단백질 데이터베이스에서 찾아졌다(표 2).
Figure 112011097936842-pct00004
본 실험에서의 중요한 발견은 트랜스알돌라아제 1의 감소이고 이러한 사실은 Q10이 암세포에서 대사상태를 변화시킨다는 전제를 뒷받침한다. 트랜스알돌라아제 1은 5탄당 인산경로(육탄당 일인산 회로라고도 알려진)에 있는 효소이다. 트랜스알돌라아제(EC:2.2.1.2) 세도헵툴로오즈 7-인산에서 글리세르알데하이드-3-인산으로 에리트로오즈-4-인산과 프룩토오즈 6-인산을 만들기 위한 탄소 세 개 케톨단위의 가역적 운반을 촉매한다. 트랜스케톨라아제와 함께 이 효소는 해당경로와 5탄당 인산경로를 연결한다. 이것은 생합성반응과 환원환경 유지를 위해 환원 당량 생성을 촉진하기 위한 뉴클레오티드와 NADPH 합성과 관련 있다.
최근 논문(Basta, P., et.al. Aμgust 2008, Cancer Detect Prevention, 32, 200-208)은 트랜스알돌라아제의 유전적 다형성의 증거를 제시했고 두경부의 편평세포암과 연관 있다. 또 다른 최근의 논문(Qian, Y., et.al. May 2008, Biochem J, 415, 123-134)에서는 미토콘드리아 항상성, 칼슘 유동, 세포사멸의 조절인자로서 트랜스알돌라아제 결핍을 확인했다.
이러한 초기 결과로부터, 2D 겔 전기영동으로 Q10에 의해 조절된다고 확인된 기타 단백질이 알려진 관계(도면9)에 대해 분석되었다. 이러한 단백질의 기능분석으로 다양한 과정[세포주기; 5탄당 인산 경로(TALDO1); 세라마이드 신호법(CTSD);아미노아실-tRNA 생합성(GARS), 미토콘드리아 단백질 수송(TOM22)]에 연관된 개개의 단백질과 함께 14-3-3-매개 신호(PDCP6IP, YWHAZ, VIM)에 연관된 그룹이 있다는 것이 밝혀졌다.
Q10 처리된 SCC 세포의 단백질체 분석
이전 SK-MEL-28 분석의 후속 실험으로 또 다른 피부암 세포주, 편평세포암(SCC)이 준비되었고 2D 전기영동법으로 분석되었다. SCC 세포는 채취 전 6시간 또는 24시간 동안 100 μM Q10으로 처리되었다. 처리되지 않은 세포도 대조군으로 채취되었다. 세포 응집체는 녹여졌고 샘플은 2D 전기영동(2회) 되었다. 6시간과 24시간 처리에 대한 대조 샘플과 비교하여 600개 이상의 단백질 반점 분석이 비교실험에서 수행되었다.
상위 24개의 유의한 반점 변화가 2D 전기영동 겔의 비교분석에서 평가되었다. 이를 통해, 12개 반점은 삭제되었고 트립신 가수분해와 질량분석 특성(아래 표3에 결과요약)을 통해 확인되었다.
Figure 112011097936842-pct00005
트랜스알돌라아제 1: Q10 처리된 SKMEL-28 세포에서 이전에 관찰된 바와 같이, 트랜스알돌라아제 1 효소는 수치가 감소되었다. 이것을 통해 Q10과 트랜스알돌라아제(및 그에 따른 세포의 대사상태)의 변화간 사전에 관찰된 연관성 독자적으로 확인된다.
트랜스알돌라아제는 5탄당 인산 경로(도면10)의 비산화 상태에 있는 효소이다. 5탄당 인산 경로는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(환원된 NADH) 생성, 환원적 생합성, ATP, DNA, RNA의 필수 요소인 리보오즈 형성을 위한 세포의 대사 상태에 필수적이다. 또한 트랜스알돌라아제는 해당과정과 5탄당 인산경로를 연결한다. 해당과정은 산화적 인산화의 미토콘드리아 과정이 이용되지 않음에 따라 암세포가 세포 생존에 필요한 에너지를 얻는 대사경로이다. Q10은 산화적 인산화와 미토콘드리아 ATP 생성에 요구되는 필수 조효소 요소이다.
BSCv: 반점 23은 BSCv라 명명된 크로모좀 20 기원의 새로운 인간 단백질이었다. BSCv 단백질은 아디포사이트 원형질막 결합 단백질(유전자명: APMAP 또는 C20orf3)로도 알려져 있고 단백질의 스트릭토시딘 합성효소(strictosidine synthase)계와 유사한 서열의 단일 관통막 타입 2 막단백질로 예상된다. Q10 처리는 이 단백질 수치의 감소를 야기했다. 이 단백질은 잘 특성화되지 않았고, 스트릭토시딘 합성효소와 상동관계도 확인되지 않았다. 재미있게도, 이 단백질은 아디포사이트 분화(Albrektsen et al., 2001)와 관련 있다. 인간 대망 지방조직에 대한 최근의 단백질체 연구는 BSCv가 병리학적으로 비만인 여성의 다낭성 난소 증후군(PCOS)에 대해 각각 다르게 발현하는 9개의 단백질 중 하나임을 확인하였다(Corton, 2008 HμM. Reprod. 23: 651-661). Q10에 반응하는 세포 표면 단백질과 같이 BSCx에 대한 항체는 바이오마커로 활용될 수 있다. 통용되는 결과와 가능한 문헌을 근거로, BSCv는 암과 당뇨에서 잠재적인 역할을 할 수 있다.
NM23A: 비전이성 세포 1, 단백질 (NME1로도 알려진 NM233A)은 전이 억제제로 예상된다. 이 유전자(NME1)는 상당히 전이적인 세포에서 감소된 mRNA 전사수준을 보였기 때문에 발견되었다. 이 단백질은 이인산 뉴클레오사이드 카이네이즈(NDK)로도 활성이 있고 'A'(이 유전자에 의해 암호화된)와 'B'(NME에 의해 암호화된) 아형으로 구성된 6합체로 존재한다. 이 유전자의 돌연변이는 공격적인 신경세포 종양에서 확인되었다. NDK 활동은 예를 들어 구연산(크렙스) 회로에서 GTP가 ATP로 변하는 때와 같이 서로 다른 삼인산 뉴클레오사이드 간의 평형을 유지한다. NDK 복합체는 STRAP과의 상호작용을 통해 p53와 관련이 있다. STRAP이 HNF4A와 연관 있다는 것은 주목할만하다. 그러므로, NM23A는 세포 조절과 질병 치료에 중요한 회로에 포함될 가능성이 있는 단백질이다.
Rho GDP 해리 억제자(GDI) 알파: GDI는 Rho 단백질로부터 GDP 해리와 그에 따른 Rho 단백질로의 GTP 결합을 저해함으로써 Rho 단백질의GDP/GTP 교환반응을 조절한다. 이 단백질은 암세포에서 상향조절 되어있다.
실시예 5: 미토콘드리아 농축 분석
여러 근거가 미토콘드리아 단백질과 암 생물학과 Q10 반응의 역할에 대한 정밀한 평가가 이루어졌다고 시사한다. 첫째로, 정상세포에서 에너지 생산을 위한 미토콘드리아 산화적 인산화 과정에서 Q10의 역할이 필수적이다. 그러나, 암세포에서 일어나는 대사의 변화는 Q10을 요구하지 않는 해당과정의 대체 경로를 통해 에너지를 생산한다. 둘째로 세포의 세포사멸 반응이 일어나기 위해서는 미토콘드리아 단백질 요구된다. Q10은 암세포(Bcl-2-단백질 그룹, 사이토크롬 c)에서 세포사멸을 촉진한다고 밝혀졌다. 마지막으로, 미토콘드리아 수송 수용체 단백질 TOM22(이하 설명된 실험 참고)이 단백질 수치를 통해 조절되는 것처럼 새로운 미토콘드리아 단백질이 Q10처리에 의해 조절됨이 확인되었다.
미토콘드리아 농축 샘플 생산:
피부암 SKMEL-28 세포가 100 μM Q10 또는 가짜 매개체로 6, 19 또는 48시간 동안 처리되었다. 세포는 세척하고 T-160 플라스크 (각 시간에 4)에서 긁어서 채취하였다. 세포는 원심분리를 통해 모아졌고 응집체는 냉각 후 영하 80℃에 보관하였다. 세포 응집체는 재부유되고 2mL Dounce 균질화기를 이용해 파열되었다. 시약과 방법은 Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells (MitoSciences, Cat# MS852)에서 구했다. 그 결과로 생긴 미토콘드리아 샘플은 75μL 분취액(한 샘플당 4-5 분취액)으로 나눠지고 영하 80도에 보관되었다.
Q10 처리된 SK-MEL-28 세포로부터 분리된 미토콘드리아 농축 샘플의 단백질체 분석
6, 19, 48 시간 동안 100 μM Q10 처리된 SK-MEL-28 미토콘드리아 농축 샘플(상응하는 가짜 매개체 대조군과 함께)의 두 분취액에 용해되어있는 단백질에서 2D 겔 전기영동이 수행되었다. 샘플은 두 번 2D 전기영동 되었다. 대조군 샘플을 다른 시간대 샘플과 비교하는 비교시험에서 525 단백질 반점분석이 수행되었다(도면 11).
2D 전기영동 겔 비교분석에서 9개의 통계적으로 유의한 반점 변화가 선택되었다. 이를 통해 9개 반점을 트립신 가수분해와 질량분석 특성화에 의한 확인을 위해 제출되었다.
Figure 112011097936842-pct00006
아실 CoA 티오에스터라제 7: 아실-CoA 티오에스터라제7(ACOT7)은 지방산 아실 CoA를 유리지방산과 CoA로 가수분해하는 반응에 촉매작용을 하는 효소 그룹의 일원이다. 그러므로 이 효소는 지방 대사와 세포 신호전달의 조절에 중요한 역할을 한다. ACOT7은 지방산 사슬의 탄소수가 8-16개(C8-C16)가 있는 고급 아실-CoA 기질을 선호한다. ACOT7의 정확한 세포에서의 기능은 온전히 이해되지 않았다. 스테롤 조절인자-결합 단백질 2에 의해 이 유전자 전사는 활성화되고 이는 콜레스테롤 대사에서의 기능을 시사한다.
본 사례에서의 결과는 ACOT7가 Q10 대사에 직접적 또는 간접적으로 연관되어있을 가능성이 있음을 시사한다. 그러므로, ACOT7을 표적으로 삼는 것은 Q10의 세포간 수치 조절을 촉진할 수 있고 따라서 세포에서 Q10 효과에 영향을 미친다.
피루브산 키나아제: 피루브산 키나아제는 해당작용의 후기단계에 관련된 효소이다. 이것은 포스포에놀피루브산(PEP)로부터 ADP로의 인산기 이동하여 피루브산 한 분자와 ATP 한 분자를 산출하는 반응을 촉매한다.
Figure 112011097936842-pct00007

이 단백질은 미토콘드리아 농축 SK-MEL-28 샘플에서 확인된 타입 2 아형인 PKM2의 단백질로 추정된다. 이 아형은 암세포 형성과 조절과 연관이 있다고 잘 알려져 있다.
미토콘드리아에서 Q10 수치 정량화
최근 발표된 방법(Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chroma A, 1175, 242-248)을 기반으로 양이온 모드에서 전자분무 이온화법(ESI)으로 LC-MS-MS를 통해 코엔자임 Q10(Q10)과 환원형 유비퀴놀-10(Q10H2)의 동시분석이 수행되었다. 이 방법을 통해 기타 선택된 지방의 감별과 동시에 Q10과 Q10H2 모두를 매우 선택적으로 감별하고 민감하게 정량하는 것이 가능하다. 100 μM Q10 처리된 SK-MEL-28의 미토콘드리아 농축 샘플 분취액이 단백질 침전, 액체-액체 추출, 건조상태로의 증발, 95:5 메탄올/헥산(부피/부피) 복원에 기반하여 일반적인 전처리되었다.
이 분석에서 Q10, Q10H2, Q9가 정량화되었다(표 5). 관련 분자인 Q9의 수치가 낮았고 거의 탐지가능 수준이었다. 처리되지 않은 샘플의 수치는 상대적으로 일관적이었고, 6시간 Q10 처리된 샘플과 같은 수준이었다. 전체 물질에서 샘플편차를 조절하기 위해서, 샘플 사이즈 에러에 의해 편차가 생기지 않았음을 확인하기 위해 콜레스테롤 수치도 측정되었다. Q10 수치가 같은 미토콘드리아 조제물의 다른 분취액의 단백질 추출물에서 얻어진 총 단백질 값에 대해 보정되었을 때, 상대적 비율이 비교되었다. 그 결과 Q10수치는 19시간(~3배)에 유의적으로 증가하였고, 48시간에는 훨씬 많이 증가되었다(~6배)(도면 12).
Figure 112011097936842-pct00008
본 실험에서의 놀라운 결과는 Q10이 세포에 산화형으로 공급되었다는 것이다. 48시간 샘플에서, 환원형 Q10H2도 측정되었고 매우 낮은 양이 존재한다는 것이 확인되었다(CoQ10 샘플의 46.63ng에 비해 CoQ10H2 샘플 0.28ng). Q10 48시간 처리 샘플에서의 Q10H2 수치가 완화하게 증가(3배)했지만, 그 수치는 분석에서의 추정 검출한계에 가까웠다. 재미있게도, 산화형(Q10)은 생물학적 체계 내에서 산화 촉진제의 역할을할 수 있었다. 문헌에 따르면, 인간 혈장에서 Q10과 Q10H2를 분석해 봤을 때, 분자의 대다수(90%)는 항산화제 역할을할 수 있는 Q10H2의 환원형이었다(Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chroma A, 1175, 242-248).
그러므로, 이러한 결과로부터 외부로부터 Q10이 배지에 추가 유입됨에 따라 미토콘드리아에서 Q10의 수치가 증가함을 확인했다. 놀랍고 예측하지 못한 발견은 Q10이 공급된 산화형(산화촉진제)에서 유지되었고 Q10H2의 환원형(항산화제)로 어떠한 유의한 양만큼 변환되지 않았다는 점이다.
실시예 6. 실시간 PCR 분석
실험 1: 세포사멸 어레이
위에 실시예 3에서 논의된 바와 같이, 암세포의 Q10 노출은 세포사멸 과정에 의해 암세포들이 사멸하는 비율을 높인다. Q10 반응에 연관된 단백질을 확인하기 위해, 세포사멸에 대한 표적 회로 어레이에 연관된 유전자/단백질에 대한 mRNA 수치의 변화를 확인하기 위해 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)법이 이루어졌다.
PCR 어레이를 스크리닝 도구로 사용하면서, 세포내 Q10의 생물학적 활동방식에 대한 이해를 도와줄 수 있는 분자 표적의 범위가 평가되었다. 80개 경로 특정 표적을 포함하는 사전에 선택된 서브세트의 mRNA 수치를 측정하기 위해 mRNA 수치의 변화는 실시간 PCR 정량법을 통해 분석되었다.
mRNA 결과를 해석하기 위해, mRNA 전사가 두 배 변화한 유전자를 확인하고 평가하였다. mRNA를 생산하기 위한 유전자 전사 수치를 통해서는 발현된 단백질 수치의 가능한 변화에 대한 대략적인 추정만이 가능하다. 노련한 사람은 각 mRNA가 분해된 정도가 다르거나 비효율적으로 번역이 되어서, 단백질 양이 다른 결과를 얻었음에 감사할 것이다.
24시간 동안 50μM Q10 처리된 SkBr-3 세포
총 84개의 세포사멸 경로 관련 단백질에 대해서 mRNA 수치 변화를 측정하기 위해 RT-PCR 분석법이 이용되었다. Q10처리(24시간)된 SkBr3에 대한 실시간 PCR 세포사멸 분석 실험을 통해 다음의 mRNA가 영향을 받음을 확인하였다: Bcl2, Bcl2L1, Bcl2L11, Birc6, Bax, Xiap, Hprt1, Apaf1, Abl1, Braf. 이러한 결과는 암세포에 Q10 처리 시 세포사멸 반응이 일어난다는 증거를 또 다시 지지한다.
[표 6a]
Figure 112011097936842-pct00009

SK-MEL-28 세포에서 이루어진 3개의 개별시험에서의 일관된 결과는 아래 표 6B에 요약되어있다. 100 μM Q10 처리된 SCC 세포에서도 여러 유전자가 조절되었다. SCC 세포에서 조절되는 것으로 보이는 세포사멸 어레이에서의 유전자들이 표 7에 설명되어 있다. SK-MEL-28 세포와 SCC 세포에 있는 많은 유전자가 6시간에 조절되었음을 확인했다. 24시간쯤에는 조절이 감소되었다. SK-MEL-28 세포와 SCC 세포에서 모두 조절되는 유전자는 표 8에 설명되어 있다.
[표 6b]
Figure 112011097936842-pct00010
Figure 112011097936842-pct00011
Figure 112011097936842-pct00012
Figure 112011097936842-pct00013
Figure 112011097936842-pct00014
재미있게도, 변화된 mRNA 수치는 세포사멸 단백질들의 상당한 상향조절을 보여주었고, 그 중 Bcl-xl에서의 변화가 가장 컸다. SK-MEL-28 세포에서의 단백질 어레이 실험에서도 이러한 결과를 확인할 수 있었다.
Bcl-xl은 미토콘드리아의 막횡단 분자이다(Bcl-xl은 "엄청 큰 기저 세포 종양"을 뜻한다). 이것은 FAS-L의 신호변환 경로에 연관되고 단백질 Bcl-2 그룹의 멤버인 여러 세포사멸 단백질 중 하나이다. Bcl-xl은 암세포 생존에 연루되었음이 시사되어왔다. 그러나, 인간 Bcl-x mRNA의 선택적 재조합으로 최소 두 개의 별개 Bcl-x mRNA 종, Bcl-xL과 Bcl-xS가 생긴다고 알려져 있다. 우세한 단백질 산물(233 아미노산)은 큰 Bcl-xL mRNA, Bcl-xL이고 이것은 성장인자 철수에 따른 세포 죽음을 저해한다(Boise et al., 1993 . Cell 74, 597-608). 반면에 Bcl-xS는 세포 죽음을 저해하는 Bcl-2 기능을 저해하고 세포를 세포사멸 세포의 죽음에 좀 더 민감하게 만든다. 이용된 분석법은 Bcl-x의 어떤 아형이 상향조절 되는지 구별하지 않았다. 이러한 실험에서 CoQ10에 의해 상향 조절된 Bcl-x 아형은 2개의 mRNA 재조합 아형(Bcl-xL 대 Bcl-sL)의 비율을 분석하기 위해 RT-PCR 법을 사용하는 것과 같이 일반에 알려진 일반적인 방법을 통해 밝혀질 수 있다.
세포사멸 관련 단백질 조사로부터, 여러 세포사멸 촉진인자와 항 세포사멸 인자는 BCL-2 패밀리 또는 내에 있거나 발현 정도를 조절하였다(BCL2L11, BNIP2, BAG1, HRK, BAK1, BCL2, BCL2L1). 이러한 단백질들은 미토콘드리아 외막 침투를 관장한다.
세포사멸 반응에 대한 초기 마커는 카스파아제 3/7 단백질에 의한 세포사멸을 사전에 관찰한 것과 일관되게 카스파아제-9(16시간)의 조절과 함께 관찰된다. 스트레스 신호전달 경로의 유도는 미토콘드리아에서 사이토크롬c의 분비와 apaf-1(apoptosome)의 활성화를 야기하고, 이것은 결국 카스파아제 9의 효소 전구체를 활성화 형으로 쪼갠다. 일단 시작되면 카스파아제 9는 다른 세포사멸 경로를 촉진하기 위해 프로카스파아제-3과 프로카스파아제-7로 쪼개진다.
조절되는 단백질의 종양괴사인자 수용체 군에 대해서 일관적인 연관성이 있다.
암단백질 p73의 강한 하향조절 또한 주목되었다. 유방암 자궁암을 포함한 인간에서 통상적으로 발견되는 여러 암 분석은 상응하는 부위의 정상 조직과 비교했을 때 p73이 과발현됨을 보여주었다. 세포주기 조절과 포유류 세포의 DNS 합성(예, E2F-1)에 연관된 인체 내 전사 요소의 조절되지 않는 과발현이 p73 발현을 유도한다는 것이 최근의 연구 결과에서 시사되었다. 그 결과에서 P73이 종양단백질일 수 있지만 p53 단백질이 연관된 기전와 다른 기전을 가질 것이라고 제시되었다. 세포사멸 경로의 도식도가 도면 13에 나타나있다.
SKMEL-28 세포
세포사멸 관련 단백질 조사로부터, 여러 세포사멸 촉진인자와 항 세포사멸 인자는 BCL-2 패밀리 또는 내에 있거나 발현 정도를 조절하였다(BCL2L11, BNIP2, BAG1, HRK, BAK1, BCL2, BCL2L1). 이러한 단백질들은 미토콘드리아 외막 침투를 관장한다.
