KR20120021239A - 레바미피드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 레바미피드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 레바미피드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 레바미피드 화합물은 염증성 사이토카인을 생성 및 분비하는 세포 독성 Th17 세포의 분화를 억제하는 효과가 우수하고, 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 제어하는 특성을 갖는 면역조절 T 세포(Treg)의 활성을 증진시키는 효과가 우수하므로 각종 암 질환 또는 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

레바미피드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cancer or immune disease comprising rebamipide}

본 발명은 면역반응의 이상으로 유발되는 암 또는 면역질환을 예방 또는 치료하는데 사용되는 레바미피드의 약학적 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 레바미피드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.

따라서 면역질환의 대부분은 이러한 두 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.

한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하는 실험들이 많이 보고되고 있다.

또한, Treg 세포 이 외에 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-ß 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-ß와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.

현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다.

또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법(대한민국공개특허 제2008-0068767호 참조) 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법(대한민국공개특허 제2000-0034847호, 대한민국공개특허 제2002-0020730호 참조)이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.

따라서 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 암 및 면역질환 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 레바미피드(rebamipide)가 Th17의 활성을 저해하고, Treg 세포의 활성을 증가시킨다는 것을 규명함으로써 각종 종양이나 면역 관련 모든 질환에서 치료제로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 각종 암과 면역반응의 이상으로 유발되는 면역질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있도록, 레바미피드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 미분화 T 세포에 레바미피드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 시험관(in vitro)내에서 레바미피드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 다른 목적은 레바미피드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 레바미피드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 레바미피드는 미분화 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 감소 또는 억제시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 레바미피드는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 결장암, 직장암, 항문부근암, 골암, 위암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 중피종, 식도암, 담도암, 방광암, 고환암, 소장암, 생식세포종, 자궁 내막암, 나팔관암종, 질암종, 음문암종, 다발성 골수종, 육종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 방광암, 요도암, 뇌하수체 선종, 신장골반 암종, 척수 종양, 다발성 골수종, 신경교종암, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 조혈종양, 섬유육종, 신경아세포종, 성상세포종, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 간암, 뇌암, 폐암, 림프종, 백혈병, 악성 흑색종 및 피부암 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈 및 궤양성 대장염 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 미분화 T 세포에 레바미피드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화 감소 또는 억제는 IL-17 사이토카인의 생성 억제를 통해 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 레바미피드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 활성화된 조절 T 세포는 Foxp3의 발현이 증가될 수 있다.

나아가, 본 발명은 레바미피드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 레바미피드 화합물은 염증성 사이토카인을 생성 및 분비하는 세포 독성 Th17 세포의 분화를 억제하는 효과가 우수하고, 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 제어하는 특성을 갖는 면역조절 T 세포(Treg)의 활성을 증진시키는 효과가 우수하므로 각종 암 질환 또는 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에 대해 안정한 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에서, 마우스로부터 분리한 비장세포를 Th17 분화조건으로 처리함과 동시에 각 농도별로 레바미피드를 처리한 후 생성되는 IL-17 사이토카인의 분비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서, 인간 PBMC 세포를 Th17 분화조건으로 처리함과 동시에 각 농도별로 레바미피드를 처리한 후 생성되는 IL-17 사이토카인의 분비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라서 Th17세포로 분화한지 3일 후에 마우스 비장세포에서의 IL-17과 Treg의 발현을 비교하기 위해 수행한 FACs stain의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라서 Th17세포로 분화한지 3일 후에 인간 PBMC 세포에서의 IL-17과 Treg의 발현을 비교하기 위해 수행한 FACs stain의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라서 면역조절 세포인 Treg 세포를 활성화시키는 작용이 있는지를 조사하기 위해, 마우스 비장세포 모델을 이용하여 레바미피드를 1000μM의 농도로 처리하였을 때 Th17 분화환경을 거친 세포에서 IL-17, Foxp3, RORrt, STAT3, CCL20 및 CCR6의 발현 정도를 RT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일실시예에 따라서 콜라겐으로 유도된 관절염 동물모델을 대상으로 레바미피드 0.6mg/kg, 6mg/kg을 각각 경구투여한 후, 관절염의 치료효과를 임상지수를 통해 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일실시예에 따라서 콜라겐으로 유도된 관절염 동물모델을 대상으로 레바미피드 0.6mg/kg, 6mg/kg을 각각 경구투여한 후, 동물 모델을 치사시킨 다음, 관절과 연골 조직의 파괴정도를 조직염색을 통해 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 본 발명의 일실시예에 따라서 레바미피드에 의한 IL-6 의존적인 STAT3의 인산화 변화를 웨스턴블롯팅 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 본 발명의 일실시예에 따라서 레바미피드에 의한 TH17 세포 분화유도시 STAT3의 인산화 변화를 유세포분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 레파미피드가 면역 조절작용을 통해 암 또는 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있음을 최초로 규명하였으며, 따라서 본 발명은 레바미피드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 면역질환 치료를 위한 새로운 면역 조절제를 개발하기 위해 레바미피드(Rebamipide) 화합물에 주목하였는데, 레바미피드는 위궤양, 급성위염 또는 만성 위염의 급성 악화로 인한 위 점막 손상의 치료에 탁월한 효과를 가지는 의약으로, 소화성궤양 치료제로 널리 사용되고 있으며, 그의 화학명은 2-(4-클로로벤조일아미노)-3-[2(1H)-퀴놀리논-4-일]프로피온산이다. 이 약제는 PGE2 생합성을 촉진시켜 점액을 증가시킴으로써 위점막을 보호하고, 세포증식을 촉진시키며, 특히 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)균에 감염된 환자에 있어서 위 점막 세포에 대한 균의 점착 및 침윤을 억제시킴으로써 위 염증을 억제하는 특징을 갖는다.

