CN101848991A - 分离的细胞群 - Google Patents

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Abstract

需要在造血干细胞移植，利用干细胞移植修复损伤组织等中能表现出出色的向组织迁移的能力和出色的附着组织的能力的细胞。因此，本申请公开了：具有出色的向组织迁移的能力和出色的附着组织的能力的细胞群；含有所述细胞体的药物；以及所述细胞的移植方法。所述细胞可用于造血干细胞移植以及使用干细胞移植修复损伤组织等。

Description

分离的细胞群
技术领域
本发明涉及具有出色的向组织迁移能力和植活能力的细胞群，含有所述细胞的药物制备物，以及所述细胞的移植方法。
背景技术
由于进行细胞疗法最主要的目的是治疗受损的组织，因此已经进行了使用造血干细胞或造血祖细胞的移植。此外，已经报道在活体的各种不同的组织和器官中存在成年组织干细胞和祖细胞，使用它们的治疗也已被尝试。
成年组织干细胞是在各种不同的活体组织中存在的干细胞。据认为，这些细胞具有自我更新能力和分化能力，有助于保持组织的稳态。干细胞增殖并维持在组织中。同时，干细胞仅具有非常有限的增殖能力，以至于干细胞分化成祖细胞，其中分化的方向是固定的，并进一步分化成具有特定功能的组织细胞。例如，造血干细胞在成年人中主要存在于骨髓组织中，并分化成造血祖细胞。通过它的进一步分化，造血干细胞成熟成为所有类型的血细胞，例如红细胞、白细胞、血小板和淋巴细胞。通过这种方式，血细胞通过造血干细胞进行的生产得以维持。
造血干细胞移植是一种治疗性方法，其中为了增加抗肿瘤效果，进行了高强度治疗(移植前治疗)，使用超过骨髓的最大耐受剂量的大量抗肿瘤药剂或全身辐射照射，这导致恶性肿瘤与患者的骨髓一起完全破坏，然后通过输入源自于同种异体供体或患者自身(自体)的事先低温保存的造血干细胞，使造血能力得到恢复。造血干细胞移植根据收集造血干细胞的方法分类为骨髓移植、外周血干细胞移植和脐带血移植，根据造血干细胞的来源进一步分类为同种异体移植和自体移植。进行移植，例如骨髓移植、脐带血移植、外周血干细胞移植等，不仅用于治疗血液肿瘤例如白血病、淋巴瘤等，而且可用于治疗严重疾病例如实体癌、自身免疫疾病等。
此外，已经尝试了通过细胞移植治疗患病组织，其中不仅使用造血干细胞和造血祖细胞，而且使用了包括间充质干细胞和血管内皮祖细胞的骨髓细胞，包含了通过粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等而从骨髓移动到外周血的各种不同干细胞和祖细胞的细胞群，脐带血衍生的干细胞和祖细胞，以及从骨髓、脂肪组织分离的间充质干细胞等。已经检查了通过向患者移植这些细胞，对许多疾病进行治疗的可能性，这些疾病例如为移植物抗宿主病(GVHD)，Crohn’s病，心肌梗塞，骨质疏松，脑梗塞，肝炎，肺炎，糖尿病，脊髓损伤，肾炎，骨折，下肢局部缺血等(参见非专利参考文献1到12)。
如上所述，根据供体细胞的不同，造血干细胞移植分类为骨髓移植、外周血移植和脐带血移植。近年来，移植、特别是脐带血移植的病例数不断增加，这是由于它具有各种不同的优点，脐带血可以容易地使用而不对其供体构成负担，因为它原本是废物，即使在组织相容性抗原匹配程度低的情况下也能够移植脐带血，并且由于制备了脐带血库，执行紧急措施也是可能的(参见非专利参考文献13)。但是，因为脐带血中细胞的数量少，脐带血移植的缺点在于它移植的目标主要是儿童，不适合于成人(参见非专利参考文献14)。此外，与骨髓移植和外周血移植相比，脐带血移植的移植结果不佳，这是因为移植后植活不足，以及血小板和嗜中性粒细胞恢复的延迟(参见非专利参考文献13和15)。对于骨髓和脐带血造血干细胞移植的临床结果来说，已知当被移植的造血干细胞(CD 34阳性细胞)的数量大时，存活率高，血小板和嗜中性粒细胞恢复快(参见非专利参考文献16到18)。因此，在移植领域中，需要保持大量的造血干细胞，并实现造血干细胞的有效植活，预计能够解决这些问题的技术和产品将改进造血干细胞的移植结果，并有助于挽救生命、降低医疗费用和提高患者的生活品质。
在成体中，造血干细胞通过在骨髓组织中重复其增殖和分化来维持造血系统。移植的造血干细胞最后经外周血通往骨髓并植入骨髓内部。这种迁移到某个组织并在其中植活的方式被称为归巢(homing)。造血干细胞与骨髓血管的相互作用，对于造血干细胞向骨髓的归巢是重要的。这种相互作用发生在造血干细胞引起滚动和附着在骨髓血管内皮细胞上的步骤中，作为这种相互作用的结果，造血干细胞通过血管内皮细胞并迁移到骨髓内部。滚动和附着由造血干细胞和骨髓血管内皮细胞上的黏附分子控制。已知E-选择蛋白和P-选择蛋白，作为在骨髓血管内皮细胞中表达的与造血干细胞的植活相关的分子，是重要的(参见非专利参考文献19)。另一方面，在造血干细胞中表达的两种或两种以上黏附分子作为糖蛋白出现。作为P-选择蛋白的配体，已知的有P-选择蛋白糖蛋白配体-1(PSGL-1)(参见非专利参考文献20到23)。作为E-选择蛋白的配体，已知的有α-4整合蛋白(参见非专利参考文献24)、CD 44(参见非专利参考文献25)和E-选择蛋白配体-1(ESL-1)(参见非专利参考文献26)。通过这些核心蛋白上的α2，3-唾液酸化和α1，3-岩藻糖基化而形成的唾液酸基路易斯X糖链，起到了选择蛋白配体的功能。
催化α1，3-岩藻糖基化的酶被称为α1，3-岩藻糖基转移酶(FT)，在人类中已经发现了6种(FT 3，FT 4，FT 5，FT 6，FT 7和FT 9)。其中，FT 4、FT 7和FT 9在血细胞中的表达已被证实。每种FT具有不同的酶反应性，通过FT 7的岩藻糖基化只形成唾液酸基路易斯(Lewis)X糖链，但是通过FT 6的岩藻糖基化，除了唾液酸基路易斯X糖链之外，还形成了路易斯X糖链。尽管路易斯X糖链表达在血细胞例如单核细胞、粒细胞等中，但是它不具有作为选择蛋白配体的功能。到目前为止，关于上面提到的6种FT的表达区域、表达控制机制、反应特异性等，还没有被足够地揭示(参见非专利参考文献27)。
已经报道了通过用FT离体处理造血干细胞和添加唾液酸基路易斯X糖链增加选择蛋白配体的量的方法。Xia等证实，当用FT 6处理细胞系时，唾液酸基路易斯X糖链增加了，与E-选择蛋白和P-选择蛋白的结合能力增加了(参见非专利参考文献28)。此外，Hindalgo等提出了一种可能性，即PSGL-1的翻译后修饰是重要的，因为脐带血衍生的CD 34阳性细胞表达PSGL-1，但是不具有与P-选择蛋白的结合能力(参见非专利参考文献29)。此外，已知用FT 6处理的脐带血衍生的CD 34阳性细胞具有增加的唾液酸基路易斯X糖链，增加的与E-选择蛋白和P-选择蛋白的结合能力，增强的骨髓血管内皮细胞和所述CD34阳性细胞在移植中的相互作用(滚动和停滞)(参见专利参考文献1)。但是，已发现所述细胞向骨髓的归巢效率没有提高。已经提出，尽管通过添加唾液酸基路易斯X糖链增加了它与血管内皮细胞的相互作用，并且通过FT 6增加了它与E-选择蛋白和P-选择蛋白的结合能力，但对归巢步骤以及其后迁移和植活到骨髓内部没有影响(参见非专利参考文献30)。另一方面，Xia等报道，在类似用FT 6处理的源自人类脐带血的单核细胞移植试验中，在移植后6周，骨髓中人类血细胞的比率增加了大约2倍(参见非专利参考文献31和专利参考文献2)。
此外，报道了通过离体FT6处理间充质干细胞添加唾液酸基路易斯X糖链来增加选择蛋白配体的量的方法。在FT6处理的间充质干细胞的移植试验中，观察到了迁移到骨髓中的间充质干细胞数量的增加(参见非专利参考文献32)。
此外，报道了通过离体FT6处理神经干细胞添加唾液酸基路易斯X糖链来增加选择蛋白配体的量的方法(参见专利文献3)。
尽管已有上述的这些报道，但关于FT的种类和特异性的差异对造血干细胞的归巢能力的影响，尚无了解。此外，对于路易斯X糖链的表达对干细胞向骨髓组织等的迁移能力和植活能力的影响，完全没有了解。此外，对于作为一种α1，3-岩藻糖基转移酶的FT 7对造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞等向组织的迁移能力和植活能力的影响，尚无了解。
专利参考文献1：WO 2005/017115
专利参考文献2：WO 2004/094619
专利参考文献3：US2008/0044383
非专利参考文献1：Saishin Igaku，Gendai Iryo no Saizensen，ExtraIssue，March，2003，Saishin Igaku Company
非专利参考文献2：Igaku no Ayumi，vol.217，No.5，2006，IshiyakuPub.Inc.
