KR20210058723A

KR20210058723A - 비멘틴 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20210058723A
Application number: KR1020200151832A
Authority: KR
Inventors: 조미라; 박성환; 이선영
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-14
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2021-05-24

Abstract

본 발명은 비멘틴(vimentin) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능성 식품 조성물에 관한 것으로, 우수한 Th17 세포 저해 활성, STAT3 활성 억제 및 Treg 세포 활성 촉진 효과를 가지고 있으므로 효과적으로 면역질환을 치료할 수 있다.

Description

비멘틴 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating immune disease comprising inhibitor of Vimentin}

본 발명은 비멘틴(vimentin) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 비멘틴 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

면역체계는 크게 선천성 면역(innate immunity)과 후천성 면역(acquired immunity)으로 나눌 수 있다. 후천성 면역은 척추동물에만 존재하는 면역체계로 여러 세포들이 네트워크처럼 얽혀 있으며, 항원제시세포, B세포, T세포 등이 관여한다. 효과기 세포(Effector cell)로는 B세포, T세포가 있는데, B세포는 항체를 분비하는 체액성면역(humoral immunity)에 관여하고, T세포는 주로 세포성면역(cellular immunity)을 담당하여 세포독성 T세포(cytotoxic T cell)와 조력 T세포(helper T cell)로 분류된다. 면역계는 정상상태에서는 자가항원에 대한 특이적 면역반응을 제어하고 있으며, 외부항원에 대한 면역반응도 억제하고 있는 경우가 있는데, 예컨대 임산부의 태아에 대한 반응 및 만성감염상태에 있는 미생물에 대한 면역반응을 들 수 있다. 이러한 현상들은 항원 특이적 면역관용이 유도될 수 있는 기전으로 클론 제거(clonal deletion), 클론 무반응(anergy) 및 면역 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 의한 능동적 통제에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 이식항원에 대한 면역관용이 우연히 획득된 일부 환자나 실험적으로 면역관용을 유도한 동물모델을 조사해 보면 위의 세 가지 기전 모두 이식면역관용에 관여한다는 사실이 확인되고 있고, 특히 최근에는 면역조절 T림프구가 이식면역반응 뿐만 아니라 자가면역, 종양면역, 감염면역반응 등 생체의 거의 모든 면역반응을 통제하는데 관여하는 중요한 세포로 주목받고 있다. T 세포 분화에서 사이토카인은 Th1 또는 Th2 세포로의 분화에 필수적인 전사인자뿐만 아니라 성장인자(growth factor)를 유도 또는 억제하며, 분화된 조력 T세포 자체에서도 분비되어 다른 면역세포의 성장 및 분화를 일으키는 매개체 역할도 한다. Th1 세포에 의해 분비되는 대표적인 사이토카인이 인터페론-γ(interferon-γ)이고, Th2 세포에 의해 분비되는 대표적인 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-13이다. IL-17은 최근에 발견된 조력 T세포의 일종인 Th17세포의 대표적 사이토카인이다. 각각의 조력 T세포에 의해 분비되는 사이토카인은 해당 조력세포의 분화를 촉진하며 또 다른 조력 T세포의 분화를 억제한다. Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, 최근 그 존재가 밝혀진 Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg), 즉, 면역조절 T 림프구(Treg)는 크게 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD4+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5 ~ 10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성(adaptive) 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-β를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts등이 여기에 해당한다. Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하고자 하는 연구들이 많이 진행되고 있다. 또한, Treg 세포 이 외에 T 세포의 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만, Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다. Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다.

현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다. 또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.

