KR20090033328A - 면역 특권 및 조절 전구 세포 - Google Patents

Abstract

본원에서는 림프구와, 상기 림프구에 의해 외래인 것으로 인식되는 물체 사이의 면역 반응을 조절하는 방법을 기술한다. 본 방법은 인간 제대의 혈관주위 부위로부터 유래된, HUCPVCs로 명명되는 새로운 부류의 전구 세포의 면역조절 활성을 이용한다. 본 방법은 또한 배양된 HUCPVCs로부터 삼출된 가용성 인자를 사용한다. 본 방법은 이식편대 숙주 질환, 자가면역 질병 등을 비롯한 면역 질병을 치료하는데 유용하다.

인간 제대 혈관주위 세포, 면역특권, 면역조절, 전구 세포,

Description

면역 특권 및 조절 전구 세포{IMMUNE PRIVILEGED AND MODULATORY PROGENITOR CELLS}

본 발명은 면역특권이 있고/거나 면역조절성인 전구 세포, 그의 생산 방법, 그의 제제, 및 그의 치료학적 용도에 관한 것이다.

성인 골수(BM)는, 시험관내에서 골격 조직: 뼈^2-4, 연골^5-7, 지방⁸ 및 근육⁹으로 분화될 수 있는 그의 능력에 의해 기능적으로 정의되는 중간엽 줄기/전구 세포(MSCs) (중간엽 간질 세포로도 명명됨¹)의 가장 보편적인 공급원이다. MSCs는 고전적으로 조직 배양 플라스틱에 대한 부착 및 콜로니 형성 단위-섬유모세포(CFU-Fs)의 형성을 통해 비균질 세포 환경으로부터 식별되는데, 그의 빈도는 성인 골수¹⁰에서 1:100,000-1:500,000 유핵 세포이며, 현재는 연구를 통해 MSCs를 분류하는 한벌의 마커가 확인되었다^{10, 11}. 이와 같이 MSCs의 비율이 낮기 때문에 임의 종류의 세포 요법을 위해 적절한 세포 갯수를 획득하기 위해서는 사용하기 전에 배양물을 확장 및 선별해야 할 필요가 있다. 예로서, CFU-F 빈도가 각각 1:32¹⁵, 1:636¹³ 및 1:88,495¹⁴인 지방 조직¹², 해면 골¹³ 및 태아 간¹⁴과 같은 MSCs의 기타 신생 공급원이 존재한다. 지방 조직은 가장 높은 빈도의 전구세포를 갖는 것으로 보이는 반면, 상기 세포의 배가 시간은 3.6 내지 4.4일 범위이고¹⁵, 추출 방법은 복잡하고, 침습적이며, 소요 시간이 길다¹². 해면 골 수거로 특히 CFU-F 빈도와 조합하였을 때에는 세포 수율이 낮고 (어린 도너로부터 89 x 10⁶ 세포/g의 뼈¹³); 해면 골 수거는 극도로 침습성인 바, 도너 부위에 질병을 일으킨다.

이들 새로운 MSCs 공급원 중 독특한 것은 인간 제대 혈관주위 세포(HUCPVCs)인데, 이는 접근하기 쉽고, 고도로 증식성인 세포 공급원으로서, 군집 배가 시간은 20시간이다 (혈청에 따라 다름)¹⁶. HUCPVCs 중 CFU-Fs의 빈도는 0 계대에서는 1:300이지만, 1 계대에서는 1:3으로 증가하며¹⁷, 이는 골수보다 차수가 더 높다¹⁶. 그러므로, HUCPVCs는 극도로 높은 비율의 MSCs를 가지며, 매우 빠르게 분할하게 되는 세포 군집을 나타내는 바, 이로써 상기는 임상의 중간엽 요법에 대한 우수한 후보 물질이 된다. 이들 세포는 그의 마커 발현 표현형 및 분화능을 측정하는 다양한 분석법에 사용되어 왔고^{16, 18}, BM-MSCs와 세포학적으로 등가성이거나, BM-MSCs보다 더 잘 실행하는 것으로 밝혀졌다.

분화할 수 있는 그의 능력 이외에도 BM-MSCs가 면역특권이 있으면서 면역조절성인 것으로 나타난 바, MSCs는 또한 잠재적인 면역학적 용도도 갖는다^19-21. 이 러한 용어는 각각 미스매치된(mismatched) 숙주의 면역계에 의해 인식되는 것을 회피할 수 있는 세포의 능력, 상기 면역계에 의해 진행 중인 반응을 완화시킬 수 있는 능력을 지칭한다. 골수 이외의 여러 공급원으로부터의 MSCs는 그의 면역원성에 대하여 시험관내 배양에서 시험되었다. 성인 피부지방절제술로부터 얻은 지방 조직으로부터의 MSCs는 시험관내에서 면역특권이 있으면서 면역조절성일 수 있는 것으로 나타난 반면²², 태아 간 세포는 미스매치된 면역 반응을 피할 수 있는 것으로 나타났지만, 이는 2개의 미스매치된 림프구 군집에 의해 유발되는 동종반응을 조절하지는 못했다^{23, 24}. 따라서, MSCs의 공급원이 상기 세포의 면역원성 능력에 직접적으로 영향을 준다.

이러한 시험관내 연구가 임상 환경하에서 입증되기 시작하였다; 예를 들면, 한 소년의 어머니로부터 얻은 일배수동종 골수 MSCs를 수혈함으로써 상기 소년을 중증 급성 이식편대 숙주 질환(GvHD)으로부터 구하였다²⁵. 치료 후 1년째에 중증도 수준이 동일한 질환을 앓고 있는 환자 코호트와 비교하였을 때 상기 소년만이 유일한 생존자였다. 이러한 최초 환자 이래 한 세트의 환자 8명을 BM-MSCs로 치료하였는데, 이중 6명의 증상이 완전히 완화된 것으로 나타났다²⁶. 동종이형 BM-MSCs는 또한 크론병에서 현 치료법에 불응성인 환자들을 치료하기 위해 사용되어 왔으며, 이러한 치료법은 현재 미국에서 임상 시험 중에 있다^{27, 28}. 태아 간 MSCs는 불완전 골생성증(OI)의 조기 치료에서 효능을 나타내었다. 남성 태아 간으로부터 얻은 MSCs를, 몇번의 자궁내 골절을 앓은 바 있고, 중증 OI를 앓고 있으며, 혈연이 아닌 32주된 여성 태아에 이식하였다²⁹. 이식 후 남은 임신 기간은 정상적으로 진행되었으며, 추가의 골절은 없었다. 출생 후 2년까지 상기 환자는 정기적으로 진찰을 받았고, 상기 어린이는 정상적인 성장 곡선을 나타내었으며, 단지 3번 골절로 고생하였다. XY-특이 프로브를 사용하였을 때, 환자는 골 생검내 0.3%의 생착(engraftment)을 갖는 것으로 밝혀졌다.

미분화 세포 이외에도, 골생성적으로 유도된 토끼의 BM-MSCs는 시험관내에서 면역특권이 있으면서 면역조절성인 것으로 밝혀졌지만, 이식되었을 때에는 생체내에서 면역조절능을 상실하였다³⁰. 그러나, 이는 그들의 역할을 이행하기 위해서는 면역 반응으로부터의 보호만을 필요로 하는 바, 세포의 기능에는 영향을 미치지 못할 것이다. 더욱 복잡한 유도에서는 에리트로포이에틴을 방출하도록 뮤린 골수 MSCs를 조작하고, 이를 마우스에 이식하였는데, 조작하지 않은 대조군과 비교하였을 때 생착은 유의적으로 더 적은 것으로 나타났다³¹. 따라서, MSCs 조작이 그의 면역조절 및/또는 면역특권 손실을 일으킬 수 있으며, 이식편의 생존과 기능에 중요할 수 있다.

MSCs의 면역특권이 종간 장벽을 넘어, 이는 이종적으로 사용될 수 있다는 것을 입증하는 증거가 존재한다. 개코 원숭이에서 인간 BM-MSCs을 사용함으로써 피부 이식편 생존이 증가되었음을 나타낸 바르톨로뮤(Bartholomew) 등에 의해 최초로 입증되었다²¹. 이러한 연구의 최종 결과는 양성인 반면, 투여된 세포의 특이적인 운명은 결정되지 못했다. 왕(Wang) 등은 이종 BM-MSCs의 생존에 대해 연구하기 위하여 GFP 형질감염된 세포와 조직학적 분석법을 사용하였는데, 이는 세포가 면역억제없이 11주가 되는 시점까지 생존하였지만, 숙주 면역 반응은 증가하였다는 것을 나타내었다³². MSCs는 또한 2개의 심장 모델의 이종 이식에서 생존한 것으로 보고되었다^{33, 34}. HUCPVC를 사용한 예비 연구에서, 세포를 투과성 챔버 중 복강내로 전달하였다. 3주후 육안으로 시각화하였을 때 주목할 만큼 두드러진 염증은 없었다³⁵. 이는 HUCPVCs의 면역특권 뿐만 아니라, 거부없이 동물 모델에서 HUCPVCs를 시험할 수 있도록 하는 그의 능력에 관한 잠재능을 지시하는 유망한 예비 연구이다.