그러나, 종래에는 레바미피드를 면역질환 또는 암 질환의 치료를 위한 용도로 사용할 수 있다는 내용에 대해서는 전혀 언급된 바가 없다.

따라서 본 발명에서는 레바미피드 화합물이 암 또는 면역질환을 예방 또는 치료하기 위한 용도로 사용할 수 있으며, 특히 레바미피드가 병원성 세포인 Th17 세포 분화를 억제시키는 동시에 면역조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성은 촉진시키는 기작을 통해 상기 면역질환 또는 암 질환의 예방 또는 치료 효과를 유도할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였다.

한편, 일반적으로 면역계는 정상상태에서는 자가항원에 대한 특이적 면역반응을 제어하고 있으며, 외부항원에 대한 면역반응도 억제하고 있는 경우가 있는데, 예컨대 임산부의 태아에 대한 반응 및 만성감염상태에 있는 미생물에 대한 면역반응을 들 수 있다. 이러한 현상들은 항원 특이적 면역관용이 유도될 수 있는 기전으로 클론 제거(clonal deletion), 클론 무반응(anergy) 및 면역조절 T 세포(Treg)에 의한 능동적 통제에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 이식항원에 대한 면역관용이 우연히 획득된 일부 환자나 실험적으로 면역관용을 유도한 동물모델을 조사해 보면 위의 세 가지 기전 모두 이식면역관용에 관여한다는 사실이 확인되고 있고, 특히 최근에는 면역조절 T 림프구가 이식면역반응 뿐만 아니라 자가면역, 종양면역, 감염면역반응 등 생체의 거의 모든 면역반응을 통제하는데 관여하는 중요한 세포로 주목받고 있다.

특히, 최근 그 존재가 밝혀진 면역조절 T 세포, 즉, 면역조절 T 림프구(Treg)는 크게 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD4+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5 ~ 10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어 인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성(adaptive) 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-ß를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts등이 여기에 해당한다.

또한, 앞서 종래기술에도 기술한 바와 같이, T 세포는 Treg 세포 이외에 분화 과정을 통해 Th17 세포로도 분화되는데, Th17 세포는 Treg 세포와 공통적으로 TGF-ß의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-ß와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화하고, IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

또한, Th17 세포는 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 세포독성을 가지는 특성이 있다. 따라서 Th17 세포로의 분화 또는 활성의 억제는 암 또는 면역질환을 치료할 수 있는 방법 중 하나이다.

이에 본 발명자들은 본 발명의 레바미피드 화합물이 T 세포의 조절, 구체적으로 미분화된 T 세포가 Treg 세포 및 Th17 세포로의 분화를 조절함을 통해 면역 또는 염증관련 질환 및 암 질환을 치료할 수 있는지를 확인하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 마우스로부터 분리한 비장 세포와 인간 PBMC 세포를 대상으로 세포에 존재하는 미분화된 T 세포가 Th17 세포로 분화될 수 있는 자극조건을 처리함과 동시에 레바미피드 화합물을 각 농도별로 처리하고 배양한 다음, 세포내에서 발현되는 IL-17 사이토카인의 양을 측정하였다. 일반적으로 염증성 사이토카인인 IL-17은 Th17 세포로부터 생성되는 것으로서 생성된 IL-17의 양을 통해 미분화된 T 세포의 Th17 세포로의 분화정도를 측정할 수 있다.

그 결과, 레바미피드를 처리하지 않은 대조군의 경우에는 Th17 세포분화 조건에 의해 Th17 세포로 분화가 되어 IL-17 사이토카인의 생성량이 아무것도 처리하지 않은 군에 비해 현저히 증가된 것으로 나타난 반면, 레바미피드를 처리한 군의 경우에는 IL-17 사이토카인의 생성이 레바미피드를 처리하지 않은 군에 비해 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 또한, 생성된 IL-17 사이토카인의 양은 처리한 레바미피드의 농도에 비례하여 감소하는 것으로 나타났다(도 1 및 도 2 참조).

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 레바미피드 화합물이 미분화된 T 세포가 염증성 사이토카인인 IL-17을 생성하는 병원성 세포인 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제한다는 사실을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명의 레바미피드 화합물은 미분화 T 세포가 병적세포인 Th17 세포로 분화되는 것을 감소 또는 억제시키는 작용을 통해 암 또는 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 특징이 있다. 즉, 본 발명에서는 면역반응 또는 염증반응을 억제함으로써 암 또는 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

나아가 본 발명자들은 레바미피드가 면역조절 T 세포(Treg)의 활성 또는 증식에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하기 위하여, 레바미피드의 처리에 따른 Foxp3 유전자의 발현정도를 측정하였다.