한편, 인체는 약 200 여개의 관절로 이루어져 있다. 관절이란 뼈와 뼈가 만나는 부위이다. 관절은 뼈와 뼈 사이가 부드럽게 운동할 수 있도록, 연골, 관절낭, 활막, 인대, 힘줄, 근육 등으로 구성되어 있으며, 움직임에 따라 발생하는 충격을 흡수하는 역할을 한다. 이러한 관절에 나타나는 염증성 질환은 자가면역이 원인인 것으로 이해되는 만성 관절 류마티스, 세균 감염에 의한 감염성 관절염, 여러 원인으로 인하여 관절 연골이나 뼈에 변성이나 파괴가 일어나는 변형성 관절염, 결합조직의 퇴행성 변화로 인하여 가용성 대사 산물이 관절 주변의 결합 조직 내에 결정으로 침착되는 결정성 관절염 등으로 크게 구분될 수 있다. 또한, 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 일산화질소의 생성과, 생성된 일산화질소에 의한 자가 증폭적인 사이토카인의 생성으로 인해 더욱 많은 MMP의 합성이 유발되어 관절기질의 분해가 촉진됨으로써 더욱 악화된다. 이와 동시에, 염증성 사이토카인은 지질 대사산물인 프로스타글란딘 E2의 생성을 증가시켜 관절염에서의 염증반응을 유발시킨다.

최근 인터루킨-17 (IL-17)을 생산하는 Th17 세포가 류마티스 관절염의 병인에 주도적인 역할을 하며, 특히 관절염증과 골 파괴를 직접 유도하는 것이 밝혀지면서 이들의 제어를 위해서 Th17 세포의 활성을 유도하는 IL-6 사이토카인을 억제하거나 forkhead box protein 3 (Foxp3)를 발현하는 면역 조절 T 세포(regulatory T cells; Treg)의 증식과 활성을 유도하여 병인 T 세포의 제어 및 면역관용을 유도하는 것이 류마티스 관절염의 치료에 중요한 것으로 알려지고 있다. 이러한 Th17 세포 또는 조절 T 세포의 동시 균형 조절은 핵심적인 사이토카인과 이에 상응하는 전사인자의 상호조절을 통해 나타나는 것으로 밝혀졌다. Th17 세포의 분화 및 활성에 핵심전사인자로 알려진 STAT3는 직접적으로 IL-17의 로커스(locus)를 조절할 수 있고 Th17 분화와 관련된 많은 전사인자들의 발현에 필수적인 요소로서 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. Th17 세포 내에서 이러한 STAT3의 활성을 억제하면 Th17 세포는 제어되고 면역 조절 T 세포의 활성은 동시에 유도되는 이상적인 면역조절이 이루어진다. 면역조절 T 세포에서는 Foxp3와 STAT5가 주요 전사인자로 알려져 있으며 Th17 세포에서 STAT3 활성을 억제하면 동시에 STAT5 활성이 유도되는 기전이 밝혀지면서 STAT3와 STAT5와 상호조절이 매우 중요한 면역조절 기전으로 예측되고 있다.

한편, 상기 관절염 치료에 사용되는 약물은 염증의 감소, 질병 진행의 지연, 요산 농도의 감소라는 주된 작용기전을 근거로 대별할 수 있는데, 많은 신경관절염 치료 약물들이 염증을 감소시키는 작용을 한다. 염증은 통증, 부종, 열감, 발작, 경직을 일으키는 병적 과정이며, 염증을 신속히 완화시키는 약물에는 아스피린을 비롯한 비스테로이드성 항염제와 코티손을 비롯한 스테로이드성 항염제가 있다.

비스테로이드성 항염제는 통증을 감소시켜서 신경관절을 편안하게 하고 염증을 완화시키는 효과가 있으나, 위장장애가 나타나거나 복통을 유발하는 경우도 있기 때문에, 활동성 소화성 궤양이나 위장 부위의 출혈적 병력이 있는 사람에게는 사용이 금지된다. 스테로이드성 항염제는 그 효과에 비해 체중 증가나 고혈압 등의 부작용이 심각하여 퇴행성 신경관절염에는 잘 사용하지 않는다.

특히, 스테로이드성 항염제는 질환의 원인 치료와는 전혀 무관하고, 단순히 통증을 일시적으로 감소시켜 관절의 과잉 사용을 유도할 소지가 있으며, 이는 신경 관절을 파괴하고 장애를 악화시키는 요인이 되기 때문에 사용에 주의를 요한다.

