WO2015026205A1 - 다우리놀 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

다우리놀 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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daurinol
disease
immune diseases
treatment
composition
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조미라
신동윤
박민정
이선영
이성희
양은지
김은경
손혜진
이은정
김재경
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가톨릭대학교 산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to daurinol compounds and their use which can effectively prevent and treat immune diseases.
  • the immune system protects the body from harmful foreign antigens. These types of antigens include bacteria, viruses, toxins, cancer cells, blood and tissues of other people or animals. The immune system responds to these harmful substances and produces antibodies to eliminate them. However, when autoimmune disorders occur, the immune system cannot distinguish between healthy body organs and harmful antigens, destroying normal tissues, and autoimmune disease caused by this reaction occurs. When the autoimmune problem occurs, the reaction occurs to the normal tissue of the body. The cause of autoimmune abnormalities is not clear, but it is hypothesized that microorganisms or drugs, such as bacteria, cause disease in people born with genes susceptible to autoimmune diseases.
  • a number of chemical and biological immunotherapeutic methods have been developed for the treatment of autoimmunity.
  • a typical treatment is the use of chemicals such as steroids or anti-immune cell antibodies to attenuate the body's immune response as a whole.
  • administration of an antibody that binds to a CD22, CD20, CD19, CD74 or HLA-DR antigen results in attenuating the body's overall immune response, including the normal function of B cells.
  • Korean Unexamined Patent Publication No. 2008-0109705 relates to mesenchymal stem cell-mediated autologous dendritic cells with increased immunosuppressive ability, and discloses dendritic cells having improved T-cell suppression ability and uses of autoimmune diseases thereof.
  • US Pat. No. 7,074,403 relates to the treatment of autoimmune diseases using antibodies targeting B cells, and discloses antibodies that specifically bind to B-cell antigens.
  • US Pat. No. 7,473,592 relates to cell compositions for treating immunological diseases using cells from other subjects, and discloses T cell compositions coated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies.
  • autoimmune disease treatment consists of two types of steroids and immunosuppressants.
  • this method of treatment weakens the body's overall immune system over long periods of time, resulting in a side effect of lowering the body's immune function that can cope with external invasion and causing other diseases.
  • side effects such as systemic skin diseases caused by steroids were also caused.
  • the treatment of autoimmune diseases is mainly immunosuppressive drugs such as glucocorticoids, calcineurin inhibitors and proliferative inhibitors. It is based on the use of antiproliferatives-antimetabolites.
  • immunosuppressive drugs such as glucocorticoids, calcineurin inhibitors and proliferative inhibitors.
  • pharmacological therapies act on a variety of targets, and as a whole, may lower immune function. Otherwise, long-term use of these pharmacological therapies poses a problem for various cytotoxic actions, which can expose the patient to risk of infection and cancer by inhibiting the immune system in a nonspecific manner. Since calcineurin and glucocorticoids present another problem due to their nephrotoxicity and diabetes-inducing properties, their use is limited for some clinical symptoms (eg renal failure, diabetes, etc.).
  • autoimmune diseases including autoimmune diseases
  • diseases have become particularly interested in the types of treatment that are considered “natural” with no major side effects and with weak anti-inflammatory effects, which can be used as disease prevention and adjuvant therapy.
  • Many researchers are interested in the development of therapeutics.
  • Korean Patent No. 668,067 Korean Patent No. 668,067 has excellent anti-inflammatory activity.
  • Korean Patent No. 396,526 discloses that xantolizol isolated from Curcuma zantoriza loxb has anti-inflammatory activity and thus can be used for treating inflammatory diseases.
  • daurinol is a monochemical component of the arylnaphthalene lignan family, which was first isolated by the inventors from Haplophyllum dauricum, a Mongolian medicinal plant in the early 1980s, and the same genus Haplo. Haplophyllum cappadocicum has also been reported (Batsuren D, et al., Chemistry of Natural Compounds, 17, 223-225, 1982; Gozler B, et al., Phytochemistry, 31, 2473-2475, 1992). . However, to date no pharmacological activity of daurinol has been reported. Plants of the genus Haplophyllum are perennial grasses that are widely distributed in Central Asia and have been used for traditional folk remedies for various diseases for hundreds of years.
  • the present inventors have found that the daurinol compound has an activity of inhibiting the production of IL-17 and TNF- ⁇ , which are inflammatory inducing agents, and confirmed that the daurinol compound can be used as a therapeutic agent for immune diseases.
  • the invention has been completed.
  • a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of immune diseases which comprises a daurinol compound as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a health functional food composition for the prevention and improvement of immune diseases comprising a daurinol compound as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of immune diseases comprising daurinol represented by the following formula (1) as an active ingredient.
  • the immune disease is osteoarthritis, Rheumatoid Arthritis, Asthma, Dermititis, Psoriasis, Cystic Fibrosis, Late organ transplantation and chronic Post transplantation late and chronic solid organ rejection, Multiple Sclerosis, systemic lupus erythematosus, Sjogren syndrome, Hashimoto thyroiditis, polymyositis, scleroderma (scleroderma), Addison disease, Vitiligo, pernicious anemia, glomerulonephritis, pulmonary fibrosis, Inflammatory Bowel Mal Malohns disease ), Autoimmune Diabetes, Diabetic retinopathy, Rhinitis, Ischemia-reperfusion injury, Post-angioplas ty restenosis, Chronic obstructive pulmonary diseases (COPD), Graves disease, Gastrointestinal allergy, Conjunctivitis, Atherosclerosis, Coronary artery disease ), Angina, cancer met
  • the daurinol may be isolated from the extract of the plant Haplophyllum (Haplophyllum).
  • the composition may exhibit a therapeutic effect by controlling the secretion of inflammatory cytokines.
  • the inflammatory cytokine may be IL-17 or TNF- ⁇ .
  • the composition exhibits at least one effect of inhibiting osteoclast differentiation, reducing joint inflammation, reducing bone destruction, and reducing cartilage damage. It may be to indicate.
  • the composition exhibits at least one effect of inhibiting proliferation of alloreactive T cells and / or increasing expression of Regulatory T cells (Treg). It may be to exhibit an effect of preventing or treating an immune disease.
  • the present invention also provides a health functional food composition for the prevention and improvement of immune diseases comprising daurinol represented by the following formula as an active ingredient.
  • the daurinol compound according to the present invention is excellent in inhibiting the production of inflammatory cytokines causing inflammatory reactions, thereby showing a therapeutic effect on arthritis and inflammatory bowel disease, inhibiting the proliferation of allogeneic reactive T cells, and regulating T cells. It can be used as a pharmaceutical composition to treat and prevent immune diseases because it can alleviate the rejection after transplantation by increasing the expression of.
  • the daurinol of the present invention is a natural substance derived from Haplophyllum dauricum or Haplophyllum cappadocicum, which is a Mongolian medicinal plant. It can be used as a functional health food composition that can prevent and improve the.
  • 1 is a graph showing the results of arthritis index evaluation to determine the effect of rheumatic arthritis by daurinol in arthritis animal model.
  • Figure 2 is the result of measuring the amount of IgG in serum after administration of daurinol in the animal model arthritis.
  • Figure 3 is the result of observing the degree of inflammation, bone destruction and cartilage damage in the joints after administration of daurinol to arthritis animal model through tissue staining.
  • Figure 4 shows the results of observing the expression changes of the inflammatory cytokines IL-17, IL-6, IL-1beta and TNF- ⁇ after administration of daurinol in the animal model arthritis.
  • Figure 6 shows the results of observing the inhibitory effect of daurinol and Th17 / Treg cell activity in the obese arthritis animal model.
  • FIG. 7 shows the results of observing IL-17 secretion inhibition (A) and TNF- ⁇ secretion inhibitory effect (B) and cytotoxicity according to daurinol concentration in vitro (D).
  • FIG. 8 shows the results of observing the effects of daurinol on phospho STAT3 and phopho m-TOR signaling using daurinol-treated CD4 + T cells.
  • Figure 13 shows the results of observing weight change (A), disease activity (B) and intestinal length change (C) according to the administration of daurinol in an animal model of inflammatory bowel disease, and the destruction of colon tissues is reduced by daurinol.
  • Figure 14 shows changes in the expression of inflammatory cytokines TNF- ⁇ , IL-6, IL-8, IL-1b and IL-17 in intestinal tissues by daurinol (A) and changes in mouse and human VEGF expression (B, It is the result of measuring C).
  • Figure 15 shows the results of measuring changes in inflammatory cytokines (IL-17, IFNr and IL-6) expression (top graph) and antibody (IgG, IgG1, IgG2 and IgG3) production in serum of animal models of inflammatory bowel disease.
  • Figure 16 measures the effect of inhibiting the production of daurinol IgG antibody (A), IL-17 and TNF- ⁇ inflammatory cytokine expression (B) in the Lupus animal model (C) One result.
  • the present invention is characterized in that it provides a novel use of the daurinol compound as a therapeutic agent for a new immune disease that has excellent anti-inflammatory activity isolated from natural products and does not cause intracellular toxicity.
  • the daurinol of the present invention is a single chemical component of the arylnaphthalene lignan family derived from Haplophyllum dauricum or Haplophyllum cappadocicum, which is a Mongolian medicinal plant. It is indicated by 1.
  • Haplophyllum dauricum (L.) G. Don. Is collected from the Uvurkhangaiskii aimak province of Mongolia, and can be extracted using ethanol as a solvent. Daurinol is present in many of the above-ground parts of the plant, but can also be separated from the root of the plant.
  • the extract can be fractionated using petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, butanol, among which the chloroform fractions are separated using a silica gel column (1:10), and various proportions of benzene-chloroform solvent are separated. Can be eluted.
  • daurinol can be separated by fractional crystallization using methanol as a solvent.
  • the daurinol of the present invention can be used by extracting and separating from a specific Haplophyllum genus plants such as Haplophyllum dauricum, Haplophyllum cappadocicum, etc. It may be prepared and used using chemical synthesis methods well known in the art.
  • the daurinol compound has excellent anti-inflammatory activity and can be used as a therapeutic agent for immune diseases.
  • the daurinol compound is an inflammatory cytokine, IL-17 and TNF- ⁇ . Inhibition of the expression of the immune disease was shown to have a therapeutic and prophylactic effect (see Fig. 7).
  • composition of the present invention was also found to exert an inhibitory effect on the rejection after transplantation, that is, the proliferation of homologous reactive T cells was inhibited in the experimental group treated with the composition containing daurinol (see FIG. 10), IL-17 Production was inhibited (see FIG. 11), and proliferation of regulatory T cells was shown to increase (see FIG. 12).
  • composition of the present invention can be used for the treatment or prophylactic use of immune diseases.
  • the immune disease in the present invention may be a disease due to the excessive production of inflammatory cytokines IL-17 and TNF- ⁇ .
  • autoimmune diseases include i) Rheumatoid Arthritis, in which the immune system attacks tissues of various joints, ii) Inflammatory Bowel Diseases, which are diseases caused by the immune system attacking the intestine. Transplantation of other cells, tissues, and organs entirely results in an immune response mainly involving cellular immunity, resulting in destruction of the graft and rejection of the graft after the graft is excreted.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of immune diseases, including daurinol as an active ingredient.
  • the daurinol compound according to the present invention may be used in the form of a salt, preferably a pharmaceutically acceptable salt.
  • the salt is preferably an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid, and an organic acid and an inorganic acid may be used as the free acid.
  • the organic acid is not limited thereto, citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, metasulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-toluenesulfonic acid, Glutamic acid and aspartic acid.
  • the inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid.
  • compositions according to the invention may comprise pharmaceutically effective amounts of daurinol compounds alone or may comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount herein refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate, and treat the symptoms of an immune disease, wherein the daurinol compound is 0.01 to 70 to a concentration of 5 ⁇ M to 25 ⁇ M or the total weight of the composition. It may be contained in weight percent.
  • the pharmaceutically effective amount of the daurinol compound according to the present invention is 0.5 to 100 mg / day per kg body weight, preferably 0.5 to 10 mg / day per kg body weight.
  • the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on the degree of symptoms of the immune disease, the age, weight, health condition, sex, route of administration, and duration of treatment of the patient.
  • the term 'pharmaceutically acceptable refers to a composition which is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness or the like when administered to humans.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • composition according to the invention can be administered via several routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, the dosage of the active ingredient being determined by several factors such as the route of administration, the age, sex, weight and severity of the patient. It may be appropriately selected depending on.
  • the composition for the prevention and improvement of the symptoms of the immune disease of the present invention can be administered in parallel with a known compound having the effect of preventing, improving or treating the symptoms of the immune disease.
  • the daurinol compound according to the present invention does not cause toxicity to cells and does not cause side effects, and thus can be used safely in the body, so it can be used as a food composition for the prevention and improvement of immune diseases.
  • a food composition for the prevention and improvement of immune diseases comprising the daurinol compound as an active ingredient is a food, which is effective for the prevention and improvement of symptoms of immune diseases, such as the main ingredients, secondary ingredients, food additives, functional foods or beverages of food. It can be utilized easily.
  • the food means a natural product or a processed product containing one or more nutrients, and preferably means a state in which it can be directly eaten through a certain processing step, and as a conventional meaning, It includes all foods, food additives, functional foods and beverages.
  • Foods to which the composition for preventing and improving the symptoms of immune diseases according to the present invention may be added include, for example, various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, functional foods, and the like.
  • food includes special nutritional products (e.g., formulated milk, young, infant food, etc.), processed meat products, fish products, tofu, jelly, noodles (e.g. ramen, noodles, etc.), bread, health supplements, seasonings.
  • Foods e.g. soy sauce, miso, red pepper paste, mixed soy sauce
  • sauces confectionery (e.g. snacks), candy, chocolates, gums, ice creams, dairy products (e.g.
  • fermented milk, cheese, etc. other processed foods
  • kimchi, Pickled foods various kimchi, pickles, etc.
  • beverages e.g., fruit drinks, vegetable drinks, soy milk, fermented beverages, etc.
  • natural seasonings e.g. ramen soup, etc.
  • the food, beverage or food additives may be prepared by a conventional manufacturing method.
  • the functional food is a biological defense rhythm control, disease prevention and recovery of a food group or a food composition that has added value to the food by using physical, biochemical, biotechnological techniques, etc. to function and express the function of the food for a specific purpose. It means a food that is designed and processed to fully express the body regulatory function related to the living body, specifically, it may be a health functional food.
  • the functional food may include food acceptable food additives, and may further include appropriate carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of functional foods.
  • the drink means a generic term for drinking to quench thirst or enjoy a taste and includes a functional drink.
  • the beverage contains, as an essential ingredient, a composition for the prevention and amelioration of the symptoms of the immune disease as an essential ingredient, and there are no particular restrictions on the other ingredients, and it contains various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks. can do.
  • the food containing the composition for the prevention and amelioration of the symptoms of the immune disease in addition to the above-mentioned is a variety of nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, such as flavoring agents, colorants and fillers ( Cheeses, chocolates, and the like), pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the components can be used independently or in combination.
  • the amount of the composition according to the present invention may comprise from 0.001% to 90% by weight of the total food weight, preferably 0.1% by weight To 40% by weight, and in the case of a beverage, it may be included in a ratio of 0.001g to 2g, preferably 0.01g to 0.1g based on 100ml, but for health and hygiene purposes or for health control purposes.
  • long-term intake to be less than the above range, since the active ingredient has no problem in terms of safety can be used in an amount above the above range is not limited to the above range.
  • type 2 collagen (Cll) was dissolved in 0.1N acetic acid solution to 4 / ml, followed by dialysis buffer, Dialysis with 50mM Tris, 0.2N Nacl) and mixed in the same amount with complete Freund's adjuvant (CFA, Chondrex) containing M. tuberculosis and subcutaneously injected into the base of the tail of the mouse to give an immunogen 100 per mari Injection was made in ⁇ l (ie 100 ⁇ l / 100 ⁇ g) (first injection).
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • arthritis evaluation was averaged by dividing the scores of the three legs except the legs to which CII / CFA was administered at the second dose per dividing according to the following scale, divided by three, and then obtained by three observers in each animal model. The average value divided by summing was used.
  • the scores and criteria according to arthritis evaluation are as follows.
  • the best arthritis index per head is 4, so the best disease index per mouse is 16.
  • IgG, IgG1 and IgG2 were used as standard by diluting 1/2, and the cell culture supernatant was added and reacted at room temperature for 2 hours. Thereafter, the biotinylated secondary antibody was reacted at room temperature for 2 hours, washed four times, and then diluted with an ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate, followed by reaction at room temperature for 2 hours. Thereafter, PNPP / DEA solution was added, followed by color development, and absorbance at 405 nm was measured.
  • IL-17, IL-6, IL-1beta and TNF- ⁇ 10% normal goat serum was applied to block nonspecific reactions for 30 minutes, and anti-mouse IL-17, anti-mouse IL -6, anti-mouse IL-1beta and anti-mouse TNF- ⁇ ab were incubated overnight at 4 after application on tissue. Then, the mixture was reacted with HRP for 2 hours and then observed under a microscope.
  • the inflammatory cytokines IL-17 and IL-6 are expressed in the joints of the arthritis animal model induced by collagen.
  • IL-1beta and TNF- ⁇ expression was significantly increased, but their expression was significantly reduced in daurinol injected animals (Fig. 4). Therefore, it can be seen that the daurinol of the present invention can treat the disease by significantly reducing the expression of inflammatory cytokines.
  • ICR mice (6-9 weeks, males) were distal to the cervical spine and then disinfected with 70% ethanol.
  • the skin of the tibia was cut in to remove the attachment muscles.
  • the tibia was dissected and the patella was dislocated to remove the tibia. Both ends of the bone were cut a little, and a 25G needle was inserted at one end, and ⁇ -MEM was flowed to collect bone marrow cells in a test tube. After centrifugation, the cells were suspended in ⁇ -MEM and 2 times Gey's solution was added to remove red blood cells. After centrifugation, the cells were resuspended in ⁇ -MEM containing 10% FBS and then cultured.
  • the cultured bone marrow cells were cultured overnight at 10ng / ml for macrophage colony stimulating factor (hereinafter, simply referred to as 'M-CSF'), and then the cells were further incubated with M-CSF 30ng / ml for 3 days.
  • Bone marrow macrophages (hereinafter referred to as 'BMM') were produced.
  • the resulting BMMs were recovered and cultured in 1 ⁇ 10 5 cells / well for 4 days in the presence of 50ng / ml of the receptor activator of NF- ⁇ B ligand (RANKL) and 30ng / ml of M-CSF.
  • RNKL NF- ⁇ B ligand
  • TRAP thyroid-resistant acid phosphatase
  • IL-17 inflammatory cytokines expressed after treatment with daurinol (1 and 5 ⁇ M) and anti-CD3 (0.5 ⁇ g / ml) in spleen cells of an obese-derived rheumatoid arthritis animal model were evaluated by ELISA. As a result, it was confirmed that daurinol inhibits the expression of IL-17 in a concentration-dependent manner (see FIG. 6A).
  • Th17 / Treg cell activity was confirmed by spleen cells of the obese arthritis animal model.
  • spleen cells of the obese arthritis animal model were treated with daurinol (1 ⁇ M) and anti-CD3 (0.5 ⁇ g / ml), and then cultured for 3 days.
  • Flow cytometry of the activity of Th17 / Treg cells regulated by daurinol significantly inhibited the expression of IL-17 expressed in obese arthritis animal models, and simultaneously induced the activity of Foxp3 + Treg cells. (See Figure 6B).
  • the anti-CD3 antibody was treated with 0.5 ⁇ g / ml of the splenocytes cell line to induce the secretion of IL-17, or the LPS was treated with 100ng / ml to induce the secretion of TNF- ⁇ . Then, after treatment with daurinol 0.5, 2. 5, 20 ⁇ M respectively, the supernatant was collected and the amount of IL-17 and TNF- ⁇ was investigated using a sandwich ELISA. The reaction was performed overnight at 4 ° C. in a monoclonal anti-IL-17 or anti-TNF- ⁇ 2 ⁇ g / ml in a 96-well plate, after which the non-specific binding was blocked with a blocking solution (1% BSA / PBST).
  • a blocking solution 1% BSA / PBST
  • IL-17 recombinant or TNF- ⁇ was used as a standard by diluting serially by 1/2, and the cell culture supernatant was added and reacted at room temperature for 2 hours. Thereafter, the biotinylated anti-IL-17 was reacted at room temperature for 2 hours and washed four times. Then, the ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate was diluted and added and reacted at room temperature for 2 hours. Thereafter, PNPP / DEA solution was added, followed by color development, and absorbance at 405 nm was measured.
  • the secretion of IL-17 decreased concentration-dependently with the treatment of daurinol, the secretion of which was reduced by 50% at 2 ⁇ M, and no secretion was detected at 20 ⁇ M (see FIG. 7A).
  • the secretion of TNF- ⁇ was also reduced by the treatment of daurinol, and when treated with 20 ⁇ M of daurinol, the secretion was confirmed to decrease by nearly 40% (see FIG. 7B).
  • the daurinol compound of the present invention inhibits inflammatory cytokine secretion, thereby inhibiting osteoclast differentiation, and as a result, has a therapeutic effect on arthritis.
  • MTT assay was conducted to observe cytotoxicity by daurinol treatment.
  • splenocytes cell lines (2 ⁇ 10 5 ) were laid on 96-well plates, treated with Daurinol MTT reagent, wrapped with aluminum foil, and reacted at 37 ° C. for 4 hours. After 4 hours, the crystals produced by DMSO were dissolved and the absorbance was measured using an ELISA reader. As a result of the measurement, the cytotoxicity according to the concentration of daurinol did not appear significantly (see FIG. 7C).
  • CD4 + T cells were isolated from normal mice, treated with daurinol (5 ⁇ M) under 0.5 ⁇ g / ml of anti-CD3 antibody, incubated for 3 days, and the cells were lysed to extract proteins. The extracted protein was then subjected to SDS-PAGE electrophoresis, followed by electrophoretic transfer of the proteins onto a nitrocellulose membrane, followed by blocking reaction for 1 hour with 5% skim milk, STAT3, STAT3p705, STAT3p727 and phospho m-TOR.
  • the present inventors confirmed the therapeutic effect of the daurinol compound as described above, and it was confirmed whether the daurinol compound can alleviate the transplant rejection reaction, which is another immune disease.
  • mice treated with daurinol compared with the control group of the transplant disease improved the disease level of the rejection disease and the survival of the mice was also maintained for 30 days. It was confirmed (see FIG. 9).
  • Daurinol inhibits T cell proliferation and changes in IL-17 expression
  • daurinol inhibited T cell proliferation in a concentration dependent manner (see FIG. 10), and also appeared to inhibit the expression of IL-17 (see FIG. 11). Therefore, it was confirmed that daurinol has an effect of suppressing rejection after transplantation.
  • Treg regulatory T lymphocytes
  • the present inventors analyzed the T cells isolated in Example ⁇ 4-2> with a flow cytometer to determine how the daurinol compound according to the present invention affects the activity of Treg cells, which are immunoregulatory cells. That is, the T cells isolated in Example ⁇ 4-2> were collected and washed with FACs buffer, and then blocked with FACs buffer for 5 minutes at 4 ° C. in order to inhibit nonspecific binding. Anti CD4 percp cy5.5 and anti CD25 APC were added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes and washed with FACs buffer. 100ul each of Cytoperm / cytofix buffer was added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes and washed with perm wash buffer.
  • the blocking was reacted at 4 ° C. for 15 minutes and then washed with perm wash buffer. Meanwhile, Anti Foxp3 PE was added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes, followed by washing with perm wash buffer. The stained cells were washed with buffer and analyzed using a flow cytometer (FACs, fluorescent-activated cell sorter).
  • FACs fluorescent-activated cell sorter
  • the inventors of the present invention in order to determine whether the treatment of the daurinol inflammatory bowel disease of the present invention, first produced an inflammatory bowel disease induction animal model.
  • C57BL / 6 (H-2kb) mice were used as test animals.
  • mice were inoculated with 3.5% dextran sulfate sodium (DSS) water for 1 week. Intestinal disease induction animal models were constructed.
  • DSS dextran sulfate sodium
  • the weight of the daurinol group was significantly improved compared to the inflammatory bowel disease-induced animal model group, and it was confirmed that over time, the weight was similar to that of the normal control group.
  • the body weight of the inflammatory bowel disease animal model was maintained similar to that of the TNF- ⁇ inhibitor, and it was found to inhibit and control the disease (see FIG. 13A).
  • one of the characteristics of inflammatory bowel disease is that the shortening of the damaged intestinal length of the large intestine is associated with disease activity, so to analyze the treatment effect of inflammatory bowel disease following daurinol treatment, two weeks after the administration of daurinol The experimental animals were euthanized and the length of the intestine was measured. As a result, it was confirmed that the daurinol treated group showed a significant increase in the intestinal length compared to the animal model of inflammatory bowel disease, showing the intestinal length close to the normal control group (see FIG.
  • tissue H & E hematoxylin and eosin staining was performed to investigate whether the destruction of colon tissue was reduced by daurinol to confirm histological findings and inflammatory cytokine expression.
  • tissue H & E hematoxylin and eosin staining was performed to investigate whether the destruction of colon tissue was reduced by daurinol to confirm histological findings and inflammatory cytokine expression.
  • daurinol was found to be responsible for the expression of inflammatory cytokines TNF- ⁇ , IL-6, IL-8, IL-1b and IL-17, which are associated with inflammatory bowel disease. Significantly inhibited (see FIG. 14A).
  • Serum was isolated from the blood of each mouse treated with inflammatory bowel disease (IBD) mice induced with inflammatory bowel disease, daurinol, and a TNF- ⁇ inhibitor.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • daurinol inflammatory bowel disease
  • TNF- ⁇ inhibitor a TNF- ⁇ inhibitor
  • Inflammatory cytokines such as IL-17, IFNr, and IL-6, which are inflammatory cytokines, were measured in the isolated serum using ELISA techniques.
  • daurinol significantly inhibited the expression of this inflammatory cytokine (see the upper graph of FIG. 15).
  • daurinol reduced the antibodies of IgG, IgG1, IgG2 and IgG3 (see graph below in Figure 15).
  • daurinol reduces the expression of inflammatory cytokines as well as the formation of antibodies in animal models of inflammatory bowel disease, it may also inhibit and regulate immune responses to autoantibodies and B cell-related inflammatory responses.
  • splenocytes of Lupus animal model were treated with daurinol (1 and 5 ⁇ M) and LPS (100 ng / ml) for 3 days, and then the IgG antibody expressed was evaluated by ELISA. As a result, it was confirmed that daurinol inhibits IgG antibody production in a concentration-dependent manner (see FIG. 16A).
  • spleen cells of the Lupus animal model were treated with daurinol (1 and 5 ⁇ M) and anti-CD3 (0.5 ⁇ g / ml) or LPS (100 ng / ml) for 3 days.
  • the expression of IL-17 and TNF- ⁇ inflammatory cytokines that were subsequently expressed by ELISA showed that daurinol inhibited the expression of IL-17 and TNF- ⁇ in a concentration-dependent manner. Excellent effect was seen (see FIG. 16B).
  • Th17 / Treg cell activity splenocytes of the Lupus animal model were treated with daurinol (1 ⁇ M) and anti-CD3 (0.5 ⁇ g / ml) and incubated for 3 days.
  • Daurinol As a result of flow cytometry evaluation of the activity of Th17 / Treg cells regulated by daurinol, Daurinol not only inhibited the activity of Th17 expressed in the Lupus animal model, but at the same time induced the activity of Foxp3 + Treg cells (see FIG. 16C). ).

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Abstract

본 발명의 다우리놀 화합물은 염증반응을 유발시키는 염증성 사이토카인인 IL-17 및 TNF-α의 생성을 억제하는 활성이 우수하여 관절염 및 염증성 장 질환에 탁월한 치료 효과를 나타내고, 동종 반응성 T 세포의 증식을 억제하고 조절 T 세포를 증가시켜 이식 후 거부반응을 완화시킬 수 있어, 본 발명에 따른 다우리놀 화합물은 면역질환을 치료 및 예방할 수 있는 약학적 조성물로 활용 가능하다. 또한, 본 발명의 다우리놀 화합물은 몽골 약용 식물인 하플로필럼 다우리쿰(Haplophyllum dauricum) 또는 하플로필럼 카파도시쿰(Haplophyllum cappadocicum)으로부터 유래한 천연 물질로 세포에 독성을 유발하지 않기 때문에 면역질환을 예방 및 개선할 수 있는 기능성 건강식품용 조성물로 활용할 수 있을 것이다.

Description

다우리놀 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물
본 발명은 면역질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 다우리놀 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다.
면역체계는 해로운 외부물질인 항원으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다. 이러한 항원의 종류로는 박테리아, 바이러스, 독소, 암세포, 다른 사람 혹은 동물의 혈액과 조직이 이에 해당된다. 면역체계는 이러한 해로운 물질에 반응하여 이를 제거하기 위하여 항체를 생산한다. 그러나 자가 면역에 이상이 생긴 경우, 면역체계는 자신의 건강한 신체 장기와 해로운 항원을 구분하지 못하여, 정상적인 조직을 파괴하게 되며, 이러한 반응으로 인해 야기되는 자가 면역 질환(autoimmune disease)이 발생하게 된다. 자가 면역에 이상이 생긴 경우에는 신체의 정상적인 조직을 대상으로 반응이 일어나게 된다. 자가면역 이상의 원인은 확실치 않으나, 박테리아와 같은 미생물 또는 약물이 자가 면역 질환에 걸리기 쉬운 유전자를 가지고 태어난 사람들에게 병을 유발하는 것이라는 가설이 있다.
자가면역 치료를 위해 다수의 화학적 및 생물학적 면역치료 방법이 개발되었다. 전형적 치료방법은 스테로이드 같은 화학제 또는 항-면역 세포항체를 이용하여 신체의 면역반응을 전체적으로 약화시키는 것이다. 예를 들어 CD22, CD20, CD19, CD74 또는 HLA-DR 항원에 결합하는 항체를 투여하여, B 세포의 정상기능을 포함한 신체의 전체적 면역반응을 약화시키는 것이다.
대한민국 공개특허공보 제2008-0109705호는 면역억제능이 증가된 간엽줄기세포-매개 자가유래 수지상세포에 관한 것으로, T-세포 억제능이 향상된 수지상 세포 및 이의 자가면역질환 용도를 개시한다.
미국특허 제7,074,403호는 B 세포를 표적으로 하는 항체를 이용한 자가면역 질환의 치료법에 관한 것으로, B-세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 개시한다.
미국특허 제7,473,592호는 다른 대상체 유래의 세포를 사용한 면역질환 치료용 세포 조성물에 관한 것으로, 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 T 세포 조성물을 개시한다.
종래 자가 면역질환 치료는 크게 스테로이드 제제와 면역억제제 두 가지로 이루어져 있다. 그러나 이러한 치료 방법은 장기간 사용시 신체의 전반적 면역시스템을 약화시키는 것으로, 외부의 침입에 대응할 수 있는 신체의 면역기능을 전반적으로 떨어뜨려 다른 질환에 걸리게 하는 부작용을 초래하였다. 또한 스테로이드 제제로 인한 전신성 피부질환 등의 부작용을 초래하기도 하였다.
자가면역 질환의 치료방법을 탐색하여 적당한 약물과 방법을 찾고자 하는 집중적인 노력을 통해, 자가면역 질환의 치료는 주로 면역억제 약물, 예컨대 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitors) 및 증식억제제-대사물 작용 억제제(antiproliferatives-antimetabolites)의 사용에 근거한 것이다. 그러나 이와 같은 약리 요법은 다양한 표적들에 대하여 작용하므로, 전체적으로는 면역기능을 저하시킬 수 있다. 그렇지 않으면, 이러한 약리 요법을 장기간 사용하였을 경우 여러 가지 세포 독성 작용이 문제가 되어, 면역 체계를 비특이적인 방식으로 억제함으로써, 환자를 감염증 및 암에 걸릴 위험에 노출시킬 수 있다. 칼시뉴린과 글루코코르티코이드는, 그들의 신독성과 당뇨병 유발 특성에 기인하여 또 다른 문제점을 나타내기 때문에, 몇 가지 임상학적 증상의 경우(예: 신기능 부전, 당뇨병 등)에는 그 사용이 제한된다.
이러한 이유로, 자가면역질환을 포함하는 면역질환을 가지는 환자는 질병 예방 및 보조 치료로서 사용될 수 있는, 주된 부작용이 없고 약한 소염 효과를 갖는 "천연"으로 간주되는 치료 유형에 특히 관심을 갖게 되었고, 천연 유래의 치료제 개발에 많은 연구자들의 관심이 증대되고 있다.
이에 최근에는 부작용이 적고 안정적인 치료제를 개발하기 위해 천연물에 연구가 진행되고 있는데, 이러한 종래기술로는 대한민국 등록특허 제668,067호에 생각으로부터 분리한 페닐부테노이드 유도체 화합물이 항염 활성이 우수하다는 내용이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제396,526호에는 커큐마 잔토리자 록스브로부터 분리한 잔토리졸이 항염 활성을 가지고 있어 염증질환 치료 용도로 사용할 수 있다는 내용이 개시되어 있다.
한편, 다우리놀은 아릴나프탈렌 리그난(arylnaphthalene lignan) 계열의 단일화학 성분으로, 1980년도 초반에 본 발명자들이 몽골 약용 식물인 하플로필럼 다우리쿰(Haplophyllum dauricum)으로부터 처음 분리하였으며, 같은 속인 하플로필럼 카파도시쿰(Haplophyllum cappadocicum)등에서도 보고되었다(Batsuren D, et al., Chemistry of Natural Compounds, 17, 223-225, 1982; Gozler B, et al., Phytochemistry, 31, 2473-2475, 1992). 그러나 현재까지 다우리놀에 대한 약리학적 활성은 전혀 보고되지 않았다. 하플로필럼(Haplophyllum) 속 식물은 중앙아시아 지방에 광범위하게 분포 하고 있는 다년생 풀이며, 수백 년간 다양한 질병을 대상으로 전통적인 민간요법에 이용되었다.
이에 본 발명자들은 다우리놀 화합물이 염증반응 유발물질인 IL-17 및 TNF-α의 생성을 억제하는 활성이 있음을 발견하고, 다우리놀 화합물이 면역질환의 치료제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 다우리놀(daurinol) 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 다우리놀 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 개선용 건강 기능성 식품용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 다우리놀(daurinol)을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014007848-appb-I000001
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Dieseses), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술 후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergy), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(Mitochondrial disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다우리놀(daurinol)은 하플로필럼(Haplophyllum) 속 식물의 추출물로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 염증성 사이토카인의 분비를 조절하여 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 IL-17 또는 TNF-α인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 파골세포 분화의 억제, 관절 내 염증의 감소, 골 파괴의 감소 및 연골 손상의 감소 중에서 하나 이상의 효과를 나타내는 것을 특징으로 하여 면역질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 동종 반응성 T 세포(alloreactive T cell)의 증식 억제 및/또는 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg)의 발현 증가 중에서 하나 이상의 효과를 나타내는 것을 특징으로 하여 면역질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식으로 표시되는 다우리놀(daurinol)을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 개선용 건강기능성 식품용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014007848-appb-I000002
본 발명에 따른 다우리놀 화합물은 염증반응을 유발시키는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 활성이 우수하여 관절염과 염증성 장 질환에 치료 효과를 나타내고, 동종 반응성 T 세포의 증식을 억제하고, 조절 T 세포의 발현을 증가시켜 이식 후 거부반응을 완화시킬 수 있으므로 면역질환을 치료 및 예방할 수 있는 약학적 조성물로 활용 가능하다. 또한, 본 발명의 다우리놀은 몽골 약용 식물인 하플로필럼 다우리쿰(Haplophyllum dauricum) 또는 하플로필럼 카파도시쿰(Haplophyllum cappadocicum)으로부터 유래한 천연 물질로 세포에 독성을 유발하지 않기 때문에 면역질환을 예방 및 개선할 수 있는 기능성 건강식품용 조성물로 사용할 수 있다.