세포사멸 반응에 대한 초기 마커는 카스파아제 3/7 단백질에 의한 세포사멸을 사전에 관찰한 것과 일관되게 카스파아제-9(16시간)의 조절과 함께 관찰된다. 스트레스 신호전달 경로의 유도는 미토콘드리아에서 사이토크롬c의 분비와 apaf-1(apoptosome)의 활성화를 야기하고, 이것은 결국 카스파아제 9의 효소 전구체를 활성화 형으로 쪼갠다. 일단 시작되면 카스파아제 9는 다른 세포사멸 경로를 촉진하기 위해 프로카스파아제-3과 프로카스파아제-7로 쪼개진다.
Figure 112011097936842-pct00015
Figure 112011097936842-pct00016

조절되는 단백질의 종양괴사인자 수용체 군에 대해서 일관적인 연관성이 있다.
암단백질 p73의 강한 하향조절 또한 주목되었다. 유방암 자궁암을 포함한 인간에서 통상적으로 발견되는 여러 암 분석은 상응하는 부위의 정상 조직과 비교했을 때 p73이 과발현됨을 보여주었다. 세포주기 조절과 포유류 세포의 DNS 합성(예, E2F-1)에 연관된 인체 내 전사 요소의 조절되지 않는 과발현이 p73 발현을 유도한다는 것이 최근의 연구 결과에서 시사되었다. 그 결과에서 P73이 종양단백질일 수 있지만 p53 단백질이 연관된 기전과 다른 기전을 가질 것이라고 제시되었다.
실험예 2: 산화 스트레스와 항산화 방어 어레이를 이용한 실시간 PCR 어레이
Q10 반응에 연관된 단백질을 확인하기 위해, 산화 스트레스와 항산화 방어에 대한 표적 회로 어레이에 연관된 유전자/단백질에 대한 mRNA 수치 변화를 확인하기 위해 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)법이 이루어졌다.
아래 표 10에는 100 μM Q10 처리된 SK-MEL-28 세포에서 조절되는 유전자가 나열되어있다. 두 별개 시험에서 조절된 유전자에 대해서만 결과가 있다. 6시간에서 상당한 양의 유전자가 조절되었지만, RNA에서 가장 큰 변화는 48시간에서 볼 수 있었다.
Figure 112011097936842-pct00017
Figure 112011097936842-pct00018
Figure 112011097936842-pct00019
Figure 112011097936842-pct00020
Figure 112011097936842-pct00021
Figure 112011097936842-pct00022
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호중구 기질 인자 2(NCF2, 65kDa, 만성육아종, 상염색체 2)는 가장 처음 유도된 mRNA 중 하나이다(6시간 때 관찰). 그 후 16시간대와 그 뒤로, 호중구 기질 인자 1(NCF1)이 최초 유도기 후 매우 높은 수준으로 유도되었다. 호중구 기질 인자 2는 호중구에서 쉽게 발견되는 NADPH라고 알려진 복합 단백질 구조물의 기질이다. 이 산화효소는 호중구 식체의 루멘으로 운반되는 많은 양의 초과산화물을 생산한다.
NADPH 산화효소 (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산-산화효소)는 막결합 효소 복합체이다. 이것은 원형질막과 식체의 막에서 발견할 수 있다. 이것은 6개의 하위단위로 구성되어 있다. 하위단위는:
Rho 구아노신 트리포스파타제 (GTPase), 일반적으로 Rac1 또는 Rac2 (Rac은 Rho-연관 C3 보툴리눔 독소 기질을 의미한다)
5개 "phox" 단위 (Phox는 포식세포 항산화제를 의미한다)
" P91-PHOX (헴 포함)
" p22phox
" p40phox
" p47phox (NCF1)
" p67phox (NCF2)
또 다른 NADPH 산화효소 수치는 변하지 않음이 관찰되었다. 그 효소는 새로운 NADPH 산화효소로 초과산화물을 생성하고 칼슘 의존적 방법 수소통로로의 기능을 하는 NOX5이다.
또한 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트-의존적 RAC 교환체 1(PREX1) 역시 상향조절되었다. 이 단백질은 작은 GTP-결합 단백질(RACs)의 RHO군에서 구아닌 뉴클레오티드 교환인자로서의 역할을 한다. 이 단백질은 RAC1에 결합하고 결합 GDP를 유리 GTP로 교환함으로써 RAC1을 활성화시킨다. 주로 세포질에서 찾을 수 있는 이 암호화된 단백질은 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트와 헤테로트라이머릭 G 단백질의 베타-감마 하위단위에 의해 활성화된다.
초기에 유도된 단백질 중 두 번째 많은 것은 산화질소 합성효소 2A(유도효소, 간세포)(NOS2A). 산화질소는 신경전달과 항균, 항암 작용을 포함한 여러 과정에서 생물학적 매개체로 작용하는 활성 자유기이다. 이 유전자는 간에서 발현되는 산화질소 합성효소를 암호화하고 특정 사이토카인과 지질다당류의 복합체에 의해 유도 가능하다.
과산화물 제거효소 2, 미토콘드리아 (SOD2)는 철/망간 과산화물 제거효소군에 속한다. 이것은 호모테트라머를 형성하고 서브유니트당 망간이온 하나를 결합시키는 미토콘드리아 단백질을 암호화한다. 이 단백질은 산화적 인산화의 초과산화 부산물에 결합하고 그것을 과산화 수소와 이원자 산소로 변화시킨다. 이 유전자에 있는 돌연변이는 특발성 심근증(IDC), 조로, 산발적 운동신경 질병, 암에 연관되어 있다.
하향 조절된 단백질의 한 예가 포크헤드 박스 M1(FOXM1)이고, 이것은 내인성 FOXM1 발현이 S와 G2/M기에서 최고조일 때 세포주기에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 최근의 연구에서 FOXM1이 Plk1, 사이클린 B2, Nek2, CENPF와 같은 G2/M 특이 유전자의 다양한 집합체의 발현을 조절하고 염색체 분리와 게놈의 안정성 유지에 중요한 역할을 한다고 밝혀졌다. FOXM1 유전자는 현재 인간의 암유전자 전구체로 알려져 있다. FOXM1의 이상 상향조절은 기저세포 종양(BCC)의 악성종양형성과 연관이 있다. 따라서 간, 유방, 폐, 전립선, 자궁경부, 직장, 췌장, 뇌를 포함한 인간 고형암의 대부분에서 FOXM1이 상향조절 되어있음이 발견된다.
SKMEL-28 세포
SKMEL-28 세포를 이용하여 추가 실험이 행해졌다. 100 μM Q10 처리된 SKKMEL-28 세포에 있는 mRNA 수치는 처리되지 않은 세포에서의 수치와 다양한 시간대에서 실시간 PCR 법(RT-PCR)을 이용하여 비교되었다. PCR 어레이 (SABiosciences) 적절한 RNA 품질관리뿐만 아니라 최적화된 실시간 PCR 프라이머 분석. PCR 어레이 분석에는 실시간 PCR의 민감도와 마이크로 어레이의 여러 유전자 프로파일링 능력이 있고, 유전자 발현 분석을 수행한다.
Figure 112011097936842-pct00024
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Figure 112011097936842-pct00026
호중구 기질 인자 2(NCF2, 65kDa, 만성육아종, 상염색체 2)는 가장 처음 유도된 mRNA 중 하나이다(6시간 때 관찰). 그 후 16시간대와 그 뒤로, 호중구 기질 인자 1(NCF1)이 최초 유도기 후 매우 높은 수준으로 유도되었다. 호중구 기질 인자 2는 호중구에서 쉽게 발견되는 NADPH라고 알려진 복합 단백질 구조물의 기질이다. 이 산화효소는 호중구 식체의 루멘으로 운반되는 많은 양의 초과산화물을 생산한다.
NADPH 산화효소 (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산-산화효소)는 막결합 효소 복합체이다. 이것은 원형질막과 식체의 막에서 발견할 수 있다. 이것은 6개의 하위단위로 구성되어 있다. 하위단위는:
Rho 구아노신 트리포스파타제 (GTPase), 일반적으로 Rac1 또는 Rac2 (Rac은 Rho-연관 C3 보툴리눔 독소 기질을 의미한다)
5개 "phox" 단위 (Phox는 포식세포 항산화제를 의미한다)
" P91-PHOX (헴 포함)
" p22phox
" p40phox
" p47phox (NCF1)
" p67phox (NCF2)
"
또 다른 NADPH 산화효소 수치는 변하지 않음이 관찰되었다. 그 효소는 새로운 NADPH 산화효소로 초과산화물을 생성하고 칼슘 의존적 방법 수소통로로의 기능을 하는 NOX5 이다.
또한 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트-의존적 RAC 교환체 1(PREX1) 역시 상향조절되었다. 이 단백질은 작은 GTP-결합 단백질(RACs)의 RHO군에서 구아닌 뉴클레오티드 교환인자로서의 역할을 한다. 이 단백질은 RAC1에 결합하고 결합 GDP를 유리 GTP로 교환함으로써 RAC1을 활성화시킨다. 주로 세포질에서 찾을 수 있는 이 암호화된 단백질은 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트와 헤테로트라이머릭 G 단백질의 베타-감마 하위단위에 의해 활성화된다.
초기에 유도된 단백질 중 두 번째 많은 것은 산화질소 합성효소 2A(유도효소, 간세포)(NOS2A). 산화질소는 신경전달과 항균, 항암 작용을 포함한 여러 과정에서 생물학적 매개체로 작용하는 활성 자유기이다. 이 유전자는 간에서 발현되는 산화질소 합성효소를 암호화하고 특정 사이토카인과 지질다당류의 복합체에 의해 유도 가능하다.
하향 조절된 단백질의 한 예가 포크헤드 박스 M1(FOXM1)이고, 이것은 내인성 FOXM1 발현이 S와 G2/M기에서 최고조일 때 세포주기에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 최근의 연구에서 FOXM1이 Plk1, 사이클린 B2, Nek2, CENPF와 같은 G2/M 특이 유전자의 다양한 집합체의 발현을 조절하고 염색체 분리와 게놈의 안정성 유지에 중요한 역할을 한다고 밝혀졌다. FOXM1 유전자는 현재 인간의 암유전자 전구체로 알려져 있다. FOXM1의 이상 상향조절은 기저세포 종양(BCC)의 악성종양형성과 연관이 있다. 따라서 간, 유방, 폐, 전립선, 자궁경부, 직장, 췌장, 뇌를 포함한 인간 고형암의 대부분에서 FOXM1이 상향조절 되어있음이 발견된다.
실험예 3: 열충격 어레이를 이용한 실시간 PCR
SCC 세포가 열충격 어레이되었고 조절된 유전자에 대한 데이터는 아래 표 13에 요약되어있다.
Figure 112011097936842-pct00027
Q10이 다양한 유전자에 영향을 주고 세포의 대사상태를 변화시킬 수 있다는 전체적인 가설을 시험하기 위해 본 사례에서 설명된 실험들을 진행하였다. Q10을 100 μM 처리한 SK-MEL-28 세포의 mRNA를 당뇨병과 그 기전에 관련된 표적 단백질로 구성된 패널을 사용하여 RT-PCR방법을 통해 평가하였다. 본 시험 결과, 당분해 작용기전과 인슐린 진행과정에 관련된 몇몇 단백질의 mRNA 발현 수준이 변화된 것을 발견하였다. (표 14에 요약하였음)
Figure 112011097936842-pct00028
본 초기 시험결과는 인슐린과 관련된 다양한 단백질의 mRNA 발현수준이 양방향으로 조절되었음을 보여주고 있다. 본 결과는 Q10이 당뇨병 치료 및 평가에 영향을 줄 수 있음을 나타내고 있다.
Q10을 처리한 SK-MEL-28 세포에서 얻은 결과를 확인하기 위해 추가적인 시험을 진행하였다. Q10을 처리한 이후 6시간에 SK-MEL-28 세포의 많은 유전자의 발현이 조절되었다. 하지만 16시간째와 24시간째에는 초기 조절이 덜 명확하게 바뀌었다. 약 48시간째에는 당뇨병과 관련된 많은 유전자의 발현이 강하게 조절되는 것을 발견하였다. 2개 이상의 독립적인 시험들로부터 얻은 일관된 결과를 표 15에 정리하였다. Q10을 처리한 SCC 세포도 처리 후 6시간째와 24시간째에 어떤 유전자의 발현이 조절되는 것을 보여주는 것 같았다. SCC 세포에 대한 결과는 표 16에 정리하였으며, SK-MEL-28 세포와 SCC 세포 모두에서 발현이 조절된 유전자에 대한 결과는 표17에 정리하였다.
Figure 112011097936842-pct00029
Figure 112011097936842-pct00030

Figure 112011097936842-pct00031
Figure 112011097936842-pct00032
다양한 인슐린 관련 단백질의 mRNA 발현 수준은 양방향으로 조절되었다. Q10은 세포의 대사조절에 영향을 주며, 따라서 당뇨병과 같이 대사가 조절되지 못하는 질병에 영향을 준다.
키나아제 14 (MAPK14)는 MAP 키나아제 군에 속한다. MAP 키나아제는 다양한 생화학적 신호를 통합하는 역할을 하며 분화, 분열, 전사 조절 및 발생과 같은 매우 넓은 범위의 세포적 진행과정에 관련한다. 본 시험을 통해 MAPK 14가 유의적으로 감소하는 것을 관찰하였다.
간세포 핵 인자(Hepatocyte nuclear factor) 4, 알파 (HNF4A): HNF4 (Hepatocyte Nuclear Factor 4)는 간, 소화관, 신장 및 간 발생에 중요한 췌장 베타 세포에 주로 발현되는 핵 수용체 단백질이다. 인간에서는 NHF4는 2개의 이형질체가 있는데, HNF4A는 알파 이형질체를, HNF4G는 감마 이형질체를 각각 암호화하고 있다 (예를 들면 Chartier FL, Bossu JP, Laudet V, Fruchart JC, Laine B (1994). "Cloning and sequencing of cDNAs encoding the hμMan hepatocyte nuclear factor 4 indicate the presence of two isoforms in hμMan liver". Gene 147 (2): 269-72 참조).
HNF4는 원래 희귀 수용체로 분류되었었다. 하지만 이후에 HNF4가 다양한 지방산에 지속적으로 붙어있는 것 때문에 지속적으로 활성화된다고 밝혀졌다 (예를 들면 Sladek F (2002). "Desperately seeking...something". Mol Cell 10 (2): 219-221 and JμMp DB, Botolin D, Wang Y, Xu J, Christian B, Demeure O (2005). "Fatty acid regulation of hepatic gene trnascription". J Nutr 135 (11) 참조). 다른 핵 수용체와 같이 HNF4의 리간드 결합역은 기본적인 알파 나선형의 샌드위치 폴드를 가지고 있으며 (예를 들면 Wisely GB, Miller AB, Davis RG, Thornquest AD Jr, Johnson R, Spitzer T, Sefler A, Shearer B, Moore JT, Miller AB, Willson TM, Williams SP (2002). "Hepatocyte nuclear factor 4 is a trnascription factor that constitutively binds fatty acids". Structure 10 (9): 1225-34 and Dhe-Paganon S, Duda K, Iwamoto M, Chi YI, Shoelson SE (2002). "Crystal structure of the HNF4 alpha ligand binding domain in complex with endogenous fatty acid ligand". J Biol Chem 277 (41): 37973-6 참조), 공활성단백질과 상호작용을 한다 (예를 들면 Duda K, Chi YI, Shoelson SE (2004). "Structural basis for HNF-4alpha activation by ligand and coactivator binding". J Biol Chem 279 (22): 23311-6 참조).
HNF4 알파 유전자의 변이는 소아성인형당뇨병 (MODY)과 관련되어 있다 (예를 들면 Fajans SS, Bell GI, Polonsky KS (2001). "Molecular mechanisms and clinical pathophysiology of maturity-onset diabetes of the young". N Engl J Med 345 (13): 971-80 참조)
HNF4 (Hepatocyte nuclear factor 4)는 간세포와 췌장세포에서 발현되는 많은 유전자를 조절하는 것으로 알려진 조직 특이적인 전사 인자 (trnascription factor)이다. 비록 HNF4가 신장의 일부분에서 매우 많이 발현되지만 신장에서의 역할이나 신장세포에서 발현되는 HNF4의 조절을 받는 유전자에 대해서는 많이 알려진 바가 없다. 신장암 (RCC)에서는 HNF4의 존재량과 활성이 자주 감소되고 이는 신장세포에서 HNF4가 발암 억제 기능을 하는 것을 의미한다. 흥미롭게도 HNF4의 조절을 받는 많은 유전자들은 신장암 마이크로어레이(microarray) 연구에서 규제해지(deregulation)되는 것으로 알려졌다. 이러한 유전자들 (ACY1, WT1, SELENBP1, COBL, EFHD1, AGXT2L1, ALDH5A1, THEM2, ABCB1, FLJ14146, CSPG2, TRIM9 및 HEY1)은 신장암에서 HNF4의 감소에 따라 활성이 변화되는 유전자 후보들이다.
HNF4알파(1M7W.pdb; Dhe-Paganon (2002) JBC, 277, 37973)의 리간드 결합 도메인의 구조에서 작은 지질이 관찰되었고 대장균(E. coli) 생산으로부터 함께 정제되었다. 결정체(crystal)는 단백질의 2가지 형태를 포함하고 있는데, 가늘고 긴 나선형10 (helix 10)과 짧은 나선형12 (helix 12)가 형태를 변화시킨다. 지질이 결합하는 부위를 살펴보면 흥미롭게도 2개의 출구지역(exits region)이 있는 것을 관찰할 수 있다. 하나의 출구지역은 작은 지질의 머리 그룹을 붙잡고 있으며 여러 개의 포켓지역(pocket region)들이 함께 위치하고 있음을 알 수 있다. Q10이 전사인자에 명확하게(specifically) 결합한다고 가정할 수 있다. 본 모델에서 Q10이 지질결합터널 (lipid binding tunnel)에 들어가면 Q10의 링부위가 표면의 포켓에 정확히 맞아 들어간다. (도면 28). 기존에 알려진 기능상실변이(loss-of-function) (E276Q)는 이러한 표면의 포켓의 안쪽 아미노산을 결정할 가능성이 있고 따라서 추측되는 Q10결합에 부정적인 영향을 미친다.
더불어, Q10결합 모델에서 소수성(hydrophobic) 꼬리부분은 내부 구멍에서 뻗어나와 가늘고 긴 나선형10과 상호작용한다. 따라서, 이러한 상호작용이 나선형10과 나선형12간의 형태변화를 일으킬 가능성도 있다. 이러한 현상은 전사인자의 활성의 활성/비활성 평형상태를 바꿀 수도 있다.
실시예 7: 항체 마이크로어레이 분석
Q10이 존재함에 따른 단백질 농도의 분석은 항체 마이크로어레이 (microarray) 방법을 사용하여 평가하였다. 마이크로어레이는 다양한 단백질 종류와 가능한 작용기전 표지물(marker)로 구성된 700개 이상의 단백질에 대한 항체를 포함한다.
첫 번째 시험은 Q10을 처리한 세포에서 단백질 농도의 변화를 측정하기 위해 항체 마이크로어레이 (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma)와 Q10을 처리한지 6시간 혹은 24시간된 SK-MEL-28 세포를 이용하여 수행하였다. 세포를 거둬들인 후 수용성 단백질 상청액(supernatant)을 추출하여 얻었다. 각 샘플(1 mg/mL)로부터 얻은 단백질(약 총 1mg)은 두 개로 나뉘어 각각 Cy3과 Cy5 형광염료(fluorescent dye)로 표시하였다. 과도한 염료는 단백질과 마이크로어레이 시험진행(incubation)에 사용된 물질로부터 제거시켰다. 두 개의 시간포인트에서 샘플을 비교하기 위해 서로 다른 표지가 된 샘플로부터 동일한 양의 단백질을 섞었다. (예: Cy3으로 표지된 3시간째 샘플을 Cy5로 표지된 24시간째 샘플과 섞었다.). 마이크로어레이 칩과 시험진행(incubation)한 후에 (제조사 추천 프로토콜에 따라), 칩을 씻고 말렸다. 형광 레이져 스캐너(scanner)를 사용하여 마이크로어레이를 스캔하여 Cy3과 Cy5 표지의 상대적인 형광 강도를 측정하였다.
Figure 112011097936842-pct00033
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사전에 관찰된 세포사멸 단백질을 확인함과 동시에 더 많은 수의 세포사멸을 촉진하는 단백질과 세포사멸을 억제하는 단백질을 알아보기 위하여 잠재적으로 관련될 수 있는 넓은 범위의 단백질군을 검진할 수 있는 2가지 분석방법을 선택하였다.
첫 번째로, 항체 마이크로어레이 (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma)를 이용하여 50μM Q10을 24시간 동안 처리한 SK-MEL-28 세포에서 단백질 농도 수준이 변화하는 것을 평가하기 위해 700개가 넘는 단백질 항체를 검진하였다.
