CN104357383A - 人脂肪间充质干细胞制备方法及其在制备疾病药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人脂肪间充质干细胞制备方法及其在制备疾病药物的应用，人脂肪间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：脂肪的采集、脂肪的运输、脂肪的交接、制备脂肪微块、SVF提取、原代培养、传代培养、细胞冻存及建立细胞库、细胞复苏。人脂肪间充质干细胞具有强大的免疫调节作用，能应用在制备治疗自身免疫性疾病药物中，与常规药物相比具有如下有点：1、治疗方便，疗效持久。能帮助患者减少药物治疗的种类和数量以及药物治疗带来的毒副作用，甚至停用免疫抑制剂等药物治疗，降低死亡率和致残率，改善生活质量；2、安全性好，无毒副反应；3、脂肪组织来源广泛，采集方便，且脂肪MSCs的基础研究扎实，制备技术成熟，可推广程度高，技术可控；4、人脂肪MSCs制备成本相对其他生物制剂费用低，多数患者能够接受。

Description

人脂肪间充质干细胞制备方法及其在制备疾病药物的应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种人脂肪间充质干细胞制备方法及其在制备疾病药物的应用。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能、低免疫原性的成体干细胞，具粘附性，呈纺锤型、成纤维细胞样形态，在胚胎发育中来源于中胚层，具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，包括骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌腱细胞等。MSCs广泛地存在于人体的骨髓、脂肪、牙周膜、新生儿的脐带、胎盘、羊膜、羊水等组织中，来源广泛且没有伦理限制，易于分离和体外扩增，在经过多次分裂传代后仍保持多向分化潜能，至今为止的临床试验研究未发现MSCs有严重副作用，是一种非常理想的细胞治疗和再生医学的种子细胞。

从细胞表型特征来看，目前并没有发现MSCs有某种特异性的细胞表型标记，而通常认为MSCs不表达造血干细胞的表面标记如CD45、CD14、CD11，及一些共刺激分子如CD80、CD86、CD40和CD31。一般认为MSCs表达CD105、CD73、CD44、CD90、CD106、CD29等。2006年国际细胞治疗协会(the international societyfor cellular therapy，ISCT)间充质组织干细胞委员会(Mesenchymal and TissueStem Cell Committee)对间充质干细胞的最低标准做了规定：第一，MSCs必须是可以在塑料培养器皿中贴壁生长的细胞；第二，MSCs流式检测必须≥95％表达CD105，CD73，CD90抗原，同时必须≤2％表达CD45，CD34，CD14，CD11b，Cd79α和HLA II；第三，MSCs必须具备在体外诱导称为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的能力。因此，一般通过以上三点综合鉴定MSCs。

脂肪组织中含有一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪MSCs，其生物学性质与骨髓MSCs相类似，并可向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化。目前所报道的MSCs主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法分离获得。相对于骨髓MSCs，脂肪MSCs有一下优势：

1、脂肪组织在体内分布广泛，储量丰富。且脂肪组织取材容易，吸脂手术属于技术成熟的常规手术，手术风险小，患者痛苦少，这一点尤其利于临床应用；

2、脂肪MSCs获取效率要优于骨髓。细胞克隆形成实验表明，MSCs只占到成人骨髓的(0.2～1)×10-5。而脂肪组织经胶原酶消化后，其中主要的细胞类型脂肪细胞，很容易通过浮力而去掉，所获得的细胞克隆形成率是骨髓MSCs的100～500倍；

3，从临床角度出发，在短时间内更容易获得大量的脂肪干细胞，对于急性心肌梗塞等疾病的快速治疗具有重要意义。在局部麻醉的情况下，成人骨髓的获取量通常不超过40ml，能获得大约1.2×109个有核细胞，其中包含大约2.4×104个MSCs。如果想获得更多的骨髓，则需要全身麻醉，则增加了病人痛苦和发生并发症的风险；而一次吸脂手术可获得超过200ml的脂肪组织，且每100ml都能获得大约2×108个有核细胞，其中含有大约1.2×108的干细胞，相当于相同体积骨髓的2000倍。

由此可见，在相同条件下，脂肪更具临床应用潜力。

由于脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便创伤小，在组织工程、器官修复、基因治疗等方面都有着广阔的应用前景。2012年1月，韩国FDA批准的自体脂肪干细胞药物Cuepistem(自体脂肪来源的MSCs)成功上市，用于治疗复杂性克隆氏病并发肛瘘。同年10月，美国FDA批准了Cytori Therapeutics公司脂肪干细胞对心脏衰竭患者有效性的临床试验。脂肪MSCs已成为继骨髓MSCs后干细胞领域另一个备受关注的热点。