상기 Foxp3는 흉선(thymus)으로부터 유래하는 면역조절 T 세포(Regulatory T cell)에 주로 존재하고, CD4+ CD25+ 표지 항원을 가진 세포에 존재하는 전사 조절 인자 (transcriptional factor)로서, 그 기능은 Foxp3를 발현하는 T 세포에 대한 항원 인지시 항원에 대해 저반응성을 가짐과 동시에 흉선으로부터 분화되어 나온 Foxp3를 발현하지 않는 CD4+ CD25- T 세포 중 잠재적으로 자가 면역증을 유발할 수 있는 T 세포들에 대하여 IL-2의 생성과 세포분열 현상을 억제하는 억제자 T 세포 (suppressor T cell)로서의 역할을 가지고 있다. 또한, Foxp3는 Foxp3를 발현하는 조절 T 세포 및 이와 세포-세포간 접촉(cell-cell contact)을 통해 CD25- T 세포에 대하여서는 IL-2 뿐만이 아니라 전사인자인 NFAT의 영향을 받는 IL-4, IFN-감마 등의 전사 조절을 억제하는 기능을 하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 상기와 같은 작용을 하는 Foxp3를 발현하고 있는 T 세포의 경우, 면역반응을 억제 또는 조절하는 작용을 통해 면역질환을 치료하는데 응용되고 있고, 또한, 인간에 존재하는 Foxp3를 발현하는 CD4 T 세포의 자가 항원 특이적인 T 세포(self-antigen specific T cell clone)를 고농도의 IL-2 사이토카인 처리 및 항-CD3, 항-CD28 항체와의 조합처리를 통해서 그 수를 증가시켜 세포 치료방법으로 응용하고자 하는 시도들이 있어왔다. 따라서 Foxp3의 발현 확인은 Treg 세포의 활성 또는 증폭을 측정할 수 있는 지표가 된다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 마우스로부터 분리한 비장세포에 Th17 세포로 분화될 수 있는 자극조건을 처리함과 동시에 레바미피드를 처리하고 배양한 다음, 분화된 Treg 세포의 증폭 또는 활성 정도를 발현된 Foxp3의 양을 측정하여 분석한 결과, 레바미피드를 처리한 군의 경우, Treg 세포에서 발현된 Foxp3의 mRNA 양은 레바미피드를 처리하지 않은 군에 비해 현저하게 증가하는 것으로 나타났고, 그 증가 정도는 처리한 레바미피드의 농도에 비례하는 것으로 나타났다. 또한, Th17 세포를 분화시키는데 관여하는 전사인자인 RORrt와 STAT3, Th17 세포의 migration marker인 CCL20과 CCR6도 레바미피드의 처리에 의해 감소하는 것으로 나타났다(도 5 참조).

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 레바미피드 화합물이 조절 T 세포(Treg)를 활성 또는 증폭시켜 암 또는 면역질환을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

나아가 본 발명의 일실시예에서는 동물모델을 대상으로 레바미피드가 면역질환을 치료할 수 있는지를 조사하였는데, 관절염 동물모델을 대상으로 레바미피드를 각각 투여한 군과 투여하지 않은 군을 대상으로 관절염의 정도를 분석한 결과, 레바미피드 투여군의 경우 대조군에 비해 관절염 증상이 월등히 개선된 것으로 나타났다(도 6a 및 6b 참조).

한편, STAT(Signal transducers and activators of transcription)는 신호전달 및 전사조절 단백질로서, 사이토카인, 호르몬, 성장인자 등의 세포외 자극에 의해 활성화되어 타이로신 잔기가 인산화되고, SH2 도메인의 상호작용으로 이량체(dimer)가 형성되어 핵 안으로 들어가 특정 프로모터에 결합하게 된다. 이런 STAT 단백질의 신호체계는 탈인산화 작용 및 단백질 분해에 의해 억제될 수 있다.

특히, 최근에는 다양한 암종에서 STAT1, STAT3 및 STAT5의 활성화된 형태가 발견되고 있는데, STAT3는 백혈병과 같은 혈액암 뿐만 아니라, 유방암, 두부경부암, 흑색종, 난소암, 폐암, 췌장암, 전립선암과 같은 다양한 고형암에서 활성화되어 있어 중요한 항암 타겟이 되고 있다(Hua Yu and Richard Jove, Nature Review Cancer.,2004, 8, 945).

또한, STAT3의 활성은 세포사멸을 억제하고, 신생혈관(angiogenesis)을 유도하며, 면역회피를 유도하는 것으로 알려진 바 있다(Wang T. et al., Nature Medicine., 2004, 10, 48). 따라서 STAT3 활성 억제는 복합적인 항암 기작으로 종양을 제어할 수 있는 효과가 있고, STAT3 단백질은 종양뿐만 아니라 다양한 세포내 기능에도 관여하므로 이의 저해제 발굴은 면역억제제로의 개발도 가능하다. 따라서 STAT3의 활성을 억제할 수 있다면 암 및 면역질환과 같은 질환을 치료할 수 있다.

