KR101786862B1 - 류마티즘성 질환을 치료 또는 예방하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는 류마티즘성 질환 치료 방법을 제공한다.
Description
관련된 출원 데이터
본 출원은 2012년 7월 4일자로 제출된 "류마티즘성 질환을 치료 또는 예방하는 방법들"이란 제목의 호주 특허 출원 번호 2011902655을 우선권으로 주장하며, 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
서열 목록
본 출원과 함께 서열 목록은 전자 형태로 제출된다. 전체 서열 목록은 여기에 참고자료로 편입된다.
분야
본 개시내용은 류마티즘성 질환을 치료 또는 예방하는 방법들에 관계한다.
류마티즘성 질환은 일반적으로 "관절염"이라고 불리는 공통적 질환 분류인데, 자가면역 반응과 연합되거나 자가면역 반응이 원인이 된다. 이런 종류의 질환들로는 류마티즘성 관절염, 척추관절염 (가령, 강직성 척수염), 쇼그렌(Sjorgren) 증후군 (시카(Sicca) 증후군), 라이터(Reiter) 질환, 건선 관절염, 장 관절염 (염증성 장 질환과 연합된 관절 문제), 천골장골관절염 또는 척추염, 그리고 골관절염을 포함한다.
질병 관리 본부(CDC)에 따르면, 대략적으로 5천만명의 성인이 미국에서만 일부 형태의 관절염으로 진단받는다. 이 수는 2030년까지 6천7백만명의 성인으로 증가될 것으로 예측된다. 미국에서 관절염 비용은 관절염 치료를 위하여 대략 US$8백8억이 들었으며, 간접 비용(가령, 실직)으로 대략 US$4백7십억이 들은 것으로 CDC는 예상한다. 전체 비용 $1278억 달러는 2003년 미국 국내 총생산액의 1.2%에 해당된다.
류마티즘성 관절염 및 골관절염
류마티즘성 관절염 (RA)은 관절 연골 및 뼈의 파괴에 수반되는 광범위한 활액성 염증을 특징으로 하는 고통스런 만성 전신 질환이다. RA의 임상 과정은 가변적이며, 흔히 완화 패턴을 보이지만, 진행성이라면 필연적으로 관절 변형 및 손상된 기능으로 이어진다. 3가지 형태의 RA로 구별될 수 있는데: 유순한, 자가-제한 질환; 유순한 진행성 질환; 그리고 약물로 조절이 곤란하고, 관절의 기능적 쇠퇴 및 방사형 악화를 특징으로 하는, 가령, 관절 공간이 좁아지고, 특히, 판누스(pannus)라고 불리는 증식하는 염증이 있는 활막 아래 연골 침식을 특징으로 하는 공격적 질환이 있다. 이 질환의 조직적 특징에 따르면, 맥관염, 폐포염, 및 안과 질환을 포함하는 관절과 별도의 현시들이 있다. 문헌에서 보고된 것과 같이 이 질환의 유행은 미국 인구의 약 1%이며, 여성이 모든 경우의 2/3를 차지한다.
RA의 개시는 피로, 신경성식욕부진, 광범위의 허약, 그리고 근골격 통증과 함께 흔히 잠행성이다. 특이적 징후들은 나중에 나타난다. 대칭적 방식으로 보통 몇 개의 관절이 영향을 받는다. 가장 흔하게는 이들 관절은 손, 손목, 무릎 및 발의 관절이다. 관절들은 통증이 있고 부어오르며, 그리고 움직임이 제한된다. 한 시간 이상의 조조강직(Morning stiffness)이 매우 전형적으로 나타난다. 지속적 염증과 함께, 손목의 가장 전형적인 방사형 일탈과 기부 근위지간 관절들의 과신장(hyperextension) 또는 굴곡(flexion)을 포함하는 다양한 변형이 발생하고; 다른 변형들 역시 발생된다. 골격 근육의 위축도 포함된다. 모든 환자의 대략 20 내지 30%에서, 관절주위 구조 또는 외상 부위에서 류마티즘성 혹(nodules)이 발생되지만, 이들은 보통 제한된 임상적 의미다. 혹은 늑막 또는 수막과 같은 다른 구조들에서도 볼 수 있다. 류마티즘성 맥관염은 거의 모든 장기(폐, 위-내장-관, 간, 비장, 췌장, 림프절, 고환, 그리고 눈)에 영향을 줄 수 있다.
RA의 치유성 치료는 없다. 모든 약물 섭생은 주로 징후들 그리고 염증을 완화시키는 시도에 해당된다. 신속한 작용 개시와 함께 아스피린 그리고 기타 비스테로이드성 항-염증성 약물 (NSAID)은 맨처음 취하는 방법이다. 경구 그리고 주사가능한 글루코코르티코이드는 필요에 따라 약물 섭생에 추가된다. 세 번째 치료 방법은 질환 변형 항류마티즘 약물 (DMARD)을 포함한다; 이들은 작용 개시가 느리고, 일부 경우에는 몇 개월 소요된다. DMARD에는 아자티오프린(azathioprine), 술파살라진(sulphasalazine), 금, D-페니실라민, 히드록시클로로퀸, 메토트렉세이트, 그리고 사이클로스포린이 포함된다. 생물학적 약물, 이를 테면 Enbrel®, Remicade® 그리고 Humira®의 최근 추가는 대안 치료법으로 제공되지만, 그러나 이들 산물의 정기적 이용은 면역 방어 체계를 억제시킬 수 있고 기회성 감염 및 질환들 이를 테면 결핵의 발생 증가와 연합되었다.
골관절염 (OA)은 서구 집단에서 가장 흔한 형태의 관절염이다. 통증 및 기능적 신체 장애의 임상적 특징을 가진 무릎 OA는 미국에서 장년층에서 만성 신체 장애의 주도적 원인이다.
병적으로, OA에서 가장 두드러진 변화는 관절의 연골과 가장자리 그리고 중앙의 새로운 뼈 형성의 촛점 상실이다. 그러나, OA는 단순히 관절의 연골과 연골하위 뼈의 질환이 아니다. 오히려, 활막, 캡슐(capsule), 인대, 관절주위 근육, 그리고 지각 신경에서 또한 발견되는 변경과 함께, 활액성 관절 질환이다.
한때 OA가 비-염증성 관절증으로 간주되기도 했지만, 환자들은 국소 염증 그리고 활액막염과 일치되는 신호 및 징후들을 대개 나타내고, 전임상 및 임상 연구들의 최근 증거들은 병리생리학적으로 염증 그리고 염증성 중개자의 역할을 뒷받침한다.
골관절염의 현재 치료는 비-의약 요법, 의약 요법, 그리고 수술적 치료를 포함한다. 비-의약 치료는 운동, 그리고 체중감량 프로그램, 열 처치, 그리고 보조 장치들 또는 지지대를 포함한다. 무릎 OA의 경우, 움직임의 범위 및 강화 운동은 기능의 손상의 감소, 기능의 개선, 그리고 관절 보호 쪽으로 설계된다. 약물은 진통제 (가령, 아세트아미노펜), 비-선택성 시클로옥시게나제 (COX) 저해물질 또는 COX-2 효소의 선택성 저해물질인 비-스테로이드성 항-염증성 약물 (NSAIDS), 주사된 관절내 코르티코스테로이드 또는 점성보충물, 그리고 증명된 또는 추정 질환-변형 골관절염 약물 (DMOAD)을 포함한다. 외과적 절차들은 관절 괴멸괴사조직제거술(debridement) 및 세척, 그리고 끝으로 전체 무릎 관절형성을 포함한다.
무릎 OA에 이용되는 가장 흔한 의약 치료는 전형적으로 통증의 50% 미만의 완화를 제공한다. 예를 들면, 아세트아미노펜, 선택성 NSAID 또는 비-선택성 NSAID의 사용은 일반적으로 100 점 (100-mm) 시각 유사 등급을 이용할 때 약 70점의 기선으로부터 약 30점의 평균 무릎 OA 통증 개선 성과를 얻었다. 따라서, 무릎 OA의 통증 관리에 있어서 개선을 위한 실질적 여지가 있다. 더욱이, 구조적 쇠퇴의 진행을 지연시키는 것으로 설명된 요법은 없었다.
강직성 척수염
강직성 척수염 (AS)은 환자 기능, 웰빙, 그리고 신체 장애에 상당한 영향을 주는 만성, 진행성, 염증성 질환이다. AS의 유행은 0.1-1.9% 범위로 추정되며, 여성보다는 남성에 더 많다. 중축 골격 및 큰 주변 관절의 만성 질환으로써, AS는 염증성 등 통증 및 경직의 원인이 되며 피부, 눈 그리고 내장의 기타 염증성 질환들과 연합된다. 심각한 경우들에서, AS는 극단적인 신체적 제약을 야기하는 완전한 척추 융합을 초래할 수 있다. 따라서, AS를 위한 안전하고 효과적인 치료가 여전히 요구된다.
질환이 진행될 때, AS 환자는 통증, 관절 경직, 그리고 척추 운동성의 궁극적 상실을 경험한다. 이들 임상 징후들과 후속적인 질환 진행은 기능적 제한 및 건강-관련 삶의 질(HRQOL)에 손상을 야기한다.
AS를 위한 현재 치료는 없다. 일반적으로, 치료는 약물, 이를 테면 NSAID, 코르티코스테로이드, 그리고 DMARD를 이용하여 통증과 경직을 완화시키는 시도를 포함한다.
염증성 관절 질환은 사회에 주요 영향을 가지는 쇠약 질환 부류라는 것은 당업자들에게 자명할 것이다. 이들 질환의 치료법 또한 필요하다.
요약
본 발명에 이르는 작업에서, 발명자들은 류마티즘성 질환들에서 간엽성 선조 세포 (MPC)의 효과를 측정하고자 하였다. 발명자들은 류마티즘성 질환들의 모델로 류마티즘성 관절염의 양 모델을 일반적으로 연구하였는데, 그 이유는 이들 질환중 많은 것들이 공통적인 특징들, 가령 질환들, 가령, 자가면역 그리고 관절내 면역 세포 그리고 염증성 사이토킨의 존재를 공유한다. 발명자들은 MPC가 관절염의 조직병리학적 지수, 이를 테면, 활액성 과형성, 기질 조직 활성화 그리고 염증성 세포 침윤의 감소에 효과적이었다는 것을 결정하였다. 더욱이, MPC의 투여는 전-염증성 사이토킨, 이를 테면, CD14+ 세포에 추가적으로, 가령, 활액성 조직내에서 전-염증성 사이토킨, 이를 테면, IL-6, TNFα, IL-17의 수준을 감소시킨다는 것을 발명자들은 보여주었다. 발명자들은 이들 세포 및 사이토킨의 수준을 감소시키는 능력이 류마티즘성 질환들, 이를 테면, 류마티즘성 관절염 및/또는 골관절염을 치료하는데 MPC(및/또는 이들의 후손 및/또는 이로부터 분비되는 가용성 인자들)를 적합하게 만든다고 생각한다.
MPC들은 연장된 치료 이익을 제공하는데, 세포의 단일 주사 효과는 최소한 약 30 일 지속된다고 발명자들은 또한 결정하였다.
발명자들은 MPC 또는 그의 후손은 류마티즘성 질환의 질병 부위로 이동되었다는 것을 추가적으로 발견하였다. 이러한 이동은 세포의 전신 투여를 허용하기 때문에 이익을 제공하는데, 전신 투여는 가령, 대상의 활액 유체 안으로 세포를 투여하는 것과 비교하였을 때 더 용이하고, 덜 어렵고 및/또는 덜 침투적이다.
표식 STRO-3의 발현에 의해 단리된 양의 MPC는 표식 STRO-3 및 STRO-1를 공동-발현시키는 인간 MPC와 기능적으로 등가이다(실시예 2에 나타낸 것과 같이).
따라서, 본 개시내용은 대상에서 류마티즘성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손이 농축된 세포 집단 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들(population of cells enriched for STRO-1+ cells and/or progeny thereof and/or soluble factors derived therefrom)을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
한 실시예에서, 류마티즘성 질환은 자가면역 류마티즘성 질환이다.
한 실시예에서, 류마티즘성 질환은 류마티즘성 관절염, 스틸(Still) 질환 (유사어. 청소년 특발성 관절염 또는 청소년 류마티즘성 관절염), 강직성 척수염, 라이터 질환, 건선 관절염, 장의 관절염, 천골장골관절염, 척추염 그리고 골관절염으로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 실시예에서, 류마티즘성 질환은 골관절염이다.
예시적인 형태에서, 류마티즘성 질환은 류마티즘성 관절염이다.
한 실시예에서, 이 방법은 STRO-1밝음(bright) 세포 및/또는 그의 후손이 농축된 세포 집단 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들을 투여하는 것을 포함한다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손이 농축된 세포 집단 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들은 전신으로 투여된다. 예를 들면, 이 세포는 정맥으로 투여된다. 이에 대해, 발명자들은 STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손이 대상에서 염증이 있는 관절 부위로 이동한다는 것을 보여주었다. 따라서, 개시내용은 대상내 염증이 있는 관절로부터 떨어진 부위에서 STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손의 투여를 고려한다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들은 대상의 관절내, 이를 테면 활액성 조직내에 CD14+ 세포에 추가적으로, 가령, IL-6, TNFα, IL-17의 수준을 감소시키는데 충분한 양으로 투여된다.
세포의 예시적인 투약량은 0.1 x 106 내지 5 x 106의 STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손을 포함한다. 예를 들면, 이 방법은 kg당 0.3 x 106 내지 2 x 106 의 STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손을 투여하는 것을 포함한다.
한 실시예에서, 이 세포는 약 0.3x106 세포/kg 내지 약 4x106 세포/kg, 이를 테면 약 0.3x106 세포/kg 내지 약 2x106 세포/kg 사이의 용량으로 투여된다.
이 방법의 한 가지 형태는 낮은 용량의 STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손을 투여하는 것과 관련된다. 이러한 낮은 용량은 예를 들면, 0.1 x 105 내지 약 0.5 x 106 의 STRO-1+ 세포/kg, 이를 테면 약 0.3 x 106의 STRO-1+ 세포/kg 이다.
또다른 실시예에서, 높은 용량의 세포가 대상에게 투여된다. 예시적인 투약량은 최소한 약 1.5 x 106의 세포/kg를 포함한다. 예를 들면, 높은 용량은 약 1.5 x 106 내지 약 4x106의 세포/kg 사이를 포함한다. 예를 들면, 높은 용량은 약 1.5 x 106 또는 약 2 x 106의 세포/kg를 포함한다. 발명자들은 이러한 용량이 CD14+ 세포에 추가적으로, IL-6, TNFα, IL-17의 수준을 감소시킴으로써 이익을 제공한다는 것을 보여주었다.
한 실시예에서, 이 세포는 환자의 체중과 무관하게 약 1억 내지 3억개의 세포 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, 이 세포는 환자의 체중과 무관하게 약 1억 내지 2억개의 세포 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, 이 세포는 환자의 체중과 무관하게 약 1억개의 세포 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, 이 세포는 환자의 체중과 무관하게 약 1.5억개의 세포 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, 이 세포는 환자의 체중과 무관하게 약 2억개의 세포 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, 이 세포는 환자의 체중과 무관하게 약 3억개의 세포 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손이 농축된 집단 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들은 이를 테면, 4주 당 1회 또는 그보다 덜 빈번하게(once every four weeks or less often), 주당 1회 또는 그보다 덜 빈번하게 투여된다.
본 개시내용은 이 세포 및/또는 가용성 인자들의 다양한 투여를 또한 고려한다. 예를 들면, 이러한 방법은 이 세포를 투여하고, 대상을 관찰하여 염증성 관절 질환의 하나 또는 그 이상의 징후들이 발생 또는 재발할 때를 판단하고 그리고 추가 용량의 세포 및/또는 가용성 인자들을 투여하는 것과 관련될 수 있다. 류마티즘성 질환의 징후를 평가하는 적합한 방법들은 당업계 숙련자들에게 자명하거나 및/또는 본 명세서에서 기술된다.
또다른 실시예에서, 세포 및/또는 가용성 인자들은 고정된 일정, 가령, 매주 또는 2주 또는 3주 또는 4주 또는 5주 또는 6주 또는 더 긴 기간당 1회, 고정된 일정으로 투여된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포들 및/또는 후손 세포들이 농축된 집단은 자가(autogeneic) 또는 동종이계(allogeneic)이며 및/또는 이 가용성 인자들은 자가 또는 동종이계 세포들로부터 유래(derive)될 수 있다.
한 실시예에서, STRO-1+세포들 및/또는 후손 세포들이 농축된 집단은 투여에 앞서 및/또는 가용성 인자들을 획득하기에 앞서 배양 확장되었다.
한 실시예에서, STRO-1+세포가 농축된 집단은 STRO-1밝음이며 및/또는 조직 비-특이적 알칼리 포스파타제 (TNAP)를 발현시키고 및/또는 후손 세포 및/또는 가용성 인자들은 STRO-1밝음이거나 TNAP를 발현시키는 STRO-1+ 세포로부터 유래된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들은 전술한 STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들 그리고 운반체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물 형태로 투여된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들은 류마티즘성 질환을 치료 또는 예방하는 또다른 화합물과 함께 투여된다. 한 실시예에서, 다른 화합물은 질환-변형 항-류마티즘성 약물 (DMARD)이다. 한 실시예에서, DMARD는 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드(leflunomide), 아자티오프린, D-페니실라민, 금 염 미노사이클린, 사이클로스포린 그리고 TNF-저해물질으로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 실시예에서, DMARD는 아자티오프린, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 레플루노미드, 메토트렉세이트 그리고 술파살라진으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시예에서, DMARD는 메토트렉세이트이다.
또다른 실시예에서, DMARD는 항-TNF 항체 (가령, 인플리시마브(infliximab), 고리무마브(golimumab) 또는 아달리무마브(adalimumab)) 또는 가용성 TNF 수용체(가령, 에타네르셉트(etanercept))이다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들은 B 세포 고갈 물질과 함꼐 투여된다. 한 실시예에서, B 세포 고갈 물질은 항-CD20 항체, 이를 테면 리투시마브(rituximab) 또는 오파투무마브(ofatumumab)이다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들은 류마티즘성 관절염을 앓고 있으며, 메토트렉세이트 치료를 받은 대상에게 투여된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들은 메토트렉세이트 요법에 부속 및/또는 부수 요법으로 투여된다.
한 실시예에서, 대상은 중간정도의 활성 류마티즘성 관절염 또는 심각한 활성 류마티즘성 관절염 또는 중간정도 내지 심각한 활성 류마티즘성 관절염을 앓는다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포는 류마티즘성 관절염을 앓고 있으며, 메토트렉세이트 치료를 받은 대상에게 투여되며, 이때 이 세포는 약 1x106 - 약 3x106 세포/kg의 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포는 류마티즘성 관절염을 앓고 있으며, 메토트렉세이트 치료를 받은 대상에게 투여되며, 이때 이 세포는 약 1.5x106 - 약 2x106 세포/kg의 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포는 류마티즘성 관절염을 앓고 있으며, 메토트렉세이트 치료를 받은 대상에게 투여되며, 이때 이 세포는 약 1.5x106 세포/kg의 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포는 류마티즘성 관절염을 앓고 있으며, 메토트렉세이트 치료를 받은 대상에게 투여되며, 이때 이 세포는 약 2x106 세포/kg의 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포는 류마티즘성 관절염을 앓고 있으며, 메토트렉세이트 치료를 받은 대상에게 투여되며, 이때 이 세포는 환자의 체중과 무관하게 약 1억 내지 3억개의 세포 용량, 이를 테면, 환자의 체중과 무관하게 약 1억 내지 2억개의 세포 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포는 전신, 가령, 정맥내로 투여된다.
따라서, 한 실시예에서, 본 개시내용은 대상의 골관절염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손이 농축된 세포 집단 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들을 대상에게 정맥(또는 전신으로)으로 투여하는 것을 포함한다. 예시적인 세포, 투약량 그리고 복합 치료는 본 명세서에서 기술되며, 그리고 개시내용의 본 실시예에 준용된다.
또다른 실시예에서, 본 개시내용은 대상의 류마티즘성 관절염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손이 농축된 세포 집단 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들을 대상에게 정맥(또는 전신으로)으로 투여하는 것을 포함한다. 예시적인 세포, 투약량 그리고 복합 치료는 본 명세서에서 기술되며, 그리고 개시내용의 본 실시예에 준용된다.
본 개시내용은 대상의 류마티즘성 관절염을 치료 또는 예방용으로 STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손이 농축된 세포 집단 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들을 추가적으로 제공한다.
본 개시내용은 대상의 류마티즘성 관절염을 치료 또는 예방용 약물 제조에 있어서 STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손이 농축된 세포 집단 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들의 용도를 추가적으로 제공한다.