본 발명자들은 HUCPVCs와 언매치된(unmatched) 림프구의 공-배양법, 및 2개의 HLA 미스매치된 도너가 존재하는 혼합 림프구 배양법(MLCs), 둘 모두를 수행함으로써 시험관내에서 HUCPVCs의 면역특권 및 면역조절 성질을 연구하였다. 선천적 및 활성화된 림프구 환경, 둘 모두에 존재하는 다양한 수준의 HUCPVCs와 함께 HUCPVC 사멸, 림프구 증식 및 활성화도 연구하였다. 또한, 면역학적 효과를 관찰하기 위한 세포 접촉의 필요성도 연구하였다.

발명의 요약

이에, 본 발명자들은 본원에서 일원 및 이원의 시험관내 혼합 림프구 배양법(MLCs)으로 시험되었을 때 HUCPVCs의 면역특권능 및 면역조절능, 둘 모두를 설명하는 일련의 실험들을 보고한다. 추가로, MLCs를 실시하여, 미리 자극받은 림프구의 활성화에서 HUCPVC-유도성 감소가 이루어졌음을 밝혀내었다. 본 발명자들은 또한, 관찰되는 면역조절 효과에는 세포 접촉이 필요하지 않으므로, HUCPVC 면역조절 작용은 HUCPVCs 배양시에 생산된 가용성 인자(들)를 통해 매개된다고 제시하였다. 추가로, 본 발명자들은 HUCPVCs가 이원의 시험관내 MLC를 조절할 수 있다고 입증하였으며, 특히 면역 반응을 조절하는 세포 요법 적용을 위한 이들 세포들의 용도에 대해 기술하였다.

따라서, 본 발명의 측면들 중 하나에서 본 발명은 피험자에게 면역조절 유효량의 (1) 인간 제대 혈관주위 세포(HUCPVCs)를 포함하는, 및 바람직하게는 본질적으로 그로 구성된 세포 군집, 및/또는 (2) 상기 세포 배양시에 생산된 면역조절성의 가용성 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 면역 부작용을 앓거나, 면역 부작용이 발생할 수 있는 위험에 있는 피험자를 치료하는 방법을 제공한다. 관련 실시태양에서, 본 방법은 세포, 조직 및 기관을 비롯한 동종이형 또는 이종 이식편의 수혜자를 치료하는데에, 이식편대 숙주 질환을 비롯한, 동종이형 또는 이종 이식편에 대한 면역 부작용의 발병 또는 중증도를 감소시키는데 적용된다. 일반적인 측면에서는, 따라서 본 발명은 생리학적으로 용인되는 비히클 및 HUCPV 세포 또는 그로부터 추출될 수 있는 면역조절성의 가용성 인자를 포함하는 제제를 면역 반응을 조절하는데, 및 특히 저해하거나 감소시키는데 유효한 양으로 도입시키는 단계를 포함하는, 예로서, 말초 혈액 림프구와 같은 림프구와, 상기 림프구에 의해 외래인 것으로 인식되는 물체 사이의 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다.

관련 측면에서, 본 발명은 이식편과 수혜자 사이의 면역 반응을 완화시키거나 감소시키기 위한 것으로, 면역 부작용을 앓거나, 면역 부작용이 발생할 수 있는 위험에 있는 피험자 치료용의, 또는 이식 이전의 이식편 치료용의 약제 제조에서 HUCPVC 세포 또는 그에 의해 생산된 면역조절성의 가용성 인자의 용도를 제공한다.

그의 또다른 측면에서, 본 발명은 면역조절 유효량의 HUCPVCs 및/또는 그에 의해 생산된 면역조절성의 가용성 인자, 및 그에 대해 생리학적으로 용인되는 비히클을 포함하는, 단위 투여 형태 또는 다중 투여 형태의 제제를 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 배양된 HUCPVCs에 의해 생산된 하나 이상의 가용성 인자를 포함하는 면역조절성 추출물, 또는 그의 면역조절성 분획을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 투여되는 세포를 수득하고, 그를 극저온 저장없이 투여하는 것인, 본원 상기에 기술된 바와 같은 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 투여되는 HUCPVCs는 면역특권이 있고 면역조절성인 세포이다. 실시태양에서, HUCPVCs에는 실질적으로 MHC I형 및 MHC II형 표현형, 둘 모두가 결여되어 있다. 관련 실시태양에서, 투여되는 HUCPVCs는 냉동 HUCPVCs 군집을 해동시킴으로써 수득한다.

본 발명의 추가의 실시태양에서, 투여되는 면역특권이 있는 HUCPVCs는 유전 공학 처리되고, 특히, 전적인 것은 아니지만, 면역계를 조정하는에 효과적인 단백질, 예로서, 면역조절을 증진시키는 단백질, 및 특히 예로서, CTLA4와 같이 면역 부작용을 저해시키는 단백질을 비롯한, 관심의 대상이 되는 이종 단백질을 코딩하는 트랜스진을 혼입한다.

본 발명의 이러한 측면 및 기타 측면들은 첨부 도면을 참고로 하여 하기에서 더욱 상세히 기술된다.

도 1: 배양물을 MMC로 처리한지 7일후에 HUCPVCs의 세포 계수 (n=2). 5% CO₂하에 37℃에서 20분 동안 다양한 농도 범위의 MMC로 세포를 처리하고, 그의 증식에 관해 분석하였다. 모두 대조군보다 유의적으로 낮은 것으로 관찰된다 (p<O.001).

도 2: MMC로 처리된 웰과 미처리된 웰에 플레이팅된 세포의 증식. BrdU에 대한 유식 세포 측정법을 사용하여 증식을 측정하고, 평균 형광 강도를 사용하여 정량하였다. 처리된 웰과 미처리된 웰 사이에는 유의적인 차이가 없었다 (p=0.62).

도 3: HUCPVC 사멸은, 도너 1로부터 얻은 PBLs와 함께 4시간 동안 인큐베이션시킨 후에 조기 세포 사멸 마커인 아넥신 5에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 사용하여 측정하였다 (n=5). 대조군과 비교하여 10% HUCPVCs와 함께 배양하였을 때 평균 아넥신 5 발현이 유의적으로 증가하였다 (p=0.01, *로 표시); 이것이 유일한 유의적인 증가였다.

도 4: 림프구 증식은, 다양한 수준의 HUCPVCs와 함께 6일 동안 배양한 후에 BrdU에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 사용하여 측정하였다 (n=5). 대조군과 비교하 여 10% HUCPVCs와 함께 배양하였을 때 평균 BrdU 발현이 유의적으로 증가하였다 (p=0.02, *로 표시).

도 5: 0, 3 또는 5일째 첨가된 10 및 40% HUCPVCs의 전 치료군에 대하여 1일째부터 6일째까지 전체 림프구 세포 갯수를 측정하였다 (n=3). 6일째까지 대조군 림프구의 갯수는 서로에 대한 반응으로 증가한 반면, HUCPVCs 처리군은 첨가 비율 또는 첨가된 날과는 상관없이 유의적으로 더 낮다는 것을 알 수 있다 (p<0.05, *로 표시).

도 6: 트랜스 웰™ 인서트(Trans Well™ insert) 상에서 첨가된 10 및 40% HUCPVCs의 전 치료군에 대하여 1일째부터 6일째까지 전체 림프구 계수를 측정하였다 (n=3). 어느 날이든 동종이형 대조군과 HUCPVC 처리군 사이에는 어떤 유의적인 차이도 없다는 것을 알 수 있다.

도 7: HUCPVCs는 휴지기 또는 활성화된 림프구 세포 갯수를 증가시키지 않았다. 배양물 중 6일간에 걸쳐 대조군과 비교하였을 때 HUCPVCs의 첨가는 림프구 세포 갯수를 유의적으로 증가시키지 않았다 (n=6). 본 도면은 평균 세포 갯수, + 표준 편차로 나타낸다.

도 8: 유식 세포 측정법으로 측정된, HUCPVCs와의 공배양물 중 PBLs의 BrdU 발현. 세포 분할율(%)은 용량과 상관없이 HUCPVCs 첨가로 증가하지 않았다 (n=3). 대조군은 HUCPVCs를 포함하지 않는 PBLs의 BrdU 발현이었다.

도 9: HUCPVCs는 가용성 인자를 통해 작용한다. HUCPVCs는 트랜스 웰 인서트를 사용하여 분리되었을 때 MLCs에서 림프구 세포 갯수를 유의적으로 감소시킬 수 있다. 실험간의 계수 편차를 감소시키기 위해 평균 대조군 림프구 세포 갯수를 도면에서 100%로 설정하였다. 본 도면은 평균 림프구 세포 계수 비율(%), + 표준 편차 (n=6) (p*<0.05)로 나타내었다.

도 10: HUCPVCs는 활성화된 림프구의 공배양물 중 CD25 발현을 감소시킨다. 본 도면은 10% HUCPVC와 함께 공배양된 림프구 및 없이 배양된 림프구 상의 CD25 발현의 평균 발현율(%) (막대) 및 평균 형광 강도 (선), 둘 모두를 도시한다. 군집을 적절히 검출할 수 있도록 하기 위해 림프구를 PKH26으로 염색하였고, 결과는 PKH26 발현에 대해 게이팅된다. 평균은 ± 표준 편차이다 (n=3). (*p<0.05)이다.