이에 본 발명자들은 본 빌명의 레바미피드 화합물이 IL-6와 같은 사이토카인 및 염증성 사이토카인을 분비하는 TH17 세포 분화시 인산화가 증가되어 활성화된 STAT3의 활성을 억제할 수 있는지를 조사하기 위해, 본 발명의 레바미피드를 처리한 마우스 모델의 조직을 대상으로 웨스턴블럿과 유세포분석을 수행한 결과, 레바미피드를 처리한 군의 경우 처리하지 않은 군에 비해 STAT3의 인산화가 현저하게 감소되는 것으로 나타났으며(도 7a 및 7b 참조), 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 레바미피드가 STAT3의 인산화를 억제하는 기작을 통해 암 또는 면역질환을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명의 레바미피드 화합물은 미분화 T 세포가 염증성 사이토카인을 분비하는 Th17 세포로 분화되는 것을 억제 또는 감소시키는 작용 또는/및 과도한 면역반응을 정상으로 조절할 수 있는 조절 T 세포의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시키는 작용을 통해 면역 또는 염증과 관련된 질환 및 암 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 특징이 있다.

본 발명에서 상기 "활성" 이란 생체 내에서 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg), 즉, 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포를 모두 포함하는 Treg 세포가 가지는 모든 기작이 촉진 또는 증진되는 것을 말하며, 생체 내의 면역반응이 정상상태를 유지하도록 면역조절작용, 예컨대 면역억제반응이 촉진 또는 증진되는 것을 말한다.

또한, 상기 "증폭(expansion)" 이란 미분화 T 세포가 조절 T 세포로 분화 및 증식되는 것을 말하는 것으로서, '분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말하며, '증식(proliferation)' 은 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다.

그러므로 본 발명은 레바미피드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 레바미피드는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

<화학식 1>

또한, 본 발명에 따른 상기 레바미피드 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 레바미피드 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 레바미티드 화합물은 병적세포인 Th17 세포를 감소 또는 억제시킬 수 있고, 반면 조절 T 세포의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증진시키는 작용을 통해 암 또는 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 "암" 은 비정상적인 세포의 빠르고 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환으로 정의된다. 암 세포는 국부적으로 확산되거나 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 암의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 결장암, 직장암, 항문부근암, 골암, 위암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 중피종, 식도암, 담도암, 방광암, 고환암, 소장암, 생식세포종, 자궁 내막암, 나팔관암종, 질암종, 음문암종, 다발성 골수종, 육종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 방광암, 요도암, 뇌하수체 선종, 신장골반 암종, 척수 종양, 다발성 골수종, 신경교종암, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 조혈종양, 섬유육종, 신경아세포종, 성상세포종, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 간암, 뇌암, 폐암, 림프종, 백혈병, 악성 흑색종, 피부암 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "면역질환" 은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.

또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다.

그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 "자가면역질환"이라고 한다.

또한, "염증성 질환" 이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-a(tumor necrosis factor-a), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

한편, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 따라서 이러한 이식면역거부반응을 감소시키기 위해 면역억제제들이 사용되고 있는데 이러한 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것이며, 최근에는 조절 T 세포를 이용하여 면역반응을 억제함으로써 이식거부질환을 치료하려는 방법이 시도되고 있다.

또한, 본 발명에서 상기 면역질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 궤양성 대장염 등을 포함할 수 있다.

그러므로 본 발명에 따른 상기 조성물은 암 또는 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

상기 "치료" 란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 "치료"란 용어는 "치료하는" 이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 암 또는 면역질환의 "치료" 또는 "치료요법" 은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 암 또는 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 암 또는 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 암 또는 면역질환을 경감시킴.

(4) 암 또는 면역질환의 재발을 예방함, 및

(5) 암 또는 면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 레바미피드 화합물 또는 그의 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 암 또는 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 레바미피드 화합물 또는 그의 염의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 암 또는 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 레바미피드 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있으며, 나아가 본 발명은 레바미피드 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 미분화 T 세포에 레바미피드 화합물 또는 그의 염을 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화 감소 또는 억제는 IL-17 사이토카인의 생성 억제를 통해 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 레바미피드 화합물 또는 그의 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따라 활성화된 상기 조절 T 세포는 Foxp3의 발현이 증가될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법, 및 조절 T 세포를 활성화시키는 방법에 있어서 레바미피드 화합물을 세포에 처리하는 방법은 상기 세포를 배양하는 배지에 레바미피드 화합물을 직접 처리하거나 또는 상기 본 발명에 따른 레바미피드 화합물을 유효성분으로 하는 조성물을 배양 배지에 처리하는 것일 수 있다. 또한, 이때 상기 배양 배지에 처리할 수 있는 레바미피드 화합물의 농도는 최종농도가 50μM ~ 1500μM 이 되도록 처리할 수 있으며, 본 발명의 일실시에에서는 레바미피드 화합물의 농도가 최종 100μM , 250μM , 500μM 및 1000μM 이 되도록 세포의 배양 배지에 첨가하였다.

나아가 본 발명에 따른 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 면역 조절 T 세포(Treg)의 활성 또는 증폭 효과가 우수하고, 염증성 사이토카인을 생성하는 병원성 세포인 Th17 세포 분화를 억제하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에 대해 안정한 특징이 있다.

따라서 본 발명은 레바미피드 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 암 또는 면역질환의 증상을 개선 또는 예방할 수 있는 식품용 조성물을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 상기 식품용 조성물은 암 또는 면역질환 증상의 개선 또는 예방에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

본원에서 상기 "식품" 이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

본원발명에 따른 상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 "기능성 식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본원발명에서 상기 "음료" 란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 암 또는 면역질환 증상의 개선 또는 예방용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 암 또는 면역질환 증상의 개선 또는 예방을 위한 식품용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본원발명의 식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

Th17 세포에서 레바미피드에 의한 IL -17 생성억제 활성 분석

본 발명자들은 레바미피드 화합물이 병원성 세포인 Th17세포에서 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하는 활성이 있는지를 다음과 같은 방법으로 조사하였다.