Q10을 24시간 처리한 SK-MEL-28 세포에 대한 항체어레이 시험으로부터 발현수준이 변경된 단백질을 다음과 같이 찾아내었다: Bcl-xl, Bmf, BTK, BLK, cJun (pSer63), Connexin 32, PμMA bbc3, BID, Par4, cCbl. 금번 초기 시험을 통해 예상된 세포사멸을 촉진하는 단백질이 변경된다는 중요한 사실을 알 수 있었다.
SK-MEL-28 세포에 대한 항체 마이크로어레이
항체 마이크로어레이 (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma)를 이용하여 50μM Q10을 24시간 동안 처리한 SK-MEL-28 세포에서 단백질 농도 수준이 변화하는 것을 평가하기 위해 700개가 넘는 단백질 항체를 검진하였다.
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Q10을 24시간 처리한 SK-MEL-28 세포에 대한 항체어레이 시험으로부터 발현수준이 변경된 단백질을 다음과 같이 찾아내었다: Bcl-xl, Bmf, BTK, BLK, cJun (pSer63), Connexin 32, PμMA bbc3, BID, Par4, cCbl. 외부에서 Q10을 추가하여 증가된 수준에서 세포사멸을 촉진하는 단백질의 수준이 변경된 것을 확인하였다.
Bcl-xl ("Basal cell lymphoma-extra large")는 미토콘드리아의 막을 통과하는 분자이다. FAS-L의 신호전달 기전에 관련되어 있으며 Bcl-2단백질군 중 세포사멸을 억제하는 여러 단백질 중 하나이다. 이것은 암세포의 생존에 관련된 것으로 알려져 있다. 하지만 인간 Bcl-x mRNA의 선택적 이어맞추기(alternative splicing) 과정에 의해 최소 2개의 서로 다른 Bcl-x mRNA 종류 (Bcl-xL과 Bcl-xS)로 나타나는 것으로 알려져 있다. 주된 단백질 (233개 아미노산)은 성장인자가 없어짐에 따라 세포가 사멸하는 것을 억제하는 더 큰 Bcl-x mRNA에서 생성된 Bcl-xL 단백질이다(Boise et al., 1993 . Cell 74, 597-608). 반면에 Bcl-xS는 세포사멸을 억제하는 Bcl-2의 역할을 억제하고 세포가 더욱 세포사멸을 허용할 수 있도록 만들어 준다.
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실시예 8: 웨스턴 블롯 ( Western Blot ) 분석
첫 번째 실험은 피부 암세포주 SKMEL-28을 이용하여 웨스턴 블롯과 2-D 겔 전기영동을 수행하였다. 50μM 혹은 100μM Q10을 각 3, 6, 12 및 24시간째 SK-MEL-28 세포에 처리하였다.
Bcl-xL에 대한 항체(도면 14), Vementin에 대한 항체(도면 15), 미토콘드리아 산화성 인산화반응 기능에 대한 다양한 항체들 (도면 16-21) 및 미토콘드리아 막의 온전함(integrity)에 대한 다양한 항체들 (도면 22-27)을 사용하여 다양한 세포 종류에 대해 평가하였다. 본 실험 결과 Q10처리에 따라 여러 단백질들의 수준이 증가되거나 감소되었다.
실시예 9: 100μM Q10 을 처리한 췌장암 세포( PaCa2 )에서 mRNA 수준이 조절되는 당뇨병 관련 유전자 발견
100μM Q10을 처리한 후 다양한 시간대별로 준비한 샘플을 당뇨병 어레이를 사용하여 실험을 수행하였다. 실험은 기본적으로 위에서 언급된 방법으로 수행되었다. Q10처리에 따라 조절되는 다양한 유전자를 아래 표 23에 정리하였다. 그 결과 ABCC8, ACLY, ADRB3, CCL5, CEACAM1, CEBRA, FOXG1, FOXP3, G6PD, GLP1R, GPD1, HNF4A, ICAM1, IGFBP5, INPPL1, IRS2, MAPK14, ME1, NFKB1, PARP1, PIK3C2B, PIK3CD, PPARGC1B, PRKAG2, PTPN1, PYGL, SLC2A4, SNAP25, HNF1B, TNRFSF1A, TRIB3, VAPA, VEGFA, IL4R 및 IL6 과 같은 유전자들이 Q10처리에 따라 조절되었다.
Figure 112011097936842-pct00038
실시예 10: 100μM Q10 을 처리한 췌장암 세포( PaCa2 )에서 mRNA 수준이 조절되는 신생혈관신생 관련 유전자 발견
100μM Q10을 처리한 후 다양한 시간대별로 준비한 샘플을 신생혈관신생 어레이를 사용하여 실험을 수행하였다. 실험은 기본적으로 위에서 언급된 방법으로 수행되었다. Q10처리에 따라 조절되는 다양한 유전자를 아래 표 24에 정리하였다. 그 결과 AKT1, ANGPTL4, ANGPEP, CCL2, CDH4, CXCL1, EDG1, EFNA3, EFNB2, EGF, FGF1, ID3, IL1B, IL8, KDR, NRP1, PECAM1, PROK2, SERPINF1, SPHK1, STAB1, TGFB1, VEGFA 및 VEGFB 과 같은 유전자들이 Q10처리에 따라 조절되었다.
Figure 112011097936842-pct00039
실시예 11: 100μM Q10 을 처리한 췌장암 세포( PaCa2 )에서 mRNA 수준이 조절되는 세포사멸 관련 유전자 발견
100μM Q10을 처리한 후 다양한 시간대별로 준비한 샘플을 세포사멸 어레이를 사용하여 실험을 수행하였다. 실험은 기본적으로 위에서 언급된 방법으로 수행되었다. Q10처리에 따라 조절되는 다양한 유전자를 아래 표 25에 정리하였다. 그 결과 ABL1, AKT1, Bcl2L1, BclAF1, CASP1, CASP2, CASP6, CIDEA, FADD, LTA, TNF, TNFSF10A 및 TNFSF10과 같은 유전자들이 Q10처리에 따라 조절되었다.
Figure 112011097936842-pct00040
실시예 12: 간세포( HEPG2 )에 대한 PCR 당뇨병 어레이
HepG2(간암세포)세포에 비히클(vehicle)를 24시간 처리하거나 혹은 100μM Q10을 각기 다른 시간동안 처리하였다. 각 웰(well)당 처음에는 1x105의 세포를 처리하였고 이후에 PaCa2세포에 사용하였던 절차를 따랐다. (상기 실시예 9-11). 하지만 예상보다 이 샘플에서 추출한 RNA의 총 양은 적었다. 전체 RNA의 1μg을 사용하여 역전사 시험(reverse trnascription)을 수행하였다 (260nm에서 측정하여 정량함). 역전사시험에 사용한 최대 용량은 8ul이다. RNA 농도가 낮기 때문에 매개체를 이용하거나 Q10을 처리하고 16시간과 48시간이 지난 샘플을 이용한 RT-PCR 어레이는 0.44μg의 RNA를 이용하여 수행하였다. 아래 표 26에 정리된 것과 같이, Q10 100μM을 처리하였을 때 HepG2세포 유전자의 조절에 대한 트렌드와 패턴에 대한 초기 분석결과를 어레이를 통해 얻었다. 결과에 따르면, PPARGC1A, PRKAA1 및 SNAP25 유전자가 처리후 16시간째 발현이 감소되었다 (대조군 대비, 각각 약 20배, 6배 및 5배 감소). 처리후 48시간째에는 PPARGC1A와 PRKAA1 유전자는 발현이 정상으로 돌아오거나 혹은 약간 증가되었으나 SNAP25 유전자는 약 2배 정도 발현이 감소되었다.
Figure 112011097936842-pct00041
실시예 13: 간세포에 대한 PCR 신생혈관형성 어레이
HepG2(간암세포)세포에 비히클(vehicle)를 24시간 처리하거나 혹은 100μM Q10을 각기 다른 시간동안 처리하였다. 각 웰(well)당 처음에는 1x105의 세포를 처리하였고 이후에 PaCa2세포에 사용하였던 절차를 따랐다. (상기 실시예 9-11). 하지만 예상보다 이 샘플에서 추출한 RNA의 총 양은 적었다. 전체 RNA의 1μg을 사용하여 역전사 시험(reverse trnascription)을 수행하였다 (260nm에서 측정하여 정량함). 역전사시험에 사용한 최대 용량은 8μl이다. RNA 농도가 낮기 때문에 매개체를 이용하거나 Q10을 처리하고 16시간과 48시간이 지난 샘플을 이용한 RT-PCR 어레이는 0.44μg의 RNA를 이용하여 수행하였다. 아래 표 27에 정리된 것과 같이, Q10 100μM을 처리하였을 때 HepG2세포 유전자의 조절에 대한 트렌드와 패턴에 대한 초기 분석결과를 어레이를 통해 얻었다. Q10처리에 따른 다양한 유전자가 조절되는 결과를 표 27에 정리하였다. 결과에 따르면, ANGPTL3, ANGPTL4, CXCL1, CXCL3, CXCL5, ENG, MMP2 및 TIMP3 유전자가 처리후 16시간째 발현이 증가되었다 (대조군 대비, 각각 약 5.5배, 3배, 3배, 3.2배, 3배, 3배, 1배 및 6.5배, 6배 및 5배 증가). ID3유전자는 Q10 처리후 16시간째 대조군 대비 약 5배 정도 발현이 감소되었다. 처리후 48시간째에는 ANGPTL3, CXCL1, CXCL3, ENG 및 TIMP3 유전자는 여전히 발현이 증가된 반면 (대조군 대비, 각각 약 3.5배, 1.5배, 3.175배, 2배 및 3배), ANGPTL4, CXCL5, ID3 및 MMP2 유전자는 대조군 대비 각각 약 1배, 1배, 2배 및 18배 발현이 감소되었다.
Figure 112011097936842-pct00042
RT-PCR어레이는 신생혈관형성 과정에 관련된 것으로 알려진 단백질로 구성되어 있다. 신생혈관형성은 암세포가 악성으로 변화하는 과정에서 매우 중요한 것이다. 이 중 몇몇 단백질은 당뇨병에도 관련되어 있다.
ANGPTL3 및 ANGPTL4: 관련 논문에 따르면, ANGPTL3단백질은 지질대사 조절에 관련되어 있다고 알려져 있다. 특히 한 논문(Li, C. Curr Opin Lipidol. 2006 Apr;17(2):152-6)은 신생혈관형성 촉진 성장인자(angiopoietins)와 유사 신생혈관형성 촉진 성장인자(angiopoietins-like)가 유사한 도메인 구조를 가지고 있다고 밝히고 있다. ANGPTL3과 4는 지방단백질(lipoprotein)을 활성을 억제하는 상과(上科, superfamily)에 속하는 유일한 두 개의 단백질이다. 하지만, ANGPTL3과 4는 각기 다른 수준에서 조절되며 생체 내에서 각기 다른 역할(non-redundant function)을 하는 것으로 알려져 있다. ANGPTL3과 4는 단백분해되어 2개로 분해되고 핵 수용체에 의해 각기 다르게 조절된다. ANGPTL4을 과발현시킨 트랜스제닉(trnasgenic) 모델과 ANGPTL3과 4를 녹아웃(knock-out) 시킨 모델에서 이 두 개의 단백질이 지방단백질 대사에 필수적인 역할을 하는 것을 밝혔다. 간세포 유래 ANGPTL3은 음식물을 먹은 상태에서의 지방단백질 지방가수분해효소(리파아제, lipase)의 활성을 주로 억제하는 반면에, ANGPTL4는 음식물을 먹은 상태와 먹지않은 상태 모두에서 중요한 역할을 한다. 추가적으로, ANGPTL4는 지방단백질 유래 지방산의 조직특이적인 이동을 조절한다. 따라서 ANGPTL4는 발현되는 장소에 따라 지방단백질 지방가수분해효소를 내분비적(endocrine)이나 자가분비적(autocrine)/근거리분비적(paracrine)으로 억제한다.
지방단백질 지방가수분해효소는 킬로미크론(chylomicrons)과 저밀도지단백(low-density lipoprotein, VLDL)에서 발견되는데, 지방단백질의 지질을 3개의 유리지방산(free fatty acide)과 1개의 글리세롤(glycerol) 분자로 가수분해하는 효소이다. 해당 조직에서 지방단백질 지방가수분해효소의 활성은 트리글리세리드(triglyceride)유래 지방산을 흡수하는데 반응속도를 제어하는 요소이다. 지방산의 분배의 불균형은 중요한 물질대사의 결과를 초래한다. 고지방 음식섭취는 조직특이적인 인슐린저항성과 이에 따른 제2형 당뇨병 발달에 연루된 조직특이적인 LPL의 과발현을 일으킨다.
본 실시예의 결과들은 Q10이 지질 대사에 관련된 단백질을 조절하며 ANGPTL3/ANGPTL4 유전자와 이와 관련된 기전에 대해 추가적인 연구가 필요함을 의미한다. 예를 들어, ANGPTL3/ANGPTL4는 Akt, 콜레스테롤, 지방산, HDL-콜레스테롤, HNF1A, ITGA5, ITGA5, ITGAV, ITG83, L-트릴아이오도티노닌(trilodothynonine), LIPG, LPL, Mapk, Nrth, NR1H3, PPARD, PTK2, RXRA, 트리아실글리세롤 및 9-시스-레티노산 같은 경로에 관련되어 있다고 알려져 있다.
실시예 14: 간세포( HEPG2 )에 대한 PCR 세포사멸 어레이
상기 기술된 것처럼 100μM Q10을 처리하고 16시간과 48시간이 지난 샘플을 이용하여 세포사멸 어레이를 수행하였다. 하지만 48시간을 위한 어레이는 형광단(fluorophore)을 SYBR대신 FAM을 사용하였다. FAM과 SYBR은 동일한 파장에서 형광 빛을 낸다.
Q10처리에 따른 다양한 유전자가 조절되는 결과를 표 28에 정리하였다. Q10처리 후 16시간째 CASP9유전자는 대조군 대비 약 61배 정도 발현이 증가되었으며, BAG1과 TNFRSF1A는 처리 후 16시간째 대조군 대비 각각 약 6배와 4배 정도 발현이 감소되었다. 처리 후 48시간째에는 CASP9, BAG1 및 TNFRSF1A는 대조군 대비 각각 약 55배, 1배 및 1배씩 발현이 증가되었다.
Figure 112011097936842-pct00043
실시예 15: MIM 혹은 외- 변환인자의 종양학적 질병을 치료할 수 있는 능력 평가
선택된 MIM 혹은 외-변환인자, 즉 CoQ10이 흑색종(melanoma)과 같은 종양학적 질병을 치료할 수 있는 능력이 있는지 쥣과(murine) 모델을 사용하여 평가하였다. SK-MEK28을 피하층에 주사하여 흑색종 종양을 유도하였다. 동물실험은 각각 대조군과 시험군에 4마리의 생쥐들(mice)을 사용하여 진행하였다. 생쥐들은 2개의 종양을 가질 수 있도록 접종하였다. MIM 혹은 외-변환인자의 국부적 제형을 30일간 매일 시험군에 처리하였으며 그 이후에 종양을 절제하여 무게를 측정하였다. 대조군에 비교하여 시험군의 총체적 평균 무게에서 유의한 차이가 보임에 따라 MIM 혹은 외-변환인자가 종양을 치료하는데 효과적이라고 밝혀졌다.
실시예 16: 종양학적 질병과 관련된 MIM 의 식별
가능한 MIM으로서 후보물질 (예를 들어 환경적 영향인자)을 평가하기 위하여 질병 세포주 (암세포)와 정상 세포주를 포함하는 세포주 패널(panel)에 선택된 후보 MIM을 외적으로 첨가하였고, 각 패널의 각 세포주에 대한 세포성 미세환경적 프로파일을 유도하는 변화를 평가하였다. 세포의 형태학적, 생리학적 및 mRNA와 단백질 수준과 같은 세포 구성물에 대한 변화를 측정하였고 정상 세포주와 질병 세포주를 비교하였다.
후보 MIM에 대한 세포의 민감도(sensitivity)와 세포사멸적 반응을 측정함으로써 세포의 형태학적 및 생리학적 변화를 평가하였다. 본 시험은 예 3에서 기술된 방법으로 수행되었다. 간략히 설명하면, 최소 1개의 대조군 세포주와 최소 1개의 암세포 세포주로 구성된 세포주 패널에 후보 MIM을 다양한 농도로 처리하였다. 가능한 MIM에 대한 세포주의 민감도는 여러 농도 범위에 걸쳐 여러 시간대별로 세포의 생존을 관찰하여 측정하였다. 가능한 MIM에 대한 세포주의 세포사멸 반응은 예를 들어 Nexin물질과 유세포분석기 (flow cytometry) 방법을 결합한 방법을 사용하여 측정하였다. Nexin물질은 2개의 염색제와 7AAD 및 Annexin-V-PE로 구성되어 있으며 세포사멸의 초기와 말기에서 세포의 수를 정량할 수 있다. 또 다른 세포사멸 측정방법은 APOSTRNADTM ELISA 방법을 통해 단일가닥(single-strnaded) DNA를 측정하는 방법도 있다. 질병 세포주와 대조군 세포주의 민감도와 세포사멸성 반응도를 측정하고 비교하였다. 정상 세포에 비교해 질병 세포에서 차별된 세포독성이나 세포사멸적 반응을 유도하는 물질은 MIM으로 식별하였다.
후보 MIM을 처리한 후에 세포의 구성물질에 변화를 측정하였다. 실시간 PCR 어레이 방법을 통해 mRNA 수준의 유전자 발현 변화를 분석하였다. 이 실험은 상기 예 6과 예 9-13에서 설명된 방법으로 수행되었다. 간략히 설명하면, 후보 MIM을 정상 대조군 세포주와 질병 세포주의 한 개 이상의 세포에 외적으로 추가하였고 처리 후 다양한 시간 대에서 mRNA를 세포로부터 추출하였다. 특정 기전에 관련된 유전자의 mRNA 발현 수준은 세포사멸, 산화적 스트레스, 항산화 방어, 신생혈관신생, 열충격(heat shock) 혹은 당뇨병에 대한 어레이등을 포함하는 표적기전 (targeted pathway) 어레이를 이용하여 평가되었다. mRNA 전사수준이 2배 이상 변화된 유전자를 선별하여 분석하였다. 세포내 mRNA 수준의 변화를 유도하거나 정상 세포에 비해 질병 세포에서 한 개 이상의 mRNA 수준의 차별적 변화를 유도하는 물질을 MIM으로 식별하였다.
보완적 실험에서, 항체 마이크로어레이 방법과 2-D 겔 전기영동법을 사용하여 단백질 수준의 유전자 발현 변화를 분석하였고 질량분석법을 이용한 단백질 식별과 웨스턴 블롯을 통해 분석하였다. 이러한 실험들은 예 7, 4 및 8에서 각기 설명된 방법처럼 수행되었다. 간략히 설명하면, 후보 MIM을 정상 대조군 세포주와 질병 세포주의 한 개 이상의 세포에 외적으로 추가하였고 처리 후 6시간째 혹은 24시간째와 같이 다양한 시간 대에서 용해성 단백질을 세포로부터 추출하였다. 다양한 범위의 단백질 종류와 가능한 기전 마커와 같은 700여개 이상의 단백질에 대한 항체를 포함하고 있는 항체어레이를 사용하여 후보 MIM에 의한 단백질의 수준변화를 평가하였다. 더 나아가 상호보완적인 단백질체학(proteomic) 분석을 2-D 겔 전기영동과 질량분석법을 이용하여 수행하였다. 후보 MIM을 정상 대조군 세포주와 질병 세포주의 한 개 이상의 세포에 외적으로 추가하였고 세포 덩어리를 용해하여 2-D 겔 전기영동에 사용하였다. 처리되지 않은 샘플인 대조군에 비해 처리받은 샘플에서 단백질 수준변화를 식별하기 위해 겔을 분석하였다. 증가 혹은 감소된 수준 혹은 단백질번역 후 번역(post-trnaslational modification)에 따른 처리시간에 따른 점의 변화를 식별하기 위해 겔을 분석하였다. 통계적으로 유의한 변화를 보이는 점을 절제하여 트립신을 사용해 분해하고 질량분석법을 통해 단백질을 식별하였다. 식별된 펩타이드를 단백질을 찾는 Mascot와 MSRAT 소프트웨어 분석과 같은 단백질 데이터베이스를 통해 검색하였다. 앞선 2-D 겔 전기영동과 항체 마이크로어레이 실험에 추가해서 후보 MIM에 의해 유도된 특정 단백질의 변화를 웨스턴 블롯을 통해 평가하였다. 이러한 모든 단백질체학 실험에서 다양한 세포주에서 발현이 증가되거나 감소되는 단백질을 식별하고 평가하였다. 세포내 단백질 수준의 변화를 유도하거나 정상 세포에 비해 질병 세포에서 한 개 이상의 단백질 수준의 차별적 변화를 유도하는 물질을 MIM으로 식별하였다.