MSCs本身不表达II类主要组织相容性抗原及共刺激因子CD80、CD86或CD40，其本身具有低免疫原性，然而，研究显示：MSCs却对主要免疫效应细胞包括T细胞，B细胞，NK细胞的增殖和功能活性均有显著抑制作用，同时调节递呈细胞如DC细胞的活性，激活调节性T细胞(T regulatory cells)。MSCs对主要免疫效应细胞作用如下：

1、MSCs与T淋巴细胞：多个实验室的研究结果表明MSCs在体内体外均对异体抗原(alloantigens)，丝裂原(mitogens)和抗CD3，CD28抗体激活的T细胞的增殖具有显著抑制作用。MSCs同样对记忆性T细胞和未成熟T细胞均有抑制作用。而且，MSCs不受主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex)限制，异体MSCs同样可以发挥抑制效果。在分子水平上，MSCs可以使活化的T细胞阻滞在G0/G1期，下调周期蛋白cyclinD2的表达，上调p27的表达。MSCs对T细胞的抑制作用机理一般有两种：1)直接接触；2)分泌细胞因子。T细胞细胞膜表面高表达Fas，而MSCs表达其配体Fasl，MSCs通过分泌MCP-1将T细胞招募到其周围，通过Fas/Fasl经典凋亡通路促使T细胞凋亡。同时凋亡的T细胞碎片被吞噬细胞吞噬后，刺激吞噬细胞产生TGF-β，又促使未成熟T细胞分化为CD4+CD25 high forkhead box P3(Foxp3+)调节性T细胞，进一步抑制T细胞增殖和功能。炎性因子如IFN-γ、IL-1β、TNF-α，可以促使MSCs分泌免疫抑制蛋白吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)，IDO能够降解色氨酸，并导致犬尿素，3-氨茴酰丙氨酸(kynurenine)合成，进而抑制淋巴细胞增殖；将MSCs与T细胞共培养后，促使MSCs分泌前列腺素E2(prostaglandinE 2，PGE2)，使用PEG2的抑制剂可以逆转MSCs对T细胞增殖的抑制作用。在炎性因子刺激下，MSCs胞内一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)表达升高，并分泌NO至胞外，NO可以抑制T细胞信号转到与转录激活蛋白5的磷酸化(signaltransducer and activator of transcription-5，STAT5)，抑制T细胞的活化。在风湿动物模型实验中，研究者发现，MSCs可以抑制促炎细胞Th1/Th17细胞扩增，降低炎性因子如IFN-γ和IL-17的分泌，同时促进Th2细胞分泌抗炎因子如IL-4和IL-10。

2、MSCs与B淋巴细胞：B细胞可以被抗CD-40L抗体或IL-4或抗免疫球蛋白抗体刺激后活化，而MSCs可以抑制活化B细胞的增殖。另外，MSCs可以抑制B细胞趋化因子受体如CXCR4、CXCR5和CCR7的表达，但不影响B细胞的共刺激分子和细胞因子的表达。MSCs抑制B细胞增殖的具体分子机制尚不清晰，有研究称，MSCs通过直接接触和分泌IDO，抑制B细胞的色氨酸信号通路抑制其扩增。

3、MSCs与NK细胞：MSCs可以抑制NK细胞的增殖，同时抑制IL-2和IL-15活化的NK细胞IFN-γ的分泌。研究称MSCs对未成熟的NK细胞有较强的抑制作用，但是，对已经活化的NK细胞只有部分抑制作用。MSCs对NK细胞功能的影响说法不一，Rasmusson报道MSCs对新分离的NK细胞的细胞杀伤功能没有影响，同时MSCs不能被NK细胞杀伤；相反，Krampera等人报道，MSCs与NK细胞在IL-2刺激下共培养5天后，NK细胞对靶细胞K562的杀伤作用减弱，而且MSCs的抑制作用于NK细胞分泌的IFN-γ相关。当MSCs与NK细胞接触培养时，二者的作用是相互的。有研究就报道，IL-2活化的NK细胞可以有效杀伤MSCs，因为活化的NK细胞表达NKp30、NKG2D和DNAM-1，而MSCs表达ULBP、PVR、nectin-2等活化NK细胞的配体，可以激活NK细胞的同种异体反应(alloreactivity)。MSCs抑制NK细胞的机理尚不清楚，Prigione报道MSCs的抑制作用与MSCs分泌的PGE2相关，而与其分泌的IDO和TGF-β无关。然而MSCs只能部分影响NK细胞的杀伤功能和细胞因子的分泌。