非专利参考文献3：Current Opinion in Investigational Drugs，7，473-81(2006)
非专利参考文献4：Stem Cells，24，2292-2298(2006)
非专利参考文献5：J.Cell.Physiol.，211，27-35(2007)
非专利参考文献6：Experimental Neurology，199，56-66(2006)
非专利参考文献7：Cellular and Molecular Neurology，26，1167-1180(2006)
非专利参考文献8：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103，17438-17443(2006)
非专利参考文献9：FASEB J.，19，992-994(2005)
非专利参考文献10：American Heart J，153，e1-8(2007)
非专利参考文献11：J.Clin.Invest.，114，330-338(2004)
非专利参考文献12：Proc.Am.Thorac.Soc.，5，323-327(2008)
非专利参考文献13：Blood，97，2962-2971(2001)
非专利参考文献14：N.Eng.J.Med.，339，1565-1577(1998)
非专利参考文献15：Blood，97，2957-2961(2001)
非专利参考文献16：N.Eng.J.Med.，344，1815-1822(2001)
非专利参考文献17：Blood，100，1611-1618(2002)
非专利参考文献18：British J.Haematology，124，769-776(2004)
非专利参考文献19：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，14423-14428(1998)
非专利参考文献20：J.Cell Bio1.，118，445-456(1992)
非专利参考文献21：J.Exp.Med.，191，1413-1432(2000)
非专利参考文献22：Blood，85，3466-3477(1995)
非专利参考文献23：Exp.Haematol.，24，1494-1500(1996)
非专利参考文献24：Blood，102，2060-2067(2003)
非专利参考文献25：J.Cell Biol.，153，1277-1286(2001)
非专利参考文献26：J.Biol.Chem.，276，31602-31612(2001)
非专利参考文献27：Lowe，J.B.，D.Vestweber，ed(HarwoodAcademic Publishers)，pp.143-177(1996)
非专利参考文献28：Blood，100，4485-4494(2002)
非专利参考文献29：J.Clin.Invest.，110，559-569(2002)
非专利参考文献30：Blood，105，567-575(2005)
非专利参考文献31：Blood，104，3091-3096(2004)
非专利参考文献32：Nature Medicine，14，181-187(2008)
发明内容
本发明待解决的问题
当在各种不同细胞例如造血干细胞、造血祖细胞等的移植中，可以获得移植的细胞向骨髓和损伤组织的出色迁移和植活的情况下，可以期望使用较少细胞获得治疗效果，并可以期望不仅改进治疗效果，而且解决了上面提到的问题。
本发明的目的是提供具有出色的向组织迁移能力和植活能力的细胞群，含有所述细胞群的药物制备物，以及所述细胞群的移植方法。
解决问题的手段
本发明涉及下列(1)到(49)：
(1)分离的细胞群，其中表达了唾液酸基路易斯X糖链，路易斯X糖链基本上不表达。
(2)(1)的细胞群，通过细胞分级处理获得。
(3)(1)或(2)的细胞群，通过在存在岩藻糖供体的情况下用α1，3-岩藻糖基转移酶处理细胞来获得。
(4)(3)的细胞群，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是α1，3-岩藻糖基转移酶7。
(5)(3)的细胞群，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成的多肽。
(6)(3)的细胞群，其中α1，3-岩藻糖基转移酶由与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成的多肽具有60％或以上同源性的氨基酸序列构成，并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性。
(7)(3)的细胞群，其中α1，3-岩藻糖基转移酶由其中在SEQ IDNO：1的氨基酸序列中至少一个氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列构成，并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性。
(8)(3)的细胞群，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由SEQ ID NO：2的核苷酸序列构成的DNA编码的多肽。
(9)(3)的细胞群，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由在严紧条件下与由SEQ ID NO：2的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的DNA杂交的DNA编码的多肽，并且也是具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽。
(10)(1)到(9)任一项的细胞群，其中细胞是干细胞或祖细胞。
(11)(10)的细胞群，其中干细胞或祖细胞是造血干细胞或造血祖细胞。
(12)(11)的细胞群，其中造血干细胞或造血祖细胞是CD 34-阳性造血干细胞或CD 34-阳性造血祖细胞。
(13)(12)的细胞群，其中CD 34-阳性造血干细胞是CD 38-阴性造血干细胞。
(14)(11)的细胞群，其中造血干细胞或造血祖细胞是CD 34-阴性和谱系阴性造血干细胞或CD 34-阴性和谱系阴性造血祖细胞。
(15)(10)的细胞群，其中干细胞是间充质干细胞。
(16)(10)的细胞群，其中干细胞或祖细胞是神经干细胞或神经祖细胞。
(17)(16)的细胞群，其中神经干细胞或神经祖细胞是巢蛋白(Nestin)阳性神经干细胞或巢蛋白阳性神经祖细胞。
(18)(16)的细胞群，其中神经干细胞或神经祖细胞是Sox2-阳性神经干细胞或Sox2-阳性神经祖细胞。
(19)(16)的细胞群，其中神经干细胞或神经祖细胞是Musashi1-阳性神经干细胞或Musashi 1-阳性神经祖细胞。
(20)(16)的细胞群，其中神经干细胞或神经祖细胞是CD34-阳性神经干细胞或CD34-阳性神经祖细胞。
(21)(16)的细胞群，其中神经干细胞或神经祖细胞是CD133-阳性神经干细胞或CD133-阳性神经祖细胞。
(22)(1)到(21)任一项的细胞群，其中细胞是源自人类的细胞。
(23)(1)到(22)任一项的细胞群，其中细胞是源自于选自骨髓、脾脏、脐带血、外周血、脂肪组织和神经组织的组织的细胞。
(24)药物制备物，含有(1)到(23)任一项的细胞群。
(25)移植细胞群的方法，包括向活体施加(1)到(23)任一项的细胞群。
(26)用于产生表达唾液酸基路易斯X糖链、但是基本上不表达路易斯X糖链的细胞的方法，包括通过分级处理获得细胞。
(27)用于生产表达唾液酸基路易斯X糖链、但是基本上不表达路易斯X糖链的细胞的方法，包括在存在岩藻糖供体的情况下通过用α1，3-岩藻糖基转移酶处理来获得细胞。
(28)(27)的生产方法，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是α1，3-岩藻糖基转移酶7。
(29)(27)的生产方法，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由SEQ IDNO：1的氨基酸序列构成的多肽。
(30)(27)的生产方法，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由与由SEQID NO：1的氨基酸序列构成的多肽具有60％或以上同源性的氨基酸序列构成，并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽。
(31)(27)的生产方法，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中至少一个氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列构成，并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽。
(32)(27)的生产方法，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由SEQ IDNO：2的核苷酸序列构成的DNA编码的多肽。
(33)(27)的生产方法，其中α1，3-岩藻糖基转移酶，是由在严紧条件下与由SEQ ID NO：2的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的DNA杂交的DNA编码，并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽。
(34)(26)到(33)任一项的生产方法，其中细胞是干细胞或祖细胞。
(35)(34)的生产方法，其中干细胞或祖细胞是造血干细胞或造血祖细胞。
(36)(35)的生产方法，其中造血干细胞或造血祖细胞是CD 34-阳性造血干细胞或CD 34-阳性造血祖细胞。
(37)(36)的生产方法，其中CD 34-阳性造血干细胞是CD 38-阴性造血干细胞。
(38)(35)的生产方法，其中造血干细胞或造血祖细胞是CD 34-阴性和谱系阴性造血干细胞或CD 34-阴性和谱系阴性造血祖细胞。
(39)(34)的生产方法，其中干细胞是间充质干细胞。
(40)(34)的生产方法，其中干细胞或祖细胞是神经干细胞或神经祖细胞。
(41)(40)的生产方法，其中神经干细胞或神经祖细胞是巢蛋白阳性神经干细胞或巢蛋白阳性神经祖细胞。
(42)(40)的生产方法，其中神经干细胞或神经祖细胞是Sox2-阳性神经干细胞或Sox2-阳性神经祖细胞。
(43)(40)的生产方法，其中神经干细胞或神经祖细胞是Musashi1-阳性神经干细胞或Musashi 1-阳性神经祖细胞。
(44)(40)的生产方法，其中神经干细胞或神经祖细胞是CD34-阳性神经干细胞或CD34-阳性神经祖细胞。
(45)(40)的生产方法，其中神经干细胞或神经祖细胞是CD133-阳性神经干细胞或CD133-阳性神经祖细胞。
(46)(26)到(45)任一项的生产方法，其中细胞是源自人类的细胞。
(47)(26)到(46)任一项的生产方法，其中细胞是源自于选自骨髓、脾脏、脐带血、外周血、脂肪组织和神经组织的组织的细胞。
(48)药物制备物，含有通过(26)到(47)任一项的生产方法获得的细胞。
(49)用于移植细胞的方法，包括向活体施加通过(26)到(47)任一项的生产方法获得的细胞。
本发明的效果
根据本发明，提供了具有出色的向组织迁移能力和植活能力的细胞群，含有所述细胞群的药物制备物，以及所述细胞群的移植方法。本发明的细胞群可用于恢复损伤的组织等。
附图说明
图1是显示了从脐带血单核细胞分离的CD34-阳性细胞的FACS分析结果的图。分离的CD 34细胞的纯度是95％或以上。一组CD34-阳性、CD-38阴性的细胞，作为人类造血干细胞，被门控(gated)到左侧图的A中并进行分析。
图2是显示用FT 6或FT 7处理的人类造血干细胞(CD34-阳性CD-38阴性细胞)的唾液酸基路易斯X糖链和路易斯X糖链的表达量与未处理细胞的表达量的比较结果的图。唾液酸基路易斯X糖链的表达量显示在A、C和E中，路易斯X糖链的表达量显示在B、D和F中。
图3是显示了用FT 6或FT 7处理的人类造血干细胞(CD34-阳性CD-38阴性细胞)的选择蛋白结合能力与未处理细胞的结合能力的比较结果的图。作为阴性对照，显示了用CD 40-Fc嵌合蛋白处理的细胞的分析结果。
图4是显示了用FT 6或FT 7处理的人类造血干细胞(CD34-阳性CD-38阴性细胞)的骨髓迁移能力与未处理细胞的迁移能力的比较结果的图。在右侧图中显示了移植12到18小时后，迁移到NOD/SCID小鼠的骨髓的人类造血干细胞(CD45-阳性CD-34阳性细胞)的FACS分析的例子。
图5是显示了用FT 6或FT 7处理的人类造血干细胞(CD34-阳性CD-38阴性细胞)在骨髓中的人类血细胞植活比率与未处理细胞的植活比率的比较结果的图。它显示了在移植8到9周后，人类血细胞植入到NOD/SCID小鼠的骨髓中。通过门显示的人类CD 45-阳性细胞表示人类血细胞，小鼠CD 45-阳性细胞表示小鼠血细胞。
图6显示了用FT 6或FT 7处理的人类造血干细胞(CD34-阳性CD-38阴性细胞)在骨髓中的人类血细胞植活比率与未处理细胞的植活比率的比较结果的图。它显示了在移植8到9周后，人类血细胞植入到NOD/SCID小鼠的骨髓中。纵坐标轴是人类血细胞植活比率(人类血细胞比率)的对数表示。纵坐标轴的值显示了人类血细胞的比率(％)的平均值±SD。
图7显示了通过流式细胞术分析酶未处理的或FT 7处理的人类间充质干细胞(hMSC)的结果。“无抗体”显示了没有用抗体处理的hMSC的分析结果，“抗唾液酸基路易斯X抗体”显示了用抗唾液酸基路易斯X糖链抗体处理、然后用FITC标记的抗小鼠IgG抗体作为第二抗体处理的hMSC的分析结果，“抗路易斯X抗体”显示了用FITC标记的抗人类CD 15抗体处理的hMSC的分析结果。纵坐标轴显示细胞数量，横坐标轴显示荧光强度。
图8是下述试验的结果：将FT 7酶处理的hMSC或未处理的hMSC(阴性对照)以1×105个细胞的剂量(对于每组来说，n＝5)移植到小鼠四氯化碳肝病模型中；24小时后提取肝脏并用胶原酶处理它；将这样获得的细胞用生物素标记的小鼠谱系组(Mouse Lineage Panel)处理；然后用PerCP标记的链亲和素和PE标记的抗人类CD 90抗体处理它们；然后通过流式细胞术分析获得的细胞。计算了每大约1.5×106个肝细胞中PE阳性细胞的数量，作为移植的hMSC向肝脏的迁移比率(％)。纵坐标轴的值显示了每个个体中迁移比率的平均值±SD。
图9是通过下列实验获得的结果：分别将5×105个细胞的FT7酶处理的hMSC或未处理的hMSC(阴性对照)移植到小鼠四氯化碳肝病模型中(对于每组来说，n＝6)；18小时后提取肝脏并用胶原酶处理它；将这样获得的细胞，在用PE-Cy7标记的链亲和素、FITC标记的抗小鼠CD45抗体、FITC标记的抗小鼠Ter 119抗体和PE标记的抗人类CD90抗体处理它们后，通过流式细胞术进行分析。计算了每1×106个肝细胞中PE阳性细胞的数量，作为向肝脏迁移的hMSC的数量。纵坐标轴的值显示了每个个体中迁移细胞数量的平均值±SD。
图10是通过下列实验获得的结果：分别将5×105个细胞的FT 7酶处理的hMSC或未处理的hMSC(阴性对照)或溶剂(PBS)施加到小鼠四氯化碳肝病模型中(对于每组来说，n＝6)，并在18小时后通过Fuji Dry Chem测量血液生物化学参数[(A)总胆红素，(B)AST，(C)ALT，(D)ALP，(E)LDH]。纵坐标轴的值显示了每个个体中值的平均值±SD。
图11是通过下列实验获得的结果：分别将5×105个细胞的FT 7酶处理的hMSC或未处理的hMSC(阴性对照)移植到小鼠四氯化碳肺病模型中(对于每组来说，n＝5)；在18小时后提取肺，并用胶原酶-弹性蛋白酶处理它们；将这样获得的细胞，在用PE-Cy7标记的链亲和素、FITC标记的抗小鼠CD45抗体、FITC标记的抗小鼠Ter 119抗体和PE标记的抗人类CD90抗体处理它们后，通过流式细胞术进行分析。计算了每1×105个肺细胞中PE阳性细胞的数量，作为向肺迁移的hMSC的数量。纵坐标轴的值显示了每个个体中迁移细胞数量的平均值±SD。
图12是用FT7处理的神经干细胞或神经祖细胞的唾液酸基路易斯X糖链和路易斯X糖链表达量与未处理细胞的情况下比较的结果。
图13是显示了用FT7处理的神经干细胞或神经祖细胞对各种不同种类的选择蛋白的结合能力与未处理细胞的情况下比较的结果的图。
本发明的最佳实施方案
1.本发明的细胞
本发明的细胞群，可以通过从含有表达唾液酸基路易斯X糖链但是基本上不表达路易斯X糖链的细胞进行分离来制备。尽管含有本发明的细胞群的细胞可以是任何细胞，只要它们含有本发明的细胞群就行，但理想情况下其中包含干细胞或祖细胞。
就此而言，术语“基本上不表达路易斯X糖链”，是指路易斯X糖链阴性或相当于阴性，其程度与唾液酸基路易斯X糖链的表达相比明显较低。它还意味着路易斯X糖链的表达与没有人工表达路易斯X糖链时具有相同的表达水平。
尽管含有本发明的细胞群的细胞可以是任何动物来源的细胞，但人类来源的细胞、非人类灵长类来源的细胞、牛来源的细胞、马来源的细胞、猪来源的细胞、绵羊来源的细胞、山羊来源的细胞、狗来源的细胞、猫来源的细胞或啮齿动物来源的细胞是优选的；人类来源的细胞或非人类灵长类来源的细胞是更优选的；人类来源的细胞是进一步更加优选的。此外，尽管含有本发明的细胞群的细胞可以是源自任何组织的细胞，但源自骨髓的细胞、源自脾脏的细胞、源自脐带血的细胞、源自外周血的细胞、源自脂肪组织的细胞或源自神经组织的细胞是优选的；源自骨髓的细胞、源自脐带血的细胞、源自外周血的细胞或源自脂肪组织的细胞是更优选的；源自骨髓的细胞或源自脐带血的细胞是进一步更加优选的。
干细胞的例子优选包括造血干细胞、间充质干细胞和神经干细胞。造血干细胞的例子包括CD 34-阳性造血干细胞、CD 34-阳性CD 38-阴性造血干细胞、CD 34-阴性谱系阴性造血干细胞等。神经干细胞的例子包括CD 34-阳性神经干细胞、CD 133-阳性神经干细胞、巢蛋白(Nestin)-阳性神经干细胞、Sox2-阳性神经干细胞、Musashi1-阳性神经干细胞等。
祖细胞的例子包括造血祖细胞、神经祖细胞等。造血祖细胞的例子包括CD 34-阳性造血祖细胞、CD 34-阴性谱系阴性造血祖细胞等。神经祖细胞的例子包括CD-34阳性神经祖细胞、CD 133-阳性神经祖细胞、巢蛋白-阳性神经祖细胞、Sox2-阳性神经祖细胞、Musashi1-阳性神经祖细胞等。
在从动物个体回收这些细胞后，它们也可以通过培养进行增殖。此外，可以使用刚刚回收后的细胞群，或者可以使用保存处理、例如冷冻等后的细胞，或细胞分级处理或酶处理后的细胞群。
本发明的细胞，在它们结合E-选择蛋白的能力、向活体组织迁移的能力和植入到活体组织中的能力方面非常出色，因此它们可用于造血干细胞移植，以及使用干细胞移植恢复损伤组织。
本发明的细胞向其迁移和植入的活体组织的例子包括骨髓组织或损伤组织。骨髓组织的例子包括经历化疗或放疗的患者的骨髓组织。损伤组织的例子包括损伤的脑、心脏、肺、肠道、肾脏、胰脏、肝脏、皮肤、血管等组织。
2.本发明的细胞的制备方法
制备用于本发明的细胞群的方法，可以是任何可以分离其中表达唾液酸基路易斯X糖链但基本上不表达路易斯X糖链的细胞群的方法。具体方法的例子包括通过细胞分级处理的制备方法，在存在岩藻糖供体的情况下用α1，3-岩藻糖基转移酶进行处理的方法等。
通过细胞分级处理的制备方法的例子，包括通过分辨唾液酸基路易斯X糖链与路易斯X糖链来回收所需细胞的方法等。所述方法的例子包括了使用能够识别唾液酸基路易斯X糖链和路易斯X糖链的抗体的方法，使用了微珠和磁体的方法，使用其上固定化有抗体的载体制备的柱子的方法等。
使用能够识别唾液酸基路易斯X糖链和路易斯X糖链的抗体的方法的例子包括这样的方法，即允许能够识别相应糖链的抗体与细胞反应，然后通过细胞分拣器回收显示出唾液酸基路易斯X糖链的高表达和路易斯X糖链的低表达的细胞群。具有高表达的细胞群，是指与阴性对照细胞群相比显示出较高荧光强度的细胞群。阴性对照的例子包括使用同种型对照抗体反应的细胞群。具有低表达的细胞群，是指与阳性对照相比显示出较低荧光强度的细胞群。在例如血细胞的情况下，阳性对照的例子包括与抗CD 45抗体反应的细胞群。
使用微珠和磁体的方法的例子包括其中路易斯X糖链阳性细胞级份被移除、然后回收唾液酸基路易斯X糖链阳性细胞级份的方法，或其中唾液酸基路易斯X糖链阳性细胞级份被回收、然后回收路易斯X糖链阴性细胞级份的方法，等等。
在存在岩藻糖供体的情况下用α1，3-岩藻糖基转移酶进行处理的方法的例子，包括在存在岩藻糖供体的情况下将α1，3-岩藻糖基转移酶添加到细胞中的方法，将细胞在保留α1，3-岩藻糖基转移酶的柱子、盘、包或注射器中进行处理的方法，等等。此外，细胞可以使用转染了α1，3-岩藻糖基转移酶编码基因的细胞系或其提取物进行处理。
对于α1，3-岩藻糖基转移酶来说，α1，3-岩藻糖基转移酶7是优选的。人类α1，3-岩藻糖基转移酶7的例子包括由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成的多肽。此外，α1，3-岩藻糖基转移酶可以是由与由SEQ IDNO：1的氨基酸序列构成的多肽具有60％或以上同源性的氨基酸序列构成、并且也具有1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽，由其中在SEQ IDNO：1的氨基酸序列中至少一个氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列构成、并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽，由SEQ ID NO：2的核苷酸序列构成的DNA编码的多肽，或由在严紧条件下与由SEQ IDNO：2的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的DNA杂交的DNA编码、并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽。
