WO2014181968A1

WO2014181968A1 - 메트포민과 코엔자임 q10을 유효성분으로 함유하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: WO2014181968A1
Application number: PCT/KR2014/003084
Authority: WO
Inventors: 조미라; 박민정; 이선영; 이성희; 양은지; 손혜진; 정정희; 전주연
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-05-09
Filing date: 2014-04-09
Publication date: 2014-11-13

Abstract

본 발명은 면역반응의 이상으로 유발되는 면역질환을 예방 또는 치료하는데 사용되는 메트포민과 코엔자임 Q10을 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 메트포민과 코엔자임 Q10의 병용 투여는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-17, IFN-γ 및/또는 IL-1b의 발현을 억제시키는 효과가 있고, 관절염 유도 동물모델에서 파골세포 분화를 감소시키거나, 염증성 세포의 침윤을 억제시키는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 염증성 장질환으로 야기되는 몸무게 감소를 개선하는 효과를 갖고 있고, 병인 B 세포의 IgG의 활성을 조절하는 효과를 갖고 있으며, 염증성 사이토카인의 발현을 억제시키고, Foxp3+ Treg의 활성을 증진시키는 효과가 우수한 바, 염증성 장질환, 루푸스, 이식편대숙주병 등의 다양한 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

메트포민과 코엔자임 Q10을 유효성분으로 함유하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물

본 발명은 면역반응의 이상으로 유발되는 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료제로서 메트포민(Metformin)과 코엔자임 Q10을 모두 유효성분으로 함유하는 면역질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

전 세계적으로 면역과민반응으로 인한 질환이 증가하고 있지만, 이러한 질환들의 발생에 대한 근본적인 원인 규명이 충분히 이루어지지 않은 상태이다. 현재 과도한 면역반응에 의한 질환의 치료방법으로는 면역억제제를 단독 또는 병용 투여함으로써 상기 질환에 의해 야기되는 각종 증상을 완화 내지 감소시키는 것이다.

면역억제제란 항원의 작용에 대하여 숙주가 항체를 만드는 능력(체액성 면역반응) 또는 세포성 면역반응을 일으키는 능력을 저하시키거나 차단하기 위해 사용되는 다양한 물질들을 말한다. 이러한 면역억제제는 장기이식분야 뿐만 아니라 루푸스, 류마티스 관절염 등과 같은 자가면역질환과, 아토피, 알러지 등의 피부과민 반응에도 유용하게 사용될 수 있다. 우수한 면역억제제는 면역반응의 불균형을 조절할 수 있어야 하고, 인체에 대한 안전성이 확보되어야 하며, 장기간 치료시에 질환의 재발 발생 빈도가 낮아야 한다. 현재 사용되고 있는 면역억제제로는 사이클로스포린 A와 FK506 등이 있는데, 이들은 복잡한 화학구조를 가진 천연물 유래의 화합물로서 원료 수급의 측면에서 고비용이 드는 문제점이 있어 비경제적이고, 장기투여로 인해 각종 부작용이 야기될 수 있다는 위험성을 내포하고 있다. 따라서 낮은 독성 및 면역관용 유도와 함께 경제적인 생산이 가능한 새로운 면역억제제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

한편, 각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다. 따라서 면역질환의 대부분은 이러한 두 가지 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.

또한, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하고자 하는 연구들이 많이 진행되고 있다. 또한, Treg 세포 이외에 T 세포의 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만, Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다. Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.

현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다. 또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다(대한민국 공개특허공보 제2012-0017465호; 대한민국 공개특허공보 제1995-7002117호).

이에 본 발명에서는 효과적인 면역질환 치료를 위한 방법으로, 메트포민 및 코엔자임 Q10을 병용으로 사용할 경우, 효과적으로 면역질환을 치료할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 메트포민 및 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 면역질환이 유발된 개체에 메트포민 및 코엔자임 Q10을 병용 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 치료방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 메트포민 및 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 조성물은 메트포민 0.1 내지 20㎎ 및 코엔자임 Q10 0.001 내지 10㎎의 양으로 포함될 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 조성물은 파골세포 분화를 감소시키거나, 염증성 세포의 침윤을 억제할 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 조성물은 염증성 사이토카인인 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6, IL-17, IFN-γ 및/또는 IL-1b의 발현을 감소 또는 억제시킬 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 조성물은 소장의 두께 및 대장의 길이를 정상상태와 같이 유지시키는 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 조성물은 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg) 및/또는 조절 B 세포(Regulatory B cell: Breg)의 활성을 촉진 또는 증가시킬 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 조성물은 염증으로 인해 감소된 미토콘드리아(mitochondria)의 양을 증가시키고, 미토콘드리아 막의 손상을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 면역질환은 베체트병, 다발성 근육염 또는 피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 미토콘드리아 관련 증후군 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 면역질환이 유발된 개체에 메트포민 및 코엔자임 Q10을 병용 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 치료방법을 제공한다. 상기 개체는 특별히 제한되지 않으나, 포유동물인 것이 바람직하고, 인간을 제외한 표유동물인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 메트포민은 0.1∼20㎎/㎏, 코엔자임 Q10는 Q10 0.001∼10㎎/㎏으로 동시에 개체에 투여할 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 투여는 메트포민과 코엔자임 Q10이 함께 함유된 복합제의 형태로 투여하거나, 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 개별적으로 동시에 투여할 수 있다.

나아가 본 발명은 메트포민 0.1∼20㎎ 및 코엔자임 Q10 0.001∼10㎎을 포함하는 면역질환 치료용 복합제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 메트포민 및 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 병용 투여하였을 때 이들을 각각 투여한 군에 비해 다양한 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 규명함으로써, 이들 성분을 함유한 복합제를 면역질환을 치료하기 위한 효과적인 치료제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 특히 본 발명의 조성물에 함유된 이들 유효성분 중 메트포민은 종래 당뇨 치료제로 사용되고 있는 화합물인 반면, 면역질환 치료제로 사용 가능함이 연구된 바 없었고, 코엔자임 Q10은 항산화제로 알려져 있지만 본원에서 규명한 것과 같이 메트포민과 복합제로 사용할 경우, 효과적인 면역질환 치료제로 사용할 수 있다는 내용이 알려진 바 없다. 각기 다른 치료제로 알려진 약물이라 할지라도 이들을 복합제로 사용하는 경우, 서로 다른 약물을 혼합할 경우, 예상치 못한 화학 반응물이 생성될 수 있고 이로 인한 각종 부작용 및 세포 독성을 유발할 수 있는 문제점이 있어 복합제제에 대한 치료제 신약에 대해서는 그에 따른 약리 효과 및 독성 평가가 실험을 통해 입증되어야 한다. 이러한 점에서 본 발명은 메트포민 및 코엔자임 Q10을 함께 함유하는 복합제가 세포에 독성을 유발시키지 않고 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 대장암, 미토콘드리아 이상 증후군 등 다양한 면역질환 치료에 효과적이며 세포 독성을 유발시키지 않음을 실험을 통해 입증할 수 있었다.

본 발명에 따른 한 구현예에 따르면, 관절염 유도 마우스 모델을 대상으로 메트포민과 코엔자임 Q10을 함께 처리한 경우, 파골세포 분화를 감소시키고, 염증성 세포의 침윤을 효과적으로 억제하여 류마티스 관절염에 효과가 있음을 확인할 수 있었고, T 세포의 이식거부반응을 억제하고 염증성 사이토카인인 IFN-γ와 IL-17의 발현을 감소시키며 Fox3+ Treg의 발현을 증가시켜 이식편대숙주병의 예방 또는 치료용 조성물로 활용할 수 있음을 규명하였다.

또한, 본 발명자들은 메트포민 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 코엔자임 Q10을 병용 투여하였을 때 염증성 장질환 유도 동물 모델의 몸무게가 효과적으로 개선되고 HT-29 대장암 세포주에서 신생혈관 촉진 및 염증 촉진에 관여하는 VEGF를 효과적으로 억제하여 염증성 장질환(IBD)에 효과가 있음을 규명하였다.

또한, 본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 투여하였을 때 IgG 생성을 조절하는 효과를 발휘하여 루프스의 예방 또는 치료용 조성물로 활용할 수 있음을 규명하였다.

또한, 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 투여하였을 때 염증반응과정에서 감소된 미토콘드리아의 양을 증가시키고, 미토콘드리아 막(mitochondria membrane)의 손상을 억제시켜 미토콘드리아 관련 증후군의 예방 또는 치료용 조성물로 활용할 수 있음을 규명하였다.

따라서, 본 발명에 따른 메트포민 화합물과 코엔자임 Q10을 함유한 복합제를 다양한 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물로 활용할 수 있음을 알 수 있었고 다음과 같은 실험을 수행하였다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 콜라겐 유도 관절염동물모델군과 SKG 관절염 유도 동물모델군에서 관절염지수 및 질병발병 정도가 메트포민 및 코엔자임 각각 단독 투여에 의해 유의하게 개선되었으며, 이들을 병용 투여 시 단독 투여에 비해 효과가 현저히 개선되는 것으로 관찰되었다(도 1 및 도 7 참조).

본 발명의 다른 한 구현예에 따르면, 콜라겐 유도 관절염동물모델군과 SKG 관절염 유도 동물모델군에서 조직학적 검사를 한 결과, 메트포민 및 코엔자임 각각 단독 투여에 의해 관절과 연골의 파괴 정도가 개선되었으며, 이들을 병용 투여 시 단독 투여에 비해 효과가 현저히 개선되는 것으로 관찰되었다(도 2 및 도 8 참조).

본 발명의 다른 한 구현예에 따르면, 콜라겐 유도 관절염동물모델군과 SKG 관절염 유도 동물모델군에서 혈청학적 검사를 한 결과, 메트포민 및 코엔자임 각각 단독 투여에 의해 혈청 내 IgG의 발현이 억제되었으며, 이들을 병용 투여 시 단독 투여에 비해 효과가 현저히 개선되는 것으로 관찰되었다(도 3a 및 도 9 참조).

본 발명의 한 구현예에 따르면, 콜라겐 유도 관절염동물모델군과 SKG 관절염 유도 동물모델군에서 T세포 발현을 확인한 결과, 메트포민 및 코엔자임 각각 단독 투여에 의해 병인세포인 Th1과 Th17의 활성은 감소되고 Treg 세포가 증가되었으며, 이들을 병용 투여 시 단독 투여에 비해 효과가 현저히 개선되는 것으로 관찰되었다(도 4, 도 11a 및 도 11b 참조).