서열 목록에 대한 핵심
SEQ ID NO: 1 GAPDH를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 2 GAPDH를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 3 SDF-1을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 4 SDF-1을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 5 IL-1β를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 6 IL-1β를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 7 FLT-1을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 8 FLT-1을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 9 TNF-α를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 10 TNF-α를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 11 KDR을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 12 KDR을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 13 RANKL을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 14 RANKL을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 15 렙틴(Leptin)을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 16 렙틴(Leptin)을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 17 CBFA-1을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 18 CBFA-1을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 19 PPARγ2를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 20 PPARγ2를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 21 OCN을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 22 OCN을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 23 MyoD를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 24 MyoD를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 25 SMMHC를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 26 SMMHC를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 27 GFAP를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 28 GFAP를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 29 네스틴(Nestin)을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 30 네스틴(Nestin)을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 31 SOX9를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 32 SOX9를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 33 콜라겐 유형 X를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 34 콜라겐 유형 X를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 35 어그리칸(Aggrecan)을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 36 어그리칸(Aggrecan)을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
도 1. 성숙 인간 골수 다형핵 세포(BMMNC)에 의한 TNAP(STRO-3) 및 간엽성 전구 세포 마커, STRO-1밝음의 공동-발현. 이중-칼라 면역형광과 유세포분석법은 FITC에 커플링된 염소 항-뮤린 IgM 항체로 간접적으로 표지된 STRO-1 MACS-선별된 BMMNC(x 축), 그리고 PE에 커플링된 염소 항-뮤린 IgG로 간접적으로 표지된 STRO-3 mAb(뮤린 IgG1)(y 축)의 배양에 의해 수행되었다. 점도표 히스토그램은 리스트모드 데이터(listmode data)로서 수집된 5 x 104 이벤트를 나타낸다. 수직선과 수평선은 동일한 조건 하에 처리된 아이소타입-정합된 대조 항체, 1B5(IgG)와 1A6.12(IgM)로 획득된 <1.0% 평균 형광의 반응성 수준으로 설정되었다. 이들 결과는 STRO-1밝음 세포의 소수 집단이 TNAP(위쪽 오른쪽 사분면)을 공동-발현하지만, 나머지 STRO-1+ 세포가 STRO-3 mAb와 반응하지 않는다는 것을 증명한다.
도 2. 배양된 그리고 확장된 STRO-1밝음 MPC의 STRO-1밝음 또는 STRO-1흐림(dim) 후손의 발현 프로파일 프로파일. 탈체(ex vivo) 확장된 골수 MPC의 단일 세포 현탁액은 트립신/EDTA 처리에 의해 준비되었다. 세포들은 STRO-1 항체로 착색되며, 후속적으로 염소-항 뮤린 IgM-플루오레세인 이소티오시아네이트와 항온처리에 의해 나타난다. 형광 활성화된 세포 분류(A)이후, 전체 세포성 RNA는 STRO-1흐림 또는 STRO-1밝음을 발현시키는 세포들의 정제된 집단으로부터 준비된다. RNAzolB 추출 방법, 및 표준 절차들을 이용하여, 각 준집단으로부터 총 RNA를 단리시켰고, cDNA 합성을 위한 주형으로 이용되었다. 다양한 전사체들의 발현은 이미 언급된 것과 같이 표준 프로토콜을 이용한 PCR 증폭에 의해 평가되었다(Gronthos et al. J Cell Sci. 116:1827-1835, 2003). 본 연구에 이용된 프라이머 세트는 표 2에 나타낸다. 증폭 이후, 각 반응 혼합물은 1.5% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되고, 에티디움 브롬화물 착색에 의해 시각화되었다(B). 각 세포 표식에 대한 상대적인 유전자 발현은 ImageQant 소프트웨어를 이용하여 하우스-키핑(house-keeping) 유전자, GAPDH의 발현에 대한 기준으로 평가되었다(C).
도 3. 배양된 그리고 확장된 STRO-1+ MPC의 STRO-1밝음 후손은 높은 수준의 SDF-1를 발현시키지만, STRO-1흐림 후손은 발현되지 않는다. (A) STRO-1+ BMMNC의 MACS-단리된 조제물은 FACS를 이용하여, 영역, STRO-1밝음 및 STRO-1흐림/둔감에 따라 상이한 STRO-1 하위세트로 분할된다. 총 RNA는 각 STRO-1 하위집단으로부터 준비되었고, STRO-1밝음 공제 혼성화 라이브러리를 구축하는데 이용되었다(B-C). 대표적인 PCR 산물로 블랏된 복제 니트로셀룰로오즈 필터들은 STRO-1밝음 공제된 cDNA로 형질변환된 세균 클론으로부터 증폭되었다. 그 다음 필터들은 [32P] 데옥시시티딘 삼인산염 (dCTP)-라벨된 STRO-1밝음(B) 또는 STRO-1흐림/둔감 (C) 공제된 cDNA로 프로브시켰다. 화살표는 인간 SDF-1에 대응하는 cDNA 단편을 내포하는 1 클론의 차등 발현을 나타낸다. (D) 역 전사효소 (RT)-PCR 분석은 배양에 앞서, 새로 MACS/FACS-단리된 BMMNC STRO-1 집단으로부터 준비된 총 RNA에서 SDF-1 및 글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소 (GAPDH) 전사체들의 상대적 발현을 설명한다. bp는 염기쌍을 나타낸다.
도 4는 류마티즘성 관절염의 양 모델에서 절름발이 득점을 나타내는 그래프다. 득점은 본 명세서에서 기술된 것과 같이 측정되었다.
도 5는 테스트 과정 동안(도면에 표시된 것과 같이), 개별 양의 우측(자극안된) 및 좌측 (자극된) 무릎의 활액 유체에서 백혈구 카운트를 나타내는 그래프다. 양 B1627 그리고 B4036은 닭 콜라겐 유형 II로 면역화되었고, 모든 다른 양들은 소의 콜라겐 유형 II로 면역화되었다. 더 높은 반응자들에서 대조군 측면에서 백혈구 농도 또한 상승되었는데, 이는 전신 반응 가능성을 나타낸다.
도 6은 대조군 양 (n = 7)과 소의 콜라겐 유형 II 로 면역화된 양(n = 5)의 활액 유체에서 백혈구 카운트를 보여주는 그래프다. 데이터는 평균 ± 표준오차를 나타낸다.
도 7A는 소의 콜라겐 유형 II로 면역화된 5마리 양의 우측 (대조군) 그리고 좌측 (자극된) 무릎으로부터 활액내 소의 콜라겐 유형 II에 대한 IgM (좌측 패널) 그리고 IgG (우측 패널) 항체의 수준을 나타내는 그래프다. 활액성 유체는 최초 면역화 이후 42일 뒤 검시에서 얻었다. 자극된 무릎에서 IgM의 수준은 4-8배 상승되었고, IgG의 수준은 10-60 배 상승되었다.
도 7B는 닭의 콜라겐 유형 II로 면역화된 2마리 양의 우측 (대조군) 그리고 좌측 (자극된) 무릎으로부터 활액내 닭의 콜라겐 유형 II에 대한 IgM (좌측 패널) 그리고 IgG (우측 패널) 항체의 수준을 나타내는 그래프다. 활액성 유체는 최초 면역화 이후 42일 뒤 검시에서 얻었다. 자극된 무릎에서 IgM의 수준은 3-5배 상승되었고, IgG의 수준은 2-8 x 106 배 상승되었다.
도 8A는 모든 집단의 좌측 무릎 관절로부터 활액성 막에 대한 집합한 그리고 개별 조직병리학 득점 (과형성, 기질 활성화, 염증성 세포 침윤)을 나타낸다. Anova = p < 0.04; Mann-Whitney 테스트로부터 p.
도 8B는 IV 주사된 모든 집단의 우측 무릎 관절로부터 활액성 막에 대한 집합한 그리고 개별 조직병리학을 보여준다.
도 8C는 염수 또는 MPC로 관절내(IA) 주사된 집단의 활액성 막에 대한 집합한 그리고 개별 조직병리학을 보여준다.
도 9A는 CD14 득점 체계 (Mo et al., J Rheumatol. 38: 2301 2308, 2011에서 설명된 것과 같은 맥관내막 득점)를 보여준다.
도 9B는 CD4, CD8, 감마-델타 TCR, CD79a 그리고 Ki-67에 적용된 세포 득점 계획을 보여준다.
도 9C는 VCAM-1, IL-6, IL-10, IL-1β, IL-17, TNFα 그리고 간질성(interstitial) CD14에 적용되는 사이토킨 그리고 부착 분자 득점 체계를 보여준다.
도 10A는 대조군 그리고 MPC 주사된 집단들의 경우 좌측 무릎 관절 활액성 조직에서 CD4, CD8, 감마-델타 TCR 그리고 CD79a에 대한 평균 ± SD 면역조직학적 득점을 보여준다.
도 10B는 대조군 그리고 MPC 주사된 집단의 경우 좌측 무릎 관절 활액성 조직에서 VCAM-맥관내막, VCAM-간질성, Ki67-맥관내막 그리고 Ki67-간질성에 대한 평균 ± SD 면역조직학적 득점을 보여준다.
도 10C는 대조군 그리고 MPC 주사된 집단의 경우에서 좌측 무릎 관절 활액성 조직에서 IL-10-맥관내막, IL-10-간질성, IL1베타-맥관내막 그리고 IL1베타-간질성에 대한 평균 ± SD 면역조직학적 득점을 보여준다.
도 10D는 IV 염수 대조군 그리고 MPC 주사된 집단에서 활액성 맥관내막 및 간질성 조직에 대한 IL-6 및 TNF-알파에 대한 활액성 면역조직화학 착색 득점의 평균 + SEM을 보여준다. 나타낸 p 값은 Mann-Whitney 비-모수(母數) t-테스트를 이용하여 산출되었다.
도 10E는 염수 대조군 그리고 MPC 주사된 집단에 대해 CD14 양성 세포를 위한 활액성 면역조직화학 간질성 조직 착색에 대한 평균 + SEM을 나타낸다. 나타낸 p 값은 Mann-Whitney 비-모수 t-테스트를 이용하여 산출되었다.
도 10F는 염수 대조군 그리고 MPC 주사된 집단에 대한 IL-17의 활액성 면역조직화학 간질성 조직 착색에 대한 평균 + SEM을 나타낸다. 나타낸 p 값은 Krushal-Wallis 테스트 & Dunns 사후(post-hoc) 테스트와 함께 ANOVA로부터 유래되었다.
도 11A는 할당된 득점을 보여주는 CD14 세포에 대해 면역착색된 활액성 구역의 현미경사진을 보여준다. 확대 x 100.
도 11B는 할당된 득점을 보여주는 TNF-α에 대해 면역착색된 활액성 구역의 현미경사진을 보여준다. 확대 x 100.
도 11C는 할당된 득점을 보여주는 IL-6에 대해 면역착색된 활액성 구역의 현미경사진을 보여준다. 확대 x 100.
도 11D는 할당된 득점을 보여주는 IL-17에 대해 면역착색된 활액성 구역의 현미경사진을 보여준다. 확대 x 100.
도 11E는 할당된 득점을 보여주는 IL-10에 대해 면역착색된 활액성 구역의 현미경사진을 보여준다. 확대 x 100.
도 2. 배양된 그리고 확장된 STRO-1밝음 MPC의 STRO-1밝음 또는 STRO-1흐림(dim) 후손의 발현 프로파일 프로파일. 탈체(ex vivo) 확장된 골수 MPC의 단일 세포 현탁액은 트립신/EDTA 처리에 의해 준비되었다. 세포들은 STRO-1 항체로 착색되며, 후속적으로 염소-항 뮤린 IgM-플루오레세인 이소티오시아네이트와 항온처리에 의해 나타난다. 형광 활성화된 세포 분류(A)이후, 전체 세포성 RNA는 STRO-1흐림 또는 STRO-1밝음을 발현시키는 세포들의 정제된 집단으로부터 준비된다. RNAzolB 추출 방법, 및 표준 절차들을 이용하여, 각 준집단으로부터 총 RNA를 단리시켰고, cDNA 합성을 위한 주형으로 이용되었다. 다양한 전사체들의 발현은 이미 언급된 것과 같이 표준 프로토콜을 이용한 PCR 증폭에 의해 평가되었다(Gronthos et al. J Cell Sci. 116:1827-1835, 2003). 본 연구에 이용된 프라이머 세트는 표 2에 나타낸다. 증폭 이후, 각 반응 혼합물은 1.5% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되고, 에티디움 브롬화물 착색에 의해 시각화되었다(B). 각 세포 표식에 대한 상대적인 유전자 발현은 ImageQant 소프트웨어를 이용하여 하우스-키핑(house-keeping) 유전자, GAPDH의 발현에 대한 기준으로 평가되었다(C).
도 3. 배양된 그리고 확장된 STRO-1+ MPC의 STRO-1밝음 후손은 높은 수준의 SDF-1를 발현시키지만, STRO-1흐림 후손은 발현되지 않는다. (A) STRO-1+ BMMNC의 MACS-단리된 조제물은 FACS를 이용하여, 영역, STRO-1밝음 및 STRO-1흐림/둔감에 따라 상이한 STRO-1 하위세트로 분할된다. 총 RNA는 각 STRO-1 하위집단으로부터 준비되었고, STRO-1밝음 공제 혼성화 라이브러리를 구축하는데 이용되었다(B-C). 대표적인 PCR 산물로 블랏된 복제 니트로셀룰로오즈 필터들은 STRO-1밝음 공제된 cDNA로 형질변환된 세균 클론으로부터 증폭되었다. 그 다음 필터들은 [32P] 데옥시시티딘 삼인산염 (dCTP)-라벨된 STRO-1밝음(B) 또는 STRO-1흐림/둔감 (C) 공제된 cDNA로 프로브시켰다. 화살표는 인간 SDF-1에 대응하는 cDNA 단편을 내포하는 1 클론의 차등 발현을 나타낸다. (D) 역 전사효소 (RT)-PCR 분석은 배양에 앞서, 새로 MACS/FACS-단리된 BMMNC STRO-1 집단으로부터 준비된 총 RNA에서 SDF-1 및 글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소 (GAPDH) 전사체들의 상대적 발현을 설명한다. bp는 염기쌍을 나타낸다.
도 4는 류마티즘성 관절염의 양 모델에서 절름발이 득점을 나타내는 그래프다. 득점은 본 명세서에서 기술된 것과 같이 측정되었다.
도 5는 테스트 과정 동안(도면에 표시된 것과 같이), 개별 양의 우측(자극안된) 및 좌측 (자극된) 무릎의 활액 유체에서 백혈구 카운트를 나타내는 그래프다. 양 B1627 그리고 B4036은 닭 콜라겐 유형 II로 면역화되었고, 모든 다른 양들은 소의 콜라겐 유형 II로 면역화되었다. 더 높은 반응자들에서 대조군 측면에서 백혈구 농도 또한 상승되었는데, 이는 전신 반응 가능성을 나타낸다.
도 6은 대조군 양 (n = 7)과 소의 콜라겐 유형 II 로 면역화된 양(n = 5)의 활액 유체에서 백혈구 카운트를 보여주는 그래프다. 데이터는 평균 ± 표준오차를 나타낸다.
도 7A는 소의 콜라겐 유형 II로 면역화된 5마리 양의 우측 (대조군) 그리고 좌측 (자극된) 무릎으로부터 활액내 소의 콜라겐 유형 II에 대한 IgM (좌측 패널) 그리고 IgG (우측 패널) 항체의 수준을 나타내는 그래프다. 활액성 유체는 최초 면역화 이후 42일 뒤 검시에서 얻었다. 자극된 무릎에서 IgM의 수준은 4-8배 상승되었고, IgG의 수준은 10-60 배 상승되었다.
도 7B는 닭의 콜라겐 유형 II로 면역화된 2마리 양의 우측 (대조군) 그리고 좌측 (자극된) 무릎으로부터 활액내 닭의 콜라겐 유형 II에 대한 IgM (좌측 패널) 그리고 IgG (우측 패널) 항체의 수준을 나타내는 그래프다. 활액성 유체는 최초 면역화 이후 42일 뒤 검시에서 얻었다. 자극된 무릎에서 IgM의 수준은 3-5배 상승되었고, IgG의 수준은 2-8 x 106 배 상승되었다.
도 8A는 모든 집단의 좌측 무릎 관절로부터 활액성 막에 대한 집합한 그리고 개별 조직병리학 득점 (과형성, 기질 활성화, 염증성 세포 침윤)을 나타낸다. Anova = p < 0.04; Mann-Whitney 테스트로부터 p.
도 8B는 IV 주사된 모든 집단의 우측 무릎 관절로부터 활액성 막에 대한 집합한 그리고 개별 조직병리학을 보여준다.
도 8C는 염수 또는 MPC로 관절내(IA) 주사된 집단의 활액성 막에 대한 집합한 그리고 개별 조직병리학을 보여준다.
도 9A는 CD14 득점 체계 (Mo et al., J Rheumatol. 38: 2301 2308, 2011에서 설명된 것과 같은 맥관내막 득점)를 보여준다.
도 9B는 CD4, CD8, 감마-델타 TCR, CD79a 그리고 Ki-67에 적용된 세포 득점 계획을 보여준다.
도 9C는 VCAM-1, IL-6, IL-10, IL-1β, IL-17, TNFα 그리고 간질성(interstitial) CD14에 적용되는 사이토킨 그리고 부착 분자 득점 체계를 보여준다.
도 10A는 대조군 그리고 MPC 주사된 집단들의 경우 좌측 무릎 관절 활액성 조직에서 CD4, CD8, 감마-델타 TCR 그리고 CD79a에 대한 평균 ± SD 면역조직학적 득점을 보여준다.
도 10B는 대조군 그리고 MPC 주사된 집단의 경우 좌측 무릎 관절 활액성 조직에서 VCAM-맥관내막, VCAM-간질성, Ki67-맥관내막 그리고 Ki67-간질성에 대한 평균 ± SD 면역조직학적 득점을 보여준다.
도 10C는 대조군 그리고 MPC 주사된 집단의 경우에서 좌측 무릎 관절 활액성 조직에서 IL-10-맥관내막, IL-10-간질성, IL1베타-맥관내막 그리고 IL1베타-간질성에 대한 평균 ± SD 면역조직학적 득점을 보여준다.
도 10D는 IV 염수 대조군 그리고 MPC 주사된 집단에서 활액성 맥관내막 및 간질성 조직에 대한 IL-6 및 TNF-알파에 대한 활액성 면역조직화학 착색 득점의 평균 + SEM을 보여준다. 나타낸 p 값은 Mann-Whitney 비-모수(母數) t-테스트를 이용하여 산출되었다.
도 10E는 염수 대조군 그리고 MPC 주사된 집단에 대해 CD14 양성 세포를 위한 활액성 면역조직화학 간질성 조직 착색에 대한 평균 + SEM을 나타낸다. 나타낸 p 값은 Mann-Whitney 비-모수 t-테스트를 이용하여 산출되었다.
도 10F는 염수 대조군 그리고 MPC 주사된 집단에 대한 IL-17의 활액성 면역조직화학 간질성 조직 착색에 대한 평균 + SEM을 나타낸다. 나타낸 p 값은 Krushal-Wallis 테스트 & Dunns 사후(post-hoc) 테스트와 함께 ANOVA로부터 유래되었다.
도 11A는 할당된 득점을 보여주는 CD14 세포에 대해 면역착색된 활액성 구역의 현미경사진을 보여준다. 확대 x 100.
도 11B는 할당된 득점을 보여주는 TNF-α에 대해 면역착색된 활액성 구역의 현미경사진을 보여준다. 확대 x 100.
도 11C는 할당된 득점을 보여주는 IL-6에 대해 면역착색된 활액성 구역의 현미경사진을 보여준다. 확대 x 100.
도 11D는 할당된 득점을 보여주는 IL-17에 대해 면역착색된 활액성 구역의 현미경사진을 보여준다. 확대 x 100.
도 11E는 할당된 득점을 보여주는 IL-10에 대해 면역착색된 활액성 구역의 현미경사진을 보여준다. 확대 x 100.
일반적 기술 및 선택된 정의들
명세서를 통하여, 다른 언급이 없는 한 또는 내용이 다른 것들을 요구하지 않는 한다, 이들 단계중 하나 및 다수(가령, 하나 또는 그 이상), 문제의 조성물의 단계들의 집단 또는 집단을 포괄하도록 단일 단계, 문제의 조성물, 문제의 조성물의 단계들의 집단 또는 집단에 대한 언급이 있을 것이다.