此外，当细胞使用转染了α1，3-岩藻糖基转移酶编码基因的细胞系或其提取物进行处理时，使用的基因可以是编码人类α1，3-岩藻糖基转移酶7的基因，由与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成的多肽具有60％或以上同源性的氨基酸序列构成、并且也具有1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽的编码基因，由其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中至少一个氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列构成、并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽的编码基因，或是在严紧条件下与由SEQ IDNO：2的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的DNA杂交的DNA，并且也编码具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽的基因。
根据本发明，与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有60％或以上同源性、并且也具有的α1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽，是指当使用分析软件例如BLAST[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]、FASTA[Methods inEnzymology，183，63(1990)]等进行计算时，与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成的多肽具有至少60％或以上，优选70％或以上，更优选80％或以上，更优选90％或以上，特别优选95％或以上，最优选97％或以上的同源性的多肽。
根据本发明，由其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中至少一个氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列构成、并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性的蛋白，包括可以通过使用定点突变在具有SEQID NO：1的氨基酸序列的蛋白的编码DNA中导入定点突变来获得的蛋白，使用的定点突变方法描述在例如《分子克隆》(第二版)(MolecularCloning，2nd edition)，《分子生物学现代方法》(Current Protocols inMolecular Biology)，Nucleic Acids Research，10，6487(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)，Gene，34，315(1985)，Nucleic AcidsResearch，13，4431(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等中。尽管被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸的数量是一个或多个，并且对于数量没有具体的限制，但数量的程度应该使得通过常规的已知技术、例如上面提到的定点突变技术等，可以将它们缺失、取代或添加。例如，它是从1到数十个，优选从1到20，更优选从1到10，进一步优选为1到5。
根据本发明，在严紧条件下杂交的DNA，是指这样的DNA，例如具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的DNA，或可以使用其部分片段作为探针，通过菌落杂交、噬斑杂交、Southern印迹杂交等获得的DNA。其具体的例子是可以通过下述方法鉴定的DNA，即使用其上固定化有源自于菌落或噬斑的DNA分子的滤膜，在65℃下，在存在0.7到1.0mol/l氯化钠的情况下进行杂交，然后在65℃下使用0.1到2倍浓度的SSC溶液(1×SSC溶液的组合物由150mmol/l氯化钠和15mmol/l柠檬酸钠组成)清洗滤膜。杂交可以按照在下述文献中描述的方法来进行：《分子克隆第二版》(Molecular Cloning，2nd edition)，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，《DNA克隆1：核心技术，实用方法》(第二版)(DNA Cloning 1：Core Techniques，APractical Approach，Second Edition，Oxford University(1995))，等等。可杂交的DNA的例子包括与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少60％或以上同源性的DNA，或具有优选70％或以上，更优选80％或以上，进一步优选90％或以上，特别优选95％或以上，最优选97％或以上的同源性的DNA。
岩藻糖的供体可以是任何供体，只要它能够向α1，3-岩藻糖基转移酶提供岩藻糖就行。其例子包括GDP-岩藻糖等。
3.检查本发明的细胞向活体组织的迁移能力和植活能力的方法
检查本发明的细胞群向活体组织的迁移能力和植活能力的方法的例子，包括在小鼠骨髓中检查移植到小鼠中的人类造血干细胞的存在的方法。可以通过在用半致死剂量的X-射线辐照小鼠后，通过尾静脉注射来移植人类造血干细胞，然后从股骨和胫骨回收骨髓细胞，来检查小鼠骨髓中的细胞。例如，可以通过分析人类CD-45阳性和人类CD-34阳性细胞的细胞数量，来检查向小鼠骨髓迁移的能力，可以通过计算人类CD-45阳性细胞占人类CD-45阳性细胞和小鼠CD-45阳性细胞的总数的比率，来检查向小鼠骨髓植入的能力。
方法还包括在小鼠组织中检查以同样的方式移植到小鼠中的人类间充质干细胞的存在的方法。例如，可以通过尾静脉或其他静脉、或通过向组织直接施加，将人类间充质干细胞移植到四氯化碳诱导的肝病或肺病[BioFactors，26，81-92(2006)]模型动物中，来检查组织中的细胞。例如，因为人类间充质干细胞是CD90阳性的，并且肝细胞、肺细胞等与链亲和素结合，因此可以通过计算CD90阳性细胞在链亲和素结合细胞中的比率，来检查人类间充质干细胞向每种组织迁移的能力。
方法还包括在小鼠组织中检查以同样的方式移植到小鼠中的小鼠神经干细胞的存在的方法。例如，可以通过尾静脉或其他静脉、或通过向组织直接施加，将荧光标记的小鼠神经干细胞移植到动物中，来检查组织中的细胞。对于荧光标记细胞来说，可以使用从表达荧光蛋白绿色荧光蛋白的转基因小鼠分离的细胞[FEBS Lett.，407，313-319(1997)]，或通过使用PKH的活细胞标记方法[Eur.J.Immunol.，28，3066-3074(1998)]制备的细胞等。
4.含有本发明的细胞的药物制备物
因为本发明的细胞群在其与E-选择蛋白的结合能力、向活体组织的迁移能力和向活体组织的植活能力方面非常出色，因此含有本发明的细胞的药物制备物可用于造血干细胞移植，以及使用干细胞移植恢复损伤组织。
作为活性成分，含有本发明的细胞群的药物制备物可以含有单独的本发明的细胞，或与其可药用的盐一起，或作为与用于其他可选治疗的活性成分的混合物。此外，这样的药物制备物通过在细胞药物技术领域公知的任选方法，通过将本发明的细胞群与一种或多种可药用载体混合在一起来生产。
优选情况下，在实施治疗中使用最有效的给药途径，对于含有本发明的细胞群的药物制备物来说，其例子包括静脉内等途径。
适合于注射等的药物制备物由含有活性化合物、优选与受体血液等渗的无菌水性制备物组成。在例如注射的情况下，可以使用载体等来制备注射溶液，载体等根据需要包括盐溶液，葡萄糖溶液，或盐水和葡萄糖溶液的混合物。此外，也可以根据需要加入一种或多种辅助成分，选自稀释剂、防腐剂、香料、填充剂、崩解剂、润滑剂、黏合剂、表面活性剂、塑化剂等。
尽管含有本发明的细胞群或其可药用的盐的药物制备物的剂量和给药频率，随着给药方式、每个患者的年龄和体重、待治疗的症状的性质或严重性等而变化，但优选情况下每次给药细胞的数量为100个或以上。
5.本发明的细胞的移植方法
本发明的细胞的移植方法可以是任何方法，只要它是可向人类移植的方法就行。具体来说，尽管方法包括了通过滴注或静脉内注射的方法，但它也可以是直接施加到各种不同组织、例如骨髓、脑、心脏、肺、肠道、肾脏、胰脏、肝脏等的方法。
尽管在下面根据实施例对本发明进行了描述，但下面的实施例的公开仅仅是出于说明的目的。因此，本发明的范围不限于下面的实施例。
[实施例1]
抗体、选择蛋白-IgG融合蛋白和α1，3-岩藻糖基转移酶的制备
荧光素异硫氰酸酯(FITC)-标记的抗人类路易斯X抗体(HI 98)，FITC-标记的抗小鼠IgM抗体(II/41)，IgM同种型对照抗体(11E10)，藻红蛋白(PE)-标记的抗人类CD38抗体(HIT 2)，PE-标记的抗小鼠CD45抗体(30-F11)，PE-标记的抗小鼠TER-119抗体(TER-119)和别藻蓝蛋白(APC)-标记的人类CD34抗体(581)购自BectonDickinson Pharmingen。FITC-标记的和APC-标记的人类CD45抗体(HI30)购自eBioscience。FITC-标记的抗人类IgG抗体购自DAKOCytomation。
作为抗人类唾液酸基路易斯X糖链抗体(KM 93)，使用了从杂交瘤培养上清液收集的抗体[Hanai等，Cancer Research，46，4438-4443(1986)]。
人类E-选择蛋白与人类IgG恒定区(Fc)的融合蛋白(在后文中被称为E-选择蛋白-Fc嵌合蛋白)和人类P-选择蛋白与Fc的融合蛋白(在后文中称为P-选择蛋白-Fc嵌合蛋白)的生产，按照常规的已知方法进行[Yago等，Journal ofImmunology，15，707-714(1997)]。此外，人类L-选择蛋白与Fc的融合蛋白(在后文中被称为L-选择蛋白-Fc嵌合蛋白)[Siegelman等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 86，5562-5566(1989)]和人类CD 40与Fc的融合蛋白(在后文中被称为CD 40-Fc嵌合蛋白)[Hollenbaugh等，EMBO J.，11，4313-4321(1992)]的生产，以与上面的描述相同的方式进行。α1，3-岩藻糖基转移酶6和7(FT 6和FT 7)在Namalwa细胞中表达并纯化[Shinoda等，Journal of BiologicalChemistry，272，31992-31997(1997)]。
人类脐带血细胞和CD34-阳性细胞
对于源自人类脐带血的造血干细胞来说，脐带血单核细胞从AllCells购买。冷冻细胞的融化和清洗，按照AllCells的说明书进行。
在通过放置在37℃的水浴中将小管中的冷冻细胞快速融化后，缓慢加入含有10％胎牛血清(FBS，由JRH Bioscience制造)的DMEM(由Gibco制造)(在后文中称为10％FBS/DMEM)，直到体积变为20ml。离心操作(1.8k rpm，室温，8分钟)后，丢弃上清液，只留下几毫升的上清液。细胞清洗操作进行两次。
为了从脐带血单核细胞回收造血干细胞，使用CD34微珠试剂盒(由Miltenyi Biotec制造)和分离装置AutoMACSTM(由Miltenyi Biotec制造)，按照产品随附的说明书来分离CD34阳性细胞。
免疫缺陷小鼠
NOD/SCID小鼠购自实验动物中心研究所(Central Institute forExperimental Animal)和CLEA Japan，饲养在动物饲养房的隔离间中。
α1，3-岩藻糖基转移酶处理
将上面获得的从0.1到10×106个源自脐带血的CD34阳性细胞，加入并悬浮在100到1,000μl岩藻糖基转移酶反应溶液中，该溶液含有10mmol/l MnCl2(由Sigma制造)、1mmol/l鸟苷二磷酸(GDP)-岩藻糖(由Kyowa Hakko Kogyo制造)、0.1％人血清白蛋白(HSA，由Sigma制造)和20mmol/l N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES，由Gibco制造)。对于每0.1-1×106个细胞，在加入16μg α1，3-岩藻糖基转移酶7(FT 7)或3μgα1，3-岩藻糖基转移酶6(FT 6)后，或用其中没有加入酶的岩藻糖基转移酶反应溶液代替加过酶的岩藻糖基转移酶反应溶液作为没有用酶处理过的组后，将反应在37℃，在5％CO2的条件下进行1小时。
抗体染色和流式细胞分析
在用染色溶液、即含有5％FBS的PBS清洗用酶处理过的细胞后，使用抗体进行细胞染色。IgM同种型对照抗体被用作阴性对照，FITC标记的抗人类CD45抗体用作阳性对照。在细胞表面上的唾液酸基路易斯X糖链的表达量分析中，抗人类唾液酸基路易斯X糖链抗体KM 93被用作第一抗体，FITC标记的抗小鼠IgM抗体用作第二抗体。在细胞表面上的路易斯X糖链的表达量分析中，使用了FITC标记的抗人类路易斯X糖链抗体。此外，为了检测作为人类造血干细胞的CD34阳性和CD38阴性细胞，使用PE标记的抗人类CD38抗体和APC标记的抗人类CD34抗体进行了细胞的抗体染色。为了在移植小鼠中分别检测小鼠和人类血细胞，使用FITC标记的抗人类CD45抗体和PE标记的抗小鼠CD45抗体进行了染色。此外，在嵌合体比率低的情况下，为了移除红细胞，使用FITC标记的抗小鼠CD45抗体、PE标记的抗小鼠TER-119抗体和APC标记的抗人类CD45抗体进行了染色。
为了在细胞清洗后通过流式细胞术(FACS)分析移除死细胞，向细胞悬浮液中加入碘化丙啶(由Invitrogen制造)至终浓度为1μg/ml。使用流式细胞术装置FACSAria(由Becton Dickinson制造)，分析了在作为活细胞的碘化丙啶阴性细胞中，CD34阳性和CD38阴性细胞群中唾液酸基路易斯X糖链、路易斯X糖链和CD45的表达量。
选择蛋白结合分析
将细胞悬浮在含有0.5％HSA和0.1g/l CaCl2的D-PBS(+)(由Gibco制造)(在后文中称为0.5％HSA％/D-PBS(+))中，在每106个细胞中分别加入1μg E-选择蛋白-Fc嵌合蛋白、2μg P-选择蛋白-Fc嵌合蛋白、2μg L-选择蛋白-Fc嵌合蛋白，以及作为阴性对照的2.2μg CD40-Fc嵌合蛋白。使用FITC标记的抗人类IgG抗体作为第二抗体进行染色。蛋白结合和第二抗体反应分别在4℃进行30分钟。在用0.5％HSA％/D-PBS(+)进行细胞清洗后，通过加入PE标记的抗人类CD38抗体和APC标记的抗人类CD34抗体，在4℃和30分钟的条件下进行染色。为了在细胞清洗后通过FACS分析移除死细胞，向细胞悬浮液中加入碘化丙啶至终浓度为1μg/ml。在使用FACSAria的FACS分析中通过定位碘化丙啶阴性细胞中的CD34阳性和CD38阴性细胞群作为活细胞，分析了选择蛋白的蛋白结合能力。
NOD/SCID小鼠中人类造血干细胞的骨髓迁移分析
将FT7或FT6处理过的源自脐带血的CD34阳性细胞或作为阴性对照的没有用酶处理过的CD34阳性细胞，移植到NOD/SCID小鼠中。在将小鼠饲养1周或以上以适应环境后，在8到10周龄时，使用X-射线辐照装置MBR-1505R(由Hitachi Medico制造)以400cGy的半致死剂量进行辐照。通过尾静脉注射，以每只动物3×105个细胞的剂量移植CD34阳性细胞。在移植12到18小时后，将每只小鼠安乐死，从股骨和胫骨收集骨髓细胞。将骨髓细胞用FITC标记的抗人类CD45抗体、PE标记的抗小鼠CD45抗体和APC标记的抗人类CD34抗体进行染色。在清洗细胞后，通过加入氯化铵溶血剂将红细胞裂解，向其中加入碘化丙啶至终浓度为1μg/ml。使用FACSAria，通过FACS分析分析了作为活细胞的碘化丙啶阴性细胞中的人类CD45阳性和人类CD34阳性细胞。通过在2×106个活细胞上获得数据，对人类CD45阳性和人类CD34阳性细胞进行分析。
人类造血干细胞移植的NOD/SCID小鼠的植活分析
将FT7或FT6处理过的源自脐带血的CD34阳性细胞或作为阴性对照的没有用酶处理过的CD34阳性细胞，移植到用250到300cGy的半致死X-射线剂量辐照过的NOD/SCID小鼠中。在将小鼠饲养1周或以上以适应环境后，在8到10周龄时，使用X-射线辐照装置MBR-1505R(由Hitachi Medico制造)进行X-射线辐照，然后进行移植。通过尾静脉注射，以每只动物2×105个细胞的剂量移植CD34阳性细胞。此外，对于脐带血单核细胞进行了同样的处理，将1×107个细胞类似移植到用X-射线辐照过的小鼠中。在移植8到9周后，将每只小鼠安乐死，从股骨和胫骨收集骨髓细胞。将骨髓细胞用FITC标记的抗人类CD45抗体和PE标记的抗小鼠CD45抗体进行染色。在嵌合体比率低的情况下，为了检测低频率的人类血细胞，将它们用FITC标记的抗小鼠CD45抗体、PE标记的抗小鼠TER-119抗体和APC标记的抗人类CD45抗体进行染色。
在清洗细胞后，通过加入氯化铵溶血剂将红细胞裂解，向其中加入碘化丙啶至终浓度为1μg/ml。使用FACSAria，通过FACS分析分析了作为活细胞的碘化丙啶阴性细胞中的人类CD45阳性和小鼠CD45阳性细胞。当使用小鼠TER-119抗体时，分析了TER-119阴性细胞中的人类CD45阳性细胞和小鼠CD45阳性细胞。人类血细胞的植活率，被计算为人类CD45阳性细胞占人类CD45阳性细胞和小鼠CD45阳性细胞的总数量的比率(％)。
显著性检验
所有值都显示为平均值±SD。在显著性检验中使用了Student’s t-检验。
人类CD34阳件细胞中唾液酸基路易斯X糖链和路易斯X糖链的 表达分析
从脐带血单核细胞分离的人类CD34阳性细胞的分析结果显示在图1中。如图1中所示，纯度是95到99％。为了分离人类造血干细胞，CD34阳性CD38阴性细胞被门控到由图1A的空心方形围绕的区域中(5到10％)。在CD34阳性CD38阴性细胞中唾液酸基路易斯X糖链和路易斯X糖链表达量的分析结果显示在图2A和2B中。如图2A和2B中所示，尽管在该细胞群中表达了唾液酸基路易斯X糖链，但路易斯X糖链的表达较低。
接下来，分析了FT 6或FT 7处理的CD34阳性CD38阴性细胞中唾液酸基路易斯X糖链的表达量。结果分别显示在图2C和图2E中。如图2C和2E中所示，两种酶都显著增加了唾液酸基路易斯X糖链的表达量。接下来，分析了路易斯X糖链的表达量。结果分别显示在图2D和图2F中。如图2F中所示，在FT 7处理的CD34阳性CD38阴性细胞中，路易斯X糖链的表达量没有增加，而如图2D中所示，在FT 6处理的CD34阳性CD38阴性细胞中，路易斯X糖链的表达量显著增加了。分析的数字结果显示在表1中。
[表1]
  同种型对照  唾液酸基路易斯X   路易斯X
  未处理   41   19562   120
  FT6处理FT7处理   3745   5241034970   71595
类似的分析独立地进行了5次，结果显示在表2中。如表2中所示，通过5次分析，上述的结果显示出可重复性。
[表2]
N＝5
  同种型对照  唾液酸基路易斯X  路易斯X   CD 45
  未处理   48±22   28254±10265  48±19   1067±127
  FT6处理   51±9   44130±7997*  133±35**   962±97
  FT7处理   45±15   40370±5542*  34±9   1089±161
人类CD34阳性细胞对选择蛋白的结合活性
分别分析了FT 6或FT 7处理的CD34阳性细胞与E-选择蛋白、P-选择蛋白和L-选择蛋白的结合。结果显示在图3和表3中。如图3和表3中所示，人类CD34阳性细胞与E-选择蛋白的结合能力被FT 7处理显著增加了。此外，与P-选择蛋白的结合能力也增加了。与E-选择蛋白和P-选择蛋白的结合能力的增加，与FT 6处理的情况下的结果相同。
[表3]
  CD40   E-选择蛋白   P-选择蛋白   L-选择蛋白
  未处理   202   18506   13168   5448
  FT6处理   160   146589   20204   4677
  FT7处理   140   109783   22738   10496
人类造血干细胞在NOD/SCID小鼠中的骨髓迁移活性
通过静脉内注射移植到外周血中的造血干细胞，在几小时内从外周血消失，并迁移到骨髓组织并植入其中。将FT6或FT7处理的源自脐带血的CD34阳性细胞或作为阴性对照的未处理细胞移植到NOD/SCID小鼠中，在12到18小时后在骨髓中检测到了人类CD45阳性人类CD34阳性细胞。结果显示在图4和表4中。如图4和表4中所示，用FT6处理没有增加骨髓迁移活性，而用FT7处理时它显著增加了3.1到3.5倍。根据上述结果，显示出在通过岩藻糖基转移酶FT 6和FT 7进行的两种处理中，FT 6处理完全没有增加骨髓迁移活性，但是FT 7处理显著增加了骨髓迁移活性。
[表4]
人类CD45阳性、小鼠CD45阴性和人类CD34阳性细胞的数量
         未处理     FT7处理     p          倍数
试验1    253±62    773±133    0.00363    3.1
试验2    95±13     313±72     0.00693    3.3
试验3    167±44    590±95     0.00223    3.5
         未处理     FT6处理
试验4    358±110   435±181    0.62
试验5    113±38    100±22     0.57
人类造血干细胞在NOD/SCID小鼠中的植活活性
将岩藻糖基转移酶处理的CD34阳性细胞移植到NOD/SCID小鼠中，在8到9周后检查了骨髓中人类血细胞的比率。结果显示在图5中。如图5中所示，因为FT 6处理的细胞移植组显示出与没有用酶处理的组相似的结果，因此没有植活增强效应。另一方面，FT 7处理的移植组显示出98到99％的源自人类的细胞植活比率。这表明，几乎所有小鼠血细胞都被人类血细胞取代。
相似的分析独立地进行了4次，结果显示在图6中。如图6中所示，显示出FT 6处理没有植活率增加效应，而以高的可重复性和稳定性获得了FT 7处理的植活率增加效应。此外，FT 7处理的植活率增加效应和FT 6处理的不具有植活率增加效应，在将移植细胞的数量减少到一半数量、即1×106个细胞后移植CD34阳性细胞的试验中，也得到了证实。
就此而言，在没有将CD34阳性细胞分离出来的脐带血单核细胞用FT7处理后进行移植的情况下，与没有用酶处理的细胞相比，证实了短时间内显著的植活增加效应。另一方面，移植用FT6处理的脐带血单核细胞的情况下，与没有用酶处理的细胞相比，不能证实显著的植活增强效应。