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 메트포민 화합물과 코엔자임 Q10을 병용 투여하여 다양한 기작에 의해 발병되는 관절염을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 이식거부반응에서 메트포민과 코엔자임 Q10 병용 처리에 의한 이식거부반응(alloresponse) 조절 효과에 대해서도 실험해 보았는데, 그 결과 메트포민과 코엔자임 Q10의 병용 처리에 의해 T 세포에 의한 이식 거부반응이 억제되고, 염증성 사이토카인인 IFN-γ, IL-17이 현저히 감소하며, Foxp3+ Treg 세포의 활성이 증가되는 것을 확인하였다(도 12a 내지 도 12d 참조).

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 메트포민 화합물과 코엔자임 Q10을 병용 투여하여 이식편대숙주병을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

본 발명자들은 염증성 장질환 유도 동물모델에서 체중 및 DAI 측정을 한 결과, 메트포민 단독 투여에 의해 체중이 감소하였고, 염증성장질환의 병증을 측정할 수 있는 DAI 점수에서도 병증이 개선되었으며, 코엔자임 Q10을 추가로 투여하였을 때 단독 투여에 비해 효과가 현저히 개선되는 것으로 관찰되었다(도 13 참조).

본 발명의 한 구현예에 따르면, HT-29 대장암 세포주에서 신생혈관 촉진 및 염증 촉진에 관여 하는 VEGF를 측정한 결과, 메트포민 단독 투여에 의해 VEGF 발현량이 감소하였으며, 코엔자임 Q10을 추가로 투여하였을 때 단독 투여에 비해 효과가 현저히 개선되는 것으로 관찰되었다(도 15 참조).

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 메트포민 화합물과 코엔자임 Q10을 병용 투여하여 염증성장질환을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

한편, 미토콘드리아는 다른 세포소기관과는 달리 독자적인 genome DNA와 이로부터 미토콘드리아 기능 조절 및 유지에 필수적인 단백질과 tRNA 등을 생산하는 독자적인 유전자 전사 및 번역체계를 갖추고 있는 기관으로 알려져 있다. 미토콘드리아 기능장애는 ATP 생산을 감소시키고, 활성산소 예를들면, 수퍼오사이드, 퍼옥시나이트라이트, 하이드록시 라디칼, 과산화수 등의 생성을 증가시키고, 칼슘의 항상성을 파괴시키며, 그리고 세포사멸인자를 방출하게 된다. 활성산소에 의한 지질과산화(lipid peroxidation)는 퇴행성 질환과 허혈성 질환에서 나타나는 중추신경계 손상의 중요 원인으로 알려져 있다. 또한, 미토콘드리아의 기능장애는 다양한 세포에서 세포사멸로 이끄는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 신경세포를 포함하는 다양한 셀에서는 미토콘드리아 막전위의 감소, 즉 미토콘드리아 기능장애의 징조는 핵 DNA 분해를 통한 세포사멸을 일으킨다. 아울러, 미토콘드리아 기능이상이 노화과정 및 노화와 관련된 여러 질환들(암과 당뇨 등의 중요 만성질환, 순환기, 호흡기, 내장 및 내분기계 등의 중요장기의 기능 이상, 퇴행성 신경질환)의 발생 및 악화과정에 중요한 역할을 한다는 연구보고가 계속되고 있으나 아직까지 어떠한 기전에 의해서 질환을 유발하는지, 어떠한 방법으로 치료해야되는 지 등 구체적인 연구는 미미한 실정이다.

따라서 본 발명자들은 Th17/IL-17 사이토카인이 세포의 염증을 촉진하고 병인을 증가시키는 기전에서는 미토콘드리아 기능의 변이를 유발하여 면역질환을 더욱 악화시킨다는 사실을 발견하였고, 이를 개선하기 위하여 다양한 연구를 진행하던 중 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리가 미토콘드리아 기능 변이를 막을 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아의 막전위 변화를 조사하기 위하여 JC-1 염색을 한 결과, 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 단독 처리하였을 때에 미토콘드리아 막 전위변화가 증가되었음을 알 수 있었으나, 이들을 병용 처리하였을 때는 각각 단독으로 처리하였을 때보다 미토콘드리아 막 전위변화가 가장 많이 증가되어 red 형광을 더 많이 띰을 알 수 있었다(도 23a 참조).

본 발명의 한 구현예에 따르면, 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아의 양 변화를 확인한 결과, IL-17 10ng 처리 군에서는 IL-17에 의해서 손상을 받아 미토콘드리아 양이 감소되었으나, 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 처리한 군에서는 감소된 미토콘드리아의 양이 증가하였음을 알 수 있었으며, 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 투여한 군에서는 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 처리한 군보다 감소된 미토콘드리아의 양이 월등히 증가하였음을 알 수 있었다(도 23b 참조).

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 메트포민 화합물과 코엔자임 Q10을 병용 투여하여 미토콘드리아 관련 증후군을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 메트포민 화합물과 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있으며, 메트포민 화합물과 코엔자임 Q10 화합물은 각각의 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 메트포민 화합물과 코엔자임 Q10은 천연으로부터 분리되거나 본 기술분야에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 메트포민 화합물과 코엔자임 Q10만을 유효성분으로 사용하여도 되지만, 이외에도 비타민 C,D, 레티노이드(Retinoid), 레티노익산(retinoic acid), EGCG, 카테킨(catechin), 타닌(tannin), 폴리페놀(polyphenol), UDCA, 피리미딘(pyrimidine), 퀴놀론(quinolones), 퀘르세틴 화합물 등을 추가로 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 면역질환은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 루프스를 포함하는 자가면역질환; 염증성 장질환을 포함하는 염증성질환; 및 이식편대숙주병을 포함하는 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.

모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 갖고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다. 그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 자가면역질환이라고 한다. 또한, 염증성 질환이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α, IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

한편, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 따라서 이러한 이식면역거부반응을 감소시키기 위해 면역억제제들이 사용되고 있는데 이러한 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것이며, 최근에는 조절 T 세포를 이용하여 면역반응을 억제함으로써 이식거부질환을 치료하려는 방법이 시도되고 있다.

또한, 본 발명에서 상기 면역질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 궤양성 대장염 등을 포함할 수 있다.

그러므로 본 발명에 따른 상기 조성물은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

상기 치료란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는치료하는이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 치료 또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 면역질환을 경감시킴,

(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및

(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 메트포민 화합물 및 코엔자임 Q10의 약학적으로 유효한 양은 각각 0.1∼100㎎/day/체중㎏, 바람직하게는 0.1∼5㎎/day/체중㎏이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

본 발명의 한 구현예에서는 20g의 체중을 갖는 마우스를 대상으로 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 0.1㎎의 양으로 1:1의 중량비로 혼합 처리하여 치료 효과를 입증한 바 있으며 또한, 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 1㎎과 0.1㎎의 양, 즉 10:1의 중량비로 혼합 처리하여 치료효과를 입증한 바 있다.

따라서 본 발명에서 제공하는 면역질환 치료용 조성물을 제조하기 위해 사용할 수 있는 메트포민 화합물 및 코엔자임 Q10의 양은 각각 메트포민을 0.1 내지 20㎎ 및 코엔자임 Q10을 0.001 내지 10㎎의 양으로 함유할 수 있으며, 바람직하게는 상기 조성물에 함유된 메트포민:코엔자임 Q10는 10:1∼1:1의 중량비로 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 범위를 벗어나서 함유할 경우, 즉 상기 2가지 약물의 최소 함량 범위보다 더 적은 양으로 사용할 경우, 치료 효과가 미비하고 최대 함량 범위를 초과할 경우 더 뛰어난 치료 효과를 도출할 수 없어 경제적으로 비효율적일 수 있다. 따라서 상기 기술된 범위 내, 바람직하게는 메트포민:코엔자임 Q10을 10:1∼1:1의 중량비로 혼합하여 사용할 경우 가장 안정된 형태로 활성이 오래 유지될 수 있는 복합제를 제조할 수 있다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 표현은 생리학적으로 허용되고 인간을 포함하는 포유류에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 갖는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 메트포민 화합물 또는 그의 염과 코엔자임 Q10을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있으며, 나아가 본 발명은 메트포민 화합물 또는 그의 염과 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 미분화 T 세포에 본 발명의 화학식1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염과 코엔자임 Q10을 처리하는 단계를 포함하는 시험관내(in vitro)에서 Foxp3를 발현하는 Treg세포의 분화 및 증식을 촉진시키는 방법을 제공할 수 있다. 나아가 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 면역 조절 T 세포(Treg)의 활성 또는 증폭 효과가 우수하고, 염증성 사이토카인을 생성하는 병원성 세포인 Th1 세포 분화를 억제하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에 대해 안정한 특징이 있다.

따라서 본 발명은 메트포민 화합물 또는 그의 염과 코엔자임 Q10을 유효성분으로 함유하는 면역질환의 증상을 개선 또는 예방할 수 있는 식품용 조성물을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 상기 식품용 조성물은 면역질환 증상의 개선 또는 예방에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

본원발명에서 상기 "식품"이란 용어는 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다. 본원발명에 따른 상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 "기능성 식품"이란 표현은 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본원발명에서 상기 "음료"란 용어는 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 면역질환 증상의 개선 또는 예방용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 면역질환 증상의 개선 또는 예방을 위한 식품용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본원발명의 식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100㎖를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 메트포민과 코엔자임 Q10의 병용 투여는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-17, IFN-γ 및/또는 IL-1b의 발현을 억제시키는 효과가 있고, 관절염 유도 동물모델에서 파골세포 분화를 감소시키거나, 염증성 세포의 침윤을 억제시키는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 염증성 장질환으로 야기되는 몸무게 감소를 개선하는 효과를 갖고 있고, 병인 B 세포의 IgG의 활성을 조절하는 효과를 갖고 있으며, 염증성 사이토카인의 발현을 억제시키고, Foxp3+ Treg의 활성을 증진시키는 효과가 우수한바, 염증성 장질환, 루푸스, 이식편대숙주병 등의 다양한 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용 가능할 것이다.

도 1은 콜라겐 유도 관절염 유도 동물모델에 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 단독 또는 병용 처리 및 시중 관절염 치료약으로 판매되고 있는 엔브렐를 처리하여 이들 실험군을 대상으로 관절염지수 및 발병정도를 측정한 결과이다.