4、MSCs与DC细胞：MSCs可以抑制单核细胞或CD34+造血干细胞向DC细胞分化，降低DC细胞共刺激分子的表达，进而抑制未成熟T细胞的分化和IL-12的分泌。另外，MSCs对DC细胞的抑制作用与MSCs分泌的细胞因子有关，且呈剂量依赖性。Spaggiari等人证实，MSCs通过分泌PGE2，而非IL-6，强烈抑制单核细胞来源的DC细胞的成熟与活化。而且，与骨髓来源的MSCs相比，脂肪来源的MSCs具有更强的抑制作用。

由于MSCs具有以上方面的强大的免疫调节能力，使其在自身免疫性疾病治疗中具有广阔的应用前景。

自身免疫性疾病是指以自身免疫应答反应导致组织器官损伤和相应功能障碍为主要发病机制的一类疾病。健康个体的正常免疫调节功能会将自身耐受和自身免疫协调在一个相辅相成的合理水平上。当某种原因使自身免疫应答过分强烈时，也会导致相应的自身组织器官损伤或功能障碍，这种病理状态就称为自身免疫性疾病。

临床上常见自身免疫病包括：1、结缔组织病：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征、多发性肌炎和皮肌炎、硬皮病、类风湿性关节炎等；2、神经肌肉疾病：多发性硬化、重症肌无力、脱髓鞘疾病；3、内分泌疾病：1型糖尿病、原发性肾上腺皮质萎缩、慢性甲状腺炎等；4、消化系统疾病：炎性肠病(克罗恩病、溃疡性结肠炎)、慢性活动性肝炎、萎缩性胃炎等；5、泌尿系统疾病：自身免疫性肾小球肾炎等；6、血液系统疾病：自身免疫性溶血性疾病、原发性血小板减少性紫癜等。

目前自身免疫性疾病主要治疗方法有激素疗法、免疫抑制剂，一方面毒副作用非常严重(胃肠道反应、血液系统损害、泌尿系统反应、影响生育等等)，另一方面对不同病人疗效差异较大，不少病人病情仍然得不到控制或者不能耐受以上治疗的严重毒副反应，因此迫切需要探索新的自身免疫性疾病治疗方法。

基于MSCs强大的免疫调节能力，使得MSCs在多种自身免疫疾病的临床试验治疗中，已经取得了一部分良好的治疗效果。Dominici M等的一项多发性硬化症临床I/II期试验(15名受试者)证实了自体骨髓MSCs经髓鞘内注射治疗的安全性，且移植数小时后患者体内调节性T细胞比例升高，从而抑制效应T细胞及DC细胞的增殖及激活。Sun等人报道，对于环磷酰胺和口服强的松(≥20mg/day)治疗失败的SLE患者(4例，发病时同时伴随狼疮性肾炎)，利用自体骨髓MSCs治疗，1、6、12个月的随访结果显示，尿蛋白水平显著下降，疾病活力指数(Disease Activity Index，SLEDAI)显著改善，治疗3个月后，病人体内调节性T细胞(CD4+/Foxp3+)比例上升，有两例患者甚至可以停药，12-18个月的随访显示没有任何不良反应出现。同时，Sun等人也报告了脐带来源的MSCs治疗严重狼疮患者的结果，16例患者(其中5例确诊为增殖性肾炎，11例在接受MSCs注射前接受环磷酰胺治疗)，选用P2-5代脐带MSCs，虽然随访只有8.25个月，但SLEDAI评分，血清白蛋白，24小时尿蛋白，肌酐，血清补体和anti-dsDNA抗体水平均显著改善，且血清IL-4水平得到提高，提示Th2细胞比例失衡得到改善。