본 명세서에서 기술된 각 구체예 또는 실시예는 다른 명시적 언급이 없는 한, 본 개시내용의 각 실시예 및 모든 구체예에 대해 필요한 변경을 하여 적용될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 발명은 명시적으로 언급된 것 이외의 다양한 변화 및 수정을 서용할 수 있다는 것을 당업계 숙련자들은 인지할 것이다. 본 발명은 이러한 모든 변화 및 수정을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명은 이 명세서에서 개별적으로 또는 집합적으로 언급된 또는 표시된 모든 단계들, 특징들, 조성물들 및 화합물들, 그리고 전술한 단계들 또는 특징들의 임의의 그리고 모든 조합들 또는 임의의 두 개 또는 그 이상의 전술한 단계들 또는 특징들을 또한 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 포함된 개시내용의 특정 구체예에 의해 그 범위가 제한되지 않으며, 이들 실시예는 설명을 목적으로만 의도된 것이다. 기능적으로 등가의 산물들, 조성물들 그리고 방법들은 본 명세서에서 설명된 것과 같이 발명의 범위내에 명백히 있다.
본 발명은 다른 언급이 없는 한, 분자 생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 기술, 용액에서 펩티드 합성, 고형상 펩티드 합성, 그리고 면역학의 통상적인 기술을 이용하여 과도한 실험없이 실시된다. 이러한 과정들은 예를 들면, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), Vols I, II, 및 III 전체; DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, 전체 내용; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, 전체 내용, 그리고 Gait, ppl-22의 논문; Atkinson et al, pp35-81; Sproat et al, pp 83-115; 및 Wu et al, pp 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, 전체 내용; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, 전체 내용; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), 시리즈 전체; J.F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany); Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342; Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. and Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides(Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York. 12. Wunsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Mler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, VoIs. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); and Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, 전체 내용에 기술된다.
명세서를 통하여, 다른 언급이 없는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 단계 또는 요소 또는 정수(integer) 또는 단계들 또는 요소들 또는 정수들의 집단을 포함하나 그러나 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 정수 또는 요소들 또는 정수들의 집단을 배제하지 않는다는 의미로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "~로부터 유래된"은 특정 원천으로부터 반드시 직접적으로 유래될 필요는 없지만, 해당 원천으로부터 명시된 완전체(integer)를 획득할 수 있다. STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들로부터 유래된 가용성 인자들의 내용에서, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들을 시험관에서 배양하는 동안 생성된 하나 또는 그 이상의 인자들, 가령, 단백질들, 펩티드들, 탄수화물들, 등을 의미할 것이다.
여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "류마티즘성 질환들"은 대상에서 최소한 하나의 관절에 염증성 반응을 특징으로 하는 임의의 질환을 의미한다. 한 실시예에서, 류마티즘성 질환은 자가면역 용태로 인한 원인이거나 또는 이와 연합된다. 예시적인 류마티즘성 질환들은 당분야에 공지되어 있고 및/또는 본 명세서에서 설명된다.
여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "유효량"은 류마티즘성 질환을 야기하는 또는 이와 연합된 대상의 관절에서 염증을 감소 및/또는 염증성 세포의 수를 감소 및/또는 염증성 사이토킨을 감소시키는데 충분한 양의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 집단을 의미한다.
여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "치료요법적 유효량"은 류마티즘성 질환의 하나 또는 그 이상의 징후들을 감소 또는 저해시키는데 충분한 양의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들이 농축된 집단 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 "예방적으로 유효량"은 염증성 관절 질환의 하나 또는 그 이상의 탐지가능한 징후들을 예방 또는 저해 또는 개시의 지연시키는데 충분한 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들의 충분한 양을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 "낮은 용량(low dose)"은 1x106 세포/kg 미만의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손의 양을 의미하지만, 대상의 관절에서 염증 및/또는 염증성 사이토킨 및/또는 염증성 세포들의 수를 감소시키는데는 여전히 충분한 양으로 이해될 것이다. 예를 들면, 낮은 투여량은 kg 당 0.5 x 106 또는 이보다 적은 세포들, 또는 0.4 x 106 이보다 적은 세포들 또는 0.3 x106 이보다 적은 세포들 또는 0.1 x 106 이보다 적은 세포들을 포함한다.
여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "높은 용량"은 대상, 가령, 대상의 관절, 이를 테면 활액성 조직 안에서, CD14+ 세포에 추가하여, IL-6, TNFα, IL-17을 감소시키는데 충분한 양의, 이를 테면 1.5x106 세포/kg 이상의 STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손의 양을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, 높은 용량은 약 1.5 x 106 내지 약 4x106 세포/kg를 포함한다. 예를 들면, 높은 용량은 약 1.5 x 106 또는 약 2 x 106/kg를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어"치료하다(treat)" 또는 "치료(treatment)" 또는 "치료하는(treating)"은 치료요법적으로 유효량의 가용성 인자들 및/또는 세포들을 투여하고, 그리고 염증성 관절 질환의 최소한 하나의 징후를 감소 또는 억제시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 "방지하다(prevent)"또는 "방지하는(preventing)" 또는 "방지(prevention)"는 예방적으로 유효량의 가용성 인자들 및/또는 세포들을 투여하고, 그리고 염증성 관절 질환의 발생 또는 진행을 중단 또는 방해 또는 지연시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 "가용성 인자"는 물 용해성인 STRO-1+ 세포 및/또는 이들의 후손에 의해 생산된, 임의의 분자, 예를 들면, 단백질, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 지질단백질, 지질펩티드, 탄수화물 등을 의미할 때 사용된다. 이런 가용성 인자는 세포내의 것이고 및/또는 세포에 의해 분비될 수 있다. 이런 가용성 인자는 복잡한 혼합물(가령, 상층액) 및/또는 이의 분획이고 및/또는 정제된 인자일 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 가용성 인자는 상층액 내에 포함된다. 따라서 하나 또는 그 이상의 가용성 인자의 투여에 관한 본 명세서에서 임의의 실시예는 상층액의 투여에 준용될 수 있는 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 "상층액"은 적합한 배지, 예를 들면, 액상 배지에서 간엽성 전구 세포, 및/또는 그의 후손 세포를 시험관내에서 배양한 후 생성된 비-세포성 물질을 지칭한다. 전형적으로, 상층액은 적합한 조건 및 시간하에 배지에서 세포를 배양하고, 이어서 원심분리와 같은 과정에 의해 세포성 물질을 제거함으로써 생산된다. 상층액은 투여 전 추가 정제 단계를 거치거나 또는 거치지 않을 수 있다. 한 실시예에서, 상층액은 105 미만의 세포들, 104 미만, 예를 들면, 103 미만의 세포를 포함하는데, 가령, 살아있는 세포가 없다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 "정상 또는 건강한 개인"은 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 및/또는 본 명세서에서 설명된 방법에 평가될 때 염증성 관절 질환을 겪지 않는 대상을 의미할 때 사용된다.
여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "대상"은 인간, 예를 들면 포유류를 포함하는 임의의 동물을 의미한다. 예시적인 대상은 인간, 영장류, 가축 (가령 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 반려 동물 (가령 개, 고양이), 실험실 테스트 동물 (가령 마우스, 토끼, 쥐, 기니아 피그, 햄스터), 포획된 야생 동물 (가령 여우, 사슴)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 실시예에서, 포유류는 인간 또는 영장류다. 한 실시예에서, 포유류는 인간이다. 한 실시예에서, 대상은 예를 들면, 염증성 관절 손상으로 새로 진단을 받았거나 또는 이미 진단을 받았고 현재 재발 또는 재현 또는 발생 위험에 처한, 염증성 관절 손상의 하나 또는 그 이상의 신호, 징후들은, 또는 기타 지표들을 경험하거나 또는 경험했던, 대상이 치료에 적합하다.
류마티즘성 질환들
본 개시내용의 한 실시예에서, 류마티즘성 질환들은 염증성 관절 질환들이다. 염증성 관절 질환들는 본 명세서에서 최대로 넓은 의미로 이용되는데, 연결 조직 그리고 연골을 포함하는 하나 또는 그 이상의 관절의 임의의 부분에 손상 또는 부분적 또는 완전한 파괴를 지칭하며, 이때 손상은 임의의 원인의 구조적 및/또는 기능적 손상을 의미하고, 관절에서 염증을 특징으로 하며, 그리고 관절 통증/관절통을 야기하거나 야기하지 않을 수 있다. 이 손상은 임의의 용태, 이를 테면 자가면역 질환 이를 테면 관절염 (가령, 급성 그리고 만성 관절염), 청소년-개시 류마티즘성 관절염, 청소년 특발성 관절염 (JIA), 또는 청소년 RA (JRA)를 포함하는 류마티즘성 관절염, 그리고 단계 이를 테면 류마티즘성 활액막염, 통풍 또는 통풍성 관절염, 급성 면역학적 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 콜라겐 유형 II-유도된 관절염, 감염성 관절염, 폐혈성 관절염, 라임(Lyme) 관절염, 증식성 관절염, 건선 관절염, 스틸 질환, 척추 관절염, 골관절염, 관절염 만성 프로그레디엔트(progrediente), 변형성 관절염, 만성 프리마리아(primaria) 다중관절염, 반응성 관절염, 폐경기 관절염, 에스트로겐-고갈 관절염, 그리고 강직성 척수염/류마티즘성 척추염), RA 이외의 류마티즘성 자가면역 질환, RA에 부차적인 유의적인 전신 관련 (맥관염, 폐 섬유증 또는 펠티(Felty) 증후군을 포함하나 이에 한정되지 않는), 혈청반응음성의 척추관절관절증, 라임 질환, 혼합형 연결 조직 질환, 콜라겐 질환과 연합된 자가면역 장애에 의해 야기될 수 있다.
한 실시예에서, 염증성 관절 질환은 예를 들면, 과다사용 또는 운동 손상 또는 관절에 충격에 의해 전적으로 원인이 되는 연골 또는 뼈 또는 관절에 손상이 아닌데, 그 이유는 이들 용태들은 질환이 아니기 때문이라는 것을 당업자는 이해할 것이다.
한 실시예에서, 염증성 관절 질환은 자가면역 질환과 연합되거나 이로 인한 것이다. "자가면역 질환"은 대상의 고유 조직 또는 장기 또는 이의 공동-분리물 또는 이의 현시 또는 이로부터 생성된 용태로부터 발생된 또는 이에 대항한 질환이다. 한 실시예에서, 염증성 관절 질환은 자가면역 염증성 관절 질환, 이를 테면 대상의 관절에서 발생되는 항원에 대항하는 면역 반응을 대상이 보유함으로써 야기된다.
한 실시예에서, 염증성 관절 손상은 관절염, 이를 테면, 류마티즘성 관절염, 골관절염, 강직성 척수염, 또는 건선 관절염에 의한 것이다.
한 실시예에서, 염증성 관절 질환은 류마티즘성 관절염이다.
한 실시예에서, 염증성 관절 질환은 골관절염 관절염이다.
본 명세서의 목적을 위하여, 관절은 골격(이를 테면 척추동물과 같은 동물의)을 에워싸고 이를 지탱하는 부분들과 함께 골격 사이의 요소들 간의 접촉 점으로써, 예를 들면, 엉덩이, 척추사이의 관절, 척추와 골반 사이의 관절(천장 관절), 건과 인대가 뼈에 부착된 관절, 늑골과 척추 사이의 관절, 어깨, 무릎, 발, 팔꿈치, 손, 손가락, 발목 그리고 발가락, 그러나 특히 손과 발의 관절을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
염증성 관절 질환을 탐지 및/또는 진단 및/또는 치료 효과를 관찰하는 방법들 및/또는 추가 치료가 필요한지 또는 권장되는지는 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들면, 치료 동안 기선과 다양한 시점사이에서 말랑하고 부어오른 관절의 수의 비교는 관절 상태와 치료에 대한 반응을 평가하는 전형적인 방식이다. RA에 대한 American College of Rheumatology (ACR) 관절 카운트(Felson et al. Arthritis & Rheumatology 38: 727-735, 1995)에서, 68개 관절은 말랑함(tenderness)에 대해 그리고 66개 관절은 부기(엉덩이는 부어오름에 대해 평가되지 않는다)에 대해 평가한다. 주로 유럽에서 이용되는 질환 활성 등급(DAS)에서, 44- 또는 28-관절 카운트가 RA에 이용된다. 관절 카운트에서, ACR 평가 기준은 복합 등급을 포함하도록 다음 효소들이 포함된다: 환자 전체적 평가(시각적 아날로그 등급[VAS]), 환자 통증, 의사의 전체적 평가(physician global), 건강 평가 문답지(HAQ; 기능의 측정), 그리고 급성-상 반응물질(C-반응성 단백질 또는 침강 속도). ACR 20 반응은 말랑하고 부어오른 관절 카운트에서 20% 개선과 복합 기준에서 다른 5개 요소들중 최소한 3개 요소들의 20% 개선으로 구성될 것이다. ACR 50 그리고 70 반응은 이들 요소들에서 최소한 50%와 70% 개선을 나타낸다. ACR 체계는 단지 변화만을 나타내지만, DAS 체계는 질환 환성의 현재 상태와 변화 모두를 나타낸다. DAS 득점 체계는 RA에서 임상 시도로부터 유래된 가중된 수학 공식을 이용한다. 예를 들면, DAS 28은 0.56(T28)+0.28(SW28)+0.70(Ln ESR)+0.014 GH이며 이때 T는 말랑한 관절의 수이고, SW는 부어오른 관절 수이며, ESR은 적혈구 침강 속도이며, 그리고 GH는 전체 건강이다. DAS의 다양한 값은 높은 또는 낮은 질환 활성 뿐만 아니라 경감을 나타내고, 그리고 변화 및 끝점 득점은 반응 정도에 따라(무반응, 중간반응, 양호한 반응) 환자를 분류한다.
여기에서 이용된 것과 같이, "류마티즘성 관절염"은 류마티즘성 관절염의 분류를 위한 2000 개정된 American Rheumatoid Association 기준, 또는 임의의 유사한 기준에 따라 진단될 수 있는 인지된 질환 상태를 말한다. RA의 생리학적 지표들은 류마티즘성 관절염에서 불변의 것은 아니지만, 특징적인 대칭적 관절 부어오름을 포함한다. 손의 기부 근위지간 (PIP) 관절 뿐만 아니라 중수지절관절 (MCP), 손목, 팔꿈치, 무릎, 발목 그리고 중족지절관절 (MTP) 관절의 방추형 부기는 공통적으로 걸리는 것이며, 부기는 용이하게 탐지된다. 수동적 움직임에서 통증은 관절 염증의 가장 민감한 테스트이며, 그리고 염증 및 구조적 변형은 질병에 걸린 관절의 움직임 범위를 대개 제한한다. 전형적인 시각적 변화는 MCP 관절에서 손가락의 척골 일탈, MCP 그리고 PIP 관절의 과신장 또는 과다 굴곡, 팔꿈치의 굴곡 긴장, 그리고 수근(carpal) 뼈 및 발가락의 부전탈구를 포함한다. 류마티즘성 관절염을 가진 대상은 DMARD에 저항성이 있거나 또는 없을 수 있는데, 이때 DMARD는 징후의 치료에 효과적이지 않거나 또는 완전하게 효과적이지 않다. 더욱이, 이 대상은 TNF 저해물질 이를 테면 에타네르셉트, 인플리시마브 및/또는 아달리무마브 및/또는 항-CD20 요법 (가령, 리투시마브)의 기존 또는 현재 치료에 부적합한 반응을 경험할 수 있는데, 그 이유는 독성 또는 부적합한 효과 (예를 들면, 에타네르셉트 3개월 동안 주당 2회 25 mg 또는 인플리시마브 3 mg/kg를 최소한 4회 주입)때문이다.
류마티즘성 관절염은 자가항체, 가령, 류마티즘성 인자(IgG에 결합하는 항체) 및/또는 항-사이클 시트루린화된 펩티드 및/또는 이종성 핵 비로뉴클레오단백질 A2 (RA33) 및/또는 콜라겐 유형 II 및/또는 스트레스 단백질 (가령, BiP 또는 hsp90) 및/또는 글루코스 6-포스페이트 이소메라이즈(GPI)의 존재에 의해 진단될 수도 있다.
"건선성 관절염" 또는 "PsA"는 피부 (건선) 그리고 관절의 염증 (관절염)을 특징으로 하는 만성 질환이다. 건선은 인설(sacling)과 함께, 누더기같은, 돋아오른, 붉은 지역의 피부 염증을 특징으로 하고, 흔히 팔꿈치의 끝 및 무릎, 머리가죽, 배꼽, 그리고 생식기 부위 또는 항문의 주변에 영향을 준다. 대략적으로 건선 환자의 10%는 이들의 관절에 연합된 염증이 발생된다. 염증성 관절염과 건선을 모두 가진 환자는 건선성 관절염으로 진단된다. 건선성 관절염은 관절 및 피부와 멀리 떨어진 신체 조직, 이를 테면 눈, 심장, 폐, 그리고 신장에 염증을 또한 야기할 수 있는 전신 류마티즘성 질환이다.
"강직성 척수염" 또는 "AS"는 척추 및 천골 (꼬리뼈 바로 위의 뼈)이 장골(둔부 위쪽의 양측에 있는 뼈)과 만나는 하부 등에 위치한 천골의 만성 염증 형태다. 이들 부위에서 만성 염증은 척추에 그리고 척추 주변에 통증과 경직을 야기한다. 시간이 경과함에 따라, 만성 척추 염증 (척추염)은 척추골의 서로 완전한 결합(융합)으로 이어질 수 있는데, 이를 유착이라고 부른다. 유착은 척추의 운동성 상실로 이어진다. 강직성 척수염은 또한 전신성 류마티즘성 질환으로써, 신체를 통하여 다른 조직들에게 영형을 줄 수 있다는 의미한다. 따라서, 이것은 척추로부터 멀리 있는 기타 관절 뿐만 아니라 기타 장기, 이를 테면 눈, 심장, 폐, 그리고 신장에 염증 또는 손상을 야기할 수 있다.
MPC
또는 후손 세포들, 및
상층액
또는 하나 또는 그 이상의 그로부터
유래된
가용성 인자들
MPC 세포는 골수, 혈액, 치수 세포, 지방 조직, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장, 간, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 림프절, 흉선, 골, 인대, 힘줄, 골격근, 피부, 그리고 골막에서 발견되는 세포들이며, 생식세포주(germ line) 예를 들면, 중배엽(mesoderm) 및/또는 내배엽(endoderm) 및/또는 외배엽(ectoderm)으로 분화될 수 있다.
한 실시예에서, MPC 세포는 지방성, 골질, 연골성, 탄성, 근육성, 그리고 섬유성 연결 조직이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다수의 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능성 세포이다. 이들 세포가 들어가는 특정한 계통 결정(lineage-commitment)와 분화 경로는 기계적 영향 및/또는 내인성 생물활성 인자, 예를 들면, 성장 인자, 사이토킨, 및/또는 호스트 조직에 의해 확립된 국소 미세환경 조건(local microenvironmental condition)으로부터 다양한 영향에 좌우된다. 따라서 MPC 다능성 세포는 분열하여 딸 세포를 산출하는 비-조혈성 기원 세포이고, 이들은 줄기 세포이거나, 또는 때가 되면, 비가역적으로 분화하여 표현형 세포를 산출하는 전구 세포이다.
MPC는 표식 STRO-1에 양성이다(가령, MPC는 STRO-1+ 세포다).
한 실시예에서, STRO-1+ 세포는 개체, 예를 들면, 치료되는 개체 또는 관련된 개체 또는 관련 없는 개체(동일한 종 또는 상이한 종인지에 상관없이)로부터 획득된 샘플로부터 농축된다. 본 명세서에서, 용어 "농축되는(enriched)", "농축(enrichment)" 또는 이의 변형은 세포의 처리되지 않은 집단(가령, 고유 환경에서 세포)과 비교할 때, 한 가지 특정 세포 유형의 비율 또는 다수의 특정 세포 유형의 비율이 증가되는 세포의 집단을 기술하는데 이용된다. 한 실시예에서, STRO-1+ 세포들에 대해 농축된 집단은 적어도 약 0.1% 또는 0.5% 또는 1% 또는 2% 또는 5% 또는 10% 또는 15% 또는 20% 또는 25% 또는 30% 또는 50% 또는 75% STRO-1+_ 세포들을 포함한다. 이에 대해, 용어 "STRO-1+ 세포들에 대해 농축된 세포들의 집단"은 "X% STRO1+ 세포들을 포함하는 세포 집단"에 대한 명백한 뒷받침을 제공하기 위해 사용되며, 이때 X%는 본 명세서에서 언급된 백분율이다. STRO-1+ 세포들은 일부 실시예들에서, 클론생성 콜로니, 가령 CFU-F (섬유아세포)를 형성하고 또는 이의 하위 집단(가령, 50% 또는 60% 또는 70% 또는 70% 또는 90% 또는 95%)은 이 활성을 보유할 수 있다.