앞선 실험에서 후보 MIM 처리에 의해 조절되는 유전자를 세포적 그리고 생화학적 기전을 통해 분석하였고 이들은 세포사멸, 암, 세포성장, 해당과정 및 대사, 분자적 이동 그리고 세포신호 등과 같은 다양한 세포적 기전으로 분류되었다.
후보 MIM이 세포내로 들어가는 것을 확인하고 세포내에서 국소적으로 위치하는지를 밝히고 세포내에 존재하는 수준과 형태를 밝히기 위해 실험을 수행하였다. 본 실험은 예 5에서 기술된 방법으로 진행하였다. 예를 들어, 미토콘드리아 내에 존재하는 후보 MIM의 수준과 형태를 밝히기 위해 후보 MIM을 처리한 세포로부터 분리한 미토콘드리아 농축 샘플(preparations)을 분석하였다. 외적으로 후보 MIM을 추가함에 따라 미토콘드리아 내 후보 MIM의 수준이 시간의존적이고 농도의존적으로 증가하는 것을 확인했다. 추가적으로 총 세포 단백질 샘플에 대해 기술된 것과 같이 2-D 겔 전기영동을 이용해 미토콘드리아 농축 샘플에서의 단백질 수준 변화를 분석하였고 질량분석법을 이용해 단백질 식별을 분석하였다. 세포내에 들어가 존재하고 미토콘드리아에 증가된 수준으로 존재하는 후보 MIM을 MIM으로 식별하였다. 평가하는 시간 동안에 미토콘드리아와 같이 세포내에서의 후보 MIM의 수준은 특정 단백질에 대한 mRNA와 단백질 수준의 조절과 같이 관찰된 세포적 변화와 밀접한 연관성이 있다.
mRNA 혹은 단백질 수준에서 유전자 발현과 같이 세포의 구성물의 변화를 유도하는 것으로 관찰된 후보 MIM을 MIM으로 식별하였다. 정상적인 상태 (비암적인)와 비교하여 질병상태 (암적인)에서 세포 형태, 생리 및 구성물 (mRNA 혹은 단백질 수준에서 유전자 발현의 차별된 변화)에서의 차별적 변화를 유도하는 것으로 관찰된 후보 MIM을 특히 다양한 특징을 가지고 있는 MIM으로 식별하였다. 후보 MIM이 치료적 효과뿐만 아니라 매개체 효과를 보여주기 때문에 세포 안으로 들어갈 수 있는 후보 MIM을 특히 다양한 특징을 가지고 있는 MIM으로 식별하였다.
실시예 17: 종양학적 질병에 관련된 외- 변환인자로서의 CoQ10 의 발견
대조군 세포주 (각질세포(keratinocyte)와 멜라닌세포(melanocyte)의 초대배양(primary culture))와 여러 피부암 세포주 (SK-MEL-28, 비전이성 피부 흑색종, SK-MEL-2, 전이성 피부 흑색종, SCC, 편평상피암(squamous cell carcinoma), PaCa2, 췌장암 세포주, HEP-G2, 간암 세포주)로 구성된 피부 세포주의 패널에 코엔자임 Q10을 처리하였다. 암세포주는 대조군 세포주와 비교하여 변화된 농도 의존적인 반응을 보였고 암세포에서만 세포사멸이 발생하였다. 예시적인 실험의 자세한 내용은 실시예 3에서 제시되었다.
어레이는 CoQ10을 상기 명시된 세포에 처리한 후에 mRNA와 단백질 수준이 변화하는 것을 측정하기 위해 사용되었다. mRNA 발현의 변화는 각 세포사멸, 산화적 스트레스와 산화방지제, 혈관신생 및 당뇨병에 특정화된 실시간 PCR 마이크로어레이 분석을 이용하여 분석하였다. 단백질 발현의 변화는 항체 마이크로어레이 분석과 웨스턴 블럿 (Western Blot) 분석을 이용하여 분석하였다. 이러한 분석 결과를 통해 코엔자임Q10에 의해 세포주에서 mRNA 수준과 단백질 수준에서 유전자 발현에 유의한 변화가 발생하는 것을 보여주었다. 세포 대사과정에 관련된 것으로 알려진 많은 유전자가 CoQ10처리 결과 발현이 조절되는 것을 관찰하였다. 예를 들어, 핵수용체 단백질 HNF4A의 발현은 Q10처리 이후에 증가되었다. 트랜스알도라제1(TAL)의 발현도 역시 Q10처리 이후에 조절되었다. TAL은 NADPH와 반응적인 산소 중간체의 균형을 맞춤으로써 ATP합성과 세포의 생존에 매우 중요한 체크 포인트인 미토콘드리아 막안팎(trnas-membrnaed)의 전기적 포텐셜을 조절한다. 종양학적 질병과 특별히 관련된 것으로서 세포사멸, 암 그리고 세포 성장 등에 관련된 것으로 알려진 많은 유전자들이 Q10에 의해 조절되고 있음이 밝혀졌다. 예시적인 실험의 자세한 내용은 실시예 4, 6, 7, 8 및 9에서 제시되었다.
Q10은 에너지 생산을 위한 미토콘드리아 안에서의 산화성인산화반응 (oxidative phosphorylation) 프로세스에 필수적인 보조인자이다. 미토콘드리아 내부에 존재하는 코엔자임Q10의 형태와 수준은 CoQ10을 처리한 세포로부터 분리한 미토콘드리아 농축 샘플(preparations)을 분석하여 밝혔다. 외부에서 Q10을 추가함에 따라 미토콘드리아 내 코엔자임Q10의 수준이 시간의존적이고 농도의존적으로 증가하는 것을 확인했다. 대사적 그리고 세포사멸적 기전과 관련된 특정 단백질에 대한 mRNA 및 단백질 수준의 조절에서 관찰된 바와 같은 매우 다양한 세포적 변화들은 시간 진행과 밀접한 연관성이 있었다. 예시적인 실험의 자세한 내용은 예 5에서 제시되었다.
여기에 기술된 결과를 통해 내재적인 CoQ10을 외-변환인자로 식별하였다. 특히 CoQ10이 세포내 대사적 상태를 이동시키고 부분적으로 미토콘드리아 기능을 복원시켰다. 여기에 기술된 데이터의 해석과 현재 알려진 내용을 바탕으로 위와 같이 결론내릴 수 있다.
Q10은 합성되어 미토콘드리아 내막 안으로 이동되고, 축적되며 사용되는 것으로 알려져 있다. Q10은 또한 미토콘드리아 내에서 에너지 생산을 하는 산화적 인산화반응에 필수적인 보조인자로 알려져 있다. 하지만, 정상세포의 미토콘드리아에서 피루브산(pyruvate)을 산화시킴으로써 에너지를 생산하는 것과는 달리 대부분의 암세포에서는 세포기질(cytosol) 내 젖산(lactic acid)의 발효에 따른 해당과정을 통해 대부분 에너지를 생산한다. 산화적 인산화반응은 전자전달체와 시토크롬C (cytochrome C)과 관련된다. 세포사멸은 세포사멸을 촉진하는 인자에 의한 미토콘드리아 막이 투과될 수 있도록 바뀌면서 미토콘드리아가 파열되는 것과 관련된다. 상이한 대사적 에너지 합성 기전을 이용함으로써 암세포는 세포의 이상에 대한 정상적인 세포사멸 반응을 완화시킬 수 있다. 이론에 얽매이지 않기 위하여, 본 출원인은 Q10이 산화적 인산화반응 기전 단백질의 발현을 증가시킴으로써 암을 유발하는 결함을 인지하고 세포사멸을 유발하는 상태로 미토콘드리아의 기능을 바꿔주는 기능을 한다고 제안한다. 따라서, Q10은 세포의 대사적 상태를 바꿈으로써 외-변환인자로서의 역할을 한다
실시예 18: 종양학적 질병에 관련된 외- 변환인자의 발견
대조군 세포주 (각질세포(keratinocyte)와 멜라닌세포(melanocyte)의 초대배양(primary culture))와 암세포주 (SK-MEL-28, 비전이성 피부 흑색종, SK-MEL-2, 전이성 피부 흑색종, SCC, 편평상피암(squamous cell carcinoma), PaCa2, 췌장암 세포주, HEP-G2, 간암 세포주)로 구성된 피부 세포주의 패널에 후보 외-변환인자를 처리하였다. 후보 외-변환인자에 대한 세포의 민감도(sensitivity)와 세포사멸적 반응을 측정함으로써 세포의 형태학적 및 생리학적 변화를 평가하였다. 본 시험은 예 3에서 기술된 방법으로 수행되었다. 간략히 설명하면, 가능한 MIM에 대한 세포주의 민감도는 여러 농도 범위에 걸쳐 여러 시간대별로 세포의 생존을 관찰하여 측정하였다. 가능한 외-변환인자에 대한 세포주의 세포사멸 반응은 예를 들어 Nexin물질과 유세포분석기 (flow cytometry) 방법을 결합한 방법을 사용하여 측정하였다. Nexin물질은 2개의 염색제와 7AAD 및 Annexin-V-PE로 구성되어 있으며 세포사멸의 초기와 말기에서 세포의 수를 정량할 수 있다. 또 다른 세포사멸 측정방법은 APOSTRNADTM ELISA 방법을 통해 단일가닥(single-strnaded) DNA를 측정하는 방법도 있다. 질병 세포주와 대조군 세포주의 민감도와 세포사멸성 반응도를 측정하고 비교하였다. 정상적인 혹은 대조군 세포와 비교해 암세포에서 후보 외-변환인자가 우선적으로 혹은 선택적으로 세포의 성장을 억제하는 능력을 가졌는지 평가하였다. 추가적으로 정상적인 혹은 대조군 세포와 비교해 암세포에서 후보 외-변환인자가 우선적으로 혹은 선택적으로 세포사멸을 유도하는 능력을 가졌는지 평가하였다.
후보 외-변환인자를 처리한 후에 상기 식별된 세포의 mRNA와 단백질 수준에 변화가 있는지 알아보기 위해 분석하였다. 실시간 PCR 마이크로어레이 방법을 통해 mRNA 수준의 유전자 발현 변화를 분석하였다. 이 실험은 상기 예 6과 예 9-13에서 설명된 방법으로 수행되었다. 간략히 설명하면, 처리 후 다양한 시간 대에서 mRNA를 세포로부터 추출하였다. 특정 기전에 관련된 유전자의 mRNA 발현 수준은 세포사멸, 산화적 스트레스, 항산화 방어, 신생혈관신생, 열충격(heat shock) 혹은 당뇨병에 대한 어레이등을 포함하는 표적기전 (targeted pathway) 어레이를 이용하여 평가되었다. mRNA 전사수준이 2배 이상 변화된 유전자를 선별하여 분석하였다.
항체 마이크로어레이 방법과 질량분석법과 연결된 2-D 겔 전기영동법 및 웨스턴 블롯을 통해 단백질 발현의 변화를 분석하였다. 이러한 실험들은 실시예 7, 4 및 8에서 각기 설명된 방법처럼 수행되었다. 간략히 설명하면, 후보 외-변환인자 처리 후 6시간째 혹은 24시간째와 같이 다양한 시간 대에서 용해성 단백질을 세포로부터 추출하였다. 다양한 범위의 단백질 종류와 가능한 기전 마커와 같은 700여개 이상의 단백질에 대한 항체를 포함하고 있는 항체 어레이를 사용하여 후보 외-변환인자에 의한 단백질의 수준변화를 평가하였다. 더 나아가 상호보완적인 단백질체학(proteomic) 분석을 2-D 겔 전기영동과 질량분석법을 이용하여 수행하였다. 후보 외-변환인자를 세포주에 외적으로 추가하였고 세포 덩어리를 용해하여 2-D 겔 전기영동에 사용하였다. 처리되지 않은 샘플인 대조군에 비해 처리받은 샘플에서 단백질 수준변화를 식별하기 위해 겔을 분석하였다. 증가 혹은 감소된 수준 혹은 단백질번역 후 번역(post-trnaslational modification)에 따른 처리시간에 따른 점의 변화를 식별하기 위해 겔을 분석하였다. 통계적으로 유의한 변화를 보이는 점을 절제하여 트립신을 사용해 분해하고 질량분석법을 통해 단백질을 식별하였다. 식별된 펩타이드를 단백질을 찾는 Mascot와 MSRAT 소프트웨어 분석과 같은 단백질 데이터베이스를 통해 검색하였다. 앞선 2-D 겔 전기영동과 항체 마이크로어레이 실험에 추가해서 후보 MIM 에 의해 유도된 특정 단백질의 변화를 웨스턴 블롯을 통해 평가하였다. 이러한 모든 단백질체학 실험에서 다양한 세포주에서 발현이 증가되거나 감소되는 단백질을 식별하고 평가하였다.
후보 외-변환인자를 추가함에 따라 세포주에서 mRNA 및 단백질 수준에서 유전자 발현에 변화에 근거하여 후보 외-변환인자를 평가한다. 특히 후보 외-변환인자가 세포적 대사과정에 관련된 것으로 알려진 유전자를 조절하는 능력이 있는지 평가된다. 종양학적 질병과 특별히 관련된 것으로서 후보 외-변환인자가 세포사멸, 암 그리고 세포 성장등에 관련된 것으로 알려진 유전자를 조절하는 능력이 있는지 평가하였다.
세포내 혹은 특정 세포내 위치에 후보 외-변환인자의 수준과 형태를 알아보기 위해 기술자에게 알려진 방법을 이용하였다. 예를 들어, 여러 시간과 다양한 농도에 있어 미토콘리드아에서 후보 외-변환인자의 수준을 알아보기 위해 후보 외-변환인자를 처리한 세포로부터 미토콘드리아 농축 샘플을 준비하여 분석하였다. 여러 시간대의 후보 외-변환인자의 수준을 대사적 그리고 세포사멸적 기전에 관계된 특정 단백질에 대한 mRNA와 단백질 수준의 조절과 같이 관찰된 다른 세포적 변화와 비교하고 상관성이 있을 수 있다.
선행 실험에서 얻은 결과에 근거하여 세포의 대사성 상태를 변화시키는 것으로 관찰된 후보 외-변환인자를 외-변환인자로 식별하였다. 예를 들어, 세포에서 세포독성이나 세포사멸적 반응을 유도하는 후보 외-변환인자를 외-변환인자로 식별하였다. 또한 정상 세포에 비교해 질병(암) 세포에서 차별된 세포독성을 보이거나 혹은 차별화된 세포사멸적 반응을 유도하는 후보 외-변환인자 (즉 정상세포에 비교해 암세포에서 세포사멸에 관련된 단백질의 발현을 차별적으로 조절하는 외-변환인자)를 외-변환인자로 식별하였다.
실시예 19: 외- 변환인자로서의 비타민 D3 의 발견
비타민 D3 혹은 1α, 25-디히드록시비타민 D3 (혹은 칼리스티올로도 알려짐)는 2단계 효소적 과정에 의해 비타민D로부터 합성되는 비타민D의 대사성이다. 비타민 D3는 어디에나 존재하는 핵 비타민D 수용체 (VDR)과 상호작용하여 칼슘과 인산염의 항상성(homeostasis) 및 세포의 분열과 분화에 관련된 다양한 유전자의 전사를 조절한다. 비타민 D3은 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 전린선암종(prostate adenocarcinoma), 난소암, 유방암 및 폐암 등과 같은 다양한 모델 시스템에서 항암성 효과가 있다고 알려져 있다 (reviewed in Deeb et al. 2007 Nature Reviews Cancer 7:684-700).
비타민 D3의 항암효과는 세포주기의 G1단계에서 성장중단, 세포사멸, 종양세포의 분화, 성장인자를 통한 세포의 생존신호의 파괴 및 신생혈관신생과 세포부착의 억제 등과 같은 다양한 메커니즘에 관련되어 있다고 보고되었다 (reviewed in Deeb et al. 2007 Nature Reviews Cancer 7:684-700). 예를 들어, 세포사멸에 대하여 비타민 D3는 항-세포사멸 단백질 BCL2와 생존촉진 단백질 BCL-XL의 발현을 억제하거나 세포사멸을 촉진하는 단백질 (예를 들면, BAX, BAK 및 BAD)의 발현을 유도하는 것과 같이 세포사멸의 중요 매개체를 조절함으로써 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Deeb et al. 2007). 추가적인 예로는, 신생혈관신생에 대하여 비타민 D3는 어떠한 종양유래 내피세포의 증식을 억제하고 종양의 신생혈관신생을 유도하는 혈관내피세포성장인자 (VEGF)의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다 (reviewed in Masuda and Jones, 2006 Mol. Cancer Ther. 5(4): 797-8070). 또 다른 예로는, 세포주기의 중단에 대하여 비타민 D3는 G1단계에서의 중단을 유도하는데 중요하다고 알려진 사이클린 의존적 키나아제 억제제 (cyclin-dependent kinase inhibitor) p21WAFI/CIPI의 유전자 전사를 유도하고 사이클린 의존적 키나아제 억제제 (cyclin-dependent kinase inhibitor) p21WAFI/CIPI 단백질을 합성이나 안정화를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Deeb et al. 2007).
선행 관찰에 근거하여 세포의 대사성 상태를 바꿀 수 있는 능력을 가진 비타민 D3를 외-변환인자로 식별하였다. 비타민 D3는 세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 능력이 있으며 특히 세포의 성장을 차별적으로 억제할 수 있으며 정상 세포에 비교해 질병(암) 세포에서 세포사멸적 반응을 유도할 수 있는 능력에 비추어 외-변환인자로 식별하였다. (즉 정상세포에 비교해 암세포에서 세포사멸에 관련된 BCL-2, BCL-XL, 그리고 BAX 등과 같은 단백질의 발현을 차별적으로 조절함)
실시예 20: 주요한 단백질의 요약
요약하면, 상기 실시예에 기술되었던 실험의 결과를 기초로 하여, Q10에 의해 조절되는 주요한 단백질을 하기의 표에 요약하였다.
Figure 112011097936842-pct00044
실시예 21: 종양성 세포와 정상세포의 코엔자임 Q10 에 대한 상대적 민감도
다양한 종양성 세포주와 정상 세포주에 대한 코엔자임Q10에 대한 효과를 검사하고 비교하였다. 코엔자임Q10에 대한 세포의 민감도는 세포사멸 유도를 관찰함으로써 평가하였다. 세포에 대한 CoQ10의 처리는 아래 물질과 방법(Material and Method)에 상세히 기술된 것처럼 수행되었다. 세포사멸의 유도는 처리된 세포에서 아래 기술된 것과 같이 초기 세포사멸에 대한 지표 (예를 들면, Bcl-2 발현, 캐스파제(카스파아제) 활성화, 아넥신V(annexin V) 분석을 이용한 방법)를 관찰함으로써 평가하였다. 이러한 연구로부터 세포주 패널에서 세포사멸을 유도하는데 필요한 최소 CoQ10 용량, 즉 CoQ10의 농도와 처리시간을 결정하였다.
예상치 못하고 놀랍게도 코엔자임Q10처리의 효과는 증가된 발암성과 더욱 큰 전이가능성을 보인 세포 타입, 즉 더욱 공격적인 암이나 종양에서 유래한 세포 타입에서 더욱 크게 나타나는 결과가 나왔다. 이러한 결과는 표 30에 정리되었다. CoQ10이 더욱 공격적인 암 상태에 있는 세포에서 시간과 농도 의존적으로 더욱 효과적인 결과를 나타내는 것으로 나타났다. 더구나 종양적 세포와 비교해서 정상 세포에서 놀라운 확산적 효과가 관찰되었다. 구체적으로 코엔자임Q10은 케라틴 세포와 피부 섬유아세포(fibroblast) 등과 같은 정상세포에서 증가된 증식과 이동이 관찰되는 정상 조직 환경에서 약간의 도와주는 역할을 하는 것이 예상치 못하게 발견되었다.
암에서의 유전자 조절과 단백질 메커니즘에 대한 코엔자임Q10의 효과는 정상세포와는 다르다. 막 유동성, 운송 메커니즘, 면역제어, 신생혈관신생, 세포주기 조절, 게놈의 안정성, 산화성 조절, 해당작용의 흐름, 대사적 조절 및 세포외 기질 단백질 등과 같은 중요한 세포의 조직과 구성물이 제대로 기능하지 못하고 있으며 따라서 세포의 유전자 지문(genetic fingerprint)과 분자적 지문(molecular fingerprint)이 변경된다. 질병적 환경이 세포의 조절 프로세스의 관리를 선호한다. CoQ10은 세포사멸 잠재성을 복원시키는 방법으로 앞서 언급한 중요한 프로세스 중 일부를 정상화 시킴으로써 상당한 수준의 효과(암세포와 정상세포의 비교 시, 더욱 더 공격적인 암 상태의 세포와 더욱 덜 공격적이거나 공격적이지 않은 암 상태의 세포의 비교 시)를 발휘하는 것으로 보여진다.