도 2는 5가지 실험군으로 나뉘어진 관절염 동물모델을 희생시킨 다음 관절세포를 분리한 후 H&E 염색을 하여 조직학적 검사를 한 결과이다.

도 3a는 5가지 실험군으로 나뉘어진 관절염 동물모델을 희생시킨 후 혈청에서의 IgG를 측정한 결과이다.

도 3b는 5가지 실험군으로 나뉘어진 관절염 동물모델을 희생시킨 후 비장세포에서의 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포 및 Breg 세포를 측정한 결과이다.

도 4는 5가지 실험군으로 나뉘어진 관절염 동물모델을 희생시킨 후 비장세포에서의 Th1, Th17 및 Treg 세포를 측정한 결과이다.

도 5는 5가지 실험군으로 나뉘어진 관절염 동물모델을 희생시킨 후 비장세포에서의 IL-6, IL-1b, TNF-α의 발현을 효소결합 면역측정법(ELISA)으로 측정한 결과이다.

도 6은 마우스 골수 세포에 M-CSF 및 RANKL를 자극한 뒤 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 단독 또는 병용 처리하여 파골세포 분화실험을 한 결과이다.

도 7은 SKG 관절염 유도 동물모델에 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 단독 또는 병용 처리 및 시중 관절염 치료약으로 판매되고 있는 엔브렐를 처리하여 이들 실험군을 대상으로 관절염지수 및 발병정도를 측정한 결과이다.

도 8은 5가지 실험군으로 나뉘어진 SKG 관절염 동물모델을 희생시킨 다음 관절세포를 분리한 후 H&E 염색을 하여 조직학적 검사를 한 결과이다.

도 9는 5가지 실험군으로 나뉘어진 SKG 관절염 동물모델을 희생시킨 후 혈청에서의 IgG를 측정한 결과이다.

도 10은 5가지 실험군으로 나뉘어진 SKG 관절염 동물모델을 희생시킨 후 비장세포에서의 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포를 측정한 결과이다.

도 11a 및 도 11b는 5가지 실험군으로 나뉘어진 SKG 관절염 동물모델을 희생시킨 후 비장세포에서의 Th1, Th2, Th17 및 Treg 세포를 측정한 결과이다.

도 12a는 메트포민 단독 처리 또는 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 처리한 군을 대상으로 이식거부질환 질병 T 세포 증식 반응을 분석한 결과이다.

도 12b 및 도 12c는 메트포민 단독 처리 또는 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 처리한 군을 대상으로 IFN-γ와 IL-17의 발현 양상을 유세포 분석기 및 ELISA로 측정한 결과이다.

도 12d는 메트포민 단독 처리 또는 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 처리한 군을 대상으로 조절 T 세포 활성을 유세포 분석기로 측정한 결과이다.

도 13은 염증성 장질환 유도 동물 모델군(IBD 마우스 모델군)에 메트포민을 단독 투여하거나 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 투여한 경우 실험동물의 무게 변화, DAI score 및 조직학적 변화를 관찰한 결과이다.

도 14는 염증성 장질환에 걸리지 않은 정상 마우스군, 염증성 장질환 유도 동물 모델인 IBD 마우스군, 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여군을 대상으로 IL-17, IL-6, TNF-α의 발현양을 관찰한 결과이다.

도 15는 HT-29 대장암 세포주에 메트포민 단독 처리 또는 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 처리한 뒤 신생혈관 촉진 및 염증촉진에 관여하는 VEGF의 발현양을 ELISA로 측정한 결과이다.

도 16은 다양한 농도의 coQ10을 단독으로 처리한 군, 메트포민을 단독으로 처리한 군 및 coQ10과 메트포민을 복합 투여한 군을 대상으로 세포독성 유무를 측정한 결과이다.

도 17a 및 도 17b는 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 염증병인 T세포(Th1, Th17) 활성을 억제하는 효과가 있는지 여부를 측정한 결과이다.

도 18은 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 염증병인 T세포의 활성을 억제하는 효과가 있는지 여부를 PCR과 ELISA로 분석한 결과이다.

도 19는 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 조절T세포 활성을 증가시키는 효과가 있는지 여부를 유세포분석 기법과 PCR 분석으로 확인한 결과이다.

도 20은 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 B 세포에서의 IgG 발현 억제 효과를 ELISA 분석을 통해 확인한 결과이다.

도 21은 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 Breg 증진 효과를 유세포기법을 이용하여 확인한 결과이다.

도 22a는 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1b, TNF-α의 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.

도 22b는 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 염증성 사이토카인인 IL-17, TNF-α의 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.

도 23a는 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아의 막전위 변화를 확인한 결과이다.

도 23b는 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아의 양을 확인한 결과이다.

도 24a는 류마티스관절염 모델에서 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아 막 전위변화를 확인한 결과이다.

도 24b는 류마티스관절염 모델에서 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아의 양을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 메트포민과 코엔자임 Q10의 병용투여에 의한 류마티스 관절염 치료 효과

본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여가 실제로 류마티스 관절염의 치료 효과가 있는지 여부를 알아보기 위하여 콜라겐으로 유도된 관절염 마우스 모델을 제조하고 하기와 같은 실험을 수행하였다. 이때 실험에 사용된 각 마우스의 무게(체중)는 20g 인 마우스를 사용하였다.

1-1. 관절염 지수 및 발병 정도 평가

관절염 마우스 모델을 제조하기 위해, DBA1/J 정상 마우스군에 type II collagen 100㎍을 CFA와 섞어서 꼬리 표피에 주입(first immunization)하여 류마티스 관절염 동물모델을 제작하였으며, 제조된 관절염 마우스 군을 대상으로 아래와 같이 약물을 투여하였다. 1주일에 5회씩 약물을 투여하였는데, 0.1㎎/mice(0.1㎎/300g)로 코엔자임 Q10만을 단독 처리하였고, 0.1㎎/mice(0.1㎎/300g)로 메트포민을 단독 처리하였으며, 메트포민 0.1㎎/mice(0.1㎎/300g) 및 코엔자임 Q10 0.1㎎/mice(0.1㎎/300g)을 함께 관절염 마우스 모델에 병용 투여하였다. 이때 상기 약물의 투여는 경구섭취(oral feeding) 시켰다. 이때 양성대조군으로 현재 시중 판매되고 있는 관절염 치료제인 상표명 엔브렐(Enbrel)을 사용하였으며, 1회 투여시 100㎍/mice의 양으로 1주일에 5회 피하주사(subcutaneous injection)하였다.

표 1

관절염 마우스 모델을 대상으로 수행한 약물 처리군

실험군	투여 약물
1	아무 것도 처리하지 않은 관절염 유도 마우스 군(음성대조군)
2	코엔자임 Q10 단독 처리군
3	메트포민 단독 처리군
4	메트포민과 코엔자임 Q10 병용 투여군
5	엔브렐(Enbrel) 투여군

관절염 지수 평가는 본 실험의 내용을 알고 있지 않은 관찰자 4명이 일주일에 3 번씩 관절 염증의 위중도를 평가하여 6주까지 관찰하였으며 하기의 척도에 따라 매긴 점수를 합하여 3으로 나눈 평균치를 사용하였다. 관절염 평가에 따른 점수와 기준은 다음과 같다.

-평가 기준-

0점: 부종이나 종창이 없음.

1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적이 있음.

2점: 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적이 있음

3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적이 있음.

4점: 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있음.

마리당 최고의 관절염 지수는 4점이므로 마우스 1 마리당 최고의 질병 지수는 16 이다.

각각의 실험군을 대상으로 관절염 유도 후부터 약물처리 후의 관절염 지수 및 발병정도를 평가한 결과, 엔브렐를 처리한 군의 관절염 지수는 5.74이고, 코엔자임 Q10 단독 처리군 및 메트포민 단독 처리군은 각각 4 정도로 나타났으며, 메트포민과 코엔자임 Q10을 함께 처리한 군에서는 관절염 지수가 1.6으로 현저히 감소된 수치로 나타났다. 따라서 본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10의 병용처리가 이들을 각각 처리한 경우 및 엔브렐을 처리한 경우보다 관절염 치료 효과가 매우 현저하게 우수하다는 것을 알 수 있었다(도 1).

1-2. 조직학적 검사

상기 실시예 <1-1>의 실험에서 사용된 각 실험군의 마우스를 대상으로, 관절염을 유도하고 약물을 각각 처리한 후, 42일 후에 마우스들을 안락사 시킨 후, 마우스의 뒷발을 10% 포르말린(formalin)으로 고정하였고, 고정된 조직을 물로 세척(washing)하여 과도한 양의 고정시약을 제거하고 조직을 농도차가 있는 알코올(graded alcohol)을 이용하여 탈수시켰다. 뼈에서 석회질을 제거한 후 수분과는 혼합되지 않는 파라핀을 조직에 처리하였는데, 유기 용매인 벤젠에 용해시킨 파라핀을 탈수된 조직으로 침투시킨 다음, 고온(60℃) 처리하여 액체 상태인 순수한 파라핀이 조직 내로 완전히 침투되도록 하였다. 이후 조직을 저온에서 식힌 후, 고체 상태로 만든 다음, 적당한 크기(7㎛)로 잘랐다. 이후 관절 조직 절편을 접착제로 처리한 유리 슬라이드에 올려놓고, 조직의 파라핀을 자일렌 유기용매로 제거하였다. 염색약은 대부분 수용액이므로 조직이 붙은 슬라이드를 고농도의 알코올에서 저농도의 알코올 수용액으로 처리하여 함수(hydration)시켰고, 헤마톡실린(hematoxylin) 수용액으로 1차염색을 한 후 에오신(eosin)으로 2차염색을 하였는데 처음에는 진하게 염색한 후 알코올 용액으로 과도하게 염색된 표본의 염색정도를 적당하게 맞추는 분별(differentiation) 과정을 거쳐 염색하였다.

조직학적 검사 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 아무 약물도 처리하지 않은 류마티스 관절염 마우스의 관절은 많은 면역 세포들이 침식(infiltration) 되어 있었으며 판누스(pannus)가 형성되었고 연골파괴 및 뼈도 침식되어 있는 것으로 나타났다. 반면, 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독으로 처리한 군에서는 관절과 연골의 파괴 정도가 개선되었으나, 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용투여한 군에서는 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독으로 처리한 군보다도 현저하게 관절 염증 정도가 억제되었음을 알 수 있었다.

