ES2763381T3 - Procedimientos de tratamiento o prevención de enfermedades reumáticas - Google Patents

Abstract

Una población de células enriquecidas en células multipotenciales STRO-1+ para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad reumática en un sujeto mediante la administración sistémica de una cantidad terapéuticamente efectiva de la población de células, donde la población de células enriquecida en células multipotenciales STRO-1+ comprenden al menos un 1 % de células multipotenciales STRO-1+.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos de tratamiento o prevención de enfermedades reumáticas

CAMPO

La presente invención se refiere a procedimientos para tratar o prevenir enfermedades reumáticas.

ANTECEDENTES

Las enfermedades reumáticas son una clase de enfermedades comunes generalmente llamadas “artritis”, que a menudo están asociadas a, o son causadas por, una respuesta autoinmune. Esta clase de enfermedades incluye la artritis reumatoide, las espondiloartropatías (por ejemplo, la espondilitis anquilosante), el síndrome de Sjorgren (el síndrome de Sicca), la enfermedad de Reiter, la artritis psoriásica, la artritis entérica (los problemas articulares asociados a la enfermedad inflamatoria intestinal), la sacroiliitis o la espondilitis y la osteoartritis.

Según el Centro para el Control de Enfermedades (CDC), aproximadamente 50 millones de adultos han sido diagnosticados con alguna forma de artritis solo en los EE.UU. Se predice que este número aumentará a 67 millones de adultos hacia el año 2030. El CDC estima que el costo de la artritis en los E^e .UU. fue de aproximadamente US$ 80.8 mil millones para los tratamientos de artritis y de aproximadamente US$ 47 mil millones para los costos indirectos (por ejemplo, por pérdida de ingresos). El costo total de $127,8 mil millones fue del 1,2 % del producto interno bruto de los Estados Unidos en 2003.

Artritis reumatoide y osteoartritis

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad sistémica crónica dolorosa caracterizada por una extensa inflamación sinovial acompañada por la destrucción del cartílago articular y el hueso. El curso clínico de la AR es variable y a menudo muestra un patrón de remisión, pero si es progresivo conduce inevitablemente a la deformidad articular y una función deteriorada. Se pueden distinguir tres formas de AR: enfermedad leve y autolimitada; enfermedad levemente progresiva; y una enfermedad agresiva que es difícil de controlar con medicamentos y se caracteriza por el deterioro funcional y el deterioro radiológico de las articulaciones, por ejemplo, el estrechamiento del espacio articular y las erosiones del cartílago, particularmente debajo del sinovio inflamado en proliferación, a lo que se denomina pannus. Según la naturaleza sistémica de la enfermedad, hay manifestaciones extraarticulares que incluyen la vasculitis, la alveolitis y la enfermedad ocular. La prevalencia de la enfermedad según lo informado en la literatura es de aproximadamente el 1 % de la población de los EE.UU., y las mujeres representan dos tercios de todos los casos. El inicio de la AR a menudo es insidioso con fatiga, anorexia, debilidad generalizada y dolor musculoesquelético. Los síntomas específicos aparecen más tarde. Varias articulaciones, generalmente de forma simétrica, se ven afectadas. Muy a menudo, se trata de articulaciones de las manos, muñecas, rodillas y pies. Las articulaciones duelen y se hinchan, y el movimiento es limitado. La rigidez matutina de más de una hora es un hallazgo muy típico. Con la inflamación persistente, se desarrolla una variedad de deformidades, incluyendo la desviación radial más típica de la muñeca y la hiperextensión o flexión de las articulaciones interfalángicas proximales; también se producen otras deformidades. Se establece la atrofia del músculo esquelético. En aproximadamente el 20 al 30 % de todos los pacientes, hay un desarrollo de nódulos reumatoides en estructuras periarticulares o sitios de trauma, pero generalmente tienen una importancia clínica limitada. Los nódulos se pueden encontrar en otras estructuras como la pleura o las meninges. La vasculitis reumatoide puede afectar a casi todos los sistemas de órganos (pulmón, tracto gastrointestinal, hígado, bazo, páncreas, ganglios linfáticos, testículos y ojo).

No hay tratamiento curativo para la AR. Todos los regímenes farmacológicos intentan principalmente aliviar los síntomas y la inflamación. La aspirina y otros medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) con un rápido inicio de acción son la primera línea de tratamiento. Los glucocorticoides orales e inyectables se agregan al régimen de medicamentos si es necesario. La tercera línea de tratamiento incluye fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FARME); tienen un inicio de acción lento; en algunos casos, de varios meses. Los FARME incluyen azatioprina, sulfasalazina, oro, D-penicilamina, hidroxicloroquina, metotrexato y ciclosporina. La adición más reciente de medicamentos biológicos, como Enbrel®, Remicade® y Humira® ha proporcionado un modo alternativo de terapia, sin embargo, el uso regular de estos productos puede suprimir el sistema de inmunodefensa y ha sido asociado a una mayor incidencia de infecciones y enfermedades oportunistas, como la tuberculosis.

La osteoartritis (OA) es la forma más común de artritis en las poblaciones occidentales. La artrosis de rodilla, caracterizada clínicamente por dolor y discapacidad funcional, es la principal causa de discapacidad crónica entre los ancianos en los EE.UU.

Patológicamente, los cambios más notables en la OA son la pérdida focal del cartílago articular y la formación de hueso nuevo marginal y central. Sin embargo, la OA no es simplemente una enfermedad del cartílago articular y el hueso subcondral. Más bien, es una enfermedad de la articulación sinovial, con alteraciones que también se encuentran en la membrana sinovial, la cápsula, los ligamentos, el músculo periarticular y los nervios sensoriales. Aunque la OA alguna vez se consideró una artropatía no inflamatoria, los pacientes a menudo presentan signos y síntomas consistentes con inflamación local y sinovitis, y la evidencia reciente de estudios preclínicos y clínicos respalda el papel de la inflamación y los mediadores inflamatorios en su fisiopatología.

El tratamiento actual de la osteoartritis incluye terapia no medicinal, terapia medicinal y tratamientos quirúrgicos. Los tratamientos no medicinales incluyen ejercicios y programas de pérdida de peso, tratamiento térmico y dispositivos de asistencia o refuerzo. Para la artrosis de rodilla, los ejercicios de amplitud del movimiento y fortalecimiento están orientados a la reducción de la discapacidad, la mejora de la función y la protección de las articulaciones. Los medicamentos incluyen analgésicos (por ejemplo, Paracetamol), antiinflamatorios no esteroideos (AINE) que son inhibidores no selectivos de la ciclooxigenasa (COX) o inhibidores selectivos de la enzima COX-2, corticosteroides intraarticulares inyectados o viscosuplementación, y o supuestos medicamentos para la osteoartritis modificadores de la enfermedad (DMOAD). Los procedimientos quirúrgicos incluyen desbridamiento y lavado de articulaciones y, por último, artroplastia total de rodilla.

Los tratamientos medicinales más comúnmente utilizados para la artrosis de rodilla generalmente proporcionan menos del 50 % de alivio del dolor. Por ejemplo, el uso de acetaminofeno, AINE selectivos o AINE no selectivos generalmente produce mejoras medias en el dolor de rodilla por OA de no más de 30 puntos desde una línea de base de aproximadamente 70 puntos, utilizando escalas analógicas visuales de 100 puntos (100 mm). Por lo tanto, hay mucho margen de mejora en el manejo del dolor de la artrosis de rodilla. Además, no se ha demostrado que ninguna terapia retarde la progresión de la degradación estructural.

Espondilitis alquilosante

La espondilitis anquilosante (AS) es una enfermedad crónica, progresiva e inflamatoria con un impacto considerable en el funcionamiento, el bienestar y la discapacidad del paciente. La prevalencia de AS se ha estimado tradicionalmente en el intervalo del 0,1 al 1,9 %, con más hombres afectados que mujeres. Como una enfermedad crónica del esqueleto axial y las articulaciones periféricas grandes, la AS causa dolor de espalda inflamatorio y rigidez, y se asocia a otras enfermedades inflamatorias de la piel, los ojos y los intestinos. En casos graves, la AS puede resultar en una fusión espinal completa, causando una limitación física extrema. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de un tratamiento seguro y efectivo para la EA.

A medida que la enfermedad progresa, los pacientes con EA experimentan dolor, rigidez en las articulaciones y la eventual pérdida de movilidad espinal. Estos síntomas clínicos y la posterior progresión de la enfermedad resultan en limitaciones funcionales y deterioro en la calidad de vida relacionada con la salud (CVRS).

No existe cura para la AS. En general, el tratamiento incluye tratar de aliviar el dolor y la rigidez usando medicamentos como los AINE, los corticosteroides y los FARME.

El documento de Giurea y col., 2006, Osteoartritis and Cartilage 14:938-943, describe que las células precursoras mesenquimales STRO-1+ se encuentran en las proyecciones de la superficie sinovial de pacientes con osteoartritis. El documento de Rüger y col., Arthritis & Rheumatism 50:2157-2166 describe que las células precursoras endoteliales se encuentran en el tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide y osteoartritis.

El documento de Goff y col., 2002, Blood 100: Abstract No. 4242, describe las diferencias relacionadas con la edad en la capacidad de las células STRO-1+ de médula ósea humana para diferenciarse hacia los osteoblastos.

El documento de Hermida-Gomez y col., 2011, Journal of Rheumatology 38:339-349, describe la cuantificación de células que expresan marcadores de células madre mesenquimales en membranas sinoviales sanas y osteoartríticas. La publicación de la solicitud de patente internacional No. WO 2009/155656 A1 describe un procedimiento para reparar y reconstituir discos invertebrales en un sujeto, lo que involucra la administración de células multipotentes STRO-1+. La publicación de la solicitud de patente internacional No. WO 2010/025506 A1, describe un procedimiento para trasplantar células precursoras hematopoyéticas en un sujeto, lo que involucra cultivar las células precursoras hematopoyéticas en presencia de una población de células enriquecidas en células STRO-1bright.

Publicación Internacional de Solicitud de Patente No. WO 2006/032092 A1, describe la progenie precursora mesenquimal expandida multipotencial (MEMP) caracterizada por los primeros marcadores de desarrollo STRO-1bri y FA.

Será evidente para el experto en la materia que la enfermedad inflamatoria de las articulaciones es una clase de enfermedades debilitantes que tienen un gran impacto en la sociedad. También existe la necesidad de terapias para estas enfermedades.

RESUMEN

La presente invención está dirigida a la materia expuesta en las reivindicaciones adjuntas.

En el trabajo previo a la presente invención, los inventores buscaron determinar el efecto de las células progenitoras mesenquimatosas (CPM) sobre las enfermedades reumáticas. Los inventores estudiaron un modelo ovino de artritis reumatoide como modelo para enfermedades reumáticas en general, ya que muchas de estas enfermedades comparten características comunes, por ejemplo, autoinmunidad y la presencia de células inmunes y citocinas inflamatorias en la articulación. Los inventores han determinado que las CPM fueron efectivas para reducir los índices histopatológicos de artritis, como la hiperplasia sinovial, la activación del tejido estromal y la infiltración celular inflamatoria. Además, los inventores han demostrado que la administración de CPM reduce los niveles de citocinas proinflamatorias, tales como la IL-6, TNFa, la IL-17 además de las células CD14+, por ejemplo, en el tejido sinovial. Los inventores consideran que la capacidad de reducir los niveles de estas células y citocinas hace que las CPM (y/o su progenie y/o factores solubles secretados a partir de ellas) sean adecuados para el tratamiento de enfermedades reumáticas, como la artritis reumatoide y/o la osteoartritis.

Los inventores también han determinado que las CPM proporcionan un beneficio terapéutico prolongado, con los efectos de una sola inyección de células que dura al menos aproximadamente 30 días.

Los inventores también han encontrado que las CPM o su progenie migraron al sitio de la patología de la enfermedad reumática. Dicha migración proporciona beneficios ya que permite la administración sistémica de las células, lo que es más fácil y puede ser menos difícil y/o menos invasivo, por ejemplo, en comparación con la administración de células al líquido sinovial de un sujeto.

Las CPM ovinas aisladas por expresión del marcador STRO-3 son funcionalmente equivalentes a las CPM humanas que coexpresan los marcadores STRO-3 y STRO-1 (como se muestra en esta invención, en el Ejemplo 2).

Por lo tanto, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad reumática en un sujeto, el procedimiento comprende administrar al sujeto una población de células enriquecidas en células STRO-1 y/o su progenie y/o sus factores solubles derivados.

En un ejemplo, la enfermedad reumática es una enfermedad reumática autoinmune.

En un ejemplo, la enfermedad reumática se selecciona de entre el grupo que consiste en la artritis reumatoide, la enfermedad de Still (el síndrome de artritis idiopática juvenil o la artritis reumatoide juvenil), la espondilitis anquilosante, la enfermedad de Reiter, la artritis psoriásica, la artritis entérica, la sacroileítis, la espondilitis y la osteoartritis.

En un ejemplo, la enfermedad reumática es la osteoartritis.

En una forma ejemplar, la enfermedad reumática es la artritis reumatoide.

En un ejemplo, el procedimiento comprende administrar una población de células enriquecidas en células STRO-1bright y/o su progenie y/o sus factores solubles derivados.

En un ejemplo, la población enriquecida en células STRO-1+ y/o su progenie y/o sus factores solubles derivados se administra sistémicamente. Por ejemplo, las células se administran por vía intravenosa. A este respecto, los inventores han demostrado que las células STRO-1+ y/o su progenie migran al sitio de una articulación inflamada en un sujeto. Por lo tanto, la descripción contempla la administración de células STRO-1+ y/o su progenie en un sitio alejado de una articulación inflamada en un sujeto.

En un ejemplo, las células STRO-1+ y/o su progenie y/o los factores solubles derivados se administran en una cantidad suficiente para reducir la IL-6, la TNFa y la IL-17, además de las células CD14+ células en un sujeto, por ejemplo, dentro de una articulación de un sujeto, como dentro del tejido sinovial.

Las dosis ejemplares de las células incluyen entre 0,1 x 106 a 5 x 106 de células STRO-1 y/o su progenie. Por ejemplo, el procedimiento comprende administrar entre 0,3 x 106 a 2 x 106 de células STRO-1 y/o su progenie por kilogramo. En un ejemplo, las células se administran a una dosis de entre aproximadamente 0,3 x 106 células/kg y aproximadamente 4 x 106 células/kg, como entre aproximadamente 0,3 x 106 células/kg y aproximadamente 2 x 106 células/kg.

Una forma del procedimiento consiste en administrar una dosis baja de células STRO-1+ y/o su progenie. Una dosis baja como tal es, por ejemplo, entre 0,1 x 105 y aproximadamente 0,5 x 106 de células STRO-1+/kg, como aproximadamente 0,3 x 106 de células STRO-1+/kg.

En otro ejemplo, se administra una alta dosis de células al sujeto. Las dosis ejemplares incluyen al menos aproximadamente 1,5 x 106 células/kg. Por ejemplo, una dosis alta comprende entre aproximadamente 1,5 x 106 y aproximadamente 4 x 106 células/kg. Por ejemplo, una dosis alta comprende aproximadamente 1,5 x 106 y alrededor de 2 x 106 células/kg. Los inventores han demostrado que tales dosis proporcionan beneficios, por ejemplo, al reducir los niveles de IL-6, TNFa, IL-17, además de las células CD14+.

En un ejemplo, las células se administran en una dosis de aproximadamente 100 millones a 300 millones de células, independientemente del peso del paciente.

En un ejemplo, las células se administran en una dosis de aproximadamente 100 millones a 200 millones de células, independientemente del peso del paciente.

En un ejemplo, las células se administran en una dosis de aproximadamente 100 millones de células independientemente del peso del paciente.

En un ejemplo, las células se administran en una dosis de aproximadamente 150 millones de células independientemente del peso del paciente.

En un ejemplo, las células se administran en una dosis de aproximadamente millones de células independientemente del peso del paciente.

En un ejemplo, las células se administran en una dosis de aproximadamente 300 millones de células independientemente del peso del paciente.

En un ejemplo, la población enriquecida en STRO-1+ y/o su progenie y/o sus factores solubles derivados se administran una vez a la semana o con menos frecuencia, por ejemplo, una vez cada cuatro semanas o con menos frecuencia.

La presente descripción también contempla numerosas administraciones de las células y/o los factores solubles. Por ejemplo, dicho procedimiento puede involucrar la administración de las células y el monitoreo del sujeto para determinar cuándo ocurre o se repite uno o más síntomas de una enfermedad inflamatoria de las articulaciones y la administración de una dosis adicional de y/o factores solubles. Los procedimientos adecuados para evaluar los síntomas de una enfermedad reumática serán evidentes para el experto en la materia y/o se describirán en esta invención.

En otro ejemplo, las células y/o factores solubles se administran en un horario fijo, por ejemplo, una vez por semana o quincena o cada tres, cuatro, cinco o seis semanas, o más.

En un ejemplo, la población enriquecida en células STRO-1+ y/o las células de la progenie son autogénicas o alogénicas y/o los factores solubles pueden derivarse de células autogénicas o alogénicas.

En un ejemplo, la población enriquecida en células STRO-1+ y/o las células de la progenie se han expandido en cultivo antes de la administración y/o antes de obtener los factores solubles.

En un ejemplo, la población enriquecida en células STRO-1+ es STRO-1bright, y/o expresa la fosfatasa alcalina no específica (TNAP) del tejido y/o las células de la progenie y/o los factores solubles se derivan de células STRO-1+ que son STRO-1bright y/o expresan TNAP.

En un ejemplo, las células STRO-1+ y/o las células de su progenie y/o sus factores solubles derivados se administran en forma de una composición que comprende dichas células STRO-1+ y/o células de su progenie y/o sus factores solubles derivados y un vehículo y/o excipiente.

En un ejemplo, las células STRO-1 y/o las células de su progenie y/o sus factores solubles derivados se administran junto con otro compuesto para tratar o prevenir una enfermedad reumática. En un ejemplo, el otro compuesto es un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad (FARME). En un ejemplo, el FARME se selecciona del grupo que consiste en hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, azatioprina, D-penicilamina, minociclina de sales de oro, ciclosporina e inhibidores de TNF.

En un ejemplo, el FARME se selecciona del grupo que consiste en azatioprina, cloroquina, hidroxicloroquina, leflunomida, metotrexato y sulfasalazina. En un ejemplo, el FARME es metotrexato.

En otro ejemplo, el FARME es un anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, infliximab, golimumab o adalimumab) o un receptor de TNF soluble (por ejemplo, etanercept).

En un ejemplo, las células STRO-1 y/o las células de su progenie y/o sus factores solubles derivados se administran junto con un agente de reducción de células B. En un ejemplo, el agente que agota las células B es un anticuerpo anti-CD20, como rituximab u ofatumumab.

En un ejemplo, las células STRO-1+ y/o las células de su progenie y/o sus factores solubles derivados se administran a un sujeto que padece artritis reumatoide y que recibe tratamiento con metotrexato.

En un ejemplo, las células STRO-1+ y/o las células de su progenie y/o sus factores solubles derivados se administran como terapia complementaria y/o concomitante a la terapia con metotrexato.

En un ejemplo, el sujeto sufre de artritis reumatoide moderadamente activa o artritis reumatoide gravemente activa o artritis reumatoide de moderada a gravemente activa.

En un ejemplo, las células STRO-1+ y/o las células de su progenie se administran a un sujeto que padece artritis reumatoide y recibe tratamiento con metotrexato, donde las células se administran a una dosis de aproximadamente 1 x 106; alrededor de 3 x 106 células/kg.

En un ejemplo, las células STRO-1+ y/o las células de su progenie se administran a un sujeto que padece artritis reumatoide y recibe tratamiento con metotrexato, donde las células se administran a una dosis de aproximadamente 1.5 x 106; alrededor de 2 x 106 células/kg.

En un ejemplo, las células STRO-1+ y/o las células de su progenie se administran a un sujeto que padece artritis reumatoide y recibe tratamiento con metotrexato, donde las células se administran a una dosis de aproximadamente 1.5 x 106 células/kg.

En un ejemplo, las células STRO-1+ y/o las células de su progenie se administran a un sujeto que padece artritis reumatoide y recibe tratamiento con metotrexato, donde las células se administran a una dosis de aproximadamente 2 x 106 células/kg.

En un ejemplo, las células STRO-1+ y/o las células de su progenie se administran a un sujeto que padece artritis reumatoide y recibe tratamiento con metotrexato, donde las células se administran a una dosis de entre aproximadamente 100 millones de células y aproximadamente 300 millones de células, independientemente del peso del paciente, tal como, entre aproximadamente 100 millones de células y aproximadamente 200 millones de células, independientemente del peso del paciente.

En un ejemplo, las células STRO-1+ y/o las células de su progenie se administran por vía sistémica, por ejemplo, por vía intravenosa.

Por lo tanto, en un ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar o prevenir la osteoartritis en un sujeto, el procedimiento comprende la administración intravenosa (o sistémica) al sujeto de una población de células enriquecidas en células STRO-1+ y/o las células de su progenie y/o sus factores solubles derivados. Las células ejemplares, las dosis y los tratamientos combinados se describen en esta invención y se deben tomar para su aplicación mutatis mutandis al presente ejemplo de la descripción.

En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar o prevenir la artritis reumatoide en un sujeto, el procedimiento comprende la administración intravenosa (o sistémica) al sujeto de una población de células enriquecidas en células STRO-1+ y/o las células de su progenie y/o sus factores solubles derivados. Las células ejemplares, las dosis y los tratamientos combinados se describen en esta invención y se deben tomar para su aplicación mutatis mutandis al presente ejemplo de la descripción.

La presente descripción proporciona adicionalmente una población de células enriquecidas en células STRO-1 y/o las células de su progenie y/o sus factores solubles derivados para su utilización en el tratamiento o prevención de una enfermedad reumática en un sujeto.

La presente descripción adicionalmente proporciona el uso de una población de células enriquecidas en células STRO-1+ y/o las células de su progenie y/o sus factores solubles derivados en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad reumática en un sujeto.

CÓDIGO PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID NO 1 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica GAPDH

SEQ ID NO 2 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica GAPDH

SEQ ID NO 3 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica SDF-1

SEQ ID NO 4 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica SDF-1

SEQ ID NO 5 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica IL-1p

SEQ ID NO 6 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica IL-1p

SEQ ID NO 7 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica FLT-1

SEQ ID NO 8 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica FLT-1

SEQ ID NO 9 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica TNF-a

SEQ ID NO 10 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica TNF-a

SEQ ID NO 11 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica KDR

SEQ ID NO 12 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica KDR

SEQ ID NO 13 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica RANKL

SEQ ID NO 14 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica RANKL

SEQ ID NO 15 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica la leptina

SEQ ID NO 16 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica la leptina

SEQ ID NO 17 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica CBFA-1

SEQ ID NO 18 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica CBFA-1

SEQ ID NO 19 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica PPAPy2

SEQ ID NO 20 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica PPARy2

SEQ ID NO 21 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica OCN

SEQ ID NO 22 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica OCN

SEQ ID NO 23 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica MyoD

SEQ ID NO 24 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica MyoD

SEQ ID NO 25 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica s Mm HC

SEQ ID NO 26 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica SMMHC

SEQ ID NO 27 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica GFAP

SEQ ID NO 28 oligonucleótidos para amplificar el ácido nucleico que codifica GFAP

SEQ ID NO 29 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica la nestina

SEQ ID NO 30 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica la nestina

SEQ ID NO 31 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica SOX9

SEQ ID NO 32 oligonucleótido para amplificar el ácido nucleico que codifica SOX9

SEQ ID NO 33 oligonucleótidos para amplificar el ácido nucleico que codifica el colágeno tipo X

SEQ ID NO 34 oligonucleótidos para amplificar el ácido nucleico que codifica el colágeno tipo X

SEQ ID NO 35 oligonucleótidos para amplificar el ácido nucleico que codifica el agrecano

SEQ ID NO 36 oligonucleótidos para amplificar el ácido nucleico que codifica el agrecano

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1. Coexpresión de TNAP (STRO-3) y el marcador de células precursoras mesenquimales, STRO-1bright por las células morfonucleares de médula ósea humana adulta (CMM-MO). Se practicó una inmunofluorescencia de color dual y citometría de flujo por incubación de CMM-MO de STRO-1 seleccionadas por MACS y marcadas indirectamente con un anticuerpo de IgM de cabra anti murino acoplado con FITC (eje x) y AcM STRO-3 (IgG1 de murino) marcado indirectamente con una IgG de cabra anti murino acoplada con PE (eje y). El histograma de gráfico de puntos representa 5 x 104 eventos recogidos como datos en modo de lista. Se establecieron las líneas vertical y horizontal a niveles de reactividad de < 1,0 % de fluorescencia media obtenidos con los anticuerpos de control de isotipo coincidente, 1B5 (IgG) y 1A6.12 (IgM) tratados en las mismas condiciones. Los resultados demuestran que una población minoritaria de células STRO-1bright coexpresaban TNAP (cuadrante superior derecho), mientras que el resto de las células STRO-1+ no consiguieron reaccionar con el AcM STRO-3.

La figura 2. Perfil de expresión génica de la progenie de STRO-1bright o STRO-1dim de CPM de STRO-1bright cultivadas y expandidas. Las suspensiones celulares individuales de CPM de médula ósea expandida ex vivo se prepararon mediante tratamiento con tripsina/EDTA. Las células se tiñeron con el anticuerpo STRO-1 que se reveló posteriormente mediante incubación con isotiocianato de IgM-fluoresceína de cabra anti murino. El aRn celular total se preparó a partir de poblaciones purificadas de células que expresan STRO-1dim o STRO-1bright, después de la clasificación celular activada por fluorescencia (A). Utilizando el procedimiento de extracción RNAzolB, y los procedimientos estándares, se aisló el ARN total de cada subpoblación y se usó como plantilla para la síntesis de ADNc. La expresión de diversos transcritos se evaluó mediante amplificación por PCR, utilizando un protocolo estándar como se describió previamente (Gronthos y col., J Cell Sci. 116:1827-1835, 2003). Los conjuntos de cebadores utilizados en este estudio se muestran en la tabla 2. Después de la amplificación, se analizó cada mezcla de reacción por electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % y se visualizó por tinción con bromuro de etidio (B). La expresión génica relativa para cada marcador celular se evaluó con referencia a la expresión del gen de mantenimiento, GAPDH, usando el software ImageQant (C).

La figura 3. La progenie de STRO-1bright de CPM de STRO-1 cultivadas y expandidas expresa altos niveles de SDF-1, mientras que la progenie de STRO-1dim no. (A) Las preparaciones aisladas mediante una MACS de las CMM-MO de STRO-1 se dividieron en diferentes subconjuntos sTrO-1 según las regiones, STRO-1bright y STRO-1dim/duN usando FACS. El ARN total se preparó a partir de cada subpoblación STRO-1 y se usó para construir una biblioteca de hibridación por sustracción (B-C) de STRO-1bright. Se replicaron los filtros de nitrocelulosa, que se han borrado con productos de PCR representativos amplificados a partir de clones bacterianos transformados con ADNc sustraído de STRO-1bright. Los filtros se sondearon ya sea con ADNc sustraído de [32P] STRO-1bright marcadas con desoxicitidina trifosfato (dCTP) (B) o STRO-1dim/duN (C). Las flechas indican la expresión diferencial de 1 clon que contiene un fragmento de ADNc correspondiente a SDF-1 humano. (D) Análisis de transcriptasa inversa (RT) -PCR que demuestra la expresión relativa de SDF-1 y transcritos de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) en ARN total preparado a partir de nuevas poblaciones de STRO-1 de CMM-MO aisladas por MACS/FACS antes del cultivo.pb indica par de bases.

La figura 4 es una representación gráfica que muestra la puntuación de cojera de un modelo de artritis reumatoide en ovejas. Las puntuaciones se determinaron como se describe en esta invención.

La figura 5 es una representación gráfica que muestra los recuentos de leucocitos en el líquido sinovial de corvejones derechos (no estimulados) e izquierdos (estimulados) de ovejas individuales durante el transcurso del ensayo (como se indica en el dibujo). Las ovejas B1627 y B4036 se inmunizaron con colágeno tipo II aviar y todas las demás ovejas se inmunizaron con colágeno tipo II bovino. En los respondedores superiores, la concentración de leucocitos en el lado de control también se elevó, lo que indica la posibilidad de una respuesta sistémica.

La figura 6 es una representación gráfica que muestra los recuentos de leucocitos en el líquido sinovial de las ovejas de control (n = 7) y las ovejas inmunizadas con colágeno bovino tipo II (n = 5). Los datos muestran el error ± estándar de la media.

La figura 7A es una representación gráfica que muestra los niveles de anticuerpos IgM (panel izquierdo) e IgG (panel derecho) contra el colágeno bovino tipo II en el líquido sinovial de los corvejones derecho (control) e izquierdo (estimulado) de 5 ovejas inmunizadas con colágeno bovino tipo II. Se tomó líquido sinovial en la autopsia, 42 días después de la inmunización inicial. Los niveles de IgM aumentaron de 4 a 8 veces y los niveles de IgG aumentaron de 10 a 60 veces en los corvejones estimulados.

La figura 7B es una representación gráfica que muestra los niveles de anticuerpos IgM (panel izquierdo) e IgG (panel derecho) contra el colágeno aviar tipo II en el líquido sinovial de los corvejones derecho (control) e izquierdo (estimulado) de 2 ovejas inmunizadas con colágeno aviar tipo II. Se tomó líquido sinovial en la autopsia, 42 días después de la inmunización inicial. Los niveles de IgM aumentaron de 3 a 5 veces y los niveles de IgG aumentaron de 2 a 8 x 106 veces en los corvejones estimulados.

La figura 8A muestra puntuaciones de histopatología agregadas e individuales (hiperplasia, activación estromal, infiltrado de células inflamatorias) para las membranas sinoviales de las articulaciones del corvejón izquierdo de todos los grupos. Anova = p < 0,04; p de la prueba de Mann-Whitney.

La figura 8B muestra la histopatología agregada e individual para las membranas sinoviales de las articulaciones del corvejón derecho de todos los grupos inyectados por vía intravenosa.

La figura 8C muestra puntuaciones de histopatología agregadas e individuales para las membranas sinoviales de los grupos inyectados intraarticularmente (IA) con solución salina o CPM.

La figura 9A muestra el sistema de puntuación CD14 (esquema de puntuación de la íntima como se describe en Mo y col., J Rheumatol. 38: 2301 - 2308, 2011).

La figura 9B muestra un esquema discreto de puntuación celular aplicado a CD4, CD8, Gamma-delta TCR, CD79a y Ki-67.

La figura 9C muestra el sistema de puntuación de citoquinas y moléculas de adhesión aplicado a VCAM-1, IL-6, IL-10, IL-1p, IL-17, TNFa y CD14 intersticial.

La figura 10A muestra puntuaciones inmunohistológicas medias ± de desviación estándar para CD4, CD8, TCR Gamma-delta y CD79a en tejidos sinoviales de la articulación del corvejón izquierdo para el control y los grupos inyectados con CPM.

La figura 10B muestra las puntuaciones inmunohistológicas medias de desviación estándar para VCAM-intima, VCAM-intersticial, Ki67-íntima y Ki67-intersticial en tejidos sinoviales de la articulación del corvejón izquierdo para el control y los grupos inyectados con CPM.

La figura 10C muestra las puntuaciones inmunohistológicas medias ± de desviación estándar para IL-10-íntima, IL-10-intersticial, IL1beta-íntima e IL1beta-intersticial en tejidos sinoviales de la articulación del corvejón izquierdo para el control y los grupos inyectados con CPM.

La figura 10D muestra la media del error estándar de la media para las puntuaciones de tinción inmunohistoquímica sinovial para IL-6 y TNF-alfa para la íntima sinovial y los tejidos intersticiales del control de solución salina IV y los grupos inyectados con CPM. Los valores de p mostrados se calcularon utilizando la prueba t no paramétrica de Mann-Whitney.

La figura 10E muestra la media del error estándar de la media para la tinción inmunohistoquímica sinovial de tejido intersticial para las células CD14 positivas para el control de solución salina y los grupos inyectados con CPM. Los valores de p mostrados se calcularon utilizando la prueba t no paramétrica de Mann-Whitney.

La figura 10F muestra la media del error estándar de la media para la tinción inmunohistoquímica sinovial de tejido intersticial para IL-17 para el control de solución salina y los grupos inyectados con CPM. Los valores de p mostrados se derivaron de ANOVa con la prueba de Krushal-Wallis y la prueba post-hoc de Dunns.

La figura 11A muestra microfotografías de secciones sinoviales sometidas a una inmunotinción para las células CD14 que muestran las puntuaciones asignadas. Aumento x 100.

La figura 11B muestra microfotografías de secciones sinoviales sometidas a una inmunotinción para TNF-a que muestra las puntuaciones asignadas. Aumento x 100.

La figura 11C muestra microfotografías de secciones sinoviales que muestran una inmunotinción para IL-6 que muestra las puntuaciones asignadas. Aumento x 100.

La figura 11D muestra microfotografías de secciones sometidas a una inmunotinción para IL-17 que muestra las puntuaciones asignadas. Aumento x 100.

La figura 11E muestra microfotografías de secciones sometidas a una inmunotinción para IL-10 que muestra las puntuaciones asignadas. Aumento x 100.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Técnicas generales y definiciones seleccionadas

A lo largo de esta especificación, a menos que se indique específicamente lo contrario o el contexto requiera lo contrario, se debe hacer referencia a una sola etapa, composición de materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia para abarcar uno y una pluralidad (es decir, uno o más) de esas etapas, composiciones de materia, grupo de etapas o grupos de composiciones de materia.

Cada realización o ejemplo descrito en esta invención debe aplicarse mutatis mutandis a todas y cada una de las otras realizaciones, a menos que se indique específicamente.

Los expertos en la técnica observarán que la descripción descrita en la presente es susceptible a otras variaciones y modificaciones además de las que se describen específicamente. Debe entenderse que la descripción incluye todas estas variaciones y modificaciones. La descripción también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos mencionados o indicados en esta memoria descriptiva, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones o cualesquiera dos o más de dichas etapas o características.

La presente descripción no debe limitarse, en cuanto a su alcance, a las realizaciones descritas en esta invención, las cuales solo tienen fines ejemplificativos. Los productos, composiciones y procedimientos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la descripción como se describe en esta invención.

La presente descripción se realiza sin experimentación indebida utilizando, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, virología, tecnología de ADN recombinante, síntesis de péptidos en solución, síntesis de péptidos en fase sólida e inmunología. Dichos procedimientos se describen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Segunda edición (1989), todos los volúmenes I, II y III; DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (D. N. Glover, ed., 1985), iRl Press, Oxford, todo el texto; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, todo el texto y particularmente los Artículos allí contenidos de Gait, ppl-22; Atkinson y col., páginas 35-81; Sproat y col., páginas 83-115; y Wu y col., páginas 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames y S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, todo el texto; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, todo el texto; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), toda la serie; J.F. Ramalho Ortigao, “The Chemistry of Peptide Synthesis” En: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Alemania); Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73336-342; Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. y Merrifield, R.B. (1979) en The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, páginas 1-284, Academic Press, Nueva York. 12. Wünsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Müler, E., ed.), vol. 15, 4ta edición, Partes 1 y 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. y Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes I a IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); y Animal Cell Culture: Practical Approach, Tercera edición (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, todo el texto.

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra “comprender”, o las variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, involucra la inclusión de una etapa o elemento o integrante o grupo de etapas establecido, o elementos o enteros, pero no la exclusión de ninguna otra etapa o elemento o integrante o grupo de elementos o integrantes.

Como se usa en esta invención, el término “derivado de” se tomará para indicar que se puede obtener un número entero especificado de una fuente particular, aunque no necesariamente directamente de esa fuente. En el contexto de los factores solubles derivados de las células STRO-1 y/o las células de su progenie, este término se considerará que significa uno o más factores, por ejemplo, proteínas, péptidos, carbohidratos, etc., producidos durante el cultivo in vitro cultivo de células STRO-1 y/o las células de su progenie.

Como se usa en esta invención, el término “enfermedades reumáticas” se entenderá que significa cualquier enfermedad caracterizada por una respuesta inflamatoria en al menos una articulación en un sujeto. En un ejemplo, la enfermedad reumática es causada por, o se asocia a, una afección autoinmune. Las enfermedades reumáticas ejemplares se conocen en la técnica y/o se describen en esta invención.

Como se usa en esta invención, el término “cantidad efectiva” se considerará que significa una cantidad suficiente de células STRO-1+ y/o células de su progenie y/o sus factores solubles derivados para reducir la inflamación y/o el número de células inflamatorias y/o citocinas inflamatorias en la articulación de un sujeto que causa, o se asocia a, una enfermedad reumática.

Como se usa en esta invención, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” se considerará que significa una cantidad suficiente de células STRO-1+ y/o células de su progenie y/o sus factores solubles derivados para reducir o inhibir uno o más síntomas de una enfermedad reumática.

Como se usa en esta invención, el término “cantidad profilácticamente efectiva” se considerará que significa una cantidad suficiente de células STRO-1+ y/o células de su progenie y/o sus factores solubles derivados para prevenir, inhibir o retrasar la aparición de uno o más síntomas detectables de una enfermedad articular inflamatoria.

Como se usa en esta invención, se entenderá que el término “dosis baja” significa una cantidad de células STRO-1 y/o células de su progenie, en menos de 1 x 106 células/kg, pero aún en una cantidad suficiente para reducir la inflamación y/o una citocina inflamatoria y/o el número de células inflamatorias en la articulación de un sujeto. Por ejemplo, una dosis baja comprende 0,5 x 106, 0,4 x 106, 0,3 x 106 o 0,1 x 106 células o menos por kg.

Como se usa en esta invención, el término “dosis alta” se entenderá que significa una cantidad de células STRO-1 y/o células de su progenie suficientes para reducir la IL-6, la TNFa y la IL-17, además de las células CD14+ en un sujeto, por ejemplo, dentro de una articulación de un sujeto, como dentro del tejido sinovial, como más de 1,5 x 106 células/kg. Por ejemplo, una dosis comprende entre aproximadamente 1,5 x 106 y alrededor de 4 x 106 células/kg. Por ejemplo, una dosis alta comprende aproximadamente 1,5 x 106 o alrededor de 2 x 106/kg.

Como se usa en esta invención, los términos “tratar”, “tratamiento” o “tratar” se entenderá que significan administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de factores solubles y/o células para reducir o inhibir al menos un síntoma de una enfermedad inflamatoria de las articulaciones.

Como se usa en esta invención, los términos “prevenir”, “prevenir” o “prevención” se entenderá que significan administrar una cantidad profilácticamente efectiva de factores solubles y/o células para detener, obstaculizar o retrasar el desarrollo o la progresión de una enfermedad articular inflamatoria.

Como se usa en esta invención, el término “factores solubles” se entenderá que significa cualquier molécula, por ejemplo, una proteína, un péptido, una glucoproteína, un glucopéptido, una lipoproteína, un lipopéptido, un carbohidrato, etc., producida por células STRO-1+ y/o células de su progenie que son solubles en agua. Dichos factores solubles pueden ser intracelulares y/o secretados por una célula. Tales factores solubles pueden ser una mezcla compleja (por ejemplo, sobrenadante) y/o una fracción de los mismos y/o pueden ser un factor purificado. En un ejemplo de la presente descripción, los factores solubles están o están contenidos dentro del sobrenadante. En consecuencia, cualquier ejemplo en esta invención dirigido a la administración de uno o más factores solubles se tomará para la aplicación mutatis mutandis a la administración de sobrenadante.

Como se usa en esta invención, el término “sobrenadante” se refiere al material no celular producido después del cultivo in vitro de células precursoras mesenquimales, y/o células de su progenie, en un medio adecuado, tal como un medio líquido. Típicamente, el sobrenadante se produce cultivando las células en el medio en las condiciones y el tiempo adecuados, seguido de la eliminación del material celular mediante un proceso tal como la centrifugación. El sobrenadante puede o no haber sido sometido a etapas de purificación adicionales antes de la administración. En un ejemplo, el sobrenadante comprende menos de 105, como menos de 104, por ejemplo, menos de 103 y, por ejemplo, ninguna célula viva.

Como se usa en esta invención, el término “sujeto normal o sano” se entenderá como un sujeto que no padece una enfermedad inflamatoria de las articulaciones según lo evaluado por cualquier procedimiento conocido en la técnica y/o descrito en esta invención.

Como se usa en esta invención, el término “sujeto” se entenderá que significa cualquier animal, incluidos los humanos, por ejemplo, un mamífero. Los temas ejemplares incluyen, entre otros, humanos, primates, ganado (por ejemplo, ovejas, vacas, caballos, burros y cerdos), animales de compañía (por ejemplo, perros y gatos), animales de prueba de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos, ratas, cobayas y hámsteres), y animales salvajes cautivos (por ejemplo, zorros o ciervos). En un ejemplo, el mamífero es un humano o un primate. En un ejemplo, el mamífero es un humano. En un ejemplo, un sujeto es elegible para el tratamiento que está experimentando o ha experimentado uno o más signos, síntomas u otros indicadores de daño articular inflamatorio, ha sido diagnosticado con daño articular inflamatorio, ya sea, por ejemplo, recién diagnosticado o diagnosticado previamente y ahora experimenta una recurrencia o recaída, o está en riesgo de desarrollar daño articular inflamatorio.

Enfermedades reumáticas

En un ejemplo de la presente descripción, las enfermedades reumáticas son enfermedades inflamatorias de las articulaciones. Las enfermedades inflamatorias de las articulaciones se usan en esta invención en el sentido más amplio y se refieren al daño o la destrucción parcial o completa de cualquier parte de una o más articulaciones, incluidos el tejido conectivo y el cartílago, donde el daño incluye daño estructural y/o funcional de cualquier causa y se caracteriza por inflamación en la articulación, y puede o no causar dolor en las articulaciones/artralgia. Este daño puede ser causado por cualquier afección, por ejemplo, una enfermedad autoinmune como la artritis (por ejemplo, la artritis aguda y crónica), la artritis reumatoide, incluida la artritis reumatoide de inicio juvenil, la artritis idiopática juvenil (AIJ) o la AR juvenil (ARJ), y etapas como la sinovitis reumatoide, la gota o la artritis gotosa, la artritis inmunológica aguda, la artritis inflamatoria crónica, la artritis degenerativa, la artritis inducida por colágeno tipo II, la artritis infecciosa, la artritis séptica, la artritis de Lyme, la artritis proliferativa, la artritis psoriásica, la enfermedad de Still, la artritis vertebral, la osteoartritis, la artritis crónica progrediente, la artritis deformante, la poliartritis crónica primaria, la artritis reactiva, la artritis menopáusica, la artritis de agotamiento de estrógenos y la espondilitis anquilosante/espondilitis reumatoide), la enfermedad autoinmune reumática distinta de la AR, el compromiso sistémico significativo secundario a la AR (incluyendo, entre otros, la vasculitis, la fibrosis pulmonar o el síndrome de Felty), la espondiloartropatía seronegativa, la enfermedad de Lyme, la enfermedad mixta del tejido conectivo y los trastornos autoinmunes asociados a una enfermedad del colágeno.

En un ejemplo, la persona experta entenderá que una enfermedad inflamatoria de las articulaciones no es una lesión del cartílago o del hueso o la articulación causada únicamente, por ejemplo, por el uso excesivo o una lesión deportiva o impacto en una articulación, ya que estas afecciones no son enfermedades.

En un ejemplo, la enfermedad inflamatoria de las articulaciones se asocia a, o es causada por, una enfermedad autoinmune. Una “enfermedad autoinmune” es una enfermedad que se origina y se dirige contra los propios tejidos u órganos de un sujeto o un co-segregado o manifestación del mismo, o la condición resultante del mismo. En un ejemplo, la enfermedad inflamatoria de las articulaciones es una enfermedad inflamatoria de las articulaciones autoinmune, tal como la causada por un sujeto que tiene una respuesta inmune contra un antígeno que ocurre en la articulación del sujeto.

En un ejemplo, el daño articular inflamatorio es causado por la artritis, como la artritis reumatoide, la osteoartritis, la espondilitis anquilosante o la artritis psoriásica.

En un ejemplo, la enfermedad inflamatoria de las articulaciones es la artritis reumatoide.

En un ejemplo, la enfermedad inflamatoria de las articulaciones es la artrosis de osteoartritis.

Para los fines de este documento, las articulaciones son puntos de contacto entre los elementos de un esqueleto (de un vertebrado como un animal) con las partes que lo rodean y lo sostienen e incluyen, entre otras, caderas, articulaciones entre las vértebras de la columna vertebral, articulaciones entre la columna vertebral y la pelvis (articulaciones sacroilíacas), articulaciones donde los tendones y ligamentos se unen a los huesos, articulaciones entre las costillas y la columna vertebral, hombros, rodillas, pies, codos, manos, dedos, tobillos y dedos de los pies, pero especialmente las articulaciones en las manos y pies.

Los procedimientos para detectar y/o diagnosticar la enfermedad inflamatoria de las articulaciones y/o controlar la eficacia del tratamiento y/o si se requiere o recomienda un tratamiento adicional serán evidentes para el experto en la materia. Por ejemplo, comparar el número de articulaciones sensibles e inflamadas entre la línea de base y varios puntos de tiempo durante el tratamiento es una forma típica de evaluar el estado de las articulaciones y la respuesta al tratamiento. En el recuento conjunto del Colegio Americano de Reumatología (ACR) para la AR (Felson y col., Arthritis & Rheumatology 38: 727-735, 1995), 68 articulaciones se evalúan en cuanto a la sensibilidad y 66 en cuanto a la inflamación (la cadera no se evalúa por inflamación). En la puntuación de actividad de la enfermedad (DAS) empleada principalmente en Europa, se utiliza un recuento de 44 o 28 articulaciones en la AR. Además del recuento conjunto, los criterios de evaluación ACR incluyen los siguientes elementos para comprender una puntuación compuesta: paciente global (en una escala analógica visual[VAS]), dolor del paciente, médico global, cuestionario de evaluación de salud (HAQ; una medida de función y un reactivo de fase aguda (proteína C reactiva o velocidad de sedimentación). Una respuesta ACR 20 constituiría una mejora del 20 % en el recuento de articulaciones inflamadas y sensibles y una mejora del 20 % de al menos 3 de los otros 5 elementos en los criterios compuestos. Las respuestas ACR 50 y 70 representan al menos una mejora del 50 % y 70 % de estos elementos. El sistema ACR solo representa el cambio, mientras que el sistema DAS representa tanto el estado actual de la actividad de la enfermedad como el cambio. El sistema de puntuación DAS utiliza una fórmula matemática ponderada, derivada de ensayos clínicos en AR. Por ejemplo, el ^dA^s 28 es 0,56(T28)+0,28(SW28)+0,70(Ln ESR)+0,014GH, donde T representa el número de articulaciones sensibles, SW es el número de articulaciones inflamadas, ESR es la velocidad de sedimentación globular y GH es la salud global. Varios valores del DAS representan una alta o baja actividad de la enfermedad, así como también la remisión, y el cambio y la puntuación del criterio de valoración dan como resultado una categorización del paciente por grado de respuesta (ninguno, moderado, bueno).

Como se usa en esta invención, “artritis reumatoide” se refiere a un estado de enfermedad reconocido que puede diagnosticarse según los criterios revisados en 2000 de la Asociación Americana de Reumatología para la clasificación de la artritis reumatoide, o cualquier criterio similar. Los indicadores fisiológicos de la AR incluyen inflamación articular simétrica que es característica, aunque no invariable, en la artritis reumatoide. La inflamación fusiforme de las articulaciones interfalángicas proximales (PIP) de las manos, así como las articulaciones metacarpofalángicas (MCP), muñecas, codos, rodillas, tobillos y metatarsofalángicas (MTP) se ven comúnmente afectadas y la inflamación se detecta fácilmente. El dolor en el movimiento pasivo es la prueba más sensible para la inflamación de las articulaciones, y la inflamación y la deformidad estructural a menudo limitan el intervalo de movimiento de la articulación afectada. Los cambios visibles típicos incluyen desviación cubital de los dedos en las articulaciones MCP, hiperextensión o hiperflexión de las articulaciones MCP y PIP, contracturas de flexión de los codos y subluxación de los huesos y dedos del carpo. El sujeto con artritis reumatoide puede o no ser resistente a los FARME, ya que los FARME no son efectivos o totalmente efectivos en el tratamiento de los síntomas. Además, el sujeto puede haber experimentado una respuesta inadecuada al tratamiento previo o actual con inhibidores de TNF como etanercept, infliximab y/o adalimumab debido a una toxicidad o eficacia inadecuada (por ejemplo, etanercept durante 3 meses a 25 mg dos veces por semana o al menos 4 infusiones de infliximab a 3 mg/kg) y/o la terapia anti-CD20 (por ejemplo, rituximab).

La artritis reumatoide también puede diagnosticarse por la presencia de autoanticuerpos, por ejemplo, el factor reumatoide (anticuerpos que se unen a IgG) y/o el péptido citrulinado anticíclico y/o la ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2 (RA33) y/o el colágeno tipo II y/o las proteínas de estrés (por ejemplo, BiP o hsp90) y/o la glucosasfosfato isomerasa (GPI).

La “artritis psoriásica” o “PsA” es una enfermedad crónica caracterizada por inflamación de la piel (psoriasis) y las articulaciones (artritis). La psoriasis presenta áreas irregulares, elevadas, rojas de inflamación de la piel con escamas y a menudo afecta las puntas de los codos y las rodillas, el cuero cabelludo, el ombligo y alrededor de las áreas genitales o el ano. Aproximadamente el 10 % de los pacientes con psoriasis también desarrollan una inflamación asociada de sus articulaciones. A los pacientes que tienen artritis inflamatoria y psoriasis se les diagnostica artritis psoriásica. La artritis psoriásica es una enfermedad reumática sistémica que también puede causar inflamación en los tejidos del cuerpo lejos de las articulaciones y la piel, así como en los ojos, el corazón, los pulmones y los riñones. La “espondilitis anquilosante” o “AS” es una forma de inflamación crónica de la columna vertebral y las articulaciones sacroilíacas, que se encuentran en la parte baja de la espalda donde el sacro (el hueso directamente sobre el coxis) se encuentra con los huesos ilíacos (huesos a cada lado de las nalgas superiores). La inflamación crónica en estas áreas causa dolor y rigidez en y alrededor de la columna vertebral. Con el tiempo, la inflamación espinal crónica (espondilitis) puede conducir a una cementación completa (fusión) de las vértebras, un proceso conocido como anquilosis. La anquilosis conduce a la pérdida de movilidad de la columna vertebral. La espondilitis anquilosante también es una enfermedad reumática sistémica, lo que significa que puede afectar a otros tejidos en todo el cuerpo. En consecuencia, puede causar inflamación o lesiones en otras articulaciones alejadas de la columna vertebral, así como en otros órganos, como los ojos, el corazón, los pulmones y los riñones.

Las CPM o las células de progenie, y el sobrenadante o uno o más de sus factores solubles derivados Las CPM son células que se encuentran en la médula ósea, la sangre, las células de la pulpa dental, el tejido adiposo, la piel, el bazo, el páncreas, el cerebro, el riñón, el hígado, el corazón, la retina, el cerebro, los folículos pilosos, el intestino, el pulmón, los ganglios linfáticos, el timo, el hueso, el ligamento, el tendón, el músculo esquelético, la dermis y el periostio; y son capaces de diferenciarse en líneas germinales como mesodermo y/o endodermo y/o ectodermo. En un ejemplo, las CPM son células multipotenciales que son capaces de diferenciarse en una gran cantidad de tipos celulares que incluyen, entre otros, tejidos conectivos adiposos, óseos, cartilaginosos, elásticos, musculares y fibrosos. El compromiso con un linaje específico y la ruta de diferenciación con estas células depende enteramente de diversas influencias, desde influencias mecánicas y/o factores bioactivos endógenos, tales como factores de crecimiento, citocinas y/o condiciones microambientales locales establecidas por los tejidos huéspedes. Las CPM son células multipotenciales y, por consiguiente, son células progenitoras no hematopoyéticas que se dividen para dar células hijas que pueden ser células madres o precursoras que, a su vez, se diferenciarán de manera irreversible para dar origen a una célula fenotípica.

Las CPM son positivas para el marcador STRO-1 (es decir, las CPM son células STRO-1+)

En un ejemplo, las células STRO-1 se enriquecen a partir de una muestra obtenida de un sujeto, por ejemplo, un sujeto a tratar, un sujeto relacionado o un sujeto no relacionado (ya sea de la misma especie o diferente). Los términos “enriquecido(a)”, “enriquecimiento” o variaciones de los mismos se usan en esta invención para describir una población de células donde la proporción de un tipo de célula particular o la proporción de un número de tipos de células particulares aumenta cuando se compara con una población no tratada de las células (por ejemplo, células en su entorno nativo). En un ejemplo, una población enriquecida en células STRO-1 comprende al menos aproximadamente el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 5, el 10, el 15, el 20, el 25, el 30, el 50 o el 75 % de células STRO-1+. En este sentido, el término “población de células enriquecidas en células STRO-1+” se tomará para proporcionar un respaldo explícito para el término “población de células que comprende X% de células STRO1+”, donde X% es un porcentaje tal como se menciona en esta invención. Las células STRO-1+ pueden, en algunos ejemplos, formar colonias clonogénicas, por ejemplo, UFC-F (fibroblastos) o un subconjunto de las mismas (por ejemplo, 50, 60, 70, 70, 90 o 95 %) pueden tener esta actividad.

En un ejemplo, la población de células se enriquece a partir de una preparación celular que comprende células STRO-1+ en una forma seleccionable. A este respecto, se entenderá que el término “forma seleccionable” significa que las células expresan un marcador (por ejemplo, un marcador de superficie celular) que permite la selección de las células STRO-1+. El marcador puede ser STRO-1, pero no necesita serlo. Por ejemplo, como se describe y/o ejemplifica en esta invención, las células (por ejemplo, CPM) que expresan STRO-2 y/o ^sT^rO-3 (TNAP) y/o S^t R^o -4 y/o VCAM-1 y/o CD146 y/o 3G5 también expresan STRO-1 (y pueden ser STRO-1bright). En consecuencia, una indicación de que las células son STRO-1 no significa necesariamente que las células se seleccionan mediante la expresión STRO-1. En un ejemplo, las células se seleccionan al menos en base a la expresión de STRO-3, por ejemplo, son STRO-3+ (TNAP+).

La referencia a la selección de una célula o población de la misma no requiere la selección de una fuente de tejido específica. Como se describe en esta invención, las células STRO-1+ pueden seleccionarse de entre, aislarse de, o enriquecerse con una gran variedad de fuentes. Dicho esto, en algunos ejemplos, estos términos proporcionan soporte para la selección de cualquier tejido que comprenda células STRO-1+ (por ejemplo, CPM) o tejido vascularizado o que comprende pericitos (por ejemplo, pericitos STRO-1+) o cualquiera de los tejidos mencionados en esta invención. En un ejemplo, las células utilizadas en la presente descripción expresan uno o más marcadores seleccionados individual o colectivamente del grupo que consiste en TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ o cualquier combinación de las mismas.

El término “individualmente” significa que la descripción abarca los marcadores o grupos de marcadores mencionados por separado, y que, sin perjuicio de que los marcadores individuales o grupos de marcadores no hayan sido nombrados en el presente documento por separado, las reivindicaciones adjuntas pueden definir tal marcador o grupos de marcadores por separado y en forma divisible uno del otro.

El término “colectivamente” significa que la descripción abarca cualquier número o combinación de los marcadores o grupos de péptidos mencionados, y que, sin perjuicio de que dichos números o combinaciones de marcadores o grupos de ellos no hayan sido específicamente nombrados en esta invención, las reivindicaciones adjuntas pueden definir dichas combinaciones o subcombinaciones por separado y de manera divisible de cualquier otra combinación de marcadores o grupos de marcadores.

Por ejemplo, las células STRO-1+ son STRO-1bright (sin. STRO-1bri). En un ejemplo, las células STRO-1bri se enriquecen preferentemente en relación con células STRO-1dim o STRO-1intermediate

Por ejemplo, las células STRO-1bright las células son adicionalmente una o más de las siguientes: TNAP+, VCAM-1+, THY-1+' STRO-2+ y/o CD146+. Por ejemplo, las células se seleccionan para uno o más de los marcadores anteriores y/o se muestra que expresan uno o más de los marcadores anteriores. A este respecto, una célula de la que se muestra que expresa un marcador no necesita ser específicamente probada, más bien las células previamente enriquecidas o aisladas pueden ser probadas y posteriormente utilizadas, puede suponerse razonablemente que las células aisladas o enriquecidas también expresan el mismo marcador.

En un ejemplo, las células precursoras mesenquimales son células precursoras mesenquimales perivasculares como se define en el documento WO 2004/85630. Por ejemplo, las células precursoras mesenquimales expresan un marcador de una célula perivascular, por ejemplo, las células son STRO-1+ o STRO-1bright y/o 3G5+. En un ejemplo, las células son, o fueron previamente, o son una progenie de células que se aislaron del tejido vascularizado u órganos, o partes del mismo.

Cuando se hace referencia a una célula como “positiva” de un marcador dado, puede ser que tenga una expresión baja (lo o dim) o alta (bright, bri) de ese marcador, dependiendo del grado en que el marcador esté presente sobre la superficie celular, donde los términos se relacionan con la intensidad de fluorescencia u otro marcador usado en el proceso de clasificación de las células. La distinción de lo (dim o dull) y bri se entenderá en el contexto del marcador usado en una población celular particular que se está clasificando. Una célula a la que se hace referencia como “negativa” para un marcador dado no necesariamente involucra que dicha célula esté completamente libre de tal marcador. Este término significa que esa célula expresa el marcador es expresado en un nivel relativamente bajo por esa célula y que genera una señal muy baja cuando se marca de manera detectable o es indetectable por encima de los niveles de fondo, por ejemplo, niveles detectados demandando un anticuerpo de control de isotipo.

El término “bright”, cuando se usa en esta invención, hace referencia a un marcador sobre una superficie celular que genera una señal relativamente alta cuando se marca detectablemente. Aunque no se desea limitarse a una teoría, se propone que las células “bright” expresan más de la proteína marcadora diana (por ejemplo, el antígeno reconocido por STRO-1) que otras células en la muestra. Por ejemplo, las células STRO-1bri producen una mayor señal de fluorescencia cuando se marcan con un anticuerpo STRO-1 conjugado con FITC, como se determina mediante el análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), que las células no bright (STRO-1dull/dim). Por ejemplo, las células “bright” constituyen al menos aproximadamente un 0,1 % de las células mononucleares de médula ósea más fuertemente marcadas contenidas en la muestra de partida. En otros ejemplos, las células “bright” constituyen al menos aproximadamente un 0,1, un 0,5, un 1, un 1,5 o al menos alrededor de un 2 % de las células mononucleares de médula ósea más fuertemente marcadas contenidas en la muestra de partida. En un ejemplo, las células STRO-1bright tienen una expresión de magnitud 2 log mayor que la expresión de superficie de STRO-1 en relación con el “fondo”, es decir, las células que son STRO-1-. En comparación, las células STRO-1dim y/o STRO-^ntemê e tienen una expresión mayor de menos de 2 log de magnitud de la expresión de superficie STRO-1, típicamente aproximadamente 1 log o menos que el “fondo”.

Como se usa en esta invención, el término “TNAP” pretende abarcar todas las isoformas de la fosfatasa alcalina no específica de tejido. Por ejemplo, el término abarca la isoforma hepática (LAP), la isoforma ósea (BAP) y la isoforma renal (KAP). En un ejemplo, la TNAP es BAP. En un ejemplo, la TNAP como se usa en la presente invención hace referencia a una molécula que puede unirse al anticuerpo STRO-3 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC el 19 de diciembre de 2005, bajo las disposiciones del Tratado de Budapest, con número de acceso al depósito PTA-7282.

Además, en un ejemplo, las células STRO-1 son capaces de dar lugar a UFC-F clonogénicas.

En un ejemplo, una proporción significativa de células multipotenciales STRO-1 es capaz de diferenciarse en al menos dos líneas germinales diferentes. Los ejemplos no limitantes de linajes con los que pueden estar comprometidos las células multipotenciales incluyen células precursoras óseas; progenitores hepatocíticos, que son multipotentes para células epiteliales de conducto biliar y hepatocitos; células restringidas neurales, que pueden generar precursores de células gliales que evolucionan hasta oligodendrocitos y astrocitos; precursores neuronales que evolucionan hasta neuronas; precursores de músculo cardíaco y cardiomiocitos y líneas celulares beta pancreáticas secretoras de insulina sensibles a glucosa. Otros linajes incluyen, pero sin limitación, odontoblastos, células productoras de dentina y condrocitos y células precursoras de las siguientes: células epiteliales de pigmento retinal, células cutáneas tales como queratinocitos, células dendríticas, células de folículo piloso, células epiteliales de conducto renal, células de músculo liso y esquelético, progenitores testiculares, células endoteliales vasculares, tendón, ligamento, cartílago, adipocito, fibroblasto, estroma medular, músculo cardíaco, músculo liso, músculo esquelético, pericito, células vasculares, epiteliales, gliales, neuronales, astrocíticas y oligodendrocíticas.

En otro ejemplo, las células STRO-1+ no son capaces de dar lugar, tras el cultivo, a células hematopoyéticas.

En un ejemplo, las células se toman del sujeto a tratar, se cultivan in vitro usando técnicas estándar y se utilizan para obtener factores sobrenadantes, solubles o células expandidas para la administración al sujeto como una composición autóloga o alogénica. En un ejemplo alternativo, se utilizan células de uno o más linajes celulares humanos establecidos. En otro ejemplo útil de la descripción, se usan células de un animal no humano (o, si el paciente no es un humano, de otra especie).

La presente descripción también contempla el uso del sobrenadante o factores solubles obtenidos o derivados de células STRO-1+ y/o células de su progenie (las últimas también denominadas células expandidas) que se producen a partir de un cultivo in vitro. Las células expandidas de la descripción pueden tener una amplia variedad de fenotipos dependiendo de las condiciones de cultivo (incluyendo el número y/o tipo de factores estimulantes en el medio de cultivo), el número de pases y similares. En ciertos ejemplos, las células de progenie se obtienen luego de alrededor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 pases de la población parental. Sin embargo, las células de progenie pueden obtenerse luego de cualquier número de pases de la población parental.

Las células de progenie pueden obtenerse mediante el cultivo en cualquier medio apropiado. El término “medio”, según su uso en referencia a un cultivo celular, incluye los componentes del entorno que rodea a las células. Los medios pueden ser sólidos, líquidos, gaseosos o una combinación de fases y materiales. Los medios incluyen medios de crecimiento líquido, así como también medios que no sostienen el crecimiento celular. Los medios también incluyen medios gelatinosos como agar, agarosa, gelatina y matrices de colágeno. Los medios gaseosos a modo de ejemplo incluyen la fase gaseosa a la que se exponen las células que crecen en una placa de petri u otro soporte sólido o semisólido. El término “medio” también hace referencia al material cuya utilización se pretende en un cultivo celular, incluso si aún no ha estado en contacto con las células. En otras palabras, un líquido rico en nutrientes preparado para el cultivo bacteriano es un medio. Una mezcla de polvo que, al mezclarse con agua u otro líquido, se convierte en adecuada para el cultivo celular puede denominarse como “medio en polvo”.

En un ejemplo, las células de progenie útiles para los procedimientos de la descripción se obtienen aislando células TNAP+ STRO-1 de la médula ósea utilizando bolas magnéticas marcadas con el anticuerpo STRO-3, y luego expandiendo por cultivo las células aisladas (véase Gronthos y col., Blood 85: 929-940, 1995 para obtener un ejemplo de las condiciones de cultivo adecuadas).

En un ejemplo, tales células expandidas (progenie) (por ejemplo, al menos después de 5 pases) pueden ser TNAP-, CC9⁺, HLA clase I⁺, HLA clase II-, CD14-, CD19-, CD3-, CD11a-c-, CD31-, CD86-, CD34^- y/o CD80-. Sin embargo, es posible que, en condiciones de cultivo diferentes a las descritas en esta invención, la expresión de los diferentes marcadores pueda variar. También, aunque las células de estos fenotipos pueden predominar en la población celular expandida, no significa que no haya una proporción minoritaria de las células que no tengan este fenotipo o fenotipos (por ejemplo, un pequeño porcentaje de las células expandidas puede ser CC9-). En un ejemplo, las células expandidas aún tienen la capacidad de diferenciarse en tipos de células diferentes.

En un ejemplo, una población celular expandida y utilizada para obtener el sobrenadante, factores solubles o células per se, comprende células en las que al menos el 25 %, por ejemplo, al menos el 50 %, de las células son CC9⁺.

En otro ejemplo, una población celular expandida y utilizada para obtener el sobrenadante, factores solubles o células per se, comprende células en las que al menos el 40 %, por ejemplo, al menos el 45 %, de las células son STRO-1⁺.

En otro ejemplo, las células expandidas pueden expresar uno o más marcadores seleccionados colectiva o individualmente de entre el grupo que consiste en LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-selectina, L-selectina, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD 90, CD29, CD18, CD61, integrina beta 6-19, trombomodulina, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1- R, NGF-R, FGF-R, Leptina-R (STRO-2 = Leptina-R), RANKL, STRO-1^bright y CD146 o cualquier combinación de estos marcadores.

En un ejemplo, las células de progenie son células de progenie multipotenciales expandidas (MEMP) STRO-1⁺ , como se define y/o se describe en el documento WO 2006/032092. Los procedimientos para la preparación de poblaciones enriquecidas de células multipotenciales STRO-1⁺ de las que puede derivarse la progenie se describen en los documentos WO 01/04268 y WO 2004/085630. En un contexto ^{in vitr°} de las células multipotenciales STRO-1 ⁺ raramente se encontrarán presentes como una preparación absolutamente pura y en general estarán presentes junto a otras células comprometidas de un tejido específico (TSCC).El documento WO 01/04268 hace referencia a la recolección de dichas células de la médula ósea en niveles de pureza de alrededor de entre un 0,1 y un 90 %. La población que comprende las CPM de las que se deriva la progenie puede cosecharse directamente de una fuente de tejido, o alternativamente puede ser una población que ya se ha expandido ex vivo.

Por ejemplo, la progenie puede obtenerse de una población recolectada y no expandida de células STRO-1 ⁺ multipotenciales sustancialmente purificadas que comprende al menos un 0,1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o un 95 % del total de células de la población en la que se encuentran presentes. Este nivel puede alcanzarse, por ejemplo, mediante la selección de células que son positivas en al menos un marcador individual o colectivamente seleccionado de entre el grupo que consiste en TNAP, STRO-1^bright, 3G5⁺, VCAM-1, THY-1, CD146 y STRO-2.

Las MEMP se pueden distinguir de las células multipotenciales STRO-1⁺ recién recolectadas en que son positivas para el marcador STRO-1^bri y negativas para el marcador fosfatasa alcalina (FA). Por el contrario, las células multipotenciales STRO-1⁺ aisladas recientemente son positivas tanto para STRO-1 como para FA. En un ejemplo de la presente descripción, al menos el 15, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o el 95 % de las células administradas tienen el fenotipo STRO-1^bri, FA^' . En otro ejemplo, las MEMP son positivas para uno o más de los marcadores Ki67, CD44 y/o CD49c/CD29, VLA-3, a3p1. Incluso en otro ejemplo, las MEMP no muestran actividad TERT y/o son negativas para el marcador CD18.

Las población inicial de células STRO-1⁺ puede derivarse de uno o más de los tipos de tejido establecidos en el documento WO 01/04268 o WO 2004/085630, a saber, la médula ósea, células de la pulpa dental, tejido adiposo y piel, o quizás más ampliamente del tejido adiposo, dientes, pulpa dental, piel, hígado, riñón, corazón, retina, cerebro, folículos pilosos, intestino, pulmón, bazo, ganglio linfático, timo, páncreas, hueso, ligamento, médula ósea, tendón y músculo esquelético.

Se entenderá que, al realizar la presente descripción, la separación de las células que cargan cualquier marcador de una cierta superficie celular puede llevarse a cabo mediante un número de distintos procedimientos. Sin embargo, los procedimientos ejemplares se basan en la unión de un agente de unión (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno allí presente) con un marcador en cuestión, seguido de una separación de aquellos que muestran unión, ya sea que cuenten con un nivel de unión alto, bajo o nulo. Los agentes de unión más convenientes son anticuerpos o moléculas basadas en anticuerpos, con los procedimientos ejemplares siendo anticuerpos monoclonales o basados en anticuerpos monoclonales debido a la especificidad de estos últimos agentes. Los anticuerpos pueden utilizarse para ambas etapas. Sin embargo, también es posible usar otros agentes, de este modo, los ligandos para estos marcadores también pueden emplearse para el enriquecimiento o ausencia de las células que los transportan. Los agentes de unión o ligandos pueden enlazarse con un soporte sólido para permitir una separación bruta. Las técnicas de separación ejemplares maximizan la retención de viabilidad de la fracción para recoger. Pueden emplearse diversas técnicas de diferente eficacia para obtener separaciones relativamente brutas. La técnica particular empleada dependerá de la eficiencia de separación, la citotoxicidad asociada, la facilidad y velocidad de rendimiento y la necesidad de un equipo sofisticado y/o habilidades técnicas. Los procedimientos para la separación pueden incluir, pero sin limitación, separación magnética usando perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo, cromatografía de afinidad e “inmunopurificación” con anticuerpo enlazado con una matriz sólida. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen, entre otros, la FACS. Los procedimientos para la realización de FACS resultarán aparentes para los expertos en la materia.

Los anticuerpos contra cada uno de los marcadores descritos en esta invención se encuentran comercialmente disponibles (por ejemplo, los anticuerpos monoclonales contra las STRO-1 se encuentran comercialmente disponibles de R&D Systems, EE.UU.), disponibles en la Colección de Cultivos Tipo de EE.UU. (ATCC) u otras organizaciones depositarias y/o pueden producirse mediante técnicas reconocidas en la materia.

Los procedimientos ejemplares para aislar las células STRO-1 comprenden una primera etapa que es una etapa de clasificación en fase sólida que utiliza, por ejemplo, una clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) que reconoce la expresión de alto nivel de STRO-1. Entonces, es posible seguir con una segunda etapa de clasificación, en caso de así desearlo, que dé como resultado un nivel más alto de una expresión de célula precursora, tal como se describe en la memoria descriptiva de la patente WO 01/14268. Esta segunda etapa de clasificación puede involucrar el uso de dos o más marcadores.

El procedimiento para obtener las células STRO-1 también puede incluir la recolección de una fuente de células antes de la primera etapa de enriquecimiento utilizando técnicas conocidas. Por consiguiente, el tejido será eliminado quirúrgicamente. Entonces, se separarán las células que comprenden el tejido fuente en lo que se denomina suspensión celular simple. Esta separación puede conseguirse por medios físicos o enzimáticos.

Una vez que se ha obtenido una población celular STRO-1+ adecuada, la misma se puede cultivar o expandir usando cualquier medio adecuado para obtener MEMP.

En un ejemplo, las células se toman del sujeto a tratar, se cultivan in vitro usando técnicas estándar y se utilizan para obtener factores sobrenadantes, solubles o células expandidas para la administración al sujeto como una composición autóloga o alogénica. En un ejemplo alternativo, se utilizan células de uno o más linajes celulares humanos establecidos para obtener los factores sobrenadantes o solubles. En otro ejemplo útil de la descripción, se usan células de un animal no humano (o, si el paciente no es un humano, de otra especie) para obtener factores sobrenadantes o solubles.

La descripción se puede practicar utilizando células de cualquier especie animal no humana, incluidas, entre otras, las células de primates no humanos, células unguladas, caninas, felinas, lagomorfas, de roedores, aves y peces. Las células de primates con las que puede llevarse a cabo la descripción incluyen, entre otras, las células de chimpancés, babuinos, monos cangrejeros y cualquier mono del Nuevo o el Viejo Mundo. Las células de ungulados con las que puede llevarse a cabo la descripción incluyen, entre otras, las células de bovinos, porcinos, ovinos, caprinos, equinos, búfalos y bisontes. Las células de roedores con las que puede llevarse a cabo la descripción incluyen, entre otras, las de ratones, ratas, conejillos de indias, hámsteres y jerbos. Los ejemplos de especies de lagomorfos con los que puede llevarse a cabo la descripción incluyen conejos domesticados, salvajes, liebres, conejos de rabo blanco, liebres americanas y ochotonas. Los pollos (Gallus gallus) constituyen un ejemplo de especie aviar con la que puede llevarse a cabo la descripción.

Las células útiles para los procedimientos de la descripción pueden almacenarse antes de su uso, o antes de obtener el sobrenadante o los factores solubles. Los procedimientos y protocolos para preservar y almacenar células eucariotas, y en particular células de mamíferos, son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Pollard, J. W. y Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, segunda edición, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, cuarta edición, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.). Cualquier procedimiento que mantenga la actividad biológica de las células madre aisladas, tal como las células madre mesenquimales o células progenitoras, o la progenie allí presente, pueden utilizarse en conexión con la presente descripción. En un ejemplo, las células se mantienen y almacenan mediante el uso de la criopreservación.

Células genéticamente modificadas

En un ejemplo, las células STRO-1+ y/o las células de su progenie se modifican genéticamente, por ejemplo, para expresar y/o secretar una proteína de interés. Por ejemplo, las células están diseñadas para expresar una proteína útil en el tratamiento de una enfermedad articular inflamatoria, como un anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, adalimumab o infliximab) o un anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, rituximab u ocrelizumab) o un receptor soluble de TNF (por ejemplo, etanercept) o un péptido útil para tratar tales afecciones (por ejemplo, como se describe en el documento de los EE.UU. 5837686).

Los procedimientos para la modificación genética de una célula resultarán aparentes para los expertos en la materia.

Por ejemplo, un ácido nucleico que debe expresarse en una célula se liga de manera operativa a un promotor para la inducción de la expresión en la célula. Por ejemplo, el ácido nucleico se une a un promotor operativo en una serie de células de un sujeto, tal como, por ejemplo, un promotor viral, por ejemplo, un promotor de CMV (por ejemplo, un promotor de CMV-IE) o un promotor SV-40. En la técnica, se conocen promotores adecuados adicionales, los cuales deben tomarse para su aplicación mutatis mutandis al presente ejemplo de la descripción.

Por ejemplo, el ácido nucleico se proporciona en forma de una construcción de expresión. Como se utiliza en esta invención, el término “construcción de expresión” se refiere a un ácido nucleico que cuenta con la capacidad de dar una expresión en un ácido nucleido (por ejemplo, un gen indicador y/o un gen indicador contraseleccionable) al que se encuentra conectado de manera operativa, en una célula. Dentro del contexto de la presente descripción, debe entenderse que una construcción de expresión puede comprender o ser un plásmido, un bacteriófago, un fagémido, un cósmido, un fragmento genómico o subgenómico de un virus u otro ácido nucleico capaz de mantener y/o replicar ADN heterólogo en un formato expresable.

Los procedimientos para la construcción de una construcción de expresión adecuada para la realización de la descripción serán evidentes para el experto en la materia y se describen, por ejemplo, en Ausubel y col., (en: Protocolos actuales de biología molecular. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987) o Sambrook y col., (En: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, tercera edición 2001). Por ejemplo, cada uno de los componentes de la construcción de expresión se amplifica a partir de un ácido nucleico templado y adecuado usando, por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y posteriormente se lo clona en una construcción de expresión adecuada, por ejemplo, un plásmido o fagómido.

Los vectores adecuados para tal construcción de expresión son conocidos en la materia y/o descritos en este documento. Por ejemplo, un vector de expresión adecuado para el procedimiento de la presente descripción en una célula de mamífero, por ejemplo, un vector del conjunto de vectores ADNpc suministrado por Invitrogen, un vector del conjunto de vectores pCI (Promega), un vector del conjunto de vectores CMVp (Clontech), un vector pM (Clontech), un vector SIp (Promega), un vector VP 16 (Clontech) o un vector del conjunto de vectores ADNpc (Invitrogen).

El experto en la materia conocerá los vectores y fuentes adicionales de dichos vectores, tales como, por ejemplo, Life Technologies Corporation, Clontech o Promega.

Los expertos en la técnica conocen los medios para introducir la molécula de ácido nucleico aislada o una construcción génica que comprende la misma en una célula para la expresión. La técnica utilizada para un organismo dado depende de las técnicas exitosas conocidas. Los medios para la introducción de ADN recombinante dentro de las células incluyen microinyecciones, transfecciones mediadas por DEAE-dextran, transfección mediada por liposomas como en el uso de lipofectamina (Gibco, MD, EE.UU.) y/o celfectina (Gibco, MD, EE.UU.), captación de Ad N mediada por PEG, electroporación y bombardeo con micropartículas como en el uso de tungsteno recubierto de ADN o partículas de oro (Agraceuts Inc., WI, EE.UU.), entre otros.

Alternativamente, una construcción de expresión de la descripción es un vector viral. Los vectores virales adecuados son conocidos en la materia y se encuentran comercialmente disponibles. Los sistemas convencionales basados en virales para el suministro de un ácido nucleico e integración del mismo en un genoma de células huésped incluyen, por ejemplo, un vector retroviral, un vector lentiviral o un vector viral adenoasociado. De manera alternativa, un vector adenoviral se utiliza para la introducción de un ácido nucleico que permanece episomal hacia dentro de una célula huésped. Los vectores virales constituyen un procedimiento eficiente y versátil para la transferencia de genes en las células y tejidos meta. De manera adicional, las altas eficiencias de transducción se han observado en muchos tipos de células diferentes y tejidos meta.

Por ejemplo, un vector retroviral en general comprende repeticiones terminales largas actuando en cis (LTR) con una capacidad de empaquetado de hasta 6-10 kb de secuencia extranjera. Las LTR mínimas actuando en cis son suficientes para la replicación y empaquetado de un vector, lo que luego se utiliza para integrar la construcción de expresión hacia dentro de la célula meta para proporcionar una expresión a largo plazo. Los vectores retrovirales ampliamente utilizados incluyen aquellos basados en el virus de la leucemia murina (VLM), el virus de la leucemia de monos gibones (VLMG), el virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de las mismas (véase, por ejemplo, Buchscher y col., J Virol. 56:2731-2739 (1992); Johann y col., J. Virol. 65:1635-1640 (1992); Sommerfelt y col., Virol. 76:58-59 (1990); Wilson y col., J. Virol.63:274-2318 (1989); Miller y col., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700; Miller y Rosman BioTechniques 7:980-990, 1989; Miller, A. D. Human Gene Therapy 7:5-14, 1990; Scarpa y col., Virology 75:849-852, 1991; Burns y col., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 90:8033-8037, 1993).

También se han desarrollado varios sistemas de vectores de virus adenoasociados (VAA) para el suministro de ácido nucleico. Los vectores de VAA pueden construirse fácilmente usando técnicas conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. No. 5.173.414 y 5.139.941; las publicaciones internacionales No. WO 92/01070 y WO 93/03769; Lebkowski y col., Molec. Cell. Biol.5:3988-3996, 1988; Vincent y col., (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539, 1992; Muzyczka. Current Topics in Microbiol e Immunol. 158:97-129, 1992; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801, 1994; Shelling y Smith Gene Therapy 7:165-169, 1994; y Zhou y col., J Exp. Med. 179:1867-1875, 1994.

Los vectores virales adicionales útiles para administrar una construcción de expresión de la descripción incluyen, por ejemplo, los derivados de la familia de virus de la viruela, tales como el virus vaccinia y el virus de la viruela aviar o un alfavirus o un vector de virus conjugado (por ejemplo, el descrito en Fisher-Hoch y col., Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU.

56:317-321, 1989).

Ensayo del potencial terapéutico/profiláctico de las células y los factores solubles

Los procedimientos para determinar la capacidad de las células o los factores solubles para tratar, prevenir o retrasar el inicio o la progresión de una enfermedad inflamatoria de las articulaciones serán evidentes para el experto en la materia.

Por ejemplo, un modelo in vitro de artritis reumatoide se describe en Schultz y col., Arthritis and Rheumatism, 40: 1420-1428, 1997, el cual involucra cultivar membranas sinoviales y explantes de cartílago articular o células sinoviales y condrocitos de sujetos que padecen artritis en una matriz de fibrina tridimensional. La administración de las células y/o los factores solubles descritos en esta invención al cultivo permite determinar la eficacia terapéutica/profiláctica de las células/factores, por ejemplo, evaluando la expresión de enzimas proteolíticas, la arquitectura de matriz de los condrocitos y la degradación de la matriz o los números de células.

Otro modelo in vitro de artritis involucra el cultivo de discos de cartílago con fibroblastos sinoviales en presencia de TNF-alfa y/o IL-1 beta. La administración de las células y/o los factores solubles descritos en esta invención al cultivo permite determinar la eficacia terapéutica/profiláctica de las células/factores, por ejemplo, evaluando la expresión de enzimas proteolíticas, la arquitectura de matriz del colágeno, la degradación de la matriz, los niveles de citoquinas pro­ inflamatorias (por ejemplo, IL-6 y/o IL-8) o los números de células.

En otro ejemplo, la eficacia de las células y/o los factores solubles descritos en esta invención se evalúa en un modelo in vivo de artritis reumatoide, por ejemplo, una cepa SKG de ratón (Sakaguchi y col., Nature, 426: 454-460), modelo de artritis de colágeno tipo II de rata, modelo de artritis de colágeno tipo II de ratón o modelos de artritis inducida por antígeno en varias especies (Bendele J Musculoskel Neuron Interact 2001; 1(4):377-385). Los inventores también han demostrado un modelo de artritis reumatoide en ovinos.

Los modelos animales de espondilitis anquilosante también se conocen en la técnica e incluyen modelos que involucran inmunizar ratones balb/c con agrecano y/o versicano, ratas y ratones ank/ank que sobreexpresan el antígeno leucocitario B27.

A partir de lo anterior, para los expertos en la materia, resultará evidente que la presente descripción también proporciona un procedimiento para identificar o aislar una célula o un factor soluble para el tratamiento, prevención o retraso de una enfermedad inflamatoria de la articulación de la misma, siendo que el procedimiento comprende: (i) administrar una célula o un factor soluble a un sujeto de prueba que padece una enfermedad inflamatoria de las articulaciones y evaluar la inflamación en una articulación del sujeto;

(ii) comparar el nivel de inflamación en la articulación del sujeto en (i) con el nivel de inflamación en la articulación de un sujeto de control que padece la enfermedad inflamatoria de la articulación a la que no se han administrado las células o el factor soluble,

donde la inflamación reducida en la articulación del sujeto de prueba en comparación con el sujeto de control indica que la célula o el factor soluble trata, previene o retrasa una enfermedad inflamatoria de la articulación.

La presente descripción también proporciona un procedimiento para identificar o aislar una célula o un factor soluble para el tratamiento, prevención o retraso de una enfermedad inflamatoria de la articulación de la misma, con el procedimiento comprendiendo:

(i) contactar un modelo de prueba in vitro de la enfermedad inflamatoria de las articulaciones y determinar del nivel de uno o más marcadores de inflamación en el modelo;

(ii) determinar el nivel de uno o más marcadores de inflamación en un modelo de control in vitro de la enfermedad inflamatoria de las articulaciones al que no se ha administrado el factor celular o soluble,

donde un nivel reducido del marcador de la inflamación en el modelo de prueba en comparación con el modelo de control indica que la célula o el factor soluble trata, previene o retrasa una enfermedad inflamatoria de la articulación. Los ejemplos de marcadores de inflamación incluyen la expresión de enzimas proteolíticas, la arquitectura de la matriz de colágeno, la degradación de la matriz, los niveles de citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-6 y/o IL-8) o los números de células inflamatorias.

La célula puede ser cualquier célula descrita en esta invención, según cualquier ejemplo.

Composiciones celulares

En un ejemplo de la presente descripción las células STRO-1 y/o las células de su progenie se administran en la forma de una composición. Por ejemplo, dicha composición comprende un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los términos “portador” y “excipiente” se refieren a composiciones de materia que se usan convencionalmente en la técnica para facilitar el almacenamiento, la administración y/o la actividad biológica de un compuesto activo (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed., Mac Publishing Company (1980). Un vehículo también puede reducir cualquier efecto secundario no deseado del compuesto activo. Un vehículo adecuado es, por ejemplo, estable, por ejemplo, incapaz de reaccionar con otros ingredientes en el vehículo. En un ejemplo, el vehículo no produce un efecto adverso local o sistémico significativo en los receptores a las dosis y concentraciones empleadas para el tratamiento.

Los vehículos adecuados para la presente descripción incluyen los usados convencionalmente, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, lactosa, solución de Ringer, una solución tamponada, hialuronano y glicoles son vehículos líquidos ejemplares, particularmente (cuando son isotónicos) para las soluciones. Los vehículos y excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, celulosa, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, glicerol, propilenglicol, agua, etanol, y similares.

En otro ejemplo, un vehículo es una composición de medios, por ejemplo, donde se cultiva o se suspende una célula. Por ejemplo, dicha composición de medios no induce ningún efecto adverso en un sujeto al que se administra. Los portadores y excipientes ejemplares no afectan adversamente la viabilidad de una célula y/o la capacidad de una célula para reducir, prevenir o retrasar la enfermedad inflamatoria de las articulaciones.

En un ejemplo, el vehículo o excipiente proporciona una actividad de amortiguación para mantener y/o factores solubles a un pH adecuado para ejercer así una actividad biológica, por ejemplo, el vehículo o excipiente es solución salina tamponada con fosfato (PBS). La PBS representa un portador o excipiente atractivo porque interactúa mínimamente con las células y los factores y permite la liberación rápida de las células y los factores, en tal caso, la composición de la descripción puede producirse como un líquido para la aplicación directa en el torrente sanguíneo o en un tejido o una región que rodea o es adyacente a un tejido, por ejemplo, mediante inyección.

Las células STRO-1 y/o las células de su progenie también se pueden incorporar o incrustar en andamios que son compatibles con el receptor y que se degradan en productos que no son perjudiciales para el receptor. Estos andamios proporcionan soporte y protección para las células que se trasplantarán a los sujetos receptores. Los andamios biodegradables naturales y/o sintéticos son ejemplos de tales andamios.

Se puede usar con éxito una variedad de andamios diferentes en la práctica de la descripción. Los andamios ejemplares incluyen, pero no se limitan a andamios biológicos degradables. Los andamios biodegradables naturales incluyen andamios de colágeno, fibronectina y laminina. El material sintético adecuado para un andamiaje de trasplante celular debería ser capaz de soportar un crecimiento celular extenso y una función celular. Tales andamios también pueden ser reabsorbibles. Los andamios adecuados incluyen andamios de ácido poliglicólico, por ejemplo, como los descritos por Vacanti y col., J. Ped. Surg. 23:3-91988; Cima, y col., Biotechnol. Bioeng. 38:1451991; Vacanti, y col., Plast. Reconstr. Surg. 88:753-91991; o polímeros sintéticos tales como los polianhídridos, los poliortoésteres y el ácido poliláctico.

En otro ejemplo, las células pueden administrarse en un andamio de gel (tal como el Gelfoam de Upjohn Company. Las composiciones celulares útiles para los procedimientos descritos en esta invención pueden administrarse solas o como mezclas con otras células. Las células que pueden administrarse junto con las composiciones de la presente descripción incluyen, entre otras, otras células multipotentes o pluripotentes, células madre o células de médula ósea. Pueden mezclarse células de diferentes tipos con una composición de la descripción inmediatamente o poco antes de la administración, o pueden cocultivarse conjuntamente durante un periodo de tiempo previamente a la administración. En un ejemplo, la composición comprende una cantidad efectiva o una cantidad de células terapéutica o profilácticamente efectiva. Por ejemplo, la composición comprende entre aproximadamente 1 x 105 células STRO-1+/kg y alrededor de 1 x 107 células STRO-1+/kg o entre aproximadamente 1 x 106 células STRO-1+/kg y aproximadamente 5 x 106 células STRO-1+/kg. La cantidad exacta de células a administrar depende de una variedad de factores, incluyendo la edad, el peso y el sexo del paciente, así como también el alcance y la gravedad de la enfermedad inflamatoria de las articulaciones.

En un ejemplo, se administra una dosis baja de células al sujeto. Las dosis ejemplares incluyen entre aproximadamente 0,1 x 104 y alrededor de 0,5 x 106 células por kg, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 x 105 y alrededor de 0,5 x 106 células por kg, tal como, entre aproximadamente 0,5 x 105 y alrededor 0,5 x 106 células por kg, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 x 106 y alrededor de 0,5 x 106 células por kg, por ejemplo, aproximadamente 0,2 x 106, 0,3 x 106 o 0,4 x 106 células por kg.

En un ejemplo, se administra una dosis alta de células al sujeto. Las dosis ejemplares incluyen al menos aproximadamente 1,5 x 106 células/kg. Por ejemplo, una dosis alta comprende entre aproximadamente 1,5 x 106 y alrededor de 6 x 106 células/kg, como entre aproximadamente 1,5 x 106 y alrededor de 5 x 106 células/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 1,5 x 106 y alrededor de 4 x 106 células/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 1,5 x 106 y alrededor de 3 x 106 células/kg. Por ejemplo, una dosis alta comprende aproximadamente 1,5 x 106 o alrededor de 2 x 106 células/kg.

En un ejemplo, las células se administran como una dosis de número total de células independientemente del peso del paciente.

Por ejemplo, las células se administran en una dosis de aproximadamente entre alrededor de 100 y 300 millones de células, independientemente del peso del paciente.

Por ejemplo, las células se administran en una dosis de aproximadamente entre alrededor de 100 y 200 millones de células, independientemente del peso del paciente.

En un ejemplo, las células se administran en una dosis de aproximadamente 100 millones de células independientemente del peso del paciente.

En un ejemplo, las células se administran en una dosis de aproximadamente 150 millones de células independientemente del peso del paciente.

En un ejemplo, las células se administran en una dosis de aproximadamente 200 millones de células independientemente del peso del paciente.

En un ejemplo, las células se administran en una dosis de aproximadamente 300 millones de células independientemente del peso del paciente.

En algunos ejemplos, las células están contenidas dentro de una cámara que no permite que las células salgan a la circulación de un sujeto, sin embargo, eso permite que los factores secretados por las células entren en la circulación. De esta manera, se pueden administrar factores solubles a un sujeto permitiendo que las células secreten los factores a la circulación del sujeto. Dicha cámara se puede implantar igualmente en un sitio en un sujeto para aumentar los niveles locales de los factores solubles, por ejemplo, se la puede implantar en o cerca de un páncreas.

En algunos ejemplos de la descripción, puede no ser necesario o deseable inmunosuprimir un paciente previamente al inicio de la terapia con composiciones celulares. En consecuencia, el trasplante con células STRO-1+ alogénicas, o incluso xenogénicas o su progenie pueden tolerarse en algunos casos.

Sin embargo, en otros casos puede ser deseable o apropiado inmunosuprimir farmacológicamente a un paciente antes de iniciar la terapia celular y/o reducir la respuesta inmune de un sujeto contra la composición celular. Esto puede lograrse mediante el uso de agentes inmunosupresores sistémicos o locales, o puede lograrse suministrando las células en un dispositivo encapsulado. Las células pueden encapsularse en una cápsula que sea permeable a los nutrientes y oxígeno requeridos por la célula y a factores terapéuticos, pero la célula es impermeable a factores humorales inmunitarios y células. Por ejemplo, el encapsulante es hipoalergénico, se sitúa fácil y establemente en un tejido diana y proporciona una protección añadida a la estructura implantada. Estos y otros medios para reducir o eliminar una respuesta inmune a las células trasplantadas son conocidos en la técnica. Como alternativa, las células pueden modificarse genéticamente para reducir su inmunogenicidad.

Composiciones de factores solubles

En un ejemplo de la presente descripción, el sobrenadante o los factores solubles derivados de las células STRO-1 o de las células de su progenie se administran en forma de una composición, por ejemplo, que comprende un vehículo y/o excipiente adecuado. Por ejemplo, el vehículo o excipiente no afecta negativamente el efecto biológico de los factores solubles o el sobrenadante.

En un ejemplo, la composición comprende una composición de materia para estabilizar un factor soluble o un componente de sobrenadante, por ejemplo, un inhibidor de proteasa. Por ejemplo, el inhibidor de proteasa no está incluido en una cantidad suficiente para tener un efecto adverso en un sujeto.

Las composiciones que comprenden el sobrenadante o los factores solubles derivados de las células STRO-1 o de células de su progenie pueden prepararse como suspensiones líquidas apropiadas, por ejemplo, en un medio de cultivo, en un vehículo estable o en una solución tampón, por ejemplo, una solución salina tamponada con fosfato. Los portadores adecuados se han descrito anteriormente en esta invención. En otro ejemplo, las suspensiones que comprenden un sobrenadante o factores solubles derivados de las células STRO-1+ o de las células de su progenie son suspensiones oleosas inyectables. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo; o ésteres de ácido graso sintético tales como oleato de etilo o triglicéridos; o liposomas. Las suspensiones que se usan para inyección pueden contener también sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el sobrenadante o los factores solubles en la cantidad requerida en un solvente adecuado con uno de los ingredientes descritos anteriormente o una combinación de los mismos, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada.

Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el sobrenadante o los factores solubles a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación ejemplares son secado a vacío y liofilización, que procuran un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de la solución previamente esterilizada por filtración. Según un aspecto alternativo de la descripción, el sobrenadante o los factores solubles pueden formularse con uno o más compuestos adicionales que potencien su solubilidad.

Otros portadores o excipientes ejemplares se describen, por ejemplo, en Hardman y col., (2001) Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, N. Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams y Wilkins, Nueva York, N. Y.; Avis, y col., (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, y col., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, Nueva York; Lieberman, y col., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, Nueva York; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y.

Las composiciones terapéuticas deberían ser típicamente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse en forma de solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Además, los factores solubles pueden administrarse en una formulación de liberación con el tiempo, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. Los compuestos activos pueden prepararse con portadores que protegerán al compuesto frente a una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros poliláctico-poliglicólico (PLG). Muchos procedimientos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los especialistas en la materia. El sobrenadante o los factores solubles pueden administrarse en combinación con una matriz apropiada, por ejemplo, para proporcionar una liberación lenta de los factores solubles.

Componentes adicionales de las composiciones

Los factores solubles o el sobrenadante derivado de las células STRO-1+, las células STRO-1 o su progenie pueden administrarse con otros fármacos beneficiosos o moléculas biológicas (factores de crecimiento, factores tróficos). Cuando se administran con otros agentes, pueden administrarse conjuntamente en una sola composición farmacéutica, o en composiciones farmacéuticas separadas, simultánea o secuencialmente a los otros agentes (antes o después de la administración de los otros agentes). Los factores bioactivos que pueden coadministrarse incluyen agentes antiapoptóticos (por ejemplo, EPO, mimeticuerpos de EPO, TPO, IGF-I e IGF-II, HGF, inhibidores de caspasa); agentes antiinflamatorios (por ejemplo, inhibidores de p38 MAPK, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 e IL-1, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMÚS y AINE (fármacos antiinflamatorios no esteroideos; por ejemplo, TEPOXALINA, TOLMETINA, SUPROFENO); agentes inmunosupresores/inmunomoduladores (por ejemplo, inhibidores de calcineurina tales como ciclosporina, tacrolimús; inhibidores de mTOR (por ejemplo, SIROLIMÚS, EVEROLIMÚS); antiproliferativos (por ejemplo, azatioprina, micofenolato de mofetilo); corticosteroides (por ejemplo, prednisolona, hidrocortisona); anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales anti-receptor IL-2Ralfa (por ejemplo, basiliximab, daclizumab), anticuerpos policlonales anti-linfocitos T (por ejemplo, anti-globulina de timocito (ATG); anti-globulina de linfocito (ALG); anticuerpo monoclonal anti-linfocitos T OKT3)); agentes antitrombogénicos (por ejemplo, heparina, derivados de heparina, urocinasa, PPack (dextrofenilalanina, prolina, arginina, clorometilcetona), compuestos antitrombina, antagonistas de receptor de plaquetas, anticuerpos antitrombina, anticuerpos anti-receptor de plaquetas, aspirina, dipiridamol, protamina, hirudina, inhibidores de prostaglandina e inhibidores de plaquetas); y antioxidantes (por ejemplo, probucol, vitamina A, ácido ascórbico, tocoferol, coenzima Q-10, glutatión, L-cisteína, N-acetilcisteína) así como anestésicos locales.

En un ejemplo, las células y/o los factores solubles se administran con un agente inmunosupresor, un agente antiinflamatorio, un FARME o un medicamento antiinflamatorio no esteroideo.

Los ejemplos de agentes inmunosupresores/antiinflamatorios incluyen sustancias que suprimen la producción de citocinas, regulan a la baja o suprimen la expresión del autoantígeno, o enmascaran los antígenos MHC. Los ejemplos de tales agentes incluyen las pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas (véase la Patente de los EE.UU. No. 4.665.077), el ganciclovir, el tacrolimus, los glucocorticoides como el cortisol o la aldosterona, los agentes antiinflamatorios como un inhibidor de la ciclooxigenasa, un inhibidor de la 5-lipoxigenasa o un antagonista del receptor de leucotrienos; los antagonistas de purina tales como la azatioprina o el micofenolato mofetilo (MMF); los agentes alquilantes tales como la ciclofosfamida; la bromocriptina; el danazol; la dapsona; el glutaraldehído (que enmascara los antígenos MHC, como se describe en la Patente de los EE.UU. No. 4.120.649); los anticuerpos antiidiotípicos para los antígenos MHC y los fragmentos MHC; la ciclosporina A; los esteroides tales como los corticosteroides o los glucocorticosteroides, o los análogos de los glucocorticoides, por ejemplo, la prednisona, la metilprednisolona, incluyendo el succinato sódico de metilprednisolona SOLU-MEDROL® y la dexametasona; los inhibidores de dihidrofolato reductasa tales como el metotrexato (oral o subcutáneo); los agentes antipalúdicos, tales como la cloroquina y la hidroxicloroquina; la sulfasalazina; la leflunomida; los antagonistas de citoquinas tales como los anticuerpos de citocina o los anticuerpos del receptor de citocina, incluidos los anticuerpos anti-interferón-alfa, -beta o -gamma, los anticuerpos anti-factor de necrosis tumoral (TNF) -alfa (infliximab o adalimumab), la inmunoadhesina anti-TNF-alfa (etanercept), los anticuerpos anti-TNF-beta, los anticuerpos anti-interleucina-2 (IL-2) y los anticuerpos del receptor anti-IL-2 y los anticuerpos y antagonistas del receptor anti-interleucina-6 (IL-6); los anticuerpos anti-LFA-1, que incluyen los anticuerpos anti-CD11a y anti-CD18; los anticuerpos anti-L3T4; la globulina anti-linfocitaria heteróloga; los anticuerpos pan-T, tales como los anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; el péptido soluble que contiene un dominio de unión a LFA-3 (WO 90/08187); la estreptoquinasa; el factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta); la estreptodomasa; el ARN o el ADN del huésped; el FK506; el RS-61443; el clorambucilo; la desoxiespergualina; la rapamicina; el receptor de células T (Patente de los EE.UU. 5114721); los fragmentos del receptor de células T (W90/11294); los antagonistas de BAFF, tales como los anticuerpos BAFF y los anticuerpos BR3 y los antagonistas de zTNF4; agentes biológicos que interfieren con las señales de ayuda de las células T, como el receptor anti-CD40 o el ligando anti-CD40 (CD154), incluyendo los anticuerpos bloqueantes del ligando CD40-CD40 y CTLA4-Ig; y los anticuerpos del receptor de células T (EP 340,109), como el T10B9. Algunos agentes inmunosupresores en esta invención también son FARME, como el metotrexato. Ejemplos de agentes inmunosupresores en esta invención incluyen ciclofosfamida, clorambucilo, azatioprina, leflunomida, MMF o metotrexato.

Los ejemplos de “fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad” o “FARME” incluyen la hidroxicloroquina, la sulfasalazina, el metotrexato, la leflunomida, el etanercept, el infliximab (más el metotrexato oral y subcutáneo), la azatioprina, la D-penicilamina, las sales de oro (orales), las sales de oro (intramusculares), la minociclina, la ciclosporina, incluida la ciclosporina A y la ciclosporina tópica, la proteína estafilocócica A, incluidas las sales y derivados de la misma, etc. En un ejemplo, el FARME es metotrexato.

Los ejemplos de “medicamentos antiinflamatorios no esteroideos” o “AINE” incluyen la aspirina, el ácido acetilsalicílico, el ibuprofeno, el flurbiprofeno, el naproxeno, la indometacina, el sulindac, la tolmetina, la fenilbutazona, el diclofenaco, el ketoprofeno, el benorilato, el ácido mefenámico, el metotrexato, el fenbufeno, la azapropazona; los inhibidores de COX-2, tales como el celecoxib 4-(5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il)bencenosulfonamida, el valdecoxib, el meloxicam, el GR 253035 (Glaxo Wellcome); y el MK966 (Merck Sharp & Dohme), incluidas sus sales y derivados, etc.

Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es un anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, rituximab u ofatumumab). Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es un anticuerpo anti-CD22 (por ejemplo, epratuzumab). Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es un anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, infliximab o adalimumab o golimumab) o un receptor de TNF soluble (por ejemplo, etanercept). Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es un antagonista de CTLA-4 (por ejemplo, abatacept, CTLA4-Ig). Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es un anticuerpo anti-IL-6 o anti-IL-6R (por ejemplo, epratuzumab).

En un ejemplo, las células STRO-1 y/o las células de su progenie y/o sus factores solubles derivados se administran como terapia complementaria y/o concomitante al otro compuesto terapéutico (por ejemplo, el metotrexato).

“Terapia complementaria” significa un tratamiento que es adicional o complementa un tratamiento previo.

“Terapia concomitante” significa un tratamiento que se administra al mismo tiempo que otro tratamiento pero que no es suplementario al mismo, por ejemplo, ambos tratamientos pueden tratar individualmente la enfermedad reumática. La discusión en esta invención de administrar conjuntamente la terapéutica o administrar más de una terapéutica no significa necesariamente que la terapia se administre en una sola composición. La terapia se puede administrar de forma simultánea o secuencial en composiciones separadas. El período entre la administración secuencial puede ser de varios días, siempre que todavía haya niveles suficientes del primer agente terapéutico para proporcionar o aumentar el beneficio terapéutico o profiláctico del segundo agente terapéutico cuando se administra.

En un ejemplo, una composición farmacéutica como se describe en esta invención, según cualquier ejemplo, comprende un compuesto usado para tratar la enfermedad inflamatoria de las articulaciones. Alternativamente, un procedimiento de tratamiento/profilaxis, como se describe en esta invención, según cualquier realización, comprende adicionalmente administrar un compuesto usado para tratar una enfermedad inflamatoria de las articulaciones (por ejemplo, en la misma composición o una composición separada y/o al mismo tiempo o en un momento diferente). Los compuestos ejemplares se describen en esta invención y se deben tomar para su aplicación mutatis mutandis a estos ejemplos de la presente descripción.

En otro ejemplo, una composición como se describe en esta invención según cualquier ejemplo comprende adicionalmente un factor que induce o mejora la diferenciación de una célula progenitora en una célula vascular. Los factores ejemplares incluyen, factor de crecimiento endotelial vascular (VEG^f ), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF; por ejemplo, PDGF-BB) y FGF.

En otro ejemplo, una composición como se describe en esta invención, según cualquier ejemplo, comprende adicionalmente una célula comprometida de un tejido específico (TSCC). A este respecto, la Solicitud de patente internacional No. PCT/AU2005/001445 demuestra que la administración de una TSCC y una célula STRO-1 puede conducir a una mayor proliferación de la TSCC. En un ejemplo, la TSCC es una célula vascular. La administración de una composición de este tipo a un sujeto puede conducir a una mayor producción de vasculatura, por ejemplo, a un aumento de los nutrientes que se suministran al tejido afectado.

Dispositivos médicos

La presente descripción también proporciona dispositivos médicos para su uso o cuando se usa en un procedimiento como se describe en esta invención según cualquier ejemplo. Por ejemplo, la presente descripción proporciona una jeringa o catéter u otro dispositivo de administración adecuado que comprende células STRO-1+ y/o células de su progenie y/o sus factores solubles y/o una composición como se describe en esta invención según cualquier ejemplo. Opcionalmente, la jeringa o el catéter se empaqueta con instrucciones para su uso en un procedimiento como se describe en esta invención, según cualquier ejemplo.

En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un implante que comprende células STRO-1+ y/o células de su progenie y/o sus factores solubles y/o una composición como se describe en esta invención, según cualquier ejemplo. Opcionalmente, el implante se empaqueta con instrucciones para su uso en un procedimiento como se describe en esta invención, según cualquier ejemplo. Los implantes adecuados pueden formarse con un andamio, por ejemplo, como se describe anteriormente en esta invención, y células STRO-1+ y/o células de su progenie y/o sus factores solubles.

Modos de administración

El sobrenadante o los factores solubles derivados de las células STRO-1+, las células STRO-1 o su progenie pueden implantarse quirúrgicamente, inyectarse, suministrarse (por ejemplo, por medio de un catéter o jeringa) o administrarse de otra manera directa o indirectamente al sitio que necesita reparación o aumento, por ejemplo, en una articulación o un sitio adyacente a la articulación.

En un ejemplo, el sobrenadante o los factores derivados de las células STRO-1+, las células STRO-1+ o su progenie se suministran al torrente sanguíneo de un sujeto. Por ejemplo, el sobrenadante o los factores solubles de las células STRO-1+, las células STRO-1+ o su progenie se suministran parenteralmente. Las vías de administración parenterales ejemplares incluyen, entre otras, la vía intraperitoneal, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal, intraarterial, intranodal o intravenosa. En un ejemplo, el sobrenadante o los factores solubles de las células STRO-1+, las células STRO-1+ o su progenie se administran intraarterialmente, en una aorta, en una aurícula o ventrículo del corazón o en un vaso sanguíneo, por ejemplo, por vía intravenosa.

En el caso del suministro de células a una aurícula o ventrículo del corazón, las células pueden administrarse a la aurícula o ventrículo izquierdos para evitar complicaciones que pueden surgir del suministro rápido de células a los pulmones.

En un ejemplo, el sobrenadante o los factores solubles derivados de las células STRO-1+, las células STRO-1+ o su progenie se inyectan en el sitio de suministro, por ejemplo, usando una jeringa o a través de un catéter o una línea central.

La selección de un régimen de administración para una formulación terapéutica depende de varios factores, que incluyen la tasa de recambio sérico o tisular de la entidad, el nivel de síntomas y la inmunogenicidad de la entidad. Por ejemplo, un régimen de administración maximiza la cantidad de compuesto terapéutico administrado al paciente de manera consistente con un nivel aceptable de efectos secundarios. En consecuencia, la cantidad de formulación administrada depende en parte de la entidad particular y la gravedad de la afección a tratar.

En un ejemplo, el sobrenadante o los factores solubles derivados de las células STRO-1+, las células STRO-1+ o las células de su progenie se administran en una sola dosis en bolo. Alternativamente, el sobrenadante o los factores solubles de las células STRO-1+, las células STRO-1+ o su progenie se administran por infusión continua, o por dosis a intervalos de, por ejemplo, un día, una semana o de 1 a 7 veces por semana. Un protocolo de dosis ejemplar es uno que involucra la dosis máxima o frecuencia de dosis que evita efectos secundarios indeseables significativos. Una dosis semanal total depende del tipo y la actividad del compuesto que se utiliza. Un médico realiza la determinación de la dosis apropiada, por ejemplo, utilizando parámetros o factores conocidos o sospechosos en la técnica que afectan el tratamiento o que se predice que afectarán el tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y luego se incrementa en pequeños incrementos hasta que se logra el efecto deseado u óptimo en relación con cualquier efecto secundario negativo. Las medidas diagnósticas importantes incluyen los síntomas de la diabetes.

Los presentes inventores han demostrado los beneficios terapéuticos proporcionados por las células STRO-1+ y/o su progenie y/o sus factores solubles derivados se observan durante al menos cuatro semanas en un sujeto. En consecuencia, en algunos ejemplos, las células se administran semanalmente, quincenalmente, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas.

Según los ejemplos de la descripción dirigida a tratar o retrasar la progresión de una enfermedad inflamatoria de las articulaciones, en un ejemplo, las células STRO-1+ y/o las células de su progenie y/o sus factores solubles derivados se administran después del diagnóstico del trastorno, por ejemplo, usando procedimientos estándares conocidos en la técnica y/o descritos en esta invención.

Para aquellos ejemplos dirigidos a prevenir o retrasar la aparición de una enfermedad articular inflamatoria, las células STRO-1+ y/o células de su progenie y/o sus factores solubles derivados pueden administrarse antes del diagnóstico clínico del trastorno.

Poblaciones de pacientes

Los procedimientos de la presente descripción también son útiles para tratar sujetos que caen dentro de subpoblaciones de sujetos que padecen una enfermedad reumática.

En un ejemplo, el sujeto padece una enfermedad reumática, por ejemplo, artritis reumatoide, y no responde adecuadamente a un inhibidor de TNF (por ejemplo, un anticuerpo anti-TNF o un receptor de TNF soluble). Un sujeto que “no responde adecuadamente a un inhibidor de TNF” ha experimentado una respuesta inadecuada al tratamiento previo o actual con uno o más inhibidores de TNF debido a una toxicidad o eficacia inadecuada. En un ejemplo, dicho paciente ha recibido, por ejemplo, etanercept durante > 3 meses, en 25 mg, dos veces por semana, o al menos 4 infusiones de infliximab a > 3 mg/kg, pero ha tenido una respuesta inadecuada a este último.

En un ejemplo, el sujeto padece una enfermedad reumática, por ejemplo, artritis reumatoide, y no responde adecuadamente al metotrexato. Un sujeto que “no responde adecuadamente al metotrexato” es un paciente que ha experimentado una respuesta inadecuada al tratamiento previo o actual con metotrexato debido a una toxicidad o eficacia inadecuada. En un ejemplo, el paciente ha estado tomando metotrexato (de 10 a 25 mg/semana) durante al menos 12 semanas y todavía tiene una enfermedad activa.

En un ejemplo, el sujeto ya está recibiendo el tratamiento con metotrexato.

En un ejemplo, el sujeto ya está recibiendo tratamiento con metotrexato y la administración de células STRO-1 y/o células de su progenie y/o sus factores solubles derivados retrasa la prescripción de una terapia anti-TNF en comparación con un sujeto que no ha recibido células STRO-1 y/o células de su progenie y/o sus factores solubles derivados.

En un ejemplo, el sujeto sufre de artritis reumatoide activa. Un sujeto con “artritis reumatoide activa” significa un sujeto con síntomas activos y no latentes de artritis reumatoide. En un ejemplo, dicho paciente tiene artritis reumatoide activa de moderada a grave de > 6 meses de duración al momento de la visita inicial. En un ejemplo, a tales pacientes se les hará: (1) recuento de articulaciones inflamadas (RAI) > 4 (recuento de 66 articulaciones); (2) recuento de articulaciones sensibles (RAS) > 4 (recuento de 68 articulaciones) y/o proteína C reactiva (PCR) > límite superior de la normalidad (LSN) en la visita de evaluación.

En un ejemplo, el sujeto sufre de artritis reumatoide activa moderada o artritis reumatoide activa grave o artritis reumatoide activa de moderada a grave.

Una persona que tiene artritis reumatoide activa moderada generalmente tiene una combinación de al menos dos, tres, cuatro o todos los síntomas siguientes:

• Entre 6 y 20 articulaciones inflamadas

• Habitualmente ninguna inflamación en otros tejidos además de las articulaciones

• Un nivel elevado de ESR o PRC

• Una prueba positiva del factor reumatoide o anticuerpos contra el péptido citrulinado anticíclico (anti-CCP)

• Evidencia de inflamación, pero no de daño óseo en radiografías

Una persona que tiene artritis reumatoide activa grave generalmente tiene una combinación de al menos dos, tres, cuatro o todos los síntomas siguientes:

• Más de 20 articulaciones inflamadas persistentemente o una pérdida rápida de capacidades funcionales

• Niveles elevados de ESR o PRC

• Anemia relacionada con enfermedades crónicas

• Bajo nivel de albúmina en sangre

• Una prueba positiva de factor reumatoide, a menudo con un nivel alto

• Evidencia de daño óseo y cartilaginoso en rayos X

• Inflamación en otros tejidos además de las articulaciones

En un ejemplo, un sujeto tiene artritis reumatoidea persistentemente activa. Una persona con artritis reumatoide persistentemente activa ha tenido evidencia de inflamación durante al menos seis a doce meses y puede tener daños irreversibles en las articulaciones y pérdida de la función.

En un ejemplo, la administración de las células o los factores solubles inhibe la progresión del daño articular estructural. La expresión “inhibición de la progresión del daño articular estructural” en un sujeto se refiere a prevenir o ralentizar el daño articular estructural causado por una enfermedad reumática, por ejemplo, un sujeto que sufre de artritis reumatoide, por ejemplo, en base al recuento de articulaciones erosionadas y/o la puntuación de daño articular. Los procedimientos para medir la progresión del daño articular estructural son conocidos por la persona experta e incluyen, entre otros, la puntuación total de Sharp modificada por Genant (TSS), la puntuación de erosión (ES) y/o la puntuación de estrechamiento del espacio articular (JSN). En un ejemplo, un procedimiento dado a conocer en esta invención comprende además evaluar la progresión del daño articular estructural, por ejemplo, usando un procedimiento descrito en esta invención y/o por rayos X. Por ejemplo, la evaluación se realiza aproximadamente 1, 3, 6 o 12 meses después de la última administración de las células o los factores solubles.

La presente descripción se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Inmunoselección de CPM por selección de células STRO-3+

Se recolectó médula ósea (BM) de voluntarios adultos sanos normales (de 20 a 35 años). Brevemente, se aspiraron 40 ml de MO de la cresta ilíaca posterior en tubos que contienen anticoagulante de litio-heparina.

Las CMM-MO se prepararon mediante la separación por gradiente de densidad utilizando Lymphoprep™ (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) como se describió anteriormente (Zannettino, AC y col., (1998) Blood 92: 2613-2628). Después de la centrifugación a 400 x g durante 30 minutos a 4°C, se retiró la capa leucocítica con una pipeta de transferencia y se lavó 3 veces con “HHF”, que contenía una solución salina equilibrada de Hank (HBSS; Life Technologies, Gaithersburg, MD), con un 5 % de suero fetal de ternero (FCS, CSL Limited, Victoria, Australia). Las células STRO-3+ (o TNAP+) se aislaron posteriormente mediante una clasificación celular activada magnéticamente, como se describió anteriormente, (Gronthos y col., (2003) Journal of Cell Science 116:1827-1835; Gronthos, S. y Simmons, PJ (1995) Blood 85: 929-940). Brevemente, se incuban aproximadamente de 1 a 3 x 108 CMM-MO en un tampón de bloqueo, el cual consiste en suero de conejo normal al 10 % (v/v) en HHF durante 20 minutos en hielo. Se incuban las células con 200 pl de una solución 10 pg/ml de AcM STRO-3 en un tampón de bloqueo durante 1 hora en hielo. Las células se lavaron posteriormente dos veces en HHF por centrifugación a 400 x g. Se agregó una dilución 1/50 de Y-biotina de cabra anti ratón (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Reino Unido) en un tampón de HHF y las células se incubaron durante 1 hora en hielo. Las células se lavan dos veces en un tampón de MACS (Ca2+ - y Mn2+ libre de PBS, suplementado con BSA al 1 %, EDTA 5 mM y azida de sodio al 0,01 %) como antes, y se procedió a la resuspensión en un volumen final de 0,9 ml de tampón de MACS.

Se añadieron 100 pl de microperlas de estreptavidina (Miltenyi Biotech; Bergisch Gladbach, Alemania) a la suspensión celular y esta última se incubó en hielo durante 15 minutos. La suspensión celular se lavó dos veces y se resuspendió en 0,5 ml de tampón de MACS. Posteriormente se cargó en una mini columna de MACS (columnas MS, Miltenyi Biotec) y se lavó tres veces con 0,5 ml de tampón de MACS para recuperar las células que no se unieron al AcM STRO-3 (depositado el 19 de diciembre de 2005 en la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-7282; véase la publicación internacional No. WO 2006/108229). Después de la adición de 1 ml adicional de tampón de MACS, se retiró la columna del imán y se aislaron las células TNAP+ mediante presión positiva. Puede teñirse una alícuota de células de cada fracción con estreptavidina-FITC y valorarse la pureza por citometría de flujo.

Ejemplo 2: Las células seleccionadas por el AcM STRO-3 son células STRO-1bright

Los experimentos fueron diseñados para confirmar el potencial del uso de AcM STRO-3 como un reactivo único para aislar células STRO-1bright de las células.

Dado que STRO-3 (IgG1) es un isotipo diferente al de STRO-1 (IgM), la capacidad del STRO-3 para identificar la UFC-F clonogénica se evaluó mediante análisis FACS de dos colores basado en su coexpresión con células STRO-1 aisladas usando el procedimiento MACS (figura 1). El histograma de gráfico de puntos representa 5 x 104 eventos recogidos como datos en modo de lista. Se establecieron las líneas vertical y horizontal a niveles de reactividad de < 1,0 % de fluorescencia media obtenidos con los anticuerpos de control de isotipo coincidente, 1B5 (IgG) y 1A6.12 (IgM) tratados en las mismas condiciones. Los resultados demuestran que una población minoritaria de células STRO-1bright coexpresaban TNAP (cuadrante superior derecho), mientras que el resto de las células STRO-1+ no consiguieron reaccionar con el AcM STRO-3. Posteriormente, en las células aisladas por FACS de los cuatro cuadrantes, se estudió la incidencia de la UFC-F (tabla 1).

Tabla 1: Enriquecimiento de células de médula ósea humanas por análisis FACS de dos colores basado en la coexpresión de los marcadores de superficie celular STRO-1 y TNAP (con referencia a la figura 1). Se cultivaron células clasificadas por FACS en condiciones clonogénicas estándares en alfa-MEM suplementado con 20 % de FCS. Los datos representan el número medio de células formadoras de colonias (UFC-F) el día 14 por 105 células sembradas ± EE (n= 3 aspirados de médula ósea diferentes). Estos datos sugieren que las CPM humanas están exclusivamente restringidas a la fracción TNAP+ de MO que coexpresa el antígeno de STRO-1 fuertemente.

(continuación)

Ejemplo 3: Expresión relativa de genes y proteínas de superficie de células STRO-1dul1 y STRO-1bright

En la primera serie de experimentos, se empleó el análisis semicuantitativo de RT-PCR para examinar el perfil de expresión génica de varios genes asociados al linaje expresados por poblaciones de STRO-1duN o STRO-1bright, aisladas por fluorescencia activada por la clasificación celular (figura 2A). En la segunda serie de experimentos, se empleó la citometría de flujo y el análisis de fluorescencia de canal medio para examinar el perfil de expresión de proteínas de superficie de varias proteínas asociadas al linaje expresadas por poblaciones de STRO-1duN o STRO-1bright, aisladas por fluorescencia activada por la clasificación celular.

El ARN celular total se preparó a partir de 2 x 106 de células primarias clasificadas de STRO-1bright o STRO-1duN, los sedimentos de condrocitos y otros cultivos inducidos y lisados usando el procedimiento de extracción de RNAzolB (Biotecx Lab. Inc., Houston, TX) según las recomendaciones del fabricante. Se usó entonces ARN aislado de cada subpoblación como molde para la síntesis de ADNc, preparado usando un kit de síntesis de ADNc de primera hebra (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). La expresión de diversos transcritos se evaluó mediante amplificación por PCR, utilizando un protocolo estándar como se describió previamente (Gronthos y col., J. Bone and Min. Res. Res. 14:48-57, 1999). Los conjuntos de cebadores utilizados en este estudio se muestran en la tabla 2. Después de la amplificación, se analizó cada mezcla de reacción por electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % y se visualizó por tinción con bromuro de etidio. La integridad del ARN se evaluó por la expresión de GAPDH.

La expresión génica relativa para cada marcador celular se evaluó con referencia a la expresión del gen de mantenimiento, GAPDH, usando el software ImageQant (figura 2B, C). Además, se utilizó el análisis de citometría de flujo de doble color para examinar el perfil de expresión de proteínas de CPM expandidas ex vivo en función de su expresión de un rango más amplio de marcadores asociados al linaje celular junto con el anticuerpo STRO-1. En la tabla 3 se presenta un resumen del fenotipo general basado en la expresión génica y de proteínas de las células cultivadas STRO-1duN y STRO-1bri. Los datos indican que las CPM STRO-1bright expandidas ex vivo muestran una expresión diferencialmente mayor de marcadores asociados a células perivasculares, incluyendo: angiopoyetina-1, VCAM-1, SDF-1, IL-1p, TNFa y RANKL. Las comparaciones entre los perfiles de expresión de proteínas y genes de las células cultivadas de STRO-1duN y STRO-1bright se resumen en las tablas 3 y 4.

T ambién se realizaron estudios de hibridación sustractiva para identificar genes expresados únicamente por las células STRO-1bri. Brevemente, las células STRO-1duN y STRO-1bright se aislaron como se describió anteriormente (véase la figura 3A). El ARN total se preparó a partir de células STRO-1duN y STRO-1bright agrupadas de 5 muestras de médula diferentes utilizando el sistema de ARN STAT-60 (TEL-TEST). La sintetización de primera cadena se realizó usando el kit de síntesis de ADNc SMART (Clontech Laboratories). El híbrido resultante de ARNm/ADNc monocatenario se amplificó mediante PCR a larga distancia (kit Advantage 2 PCR; Clontech) utilizando sitios de cebadores específicos en los extremos de cebador 3' y 5' formados durante el proceso de RT inicial según las especificaciones del fabricante. Después de la digestión con Rsal del ADNc de STRO-1bright, se usaron 2 alícuotas para ligar diferentes oligonucleótidos adaptadores específicos usando el kit de sustracción de ADNc de PCR-Select de Clontech. Se realizaron dos rondas de hibridación sustractiva utilizando ADNc STRO-1bright (probador) y STRO-1duN (controlador) y viceversa, según el protocolo del fabricante. Este procedimiento también se realizó a la inversa usando ADNc probador de STRO-1duN hibridizado contra el ADNc controlador de STRO-1bright.

Para identificar genes expresados únicamente por la población STRO-1bright, el ADNc con STRO-1bright sustraído se utilizó para construir filtros de micromatrices de baja densidad replicados que comprenden 200 clones bacterianos seleccionados al azar transformados con los ADNc sustraídos de STRO-1bright ligados a un vector de clonación T/A. Las micromatrices se sondearon posteriormente, ya sea con ADNc sustraído de STRO-1 duN o STRO-1bright marcado como [32P] dCTP (figura 3B-C). El cribado diferencial identificó un total de 44 clones, que se expresaron de forma altamente diferencial entre las subpoblaciones de células STRO-1duN y STRO-1bright. La secuenciación de ADN de todos los clones expresados diferencialmente reveló que únicamente 1 clon era representativo de un mitógeno de células estromales conocido; concretamente, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (Gronthos y Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995). Curiosamente, se encontró que 6 de los 44 clones contenían inserciones de ADN correspondientes a la quimiocina, factor 1 derivado del estroma (SDF-1). La gran abundancia de transcripciones SDF-1 en células STRO-1bright humanas se confirmaron mediante una RT-PCR semicuantitativa de ARN total preparado a partir de subpoblaciones STRO-1bright, STRO-1duN y STRO-1duN de médula ósea recién clasificadas (figura 3D y tabla 3^).

Tabla 2. Cebadores de RT-PCR y condiciones para la amplificación específica de ARNm humano

(continuación)

Tabla 3. Resumen de la expresión génica relativa en poblaciones de STRO-1bright y STRO-1dul1. Se presenta una lista de genes que muestran una expresión medible y diferencial entre las poblaciones de células STRO-1bright y STRO-1duN, determinadas por la PCR de transcripción inversa. Los valores representan la expresión génica relativa con referencia al gen de mantenimiento, GAPDH.

Para correlacionar la expresión de superficie de proteína con la densidad de expresión de STRO-1, se prepararon suspensiones de células individuales ex vivo derivadas de CPM de la médula ósea mediante el desprendimiento de tripsina/EDTA y posteriormente se incubaron con el anticuerpo STRO-1 en combinación con anticuerpos que identifican una amplia gama de marcadores asociados al linaje celular. Se identificó STRO-1 usando un isotiocianato de IgM-fluoresceína de cabra anti murino, mientras que todos los demás marcadores se identificaron usando una IgG-ficoeritrina de cabra anti ratón o anti conejo. Para aquellos anticuerpos que identifican antígenos intracelulares, las preparaciones celulares se marcaron primero con el anticuerpo STRO-1, se fijaron con etanol frío al 70 % para permeabilizar la membrana celular y luego se incubaron con anticuerpos específicos de antígeno intracelulares. Los anticuerpos de control de isotipo coincidentes se usaron en idénticas condiciones. Se realizó un análisis de citometría de flujo de color dual con un citómetro de flujo COULTER EPICS y se recopilaron los datos en modo de lista. Los gráficos de puntos representan 5.000 eventos en modo de lista que indican el nivel de intensidad de fluorescencia para cada marcador de celda de linaje (eje y) y STRO-1 (eje x). Los cuadrantes verticales y horizontales se establecieron con referencia a los anticuerpos de control negativo emparejados con isotipo.

Tabla 4. Resumen de la expresión relativa de proteínas en poblaciones STRO-1bright y STRO-1duN. Se presenta una lista de proteínas que muestran expresión diferencial entre las poblaciones STRO-1Bri y STRO-1duN según se determina mediante citometría de flujo. Los valores representan la intensidad de fluorescencia media relativa de la tinción.

Ejemplo 4: Un modelo de artritis reumatoide en ovejas

4.1 Procedimientos

A continuación, se proporciona un resumen del procedimiento para producir un modelo de artritis reumatoide en ovejas:

1. Día 0

i. A 5 ovejas (B1626, B1584, B3619, B1612, B1302) se les administró adyuvante completo de Freund+5 mg de colágeno bovino tipo II (5 x 0,2 ml S/C por oveja). La solución se administró por vía subcutánea (S/C) ii. A 2 ovejas (B1627, B4036) se les administró adyuvante completo de Freund 5 mg de colágeno aviar tipo II (5 x 0,2 ml S/C por oveja)

iii. Se recogieron 10 ml de sangre para analizar los anticuerpos contra el colágeno tipo II utilizando un ELISA iv. Examen clínico para lo siguiente:

© Cojera

© Hinchazón

© Engrosamiento articular

2. Día 14

i. A 5 ovejas se les administró adyuvante incompleto de Freund+5 mg de colágeno bovino tipo II (5 x 0,2 ml S/C por oveja)

ii. A 2 ovejas se les administró adyuvante incompleto de Freund+5 mg de colágeno aviar tipo II (5 x 0,2 ml S/C por oveja)

iii. Se recogieron 10 ml de sangre para analizar los anticuerpos contra el colágeno tipo II utilizando un ELISA y conteos de glóbulos blancos

iv. Examen clínico para lo siguiente:

© Cojera

© Hinchazón

© Engrosamiento articular

3. Día 28

i. A 5 ovejas se les administró 100 |jg de colágeno bovino tipo II en solución salina mediante inyección intraarticular en el corvejón izquierdo (500 j l por oveja)

ii. A 2 ovejas se les administró una inyección intraarticular de 100 jg de colágeno aviar tipo II en solución salina en el corvejón izquierdo (500 j l por oveja)

iii. Se recogieron 10 ml de sangre para analizar los anticuerpos contra el colágeno tipo II utilizando un ELISA y conteos de glóbulos blancos

iv. Examen clínico para lo siguiente:

© Cojera

© Hinchazón

© Engrosamiento articular

4. Día 30 2 días de inyección IA

i. Examen clínico para lo siguiente:

© Cojera

© Hinchazón

© Engrasamiento articular

5. Día 36 8 días de inyección IA

i. Examen clínico para lo siguiente:

© Cojera

© Hinchazón

© Engrasamiento articular

6. Día 42 14 días de inyección IA

i. 4 ovejas (B1626, B3619, B1612, B1302) que recibieron el colágeno bovino tipo II fueron sacrificadas ii. 2 ovejas (B1627, B4036) que recibieron el colágeno aviar tipo II fueron sacrificadas

iii. Se recogieron 10 ml de sangre para analizar los anticuerpos contra el colágeno tipo II utilizando un ELISA y conteos de glóbulos blancos

iv. Examen clínico para lo siguiente:

© Cojera

© Hinchazón

© Engrasamiento articular

v. Ovejas sacrificadas

© Líquido sinovial en articulaciones de corvejón izquierdo y derecho

a. Evaluado para anticuerpos de colágeno tipo II

b. Recuento de células

© Tejido sinovial en articulaciones de corvejón izquierdo y derecho

a. Secciones de H y E de fijación de formalina

b. Congelación con nitrógeno líquido

© Cartílago articular izquierdo y derecho

a. Fotos

b. Fijación de formalina y descalcificación para H y E

7. Día 56

i. 1 oveja (1584) que recibió colágeno bovino tipo II fue sacrificada

ii. Se recogieron 10 ml de sangre para analizar los anticuerpos contra el colágeno tipo II utilizando un ELISA y conteos de glóbulos blancos

iii. Examen clínico para lo siguiente

© Cojera

© Hinchazón

© Engrosamiento articular

iv. Ovejas sacrificadas

© Líquido sinovial en articulaciones de corvejón izquierdo y derecho

a. Evaluado para los conteos celulares de anticuerpos de colágeno tipo II

© Tejido sinovial en articulaciones de corvejón izquierdo y derecho

a. Secciones de H y E de fijación de formalina

b. Congelación con nitrógeno líquido

© Cartílago articular izquierdo y derecho

a. Fotos

b. Fijación de formalina y descalcificación para H y E

4.2 Resultados

Los signos clínicos de cojera leve fueron evidentes en las 7 ovejas, con hinchazón articular y dolor en la flexión articular aparente en 4 ovejas. Estos signos se observaron solo en el corvejón izquierdo (tratado).

Después de que las ovejas fueron sacrificadas, el engrosamiento macroscópico de la membrana sinovial que rodea la articulación tibiotarsal fue evidente en 6 de las 7 ovejas. Esta fue la evidencia más llamativa de los cambios inflamatorios. Al examinar el cartílago articular de esta articulación, se observaron lesiones erosivas inflamatorias graves en 3 de las ovejas, sobre todo en la superficie articular del hueso astrágalo.

Cuando se observaron cambios inflamatorios en el corvejón izquierdo (tratado), en el corvejón contralateral (derecho) ocasionalmente se observaron cambios inflamatorios muy leves.

La tabla 5 resume los resultados de las características observadas en las ovejas tratadas.

Las tablas 7-11 muestran los resultados de la evaluación clínica de ovejas en varios puntos de tiempo. No se observaron cambios clínicos hasta después de la inyección IA de CII.

Tabla 7. Evaluación clínica (+2d IA)

Tabla 8. Evaluación clínica (+8d IA)

Tabla 9. Evaluación clínica (+14d IA)

Tabla 10. Evaluación clínica (+21d IA)

Tabla 11. (+ 28d IA)

La figura 4 muestra la puntuación media de cojera para las ovejas después de la inyección intraarticular de colágeno tipo II. Como se muestra, la cojera aumentó aproximadamente 28 días después de la primera inyección de colágeno tipo II.

La figura 5 muestra los recuentos de leucocitos en el líquido sinovial de corvejones derechos (no estimulados) y de corzos (estimulados) de ovejas individuales. En los respondedores superiores, la concentración de leucocitos en el lado de control también se elevó, lo que indica la posibilidad de una respuesta sistémica. La figura 6 muestra el recuento medio de leucocitos en el líquido sinovial de ovejas control y ovejas inmunizadas con colágeno bovino tipo II.

Las figuras 7A y 7B muestran niveles de anticuerpos IgM e IgG en el líquido sinovial de ovejas inmunizadas con colágeno bovino tipo II y colágeno aviar tipo II, respectivamente. Estos resultados indican aumento de IgM e IgG contra colágeno tipo II en corvejones inmunizados de estos animales. Estos datos también se resumen en la tabla 12. Tabla 12. Niveles relativos de anticuerpos contra el colágeno bovino o aviar tipo II en el plasma de ovejas inmunizadas

* El sistema de clasificación incorpora tres criterios morfológicos: hiperplasia de la capa de células sinoviales, infiltración inflamatoria y activación del estroma sinovial, y tiene una puntuación máxima de 9 (Krenn y col., Pathol Res. Pract. 198:317-325, 2002). **Los niveles de IgM alcanzaron un pico en el día 14.

Los datos presentados anteriormente muestran que la artritis inducida por colágeno (CIA) se indujo en 7 ovejas mediante la inyección subcutánea de colágeno heterólogo tipo II en adyuvante de Freund el día 0 y el día 14 y la inyección intraarticular de colágeno tipo II en la articulación del corvejón el día 28. La enfermedad progresó rápidamente y 14 días después de la inyección intraarticular de CII se caracterizó por inflamación articular, hiperplasia sinovial, infiltración de células mononucleares, anticuerpos anti colágeno tipo II y, en algunas ovejas, lesiones erosivas del cartílago articular. Los signos clínicos de cojera fueron evidentes en las 7 ovejas y el engrasamiento macroscópico de la membrana sinovial que rodea la articulación tibiotarsal fue evidente en 6 de las 7 ovejas.

La CIA en ovejas parece ser un excelente modelo animal grande de artritis con similitudes significativas con la artritis reumatoide humana.

Ejemplo 5: Diseño experimental

Un modelo de artritis reumatoide en ovejas se produce esencialmente como se describe en el Ejemplo 4.

Treinta y seis ovejas se asignarán al azar a uno de los seis (6) grupos, cada uno con ocho (6) ovejas, como se muestra en la tabla 13. Los artículos de prueba se administrarán a animales relevantes 42 días después de la primera inyección de colágeno.

Treinta días después de la administración de los artículos de prueba, las ovejas serán sacrificadas y se realizará un examen de necropsia macroscópica y se recolectará tejido para la patología y el examen histológico.

Tabla 13 Asignación de tratamiento

Preparación de dosis de CPM

• 24 millones de CPM ovinas (CPMo) en 4,0 mL de ProFreeze®/DMSO/Alpha-MEM (que se utilizará para proporcionar una dosis de 0,3 millones de CPMo/kg por inyección IV)

• 80 millones de CPMo en 4,0 ml de ProFreeze®/DMSO/Alpha-MEM (que se utilizará para proporcionar una dosis de 1 millón de CPMo/kg por inyección IV)

• 160 millones de CPMo en 4,0 ml de ProFreeze®/DMSO/Alpha-MEM (que se utilizará para proporcionar una dosis de 2 millón de CPMo/kg por inyección IV) •

• 35 millones de CPMo en 0,7 ml de ProFreeze®/DMSO/Alpha-MEM (que se utilizará para proporcionar una dosis de 25 millones de CPMo mediante inyección intraarticular)

• Solución salina estéril (control).

Patología macroscópica

La necropsia y la recolección de tejido se realiza en todos los animales que mueren o son sacrificados. Los tejidos recogidos se fijan en formol tamponado al 10 %. Los hallazgos macroscópicos se registran para cada tejido.

Las articulaciones de corvejón izquierda (tratada) y derecha (control) están expuestas y diseccionadas hacia la membrana sinovial. Se colocan muestras de sinovial (y grasa subyacente) en formalina neutra tamponada al 10 % para fijación o en compuesto OCT para congelación rápida.

Luego se desarticulan las articulaciones y se examinan las superficies articulares en busca de evidencia de lesiones de cartílago macroscópico y se fotografían. Los segmentos de la superficie articular del hueso astrágalo (ver más abajo) se eliminan con una sierra y se fijan en formalina neutra tamponada al 10 %.

Puntuación histopatológica de los tejidos sinoviales de las articulaciones de corvejón

La metodología para la preparación de secciones histológicas y la puntuación de los cambios patológicos dentro de la membrana sinovial y los tejidos subsinoviales de la articulación de corvejón izquierdo y derecho de control y animales tratados se basó en la publicación de Krenn y col., (Pathol Res. Pract. 198:317-325).

Estudios inmunohistoquímicos y puntuación de los tejidos sinoviales de las articulaciones de corvejón La membrana sinovial se recolectó de la región dorso-lateral y dorso-medial de las articulaciones tibiotarsal (corvejón) derechas e izquierdas de los animales tratados y de control. Estos tejidos se congelaron en compuesto OCT y se seccionaron usando un criostato sobre portaobjetos de vidrio. Las secciones se sometieron a tinción utilizando procedimientos inmunohistoquímicos estándar para la identificación de tipos de células y anticuerpos específicos siguiendo metodologías publicadas (16) y protocolos disponibles comercialmente. Los anticuerpos utilizados incluyeron aquellos generados contra CD4 (44-97), CD8 (38-65), gamma-delta (células T ^y§ (86D/127-5), CD14 (Vm Rd aM-M9), célula B (CD79a: HM57) y citocinas TNF-alfa, interleucina-6, interleucina-1beta, interleucina-17, interleucina-10, interferón gamma, factor VIII y VCAM-1 y se obtuvieron de fuentes comerciales o se prepararon en el laboratorio. Las secciones teñidas se puntuaron cegadas.

Patología clínica

Se recogieron aproximadamente de 30 a 40 ml de sangre en el ingreso previo al estudio, en el día 0 (línea de base), el día 42, el día 49, el día 56, el día 63 y en la necropsia (día 72) y se usaron para los siguientes ensayos: Citoquinas: Se determinaron los niveles de las citocinas, TNF-a, IFN-g, IL-1b e IL-6, en líquido sinovial y plasma.

Procedimientos estadísticos

El análisis estadístico y la representación gráfica de los datos obtenidos para los diversos grupos de tratamiento se llevaron a cabo utilizando ANOVA de una vía, seguido de pruebas de comparación múltiple de Tukey o Newman-Keuls utilizando el software estadístico Graphpad Prism (versión 5.0b) (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA EE.UU.) La significación estadística entre los grupos de tratamiento se tomó como p < 0,05. Para los datos paramétricos, la significancia entre los grupos de tratamiento individuales y los controles se determinó utilizando la prueba t de Student emparejada. Para la evaluación no paramétrica, las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante las pruebas de intervalo con signo de pares emparejados de Mann-Whitney o Wilcoxon con significancia aceptada en p < 0.05.

Ejemplo 6: Resultados de la puntuación histopatológica de los tejidos sinoviales de las articulaciones de corvejón

Las puntuaciones histopatológicas individuales para las membranas sinoviales de las articulaciones de corvejón izquierdas (articulación inyectada con colágeno de tipo II bovino (BII)) y derechas de todos los animales fueron determinadas por observadores cegados. La puntuación agregada y componente para cada sección obtenida mediante la suma de las puntuaciones individuales para la hiperplasia, la activación del estroma (tejido sinovial) y el infiltrado inflamatorio se resumen gráficamente en las figuras 8A y 8B. A partir de estas figuras, resulta evidente que la puntuación agregada para las articulaciones izquierdas inyectadas con BII fue mayor que las puntuaciones para las articulaciones derechas contralaterales. Además, se demostraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos tratados con CPM y el grupo de control para los grupos inyectados con dosis de CPM bajas (p < 0,017) y altas (p < 0,025) (figura 8A) pero no para cualquiera de las puntuaciones histopatológicas para el sinovio correspondiente en las articulaciones derechas (figura 8B). La principal contribución a las diferencias entre los grupos de control y tratados con CPM parecería estar en la reducción de la hiperplasia sinovial en los grupos tratados con células (figura 8A).

Las puntuaciones de los cambios histopatológicos sinoviales en las articulaciones del corvejón izquierdo y derecho de los grupos inyectados intraarticulares no mostraron diferencias significativas entre la inyección con solución salina o 25 millones de CPM, pero, como se esperaba, las puntuaciones para las articulaciones izquierdas fueron más altas que para la articulación derecha (figura 8C).

Ejemplo 7: Estudios inmunohistoquímicos de los tejidos sinoviales

Los resultados de los sistemas de puntuación utilizados para semicuantificar los cambios celulares y los niveles de citoquinas en los tejidos sinoviales de los diversos grupos animales después de la tinción inmunohistoloquímica con los anticuerpos descritos en la sección de procedimientos se muestran en las figuras 9A - 9C. El uso de 3 procedimientos diferentes para calificar estas secciones múltiples impidió la generación de una puntuación combinada significativa para cada uno de los grupos experimentales examinados. Por lo tanto, las puntuaciones medias obtenidas para cada uno de los grupos experimentales para los anticuerpos marcadores individuales utilizados se presentan por separado y se muestran en las figuras 10A - 10F. En las figuras 11A a 11E, se muestran ejemplos representativos de fotomicrografía de algunas de estas secciones junto con las puntuaciones asignadas.

Aunque se observaron tendencias claras para una disminución en la IL-1 y la VCAM-1 intimales y un aumento de TCR Gamma-Delta (figuras 10A - 10C), no se pudieron demostrar diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de control e inyectados con CPM. Sin embargo, la tinción de la íntima sinovial (sinoviocito) para la IL-6 (p = 0,029) y la TNF-alfa (p = 0,049) (figura 10D) y la tinción de tejidos intersticiales para las células CD-14 (figura 10e ) para el grupo inyectado con dosis altas de CPM se demostró que era significativamente más bajo que el grupo control inyectado con solución salina (p = 0,009). Además, los niveles de la citocina IL-17 en los tejidos intersticiales sinoviales del grupo de dosis alta también fueron significativamente más bajos que para el grupo de control correspondiente (ANOVA, p < 0,005) (figura 10F).

Los resultados de las puntuaciones inmunohistoquímicas obtenidas para las articulaciones inyectadas con solución salina y CPM se muestran en la tabla 14. Parecía haber una mayor tinción para CD4, CD8 y CD79 en las articulaciones inyectadas con CPM, un hallazgo que era consistente con el mayor número de linfocitos observado en las articulaciones inyectadas con CPM. Sin embargo, los valores medios para la TNF-alfa y la IL-17 en las articulaciones inyectadas con CPM fueron más bajos que para las articulaciones inyectadas con solución salina, particularmente para la región de la íntima de la membrana sinovial izquierda.

Discusión general

Como se describe en esta invención, la inmunización de ovejas adultas mediante la inyección SC de colágeno bovino tipo II en adyuvante completo e incompleto de Freund, seguido de inyección intraarticular (IA) de la misma proteína sola en sus articulaciones de corvejón, resultó en la inducción de una artropatía. que mostraba muchas de las características patológicas clásicas de la AR humana.

Por lo tanto, este modelo ovino de AR se consideró adecuado para la evaluación de los efectos terapéuticos de las CPM administradas por vía IV en las dosis de 0,3 x 106, 1,0 x 106 y 2,0 x 106 células/kg en relación con los efectos de un volumen equivalente de solución salina IV. Para fines comparativos, un grupo IA que recibió una inyección única de 25 x 106 de CPM o solución salina en las articulaciones del corvejón izquierdo también se incluyó en el estudio. Las CPM o las soluciones salinas se administraron 14 días después de la inyección intraarticular de colágeno bovino tipo II (día 28) y 30 días después se procedió al sacrificio (día 72).

Los resultados del análisis histopatológico y del inmunohistoquímico de los tejidos sinoviales fueron positivos. Además, de entre las tres dosis IV de CPM administradas, la dosis más alta de 2 millones de CPM/kg generó consistentemente mejoras estadísticas en relación con el grupo de control de solución salina. Mientras que el grupo de dosis baja de CPM también mostró efectos positivos en algunos de los parámetros estudiados, el grupo de dosis media de CPM tratado mostró una respuesta mixta. La razón de la ausencia de una relación clara de respuesta a la dosis en el presente estudio no está del todo clara, pero puede estar relacionada con el pequeño número de animales utilizados en cada grupo y la heterogeneidad en la intensidad de la expresión de la enfermedad dentro del grupo, como lo demuestran las altas desviaciones estándares observadas para muchos de los parámetros del grupo de control. Sin embargo, la reducción estadísticamente significativa de las puntuaciones histopatológicas observadas para las membranas sinoviales de las articulaciones del corvejón izquierdo de los grupos de CPM de dosis altas en relación con los controles de solución salina (figura 8C) fueron respaldadas por las puntuaciones inmunohistoquímicas reducidas para la tinción de sinoviocitos (íntima) para IL-6, TNF-alfa (figura 4D) y la tinción de tejido intersticial para las células CD14 (figura 10E) e IL-17 (figura 10F).

Los resultados de los presentes estudios que utilizan un modelo ovino de AR crónica han confirmado que una sola inyección IV de entre 0,3 y 2,0 millones de CPM/kg fue efectiva para reducir los índices histopatológicos claves de la artritis, a saber, la hiperplasia sinovial, la activación del tejido estromal y la infiltración celular inflamatoria. Además, la demostración, usando tinción inmunohistoquímica de secciones congeladas, de que los niveles de células IL-6, TNF-alfa, IL-17 y CD14+ se redujeron significativamente en los animales con dosis altas de CPM, en relación con los controles de solución salina, apoyó nuestra hipótesis de trabajo. Se ha demostrado que la IL-17 (Shahrara y col., (2009) Journal of Immunology 182: 3884-3891) induce la migración de monocitos in vivo, lo que sugiere que esta citocina fue responsable del reclutamiento de monocitos en las articulaciones de los pacientes con AR. Esta visión fue consistente con nuestra hipótesis de que al reducir los niveles de la IL-17 en el intersticio sinovial, las CPM inyectadas disminuyeron indirectamente el número de monocitos que migran desde la médula ósea a la articulación inflamada, limitando así los niveles de citocinas proinflamatorias, tales como la IL-6 y la TNF-alfa producidos por los sinoviocitos de la íntima proliferante.

Además, se ha sugerido que las citocinas inflamatorias “convencionales” expresadas en el cartílago y el sinovio desempeñan un papel en la osteoartritis, incluyendo la interleucina-1p (IL-1p), el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), la IL-6, la IL-8, la IL-17 y las células CD14 solubles (Liu-Bryan y Terkeltaub Arthritis and Rheumatism, 64: 2055-2058, 2012). Por lo tanto, los datos presentados en esta invención respaldan un papel para la administración de CPM (por ejemplo, por vía intravenosa) para tratar la osteoartritis.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una población de células enriquecidas en células multipotenciales STRO-1 para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad reumática en un sujeto mediante la administración sistémica de una cantidad terapéuticamente efectiva de la población de células, donde la población de células enriquecida en células multipotenciales STRO-1 comprenden al menos un 1 % de células multipotenciales STRO-1+.

2. La población de células para el uso de la reivindicación 1, donde la enfermedad reumática se selecciona de entre el grupo que consiste en la artritis reumatoide, la enfermedad de Still, la espondilitis anquilosante, la enfermedad de Reiter, la artritis psoriásica, la artritis entérica, la sacroileítis, la espondilitis y la osteoartritis.

3. La población de células para el uso en la reivindicación 1, donde la enfermedad reumática es la artritis reumatoide.

4. La población de células para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el sujeto está recibiendo tratamiento con metotrexato antes de la administración de la población de células enriquecidas en células multipotenciales STRO-1+.

5. La población de células para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde las células multipotenciales STRO-1+ son células multipotenciales STRO-1bright.

6. La población de células para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde:

(i) se administran células multipotenciales STRO-1+ en una cantidad suficiente para reducir el nivel de una o más de las siguientes: la IL-6, la TNFa, la IL-17 y/o las células CD14+ en una articulación del sujeto;

(ii) se administran entre 0,1 x 106 y 5 x 106 células multipotenciales STRO-1+ por kilogramo o entre 0,3 x 106 células/kg y 2 x 106 células multipotenciales STRO-1+/kg;

(iii) se administra una dosis baja de células multipotenciales STRO-1+ de entre 0,1 x 105 y 0,5 x 106 células multipotenciales STRO-1+ por kilogramo o aproximadamente 0,3 x 106 células multipotenciales STRO-1+ por kilogramo; o

(iv) se administra una dosis alta de células multipotenciales STRO-1+ de entre 1,5 x 106 y 2 x 106 células multipotenciales STRO-1+ por kilogramo o entre 100 y 300 millones de células STRO-1+.

7. La población de células para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la población enriquecida en células multipotenciales STRO-1+ se administrará una vez por semana o con menos frecuencia, o una vez cada cuatro semanas o con una frecuencia menor.

8. La población de células para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la población enriquecida en células multipotenciales STRO-1+ se administrará por vía intraarterial, en una aorta, en una aurícula o ventrículo del corazón o por vía intravenosa.

9. La población de células para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la población enriquecida en células multipotenciales STRO-1+ es autogénica o alogénica.

10. La población de células para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la población enriquecida en células multipotenciales STRO-1+ se expandió antes de la administración.

11. La población de células para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde las células multipotenciales STRO-1+ son STRO-1bri y/o expresan fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNAP).

12. La población de células para usar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la población que se enriqueció en células STRO-1+ se administra en forma de una composición que comprende dicha población y un vehículo y/o excipiente.

13. La población de células para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde la población de células enriquecida en células multipotenciales STRO-1+ comprende al menos un 5 % de células multipotenciales STRO-1+.