发明内容

为了克服现有技术领域存在的上述问题，本发明的目的在于，提供一种人脂肪间充质干细胞制备方法及其在制备疾病药物的应用。

一种人脂肪间充质干细胞制备方法：

(1)脂肪的采集：经供体筛选合格后吸脂或手术切除方式无菌采集脂肪标本10ml以上。

(2)脂肪的运输：将脂肪置于保存液中，2-8℃恒温保存于疫苗箱中，48h内送至实验室。

(3)脂肪的交接：实验室接收脂肪，登记好客户信息，并进行编码。

(4)制备脂肪微块：洗涤脂肪，去除残留的血液，将脂肪绞碎为0.5-1mm3的脂肪微块。

(5)SVF提取：0.1％胶原酶I消化脂肪微块，离心弃去上层，100um滤网过滤，获得SVF。

(6)原代培养：按照1×105个/ml接种，置于(37±0.5)℃，(5±0.2)％浓度CO2条件，培养基为人间充质干细胞无血清完全培养基。

(7)传代培养：原代培养经7d左右，细胞融合达70％～80％时，胰酶消化收集PO代细胞，按照5000～6000个/cm2的密度传P1，经3d，P1代融合达80％～90％时，同上，传P2，以此类推传至P3、P4......

(8)细胞冻存及建立细胞库：将上述获得的每批次人脂肪间充质干细胞进行无菌、支原体、内毒素、流式表面标记等检测，检测合格的人脂肪间充质干细胞按照供体来源、细胞编码、细胞数量、细胞代数及冻存日期等进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，建立细胞库。

(9)细胞复苏：将人脂肪间充质干细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得人脂肪间充质干细胞，按照需求使用即可。

所述的人脂肪间充质干细胞具有强大的免疫调节作用，能应用在制备治疗自身免疫性疾病药物中。

所述的自身免疫性疾病是指包括系统性红斑狼疮、系统性硬化、多发性肌炎和皮肌炎、类风湿性关节炎、多发性硬化、1型糖尿病等在内的一大类疾病。

所述自身免疫性疾病尤其指系统性红斑狼疮、多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎。

发明人通过调研大量案例，发现人脂肪MSCs具有强大的免疫调节作用。而自身免疫性疾病的发生是因为正常免疫调节功不能将自身耐受和自身免疫协调在一个相辅相成的合理水平上，即当某种原因使自身免疫应答过分强烈导致相应的自身组织器官损伤或功能障碍，从而发病。同时，MSCs本身不表达II类主要组织相容性抗原及共刺激因子CD80，CD86或CD40，其本身具有低免疫原性，可无需配型异基因使用。因此，可以将外源正常功能的MSCs移植入自身免疫性疾病患者体内，利用MSCs强大的免疫调节作用，诱导免疫耐受，减轻免疫应答，治疗自身免疫疾病。

本发明提出人脂肪MSCs在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。采用人脂肪MSCs制备得到的治疗自身免疫性疾病的药物与治疗自身免疫性疾病的常规药物相比，具有以下优点：1、治疗方便，疗效持久。能帮助患者减少药物治疗的种类和数量以及药物治疗带来的毒副作用，甚至停用免疫抑制剂等药物治疗，降低死亡率和致残率，改善生活质量；2、安全性好，无毒副反应；3、脂肪组织来源广泛，采集方便，且脂肪MSCs的基础研究扎实，制备技术成熟，可推广程度高，技术可控。4、人脂肪MSCs制备成本相对其他生物制剂费用低，多数患者能够接受。因此，人脂肪MSCs在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用具有巨大的社会和经济效益。

附图说明

图1示人脂肪MSCs，P4代，第3天，100倍；

图2示人脂肪MSCs成脂肪诱导2周后油红O染色阳性；

图3示人脂肪MSCs成骨诱导2周后碱性磷酸酶染色呈强阳性反应；

图4示多发性硬化患者异基因人脂肪MSCs移植治疗后头颅MRI影像学显示病灶范围明显缩小。

具体实施方式

本发明中使用的仪器和试剂均是本领域技术人员公知的，可通过商业机构购买获得。本发明使用的方法，如流式细胞表面标记鉴定、核型分析、内毒素检测等等均为本领域公知的方法，可通过教科书或者相应文献的描述进行，本发明说明书中有描述的，参照本发明描述进行。

实施例一 人脂肪MSCs的制备

1、脂肪的采集：对供者进行HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV、梅毒螺旋体感染检测(供体筛选)，检测合格后在无菌条件采集脂肪。可以采用抽脂方式，抽脂部位包括：腰腹、臀部、腿部等等，也可以采用手术方式，采集腹腔或盆腔脂肪块。脂肪量以10ml以上。采集后，将脂肪置于保存液中，2-8℃恒温保存。