1-3. 혈청학적 검사

상기 실시예 <1-2>의 실험에서 사용한 마우스 실험군들을 대상으로, 각 마우스로부터 혈청을 수득하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. B 세포의 활성 정도를 조사하기 위해, 혈청 내 Total IgG와 CII에 특이적인 Total IgG와 IgG2a 항체를 효소결합 면역측정법(ELISA)을 통해 수행하였다. 일반적으로 관절염이 발병되는 경우, 혈청 내 전체적인 IgG는 증가되고 IgG2a가 특이적으로 증가된다고 알려져 있다. 따라서 각 실험군의 혈청을 sandwich ELISA를 이용하여 Total IgG와 항체 특이적인 Total IgG와 IgG2a를 측정하였다. 96 웰 플레이트(well plate)에 각각의 단클론성 항-마우스 IgG 와 CII로 상온에서 1시간 반응시키고 이후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비 특이적 결합을 차단하였다. 마우스 대조군 혈청을 1/2씩 연속 희석하여 스탠다드(standard)로 사용하였으며, 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 1시간 반응하였다. 이후 항-마우스 IgG-HRP, 항-마우스 IgG2a-HRP 1시간 실온 반응시키고 4회 세척한 다음, TMB system으로 발색하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

혈청학적 검사를 수행한 결과, 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독으로 처리한 군에서는 관절염 질환의 활성 지표인 혈청내 Total IgG의 발현이 아무런 약물도 처리하지 않은 관절염 유발군에 비해 억제된 것으로 나타났고, CII에 특이적인 Total IgG와 Th1 response를 가진 IgG2a의 발현도 억제된 것으로 나타났다. 그러나 메트포민과 코엔자임 Q10 병용 투여군한 군에서는 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독 처리한 군에 비해 Total IgG, CII에 특이적인 Total IgG 및 Th1 response를 가진 IgG2a의 발현이 더욱 억제되는 것을 알 수 있었다(도 3a).

1-4. B 세포 발현에 미치는 영향 관찰

상기 실시예 <1-2>의 실험에서 사용한 마우스 실험군들을 대상으로 각 마우스 군으로부터 비장세포를 분리한 후, 비장세포에서 미성숙 B (Immature B), 성숙 B(Mature B) 세포의 수준을 분석하기 위해 항-B220-APC 및 항-IgM-Percp 항-IgD-FITC를 사용하였고, Breg 세포 수준을 분석하기 위해 항-CD19 Percp, 항-CD5 FITC, 항-CD1d PE를 사용하였는데, 이들 사용 물질을 4℃에서 30분간 분리한 비장세포와 반응시킨 후, 유세포기(FACS caliber)를 이용하여 각 세포수를 분석하였다.

그 결과, 면역조절능을 갖고 있다고 알려진 미성숙 B 세포 및 Breg 세포는 다른 실험군에 비해 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여군에서 세포수가 현저히 높은 것으로 나타났고, 특히 Breg 세포수는 엔브렐 처리군 보다도 2배 이상으로 증가한 것으로 나타났다. 또한, 성숙 B 세포는 다른 실험군에 비해 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여군에서 세포수가 감소된 것으로 나타났다(도 3b).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10을 함께 포함하는 복합제제가 면역조절능을 갖고 있는 미성숙 B 세포 및 Breg 세포의 세포수를 증가시켜 향상된 면역조절능으로 관절염을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 알 수 있었고, 나아가 성숙한 B 세포의 수는 감소시키고 미성숙 B 세포의 수는 증가시킴을 통해 B 세포의 분화 및 성숙을 억제시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.

1-5. T 세포 발현에 미치는 영향분석

실시예 <1-4>의 실험을 통해 메트포민과 코엔자임 Q10의 복합제 처리가 B 세포에 미치는 영향을 분석하였는데, 나아가 T 세포에 미치는 영향 또한 분석하였다. 즉, 실시예 <1-4>의 실험에서 사용한 각 실험군을 대상으로 각 마우스의 비장세포에서 Th1, Th17 및 Treg 세포수를 분석하기 위해, 항-CD4-percp(Th1, Th17 조사용) 및 항-CD4-percp 와 항-CD25-APC(Treg 조사용)를 비장세포에 처리하고 4℃에서 30분간 반응시킨 다음, 세포를 permeabilization 한 다음, 항-IL-17-PE, 항-IFNr-FITC 및 Ab 항-Foxp3-PE 형광 Ab로 각각 반응시켰다.

반응 후 유세포기를 이용하여 각 세포를 분석한 결과, 대조군(관절염 유발 마우스의 비장세포(약물 미처리군))에 비해 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 투여한 군에서 병인세포인 Th1 및 Th17 세포수는 2배 정도 감소된 것으로 나타났고, 반면 면역조절능을 갖는 Treg 세포는 1.5배 정도 증가된 것으로 나타났다(도 4).

1-6. 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향분석

본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여가 실제 질병악화 및 발병 요인이 되는 염증성 사이토카인을 억제할 수 있는 효과가 있는지 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. Sanroque 마우스의 비장세포를 이용하여 실험을 진행하였는데, Sanroque 마우스는 ICOS의 과발현에 의한 TFH 세포 증가에 의해 배중심(Germinal center) 생성이 증가되어 B 세포가 과활성되어 있는 마우스로서, 즉, 자가항체 생성이 증가되어 자가면역질환이 병적상태로 유지되어 있는 마우스를 말한다.

본 발명자들은 상기와 같이 준비된 Sanroque 마우스로부터 수득한 비장세포에 T 세포를 자극시킬 수 있는 항-CD3 0.5㎍/㎖ 및 항-CD28 1㎍/㎖을 처리하였는데, 이때 항-CD3 0.5㎍/㎖는 2시간 전 처리하여 수행하였다. 메트포민 처리군은 메트포민을 0.2mM 처리하였고, 코엔자임 Q10 처리군은 코엔자임 Q10을 1μM 처리하였으며, 메트포민과 코엔자임 Q10의 병용처리 군은 0.2mM의 메트포민과 1μM의 코엔자임 Q10을 동시에 처리하고 3일 동안 세포를 배양하였다. 또한, B 세포를 자극시킬 수 있는 자극제로서 LPS 100ng/㎖을 비장세포에 처리한 후 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독처리한 군 및 이들을 병용처리한 군을 2일간 배양한 다음, 각각의 실험군에서 IL-6, IL-1b, TNF-α의 발현 정도를 효소결합 면역측정법(ELISA)으로 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 자가면역질환이 병적상태로 유지되어 있는 마우스의 비장세포 내에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1b 및 IL-6 생성을 메트포민과 코엔자임 Q10 단독 처리 군에 비해 병용처리 군이 현저하게 억제할 수 있는 효과가 있음을 알 수 있었다.

1-7. 파골세포 분화 억제 효과

파골세포 분화 과정에서의 메트포민과 코엔자임 Q10의 영향을 조사하기 위해, 마우스의 골수세포를 수득하고 상기 골수세포를 MCSF(macrophage colony-stimulating factor) 및 용해성 RANKL의 존재 하에서 분화되도록 유도하였다(Sugatani et al. 2003, J. Cell. Biochem. 90, 59-67 방법 참조). 골수세포는 6주령의 DBA/1J 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 준비하였고, 37℃에서 8구 챔버 슬라이드(3×10⁵세포/구; Nalge Nunc International, Naperville, IL)에서 M-CSF(30ng/㎖:R&D Systems, Minneapolis, MN)의 존재 하에 정치시켰고, 3일 후에 림프구를 포함한 비접착성 세포를 제거한 다음, 접착성 파골세포의 전구세포를 M-CSF(30ng/㎖) 및 RANKL(30ng/㎖; Strathmann, Hamburg, Germany)의 존재 하에서 추가로 4일 동안 배양하여 파골세포를 수득하였다. 이때 세포배양 배지는 M-CSF 및 RANKL가 첨가되어 있는 동안에 1차례 교환하였다. 세포를 고정하고 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)에 대하여 염색 키트(sigma)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 염색을 실시하였다. 각 챔버에서 현미경으로 (40배율)관찰한 결과, 3개 이상의 핵을 포함하는 TRAP 양성 다핵세포는 파골세포로서 계수되었다(Sugatani. et al. 2003, J. Cell. biochem. 90, 59-67).

본 발명에서 사용한 약물인 메트포민과 코엔자임 Q10이 골수세포와 분화된 파골세포에서 독성을 유발하는지 확인하기 위해 먼저 골수세포에 대해서는 골수세포(1×10⁵세포/구)를 9구판에 접종하였고 24시간 동안 정치하였다. 이후, 10μM 농도의 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 세포에 처리하고 48시간 동안 배양하였으며, 10μM 농도의 메트포민과 10μM 농도의 코엔자임 Q10을 병용 처리한 후에도 48시간 동안 세포를 배양하였다. 그런 뒤, 생존한 세포를 수용성 테트라졸리움 염 WST-8(Cell Counting Kit-8, Donjindo Laboratories, Kumamoto, Japan)로 제조업자의 프로토콜에 따라 염색하였다. 또한, 분화된 파골세포에 대한 세포독성은 앞서 설명한 바와 같이 골수세포를 파골세포로 분화하고, M-CSF 및 RANKL의 존재하에서 메트포민과 코엔자임 Q10을 상기 기술된 농도로 처리한 다음, 48시간 동안 정치하였다. 이후, 세포를 TRAP에 대하여 염색하고 TRAP 양성인 다핵 세포를 계수하였다. 파골세포는 관절의 뼈 파괴에서 상당한 역할을 하는 것으로 알려져 있어 골수 마크로파지의 파골세포로의 분화에 대한 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여의 영향을 확인하였다.