<1-1> Th17 세포로의 분화 유도 및 레바미피드 처리

① 마우스 비장세포 : 마우스로부터 비장(spleen)세포를 수득하였는데, 즉, 마우스로부터 적출된 비장은 유리 슬라이드를 이용하여(teasing slide) 비장 조직을 잘게 갈은 후 적혈구 용혈 용액으로 비장내의 적혈구를 제거하였다, 이후 PBS 완충 용액을 첨가하고 원심 분리하여 세척함으로써 비장세포를 수득하였다.

그런 뒤, 상기 비장에서 분리한 단일세포 1×10⁶을 anti-CD3 항체가 1μg/ml로 코팅(coating) 처리된 24 웰 플레이트에 분주하고, Th17세포를 자극시킬 수 있는 조건인 anti-CD28 항체 1μg/ml, TGF-ß 20ng/ml, IL-6 20ng/ml, anti-IL-4 10ng/ml, anti-IFNr 10ng/ml를 동시에 함께 처리한 후, 3일 동안 세포를 배양하여 Th17 세포 분화를 유도하였다. 이때, 상기 세포에 레바미피드 화합물을 각각 250μM, 500μM, 1000μM의 농도로 처리하여 배양하였다.

② 인간 세포주 : 인간 전혈(human peripheral blood)에서 분리한 PBMC( Peripheral blood mononuclear cell) 1×10⁶을 anti-CD3 항체가 1μg/ml로 코팅(coating) 처리된 24 웰 플레이트에 분주하고, Th17세포를 자극시킬 수 있는 조건인 anti-CD28 항체 1μg/ml, IL-6 20ng/ml, IL-1ß 20ng/ml, IL-23 20ng/ml, anti-IL-4 10ng/ml, anti-IFNr 10ng/ml를 동시에 함께 처리한 후, 3일 동안 세포를 배양하여 Th17 세포 분화를 유도하였다. 이때, 상기 세포에 레바미피드 화합물을 각각 100μM , 500μM 의 농도로 처리하여 배양하였다.

<1-2> IL -17 사이토카인 측정 ( ELISA )

생성된 IL-17 사이토카인의 양을 측정하기 위하여, 세포가 배양된 상층액을 모아 IL-17 및 sandwich ELISA를 이용하여 IL-17 발현 정도를 조사하였다. 96웰 플레이트에 단클론성 anti-IL-17 2μg/ml으로 4℃에서 밤새 반응시키며, 반응 후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. IL-17 recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 standard로 사용하였으며, 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, biotinylated anti-IL-17을 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후 4회 세척한 다음, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, PNPP/DEA 용액을 넣고 발색한 후 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 마우스 비장세포 모델의 경우 도 1에 나타낸 바와 같이, 병원성 세포인 Th17 세포로부터 생성되는 염증성 사이토카인인 IL-17은 본 발명의 레바미피드 화합물에 의해 생성이 억제되는 것으로 나타났으며, 레바미피드 농도에 의존적으로 IL-17의 생성이 감소되는 것으로 나타났다.

한편, 인간 세포주 모델의 경우에도 도 2에 나타낸 바와 같이, 병원성 세포인 Th17 세포로부터 생성되는 염증성 사이토카인인 IL-17은 본 발명의 레바미피드 화합물에 의해 생성이 억제되는 것으로 나타났으며, 레바미피드 농도에 의존적으로 IL-17의 생성이 감소되는 것으로 나타났다.

< 실시예 2>

FACs stain 분석

Th17세포로 분화한지 3일 후에 세포에서의 IL-17과 Treg의 발현을 비교하기 위해 FACs stain을 진행하였다.

<2-1> 마우스 비장세포

세포를 모으고 FACs buffer로 세척한 후, 비특이성 결합을 억제하기 위해 blocking을 4℃에서 5분간 반응한 뒤 FACs buffer로 세척하였다. Anti CD4 percp cy5.5와 anti CD25 APC를 넣고 4℃에서 30분간 반응한 뒤 FACs buffer로 세척하였다. Cytoperm/cytofix buffer를 100ul씩 넣고 4℃에서 30분간 반응한 뒤 perm wash buffer로 세척하였다. 비특이성 결합을 억제하기 위해 blocking을 4℃에서 15분간 반응한 뒤 perm wash buffer로 세척하였다. Anti IL-17 FITC와 anti Foxp3 PE를 넣고 4℃에서 30분간 반응한 뒤 perm wash buffer로 세척하였다. 염색이 끝난 세포는 FACs buffer로 세척한 후, 유세포분석기(FACs,fluorescent-activated cell sorter)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 250μM의 레바미피드를 처리한 경우 Foxp3의 발현은 11.6, IL-17의 발현은 28.9로 나타났고, 1000μM의 레바미피드를 처리한 경우 Foxp3의 발현은 20.2, IL-17의 발현은 15.7로 나타난 반면, 처리하지 않은 대조군은 Foxp3의 발현은 9.81, IL-17의 발현은 25.5로 나타났다. 이러한 결과를 통해 레바미피드를 처리함에 따라 처리 농도에 의존적으로 Foxp3의 발현은 점점 증가하고, IL-17의 발현은 점점 감소한다는 사실을 확인하였다.