도 11: HUCPVCs와의 이원 MLC (활성화된 림프구 포함)에서 CD45 발현. 불활성 군집으로부터 활성화된 림프구를 나타내기 위해 PKH26로 활성화된 림프구를 염색하고, 결과는 PKH26 발현에 대해 게이팅된다. 발현율(%) (막대 * p<0.05) 및 MFI (선 + p<0.05), 둘 모두를 나타낸다 (n=3). 대조군은 HUCPVCs를 포함하지 않는 ATL의 CD45 발현이었다.

도 12: (A) 녹색 형광 단백질(GFP)로 형질감염된 HUCPVCs, 발현 수준은 97.89%였다. (B). 이들 세포를 확립된 기법을 사용하여 렌티바이러스 벡터로 형질감염시켰다. 그리고,

도 13: 골수-유래 MSCs (A) 및 HUCPVCs (B)에 대한 고처리량 암 길라잡이 유전자 어레이 결과. 괄호 안의 유전자는 존재하지 않는 유전자를 나타낸다.

상세한 설명 및 바람직한 실시태양

본 발명은 특히, 숙주에 의한 면역 부작용으로부터, 또는 숙주에 대한 항원 체에 의한 면역 부작용으로부터 유발된, 동종항원체 및 이종항원체에 의해 유도되어진 부작용을 감소시키는 것이 유익한 증상을 치료하는데 있어서 신규하고 임상적으로 유용한 HUCPVCs의 적용법을 제공한다. 더욱 일반적으로, 본 발명은 림프구와 외래인 것으로 인식되는 물체 사이의 면역 반응을 저해하거나 감소시키기 위해 HUCPVCs 및/또는 그에 의해 생산된 가용성 인자를 도입시키는 방법을 제공한다.

본원에서 사용되는 바, 상기와 같은 물체로는 인간을 비롯한 포유동물의 물체로 전달되거나 그에 침습성인 임의의 살아있는 물질 또는 죽은 생물학적 물질을 포함할 수 있다. 상기와 같은 항원체는 예로서, 골수, 조직 또는 기관 이식편과 같이 정상적인 과정에서 수혜자 또는 물체에 의해, 예를 들면, 물체 그 자체가 림프구를 비롯한 면역 세포를 포함할 경우 면역 반응을 유도하는 것이다. 동종항원체는 동일한 종내의 개체들간에 항원성을 띤 물체이고; 이종항원체는 상이한 종의 개체들간에 항원성을 띠는 것이다. 자가 물체는 수혜자로부터 얻은 물체이다. 실시태양에서, 물체는 HLA 미스매치된 물체이다. 다른 실시태양에서, 물체는 HLA 미스매치된 림프구를 포함한다.

HUCPVC 면역조절의 작용 기전이 완전하게 이해되지는 못했지만, HUCPVCs 및 그에 의해 생산된 가용성 인자가 동종항원 인식 및 제거에 관여하는 주요 세포 군집, 예로서, 항원 제시 세포, 세포독성 T 세포를 비롯한 T 세포, 및 자연살 세포에 영향을 미칠 것으로 예측된다.

본 발명에 유용한 HUCPVCs는 상기 언급한 바와 같이 문헌 상에 기재되어 있고, 이는 더욱 특히 인간 제대를 포함하나, 이에 한정되지 않는 제대의 혈관주위 부위로부터 추출가능한 전구 세포로서 특징화된다. 본원에 기술된 프로토콜을 사용함으로써 제대 혈관주위 세포는 말, 소, 돼지, 영장류 등을 포함하는 기타 포유동물의 제대 혈관계로부터 추출될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 혈관주위 부위는 제대 혈관계와 결합된 워튼 젤리(Wharton's jelly)와 제대 혈관계 바깥쪽을 포함한다. HUCPVCs는, 예를 들면, 문헌 [Sarugaser et al, 2005] (상기 문헌의 전체 내용은 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 바와 같이, 예로서는 콜라게나제 또는 결합된 결합 조직을 제거하는데 적합한 관련된 효소를 사용하는 표준 분해 방법을 사용하여 혈관주위 부위에 위치하는 워튼 젤리로부터 추출될 수 있다. 바람직하게, HUCPVCs는 오직 혈관주위 세포로부터만 수거되고, 혈관주위 부위 너머로 확장된 워튼 젤리로부터, 또는 혈관계 그 자체의 일부 또는 그 내부에 존재하는 조직 또는 유체로부터는 수거되지 않는다. 이를 통해 일반적으로는 상기 제대내에 존재하는 기타 세포에 의한 오염을 막을 수 있다. 대안으로는, 단, 본원에서 언급한 표현형과 특징들을 갖는 전구 세포를 농축시키기 위해 예를 들면, 유식 세포 측정법을 사용하여 생성된 세포 군집을 HUCPVCs를 농축시켰다면, 혈관주위 세포를 선별하지 않고 워튼 젤리로부터 추출하는 것을 실시할 수 있다. HUCPVCs는 추가로 상대적으로 빠른 증식을 특징으로 하는데, 이는 표준 부착 조건하에서 배양되었을 때 2-7 계대 각각에서 약 20시간 (혈청에 따라 다름)의 배가 시간을 나타낸다. 표현형에 있어서 HUCPVCs는 수거시 Oct4-, CD14-, CD19-, CD34-, CD44+, CD45-, CD49e+, CD90+, CD105(SH2)+, CD73(SH3)+, CD79b-, HLA-G-, CXCR4+, c-kit+를 특징으로 한다. 추가로, HUCPVCs는 CK8, CK18, CK19, PD-L2, CD146 및 3G5 (혈관주위 세포 마커)에 양성인 세포를 혈관주위 부위 이외의 워튼 젤리 공급원으로부터 추출된 세포 군집에서보다 더 높은 수준으로 함유한다.

HUCPVCs는 또한 조작에 따라 0-100%의 다양한 수준으로 MHC I형을 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Sarugaser et al, 2005] (본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 바와 같이, 수거한 세포를 냉동-해동 주기를 수행함으로써 MHC I형과 MHC II형, 둘 모두에 대하여 실질적으로 음성인 HUCPVC 군집을 수득한다 (95%). 본원에서 사용되는 바, 소정 군집에 상주하고, MHC I형 및 MHC II형 중 어느 하나 또는 둘 모두의 표현형을 발현시키는 세포의 갯수가 세포 군집의 약 20%보다 많지 않다면, 예를 들어, 전체 HUCPVC 군집의 15% 이하, 10%, 5% 또는 그 이하라면, HUCPVCs는 MHC I형 및 MHC II형에 대하여 "실질적으로" 음성인 것으로 간주된다. 적절히 태깅된 항체를 사용하는 표준 유식 세포 측정 기법을 사용함으로써 측정할 수 있다. 이러한 MHC 이중 음성 HUCPVC 군집이 본 발명의 방법에 특히 유용하다. 본 방법에서 투여되는 HUCPVC 군집은 새로 추출된 (임의로 확장된) MHC I형 음성 세포, 또는 해동된 MHC 이중 음성 HUCPVCs를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. MHC 이중 음성 HUCPVCs가 수혜자에서 면역 반응을 자극할 가능성은 훨씬 적고, 따라서, 그의 임상적 용도는 본원에서 바람직하다. 그러나, MHC 표현형을 조작하는 것이 반드시 필요한 것은 아니라는 것을 이해하여야 한다. 면역특권 및 면역조절 성질은 또한 임의로 저장된 바 있는 새로 추출된 HUCPVCs에서 뿐만 아니라, 냉동/해동에 의해 조작된 바 있는 HUCPVCs에서도 관찰된다.

본 방법에서, HUCPVCs는 당해 환경으로부터 이익을 얻게 되는 임상 환경에서 그의 면역특권 및 면역조절 성질을 위해 이용된다. 본원에서 "면역특권이 있다"라는 용어는 말초 혈액 림프구와 함께 인큐베이션되었을 때, 특히, 당업계에 확립되어 있고, 본원에 예시되어 있는 것으로서 소위 일원 MLC 분석법을 사용하여 시험하였을 경우, 통계학적으로 유의적인 범위까지는 PBL 증식을 자극하지 않거나, 통계학적으로 유의적인 수준으로 그의 생육성을 유지하는 세포, 예로서, HUCPVCs와 관련하여 사용된다.

본원에서 "면역조절"이라는 용어는 예를 들면, 소위 일원 또는 이원 혼합 림프구 반응(MLR)을 사용함으로써 측정된 바, 림프구 군집의 사망률 감소에 의해 또는 림프구 군집의 생육성 증가에 의해 나타나는 것과 같은, 미스매치된 림프구 군집 간의 반응을 완화, 감소, 또는 저해시킬 수 있는 HUCPVCs의 능력과 관련하여 사용된다.

또한, 배양된 HUCPVCs에 의해 삼출된 인자들은 단독으로, 무손상 HUCPVCs를 사용하였을 때 관찰된 유형의 면역조절 효과를 발휘할 수 있다는 것도 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 측면들 및 실시태양에서, HUCPVCs 배양시 생산된, 추출된 가용성 인자는 면역 조절 물질로서 단독으로 또는 HUCPV 세포와 함께 사용된다.