한 실시예에서, 세포들의 집단은 선택가능한 형태의 STRO-1+ 세포들을 포함하는 세포 조제물로부터 농축된다. 이 점에 있어서, 용어 "선택가능한 형태"는 이 세포들이 STRO-1+ 세포들의 선별을 허용하는 마커(가령, 세포 표면 마커)를 발현시킨다는 것으로 이해될 것이다. 이 마커는 STRO-1일 수 있지만, 반드시 그렇지는 않다. 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 및/또는 구체화된 것과 같이, STRO-2 및/또는 STRO-3 (TNAP) 및/또는 STRO-4 및/또는 VCAM-1 및/또는 CD146 및/또는 3G5를 발현시키는 세포들(가령, MPC)은 또한 STRO-1을 발현시킨다(그리고 STRO-1밝음일 수 있다). 따라서, 세포들이 STRO-1+ 이라는 표시는 이 세포들이 STRO-1 발현에 의해 선택될 수 있다는 것을 필연적으로 의미하지 않는다. 한 실시예에서, 이 세포들은 적어도 STRO-3 발현에 의해 선택되는데, 가령, 이들은 STRO-3+ (TNAP+)이다.
세포 또는 이의 집단의 선택에 대한 언급은 특정 조직 원천으로부터 선택을 요구하지 않는다. 본 명세서에서 기술된 것과 같이, STRO-1+ 세포들은 방대한 원천으로부터 선택되거나 또는 단리되거나 농축될 수 있다. 즉, 일부 실시예들에서, 이들 용어는 STRO-1+ 세포들 (가령, MPC) 또는 맥관화된 조직을 포함하는 임의의 조직으로부터 또는 혈관주위세포 (가령, STRO-1+ 혈관주위세포) 또는 본 명세서에서 언급된 임의의 하나 또는 그 이상의 조직을 포함하는 것으로부터 선택을 위한 뒷받침을 제공한다.
한 실시예에서, 본 발명에 이용된 세포는 TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 개별적으로 또는 집단적으로 선택되는 하나 또는 그 이상의 마커를 발현한다.
"개별적으로"는 본 발명이 언급된 마커 또는 마커의 그룹을 하나하나씩 포함하고, 그리고 개별 마커 또는 마커의 그룹이 본 명세서에 하나하나씩 열거되지 않았음에도 불구하고, 첨부된 청구항이 이런 마커 또는 마커의 그룹을 하나하나씩 및 서로로부터 나누어 정의한다는 것을 의미한다.
"집단적으로"는 본 발명이 임의의 숫자 또는 조합의 언급된 마커 또는 마커의 그룹을 포함하고, 그리고 이런 숫자 또는 조합의 마커 또는 마커의 그룹이 본 명세서에 구체적으로 열거되지 않았음에도 불구하고, 첨부된 청구항이 이런 조합 또는 하위-조합을 하나하나씩, 그리고 임의의 다른 조합의 마커 또는 마커의 그룹으로부터 나누어 정의한다는 것을 의미한다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포는 STRO-1밝음(bright)(동의어, STRO-1밝음(bri))이다. 한 실시예에서, Stro-1밝음 세포는 STRO-1흐림 또는 STRO-1중간 세포에 비하여 우선적으로 농축된다.
한 실시예에서, STRO-1밝음 세포는 추가적으로, TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+ 및/또는 CD146+ 중에서 하나 또는 그 이상이다. 예를 들면, 이 세포들은 전술한 마커들중 하나 또는 그 이상에 대해 선택되고 및/또는 전술한 마커들중 하나 또는 그 이상을 발현하는 것으로 보인다. 이점에 있어서, 기존에 농축된 또는 단리된 세포들이라기 보다는 명시적으로 테스트할 필요가 없는 마커을 발현하는 것으로 나타난 세포들이 테스트되고, 그리고 후속적으로 이용되며, 단리된 또는 농축된 세포들은 동일한 마커를 또한 발현하는 것으로 합당하게 추정될 수 있다.
한 실시예에서, 간엽성 전구 세포는 WO 2004/85630에서 정의된 바와 같은 혈관주위 간엽성 전구 세포이다. 예를 들면, 간엽성 전구 세포들은 혈관주의세포 세포의 표식을 발현시키는데, 가령, 이 세포들은 STRO-1+ 또는 STRO-1밝음 및/또는 3G5+이다. 한 실시예에서, 이 세포들은 맥관화된 조직 또는 장기들 또는 이의 일부분으로부터 단리된 세포들이거나 또는 이었거나 또는 이 세포들의 후손이다.
소정의 마커에 대해 "양성"인 것으로 지칭되는 세포는 마커가 세포 표면 상에 존재하는 정도에 따라, 상기 마커를 낮은(lo 또는 흐림) 또는 높은(밝음(bright), 밝음(bri)) 수준으로 발현할 수 있고, 여기서 이들 용어는 세포의 분류 과정에 이용된 형광 또는 다른 마커의 강도에 관계한다. lo(또는 흐림 또는 둔감) 및 밝음의 구별은 분류되는 특정 세포 집단에서 이용된 마커의 문맥에서 이해될 것이다. 소정의 마커에 대해 "음성"인 것으로 지칭되는 세포는 상기 세포로부터 반드시 완전하게 존재하지 않는 것은 아니다. 이 용어는 마커가 상기 세포에 의해 상대적으로 매우 낮은 수준에서 발현되고, 그리고 검출가능하게 표지될 때 매우 낮은 신호를 발생시키거나, 또는 배경 수준, 예를 들면, 아이소타입 대조 항체를 이용하여 검출된 수준 이상으로 검출되지 않는다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 이용된, 용어 "밝음"은 검출가능하게 표지될 때 상대적으로 높은 신호를 발생시키는 세포 표면 상에 마커를 지칭한다. 이론에 한정됨 없이, "밝음" 세포는 샘플 내에 다른 세포보다 표적 마커 단백질(가령, STRO-1에 의해 인식되는 항원)을 더욱 많이 발현하는 것으로 제안된다. 가령, STRO-1밝음 세포는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석에 의한 측정에서 FITC-접합된 STRO-1 항체로 표지될 때, 비-밝음 세포 (STRO-1둔감/흐림)보다 더욱 큰 형광 신호를 발생시킨다. 한 실시예에서, "밝음" 세포는 출발 샘플 내에 포함된 가장 밝게 표지된 골수 단핵 세포 중에서 적어도 약 0.1%를 구성한다. 다른 실시예들에서, "밝음"세포는 출발 샘플 내에 포함된 가장 밝게 표지된 골수 단핵 세포 중에서 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.5%, 또는 적어도 약 2%를 구성한다. 한 실시예에서, STRO-1밝음 세포는 "배경", 다시 말하면, STRO-1- 세포에 비하여, STRO-1 표면 발현의 2 로그 크기(log magnitude) 높은 발현을 갖는다. 그에 비해, STRO-1흐림 및/또는 STRO-1중간 세포는 "배경"보다 STRO-1 표면 발현의 2 로그 크기 이하, 전형적으로 약 1 로그 또는 그 이하 높은 발현을 갖는다.
본 명세서에서, 용어 "TNAP"는 조직 비-특이적 알칼리성 포스파타아제의 모든 동족체(isoform)를 포함하는 것으로 의도된다. 가령, 용어는 간 동족체(LAP), 골 동족체(BAP) 및 신장 동족체(KAP)를 포함한다. 한 실시예에서, TNAP는 BAP이다. 한 실시예에서, 본 명세서에서 TNAP는 Budapest Treaty의 규정 하에 수탁 번호 PTA-7282로 2005년 12월 19일자에 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다.
더 나아가, 한 실시예에서, STRO-1+ 세포는 클론원성 CFU-F를 발생시킬 수 있다.
한 실시예에서 STRO-1+ 다능성 세포 중에서 유의미한 부분이 적어도 2가지 상이한 생식세포주로 분화할 수 있다. 다능성 세포가 결정(commitment)될 수 있는 계통의 무제한적 실시예에는 골 전구 세포; 담관 상피 세포와 간세포에 대해 다능성인 간세포 기원; 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)와 별아교세포(astrocyte)로 진행하는 아교 세포 전구체를 발생시킬 수 있는 신경 국한된 세포; 뉴런으로 진행하는 뉴런 전구체; 심근과 심근세포, 포도당-반응성 인슐린 분비 췌장 베타 세포주에 대한 전구체가 포함된다. 다른 계통에는 치아모세포(odontoblast), 상아질-생산 세포(dentin-producing cell)와 연골세포, 그리고 망막 색소 상피 세포, 섬유아세포, 피부 세포, 예를 들면, 케라티노사이트, 수상돌기 세포, 모낭 세포, 신관 상피 세포, 평활근과 골격근 세포, 고환 기원(testicular progenitor), 혈관 내피 세포, 힘줄, 인대, 연골, 지방세포, 섬유아세포, 골수 간질, 심근, 평활근, 골격근, 혈관주위, 혈관, 상피, 아교, 뉴런, 별아교 및 희소돌기아교 세포의 전구 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
또다른 실시예에서, STRO-1+ 세포는 배양 시에, 조혈 세포를 발생시킬 수 없다.
한 실시예에서, 이들 세포는 치료되는 개체로부터 채취되고, 표준 기술을 이용하여 시험관내에서 배양되고, 그리고 자기조직 또는 동종이계 조성물로서 개체에 투여를 위한 상층액 또는 가용성 인자 또는 확대된 세포를 획득하는데 이용된다. 대안적 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 확립된 인간 세포주의 세포가 이용된다. 본 개시내용의 또다른 유용한 가지 실시예에서, 비-인간 동물의 세포(또는 환자가 인간이 아니면, 다른 종으로부터)가 이용된다.
본 발명에서는 또한, 시험관내 배양액으로부터 생산되는 STRO-1+ 세포 및/또는 이들의 후손 세포(후자는 또한, 확대된 세포로서 지칭됨)로부터 획득되거나 유래되는 상층액 또는 가용성 인자의 이용을 고려한다. 본 발명의 확대된 세포는 배양액 조건(배양 배지에서 자극 인자의 숫자 및/또는 유형 포함), 계대배양(passage)의 횟수 및 이와 유사한 것에 따라, 매우 다양한 표현형을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 후손 세포는 모(母) 집단으로부터 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10회 계대배양(passage)후 획득된다. 하지만, 후손 세포는 모(母) 집단으로부터 임의의 횟수의 계대배양후 획득될 수도 있다.
후손 세포는 적절한 배지에서 배양함으로써 획득될 수 있다. 세포 배양액과 관련하여 이용될 때, 용어 "배지"는 세포를 둘러싸는 환경의 성분을 포함한다. 배지는 고체, 액체, 기체 또는 상(phase)과 물질(material)의 혼합물일 수 있다. 배지에는 액체 성장 배지뿐만 아니라 세포 성장을 유지하지 않는 액체 배지가 포함된다. 배지에는 또한, 아교질 배지, 예를 들면, 아가, 아가로오스, 젤라틴 및 콜라겐 매트릭스가 포함된다. 예시적인 기체 배지에는 페트리 접시 또는 다른 고형 또는 반고형 서포트 상에서 성장하는 세포가 노출되는 기체 상(gaseous phase)이 포함된다. 용어 "배지"는 또한, 비록 세포와 아직 접촉되지 않은 경우에도 세포 배양에서 이용이 의도되는 물질을 지칭한다. 다시 말하면, 박테리아 배양액에 대해 제조된 영양소 농축된 액체가 배지이다. 물 또는 다른 액체와 혼합될 때 세포 배양에 적합해지는 분말 혼합물은 "분말 배지"로 명명될 수 있다.
한 실시예에서, 본 발명의 방법에 유용한 후손 세포는 STRO-3 항체로 표지된 자성 구슬을 이용하여 골수로부터 TNAP+ STRO-1+ 세포를 단리하고, 그리고 이후, 단리된 세포를 배양 확대함으로써 획득된다(적절한 배양 조건의 실시예를 위해 Gronthos et al. Blood 85: 929-940, 1995를 참고한다).
한 실시예에서, 이런 확대된 세포(후손)(가령, 적어도 5회 계대배양 후)는 TNAP-, CC9+, HLA 클래스 I+, HLA 클래스 II-, CD14-, CD19-, CD3-, CD11a-c-, CD31-, CD86-, CD34- 및/또는 CD80-일 수 있다. 하지만, 본 명세서에서 기술된 것들과 상이한 배양 조건 하에, 상이한 마커의 발현이 변할 수도 있다. 또한, 이들 표현형의 세포가 확대된 세포 집단에서 우세할 수 있긴 하지만, 이것은 이러한 표현형(들)을 갖지 않는 적은 부분의 세포가 존재한다는 것을 의미하지 않는다(가령, 확대된 세포 중에서 적은 비율은 CC9-일 수 있다). 한 가지 실시예에서, 확대된 세포는 상이한 세포 유형으로 분화하는 능력을 여전히 갖는다.
한 실시예에서, 상층액 또는 가용성 인자, 또는 세포 그 자체를 획득하는데 이용되는 확대된 세포 집단은 세포 중에서 적어도 25%, 예를 들면, 적어도 50%가 CC9+인 세포를 포함한다.
다른 실시예에서, 상층액 또는 가용성 인자, 또는 세포 그 자체를 획득하는데 이용되는 확대된 세포 집단은 세포 중에서 적어도 40%, 예를 들면, 적어도 45%가 STRO-1+인 세포를 포함한다.
추가의 실시예에서, 확대된 세포는 LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD 90, CD29, CD18, CD61, 인테그린 베타 6-19, 트롬보모듈린, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R (STRO-2 = 렙틴-R), RANKL, STRO-1밝음 및 CD146 또는 이들 마커의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 마커를 집단적으로 또는 개별적으로 발현할 수 있다.
한 가지 실시예에서, 후손 세포는 WO 2006/032092에서 정의되고 및/또는 기술된 바와 같은 다능성 확대된 STRO-1+ 다능성 세포 후손(MEMP)이다. 후손이 유래될 수 있는 STRO-1+ 다능성 세포의 농축된 집단을 제조하는 방법은 WO 01/04268 및 WO 2004/085630에서 기술된다. 시험관내 배경에서, STRO-1+ 다능성 세포는 드물게는, 절대 순수한 조제물로서 존재하고, 그리고 일반적으로 조직 특이적 결정된 세포(TSCC)인 다른 세포와 함께 존재할 것이다. WO 01/04268에서는 약 0.1% 내지 90%의 순도 수준에서 골수로부터 이런 세포를 수확하는 것을 언급한다. 후손이 유래되는 MPC를 포함하는 집단은 조직 공급원으로부터 직접적으로 수확되거나, 또는 대안으로, 탈체(ex vivo)에서 이미 확대된 집단일 수 있다.
예를 들면, 후손은 그들이 존재하는 집단의 전체 세포 중에서 적어도 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 95%를 포함하는, 실질적으로 정제된 STRO-1+ 다능성 세포의 수확된, 확대되지 않은 집단으로부터 획득될 수 있다. 이러한 수준은 예로써, TNAP, STRO-1밝음, 3G5+, VCAM-1, THY-1, CD146 및 STRO-2로 구성된 군에서 개별적으로 또는 집단적으로 선택되는 적어도 하나의 마커에 대해 양성인 세포를 선별함으로써 달성될 수 있다.
MEMPS는 그들이 마커 STRO-1밝음에 대해 양성이고 마커 알칼리성 포스파타아제(ALP)에 대해 음성인 점에서, 새로 수확된 STRO-1+ 다능성 세포로부터 구별될 수 있다. 대조적으로, 새로 단리된 STRO-1+ 다능성 세포는 STRO-1밝음과 ALP 둘 모두에 대해 양성이다. 본 발명의 한 가지 실시예에서, 투여된 세포 중에서 적어도 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%는 표현형 STRO-1밝음, ALP-를 갖는다. 추가 한 가지 실시예에서, MEMPS는 마커 Ki67, CD44 및/또는 CD49c/CD29, VLA-3, α3β1 중에서 하나 또는 그 이상에 대해 양성이다. 또 다른 실시예에서, MEMPS는 TERT 활성을 나타내지 않고 및/또는 마커 CD18에 대해 음성이다.
STRO-1+ 세포 출발 집단은 WO 01/04268 또는 WO 2004/085630에서 기술된 임의의 하나 또는 그 이상의 조직 유형, 다시 말하면, 골수, 치수 세포, 지방 조직 및 피부, 또는 아마도 더욱 넓게는, 지방 조직, 치아, 치수, 피부, 간, 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 비장, 림프절, 흉선, 췌장, 골, 인대, 골수, 힘줄 및 골격근으로부터 유래될 수 있다.
본 발명을 실시함에 있어서, 임의의 소정의 세포 표면 마커를 보유하는 세포의 분리가 다수의 상이한 방법에 의해 달성될 수 있지만, 예시적인 방법은 관련된 마커에 결합제(가령, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 결합, 그 이후에 높은 수준 결합, 또는 낮은 수준 결합 또는 결합 없음을 나타내는 것들의 분리에 의존하는 것으로 이해될 것이다. 가장 편리한 결합 작용제는 항체 또는 항체-기초된 분자, 예를 들면, 단클론 항체이거나, 또는 이들 후자 작용제의 특이성으로 인하여 단클론 항체에 기초된 분자이다. 항체가 양쪽 단계에 이용될 수 있지만, 다른 작용제가 이용될 수도 있고, 따라서 이들 마커에 대한 리간드는 또한, 그들을 보유하거나, 또는 그들이 없는 세포를 농축하는데 이용될 수 있다.
항체 또는 리간드는 조제(粗製) 분리를 가능하게 하는 고형 서포트에 부착될 수 있다. 예시적인 분리 기술은 수집되는 분획의 생존능의 유지를 극대화시킨다. 상이한 효능의 다양한 기술이 상대적 조제(粗製) 분리를 달성하는데 이용될 수 있다. 이용되는 특정 기술은 분리의 효능, 연관된 세포독성, 수행의 용이함과 속도, 그리고 정교한 장비 및/또는 기술에 대한 필요성에 좌우될 것이다. 분리를 위한 절차에는 항체-코팅된 자성 구슬을 이용한 자성 분리, 친화성 크로마토그래피 및 고형 매트릭스에 부착된 항체로 "팬닝(panning)"이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 정확한 분리를 제공하는 기술에는 FACS가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. FACS를 수행하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에서 기술된 각 마커에 대한 항체는 상업적으로 구입가능하고(가령, STRO-1에 대한 단클론 항체는 R&D Systems(USA)로부터 상업적으로 구입가능하다), ATCC 또는 다른 기탁 기관으로부터 입수가능하고 및/또는 당분야의 인정된 기술을 이용하여 생산될 수 있다.
STRO-1+ 세포를 단리하는 예시적인 방법은 예로써, STRO-1의 높은 수준 발현을 인식하는 자성 활성화된 세포 분리(MACS)를 이용하는 고형 상 분류 단계인 첫 번째 단계를 포함한다. 특허 명세서 WO 01/14268에서 기술된 바와 같이, 더욱 높은 수준의 전구 세포 발현의 유발이 요망되면, 두 번째 분류 단계가 뒤따를 수 있다. 이러한 두 번째 분류 단계는 2개 또는 그 이상 마커의 이용을 필요로 할지도 모른다.
STRO-1+ 세포를 획득하는 방법은 또한, 공지된 기술을 이용한 첫 번째 농축 단계전 이들 세포의 공급원을 수확을 포함할 지도 모른다. 따라서 상기 조직은 외과적으로 제거될 것이다. 공급원 조직을 포함하는 세포는 이후, 소위 단일 세포 현탁액 내로 분리될 것이다. 이러한 분리는 물리적 및/또는 효소적 수단에 의해 달성될 수 있다.
일단 적절한 STRO-1+ 세포 집단이 획득되면, 이것은 임의의 적절한 수단에 의해 배양되거나 확대되어 MEMP가 획득될 수 있다.
한 가지 실시예에서, 이들 세포는 치료되는 개체로부터 채취되고, 표준 기술을 이용하여 시험관내에서 배양되고, 그리고 자기조직 또는 동종이계 조성물로서 개체에 투여를 위해 상층액 또는 가용성 인자 또는 확대된 세포를 획득하는데 이용된다. 대안적 실시예에서, 확립된 인간 세포주 중에서 하나 또는 그 이상의 세포는 상층액 또는 가용성 인자를 획득하는데 이용된다. 본 발명의 다른 유용한 가지 실시예에서, 비-인간 동물의 세포(또는 환자가 인간이 아니면, 다른 종으로부터)가 상층액 또는 가용성 인자를 획득하는데 이용된다.
본 발명은 비-인간 영장류 세포, 유제류, 개, 고양이, 토끼목, 설치류, 조류, 그리고 어류 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 비-인간 동물 종으로부터 세포를 이용하여 실시될 수 있다. 본 방법이 실시될 수 있는 영장류 세포에는 침팬지, 비비, 게잡이 원숭이, 그리고 임의의 다른 신세계 또는 구세계 원숭이의 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 방법이 실시될 수 있는 유제류 세포에는 소, 돼지, 양, 염소, 말, 물소 및 들소의 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 개시내용이 실시될 수 있는 설치류 세포에는 생쥐, 쥐, 기니 피그, 햄스터 및 게르빌루스 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 방법이 실시될 수 있는 토끼목 종의 실시예에는 집토끼, 산토끼, 야토, 솜꼬리토끼, 눈신토끼, 그리고 새앙토끼가 포함된다. 닭(Gallus gallus)은 본 방법이 실시될 수 있는 조류 종의 실시예이다.