2、脂肪的运输：将脂肪置于保存液中，2-8℃恒温保存于疫苗箱中，48h内送至实验室。

3、脂肪的交接：实验室接收脂肪，登记好客户信息，并进行编码。

4、制备脂肪微块：吸弃脂肪保存液，加入等体积含青霉素和链霉素的PBS，反复振荡几次，静置分层，吸弃下层液体，同上，反复振荡洗涤2～3次，至下层洗涤液澄清即可，吸弃下层洗涤液，获得脂肪。将脂肪绞碎为0.5-1mm3的脂肪微块。

5、SVF提取：获得的脂肪加入等体积的0.1％胶原酶I(预热到37℃)，置于恒温振荡培养箱中，37℃，200rpm，消化30～60min，至脂肪呈靡状即可。将消化后的靡状脂肪组织，700g离心10min，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液(注意在SVF沉淀上方留下少量的溶液以免扰动沉淀细胞)，加PBS涤液混匀，100um滤网过滤，吸取1ml悬液计数，其余400g离心8min，弃上清，获得SVF。

6、原代培养：按照1×105个/ml接种到培养瓶，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。培养条件：(37±0.5)℃，二氧化碳体积分数为(5±0.2)％。培养基：人间充质干细胞无血清完全培养基(LONZA，00190632)。

7、传代培养：原代培养经7d左右，细胞达70％～80％融合时，吸弃旧细胞培养液，加细胞洗涤液，静置1min，吸弃细胞洗涤液，加入细胞消化液，消化1.5～2.5min，反复吹打瓶底至细胞大部分脱落，移入50ml离心管中，细胞计数，400g离心8min，弃上清，获得PO代脂肪MSCs。按照5.0×105个/ml加入细胞培养液，接种到T175培养瓶，放入二氧化碳培养箱内培养，计为P1代。待3d左右，P1代细胞达80％～90％融合时，同上操作，收获细胞，计数P1代脂肪MSCs，同上继续传代(每3～5d可传代一次)，以此类推，直至收获P3、P4代(如图1)......

8、细胞冻存及建立细胞库：将上述获得的每批次人脂肪MSCs进行无菌、支原体、内毒素、流式表面标记等检测。检测合格的人脂肪MSCs，缓慢加入细胞冻存液(含10％DMSO的人间充质干细胞无血清完全培养基)，轻轻混匀，然后在冻存管上标明细胞名称、细胞数量、细胞代数及冻存日期；放入冻存盒，-80℃冰箱过夜，次日转移到液氮，并按照供体来源、细胞编码、细胞数量、细胞代数及冻存日期等进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，建立细胞库。

9、细胞复苏：将人脂肪MSCs冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，然后将冻存管以75％酒精消毒，移入超净台内，打开冻存管盖，吸出细胞悬液，移入离心管中，加适量生理盐水，1000rpm离心8min，吸弃上清，获得人脂肪MSCs，按照需求使用即可。

实施例二 人脂肪MSCs的质量控制

1、人脂肪MSCs流式细胞表面标记鉴定：取人脂肪MSCs，流式检测细胞表面标记，流式结果如下

其中，阳性标记物CD29、CD73、CD90、CD105、CD49d阳性表达，阴性标记物CD14、CD34、CD45阴性表达，Actin阴性表达排除成纤维细胞，证明获得的细胞为MSCs。HLA-DR、CD80、CD86阴性表达证明人脂肪MSCs免疫原性低，无需配型，可以异体使用。

2、人脂肪MSCs成脂诱导及鉴定：人脂肪MSCs以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15％FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；待细胞达80％融合，换为诱导培养液(高糖DMEM，FBS 15％，地塞米松1uM，消炎痛200uM，IBMX 0.5uM，胰岛素10ng/ul)，以后每3～4d换一次液，诱导2周后进行油红O染色鉴定。结果：诱导2周后，油红O染色可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色(如图2)，而对照组无变化，证明其成脂分化能力。

3、人脂肪MSCs成骨诱导及鉴定：人脂肪MSCs以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15％FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；待细胞达80％融合，换为诱导培养液(高糖DMEM，地塞米松0.1uM，β-磷酸甘油10mM，抗坏血酸50uM)，以后每3～4d换一次液，诱导2周后进行碱性磷酸酶染色鉴定。结果：诱导2周后，碱性磷酸酶染色呈强阳性反应(如图3)，而对照组呈阴性，证明其成骨分化能力。

