CN102144028B - 造血前体的扩增 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种向有需要的对象移植造血前体细胞的方法，其包括在存在富集STRO‑1bright细胞的细胞群的条件下培养造血前体细胞。本发明的所述方法可用于血液疾病的治疗。

Description

造血前体的扩增
发明领域
本发明涉及一种向有需要的对象移植造血前体细胞的方法，其包括在存在富集STRO-1bright细胞的细胞群的条件下培养造血前体细胞。本发明的所述方法可用于治疗血液疾病。
发明背景
十多年来，对于缺乏HLA-匹配骨髓供体的患者的同种异基因移植，脐带血(CB)已被作为造血祖细胞的可选择来源进行临床研究。相较于骨髓，在CB中较少的T-细胞和/或更少发育的T-细胞，使得存在CB移植将会产生更少的移植物抗宿主病(GVHD)的可能性，该病是在同种异基因移植环境中发病率和死亡率的主要原因。考虑到相较于从活着的供体收集骨髓或外周血祖细胞(PBPC)，在胎盘的处理之前从胎盘的静脉收集CB的可用性和方便，其他潜在的优势包括显著增加可提供的同种异基因移植物数量和增加因此可能被移植的患者数量的能力。这个造血祖细胞的新来源允许CB库靶向收集带有例如少数非洲裔美国人和西班牙人群的人白细胞抗原(HLA)类型的个体，它们在国家骨髓捐赠项目库中的代表人数缺乏。
自从1988年第一个CB移植完成，世界范围内超过5000个患者因为种种恶性或非恶性疾病而接受相关或非相关的CB移植。大多数CB接受者是儿童，不过当HLA-匹配供体不可用时成年人正越来越多地接受CB移植。报告的无进展生存率到目前为止与按照同种异基因骨髓移植获得的结果相当(Barker JN et al.，(2001))。而且，与骨髓移植相关的GVHD相比，许多报告显示CB移植看起来更少GVHD，尽管使用CB移植具有比骨髓或PBPC同种异基因移植的接受者中耐受的实质上更多的供体-受体HLA差异。CB的主要缺点是低的细胞剂量，当与骨髓移植相比时，它导致植入的时间更慢和更高比率的植入失败(Kernan NA et al.，(1993))。在由Kurtzberg(Kurtzberg J.，(1996))、Gluckman(Gluckman et al.，(1997))、Rubinstein(Rubinstein P.，(1998))、Rizzieri(Rizzieri DA et al.，(2001))和Laughlin(Laughlin MJ et al.，(2001))公开的CB移植的研究中，到嗜中性粒细胞绝对计数值(ANC)≥0.5×109/L的中位时间范围为22至34天。到不输血(transfusion-independent)血小板计数≥20×109/L的中位时间为56天到超过100天，有12-18％的植入失败率。然而，在那些系列内成年患者(＞18岁和/或＞45Kg)的植入失败率基本上更高，为10-62％。这些更大、成年的患者，其从CB祖细胞的离体扩增可能获益最多。
从在上面引用的研究中，注入的未操作CB的总有核细胞(TNC)剂量和植入时间中似乎存在一种阈值效应。在Gluckman的研究中，在接受≥3.7×107TNC/Kg的患者中植入和存活较好。这个大细胞剂量对于体重超过45kg的患者一般不可用。对于成年患者，看起来≥1.0×107TNC/Kg的接受者比较低细胞剂量的接受者有更有利的植入。Kurtzberg等报告了在非相关CB移植环境中CB有核细胞注入的数量与嗜中性粒细胞植入时间之间的线性相关(p＜0.002)。这些数据暗示供给更多的CB细胞可以导致更快的嗜中性粒细胞植入。
发明概述
本发明人已经开发了一种用于通过与富集STRO-1bright细胞的细胞群或其子代共培养来扩增造血祖细胞(HPC)的方法。扩增的HPC可以用于移植到有需要的对象中，如患有血液疾病的个体。
因此，本发明提供一种移植造血前体细胞到有需要的对象中的方法，该方法包括：
在存在富集STRO-1bright细胞的细胞群或从此衍生的上清液或子代的条件下培养造血前体细胞，其中这样的STRO-1bright细胞是间充质前体细胞(MPC)，其包含能产生成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)的间充质前体细胞，以扩增该造血前体细胞；和
把该扩增的造血前体细胞施用于对象。
在本发明的一个实施方案中，富集STRO-1bright细胞的细胞群是同种异基因细胞。
在另一个实施方案中，在起始培养后使富集STRO-1bright的细胞生长大约4天至＞70％汇合，用于脐带血共培养。
在另一个实施方案中，在共同培养开始时富集STRO-1bright的细胞与造血前体细胞的比率为大约1∶4，大约1∶5，大约1∶6，大约1∶7，大约1∶8，大约1∶9或大约1∶10。
富集STRO-1bright的细胞可能来源于任何合适的组织来源。合适的组织来源的例子包括骨髓、血、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾、胰、脑、肾、肝、心、视网膜、大脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、腱、骨骼肌、真皮和骨膜。
在另一个实施方案中，造血前体细胞来源于脐带血。在扩增之前造血前体细胞可以或可以不从脐带血分离。因此，在一个实施方案中该方法包括共同培养未操作的脐带血细胞与富集STRO-1bright细胞的细胞群或其子代。