본 발명의 방법에 유용한 세포는 사용에 앞서, 또는 상층액 또는 가용성 인자를 획득하기에 앞서 보관될 수 있다. 진핵 세포, 특히 포유동물 세포의 보존과 보관을 위한 방법과 프로토콜은 당분야에 공지되어 있다(예로써, Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.를 참고한다). 단리된 줄기 세포, 예를 들면, 간엽성 줄기/기원 세포, 또는 그의 후손의 생물학적 활성을 유지하는 임의의 방법이 본 발명과 관련하여 이용될 수 있다. 한 가지 실시예에서, 이들 세포는 냉동-보존(cryo-preservation)을 이용함으로써 유지되고 보관된다.
유전자 조작된 세포
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 이들의 후손 세포는 예로써, 목적 단백질을 발현시키기 위하여 유전적으로 변형된다. 예를 들면, 세포들은 염증성 관절 질환의 치료에 유용한 단백질, 이를 테면 항-TNF 항체 (가령, 아달리무마브 또는 인플리시마브) 또는 항-CD20 항체 (가령, 리투시마브 또는 오크레리주마브) 또는 가용성 TNF 수용체(가령, 에타네르셉트) 또는 이러한 용태를 치료하는데 유용한 펩티드 (가령, US5837686에서 설명된 것과 같은)을 발현 및/또는 분비하도록 유전적으로 변형된다.
세포를 유전자 조작하기 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 가령, 세포 내에서 발현되는 핵산은 세포 내에서 발현을 유도하기 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 가령, 핵산은 개체의 다양한 세포에서 작동하는 프로모터, 예를 들면, 바이러스 프로모터, 예를 들면, CMV 프로모터(가령, CMV-IE 프로모터) 또는 SV-40 프로모터에 연결된다. 추가 적절한 프로모터는 당분야에 공지되어 있고, 그리고 본 발명의 현재 구체예에 준용될 것이다.
예를 들면, 핵산은 발현 구조체의 형태로 제공된다. 본 명세서에서, 용어 "발현 구조체"는 세포 내에서, 발현 구조체가 작동가능하게 연결되는 핵산(가령, 리포터 유전자 및/또는 역-선택가능 리포터 유전자)에 발현을 공여하는 능력을 갖는 핵산을 지칭한다. 본 발명의 문맥 내에서, 발현 구조체는 이종기원 DNA를 발현가능 형식으로 유지하고 및/또는 복제할 수 있는 플라스미드, 박테리오파아지, 파지미드, 코스미드, 바이러스 하위-게놈 또는 게놈 단편, 또는 기타 핵산이거나, 또는 이를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 실시를 위한 적절한 발현 구조체의 작제를 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이고, 그리고 예로써, Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987) 또는 Sambrook et al (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)에서 기술된다. 예를 들면, 발현 구조체의 각 성분은 예로써, PCR을 이용하여 적절한 주형 핵산으로부터 증폭되고, 그리고 적절한 발현 구조체, 예를 들면, 플라스미드 또는 파지미드 내로 차후 클로닝된다.
이런 발현 구조체에 적합한 벡터는 당분야에 공지되어 있고 및/또는 본 명세서에서 기술된다. 가령, 포유동물 세포에서 본 발명의 방법에 적합한 발현 벡터는 예로써, Invitrogen에 의해 공급된 pcDNA 벡터 스위트의 벡터, pCI 벡터 스위트(Promega)의 벡터, pCMV 벡터 스위트(Clontech)의 벡터, pM 벡터(Clontech), pSI 벡터(Promega), VP 16 벡터(Clontech) 또는 pcDNA 벡터 스위트(Invitrogen)의 벡터이다.
당업자는 추가 벡터 및 이런 벡터의 공급원, 예를 들면, Life Technologies Corporation, Clontech 또는 Promega을 인지할 것이다.
발현을 위한 세포 내로 단리된 핵산 분자 또는 이를 포함하는 유전자 구조체를 도입하기 위한 수단은 당업자에게 공지되어 있다. 소정의 생물체에 대해 이용되는 기술은 공지된 성공적인 기술에 좌우된다. 세포 내로 재조합 DNA을 도입하기 위한 수단에는 그중에서도 특히, 미세주사, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염(transfection), 리포좀(liposome), 예를 들면, 리포펙타민(lipofectamine)(Gibco, MD, USA) 및/또는 셀펙틴(cellfectin)(Gibco, MD, USA)에 의해 매개된 형질감염, PEG-매개된 DNA 흡수, 전기천공(electroporation) 및 예로써, DNA-코팅된 텅스텐 또는 금 입자(Agracetus Inc., WI, USA)를 이용한 미세입자 폭발(microparticle bombardment)이 포함된다.
대안으로, 본 발명의 발현 구조체는 바이러스 벡터이다. 적절한 바이러스 벡터는 당분야에 공지되어 있고 상업적으로 구입가능하다. 핵산의 전달 및 상기 핵산의 호스트 세포 게놈으로의 통합(integration)을 위한 전통적인 바이러스-기초된 시스템에는 예로써, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-연관된 바이러스 벡터가 포함된다. 대안으로, 아데노바이러스 벡터는 에피솜(episome) 상태로 남아있는 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 유용하다. 바이러스 벡터는 표적 세포와 조직에서 유전자 전달의 효율적이고 다재다능한 방법이다. 추가적으로, 높은 형질도입(transduction) 효율이 많은 상이한 세포 유형과 표적 조직에서 관찰되었다.
가령, 레트로바이러스 벡터는 일반적으로, 최대 6-10 kb의 외래 서열에 대한 포장 수용력(packaging capacity)을 갖는 시스-작용 긴 말단 반복(long terminal repeat, LTR)을 포함한다. 최소 시스(cis)-작용 LTR은 벡터의 복제와 포장에 충분하고, 이것은 이후, 발현 구조체를 표적 세포 내로 통합하여 장기 발현을 제공하는데 이용된다. 폭넓게 이용되는 레트로바이러스 벡터에는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(SrV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 그리고 이들의 조합에 기초된 것들이 포함된다(예로써, Buchscher et al., J Virol. 56:2731-2739 (1992); Johann et al, J. Virol. 65:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al, Virol. 76:58-59 (1990); Wilson et al, J. Virol. 63:274-2318 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700; Miller and Rosman BioTechniques 7:980-990, 1989; Miller, A. D. Human Gene Therapy 7:5-14, 1990; Scarpa et al Virology 75:849-852, 1991; Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:8033-8037, 1993).
핵산 전달을 위해 다양한 아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터 시스템 역시 개발되었다. AAV 벡터는 당분야에 공지된 기술을 이용하여 용이하게 작제될 수 있다. 예로써, U.S. 특허 번호 5,173,414 및 5,139,941; 국제 공개 번호 WO 92/01070 및 WO 93/03769; Lebkowski et al. Molec. Cell. Biol. 5:3988-3996, 1988; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press);Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539, 1992; Muzyczka. Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158:97-129, 1992; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801, 1994; Shelling and Smith Gene Therapy 7:165-169, 1994; 그리고 Zhou et al. J Exp. Med. 179:1867-1875, 1994를 참고.
본 발명의 발현 구조체를 전달하는데 유용한 추가 바이러스 벡터에는 예로써, 바이러스의 폭스 패밀리(pox family), 예를 들면, 우두 바이러스(vaccinia virus) 및 조류 폭스바이러스(avian poxvirus) 또는 알파바이러스(alphavirus) 또는 접합체 바이러스 벡터로부터 유래된 것들(가령, Fisher-Hoch et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 56:317-321, 1989에서 기술된 것들)이 포함된다.
세포 및 가용성 인자의 치료적/예방적 잠재력 분석
염증성 관절 질환을 치료 또는 예방하고 또는 염증성 관절 질환의 개시 또는 진행을 지연시키는 세포들 또는 가용성 인자들의 능력을 측정하는 방법들은 당업자들에게 자명할 것이다.
예를 들면, 류마티즘성 관절염의 시험관 모델은 Schultz et al., Arthritis and Rheumatism, 40: 1420-1428, 1997에서 설명되며, 관절염을 앓는 대상으로부터 취한 활액성 막 및 관절의 연골 외식편 또는 활액성 세포 및 연골세포를 3-차원 피브린 매트릭스에 배양하는 것과 관련된다. 이 배양물에 본 명세서에서 기술된 세포 그리고 또는 가용성 인자들의 투여는 단백질분해 효소의 발현, 연골세포 매트릭스 구조양식, 매트릭스 쇠퇴 또는 세포 수를 평가함으로써, 이 세포/인자들의 치료/예방 효과의 측정을 허용한다.
관절염의 또다른 시험관 모델은 TNF-알파 및/또는 IL-1 베타 존재하에서 활액성 섬유아세포와 함께 연골 디스크를 배양하는 것과 관련된다. 이 배양물에 본 명세서에서 기술된 세포 그리고 또는 가용성 인자들의 투여는 단백질분해 효소의 발현, 콜라겐 매트릭스 구조양식, 매트릭스 쇠퇴, 전-염증성 사이토킨 수준 (가령, IL-6 및/또는 IL-8) 또는 세포 수를 평가함으로써, 이 세포/인자들의 치료/예방 효과의 측정을 허용한다.
또다른 실시예에서, 본 명세서에서 기술된 세포 및/또는 가용성 인자들의 효과는 류마티즘성 관절염의 생체내 모델, 가령, SKG 계통의 마우스(Sakaguchi et al., Nature, 426: 454-460), 쥐 콜라겐 유형 II 관절염 모델, 마우스 콜라겐 유형 II 관절염 모델 또는 몇 가지 종들에서 항원 유도된 관절염 모델들(Bendele J Musculoskel Neuron Interact 2001; 1(4):377-385)에서 평가된다. 발명자들은 류마티즘성 관절염의 양 모델도 또한 설명하였다.
강직성 척수염의 동물 모델은 당업계에 공지되어 있는데, balb/c 마우스를 어그레칸 및/또는 베르시칸으로 면역화시키는 것과 관련된 모델, 백혈구 항원-B27를 과다발현시키는 ank / ank 마우스 쥐를 포함한다.
전술한 내용으로부터 본 개시내용은 염증성 관절 질환의 치료, 예방 또는 지연을 위한 세포 또는 가용성 인자들을 확인 또는 단리하는 방법 또한 제공한다는 것이 당업자에게는 자명할 것이며, 이 방법은 다음을 포함한다:
(i) 염증성 관절 질환을 앓고 있는 테스트 대상에게 세포 또는 가용성 인자를 투여하고, 대상의 관절에서 염증을 평가하고;
(ii) (i)에서 대상의 관절에서 염증 수준과 염증성 관절 질환을 앓고 있지만, 세포 또는 가용성 인자가 투여되지 않은 대조군의 관절내 염증 수준을 비교하고,
이때 대조군 대상과 비교하여 테스트 대상 관절에서의 염증의 감소는 이 세포 또는 가용성 인자가 염증성 관절 질환을 치료, 예방 또는 지연시킨다는 것을 나타낸다.
본 개시내용은 염증성 관절 질환의 치료, 예방 또는 지연을 위한 세포 또는 가용성 인자들을 확인 또는 단리하는 방법 또한 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다:
(i) 염증성 관절 질환의 시험관 테스트 모델과 접촉시키고, 이 모델에서 염증의 하나 또는 그 이상의 표식 수준을 측정하고;
(ii) 이 세포 또는 가용성 인자가 투여되지 않은 염증성 관절 질환의 대조군 시험관 모델에서 염증의 하나 또는 그 이상의 표식 수준을 측정하고,
이때 대조군 모델과 비교하여 테스트 모델에서 염증 표식의 수준 감소는 이 세포 또는 가용성 인자가 염증성 관절 질환을 치료, 예방 또는 지연시킨다는 것을 나타낸다.
염증의 예시적인 표식은 단백질분해 효소의 발현, 콜라겐매트릭스 구조양식,매트릭스 쇠퇴, 전-염증성 사이토킨 수준 (가령, IL-6 및/또는 IL-8) 또는 염증성 세포 수를 포함한다.
이 세포는 임의의 실시예에 따라 본 명세서에서 기술된 임의의 세포일 수 있다.
세포 조성물
본 개시내용의 한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 이들의 후손 세포는 조성물의 형태로 투여된다. 예를 들면, 이런 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함한다.
용어 "담체"와 "부형제"는 활성 화합물의 보관, 투여, 및/또는 생물학적 활성을 용이하게 하기 위해 당분야에서 편의적으로 이용되는 물질의 조성(composition of matter)을 지칭한다(예로써, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980)을 참고한다). 담체는 또한, 활성 화합물의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 감소시킬 수 있다. 적절한 담체는 예로써, 안정적인데, 예를 들면, 담체 내에 다른 성분과 반응할 수 없다. 한 실시예에서, 담체는 치료에 이용되는 용량과 농도에서 수용자에서 유의미한 국소 또는 전신 부작용을 발생시키지 않는다.
본 개시내용에 적합한 담체에는 편의적으로 이용되는 것들이 포함된다, 예를 들면, 물, 염수, 수성 덱스트로스, 락토오스, 링거 용액, 완충된 용액, 히알루로난(hyaluronan)과 글리콜은 특히, 용액(등장성일 때)에 대한 선호되는 액체 담체이다. 적절한 제약학적 담체와 부형제에는 전분, 셀룰로오스, 포도당, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아레이트 마그네슘, 스테아레이트 나트륨, 모노스테아레이트 글리세롤, 염화나트륨, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다.
또다른 실시예에서, 담체는 예로써, 세포가 성장되거나 현탁되는 배지 조성물이다. 예를 들면, 이런 배지 조성물은 투여되는 개체에서 임의의 유해한 효과를 유도하지 않는다.
예시적인 담체와 부형제는 세포의 생존능 및/또는 염증성 관절 질환을 감소, 예방 또는 지연시키는 세포의 능력에 유해한 영향을 주지 않는다.
한 가지 실시예에서, 담체 또는 부형제는 세포 및/또는 가용성 인자를 적절한 pH에 유지시켜 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 완충 활성을 제공한다, 예를 들면, 담체 또는 부형제는 포스페이트 완충된 염수(PBS)이다. PBS는 매력적인 담체 또는 부형제인데, 그 이유는 이것이 세포 및 인자와 최소한으로 상호작용하고 세포 및 인자의 신속한 방출을 가능하게 하기 때문이고, 이런 경우에 본 발명의 조성물은 예로써, 주사에 의해 혈류에, 또는 조직 또는 조직을 둘러싸거나 조직에 인접한 구역 내로 직접 적용을 위한 액체로서 생산될 수 있다.
STRO-1+ 세포 및/또는 이들의 후손 세포는 또한, 수용자-화합성이고 수용자에게 유해하지 않는 산물로 분해되는 골격(scaffolds) 내에 함입되거나 끼워 넣어질 수 있다. 이들 골격은 수용자 대상 내로 이식되는 세포에 대한 서포트와 보호를 제공한다. 자연 및/또는 합성 생물분해성 골격은 이런 골격의 실시예이다.
다양한 상이한 골격이 본 발명의 실시예 성공적으로 이용될 수 있다. 예시적인 골격에는 생물학적, 분해성 골격이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 자연 생물분해성 골격에는 콜라겐, 피브로넥틴, 그리고 라미닌 골격이 포함된다. 세포 이식 골격에 적합한 합성 재료는 광범위한 세포 성장과 세포 기능을 지원할 수 있어야 한다. 이런 골격은 또한, 재흡수될 수도 있다. 적절한 골격에는 예로써, Vacanti, et al. J. Ped. Surg. 23:3-9 1988; Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38:145 1991; Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 88:753-9 1991에서 기술된 바와 같은 폴리글리콜산 골격; 또는 합성 중합체(synthetic polymer), 예를 들면, 폴리무수물(polyanhydride), 폴리오르토에스테르(polyorthoester), 그리고 폴리락트산(polylactic acid)이 포함된다.
또다른 실시예에서, 이들 세포는 겔 골격(가령, Upjohn Company로부터 Gelfoam)에 담겨 투여될 수 있다.
본 개시내용에 유용한 세포 조성물은 단독으로, 또는 다른 세포와의 혼합물로서 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물과 공동으로 투여될 수 있는 세포에는 다능성(multipotent) 또는 만능성(pluripotent) 세포 또는 줄기 세포, 또는 골수 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 상이한 유형의 세포는 투여 직전에 또는 조금 전에 본 발명의 조성물과 혼합되거나, 또는 이들은 투여에 앞서 일정한 기간 동안 함께 공동-배양될 수 있다.
한 실시예에서, 조성물은 효과량 또는 치료적 또는 예방적 효과량의 세포를 포함한다. 가령, 조성물은 약 1x105 STRO-1+ 세포/kg 내지 약 1x107 STRO-1+ 세포/kg 또는 약 1x106 STRO-1+ 세포/kg 내지 약 5x106 STRO-1+ 세포/kg을 포함한다. 투여되는 세포의 정확한 양은 환자의 연령, 체중과 성별, 그리고 염증성 관절 질환의 정도와 심각도를 비롯한 다양한 인자에 좌우된다.
한 실시예에서, 낮은 약량의 세포들이 대상에게 투여된다. 예시적인 약량은 약 0.1 x 104 내지 0.5 x 106 세포/kg, 예를 들면, 약 0.1 x 105 내지 0.5 x 106 세포/kg, 이를 테면, 약 0.5 x 105 내지 0.5 x 106 세포/kg, 예를 들면, 약 0.1 x 106 내지 0.5 x 106 세포/kg, 가령, 약 0.2 x 106 또는 0.3 x 106 또는 0.4 x 106 세포/kg를 포함한다.
한 실시예에서, 높은 용량의 세포가 대상에게 투여된다. 예시적인 투약량은 최소한 약 1.5 x 106 세포/kg를 포함한다. 예를 들면, 높은 용량은 약 1.5 x 106 내지 약 6x106 세포/kg, 이를 테면 약 1.5 x 106 내지 약 5x106 세포/kg, 예를 들면, 약 1.5 x 106 내지 약 4x106 세포/kg, 예를 들면, 약 1.5 x 106 내지 약 3x106 세포/kg를 포함한다. 예를 들면, 높은 용량은 약 1.5 x 106 또는 약 2 x 106 세포/kg를 포함한다.
한 실시예에서, 이 세포는 환자의 체중에 관계없이 전체 세포 수 용량으로 투여된다.
예를 들면, 한 실시예에서, 이 세포는 환자의 체중과 무관하게 약 1억 내지 3억개의 세포 용량으로 투여된다.
예를 들면, 한 실시예에서, 이 세포는 환자의 체중과 무관하게 약 1억 내지 2억개의 세포 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, 이 세포는 환자의 체중과 무관하게 약 1억개의 세포 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, 이 세포는 환자의 체중과 무관하게 약 1.5억개의 세포 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, 이 세포는 환자의 체중과 무관하게 약 2억개의 세포 용량으로 투여된다.
한 실시예에서, 이 세포는 환자의 체중과 무관하게 약 3억개의 세포 용량으로 투여된다.
일부 실시예들에서, 세포는 이들 세포가 개체의 순환(circulation) 내로 빠져나가는 것을 허용하지 않지만, 이들 세포에 의해 분비되는 인자가 순환 내로 들어가도록 허용하는 챔버 내에 포함된다. 이러한 방식으로, 가용성 인자는 세포가 이들 인자를 개체의 순환 내로 분비하도록 허용함으로써 개체에 투여될 수 있다. 이런 챔버는 가용성 인자의 국소 수준을 증가시키기 위해 개체 내에 부위에 동등하게 이식될 수 있다, 예를 들면, 이식된 췌장 내에 또는 인근에 이식될 수 있다.
본 발명의 일부 실시예들에서, 세포 조성물로 치료의 개시에 앞서 환자를 면역억제하는 것이 필요하거나 바람직하지 않을 수도 있다. 따라서 동종이계, 또는 심지어 이종 STRO-1+ 세포 또는 그의 후손으로 이식이 일부 경우에 관용될 수 있다.
하지만, 다른 경우들에, 세포 조성물에 대항하여 대상의 면역 반응을 감소시키기 위하여, 세포 요법을 시작하기에 앞서, 환자를 약리학적으로 면역억제하는 것이 바람직하거나 적절할 수 있다. 이것은 전신 또는 국소 면역억제 작용제의 이용을 통해 달성되거나, 또는 캡슐화된 장치에서 세포를 전달함으로써 달성될 수 있다. 세포는 세포 및 세포의 치료 인자에 의해 요구되는 영양소와 산소에 침투성이고, 그리고 면역 체액 인자와 세포에 불침투성인 캡슐 내에 캡슐화될 수 있다. 예를 들면, 봉합제(encapsulant)는 저자극성(hypoallergenic)이고, 표적 조직 내에 쉽고 안정되게 위치되고, 그리고 이식된 구조에 부가된 보호를 제공한다. 이식된 세포에 대한 면역 반응을 감소시키거나 제거하기 위한 이들 수단 및 다른 수단은 당분야에 공지되어 있다. 대안으로서, 이들 세포는 그들의 면역원성을 줄이기 위해 유전자 조작될 수 있다.