HUCPVC 배양시 삼출된 하나 이상의 면역조절 인자를 본원에서는 가용성 인자로 지칭하며, 이는 HUCPVCs가 배양된 배지로부터 추출될 수 있다. 하나의 측면에서, 면역조절성의 가용성 인자는 예로서, 원심분리에 의해 HUCPVC 세포의 성장에 의해 조절된 배지로부터 HUCPVC 세포가 제거될 때 수득된 추출물로서 제공된다. 원심분리를 사용하였을 때 추출물은 상등액으로서 제공된다. 적합한 HUCPVC 배양 조건은 본원에서 예시된다. 예로서, 원심분리에 의해 조절된 배양 배지로부터 세포를 분리함으로써 추출물을 수득한다. 다른 실시태양에서, 가용성 인자는 상기 추출물의 면역조절성 분획으로서 제공된다. 면역조절 활성을 갖는 추출물 분획 또한 본원에서 유용하며, 이는 본원에서 기술된 혼합 림프구 반응을 사용함으로써 확인될 수 있다. 이들 추출물 분획은 물론 용매 추출, HPLC 분별, 원심분리, 크기 배제, 염 또는 삼투압 구배 분별 등을 비롯한 임의의 편리한 기법을 사용하여 HUCPVC 추출물을 분별함으로써 수득될 수 있다. 이어서, 용출되었거나 수집된 분획은 각각 MLR을 수행하여 면역조절에 대하여 활성인 분획을 동정할 수 있고, 면역조절 활성을 갖는 분획은 본원에 기술된 방식으로 임상적으로 사용될 수 있다.

따라서, 실시태양에서 본 발명은 HUCPVCs 배양시 삼출된 가용성 인자를 포함하는 면역조절성 추출물 또는 그의 면역조절성 분획의 용도를 포함한다.

본 발명에 따라 면역특권이 있고/거나 면역조절성인 HUCPVCs, 및 그의 군집의 용도는 그의 수집, 임의로 그의 확장, 추가적으로서 임의로 그의 극저온 저장 및 냉동 상태로부터의 재생, 및 계획된 수혜자에게 투여하기 위한 그의 추후의 제제화를 수반한다. 특정의 조작, 투약 요법 및 치료 요법도 물론 치료하고자 하는 질환 또는 증상의 유형 및 중증도를 비롯한 다수의 인자에 따라 달라질 것이다. 면역학적 증상의 경우 (예로서, GvHD, 자가면역 증상), HUCPVC 군집의 크기, 즉, 수혜자에게 투여되는 투여량은 일반적으로 수혜자 체중 1 kg당 1만개 내지 약 500만개 세포 범위에 있을 것이다. 전달을 위해서 세포는 생리학적으로 용인되는 비히클, 즉, 세포 뿐만 아니라, 수혜자에 의해 용인되는 비히클을 추가로 포함하는 제제로서 적절히 제공된다. 적합하게 세포는 담체로서, 생리학적으로 용인되는 비히클, 예로서, 염수, 완충처리된 염수, 예로서, PBS, 필수 아미노산, 성장 인자, 사이토카인, 비타민, 항생제, 또는 무혈청의 화학적 합성 배지 등의 것 중 어느 것을 함유하는 세포 배양 배지, 또는 유사 액체, 또는 멸균수를 포함하는 멸균 제제로 제공된다. 제제화된 세포는 주입에 의해, 또는 예를 들면, 1-25 ml 범위의 부피를 사용하는 주사에 의해 투여될 수 있다.

HUCPVC에 의해 생산되고, 폐 HUCPVC 배양 배지로부터 추출될 수 있는 면역조절성의 가용성 인자는 무손상 HUCPVCs와 관련하여 상기 기술된 방식으로 유사하게 유용하다. 하나의 측면에서, 추출물 그 자체가 약제학적 조성물을 구성하는 바, 따라서, 면역조절성의 가용성 인자 형태의 활성제, 및 생리학적으로 용인되는 비히클을 구성하는 배지를 포함한다. 대안으로, 추출물은 가용성 인자(들)를 유지하기 위해 건조시킬 수 있고, 상이한 비히클, 예로서, 인산염 완충처리된 염수에서 재구성할 수 있다. 임상 적용에 적합한 투여량 크기 및 투약 요법은 무손상 HUCPVCs에 효과적인 투약과 관련하여 결정될 수 있다. 추출물에 등가인 투여량은 MLR 분석법에서 추출물과 무손상 세포의 상대적인 효능을 산출함으로써 또는 예로서, 표적화된 징후에 대한 적절한 동물 모델에서와 같이 당해 요법이 사용되는 임상적 환경을 반영하는 그에 대한 임의의 대안에 의해 결정될 수 있다.

사용시, 제제화된 HUCPVCs 또는 그에 의해 생산된 가용성 인자는 면역 부작용을 경험하고 있거나, 면역 부작용이 발병될 위험에 있는 피험자를 치료하기 위해 투여된다. 그러한 피험자로는 특히 세포, 예로서, 골수 및 말초 혈액, 피부 및 혈 관 조직 (관상 조직 및 위장 조직 포함)을 비롯한 조직, 또는 기관, 예로서, 간, 신장, 심장, 폐 등의 형태로 동종이형 또는 이종 이식 또는 이식편을 받았거나, 이제 막 받은 피험자를 포함한다. 제제화된 HUCPVCs는 도너 이식편에 존재하는 림프구에 의해 매개되는 숙주 조직의 면역 공격으로부터 유발된 증상인 이식편대 숙주 질환의 발병 또는 중증도를 감소시키는데 특히 유용하다. 본 발명의 하나의 측면에서, HUCPVCs는 이식편에 상주하는 림프구의 활성을 감소시키거나 정지시키는데 충분한, 이식 이전의 시간 기간 동안 그와 함께 인큐베이션시킴으로써 이식편을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 인큐베이션은 이식 이전에 증식을 중단시키기 위하여 HUCPVCs (새 스톡 또는 냉동 스톡으로부터의 HUCPVCs)가 전체 이식편 림프구의 5-60% 용량 (이식편에 존재하는 혈액 부피에 의해 측정된 바), 바람직하게는 4 내지 10일 사이의 기간 동안 10-40%으로 포함되는 것을 필요로 한다. 기관 이식편인 경우, 기관은 기관의 림프구가 불활성이 되도록 하는 시간 기간 동안 이식 이전에 기관 질량 1 g당 10개 내지 5 x 10³개 세포인 투여량으로 새 스톡 또는 냉동 스톡으로부터의 HUCPVCs (상기 언급된 바와 같이 생리학적으로 용인되는 비히클에 현탁된 HUCPVCs)와 함께 인큐베이션될 것이다. 이식편 수혜자인 피험자의 경우, HUCPVCs는 바람직하게 조직에서 동종이형 기관을 직접 둘러쌈으로써 이식 이전에 (예를 들어, 이식 시간 이내에), 그와 동시에 또는 그 이후에 (예를 들어, 그후의 시간 이내에, 및 면역 반응을 조절하는데 필요한 만큼 그후에도) 수혜자에게 투여된다. HUCPVCs는 예로서, 피하로, 근육내로, 혈관내로, 정맥내로, 동맥내로, 또는 복강내로의 주입 또는 주사에 의해 이식 부위로 가장 적절히 투여될 수 있다. 하나의 측면에서, 수혜자는 체중 1 kg당 5 x 10⁴개 내지 5 x 10⁷개 세포, 예로서, 약 1 x 10⁶개 내지 5 x 10⁶개 세포 범위의 HUCPVC 투여량을 사용하여 주입함으로써 이식시에 치료된다. 세포는 5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 10 ml의 표준 염수 중에서 제제화된다. 2회 이상의 주입이 사용될 수 있는데, 각각 약 10-15분간 지속될 수 있다. 세포는 또한 생육성 세포가 시간이 경과함에 따라 이식 부위 (예로서, 복간내, 근육내 등)에서 방출될 수 있도록 하는 서방성 제제로 이식될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 담체로는 젤라틴, 하이알루론산, 알긴산 염 등을 포함한다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, HUCPVCs는 진행중이고, 가능하게는 다른 치료법에 대해 불응성인 예로서, GvHD와 같은 면역학적 증상을 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, HUCPVCs 또는 삼출된 가용성 인자는 그를 함유하는 면역 세포 또는 조직의 이식이 지시되는, 백혈병, 재생 불량성 빈혈 및 효소 또는 면역 결핍증을 앓는 피험자를 치료하는데 유용할 것이다.