그 결과, M-CSF 및 RANKL에 의해 유도된 TRAP, MMP, b3 integrin 양성인 다핵 파골세포의 형성은 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독 처리한 군에 비해, 이들을 병용 처리한 군에서 파골세포 분화인자인 TRAP, MMP, b3 integrin의 발현이 모두 현저하게 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 6). 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10을 함께 함유한 복합제제가 파골세포 분화억제를 통한 골질환의 치료에도 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

1-8. SKG 관절염동물 모델에서의 관절염 지수 및 발병 정도 평가

본 발명자들은 실시예 <1-1>에서 제작된 관절염 동물모델과 다른 질병 모델로서, SKG 관절염 마우스 모델을 제작하였는데 SKG 마우스는 T세포 면역 체계의 유전적 결함이 있어 T세포 유발 만성 자가면역질환이 유발하는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 면역 세포의 70kD의 제타-연관 단백질(zeta-associated protein; Zap-70)의 유전자가 결손된 8주령의 SKG 마우스에 지모산(Zymosan)을 2㎎/㎏ 복강주사로 주입하여 관절염을 유발시켜 SKG 관절염이 유도된 마우스를 제조하였다. 이후, 본 발명자들은 상기 관절염 유도 마우스에 주 5회 코엔자임 Q10을 0.1㎎/mice(0.1㎎/300g)로 단독처리하고, 다른 군은 메트포민을 0.1㎎/mice(0.1㎎/300g)로 단독 처리하였으며, 또 다른 군에는 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 투여하였는데, 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 0.1㎎/mice(0.1㎎/300g)의 양으로 경구섭취(oral feeding) 시켰다. 또한, 양성대조군으로 관절염 치료제인 상표명 엔브렐(Enbrel)을 사용하였으며, 이를 위하여 류마티스 관절염 동물모델에 주 5회 피하주사하였다.

이상과 같은 실험을 통해 SKG 관절염 마우스 모델의 관절염 지수 및 발병정도를 평가한 결과, 엔브렐을 처리한 군의 관절염 지수는 4이고, 코엔자임 Q10 처리군은 5.6, 메트포민 처리군은 6.3으로 나타났으나, 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여군에서는 관절염 지수가 2.3으로 나타나, 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여(복합제)는 관절염 치료 효과가 아주 우수하여, 엔브렐을 대체할 수 있는 새로운 관절염 치료제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다(도 7).

1-9. SKG 관절염 마우스 모델을 대상으로 한 조직학적 검사

실시예 <1-8>의 방법으로 제조된 SKG 관절염 유도 동물모델에 상기 표 1과 같이 각 마우스에 약물을 처리한 군을 대상으로 다음과 같은 실험을 수행하였다. 관절염 유도 56일 후에 마우스를 안락사 시킨 후, 마우스의 뒷발을 10% 포르말린 (formalin)으로 고정하였고, 충분히 고정된 조직을 물로 세척(washing)하여 과도한 양의 고정시약을 제거하고 조직을 농도차가 있는 알코올(graded alcohol)을 이용하여 탈수시켰다. 뼈에서 석회질을 제거한 후 수분과는 혼합되지 않는 파라핀을 묻혔다. 유기 용매인 벤젠에 용해시킨 파라핀을 탈수된 조직으로 침투시킨 다음, 고온(60℃)에서 액체상태인 순수한 파라핀으로 처리하여 완전히 침투시켰다. 조직을 함유한 파라핀을 저온에서 식혀 고체상태로 만든 후 적당한 크기로 잘라서 다듬었다(trimming). 관절 절편(7㎛)을 준비하고 접착제로 처리한 유리 슬라이드에 조직을 올려 놓고, 조직의 파라핀을 자일렌과 같은 유기용매로 제거하였다. 염색약은 대부분 수용액이므로 조직이 붙은 슬라이드를 고농도의 알코올에서 저농도의 알코올 수용액으로 처리하여 함수(hydration)시켰고, 헤마톡실린(hematoxylin) 수용액으로 일차염색을 한 후 에오신(eosin)으로 이차염색을 하는데 처음에는 진하게 염색한 후 알코올 용액으로 과도하게 염색된 표본의 염색정도를 적당하게 맞추는 분별(differentiation) 과정을 거쳐 염색했다.

조직학적 검사 결과, SKG 관절염 마우스의 관절은 많은 면역 세포들이 침식(infiltration) 되어 있었으며 판누스(pannus) 형성, 연골파괴 및 뼈 침식 등이 관찰되었다. 반면, 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독으로 처리한 군에서는 관절과 연골의 파괴 정도가 개선되었으며, 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여군에서는 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독으로 처리한 군보다도 현저하게 억제되었는데, 질병이 유발된 마우스 군에 비해서는 4배 이상의 치료 효과가 있었고, 엔브렐 처리군에 비해서는 3배 이상의 효과가 있었으며 메트포민과 코엔자임 Q10 단독 처리군에 비해서는 2배 이상의 효과가 있는 것으로 나타났다(도 8).

1-10. SKG 관절염동물 모델에서의 혈청학적 검사

실시예 <1-8>의 방법으로 제조된 SKG 관절염 유도 마우스군을 대상으로 상기 표 1과 같이 각 약물을 처리한 마우스로부터 관절염 유도 56일 후에 마우스를 안락사 시킨 후 혈청을 얻었다. 혈정 내 Total IgG의 양을 측정하기 위해 효소결합 면역측정법(ELISA)을 수행하였다. 일반적으로 관절염이 유도될 경우, 전체적인 IgG는 증가되고 또한 IgG2a가 특이적으로 증가되는 것으로 알려져 있다. 이를 위해, 각 실험군의 혈청을 sandwich ELISA를 이용하여 Total IgG와 항체 특이적인 Total IgG와 IgG2a를 측정하였다. 96 웰 플레이트(well plate)에 각각의 단클론성 항-마우스 IgG 와 CII로 상온에서 1시간 반응시키며, 반응 후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비 특이적 결합을 차단하였다. 마우스 대조군 혈청을 1/2씩 연속 희석하여 스탠다드(standard)로 사용하였으며, 세포배양 상층 액을 넣고 실온 1시간 반응하였다. 그리고 나서 항-마우스 IgG-HRP, 항-마우스 IgG2a-HRP 1시간 실온 반응 시키며 반응 후 4회 세척 하고 TMB system으로 발색하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

상기와 같은 방법으로 혈청학적 검사를 수행한 결과, 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독으로 처리한 군에서 관절염 질환의 활성 지표인 혈청내 Total IgG의 발현이 억제되는 것으로 나타났으며, 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독으로 처리한 군보다 메트포민과 코엔자임 Q10 병용 투여군에서 혈청내 Total IgG의 발현 억제 효과는 더 우수한 것으로 나타났고, 엔브렐 처리군 보다도 더 우수한 것으로 나타났다(도 9).

1-11. SKG 관절염동물 모델에서의 B 세포 분화 및 발현에 미치는 영향분석

실시예 <1-10>의 실험에서 사용한 마우스 모델을 대상으로 각각 비장세포를 분리한 후, 약물 처리에 따른 비장세포 내에서의 미성숙 B (Immature B) 세포, 성숙 B(Mature B) 세포수를 분석하기 위해 항-B220-APC 및 항-IgM-Percp 항-IgD-FITC를 사용하였고, Breg 세포수를 분석하기 위해서 항-CD19 Percp, 항-CD5 FITC, 항-CD1d PE를 사용하여 4℃에서 30분간 반응시키고, 유세포기(FACS caliber)를 이용하여 각 세포를 분석하였다.

그 결과, 면역 조절능을 갖고 있다고 알려진 미성숙 B 세포 및 Breg 세포는 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독으로 처리한 군과 엔브렐 처리군에서 비슷한 세포수를 보이는 것으로 나타난 반면, 성숙 B 세포는 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독으로 처리한 군에서 대조군에 비해 감소되어 있는 것으로 나타났다. 한편, 메트포민과 코엔자임 Q10을 함께 처리한 군은 미성숙 B 세포 및 Breg 세포수가 이들 약물을 단독 처리한 군에 비해 더 세포수가 증가한 것으로 나타났고, 성숙한 B 세포수는 메트포민과 코엔자임 Q10을 복합처리한 군에서 다른 군에 비해 가장 적은 것으로 나타났다(도 10).

따라서, 이러한 결과를 통해 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여 또는 메트포민과 코엔자임 Q10을 포함하는 복합제는 T세포 면역 체계의 유전적 결함으로 발병하는 관절염 동물모델에서 B 세포의 염증 면역반응을 효과적으로 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

1-12. SKG 관절염동물 모델에서의 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여에 의한 T 세포 발현 관찰

본 발명자들은 실시예 <1-8>의 방법으로 제조된 SKG 관절염 유도 동물모델에 상기 표 1과 같이 각 마우스에 약물을 처리하고 이들 마우스의 비장세포에서 Th1, Th17 세포수를 분석하기 위해 항-CD4-percp를 사용하였고, Treg 세포수를 조사하기 위해서 항-CD4-percp, 항-CD25-APC를 4℃에서 30분간 반응시킨 후, permeabilization 후 항-IL-17-PE, 항-IFNr-FITC 및 Ab 항-Foxp3-PE 형광 Ab로 각각 반응시켰다.

유세포기를 이용하여 각 세포수를 분석한 결과, 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 투여한 군이 병인세포인 Th1과 Th17의 세포수를 월등히 감소시키는 것으로 나타났고, Treg 세포수는 현저하게 증가되는 것으로 나타났다(도 11a 및 도 11b).

실시예 2. 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여에 의한 이식거부질환 치료 효과

2-1. T 세포의 이식 후 거부반응 억제 효과 및 IFN-γ, IL-17 발현 억제 효과 분석

본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10의 병용 투여가 이식거부질환의 증상을 완화 및 치료할 수 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 시험관내(In vitro)에서 96well round bottom plate내에 각 웰당 2×10⁵개의 정상 수여자(Balb/c, responder)의 CD4+T 세포와 2×10⁵개의 방사선으로 조사된 수여자(동종동형) 또는 공여자(C57BL/6, stimulator,동종이형) 유래의 T 세포가 제거된 비장세포를 첨가한 후, 혼합 배양시켰다. 이때 동종이형반응에 메트포민을 처리하지 않거나, 메트포민(200μM, 1mM)을 단독 처리, 메트포민(200μM, 1mM)과 코엔자임 Q10(2μM)을 병용 처리한 각 실험군을 4일간 배양하고 배양된 세포에서 T 세포 증식 반응 확인을 위해 배양액을 대상으로 ELISA를 수행하였고 또한 유세포 분석기로 IL-17, IFNr의 발현을 조사하였다.

그 결과, 메트포민은 농도 의존적으로 T 세포의 이식 후 거부반응을 억제하였으며, IL-17과 IFN-γ의 발현을 현저하게 억제시킴을 알 수 있었다. 한편, 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 처리한 경우에는 T 세포의 이식 후 거부반응을 억제하고, IL-17과 IFN-γ의 발현 역시 억제하는 것으로 나타났으며, 병용 처리군이 메트포민을 단독 처리한 경우에 비해 이식 후 거부반응 억제효과가 더 우수한 것으로 확인되었다(도 12a 내지 도 12c).

2-2. 조절 T 세포(Treg 세포) 분화 양상 관찰

나아가 본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10의 병용투여가 면역조절능을 갖는 조절 T 세포(Treg)의 활성도 촉진시키는 작용을 하는지 확인하기 위해, 상기 실시예 <2-1>에서 사용된 세포들을 대상으로 Foxp3+ Treg 세포를 유세포 분석기로 분석하였다.

그 결과, 메트포민을 단독으로 처리한 경우에 비해 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 처리한 경우, Foxp3+ Treg 세포수가 더 증가한 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독 처리하는 것에 비해 이들을 함께 처리할 경우, Treg 세포의 면역조절능을 촉진시켜 보다 효과적으로 면역질환을 치료할 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 12d).

실시예 <2-1> 및 <2-2>에서 관찰한 바와 같이 메트포민과 코엔자임 Q10의 병용 처리에 의해 T 세포의 이반응(Alloresponse)을 억제하고, 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키며, 조절 T 세포(Treg)의 활성을 증가시키는 바, 이식편대숙주질환과 같은 이식거부반응도 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3. 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여에 의한 염증성 장질환 치료 효과

3-1. 염증성 장질환 동물 모델 제작

메트포민과 코엔자임 Q10의 병용 투여가 염증성 장질환을 효과적으로 치료할 수 있는지를 확인하기 위하여, 먼저 염증성 장질환 유도 동물모델을 제작하였다. 시험동물은 C57BL/6(H-2kb) 마우스를 사용하였으며, 염증성 장질환 유도 동물모델을 제조하기 위해, 마우스에 3.5% 덱스트란 설페이트 나트륨(dextran sulfate sodium, DSS) 물을 1주일간 음용하게 하여 염증성 장질환 유도 동물 모델을 제작하였다.

3-2. 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여에 의한 염증성 장질환 치료 효과

본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여에 의한 염증성 장질환의 치료효과를 관찰하기 위하여, 상기 실시예 <3-1>의 방법으로 제조된 염증성 장질환 유도 동물 모델인 IBD 마우스 모델을 대상으로 아무런 약물을 투여하지 않은 대조군, 메트포민(1㎎/㎏) 단독 투여군, 메트포민(1㎎/㎏)과 코엔자임 Q10(20㎎/㎏) 병용투여군의 세 그룹으로 나누고, 각 약물들은 하루에 한 번씩 경구 투여하였다.

이후 매일 세 그룹의 동물 모델에 대해 무게를 측정해 본 결과, 대조군은 체중이 5일 이후 급격히 감소하는 것으로 나타났고, 메트포민 단독 투여군은 대조군에 비해 다소 적게 감소하는 경향을 나타내었으며, 메트포민과 코엔자임 Q10의 병용 투여군은 체중 감소가 현저히 개선되어 무게 감소가 현저히 개선되는 것으로 나타나 염증성 장질환의 증상을 개선하는데 있어서 메트포민과 코엔자임 Q10의 병용처리가 유효하다는 것을 알 수 있었다(도 13).

또한 염증성장질환의 병증을 측정할 수 있는 DAI score를 분석한 결과, IBD 발병 대조군 마우스군(약물 미처리군)은 질병 지수가 3.8인 것으로 나타났고, 메트포민 단독 투여군에서는 질병 지수가 2를 보였고, 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여군에서는 질병 지수가 0.6을 보여, 병용처리에 따른 치료 효과가 매우 현저하다는 것을 알 수 있었다(도 13).

또한, 조직학적 소견을 확인하기 위해서 치사 시킨 마우스의 장을 직접 얻어서 H&E 염색을 진행한 결과, 염증성장질환 동물 모델(IBD)과 비교하였을 때 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여군에서 대조군과 비슷하게 장의 융모가 그대로 유지되어 있음을 알 수 있었다(도 13).

3-3. 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여에 따른 염증성 사이토카인 억제 효과 분석

본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10의 복합제 처리 또는 병용투여의 의해 염증성 장질환의 치료효과 기작을 살펴보기 위해 이들 약물에 의한 염증성 사이토카인의 억제 효과를 살펴보았다. 이를 위해, 염증성 장질환에 걸리지 않은 정상 마우스군, 염증성 장질환 유도 동물 모델인 IBD 마우스군, 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여군의 세 그룹의 마우스 동물모델을 대상으로 동물을 각각 치사시킨 후, 각 군의 마우스의 장을 채취하여 10% 중성완충포르말린에 고정시켰다. 이후, 파라핀에 포배하고, 장 조직을 5μM 두께로 절편으로 만들어 슬라이드에 부착하였으며, 염색을 진행하기전에 자일렌을 이용하여 탈 파라핀 과정을 통과 시킨 다음 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수 시켰다. IL-17, IL-6, TNF-α의 발현을 조사하고자 10% 정상 염소 혈청을 도포하여 30분간 비특이적 반응을 차단하였으며, 반응 진행 후 항-마우스 IL-17, 항-마우스 IL-6, 항-마우스 TNF-α ab를 조직위에 도포 후 4℃에서 밤새 배양하였다. 그런 다음 HRP로 2시간 반응한 다음 현미경으로 관찰하였다.

상기 동물모델군을 대상으로 IL-17, IL-6, TNF-α의 발현을 확인한 결과, 염증성 장질환이 유도된 IBD 마우스군에서는 염증성 사이토카인인 IL-17, IL-6, TNF-α의 유전자 발현량이 정상 마우스군에 비해 현저히 발현이 증가한 것으로 나타났으나, 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10 병용 투여군에서는 IL-17, IL-6, TNF-α의 유전자 발현량이 현저히 감소하여 이들 염증성 사이토카인의 발현을 월등히 감소시켜 질환을 치료할 수 있음을 알 수 있었다(도 14).

3-4. 대장암 세포주에서 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여에 따른 염증성 사이토카인 억제 효과 분석

염증성 장질환 이외에 대장암에서도 약물의 병용처리가 치료 효과를 도출할 수 있는지 확인하기 위해, HT-29 대장암 세포주를 대상으로 메트포민 1㎎을 단독 처리한 군 및 메트포민 1㎎과 코엔자임 Q10 50μM을 병용 처리한 군을 대상으로 VEGF의 발현 정도를 분석하였다.

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 신생혈관 촉진 및 염증 촉진에 관여 하는 VEGF의 발현을 메트포민 단독 처리에 비해 복합하여 처리한 군에서 더 우수하게 발현 억제 효과가 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 약물을 전혀 처리하지 않은 HT-29 대장암 세포주에서의 hVEGF 발현량은 약 5,800pg/㎖을 나타났으나, 메트포민 단독 처리군에서는 약 5,200pg/㎖로 나타났고, 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여군에서는 hVEGF 발현량이 약 3,950pg/㎖을 보여 VEGF의 생성이 현저히 감소하였음을 알 수 있었다.

실시예 4. 시험관내에서의 약물 병용처리에 의한 약리 효과의 유효성 평가

4-1. 세포독성 유무 확인

코엔자임 Q10(coenzyme Q10; coQ10)과 메트포민의 복합제를 세포에 처리 시 세포독성을 유발하는지 확인하기 위해 MTT assay 시험방법을 수행하였다. 이를 위해 먼저, C57bl6 마우스의 비장 세포를 페니실린(100IU/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖), 5% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 RPMI 배지에 넣고, 5% CO₂ 조건에서 37℃로 배양하였다. MTT 어세이를 위해, 마우스의 비장 세포를 96웰 플레이트(96 well plate)에 각 웰당 2×10⁵개의 세포수로 맞추어 분주하고 1μM, 5μM, 20μM 농도의 코엔자임 Q10을 각각 단독으로 처리한 군, 0.2mM, 1mM, 5mM 농도의 메트포민을 각각 단독으로 투여한 군 및 다양한 농도의 코엔자임 Q10과 메트포민을 복합하여 투여한 군으로 나누어 72시간 동안 배양한 다음, 세포에 MTT 용액(0.5% 3-4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- 2H-tetrazolium bromide)을 첨가하여 4시간 배양한 다음, ELISA(enzymelinked immunospecific assay) 측정기로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 코엔자임 Q10을 농도별로 단독으로 처리한 군, 메트포민을 단독으로 처리한 군 및 코엔자임 Q10과 메트포민을 복합 투여한 군에서 모두 세포 독성이 나타나지 않음을 알 수 있었다(도 16). 따라서, 코엔자임 Q10과 메트포민을 복합하여 처리하여도 세포에 독성을 유발하지 않아 체내 안정한 치료제로 함께 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

각기 단일 약물이 각각의 질환 치료 용도로 사용되고 있어도 서로 다른 2가지 또는 2가지 이상의 약물을 복합하여 처리할 경우, 이들 약물간의 상호 화학반응에 따라 단독 투여시에는 세포에 독성을 유발하지 않다가도 복합처리 시 독성을 유발할 수도 있기 때문에 본 발명에서는 실제 실험을 통해 코엔자임 Q10과 메트포민을 함께 처리하여도 세포 독성을 유발하지 않음을 알 수 있었다.

4-2. 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 염증병인 T세포 활성 억제 효과

본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리가 염증병인 T세포(Th1, Th17) 활성을 억제하는 효과가 있는지 알아보기 위하여 마우스의 비장세포에서 분리한 CD4+ T 세포를 1×10세포수로 분주하고, Th17 세포 분화 조건으로 자극하기 위해 48 웰 플레이트에 5×10⁵세포수로 각각 분주하고, 항-CD3 0.5㎍/㎖, 항-CD28 1㎍/㎖를 처리하면서 동시에 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 단독 및 병용처리 후 3일간 배양한 다음 각각의 세포를 수득하였다. 이후 Th1, Th17 세포수 및 세포활성을 분석하기 위해 항-CD4-percp를 4℃에서 30분간 반응시키고, 반응 후 세포를 permeabilization 한 다음, 항-IL-17-PE, 항-IFNr-FITC 형광 Ab로 반응시켰다. 반응 후 FACS caliber를 이용하여 Th1 세포인 CD4+IFN-γ+, Th17 세포인 CD4+IL-17+의 발현 정도를 분석하였다. 본 발명에서 억제 수율(Suppression yield)은 Th0 상태의 Th17과 Th1 세포의 발현을 100%로 정하고 나머지 결과를 환산하여 그래프를 그렸다.

그 결과, 항-CD3 0.5㎍/㎖항체를 2 시간 전처리 하고 항-CD28 1㎍/㎖로 자극한 Th0 조건에서 대조군과 각 약물 처리군을 비교한 결과, 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리군은 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 처리한 군에 비해 염증성 사이토카인인 Th1과 Th17의 활성이 확연히 감소되었음을 알 수 있었다(도 17a 및 도 17b).