在本发明的另一个实施方案中扩增的造血前体细胞包括CFU-GM细胞。扩增的造血前体细胞可能包括至少1×104CFU-GM细胞每kg对象体重。
在本发明的另一个实施方案中，在施用扩增的造血前体细胞之后，对象发生造血重建。例如，对象的造血重建可能发生在施用扩增的造血前体细胞后的30天内，更优选在25天内，更优选在20天内，更优选在15天内和更优选在10天内。
还有另一个实施方案，在不存在不利免疫反应的情况下发生造血重建。在这个实施方案中，施用扩增的造血前体细胞不导致显著的移植排斥。
可通过许多合适的测量中的任何一种确定造血重建。例如，可通过嗜中性粒细胞植入、血小板植入、淋巴植入、红系细胞植入和/或巨核细胞植入确定造血重建。
本发明的方法还可以包括给对象施用增强造血前体细胞分化成特定造血谱系细胞的一种或多种因子。增强分化的因子可以与扩增的造血前体细胞同时施用，或在施用扩增的造血前体细胞之后独立施用。
由分化产生的造血谱系细胞可能是，例如，B-细胞、T-细胞、树突细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、粒细胞、红细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、血小板、骨髓细胞、脾细胞、真皮细胞或基质细胞。
增强分化的因子可能是，例如，干细胞因子(SCF)、GM-SCF、M-CSF、G-CSF、MGDF、EPO、FLT3-配体、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-11、TNFα或血小板形成素。
扩增的造血前体细胞的移植可能与共培养的MPC或其子代一起实施，和/或与来源于共同培养的MPC或其子代的上清液或一种或多种可溶因子一起实施。
在一个实施方案中，当与施用未进行离体扩增的造血前体细胞相比时，施用根据本发明方法的扩增的造血前体细胞导致移植物抗宿主病的降低的风险。在另一个实施方案中，当与施用通过本发明以外的其他方法扩增的造血前体细胞相比时，施用根据本发明方法扩增的造血前体细胞导致移植物抗宿主病的降低的风险。
应当理解本发明的方法可用于治疗一系列血液疾病。
例如，本发明的方法可用于治疗血小板数目和/或功能疾病，如血小板减少、特发性血小板减少性紫癜(ITP)或与病毒感染、药物滥用或恶性肿瘤有关的疾病。
在另一个实施例中，本发明的方法可用于治疗红细胞数目和/或功能疾病，例如贫血。可被治疗的贫血的例子包括再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、失血性贫血、Cooley’s贫血、Diamond-Blackfan贫血、范可尼贫血、叶酸(folic acid)缺乏性贫血、溶血性贫血、缺铁性贫血、恶性贫血、镰刀细胞贫血、地中海贫血或真性红细胞增多症。
在另一个实施例中，本发明的方法可用于治疗淋巴细胞数目和/或功能的疾病，例如由T-细胞或B-细胞缺乏引起的疾病。淋巴细胞数目和/或功能疾病的例子是AIDS、白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkins lumphoma)、慢性感染例如粟粒性结核病、病毒感染、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、或遗传疾病例如血丙种球蛋白缺乏症、DiGeorge异常、Wiskott-Aldrich综合症、或共济失调毛细血管扩张。
在另一个实施例中，本发明的方法可用于治疗多系骨髓造血功能衰竭的疾病，其可能是放射线疗法或化学疗法或者恶性置换(malignant replacement)的结果。例如，所述疾病可能是骨髓纤维化、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL))、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金病(HD)、多发性骨髓瘤(MM)、或散播到骨骼的继发恶性肿瘤。
本发明适用于各种动物。例如，对象可以是哺乳动物如人、狗、猫、马、母牛或羊。在一个实施方案中对象是人。
在整个说明书中词语“包括”(comprise)，或如“包括”(comprises)或“包括”(comprising)的变化，将被理解为意指包括规定的元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的集合，但不是排除任何其他元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的集合。
发明的优选实施方案的详细描述
本发明提供了通过与间充质前体细胞(MPC)共培养离体扩增源自HPC的脐带血的方法。这样扩增的HPC可用于治疗如造血恶性肿瘤的疾病，和用于同种异基因细胞治疗中促进骨髓的再生。
如本文所用，术语“扩增(expanding)”或者“扩增(expansion)”指细胞增殖的过程。经历扩增的细胞保持它们的细胞更新特性。
因此本发明提供一种移植造血前体细胞到有需要的对象中的方法，这种方法包括：
在存在富集STRO-1bright细胞的细胞群或从此衍生的上清液或子代的条件下培养造血前体细胞，其中这样的STRO-1bright细胞是间充质前体细胞(MPC)，其包含能产生成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)的间充质前体细胞，以扩增该造血前体细胞；和
把该扩增的造血前体细胞施用于对象。
术语“上清液”指包含间充质前体细胞和/或其子代细胞在合适的培养基中，优选在液体培养基中离体培养后产生的一种或多种可溶因子的非细胞物质。通常，通过在合适的条件和时间下在培养基中培养细胞，随后通过一个如离心的过程除去细胞材料来产生上清液。在施用之前上清液可以或可以不进行更进一步的纯化步骤。在一个优选实施方案中，上清液包含少于105细胞，更优选少于104细胞，更优选少于103细胞以及甚至更优选没有活细胞。
术语“一种或多种可溶因子”指在培养期间，由MPC和/或其子代细胞所分泌的分子，通常是蛋白质。
本发明的一个实施方案中富集STRO-1bright细胞的细胞群是同种异基因细胞。同种异基因细胞可以从与对象有相近HLA匹配的个体中获得。本发明的一个优势是，同种异基因细胞可被商业上大批生产作为在造血前体细胞的离体扩增中的“现货供应”使用。
“现货供应”来源提供了优于源自家庭成员的STRO-1bright细胞的主要潜在优势。首先，细胞可以被制成适用于立即使用，不需要冗长的处理或没有在培养期间污染的可能性。来自年轻、健康志愿者的主细胞库的开发，提供了一种绕过疾病相关的干细胞功能降低的方法，其提供了用于脐带血共培养的STRO-1bright细胞的最佳来源。最后，选择和分离程序的标准化提供一种非常能够再生产的产品。
本发明的方法的另一优点是，相较于从来自骨髓供体的MPC的从头生成的以前的方法，可以相当更迅速的获得用于与脐带血细胞共培养的足够数量的STRO-1bright富集的细胞。这使得移植之前处于脆弱的症状缓解中的患者能更快的被治疗，并因此降低复发的可能。
造血前体细胞可来源于任何合适的来源，其中之一是脐带血。没有必要在扩增之前分离造血前体细胞。因此，本发明的方法可能包括共培养脐带血和富集STRO-1bright细胞的细胞群或其衍生的上清液或子代。这一实施方案的优点是，它消除对于在扩增之前从脐带血分离CD34+或CD133+细胞的需要，因此使造血前体细胞的操作和损失减到最小。
共同施用分化因子可促进移植物植入，所述分化因子例如干细胞因子(SCF)、GM-SCF、M-CSF、G-CSF、MGDF、EPO、FLT3-配体、IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-11、TNFα或血小板形成素。可在施用HPC时和/或在施用HPC之后以规律的间隔施用分化因子。
由分化产生的造血谱系细胞可以是，例如，B-细胞、T-细胞、树突细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、粒细胞、红细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、血小板、骨髓细胞、脾细胞、真皮细胞或基质细胞。
因此，本发明的方法也扩展到一种或多种分化因子的任选使用，用于促进注入扩增的HPC之后的造血重建。
富集STRO-1bright细胞的细胞
在本发明方法的一个实施方案中涉及造血前体细胞与富集STRO-1bright细胞的细胞群的共同培养，其中这样的STRO-1bright细胞是间充质前体细胞(MPC)，其包含能产生成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)的间充质前体细胞。
MPC是能形成大量多能细胞集落的非造血祖细胞。在WO 01/04268中详细描述了成人MPC的富集，其全部内容通过引用并入本文。根据本发明的术语“MPC”也被理解为包括如WO 2006/032092中所定义的多能扩增的MPC子代(MEMP)。
间充质前体细胞(MPC)细胞是在骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾、胰、脑、肾、肝、心、视网膜、大脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、腱、骨骼肌、真皮和骨膜中发现的细胞；并且能分化成不同的生殖系如中胚层、内胚层和外胚层。因此，MPC能分化成许多细胞类型包括但不限于，脂肪、骨、软骨、弹性组织、肌肉和纤维结缔组织。这些细胞进入的特定的谱系路线和分化途径依赖于各种的来自机械的影响和/或内源生物活性因子的影响，例如生长因子、细胞因子和/或宿主组织建立的局部微环境条件。间充质前体细胞是非造血祖细胞，其分裂产生子细胞，该子细胞是干细胞或是前体细胞，前体细胞将适时地不可逆分化产生表型细胞。
在一个实施方案中，本发明中使用的STRO-1+细胞也是TNAP+、STRO-3+(TNSAP)、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、CD45+、CD146+、3G5+或其任何组合。例如，STRO-1bright细胞可能又是VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-3+(TNSAP)和/或CD146+中的一种或多种。
在一个实施方案中，间充质前体细胞是如WO 2004/85630里所定义的血管周间充质前体细胞。
如果细胞是给定的标记的低(lo或dim)或高(明亮的(bright)，bri)的表达子(取决于该标记在细胞表面上呈现的程度)，所述细胞对于给定的标记是“阳性”，其中该术语涉及荧光强度或其他在细胞颜色分类过程中使用的颜色。lo(或dim或dull)和bri的区别将在被分类的特定细胞群中使用的标记的上下文中理解。
术语“明亮的”，在此使用时，指细胞表面上的一个标记，当被可检测标记时，该标记产生一个相对高的信号。当不希望受理论限制时，建议“明亮的”细胞表达更多的靶标记抗原。例如，当用FITC-共轭的STRO-1抗体标记，由FACS分析测定时，STRO-1bri细胞产生与非明亮的细胞(STRO-1dull/dim)相比更强的荧光信号。在另一个实例中，STRO-1bright细胞相对于同种型匹配的阴性对照有STRO-1表面表达的2个对数级的更高表达。比较起来，STRO-1dim和/或STRO-1intermediate细胞相对于同种型匹配的阴性对照具有STRO-1表面表达的少于2个对数级的更高表达，一般为大约1个对数级或更少的更高表达。
相对于STRO-1dim和/或STRO-1intermedite细胞，用于本发明的细胞群优选富集STRO-1+细胞。
当在此使用时，术语“TNAP”旨在包含组织非特异性碱性磷酸酶的全部同种型。例如，该术语包括肝同种型(LAP)，骨同种型(BAP)和肾同种型(KAP)。在一个优选实施方案中，TNAP是BAP。在一个特别优选的实施方案中，这里使用的TNAP指能结合由杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子，该杂交瘤细胞系于2005年12月19日依据布达佩斯条约的规定以保藏号PTA-7282在ATCC保藏。
优选地，相当多比例的MPC能分化成至少两种不同的种系。多能细胞可能被诱导成的谱系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞，其对于胆汁导管上皮细胞和肝细胞是多能的；神经限制细胞，其能产生神经胶质细胞前体，然后发展为少突神经胶质细胞和星形细胞；发展为神经元的神经元前体；心肌和心肌细胞的前体，葡萄糖敏感的胰岛素分泌胰的β细胞系。其他谱系包括，但不局限于，成牙质细胞，产牙质细胞和软骨细胞，和以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞如角质化细胞、树突状细胞、毛囊细胞、肾的导管上皮细胞、平滑和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质、神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞。
在另一个实施方案中，刚培养时，MPC不能产生造血细胞。
本发明也涉及使用从MPC和/或其子代细胞(后者也被称为扩增的细胞)获得的上清液或可溶因子，其由新鲜分离的MPC在体外培养产生。本发明的扩增细胞可以有多种表型，这取决于培养条件(包括培养基中刺激因子的数目和/或类型)、传代数目等等。在某些实施方案中，子代细胞是来自亲本群体的大约2次、大约3次、大约4次、大约5次、大约6次、大约7次、大约8次、大约9次或大约10次传代之后而获得的。不过，子代细胞可能是从亲本群体的任何传代次数之后而获得的。
子代细胞可通过在任何合适的培养基里培养获得。术语“培养基”，用于指细胞培养时，包括围绕细胞的环境的组分。优选地，用于本发明的共培养方法的培养基是液体培养基。
优选地，培养基补充一种或多种生长因子或细胞因子，其支持HPC的扩增。优选地，细胞因子是早期作用细胞因子，例如，但不限于重组metHu干细胞因子(SCF)、flt-3配体(FLT3)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、α-肿瘤坏死因子和血小板形成素。
延迟作用的细胞因子也能被使用。这些细胞因子包括例如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素(EPO)、LIF和巨噬细胞生长因子(M-CSF)。
WO 2006/032092中限定了多能扩增的MPC子代(MEMP)。用于制备从其衍生子代的MPC的富集群体的方法在WO 01/04268和WO 2004/085630中描述。在体外环境中MPC很少以绝对纯的制剂存在，并且一般与其他组织特异性定型细胞(TSCC)一起存在。WO 01/04268涉及在高达大约90％纯度的水平上从骨髓收获这样的细胞。包括从其衍生子代的MPC的群体可直接从组织来源收获，从主细胞库获得，或作为选择的，它可以是已被离体扩增的群体。
例如，子代可从已收获的、未扩增的、基本上纯化的MPC的群体中获得，包括它们存在的群体中至少大约0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或95％的总细胞。这个水平可能被取得，例如，通过选择对于选自TNAP、STRO-1bright、3G5+、VCAM-1、THY-1、CD146和STRO-2的至少一种标记是阳性的细胞。
MPC起始群体可来源于WO 01/04268或WO 2004/085630中所述的任何一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或者也许更宽泛的来自脂肪组织、牙齿，牙髓、皮肤、肝、肾、心、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰、骨、韧带、骨髓、腱和骨骼肌。
MEMP可以区别于新鲜收获的MPC，因为它们对于STRO-1bri标记是阳性的，对于碱性磷酸酶(ALP)标记是阴性的。在一个本发明的优选实施方案中，至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞具有STRO-1bri、ALP-表型。在另外一个优选的实施方案中，MEMP对于Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3，α3β1标记中的一种或多种是阳性的。在另外一个更优选的实施方案中，MEMP不表现出TERT活性和/或对于CD18标记是阴性的。
一旦合适的MPC群体被获得，它可通过任何合适的手段进行培养或扩增而获得MEMP。
在本发明的一个优选实施方案中，MPC从源自年轻健康的志愿者的骨髓中富集的MPC的主细胞库获得。源自这种来源的MPC的使用对没有一名合适的家庭成员能作为其MPC供体的对象特别有利。而且，其他对象，尤其患有急性的白血病的那些对象，在移植之前的脆弱的症状缓解过程中和在产生MPC和然后进行共培养的冗长的时间内处于复发的高风险。“现货供应”的来源提供了优于源自家庭成员的MPC的主要潜在优势，因为细胞可用于立即使用而不需要冗长的处理或没有在培养期间污染的可能性。主细胞库的开发提供了一种绕过疾病相关的干细胞功能降低的方法，其提供了用于脐带血共培养的MPC的最佳来源。
申请人已经开发了一种现货供应的离体扩增的同种异基因MPC产品用于慢性局部缺血的心血管疾病的治疗，称为“间充质前体细胞”或RevascorTM。骨髓细胞从健康人类供体的髂后嵴中采集。使用STRO-3(TNSAP)单克隆抗体免疫筛选单核细胞以进行基质富集(Simmons PJ et al，(1991))，随后扩增，以及低温保藏而产生细胞库。浓缩间充质细胞前体的免疫筛选的骨髓单核细胞的扩增产生了具有规定纯度，表达间充质前体特异性标记并具有有效生物学活性的产品。而且，通过本申请人和其他人的工作确认在各种临床前和临床的同种异基因环境下它们的同种异基因MPC的免疫学耐受性。
由于申请人的商购来源的MPC不表达HLA-II(DR)，因此它们是非免疫原性的，并且提供一种用于本发明的理想的MPC来源。
脐带血
可以通过，例如，但是非限制性的，排泄、重力引起的流出、按摩、挤压、抽吸等等获得脐带血的放血。在一个优选的实施方案中，通过注射器的使用实现脐带的放血，注射器可以包括或可以不包括抗凝血剂。
用于本发明的方法中的脐带血可以通过一个商业的来源获得，例如LifeBank USA(Cedar Knolls，NJ)、ViaCord(Boston MA)、Cord Blood Registry(San Bruno，CA)和Cryocell(Clearwater，FL)。
用于收获脐带血细胞的方法是本领域公知的。这样的方法的例子也描述于专利文献中，包括，例如，题目为“脐带血收集”的US 5916202和题目为“脐带血和胎盘收集试剂盒”的US 7147626。
在一个实施方案中，脐带血与对象的4、5或6/6 HLA I(血清学)和II(分子)类抗原匹配。在另一个实施方案中，每个对象使用至少两个脐带血单位。脐带血单位可在使用之前被低温冷冻或从脐带中收集后立刻使用。
在培养之前，脐带血细胞可富集CD34+祖细胞，或它们可基于CD133标记的表达而富集祖细胞。
在一个实施方案中，脐带血细胞在添加到MPC之前没有被操作，。
在另一个实施方案中，脐带血细胞被添加到预建立的MPC或MEMP的汇合单层细胞中。
在另一个实施方案中，脐带血单位在合适的离体扩增培养基中共培养大约14天。用于共培养的扩增培养基可以包括胎牛血清、谷氨酰胺和合适的生长因子。
在本发明的一个实施方案中，用于治疗对象的扩增的HPC的数量在从≥1.0×107TNC/kg到≥4.0×107TNC/kg的范围中。
共培养条件
在本发明的一个实施方案中，造血前体细胞，或没有操作的脐带血细胞，被添加到已建立的粘附MPC细胞培养物中。可以培养该MPC到汇合，再铺板和再培养以提供一个滋养层，添加脐带血细胞到该滋养层用于共培养。
本发明的实施方案的一个优点是，从单个低温保藏的小瓶(含有在低温保藏的≥1.5×107细胞/ml)起始MPC之后大约4天内，可获得足够数目的汇合粘附同种异基因MPC用于共培养。根据本发明的MPC的足够数目是，其中存在足够的细胞以在12×T-150cm2组织培养烧瓶中达到＞70％汇合(每个对象)。这比从骨髓供体重新产生MPC的现有技术的方法要快得多，其通常花费大约4周。
在本发明的一个实施方案中，脐带血细胞在包含胎牛血清、谷氨酰胺、G-CSF、SCF、FLT3-配体和血小板形成素的离体扩增培养基中与MPC共培养。
细胞可共培养大约14天。
将HPC施用于对象
根据本发明的所述方法，离体扩增的HPC(其还可以包括或可以不包括共培养的MPC或MEMP)被移植到患有血液恶性肿瘤的对象。在一个优选实施方案中，所述对象是人。
细胞的施用模式包括，但不限于，全身静脉注射。通过任何适宜途径施用细胞制剂，例如通过注入或推注注射以及通过和其他生物学活性剂一起施用。
在一些实施方案中，可以实施用于减少HPC的移植排斥和/或与移植物抗宿主疾病的疗法，特别在同种异基因MPC也被提供给对象的情况下。这样的疗法在现有技术中是已知的。参见，例如Slavin S等，J Clin Immunol.2002 22：64。通常GVHD预防剂包括抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、霉酚酸酯(mycophenalate mofetil(MMF))和他克莫司。
应当理解HPC能与培养基上清液或源自从培养基分离的共培养MPC的一种或多种因子一起提供，以及以药学上可接受的载体施用。因此，本发明的细胞群能以药学上可接受的载体或稀释剂施用，如无菌盐水和水缓冲溶液。这样的载体和稀释剂的使用是本领域公知的。
在一个实例中，扩增的HPC单独与共培养的MPC或MEMP一起提供。在另一个实施例中，提供HPC，而没有MPC或MEMP。用于间充质细胞和造血细胞的分离方法是本领域公知的，而且包括，但不限于，通过色谱法的亲和分离(根据间充质细胞和造血细胞上存在的标记)、批量分离和/或流式细胞仪(FACS)。
MPC、MEMP或从此衍生的上清液能在施用HPC之前、同时或之后施用。
造血重建
在本发明的一个实施方案中，在施用扩增的造血前体细胞之后对象发生造血重建。例如，可在施用扩增的造血前体细胞的30天内，更优选在25天内，更优选在20天内，更优选在15天内和更优选在10天内对象发生造血重建。
可通过许多合适的测量中的任何一种确定造血重建。例如，一旦以下的一种或多种发生：嗜中性粒细胞植入、血小板植入、淋巴植入、白细胞植入、红细胞植入、红系细胞植入和/或巨核细胞植入，就认为造血重建已经发生。
嗜中性粒细胞植入
嗜中性粒细胞植入被定义为持续绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)，其连续3天大于或等于0.5×109/L。
血小板植入
血小板植入被定义为连续3天中没有支撑的血小板计数大于50×109/L的第一天。
白细胞植入
白细胞植入被定义为连续3天中多形核白细胞(PMN)绝对值大于50×109/L的第一天。
红细胞(RBC)植入
可通过使用HbF的测量和观察血涂片上的F细胞记录红细胞(RBC)植入。例如，红细胞植入可能当HbF是大约3.6％和F细胞是大约7-8％时已经发生。
根据以下非限制的实施例，本发明现在将被更详细描述。
实施例
实施例1“现货供应”同种异基因MPC和自体MSC的比较
对从骨髓重新产生的MSC共培养的脐带血(CB)和与申请人“现货供应”MPC共培养的脐带血比较(Robinson et al，2007)。
MSC是如下所述从骨髓重新产生的。大约80-100ml的骨髓被抽吸到无菌、含有肝素的注射器内，并带到MDACC细胞治疗实验室中用于产生MSC。用聚蔗糖-泛影葡胺(hypaque)来分离骨髓单核细胞，并且将其放入每瓶有50ml MSC扩增培养基的两个T175烧瓶中，该培养基包括含有庆大霉素、谷氨酰胺(2mM)和20％的(v/v)胎牛血清(FBS)(Hyclone)的α改良的MEM(αMEM)。
细胞在37℃、5％的CO2中培养2-3天，期间非粘附的细胞将被除去；剩下的粘附细胞将被连续培养直到该细胞的汇合程度达到70％或更高(7-10天)，然后该细胞将被胰蛋白酶化并且被重新放到有MSC扩增培养基(每只烧瓶50毫升培养基)的6个T175烧瓶中。细胞在37℃、5％的CO2中再培养一周。在第14天(+/-5天)这6瓶中有70％或更高汇合程度的MSC被再次分到12个烧瓶中，并在MSC扩增培养基中如上所述又培养三周。该MSC单层，这时将有＞70％的汇合程度，然后准备用于应该在化学疗法的第-14天起始的CB扩增。如果MSC在第-14天之前准备好，该MSC单层通过每周更换一次MSC培养基进行保持，直到准备使用。
两个冷冻的脐带血单位被解冻、清洗并与来自每个来源(MSC或MPC)的粘附单层共培养14天，使用生长因子SCF，FLT3-配体，G-CSF和TPO。如表1中所示，同种异基因MPC在扩增脐带血CD34祖细胞中比同种异基因MSC表现更好。
表1
实施例2产生足够数量的“现货供应”MPC用于脐带血共培养的时间
一个含有冷冻的人间充质前体细胞的小瓶(Lot No.25126787，＞1.5×107细胞/ml)被解冻，并且2.03×106细胞被回收到补充有抗生素(青霉素和链霉素)、谷氨酰胺和10％(v/v)胎牛血清(FBS)的360ml的αMEM培养基中。然后细胞悬浮液被分装到12×T-150cm2组织培养瓶中(每个T-150cm2组织培养瓶有大约1.7×106细胞)。使用倒置相差显微镜监控培养。在培养开始之后的4到5天，MPC有＞70％的汇合程度，并且可用于脐带血单核细胞(MNC)共培养扩增。因此，所培养的MPC在培养开始之后的4天充分汇合是可能的。这表明单瓶的现货供应的MPC足以在培养的3-5天之后产生足够数目的细胞用于脐带血共培养。这表示从骨髓抽出物获得用于共培养的足够汇合MPC数目所需扩增培养的大约4周的时间显著减少。
实施例3脐带血移植治疗方案
3.1双倍的脐带血移植
为了试图增加继高剂量或非骨髓清除性治疗之后注入的CB细胞的数量，研究者已组合不同HLA类型的两个单位，并将它们注入作为同种异基因造血支持物。这些研究支持这样的原则，即移植两个免疫学不同的CB单位就交叉免疫学排斥而言是安全的。没有观察到移植失败，但是多数患者仅仅植入一个单一CB单位。在现在的实验中我们将使用两个CB单位，其中一个将被离体扩增，旨在降低植入到CB移植受体中的时间，降到这种情况中一般报告的20-30天以下。
3.2用于离体扩增的生长因子
CB细胞将与这部分所描述的非常低浓度的生长因子一起培养(与全身性使用的微克浓度相反的纳克浓度)。另外，扩增的细胞在注入患者之前将被广泛的清洗。因此，他们产生任何全身性副作用是不太可能的。
合适的生长因子描述如下。
1.非格司亭[粒细胞集落刺激因子(G-CSF)]
治疗分类：重组生长因子
作用机理：G-CSF是一种人粒细胞-刺激因子，其作用于造血细胞而刺激增殖、分化和一些终端细胞功能活性。
储存和稳定性：G-CSF应该在2-8℃储存。在注射之前，非格司亭可允许达到室温，不过，留在室温下超过24小时的任何药瓶应该被丢掉。药瓶不应该被摇晃。在施用之前应该检查药瓶的沉淀或变色。如果观察到沉淀或者变色，药瓶不应使用。
施用途径：SC注射-IV注入
不相容性：没有已知的明确的不相容性。不过，可加强嗜中性粒细胞释放的药物应该谨慎使用。
获得途径：含有300mcg(1ml药瓶)和480mcg(1.6ml药瓶)的非格司亭的单剂量、无防腐剂的药瓶在市场上可买到。
副作用：在接受骨髓抑制治疗的患者中，轻度到中度骨骼疼痛是可能的。会发生一般的皮疹、脱发、发烧、血小板减少、骨质疏松、恶心、呕吐、腹泻、粘膜炎、厌食、血管炎症、和/或心律失常。脾肿大可能在高剂量的非格司亭下产生。
2.重组-metHuStem细胞因子(SCF)。
治疗分类：重组生长因子
作用机理：SCF是一种人粒细胞-刺激因子，其作用于造血细胞而刺激其增殖、分化和一些终端细胞功能活性。
制药的数据：重组甲硫氨酰基人干细胞因子(r-metHuSCF)是通过重组DNA技术在大肠杆菌中生产的重组人蛋白质。165个氨基酸、非糖基化的蛋白质含有两个分子内二硫键，以非共价连接的二聚体存在，分子量为36000d，而且不同于天然蛋白，由于其表达导致在N-末端(残基号[-1])甲硫氨酸部分的存在以及事实上该重组蛋白不被糖基化。表达r-metHuSCF的细胞在规定和控制的条件下生长于培养基中。收获细胞，其产生一种糊状物，从该糊状物提取r-metHuSCF并通过一系列专利处理和色谱步骤进行纯化。所得到的纯化的r-metHuSCF在经历过滤除菌和充填之前配制于含水的缓冲液。用于临床的r-metHuSCF的释放标准是严格的。这些标准包括通过USP兔致热原测试、鲎变形细胞测定、无菌试验和一般安全试验(Code of Federal Regulations，Title 21，Section 610.11)。核酸含量不大于1.7pg/mg蛋白质。最终产品是一种清澈的、无色、无菌的无颗粒蛋白溶液；r-metHuSCF的纯度不低于95％。纯化制品的生物学活性通过放射感受器结合和增殖测定进行评价。
储存和稳定性：重组-metHuSCF必须被储存在2-8℃。当储存在这些条件下时，在1.5mg/ml浓度的r-metHuSCF已被证明有12个月的稳定性。稳定性测试正在进行中。应当避免把材料暴露于高于或低于这个范围的极端温度。不允许r-metHuSCF冻结，并且如果内容物在运输中或在储存过程中冻结则不再使用。
副作用：不详，但有像风疹和红斑的注射部位并发症
3.血小板形成素(TPO)
治疗分类：重组生长因子
作用机理：TPO是一种人粒细胞-刺激因子，其作用于造血细胞，以及尤其是巨核细胞(megarkyocyte)祖细胞而刺激增殖、分化和一些终端细胞功能活性。
储存和稳定性：TPO应该储存在2-8℃。药瓶不应该被摇晃。在施用之前应该对药瓶进行沉淀或变色检查。如果观察到沉淀或者变色，药瓶不能被使用。
已知的副作用：血小板增多，深静脉的血栓形成，肺栓塞，血栓性静脉炎。
4.FLT3-配体(FLT3)
治疗分类：重组生长因子
作用机理：FLT3是一种人粒细胞-刺激因子，其作用于造血细胞。
储存和稳定性：FLT3应该被储存在2-8℃。在施用之前应该对药瓶进行沉淀或变色检查。如果观察到沉淀或者变色，药瓶不能被使用。
已知的副作用：血小板增多，深静脉的血栓形成，肺栓塞，血栓性静脉炎。
3.3现货供应MPC的施用。
Angioblast Revascor TM MPC用于CB共培养。单个冷冻药瓶的AngioblastRevascorTMMPC将提供足够的细胞接种入3到4个T-300cm2培养瓶。在通过解冻回收之后，以及在补充以10％胎牛血清的αMEM培养基(MPC培养基)中培养2-3天时间之后，通过胰蛋白酶化收集粘附细胞，并全部转移进12只T-150cm2培养瓶。细胞将在12只T-150cm2培养瓶中的MPC培养基中培养另外5到6天，直到获得的生长足以在有效培养表面上获得大于70％汇合程度。这时T-150cm2培养瓶将被释放用于脐带血共培养扩增方案。用这样的方式产生的培养瓶可通过每周一次的培养基更换被保持在＞70％的汇合程度，直到需要使用。产生的并含有＞70％汇合程度的MPC的12只T-150cm2培养瓶中的10只，将接受10％的解冻的、清洗过的脐带血单位。共培养将被在培养基里进行，该培养基补充有胎牛血清，以及对于源自家庭成员的MSC含有如上所述的每种100ng/ml的SCF、FLT3-L、TPO和G-CSF。
患者将住院在第-9天进行水合并在第-8天到第-2天接受指定的预备治疗方案。在第0天，未操作的CB单位将被注入，随后注入扩增的CB单位。在第0天(培养第14天)，收获来自两种培养物的细胞并洗涤用于注入。
实施例4：临床试验结果
在一个正在进行的实验中，14位患者被移植了MPC诱导的扩增的脐带血。患者的平均年龄是40岁。移植的最近结果显示在以下的表2中。
嗜中性白细胞植入的中位时间是17天(与34天的历史对照相比)。血小板植入的中位时间是38天(与128天的历史记载对照相比)。没有患者有III/IV级GVHD(与40％的历史记载对照相比)。
表3显示了目前MPC诱导的扩增的脐带血移植结果优于可选择的脐带血扩增策略。
已包括在本说明书里的文献、法令、材料、设备、文章或类似物的任何论述，其单独为了对本发明提供上下联系的目的。不将其理解成其承认任何或所有这些内容由于在本申请的每个权利要求的优先权日期之前已经存在而形成现有技术基础的部分或是本发明相关领域中的普通常识。
本领域技术人员应当理解，可以对如特定实施方案中所示的发明进行各种变化和/或修饰而不背离如广泛描述的本发明的范围。本发明的实施方案，因此，被认为在各方面是说明性的而非限制性的。
表2
表3
*Jaroseak et al.，2003
**Chan et al.，2006
***de Lima et al.，2008
****Rubinstein et al.，1998
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Claims (31)

1.一种扩增造血前体细胞的方法，所述方法包括：
在存在富集STRO-1bright细胞的细胞群或从此衍生的上清液或子代的条件下培养造血前体细胞，以获得扩增的造血前体细胞，其中所述STRO-1bright细胞是间充质前体细胞(MPC)，其包含能产生成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)的间充质前体细胞，且其中所述扩增的造血前体细胞，与施用未进行离体扩增的造血前体细胞相比，具有降低的宿主抗移植物病的风险。
2.权利要求1的方法，其中所述富集STRO-1bright细胞的细胞群是同种异基因细胞。
3.权利要求1或2的方法，其中所述扩增的造血前体细胞包含CFU-GM细胞。
4.通过权利要求1-3中任一项的方法获得的扩增的造血前体细胞在制备用于治疗患有血液疾病的对象的组合物中的用途。
5.权利要求4的用途，其中所述扩增的造血前体细胞包含CFU-GM细胞。
6.权利要求5的用途，其中所述扩增的造血前体细胞包含1×104CFU-GM细胞每kg对象体重。
7.权利要求4-6中任一项的用途，其中所述组合物还包含增强造血前体细胞向特定造血谱系细胞分化的因子。
8.权利要求4-6中任一项的用途，其中所述组合物和增强造血前体细胞向特定造血谱系细胞分化的因子组合施用。
9.权利要求7的用途，其中所述造血谱系细胞是B-细胞、T-细胞、树突细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、粒细胞、红细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、血小板、骨髓细胞、脾细胞、真皮细胞或基质细胞。
10.权利要求7的用途，其中所述增强分化的因子是干细胞因子(SCF)、GM-SCF、M-CSF、G-CSF、MGDF、EPO、FLT3-配体、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-11、TNFα或血小板形成素。
11.权利要求4的用途，其中所述组合物还包含共培养的MPC或其子代。
12.权利要求4的用途，其中所述组合物还包括来源于共培养的MPC或其子代的上清液或一种或多种可溶因子。
13.权利要求4的用途，其中所述血液疾病是血小板数目和/或功能疾病。
14.权利要求13的用途，其中所述血液疾病是血小板减少，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，或与病毒感染、药物滥用或恶性肿瘤有关的疾病。
15.权利要求4的用途，其中所述血液疾病是红细胞数目和/或功能疾病。
16.权利要求15的用途，其中所述血液疾病是贫血。
17.权利要求16的用途，其中所述贫血包括再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、失血性贫血、Cooley’s贫血、Diamond-Blackfan贫血、范可尼贫血、叶酸缺乏性贫血、溶血性贫血、缺铁性贫血、恶性贫血、镰刀细胞贫血、地中海贫血或真性红细胞增多症。
18.权利要求4的用途，其中所述血液疾病是淋巴细胞数目和/或功能疾病。
19.权利要求18的用途，其中所述疾病是由于T-细胞或B-细胞缺乏。
20.权利要求18的用途，其中所述疾病是白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性感染、病毒感染、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、或遗传疾病。
21.权利要求20的用途，其中所述慢性感染为粟粒性结核病。
22.权利要求20的用途，其中所述遗传疾病为血丙种球蛋白缺乏症、DiGeorge异常、Wiskott-Aldrich综合症、或共济失调毛细血管扩张。
23.权利要求18的用途，其中所述疾病是AIDS。
24.权利要求4的用途，其中所述血液疾病是多系骨髓造血功能衰竭疾病。
25.权利要求24的用途，其中所述血液疾病是放射疗法或化学疗法的结果。
26.权利要求24的用途，其中所述血液疾病是恶性置换的结果。
27.权利要求24的用途，其中所述血液疾病是骨髓纤维化、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金病(HD)、多发性骨髓瘤或散播到骨骼的继发恶性肿瘤。
28.权利要求4的用途，其中在施用所述组合物后，扩增的造血前体细胞能够在对象中诱导造血重建。
29.权利要求28的用途，其中在施用所述组合物后的10至30天内对象发生造血重建。
30.权利要求28或29的用途，其中在不存在不利免疫反应的情况下发生造血重建。
31.权利要求28或29的用途，其中通过嗜中性粒细胞植入、血小板植入、淋巴植入、红系细胞植入和/或巨核细胞植入确定造血重建。
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