4、人脂肪MSCs染色体核型分析：将人脂肪MSCs培养上清中加入秋水仙素使其终浓度为1ug/ml，继续培养30min，弃上清，1％枸橼酸钠低渗处理50min，用固定液(甲醇∶冰乙酸＝3∶1)固定，原位收获细胞，45℃烤片过夜，胰酶法G显代。每例标本计数15个中期分裂相，分析5个核型。结果：均为正常染色体核型。

5、人脂肪MSCs细胞计数及细胞活率测定：每次临床应用前计数人脂肪MSCs细胞数目及活率，活率要求不低于85％。结果：符合要求。

6、人脂肪MSCs内毒素检测：依据现行版《中华人民共和国药典》中内毒素检测规程，对每批次人脂肪MSCs进行内毒素检测。结果：内毒素阴性。

7、人脂肪MSCs无菌试验和支原体检测：依据现行版《中华人民共和国药典》中生物制品无菌试验和支原体检测规程，对每批次人脂肪MSCs进行细菌、真菌及支原体污染的检测。结果：无细菌和支原体污染。

实施例三 人脂肪MSCs给药方法

1、经供体筛选无HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV、梅毒螺旋体等感染，经无菌检测、支原体检测、内毒素检测、核型分析、流式表面标记检测均合格的P2-6代人脂肪MSCs，复苏后细胞活率85％以上，用生理盐水或者电解质注射液稀释，装入转移袋，标记患者姓名，准备回输。

2、细胞输注前半小时给予地塞米松5～10mg或者异丙嗪20～50mg。

3、开放手背静脉，连接装有人脂肪MSCs的转移袋，调整输液速度。

4、输液过程中注意观察患者反应，及时对症处理。整个过程大约耗时30min。

实施例四 人脂肪MSCs在制备治疗不同自身免疫性疾病的药物中的应用

(一)人脂肪MSCs在制备治疗系统性红斑狼疮(SLE)的药物中的应用

1、病例选择：26例系统性红斑狼疮(SLE)患者，符合美国风湿病学会1982年修订的系统性红斑狼疮诊断标准：(1)面颊部蝶形红斑；(2)盘状红斑；(3)日光过敏；(4)口腔溃疡；(5)非侵蚀性关节炎；(6)胸膜炎、心包炎；(7)、蛋白尿每日0.5克以上；(8)神经系统异常：抽搐或精神病；(9)血液学异常，溶血性，或白细胞少于4x109/L，或淋巴细胞少于1.5x109/L，或血小板少于100x109/L；(10)免疫学异常，狼疮细胞阳性，抗双链dna抗体阳性或抗sm抗体阳性，或血清试验假阳性；(11)免疫荧光抗核抗体阳性。在以上11项标准中，符合4项或4项以上者，即可诊断为系统性红斑狼疮，可入选。经伦理委员会同意，并患者签署知情同意书。

2、治疗方案：采取静脉注射方式移植，一个疗程应用4次，间隔5d应用一次，每次应用异基因人脂肪MSCs数量2×106/kg体重。

3、疗效评价：观察移植前及移植后1周，1月，3月，6月，12月，18月，24月患者SLE-DAI评分、24小时尿蛋白、血清肌酐、尿素氮、ANA、抗ds-DNA抗体滴度、Treg(外周血调节性T细胞)数量及TH1、TH2型细胞因子变化。

4、结果：人脂肪MSCs治疗系统性红斑狼疮可以显著降低SLE-DAI评分，显著上调血清白蛋白及补体C3，显著降低24小时尿蛋白定量，显著降低血清肌酐及尿素氮，上调Treg及抑制Th17，改善血液系统损害。26例患者，完全缓解(SLEDAI＜3且Pred量＜10mg/d)为18例，占69.23％，部分缓解(SLE器官受累恢复＞50％，Pred及免疫抑制剂用量较前减少)为8例，占30.77％；无效/复发(SLEDAI增加＞3，同时Pred量无减少，增加或新增免疫抑制剂)为0例，占0％。证明人脂肪MSCs治疗系统性红斑狼疮(SLE)有效。