Figure 112011097936842-pct00045
Figure 112011097936842-pct00046

물질과 방법
세포준비 및 처리
디쉬(dish) 혹은 플라스크에 준비된 세포
T-75 플라스크에 10% 소태아혈청 (fetal bovine serμM, FBS), 1% PSA (페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 B)과 함께 관련 배지를 넣어 5% 이산화탄소가 공급되는 37℃인큐베이터에서 70~80%의 컨플루언스(confluence)가 도달할 때까지 세포를 배양한다. 처리를 위해 세포를 수거하기 위하여 1mL 트립신을 플라스크에 처리한 뒤 흡입하여 제거하고 다시 3mL 트립신을 처리한 뒤 37℃에서 3-5분간 배양한다. 동일한 양의 배지를 (3mL 배지) 추가하여 중화시키고 그 다음에 용액을 8분간 10,000rpm으로 원심분리시킨다. 상청액을 흡입하여 제거하고 세포를 8.5mL 배지에 재부유(resuspended)시킨다. 재부유시킨 용액의 500ul와 이소프로파놀 9.5mL를 섞은 혼합체를 콜터 계수기 (coulter counter)를 이용하여 2번 측정하고 각 접시에 담을 적절한 세포 수를 결정하였다. 대조군과 0-200μM 농도범위의 그룹들을 3회씩 검사하였다. 500μM CoQ10 원액으로부터 순차적인 희석을 수행하여 각 접시에 희망하는 실험 농도를 준비하였다. 세포 종류와 실험 프로토몰에 따라 각 접시는 5% 이산화탄소가 공급되는 37℃ 인큐베이터에서 0-72시간동안 배양 되었다.
단백질 분리 및 정량
접시에 준비된 세포
처리된 세포의 배양이 완료된 후에 단백질 분리를 수행하였다. 처리군의 접시들은 얼음처럼 차가운 1X 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline , PBS) 2mL을 사용하여 2번 씻은 후에 한번 더 1mL을 사용하여 씻는다. 처음 두 번의 PBS만 흡입하여 제거한다. 마지막 PBS 양을 이용하여 세포를 부드럽게 긁어모아서 마이크로센트리퓨즈 튜브에 담고 10분간 10,000rpm으로 원심분리시킨다. 원심분리 이후, 상청액을 흡입하여 제거하고 50μL의 용해 버퍼 (100μL의 용해 버터마다 1uL의 프로테아제와 인산염 억제제 포함)를 이용하여 세포 덩어리를 용해시킨다. 샘플은 영하 20℃에서 밤새 얼린다.
처리된 세포의 배양이 완료된 후에 단백질 분리를 수행하였다. 처리군의 접시들은 얼음처럼 차가운 1X 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline , PBS) 5mL을 사용하여 2번 씻은 후에 한번 더 3mL을 사용하여 씻는다. 처음 두 번의 PBS만 흡입하여 제거한다. 마지막 PBS 양을 이용하여 세포를 부드럽게 긁어모아서 15mL 센트리퓨즈 튜브에 담고 10분간 10,000rpm으로 원심분리시킨다. 원심분리 이후, 상청액을 흡입하여 제거하고 적절한 양의 용해 버퍼 (100μL의 용해 버터마다 1μL의 프로테아제와 인산염 억제제 포함)를 이용하여 세포 덩어리를 용해시킨다. 용해 버퍼의 양은 세포 덩어리의 크기에 따라 다르다. 샘플은 영하 20℃에서 밤새 얼린다.
단백질 정량
단백질 분리 하루 뒤에 샘플을 영하 4℃에서 녹이고 균진화되도록 초음파를 쬐어 분해하였다. 단백질 정량은 마이크로 BCA 단백질 분석 키트 (Pierce)를 이용하여 수행되었다. 면역블롯팅(immune-blotting)을 위한 샘플을 준비하기 위해, 베타메캅토에타놀 (Sigma)를 샘플 버퍼 (Bio-Rad)와 1:19의 비율로 섞어서 준비하였다. 샘플을 베타메캅토에타놀-샘플 버퍼 용액과 1:1로 희석한 뒤에 5분간 95℃에서 끓인 뒤에 영하 20℃에서 밤새 얼렸다.
면역블롯팅
Bcl-2, 카스파아제 9,시토크롬 c
웰당 로딩할 샘플의 양은 BCA 단백질 분석에서 얻은 단백질의 평균농도를 이용하여 결정하였다. 대략 30-60μg의 단백질이 각 처리 시간대별로 로딩되었다. 12% Tris-HCl 레디겔 (모든 것이 미리 준비되어 판매되는 겔) (Bio-Rad)이나 혹은 직접 손으로 만들어 준비한 겔을 1X 러닝버퍼 (running buffer)에 넣어 85볼트와 100볼트에서 3번씩 단백질을 로딩하여 진행하였다. 이후에 단백질을 니트로셀루로오스 종이에 100볼트에서 한시간 가량 이동시키고 5%의 우유 용액으로 다시 한시간 가량 차단하였다. 막을 1차 항체 (1μL 항체: 1,000μL TBST) (Cell Signaling) 용액에 넣어 영하 4℃에서 밤새 놔두었다. 다음날, Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST)를 사용하여 10분간 3번씩 씻은 후 2차 항체 (항-토끼, 1μL 항체: 1,000μL TBST)를 영하 4℃에서 한시간 가량 적용하였다. 다시 TBST를 사용하여 10분간 3번씩 씻은 후 피코 혹은 펨토 기질을 사용하여 화학발광을 완료하였다 (Pierce). 그 이후 막은 가장 좋은 시각적 결과를 보여주도록 시간을 갖고 현상하였다. 현상 후, 액틴 수준을 측정하기 전까지 영하 4℃에 TBST에 담그어 보관하였다.
액틴
막을 1차 액틴항체 (1uL 항체: 5,000uL TBST) (Cell Signaling) 용액에 넣어 영하 4℃에서 한시간 가량 놔둔 후, TBST를 사용하여 10분간 3번씩 씻은 후, 2차 항체 (항-생쥐, 1μL 항체: 1,000μL TBST)를 영하 4℃에서 한시간 가량 적용하였다. 다시 TBST를 사용하여 10분간 3번씩 씻은 후 피코 기질을 사용하여 화학발광을 완료하였다 (Pierce). 그 이후 막은 가장 좋은 시각적 결과를 보여주도록 시간을 갖고 현상하였다.
아넥신 V 분석
세포를 PBS 10X로 두번 씻은 후 바인딩 버퍼 (0.1M HEPES, pH 7.4; 1.4 M NaCl; 25 mM CaCl2)에 재부유시켰다. 100μl 샘플을 5ul 아넥신-PE 염료 혹은 7-ADD와 함께 배양 튜브에 넣었다. 세포를 섞은 후 실온에서 15분간 빛을 차단하고 배양 시켰다. 이 후에 400μl의 1X 바인딩 버퍼를 각 샘플에 추가하였고 유세포 분석기를 이용해 분석하였다.
실시예 21. 코엔자임 Q10 으로 처리한 세포의 웨스턴 분석
지난 50년이 넘는 기간 동안 내인성/외인성 인자가 악성세포로 전환의 근본적 원인과 같은 특정 과정에 영향을 준다고 암시하는 방대한 양의 정보가 만들어졌다. 임상과 기초 논문에서 암을 유전적 질병으로 정의하면서, DNA 구조와 기능의 변화가 암 발생과 진행에 중요한 역할을 한다는 증거를 제공했다(Wooster, 2010; Haiman, 2010). 1920년대 초기에 암 생성 병인에서의 근본적이 변화를 특성화 분석하는 작업에 관련된 Otto Warburg와 다른 연구자들은 두 개의 주요 관찰결과를 설명했다. (a) 산소 존재 하에 에너지 발생을 위한 ATP생성 과정에서 당을 운반하고 이용하는 세포의 능력- 바르버그 효과(Warburg Effect)로도 알려진 (b) 미토콘드리아 구조와 기능의 변화 - 미토콘드리아 ATP 생성 감소를 일으키는 전자 전달에서의 변화를 포함. 암을 대사성 질환으로 보는 것과 같이 지난 몇 년간 암 병인에서 세포 생물에너지학의 중심역할에 대한 연구가 부활되었다.
역사상, 유전자에서 돌연변이로 인해 세포 발현이 변화된다고 생각되어왔지만, 후성적 과정이 암 발생에서의 유전자 발현에 큰 영향을 주는 중요한 역할을 한다는 것을 뒷받침하는 문헌이 점점 쌓여가고 있다. 이것은 대부분 유전자에서 돌연변이 비율이 낮고 암세포에서 발생되는 많은(광범위한) 돌연변이를 일으킬 수 없다는 관찰을 통해 입증되었다. 후성적 변화는 메틸화와 히스톤 테일의 변형에 의해 조절되고, 두 가지 변화 모두 히스톤 아세틸화(ref)에 아세틸 CoA가 요구되는 것과 같이 보조인자를 필요로 하기 때문에 세포의 에너지(영양) 상태와 선천적으로 관련이 있다. 아세틸 CoA의 생합성은 세포내 에너지 상태를 유전자 발현과 활성의 조절에 직접 연결하면서 해당과정과 크렙 사이클에 의존한다.
정상 세포에서, 미토콘드리아 산화적 인산화는 정상 생리활성과 세포 생존을 유지하는데 요구되는 에너지를 충족시키기 위해 충분한 ATP를 생성한다. 미토콘드리아 에너지 생성의 결과로 미토콘드리아에 손상을 주는 정상적이지 않은 생성, 활성 산소종(ROS)이 발생된다(refs). 미토콘드리아에 의한 만성 ROS 발생이 유전자 돌연변이를 누적증가를 일으킨다는 사실이 잘 정립되어 있고 이러한 현상은 암 발생의 병인으로 암시되어왔다. 암세포가 ROS 발생을 최소화하기 위해 미토콘드리아 호흡을 감소시키고 에너지 생성을 지속하기 위해 미토콘드리아 호흡을 해당과정으로 바꾼다고 암시되어 왔다. 그러므로, 산화적 인산화로부터 해당과정으로 에너지 발생을 점차 변화시키는 것은 세포에서 에너지 발생과 생리적 기능을 유지하는데 본질적이고 정상세포 표현형으로부터 암세포 표현형으로의 진행에 연관될 수 있다. 세포 에너지(생물 에너지학) 프로파일과 미토콘드리아 유전자 구성에서 축적된 변이(돌연변이)의 점진적 변화는 세포 대사성을 바꾼다. 미토콘드리아 인산화의 해당작용으로 전이의 결과와 같은 전체 세포 대사성 프로파일에서의 변화는 비정상적 생물 에너지에서 유도된 대사성 프로파일과 일치하고 암 발생을 뒷받침하는 근본적 원인이다. 비-암성 정상 미토콘드리아 산화적 인산화에 연관된 세포 생물 에너지학적 상태로 세포 대사성 변화를 이끌어내기 위해 내인성 분자를 이용한 표적 개입은 암 치료의 치료적 변수에 해당한다.
Epi-대사성 변화를 야기하는 MIM으로서의 코엔자임 Q10
여기에 있는 자료는 코엔자임 Q10으로의 정상세포와 암세포 치료가 해당작용-미토콘드리아 산화 스트레스 연속체 내에서 핵심 생화학적 말단을 조절하는 단백질 발현에서의 변화와 연관이 있음을 입증한다. 웨스턴 블롯을 통한 단백질 발현과 산소 소비율 평가를 설명하는 자료의 조합은 정상세포에서 코엔자임 Q10에 노출된 후에 정상 해당작용과 미토콘드리아 호흡률에 큰 변화가 없었다고 밝혔다. 따라서, HDFa(정상 인간 성체 섬유아세포), HASMC(정상 인간 대동맥 평활근 세포), nFib(정상 섬유아세포), HeKa (정상 인간 각질세포)와 같은 정상 세포주에서 단백질 발현과 미토콘드리아 호흡률 수치가 기저 생리상태를 대표한다고 생각될 수 있다. HepG2 (간암), PaCa-2 (췌장암), MCF7 (유방암), SK-MEL (흑색종), SCC-25 (편평세포암)과 같은 암세포 세포주에서 단백질 발현과 미토콘드리아 호흡률의 어떠한 일탈은 이 경우엔 암인 질병의 시작/진행에 따른 변화를 대표한다. 실험적 증거가 암세포로의 코엔자임 Q10 노출이 정상세포를 연상시키는 세포 병리생리학적 개편과 연관 있다는 가설을 뒷받침한다. 세부적으로, 여기에서 제공된 자료는 암세포에서 코엔자임 Q10 노출이 정상 세포에서 관찰된 해당경로와 미토콘드리아 산화적 인산화에서의 변화와 연관 있음을 입증하고, 그러한 정상세포에서 관찰된 변화는 세포 구조의 전반적 개편을 유도한다.
정상세포에서, 해당과정 산물의 변수는 미토콘드리아 산화적 인산화(OXPHOS), 예. 미토콘드리아 OXPHOS를 통해 ATP를 생성하고 이에 필요한 환원 당량을 생성하기 위한 크렙스 회로(트리카복실산 회로, TCA, 또는 구연산 회로)에 들어가기 위해 해당경로를 통한 당에서의 피루브산 발생, 와 연결되어 있다. 그러므로, 정상세포에서 해당과정에 연관된 유전자 산물의 발현과 기능적 지향은 피루브산의 적절한 생성과 크렙스 회로로 피루브산의 유입에 대해 준비된다. 암세포에서의 해당작용과 크렙스 회로에 관여하는 중요 단백질의 잘 조절되지 않은 발현과 기능이 해당작용을 증가시키고 미토콘드리아 기능을 현저히 저하시킨다. 미토콘드리아 호흡사슬에 선택적으로 영향을 주는 내인성 분자인 코엔자임 Q10에 대한 암세포의 노출은 미토콘드리아에서 에너지 생산(예, ATP 생성)을 회복시키는 것과 같은 생물 에너지학적 변화를 촉진시키기 위해 해당작용과 크렙스 회로의 단백질 발현을 변화시킨다(정상화시킨다).
실험방법
웨스턴 블롯 실험 1
실험에 사용된 세포는 HDFa와 MCF-7이었고 코엔자임 Q10 두 농도, 50μM과 100μM 로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 24시간 후 채취되었다. 전체 세포 응집체는 C7 완충액 1mL에 차례로 재부유되었고, 라벨된 15mL 시험관으로 옮겨졌다. 샘플은 얼음이 있는 저온 실험실에서 14번 세팅의 6초음파 펄스를 이용하여 초음파처리되었다. 샘플은 초음파 후 짧은 시간 동안 2500g까지 회전시켜졌고 2ml 시험관에 옮겨 닮아졌다. 50mL 샘플 시험관에 남아있는 거품을 이용하여 각 샘플의 pH(pH는 9.0이 되어야 함)가 측정되었다.
1M 아크릴아미드 10 μl, 트리부틸포스펜 25 μl를 추가하고 90분 동안 간헐적으로 저으면서 배양을 하여 각 샘플의 알킬화와 환원이 수행되었다. 배양 후, 1M DTT 10μl이 추가되고 시험관은 20도에서 10분 동안 20,000g로 회전시키고 상층액을 라벨된 Amicon Ultra 원심분리기 필터 단위 10 k 컷오프 (Millipore catalog # UFC 801024)로 옮겼다. 샘플은 2500g에서 15분 동안 2 간격으로 회전시켰다. 전도도 측정기를 이용하여 샘플과 챕스에 대한 전도도를 측정하였다. 샘플의 전도도가 높으면, 완충액 교환을 위해 1ml 챕스(chaps)가 추가되었고 다시 2500g에서 부피가 250μl이 될 때까지 회전시켰다. 전도도가 200이거나 그 이하일 때는 샘플은 5분 간격으로 2500g에서 상층액의 부피가 150-100μl 사이가 될 때까지 회전시켜졌다. 샘플의 상층액은 에펜도르프 튜브에 옮겨졌고 BSA를 표준물질로 하여 Bradford 분석이 수행되었다.
샘플은 위에 명시된 표준 프로토콜 대로 처리되었고 각 샘플에 있는 단백질의 양이 Bradford 분석법을 이용하여 측정되었다. 단백질 10μg과 동일한 세포 부피가 아래 있는 것처럼 라멜리 로딩 염료 (LDS)와 함께 준비되었고 MilliQ water(MilliQ 수)가 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE 겔 (Invitrogen, cat # NP0323Box)에 쓰였다.
겔은 200V에서 NOVEX Xcell Surelock 시스템과 1X MOPS 완충액을 이용하여 50분 동안 수행되었다. 그 후 겔은 한 시간 동안 NOVEX Xcell 슈어록 웨트(Surelock wet) 트랜스퍼 프로토콜을 이용하여 30V에서 이동되었다. 블롯은 인비트로젠으로부터의 심플리 블루 세이프테인(LC6065)으로 염색되었다.
HDFa와 MCF-7 샘플에서 IDH1과 ATP 시트르산 분해효소 수준
이동 후, 각 블롯을 2개의 와트만 필터 페이퍼 사이에 놓이도록 하고 15-20분간 건조시켰다. 건조 후 HB 연필을 사용하여 블롯에 날짜, 샘플 종류, 블롯1 또는 블롯2가 라벨되었다. 분자량 마커는 연필로 윤곽을 그렸고 파란색 마커는 한줄로 색깔있는 마커는 두줄로 표시하였다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5')로 3회 세척되었다. 4℃에서 밤새 흔들면서 배양 시킴으로써 블롯 1은 5% BSA(1:1000 희석) TBST안에서 IDH1(Cell Signaling # 3997)에 대한 일차 항체로 탐침 되었고 블롯 2는 1:1000 희석된 5% BSA(Cell Signaling #4332) 안에서 ATP 시트르산 분해효소에 대한 토끼 다클론 항체로 탐침되었다. 일차 항체와 함께 밤새 배양 시킨 후, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항토끼; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 배양한지 한시간 뒤에, 블롯은 TBS-T( 각각 1X-15' ; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
HDFa 와 MCF -7 샘플에서의 액틴 수준
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양하고 TBS-T로 10분간 두번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척하여 박리되었다. 두 개의 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5'로 3회 세척되었으며 1:5000으로 희석된 5% BSA(Sigma catalog # A5316, clone AC-74)에서 액틴에 대한 항체로 실온에서 흔들면서 한 시간 동안 탐침되었다. 액틴에 대한 일차 항체로 한 시간 동안 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항마우스; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 시한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 배양한지 한시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
웨스턴 블롯 실험 2
실험에 사용된 세포는 SKMEL28, SCC-25, nFib, Heka이었고 코엔자임 Q10 두 농도, 50 μM과 100 μM 로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 3, 6 및/또는 24시간 후 채취되었다. 샘플은 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE 겔에서 위에서 설명된 것과 같이 처리되고 시험되었다. 겔은 위에서 설명된 것처럼 작동되고, 이동되고 염색되었다.
4개의 세포주에 대한 IDH1 수준
이동 후 블롯이 15-20분간 건조되었고, 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5' 로 3회 세척되었다. 그 후 4℃에서 밤새 흔들면서 배양 시킴으로써 블롯은 5% BSA(1:1000 희석) TBST안에서 IDH1(Cell Signaling # 3997)에 대한 일차 항체로 탐침되었다. IDH1에 대한 일차 항체와 함께 밤새 배양 시킨 후, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항토끼; 1:10,000 희석)로 탐침되었다. 이차 항체로 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
4개 세포주에서 ATP 시트르산 분해효소 수준
이소시트르산 탈수소효소 블롯은 메탄올로 30분간 배양하고 TBS-T로 10분간 두번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5')로 3회 세척되었으며 1:1000으로 희석된 5% BSA (Cell Signaling #4332)에서 ATP 시트르산 분해효소에 대한 항체로 4℃에서 흔들면서 한 시간 동안 탐침되었다. ATP 시트르산 분해효소에 대한 일차 항체로 한 시간 동안 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항토끼; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
4개의 각기 다른 세포주에서 액틴 수준
ATP 시트르산 용해요소 블롯은 메탄올로 30분간 배양하고 TBS-T로 10분간 두번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5'로 3회 세척되었으며 1:5000으로 희석된 5% BSA (Sigma catalog # A5316, clone AC-74)에서 액틴에 대한 항체로 실온에서 흔들면서 한 시간 동안 탐침되었다. 액틴에 대한 일차 항체로 한 시간 동안 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항마우스; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
웨스턴 블롯 실험 3
실험에 사용된 세포는 HepG2, HASMC, PACA2 이었고 코엔자임 Q10 두 농도(50μM과 100μM)로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 48시간 후 채취되었다. 본 실험(웨스턴 블롯 실험 3)과 이 예에서 아래 설명된 모든 실험(웨스턴 블롯 실험 4-9)에서, 세포는 5mM 당("5G") 또는 22mM 당("22G") 중 하나에 추가적으로 처리되었다. 세포에서 유래된 샘플은 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE 겔에서 위에서 설명된 것과 같이 처리되고 시험되었다. 겔은 위에서 설명된 것처럼 작동되고, 이동되고 염색되었다.
HASMC 대 PACA2 와 HepG2 에서 IDH1 , ATP 시트르산 용해효소, 액틴 수준
IDH1, ATP 시트르산 용해요소, 액틴 수준은 위에 설명된 것처럼 블롯을 IDH1, ATP 시트르산 용해요소, 액틴에 대한 일차 항체로 탐침함으로써 확인되었다.