가용성 인자의 조성물
본 발명의 한 실시예에서, STRO-1+ 세포-유래된 및/또는 후손 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자는 예로써, 적절한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물의 형태로 투여된다. 예를 들면, 담체 또는 부형제는 가용성 인자 또는 상층액의 생물학적 효과에 부정적인 영향을 주지 않는다.
한 실시예에서, 조성물은 상층액의 가용성 인자 또는 성분, 예를 들면, 프로테아제 저해제를 안정화시키는 물질의 조성을 포함한다. 예를 들면, 프로테아제 저해제는 개체에 대한 유해한 효과가 나타낼 만큼 충분한 양으로 포함되지 않는다.
STRO-1+ 세포-유래된 및/또는 후손 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자를 포함하는 조성물은 예로써, 배양액 배지에서 또는 안정된 담체 또는 완충액 용액, 예를 들면, 포스페이트 완충된 염수에서 적절한 액체 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적절한 담체는 상기 본 개시내용에서 기술된다. 또다른 실시예에서, STRO-1+ 세포-유래된 및/또는 후손 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자를 포함하는 현탁액은 주사를 위한 유성 현탁액이다. 적절한 친유성 용매 또는 운반제에는 지방 오일, 예를 들면, 참깨 오일; 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면, 에틸 올리에이트 또는 트리글리세리드; 또는 리포좀이 포함된다. 주사에 이용되는 현탁액은 또한, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 소르비톨, 또는 덱스트란을 내포할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한, 고도로 농축된 용액의 제조가 가능하도록 화합물의 용해도를 증가시키기 위해 적절한 안정화제 또는 작용제를 내포할 수 있다.
무균 주사가능 용액은 적절한 용매에서 필요한 양으로 상층액 또는 가용성 인자를 필요에 따라, 앞서 열거된 성분 중에서 한 가지 또는 이들의 조합과 통합하고, 그 이후에 여과된 멸균에 의해 제조될 수 있다.
일반적으로, 분산액은 상층액 또는 가용성 인자를 기본 분산 매체 및 앞서 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 내포하는 무균 운반제 내로 통합함으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 미리 무균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가 원하는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조(vacuum drying) 및 냉동-건조(freeze-drying)이다. 본 발명의 대안적 양상에 따라서, 상층액 또는 가용성 인자는 용해성을 증강시키는 하나 또는 그 이상의 추가 화합물로 조제될 수 있다.
다른 예시적인 담체 또는 부형제는 예로써, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N. Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y에서 기술된다.
치료적 조성물은 전형적으로, 제조와 보관의 조건 하에 무균이고 안정되어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 기타 정연한 구조로서 조제될 수 있다. 담체는 예로써, 물, 에탄올, 폴리올(가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 그리고 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 그리고 이들의 적절한 혼합물을 내포하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적절한 유동성(fluidity)은 예로써, 레시틴과 같은 코팅의 이용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우들에서, 조성물 내에 등장성 작용제, 예를 들면, 당, 다가알코올, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염과 젤라틴을 조성물 내에 포함함으로써 달성될 수 있다. 게다가, 가용성 인자는 시한 방출 제제(time release formulation), 예를 들면, 느린 방출 중합체(slow release polymer)를 포함하는 조성물에 담겨 투여될 수 있다. 활성 화합물은 급속한 방출로부터 화합물을 보호하는 담체로, 이식물 및 미세캡슐화된 전달 시스템(microencapsulated delivery system)을 비롯한 방출 제어형 제제(controlled release formulation)로서 제조될 수 있다. 생물분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 폴리락틱, 폴리글리콜릭 공중합체(PLG)가 이용될 수 있다. 이런 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허화되거나, 또는 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다.
상층액 또는 가용성 인자는 예로써, 가용성 인자의 느린 방출을 제공하기 위해 적절한 매트릭스와 공동으로 투여될 수 있다.
조성물의 추가 성분들
STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자들, STRO-1+ 세포들 또는 그의 후손은 다른 유익한 약물들 또는 생물학적 분자들(성장 인자들, 영양에 관한 인자들)과 함께 투여될 수 있다. 다른 물질들과 함께 투여될 때, 이들은 단일 약학 조성물 안에서 함께 투여될 수 있거나, 또는 별도의 약학 조성물로서, 다른 물질들과 동시에 또는 순차적으로(다른 물질들의 투여 전 또는 후) 투여될 수 있다. 함께 투여될 수 있는 생활성 인자들은 항-자가사멸제(apoptotic agent)(가령, EPO, EPO 미메티바디(mimetibody), TPO, IGF-I 및 IGF-II, HGF, 카스파제 억제제들); 항-염증성 물질(가령, p38 MAPK 억제제들, TGF-베타 억제제들, 스타틴, IL-6 및 IL-1 억제제들, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS, 그리고 NSAIDs (비-스테로이드성 항-염증성 약물들; 가령, TEPOXALIN, TOLMETIN, SUPROFEN); 면역억제성/면억조절성 물질들(가령, 칼시뉴린 억제제들, 예를 든다면 사이클로스포린, 타크로리무스; mTOR 억제제(가령, SIROLIMUS, EVEROLIMUS); 항-증식제 (가령, 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸); 코르티코스테로이드(가령, 프레디니솔론, 하이드로코르티손); 항체들 이를 테면, 단클론 항-IL-2R알파 수용체 항체들 (가령, 바실리시마브, 다클리주마브), 다클론성 항-T-세포 항체들 (가령, 항-흉선세포 글로블린(ATG); 항-임파세포 글로블린(ALG); 단클론 항-T 세포 항체 OKT3)); 항-트롬보겐 물질들 (가령, 헤파린, 헤파린 유도체들, 유로키나제, PPack (덱스트로페닐알라닌 프롤린 아르기닌 클로로메틸케톤), 항트롬빈 화합물들, 혈소판 수용체 길항물질들, 항-트롬빈 항체들, 항-혈소판 수용체 항체들, 아스피린, 디피리다몰 프로타민, 히루딘, 프로스타글란딘 억제제들, 그리고 혈소판 억제제들); 그리고 항-산화제(가령, 프로부콜, 비타민 A, 아스코르브산, 토코페롤, 코엔자임 Q-10, 글루타티온, L-시스테인, N-아세틸시스테인) 뿐만 아니라 국소 마취제를 포함한다.
한 실시예에서, 이 세포 및/또는 가용성 인자들은 면역억제성 물질 또는 항-염증성 물질 또는 DMARD 또는 비-스테로이드성 항-염증성 약물과 함께 투여된다.
예시적인 면역억제성/항-염증성 물질들은 사이토킨 생산을 억제하는 물질, 자가-항원 발현을 하향-조절 또는 억제하는 물질, 또는 MHC 항원들을 차단하는 물질들을 포함한다. 이러한 물질들의 예로는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 (U.S. 특허 제4,665,077호 참고) 강시클로비르, 타크로리무스, 글루코코르티코이드 이를 테면 코르티솔 또는 알도스테론, 항-염증성 물질들 이를 테면 시클로옥시게나제 저해제, 5-리폭시게나제 저해제, 또는 루코트리엔 수용체 길항제; 퓨린 길항제 이를 테면 아자티오프린 또는 미코페놀레이트 모페틸 (MMF); 알킬화 물질들 이를 테면 사이클로포스파미드; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타알데히드 (U.S. 특허 제4,120,649호에 설명된 것과 같이, MHC 항원을 차단하는); MHC 항원 및 MHC 단편들에 대한 항-이디오타입 항체들; 사이클로스포린 A; 스테로이드 이를 테면 코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코이드 유사체들, 가령, 프레드니손, SOLU-MEDROL® 메틸프레드니졸론 나트륨 숙시네이트를 포함하는 메틸프레드니졸론, 그리고 덱사메타손; 디하이드로폴레이트 환원효소 저해물질 이를 테면 메토트렉세이트 (경구 또는 피하); 항-말라리아 물질들 이를 테면 클로로퀸 그리고 히드록시클로로퀸; 술파살라진; 레플루노미드; 사이토킨 길항제 이를 테면 항-인터페론-알파, -베타, 또는 -감마 항체들, 항-종양 괴사 인자 (TNF)-알파 항체들 (인플리시마브 또는 아달리무마브), 항-TNF-알파 면역흡착 (에타네르셉트), 항-TNF-베타 항체들, 항-인터루킨-2 (IL-2) 항체들 그리고 항-IL-2 수용체 항체들, 그리고 항-인터루킨-6 (IL-6) 수용체 항체들 그리고 길항제을 포함하는 사이토킨 항체들 또는 사이토킨 수용체 항체들;항-CD11a 그리고 항-CD18 항체들을 포함하는 항-LFA-1 항체들; 항-L3T4 항체들; 이종기원의 항-림프구 글로불린; pan-T 항체들, 이를 테면 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체들; LFA-3 결합 도메인 (WO 90/08187)을 함유하는 가용성 펩티드; 스트렙토키나제; 형질변환 성장 인자-베타 (TGF-베타); 스트렙토도마제; 숙주로부터 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 클로람부칠; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체(US5114721); T-세포 수용체단편들 (W90/11294); BAFF 길항제들 이를 테면 BAFF 항체들 그리고 BR3 항체들 그리고 zTNF4 길항제들; T 세포 헬퍼 신호를 간섭하는 생물학적 물질들, 이를 테면 CD40-CD40 리간드 및 CTLA4-Ig에 대한 차단 항체들을 포함하는 항-CD40 수용체 또는 항-CD40 리간드(CD154); 그리고 T-세포 수용체항체들 (EP 340,109) 이를 테면 T10B9를 포함한다. 본 명세서에서 일부 면역억제성 물질들은 또한 DMARD, 이를 테면 메토트렉세이트이다. 본 명세서에서 예시적인 면역억제성 물질들은 사이클로포스파미드, 클로람부칠, 아자티오프린, 레플루노미드, MMF, 또는 메토트렉세이트를 포함한다.
"질환-변형 항-류마티즘성 약물" 또는 "DMARD"의 예로는 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 에타네르셉트, 인플리시마브 (플러스 경구 그리고 피하 메토트렉세이트), 아자티오프린, D-페니실라민, 금 염(경구), 금 염(근육내), 미노사이클린, 사이클로스포린 A 및 국소 사이클로스포린을 포함하는 사이클로스포린, 스타필로코커스 단백질 A 및 이의 염 또는 유도체 등을 포함한다. 한 실시예에서, DMARD는 메토트렉세이트이다.
"비-스테로이드성 항-염증성 약물" 또는 "NSAID"의 예로는 아스피린, 아세틸살리실산, 이부프로펜, 플루르비프로펜, 나프록센, 인도메타신, 술린닥, 토멜틴, 페닐부타존, 디클로페낙, 케포프로펜, 베노릴레이트, 메페나민산, 메토트렉세이트, 펜부펜, 아자프로파존; COX-2 저해물질 이를 테면 세레콕시브 4-(5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오르메틸)-1H-피라졸-1-일)벤젠실폰아미-드, 발데콕시브, 멜옥시캄, GR 253035 (Glaxo Wellcome); 그리고 MK966 (Merck Sharp & Dohme), 및 이의 염 또는 이의 유도체 등을 포함한다.
대안으로, 또는 추가적으로, 다른 화합물은 항-CD20 항체 (가령, 리투시마브 또는 아파투무마브)이다. 대안으로, 또는 추가적으로, 다른 화합물은 항-CD22 항체 (가령, 에프라투주마브). 대안으로, 또는 추가적으로, 다른 화합물은 항-TNF 항체 (가령, 인플리시마브 또는 아달리무마브 또는 고리무마브) 또는 가용성 TNF 수용체(가령, 에타네르셉트)이다. 대안으로, 또는 추가적으로, 다른 화합물은 CTLA-4 길항제 (가령, 아바타셉트, CTLA4-Ig). 대안으로, 또는 추가적으로, 다른 화합물은 항-IL-6 또는 항-IL-6R 항체 (가령, 토시리주마브)이다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들은 기타 치료 화합물 (가령, 메토트렉세이트)에 부속 및/또는 부수 요법으로 투여된다.
"부속 요법"은 기존 치료에 추가 또는 보충되는 치료를 의미한다.
"부수적 요법"은 또다른 치료와 동시에 제공되지만, 다른 치료에 부수적인 치료를 의미하는 것은 아닌데, 가령, 두 가지 치료는 모두 개별적으로 류마티즘성 질환을 치료할 수 있다.
치료제의 공동 투여또는 한 가지 이상의 치료제의 투여는 이 치료제들이 단일 조성물로 반드시 투여되어야 한다는 의미는 아니다. 치료제들은 별도 조성물로써 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 연속 투여 사이의 기간은 제 1 치료제가 투여될 때 제 1 치료제의 수준이 제 2 치료의 치료 또는 예방적 이익을 제공하거나 부가할 정도의 충분한 수준이라면 수일이 될 수 있다.
한 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본 개시내용에서 설명된 것과 같이 약학 조성물은 염증성 관절 질환에 이용된 화합물을 포함한다. 대안으로, 구체예의 임의의 실시예에 따라 설명된 것과 같이 치료/예방 방법은 염증성 관절 질환에 이용되는 화합물의 투여(가령, 동일한 조성물 또는 별도의 조성물에서 및/또는 또는 동일한 또는 상이한 시간에)를 포함한다. 예시적인 화합물들이 본 개시내용에 설명되며, 이들은 본 개시내용의 이들 실시예에 필요한 변경에 의해 적용될 수 있다.
또다른 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본 개시내용에서 설명된 조성물은 선조 세포가 맥관 세포로의 분화를 유도 또는 강화시키는 인자를 추가적으로 포함한다. 예시적인 인자들은 맥관 내피 성장 인자(VEGF), 혈소판 유래된 성장 인자 (PDGF; 가령, PDGF-BB), 그리고 FGF를 포함한다.
또다른 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본 개시내용에서 설명된 조성물은 조직 특이적 결정된(committed) 세포 (TSCC)를 추가적으로 포함한다. 이 점에 있어서, 국제 특허 출원 PCT/AU2005/001445는 TSCC 및 STRO-1+ 세포들의 투여는 TSCC의 강화된 증식을 유도할 수 있다고 설명한다. 한 실시예에서, TSCC는 맥관 세포다. 대상에게 이러한 조성물의 투여는 맥관 구조의 증가된 생산, 가령, 병에 걸린 조직으로 운반될 영양분의 증가로 이어질 수 있다.
의료 장치들
본 개시내용은 임의의 실시예에 따른 본 명세서에서 기술된 방법에 이용되거나 또는 용도의 의료 장치를 또한 제공한다. 예를 들면, 본 개시내용은 임의의 실시예에 따라 본 개시내용에서 설명된 것과 같은 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 이로부터 얻은 가용성 인자들을 포함하는 주사기 또는 카테테르 또는 다른 적합한 운반 장치를 제공한다. 선택적으로, 주사기 또는 카테테르는 임의의 실시예에 따른 본 명세서에서 기술된 방법에 사용을 위한 지침과 함께 포장된다.
또다른 실시예에서, 본 개시내용은 임의의 실시예에 따라 본 개시내용에서 설명된 것과 같은 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 이로부터 얻은 가용성 인자들을 포함하는 이식물을 제공한다. 선택적으로, 이식물은 임의의 실시예에 따른 본 명세서에서 기술된 방법에 사용을 위한 지침과 함께 포장된다. 적합한 이식물은 상기 본 개시내용에서 설명된 것과 같이 골격과 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 이로부터 얻은 가용성 인자들로 형성될 수 있다.
투여 방식
STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1+ 세포 또는 그의 후손은 외과적으로 이식되거나, 주사되거나, 전달되거나(가령, 카테터 또는 주사기에 의해), 또는 수복 또는 증가가 요구되는 부위, 예를 들면, 관절 또는 관절에 인접한 부위로 직접적으로 또는 간접적으로 달리 투여될 수 있다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1+ 세포 또는 그의 후손은 대상의 혈류로 전달된다. 가령, STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1+ 세포 또는 그의 후손은 비경구 전달된다. 비경구 투여의 예시적인 루트에는 복막내, 심실내, 뇌실내, 척수강내, 동맥내, 마디내 또는 정맥내가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 한 실시예에서, STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1+ 세포 또는 그의 후손은 동맥내, 대동맥 내로, 심장의 심이 또는 심실 내로, 혈관, 예를 들면, 정맥내로 전달된다.
심장의 심이 또는 심실에 세포 전달의 경우에, 세포는 폐에 세포의 급속한 전달로부터 발생할 수 있는 합병증을 피하기 위해 왼쪽 심이 또는 심실에 투여될 수 있다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1+ 세포 또는 그의 후손은 예로써, 주사기를 이용하여, 또는 카테터 또는 중심선(central line)을 통해 전달 부위 내로 주사된다.
치료적 제제에 대한 투여 섭생의 선별은 독립체의 혈청 또는 조직 회전율(turnover rate), 증상의 수준, 그리고 독립체의 면역원성(immunogenicity)을 비롯한 여러 인자에 좌우된다. 예를 들면, 투여 섭생은 허용되는 수준의 부작용과 일관되게, 환자의 전달되는 치료적 화합물의 양을 극대화시킨다. 따라서 전달되는 제제의 양은 특정 독립체 및 치료되는 질환의 심각도에 부분적으로 좌우된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1+ 세포 또는 그의 후손은 단일 일시주사 복용량(single bolus dose)으로서 전달된다. 대안으로, STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1+ 세포 또는 그의 후손은 연속 주입(continuous infusion)에 의해, 또는 예로써, 하루, 1주 또는 주당 1-7회의 간격에서 투약에 의해 투여된다. 예시적인 투약 프로토콜은 유의미한 원치 않는 부작용을 회피하는 최대량 또는 투약 빈도(dose frequency)를 수반하는 것이다. 총 1주 용량은 이용되는 화합물의 유형과 활성에 좌우된다. 적절한 용량의 결정은 예로써, 치료에 영향을 주거나, 또는 치료에 영향을 줄 것으로 예측되는 당분야에서 공지되거나 예상되는 파라미터 또는 인자를 이용하여 임상의에 의해 만들어진다. 일반적으로, 투약은 최적 용량(optimum dose)보다 다소 적은 양으로 시작되고, 그 이후 임의의 부정적인 부작용에 비하여 원하는 또는 최적 효과가 달성될 때까지 작은 증분(increment)에 의해 증가된다. 중요한 진단 측정은 당뇨병 증상들의 것을 포함한다.
본 발명자들은 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들에 의해 제공되는 치료 효과는 대상에서 적어도 4주간 관찰된다는 것을 보여주었다. 따라서, 일부 실시예들에서 세포들은 주당, 격주로, 3주에 한번 또는 4주에 한번 투여된다.
염증성 관절 질환의 치료 또는 진행을 지연시키기 위한 본 발명의 한 실시예에 따르면, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들은 가령, 당 분야에 공지된 표준 방법들 및/또는 본 개시내용에서 설명된 방법들을 이용하여 질환의 진단 이후 투여된다.
염증성 관절 질환을 예방 또는 개시를 지연시키는 이들 실시예의 경우, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들은 질환의 임상전 진단에 앞서 투여될 수 있다.
환자 집단
본 개시내용의 방법들은 류마티즘성 질환을 앓고 있는 대상의 하위집단내에 속하는 대상을 치료하는데 또한 유용하다.
한 실시예에서, 이 대상은 류마티즘성 질환, 가령, 류마티즘성 관절염을 앓고, TNF 저해제 (가령, 항-TNF 항체 또는 가용성 TNF 수용체)에 적절하게 반응하지 않는다. "TNF 저해제에 적절하게 반응하지 않는" 대상은 독성 또는 부적합한 효과로 인하여, 하나 또는 그 이상의 TNF 저해물질을 이용한 기존 또는 현재 치료에 부적합한 반응을 경험하였다. 한 실시예에서, 이러한 환자는 예를 들면, >3개월 이상 동안 주당 2회씩 25 mg의 에타네르셉트를 제공받았거나 또는 인플리시마브, >3 mg/kg을 최소한 4회 주입받았지만, 이에 대해 부적합한 반응을 보였다.
한 실시예에서, 이 대상은 류마티즘성 질환, 가령, 류마티즘성 관절염을 앓고, 메토트렉세이트에 적절하게 반응하지 않는다. "메토트렉세이트에 적절하게 반응하지 않는" 대상은 독성 또는 부적합한 효과로 인하여, 메토트렉세이트을 이용한 기존 또는 현재 치료에 부적합한 반응을 경험하였다. 한 실시예에서, 이 환자는 최소한 12주 동안 메토트렉세이트 (10-25mg/주)를 제공받았지만, 여전히 질환은 활성인 상태다.