(二)人脂肪MSCs在制备治疗多发性硬化的药物中的应用

1、病例选择：16例确诊多发性硬化患者，排除严重感染，排除疾病终末期已出现重要脏器功能严重受损。经伦理委员会同意，并同患者签署知情同意书。

2、治疗方案：采取静脉注射方式移植，一个疗程应用4次，间隔5d应用一次，每次应用异基因人脂肪MSCs数量为2×106/kg体重。

3、疗效评价：移植前及移植后1月，3月，6月，12月对患者肌力情况进行评估，并行头颅及脊髓MRI检查判断移植前后有无变化。

4、结果：移植后16例患者肌无力症状改善，头颅及脊髓MRI好转。证明脂肪MSCs治疗多发性硬化有效。

5、典型病例：李某，64岁，临床诊断多发性硬化，因“下肢运动困难进行性加重13年，上肢无力进行加重3月”入院。症状：双上肢无力，指物不准，握持无力，视物不清，小便失禁，双下肢肌张力增高，不能活动。治疗方案：一个疗程4次，间隔5d，每次应用1×108人脂肪MSCs，结果：头颅MRI影像学显示病灶范围明显缩小(图4)，肌张力较前降低，肌力增加1-2级，言语较前清晰，其他症状均有改善。

(三)人脂肪MSCs在制备治疗自身免疫性1型糖尿病的药物中的应用

黄某，女，16岁，因“口干、多饮、多尿3月”入院，诊断为1A型糖尿病(自身免疫性1型糖尿病)。入院检查：尿酮体++、糖化血红蛋白12.9％，空腹血糖12.9mmol/L，空腹及餐后1h、2h的C-肽分别为：0.11、1.24、2.96ng/ml，住院血糖波动大，胰岛素总量30u/d。治疗方式：采取静脉注射方式移植，一个疗程应用4次，间隔5d应用一次，每次应用人脂肪MSCs数量为6×107。一个疗程后，胰岛素逐渐减至2u/d，血糖波动明显减轻。细胞治疗3月后，患者停用胰岛素，血糖维持正常。

(四)人脂肪MSCs在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用

孙某，男，51岁，因“四肢关节肿胀伴晨僵两年，加重三天”入院，诊断为类风湿性关节炎。入院检查：双肩、双腕、双膝肿胀、压痛明显，活动受限，关节抗CCP抗体阳性，RF196IU/L，ESR89mm/h，DAS28评分9.08。治疗方式：采取静脉注射方式移植方式，一个疗程应用2次，间隔5d应用一次，每次应用人脂肪MSCs数量为1×108。结果：第一次移植后，患者关节肿胀疼痛明显好转，两次移植后，ESR28mm/h，DAS28评分4.48，好转出院。

基于人脂肪间充质干细胞强大的免疫调节作用，本发明的人脂肪间充质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，不仅包括上述在制备治疗实施例中提到的在制备治疗系统性红斑狼疮、多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎的药物中的应用，还包括在制备治疗其他自身免疫性疾病的药物中的应用。

Claims (2)

1.一种人脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于：它包括如下具体步骤：

(1)脂肪的采集：经供体筛选合格后吸脂或手术切除方式无菌采集脂肪标本10ml以上；

(2)脂肪的运输：将脂肪置于保存液中，2-8℃恒温保存于疫苗箱中，48h内送至实验室；

(3)脂肪的交接：实验室接收脂肪，登记好客户信息，并进行编码；

(4)制备脂肪微块：洗涤脂肪，去除残留的血液，将脂肪绞碎为0.5-1mm3的脂肪微块；

(5)SVF提取：0.1％胶原酶I消化脂肪微块，离心弃去上层，100um滤网过滤，获得SVF；

(6)原代培养：按照1×105个/ml接种，置于(37±0.5)℃，(5±0.2)％浓度C02条件，培养基为人间充质干细胞无血清完全培养基；

(7)传代培养：原代培养经7d左右，细胞融合达70％～80％时，胰酶消化收集P0代细胞，按照5000～6000个/cm2的密度传P1，经3d，P1代融合达80％～90％时，同上，传P2，以此类推传至P3、P4......；

(8)细胞冻存及建立细胞库：将上述获得的每批次人脂肪间充质干细胞进行无菌、支原体、内毒素、核型分析、流式表面标记等检测，检测合格的人脂肪间充质干细胞按照供体来源、细胞编码、细胞数量、细胞代数及冻存日期等进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，建立细胞库；

(9)细胞复苏：将人脂肪间充质干细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得人脂肪间充质干细胞，按照需求使用即可。

2.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞在制备疾病药物中的应用，其特征在于：特别是在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，其中自身免疫性疾病是指系统性红斑狼疮、多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎。