CN110051693A - 治疗或预防风湿性疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗风湿性疾病的方法，所述方法包括施用富含STRO‑1⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。

Description

治疗或预防风湿性疾病的方法

相关申请数据

本申请是201280042829.7号中国专利申请的分案申请，要求于 2012年7月4日提交的名称为“治疗或预防风湿性疾病的方法”的澳大利亚专利申请号2011902655的优先权。所述申请的全部内容特此以引用的方式并入。

序列表

序列表是以电子表格的形式与本申请一起提交。所述序列表的全部内容特此以引用的方式并入。

领域

本发明涉及用于治疗或预防风湿性疾病的方法。

背景

风湿性疾病是通常被称为“关节炎”的一类常见疾病，所述疾病经常与自身免疫反应相关或由自身免疫反应引起。这类疾病包括类风湿性关节炎、脊椎关节病(例如，强直性脊椎炎)、斯耶格伦综合征 (Sjorgren Syndrome)(干燥综合征(Sicca Syndrome))、莱特尔氏病 (Reiter’s disease)、银屑病性关节炎、肠道关节炎(与炎性肠病相关的关节问题)、骶髂关节炎或脊椎炎、以及骨关节炎。

根据疾病控制中心(CDC)，仅在美国有近5千万成人已经被诊断具有一些形式的关节炎。预测到2030年，这一数目会增加至6700万成人。CDC估计在美国关节炎的成本为大约US$808亿的关节炎治疗成本和大约US$470亿的间接成本(例如，失去收入)。总成本$1278亿是2003年美国国内生产总值的1.2％。

类风湿性关节炎和骨关节炎

类风湿性关节炎(RA)是痛苦的慢性全身性疾病，其特征为严重的滑膜炎症，伴随关节软骨和骨的破坏。RA的临床过程是可变的并且经常显示缓解模式，但如果是进行性的则不可避免地导致关节变形和功能受损。可以区分三种形式的RA：轻度，自限性疾病；轻微进行性疾病；以及侵袭性疾病，侵袭性疾病难以用药物进行控制并且其特征为关节的功能衰退和放射性退化，例如关节间隙变窄和软骨侵蚀，特别是在增殖性发炎的滑膜下的，被称为血管翳。根据疾病的全身性性质，存在关节外表现，包括血管炎、肺泡炎、以及眼病。文献中报告的所述疾病的流行性为美国人口的大约1％，其中妇女占所有病例的三分之二。

RA的发病通常隐伏疲劳、厌食、全身乏力以及肌肉骨骼疼痛。具体症状随后出现。一些通常呈对称形式的关节受到影响。最经常这些是手、腕、膝以及脚的关节。关节疼痛和肿胀，并且运动受到限制。超过一小时的晨僵是非常典型的发现。在持久性炎症的情况下，发展多种变形，所述变形最典型包括手腕的桡偏和近端指节间关节的过伸或屈曲；也发生其它变形。骨骼肌的萎缩发生。在所有患者的大约 20％至30％中，存在关节周围结构或创伤部位上的类风湿性结节的发展，但是它们通常具有有限的临床意义。所述结节可以在其它结构中发现，如胸膜或脑膜。类风湿性血管炎可以影响几乎所有器官系统 (肺、胃肠道、肝、脾、胰腺、淋巴结、睾丸、以及眼)。

对于RA来说，不存在治愈性治疗。所有药物方案主要试图缓解症状和炎症。阿司匹林和其它起效快的非类固醇抗炎药物(NSAID)是一线治疗。如果必要的话，将口服和可注射糖皮质激素添加至所述药物方案。三线治疗包括改善疾病的抗风湿药物(DMARDs)；它们起效缓慢，在一些情况下达几个月。DMARD包括硫唑嘌呤、柳氮磺胺吡啶、金、D-青霉胺、羟氯喹、甲氨蝶呤以及环孢霉素。最近添加生物药物，如以及已经提供了替代治疗模式，然而这些产品的常规使用可能抑制免疫防御系统并且已与机会性感染和如结核病的疾病的增加的发生率相关。

骨关节炎(OA)是西方人群体中最常见的关节炎形式。临床上以疼痛和功能性残疾为特征的膝OA是美国老年人中慢性残疾的主导原因。

病理上，OA中最显著的变化是关节软骨的局灶性缺失以及边缘和中心新骨形成。然而，OA不单单是关节软骨和软骨下骨疾病。反而，它是滑膜关节的疾病，其中还在滑膜、囊、韧带、关节周围肌肉以及感觉神经中发现改变。

虽然OA一度被认为是非炎性关节病，但是患者经常表现出与局部炎症和滑膜炎一致的病征和症状，并且来自临床前和临床研究的最新证据支持了炎症和炎症介质在其病理生理学中的作用。

骨关节炎的当前治疗包括非药物疗法、药物疗法、以及外科治疗。非药物治疗包括锻炼和减肥计划、热处理、以及辅助装置或支撑件。对于膝OA来说，全范围运动和强化锻炼适用于减少损伤、改善功能以及关节保护。药物包括镇痛剂(例如，扑热息痛)、为非选择性环氧合酶(COX)抑制剂或选择性COX-2酶抑制剂的非类固醇抗炎药物 (NSAID)、关节内注射的皮质类固醇或透明质酸、以及证实的或公认的改善疾病的骨关节炎药物(DMOAD)。外科手术包括关节清创术和灌洗、以及最后的全膝关节成形术。

膝OA的最常使用的药物治疗通常提供小于50％的疼痛缓解。例如，使用扑热息痛、选择性NSAID或非选择性NSAID通常引起的膝 OA疼痛的平均改善从使用100分(100-mm)视觉模拟量表的约70分的基线算起不超过30分。因此，在膝OA的疼痛管理方面存在相当大的改善空间。此外，没有疗法已经被证明延迟结构退化的进展。

强直性脊椎炎

强直性脊椎炎(AS)是对患者功能、健康以及残疾具有相当大的影响的慢性、进行性、炎性疾病。AS的流行性传统上已经被估计在0.1％至1.9％的范围内，其中受影响的男性比女性更多。作为中轴骨骼和大的外周关节的慢性疾病，AS引起炎性背痛和僵硬，并且它与其它皮肤、眼和肠的炎性疾病相关。在严重情况下，AS可能导致完全脊柱融合，从而引起极端身体限制。因此，仍然存在对安全且有效的 AS治疗的需要。

随着疾病进展，患有AS的患者经历疼痛、关节僵硬、并且最终脊柱活动度的损失。这些临床症状和随后疾病进展导致健康相关生命质量(HRQOL)方面的功能限制和损伤。

对于AS来说，不存在治愈。一般来说，治疗包括尝试使用药物如NSAID、皮质类固醇、以及DMARD来缓解疼痛和僵硬。

对于本领域技术人员将是清楚的是炎性关节疾病是对社会具有主要影响的一类致衰弱疾病。还需要用于这些疾病的治疗剂。

概述

在本发明之前的工作中，诸位发明人寻求确定间充质祖细胞 (MPC)对风湿性疾病的作用。诸位发明人通常研究类风湿性关节炎的绵羊模型作为风湿性疾病的模型，因为许多这些疾病具有共同的特征，例如，自身免疫和关节中免疫细胞和炎性细胞因子的存在。诸位发明人已经确定MPC有效降低关节炎的组织病理学指数，如，滑膜增生、基质组织活化以及炎性细胞浸润。此外，诸位发明人已经展示了施用MPC降低促炎性细胞因子的水平，所述促炎性细胞因子如(例如)滑膜组织中的IL-6、TNFα、IL-17还有CD14⁺细胞。诸位发明人考虑到降低这些细胞和细胞因子的水平的能力使得MPC(和/或它们的子代和/或由其分泌的可溶性因子)适合用于治疗风湿性疾病，如，类风湿性关节炎和/或骨关节炎。

诸位发明人还确定MPC提供长期治疗益处，其中细胞的单次注射的作用持续至少约30天。

诸位发明人已经另外发现MPC或其子代迁移到风湿性疾病的病理学部位。这种迁移提供益处，因为它允许全身性施用所述细胞，这 (例如)与将细胞施用到受试者的滑液中相比既容易又可以是更少困难和/或更小侵入性的。

通过标志物STRO-3的表达而分离的绵羊MPC在功能上等效于共表达标志物STRO-3和STRO-1的人MPC(如本文实施例2中所示)。

本发明因此提供一种用于治疗或预防受试者中的风湿性疾病的方法，所述方法包括对受试者施用富含STRO-1⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。

在一个实施例中，所述风湿性疾病是自身免疫性风湿性疾病。

在一个实施例中，所述风湿性疾病选自由以下各项组成的组：类风湿性关节炎、斯蒂尔病(Still’s disease)(同义词幼年特发性关节炎或幼年类风湿性关节炎)、强制性脊椎炎、莱特尔氏病、银屑病性关节炎、肠道关节炎、骶髂关节炎、脊椎炎、以及骨关节炎。

在一个实施例中，所述风湿性疾病是骨关节炎。

在示例性形式中，所述风湿性疾病是类风湿性关节炎。

在一个实施例中，所述方法包括施用富含STRO-1^亮细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。

在一个实施例中，富含STRO-1⁺细胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是全身性地施用的。例如，所述细胞是静脉内施用的。在这点上，诸位发明人已经展示了STRO-1⁺细胞和/或其子代迁移到受试者中发炎关节的部位。因此，本发明涵盖在远离受试者中发炎关节的部位施用STRO-1⁺细胞和/或其子代。

在一个实施例中，所述STRO-1⁺细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是以足以减少受试者中(例如，受试者的关节内，如滑膜组织内)IL-6、TNFα、IL-17还有CD14⁺细胞的量施用。

细胞的示例性剂量包含0.1×10⁶至5×10⁶之间个STRO-1⁺细胞和/ 或其子代。例如，所述方法包括施用每千克0.3×10⁶至2×10⁶之间个 STRO-1⁺细胞和/或其子代。

在一个实施例中，所述细胞是以约0.3×10⁶个细胞/kg至约4×10⁶个细胞/kg之间、如约0.3×10⁶个细胞/kg至2×10⁶个细胞/kg之间的剂量施用。

所述方法的一种形式涉及施用低剂量的STRO-1⁺细胞和/或其子代。这种低剂量是(例如)0.1×10⁵至约0.5×10⁶之间个STRO-1⁺细胞/kg，如约0.3×10⁶个STRO-1⁺细胞/kg。

在另一个实施例中，将高剂量的细胞施用至受试者。示例性剂量包含至少约1.5×10⁶个细胞/kg。例如，高剂量包含约1.5×10⁶至约4×10⁶之间个细胞/kg。例如，高剂量包含约1.5×10⁶或约2×10⁶个细胞/kg。诸位发明人已经展示这类剂量(例如)通过降低IL-6、TNFα、IL-17、还有CD14⁺细胞的水平来提供益处。

在一个实施例中，所述细胞是以约1亿至3亿个细胞的剂量施用，不考虑患者的体重。

在一个实施例中，所述细胞是以约1亿至2亿个细胞的剂量施用，不考虑患者的体重。

在一个实施例中，所述细胞是以约1亿个细胞的剂量施用，不考虑患者的体重。

在一个实施例中，所述细胞是以约1.5亿个细胞的剂量施用，不考虑患者的体重。

在一个实施例中，所述细胞是以约2亿个细胞的剂量施用，不考虑患者的体重。

在一个实施例中，所述细胞是以约3亿个细胞的剂量施用，不考虑患者的体重。

在一个实施例中，富含STRO-1⁺细胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是每周一次或以更低频率、如每四周一次或以更低频率施用。

本发明还涵盖多次施用所述细胞和/或可溶性因子。例如，这种方法可以涉及施用所述细胞和监测受试者以便确定炎性关节疾病的一种或多种症状发生或复发的时间，以及施用另一剂量的所述细胞和 /或可溶性因子。用于评定风湿性疾病的症状的适合方法对于本领域的技术人员将是清楚的和/或在本文中描述。

在另一个实施例中，细胞和/或可溶性因子根据固定时间表来施用，例如，每周或两周或三周或四周或五周或六周或更长时间一次。

在一个实施例中，富含STRO-1⁺细胞的群和/或子代细胞是自体的或同种异体的和/或可溶性因子可以从自体或同种异体细胞得到。

在一个实施例中，富含STRO-1+细胞的群和/或子代细胞在施用之前和/或在获得可溶性因子之前已培养扩增。

在一个实施例中，富含STRO-1⁺细胞的群是STRO-1^亮，和/或表达组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)和/或子代细胞和/或可溶性因子是从为STRO-1^亮的和/或表达TNAP的STRO-1⁺细胞得到。

在一个实施例中，STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子是以包含所述STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子和载体和/或赋形剂的组合物的形式来施用。

在一个实施例中，STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子与另一种化合物一起施用用于治疗或预防风湿性疾病。在一个实施例中，所述另一化合物是改善疾病的抗风湿药物 (DMARD)。在一个实施例中，所述DMARD选自由以下各项组成的组：羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、甲氨蝶呤、来氟米特、硫唑嘌呤、D- 青霉胺、金盐、米诺环素、环孢霉素以及TNF抑制剂。

在一个实施例中，所述DMARD选自由以下各项组成的组：硫唑嘌呤、氯喹、羟氯喹、来氟米特、甲氨蝶呤以及柳氮磺胺吡啶。在一个实施例中，所述DMARD是甲氨蝶呤。

在另一个实施例中，所述DMARD是抗TNF抗体(例如，英夫利昔单抗、戈利木单抗或阿达木单抗)或可溶性TNF受体(例如，依那西普)。

在一个实施例中，STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子与B细胞耗竭剂一起施用。在一个实施例中，所述B 细胞耗竭剂是抗CD20抗体，如利妥昔单抗或奥法木单抗。

在一个实施例中，将STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子施用至患有类风湿性关节炎并且接受甲氨蝶呤治疗的受试者。

在一个实施例中，STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子是作为甲氨蝶呤疗法的辅助和/或伴随疗法施用。

在一个实施例中，受试者患有中度活动性类风湿性关节炎或重度活动性类风湿性关节炎或中度至重度活动性类风湿性关节炎。

在一个实施例中，将STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞施用至患有类风湿性关节炎并且接受甲氨蝶呤治疗的受试者，其中所述细胞是以约1×10⁶至约3×10⁶个细胞/kg的剂量施用。

在一个实施例中，将STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞施用至患有类风湿性关节炎并且接受甲氨蝶呤治疗的受试者，其中所述细胞是以约1.5×10⁶至约2×10⁶个细胞/kg的剂量施用。

在一个实施例中，将STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞施用至患有类风湿性关节炎并且接受甲氨蝶呤治疗的受试者，其中所述细胞是以约1.5×10⁶个细胞/kg的剂量施用。

在一个实施例中，将STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞施用至患有类风湿性关节炎并且接受甲氨蝶呤治疗的受试者，其中所述细胞是以约2×10⁶个细胞/kg的剂量施用。

在一个实施例中，将STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞施用至患有类风湿性关节炎并且接受甲氨蝶呤治疗的受试者，其中所述细胞是以 (不考虑患者的体重)约1亿个细胞至约3亿之间个细胞、如(不考虑患者的体重)约1亿个细胞至约2亿之间个细胞的剂量施用。

在一个实施例中，STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞是全身性(例如静脉内)地施用。

因此，在一个实施例中，本发明提供一种用于治疗或预防受试者中的骨关节炎的方法，所述方法包括向受试者静脉内(或全身性地)施用富含STRO-1⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。示例性细胞、剂量以及组合治疗在本文中进行描述并且将加以必要的变更以适用于本发明的实施例。

在另一个实施例中，本发明提供一种用于治疗或预防受试者中的类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向受试者静脉内(或全身性地) 施用富含STRO-1⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。示例性细胞、剂量以及组合治疗在本文中进行描述并且将加以必要的变更以适用于本发明的实施例。

本发明另外提供一种用于治疗或预防受试者中的风湿性疾病的富含STRO-1⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。

本发明另外提供富含STRO-1⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子在制造用于治疗或预防受试者中的风湿性疾病的药物中的用途。

序列表注释

SEQ ID NO：1，用于扩增编码GAPDH的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：2，用于扩增编码GAPDH的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：3，用于扩增编码SDF-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：4，用于扩增编码SDF-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：5，用于扩增编码IL-1β的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：6，用于扩增编码IL-1β的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：7，用于扩增编码FLT-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：8，用于扩增编码FLT-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：9，用于扩增编码TNF-α的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：10，用于扩增编码TNF-α的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：11，用于扩增编码KDR的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：12，用于扩增编码KDR的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：13，用于扩增编码RANKL的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：14，用于扩增编码RANKL的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：15，用于扩增编码瘦蛋白的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：16，用于扩增编码瘦蛋白的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：17，用于扩增编码CBFA-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：18，用于扩增编码CBFA-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：19，用于扩增编码PPARγ2的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：20，用于扩增编码PPARγ2的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：21，用于扩增编码OCN的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：22，用于扩增编码OCN的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：23，用于扩增编码MyoD的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：24，用于扩增编码MyoD的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：25，用于扩增编码SMMHC的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：26，用于扩增编码SMMHC的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：27，用于扩增编码GFAP的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：28，用于扩增编码GFAP的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：29，用于扩增编码巢蛋白的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：30，用于扩增编码巢蛋白的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：31，用于扩增编码SOX9的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：32，用于扩增编码SOX9的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：33，用于扩增编码X型胶原的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：34，用于扩增编码X型胶原的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：35，用于扩增编码聚集蛋白聚糖的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO：36，用于扩增编码聚集蛋白聚糖的核酸的寡核苷酸

附图简述

图1.TNAP(STRO-3)和间充质前体细胞标志物STRO-1^亮在成人骨髓形核细胞(BMMNC)中的共表达。通过孵育MACS选择的 BMMNC并用与FITC偶合的山羊抗鼠类IgM抗体间接标记的STRO-1 (x轴)和用与PE偶合的山羊抗鼠类IgG间接标记的STRO-3 mAb(鼠类IgG1)(y轴)进行双色免疫荧光和流式细胞术。点阵直方图表示以列表模式数据形式收集的5×10⁴个事件。垂直线和水平线设定为小于用在相同条件下处理的同种型匹配对照抗体1B5(IgG)和1A6.12(IgM) 获得的平均荧光的1.0％的反应性水平。结果表明STRO-1^亮细胞的较小群体共表达TNAP(右上象限)，而其余STRO-1⁺细胞未能与STRO-3 mAb反应。

图2.经培养和扩增的STRO-1^亮MPC的STRO-1^亮或STRO-1^暗子代的基因表达谱。通过胰蛋白酶/EDTA处理制备离体扩增的骨髓 MPC的单细胞悬浮液。将细胞用STRO-1抗体染色，所述STRO-1 抗体随后通过与山羊抗鼠类IgM-异硫氰酸荧光素一起孵育加以显现。荧光活化细胞分选(A)后，由经过纯化的表达STRO-1^暗或STRO-1 ^亮的细胞的群制备总细胞RNA。使用RNAzolB提取方法和标准程序，从各子群体分离总RNA并且用作cDNA合成的模板。使用如先前所描述的标准方案(Gronthos等J Cell Sci.116：1827-1835，2003)通过 PCR扩增评定各种转录物的表达。此研究中所用的引物组在表2中示出。扩增后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对各反应混合物进行分析，并且通过溴化乙锭染色进行观测(B)。使用ImageQant软件参考持家基因GAPDH的表达来评定各细胞标志物的相对基因表达(C)。

图3.经过培养和扩增的STRO-1⁺MPC的STRO-1^亮子代表达高水平的SDF-1，STRO-1^暗子代不能。(A)使用FACS根据区域STRO-1^亮和STRO-1^暗/深将通过MACS分离的STRO-1⁺BMMNC制备物划分为不同的STRO-1子集。从各STRO-1子群体制备总RNA并且用于构建STRO-1^亮消减杂交文库(B-C)。复制已经用由经过STRO-1^亮消减 cDNA转化的细菌克隆扩增的代表性PCR产物点印的硝化纤维素过滤器。所述过滤器接着用[³²p]三磷酸脱氧胞苷(dCTP)标记的STRO-1 ^亮(B)抑或STRO-1^暗/深(C)消减cDNA探测。箭头指示含有对应于人 SDF-1的cDNA片段的1个克隆的差异表达。(D)逆转录酶(RT)-PCR 分析显示由在培养前通过MACS/FACS新鲜分离的BMMNCSTRO-1 群体制备的总RNA中SDF-1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)转录物的相对表达。bp表示碱基对。

图4是示出类风湿性关节炎的绵羊模型的跛行得分的图示。得分如本文所述进行确定。

图5是示出在试验过程中来自个体绵羊的右(未受刺激的)跗关节和左(受刺激的)跗关节的滑液中的白细胞计数的图示(如图中所指示)。绵羊B1627和B4036用鸡II型胶原进行免疫并且所有其它绵羊用牛II型胶原进行免疫。在较高反应者中，对照侧中的白细胞浓度也升高，这指示全身性反应的可能性。

图6是示出对照绵羊(n＝7)和用牛II型胶原进行免疫的绵羊(n＝5) 的滑液中白细胞计数的图示。数据示出平均值±标准误差。

图7A是示出来自用牛II型胶原免疫的5只绵羊的右(对照)跗关节和左(受刺激的)跗关节的滑液中的针对牛II型胶原的IgM(左侧图) 和IgG(右侧图)抗体的水平的图示。滑液在初始免疫之后42天尸检时取得。在受刺激的跗关节中，IgM的水平升高4至8倍并且IgG的水平升高10至60倍。

图7B是示出来自用鸡II型胶原进行免疫的2只绵羊的右(对照) 跗关节和左(受刺激的)跗关节的滑液中的针对鸡II型胶原的IgM(左侧图)和IgG(右侧图)抗体的水平的图示。滑液在初始免疫之后42天尸检时取得。在受刺激的跗关节中，IgM的水平升高3至5倍并且IgG 的水平升高2-8×106倍。

图8A示出来自所有组的左跗关节的滑膜的总组织病理学得分和单个组织病理学得分(增生、基质活化、炎性细胞浸润)。方差分析 (Anova)＝p＜0.04；p来自Mann-Whitney检验。

图8B示出来自所有IV注射组的右跗关节的滑膜的总组织病理学得分和单个组织病理学得分。

图8C示出来自关节内注射(IA)盐水或MPC的组的滑膜的总组织病理学得分和单个组织病理学得分。

图9A示出CD14评分系统(如Mo等，J Rheumatol.38：2301-2308， 2011中所描述的内膜评分方案)。

图9B示出应用于CD4、CD8、γ-δTCR、CD79a以及Ki-67的离散细胞评分方案。

图9C示出应用于VCAM-1、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-17、TNFα以及间质CD14的细胞因子和粘附分子评分系统。

图10A示出对照组和注射MPC的组的左跗关节滑膜组织中的 CD4、CD8、γ-δTCR以及CD79a的平均值±SD免疫组织学得分。

图10B示出对照组和注射MPC的组的左跗关节滑膜组织中的 VCAM-内膜、VCAM-间质、Ki67-内膜以及Ki67-间质的平均值±SD 免疫组织学得分。

图10C示出对照组和注射MPC的组的左跗关节滑膜组织中的 IL-10-内膜、IL-10-间质、IL1β-内膜以及IL1β-间质的平均值±SD免疫组织学得分。

图10D示出IV盐水对照组和注射MPC的组的滑膜内膜和间质组织的IL-6和TNF-α的滑膜免疫组织化学染色得分的平均值+ SEM。所示的p值使用Mann-Whitney非参数t检验进行计算。

图10E示出针对盐水对照组和注射MPC的组的CD14阳性细胞的滑膜免疫组织化学间质组织染色的平均值+SEM。所示的p值使用Mann-Whitney非参数t检验进行计算。

图10F示出针对盐水对照组和注射MPC的组的IL-17的滑膜免疫组织化学间质组织染色的平均值+SEM。所示的p值从使用 Krushal-Wallis检验和Dunns事后检验的方差分析(ANOVA)得到。

图11A示出针对CD14细胞进行免疫染色的滑膜切片的显微照片，其示出分配得分。放大倍数×100。

图11B示出针对TNF-α进行免疫染色的滑膜切片的显微照片，其示出分配得分。放大倍数×100。

图11C示出显示针对IL-6进行免疫染色的滑膜切片的显微照片，其示出分配得分。放大倍数×100。

图11D示出针对IL-17进行免疫染色的滑膜切片的显微照片，其示出分配得分。放大倍数×100。

图11E示出针对IL-10进行免疫染色的滑膜切片的显微照片，其示出分配得分。放大倍数×100。

详述

通用技术和选定的定义

在本说明书中，除非另有特别说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质的组合物、步骤的组或物质组合物的组应视为包括那些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组中的一个或多个 (即，一个或多个)。

除非另有特别声明，否则本文描述的每个实施方案或实施例在作必要的修改的情况下适用于每一个其它实施方案。

本领域的技术人员应了解，本文所述的本发明容许具体描述的内容以外的变化和修改。应理解，本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括在本说明书中个别地或共同地提及或指示的所有的步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或其任何两者或多者。

本发明在范围上不受本文所述的具体实施方案限制，所述具体实施方案意图仅是用于示例的目的。功能上等同的产物、组合物以及方法显然在如本文所述的本发明的范围内。

除非另有指示，否则在不进行过度实验的情况下使用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液相肽合成、固相肽合成以及免疫学的常规技术来执行本发明。所述程序描述于以下文献中，例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第二版(1989)，卷I、II以及III全部；DNA Cloning：A Practical Approach，卷I和II(D.N.Glover编著，1985)，IRL Press，Oxford，全文； Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(M.J.Gait编著，1984) IRL Press，Oxford，全文，以及尤其是其中Gait的论文，第1-22页；Atkinson等，第35-81页；Sproat等第83-115页；以及Wu等，第 135-151页；4.Nucleic AcidHybridization：A Practical Approach(B.D. Hames和S.J.Higgins编著，1985)IRLPress，Oxford，全文； Immobilized Cells and Enzymes：A Practical Approach(1986)IRLPress，Oxford，全天；Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编著， Academic Press，Inc.)，全系列；J.F.Ramalho Ortigao，″The Chemistry of Peptide Synthesis″见：Knowledge databaseof Access to Virtual Laboratory website(Interactiva，德国)；Sakakibara，D.，Teichman，J.， Lien，E.Land Fenichel，R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73336-342；Merrifield，R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154； Barany，G.和Merrifield，R.B.(1979)见The Peptides(Gross，E.和 Meienhofer，J.编著)，卷.2，第1-284页，Academic Press，New York 12. Wünsch，E.编著(1974)Synthese von Peptiden inHouben-Weyls Metoden der Organischen Chemie(Müler，E.编著)，卷15，第4版，第1 和2部分，Thieme，Stuttgart；Bodanszky，M.(1984)Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.和Bodanszky，A. (1984)The Practice ofPeptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg； Bodanszky，M.(1985)Int.J.PeptideProtein Res.25，449-474； Handbook of Experimental Immunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C. Blackwell编著，1986，Blackwell Scientific Publications)；以及Animal CellCulture：Practical Approach，第3版(John R.W.Masters编著， 2000)，ISBN 0199637970，全文。

在本说明书中，除非全文另有要求，否则词语“包括(comprise)，或变化形式如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，将被理解为意指包括所述步骤或要素或整数或者步骤或要素或整体的组，但是不排除任何其它的步骤或要素或整数或者要素或整数的组。

如本文中所用的，术语“来源于”应意味指示指定的整数可从特定的来源来获得，即使不一定直接来自该来源。在由STRO-1⁺细胞和/ 或其子代细胞得到的可溶性因子的上下文中，这个术语应意味一种或多种因子，例如蛋白质、肽、碳水化合物等等是在体外培养STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞期间产生。

如本文中所用的，术语“风湿性疾病”应被理解为意指以受试者中至少一个关节中的炎症反应为特征的任何疾病。在一个实施例中，所述风湿性疾病是由自身免疫性病状引起或与自身免疫性病状相关。示例性风湿性疾病是本领域已知的和/或在本文加以描述。

如本文中所用的，术语“有效量”应被理解为意指足以减少受试者关节中的引起风湿性疾病或与风湿性疾病相关的炎症和/或炎性细胞的数目和/或炎性细胞因子的STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的量。

如本文中所用的，术语“治疗有效量”应被理解为意指足以减少或抑制风湿性疾病的一种或多种症状的STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的量。

如本文中所用的，术语术语“预防有效量”应被理解为意指足以预防或抑制或延迟炎性关节疾病的一种或多种可检测的症状的发作的 STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的量。

如本文中所用的，术语“低剂量”应被理解为意指小于1×10⁶个细胞/kg、但仍然足以减少受试者关节中的炎症和/或炎性细胞因子和/ 或炎性细胞的数目的STRO-1⁺细胞和/或其子代的量。例如，低剂量包含每千克0.5×10⁶个或更少的细胞，或0.4×10⁶个或更少的细胞或 0.3×10⁶个或更少的细胞或0.1×10⁶个或更少的细胞。

如本文中所用的，术语“高剂量”应被理解为意指足以减少受试者中(例如，受试者的关节内，如滑膜组织内)的IL-6、TNFα、IL-17还有CD14⁺细胞的STRO-1⁺细胞和/或其子代的量，如多于1.5×10⁶个细胞/kg。例如，高剂量包含约1.5×10⁶至约4×10⁶之间个细胞/kg。例如，高剂量包含约1.5×10⁶或约2×10⁶/kg。

如本文中所用的，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”应被理解为意指施用治疗有效量的可溶性因子和/或细胞并且减少或抑制炎性关节疾病的至少一种症状。

如本文中所用的的，术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”或“预防(prevention)”应被理解为意指施用预防有效量的可溶性因子和/ 或细胞并且停止或阻止或延迟炎性关节疾病的发展或进展。

如本文中所用的，术语“可溶性因子”应被理解为意指可溶于水的由STRO-1⁺细胞和/或其子代产生的任何分子，例如，蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、碳水化合物等。所述可溶性因子可以在细胞内和/或由细胞分泌。所述可溶性因子可以是复杂混合物(例如，上清液)和/或其组分和/或可以是纯化的因子。在本发明的一个实施例中，可溶性因子是上清液或是含于上清液内。因此，本文涉及施用一种或多种可溶性因子的任何实施例应被理解为在作了必要的修改的情况下适用于施用上清液。

如本文中所用的，术语“上清液”是指在适合的培养基(如，液体培养基)中体外培养间充质前体细胞和/或其子代细胞后产生的非细胞物质。通常，上清液是通过在适合的条件和时间下在培养基中培养细胞，随后通过如离心的过程移除细胞物质后所产生。在施用之前，上清液可能会或可能不会经受进一步纯化步骤。在一个实施例中，上清液包含少于10⁵个，如少于10⁴个，例如少于10³个以及例如无活细胞。

如本文中所用的，术语“正常或健康受试者”应被理解为意指如通过本领域已知和/或本文所述的任何方法所评定的未患炎性关节疾病的受试者。

如本文中所用的，术语“受试者”将理解为意指包括人类的任何动物，如哺乳动物。示例性受试者包括但不限于人类、灵长类、家畜(例如棉羊、牛、马、驴、猪)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室试验动物 (例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、捕获的野生动物(例如狐狸、鹿)。在一个实施例中，哺乳动物是人或灵长类。在一个实施例中，哺乳动物是人。在一个实施例中，以下受试者符合治疗的条件：所述受试者正在经历或已经经历炎性关节疾病的一种或多种体征、症状、或其它指标，已经被诊断患有炎性关节损害(无论是例如新近诊断的或先前诊断的)并且现在正在经历复发或再发，或处于发展炎性关节损害的风险。

风湿性疾病

在本发明的一个实例中，风湿性疾病是炎性关节疾病。炎性关节疾病在本文以最广泛的含义来使用，并且是指对一个或多个关节的任何部分(包括结缔组织和软骨)的损害或部分或完全破坏，其中损害包括任何原因的结构和/或功能损害并且特征为关节中的炎症，并且可能会或可能不引起关节疼痛/关节痛(arthalgia)。这种损害可以由以下任何病状引起，如自身免疫性疾病如关节炎(例如，急性和慢性关节炎)、类风湿性关节炎包括幼发型类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎(JIA)、或幼年RA(JRA)，和阶段如类风湿性滑膜炎、痛风或痛风性关节炎、急性免疫性关节炎，慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II 型胶原诱导的关节、感染性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、增殖性关节炎、银屑病性关节炎、斯蒂尔病、脊椎关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente)、变形性关节炎、慢性原发性多发性关节炎、反应性关节炎、绝经期关节炎、雌激素耗竭关节炎、以及强直性脊椎炎/类风湿性脊椎炎，不同于RA的风湿性自身免疫性疾病，继发于RA的显著累及全身(包括但不限于血管炎、肺纤维化或费尔蒂氏综合征(Felty′s syndrome))、血清阴性脊椎关节病、莱姆病、混合性结缔组织病、与胶原病相关的自身免疫性病症。

在一个实施例中，技术人员将会理解，炎性关节疾病不是单独由 (例如)过度使用或运动损伤或对关节的撞击所引起的对软骨或骨或关节的损伤，因为这些病状不是疾病。

在一个实施例中，所述炎性关节疾病与自身免疫性疾病相关或由自身免疫性疾病引起。“自身免疫性疾病”是起因于或针对受试者的自身组织或器官或其共分离或表现或由其产生的病状的疾病。在一个实施例中，所述炎性关节疾病是自身免疫性炎性关节疾病，如因受试者针对抗原具有免疫反应(在所述受试者的关节中发生)而引起。

在一个实施例中，所述炎性关节损害是由关节炎引起，如类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊椎炎、或银屑病性关节炎。

在一个实施例中，所述炎性关节疾病是类风湿性关节炎。

在一个实施例中，所述炎性关节疾病是骨关节炎。

出于本文的目的，关节是在具有围绕和支撑它的部分的(脊椎动物如动物的)骨骼元件之间的接触点，并且包括但不限于例如，髋、脊柱的椎骨之间的关节、脊柱与骨盆之间的关节(骶髂关节)、其中腱和韧带附接至骨的关节、肋骨与脊柱、肩、膝、脚、肘、手、手指、脚踝以及脚趾之间的关节，但尤其是手和脚中的关节。

用于检测和/或诊断炎性关节疾病和/或监测治疗的功效和/或是否需要或推荐另外治疗的方法对于熟练的业内人士来说是显而易见的。例如，在治疗过程中比较基线与不同时间点之间的压痛和肿胀关节的数目是用于评定关节状态和对治疗的反应的典型方式。在RA的美国风湿病学会(ACR)关节计数(Felson等Arthritis&Rheumatology 38： 727-735，1995)中，针对压痛评定68个关节并且针对肿胀评定66个关节(没有评定髋的肿胀)。在欧洲最初采用的疾病活动度评分(DAS)中， 44或28个关节计数用于RA中。除关节计数外，ACR评估标准包括以下要素以便包括综合得分：患者整体(在视觉模拟量表[VAS]上)、患者疼痛、医师整体、健康评定问卷(HAQ；功能测度)、急性期反应物 (C反应蛋白或沉降速度)。ACR 20反应将构成压痛和肿胀关节计数的 20％改善和综合标准中的其它5个要素中的至少3个的20％改善。 ACR 50和70反应表示这些要素的至少50％和70％改善。ACR系统仅表示变化，而DAS系统表示疾病活动度的当前状态和变化二者。DAS评分系统使用来源于RA中的临床试验的加权数学公式。例如， DAS 28是0.56(T28)+0.28(SW28)+0.70(Ln ESR)+0.014GH，其中T表示压痛关节数目，SW是肿胀关节数目，ESR是红细胞沉降速度，并且GH是整体健康。DAS的不同值表示高或低疾病活动度以及缓和，并且变化和终点得分导致通过反应的程度(无、中度、良好)来分类患者。

如本文使用，“类风湿性关节炎”是指可以根据针对类风湿性关节炎的分类的2000年修订的美国风湿病协会标准或任何类似标准来诊断的公认的疾病状态。RA的生理指标包括，对称关节肿胀，其是特征性的但不是在类风湿性关节炎中不变的。手的近端指间(PIP)关节和掌指(MCP)、腕、肘、膝、踝以及跖趾(MTP)关节的梭形肿胀是通常受影响的并且肿胀容易检测到。被动运动时的疼痛是用于关节炎症的最敏感的测试，并且炎症和结构变形经常限制受影响的关节的运动范围。典型的可见变化包括MCP关节处的手指的尺骨偏移、MCP和 PIP关节的过伸或过屈、肘的屈曲挛缩、以及腕骨和脚趾的半脱位。患有类风湿性关节炎的受试者可能会或可能不对DMARD具有抗性，因为DMARD在治疗症状中不是有效的或不是完全有效的。此外，所述受试者可能已经经历由于毒性或功效不足所致的对用TNF抑制剂(如依那西普、英夫利昔单抗和/或阿达木单抗)(例如，一周两次每次25mg的依那西普持续3个月，或至少4次输注3mg/kg的英夫利昔单抗)和/或抗-CD20疗法(例如，利妥昔单抗)实施的先前或当前治疗的不充分反应。

类风湿性关节炎还可以通过自身抗体例如，类风湿因子(结合IgG 的抗体)和/或抗环瓜氨酸肽和/或异质核内核糖核蛋白A2(RA33)和/ 或II型胶原和/或应激蛋白(例如，BiP或hsp90)和/或葡萄糖6-磷酸异构酶(GPI)的存在来诊断。

“银屑病性关节炎”或“PsA”是以皮肤的炎症(银屑病)和关节的炎症(关节炎)为特征的慢性疾病。银屑病的特征是皮肤炎症的具有鳞状物的斑快、隆起的红色区域，并且经常影响肘和膝的顶端、头皮、肚脐、以及生殖器区域或肛门的周围区域。大约10％的患有银屑病的患者还发展有他们关节的相关炎症。患有炎性关节炎和银屑病二者的患者被诊断为患有银屑病性关节炎。银屑病性关节炎是全身性风湿性疾病，其还可以引起远离关节和皮肤的身体组织(如眼睛、心脏、肺、以及肾)中的炎症。

“强直性脊椎炎”或“AS”是脊柱和骶髂关节的慢性炎症的一种形式，所述骶髂关节位于下背部骶骨(在尾骨正上方的骨)与髂骨(上臀部的任一侧上的骨)接触的地方。这些区域中的慢性炎症引起脊柱中和脊柱周围的疼痛和僵硬。随时间推移，慢性脊柱炎症(脊椎炎)可能导致椎骨完全粘合在一起(融合)，这是被称为关节强直的一个过程。关节强直导致脊柱的活动度损失。强直性脊椎炎还是全身性风湿性疾病，这意味着它会影响整个身体的其它组织。因此，它可能引起远离脊柱的其它关节以及其它器官(如眼睛、心脏、肺、以及肾)中的炎症或对它们的损伤。

MPC或子代细胞，和由其得到的上清液或一种或多种可溶性因子

MPC为在骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾、胰、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮以及骨膜中发现的细胞；并且能够分化成生殖系，如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。

在一个实施例中，MPC是多能细胞，其能够分化成大量细胞类型，包括但不限于脂肪组织、骨组织、软骨组织、弹性组织、肌肉组织、以及纤维结缔组织。这些细胞所进入的特定谱系决定和分化路径取决于来自机械影响和/或内源性生物活性因子(如生长因子、细胞因子)和/或由宿主组织建立的局部微环境条件的各种影响。为多能细胞的MPC因此是非造血祖细胞，其分裂产生子细胞，所述子细胞为干细胞或适时不可逆分化产生表型细胞的前体细胞。

MPC对于标志物STRO-1呈阳性(即MPC是STRO-1⁺细胞)。

在一个实施例中，STRO-1⁺细胞是从由受试者(例如欲治疗的受试者或相关受试者或不相关受试者(无论是相同物种抑或不同物种))获得的样本富集而来。术语“富含”或其变形在本文中用于描述一种细胞群体，其中当与细胞的未处理群体(例如处于天然环境中的细胞)相比较时，一种特定细胞类型的比例或者多种特定细胞类型的比例增加。在一个实施例中，富含STRO-1⁺细胞的群包含至少约0.1％或0.5％或 1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％的 STRO-1⁺_细胞。在这方面，术语“富含STRO-1⁺细胞的细胞群”将被理解为为术语“包含X％STRO1⁺细胞的细胞群”提供明确的支持，其中 X％是本文列举的百分比。在某些实施例中，STRO-1⁺细胞可以形成无性系的集落，例如，CFU-F(成纤维细胞)或其亚群(例如50％或60％或70％或70％或90％或95％)可以具有这种活性。

在一个实施例中，细胞群是富含包含处于可选择的形式的 STRO-1⁺细胞的细胞制剂。在这方面，术语“可选择的形式”将被理解为意指细胞表达允许选择STRO-1⁺细胞的标志物(例如，一种细胞表面标志物)。标志物可以是STRO-1，但不一定是。例如，如本文描述的和/或例证的，表达STRO-2和/或STRO-3(TNAP)和/或STRO-4和/ 或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的细胞(例如MPC)也表达 STRO-1(并且可以是STRO-1^亮)。因此，表明细胞是STRO-1⁺并不一定意指细胞由STRO-1表达来选择。在一个实施例中，细胞是基于至少表达STRO-3来选择，例如，它们是STRO-3⁺(TNAP⁺)。

提及选择细胞或其群不需要从特定的组织来源进行选择。如本文描述的，STRO-1⁺细胞可以是从种类繁多的来源中进行选择或分离或富集的。也就是说，在某些实施例中，这些术语为从任何包含STRO-1⁺细胞(例如，MPC)的组织或血管化组织或包含周细胞(例如STRO-1⁺周细胞)的组织或本文描述的组织中的任何一种或多种中进行选择提供支持。

在一个实施例中，本发明中所使用的细胞表达一种或多种个别地或全体选自由以下组成的组的标志物：TNAP⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、 STRO-2⁺、CD45⁺、CD146⁺、3G5⁺或其任何组合。

“个别地”指本发明独立地涵盖所述标志物或标志物组，以及虽然个别标志物或标志物组可能未独立地在本文中列出，但随附权利要求书仍可彼此独立地和分开地定义所述标志物或标志物组。

“全体”指本发明涵盖任何数量的所述标志物或肽组或其组合，以及虽然所述数量的标志物或标志物组或其组合可能未在本文中具体列出，但随附权利要求书仍可将所述组合或子组合与标志物或标志物组的任何其它组合独立地和分开地定义。

例如，STRO-1⁺细胞是STRO-1^亮(同义词STRO-1^亮)。在一个实施例中，相对于STRO-1^暗或STRO-1^中间细胞，Stro-1^亮细胞优先富集。

例如，STRO-1^亮细胞另外是TNAP⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺和/或CD146⁺中的一种或多种。例如，细胞是为一种或多种的前述标志物而选择和/或显示表达一种或多种前述标志物。在这方面，显示表达标志物的细胞不需要被特别地测试，而是可以测试预先富集或分离的细胞并且随后使用，可以合理地假设分离的或富集的细胞也表达同样的标志物。

在一个实施例中，间充质前体细胞是如WO 2004/85630中所定义的血管周围间充质前体细胞。例如，间充质前体细胞表达血管周围细胞的标志物，例如，所述细胞是STRO-1⁺或STRO-1^亮和/或3G5⁺。在一个实施例中，所述细胞是或之前是从血管化组织或器官或其部分分离的细胞的子代。

对于指定标志物称为“阳性”的细胞，其可能根据标志物存在于细胞表面上的程度而表达低(低或暗)或高(亮、亮)水平的所述标志物，其中所述术语涉及细胞分选过程中所用的荧光或其它标志物的强度。低(或暗或深)和亮的区别应放在所分选特定细胞群体上所用的标志物的情形中加以理解。对于指定标志物称为“阴性”的细胞不一定完全不存在于所述细胞。所述术语指细胞表达所述标志物的水平相对极低，并且当在可检测标记时产生极低信号或者在背景水平以上不可检测，例如使用同种型对照抗体检测到的水平。

当在本文中使用时，术语“亮”是指细胞表面上的标志物在可检测标记时产生相对较高的信号。虽然不希望受理论限制，但提出“亮”细胞所表达的靶标志物蛋白(例如由STRO-1识别的抗原)比样本中的其它细胞多。例如，当用缀合FITC的STRO-1抗体标记时，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析所测定的STRO-1^亮细胞产生比非亮细胞 ((STRO-1^深/暗)高的荧光信号。例如，“亮”细胞构成起始样本中所含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％。在其它实施例中，“亮”细胞构成起始样本中所含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％或至少约2％。在一个实施例中，STRO-1^亮细胞的STRO-1表面表达相对于“背景”(即STRO-1-细胞) 具有2个对数量级以上的表达。相比之下，STRO-1^暗和/或STRO-1^中间细胞的STRO-1表面表达与“背景”相比具有小于2个对数量级的表达，通常与“背景”相比约1个对数以下。

如本文所用，术语“TNAP”意欲涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有亚型。例如，所述术语涵盖肝亚型(LAP)、骨亚型(BAP)和肾亚型 (KAP)。在一个实施例中，TNAP是BAP。在一个实施例中，如本文所用的TNAP是指可以结合由2005年12月19日根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定以保藏编号PTA-7282保藏于ATCC的杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子。

此外，在一个实施例中，STRO-1⁺细胞能够产生克隆CFU-F。

在一个实施例中，大比例的STRO-1⁺多能细胞优选能够分化成至少两种不同生殖系。多能细胞可以发展成的谱系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞，其具有胆道上皮细胞和肝细胞的多潜能；神经限制细胞，其可以产生会发展成少突胶质细胞和星形胶质细胞的神经胶质细胞前体；神经元前体，其会发展出神经元；心肌和心肌细胞、葡萄糖反应性胰岛素分泌胰腺β细胞系的前体。其它谱系包括但不限于成牙质细胞、牙质产生细胞和软骨细胞，以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞(如角化细胞)、树突状细胞、毛囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在另一个实施例中，STRO-1⁺细胞在培养时不能产生造血细胞。

在一个实施例中，细胞是取自欲治疗的受试者，使用标准技术在体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩增细胞以自体或同种异体组合物形式施用至受试者。在可选实施例中，使用一种或多种已建立的人细胞系的细胞。在本发明的另一适用实施例中，使用非人动物的细胞(或者如果患者不是人，而来自于另一物种)。

本发明还涵盖使用由自体外培养物产生的STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞(后者也称为扩增细胞)获得或得到的上清液或可溶性因子。本发明的扩增细胞根据培养条件(包括培养基中刺激因子的数量和/或类型)、传代次数等可以具有多种表型。在某些实施例中，子代细胞是在从亲本群体传代约2次、约3次、约4次、约5次、约6次、约 7次、约8次、约9次或约10次后获得。然而，子代细胞可以在从亲本群体传代任何次后获得。

子代细胞可以通过在任何适合培养基中培养而获得。如本文在提及细胞培养时使用的术语“培养基”包括细胞周围环境的组分。培养基可以是固体、液体、气态或相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不供养细胞生长的液体培养基。培养基也包括胶状培养基，如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性气态培养基包括在皮氏培养皿(petri dish)或其它固体或半固体支持物上生长的细胞所暴露的气相。术语“培养基”也指意欲用于细胞培养中的材料，即使其尚未与细胞接触。换句话说，制备用于细菌培养的富营养液体是培养基。当与水或其它液体混合时变得适于细胞培养的粉末混合物可称为“粉状培养基”。

在一个实施例中，适用于本发明方法的子代细胞是通过使用经过 STRO-3抗体标记的磁性珠粒从骨髓分离TNAP⁺STRO-1⁺细胞，并接着培养扩增所分离的细胞来获得(关于适合培养条件的实例，请参见 Gronthos等Blood 85：929-940，1995)。

在一个实施例中，所述扩增细胞(子代)(例如，至少在5次传代后)可以是TNAP^-、CC9⁺、I类HLA⁺、II类HLA^-、CD14^-、CD19^-、 CD3^-、CD11a^-c^-、CD31^-、CD86^-、CD34^-和/或CD80^-。然而，在与本文所述不同的培养条件下，不同标志物的表达有可能会变化。此外，虽然具有这些表型的细胞可以在扩增细胞群中占优势，但这并不意指较小比例的细胞不具有这一种或多种表型(例如，小百分比的扩增细胞可以是CC9^-)。在一个实施例中，扩增细胞仍具有分化成不同细胞类型的能力。

在一个实施例中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩增细胞群包含其中至少25％(例如至少50％)的细胞是CC9⁺的细胞。

在另一个实施例中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩增细胞群包含其中至少40％(例如至少45％)的细胞是STRO-1⁺的细胞。

在另一实施例中，扩增细胞可表达一种或多种全体或个别地选自由以下组成的组的标志物：LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择蛋白、L-选择蛋白、3G5、CD49a/CD49b/CD29、 CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD 90、CD29、CD18、CD61、整联蛋白β6-19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、 IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R(STRO-2＝瘦素-R)、RANKL、 STRO-1^亮和CD146或这些标志物的任何组合。

在一个实施例中，子代细胞是如WO 2006/032092中所定义和/ 或所述的多能扩增STRO-1⁺多能细胞子代(MEMP)。制备可用于得到子代的STRO-1⁺多能细胞的富集群体的方法描述于WO 01/04268和 WO 2004/085630中。在体外情形中，STRO-1⁺多能细胞极少以绝对纯制备物形式存在，而是一般与作为组织特异性定向细胞(TSCC)的其它细胞一起存在。WO01/04268提出以约0.1％至90％的纯度水平从骨髓采集所述细胞。包含可得到子代的MPC的群体可直接从组织来源采集，或者其可为已在离体扩增的群体。

例如，子代可获自大致上纯化的STRO-1⁺多能细胞的已采集且未扩增的群体，其构成其所存在的群体总细胞的至少约0.1％、1％、5％、 10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或95％。此水平可以通过例如选择对至少一种个别地或全体选自由TNAP、STRO-1^亮、 3G5⁺、VCAM-1、THY-1、CD146和STRO-2组成的组的标志物呈阳性的细胞来实现。

MEMPS与新鲜采集的STRO-1⁺多能细胞的区别之处可在于其对于标志物STRO-1^亮呈阳性且对于标志物碱性磷酸酶(ALP)呈阴性。相比之下，新鲜分离的STRO-1⁺多能细胞对于STRO-1^亮和ALP两者都呈阳性。在本发明的一个实施例中，至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的所施用细胞具有表型STRO-1 ^亮、ALP^-。在另一实施例中，MEMPS对于标志物Ki67、CD44和/或 CD49c/CD29、VLA-3、α3β1中的一种或多种呈阳性。在另一实施例中，MEMP不显示TERT活性和/或对于标志物CD18呈阴性。

STRO-1⁺细胞起始群体可源自WO 01/04268或WO 2004/085630 中所述的任一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或许更广泛来说来自脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰、骨、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌。

应理解，在进行本发明时，带有任何指定细胞表面标志物的细胞的分离可以通过多种不同方法来实现，然而，示例性方法依赖于结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)与所关注的标志物的结合，随后分离显示结合(为高水平结合抑或低水平结合)或不结合的那些细胞。最适宜的结合剂为抗体或基于抗体的分子，其中示例性方法为单克隆抗体或是基于单克隆抗体，因为这些后者试剂具有特异性。抗体在两个步骤中都可以使用，然而也可以使用其它试剂，因此这些标志物的配体也可以用于富集带有所述标志物或缺乏所述标志物的细胞。

抗体或配体可连接至固体支持物以允许粗分离。示例性分离技术最大程度地保持欲收集的部分的活力。具有不同功效的各种技术可用于获得相对较粗的分离。所用特定技术将取决于分离效率、相关细胞毒性、执行的容易性和速度，以及复杂设备和/或技术技能的必要性。分离程序可包括但不限于使用涂有抗体的磁性珠粒的磁性分离、亲和色谱和利用连接至固体基质的抗体的“淘选”。提供精确分离的技术包括但不限于FACS。执行FACS的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

针对本文所述的各标志物的抗体可商购获得(例如抗STRO-1的单克隆抗体可从R&D Systems，USA商购获得)、从ATCC或其它保藏组织获得和/或可使用业内公认的技术产生。

用于分离STRO-1⁺细胞的示例性方法例如包括第一步骤，其为利用例如识别STRO-1的高水平表达的磁性活化细胞分选(MACS)的固相分选步骤。接着必要时可进行第二分选步骤以得到更高水平的前体细胞表达，如专利说明书WO 01/14268中所述。此第二分选步骤可能涉及使用两种或更多种标志物。

获得STRO-1⁺细胞的方法还可能包括使用已知技术进行第一富集步骤之前采集细胞来源。因此，组织将以手术方式移除。接着将构成来源组织的细胞分离为所谓单细胞悬浮液。此分离可以通过物理和或酶学方式达成。

一旦获得了适合的STRO-1⁺细胞群体，就可以通过任何适合方式对其进行培养或扩增以获得MEMP。

在一个实施例中，细胞是取自欲治疗的受试者，使用标准技术在体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩增细胞以自体或同种异体组合物形式施用至受试者。在可选实施例中，使用一种或多种已建立的人细胞系的细胞来获得上清液或可溶性因子。在本发明的另一适用实施例中，使用非人动物的细胞(或者如果患者不是人，则来自另一物种)来获得上清液或可溶性因子。

本发明可以使用来自任何非人动物物种的细胞加以实施，包括但不限于非人灵长类动物细胞、有蹄类动物、犬科动物、猫科动物、兔类动物、啮齿动物、鸟类动物和鱼类动物细胞。可用于实施本发明的灵长类动物细胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、食蟹猕猴和任何其它新世界或旧世界猴类的细胞。可用于实施本发明的有蹄类动物细胞包括但不限于牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛的细胞。可用于实施本发明的啮齿动物细胞包括但不限于小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠和沙鼠细胞。可用于实施本发明的兔类动物物种的实施例包括家兔、长腿大野兔、野兔、棉尾兔、雪地兔和鼠兔。鸡(原鸡(Gallus gallus))为可用于实施本发明的鸟类物种的一个实例。

适用于本发明方法的细胞在使用前或获得上清液或可溶性因子前可储存。保藏和储存真核细胞和尤其哺乳动物细胞的方法和方案在本领域中是已知的(参见例如Pollard，J.W.和Walker，J.M.(1997) Basic Cell Culture Protocols，第二版，Humana Press，Totowa，N.J.； Freshney，R.I.(2000)Culture of Animal Cells，第四版，Wiley-Liss，Hoboken，N.J.)。维持所分离的干细胞(如间充质干细胞/祖细胞)或其子代的生物活性的任何方法都可以结合本发明来使用。在一个实施例中，通过使用低温保藏来维持和储存细胞。

遗传修饰的细胞

在一个实施例中，对STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞进行遗传修饰，例如，以表达和/或分泌相关蛋白质。例如，细胞被工程改造来表达在治疗炎性关节疾病中有用的蛋白质，如抗TNF抗体(例如，阿达木单抗或英夫利昔单抗)或抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗或奥瑞珠单抗(ocrelizumab))或可溶性TNF受体(例如，依那西普)或适用于治疗此类病状的肽(例如，如US5837686所描述的)。

遗传修饰细胞的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。例如，使欲在细胞中表达的核酸可操作地连接至用于在细胞中诱导表达的启动子。例如，将核酸连接至可在受试者的多种细胞中可操作的启动子，如病毒启动子，例如CMV启动子(例如CMV-IE启动子)或 SV-40启动子。其它适合启动子在本领域中是已知的并且应理解为在作了必要修改的情况下适用于本发明的实施例。

例如，核酸以表达构建体的形式提供。如本文所用，术语“表达构建体”是指具有在细胞中将表达赋予到可操作地连接的核酸(例如报道基因和/或可反选择的报道基因)的能力的核酸。在本发明的上下文中，应了解，表达构建体可包含或为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段或能够以可表达格式维持和/或复制异源 DNA的其它核酸。

构建适用于实施本发明的表达构建体的方法对于本领域的技术人员来说将是显而易见的并且描述于以下文献中：例如Ausubel等 (见：Current Protocols in MolecularBiology.Wiley Interscience，ISBN 047 150338，1987)或Sambrook等(见：MolecularCloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratories，New York，第三版2001)。例如，使用例如PCR从适合模板核酸扩增表达构建体的各组分并随后克隆至适合的表达构建体(如质粒或噬菌粒) 中。

适于所述表达构建体的载体是本领域已知的和/或在本文中描述。例如，适于哺乳动物细胞中的本发明方法的表达载体是例如由 Invitrogen供应的pcDNA载体套装的载体、pCI载体套装的载体 (Promega)、pCMV载体套装的载体(Clontech)、pM载体(Clontech)、pSI载体(Promega)、VP 16载体(Clontech)或pcDNA载体套装的载体 (Invitrogen)。

本领域的技术人员将认识到另外载体和所述载体的来源，例如像 LifeTechnologies Corporation、Clontech或Promega。

用于将分离的核酸分子或包含所述核酸的基因构建体引入细胞中用于表达的方式对于本领域的技术人员来说是已知的。用于指定生物体的技术取决于已知的成功技术。用于将重组DNA引入细胞中的方式包括显微注射、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体(如使用lipofectamine(Gibco，MD，USA)和/或cellfectin(Gibco，MD，USA))介导的转染、PEG介导的DNA吸收、电穿孔和微粒轰击(如使用涂有DNA 的钨粒子或金粒子(Agracetus Inc.，WI，USA))以及其它方式。

或者，本发明的表达构建体是病毒载体。适合病毒在本领域中是已知的并且可商购获得。用于递送核酸和使所述核酸整合至宿主细胞基因组中的常规基于病毒的系统包括例如逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。或者，腺病毒载体适用于将保持游离形式的核酸引入宿主细胞中。病毒载体为靶细胞和组织中基因转移的有效且通用的方法。另外，已在多种不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。

例如，逆转录病毒通常包含包装能力高达6-10kb外来序列的顺式作用长末端重复(LTR)。最小顺式作用LTR就足以用于载体的复制和包装，其接着用于将表达构建体整合至靶细胞中以提供长期表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于以下病毒的载体：鼠类白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SrV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和其组合(参见例如Buchscher等，J Virol. 56：2731-2739(1992)；Johann等，J.Virol.65：1635-1640(1992)； Sommerfelt等，Virol.76：58-59(1990)；Wilson等，J.Virol.63：274-2318 (1989)；Miller等，J.Virol.65：2220-2224(1991)；PCT/US94/05700； Miller和Rosman BioTechniques 7：980-990，1989；Miller，A.D.Human GeneTherapy 7：5-14，1990；Scarpa等Virology 75：849-852，1991；Bums 等Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：8033-8037，1993)。

已开发各种腺相关病毒(AAV)载体系统用于核酸递送。AAV载体可以使用本领域中已知的技术容易地构建。参见例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公布号WO 92/01070和WO 93/03769； Lebkowski等Molec.Cell.Biol.5：3988-3996，1988；Vincent等(1990) Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter CurrentOpinion in Biotechnology 5：533-539，1992；Muzyczka.Current Topics in Microbiol，and Immunol.158：97-129，1992；Kotin，Human Gene Therapy 5：793-801，1994；Shelling和Smith Gene Therapy 7：165-169，1994；和 Zhou等J Exp.Med. 179：1867-1875，1994。

适用于递送本发明的表达构建体的其它病毒载体包括例如来源于痘病毒家族的载体，如牛痘病毒和禽痘病毒或α病毒或缀合病毒载体(例如Fisher-Hoch等，Proc.NatlAcad.Sci.USA 56：317-321，1989中所述的载体)。

测定细胞和可溶性因子的治疗/预防潜能

用于确定细胞或可溶性因子治疗或预防或延迟炎性关节疾病的发病或进展的能力的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

例如，类风湿性关节炎的体外模型描述于Schultz等，Arthritis andRheumatism，40：1420-1428，1997中并且涉及在3维纤维蛋白基质中培养来自患有关节炎的受试者的滑膜和关节软骨外植体或滑膜细胞和软骨细胞。将本文所述的细胞和或可溶性因子施用至所述培养物允许(例如)通过评定蛋白水解酶的表达、软骨细胞基质构造、基质降解或细胞数目来确定所述细胞/因子的治疗/预防功效。

关节炎的另一体外模型涉及在存在TNF-α和/或IL-1β的情况下培养软骨盘与滑膜成纤维细胞。将本文所述的细胞和或可溶性因子施用至所述培养物允许(例如)通过评定蛋白水解酶的表达、胶原基质构造、基质降解、或促炎性细胞因子水平(例如，IL-6和/或IL-8)或细胞数目来确定所述细胞/因子的治疗/预防功效。

在另一个实施例中，在类风湿性关节炎的体外模型，例如小鼠的 SKG株(Sakaguchi等，Nature，426：454-460)、大鼠II型胶原关节炎模型、小鼠II型胶原关节炎模型或几种物种的抗原诱导的关节炎模型 (Bendele J Musculoskel Neuron Interact2001；1(4)：377-385)中评定本文所述的细胞和/或可溶性因子的功效。诸位发明人还已经证明类风湿性关节炎的绵羊模型。

强直性脊椎炎的动物模型也是本领域中已知的，并且包括涉及使用聚集蛋白聚糖和/或多功能蛋白聚糖balb/c使小鼠免疫、过表达白细胞抗原-B27的ank/ank小鼠大鼠的模型。

根据前文本领域的技术人员将清楚的是，本发明还提供一种用于鉴别或分离用于治疗、预防或延迟其炎性关节疾病的细胞或可溶性因子的方法，所述方法包括：

(i)对患有炎性关节疾病的测试受试者施用细胞或可溶性因子并且评定受试者的关节中的炎症；

(ii)将(i)的受试者关节中的炎症水平与患有所述炎性关节疾病但未施用所述细胞或可溶性因子的对照受试者关节中的炎症水平进行比较，其中与对照受试者相比，测试受试者的关节炎症减少表明所述细胞或可溶性因子治疗、预防或延迟炎性关节疾病。

本发明还提供一种用于鉴别或分离用于治疗、预防或延迟其炎性关节疾病的细胞或可溶性因子的方法，所述方法包括：

(i)接触炎性关节疾病的测试体外模型并且确定所述模型中炎症的一种或多种标志物的水平；

(ii)确定未施用所述细胞或可溶性因子的炎性关节疾病的对照体外模型中炎症的一种或多种标志物的水平，其中与对照模型相比，测试模型中炎症的标志物水平降低表明所述细胞或可溶性因子治疗、预防或延迟炎性关节疾病。

炎症的示例性标志物包括蛋白水解酶的表达、胶原基质构造、基质降解、促炎性细胞因子水平(例如，IL-6和/或IL-8)或炎性细胞数目。

所述细胞可以是本文根据任何实施例描述的任何细胞。

细胞组合物

在本发明的一个实例中，STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞是以组合物形式施用。例如，所述组合物包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

术语“载体”和“赋形剂”是指在本领域中常规用于促进活性化合物的储存、施用和/或生物活性的物质的组合物(参见，例如， Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Mac Publishing Company(1980)。载体还可以减少活性化合物的任何不良副作用。适合的载体是(例如)稳定的，例如，不能与载体中的其它成分反应。在一个实施例中，载体在用于治疗所采用的剂量和浓度下不会在接受者体内产生显著的局部或全身性有害作用。

用于本发明的适合的载体包括常规使用的那些，例如水、盐水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(Ringer′s solution)、缓冲溶液、透明质酸以及二醇是示例性液体载体，特别是(当等渗时)溶液的载体。适合的药用载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

在另一个实施例中，载体是介质组合物，例如细胞在其中生长或悬浮的介质组合物。例如，所述介质组合物不在其所施用的受试者中诱导任何不良作用。

示例性介质和赋形剂不会不利地影响细胞活力和/或细胞减少、预防或延迟炎性关节疾病的能力。

在一个实施例中，载体和赋形剂提供缓冲活性以使细胞和/或可溶性因子维持在适合的pH下，以便由此发挥生物活性，例如，载体或赋形剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS代表一种有吸引力的载体或赋形剂，因为其与细胞和因子相互作用的程度最低并且允许快速释放细胞和因子，在这种情况下，本发明的组合物可以被产生为用于(例如)通过注射直接应用至血流或组织或围绕组织或与组织相邻的区域中的液体。

STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞还可以并入或包埋于与接受者相容并且降解为对接受者无害的产物的支架中。这些支架提供对待移植到接受受试者体内的细胞的支持和保护。天然和/或合成生物可降解性支架是所述支架的实例。

多种不同的支架可以成功地用于实践本发明。示例性支架包括但不限于生物可降解的支架。天然生物可降解支架包括胶原、纤连蛋白以及层连蛋白支架。用于细胞移植支架的适合的合成材料应能够支持广泛细胞生长和细胞功能。所述支架还可以是可再吸收的。适合的支架包括聚乙醇酸支架，例如，如由Vacanti等，J.Ped.Surg.23：3-91988； Cima等，Biotechnol.Bioeng.38：1451991；Vacanti等，Plast.Reconstr. Surg.88：753-91991所描述的；或合成聚合物如聚酸酐、聚原酸酯以及聚乳酸。

在另一个实施例中，细胞可以在凝胶支架(如来自Upjohn公司的 Gelfoam)中施用。

适用于本文所述的方法的细胞组合物可以单独施用或作为与其它细胞的混合物施用。可以结合本发明的组合物施用的细胞包括但不限于其它多效或多能细胞或干细胞，或骨髓细胞。不同类型的细胞可以在临施用前或施用前不久与本发明的组合物混合，或其可以在施用前一起共培养一段时间。

在一个实施例中，所述组合物包含有效量的或治疗或预防有效量的细胞。例如，所述组合物包含约1×10⁵个STRO-1⁺细胞/kg至约1×10⁷个STRO-1⁺细胞/kg或约1×10⁶个STRO-1⁺细胞/kg至约5×10⁶个 STRO-1⁺细胞/kg。待施用的细胞的确切量取决于多种因素，包括患者的年龄、体重以及性别、以及所述炎性关节疾病的范围和严重度。

在一个实施例中，将低剂量的细胞施用至受试者。示例性剂量包含每千克约0.1×10⁴至约0.5×10⁶之间个细胞，例如每千克约0.1×10⁵至约0.5×10⁶之间个细胞，如每千克约0.5×10⁵至约0.5×10⁶之间个细胞，例如每千克约0.1×10⁶至约0.5×10⁶之间个细胞，例如，每千克约 0.2×10⁶或0.3×10⁶或0.4×10⁶个细胞。

在一个实施例中，将高剂量的细胞施用至受试者。示例性剂量包含至少约1.5×10⁶个细胞/kg。例如，高剂量包含约1.5×10⁶至约6×10⁶之间个细胞/kg，如约1.5×10⁶至约5×10⁶之间个细胞/kg，例如约 1.5×10⁶至约4×10⁶之间个细胞/kg，例如，约1.5×10⁶至约3×10⁶之间个细胞/kg。例如，高剂量包含约1.5×10⁶或约2×10⁶个细胞/kg。

在一个实施例中，细胞作为总细胞数目剂量施用，不考虑患者的体重。

例如，在一个实施例中，细胞是以约1亿至3亿之间个细胞的剂量施用，不考虑患者的体重。

例如，在一个实施例中，细胞是以约1亿至2亿之间个细胞的剂量施用，不考虑患者的体重。

在一个实施例中，细胞是以约1亿个细胞的剂量施用，不考虑患者的体重。

在一个实施例中，细胞是以约1.5亿个细胞的剂量施用，不考虑患者的体重。

在一个实施例中，细胞是以约2亿个细胞的剂量施用，不考虑患者的体重。

在一个实施例中，细胞是以约3亿个细胞的剂量施用，不考虑患者的体重。

在一些实施例中，细胞是含于不允许细胞离开进入受试者循环中，然而允许由细胞分泌的因子进入循环中的腔室中。以此方式，可通过允许细胞分泌因子进入受试者循环中来向受试者施用可溶性因子。所述腔室同样可植入受试者的某一部位以增加可溶性因子的局部水平，例如在胰腺中或其附近植入。

在本发明的一些实施例中，可不必或不需要在起始细胞组合物疗法前对患者进行免疫抑制。因此，移植同种异体或者甚至异种的 STRO-1⁺细胞或其子代在一些情况下可能是耐受的。

然而，在其它情况下，在起始细胞疗法前以药理学方式对患者进行免疫抑制和/或针对细胞组合物减少受试者的免疫反应可能是需要或适当的。这可以通过使用全身性或局部免疫抑制剂来实现，或者这可以通过在囊封装置中递送细胞来实现。细胞可以囊封在细胞所需要的营养物和氧以及治疗因子可透过，而细胞不可透过的胶囊中来免疫体液因子和细胞。例如，囊封剂具有低变应原性，容易地且稳定地位于靶组织中，并且对所植入的结构提供附加保护。降低或消除对移植细胞的免疫反应的这些和其它方式在本领域中是已知的。作为替代，可对细胞进行遗传修饰以降低其免疫原性。

可溶性因子的组合物

在本发明的一个实例中，由STRO-1⁺细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子是以(例如)包含适合的载体和/或赋形剂的组合物形式施用。例如，所述载体或赋形剂不会不利地影响可溶性因子或上清液的生物学作用。

在一个实施例中，所述组合物包含稳定可溶性因子或上清液组分 (例如蛋白酶抑制剂)的物质的组合物。例如，所包括的蛋白酶抑制剂的量不足以对受试者产生不良影响。

包含由STRO-1⁺细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子的组合物可以被制备为适当的液体悬浮液，例如，在培养基或在稳定载体或缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)中的悬浮液。适合的载体在上文中进行描述。在另一个实施例中，包含由STRO-1⁺细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子的悬浮液是用于注射的油性悬浮液。适合的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油；或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。待用于注射的悬浮液还可以含有增加悬浮液的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有适合的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。

可以通过在具有上述的成分之一或其组合的适当溶剂中并入所需量的上清液或可溶性因子，根据需要随后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。

一般来说，通过将上清液或可溶性因子并入含有基本分散介质和来自以上列出成分的其它所需成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，示例性制备方法是真空干燥和冷冻干燥，此举产生活性成分加来自其前述无菌过滤溶液的任何另外所需成分的粉末。根据本发明的替代方面，上清液或可溶性因子可以与增强它的溶解度一种或多种另外化合物一起配制。

其它示例性载体或赋形剂描述于以下文献中：例如Hardman等， (2001)Goodman和Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics， McGraw-Hill，New York，N.Y.；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams以及Wilkins， New York，N.Y.；Avis等，(编著)(1993)Pharmaceutical DosageForms： Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman等，(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker，NY；Lieberman 等，(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems， Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.。

治疗性组合物通常应无菌并且在制造和储存条件下稳定。组合物可以被配制为溶液、微乳液、脂质体、或其它有序结构。载体可以是含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、以及液体聚乙二醇等)、以及其适合的混合物的溶剂或分散介质。可以(例如)通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，需要的是在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射的组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬酯酸盐和明胶)来达成。此外，可溶性因子可以在时间释放制剂中施用，例如在包含缓慢释放聚合物的组合物中施用。活性化合物可用将保护化合物免于快速释放的载体进行制备，如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸以及聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制备所述制剂的多种方法已获得专利或通常为本领域的技术人员所已知。

上清液或可溶性因子可以与(例如)提供可溶性因子的缓慢释放的适当基质组合施用。

组合物的附加组分

STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性细胞因子、STRO-1⁺细胞或其子代可以与其它有益的药物或生物分子(生长因子、营养因子)一起施用。当与其它药剂一起施用时，它们可以在单一药物组合物中、或在分开的药物组合物中、与其它药剂同时或按序(在施用其它药剂之前或之后)一起施用。可以共同施用的生物活性因子包括抗细胞凋亡剂(例如EPO、EPO模拟体、TPO、IGF-I和IGF-II、HGF、半胱氨酸蛋白酶抑制剂)；消炎药(例如，p38MAPK抑制剂、TGF-β抑制剂、他汀类、IL-6和IL-1抑制剂、PEMIROLAST、TRANLAST、 REMICADE、SIROLIMUS，以及NSAID(非类固醇消炎药，例如 TEPOXALIN、TOLMETIN、SUPROFEN)；免疫抑制/免疫调节剂(例如钙调神经磷酸酶抑制剂，例如环孢素、他克莫司；mTOR抑制剂(例如，SIROLIMUS、EVEROLIMUS)；抗增生剂(例如，咪唑硫嘌呤、霉酚酸酯)；皮质类固醇(例如，泼尼松龙、氢化可的松)；抗体例如单克隆抗-IL-2α受体抗体(例如，巴利昔单抗、达克珠单抗)、多克隆抗 T细胞抗体(例如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)；抗淋巴细胞球蛋白(ALG)；单克隆抗T细胞抗体OKT3))；抗血栓形成剂(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯基丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿司匹林、双嘧达莫、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制剂和血小板抑制剂)；和抗氧化剂(例如普罗布考、维生素A、抗坏血酸、生育酚、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)，以及局部麻醉剂。

在一个实施例中，所述细胞和/或可溶性因子是与免疫抑制剂或抗炎药或DMARD或非类固醇抗炎药物一起施用。

示例性免疫抑制剂/抗炎药包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自体抗原表达、或掩蔽MHC抗原的物质。所述药剂的实例包括2- 氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利号4,665,077)、更昔洛韦、他克莫司、糖皮质激素如氢化可的松或醛甾酮、抗炎药如环氧合酶抑制剂、5-脂肪氧合酶抑制剂、或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂如硫唑嘌呤或霉酚酸酯(MMF)；烷化剂如环磷酰胺；溴隐亭；达那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649中所描述)； MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢霉素A；类固醇如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物，例如，泼尼松、甲泼尼龙，包括SOLU-甲泼尼龙琥珀酸钠，以及地塞米松；二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨蝶呤(口服或皮下)；抗疟药如氯喹和羟氯喹；柳氮磺胺吡啶；来氟米特；细胞因子拮抗剂如细胞因子抗体或细胞因子受体抗体，包括抗干扰素-α、-β、或-γ抗体、抗肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(英夫利昔单抗或阿达木单抗)、抗TNF-α免疫粘附素 (依那西普)、抗TNF-β抗体、抗白细胞介素-2(IL-2)抗体和抗IL-2受体抗体、以及抗白细胞介素-6(IL-6)受体抗体和拮抗剂；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；pan-T抗体如抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(WO 90/08187)；链激酶；转化生长因子-β(TGF-β)；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；苯丁酸氮芥；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T-细胞受体(US5114721)；T-细胞受体片段(W90/11294)；BAFF拮抗剂如BAFF抗体和BR3抗体以及zTNF4 拮抗剂；干扰T细胞辅助信号的生物剂，如抗CD40受体或抗CD40 配体(CD154)，包括针对CD40-CD40配体和CTLA4-Ig的封闭性抗体；以及T-细胞受体抗体(EP 340,109)如T10B9。本文的一些免疫抑制剂还是DMARD，如甲氨蝶呤。本文的示例性免疫抑制剂包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、来氟米特、MMF、或甲氨蝶呤。

“改善疾病的抗风湿药物”或“DMARD”的实例包括羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、甲氨蝶呤、来氟米特、依那西普、英夫利昔单抗(加口服和皮下甲氨蝶呤)、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金盐(口服)、金盐(肌肉内)、米诺环素、环孢霉素(包括环孢霉素A和局部环孢霉素)、葡萄球菌蛋白A，包括其盐和衍生物等。在一个实施例中，所述DMARD是甲氨蝶呤。

“非类固醇抗炎药物”或“NSAID”的实例包括阿司匹林、乙酰水杨酸、布洛芬、氟比洛芬、萘普生、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、保泰松、双氯芬酸、酮洛芬、扑炎痛、甲灭酸、甲氨蝶呤、芬布芬、阿扎丙宗；COX-2抑制剂如塞来考昔4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰-胺、伐地考昔、美洛昔康、GR 253035(Glaxo Wellcome)；以及MK966(Merck Sharp&Dohme)，包括其盐和衍生物等。

或者或另外，其它化合物是抗CD20抗体(例如，妥昔单抗或奥法木单抗)。或者或另外，其它化合物是抗CD22抗体(例如，依帕珠单抗)。或者或另外，其它化合物是抗TNF抗体(例如，英夫利昔单抗或阿达木单抗或戈利木单抗)或可溶性TNF受体(例如，依那西普)。或者或另外，其它化合物是CTLA-4拮抗剂(例如，阿巴西普 (abatacept)、CTLA4-Ig)。或者或另外，其它化合物是抗IL-6或抗IL-6R 抗体(例如，托珠单抗(tocilizumab))。

在一个实施例中，STRO-1⁺细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是作为其它治疗化合物(例如，甲氨蝶呤)的辅助和/或伴随疗法施用。

“辅助疗法”意指为先前治疗的附加或补充的治疗。

“伴随疗法”意指与另一治疗同时给予但不是另一治疗的补充治疗的治疗，例如，两种治疗可以单独地治疗风湿性疾病。

本文讨论的共同施用治疗剂或施用多于一种治疗剂不一定意指所述治疗剂是在单一组合物中施用。所述治疗剂可以在单独组合物中同时或循序施用。循序施用之间的时间可以是几天，其条件是当施用第二治疗剂时仍然存在足够水平的第一治疗剂来提供或增加第二治疗剂的治疗或预防益处。

在一个实施例中，如本文根据任何实例所描述的药物组合物包含用于治疗炎性关节疾病的化合物。或者，如本文根据任何实施方案所描述的治疗/预防方法另外包括施用用于治疗炎性关节疾病的化合物 (例如，在同一组合物或单独组合物中和/或在相同或不同时间)。示例性化合物在本文进行描述并且应理解为在作了必要的修改的情况下适用于本发明的这些实例。

在另一个实施例中，如本文根据任何实例所描述的组合物另外包含诱导或增强祖细胞分化为血管内皮细胞的因子。示例性因子包括，血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF，例如，PDGF-BB)、以及FGF。

在另一个实施例中，如本文根据任何实例所描述的组合物另外包含组织特异性定向细胞(TSCC)。在这方面，国际专利申请号 PCT/AU2005/001445证明了施用TSCC和STRO-1⁺细胞可以使得 TSCC的增殖增强。在一个实施例中，TSCC是血管细胞。对受试者施用所述组合物可以导致血管的产生增加，例如导致被递送至受影响的组织的营养成分增加。

医疗装置

本发明还提供了用于使用或当在如本文根据任何实施例描述的方法中使用时的医疗装置。例如，本发明提供包含如本文根据任何实施例描述的STRO-1⁺细胞和/或其子代和/或其可溶性因子和/或组合物的注射器或导管或其它合适的递送装置。任选地，注射器或导管与如本文根据任何实施例描述的方法的说明书一起包装。

在另一个实施例中，本发明提供包含如本文根据任何实施例描述的STRO-1⁺细胞和/或其子代和/或其可溶性因子和/或组合物的植入物。任选地，植入物与如本文根据任何实施例描述的方法的说明书一起包装。合适的植入物可以形成为具有支架，例如如上文所述，和 STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或其可溶性因子。

施用模式

由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代可以手术植入、注射、递送(例如，借助于导管或注射器)、或以其它方式直接或间接施用至需要修复或增强的部位，例如施用至关节中或关节邻近处。

在一个实施例中，由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、 STRO-1⁺细胞或其子代是递送至受试者的血流中。例如，由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代是以肠胃外方式递送。肠胃外施用的示例性途径包括但不限于腹腔内、心室内、脑室内、鞘内、动脉内、结节内或静脉内。在一个实施例中，由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代是动脉内递送至主动脉中、心脏的心房或心室中或血管中，例如，静脉内。

在细胞递送至心脏的心房或心室的情况下，可以将细胞施用至左心房或左心室以避免可能由细胞快速递送至肺引起的并发症。

在一个实施例中，例如使用注射器或通过导管或中心管线将由 STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代注射至递送部位中。

用于治疗性制剂的施用方案的选择取决于若干因素，包括实体的血清或组织周转率、症状水平以及实体的免疫原性。例如，施用方案使与可接受水平的副作用相一致的递送至患者的治疗性化合物的量达到最大。因此，所递送的制剂的量部分取决于具体实体和所治疗的病状的严重度。

在一个实施例中，由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、 STRO-1⁺细胞或其子代是以单次推注剂量来递送。或者，通过连续输注、或通过间隔为(例如)一天、一周或每周1-7次的剂量来施用由 STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代。示例性剂量方案是涉及最大剂量或避免显著不良副作用的剂量频率的方案。总每周剂量取决于所使用的化合物的类型和活性。适当剂量由临床医师例如使用本领域中已知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素来确定。一般来说，剂量始于稍小于最佳剂量的量并且在此后以较小增量增加直至相对于任何负面副作用达成所需或最佳作用。重要诊断指标包括糖尿病症状指标。

诸位发明人已经展示了在受试者中观察至少四周由STRO-1⁺细胞和/或其子代和/或其得到的可溶性因子提供的治疗益处。因此，在一些实施例中，细胞是每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次地施用。

根据本发明涉及治疗或延迟炎性关节疾病的进展的实施例，在一个实施例中，STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或其得到的可溶性因子是在(例如)使用本领域已知的和/或本文所述的标准方法诊断出病症之后施用。

对于涉及预防或延迟炎性关节疾病的发病的那些实施例， STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或其得到的可溶性因子可以在临床上诊断出病症之前施用。

患者群体

本发明的方法还适用于治疗属于患有风湿性疾病的受试者的亚群体的受试者。

在一个实施例中，受试者患有风湿性疾病，例如，类风湿性关节炎，并且对TNF抑制剂(例如，抗TNF抗体或可溶性TNF受体)反应不充分。由于毒性或功效不足，“对TNF抑制剂反应不充分”的受试者已经对使用一种或多种TNF抑制剂实施的先前或当前治疗反应不充分。在一个实施例中，此类患者已经接受(例如)一周两次每次25mg 的依那西普持续大于3个月或大于3mg/kg的英夫利昔单抗至少4次输注，但对其反应不充分。

在一个实施例中，受试者患有风湿性疾病，例如，类风湿性关节炎，并且对甲氨蝶呤反应不充分。对“对甲氨蝶呤反应不充分”的受试者是由于毒性或功效不足，已经对先前或当前甲氨蝶呤治疗反应不充分的患者。在一个实施例中，患者已经服用甲氨蝶呤(10-25mg/周)至少12周并且仍具有活动性疾病。

在一个实施例中，受试者已经接受甲氨蝶呤治疗。

在一个实施例中，受试者已经接受使用甲氨蝶呤实施的治疗并且与还未接受STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的受试者相比，施用STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子延迟抗TNF疗法的时效。

在一个实施例中，受试者患有活动性类风湿性关节炎。患有“活动性类风湿性关节炎”的受试者意指具有类风湿性关节炎的活动性而非潜伏性症状的受试者。在一个实施例中，此类患者在基线访问时具有大于6个月疾病持续时间的中度至重度活动性类风湿性关节炎。在一个实施例中，此类患者在筛选访问时将具有：(1)肿胀关节计数(SJC)＞4(66个关节计数)、(2)压痛关节计数(TJC)＞4(68个关节计数)、和/或C-反应蛋白(CRP)＞正常值上限(ULN)。

在一个实施例中，受试者患有中度活动性类风湿性关节炎或重度活动性类风湿性关节炎或中度至重度活动性类风湿性关节炎。

患有中度活动性类风湿性关节炎的个人通常具有以下症状中的至少两种或三种或四种或全部的组合：

·6与20之间个发炎关节

·通常没有除关节外的组织中的炎症

·升高的ESR或CRP水平

·阳性类风湿性因子测试或抗环瓜氨酸肽(抗CCP)抗体

·在x-射线时有炎症迹象，但无骨损害迹象

具有重度活动性类风湿性关节炎的个人通常具有以下症状中的至少两种或三种或四种或全部的组合：

·多于20个持久发炎的关节或功能性能力的迅速损失

·升高的ESR或CRP水平

·与慢性疾病相关的贫血

·较低的血白蛋白水平

·阳性风湿性因子测试，经常具有高水平

·在x-射线时有骨和软骨损害的迹象

·在除关节外的组织中的炎症

在一个实施例中，受试者具有持久活动性类风湿性关节炎。患有持久活动性类风湿性关节炎的个人具有至少6至12个月的炎症迹象，并且可能具有不可逆的关节损害和功能损失。

在一个实施例中，施用所述细胞或可溶性因子抑制结构性关节损害的进展。表达在受试者中“抑制结构性关节损害的进展”是指例如，基于侵蚀关节计数和/或关节损伤得分防止或减慢(例如)患有类风湿性关节炎的受试者由风湿性疾病引起的结构性关节损害。用于测量结构性关节损害的进展的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于，Genant修改的总夏普得分(Total Sharp Score，TSS)、侵蚀得分 (ES)、和/或关节间隙变窄(JSN)得分。在一个实施例中，本文所公开的方法另外包括例如使用本文所述的方法和/或通过X-射线来评定结构性关节损害的进展。例如，所述评定是在最后一次施用所述细胞或可溶性因子之后约1个月或3个月或6个月或12个月进行。

本发明在以下非限制性实施例中进行进一步描述。

实施例

实施例1：通过选择STRO-3⁺细胞对MPC进行免疫选择

骨髓(BM)是从健康正常的成人志愿者(20-35岁)中采集。简单地说，从髂后嵴抽吸40ml BM至含肝素锂抗凝剂的试管中。

如先前所述(Zannettino，A.C.等(1998)Blood 92：2613-2628)使用 Lymphoprep^TM(Nycomed Pharma，Oslo，Norway)通过密度梯度分离制备BMMNC。在4℃下以400×g离心30分钟后，用转移吸管移除白细胞层并在由含有5％胎牛血清(FCS；CSL Limited，Victoria，Australia) 的汉克氏平衡盐溶液(HBSS；Life Technologies，Gaithersburg，MD)构成的“HHF”中洗涤三次。

随后如先前所述(Gronthos等(2003)Journal of Cell Science 116： 1827-1835；Gronthos，S.和Simmons，P.J.(1995)Blood 85：929-940)通过磁性活化细胞分选法分离STRO-3⁺(或TNAP⁺)细胞。简单地说，在冰上将约1-3×10⁸个BMMNC在由10％(v/v)正常兔血清于HHF中组成的阻断缓冲液中孵育20分钟。在冰上将细胞与200μl的STRO-3 mAb于阻断缓冲液中的10μg/ml溶液一起孵育1小时。随后通过在 400×g下离心将细胞在HHF中洗涤两次。加入山羊抗小鼠γ-生物素 (Southern Biotechnology Associates，Birmingham，UK)于HHF缓冲液中的1/50稀释液且在冰上将细胞孵育1小时。如上将细胞在MACS 缓冲液(补充有1％BSA、5mM EDTA和0.01％叠氮化钠的无Ca²⁺且无Mn²⁺的PBS)中洗涤两次并重悬于最终体积为0.9ml的MACS缓冲液中。

将100μl抗生蛋白链菌素微珠(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach， Germany)加入细胞悬浮液中且在冰上孵育15分钟。将细胞悬浮液洗涤两次并重悬于0.5ml MACS缓冲液中且随后上样至微型MACS管柱(MS Columns，Miltenyi Biotec)上，并用0.5ml MACS缓冲液洗涤三次以回收未结合STRO-3 mAb的细胞(于2005年12月19日保藏于美国典型培养物中心(American Type Culture Collection；ATCC)，保藏编号PTA-7282-参见国际公布号WO2006/108229)。再加入1ml MACS缓冲液后，由磁体移除管柱并通过正压力分离TNAP⁺细胞。将来自各部分的细胞等分试样用抗生蛋白链菌素-FITC染色并通过流式细胞术评估纯度。

实施例2：通过STRO-3 mAb选择的细胞是STRO-1^亮细胞

设计实验以证实使用STRO-3 mAb作为用于分离细胞STRO-1^亮细胞的单一试剂的可能性。

鉴于STRO-3(IgG1)的同种型与STRO-1(IgM)的同种型不同，因此通过双色FACS分析基于与使用MACS程序分离的STRO-1⁺细胞的共表达评估STRO-3鉴定克隆CFU-F的能力(图1)。点阵直方图表示以列表模式数据形式收集的5×10⁴个事件。垂直线和水平线设定为小于用在相同条件下处理的同种型匹配对照抗体1B5(IgG)和1A6.12 (IgM)获得的平均荧光的1.0％的反应性水平。结果表明STRO-1^亮细胞的较小群体共表达TNAP(右上象限)，而其余STRO-1⁺细胞未能与STRO-3 mAb反应。随后测定所有四个象限的通过FACS分离的细胞的CFU-F发生率(表1)。

表1：通过双色FACS分析基于细胞表面标志物STRO-1和TNAP 的共表达富集人骨髓细胞(参考图1)。将FACS分选的细胞在标准克隆条件下在补充有20％FCS的α MEM中培养。数据表示铺板的每 10⁵个细胞中第14天群落形成细胞(CFU-F)的平均数±SE(n＝3个不同骨髓抽吸物)。这些数据表明人MPC仅局限于BM(其明显共表达 STRO-1抗原)的TNAP阳性部分。

骨髓部分	每10<sup>5</sup>个细胞中CFU-F的频率	富集(增加倍数)
			未分级分离的BMMNC	11.0±2.2	1.0
TNAP<sup>+</sup>/STRO-1<sup>亮</sup>	4,511±185	410
			TNAP<sup>+</sup>/STRO-1<sup>深</sup>	0.0	0.0

实施例3：STRO-1^深和Stro-1^亮细胞的相对基因和表面蛋白表达

在第一系列实验中，采用半定量RT-PCR分析来检验由通过荧光活化细胞分选法分离的STRO-1^深或STRO-1^亮群体表达的各种谱系相关基因的基因表达谱(图2A)。在第二系列实验中，采用流式细胞术和平均通道荧光分析来检验由通过荧光活化细胞分选法分离的STRO-1 ^深或STRO-1^亮群体表达的各种谱系相关蛋白质的表面蛋白表达谱。

总细胞RNA从2×10⁶个STRO-1^亮或STRO-1^深分选的原代细胞、软骨细胞沉淀和其它诱导的培养物来制备，并且使用RNAzolB提取方法(Biotecx Lab.Inc.，Houston，TX)根据制造商的建议来裂解。从各亚群体分离的RNA接着用作cDNA合成的模板，使用第一链cDNA合成试剂盒(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)进行制备。使用如前所述的标准方案(Gronthos等，J.Bone and Min.Res.14：48-57，1999)通过 PCR扩增来评定各种转录物的表达。此研究中所使用的引物组在表2 中示出。扩增后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对各反应混合物进行分析，并且通过溴化乙锭染色进行观测。通过GAPDH的表达来评定 RNA完整性。

使用ImageQant软件参考持家基因GAPDH的表达来评定各细胞标志物的相对基因表达(图2B、图2C)。另外，与STRO-1抗体组合基于多种多样的细胞谱系相关标志物的表达使用双色流式细胞分析来检验离体扩增的MPC的蛋白质表达谱。基于STRO-1^深和STRO-1 ^亮培养细胞的基因和蛋白质表达的一般表型的概述呈现于表3中。数据表明，离体扩增的STRO-1^亮MPC表现出与血管周围细胞相关的标志物(包括血管位蛋白1、VCAM-1、SDF-1、IL-1_β、TNFα以及RANKL) 的差异较高表达。STRO-1^深和STRO-1^亮培养细胞的蛋白质与基因表达谱之间的比较总结于表3和表4中。

还进行消减杂交研究以鉴别由STRO-1^亮细胞唯一表达的基因。简单地说，如上所述分离STRO-1^深和STRO-1^亮(参见图3A)。使用 RNA STAT-60系统(TEL-TEST)由从5个不同骨髓样本汇集的 STRO-1^深和STRO-1^亮细胞制备总RNA。使用SMART cDNA合成试剂盒(ClontechLaboratories)进行第一链合成。根据制造商的说明书使用在初始RT过程中形成的3′和5′初始末端上的特定引物位点通过长程PCR(Advantage 2 PCR试剂盒；Clontech)扩增所得到的mRNA/单链cDNA杂交体。用RsaI消化STRO-1^亮cDNA后，使用2个等分试样利用ClontechPCR-Select cDNA消减试剂盒来连接不同特定接头寡核苷酸。根据制造商的方案使用STRO-1^亮(测试者)和STRO-1^深(驱赶者)cDNA(且反之亦然)来进行两轮消减杂交。还使用针对STRO-1^亮驱动cDNA杂交的STRO-1^深测试cDNA逆向进行此程序。

为了鉴别由STRO-1^亮群体唯一表达的基因，使用STRO-1^亮消减 cDNA来构建包含200个随机选择的、用连接至T/A克隆载体中的 STRO-1^亮消减cDNA转化的细菌克隆的重复低密度微阵列过滤器。随后用[³²P]dCTP标记的STRO-1^亮或STRO-1^深消减cDNA探测微阵列(图3B-3C)。不同筛选鉴别出总共44个克隆，其在STRO-1^深与 STRO-1^亮亚群体之间高度地差异表达。对所有差异表达的克隆进行的 DNA测序揭示，仅1个克隆代表已知的基质细胞有丝分裂原；即，血小板衍生生长因子(PDGF)(Gronthos和Simmons，Blood.85：929-940，1995)。有趣的是，发现44个克隆中有6个含有对应于趋化因子基质衍生因子1(SDF-1)的DNA插入。人STRO-1^亮细胞中SDF-1 转录物的高丰度通过从新鲜分选的STRO-1^亮、STRO-1^深以及STRO-1 ^阴性骨髓亚群体制备的总RNA的半定量RT-PCR得到证实(图3D和表 3)。

表2.用于特异性扩增人mRNA的RT-PCR引物和条件

表3.STRO-1^亮和STRO-1^深群体中相对基因表达的概述。呈现当通过逆转录PCR进行测定时在STRO-1^亮与STRO-1^深群体之间显示可测量且差异表达的基因列表。值表示参考持家基因GAPDH的相对基因表达。

为使蛋白质表面表达与STRO-1表达的密度相关联，通过胰蛋白酶/EDTA分离制备离体扩增的由骨髓MPC得到的细胞的单细胞悬浮液并且随后与STRO-1抗体与鉴别多种多样细胞谱系相关标志物的抗体的组合一起孵育。使用山羊抗鼠类IgM-异硫氰酸荧光素鉴别STRO-1，同时使用山羊抗小鼠或抗兔IgG-藻红蛋白鉴别所有其它标志物。对于鉴别细胞内抗原的那些抗体，首先用STRO-1抗体标记细胞制备物，用70％冷乙醇固定以使细胞膜渗透并且接着与细胞内抗原特异性抗体一起孵育。在相同条件下使用同种型匹配对照抗体。使用 COULTER EPICS流式细胞仪进行双色流式细胞分析并且收集列表模式数据。点阵图表示指示各谱系细胞标志物(y轴)和STRO-1(x轴) 的荧光强度水平的5,000个列表模式事件。参考同种型匹配阴性对照抗体建立垂直和水平象限。

表4.STRO-1^亮和STRO-1^深群体中相对蛋白质表达的概述。呈现当通过流式细胞术进行测定时在STRO-1^亮与STRO-1^深群体之间显示差异表达的蛋白质的列表。值表示染色的相对平均荧光强度。

实施例4：类风湿性关节炎的绵羊模型

4.1方法

用于产生类风湿性关节炎的绵羊模型的方法的概述如下：

1.第0天

i.对5只绵羊(B1626、B1584、B3619、B1612、B1302)施用弗氏完全佐剂+5mg牛II型胶原(每只绵羊5×0.2ml S/C)。皮下地(S/C) 施用溶液

ii.对2只绵羊(B1627、B4036)施用弗氏完全佐剂+5mg鸡II型胶原(每只绵羊5×0.2ml S/C)

iii.收集10ml血液用于使用ELISA测试II型胶原抗体

iv.针对以下进行临床检查：

跛行

肿胀

关节增厚

2.第14天

i.对5只绵羊施用弗氏不完全佐剂+5mg牛II型胶原(每只绵羊 5×0.2ml S/C)

ii.对2只绵羊施用弗氏不完全佐剂+5mg鸡II型胶原(每只绵羊 5×0.2ml S/C)

iii.收集10ml血液用于使用ELISA测试II型胶原抗体和白血细胞计数

iv.针对以下进行临床检查：

跛行

肿胀

关节增厚

3.第28天

i.经由关节内注射到左跗关节中对5只绵羊施用在盐水中的100 μg牛II型胶原(每只绵羊500μl)

ii.2只绵羊，在盐水中的100μg鸡II型胶原关节内注射到左跗关节中(每只绵羊500μl)

iii.收集10ml血液用于使用ELISA测试II型胶原抗体和白血细胞计数

iv.针对以下进行临床检查：

跛行

肿胀

关节增厚

4.第30天+2天IA注射

i.针对以下进行临床检查：

跛行

肿胀

关节增厚

5.第36天+8天IA注射

i.针对以下进行临床检查：

跛行

肿胀

关节增厚

6.第42天+14天IA注射

i.将接受牛II型胶原的4只绵羊(B1626、B3619、B1612、B1302) 杀死

ii.将接受鸡II型胶原的2只绵羊(B1627、B4036)杀死

iii.收集10ml血液用于使用ELISA测试II型胶原抗体和白血细胞计数

iv.针对以下进行临床检查：

跛行

肿胀

关节增厚

v.杀死的绵羊

滑液左跗关节和右跗关节

a.评定II型胶原抗体

b.细胞计数

滑膜组织左跗关节和右跗关节

a.福尔马林固定H&E切片

b.液氮冻结

关节软骨左和右

a.照片

b.对H&E进行福尔马林固定和脱钙

7.第56天

i.将接受牛II型胶原的1只绵羊(1584)杀死

ii.收集10ml血液用于使用ELISA测试II型胶原抗体和白血细胞计数

iii.针对以下进行临床检查

跛行

肿胀

关节增厚

iv.杀死的绵羊

滑液左跗关节和右跗关节

a.评定II型胶原抗体细胞计数

滑膜组织左跗关节和右跗关节

a.福尔马林固定H&E切片

b.液氮冻结

关节软骨L&R

a.照片

b.对H&E进行福尔马林固定和脱钙

4.2结果

轻微跛行的临床病征在所有7只绵羊中是明显的，其中关节肿胀和关节屈曲时疼痛在4只绵羊中明显。这些病征仅在左(经处理的)跗关节中观察到。

在将绵羊安乐死之后，围绕胫跗关节的滑膜的大体增厚在7只绵羊的6只中是明显的。这是炎性变化的最显著的证据。检查所述关节的关节软骨，在3只绵羊中观察到大体炎症侵蚀损伤，这在距骨的关节表面上是最显著的。

虽然在左(经处理的)跗关节中观察到炎性变化，但在对侧(右)跗关节偶尔也观察到非常轻微的炎性变化。

表5总结了在经处理的绵羊中观察到的特征的结果

表7至表11示出在不同时间点的绵羊临床评定的结果没有观察到临床变化，直到在IA注射CII之后。

表7.临床评定(+2天IA)

表8.临床评定(+8天IA)

表9.临床评定(+14天IA)

表10.临床评定(+21天IA)

表11.(+28天IA)

图4示出在关节内注射II型胶原之后绵羊的平均跛行得分。如所示，跛行在首次注射II型胶原之后约28天时增加。

图5示出来自个别绵羊的右(未受刺激的)跗关节和左(受刺激的)跗关节的滑液中的白细胞计数。在更高反应者中，对照侧中的白细胞浓度也升高，这指示全身性反应的可能性。图6示出对照绵羊和用牛II 型胶原进行免疫的绵羊的滑液中的平均白细胞计数。

图7A和图7B示出来自分别用牛II型胶原和鸡II型胶原进行免疫的绵羊的滑液中的IgM和IgG抗体的水平。这些结果指示这些动物的免疫的跗关节中的针对II型胶原的IgM和IgG增加。这些数据也总结在表12中。

表12.免疫的绵羊的血浆中针对牛或鸡II型胶原的抗体的相对水平

*分级系统并入三个形态学标准：滑液细胞层的超长增殖、滑膜基质的炎性浸润和活化以及具有9的最大得分(Krenn等，Pathol Res. Pract.198：317-325，2002)。

**水平在第14天时最高。

以上所呈现的数据显示通过在第0天和第14天皮下注射在弗氏佐剂中的异源II型胶原并且在第28天将II型胶原关节内注射到跗关节中在7只绵羊中诱导胶原诱导的关节炎(CIA)。疾病进展迅速并且到关节内注射CII之后14天其特征为关节炎症、滑膜增生、单核细胞浸润、抗II型胶原抗体以及在一些绵羊中关节软骨的侵蚀损伤。跛行的临床病征在所有7只绵羊中是明显的并且围绕围绕胫跗关节的滑膜的大体增厚在7只绵羊中的6只中是明显的。

绵羊中的CIA看起来是与人类风湿性关节炎具有显著相似性的关节炎的优异大型动物模型。

实施例5：实验设计

类风湿性关节炎的绵羊模型是基本上如实施例4中所描述而产生的。

三十六只绵羊将被随机分配至六组(6)中的一组，各组包括八只(6) 绵羊，如表13中所示。测试品将在首次注射胶原之后42天施用至相关动物。

在施用所述测试品之后三十天，将绵羊安乐死并且进行大体尸检检查并且收集组织用于病理学和组织学检查。

表13治疗分配

MPC剂量的制备

·2400万绵羊MPC(oMPC)在4.0mL/DMSO/α-MEM 中(待用于通过IV注射提供30万oMPC/kg的剂量)

·8000万oMPC在4.0mL/DMSO/α-MEM中(待用于通过IV注射提供100万oMPC/kg的剂量)

·1亿6千万oMPC在4.0mL/DMSO/α-MEM中(待用于通过IV注射提供200万oMPC/kg的剂量)

·3500万oMPC在0.7mL/DMSO/α-MEM中(待用于通过关节内注射提供2500万oMPC的剂量)

·无菌盐水(对照)

大体病理学

尸体剖检和组织收集在死亡或被安乐死的所有动物上进行。将收集的组织固定在10％缓冲福尔马林中。针对每个组织记录肉眼可见的发现。

将左(治疗的)跗关节和右(对照)跗关节暴露并且向下解剖至滑膜。将滑膜(和下层脂肪)样品放置在用于固定的10％缓冲中性福尔马林或用于速冻的OCT化合物中。

然后使所述关节关节脱落并且针对大体软骨损伤的迹象检查关节表面并且照相。使用锯去除距骨的关节表面的片段(参见以下)并且固定在10％缓冲中性福尔马林中。

来自跗关节的滑膜组织的组织病理学评分

用于组织切片的制备和对照动物和治疗动物的左跗关节和右跗关节的滑膜和滑膜下组织内的病理变化的评分的方法学是基于Krenn等 (Pathol Res.Pract.198：317-325)的出版物。

来自跗关节的滑膜组织的免疫组织化学研究和评分

从来自治疗动物和对照动物的右和左胫跗(跗关节)关节的背侧和背中区域收集滑膜。将这些组织冷冻在OCT化合物中并且使用低温恒温器切片至载玻片上。使用标准免疫组织化学方法使切片经受染色以用于按照已经出版的方法学(16)和商业上可获得的方案鉴别特定细胞类型和抗体。所使用的抗体包括针对CD4(44-97)、CD8(38-65)、γ-δ(γδ T细胞(86D/127-5)、CD14(VMRD a-M-M9)、B细胞(CD79a：HM57) 以及细胞因子TNF-α、白细胞介素-6、白细胞介素-1β、白细胞介素-17、白细胞介素-10、干扰素γ、因子VIII和VCAM-1提出的那些并且是从商业来源获得的或自制制备的。将染色的切片评分为盲的。

临床病理学

在研究开始前、第0天(基线)、第42天、第49天、第56天、第 63天以及在尸体剖检(第72天)时收集大约30至40mL血液并且用于以下测定：

细胞因子：测定滑液和血浆中的细胞因子TNF-a、IFN-g、IL-1b 以及IL-6的水平。

统计方法

图示使用单因素方差分析(one way ANOVA)、接着使用Graphpad Prism统计软件(5.0b版)(GraphPad Software Inc，La Jolla，Ca USA)进行Tukey或Newman-Keuls多重比较检验来对不同治疗组所获得的数据进行统计分析和图示。治疗组之间的统计显著性看作为p＜0.05。对于参数数据，使用成对的学生t-检验测定个别治疗组与对照之间的显著性。对于非参数评定，使用Mann-Whitney或Wilcoxon配对符号秩次检验评估组之间的差异，其中可接受的显著性在p＜0.05。

实施例6：来自跗关节的滑膜组织的组织病理学评分的结果

通过盲观察者确定所有动物的左(牛II型胶原(BII)注射点)和右跗关节的滑膜的单个组织病理学得分。通过增生、基质(滑膜组织)活化、以及炎性浸润的单个得分的求和获得的每个切片的总得分和部分得分以图形的方式总结在图8A和图8B中。从这些图中显而易见的是注射 BII的左关节的总得分高于对侧右关节的得分的总得分。此外，针对注射低(p＜0.017)和高(p＜0.025)MPC的组展示了MPC治疗的组与对照组之间统计上显著的差异(图8A)，但未针对右关节中的对应滑膜的任何组组织病理学评分(图8B)予以展示。对照组与MPC治疗的组之间的差异的主要原因将似乎在于细胞治疗的组中的滑膜增生的减少(图8A)。

关节内注射的组的左和右跗关节中的滑膜组织病理学变化的得分没有显示用盐水或2500万MPC注射之间的任何显著差异，但如预期的，左关节的得分高于右关节(图8C)。

实施例7：滑膜组织的免疫组织化学研究

用于半定量在用方法部分中所描述的抗体进行免疫组织化学染色之后不同动物组的滑膜组织中的细胞变化和细胞因子水平的评分系统的结果在图9A至图9C中示出。使用3种不同的评分方法，这多个切片排除了所检查的每个实验组的有意义的综合得分的产生。因此，针对所使用的单个标志物抗体所获得的每个实验组的平均得分单独地呈现并且在图10A至图10F中示出。一些这些切片连同所分配的得分的代表性显微照片实例在图11A至图11E中示出。

虽然内膜IL-1和VCAM-1减少和γ-δTCR增加的清楚趋势是明显的(图10A至10C)，但对照组与注射MPC的组之间未显示有统计上显著的差异。然而，对于注射高MPC剂量的组来说，对IL-6(p＝0.029) 和TNF-α(p＝0.049)的滑膜内膜(滑膜细胞)染色(图10D)和对CD-14细胞的间质组织染色(图10E)显示显著低于注射盐水的对照组(p＝ 0.009)。此外，高剂量组的滑膜间质组织中细胞因子IL-17的水平也显著低于对应对照组的水平(ANOVA，p＜0.005)(图10F)。

注射盐水和MPC的关节所获得的免疫组织化学得分的结果在表 14中示出。对于注射MPC的关节中的CD4、CD8以及CD79似乎存在更高染色，此发现与注射MPC的关节中所观察到的淋巴细胞的更高数目相一致。然而，MPC注射关节中的TNF-α和IL-17的平均值低于注射盐水的关节，特别是对于左关节滑膜的内膜区域来说。

一般讨论

如本文所公开，通过SC注射弗氏完全和不完全佐剂中的牛II型胶原、接着单独关节内(IA)注射相同蛋白质到成年绵羊的跗关节中对成年绵羊进行免疫导致诱导关节病，所述关节病显示出人RA的许多经典病理学指标。

这个RA绵羊模型因此被认为适合用于评估在0.3×10⁶个细胞 /kg、1.0×10⁶个细胞/kg以及2.0×10⁶个细胞/kg的剂量下IV施用的 MPC相对于相等体积的IV盐水的作用的治疗作用。出于比较目的，接受25×10⁶MPC或盐水的单一注射到左跗关节中的IA组也包括在所述研究中。在关节内注射牛II型胶原(第28天)后14天施用MPC 或盐水并且在30天之后处死(第72天)。

滑膜组织的组织病理学和免疫组织化学分析的分析结果是阳性的。此外，在所施用的三个IV MPC剂量中，200万MPC/kg的最高剂量相对于盐水对照组一致产生统计上的改善。虽然低剂量MPC组在所研究的一些参数方面也显示出积极作用，但中剂量MPC治疗的组表现出混合反应。在本研究中缺乏清楚剂量反应关系的原因并不完全清楚，但可能与每个组中所使用的动物的小数目和如对于许多对照组参数所观察到的高标准偏差所例示的所述组内疾病表达强度的不均匀性有关。然而，相对于盐水对照(图8C)，对于高剂量MPC组的左跗关节的滑膜所观察到的组织病理学得分的统计上显著的减少通过IL-6、TNF-α的滑膜细胞(内膜)染色(图10D)和CD14细胞的间质组织染色(图10E)和IL-17的间质组织染色(图10F)的免疫组织化学得分减小而得以支持。

本研究的使用慢性RA的绵羊模型的结果已经证实，30至200 万MPC/kg之间的单一IV注射有效减少关节炎的关键组织病理学指数，即滑膜增生、基质组织活化以及炎性细胞浸润。此外，使用冷冻切片的免疫组织化学染色，IL-6、TNF-α、IL-17以及CD14+细胞的水平在高MPC给药的动物中显著减少(相对于盐水对照)的实证支持了我们的工作假设。IL-17已经显示(Shahrara等(2009)Journal of Immunology 182：3884-3891)体内诱导单核细胞迁移，从而表明这一细胞因子是造成单核细胞募集到RA患者的关节中的原因。这一观点与以下假设一致：通过降低滑膜间质中的IL-17的水平，所注射的MPC 间接减少从骨髓迁移至发炎关节的单核细胞的数目，从而限制促炎性细胞因子(如由增殖内膜的滑膜细胞产生的IL-6和TNF-α)的水平。

此外，在软骨和滑膜中表达的“常规”炎性细胞因子已经表明在骨关节炎中起作用，所述因子包括白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-6、IL-8、IL-17以及可溶性CD14(Liu-Bryan和 Terkeltaub Arthritis and Rheumatism，64：2055-2058，2012)。因此，本文所呈现的数据支持施用MPC(例如，静脉内)来治疗骨关节炎的作用。

序列表

<110> 麦瑟布莱斯特公司 (MESOBLAST, INC.)

<120> 治疗或预防风湿性疾病的方法

<130> 511972

<150> AU2011902655

<151> 2011-07-04

<160> 36

<170> PatentIn 第3.5版

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Claims (11)

1.富含STRO-1⁺多能细胞的细胞群和/或其子代在制备用于向受试者全身性施用来治疗或预防风湿性疾病相关炎症的药物中的用途，其中所述富含STRO-1⁺多能细胞的细胞群包含至少1％的STRO-1⁺多能细胞。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述风湿性疾病选自由以下各项组成的组：类风湿性关节炎、斯蒂尔病、强直性脊椎炎、莱特尔氏病、银屑病性关节炎、肠道关节炎、骶髂关节炎、脊椎炎以及骨关节炎。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述风湿性疾病是自身免疫性风湿性疾病。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述风湿性疾病是类风湿性关节炎。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述细胞群富含STRO-1^亮多能细胞，其中所述富含STRO-1^亮多能细胞的细胞群包含至少1％的STRO-1^亮多能细胞。

6.如权利要求1或5所述的用途，其中所述药物适于动脉内施用至主动脉中、心脏的心房或心室中或静脉内施用。

7.如权利要求1或5所述的用途，其中所述富含STRO-1⁺多能细胞的群是自体的或同种异体的。

8.如权利要求1所述的用途，其中所述富含STRO-1⁺多能细胞的群在施用之前经过培养扩增。

9.如权利要求1所述的用途，其中所述药物包含所述STRO-1⁺多能细胞和载体和/或赋形剂。

10.如权利要求1所述的用途，其中所述富含STRO-1⁺多能细胞的细胞群包含至少约5％的STRO-1⁺多能细胞。

11.如权利要求1所述的用途，其中所述富含STRO-1⁺多能细胞的细胞群包含至少5％的STRO-1⁺多能细胞。