4-3. 자가면역관절염의 주요 병인세포인 IL-17과 IL-17 관련 마커 관찰

정상마우스의 비장세포와 염증세포가 활성화된 질병마우스(상기 기술된 바와 같이 염증자극 인자를 처리함)로부터 비장세포를 각각 수득하고, T 세포의 자극을 위해 항-CD3 0.5㎍/㎖(plate coating 2h)+ 항-CD28 1㎍/㎖과 LPS 100ng/㎖로 자극한 다음, 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독처리하거나 병용처리한 군을 각각 3일간 배양한 다음, 본 기술분야에 공지된 방법에 따라 세포들로부터 RNA를 각각 추출한 후, IL-17, CCL20, RORgt 및 b-actin을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응을 수행하였으며, RT-PCR를 위한 반응물은 부피가 총 25㎕가 되도록 하였고, 용액의 조성은 2.5㎕의 10x 반응버퍼, 0.5mM의 dNTP 및 하기 표 2에 기재된 서열을 갖는 각각의 프라이머 쌍을 사용하였으며, 증폭은 Dual-bay Thermal cycler system 기기를 사용하여 실험을 진행하였다.

표 2

사용한 프라이머 서열

유전자	방향	서열	서열번호
IL-17	정방향	5'-CCTCAAAGCTCAGCGTGT-3'	1
IL-17	역방향	5'-GAGCTCACTTTTGCGCCAAG-3'	2
CCL20	정방향	5'-CAGCTGTTGCCTCTCGTACA-3'	3
CCL20	역방향	5'-CACCCAGTTCTGCTTTGGAT-3'	4
RORgt	정방향	5'-TGTCCTGGGCTACCCTACTG-3'	5
RORgt	역방향	5'-GTGCAGGAGTAGGCCACATT-3'	6
β-actin	정방향	5'-GAAATCGTGCGTGACATCAAAG-3'	7
β-actin	역방향	5'-TGTAGTTTCATGGATGCCACAG-3'	8

그 결과, IL-17의 발현양이 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 처리한 군에서보다 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리 군에서 확연히 감소된 것을 알 수 있었는데, 특히 질병상태의 결과를 보면 단독 처리군에서는 거의 IL-17의 발현이 감소되지 못하고 있었으나 함께 처리한 군에서 현저하게 발현 감소를 나타내었다.

또한, Th17 마커로 사용되고 있는 CCL20과 Th17 세포의 전사인자인 RORrt의 발현 역시 질병상태의 세포에서 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 처리한 군에 비해 함께 처리한 군이 월등히 억제 효과가 높다는 것을 알 수 있었다. 이들 약물에 의한 처리는 정상상태에서도 그 효과가 있었으나, 질병상태에서의 효과가 더 현저하여 치료 효과를 도출할 수 있음을 알 수 있었고, 특히 2가지를 병용 처리하였을 경우, 질병 세포내에서 RORrt의 발현은 거의 100%에 가깝게 억제되는 것으로 나타났다.

이는 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리는 Th17 병인 세포의 발현을 효과적으로 억제 할 수 있음을 의미하며, 정상마우스의 비장세포와 염증 세포 활성 상태의 마우스에서 얻은 세포의 상층액으로 측정한 ELISA 결과에서도 IL-17의 발현이 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 처리한 군에서보다 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리 군에서 확연히 감소되었음을 알 수 있었다(도 18).

4-4. 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 조절 T세포 증강 효과 분석

메트포민과 코엔자임 Q10의 병용처리로 조절 T세포수가 증가하고 활성이 증가되는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

실시예 <4-3>의 실험에서 사용한 정상과 질병세포들을 대상으로, 항-CD3 0.5㎍/㎖ (plate coating 2h)+ 항-CD28 1㎍/㎖ 처리 시, 동시에 메트포민과 코엔자임 Q10 단독 또는 이들을 병용처리 후 3일간 각각 세포군들을 배양한 다음, 각각의 세포를 얻어 Treg의 세포수를 분석하였는데, 세포분석을 위해 항-CD4-percp와 항-CD25 APC를 4℃의 온도에서 30분간 반응시키고, 반응 후 세포를 permeabilization 항-Foxp3-PE 형광 Ab로 반응시킨 다음, 유세포기를 이용하여 Treg 세포인 CD4+이면서 CD25highFoxp3+세포의 발현정도를 분석 후 Th0 상태의 Treg 세포의 발현을 100%로 정하고 나머지 결과를 환산하여 그래프를 그렸다.

표 3

사용한 프라이머 서열

유전자	방향	서열	서열번호
Foxp3	정방향	5'-GGCCCTTCTCCAGGACAGA-3'	9
Foxp3	역방향	5'-GCTGATCATGGCTGGGTTGT-3'	10
β-actin	정방향	5'-GAAATCGTGCGTGACATCAAAG-3'	7
β-actin	역방향	5'-TGTAGTTTCATGGATGCCACAG-3'	8

그 결과, 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용처리한 군의 경우 질병상태의 세포에서 면역조절능을 갖는 Treg 세포의 발현이 현저히 증가되는 것으로 나타났고 mRNA 레벨에서도 Foxp3의 발현이 증가된 곳으로 나타났다. 한편 특이하게도 질병상태에서 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독 처리한 군에서는 Treg 세포의 표지 인자인 Foxp3의 발현이 대조군(질병유발된 약물 미처리 세포군)에 비해 오히려 감소되는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 Treg의 세포 활성화에 있어서, 질병상태에서는 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독처리한 경우 오히려 Foxp3의 발현이 이들 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 반면, 함께 처리한 군에서만 Foxp3의 발현이 증가되는 현상이 일어난다는 것을 알 수 있었다(도 19).

4-5. 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 B 세포 활성 및 IgG 억제 효과 분석

메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 처리한 경우 B 세포에서의 IgG 발현 억제 효과가 일어나는지 확인하였다. 이를 위하여 B 세포를 면역질환 마우스의 림프절(lymph node)에서 분리하고 LPS 100ng/㎖을 처리하고 IgG1 발현을 유도하되, LPS와 함께 메트포민을 단독으로 처리하거나 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 처리한 다음, IgG1 및 IgG3 발현 양상을 분석해 보았다.

IgG1 및 IgG3 발현양 분석은 상기 약물 처리 후, 3일 세포를 배양한 다음 ELISA를 통해 분석하였는데, 그 결과, IgG1은 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 처리하였을 때도 발현양이 감소하였으나, 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 처리하였을 때는 더 효과적으로 감소하는 것으로 나타났다. 반면, IgG3은 IgG1의 발현 양상과는 달리, 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 처리하였을 때에는 IgG3의 발현이 증가하였으나, 병용 처리하였을 때는 IgG3의 발현양이 확연히 감소하였음을 알 수 있었다(도 20).

이와 같은 결과를 통해 메트포민과 코엔자임 Q10의 병용 처리는 B 세포 면역 질환에서 병인 B 세포를 억제할 수 있는 활성을 나타내는 바, 루프스를 포함하는 B 세포 이상에 의해 발생하는 면역질환 치료에도 이들 2가지 약물을 모두 포함하는 복합제를 치료제로 유용하게 활용할 수 있음을 알 수 있었다.

4-6. 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 Breg 증진 효과

조절 B 세포(Breg)의 활성 여부를 조사하기 위해 마우스로부터 비장세포를 분리하고, 이들 세포에 LPS 100ng/㎖와 함께 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독 처리하거나 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 처리한 후 3일간 배양하였다. 배양 후 얻은 세포를 유세포분석 진행을 위해 FACS 버퍼로 워시(wash)한 후에 항-마우스 B220 APC, 항-마우스 IgD FITC, 항-마우스 IgM PE, 항-마우스 CD138 Percp ab로 4℃의 온도에서 30분간 반응하였다. FACS 버퍼로 워시(wash) 진행 후 유세포 분석기를 이용하여 리딩(Reading) 후 Flow jo를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 메트포민과 코엔자임 Q10 병용 처리 조건에서 면역조절 기능을 갖는 Breg 세포와 Naive B 세포는 메트포민과 코엔자임 Q10 단독 처리에서보다 월등히 증가되었고, 항체 생성에 관여하는 플라즈마 B 세포는 약물 병용 투여시 단독 투여때 보다 억제되는 것으로 나타났다(도 21).

따라서, 본 발명자들은 B 세포의 활성 조절을 통한 면역조절에 있어서도 메트포민과 코엔자임 Q10의 단독 투여보다 병용투여가 효과적임을 확인할 수 있었다.

4-7. 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 염증성 사이토카인 억제 효과 분석(1)

본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리가 염증성 사이토카인을 억제하는 효과가 있는지를 알아보기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다. 먼저, 마우스의 비장세포에 B 세포를 활성시키기 위해서 LPS 100ng/㎖와 메트포민과 코엔자임 Q10 단독 처리 및 메트포민과 코엔자임 Q10 병용 처리한 후 3일간 배양하였다. 배양 후 배양액의 상층액에서 IL-6, IL-1b, TNF-α의 발현을 ELISA 분석을 이용하여 확인하였다. 실험을 위해 먼저 각각의 IL-6, IL-1b, TNF-α의 capture ab를 96 웰 플레이트(well plate)에 깔고 밤새 배양 후(overnight) 블락킹 버퍼(blocking buffer)로 2시간 반응을 진행하였다. 스탠다드(Standard)와 샘플을 처리 후 2시간 상온에서 반응시켰으며, 워시 버퍼(wash buffer)로 3번 수행 후, detection ab 처리 후 2시간 상온에서 반응시켰다. AP를 붙이고 2시간 반응후 PNPP를 이용하여 발색시켰고, ELISA reader 기기를 사용하여 발색정도에 따른 값을 확인하였다.

그 결과, 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1b, TNF-α의 발현양은 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독으로 처리하였을 때에도 다소 감소하였으나, 본 발명의 방법으로 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 처리하였을 때에는 확연하게 억제되어 있음을 알 수 있었다(도 22a).

4-8. 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 염증성 사이토카인 억제 효과 분석(2)

마우스의 dLN의 세포에서 T 세포를 활성화 시키기 위해 항-CD3 0.5㎍/㎖ (plate coating 2h)와 메트포민과 코엔자임 Q10 단독 및 병용처리 후 3일간 배양 후에 각각의 조건에서 상층액(supernatant)을 얻어 TNF-α와 IL-17의 발현을 ELISA 분석으로 조사하였다. 실험을 위하여 본 발명자들은 각각의 TNF-α와 IL-17 capture ab를 96 웰 플레이트(well plate)에 깔고 밤새 배양 후(overnight) 블락킹 버퍼(blocking buffer)로 2시간 반응을 진행하였다. 스탠다드(Standard)와 샘플을 처리 후 2시간 상온에서 반응시켰으며, 워시 버퍼(wash buffer)로 3번 수행 후, detection ab 처리한 다음 2시간 상온에서 반응시켰다. AP를 붙이고 2시간 반응후 PNPP를 이용하여 발색을 시켰으며, ELISA reader 기기를 사용하여 발색정도에 따른 값을 확인하였다.

그 결과, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-17의 발현양은 메트포민과 코엔자임 Q10을 단독으로 처리하였을 때에는 아무 것도 처리하지 않은 대조군과 비슷하였으나, 본 발명의 방법으로 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 처리하였을 때에는 TNF-α, IL-17의 발현양이 확연하게 억제되어 있음을 알 수 있었다(도 22b).

실시예 5. 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아 손상 조절 능력 확인

<5-1> 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아 막 전위변화 조사

본 발명자들은 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아의 막전위 변화를 조사하기 위하여 JC-1 염색을 시행하였다. 관절을 둘러싸고 있는 활막세포(FLS)에 염색 시 DMEM 배지에 JC-1 200mM을 100nM로 희석 후 10㎍/㎖로 추가(adding)한 다음 37℃의 온도에서 15분간 인큐베이션(incubation) 하였다. DMEM 배지 교체 후 10분 뒤에 PBS 워싱(washing)진행한 후 형광현미경으로 관찰하였다. 상기 "JC-1 염색"은 미토콘드리아의 막전위 변화 연구에 주로 이용되는 실험 방법으로서, 정상 세포내에서는 JC-1 dye가 미토콘드리아에 레드 형광을 띠며 축적되나, 아톱토시스(apotosis)가 일어난 세포에서는 세포질에 그린(green) 형광으로 남게 되는 특징이 있다.

형광현미경으로 관찰 결과, 아무것도 처리 하지 않은 대조군 상태의 미토콘드리아 막 전위변화는 유지가 잘 되고 있어서 Red 형광이 잘 발현하고 있지만 IL-17을 처리한 조건에서는 Th17 또는 사이토카인 IL-17에 의해서 미토콘드리아 손상을 유발시키기 때문에 Green 형광이 증가되어 있음 알 수 있었다. 그러나 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 단독 처리하였을 때에는 미토콘드리아 막 전위변화가 증가되었음을 알 수 있었으나, 이들을 병용 처리하였을 때는 각각 단독으로 처리하였을 때보다 미토콘드리아 막 전위변화가 가장 많이 증가되어 red 형광을 더 많이 띰을 알 수 있었다(도 23a).

5-2. 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아의 양 변화 조사

메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아의 양 변화가 있는지를 알아보기 위하여 Mitotracker / a-tubulin 염색을 수행하였다. 먼저, DMEM 배지에 미토트래커(Mitotracker)를 100nM 농도로 희석한 후 관절을 둘러싸고 있는 활막세포(FLS) 플레이트에 추가(adding)하였다. 그 후 37℃의 온도에서 15분간 인큐베이션하였으며, PBS 워싱을 하였다. 아세톤(Acetone)과 메탄올(Methanol)을 1:1 비율로 희석하여 10분 고정 후 PBS 워싱을 15분간 진행하였다. 또한, 10% Normal goat serum으로 블락킹(blocking)하였으며, 30분 후 Ab 넣고 4℃에서 밤새 배양하여 진행 후 PBS 워싱한 다음 DAPI (1:500) stain 후 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, IL-17 10ng 처리 군에서는 IL-17에 의해서 손상을 받아 미토콘드리아 양이 감소되었으나, 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 처리한 군에서는 감소된 미토콘드리아의 양이 증가하였음을 알 수 있었으며, 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 투여한 군에서는 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 처리한 군보다 감소된 미토콘드리아의 양이 월등히 증가하였음을 알 수 있었다(도 23b).

5-3. 류마티스관절염 모델에서 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아 막 전위변화 조사

본 발명자들은 류마티스관절염 모델에서 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아 막 전위변화를 알아보기 위하여 하기와 같이 실험하였다. DBA1/J 정상 마우스군에 type II collagen 100㎍을 CFA와 섞어서 꼬리 표피에 주입(first immunization)하여 류마티스 관절염 동물모델을 제작하였으며, 1주일에 5회 코엔자임 Q10 단독 처리군은 0.1㎎/mice, 메트포민 단독 처리군은 0.1㎎/mice, 메트포민과 코엔자임 Q10 병용투여은 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 0.1㎎/mice의 양으로 경구섭취(oral feeding) 시켰다. 상기와 같이 제작된 류마티스 관절염 동물모델을 희생시킨 후 비장세포를 얻었으며, 각각의 처리군의 세포에 H₂O₂를 처리하여 미토콘드리아의 막 전위를 망가지게 하였다. 각각의 처리군을 대상으로 JC-1 염색을 진행하였는데 염색 시 배양 상층액을 버리고 세포에 PBS를 넣은 후 JC-1 200mM을 100nM로 희석 후 10㎍/㎖로 추가(adding)한 다음 37℃의 온도에서 15분간 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포 원심분리를 진행한 후 형광 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 아무것도 처리하지 않은 류마티스관절염 마우스 군에서는 red 형광이 거의 없고 green 형광이 대부분이나 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 단독으로 처리한 군에서는 red 형광이 증가하였으며, 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10을 병용 처리한 군에서는 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 단독으로 처리한 군보다 red 형광이 월등히 증가하였음을 알 수 있었다(도 24a).

따라서 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10의 병용처리 또는 이들을 함유하는 복합제의 처리는 질환 유발로 인해 감소된 미토콘드리아 막 전위를 확연히 증가시켜 미토콘드리아 막 전위변화가 잘 유지되고 있음을 알 수 있었다.

5-4. 류마티스관절염 모델에서 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리에 의한 미토콘드리아의 양 변화 조사

본 발명자들은 상기 실시예 <5-3>의 방법으로 제조된 류마티스 관절염 유도 동물모델을 희생하여 비장 절편을 얻었으며, 아무것도 처리되지 않은 류마티스 관절염 유도 동물모델군, 메트포민이 처리된 군, 코엔자임 Q10이 처리된 군 및 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리된 군의 비장조직을 이용하여 동결절편(Optimal Cutting Temperature compound; O.C.T. compound)을 포매시킨 다음 액화질소에서 조직을 급속냉각시키고, 냉동절편기를 이용하여 7㎛ 두께로 슬라이드에 부착하였다. 이후 절편을 아세톤으로 고정하고, 10% 정상 염소 혈청을 도포하여 30분간 비특이적 반응을 차단하였다. CoxIV 분석에는 PBS(pH7.5)에 희석된 1차항체 CD4 alexa 488 (1:200), CoxIV (1:200, 토끼 / 2nd 항-토끼 PE 1:500)로 4℃에서 하룻밤 동안 반응 시켰으며, 다음날 PBS용액으로 세척하고, 염색한 조직을 공초점 현미경으로 분석 하였다.

그 결과, 메트포민을 처리한 군에서는 아무것도 처리하지 않은 류마티스 관절염 유도 동물모델군과 비슷한 미토콘드리아 양을 보여 메트포민 단독처리에 의해서는 미토콘드리아의 양이 증가되지 않음을 알 수 있었다. 그러나, 코엔자임 Q10 처리군에서는 미토콘드리아의 양이 증가되었으며, 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리된 군에서는 더 월등히 증가하였음을 알 수 있었다(도 24b).

따라서 본 발명의 메트포민과 코엔자임 Q10 병용처리는 미토콘드리아 기능의 저하에 따른 다양한 질병도 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

본 발명은 보건복지부의 재원으로 보건의료연구개발사업(연구관리 전문기관: 한국보건산업진흥원, 연구과제명: 고형장기 이식에서 Th17 세포군 조절을 통한 항체 생산 면역반응 제어와 면역 관용법 개발, 과제고유번호: HI09C1555)의 지원을 받아 수행되었다.

Claims

메트포민 및 코엔자임 Q10을 유효성분으로 모두 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 조성물은 메트포민을 0.1 내지 20㎎ 및 코엔자임 Q10을 0.001 내지 10㎎의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 조성물은 파골세포 분화를 감소시키거나, 염증성 세포의 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 조성물은 TNF-α, IL-6, IL-17, IFN-γ 및 IL-1b로 이루어진 군으로부터 선택되는 염증성 사이토카인의 발현을 감소 또는 억제시키는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 조성물은 소장의 두께 및 대장의 길이를 정상상태와 같이 유지시키는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 조성물은 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg) 및/또는 조절 B 세포(Regulatory B cell: Breg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 조성물은 염증으로 인해 감소된 미토콘드리아의 양을 증가시키고, 미토콘드리아 막의 손상을 억제시키는 것을 특징으로 하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 면역질환은 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 8에 있어서,

상기 면역질환은 베체트병, 다발성 근육염 또는 피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 미토콘드리아 관련 증후군 및 궤양성 대장염으로 이루어진 중으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 조성물에 함유된 메트포민:코엔자임 Q10는 10:1∼1:1의 중량비로 혼합되어 있는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
면역질환이 유발된 개체에 메트포민 및 코엔자임 Q10을 병용 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 치료방법.
청구항 11에 있어서,

상기 메트포민은 0.1∼20㎎/㎏, 코엔자임 Q10는 Q10 0.001∼10㎎/㎏으로 동시에 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 면역질환의 치료방법.
청구항 12에 있어서,

상기 투여는 메트포민과 코엔자임 Q10이 함께 함유된 복합제의 형태로 투여하거나, 메트포민과 코엔자임 Q10을 각각 개별적으로 동시에 투여하는 것을 특징으로 하는 면역질환의 치료방법.
청구항 13에 있어서,

상기 복합제는 메트포민:코엔자임 Q10이 10:1∼1:1의 중량비로 혼합되어 있는 것을 특징으로 하는 면역질환의 치료방법.
청구항 11에 있어서,

상기 개체는 인간을 제외한 포유동물인 것을 특징으로 하는 면역질환의 치료방법.