한 실시예에서, 이 대상은 메토트렉세이트 치료를 이미 제공받고 있다.
한 실시예에서, 이 대상은 메토트렉세이트 치료를 이미 받고 있으며, STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들의 투여는 STRO-1+ 세포 및/또는 그의 후손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들를 제공받지 않는 대상과 비교하여 항-TNF 요법의 처방을 지연시킨다.
한 실시예에서, 이 대상은 활성 류마티즘성 관절염을 앓고 있다. "활성 류마티즘성 관절염"을 가진 대상이란 류마티즘성 관절염이 활성이며, 잠복기 징후들이 없는 대상을 의미한다. 한 실시예에서, 이러한 환자는 첫 방문시기에서 >6개월 의 질환 기간을 가진 중간 내지 심각한 활성 류마티즘성 관절염을 가진다. 한 실시예에서, 이러한 환자들은 다음을 가진다: (1) 부어오른 관절 카운트 (SJC) > 4 (66 관절 카운트), (2) 말랑한 관절 카운트 (TJC) > 4 (68 관절 카운트), 및/또는 C-반응성 단백질 (CRP) > 첫 방문시 정상의 상한선(ULN).
한 실시예에서, 이 대상은 중간정도의 활성 류마티즘성 관절염 또는 심각한 활성 류마티즘성 관절염 또는 중간 내지 심각한 활성 류마티즘성 관절염을 앓고 있다.
중간정도의 활성 류마티즘성 관절염을 가진 사람은 일반적으로 다음 징후들중 최소한 2개 또는 3개 또는 4개 또는 이들 모두의 조합을 가진다:
● 6 내지 20의 염증이 있는 관절
● 보통 관절이외의 조직에는 염증이 없음
● 상승된 ESR 또는 CRP 수준
● 양성 류마티즘성 인자 테스트 또는 항-사이클 시투룰린화된 펩티드(항-CCP) 항체들
● x-선 사진상에 염증은 있으나, 뼈 손상의 증거는 없다
심각한 활성 류마티즘성 관절염을 가진 사람은 일반적으로 다음 징후들중 최소한 2개 또는 3개 또는 4개 또는 이들 모두의 조합을 가진다:
● 20 이상의 지속적으로 염증이 있는 관절 또는 기능적 능력의 급격한 상실
● 상승된 ESR 또는 CRP 수준
● 만성 질병과 관련된 빈혈
● 낮은 혈액 알부민 수준
● 양성 류마티즘성 인자 테스트, 대개 높은 수준
● x-선 사진상에 뼈 및 연골 손상 증거
● 관절이외의 조직에서 염증
한 실시예에서, 대상은 지속적으로 활성 류마티즘성 관절염을 가진다. 지속적 활성 류마티즘성 관절염을 가진 사람은 최소한 6 내지 12개월 동안 염증 증거를 가지며, 비가역적 관절 손상 및 기능 상실을 가질 수 있다.
한 실시예에서, 이 세포 또는 가용성 인자들의 투여는 구조적 관절 손상의 진행을 억제한다. 대상에서 "구조적 관절 손상의 진행을 억제한다"는 표현은 류마티즘성 질환에 의한 구조적 관절 손상을 예방 또는 지연시키는 것을 지칭하는데, 가령, 예를 들면 침식된 관절 카운트 및/또는 관절 손상 득점에 근거하여 류마티즘성 관절염을 앓고 있는 대상. 구조적 관절 손상의 진행을 측정하는 방법들은 당업자에게 공지되어 있고, 변형된-Genant Total Sharp Score (TSS), 침식 득점(ES), 및/또는 관절 공간 좁아짐(JSN) 득점을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 실시예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 가령, 본 명세서에서 설명된 방법 및/또는 X-선을 이용하여, 구조적 관절 손상의 진행을 평가하는 것을 추가적으로 포함한다. 예를 들면, 평가는 이 세포 또는 가용성 인자들의 최종 투여 후 약 1개월 또는 3개월 또는 6개월 또는 12개월에 이루어진다.
본 발명은 다음의 비-제한적 실시예에서 추가 설명된다.
실시예
실시예들
실시예 1: STRO-3
+
세포의 선별에 의한 MPC의 면역선별
골수(BM)는 건강한 정상 성인 지원자(20-35세 연령)로부터 수확되었다. 간단히 말하면, 40 ml의 BM이 후장골극(posterior iliac crest)으로부터 리튬-헤파린 항응혈약-내포 튜브 내로 흡출된다.
BMMNC는 기존 문헌(Zannettino, A.C. et al. (1998) Blood 92: 2613-2628)에서 기술된 바와 같이, LymphoprepTM(Nycomed Pharma, Oslo, Norway)을 이용한 밀도 구배 분리에 의해 제조된다. 4℃에서 30분 동안 400 x g에서 원심분리 이후에, 연층(buffy layer)은 이전 피펫(transfer pipette)으로 제거되고, 그리고 5% 소 태아 혈청(FCS, CSL Limited, Victoria, Australia)을 내포하는 Hank 균형 염 용액(HBSS; Life Technologies, Gaithersburg, MD)으로 구성되는 "HHF"에서 3회 세척된다.
STRO-3+ (또는 TNAP+) 세포는 기존 문헌(Gronthos et al. (2003) Journal of Cell Science 116: 1827-1835; Gronthos, S. and Simmons, P.J. (1995) Blood 85: 929-940)에서 기술된 바와 같이, 자성 활성화 세포 분리에 의해 차후 단리되었다. 간단히 말하면, 대략 1-3 x 108 BMMNC는 HHF에서 10%(v/v) 정상 토끼 혈청으로 구성되는 차단 완충액에서, 얼음 위에서 20분 동안 배양되었다. 이들 세포는 차단 완충액에서 STRO-3 mAb의 10 ㎍/ml 용액 200 ㎕와 함께, 얼음 위에서 1시간 동안 배양된다. 이들 세포는 400 x g에서 원심분리에 의해 HHF에서 차후 2회 세척된다. HHF 완충액에서 1/50 희석의 염소 항-생쥐 γ-비오틴(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, UK)이 첨가되고, 그리고 이들 세포는 얼음 위에서 1시간 동안 배양된다. 세포는 MACS 완충액(1% BSA, 5 mM EDTA 및 0.01% 나트륨 아지드로 보충된 Ca2+-와 Mn2+-없는 PBS)에서 상기와 같이 2회 세척되고 0.9 ml MACS 완충액의 최종 부피에서 재현탁되었다.
100 ㎕ 스트렙타비딘 마이크로구슬(Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germany)이 세포 현탁액에 첨가되고 얼음 위에서 15분 동안 배양된다. 세포 현탁액은 2회 세척되고, 0.5 ml의 MACS 완충액에서 재현탁되고, 그리고 미니 MACS 칼럼(MS Columns, Miltenyi Biotec) 위에 차후 적하되고, 그리고 STRO-3 mAb(수탁 번호 PTA-7282로 2005년 12월 19일자에 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁됨 - International Publication No. WO 2006/108229를 참고한다)에 결합하지 않은 세포를 회수하기 위해 0.5 ml MACS 완충액으로 3회 세척된다. 추가의 1 ml MACS 완충액의 첨가 후, 칼럼은 자석으로부터 제거되고, 그리고 TNAP+ 세포는 정압(positive pressure)에 의해 단리된다. 각 분획으로부터 세포의 분취량(aliquot)은 스트렙타비딘-FITC로 염색될 수 있고, 그리고 순도는 유세포분석법에 의해 평가될 수 있다.
실시예 2: STRO-3 mAb에 의해 선별된 세포는 STRO-1
밝음
세포이다
세포 STRO-1밝음 세포를 단리하기 위한 단일 반응물로서 STRO-3 mAb를 이용하는 잠재력을 확증하기 위한 실험이 설계되었다.
STRO-3(IgG1)은 STRO-1(IgM)의 것과 상이한 아이소타입이라는 점을 고려하여, 클론원성 CFU-F를 확인하는 STRO-3의 능력은 MACS 절차를 이용하여 단리된 STRO-1+ 세포와의 공동-발현에 기초하여 이중-칼라 FACS 분석에 의해 평가되었다(도 1). 점도표 히스토그램은 리스트모드 데이터로서 수집된 5 x 104 사건을 나타낸다. 수직선과 수평선은 동일한 조건 하에 처리된 아이소타입-정합된 대조 항체, 1B5(IgG)와 1A6.12(IgM)로 획득된 <1.0% 평균 형광의 반응성 수준으로 설정되었다. 이들 결과는 STRO-1밝음 세포의 소수 집단이 TNAP(위쪽 오른쪽 사분면)을 공동-발현하지만, 나머지 STRO-1+ 세포가 STRO-3 mAb와 반응하지 않는다는 것을 증명한다. 4개의 사분면 모두로부터 FACS에 의해 단리된 세포는 CFU-F의 발생에 대해 차후 검정되었다(표 1).
실시예 3: STRO-1
둔감
및 STRO-1
밝음
세포들의 상대적인 유전자 및 표면 단백질 발현
첫 번째 연속 실험에서, 반-정량적 RT-PCR 분석을 이용하여 형광 활성화된 세포 분류에 의해 단리된 STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 집단에 의해 발현되는 다양한 계통-연합된 유전자들의 유전자 발현 프로파일을 검사하였다(도 2A). 두 번째 연속 실험에서, 유동 세포분석법 및 평균 채널 형광 분석을 이용하여 형광 활성화된 세포 분류에 의해 단리된 STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 집단에 의해 발현되는 다양한 계통-연합된 단백질들의 표면 단백질 발현 프로파일을 검사하였다.
총 세포성 RNA는 2 x 106 STRO-1밝음 또는 STRO-1둔감 분류된 1차 세포들, 연골세포 펠렛 및 기타 유도된 배양물로부터 준비하였고, 그리고 제조업자의 권장에 따라 RNAzolB 추출 방법(Biotecx Lab. Inc., Houston, TX)을 이용하여 추출하였다. 각 하위집단으로부터 단리된 RNA를 제 1 가닥 cDNA 합성 키트 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 이용하여 준비된 cDNA 합성을 위한 주형으로 이용하였다. 다양한 전사체들의 발현은 이미 설명된 표준 프로토콜(Gronthos et al., J. Bone and Min. Res. 14:48-57, 1999)을 이용하여 PCR 증폭에 의해 산정되었다. 본 연구에 이용된 프라이머 세트는 표 2에 나타낸다. 증폭 후, 각 반응 혼합물은 1.5% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되었고, 그리고 에티디움 브롬화물 착색으로 시각화되었다. RNA 일체성은 GAPDH의 발현에 의해 평가되었다.
각 세포 표식에 대한 상대적인 유전자 발현은 ImageQant 소프트웨어를 이용하여 하우스-키핑 유전자, GAPDH의 발현을 참고하여 평가되었다(도 2B, C). 추가적으로, 이중-색 유동 세포분석을 이용하여 STRO-1 항체와 조합된 광범위한 세포 계통-연합된 표식의 발현에 기초하여 탈체 확장된 MPC의 단백질 발현 프로파일을 검사하였다. STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 배양된 세포들의 유전자 및 단백질 발현에 기초하여 일반적인 유전자형의 요약은 표 3에 제시된다. 이 데이터에서 탈체 확장된 STRO-1밝음 MPC는 혈관 주위 세포들과 연합된 앙기오포에틴-1, VCAM-1, SDF-1, IL-1β, TNFα, 및 RANKL을 포함하는 표식들을 차등적으로 더 많이 발현하였다는 것을 나타낸다. STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 배양된 세포들의 단백질 및 유전자 발현 프로파일의 비교는 표 3 및 4에 요양된다.
공제(substractive) 혼성화 연구를 또한 실행하여 STRO-1밝음 세포들에 의해 독특하게 발현되는 유전자를 확인하였다. 간략하게 설명하자면, STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 은 상기에서 설명된 것과 같이 단리되었다(도 3A 참고). RNA STAT-60 시스템(TEL-TEST)을 이용하여 5가지 상이한 골수 시료로부터 모은 STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 세포들로부터 총 RNA가 준비되었다. 제 1-가닥 합성은 SMART cDNA 합성 키트(Clontech Laboratories)를 이용하여 실행되었다. 생성된 mRNA/단일-가닥으로된 cDNA 하이브리드는 제조업자의 설명에 따라 첫 RT 과정 동안 형성된 3' 및 5' 프라임 말단에서 특이적 프라이머 부위들을 이용하여 먼-거리(long-distance) PCR(Advantage 2 PCR 키트; Clontech)에 의해 증폭되었다. STRO-1밝음 cDNA의 Rsa1 절단 이후, Clontech PCR-Select cDNA Substraction 키트를 이용하여 상이한 특이적 어뎁터 올리고뉴클레오티드를 결찰시키는데 2 분획(aliquots)이 이용되었다. 2회의 공제 혼성화는 제조업자의 프로토콜에 따라, STRO-1밝음 (테스터) 및 STRO-1둔감 (드라이버) cDNA를 이용하여, 그리고 반대경우도 마찬가지로, 실행되었다. 이 과정은 STRO-1밝음 드라이버 cDNA에 대항하여 혼성화된 STRO-1둔감 테스터 cDNA를 이용하여 또한 실행되었다.
STRO-1밝음 집단에 의해 독특하게 발현되는 유전자를 확인하기 위하여, STRO-1밝음-공제된 cDNA를 이용하여 T/A 클로닝 벡터안에 결찰된 STRO-1밝음 공제된 cDNA로 형질변환된 200개의 무작위로 선택된 세균 클론을 포함하는 모사(replicate) 저-밀도 마이크로어래이 필터를 구축하였다. 마이크로어래이는 [32P] dCTP라벨된 STRO-1밝음또는 STRO-1둔감 공제된 cDNA로 후속적으로 프로브되었다(도 3B-C). 분별 스크리닝으로 총 44개의 클론이 확인되었는데, 이들은 STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 하위집단 사이에 매우 차등적으로 발현되었다. 차등적으로 발현된 모든 클론의 DNA 서열과에서 오직 1개의 클론이 공지의 기질(stromal) 세포 미토겐; 즉, 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF)을 나타내었다(Gronthos and Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995). 흥미로운 것은, 44개의 클론중 6개는 케모킨, 기질-유래된 인자-1(SDF-1)에 대응하는 DNA 삽입물을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 인간 STRO-1밝음 세포들에서 SDF-1 전사체들의 매우 풍부함은 새로 분류된 STRO-1밝음, STRO-1둔감, 그리고 STRO-1음성 골수 하위집단으로부터 준비된 총 RNA의 반정량적 RT-PCR에 의해 확인되었다(도 3D 및 표 3).
단백질 표면 발현과 STRO-1 발현의 밀도와의 상관관계를 위하여, 탈체 확장된 세포 유래 골수 MPC의 단일 세포 현탁액을 트립신/EDTA 분리에 의해 준비하였고, 후속적으로 세포 계통-연합된 광범위한 표식들을 확인하는 항체와 함께 STRO-1 항체로 항온처리되었다. STRO-1은 염소 항-뮤린 IgM-플루오레세인 이소티오시아네이트를 이용하여 확인되었으며, 모든 다른 표식들은 염소 항-마우스 또는 항-토끼 IgG-피코에리트린을 이용하여 확인되었다. 세포내 항원을 확인하는 이들 항체의 경우, 세포 조제물을 우선 STRO-1 항체로 라벨시키고, 차가운 70% 에탄올에 고정시켜, 세포 막이 삼투성이 되도록 하고, 그 다음 세포내 항원-특이적 항체와 함께 항온처리되었다. 아이소타입 정합된 대조군 항체들이 동일한 조건에서 이용되었다. 이중-색조 유동 세포분석은 COULTER EPICS 유동 세포측정기를 이용하여 실행하였고, 리스트 모드 데이터가 수집되었다. 점도표는 각 계통 세포 표식 (y-축) 및 STRO-1 (x-축)에 대한 형광 강도 수준을 나타내는 5,000개 리스트모드 이벤트를 나타낸다. 수직 및 수평 사분면은 아이소타입 정합된 음성 대조군 항체를 기준하여 확립되었다.
실시예 4: 류마티즘성 관절염의 양 모델
4.1
방법
류마티즘성 관절염의 양 모델을 만드는 방법의 개요는 다음과 같다:
1. 0일차
i. 5마리 양 (B1626, B1584, B3619, B1612, B1302)들에게 Freund 완전한 어쥬번트 + 5mg 소의 콜라겐 유형 II (양 한 마리당 0.2ml S/C x 5)를 투여하였다. 용액은 피하로 투여되었다(S/C)
ii. 2마리 양 (B1627, B4036)에게 Freund's 완전한 어쥬번트 + 5mg 닭 콜라겐 유형 II (양 한 마리당 0.2ml S/C x 5)을 투여하였다.
iii. 10ml의 혈액은 ELISA를 이용하여 콜라겐 유형 II 항체들에 대한 테스트를 위하여 수집되었다.
iv. 다음을 위한 임상 검사:
ⓒ 절름발이
ⓒ 부기
ⓒ 관절 두꺼워짐
2. 14일차
i. 5마리 양들에게 Freund 불완전한 어쥬번트 + 5mg 소의 콜라겐 유형 II (양 한 마리당 0.2ml S/C x 5)을 투여함
ii. 2마리 양들에게 Freund 불완전한 어쥬번트 + 5mg 닭 II 콜라겐 (양 한 마리당 0.2ml S/C x 5)를 투여함
iii. 10ml의 혈액은 ELISA 및 백혈구 세포 카운트를 이용하여 콜라겐 유형 II 항체들에 대한 테스트를 위하여 수집되었다.
iv. 다음을 위한 임상 검사:
ⓒ 절름발이
ⓒ 부기
ⓒ 관절 두꺼워짐
2. 28일차
i. 5마리 양들에게 염수에서 100μg 소의 콜라겐 유형 II를 관절내 주사를 통하여 좌측 무릎으로 투여하였다 (양 한 마리 당 500μl)
ii. 2마리 양들에게 염수에서 100μg 닭 콜라겐 유형 II를 관절내 주사를 통하여 좌측 무릎으로 투여하였다 (양 한 마리 당 500μl)
iii. 10ml의 혈액은 ELISA 및 백혈구 세포 카운트를 이용하여 콜라겐 유형 II 항체들에 대한 테스트를 위하여 수집되었다.
iv. 다음을 위한 임상 검사:
ⓒ 절름발이
ⓒ 부기
ⓒ 관절 두꺼워짐
4. 30일차 + 2일차 IA 주사
i. 다음을 위한 임상 검사:
ⓒ 절름발이
ⓒ 부기
ⓒ 관절 두꺼워짐
5. 36일차 + 8일차 IA 주사
i. 다음을 위한 임상 검사:
ⓒ 절름발이
ⓒ 부기
ⓒ 관절 두꺼워짐
6. 42일차 + 14일차 IA 주사
i. 소의 콜라겐 유형 II를 제공받은 4마리 양 (B1626, B3619, B1612, B1302을 죽였다.
ii. 닭 유형 II 콜라겐을 제공받은 2마리 양(B1627, B4036)을 죽였다.
iii. 10ml의 혈액은 ELISA 및 백혈구 세포 카운트를 이용하여 콜라겐 유형 II 항체들에 대한 테스트를 위하여 수집되었다.
iv. 다음을 위한 임상 검사:
ⓒ 절름발이
ⓒ 부기
ⓒ 관절 두꺼워짐
v. 죽은 양
ⓒ 활액성 유체 좌측 & 우측 무릎 관절
a. 콜라겐 유형 II 항체들에 대해 평가됨
b. 세포 카운트
ⓒ 활액성 조직 좌측 & 우측 무릎 관절
a. 포르말린 고정 H&E 구역
b. 액화 질소 동결
ⓒ 관절의 연골 좌측 그리고 우측
a. 사진
b. 포르말린 고정 및 H & E를 위한 탈칼슘화
7. 56일 차
i. 소의 콜라겐 유형 II를 제공받은 1마리 양(1584)을 죽였다
ii. 10ml의 혈액은 ELISA 및 백혈구 세포 카운트를 이용하여 콜라겐 유형 II 항체들에 대한 테스트를 위하여 수집되었다.
iii. 다음을 위한 임상 검사:
ⓒ 절름발이
ⓒ 부기
ⓒ 관절 두꺼워짐
iv. 죽은 양
ⓒ 활액성 유체 좌측 & 우측 무릎 관절
a. 콜라겐 유형 II 항체들 세포 카운트에 대해 평가됨
ⓒ 활액성 조직 좌측 & 우측 무릎 관절
a. 포르말린 고정 H&E 구역
b. 액화 질소 동결
ⓒ 관절의 연골 좌측 그리고 우측
a. 사진
b. 포르말린 고정 및 H & E를 위한 탈칼슘화
4.2
결과
7마리 양 모두들에게서 유순한 절름발이의 임상 신호가 나타났고, 4마리 양들에게서는 관절 부기와 관절 굴곡에 통증이 있었다. 오직 좌측(치료된) 무릎에서만 이들 신호가 관찰되었다.