<2-2> 인간 PBMC 세포

세포를 모으고 FACs buffer로 세척한 후, 비특이성 결합을 억제하기 위해 blocking을 4℃에서 15분간 반응한 뒤 FACs buffer로 세척하였다. Anti CD4 percp cy5.5와 anti CD25 APC를 넣고 4℃에서 30분간 반응한 뒤 FACs buffer로 세척하였다. Cytoperm/cytofix buffer를 100ul씩 넣고 4℃에서 30분간 반응한 뒤 perm wash buffer로 세척한 뒤 anti Foxp3 PE를 넣고 4℃에서 30분간 반응한 뒤 perm wash buffer로 세척하였다. 염색이 끝난 세포는 FACs buffer로 세척한 후, 유세포분석기(FACs,fluorescent-activated cell sorter)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, Foxp3의 발현은 100μM의 레바미피드를 처리한 경우에 3.22, 500μM의 레바미피드를 처리한 경우에 5.64로 나타난 반면, 처리하지 않은 대조군은 2.59로 나타났다. 이러한 결과를 통해 레바미피드를 처리함에 따라 처리 농도에 의존적으로 Foxp3의 발현이 점점 증가한다는 사실을 확인하였다.

< 실시예 3>

레바미피드가 Th17 세포 및 Treg 세포에 미치는 영향 분석( RT - PCR )

제어성 T 림프구, 즉 Treg(regulatory T lymphocytes) 세포는 면역 관용의 유지에서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있고(Nat. Rev. Immunol. 2009, 7:305), 주로 흉선에서 생산되고 전사 인자인 Foxp3의 발현이 요구되며, Foxp3는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 역할도 하는 것으로 알려져 있다. 또한, Th17 세포를 분화시키는데 관여하는 전사 인자(transcription factor)로 RORrt, STAT3이 알려져 있으며, Th17 migration marker로는 CCL20과 CCR6이 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 레바미피드 화합물이 면역조절 세포인 Treg 세포의 활성을 활성화시키는 작용이 있는지를 조사하기 위해, 마우스 비장세포 모델을 이용하여 상기 실시예 1의 Th17 분화환경을 거친 세포에서 IL-17, Foxp3, RORrt, STAT3, CCL20 및 CCR6의 발현 정도를 분석하기 위하여, RT-PCR을 수행하였다.

우선, Th17 분화조건에서 세포에 대해 레바미피드를 1000μM의 농도로 처리한 후, 상기 세포들로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 RNA를 각각 추출하여 cDNA 산물을 얻었다. 이렇게 얻은 cDNA 산물을 이용하여 IL-17, Foxp3, RORrt, STAT3, CCL20, CCR6 및 대조군인 ß-actin을 증폭할 수 있는 하기 표 1에 나타낸 프라이머들을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. RT-PCR을 위한 반응 화합물은 총 25μl가 되도록 하였고, 용액의 조성은 2.5μl의 10×반응버퍼 0.5 mM의 dNTP 및 하기 표 1에 기재된 서열을 갖는 각각의 프라이머 쌍을 사용하였다. 증폭을 위해 Dual-bay Thermal cycler system 기기를 사용하여 변성 단계에서 94℃ 30초, 어닐링 단계에서 60℃ 30초, 신장 단계에서 72℃ 30초간의 반응을 25회 반복하였고, 사용된 각 프라이머의 서열은 다음의 표 1과 같다.

프라이머 서열

프라이머	프라이머 서열	서열번호
IL-17 센스	5'-CCTCAAAGCTCAGCGTGTCC-3'	1
IL-17 안티센스	5'- GAGCTCACTTTTGCGCCAAG-3'	2
Foxp3 센스	5'-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3'	3
Foxp3 안티센스	5'-CAAACAGGCCGCCGTCTGGAGCC-3'	4
RORrt 센스	5'-TGTCCTGGGCTACCCTACTG-3'	5
RORrt 안티센스	5'- GTGCAGGAGTAGGCCACATT-3'	6
STAT3 센스	5'-GACCCGCCAACAAATTAAGA-3'	7
STAT3 안티센스	5'-TCGTGGTAAACTGGACACCA-3'	8
CCL20 센스	5'-CAGCTGTTGCCTCTCGTACA-3'	9
CCL20 안티센스	5'-CACCCAGTTCTGCTTTGGAT-3'	10
CCR6 센스	5'-CCATGACTGACGTCTACCTGTTGAACA-3'	11
CCR6 안티센스	5'-GAACAGCTCCAGTCCCATACCCAGCAG-3'	12
ß-actin 센스	5'-GAAATCGTGCGTGACATCAAAG-3'	13
ß-actin 안티센스	5'-TGTAGTTTCATGGATGCCACAG-3'	14

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 레바미피드를 1000μM의 농도로 처리하였을 때 세포에서 IL-17의 발현이 대조군에 비해 현저히 감소하는 것으로 나타났으며, Foxp3의 발현은 대조군에 비해 증가하는 것으로 나타났다. 또한, Th17 세포를 분화시키는데 관여하는 전사인자인 RORrt와 STAT3, Th17 세포의 migration marker인 CCL20과 CCR6 또한 레바미피드의 처리에 의해 감소하는 것으로 나타났다.