HUCPVCs 또는 가용성 인자의 투여는 또한 자가면역 질환, 예로서, 크론병, 루푸스 및 다발경화증 뿐만 아니라, 류마티스 관절염, 1형 인슐린 의존 당뇨병, 성인 호흡 곤란 증후군, 염증성 장 질환, 피부염, 수막염, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 쇼그렌 증후군, 뇌염, 포도막염, 백혈구 부착 결핍증, 류마티스열, 라이터 증후군, 건선성 관절염, 진행성 전신 경화증, 원발성 담즙성 간경변, 중증 근육무력증, 홍반성 루푸스, 혈관염, 악성 빈혈, 항원-항체 복합체 매개 질환, 레이너드 증 후군, 사구체신염, 만성 활성 간염, 만성 소화 장애증, AIDS의 자가면역 합병증, 강직성 척추염 및 애디슨병 치료에서 적용성을 갖는다. 이러한 경우 HUCPVCs는 생리학적으로 용인되는 비히클 (앞서 언급한 바와 같이) 중에서 정맥내로 투여되며, 투여량 범위는 0.1 - 10 x 10⁶ 세포/kg 체중이다. 1회 초과의 투여가 필요할 수 있으며, 필요에 따라 반복 투여될 수 있다.

다음으로, HUCPVCs는 단백질/효소 결핍증을 치료하는데 사용될 수 있는데, 여기서, HUCPVCs는 원하는 단백질/효소를 생산하는데 필요한 유전자로 형질감염된다. 이러한 공정은 형질도입 (렌티바이러스, 레트로바이러스 및 아데노바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않음); 및 형질감염 (뉴클레오펙션, 전기천공, 리포좀을 포함하나, 이에 한정되지 않음)을 포함할 수 있고, 이는 결핍증을 앓는 환자에게로 주입된다. 수혜자에게 투여되는 투여량은 일반적으로 수혜자 체중 1 kg당 1 만개내지 약 500만개의 세포 범위일 것이다. 이어서, HUCPVCs는 구성적으로 관심의 대상이 되는 단백질 또는 효소를 생산하게 될 것이다.

마지막으로, 특정 바이러스/항원에 노출될 위험이 있는 사람에게 투여하기 위해 대량으로 생성시키기 위해서 백신용으로 HUCPVCs는 공학처리되어 상기 언급한 형질감염 방법을 통해 트랜스진을 도입할 수 있다.

물질 및 방법

세포 수거

HUCPVCs

토론토 대학(University of Toronto) 뿐만 아니라, 써니브룩 & 우먼스 칼리지 헬스 사이언시즈 센터(Sunnybrook & Women's College Health Sciences Centre)로부터 본 연구에 대한 윤리학적 동의를 얻었다. 양쪽 부모 모두로부터 사전 동의를 구하였을 때, 무균 제왕절개술로 만기 출생된 아기로부터 제대를 수집하였다. 상기 제대를 즉시 토론토 대학으로 이송하고, 그곳에서 앞서 보고된 바와 같이¹⁶ 멸균 조건하에서 세포를 혈관주위 영역으로부터 세포를 추출하였다. 간략하면, 제대를 4 cm 절편으로 절단하고, 상피를 제거하였다. 이어서, 혈관 주변의 워튼 젤리을 포함하여 혈관을 추출하고, 평활근 분해를 막기 위해서 루프로 묶고, 콜라게나제 용액 중에서 밤새도록 분해시켰다. 그 다음날, 분해물로부터 제거할 때 세포를 염화암모늄 중에서 세정하여 제대혈로부터의 임의의 적혈구 세포를 용해시켰다. 이어서, 세포를 세정하고, 5% 우태아 혈청 및 10% 항생제 (167 유니트/ml의 페니실린 G (시그마(Sigma)), 50 ㎍/ml의 젠타마이신(시그마), 및 0.3 ㎍/ml의 암포테리신 B)를 함유하는 85% α-MEM에 4,000 세포/㎠ 밀도로 플레이팅하였다. 세포가 75-80% 합류 상태에 도달할 때, 즉, 대략 매 6-7일마다 세포를 계대접종한다.

MHC -/- HUCPVCs

1 x 10⁵개 초과의 세포의 시험 세포 군집을 2% FBS를 함유하는 PBS에서 세척하고, 4℃에서 30분 동안 포화 농도 (1:100 희석율)의 하기 접합된 마우스 IgG1 HLA-A,B,C-PE (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences) #555553, 로트 M076246) (MHC I), HLA-DR,DP,DQ-FITC (BD 바이오사이언시즈 #555558, 로트 M074842) (MHC II) 및 CD45-Cy-사이크롬 (BD 바이오사이언시즈 # 555484, 로트 0000035746)과 함께 PBS + 2% FBS에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 PBS + 2% FBS로 2회에 걸쳐 세척하고, ExpoADCXL4 소프트웨어 (플로리다주 마이애미에 소재하는 베크만-쿨터(Beckman-Coulter))를 사용하여 유식 세포 측정기 (XL, 베크만-쿨터) 상에서 분석하기 위해 PBS + 2% FBS에 재현탁시켰다. 양성 염색을, 매치된 이소형 항체 (FITC-, PE-, 및 Cy-사이크롬-접합된 마우스 IgG1, κ 모노클로날 이소형 표준, BD 바이오사이언시즈)로 염색된 대조군 군집으로부터 99% 초과의 세포에 의해 수득된 수준을 초과하는 형광 신호의 방출로서 정의하였으며, 이는 인간 BM 샘플의 양성 형광에 의해 확인되었다. 각 샘플에 대해 10,000개 이상의 열거 모드 이벤트를 수집하였다. 모든 플롯은 EXPO 32 ADC 분석 소프트웨어로 작성되었다.

0.1% 트립신 용액을 사용하여 부착된 세포를 7일 후에 계대배양 (계대접종)하였는데, 상기 시점에서 광학 현미경에 의해 관찰한 바, 상기 세포는 80-90% 합류 상태를 나타내었다. 계대접종시, 세포를 MHC-A,B,C, MHC-DR,DP,DQ, 및 CD45의 발현에 대해서 유식 세포 측정법으로 관찰하였다. 이어서, 세포를 SM 중 4x10³ 세포/㎠로 T-75 조직 배양 폴리스티렌 플라스크에 플레이팅하고, 이들 세포의 골생성능에 대하여 시험하기 위하여 10^-8 M Dex, 5 mM β-GP 및 50 ㎍/ml 아스코르브산으로 처리하였다. 2, 3, 4, 5 및 6일째 이들 플라스크의 배양물을 CFU-O, 또는 골 결절 형성에 대하여 관찰하였다. 계대접종 절차로부터 남은 임의의 세포 또한 추가 사 용을 위해 저온 보관하였다.

분취량의 1x10⁶개의 PVT 세포를 90% FBS, 10% 디메틸 설폭시드(DMSO) (시그마 D-2650, 로트 번호 11K2320)로 구성된 총 1 ml 부피로 제조하고, 1 ml 폴리프로필렌 냉동 바이알에 피펫팅하였다. 바이알을 밤새도록 -7O℃ 냉동 장치에 놓고, 장기간 저장하기 위해 그 다음날 -150℃ 냉동 장치로 옮겨 놓았다. 1주 동안 저온 보관한 후, PVT 세포를 해동시키고, 유식 세포 측정법에 의해 MHC-A,B,C, MHC-DR,DP,DQ, 및 CD45의 발현에 대해 관찰하였다. 1주 동안 저온 보관한 후, PVT 세포를 해동시키고, 1주 동안 재배양하고, 계대배양한 후, 유식 세포 측정법에 의해 MHC-A,B,C, MHC-DR,DP,DQ, 및 CD45의 발현에 대해 재분석하는 제2 프로토콜을 사용하였다.

새로운 세포 군집내 MHC-/-의 빈도가 수회의 계대접종을 통해 유지되는 것이 보였다. 계대접종 후에 새로운 세포를 1주 동안 -150℃에서 냉동시킨 후, 즉시 MHC 표현형에 대하여 분석하였을 때, 상기 분석된 군집은 MHC -/- 표현형의 세포 빈도가 현저히 증가한 것으로 나타났다. 특히, 저온 보관된 세포를 1차 계대접종하였을 때에 상대적인 MHC -/- 세포 군집이 50% 초과로 증가하였고, 이어서, 상기 세포를 냉동시키고 계대접종하였을 때에는 80%, 85%, 90% 및 95% 초과의 MHC -/- 군집을 수득하였다.

림프구

말초 혈액 림프구(PBLs)를 건강한 도너로부터 유래된 헤파린첨가 혈액으로부 터 추출하였다. 세포를 380 x g에서 35분 동안 회전시키는 피콜-플라크™ 플러스(Ficoll-Paque™ PLUS) 밀도 구배 (아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences) #17-1440-03)에 의해 세포를 분리하였다. 백혈구 연층을 제거하고, 세포 및 핵 크기에 의해 측정되는 바에 따라, 림프구에 특이적인 프로토콜과 함께 ViCell-XR™ (베크만-쿨터)를 사용하여 계수하였다. 이어서, HEPES (25 mmol/L), L-글루타민 (2 mmol/L), 10% 우태아 혈청 및 10% 항생제를 함유하는 80% RPMI-1640 배지 (시그마 #R5886)에서 분석 요건에 따라 세포를 플레이팅하였다.

혼합 림프구 배양법

미토마이신 C

일원 MLCs를 실시하기 위해서는 HUCPVCs, 및 PBL 군집들 중 하나가 휴지 상태여야 한다. 이는 설정 농도로 및 설정 시간에 세포를 미토마이신 C(MMC)로 처리함으로써 달성하는데, 이를 통해 MMC는 DNA에 부착할 수 있고, 분할을 막을 수 있다. 이러한 농도는 96 웰 플레이트의 웰 중 5000개 세포의 출발 세포 군집과 함께 20분 동안 37℃ (5% CO₂)에서 인큐베이션된 MMC의 적정 곡선에 의해 결정되었다. 농도 10, 20, 30, 40, 50, 및 75 ㎍/mL의 MMC를 통상의 배지 (85% α-MEM, 5% FBS, 10% 항생제)에서 시험하고, 그 후에 임의 미량의 MMC를 제거하기 위해 PBS로 2회에 걸쳐 세척하였다. 1주 후에 증식을 평가하기 위해서 웰을 계수하였다. 세포 군집을 MLC로 조합하였을 때 미량의 MMC가 림프구의 증식능에 영향을 주지 않도록 하기 위해서는 모든 미량의 MMC를 제거하는 것이 필수적이다. 이를 확실히 하기 위해 96 웰 플레이트 (팔콘(Falcon))의 빈 웰을 MMC로 처리하고, 프로토콜에 따라 세척하였다. 이어서, 림프구를 첨가하고, 그의 증식에 대하여 대조군인 일반 웰과 비교하여 평가하였다.

면역특권 분석법

3벌의 1 x 10⁴개의 HUCPVCs (새로운 HUCPVCs 및 냉동 HUCPVCs, 둘 모두 분석하였다)를 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다 (n=5). 일단 세포가 부착되면 (대략 2시간후), 세포를 20 ㎍/mL의 MMC로 처리하였다. 이어서, HUCPVCs를 세정하고, 도너 1로부터 얻은 10⁵개의 PBLs를 각 웰에 가하였다. 플레이트는 HEPES (25 mmol/L), L-글루타민 (2 mmol/L), 10% 우태아 혈청 및 10% 항생제를 함유하는 80% RPMI-1640 배지에서 5% CO₂ 대기하에 37℃에서 인큐베이션시켰다. 6일 후에 HUCPVCs를 포함하는 배양물 중에 존재하는 림프구를 ViCell 계수기를 사용하여 계수하고, 대조군과 비교하였다. 세포 사멸 분석법의 경우, 플레이트를 4시간 동안 인큐베이션시키고, HUCPVCs를 각각 조기 및 말기 세포 사멸 마커인 아넥신 5 (R&D 시스템즈(R&D Systems) TA4638) 및 7-아미노-악티노마이신 D(7-AAD)에 대하여 평가하였다. 이들 수준은 베크만 쿨터 플로우센터(FlowCenter)에서 유식 세포 측정법을 사용하여 측정하고 비교하였다. PBL 증식 분석법의 경우, 세포를 6일 동안 인큐베이션시킨 후, 티미딘의 염기 유사체인 5-브로모-2-데옥시우리딘(BrdU)으로 세포를 염색하고, 유식 세포 측정법을 사용하여 측정하였다. 양 분석법 모두에 대하여 PBLs 단독 및 HUCPVCs 단독의 대조군을 사용하였다.

일원 MLCs의 경우, HUCPVCs를 먼저 96 웰 플레이트에 3번에 걸쳐 플레이팅하고 (웰당 1, 2, 3, 및 4 x 10⁴개의 세포), MMC로 처리하고, PBS로 세척하였다. 유망한 도너 풀로부터 선택된 2개의 언매치된 도너로부터 PBLs를 회수하였다 (시험된 6개의 HLA 중 5개에서 미스매치: 도너 1 HLA-A *01, *02; B *07, *18; DRB1 *15, *--; 도너 2 A *01, *--; B *08, *- ; DRBl *03, *--). 저해상도로 DNA 부여 기법을 사용하여 지역 조직적합 실험실(Regional Histocompatibility Laboratory) (온타리오주 토론토에 소재하는 토론토 종합 병원)에서 형결정을 실시하였다. 피콜링한 후, 도너 2의 림프구를 MMC로 처리하여 휴지 상태가 되게 하였다. 이어서, 세포를 스핀 다운시키고, 세척하고, 각 웰당 10⁵개의 세포로 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 도너 1의 림프구를 각 웰당 10⁵개의 세포로 첨가하고, 3개의 세포 군집을 6일 동안 함께 인큐베이션시킨 후, 티미딘의 염기 유사체인 5-브로모-2-데옥시우리딘(BrdU)으로 염색하였다. 이어서, 증식을 평가하기 위해 림프구 상에서 BrdU에 대한 유식 세포 측정법을 실시하였다. 이후, 림프구-특이 프로토콜과 함께, ViCell-XR™ 세포 계수기를 사용하여 얻은 림프구의 1일 계수값 (1일부터 6일)을 사용하여 측정된 결과를 통해 유사한 분석법을 실시하였다. 모든 결과를 두 도너 모두로부터 얻은 동종이형 및 자가 대조군과 비교하였다.

면역조절 분석법

이원 MLCs는 언매치된 도너 (상기와 동일한 도너)로부터 2개의 PBL 군집을 혼입하였는데, 이 둘 모두는 증식할 수 있다. 간략하면, 둘 모두의 도너로부터 얻 은 1 x 10⁵개의 PBLs를 96 웰 플레이트의 각 웰에 가하고, 6일 동안 인큐베이션될 수 있도록 방치하였다. 실험하는 동안, 면역 반응이 이미 시작되었다면 HUCPVCs의 유효성을 분석하기 위해 1 또는 4 x 10⁴개의 HUCPVCs를 0, 3 또는 5일째 3회에 걸쳐 웰에 가하였다. 10 및 40% HUCPVC:PBL 비, 둘 모두가 앞서 양성 결과를 나타낸 바, 이들을 선택하였고, 따라서, 이는 저수준 및 고수준의 HUCPVC 함유물로서 선택되었다. 각 플레이트로부터 얻은 샘플은 ViCell-XR™ 세포 계수기를 사용하여 매일 계수하고, 자가 및 동종이형 대조군과 비교하였다.

가용성 인자

주목되는 효과가 가용성 인자에 기인한 것인지 여부, 또는 세포-세포 접촉이 필요한지 여부에 관해 결정하기 위해 HUCPVC와 PBL의 직접적인 세포 접촉없이 이원 MLC 분석법을 다시 실시하였다. HUCPVCs (웰당 1 및 4 x 10⁴개의 세포)를 24 웰 플레이트를 위해 트랜스웰® 인서트 (코닝(Corning)) 상에서 배양하고, 대략 2시간 동안 부착될 수 있도록 하였다. 일단 세포가 부착되면, 인서트를 도너 1/도너 2 (상기와 동일한 도너)로부터 얻은 PBL 군집의 공배양물을 함유하는 24 웰 플레이트로 옮겼다 (n=3). 림프구 세포 갯수는 ViCell-XR™를 사용하여 6일동안 매일 계수하고, 자가 및 동종이형 대조군과 비교하였다.

림프구 활성화

앞서 언급한 바와 같이 면역특권 분석법 및 이원 MLCs, 둘 모두를 실시하였다. 본 분석법의 종점은 활성화된 림프구의 마커인 IL-2R (CD25) (벡톤 디킨 슨(Becton Dickinson), #555431)의 존재에 대하여 림프구를 유식 세포 측정 분석법으로 분석하는 것이었다. HUCPVCs가 림프구 활성화를 증가시키는지 또는 감소시키는지 여부를 측정하기 위해 상기 분석법을 6일간에 걸쳐 실시하였다. 적절한 세포 군집을 수득하였는지를 확인하기 위해 림프구를 또한 CD45로 함께 염색시켰다. 음성 대조군은 HUCPVCs가 첨가되지 않고, 염색되지 않은 림프구 배양물이었다.

활성화된 T 세포주 생성

상기와 같이 PBLs를 도너 1 및 2로부터 추출하고, 피콜 구배를 사용하여 분리시켰다. 세포를 계수하고, 도너 2로부터 얻은 세포는 MMC를 사용하여 휴지 상태가 되게 하였다. 도너 1로부터 얻은 10⁶개의 세포를 24 웰 플레이트에 플레이팅하고, 1:1 비율의 도너 2로부터 얻은 휴지 상태 PBLs로 자극시켰다. 세포에 2 mLs의 RPMI-1640 배지 (10% 혈청 및 상기와 같은 10% 보충물로 보충됨)를 제공하고, 세포를 활성화시켰다. 배지 색상이 황색으로 상당 수준 변하였을 때 (~3일) 배지를 교체하였다. ~11일후 (또는 배지가 3일 이내 색상이 변색되었을 때), 세포를 수거하고 계수하였다. 세포를 웰당 10⁶개로 다시 플레이팅하고, 1:1 비율의 도너 2로부터 얻은 휴지 상태 PBLs로 다시 자극시켰다. 2차 자극시, 공급하면서 2일간 매일 IL-2 (BD 바이오사이언시즈 #354043)를 100 U/mL 농도로 가하였다. 3일 이전에 배지 색상이 황색으로 변하였을 때, 세포를 수거하고, 계수하고, 분리하였다. 이러한 방법에 따라 도너 2에 대해 특이적인 항체와 함께 세포는 활성화된 T 림프구(ATLs)로서 사용될 준비가 되었다. 상기와 같이 PBL 공배양 및 이원 MLCs를 수행하고, 세포 증식 및 CD25의 발현에 대하여 분석하였다.

림프구 표지화

2개의 림프구 군집 사이의 차이를 시각화하고 정량하기 위하여 PKH26 (시그마 #PKH26-GL)을 사용하였다. PHK26은 반감기가 긴 (~100일) 비세포독성의 막 염료이다. 상기 제품과 함께 제공된 프로토콜에 따라 세포를 염색하였다: 림프구를 트립신으로 처리하고, 풀링하고, 펠릿화시키고; 이어서, 희석된 염료를 2 내지 5분 동안 세포 현탁액에 가하였다 (2 ml의 2 x 10^-6 몰랄 PHK26 용액). 염색 후, 동량의 혈청을 가하여 반응을 중단시키고; 세포를 배지에 현탁시키고, 스핀 다운시키고, 수회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 적절히 염료가 흡수되었는지 확인하기 위하여 형광 현미경 상에서 염색을 시각화하였다. 염색에 사용된 세포는 도너 1로부터 수득한 ATLs였고; 이들 적혈구는 도너 2로부터 수득한 미염색 세포, 및 HUCPVCs를 포함하는 MLC에 포함되었다. 본 분석법의 종점은 PKH26의 존재 또는 부재에 대해 게이팅되는 CD45 (BD #555482) 및 CD25에 관한 유식 세포 측정법이었다. 음성 대조군은 미염색 세포, 및 HUCPVCs를 포함하지 않는 MLCs였다.

형질감염

먼저, 293 세포를 원하는 DNA 및 플라스미드 (벡터 DNA, 10 ㎍ gag/pol 발현 플라스미드, 10 ㎍의 rev 발현 플라스미드, 10 ㎍의 tat 발현 플라스미드, 2.5 M CaCl₂를 포함하는 5 ㎍의 VSV-G 발현 플라스미드)로 형질감염시켰다. 이들을 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 배지를 교체하였다. 이어서, 세포를 3일간 더 상기 배지 와 함께 방치한 후, 세포 상등액을 수집하고, 여과시켰다. 이어서, 초원심분리 (90분 동안 50000 g)에 의해 또는 아미콘 울트라-15 원심분리 여과기 장치(Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter device) (100,000 MWCO; 밀리포어(Millipore))를 사용하여 바이러스 상등액을 농축시켰다. 상기 공정 종결시, 바이러스 상등액을 농축된 바이러스를 적정함으로써 결정된 농도로 HUCPVCs와 함께 조합하고, 밤새도록 인큐베이션시킬 수 있었다. 그 다음날, 추가의 배지를 가하고, 배지를 교체하기 이전에 세포를 6시간 더 인큐베이션시켰다. 이러한 방식으로, 면역 부작용을 조정하는데 유용한 단백질 (면역억제 단백질)을 비롯한 임의의 단백질을 코딩하는 트랜스진을 도입하고 발현시키기 위하여 HUCPVCs를 공학처리할 수 있다. 그러한 단백질로는 CTLA4, VCP, PLIF, LSF-1, Nip, CD200 및 유로모듈린을 포함한다.

마이크로어레이 분석법

올리고 GE어레이 인간 암 마이크로어레이(Oligo GEArray Human Cancer Microarray) (메릴랜드주 프레더릭에 소재하는 슈퍼어레이 바이오사이언시즈(Superarray Biosciences), 카탈로그 번호: OHS-802)를 사용하여, 암 진행시 빈번하게 변경되는 여러 상이한 경로들을 대표하는 유전자 발현의 변화를 찾아내었다. 인간 암에 대한 올리고 GE어레이는 440개의 대표적인 암 유전자를 갖고, 아포프토시스, 세포 주기, 세포 성장 및 분화, 신호 전달, 및 기타 암-관련 유전자를 비롯한 기능성 유전자 분류로 조직화되어 있다.

HUCPVCs 및 인간 골수-유래의 MSCs를 2 계대까지 배양하고, 이들 세포로부터 RNA를 단리시켰다. 정제된 RNA는 제조사 (슈퍼어레이 바이오사이언시즈 코포레이 션(Superarray Biosciences Corp.)의 프로토콜에 따라 공정처리하고, 올리고 GE어레이 인간 암 마이크로어레이에 혼성화시켰다. 올리고 GE어레이 인간 암 마이크로어레이를 사용함으로써 정상적인 인간 골수-유래의 MSCs와 비교하여 HUCPVCs에서 암과 관련된 차별적인 유전자 발현을 측정하였다.

결과

미토마이신 C는 HUCPVCs에 대한 효과적인 항-증식제이다.

HUCPVCs를 20분 동안 37℃ (5% CO₂)에서 일련의 농도의 MMC로 처리하였다. 도 1은 배양물을 MMC로 처리한지 1주후에 HUCPVCs의 세포 갯수를 나타낸다 (n=2). 대조군과 비교하여 모든 세포에서 증식이 현저히 감소한 것으로 나타났고 (p <0.001), 처리군들 사이에서의 차이는 없었다. 따라서, 문헌에 제시된 바에 따라 20 ㎍/mL를 선택하였다. 도 2는 MMC로 처리되고 세척된 웰 대 미처리된 웰에 플레이팅된 세포에는 효과가 없다는 것을 도시한다 (n=2, p=0.16). 따라서, MMC는 앞서 MMC로 처리된 웰에서 수득된 실험 결과에 어떤 영향도 미치지 않을 것이다. 본원에서 제시하는 모든 통계는 통계 컴퓨팅(Statistical Computing)을 위한 R 프로젝트를 통해 평균을 비교하는 ANOVAs를 사용하여 수득하였다.

HUCPVCs는 상기 림프구에 의해 외래인 것으로 인식되지 않는다

림프구 (도너 1)와 함께 HUCPVC 군집을 함께 인큐베이션시켰을 때, 아넥신 5 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정된 바, 10% HUCPVC:PBL 비율로 HUCPVC 사멸이 통계학상 유의적으로 증가하였다 (n=5, p=0.01). 도 3은, 이러한 세포 사멸의 증가 는 10%보다 높은 HUCPVC 투여량에서는 주시되지 않았고, 따라서, 상기의 정확한 비율에서 HUCPVCs는 언매치된 림프구에 의해 공격받지 않았음을 나타낸다. 이는 림프구 증식 분석법을 사용함으로써 확인될 수 있는데, 여기서는 BrdU MFI (p=0.02)에 의해 측정된 바, 림프구가 10% HUCPVC:PBL에 대한 반응에서는 증식하지만, 그보다 높은 농도의 HUCPVC에서는 증식하지 않는 것이 관찰될 수 있다 (도 4). T 및 B 림프구, 둘 모두의 분할은 활성화 연쇄반응으로 발생하는 바, 림프구 증식이 활성화의 표준 척도이다. 그러므로, 더 낮은 비율의 HUCPVCs는 면역학적 회피 능력이 실현될 수 있도록 하는데 충분할 정도로 존재하는 것이 아니다. 그러나, 그보다 높은 농도인 20-40%에서 PBLs는 증식하지 않고, HUCPVCs는 사멸되지 않는다.

HUCPVCs가 휴지기 PBLs 또는 ATLs를 포함하는 공배양물 중에 포함되었을 때에 림프구 세포 갯수에 HUCPVCs가 미치는 효과에 대해서도 분석하였다. 두 경우 모두에서, HUCPVCs는 대조군 세포 갯수에 비하여 유의적인 증가를 일으키지 않았는데 (PBL: 35.2±3.1 x 10³, +10% HUCPVCs 45.0±5.7 x 10³; ATL: 38.8±18.2 x 10³, +10% HUCPVCs 40.8±4.8 x 10³), 이는 휴지기 또는 자극받은 조건하에서 그의 면역특권을 지시하는 것이다 (도 7).

HUCPVCs를 일원 MLC에서 10, 20, 30 및 40% 비율로 PBL 군집에 포함시키고, 6일후 BrdU 발현에 의해 그의 증식에 관해서 평가하였다. 도 8은 포함된 HUCPVCs의 비율과는 상관없이 세포 증식 갯수에는 유의적인 증가가 없었다는 것을 나타낸다.

HUCPVCs는 면역조절성이다.

도 5는 6일째 동종이형의 공-배양된 림프구의 갯수가 증가한 반면, HUCPVCs가 존재하는 모든 배양물은 HUCPVCs가 첨가된 시간이나 첨가 비율과는 상관없이 대조군과 비교하여 유의적으로 더 적은 림프구 세포 계수를 갖고 있음을 나타낸다 (n=3).

HUCPVCs는 가용성 인자를 통해 그의 작용을 발휘할 수 있다.

트랜스웰® 인서트를 사용하여 이원 MLC에서 PBLs로부터 HUCPVCs를 분리하였다. 10% 또는 40% HUCPVCs를 사용한 경우에는 어느 때에도 대조군과 비교하여 림프구 갯수상의 유의적인 감소는 관찰되지 않았다 (n=3) (도 6). 그러나, 샘플 갯수를 증가시켰을 때, 10% HUCPVCs 첨가는 대조군과 비교하여 6일간의 배양 기간에 걸쳐 림프구 세포 갯수를 유의적으로 감소시킨 것으로 나타났다 (MLC: 40.7±32.9 x 10³ 세포, 10% HUCPVCs: 21.3±14.7 x 10³ 세포) (도 9). 그러므로, 가용성 인자(들)는 HUCPVC 면역조절할 수 있지만, 어떤 인자(들)인지, 그리고 어떻게 그들이 림프구에 영향을 주는지에 관해서는 여전히 알려지지 않았다.

HUCPVCs는 림프구의 활성화 상태를 감소시킨다

PKH26로 염색된 ATLs를 10% HUCPVCs를 포함하는 공-배양물에 가하고, 림프구 활성화의 마커인 CD25 (IL-2 수용체) 발현에 대하여 분석하였다. HUCPVCs 포함시, CD25를 발현하는 세포의 비율(%) (대조군: 100%±0, 10% HUCPVC: 96.9%±0.7), 및 평균 형광 강도 (대조군: 28.6±0.1, 10% HUCPVC: 3.76±0.1) 모두 유의적으로 감 소하였다 (도 10). 따라서, HUCPVCs는 활성화된 림프구의 활성화 상태를 감소시킴으로써 활성화된 림프구에 물리적인 영향을 미친다.

추가로, HUCPVCs는 림프구의 CD45 발현을 감소시켰고, 비율(%) (대조군: 100%±0, 10% HUCPVC: 99.6%±0.1, 40% HUCPVC: 98.4%±0.36) 및 평균 형광 강도 (대조군: 28.20±4.24, 10% HUCPVC: 16.33±1.27, 40% HUCPVC: 14.70±1.22), 둘 모두 유의적으로 상이하였다 (p<0.05) (도 11). CD45가 모든 림프구에서 발현되는 바, 상기와 같은 결과는 예측하지 못했다. 그러나, CD45는 림프구의 발생 및 작용에 중요한 것으로 보이며³⁶, 이는 HUCPVCs의 첨가에 기인하여 림프구 작용이 감소되었음을 추가로 나타내는 것일 수 있다.

형질감염

GFP로 HUCPVCs가 성공적으로 형질감염되었고, 세포는 고수준의 단백질을 발현하였다. 97%의 형질감염율을 달성하였고 (도 12), 우수한 증식율도 유지하였다. 이러한 성공율은 세포가 형질감염된 계대수에 따라 다르다. 따라서, 기능성 형질감염 프로토콜을 사용하여 세포를 임의 단백질로 형질감염시킬 수 있고, 상기 단백질을 구성적으로 발현시킬 수 있다.

마이크로어레이 분석

HUCPVCs는 종양발생과 관련된 유전자를 검출가능한 수준으로 발현하지 못한다. 유전자 어레이 분석을 통해 인간 암과 관련된 기능성 유전자 및 예로서, 사이클린 D1(CCNDl), CCND2 및 CCND3과 같이 세포 주기 조절에 중요한 것으로 알려진 발현 유전자가 존재하지 않는다는 결과를 얻었다 (도 13).

논의

골수 이외의 공급원인 인간 제대로부터 유래된 MSC 군집의 시험관내 면역특권 및 면역조절 성질을 본원에 기술하였다. HUCPVCs는 제대의 혈관주위 영역으로부터 추출되는데, 이는 상기 혈관주위 영역이 가장 빠르게 증식하는 세포 군집인 것으로 사료되기 때문이다. 앞서, 제대 정맥의 벽으로부터의 내피 세포가 시험관내에서 림프구를 자극시키는 것으로 제시된 바 있다³⁷. 이는 보고된 결과와 현저한 대조를 이루며, HUCPVCs가 회수되는 별도의 영역을 보강한다.

따라서, HUCPVCs는 특히, 이식편대 숙주 질환의 발병 및/또는 중증도를 감소시키고, 숙주에 의한 이식편 거부를 감소 또는 제거하는데 있어서의 임상적 용도, 및 혼합 림프구 반응을 억제하는 것이 이로운 기타 면역-매개 질병의 치료에 매우 적합하다. 추가로, 관심의 대상이 되는 단백질/효소의 유전자를 함유하도록 형질감염에 의해 조작된 경우에 HUCPVCs는 구성적으로 상기 생성물을 생산할 수 있고, 따라서, HUCPVCs는 특히 거부없이 미스매치된 환자에서 동종이형적으로 사용될 수 있기 때문에 단백질/효소 결핍이 환자에게 악영향을 끼치게 되는 임의 증상을 치료하는데 유용할 것이다. 추가로, HUCPVCs는 또한 필요한 유전자로 형질감염된 후 관심의 대상이 되는 백신 생산에 사용될 수 있다.

시간이 경과함에 따라 그의 성장 환경에 의해 지령받은 다양한 중간엽 조직으로 확장 및 분화하는 성향을 갖는 전구 세포로서 기타 중간엽 전조 또는 줄기 세 포와 같은 HUCPVCs는 생체내에서 그의 성장과 분화가 조절되지 못하는 몇몇 위험을 수반할 수 있다. 두드러지게는 임상적으로 볼 때 HUCPVCs 이용의 추가로 유익한 이점으로 HUCPVCs는 그의 종양발생에 대한 성향을 나타내는 지시자인 텔로머라제 활성이 극도로 낮은 것으로 측정되었다. 추가로, HUCPVCs에는 종양발생의 특징인 유전자 마커 다수가 존재하지 않는다는 것이 측정되었다. 종양발생은 생물학적 경로를 탈조절화하고, 세포가 아무런 억제없이 성장 및 분할할 수 있도록 하고, 아포프토시스(세포예정사)를 회피할 수 있도록 하고, 성장 인자에 대해 비정상적으로 반응하도록 하고, 혈액 공급을 받을 수 있도록 하고 (혈관형성), 하나의 위치로부터 또다른 위치로 이주할 수 있도록 하는 (전이 및 침윤) 돌연변이에 의해 발생한다. 다수의 유전자가 각각의 상기 조절 기전에 관여하며, 그중 어느 하나에서의 돌연변이가 탈조절을 일으킬 수 있다.

하기 참고 문헌은 그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다.

참고 문헌 목록

Claims (20)

1. 림프구와, 상기 림프구에 의해 외래인 것으로 인식되는 물체 사이의 면역 반응을 저해시키거나 감소시키는데 효과적인 양으로 (1) 제대 혈관주위 세포, 및/또는 (2) 상기 세포에 의해 생산된 면역조절성의 가용성 인자로부터 선택되는 물질을 도입시키는 단계를 포함하는, 림프구와, 상기 림프구에 의해 외래인 것으로 인식되는 물체 사이의 면역 반응을 조절하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 피험자에게 면역조절 유효량의, (1) 제대 혈관주위 세포, 및/또는 (2) 상기 세포에 의해 생산된 면역조절성의 가용성 인자로부터 선택되는 물질을 투여하는 단계를 포함하는, 면역 부작용을 앓거나, 면역 부작용이 발생할 수 있는 위험에 있는 피험자를 치료하는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 피험자가 이식편대 숙주 질환을 앓거나, 이식편대 숙주 질환에 걸릴 위험에 있는 것인 방법.
4. 제2항에 있어서, 피험자가 혼합 림프구 반응을 앓거나, 혼합 림프구 반응에 걸릴 위험에 있는 것인 방법.
5. 제2항에 있어서, 피험자가 이식편 거부를 앓거나, 이식편 거부에 걸릴 위험 에 있는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 이식편이 피부 이식편인 방법.
7. 제5항에 있어서, 이식편이 기관 이식편인 방법.
8. 제5항에 있어서, 이식편이 골수 이식편인 방법.
9. 제5항에 있어서, 이식편이 말초 혈액 이식편인 방법.
10. 제2항에 있어서, 피험자가 자가면역 질병을 앓는 것인 방법.
11. 제2항에 있어서, 피험자가 백혈병으로 고생하고, 이식편대 숙주 질환에 걸릴 위험에 있는 것인 방법.
12. 이식편을, 그를 이식시키기 이전에 면역조절 유효량의 (1) 제대 혈관주위 세포, 및/또는 (2) 상기 세포에 의해 생산된 면역조절성의 가용성 인자로부터 선택되는 물질에 노출시키는 단계를 포함하는, 이식편 수혜자에서 이식편대 숙주 질환을 감소시키는 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 물질이 제대 혈관주위 세포인 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 물질이 인간 제대 혈관주위 세포(HUCPVCs)인 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제대 혈관 세포가 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 것인 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제대 혈관주위 세포가 실질적으로 MHC 이중 음성 HUCPVCs인 방법.
17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, HUCPVCs가 피험자 1 kg당 1만개 내지 약 500만개 HUCPVC 세포 범위의 단위 투여량으로 존재하는 것인 방법.
18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 물질이 HUCPVCs에 의해 생산된 면역조절성의 가용성 인자인 방법.
19. 제18항에 있어서, 면역조절성의 가용성 인자가 HUCPVC 성장에 의해 조절된(conditioned) 배지의 추출물로서 제공되는 것인 방법.
20. HUCPVCs 배양시 생산된 면역조절성의 가용성 인자를 포함하는 추출물.

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