웨스턴 블롯 실험 4
본 실험에 사용된 세포는 HepG2이고 코엔자임 Q10 두 농도, 50μM와 100μM로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 24시간 또는 48시간 후 채취되었다. 샘플은 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE 겔에서 위에서 설명된 것과 같이 처리되고 시험되었다. 겔은 위에서 설명된 것처럼 작동되고, 이동되고 염색되었다.
HepG2 세포에서 젖산 탈수소효소 수준
이동 후 블롯이 15-20분간 건조되었고, 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15'2X5'로 3회 세척되었으며 그 후 4℃에서 밤새 흔들면서 배양 시킴으로써 블롯은 5% BSA(1:1000 희석)에서 젖산 탈수소효소(abcam ab2101; 다클론)에 대한 일차 항체로 탐침되었다. 젖산 탈수소효소에 대한 일차 항체와 함께 밤새 배양 시킨 후, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(토끼의 항염소; 1:10,000 희석)로 탐침되었다. 이차 항체로 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
HepG2 세포에서 피루브산 키나아제 근육형( PKM2 ) 수준
젖산 탈수소효소 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 2개의 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5'로 3회 세척되었으며 1:500으로 희석된 5% BSA (NOVUS BIOLOGICALS catalog # H00005315-D01P)에서 피루브산 키나아제 M2에 대한 토끼 다클론 항체로 4℃에서 흔들면서 탐침되었다. 피루브산 키나아제 M2에 대한 일차 항체로 밤새 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항토끼; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
HepG2 세포에서 피루브산 탈수소효소 베타 수준
피루브산 키나아제 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 2개의 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 항체의 박리와 ECF 시약이 효과가 있었음을 확인한 후, 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5'로 3회 세척되었으며 1:500으로 희석된 5% BSA (ABNOVA catalog # H00005162-M03)에서 피루브산 탈수소효소에 대한 토끼 항체로 4℃에서 흔들면서 밤새 탐침되었다. 피루브산 탈수소효소에 대한 일차 항체로 밤새 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항마우스; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
HepG2 세포에서 액틴 수준
피루브산 탈수소효소 블롯은 박리된 후 위에 설명된 것처럼 액틴으로 재탐침되었다.
웨스턴 블롯 실험 5
본 실험에 사용된 세포는 MIAPACA2 (PACA2) 이고 코엔자임 Q10 두 농도, 50 μM와 100μM로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 24시간 또는 48시간 후 채취되었다. 위에서 설명된 것과 같이 PACA2 샘플은 처리되었고 겔은 작동되고, 이동되고 염색되고 스캔되었다.
PaCa2 세포에서 락트산 탈수소효소( LDH )와 피루브산 탈수소효소( PDH ) 수준
LDH와 PDH 수준은 위에 설명된 것과 같이 LDH와 PDH에 대한 일차 항체로 블롯을 성공적으로 탐침함으로써 측정되었다.
PaCa2 세포에서 카스파아제3 수준
블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 2개의 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15' 2X5')로 3회 세척되었으며 1:200으로 희석된 5% BSA (Santacruz Biotechnology # sc7272)에서 카스파아제 3에 대한 항체로 4℃에서 흔들면서 밤새 탐침되었다. 카스파아제 3 대한 일차 항체로 밤새 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항마우스; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
웨스턴 블롯 실험 6
본 웨스턴 블롯 실험에 사용된 세포는 PC-3, HepG2, MCF-7, HDFa, PACA2 이고 코엔자임 Q10 IV 제조법으로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 24시간 후 채취되었다. 위에서 설명된 것과 같이 샘플은 처리되었고 겔은 작동되고, 이동되고 염색되고 스캔되었다.
각기 다른 세포종류에서 카스파아제3과 액틴 수준
카스파아제3과 액틴의 수준은 위에 설명된 것과 같이 카스파아제3과 액틴에 대한 일차 항체로 블롯을 성공적으로 탐침함으로써 측정되었다.
웨스턴 블롯 실험 7
본 웨스턴 블롯 실험에 사용된 세포는 인간 대동맥 평활근 세포(HASMC)이고 코엔자임 Q10 두 농도, 50 μM 또는 100 μM로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 24시간 또는 48시간 후 채취되었다. 위에서 설명된 것과 같이 HASMC 샘플은 처리되었고 겔은 작동되고, 이동되고 염색되고 스캔되었다.
액틴에 대한 시험 프로토콜:
액틴 수준은 위에 설명된 것처럼 블롯을 액틴에 대한 일차 항체로 탐침하여 측정하였다.
Hif 1 알파, 카스파아제3 , PDHB 에 대한 실험 프로토콜
액틴 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15' 2X5'로 3회 세척되었으며 1:200으로 희석된 5% BSA 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 배양)에서 Hif 1 알파, 카스파아제 3 또는 PDHB에 대한 항체로 탐침되었다. Hif 1알파(Abcam ab2185; 항토끼)에 대한 일차 항체는 5% BSA에 1:500으로 희석되어 있었다. 카스파아제 3(Santacruz sc7272; 항토끼)에 대한 일차 항체는 5% BSA에 1:200으로 희석되어 있었다. 피루브산 탈수소효소 베타(PDHB)( Novus Biologicals H00005162-M03; 항마우스)에 대한 일차 항체는 5% BSA에 1:500으로 희석되어 있었다. 일차 항체로 밤새 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (PDHB 항마우스; Hif 1a과 카스파아제 3 항토끼:10,000 희석)로 탐침되었다. 이차 항체로 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
PKM2 , SDHB , SDHC 에 대한 실험 프로토콜:
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15' 2X5'로 3회 세척되었으며 1:200으로 희석된 5% BSA 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 배양 함으로써 PKM2, SDHB 또는 SDHC에 대한 항체로 탐침되었다. SDHC(ABNOVA H00006391-M02; 항마우스)에 대한 일차 항체는 1:500으로 희석되어 있었다. SDHB에 대한 일차 항체는 Abcam ab4714-200; 항마우스; 1:1000 희석에서 얻었다. 피루브산 키나아제 M2(PKM2)에 대한 일차 항체는 Novus Biologicals H00005315-D0IP; 항토끼; 1:500 희석에서 얻었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (PDHB 항마우스; Hif 1a과 카스파아제 3 항토끼:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 탐침되었다. 이차 항체로 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
LDH , Bik 에 대한 실험 프로토콜:
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15' 2X5')로 3회 세척되었으며 TBS-T에 있는 5% BSA에서 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 배양 함으로써 LDH 또는 Bik에 대한 항체로 탐침되었다. LDH에 대한 일차 항체는 Abcam ab2101; 항염소; 1:1000 희석에서 얻었다. Bik에 대한 일차 항체는 Cell Signaling #9942; 항토끼; 1:1000 희석에서 얻었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (LDH 항염소; Jackson Laboratories) 와 Bik 항토끼; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 탐침되었다. 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
웨스턴 블롯 실험 9
사용된 세포는 HepG2이고 코엔자임 Q10 두 농도, 50 μM 또는 100 μM로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 24시간 또는 48시간 후 채취되었다. 위에서 설명된 것과 같이 HepG2 샘플은 처리되었고 겔은 작동되고, 이동되고 염색되고 스캔되었다.
액틴에 대한 실험 프로토콜:
액틴 수준은 위에 설명된 것처럼 블롯을 액틴에 대한 일차 항체로 탐침하여 측정하였다.
카스파아제 3과 MMP -6에 대한 실험 프로토콜:
액틴 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15'2X5'로 3회 세척되었으며 5% BSA에서 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 배양 함으로써 카스파아제3 또는 MMP-6에 대한 항체로 탐침되었다. 카스파아제(Abcam ab44976-100; 항토끼)에 대한 일차 항체는 5% BSA에서 1:500으로 희석되었다. MMP-6(Santacruz scMM0029-ZB5; 항마우스)에 대한 일차 항체는 5% BSA에서 1:100으로 희석되었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (MMP-6 항마우스; 카스파아제 3 항토끼; 1:10,000희석)로 탐침되었다. 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
LDH 에 대한 실험 프로토콜:
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15'2X5'로 3회 세척되었으며 5% BSA 또는 5% 우유에서 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 배양 함으로써 LDH에 대한 항체로 탐침되었다. LDH 080309b1 (Abcam ab2101; 항염소)에 대한 일차 항체는 5% 우유에서 1:1000으로 희석되었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (Jackson Immuno Research 항염소; 1:10,000 희석; 305-055-045)로 탐침되었다. 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
트랜스알돌라아제와 Hif1a 에 대한 실험 프로토콜:
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15'2X5'로 3회 세척되었으며 5% BSA에서 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 배양 함으로써 트랜스알돌라아제 또는 Hif1a에 대한 항체로 탐침되었다. 트랜스알돌라아제 (Abcam ab67467; 항마우스)에 대한 일차 항체는 1:500으로 희석되었다. Hif1a (Abcam ab2185; 항토끼)에 대한 일차 항체는 1:500으로 희석되었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (항마우스 또는 항토끼; 1:10,000 희석)로 탐침되었다. 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
IGFBP3 과 TP53 에 대한 실험:
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15'2X5'로 3회 세척되었으며 5% BSA에서 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 배양 함으로써 IGFBP3 또는 TP53에 대한 항체로 탐침되었다. IGFBP3 (Abcam ab76001; 항토끼)에 대한 일차 항체는 1:100으로 희석되었다. TP53 (Sigma Aldrich AV02055; 항염소)에 대한 일차 항체는 1:100으로 희석되었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (항토끼; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 탐침되었다. 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
트랜스알돌라아제와 PDHB 에 대한 실험 프로토콜:
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 배양 되었으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15'2X5'로 3회 세척되었으며 5% BSA에서 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 배양 함으로써 트랜스알돌라아제 또는 PDHB에 대한 항체로 탐침되었다. 트랜스알돌라아제 (Santacruz sc51440; 항염소)에 대한 일차 항체는 1:200으로 희석되었다. PDHB (Novus Biologicals H00005162-M03; 항마우스)에 대한 일차 항체는 1:500으로 희석되었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (항염소 또는 항마우스; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 탐침되었다. 배양한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
결론:
이소시트르산 탈수소효소-1 (IDH-1)
이소시트르산 탈수소효소는 미토콘드리아 기질 내에서 주로 일어나는 TCA 회로 포함된 효소 중 하나이다. 그러나 IDH1은 이소시트르산의 알파-케토글루타레이트로의 산화적 탈탄산 반응을 촉매하는 효소의 시토졸 형태이고 두단계 과정에서 이산화탄소를 발생한다. IDH1은 시토졸과 퍼옥시좀에 존재하는 NADP+ 의존적 형태이다. IDH1은 Ser113 인산화에 의해 불활성화 되고 시트르산 회로가 없는 종들을 포함해서 많은 종에서 발현된다. IDH1은 정상적으로 종양 억제자 기능을 하고, IDH1이 불활성화되면 HIF-1 회로(Bayley 2010; Reitman, 2010)의 활성화를 통해 암 발생에 부분적으로 기여한다. 최근의 연구에서 교모세포종의 병인에서 IDH1의 불활성화 돌연변이가 연루되었음을 보여주었다(Bleeker, 2009; Bleeker, 2010)
코엔자임 Q10으로의 처리는 MCF-7, SKMEL28, HepG2, PaCa-2 세포를 포함한 암세포주에서 IDH1의 발현을 증가시켰다. SCC25 세포주에서는 발현이 중간 정도로 증가하였다. 일차 인간유래 섬유아세포 HDFa, nFIB와 인간 대동맥 평활근 세포 HASMC의 대조배양에서 코엔자임 Q10에 대한 반응으로 IDH1의 발현 패턴이 유의하게 변화함을 입증하지 못했다. 알파-케토글루타레이트(알파-KG)는 TCA 회로의 중요한 중간체이고, 이소시트르산으로부터 생화학적으로 합성되며 최종적으로 숙시닐 CoA로 변환되며 약물이 될 가능성이 있는 MIM이고 외-변환인자이다. 알파-KG는 세포에 의해 회로의 중간체를 보충하는 데 사용될 수 있고 따라서 산화적 인산화를 증가시키기 위한 환원당량을 생성시킬 수 있기 때문에 알파-KG의 발생은 TCA 회로에서 중대한 시점으로의 역할을 한다. 따라서, 코엔자임 Q10 매개된 IDH1 발현의 증가는 중간체 형성을 야기하고 이것은 미토콘드리아 TCA 회로에 암세포에서 산화적 인산화를 증가시키는데 사용될 수 있다. 실험의 결과는 아래 표31-33에 요약되어 있다.
Figure 112011097936842-pct00047

Figure 112011097936842-pct00048
Figure 112011097936842-pct00049
ATP 시트르산 용해효소(ACL)
ATP 시트르산 용해효소(ACL)는 호모테트라머(~126kd) 효소이고 시토졸에서 아세틸 CoA와 옥살아세테이트 형성을 촉매한다. 이 반응은 지방산, 콜레스테롤, 아세틸콜린 생합성과 당 생성작용에서 매우 중요한 첫 단계이다(Towle et al., 1997). 영양소와 호르몬이 이 중요 효소의 발현 수준과 인산화 상태를 조절한다. Akt와 PKA에 의한 ACL의 Ser454 인산화가 보고되었다(Berwick., DC MW et al., 2002; Pierce MW et al., 1982).
이 자료는 정상세포와 암세포에서 ATP 시트르산 용해효소에 대한 코엔자임 Q10의 효과가 있다고 설명한다. 이와 일관되게 암세포에서 용량의존적 ACL 효소 발현의 감소가 관찰되었다. 이와 대조적으로 정상세포에서 ACL 발현은 증가하는 경향을 보였다. 시토졸 ACL은 성장인자 자극과 분화 중에 세포에서 히스톤 아세틸화에 필수적이라고 밝혀졌다. ACL이 종양의 과정에서 중요한 과정인 시토졸 당에서 나온 시트르산을 히스톤 아세틸화에 필수적인 아세틸 CoA를 만들기 위해 이용한다는 사실은 코엔자임 Q10에 의해 유도된 ACL 발현이 암세포 기능에 영향을 미친다는 것을 설명한다. 시토졸 ACL에 의해 시트르산에서 생성된 아세틸 CoA는 세포 분열 중 새로운 지방과 콜레스테롤의 생합성을 위한 근원물질로서 작용한다. 따라서, 코엔자임 Q10이 유도한 ACL 발현의 변화는 아세틸 CoA가 정상세포 대 암세포에서 지방과 콜레스테롤 생합성하는 능력을 변화시킨다. 실험의 결과는 아래 표34-37에 요약되어 있다.
Figure 112011097936842-pct00050
Figure 112011097936842-pct00051
Figure 112011097936842-pct00052
Figure 112011097936842-pct00053
피루브산 키나아제 M2 ( PKM2 )
피루브산 키나아제는 해당경로에 연관된 효소이다. 이 효소는 ATP와 피루브산을 생성하기 위해 인산을 포스포이놀피루베이트(PEP)에서 이인산 아데노신 (ADP)로 운반하는 역할을 한다. PKM2는 해당 피루브산 키나아제의 동위효소이고, 이 효소의 발현은 조직의 대사 가능에 의해 특성화된다. 예를 들어 M2 동위효소는 배아세포와 같이 고 에너지를 필요로 하면서 정상적으로 빠르게 증식하는 세포에서 발현되고 폐와 빠른 속도의 핵산 합성을 요하는 또한 췌장도세포와 같이 정상 분화되는 소수의 조직에서 발견된다. PKM2는 세포의 에너지 필요를 충족하기 위한 해당경로에의 의존에 의해 암세포에서 상당히 많이 발현된다. 배아에서는 제한되어있다고 생각되는 PKM2 이소폼은 암세포에서 재발현된다.PKM2를 발현하는 세포는 락트산 생성 증가와 산화적 인산화 감소를 보이면서 호기성 해당 형질(대사성 형질에서 변화를 보임)을 선호한다. 따라서, 암세포에서 PKM2 발현의 감소는 해당경로를 통한 에너지 생성을 변화시키거나 하향조절할 것이고, 이것은 암 치료에서 유용한 전략이다. 자료는 정상세포와 암세포에서 PKM2의 다양한 발현 패턴을 보여주었고, 암세포가 정상세포에 비교했을 때 발현 수준이 더 높았다. 코엔자임 Q10으로의 세포 처리는 정상세포와 암세포에서(도면 81-85) PKM2 상한과 하한 밴드 발현 패턴을 변화시킨다. 시험된 암세포에서, PKM2 발현이 용량의존적으로 감소했고 정상세포에서는 중요한 변화가 관찰되지 않았다. 실험의 결과는 아래 표 38-40에 요약되어 있다.
Figure 112011097936842-pct00054
Figure 112011097936842-pct00055
Figure 112011097936842-pct00056
락트산 탈수소효소 ( LDH )
LDH는 NADH와 NAD+를 상호변환하면서 피루브산과 락트산의 상호변환을 촉매하는 효소이다. 이 효소는 미토콘드리아의 산화적 인산화로 낮은 세포의 산소분압에서 환원당량 생성과 ATP 발생을 위해 피루브산을 락트산으로 변화시키는 능력이 있다. 암세포는 ATP와 환원당량과 환원적 미토콘드리아 OXPHOS를 생성하기 위한 해당과정의 흐름을 유지하기 위해 통상적으로 LDH의 증가된 발현을 보여준다. 따라서, 암세포에서 LDH 발현을 감소시키는 것은 TCA 회로로의 피루브산의 진입을 촉진하기 위해 락트산 생성으로부터 대사를 변화시킬 것이다. 코엔자임 Q10 처리는 정상세포에는 최소의 영향을 주었고 암세포에서 락트산 탈수소효소 (LDH) 발현을 감소시켰으며 이것은 코엔자임 Q10이 세포질 피루브산이 락트산으로 변화하는 것을 최소화함으로 해당작용에서의 ATP 발생을 미토콘드리아 OXPHOS로 근원물질로 변화시키기 위해 암세포 생물 에너지에서의 변화를 야기하는 역할을 한다는 것을 뒷받침한다. 실험의 결과는 아래 표41-43에 요약되어 있다.
Figure 112011097936842-pct00057
Figure 112011097936842-pct00058
Figure 112011097936842-pct00059
피루브산 탈수소효소 베타(PDH-E1)는 피루브산을 아세틸 CoA로 변환시키는 피루브산 탈수소효소 복합체(PDC)의 일부인 첫 번째 효소 요소이다. PDH-E1은 PDC 복합체에서 미토콘트리아에서 TCA 회로에 들어가기 위해 피루브산의 아세틸 CoA로의 변화에 본질적인 처음 두 개의 생화학 반응을 수행하는 활성을 나타내기 위해 티아민을 보조인자로 필요로 한다. 따라서, 암세포에서의 PDH-E1 발현의 증가와 함께 PKM2와 LDH 발현의 동시 감소는 ATP 생성을 위한 미토콘드리아 OXPHOS를 증가시키는 방향으로 피루브산이 진입률을 증가시킬 것이다. 자료가 정상 세포와 암 세포주에서 PDH-E1 발현에 대해 암세포에서 본 효소의 기저 발현이 정상세포에 비해 감소했음을 보여준다. 코엔자임 Q10으로의 처리는 정상세포에는 변화를 거의 주지 않고 암세포에서 PDH-E1 단백질 발현의 점진적 증가와 연관있다. 실험의 결과는 아래 표44-46에 요약되어 있다.
Figure 112011097936842-pct00060
Figure 112011097936842-pct00061
Figure 112011097936842-pct00062
카스파아제 3
세포사멸 개시의 조절은 때때로 개시 카스파아제, 카스파아제-2,-9dhk -8/10의 수준에서 행해진다. 세포사멸의 외인성 경로에서, 카스파아제-8은, 활성이 있으면, 직접적으로 카스파아제-3과 같은 종결 카스파아제를 쪼개고 활성화시킨다. 이 활성있는 카스파아제-3은 다른 카스파아제(6, 7, 9)뿐만 아니라 세포내 관련 표적을 쪼개고 활성화시킨다(예, PARP와 DFF). 이러한 실험에서 암 세포주와 정상 세포주에서 코엔자임 Q10 반응에 대한 작동 카스파아제-3 단백질 수준이 측정되었다. 세포사멸의 조절이 개시 카스파아제를 통해 이루어졌으나, 많은 신호전달 경로가 대신 작동 카스파아제를 직접 저해함으로써 세포사멸 신호전달을 방해하였다는 사실이 주목할 만 하다. 예를 들어 P38 MAPK는 카스파아제-3을 인산화시키고 이의 활성을 억제한다(Alvarado-Kristensson et al., 2004). 재미있게도, 동일 실험에서 단백질 인산염(PP2A)의 활성 또는 단백질 키나아제 C 델타(PKC 델타))(Voss et al., 2005)는 카스파아제-3 활성을 증가시키기 위해 p38 MAPK의 효과에 대응하고 세포사멸 신호 전달을 강화할 수 있다. 따라서, 활성화 또는 활성화 후 카스파아제-3 수준에서의 일이 어떤 경우에서 세포의 존망을 결정할 수 있다.