따라서 관절염 등의 관절손상에 사용되는 종래의 치료법은 한정적인 유효성을 갖고, 명백한 유독성 부작용을 수반하며, 장기간 동안 지속적으로 사용할 수 없어 그 유효성이 제한되므로, 기존의 치료법이 갖는 단점을 극복한 새로운 신규 치료법 내지는 치료제가 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 비멘틴(vimentin) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비멘틴(vimentin) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 목적은 비멘틴(vimentin) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 비멘틴(vimentin) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 비멘틴(vimentin) 유전자를 억제시킴으로서 우수한 Th17 세포 저해 활성, STAT3 활성 억제 및 Treg 세포 활성 촉진 효과를 가지므로 효과적으로 면역질환을 치료할 수 있다.

도 1a는 병인 Th17 세포 내 비멘틴의 특이적 발현을 FACS를 통해 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 병인 Th17 세포 내 비멘틴의 특이적 발현을 공초점 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 관절염 마우스 모델의 관절 내 비멘틴의 발현 정도를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 관절염 마우스 모델의 비장에서 비멘틴 발현에 따른 발현 정도를 공초점 현미경 관찰을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2c는 관절염 마우스 모델의 비장에서 비멘틴 발현 CD4+ T 세포에서의 p-STAT3의 발현 정도를 공초점 현미경 관찰을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 비멘틴 유전자 억제에 의한 Th17 활성 제어 효과를 나타낸 도이다.
도 3b는 비멘틴 유전자 억제에 의한 Th0 및 Th17 세포에서의 STAT3 활성을 공초점 분석을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 비멘틴 억제제에 의한 관절염 치료 효과를 확인한 것으로, 비멘틴 억제제 투여에 의한 관절염 지수 및 관절염 발병정도를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 비멘틴 억제제 처리된 마우스의 비장 면역 세포 내 Treg 세포 증가 효과를 FACS 분석을 통해 나타낸 도이다.
도 5는 비멘틴이 넉 아웃된 마우스 비장 면역 세포에서의 TH17 세포, 플라즈마 B 세포 및 TFH-17 병인 세포 억제 효과를 FACS 분석을 통해 나타낸 도이다.
도 6a은 비메틴 넉 아웃 마우스에 type collagen 특이 항체 주입을 통해 자가항체 특이적 관절염 유발된 마우스에서의 관절염 질환 억제 효력을 나타낸 도이다.
도 6b은 자가항체 특이적 관절염 유발된 마우스의 비장 조직에서의 비멘틴 발현 Th17 세포의 억제 효력을 나타낸 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 발명에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명은 비멘틴(vimentin) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 비멘틴 억제제는 RNA 간섭에 의해 비멘틴의 유전자 발현을 억제하는 핵산 분자 또는 이를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터일 수 있으며, 핵산 분자는 siRNA(small interfeing RNA) 또는 shRNA(short hairpin RNA)일 수 있다.

상기 비멘틴 억제제는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진시킬 수 있고, Th17 세포를 저해할 수 있으며, STAT3 활성을 억제할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “발현 억제"란 표적 유전자의 (mRNA로의) 발현 또는 (단백질로의) 번역 저하를 야기하는 것을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "siRNA(small interfering RNA)"란 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다 (국제 공개특허 번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자 치료 방법으로 제공된다. 본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(비멘틴의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(비멘틴의 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분 자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 비멘틴의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다 (shRNA). 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다. siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포 안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.

상기 비멘틴에 대한 siRNA를 비멘틴 억제제로 포함하는 조성물은 siRNA의 세포 내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포 내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으 며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1 종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔 (polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄 (polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자 (cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산 (hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.

본 발명은 서열번호1로 기재되는 염기서열을 갖는 비멘틴(vimentin)의 발현을 억제하는 shRNA를 제공한다.

상기 비멘틴 (서열번호 1)에 대한 shRNA는 통상의 기술자에게 공지된 방법으로 제작할 수 있다.

상기 shRNA(short hairpin RNA)는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루지 않고, 스템-루프(stem-loop)의 구조를 이루는 헤어핀 구조를 가지는데, 상기 이중사슬 또는 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 5 내지 80 염기, 바람직하게는 10 내지 50 염기, 더욱 바람직하게는 15 내지 30 염기이다. 또한, 상기 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스서열과 안티센스서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3-10 정도의 염기를 가지고 있으면 족하다. 종래에 shRNA의 루프 영역으로 많이 사용되어온 예들은 다음과 같다: AUG(Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(8):5515-5520, 2002), CCC, CCACC 또는 CCACACC(Paul et al., Nature Biotechnology 20:505-508, 2002), UUCG(Lee et al., Nature Biotechnology 20:500-505), CTCGAG, AAGCUU(Editors of Nature Cell Biology Whither RNAi, Nat Cell Biol.5:489-490, 2003), UUCAAGAGA(Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052, 2002) 및 TTGATATCCG(www.genscript.com의 default spacer).

또한, 본 발명은 상기 서열번호1로 기재되는 염기서열을 갖는 비멘틴(vimentin)의 발현을 억제하는 shRNA를 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 선형 DNA(linear DNA), 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스 벡터로 구성된다.

상기 플라스미드(Plasmid)는 세균의 세포 내에 복제되어 독자적으로 증식할 수 있는 염색체 이외의 DNA 분자를 총칭하는 말로서 고리 모양을 띤다. 플라스미드는 세균의 생존에 필수적이지는 않으며, 다른 종의 세포 내에도 전달될 수 있으므로 이런 성질을 이용하여 세균 내 플라스미드를 세포 밖으로 빼내고 제한효소로 자른 뒤 필요로 하는 유전자를 삽입하여 이를 다시 세균에 넣어 배양하는 유전자재조합 기술을 사용한다.

상기 재조합 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스(retrovirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 및 렌티바이러스(lentivirus)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 렌티바이러스이다.

상기 아데노바이러스(Adenoviridae)는 90~100nm의 중형 크기의 바이러스로서 외피는 없고 정이십면체로 되어 있으며, 이중나선 형태의 DNA를 가지고 있다. 아데노바이러스는 어린이가 걸린 상부 호흡기 질환 중 5~10%의 원인이며, 어른들도 감염되기도 한다.

상기 아데노부속 바이러스는 파르보바이러스(parvovirus)에 속하는 단일 가닥의 DNA 바이러스로서 단독으로 복제를 할 수 없으며 아데노바이러스나 백시니아(vaccinia), 혹은 헤르페스바이러스(herpesvirus) 등의 헬퍼(helper) 바이러스와 함께 감염되었을 때 복제, 증식할 수 있는 결함 바이러스이다. 헬퍼(helper) 바이러스가 없을 때 아데노부속 바이러스 게놈은 사람 세포의 19번 염색체의 특정 부위 내로 삽입되어 잠복 상태로 남아 있다가 헬퍼(helper) 바이러스가 감염되면 복제, 증식이 가능하게 된다. 아데노부속 바이러스 게놈은 4681 bp의 DNA로, 양 끝에 145 bp의 ITR을 갖는데, 이는 복제와 포장 그리고 rescue에 요구되는 최소 염기 서열이다. ITR내부에는 2개의 ORF이 있는데, 이는 복제에 요구되는 rep, 그리고 구조 단백질을 코딩하는 cap 유전자이다. 아데노부속 바이러스는 사람 세포에 잠복 감염이 가능하여, 염색체내로의 삽입이 세포 성장에 어떠한 변화도 야기하지 않으며, 다양한 세포에 효율적으로 감염할 수 있고, 아데노바이러스처럼 면역 반응을 유도하지 않는다.

최초의 재조합 아데노부속 바이러스 벡터는 cap 유전자를 제거하고 외래 유전자를 삽입함으로써 제조될 수 있고, 보다 바람직하게는 rep 유전자와 cap 유전자가 모두 외래유전자로 대치된 형태일 수 있다.

상기 레트로 바이러스(retrovirus)는 감염된 세포에서 RNA 게놈이 DNA로 전환되어 숙주세포의 염색체내로 삽입되는 일련의 바이러스 군으로, 현재까지 Moloney Murine Leukemia Virus (MoMLV)에 기초한 레트로바이러스 벡터가 각종 유전자 치료를 위한 임상 시험에 가장 널리 사용된다. 레트로바이러스 입자는 2가닥의 RNA를 포함하는 단백질 core가 지질 외막에 의해 돌러 싸인 형태를 하고 있다. 레트로바이러스는 외막 단백질이 세포 표면의 특정 수용체와 결합함으로써 시작되는데, 동물 세포에 감염할 수 있는 ecotropic 외막의 경우 그 수용체는 cationic amino acid transporter이며, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 MoMLV amphotropic 외막의 수용체는 phosphate transporter (Ram-1)로 알려져 있다. 바이러스와 세포막간의 융합 혹은 세포흡수작용에 의해 바이러스는 세포내로 도입되고 바이러스의 RNA는 역전사과정에 의해 DNA로 전환되어 핵으로 이동한다. 대부분의 레트로바이러스는 상기 DNA가 핵속으로 들어가기 위해 유사 분열과 그에 따른 핵막의 파괴를 필요로 하며, 핵내에서 DNA는 염색체내로 삽입되어 provirus를 형성한다. 삽입된 provirus에서 전사된 RNA로부터 gag, pol, env 유전자 산물이 합성되고 이들은 게놈 크기의 바이러스 RNA만을 포장하여 바이러스 입자를 생산하게 된다.

상기 렌티바이러스(Lentivirus)벡터는 레트로바이러스의 일종으로서 일반적인 레트로바이러스와는 달리 분열하는 세포뿐 아니라 성장이 멈춘 세포나 분화가 끝난 세포에도 감염할 수 있다는 특성으로 인하여 유전자 전달 벡터로 개발되고 있으며, 대표적인 예가 HIV인데, 이는 gag, pol, env 외에도 6개의 accessary 유전자을 더 포함한다. 몇몇 accessary 유전자를 제거한 HIV 벡터의 경우 VSV 외막 단백질로 pseudotyping 되었을 때 동물시험에서 뇌, 간, 근육 세포등 광범위한 세포로 감염할 수 있고, 6개월 이상 지속적인 유전자 발현을 유도할 수 있다.

면역질환은 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부 질환일 수 있으며, 골관절염, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 궤양성 대장염, 염증성 대장 질환 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 골관절염인 것이 더욱 바람직하다.

면역질환은 Treg 세포가 감소하고; Th17 세포 및 IL-17 생성 세포가 증가하며; 병인 Th17 세포 내 비멘틴 발현이 증가하고; 및 인산화된 STAT3 (Y705 및 S727)가 증가된 질환일 수 있다.

본 발명의 용어, "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 류마티스 관절염, 이식 거부 질환 등과 같은 면역질환의 치료 또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴;

(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함;

(3) 면역질환을 경감시킴;

(4) 면역질환의 재발을 예방함; 및

(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양의 비멘틴 억제제를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 조성물의 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 조성물은 골관절염의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 1 x 10³~1 x 10¹²세포/kg 이다.

본 발명은 비멘틴 억제제를 유효성분으로 포함하는 STAT3 활성 억제제, Th17 세포 저해제 또는 Treg 세포 활성 촉진제를 제공한다.

또한, 본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 비멘틴 억제제를 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 비멘틴 억제제 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 비멘틴 억제제를 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 비멘틴 억제제를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 비멘틴 억제제를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 비멘틴 억제제와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 비멘틴 억제제와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

본 발명은 비멘틴 억제제를 처리하는 단계를 포함하는 Th17 세포를 저해하는 방법을 제공한다.

본 발명은 비멘틴 억제제를 처리하는 단계를 포함하는 Treg 세포 활성 촉진방법을 제공한다.

이하 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

실험예 1. 관절염 동물모델의 제작

분양받은 6∼7주령의 수컷 DBA/1J 마우스(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)는 2주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 22.0±2℃, 1일 중 12시간은 200∼300 Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다. DBA/1J 마우스에 Complete Freund's Adjuvant (CFA; DIFCO, Detroit, MI)와 1：1 (v/v)비율로 섞은 Bovine Type II collagen(Chondrex Inc., Redmond, WA) 100 μg을 꼬리 부분에 피하로 주사하여 류마티스 관절염 동물모델인 콜라겐 유도관절염 모델(type II collagen-induced arthritis; CIA)을 제작하였다.

실험예 2. 비멘틴(vimentin) 억제용 shRNA 제작

비멘틴 억제용 shRNA을 Santacruz/sc-29523-SH(서열번호 1로 표시되는 비멘틴)를 구입하여 이용하였다.

실시예 1. 병인 Th17 세포 내 비멘틴의 특이적 발현 증가 확인

병인 Th17 세포 내 비멘틴의 특이적 발현 증가를 확인하고자 FACS 및 공초점 분석을 진행하였다. 이를 위하여 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 각 T helper 세포로 분화시킨 후 실험에 이용하였다. 이후 각 T helper 세포에서 비멘틴 발현정도를 측정하였다.

그 결과 도 1a에 나타낸 바와 같이 병인 Th17 세포 내 비멘틴이 현저하게 증가함을 확인하였으며, 도 1b에 나타낸 바와 같이 Th17 세포에서 비멘틴이 높은 것을 확인하였으며, Foxp3 발현 Treg 세포에서의 비멘틴 발현은 감소됨을 확인하였다.

실시예 2. 관절염 유발 마우스 모델의 관절 및 비장 조직 내 비멘틴의 특이적 발현 확인

실시예 2-1. 공초점 현미경 관찰

관절염 유발 마우스 모델의 관절 및 비장 조직 내 비멘틴의 특이적 발현 확인하기 위하여 공초점 현미경 관찰을 실시하였다.

구체적으로 상기 실험예 1의 마우스를 희생시켜 관절 및 비장 조직을 수득한 후 OCT compound (Sakura Finetech USA, Torrance, CA)에 포매시킨 뒤 액체질소로 동결된 비장조직을 7 μm 두께의 연속적인 조직 절편을 Coated slide에 부착하였다. 조직절편은 공기 중에서 한 시간 건조시킨 후 4% paraformaldehyde solution(Sigma)에 넣어 실온에서 차가운 acetone으로 15분간 고정시킨 뒤 PBS로 15분간 씻어주었다. 불특정 결합을 억제하기 위해 10% normal goat serum을 넣고 상온에서 30분간 반응시켰다. Anti-CD4 PerCP(BD Pharmingen, San Diego, CA), anti-IL-17 PE 항체(eBioscience, San Diego, CA)와 anti-Foxp3 PE (eBioscience), anti-STAT3 phospho Y705 항체-PE 항체(BD Pharmingen), anti-STAT3 phospho S727 항체(BD Pharmingen)를 넣고 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS로 30분간 씻어주었다. Cover-slip 위에 수용성 봉입제(Dako cytomation, Denmark)를 한 방울 떨어뜨린 뒤 조직 부위에 살포시 덮었다. 그리고 공초점 현미경(Zeiss, LSM510 Meta, Germany)으로 관찰하였다.

그 결과 도 2a에 나타낸 바와 같이 관절염 발병군(CIA)의 관절 시노비움 내에서 비멘틴 발현이 증가함을 확인하였다.

실시예 2-2. 비멘틴 발현에 의한 Th17 세포 및 조절 T 세포 변화 관찰

Th17세포는 류마티스 관절염의 병인에 주도적 역할을 하며 면역 조절을 위하여는 Th17 세포는 억제되고 조절 T 세포는 증식 및 활성이 이루어져야 하는바, 비멘틴 발현에 의한 Th17 세포 및 조절 T 세포 변화를 관찰하였다.

그 결과 도 2b에 나타낸 바와 같이 관절염 발병군(CIA)에서 많은 양의 CD4+IL-17+ 세포의 분포가 관찰되어 Th17 세포가 증가함을 확인하였으며 반면 CD4+FoxP3+는 감소하여 조절 T 세포는 감소함을 확인하였다. 관절염 발병군에서 증가된 Th17 세포에 vimentin의 발현이 증가되어 있음을 확인하였으며, 조절 Treg 세포에서는 그 발현이 감소되어 있음을 확인하였다.

실시예 2-3. 비멘틴 발현에 의한 STAT3 의존적인 TH17 세포 및 면역조절 T 세포의 변화 확인

TH17 세포의 분화는 STAT3에 의존적으로 조절된다. 이에 비멘틴이 이러한 주요 전사인자들의 발현과 연관성이 있는지 보고자 CD4+ T 세포 내 STAT3의 인산화 부위를 면역형광염색을 통해 조사하였다.

그 결과 도 2c에 나타낸 바와 같이, 관절염 발병군(CIA)에서 비멘틴을 발현하는 TH17 세포에 동일한 양상으로 인산화된 STAT3 (Y705와 S727)가 증가함을 확인하였다.

실시예 3. 비멘틴 억제제에 의한 STAT3 활성 억제 매개 Th17 활성 억제 확인

비멘틴 억제제에 의한 Th17-IL17 활성 제어 및 STAT3의 활성 억제 효과를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿을 통해 Th17의 활성과 관련 있는 STAT3 727, 705와 STAT3 및 비멘틴 발현 정도를 측정하였다.

먼저 정상 마우스 T 세포를 Th0, Th17 세포 분화 조건으로 분화시켰으며, 이때 vimentin lentiviral sup을 처리하여 비멘틴의 발현을 억제하였다. 각 세포 배양 후 세포로부터 유전자 및 단백질을 분리하였으며, 분리된 유전자에서 IL-17 및 비멘틴 유전자를 분석하였다.

또한 분리된 단백질을 이용하여 WB 을 진행함. 각 로딩된 멤브레인에 pSTAT3 705, pSTAT3727, total STAT3, vimentin, b-actin 특이적인 항체와 반응시간을 주었으며, 각 항체의 특이 secondary Ab를 이용하여 각 단백질을 분석하였다.

그 결과 도 3a에 나타난 바와 같이 비멘틴 유전자가 억제된 경우 Th17-IL-17 활성이 억제되는 것으로 나타났으며, 도 3b에 나타낸 바와 같이 Th17 분화 조건하에서 pSTAT3 727이 증가된것을 확인 할 수 있었으며, 반면 vimentin lentiviral sup 처리에 의해서 비멘틴 발현을 억제한 처리군에서는 pSTAT3 727이 감소됨을 확인하였다. 또한 양성 대조군에서 비멘틴의 발현이 vim lentiviral sup 처리에 의해서 감소됨을 확인하였다.

상기 결과를 통하여 Th17 세포의 분화에 비멘틴 단백질이 관여하고 있음을 확인하였다.

실시예 4. 관절염 지수 평가

비멘틴 억제제의 관절염 치료효과를 평가하기 위해 제2형 콜라겐을 이용하여 상기 실험예 1과 같이 콜라겐 유발 관절염 마우스를 확립하였다. 콜라겐 1차 주입 후 7일째 후 부터 일주일에 단위로 hydrodynamic 방법을 이용하여 유전자를 주입하였다. 비멘틴 억제제를 복강 투여한 치료군과 PBS만 투여한 대조군의 관절염 중증도를 평가하였다. 관절염 병변의 육안적 관찰은 공지된 기준(Barnett ML, Kremer JM, St Clair EW, Clegg DO, Furst D, Weisman M, et al. Treatment of rheumatoid arthritis with oral type II collagen. Results of a multicenter, double-blind, placebo-controlled trial. Arthritis Rheum 1998;41:290-7.)에 근거하여 다음과 같은 스코어를 사용하여 실시하였다.

0점: 부종이나 종창이 없음

1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한부종과 발적

2점: 발목관절에서 족근골에 걸친 경한 부종과 발적

3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적

4점: 발목에서 다리전체에 걸쳐 부종과 발적이 있고 관절경직이 나타난 경우

따라서, 관절염 병변의 최고 스코어는 마우스 한 마리 당 16이며, 꼬리에 주사한 시점으로부터 8주까지 일주일에 2회씩 실시하였고, 평가 자료는 실험과 관계없는 3인이 작성하였다.

그 결과 도 4a에 나타낸 바와 같이 콜라겐 유발 관절염 모델은 1차 면역 후 약 3주부터 관절염이 발병하기 시작하였으며 비멘틴 억제제 처리군에서는 대조군과 비멘틴을 과발현 시킨 군에 비하여 비교적 낮은 중증도를 유지함을 확인하였다.

실시예 5. 관절염 유발 마우스 모델 내 면역조절 T세포 조절효과 확인

최근 염증성 자가면역질환의 치료는 병인세포를 억제하는 동시에 조절세포의 분포 및 활성을 증가시켜 면역체계의 이상을 정상화하는 것에 초점이 맞춰지고 있는바 본 발명의 비멘틴 억제제 처리에 따른 Foxp3를 발현하는 조절 T 세포의 분포를 변화를 확인하였다.

그 결과 도 4b에 나타낸 바와 같이, 비멘틴 억제제는 비멘틴을 억제하지 않은 처리군에 비하여 Treg 분화 조건에서 Foxp3를 발현하는 세포를 현저하게 증가시킴을 확인하였다.

실시예 6 비멘틴 넉아웃 마우스에서 병인 Th17 세포 활성 억제 및 TFH-17 세포 활성 억제 확인

10주령의 비메틴 넉아웃 마우스(129S-Vimtm1Cba/MesDmarkJ로부터 구매)의 비장 세포에서 각 세포 아형을 유세포 분서하였다. 보다 구체적으로, 129Sj wt 마우스 대비 비멘틴 넉아웃 마우스에서 각 세포 아형을 분석하였다( Th17(cd4+ Il-17+ T cell), Treg (CD4+CD25+Foxp3+) , plasma B cell (B220-Cd138+), TFH-17 (cd4+cxcr5+Il-17+)).

도 5에 나타난 바와 같이, 비멘틴이 넉아웃되는 경우, 병인성 TH17 세포, 플라즈마 B 세포 및 TFH-17 세포의 아형이 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 비멘틴이 병인성 TH17 세포 및 TFH-17 세포를 감소시켜 TH17 증가로 인한 면역질환에 범용적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

시예 6 비메틴 넉 아웃 마우스에 type II collagen 자가항체 cocktaildmf 이용한 자가항체 관절염 마우스 CAIA (Collagen Antibody Induced Arthritis) 관절염 질환 제어 검증

8주령의 129Sj wt 및 비멘틴 넉아웃 마우스에서 타입 II 콜라겐 항체 칵테일 (Arthrogen-CIA® 5-Clone Cocktail Kit, 40 mg, chondrex, Inc.) 5mg을 정맥주사하고, 주입 3일 후, LPS (sigma aldrich)를 복강 주사하여 CAIA를 유도하였다. 이 후, 관절염 점수를 확인하였다. 이의 결과를 도 6에 나타내었다.

이의 결과, 비멘틴 넉아웃 마우스에서의 CAIA 발병이 현저히 감소함을 확인하였다. 또한, 비장 조직 내, p-STAT3 727+vim+Th17 세포의 활성이 저해됨을 확인하였다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for preventing or treating immune disease comprising Vimentin <130> PN1911-625 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vimentin <400> 1 attccaaatc tatcttgcg 19

Claims

비멘틴(vimentin) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 면역질환은 Th17 세포 내 비멘틴이 증가된 면역질환인 것인, 조성물
제 1항에 있어서, 상기 면역질환은 1)병인성 Th17 세포의 활성을 증가; 또는 2)TFH-17 세포의 활성이 증가된 질환인 것인, 조성물.
제 3항에 있어서, 억제제는 RNA 간섭에 의해 유전자의 발현을 억제하는 핵산 분자 또는 이를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터인, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 핵산 분자는 siRNA(small interfeing RNA) 또는 shRNA(short hairpin RNA)인, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 비멘틴은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 재조합 벡터는 재조합 바이러스 벡터인, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 7항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스(retrovirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 및 렌티바이러스(lentivirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 면역질환은 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부 질환인, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 면역질환은 골관절염, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 궤양성 대장염, 염증성 대장 질환 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 면역질환은 관절염인, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 면역질환은
1) Treg 세포가 감소하고;
2) Th17 세포 및 IL-17 생성 세포가 증가하며;
3) 병인 Th17 세포 내 비멘틴 발현이 증가하고; 및
4) 인산화된 STAT3 (Y705 및 S727)가 증가한 조건을 갖는 것인, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 비멘틴 억제제는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진시키는, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 비멘틴 억제제는 Th17 세포를 저해하는, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 비멘틴 억제제는 STAT3 활성을 억제하는, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.