양을 안락사시키고, 7마리 양중 6마리에서 경골뒤발목 관절 주변의 전체적으로 두꺼워짐이 분명하게 나타났다. 이것은 염증성 변화의 가장 두드러진 증거다. 이 관절의 관절 연골을 검사하고, 이들 양 3마리에서 비대한 염증성 부식성 병소가 관찰되었는데, 발목 뼈의 관절 표면에서 가장 두드러졌다.
좌측 (치료된) 무릎에서 염증성 변화가 관찰되었고, 반대측(우측) 무릎에서 매우 유순한 염증성 변화가 가끔 관찰되었다.
표 5에서 치료된 양에서 관찰된 특징적 결과들을 요약한다.
양의 임상 평가
표 6은 치료된 양을 평가하기 위하여 이용된 득점 체계를 제공한다.
표 7-11은 다양한 시점에서 양들의 임상적 평가 결과를 보여준다. CII의 IA 주사를 할 때까지 임상적 변화가 관찰되지는 않았다.
도 4는 관절내 콜라겐 유형 II의 주사 후 양에서 평균 절름발이 득점을 보여준다. 나타낸 것과 같이, 콜라겐 유형 II의 첫 주사 이후 약 28일 시점에서 절름발이가 증가되었다.
도 5는 개별 양의 우측 (자극안된) 및 좌측(자극된) 무릎으로부터 활액성 유체 내 백혈구 카운트를 보여준다. 더 높은 반응군에서, 대조군 측면에서 백혈구 농도가 또한 상승되었는데, 이는 전신 반응 가능성을 나타낸다. 도 6은 대조군 양 및 소의 콜라겐 유형 II으로 면역화된 양의 활액성 유체내 평균 백혈구 카운트를 보여준다.
도 7A 및 7B는 소의 콜라겐 유형 II 그리고 닭 콜라겐 유형 II로 각각 면역화된 양의 활액성 유체내에서 IgM과 IgG 항체들의 수준을 보여준다. 이들 결과에서 이들 면역화된 동물 무릎에서 콜라겐 유형 II에 대항하여 IgM과 IgG가 증가되었음을 나타낸다. 이들 데이터들은 또한 표 12에 요약된다.
상기에서 나타낸 데이터에서 0일차와 14일차에 Freund 어쥬번트에서 이종기원의 콜라겐 유형 II의 주사 및 28일차 무릎 관절로 콜라겐 유형 II의 관절내 주사에 의해 7마리 양에서 콜라겐 유도된 관절염 (CIA)이 유도되었음을 보여준다. 이 질환은 신속하게 진행되었고 관절내 CII의 주사후 14 일차에 관절 염증, 활액성 과형성, 단핵 세포 침윤, 항 콜라겐 유형 II 항체들 그리고 일부 양들의 경우 관절의 연골의 침식성 병소를 특징으로 한다. 7마리 양 모두에서 절름발이 임상 신호가 명백하고, 7마리 양중 6마리에서 발목 관절 주변 활성의 전체적 두꺼워짐이 명백하였다.
양에서 CIA는 인간 류마티즘성 관절염과 상당히 유사한 매우 우수한 큰 동물 모델임이 나타났다.
실시예 5: 실험 기획
류마티즘성 관절염의 양 모델은 실시예 4에서 설명된 것과 같이 기본적으로 만들어진다.
36마리 양을 표 13에 나타낸 것과 같이 각 집단에 여덟(6)마리 양을 포함하는, 6개 집단 중 하나에 무작위로 할당될 것이다. 첫 콜라겐 주사 후 42일 시점에 테스트 관련 동물에 물품이 투여될 것이다.
테스트 물품을 투여한 후 30일 시점에 양들은 안락사될 것이고, 전체적인 부검이 시작되며, 병리 및 조직적 검사를 위하여 조직이 수거되었다.
MPC 용량 준비
● 4.0 mL ProFreeze®/DMSO/알파-MEM (IV 주사에 의해 3십만 oMPCs/kg의 용량을 제공하기 위하여)에서 2천4백만 양의 MPCs (oMPCs)
● 4.0 mL ProFreeze®/DMSO/알파-MEM (IV 주사에 의해 1 백만 oMPCs/kg의 용량을 제공하기 위하여)에서 8천만 양의 oMPCs
● 4.0 mL ProFreeze®/DMSO/알파-MEM (IV 주사에 의해 2 백만 oMPCs/kg의 용량을 제공하기 위하여)에서 1억6천만 양의 oMPCs
● 0.7 mL ProFreeze®/DMSO/알파-MEM (관절내 주사에 의해 2천5 백만 oMPCs의 용량을 제공하기 위하여)에서 3천5백만 양의 oMPCs
● 멸균 염수 (대조군).
총체적 병리학(Gross Pathology)
죽은 또는 안락사된 모든 동물에서 부검 및 조직 수거를 실행하였다. 수집된 조직은 10% 완충된 포르말린에서 고정된다. 각 조직에서 육안으로 발견을 기록한다.
좌측 (처리된) 및 우측 (대조군) 무릎 관절을 노출시키고, 활액성 막까지 아래로 절개한다. 활막 ( 및 하위 지방)의 시료는 고정을 위하여 10% 완충된 중성 포르말린에 위치시키거나 스냅(snap) 동결을 위하여 OCT 화합물에 위치시킨다.
그 다음 관절은 탈구시키고, 전체 연골 병소의 증거를 위하여 관절의 표면을 검사하였고, 사진을 찍었다. 발목 뼈의 관절 표면 부분(하기 참고)은 톱을 이용하여 제거하고, 그리고 10% 완충된 중성 포르말린에 고정된다.
무릎 관절로부터 활액성 조직의 조직병리학적 득점
대조군 및 처리된 동물의 좌우 무릎 관절의 활액성 막 및 하부활액성 조직내에 조직학적 구역의 준비 및 병리학적 변화 득점을 위한 방법은 Krenn et al (Pathol Res . Pract . 198:317-325)의 공개에 기초된다.
무릎 관절로부터 활액성 조직의 면역조직화학 연구들 및 득점
활액성 막은 처리된 그리고 대조군 동물의 좌우 경골뒤발목 (무릎) 관절의 등-측면 및 등-중앙 영역으로부터 수집되었다. 이들 조직은 OCT 화합물에서 냉동되었고, 유리 슬라이드 상에서 그리고 저온유지장치(cryostat)를 이용하여 절단되었다. 절단구역은 공개된 방법(16) 및 시판되는 이용가능한 프로토콜에 따라 특이적 세포 유형 및 항체들을 확인하기 위하여 표준 면역조직화학 방법을 이용하여 착색된다. 이용된 항체들은 CD4 (44-97), CD8 (38-65), 감마-델타 (γδ T 세포 (86D/127-5), CD14 (VMRD a-M-M9), B 세포 (CD79a: HM57) 그리고 사이토킨 TNF-알파, 인터루킨-6, 인터루킨-1베타, 인터루킨-17, 인터루킨-10, 인터페론 감마, 인자 VIII 그리고 VCAM-1에 대항하여 생성된 것들을 포함하고 그리고 시판되는 것으로부터 구하거나, 또는 직접 준비한다. 착색된 구역은 블라인드로 득점화된다.
임상 병리학
대략 30-40 mL의 혈액을 사전-연구 진입, 0일차(기준), 42일차, 49일차, 56일차, 63일차 그리고 부검시 (72일차)에 수집되고, 다음 분석에 이용된다:
사이토킨: 활액성 유체 및 혈장에서 사이토킨, TNF-a, IFN-g, IL-1b 그리고 IL-6의 수준이 결정된다.
통계학적 방법들
다양한 처리 집단으로부터 획득한 데이터의 통계학적 분석 및 그래프는 일원분산분석(one way ANOVA), Graphpad Prism Statistical 소프트웨어(버젼 5.0b) (GraphPad Software Inc, La Jolla, Ca USA)를 이용한 Tukey 또는 Newman-Keuls 다중 비교 테스트를 이용하여 실시되었다. 처리된 집단간의 통계학적 유의성은 p < 0.05로 얻었다. 개별 처리 집단과 대조군 사이에 모수 데이터 유의성은 대응 Student t-테스트를 이용하여 결정되었다. 비-모수 평가를 위하여, 집단간에 차이는 Mann-Whitney 또는 Wilcoxon 정합된 쌍 순위 표시 테스트(matched-pairs signed rank tests)를 이용하여 평가되었고, 유의성은 p < 0.05에서 수용되었다.
실시예 6: 무릎 관절로부터 활액성 조직의 조직병리학적 득점 결과
모든 동물의 좌측(소의 콜라겐 유형 II (BII) 주사된 관절) 및 우측 무릎 관절의 활액성 막에 대한 개별 조직병리학적 득점은 내용을 모르는(blinded) 관찰자들에 의해 결정되었다. 과형성, 기질 (활액성 조직) 활성화, 그리고 염증성 침윤에 대한 개별 득점의 총합으로 획득된 각 절단면의 집합 및 성분 득점은 도 8A 그리고 8B에서 그래프로 요약된다. 이들 도면으로부터 BII 주사된 좌측 관절의 집합 득점은 반대측 우측 관절의 득점보다 더 높다는 것이 명백하다. 더우기, MPC 처리된 집단과 대조군 사이에 통계학적으로 유의적인 차이는 낮고(p < 0.017) 그리고 높은 (p < 0.025) MPC 주사된 집단 (도 8A)에의 경우에 나타나지만, 우측 관절에서 대응하는 활막의 경우 집단 조직병리학적 득점에 대해서 나타나지 않았다 (도 8B). 대조군과 MPC 처리된 집단 사이의 차이에 대한 주요 원인은 이 세포 처리된 집단에서 활액성 과형성의 감소인 것으로 보인다 (도 8A).
관절내 주사된 집단의 좌우 무릎 관절에서 활액성 조직병리학적 변화의 득점은 염수 또는 2천5백만 MPC의 주사간에 임의의 유의적인 차이를 보이지 못하였지만, 예상과 같이 좌측 관절에 대한 예상 득점은 우측 관절보다 더 높았다(도 8C).
실시예 7: 활액성 조직의 면역조직화학 연구들
이 방법 단락에서 설명된 항체들로 면역조직화학적 착색 이후 다양한 동물 집단의 활액성 조직내에서 세포 변화 및 사이토킨 수준을 반-정량화하는데 이용된 득점 체계 결과는 도 9A - 9C에 나타낸다. 이들 다중 구역을 득점화하는 3가지 상이한 방법의 이용은 검사된 각 실험 집단 각각에 대한 유의적 복합 득점의 생성을 방해하였다. 따라서, 개별 표식 항체들에 대한 각 실험 집단에서 획득된 평균 득점은 별도로 도 10A - 10F에 나타낸다. 할당된 득점과 함께 이들 구역의 일부의 현미경 사진의 예시는 도 11A - 11E에 나타낸다.
맥관내막 IL-1 그리고 VCAM-1에서 감소와 감마-델타 TCR에서 증가가 명백하지만(도 10A - 10C) 대조군과 MPC 주사된 집단 사이에 통계학적 유의적 차이는 설명될 수 없을 것이다. 그러나, 높은 MPC 용량이 주사된 집단의 경우 IL-6 (p = 0.029) 그리고 TNF-알파 (p = 0.049) (도 10D)에 대한 활액성 맥관내막 착색(도 10D)과 CD-14 세포에 대한 간질 조직 착색(도 10E)은 염수 주사된 대조군 집단보다 유의적으로 더 낮다는 것이 설명되었다(p = 0.009). 더욱이, 높은 용량 집단의 활액성 간질성 조직에서 사이토킨 IL-17의 수준은 대응하는 대조군의 경우보다 유의적으로 더 낮았다(ANOVA, p < 0.005) (도 10F).
염수 및 MPC 주사된 관절에서 획득된 면역조직화학 득점의 결과는 표 14에 나타낸다. MPC 주사된 관절에서 CD4, CD8 그리고 CD79에 대한 더 높은 착색이 있었는데, 이는 MPC 주사된 관절에서 관찰된 림프구 수가 더 높은 것과 일관되었다. 그러나, MPC 주사된 관절에서 TNF-알파 및 IL-17에 대한 평균값은 염수 주사된 관절, 특히 좌측 관절 활막의 맥관내막 영역보다 더 낮았다.
전반적인 토론
본 명세서에서 기술된 것과 같이, Freund 완전한 그리고 불완전한 어쥬번트에서 소의 콜라겐 유형 II의 SC 주사에 이어 이들의 무릎 관절로 동일한 단백질 단독으로 관절내 (IA) 주사함으로써 다자란 양의 면역화는 인간 RA의 전통적인 병리학적 특징을 많이 나타내는 관절증이 유도되었다.
RA의 이러한 양의 모델은 따라서 동량의 IV 염수 효과와 비교하여 0.3 x 106 세포/kg, 1.0 x 106 세포/kg 그리고 2.0 x 106 세포/kg의 용량에서 IV 투여된 MPC의 치료 효과 평가에 적합한 것으로 간주되었다. 비교를 목적으로 25 x 106 MPC 또는 염수의 단일 주사를 좌측 무릎 관절로 제공받은 IA 집단도 이 연구에 또한 포함되었다. 관절내 소의 콜라겐 유형 II (28일 차)의 관절내 주사후 14일 차에 MPCs 또는 염수가 투여되었고, 30일 후(72일차) 희생시켰다.
활액성 조직의 조직병리학적 그리고 면역조직화학 분석 결과는 양성이었다. 더욱이, 투여된 3가지 IV MPC 용량중 최대 용량의 2 백만 MPC/kg는 염수 대조군 집단과 비교하여 통계학적으로 일관된 개선을 야기하였다. 낮은 용량 MPC 집단은 연구된 매개변수중 일부에서 양성 효과를 보였지만, 처리된 중간 용량 MPC는 혼합형 반응을 나타내었다. 본 연구에서 명백한 용량 반응 상관관계에 대한 이유는 전체적으로 명확하지는 않지만, 각 집단에 이용된 소수의 동물과 관련있을 수 있고, 대조군 집단의 많은 매개변수에서 관찰된 높은 표준 편차로 예시화된 것과 같이 집단내 질환 발병의 강도에서 이형성과 관련있을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 염수 대조군과 비교하여 높은 용량 MPC 집단으로부터 좌측 무릎 관절의 활액성 막에서 관찰된 조직병리학적 득점의 통계학적으로 유의적인 감소(도 8C)는 IL-6, TNF-알파 (도 4D)에 대한 활막세포(맥관내막)에 대한 감소된 면역조직화학 득점과 CD14 세포 (도 10E) 그리고 IL-17 (도 10F)에 대한 간질적 조직 착색에 의해 뒷받침된다.
만성 RA의 양의 모델을 이용한 본 연구의 결과들은 0.3 - 2.0 백만 MPC/kg 사이에 단일 IV 주사는 관절염의 주요 조직병리학적 지수, 즉, 활액성 과형성, 기질 조직 활성화 그리고 염증성 세포 침윤의 감소에 효과적이라는 것을 확인시켰다. 더욱이 냉동된 단면의 면역조직화학 착색을 이용한, IL-6, TNF-알파, IL-17 그리고 CD14+ 세포의 수준은 염수 대조군과 비교하여 높은 PMPC 용량을 제공받은 동물에서 상당히 감소되었다는 설명은 우리 작업의 가설을 뒷받침한다. IL-17은 생체내에서 단핵구 이동을 유도하고(Shahrara et al . (2009) Journal of Immunology 182: 3884-3891) 이는 이 사이토킨이 RA 환자의 관절로 단핵구의 모집을 담당한다는 것을 제안한다. 이러한 관점은 활액성 간질(interstitium)에서 IL-17의 수준 감소에 의해, 주사된 MPC는 뼈 골수로부터 염증이 있는 관절로 이동하는 단핵구의 수를 간접적으로 감소시키고, 이로 인하여 증식성 맥관내막의 활막세포에 의해 생산된 전-염증성 사이토킨, 이를 테면 IL-6 그리고 TNF-알파의 수준을 제한한다는 우리의 가설과 일치된다.
더욱이, 연골 그리고 활막에서 발현되는 "통상적인" 염증성 사이토킨은 인터루킨-1β (IL-1 β), 종양 괴사 인자 알파 (TNFα), IL-6, IL-8, IL-17 그리고 가용성 CD14 (Liu-Bryan and Terkeltaub Arthritis and Rheumatism, 64: 2055-2058, 2012)를 포함하는 골관절염에서 역할을 한다고 제안되었다. 따라서, 본 명세서에서 제시된 데이터는 골관절염을 치료하기 위하여 MPC의 투여(가령, 정맥내)를 위한 역할을 뒷받침한다.
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Claims (24)
- STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 그로부터 유래된 가용성 인자, 또는 이들의 임의의 조합이 농축된 치료학적으로 유효한 양의 세포 집단을 포함하고, 상기 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 그로부터 유래된 가용성 인자, 또는 이들의 임의의 조합이 농축된 세포 집단을 전신으로 투여하는 것인, 대상에서 류마티즘성 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 류마티즘성 질환은 류마티즘성 관절염, 스틸 질환(Still's disease), 강직성 척수염, 라이터 질환(Reiter's disease), 건선 관절염, 장의 관절염(enteric arthritis), 천골장골관절염(sacroiliitis), 척추염, 및 골관절염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 류마티즘성 질환은 류마티즘성 관절염인 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상은 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 그로부터 유래된 가용성 인자, 또는 이들의 임의의 조합이 농축된 세포 집단의 투여 전에 메토트렉세이트 치료를 받는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, STRO-1밝음 다능성 세포, 그의 후손, 그로부터 유래된 가용성 인자, 또는 이들의 임의의 조합이 농축된 세포 집단을 포함하는 것인 약학 조성물.
- 삭제
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 그로부터 유래된 가용성 인자, 또는 이들의 임의의 조합을 대상의 관절에서 IL-6, TNFα, IL-17, CD14+ 세포, 및 이들의 임의의 조합 중 하나 이상의 수준을 감소시키는데 충분한 양으로 투여하는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, kg당 0.1 x 106 내지 5 x 106 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 또는 이들의 임의의 조합을 투여하는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 또는 이들의 임의의 조합을 kg 당 0.3 x 106 내지 2 x 106 세포를 투여하는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 낮은 용량의 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 또는 이들의 임의의 조합을 투여하는 것인 약학 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 낮은 용량의 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 또는 이들의 임의의 조합은 kg당 0.1 x 105 내지 0.5 x 106 STRO-1+ 다능성 세포를 포함하는 것인 약학 조성물.
- 청구항 11에 있어서, 상기 낮은 용량의 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 또는 이들의 임의의 조합은 kg당 0.3 x 106 세포를 포함하는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 높은 용량의 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 또는 이들의 임의의 조합을 투여하는 것인 약학 조성물.
- 청구항 13에 있어서, 상기 높은 용량의 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 또는 이들의 임의의 조합은 kg 당 1.5 x 106 내지 2 x 106 STRO-1+ 다능성 세포를 포함하는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 또는 이들의 임의의 조합의 용량은 1억개의 세포 내지 3억개의 세포의 용량을 포함하는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 그로부터 유래된 가용성 인자, 또는 이들의 임의의 조합이 농축된 집단은 주당 1회 또는 그보다 덜 빈번하게 투여하는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 그로부터 유래된 가용성 인자, 또는 이들의 임의의 조합이 농축된 집단은 4주당 1회 또는 그보다 덜 빈번하게 투여하는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 그로부터 유래된 가용성 인자, 또는 이들의 임의의 조합이 농축된 집단은 동맥내로, 대동맥, 심장의 심방 또는 심실 또는 정맥으로 투여하는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 또는 이들의 임의의 조합이 농축된 집단은 자가(autogeneic) 또는 동종이계(allogeneic)이며, 가용성 인자들은 자가 또는 동종이계 세포들로부터 유래될 수 있는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 또는 이들의 임의의 조합이 농축된 집단은 투여에 앞서 또는 가용성 인자들의 획득에 앞서 배양 확장(culture expand)되는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STRO-1+ 다능성 세포에 대해 농축된 집단은 STRO-1밝음 이거나, 조직 비-특이적 알칼리 포스파타제 (TNAP)를 발현하거나, 상기 후손 세포 또는 가용성 인자들이 STRO-1밝음 이거나 TNAP를 발현하는 STRO-1+ 다능성 세포로부터 유래되는 것인 약학 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 운반체, 부형제, 또는 이들의 임의의 조합을 더 포함하는 것인 약학 조성물.
- 대상에서 류마티즘성 질환의 치료 또는 예방에 전신투여에 의해 사용하기 위한 STRO-1+ 다능성 세포, 그의 후손, 그로부터 유래된 가용성 인자, 또는 이들의 임의의 조합이 농축된 세포 집단.
- 삭제
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