< 실시예 4>

관절염 동물모델에서 레바미피드 투여에 따른 치료 효과 분석

<4-1> 동물모델의 준비

시험동물은 7 주령의 수컷 DBA/1J계 마우스를 사용하였으며, 관절염 동물모델을 제조하기 위해, 제 2형 콜라겐 (Cll) 을 4mg/ml이 되도록 0.1N 아세트산 용액에 녹인 후 투석 완충액 (dialysis buffer, 50mM Tris, 0.2N Nacl) 으로 투석하여 M. 투베르쿨로시스 (tuberculosis) 를 함유하는 complete Freund's adjuvant (CFA, Chondrex) 와 동량으로 섞은 후 상기 마우스의 꼬리 기저부에 피하 주사하여 면역원을 마리당 100㎕ (즉 100㎕ /100㎕) 으로 주사하였다 (1차 주사). 이로부터 2주 후 동일한 CII를 동량의 incomplete Freud's adjuvant (IFA, Chondrex) 와 섞은 후 100㎕(즉 100㎕/100㎕) 를 한쪽 뒷다리(발바닥(foot pad))에 주사하였다 (2차 주사).

2차 주사를 통한 2차 면역 후 일주일에 3회씩 구강내로 0.6mg/kg 및 6mg/kg의 레바미피드를 각각 10회 주입하였고, 이때 상기 레바미피드는 0.5% CMC용액에 녹여서 사용하였으며, 각 군은 5마리씩을 대상으로 진행하였고 관절염 평가는 10주까지 평가하였다. 또한, 시험관내(in vitro)시험을 위해 관절염 지수가 유의성 있게 차이나는 시기에 각 동물을 치사시켜, 하기와 같이 혈액, 관절조직 내에서 관절염의 병의 활성 정도와 레바미피드에 의한 치료 효과를 조사하였다.

<4-2> 관절염 동물모델에서 레바미피드에 의한 류마티스 관절염 치료 활성 평가

<4-2-1> 관절지수평가

첫 번째 접종을 시작점으로 하여 3주 후부터 실험의 내용을 알고 있지 않은 관찰자 네 명이 일주일에 세 번씩 관절 염증의 위중도를 평가하여 10주까지 관찰하였다. 이 때 관절염 평가는 마리당 2차 접종 때 CII/CFA 를 투여한 다리를 제외한 나머지 세 다리에서 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 합하여 3 으로 나눈 평균치를 얻고, 다시 각 동물 모델에서 3명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용하였다. 관절염 평가에 따른 점수와 기준은 다음과 같다.

-평가 기준-

0점: 부종이나 종창이 없다.

1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적

2점: 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적

3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적

4점: 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우

마리당 최고의 관절염 지수는 4점이므로 마우스 1 마리당 최고의 질병 지수는 16 이다.

관찰 결과, 콜라겐으로 유도된 관절염 마우스 모델은 4주가 지나면서 관절염 점수가 계속 증가하여 관절염 증상이 심해지는 것으로 나타나는 반면, 레바미피드를 주입한 동물모델에서는 관절염지수가 감소하는 것으로 나타났고, 특히 레바미피드를 6mg/kg의 양으로 주입한 마우스에서는 관절염지수가 거의 증가하지 않은 것으로 나타났다(도 6a 참조).

<4-2-2> 조직학적 검사

콜라겐에 의해 유도되는 관절염 (collagen induced arthritis, CIA) 동물 모델에 레바미피드를 0.6mg/kg 및 6mg/kg의 용량으로 각각 경구 투여하였다. 10주 후에 시험동물을 안락사 시킨 후, 마우스의 뒷발을 10% 포르말린 (formalin)으로 고정하고 뼈에서 석회질을 제거한 후 파라핀을 묻혔다. 관절 절편 (7um)을 준비하고 헤마톡실린 (hematoxylin)과 에오신 (eosin)으로 염색하였다. 또한, 연골파괴 정도를 확인하기 위하여 톨루이딘블루(Toluidine blue)와 사프라닌 O (safranin O) 염색으로 조직학적 검사를 실시하였다.

조직학적 검사 결과, CIA 동물의 관절은 많은 면역 세포들이 침식 (infiltration) 되어 있었으며 판누스(pannus) 형성, 연골파괴 및 뼈 침식 등이 관찰되었다. 반면 레바미피드 0.6mg/kg, 6mg/kg을 경구투여한 동물은 관절과 연골의 파괴정도가 심하지 않고 정상 마우스와 유사하게 유지되는 것으로 관찰되었다(도 6b 참조).

<4-2-3> 웨스턴브롯을 통한 분석

마우스로부터 비장세포를 수득하였는데 비장에서 분리한 CD4+ T Cell 1×10⁷ 을 레바미피드 1000μM의 농도로 1시간동안 전처리 후 IL-6 20ng/ml 의 농도로 1시간 동안 자극한 세포를 추출용액 [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.02% sodium azide, 1 mM phenylmethysulfonyl fluoride 및 5 μg/mL leupeptin]에서 균질화 과정을 거치고 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리한 후, 브래드포드방법(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 통해 단백질을 측정하였다. 정량된 단백질은 4% SDS와 10% 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 첨가된 동일 추출용액과 정해진 비율로 섞은 후 100℃에서 10분간 끓였다. 10% SDS-PAGE gel에 단백질 50 μg씩을 탑재하여 전기영동 시킨 후 단백질의 전기적 성질을 이용하여 니트로섬유소막(nitrocellulose membrane)에 블롯팅(blotting)시켰다. 5%의 탈지분유(in 0.05% Tween-20, PBS)를 사용하여 비특이적 면역반응을 제거하고, phospho와 total STAT3 또는 ß-actin 1차 및 goat anti-rabbit IgG 또는 goat anti-mouse IgG의 2차 항체를 처리한 후, ECL (enhanced chemiluminescense: Amersham, Burlingame, CA, USA)를 이용하여 단백질 발현 정도를 관찰하였다.

분석 결과, IL-6 에 의해 증가된 STAT3의 인산화형은 레바미피드의 처리에 의해 인산화 정도가 감소됨을 확인하였다(도 7a 참조)

<4-2-4> 유세포 분석

상기 비장에서 분리한 CD4+ T cells 1×10⁶ 을 Th17 세포 분화 조건으로 자극하기 위해 anti-CD3 항체가 1μg/ml 로 코팅(coating) 처리된 24 웰 플레이트에 분주하고, Th17세포를 자극시킬 수 있는 조건인 anti-CD28 항체 1μg/ml, TGF-ß2ng/ml, IL-6 20ng/ml, anti-IL-4 10ng/ml, anti-IFNr 10ng/ml를 동시에 함께 처리한 후, 1시간 동안 세포를 자극한다. 이때, 상기 세포에 레바미피드 화합물을 1000μM의 농도로 한시간 동안 전처리하여 배양하였다. 수집한 세포는 PerCPμ-anti-mouse CD4항체와 PE-anti- mouse phospho STAT3 항체를 넣고 4℃에서 30분간 암시야에서 반응시킨 뒤 FACs buffer (0.002% sodium azide, 0.2% BSA/PBS)로 세척하고, 이 세포들을 Permwash buffer로 두 차례 세척 한 후 FACs buffer에 재부유하여 유세포 분석기로 분석하였다.

레바미피드에 의한 Th17 세포 분화유도시 STAT3 의 인산화 변화를 보기 위하여 유세포 분석을 시행한 결과, Th17 분화시 증가된 STAT3의 인산화 정도는 레바미피드의 처리 시 인산화 정도가 감소된 것으로 나타났다.

최종적으로, 상기 결과들을 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 레바미피드 화합물의 경우, 병원성 세포인 Th17로의 세포 분화는 억제하고, 반면, Foxp3의 발현은 증가시키는 활성이 있음을 확인함에 따라 레바미피드가 면역조절세포인 Treg 세포를 활성화시키는 작용을 통해 면역질환 또는 암 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었고 나아가 IL-6 및 TH17 세포 분화시 증가되는 STAT3의 인산화를 억제하는 기작을 통해 면역질환을 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Composition for preventing or treating cancer or immune disease comprising rebamipide <130> np11-1198 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17 sense primer <400> 1 cctcaaagct cagcgtgtcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17 antisense primer <400> 2 gagctcactt ttgcgccaag 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foxp3 sense primer <400> 3 cccaggaaag acagcaacct t 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foxp3 antisense primer <400> 4 caaacaggcc gccgtctgga gcc 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RORrt sense primer <400> 5 tgtcctgggc taccctactg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RORrt antisense primer <400> 6 gtgcaggagt aggccacatt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT3 sense primer <400> 7 gacccgccaa caaattaaga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT3 antisense primer <400> 8 tcgtggtaaa ctggacacca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL20 sense primer <400> 9 cagctgttgc ctctcgtaca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL20 antisense primer <400> 10 cacccagttc tgctttggat 20 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR6 sense primer <400> 11 ccatgactga cgtctacctg ttgaaca 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR6 antisense primer <400> 12 gaacagctcc agtcccatac ccagcag 27 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin sense primer <400> 13 gaaatcgtgc gtgacatcaa ag 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin antisense primer <400> 14 tgtagtttca tggatgccac ag 22

Claims (11)

1. 레바미피드(rebamipide) 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 레바미피드는 미분화 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 감소 또는 억제시키는 것을 특징으로 하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 레바미피드는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 암은 결장암, 직장암, 항문부근암, 골암, 위암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 중피종, 식도암, 담도암, 방광암, 고환암, 소장암, 생식세포종, 자궁 내막암, 나팔관암종, 질암종, 음문암종, 다발성 골수종, 육종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 방광암, 요도암, 뇌하수체 선종, 신장골반 암종, 척수 종양, 다발성 골수종, 신경교종암, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 조혈종양, 섬유육종, 신경아세포종, 성상세포종, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 간암, 뇌암, 폐암, 림프종, 백혈병, 악성 흑색종 및 피부암 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 면역질환은 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 면역질환은 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈 및 궤양성 대장염 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
7. 미분화 T 세포에 레바미피드(rebamipide) 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화 감소 또는 억제는 IL-17 사이토카인의 생성 억제를 통해 이루어짐을 특징으로 하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법.
9. 시험관(in vitro)내에서 레바미피드(rebamipide) 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법.
10. 제9항에 있어서,
    활성화된 조절 T 세포는 Foxp3의 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 조절성 T 세포를 활성화시키는 방법.
11. 레바미피드(rebamipide) 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물.
    

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