도 1은 관절염 동물모델에서 다우리놀에 의한 류마티스 관절염 치료 효과를 판단하기 위한 관절염 지수 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 관절염 동물모델에 다우리놀을 투여한 후 혈청 내 IgG 양을 측정한 결과이다.
도 3은 관절염 동물모델에 다우리놀을 투여한 후, 관절 내 염증, 골파괴 및 연골 손상 정도를 조직 염색법을 통해 관찰한 결과이다.
도 4는 관절염 동물모델에 다우리놀을 투여한 후, 염증성 사이토카인인 IL-17, IL-6, IL-1beta 및 TNF-α의 발현 변화를 관찰한 결과이다.
도 5는 시험관 내에서 다우리놀 처리에 의한 파골 세포 분화 정도를 관찰한 결과이다.
도 6은 비만관절염 동물모델에서 다우리놀의 염증억제 효과와 Th17/Treg 세포의 활성 조절 효과를 관찰한 결과이다.
도 7은 시험관 내에서 다우리놀 처리에 의한 IL-17 분비 억제(A) 및 TNF-α 분비 억제 효과(B), 및 다우리놀 농도에 따른 세포독성을 관찰한 결과(C)이다.
도 8은 다우리놀을 처리한 CD4+T 세포를 이용하여 다우리놀이 phospho STAT3 및 phopho m-TOR 신호전달에 미치는 영향을 관찰한 결과이다.
도 9는 동물모델의 무게, 질병도 및 생존도를 측정하여, 다우리놀에 의한 이식거부질환(GVHD) 치료 효과를 조사한 결과이다.
도 10은 시험관 내에서 다우리놀 처리에 의한 이식 후 거부반응에 관여하는 T 세포 증식 억제 효과를 관찰한 결과이다.
도 11은 시험관 내에서 다우리놀 처리에 의한 이식 후 거부반응에 관여하는 IL-17 생성 억제 효과를 관찰한 결과이다.
도 12는 시험관 내에서 다우리놀 처리에 의한 이식 후 거부반응에 관여하는 조절 T 세포의 증식 효과를 관찰한 결과이다.
도 13은 염증성 장 질환 동물모델의 다우리놀 투여에 따른 몸무게 변화(A), 질병 활성도(B) 및 장 길이 변화(C)를 관찰한 결과와, 다우리놀에 의해 대장 조직의 파괴가 감소되었는지를 조사하기 위한 조직 H&E(hematoxylin and eosin) 염색 결과이다(D).
도 14는 다우리놀에 의한 장 조직 내 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6, IL-8, IL-1b 및 IL-17의 발현 변화(A)와 마우스 및 사람 VEGF 발현의 변화(B,C)를 측정한 결과이다.
도 15는 염증성 장 질환 동물 모델의 혈청 내 염증성 사이토카인(IL-17, IFNr 및 IL-6) 발현 변화(위쪽 그래프)와 항체(IgG, IgG1, IgG2 및 IgG3) 생성 변화를 측정한 결과이다.
도 16은 루프스 동물 모델에서 다우리놀의 IgG 항체 생성 억제 효과(A), IL-17 및 TNF-α 염증성 사이토카인 발현 억제 효과(B) 및 Th17/Treg 세포의 활성 조절 효과(C)를 측정한 결과이다.
본 발명은 천연물로부터 분리한 항염 활성이 우수하고 세포 내 독성을 유발하지 않는 새로운 면역질환의 치료제로서 다우리놀 화합물의 신규한 용도를 제공한다는 점에 특징이 있다.
본 발명의 다우리놀(daurinol)은 몽골 약용 식물인 하플로필럼 다우리쿰(Haplophyllum dauricum) 또는 하플로필럼 카파도시쿰(Haplophyllum cappadocicum)으로부터 유래한 아릴나프탈렌 리그난 계열의 단일 화학성분으로서, 하기 화학식 1로 표시된다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014007848-appb-I000003
상기 하플로필럼 다우리쿰[Haplophyllum dauricum (L.) G. Don.]은 몽골의 우불크한가이스키 아이막(Uvurkhangaiskii aimak) 지방에서 채집되며, 에탄올을 용매로 하여 추출할 수 있다. 다우리놀은 상기 식물의 지상부에 많이 존재하지만, 이 식물의 뿌리에서도 분리할 수 있다. 추출물은 석유 에테르(petroleum ether), 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 분획할 수 있으며, 이 중에서 클로로포름 분획물을 실라카겔 칼럼(1:10)을 이용하여 분리하고, 다양한 비율의 벤젠-클로로포름 용매를 이용하여 용리할 수 있다. 한편, 메탄올을 용매로 하여, 분별결정(fractional recrystallization) 함으로써 다우리놀은 분리할 수 있다.
본 발명의 다우리놀은 상기와 같은 방법으로 하플로필럼 다우리쿰(Haplophyllum dauricum), 하플로필럼 카파도시쿰(Haplophyllum cappadocicum) 등의 특정 하플로필럼(Haplophyllum) 속 식물로부터 추출 분리하여 사용하거나, 당업계에서 널리 알려진 화학 합성 방법을 이용하여 제조하여 사용할 수도 있다.
본 발명자들은 다우리놀 화합물이 항염 활성이 우수하여 면역질환의 치료제로 사용할 수 있음을 확인하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 다우리놀 화합물은 염증성 사이토카인인 IL-17 및 TNF-α의 발현을 억제하여 면역질환의 치료 및 예방 효과를 나타내는 것으로 나타났다(도 7 참조).
또한, 본 발명의 다우리놀 화합물을 관절염 동물모델에 투여한 결과 관절염 지수평가에서 관절염이 의미있게 감소한 것으로 확인되었고(도 1 참조), 관절염 혈청 내 IgG, IgG1 및 IgG2a가 현저히 감소하는 것으로 확인되었으며(도 2 참조), 동물모델의 관절 내 염증과 골파괴 및 연골 손상도 모두 의미있게 감소하는 것으로 나타났다(도 3 참조). 한편, 시험관 내 실험을 통하여 다우리놀을 처리하는 경우 골수 세포의 파골세포로의 분화도 현저히 저해할 수 있음이 확인되었다(도 5 참조).
본 발명의 조성물은 이식 후 거부반응의 억제 효과도 발휘하는 것으로 확인되었는데, 즉 다우리놀을 함유한 조성물을 처리한 실험군에서 동종 반응성 T 세포의 증식이 억제되고(도 10 참조), IL-17의 생성이 저해되며(도 11 참조), 조절 T 세포의 증식은 증가되는 것으로 나타났다(도 12 참조).
그리고, 본 발명의 조성물을 처리한 염증성 장 질환 동물 모델의 경우, 몸무게 감소를 개선할 수 있고, 질병 활성도(DAI)도 유의하게 감소하였으며, 장 길이도 정상 대조군과 거의 유사한 수준으로 관찰되었다(도 13 참조).
따라서 본 발명의 조성물은 면역질환의 치료 또는 예방적 용도로 사용될 수 있다.
특히, 본 발명에서의 면역질환은 염증성 사이토카인 IL-17 및 TNF-α의 과량 생성에 기인하는 질환일 수 있다.
더욱 상세하게는, 상기 면역질환은 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Dieseses), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술 후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergy), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(Mitochondrial disease) 등을 포함한다.
더욱 바람직하게는, 자가면역질환으로, i) 면역계가 각종 관절의 조직을 공격하는 류마티스관절염(Rheumatoid Arthritis), ii) 면역계가 장을 공격하여 나타나는 질환인 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Diseases) iii) 유전적으로 다른 세포, 조직, 장기의 이식에 의해 세포성 면역을 주체로 하는 면역반응이 일어나고, 이식조직의 파괴를 가져오며 이식편이 배설되는 이식 후 거부반응을 들 수 있다.
상기와 같은 면역질환의 치료 효과를 나타내는 본 발명에 따른 실험결과들을 토대로, 본 발명은 다우리놀을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 다우리놀(daurinol) 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양의 다우리놀 화합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말하며, 상기 조성물에 대해 다우리놀 화합물은 5 μM ~ 25 μM 의 농도 또는 조성물 총 중량에 대해 0.01 내지 70 중량%로 함유될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 다우리놀 화합물의 약학적으로 유효한 양은 체중 kg 당 0.5 ~ 100 mg/day, 바람직하게는 체중 kg 당 0.5 ~ 10 mg/day이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 면역질환의 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 '약학적으로 허용되는' 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 면역질환의 증상의 예방 및 개선용 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 다우리놀 화합물은 세포에 대한 독성을 유발하지 않고 부작용을 일으키지 않아 안정성이 있어 체내에 안심하고 사용할 수 있으므로 면역질환의 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물로도 사용할 수 있다.
그러므로 다우리놀 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 개선용 식품 조성물은 면역질환 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본 발명에서 상기 식품이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본 발명에 따른 면역질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 면역질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본 발명의 면역질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 면역질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001 중량% 내지 90 중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 40 중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
다우리놀의 관절염 치료 효과 분석
<1-1> 동물모델의 준비
시험동물은 7 주령의 수컷 DBA/1J계 마우스를 사용하였으며, 관절염 동물모델을 제조하기 위해, 제 2형 콜라겐(Cll)을 4/ml이 되도록 0.1N 아세트산 용액에 녹인 후 투석 완충액(dialysis buffer, 50mM Tris, 0.2N Nacl)으로 투석하여 M.투베르쿨로시스(M.tuberculosis)를 함유하는 complete Freund's adjuvant(CFA, Chondrex)와 동량으로 섞은 후 상기 마우스의 꼬리 기저부에 피하 주사하여 면역원을 마리당 100㎕(즉 100㎕/100㎍)으로 주사하였다(1차 주사). 이로부터 2주 후 동일한 CII를 동량의 incomplete Freud's adjuvant(IFA, Chondrex) 와 섞은 후 100㎕(즉 100㎕/100㎍)를 한쪽 뒷다리(발바닥(foot pad))에 주사하였다(2차 주사).
2차 주사를 통한 2차 면역 후 정맥으로 일주일에 3회씩 체중 kg 당 20mg의 다우리놀을 총 9회 주입하였고, 이때 상기 다우리놀은 DMSO:Crernophor EL:DW을 1:1:8로 혼합한 용매에 녹여서 사용하였으며, 각 군은 5마리씩을 대상으로 진행하였고 관절염 평가는 7주까지 평가하였다. 또한, 시험관내(in vitro) 시험을 위해 관절염 지수가 유의성 있게 차이나는 시기에 각 동물을 치사시켜, 하기와 같이 혈액, 관절조직 내에서 관절염의 병의 활성 정도와 다우리놀에 의한 치료 효과를 조사하였다.
<1-2> 관절염 지수평가
첫 번째 접종을 시작점으로 하여 3주 후부터 실험의 내용을 알고 있지 않은 관찰자 네 명이 일주일에 세 번씩 관절 염증의 위중도를 평가하여 7주까지 관찰하였다. 이 때 관절염 평가는 마리당 2차 접종 때 CII/CFA 를 투여한 다리를 제외한 나머지 세 다리에서 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 합하여 3 으로 나눈 평균치를 얻고, 다시 각 동물 모델에서 3명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용하였다. 관절염 평가에 따른 점수와 기준은 다음과 같다.
-평가 기준-
0점: 부종이나 종창이 없다.
1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적
2점: 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적
3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적
4점: 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우
마리당 최고의 관절염 지수는 4점이므로 마우스 1 마리당 최고의 질병 지수는 16 이다.
관찰 결과, 콜라겐으로 유도된 관절염 마우스 모델(collagen induced arthritis, CIA)은 4주가 지나면서 관절염 점수가 계속 증가하여 관절염 증상이 심해지는 것으로 나타나는 반면, 다우리놀을 주입한 동물모델에서는 관절염지수가 거의 증가하지 않은 것으로 나타났다(도 1 참조).
<1-3> 혈청 내 IgG, IgG1 및 IgG2a 측정
콜라겐으로 유도된 관절염 마우스 모델(collagen induced arthritis, CIA)에 다우리놀을 주입한 경우 혈청 내 IgG, IgG1 및 IgG2a의 양이 어떻게 변화하는지 측정하기 위하여, 다우리놀을 주입한지 3주가 경과한 마우스를 안락사 시키고 혈청을 채취하여 sandwich ELISA를 이용하여 IgG, IgG1 및 IgG2a의 발현 정도를 조사하였다. 96웰 플레이트에 단클론성 anti-IgG, anti-IgG1 및 anti-IgG2를 2g/ml으로 4℃에서 밤새 반응시키며, 반응 후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. 상업용 IgG, IgG1 및 IgG2를 1/2씩 연속 희석하여 standard로 사용하였으며, 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, biotinylated 2차 항체를 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후 4회 세척한 다음, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, PNPP/DEA 용액을 넣고 발색한 후 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 관절염 마우스 모델의 경우 IgG, IgG1 및 IgG2a가 과발현되었으나, 다우리놀 처리에 의해 IgG의 발현이 효과적으로 감소하는 것으로 나타났다(도 2 참조).
<1-4> 조직학적 검사
콜라겐에 의해 유도되는 관절염 동물 모델(collagen induced arthritis, CIA)에 다우리놀을 정맥 주사한 후 3주가 경과하고 실험동물을 안락사시켰다. 그 후, 마우스의 뒷발을 10% 포르말린(formalin)으로 고정하고 뼈에서 석회질을 제거한 후 파라핀을 묻혔다. 관절 절편(7㎛)을 준비하고 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하였다. 또한, 연골파괴 정도를 확인하기 위하여 톨루이딘블루(Toluidine blue)와 사프라닌 O(safranin O) 염색으로 조직학적 검사를 실시하였다.
조직학적 검사 결과, 콜라겐에 의해 유도된 관절염 동물모델의 관절은 많은 면역 세포들이 침식(infiltration) 되어 있었으며 판누스(pannus) 형성, 연골파괴 및 뼈 침식 등이 관찰되었다. 반면 다우리놀을 정맥 주사한 동물은 관절과 연골의 파괴정도가 심하지 않은 것으로 나타났다(도 3 참조).
<1-5> 염증성 사이토카인의 발현 측정
콜라겐에 의해 유도되는 관절염 동물 모델(collagen induced arthritis, CIA)에 다우리놀을 정맥 주사한 후 3주가 경과하고 실험동물을 안락사시켰다. 그 후, 마우스의 뒷발을 10% 포르말린(formalin)으로 고정하고 뼈에서 석회질을 제거한 후 파라핀을 묻혔다. 관절 절편(5㎛)을 준비하고 염색을 진행하기 전에 자일렌(xylen)을 이용하여 탈 파라핀 과정을 통과시킨 다음 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수시켰다.
IL-17, IL-6, IL-1beta 및 TNF-α의 발현을 조사하고자 10% 정상 염소 혈청을 도포하여 30분간 비특이적 반응을 차단하였으며, 반응 진행 후 anti-mouse IL-17, anti-mouse IL-6, anti-mouse IL-1beta 및 anti-mouse TNF-α ab를 조직위에 도포 후 4에서 밤새 배양하였다. 그 다음, HRP로 2시간 반응한 다음 현미경으로 관찰하였다.
상기 동물모델군을 대상으로 IL-17, IL-6, IL-1beta 및 TNF-α의 발현을 확인한 결과, 콜라겐에 의해 유도된 관절염 동물모델의 관절에서는 염증성 사이토카인인 IL-17, IL-6, IL-1beta 및 TNF-α의 발현이 현저히 증가 되었으나, 다우리놀을 정맥 주사한 동물에서는 이들의 발현이 현저히 감소하였다(도 4). 따라서 본 발명의 다우리놀은 염증성 사이토카인의 발현을 월등히 감소시켜 질환을 치료할 수 있음을 알 수 있다.
<1-6> 파골세포 분화 억제 효과 분석
ICR 마우스 (6-9주, 수컷)를 경추 탈골한 후 70% 에탄올로 소독하였다. 경골 부분의 피부를 절개하여 부착 근육을 떼어냈다. 경골 원심부를 절단하고 슬개골을 탈골시켜 경골을 적출하였다. 뼈 양끝을 조금 잘라 한 쪽 끝에 25G의 주사바늘을 꽃고 α-MEM을 흘려보내 골수세포를 시험관에 모았다. 원심 분리한 후 α-MEM에 현탁하고 2배의 Gey's solution을 가해 적혈구를 제거했다. 원심 분리한 후 10% FBS가 함유된 α-MEM으로 재현탁한 후 배양하여 사용하였다.
배양된 골수세포를 대식세포증식자극인자(macrophage colony stimulating factor : 이하 간략하게 'M-CSF'이라 함) 10ng/ml로 하룻밤 배양한 후 부유세포를 M-CSF 30ng/ml로 3일간 추가 배양하여 골수 대식세포(Bone marrow Macrophages: 이하 간략하게 'BMM'라 함)가 생성되었다. 생성된 BMM를 회수한 다음 1×105 cells/well에 파골세포분화인자 RANKL(receptor activator of NF-κB ligand) 50ng/ml 과 M-CSF 30ng/ml 존재 하에서 4일간 배양하였다. 배양이 끝난 세포는 10% 포르말린으로 10분간 고정한 후 에탄올-아세톤(1:1)로 1분간 재고정하여 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색하였다. 현미경 하에서 관찰하여 3개 이상의 핵을 가진 TRAP+ 세포를 다핵 파골세포로 판정하였다.
상기 TRAP+ 다핵세포(multinucleate cell: MNC) 수를 측정한 결과, 본 발명의 다우리놀 화합물을 2μM 처리할 때 파골 세포 분화는 60% 이상 감소하였고, 10μM 처리시에는 파골 세포 분화가 거의 관찰되지 않아, 다우리놀 화합물이 농도 의존적으로 파골세포 분화를 억제되는 것을 알 수 있었다(도 5 참조).
<1-7> 비만관절염 동물 모델에서 다우리놀의 염증억제 효과와 Th17/Treg 세포의 활성 조절 조사
비만 유래 류마티스 관절염 동물 모델의 비장세포에 다우리놀(1 및 5μM)과 anti-CD3(0.5㎍/ml)를 3일 동안 처리한 뒤 발현되는 IL-17 염증성 사이토카인을 ELISA를 이용하여 평가한 결과, 다우리놀은 농도 의존적으로 IL-17의 발현을 억제시키는 것을 확인하였다(도 6A 참조).
또한, Th17/Treg 세포 활성 조절을 확인하기 위하여, 비만 관절염 동물 모델의 비장세포에 다우리놀(1μM)과 anti-CD3(0.5㎍/ml)을 처리하고 3일 동안 배양한 후, 다우리놀에 의해서 조절되는 Th17/Treg 세포의 활성을 유세포 분석으로 평가한 결과, 다우리놀은 비만 관절염 동물 모델에서 발현되는 IL-17의 발현을 현저히 억제시켰으며, 이와 동시에 Foxp3+ Treg 세포의 활성을 유도하였다(도 6B 참조).
<실시예 2>
다우리놀의 염증성 사이토카인 억제 효과 및 세포독성 측정
일반적으로 파골세포 분화는 염증성 사이토카인 분비에 의해 촉진된다고 알려져 있다. 이에 본 발명의 다우리놀 화합물 처리가 염증성 사이토카인의 분비에 어떠한 영향을 미치는지 확인해 보고자 하였다.
이를 위하여 splenocytes 세포주에 항CD3 항체를 0.5㎍/ml 처리하여 IL-17의 분비를 유도하거나, LPS를 100ng/ml 처리하여 TNF-α의 분비를 유도하였다. 이후, 다우리놀을 각각 0.5, 2. 5, 20 μM 을 처리한 후, 상층액을 모아 IL-17 및 TNF-α의 양을 sandwich ELISA를 이용하여 조사하였다. 96웰 플레이트에 단클론성 anti-IL-17 또는 anti-TNF-α 2μg/ml으로 4℃에서 밤새 반응시키며, 반응 후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. IL-17 recombinant 또는 TNF-α를 1/2씩 연속 희석하여 standard로 사용하였으며, 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, biotinylated anti-IL-17을 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후 4회 세척한 다음, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, PNPP/DEA 용액을 넣고 발색한 후 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, IL-17의 분비는 다우리놀의 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하여 2μM에서는 그 분비가 50%까지 감소하였고, 20μM에서는 그 분비가 전혀 감지되지 않았다(도 7a 참조). 한편, TNF-α의 분비도 다우리놀 처리에 따라 감소하였는데, 다우리놀을 20μM 처리한 경우 그 분비가 40% 가까이 감소하는 것으로 확인되었다(도 7b 참조).
상기와 같은 실시예들을 통하여 본 발명자들은 본 발명의 다우리놀 화합물이 염증성 사이토카인 분비를 억제하여 파골세포 분화를 억제하고, 그 결과 관절염 치료 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
또한, 다우리놀 처리에 의해 세포독성을 관찰하기 위해 MTT 어세이(assay)를 진행하였다. 이를 위하여 splenocytes 세포주(2×105)를 96-웰 플레이트에 깔고 다우리놀에 MTT 시약을 처리한 후 알루미늄 호일로 감싼 후 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 4시간 후 DMSO로 생성된 결정을 녹이고 ELISA 리더(reader)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 측정 결과 다우리놀 농도에 따른 세포독성은 크게 나타나지 않았다(도 7c 참조).
<실시예 3>
다우리놀 화합물 처리에 따른 phospho-STAT3 및 phospho-mTOR 신호전달 억제 효과 측정
다우리놀을 처리한 세포내 세포신호인자들의 변화를 관찰하고자 웨스턴블럿을 수행하였다. 이를 위해 정상마우스로부터 CD4+T 세포를 분리한 후 항CD3 항체를 0.5㎍/ml 처리한 조건에서 다우리놀(5μM)을 처리하고 3일간 배양한 후 세포들을 용해시켜 단백질을 추출하였다. 이후 추출된 단백질을 SDS-PAGE 전기영동한 후, 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 단백질들을 전기적 이동시킨 다음, 5% 스킴 밀크로 1시간 동안 블록킹 반응시키고, STAT3, STAT3p705, STAT3p727 및 phospho m-TOR에 대한 1차 항체를 붙여 반응시킨 후, 이에 대한 2차 항체를 붙여 다시 반응시킨 다음, ECL (Enhanced Chemilunimoecence) 용액을 사용하여 Kodak X-ray에 감광시켜 이들 유전자의 단백질 발현 정도를 분석하였다.
그 결과, 다우리놀을 처리한 CD4+T 세포에서는 phospho STAT3 (p705,p727) 및 phopho m-TOR의 발현이 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 8). 이러한 결과는 다우리놀에 의해 야기된 mTOR-STAT3의 활성억제가 염증 억제에 증요한 원인으로 작용한다는 것을 나타낸다.
<실시예 4>
다우리놀의 이식거부질환 억제 효과 분석
본 발명자들은 상기와 같이 다우리놀 화합물의 관절염 치료 효과를 확인하였으므로, 다우리놀 화합물이 다른 면역질환인 이식거부반응을 완화시킬 수 있는지 확인해 보았다.
<4-1> 다우리놀에 의한 이식거부질환(GVHD) 치료 효과 조사
다우리놀이 실제적으로 면역질환의 치료에 적용될 수 있는지 확인하기 위해 이식거부질환 동물모델을 대상으로 치료 효과를 조사하였다. 먼저, 이식거부질환 동물을 제작하기 위해 수여마우스 Balb/c(H-2k/d)에 전신방사선조사(TBI)(800cGy)를 하고 공여마우스 C57BL/6(H-2k/b)의 대퇴골과 경골에서 조혈모세포와 비장세포를 분리하여 조혈모세포 5×106 과 비장세포 1×106 을 수여마우스 Balb/c(H-2k/d)에 이식하였다. 이식 후 일주일에 3회씩 체중 kg 당 20mg의 다우리놀을 총 9회 주입하였고, 이때 상기 다우리놀은 DMSO:Crernophor EL:DW을 1:1:8로 혼합한 용매에 녹여서 사용하였다. 각 군은 5마리씩을 대상으로 하여 실험 및 평가를 진행하였다.
마우스의 무게, 질병도 측정 및 생존도를 관찰한 결과, 이식질환 대조군에 비해 다우리놀을 주입한 마우스 군의 경우, 이식거부질환마우스의 질병도를 개선시키고 마우스의 생존도 또한 30일간 유지되는 것을 확인하였다(도 9 참조).
<4-2> 다우리놀에 의한 T 세포 증식 억제 및 IL-17 발현양 변화 관찰
다우리놀 화합물이 T 세포 증식 억제 및 IL-17 발현양에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자, 시험관 내(in vitro)에서 96well round bottom plate내 각 웰당 2×105개의 정상 수여자(Balb/c, responder)의 CD4+T 세포와 2×105개의 방사선으로 조사시킨 수여자(동종동형) 또는 공여자(C57BL/6, stimulator,동종이형) 유래 T 세포 제거 비장세포를 넣고 혼합 배양시켰다. 이때 동종이형반응에 다우리놀을 처리하지 않거나 다우리놀을 각각 0.5, 2, 10, 20 μM 처리했을 때 T 세포 증식과 IL-17의 분비를 관찰하였다.
그 결과, 다우리놀은 농도 의존적으로 T 세포 증식을 억제하였으며(도 10 참조), IL-17의 발현도 억제시키는 것으로 나타나(도 11 참조). 따라서 다우리놀은 이식 후 거부반응을 억제하는 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
<4-3> 다우리놀에 의한 조절 T 세포 분화 양상 관찰
한편, 조절 T 세포, 즉 Treg(regulatory T lymphocytes) 세포는 면역 관용의 유지에서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있고(Nat. Rev. Immunol. 2009, 7:305), 주로 흉선에서 생산되고 전사 인자인 Foxp3의 발현이 요구되며, Foxp3는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 역할도 하는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 다우리놀 화합물이 면역조절 세포인 Treg 세포의 활성에 어떠한 영향을 미치는지 확인해 보고자, 상기 실시예 <4-2>에서 분리한 T 세포를 유세포 분석기로 분석하였다. 즉, 상기 실시예 <4-2>에서 분리한 T 세포를 모아 FACs buffer로 세척한 후, 비특이성 결합을 억제하기 위해 blocking을 4℃에서 5분간 반응한 뒤 FACs buffer로 세척하였다. Anti CD4 percp cy5.5와 anti CD25 APC를 넣고 4℃에서 30분간 반응한 뒤 FACs buffer로 세척하였다. Cytoperm/cytofix buffer를 100ul씩 넣고 4℃에서 30분간 반응한 뒤 perm wash buffer로 세척하였다. 비특이성 결합을 억제하기 위해 blocking을 4℃에서 15분간 반응한 뒤 perm wash buffer로 세척하였다. 한편, Anti Foxp3 PE를 넣고 4℃에서 30분간 반응한 뒤 perm wash buffer로 세척하였다. 염색이 끝난 세포는 buffer로 세척한 후, 유세포분석기(FACs,fluorescent-activated cell sorter)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 다우리놀 무처리한 대조군의 경우 Treg 세포가 7.27%인데 비하여, 다우리놀을 1μM을 처리한 경우 9.18%, 다우리놀을 5μM 처리한 경우 16.6%로 증가하여 다우리놀이 Tregdml 발현을 증가시켜 이식 후 거부반응을 억제하는 것을 확인하였다(도 12 참조).
<실시예 5>
다우리놀의 염증성 장 질환 치료 효과 분석
<5-1> 염증성 장 질환(IBD) 동물 모델 제작
본 발명자들은 본 발명의 다우리놀이 염증성 장 질환을 치료할 수 있는지를 확인하기 위하여, 먼저 염증성 장 질환 유도 동물모델을 제작하였다. 시험동물은 C57BL/6(H-2kb) 마우스를 사용하였으며, 염증성 장질환 유도 동물모델을 제조하기 위해, 마우스에 3.5% 덱스트란 설페이트 소듐(dextran sulfate sodium, DSS) 물을 1주일간 음용하게 하여 염증성 장 질환 유도 동물 모델을 제작하였다.
<5-2> 다우리놀에 의한 염증성 장 질환 동물 모델의 몸무게, 질병 활성도 및 장 길이 관찰
본 발명자들은 실험동물을 정상 대조군, 염증성 장 질환 유도 동물 모델군, 염증성 장 질환 유도 동물 모델에 다우리놀 또는 TNF-α 억제제를 투여한 군으로 나누고, 다우리놀을 투여한 군은 질환 유도 4일째부터 다우리놀을 kg 당 20mg 농도로 매일 경구 및 직장에 투여하였다.
그 결과, 다우리놀을 투여한 군에서 몸무게가 염증성 장 질환 유도 동물 모델군에 비하여 유의하게 개선되었으며, 시간이 경과 할수록 정상 대조군의 몸무게와 유사해지는 것으로 확인되었으며, 다우리놀을 투여한 군은 TNF-α 억제제보다 더 염증성 장 질환 동물 모델의 몸무게를 정상과 유사하게 유지 시켰으며, 질환을 억제 조절하는 것으로 확인되었다(도 13A 참조).
다음오로, 염증성 잘질환 활성도 평가를 수행한 결과(몸무게, 변의 묽기 정도, 출혈), 다우리놀을 투여한 군에서 DAI(Disease Activity Index)도 현저히 감소하는 것으로 나타나, 다우리놀이 염증성 장질환 활성을 현저히 억제시키는 것으로 확인되었다(도 13B 참조).
또한, 염증성 장 질환의 특징 중 하나는 대장의 손상관 길이가 짧아지는 것이 질환 활성도와 관련이 있다는 것이므로, 다우리놀 처리에 따른 염증성 장 질환 치료효과를 분석하기 위해, 다우리놀 투여 2주 후 상기 실험동물을 안락사시키고, 장의 길이를 측정하였다. 그 결과, 다우리놀 처리군은 염증성 장 질환 동물 모델에 비해 장 길이가 현저히 증가하여 정상 대조군에 가까운 장 길이를 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 13C 참조).
추가로, 대장 조직의 조직적인 소견과 염증성 사이토카인 발현 확인을 위해, 다우리놀에 의해 대장 조직의 파괴가 감소되었는지 조사하고자 조직 H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 수행하였다. 그 결과, 염증성 장 질환(IBD) 동물모델의 경우 대장 조직이 많이 파괴되어 있었지만, 다우리놀 처리군에서는 상대적으로 조직의 손상이 감소된 것을 확인할 수 있었으며, 또한 염증성 사이토카인 TNF-α의 발현을 현저히 억제시키는 것을 확인할 수 있었다(도 13D 참조).
<5-3> 다우리놀에 의한 장 조직 내 염증성 사이토카인 분비 감소 및 마우스/사람 VEGF 발현 억제 측정
대장 조직 내 염증성 사이토카인의 발현을 확인한 결과, 다우리놀은 염증성 장 질환과 관련이 있는 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6, IL-8, IL-1b 및 IL-17의 발현을 대장 조직 내에서 현저히 억제시켰다(도 14A 참조).
또한, 대장 조직 내에서의 VEGF 발현을 조사한 결과, 다우리놀은 염증성 장질환 동물(마우스) 모델의 대장 조직에서 VEGF의 발현을 현저히 억제시키는 것을 확인하였다(도 14B 참조). 사람 대장 세포주 HT-29 cell line을 이용하여, 사람 대장 세포주에서 발현되는 VEGF의 발현도 억제 조절할 수 있는지를 평가한 결과, 다우리놀은 TNF-α 억제제, merformin 보다도 VEGF의 억제 효력이 큰 것을 확인하였고, 억제(inhibition)%로 분석할 경우 VEGF의 활성을 현저히 억제함을 확인할 수 있었다(도 14C 참조).
<5-4> 염증성 장 질환 동물 모델의 혈청 내 염증성 사이토카인과 항체 생성 변화 조사
염증성 장질환이 유도된 염증성 장 질환(IBD) 마우스와 다우리놀, TNF-α 억제제가 처리된 각각의 마우스 혈액으로부터 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청에서 ELISA 기법을 이용하여 염증성 사이토카인인 IL-17, IFNr 및 IL-6 등의 염증성 사이토카인을 측정하였다. 그 결과, 다우리놀은 이러한 염증성 사이토카인의 발현을 현저히 억제시키는 것을 확인하였다(도 15 위쪽 그래프 참조).
또한, 혈청에서 발현되는 항체를 측정한 결과, 다우리놀은 IgG, IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체를 감소시켰다(도 15 아래쪽 그래프 참조). 따라서 다우리놀은 염증성 장질환 동물 모델에서 염증성 사이토카인의 발현뿐만 아니라 항체의 형성을 감소시키므로, 자가 항체에 대한 면역반응 및 B 세포 관련 염증 반응 또한 억제 조절 할 수 있다.
<실시예 6>
다우리놀의 루프스 치료 효과 분석
본 발명의 다우리놀이 또 다른 면역 질환인 루프스(SLE)를 치료하는 효과가 있는지 확인하기 위하여, 루프스 동물 모델에서 다우리놀의 염증억제 효과와 Th17/Treg 세포의 활성 조절 효과를 조사하였다.
먼저, 자가항체 생성 조절 효과와 관련하여, 루프스 동물 모델의 비장세포에 다우리놀(1 및 5μM)과 LPS(100ng/ml)를 3일 동안 처리한 뒤 발현되는 IgG 항체를 ELISA를 이용하여 평가한 결과, 다우리놀은 농도 의존적으로 IgG 항체 생성을 억제 함을 확인하였다(도 16A 참조).
또한, 염증성 사이토카인의 생성 조절을 확인하기 위하여, 루프스 동물 모델의 비장세포에 다우리놀(1 및 5μM)과 anti-CD3(0.5㎍/ml) 또는 LPS(100ng/ml)를 3일 동안 처리한 뒤 발현되는 IL-17 및 TNF-α 염증성 사이토카인을 ELISA를 이용하여 평가한 결과, 다우리놀은 농도 의존적으로 IL-17 및 TNF-α의 발현을 억제시켰으며, 특히 IL-17 억제에 뛰어난 효과를 나타냈다(도 16B 참조).
마지막으로, Th17/Treg 세포 활성 조절을 확인하기 위하여, 루프스 동물 모델의 비장세포에 다우리놀(1μM)과 anti-CD3(0.5㎍/ml)를 처리하여 3일 동안 배양하고, 다우리놀에 의해서 조절되는 Th17/Treg 세포의 활성을 유세포 분석으로 평가한 결과, 다우리놀은 루프스 동물 모델에서 발현되는 Th17의 활성을 억제시킬 뿐만 아니라, 이와 동시에 Foxp3+ Treg 세포의 활성을 유도하였다(도 16C 참조).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 다우리놀(daurinol)을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2014007848-appb-I000004
  2. 제1항에 있어서,
    상기 면역질환은 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Dieseses), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술 후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergy), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(Mitochondrial disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 다우리놀(daurinol)은 하플로필럼(Haplophyllum) 속 식물의 추출물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 염증성 사이토카인의 분비를 조절하여 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 염증성 사이토카인은 IL-17 또는 TNF-α인 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 파골세포 분화의 억제, 관절 내 염증의 감소, 골 파괴의 감소 및 연골 손상의 감소 중에서 하나 이상의 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 동종반응성 T 세포(alloreactive T cell)의 증식 억제 및 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg)의 발현 증가 중에서 하나 이상의 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 면역질환은 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증, 염증성 장질환, 전신성 홍반성 루푸스, 골관절염 및 류마티스 관절염으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  9. 하기 화학식으로 표시되는 다우리놀(daurinol)을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 개선용 건강기능성 식품용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2014007848-appb-I000005
PCT/KR2014/007848 2013-08-22 2014-08-22 다우리놀 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물 WO2015026205A1 (ko)

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