카스파아제-3은 세포사멸의 진행 과정에서 중요한 역할을 하는 시스테인-아스파트산 프로테아제이다. 암세포에서 카스파아제 3 수준은 코엔자임 Q10 처리로 증가되었다. 이와 반대로 정상세포에서 카스파아제-3의 발현은 완화하게 감소하였다. 실험의 결과는 아래 표47-49에 요약되어 있다.
Figure 112011097936842-pct00063
Figure 112011097936842-pct00064
Figure 112011097936842-pct00065
숙신산 탈수소효소 ( SDH )
숙신산 코엔자임 Q 환원효소로도 알려진 숙신산 탈수수효소는 TCA와 전자전달반응 모두에 연관된 내부 미토콘드리아 막의 복합체이다. TCA에서, 이 복합체는 숙신산의 푸마르산으로의 산화와 동시에 유비퀴논의 유비퀴놀로의 환원을 촉매한다(Baysal et al., Science 2000; 그리고 Tomlinson et al., Nature Genetics 2002). SDH B, C, D 하위단위에서의 배선 돌연변이가 가족성 부신경절종 또는 자궁근종을 개시한다고 발견되었다(Baysal et al., Science 2000).
코엔자임 Q10 처리된 암세포의 미토콘드리아 분획에서 SDH 하위단위 B 발현의 특성화를 위해 웨스턴 블롯 분석법이 사용되었다. 그 결과는 코엔자임 Q10 처리가 세포의 미토콘트리아에서 SDH 단백질 수준을 높이는데 연관이다고 암시한다. 이러한 결과는 코엔자임 Q10의 기전 중 하나는 SDHB 같은 미토콘드리아 효소 수준을 증가시킴으로써 세포의 대사를 TCA 회로와 미토콘드리아로 변화시키는 것이다. 실험의 결과는 아래 표 50에 요약되어 있다.
Figure 112011097936842-pct00066
저산소증 유도 인자 - 1
저산소증 유도 인자(Hif)는 알파와 베타 하위단위로 구성된 전사 인자이다. 산소 정상 상태에서, Hif1 알파 단백질 수준은 매우 낮다. Hif1 알파 단백질 수준은 단백질번역 후 일련의 사건들을 통한 계속적인 분해로 인해 매우 낮다. 해당작용과 산화적 인산화과정사이의 이동은 보통 피루브산의 이화작용적 운명을 결정하는 PDH와 LDH의 두 개의 효소의 상대적 활성에 의해 조절되는 것으로 간주된다. Hif는 LDH 수준을 유도하고 PDK를 자극함으로써 PDH를 억제하는 작용을 통해 중대한 비퓨게이션(bifurgation)을 조절한다. 피루브산 대사를 미토콘드리아에서 세포질로 전환시키는 능력 때문에, Hif는 암세포에서 생물에너지의 이동에 대한 중대한 매개체로 간주된다.
코엔자임Q10의 처리는 암세포의 미토콘드리아 분획에서 Hif1 알파 단백질 수준을 감소시킨다. 정상세포의 모든 세포 용해물에서, Hif1알파의 하단밴드가 관찰되고 역시 감소되는 것으로 보인다. 결과들은 아래 표 51-52에 정리되었다.
Figure 112011097936842-pct00067
Figure 112011097936842-pct00068
실시예 22: CoQ10 을 처리한 정상세포와 암세포에서의 산소 소비 비율 ( OCR )과 세포밖의 산성화 ( ECAR )의 분석
본 예는 세포를 스트레서(즉, 고혈당증, 저산소증, 젖산)가 있거나 없는 상태에서 대표적인 MIM/CoQ10의 외-변환인자로 처리하였을 때, 정상 생리적 조건에서 정상세포에서 측정되는 대표적인 값인 해당과정/젖산 생합성과 미토콘드리아의 산화성 인산화과정 (ECAR과 OCR값으로 측정되는)으로 이동하는 것을 보여준다.
출원은 이전 부분에서 암세포에 CoQ10을 처리하는 것은 미토콘드리아의 산화적 인산화과정을 촉진하는 특정 단백질의 발현의 변화와 관련이 있고 해당과정과 젖산 생합성의 수반되는 감소와 관련이 있다는 것을 보여주었다. 본 예는 인-비트로(in-vitro) 실험모델에서 용해된 산소와 세포밖의 pH수준을 측정하는 기계인 SeaHorse XF 분석기를 이용하여 세포주에서 산소 소비 비율 (OCR)을 측정함으로써 얻을 수 있는 미토콘드리아의 산화적 인산화과정의 직접적 수치를 보여준다 (SeaHorse Biosciences Inc, North Billerica, MA).
정상 조직을 둘러싸고 있는 세포내의 (세포질의) pH에 비교해 종양에서의 세포 밖의 미세환경의 pH는 상대적으로 산성이다. 종양의 이러한 특징은 세포외기질(ECM)을 침투할 수 있는 능력과, 나중에 아래 사항을 더 조절하는 신호전달 단계를 시작하는 종양의 전이에 대한 특징을 포함하는 다양한 목적을 제공한다.
종양 신생혈관신생
세포주기 회전을 조절하는 중단 매커니즘의 증가된 활성화
면역학적 감시에 대한 세포적 회피 시스템을 가능하게 하는 면역-조절적 메커니즘
당분해과정의 흐름과 젖산 사용에 대한 의존성을 증가시키는 대사성 조절 요소
발암성을 증가시는 Bcl -2, IAP , EndoG , AIF 와 같은 중요 세포사멸적 유전자군의 기능장애
어느 특정한 이론에 얽매이지 않아도, 종양의 세포밖 미세환경의 산성pH는 변경된 해당과정 현상으로부터 증가된 젖산 생산에 따른 종양 세포에서 짜내진 수소 이온의 농도가 증가된 결과이다.
본 실험에서, 정상 세포주에서 OCR과 ECAR을 CoQ10이 있을 때와 없을 때 측정하여 기준치 값을 결정하였다. 정상적으로 영양분이 공급되는 환경에서 정상세포주의 OCR 비율은 다르고 체내에서 세포의 생리학적 역할을 기능을 하는 것으로 관찰되었다.
예를 들어, 한 실험은 사람 성인 피부 섬유아세포 세포주인 비-종양성 세포주 HDFa를 이용하여 수행하였다. 섬유아세포는 주로 세포외기질(ECM) 요소와 조직의 구조적 체계(스트로마 기질)를 형성하는 콜라겐을 합성하고 분비하는 세포이다. 더불어, 섬유아세포는 상처를 치료하고 국부적인 면역조절과 같은 다양한 기능의 조직의 대사로 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 정상적인 생리적 조건에서, 정상 섬유아세포의 에너지 필요는 해당과정과 산화적 인산화과정-EMC의 합성에 필요한 영양분을 공급하는 해당과정-의 결합을 통해 충족된다.
HDFa와는 반대로, HASMC(인간 대동맥 평활근 세포)는 동맥, 정맥, 림프관, 위장관, 호흡기계, 방광 및 기타 흥분수축결합을 하는 능력을 가진 조직들에서 발견된다. HASMC 세포와 같은 평활근이 수축할 수 있는 능력은 ATP로부터 에너지를 필요로 한다. 이러한 조직은 미토콘드리아로부터 ATP를 공급받는 낮은 에너지 모드로부터 ATP를 빠르게 생산하기 위한 해당작용으로의 전환에 이해 에너지가 공급되는 높은 에너지 모드 (운동/스트레스 동안)로 전환된다. 따라서 정상 평활근 세포는 정상적인 생리적 환경에서 필요한 에너지를 충족하기 위해 미토콘드리아 OXPHOS와 해당과정을 결합하여 사용한다.
그들의 각각의 생리적 역할의 다름 (즉, HDFa와 HASMC)는 SeaHorse XF 분석기를 이용하여 세포주에서 측정된 휴면하고 있는 OCR 값에서 관찰된다. 도면 29와 30은 생리적으로 정상적인 포도당 (약 4.6mM)과 고농도 포도당 (고혈당) 조건에서 자란 HDFa와HASMC 세포의 OCR을 설명하고 있다.
정상적으로 산소를 공급하고, 5.5mM 포도당이 있으면서, 어떠한 처리도 하지 않은 HDFa에 대한 기준치 OCR 값은 약 40 pmoles/분이다. (도면 29) 세포를 22mM 포도당에서 유지하면 이 값은 약간 상승한다. 반대로, 5.5mM 포도당이 있는 HASMC 세포의 OCR 값은 약 90 pmoles/분이며, 22mM 포도당에서 40 pmoles/분으로OCR 값은 감소한다. 따라서, 고혈당 조건에서, HDFa와 HASMC간에 다른 반응을 보이고, 더 나아가 그들 각각의 생리적 기질과 기능에 내재하는 차이를 보여주고 있다.
세포에 CoQ10을 처리하는 것은 정상 포도당 조건(5mM)에서 관찰되는 대표적 상태인 OCR의 변화와 관계가 있다. 생리적 반응의 복잡함은 낮은 산소분압에 있을 때 악화된다. 따라서 CoQ10을 처리하는 것은 특정 세포에 있어 원래 생리학적 상태로 돌아가려는 정상세포의 OCR 비율의 변화와 관련되어 있다.
표 53은 HDFa세포에서 CoQ10이 있을 때와 없을 때, 산소정상상태와 저산소상태일 때, 포도당이 5.5mM일 때와 22mM일 때 ECAR값 (mpH/분)을 보여준다. 정상세포에서 CoQ10을 처리하면 ECAR값에 최소한의 영향을 주지만 OCR에는 영향을 주는 것을 관찰할 수 있다. 높은 포도당과 저산소상태에서 CoQ10을 처리하면, 정상산소상태에서 처리하지 않았을 때 관찰되는 값보다 증가된 ECAR을 낮춰주는 것과 관련되어 있다.
Figure 112011097936842-pct00069
표 54에서, HASMC세포에서 측정된 ECAR 기준치 값 (mpH/분)이 HDFa의 기준치 값보다 높은 것을 알 수 있다. 저산소상태로의 유도는 아마도 증가된 해당작용에 대한 이차적인 산성혈증을 유도하는 세포내 저산소증과 관련된 ECAR의 증가를 야기한다.
Figure 112011097936842-pct00070
CoQ10처리는 산소정상상태의 정상 포도당 조건에서 관찰되는 값으로 향해가는 저산소상태의 고혈당 조건의 HASMC세포에서 ECAR비율의 하향적 경향과 관련되어 있다. 이러한 자료는 특정세포의 생리적 역할에 대해 내재된 생리적 변수의 존재와 CoQ10을 처리하였을 때 정상으로 향해서 움직이는 비정상 조건에서 (고혈당조건) 관찰되는 변화를 보여준다.
반대로, 암세포 (즉, MCF-7, PaCa-2)는 배양에서 유지하기 위한 해당과정 현상 때문에 내재적으로 정상세포에 비해 높은 수준의 포도당에서 배양될 수 있도록 준비되어 있다. CoQ10처리는 OCR 값에서 지속적인 감소를 유발한다. (도면 31과 도면 32)
MCF-7과 PaCa-2세포에서 OCR 값에 대한 CoQ10의 영향은 정상적인 HDFa와 HASMC세포에 대한 것과 유사하고, 그점에서 다양한 반응은 암세포의 각각의 대사성 프로파일에 근거한 치료적 반응을 연상시킨다.
Figure 112011097936842-pct00071
표 55는 PaCa-2세포에서의 ECAR값을 나타낸다. 정상세포와는 달리, 암세포는 현상적으로 ATP 생성(증가된 해당작용)을 위해 많은 포도당을 사용하도록 준비되어 있고, 이것은 21 mpH/분이라는 높은 ECAR로 나타난다 (표 55, 산소정상상태의 포도당 17mM의 치료하지 않은 그룹의 ECAR). CoQ10처리는 이러한 조건에서 ECAR비율의 유의한 감소를 만들어내고 아마도 젖산을 생산하는 해당과정의 감소와 연관이 있다. 이러한 세포에서의 OCR의 관련된 감소는 미토콘드리아의 OXPHOS의 증가된 효율과 관련되어 있다.
HAEC (정상 인간 대동맥 내피세포), MCF-7(유방암 세포), HepG2 (간암세포) 및 높은 전이성을 가진 PC-3(전립선암 세포) 세포주와 같은 다양한 정상세포와 암세포에서 OCR와 ECAR 값을 비교하였다. (자료를 보이지 않음). 실험한 모든 세포주에서 스트레서(고혈당, 저산소증, 젖산)가 있거나 없는 상태에서 CoQ10의 처리한 것은 정상 생리 조건에서 정상세포에서 관찰되는 대표적인 값인 OCR과 ECAR 값으로 이동하려는 것과 관련이 있다. 따라서, 세포사를 포함한 암세포에 CoQ10을 처리하는 전반적인 효과는 단백질적, 유전자적, 대사성 결과와 함께 해당과정부터 미토콘드리아 OXPHOS까지의 세포적 생물에너지학의 이동에 총체적으로 영향을 주는 후속효과이다.
실시예 23: CoQ10 생합성에 대한 빌딩블럭 분자
본 예에서는 벤조퀴논 링의 생합성에 대한 전구물질, 이소프레노이드 반복의 생합성의 전구물질 및 벤조퀴논 링의 부가물 등과 같은 ("빌딩블록 요소") CoQ10 생합성의 전구물질이 타겟세포에 각각 혹은 결합하여 들어가서 세포사멸 억제제 Bcl-2의 발현감소나 세포사멸 촉진제 카스파아제-3의 발현증가의 효과를 내는 것을 보여주고 있다. 어떠한 전구체나 그들의 결합은 세포의 증식을 억제하기도 한다. CoQ10 전구체는 CoQ10 투여에 따른 결과와 실질적으로 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것을 보여준다.
본 실험에 대한 일부 예시적 실험조건은 아래와 같다.
Skmel-28 흑색종 세포를 5% FBS와 1X 항생제를 넣은 DMEM/F12 배양액에서 키웠다. 세포를 85% 포화상태까지 키우고 빌딩블럭 요소를 3, 6, 12 및 24시간동안 처리하였다. 세포를 덩어리로 수거하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
실험에 사용한 빌딩블럭 요소로는 L-페닐알라닌, DL-페닐알라닌, D-페닐알라닌, L-티로신, DL-티로신, D-티로신, 4-하이드록시-페닐피루브산, 페닐아세트산, 3-메톡시-4-하이드록시만델산 (바닐릴만델산, VMA), 바닐린산, 4-하이드록시-벤조에이트, 피리독신, 판테놀, 메발론산, 아세틸글리신, 아세틸-CoA, 파네실 및 2,3-디메톡시-5-메틸-p-벤조퀴논 등이다.
웨스턴 블롯 분석에서, 세포는 차가운 PBS에 덩어리로 수거되어 용해되고 BCA 단백질 분석을 이용하여 단백질 수준을 정량하였다. 전체 세포 용해물을 4%로팅 12% 러닝 Tris-HCL겔에 로팅하였다. 단백질을 니트로셀루로오스 종이로 이동 시킨 후 5%의 우유 Tris버퍼 용액으로 한시간 가량 차단하였다. 단백질에 1차 항체 (Bcl-2와 카스파아제-3)에 밤새 노출시켰다. 니트로셀루로오스 종이를 피코 케미루미네센트에 5분간 노출시킨 다음 단백질 발현을 기록하였다. 노출 후, 같은 방법으로 액틴을 정량하였다. 이미지J를 이용하여 단백질 수준을 정량하였다. T-테스트를 이용하여 통계적 유의성을 분석하였다.
실험들의 실례적 결과는 아래 정리하였다.
L-페닐알라닌 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 퀴논링 구조에 대한 합성기전을 진행하기에 앞서 L-페닐알라닌은 티로신으로 전환된다. 흑색종 세포에서 세포사멸 단백질의 발현의 변화를 정량하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 시험에 사용한 농도는 5 μM, 25 μM, 그리고 100 μM 이다. L-페닐알라닌을 0.4M 페닐알라닌을 포함하고 있는 DMEM/F12 배양액에 추가하였다. 배양액에서의 5 μM, 25 μM, 그리고 100 μM의 L-페닐알라닌의 최종 농도는 각각 0.405 M, 0.425 M, 그리고 0.500 M이 되었다. 이러한 최종 농도를 Skmel-28 세포에 3, 6, 12 및 24시간 동안 배양하여 시험하였다. 세포를 80% 포화상태까지 키우고 처리배양액을 추가한 뒤, 위에 언급한 것과 같이 웨스턴 블롯 분석 절차에 따라 세포를 수거하였다. 100μM L-페닐알라닌을 3시간과 12시간 배양 시켰을 때, Bcl-2에서 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다. 5μM L-페닐알라닌에 대해서는, 6시간 배양 시켰을 때 Bcl-2에서 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다. 25μM L-페닐알라닌에 대해서는, 12시간 배양 시켰을 때 Bcl-2에서 통계적으로 유의한 감소가 그리고 카스파아제-3에서 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었다. Bcl-2의 통계적으로 유의한 감소는 세포사멸 가능성에 변화가 생긴 것을 의미하며, 카스파아제-3의 통계적으로 유의한 증가는 세포가 세포사멸 과정을 겪고 있는 것을 의미한다. 샘플 크기와 표준편차 때문에 대조군과 비교했을 때 Bcl-2의 감소 트렌드는 항상 관찰되었고 이러한 시간대의 결과는 본 실험에서 통계적으로 유의하지 않았다.
D-페닐알라닌 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 생체에서 활성을 가진 L-페닐알라닌의 화학적 합성형태인 D-페닐알라닌을 L-페닐알라닌에 비교하여 시험하였다. 세개의 농도 (5 μM, 25 μM, 그리고 100 μM D-페닐알라닌), 6시간 배양 시켰을 때 Bcl-2 발현에 유의한 감소가 관찰되었다. 5μM 과 25μM 에 대해서, 3시간 배양 시켰을 때 유의한 감소가 관찰되었다. 5μM 과 100μM 에 대해서, 6시간 배양 시켰을 때 카스파아제-3 발현에 유의한 증가가 관찰되었다.
DL -페닐알라닌 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: DL-페닐알라닌을 L-페닐알라닌에 비교하여 시험하였다. 5 μM, 25 μM, 그리고 100 μM 을 Skmel-28세포에 처리하였다. 배양 시간은 3, 6, 12 및 24시간이었다. 3시간 배양 후에, 카스파아제-3의 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었다. 24시간 배양 후에, Bcl-2의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다. 모든 다른 농도와 시간대에서 Bcl-2의 감소 경향과 카스파아제-3의 증가 경향이 관찰되었지만, 본 시험에서는 모두 통계적으로 유의하지 않았다.
L-티로신 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: L-티로신은 CoQ10의 퀴논 링 구조를 합성하는데 사용되는 빌딩블럭 요소이다. L-티로신에 대한 초기 시험에서는 웨스턴 블롯 분석을할 수 있는 충분한 단백질 농도를 나타내지 않았다. 본 실험에서 25 μM 이하의 농도를 웨스턴 블롯 분석에 시험하였다. L-티로신 디소디움 염 0.398467 M을 포함하는 DMEM/F12 배양액을 사용하였다. 초기 농도는 500 nM, 5 μM, 그리고 15 μM으로 증가되었다. 12시간 배양 후에, 500nM에서 카스파아제-3의 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었다. 24시간 배양 후에, 5μM에서 카스파아제-3의 통계적으로 유의한 증가와 Bcl-2의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다. 24시간 배양 후에, 500μM과 5μM에서도 Bcl-2의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다.
D-티로신 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: L-티로신의 화학적 합성형태인 D-티로신을 흑색종 세포에서 세포사멸적 효과를 보이는 L-티로신과 비교하여 시험하였다. L-티로신에 대한 초기 시험에 근거하여, 25 μM 이하의 농도를 웨스턴 블롯 분석에 시험하였다. 시험농도는 1μM, 5μM 및 15μM이었다. 12시간과 24시간이 지났을 때, 5μM과 15μM에서 D-티로신은 Bcl-2 발현의 감소를 보여줬다. 카스파아제-3는 5μM에서 3, 12, 24시간이 지났을 때 유의하게 증가되었다. 카스파아제-3는 1μM에서 12시간과 24시간이 지났을 때 발현이 증가되었다. 추가로 카스파아제-3는 5μM에서 12시간이 지났을 때에도 발현이 증가되었다.
DL -티로신 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: L-티로신의 화학적 합성형태인 DL-티로신을 세포에서 세포사멸적 효과를 보이는 L-티로신과 비교하여 시험하였다. 12시간 배양 이후, 1μM과 15μM에서 Bcl-2의 발현이 통계적으로 감소되었고, 24시간 배양 이후 5μM에서 Bcl-2 발현이 통계적으로 감소되었다. 12시간 배양 이후 5μM과 15μM에서 카스파아제-3의 발현이 증가되는 것을 관찰하였다.
4- 하이드록시 - 페닐피루브산 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 4-하이드록시-페닐피루브산 은 타이로산과 페닐알라닌 아미노산으로부터 생성되며 링 구조 합성에 중요한 역할을 한다. Bcl-2와 카스파아제-3의 발현을 알아보기 위해 1μM, 5μM 및 15μM의 농도를 시험하였다. 24시간의 배양 이후 5μM과 15μM에서 Bcl-2 발현의 유의한 감소를 관찰하였고, 12시간의 배양 이후, 5μM과 15μM에서 카스파아제-3 발현의 유의한 증가를 관찰하였다.
페닐아세트산 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 페닐아세트산은 링 구조에 곁사슬을 붙이는 역할을 하는 4-하이드록시-벤조에이트로 전환될 수 있다. 시험 농도는 1μM, 5μM 및 15μM 을 사용하였다. 페닐아세트산에 대해, 12시간과 24시간의 배양 이후 5μM과 15μM에서 Bcl-2 발현의 감소가 있었다. 12시간과 24시간의 배양 이후 5μM과 15μM에서 카스파아제-3 발현의 증가가 관찰되었다.
3- 메톡시 -4- 하이드록시만델산 ( 바닐릴만델산 , VMA ) 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: VMA는 CoQ10의 링 구조를 합성하는 추가적인 요소이다. 시험 농도는 100nM, 250nM, 1μM, 25μM, 50μM 및 100μM 을 사용하였다. 본 실험에서는 통계적으로 유의한 세포사멸적 효과를 관찰할 수 없었지만, Bcl-2 발현이 감소하는 경향은 관찰하였다.
바닐린산 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 바닐린산은 퀴논링 합성에 필요한 전구체로 시험 농도는 550nM, 5μM및 15μM이었다. Bcl-2와 카스파아제-3 발현을 대해 웨스턴 블롯 분석을 통해 측정하였다. 바닐린산은 24시간 배양 시킨 후 500nM과 5μM에서 Bcl-2 발현을 유의적으로 감소시켰다. 3시간 배양 시킨 후 15μM에서 Bcl-2 발현의 감소가 있었다. 15μM에서 24시간 배양 시키면, 카스파아제-3 발현이 유의적으로 증가하였다.
4- 하이드록시 - 벤조에이트 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 4-하이드록시-벤조에이트는 링 구조에 이소프레토이드 곁사슬을 붙이는 역할을 한다. 시험 농도는 500nM, 1μM및 50μM이었다. 24시간 배양 시킨 후 15μM에서 Bcl-2 발현의 유의한 감소가 있었다.
피리독신 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 피리독신은 CoQ10의 퀴논링 구조를 합성하는데 필요한 또 다른 전구체 물질이다. 시험 농도는 5μM, 25μM및 100μM이었다. 세포에서 Bcl-2와 카스파아제-3의 수준을 측정하였다. 24시간 배양 시킨 후 피리독신은 흑색종 세포에서 Bcl-2 발현을 유의적으로 감소시켰다.
판테놀 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 판테놀은 CoQ10의 퀴논링 구조를 합성하는 역할을 한다. 시험 농도는 5μM, 25μM및 100μM이었다. 판테놀은 25μM에서 Bcl-2 발현을 유의적으로 감소시켰다.
메발론산 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 메발론산은 CoQ10 합성에 주요 요소이다. 시험 농도는 500nM, 1μM, 25μM및 50μM이었다. 판테놀은 본 실험에서 Bcl-2 발현을 감소시키거나 카스파아제-3 발현을 증가시키지 않았다.
아세틸글리신 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: CoQ10을 합성하는 또 다른 방법은 이소프레노이드(곁사슬) 합성이다. 아세틸글리신을 추가하면 코엔자임A를 아세틸-CoA로 전환하고, 아세틸-CoA는 이소프레노이드 합성을 위한 메발로산 기전으로 들어간다. 시험 농도는 5μM, 25μM및 100μM이었다. 아세틸글리신은 12시간 배양 이후 5μM과 25μM에서 Bcl-2 발현을 유의적으로 감소시켰다. 24시간 배양 이후 100μM에서도 Bcl-2 발현은 유의적으로 감소하였다.
아세틸- CoA 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 아세틸-CoA는 CoQ10을 합성하는 메발로산 기전에 대한 전구체이다. 시험 농도는 500nM, 1μM, 25μM 및 50μM이었다. 아세틸-CoA는 본 실험에서 유의적으로 Bcl-2 발현을 감소시키거나 카스파아제-3 발현을 증가시키지 않았다.
파네실 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: L-티로신은 CoQ10의 퀴논링 구조의 합성에 필요한 전구체 중 한 요소이다. 이전 실험에서 L-페닐알라닌과 L-티로신이 들어있는 배양액에서 L-티로신의 반응을 실험하였다. 이 실험에서 L-페닐알라닌과 L-티로신을 추가하지 않은 배양액에 대한 L-티로신도 살펴보았다. 이 실험에서 사용된 L-티로신의 농도는 500 nM, 5 μM, 그리고 15 μM이었다. 파네실은 50μM에서 실험되었다. 3시간과 6시간 째에서 유의한 반응이 관찰되지 않았다.
파네실과 배합된 L-페닐알라닌 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 퀴논링 구조의 합성에 필요한 전구체인 L-페닐알라닌은 L-티로신과 L-페닐알라닌이 없는 배양액에 프라네실과 함께 처리하여 실험하였다. Bcl-2와 카스파아제-3의 발현을 분석하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 최종 L-페닐알라닌의 농도는 5 μM, 25 μM, 그리고 100 μM을 사용하였다. 파네실은 50μM을 사용하여 추가하였다. 본 실험에서 아래 표에 설명된 것과 같이 대부분의 농도와 병용한 실험에서 Bcl-1 발현이 감소되는 것을 확인하였다.
Figure 112011097936842-pct00072
4- 하이드록시 - 벤조에이트와 벤조퀴논의 병용에 대한 세포 증식 분석: 본 실험은 서로 다른 빌딩블록 분자를 병용하여 세포의 증식에 미치는 효과를 알아보기 위해 세포 증식 분석을 수행한 결과이다.
첫 번째 실험은 4-하이드록시-벤조에이트와 벤조퀴논을 병용한 효과를 살펴보았다. 살아있는 세포에 대해 세포수를 계산한 후에 세포를 48시간 동안 배양하였다. 각 실험군은 대조군과 비교하였으며, 각 병용그룹은 벤조퀴논 처리 대조군과 비교하였다. 화합물은 벤조퀴논 추가에 대해 통계적으로 분석되었다. 다음 표에 세포 수 계산 결과를 요약하였으며 X 표시는 세포수가 통계적으로 감소한 것을 의미한다.
Figure 112011097936842-pct00073
4-하이드록시-벤조익과 벤조퀴논을 병용한 세포에서 세포수의 유의한 감소가 일어났다. 4-하이드록시-벤조에이트 50μM과 벤조퀴논 70μM을 병용하면, 벤조퀴논 단독으로 처리한 것에 비해 유의한 세포수 감소가 있었다. 이것은 이러한 분자비에 대해 상승적인 효과를 의미한다.
추가적인 분자비에 대한 추가 시험을 수행하였다. 첫 번째로 4-하이드록시-벤조익의 농도를 500 nM, 1 μM, 그리고 50 μM로 실험하였다. 이러한 농도는 2,3-디메톡시-5-메틸-p-벤조퀴논(벤조)와 병용하여 시험되었다. 벤조의 농도는 25 μM, 50 μM, 그리고100 μM을 실험하였다. 흑색종 세포를 80% 포화상태로 키우고 6웰 플레이트에 웰당 40K 세포 수만큼 나누어 심었다. 세포에 CoQ10, 4-하이드록시벤조에이트, 벤조 그리고 4-하이드록시벤조에이트/벤조 병용을 처리하였다.
T-테스트를 p<0.05를 통계적 유의성으로 삼고 수행하였다. X 표시는 세포수가 통계적으로 감소한 것을 의미한다.
Figure 112011097936842-pct00074
HB를 포함하는 배양액을 처리하면 세포의 증식이 유의하게 감소한다. 더구나 HB와 벤조퀴논을 병용처리하면 벤조퀴논만 단독으로 처리한 농도군과 비교하여 세포수가 유의하게 감소한다.
신생아 섬유아세포에 대해 세포 증식 분석을 수행하였다. 처리한 HB 농도는 500 nM, 5 μM, 그리고 25 μM이다. HB와 병용하여 벤조퀴논을 25 μM, 50 μM, 그리고 100 μM 농도로 처리하였다. 흑색종 세포를 웰당 40K 세포수로 심은 후에 24시간 동안 처리하였다. 세포에 트립신을 처리하고 콜터카운터로 세포수를 정량하였다.
섬유아세포에서는 통계분석결과 유의한 감소를 보여주지 않았다. 이것은 정상 세포에서 독성이 최소이거나 아예 없다는 것을 나타낸다.
페닐아세테이트와 벤조퀴논의 병용에 대한 세포 증식 분석: 페닐아세테이트는 4-하이드록시-벤조익산(링 구조의 붙임을 촉진한다)의 합성을 위한 전구체이다. 페닐아세테이트를 CoQ10과 벤토퀴논과 함께 병용하여 배양 시켰을 때의 영향을 분석하기 위해 세포 증식 분석을 수행하였다.
페닐아세테이트와 벤조퀴논을 병용하였을 때 세포성 증식을 유의하게 감소시켰다. CoQ10과 벤조퀴논을 함께 배양 했을 때와 비교해 CoQ10과 페닐아세테이트를 병용하였을 때 유의하게 세포 수를 감소시켰다.
Figure 112011097936842-pct00075
4- 하이드록시 - 벤조에이트와 파네실의 병용에 대한 세포 증식 분석: 4-하이드록시-벤조에이트를 파네실과 병용하여 배양 시켰다. 결과는 아래 정리하였다. 4-하이드록시벤조에이트 그룹은 대조군과 하르네실 대조군 그룹과 비교하였다. X 표시는 세포수가 통계적으로 감소한 것을 의미한다.
Figure 112011097936842-pct00076
L-페닐알라닌과 벤조퀴논의 병용에 대한 세포 증식 분석: L-페닐알라닌과 벤조퀴논의 병용을 시험하기 위해 세포증식분석을 수행하였다. L-페닐알라닌을 대조군과 벤조퀴논 대조군과 비교한 결과를 아래 정리하였다. X 표시는 통계적으로 감소한 것을 의미한다.
Figure 112011097936842-pct00077
L-페닐알라닌과 벤조퀴논을 병용한 것에 대한 유사한 상승적 역할을 관찰하였다.
L-페닐알라닌과 파네실의 병용에 대한 세포 증식 분석: L-페닐알라닌을 파네실과 함께 배양한 것에 대한 세포 증식에 대한 결과이다. L-페닐알라닌을 대조군과 파네실 대조군 그룹과 비교하였다. X 표시는 세포수가 통계적으로 감소한 것을 의미한다.
Figure 112011097936842-pct00078
L-티로신과 벤조퀴논의 병용에 대한 세포 증식 분석: 세포수를 센 뒤 L-티로신을 벤조퀴논과 함께 배양 시켰다. 대조군과 벤조퀴논 대조군 그룹과 비교하였다.
Figure 112011097936842-pct00079
벤조퀴논의 추가는 L-티로신의 세포수에 대한 효과를 증폭시키지 않는다.
L-티로신과 벤조퀴논의 병용에 대한 세포 증식 분석: L-티로신과 파네실의 병용에 대해 점검하였다. 대조군과 파네실 대조군 그룹과 비교하였다.
Figure 112011097936842-pct00080
L-티로신과 파네실의 병용은 본 실험에서 세포 수를 감소시키는 상승적인 효과를 보이지 않았다.
CoQ10의 합성은 2개의 주요 부분으로 나뉘는데, 링 구조를 합성하는 것과 곁사슬 구조를 합성하는 것이다. 여기서 종양학적 세포에 곁사슬 합성에 필요한 전구체들과 링 구조 요소를 함께 처리하였다. 본 결과는 링 구조 합성에 관여하는 3개의 주요 요소와 링 구조를 곁사슬 구조에 붙이는 역할을 하는 2개의 요소에 집중하였다. Bcl-2의 유의한 감소와 카스파아제-3의 유의한 증가를 보여주는 3가지 요소는 (1) L-페닐알라닌 (2) L-티로신 (3) 4-하이드록시페닐피루브산이다. 곁가지를 링 구조에 붙이는데 관련된 2가지 요소는 (1) 4-하이드록시벤조에이트와 (2) 페닐아세테이트이다.
본 결과는 이러한 요소들을 2,3-디메톡시-5-메틸-p-벤조퀴논(벤조퀴논)과 함께 병용하여 외부에서 처리하였을 때 세포 증식을 유의하게 억제하는 것을 보여준다. 이것은 링 구조와 함께 벤조퀴논 링에 곁사슬을 붙이는 요소를 함께 보조하면 손상된 CoQ10 합성기전을 보충할 수 있는 것을 가리킨다.
균등물:
이 기술분야의 기술자는 단지 일과적인 실험을 사용하여, 여기 기재된 특정 실시양태 및 방법에 대한 많은 균등물을 알아낼 수 있거나 인식할 것이다. 이러한 균등물은 하기 특허청구항의 범위에 포함되는 것이 의도된다.

Claims (65)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 개체에서 종양학적 장애를 치료하기 위한 코엔자임 Q10 (CoQ10)의 효능을 평가하는 방법으로서,
    (1) 상기 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 적어도 하나의 마커의 발현 수준을 결정하는 단계로서, 여기에서, 상기 생물학적 시료는 CoQ10에 노출되었으며, 그리고, 상기 적어도 하나의 마커는 APAF1, BAX, Calmodulin, CCT3, CTSD, GRB2, 열충격 (Heat Shock) 단백질 110, GRP78 Bip, IDH-1, 호중구 시토졸 인자 2(neutrophil cytosolic factor 2), PDIA3, PECAM1, PRDX4, PSME3, RAB7, SOD3, 및 SRXN1으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 마커들 중 하나인 단계; 및
    (2) 상기 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 적어도 하나의 마커의 발현 수준과 대조군 시료에 존재하는 적어도 하나의 마커의 발현 수준을 비교하여 비교 결과를 수득하는 단계
    를 포함하고, 여기서, CoQ10에 대한 노출 결과로서, APAF1, BAX, Calmodulin, GRB2, 열충격 단백질 110, GRP78 Bip, IDH-1, 호중구 시토졸 인자 2 또는 PDIA3에서의 증가가 검출되거나, CCT3, CTSD, PECAM1, PRDX4, PSME3, RAB7, SOD3, 또는 SRXN1에서의 감소가 검출되는 경우 CoQ10이 종양학적 장애를 치료하기 위해 효과적인 것으로 결정되는, 방법.
  2. 하기의 단계를 포함하는, 개체가 CoQ10 반응성 상태 중의 종양학적 장애를 가지고 있는지의 여부를 평가하는 방법으로서,
    (1) 상기 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 적어도 하나의 마커의 발현 수준을 결정하는 단계로서, 여기에서, 상기 개체로부터 수득한 생물학적 시료는 CoQ10에 노출되었으며, 그리고, 상기 적어도 하나의 마커는 APAF1, BAX, Calmodulin, CCT3, CTSD, GRB2, 열충격 (Heat Shock) 단백질 110, GRP78 Bip, IDH-1, 호중구 시토졸 인자 2, PDIA3, PECAM1, PRDX4, PSME3, RAB7, SOD3, 및 SRXN1으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 마커들 중 하나인 단계; 및
    (2) 상기 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 적어도 하나의 마커의 발현 수준과 대조군 시료에 존재하는 적어도 하나의 마커의 발현 수준을 비교하여 비교 결과를 수득하는 단계
    를 포함하고, 여기서, CoQ10에 대한 노출 결과로서, APAF1, BAX, Calmodulin, GRB2, 열충격 단백질 110, GRP78 Bip, IDH-1, 호중구 시토졸 인자 2 또는 PDIA3에서의 증가가 검출되거나, CCT3, CTSD, PECAM1, PRDX4, PSME3, RAB7, SOD3, 또는 SRXN1에서의 감소가 검출되는 경우, 상기 개체가 CoQ10 반응성 상태 중의 종양학적 장애를 가지고 있는 것으로 결정되는, 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 종양학적 장애는 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 흑색종(melanoma), 암종(carcinoma) 또는 육종(sarcoma)인, 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 시료는 개체로부터 수득된 액체(fluid)를 포함하는, 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 액체는 혈액(blood fluid), 구토(vomit), 침(saliva), 림프(lymph), 포낭액(cystic fluid), 요(urine), 기관지 세척(bronchial lavage)에 의해 수거된 액체, 복막 세척(peritoneal rinsing)에 의해 수거된 액체, 또는 부인과 액체(gynecological fluid)인, 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 시료는 혈액 시료 또는 그것의 구성요소(component)인, 방법.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 시료는 개체로부터 수득한 조직 또는 그것의 구성요소(component)를 포함하는, 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 조직은 뼈, 연결조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육조직, 심장, 췌장, 또는 피부인, 방법.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 개체는 인간인, 방법.
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 생물학적 시료에 있는 적어도 하나의 마커의 발현 수준은 시료에 있는 전사된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 일부분을 검사함으로써 결정되는, 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 전사된 폴리뉴클레오티드를 검사하는 것은 상기 전사된 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 개체 시료에 있는 적어도 하나의 마커의 발현 수준은 시료에 있는 단백질 또는 그것의 일부분을 검사함으로써 결정되는, 방법.
  13. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단백질은 상기 단백질과 특이적으로 결합하는 시약(reagent)을 사용하여 검사하는, 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 시약은 표지된 것인, 방법.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 시약은 항체 또는 항원-결합 항체 단편인, 방법.
  16. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 시료에 있는 적어도 하나의 마커의 발현 수준이 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction;PCR) 증폭 반응(amplification reaction), 역전사효소 PCR 분석(reverse-transcriptase PCR analysis), 단일가닥 구조 다형성(single-strand conformation polymorphism; SSCP), 미스매치절단 탐지(mismatch cleavage detection), 이형이중체 분석(heteroduplex analysis), 서던 블롯 분석(Southern blot analysis), 노던 블롯 분석(Nothern blot analysis), 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis), 인시추 혼성화(in situ hybridization), 어레이 분석(array analysis), 데옥시리보핵산 서열 시퀀싱(deoxyribonucleic acid sequencing), 제한 단편 길이 다형성 분석(restriction fragment length polymorphism analysis), 그리고 이들의 조합(combination) 또는 서브조합(sub-combination)으로 구성된 군으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정되는, 방법.
  17. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 시료에 있는 적어도 하나의 마커의 발현 수준이 면역조직화학법(immunohistochemistry), 면역세포화학법(immunocytochemistry), 세포 유동분석기(flow cytometry), ELISA 또는 질량 분석(mass spectrometry)을 사용하여 결정되는, 방법.
  18. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 다수의 상기 마커의 발현 수준이 결정되는, 방법.
  19. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 마커는 APAF1, BAX, Calmodulin, GRB2, 열충격 단백질 110, GRP78 Bip, IDH-1, 호중구 시토졸 인자 2 또는 PDIA3인, 방법.
  20. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 마커는 CCT3, CTSD, PECAM1, PRDX4, PSME3, RAB7, SOD3 또는 SPXN1인, 방법.
  21. 종양학적 장애를 갖는 대상체에서 종양학적 장애를 치료하기 위한 CoQ10의 효능을 평가하기 위한 키트로서, 상기 키트는 APAF1, BAX, Calmodulin, CCT3, CTSD, GRB2, 열충격 (Heat Shock) 단백질 110, GRP78 Bip, IDH-1, 호중구 시토졸 인자 2, PDIA3, PECAM1, PRDX4, PSME3, RAB7, SOD3, 및 SRXN1으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 종양학적 장애를 갖는 개체에서 종양학적 장애를 치료하기 위한 CoQ10의 효능을 평가하기 위하여 키트의 사용을 위한 설명서를 포함하는, 키트.
  22. 제 21항에 있어서, 개체로부터 생물학적 시료를 수득하기 위한 수단을 추가로 포함하는 키트.
  23. 제 21항에 있어서, 대조군 시료를 추가로 포함하는 키트.
  24. 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 수단은 시료에 있는 전사된 폴리뉴클레오티드 (transcribed polynucleotide) 또는 그것의 일부분을 검사하기 위한 수단을 포함하는, 키트.
  25. 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 수단은 시료에 있는 단백질 또는 그것의 일부분을 검사하기 위한 수단을 포함하는, 키트.
  26. 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, CoQ10을 추가로 포함하는 키트.
  27. 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 다수의 마커의 발현 수준을 결정하는 시약을 포함하는, 키트.
  28. 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 마커는 APAF1, BAX, Calmodulin, GRB2, 열충격 단백질 110, GRP78 Bip, IDH-1, 호중구 시토졸 인자 2 또는 PDIA3인, 키트.
  29. 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 마커는 CCT3, CTSD, PECAM1, PRDX4, PSME3, RAB7, SOD3 또는 SPXN1인, 키트
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