[实施例2]
在肝炎模型中间充质干细胞向肝脏的迁移
1.在人类间充质干细胞中路易斯X糖链和唾液酸基路易斯X糖链 的表达分析
人类间充质干细胞(在后文中称为hMSC)购自CAMBREX。将hMSC在CO2培养箱中，使用MSCGM培养基(由CAMBREX制造)，在37℃和5％CO2条件下进行培养。在用磷酸盐缓冲盐水(在后文中称为PBS(-))清洗后，通过加入TrypLE Select(由Invitrogen制造)并在37℃处理2分钟，使细胞剥离，然后通过加入含有5％FBS的PBS(-)溶液终止反应。通过以1,000rpm(转/分钟)离心5分钟回收细胞，用PBS(-)清洗，然后将1-2×106个细胞悬浮在80-100μl的Hanks’平衡盐溶液(HBSS)反应液中[25mmol/l HEPES(由Gibco制造)，10mmol/lMnCl2(由SIGMA制造)，0.1％HAS，HBSS(-)(由Gibco制造)]。在每1×106个细胞加入4-16μg FT 7后，将GDP-岩藻糖(由Kyowa Hakko Kogyo制造)调整到终浓度为1mmol/l，在37℃温育1小时。另一方面，作为阴性对照，单独使用HBSS(-)反应液将hMSC在37℃温育1小时。在用PBS(-)清洗细胞三次后，将细胞悬浮在含有5％FBS的PBS(-)溶液中，分配成1×105个细胞的部分。作为抗路易斯X糖链抗体，以5％的浓度加入FITC标记的抗人类CD 15抗体(由BectonDickinson制造)，使其在4℃反应1小时。另一方面，作为抗唾液酸基路易斯X糖链抗体，以5％的浓度加入抗人类唾液酸基路易斯X糖链抗体KM93(由CALBIOCHEM制造)，使其在4℃反应30分钟。在用含有5％FBS的PBS(-)溶液清洗后，以4,500rpm离心1分钟回收细胞，并悬浮在含有5％FBS的PBS(-)溶液中。以5％的浓度加入作为第二抗体的FITC标记的抗小鼠IgG抗体(由Becton Dickinson制造)，使其在4℃反应30分钟。将用抗人类路易斯X糖链抗体处理过的细胞和用抗唾液酸基路易斯X糖链抗体处理、然后用第二抗体处理过的细胞，用含有5％FBS的PBS(-)溶液清洗三次，然后悬浮在1ml含有5％FBS的PBS(-)溶液中，并通过流式细胞术(Becton Dickinson；FACSAria)进行分析。结果显示在图7中。如图7中所示，在hMSC中，路易斯X糖链的表达没有发现，唾液酸基路易斯X糖链的表达几乎不能发现。此外，发现路易斯X糖链没有增加，但是单独的唾液酸基路易斯X糖链被FT7处理选择性增加。
此外，还将细胞悬浮在含有0.5％HAS和0.1g/l CaCl2的D-PBS(+)(由Gibco制造)中[在后文中称为0.5％HSA％/D-PBS(+)]，对于每1-5×105个细胞，分别向其中加入1μg E-选择蛋白-Fc嵌合蛋白、2μg P-选择蛋白-Fc嵌合蛋白或2μg L-选择蛋白-Fc嵌合蛋白。使用FITC标记的抗人类IgG抗体作为第二抗体进行染色。蛋白结合和第二抗体反应，分别在4℃进行30分钟。在用0.5％HSA％/D-PBS(+)清洗细胞后，为了通过FACS分析消除死细胞，向细胞悬液中加入碘化丙啶至终浓度为1μg/ml。在FACS分析中，通过FACSAria分析了作为活细胞的碘化丙啶阴性细胞的选择蛋白蛋白结合能力。结果显示在表5中。如表5中所示，证实了通过FT7处理后平均荧光强度(MFI)、即E、P、L-选择蛋白结合能力的增加。
[表5]
  E-选择蛋白   P-选择蛋白   L-选择蛋白
  未处理的hMSC   564   8943   7266
  FT7酶处理的hMSC   20545   13667   15388
2.小鼠四氯化碳肝病模型的制备
将5周龄的雄性BALB/c-nu/nu Slc小鼠(Japan SLC)适应性饲养1周。将四氯化碳(由Wako Pure Chemical Industries制造)用橄榄油(由Wako Pure Chemical Industries制造)稀释10倍，以1ml/kg的比率将四氯化碳腹膜内给药到BALB/c-nu/nu Slc小鼠中，以诱导急性肝病。
3.hMSC移植到小鼠四氯化碳肝病模型中以及肝脏迁移细胞的分 析(1)
按照与上面描述相同的方式，将FT 7酶处理的hMSC和阴性对照hMSC悬浮在PBS(-)中，并调整到1×106个细胞/ml。将给药四氯化碳后过去24小时的BALB/c-nu/nu Slc小鼠，通过肌肉内注射40μl/头的混合麻醉液[Dormicum注射液(由Astellas Pharma制造)、Domitor(由Meiji Seika制造)、戊巴比妥钠(由Dainippon Sumitomo Pharmaceutical制造)和生理盐水的3∶3∶10∶110的混合物]进行麻醉。通过进行腹部切口，将FT 7酶处理的hMSC或对照hMSC以1×105个细胞/头的剂量(对于每组来说n＝5)移植到脾脏中。在移植24小时后，取出肝脏，在胶原酶反应液[0.04％胶原酶类型IV(由SIGMA制造)，0.004％胰蛋白酶抑制剂(由SIGMA制造)，5mmol/l CaCl2(由Nakalai Tesque制造)，HBSS(-)(由Nakalai Tesque制造)]中切成碎块，然后在37℃温育2小时。使用100μm膜(由Becton Dickinson制造)将它过滤，用含有5％FBS的PBS(-)清洗三次。在悬浮于同样的溶液中之后，将其分配成1×108个细胞的部分。向其中加入浓度为2％的生物素标记的小鼠谱系组(由Becton Dickinson制造)，使其在4℃反应1小时。在用含有5％血清的PBS(-)溶液清洗后，以4,500rpm离心1分钟回收细胞，并悬浮在含有5％FBS的PBS(-)溶液中。进一步向其中加入浓度为10％的PerCP标记的链亲和素(由Becton Dickinson制造)和PE标记的抗人类CD 90抗体(由Becton Dickinson制造)，使其在4℃反应2小时。在用含有5％FBS的PBS(-)溶液清洗3次后，将细胞悬浮在1ml同样的溶液中，通过流式细胞术进行分析。因为源自肝脏的血细胞用小鼠谱系组处理，然后用PerCP标记的链亲和素处理，并且肝细胞与链亲和素结合，因此所有收集到的源自小鼠肝脏的细胞都可以被检测为PerCP阳性细胞。另一方面，因为源自小鼠肝脏的细胞不与人类CD 90抗体反应，因此hMSC可以被特异性染色。因此，每一定数量的PerCP阳性细胞中PE阳性细胞的数量，可以表示成移植的hMSC向肝脏的迁移比率(％)。通过流式细胞术分析的结果显示在图8中。如图8中所示，通过FT 7酶处理的移植的hMSC显示出增加的向肝脏的迁移比率。这显示出在没有添加路易斯X糖链而通过FT 7酶处理添加了单独的唾液酸基路易斯X糖链的细胞中，向损伤区域迁移的性质得到改进。
4.hMSC移植到小鼠四氯化碳肝病模型中以及肝脏迁移细胞的分 析(2)
将FT 7酶处理的hMSC或阴性对照hMSC按照上面的描述悬浮在PBS(-)中，并调整到2.5×106个细胞/ml。在给药四氯化碳24小时后，从BALB/c-nu/nu Slc小鼠的微静脉，以5×105个细胞/头的剂量移植FT7酶处理的hMSC或对照hMSC(对于每组来说n＝6)。在移植18小时后，取出肝脏，按照上面的描述进行处理，然后进行溶血处理，将细胞分配成3×106个的部分。
以10％的浓度向其中添加PE-Cy7标记的链亲和素(由BectonDickinson制造)和PE标记的人类CD90抗体，以5％的浓度添加FITC标记的小鼠CD45抗体(由Becton Dickinson制造)和FITC标记的小鼠Ter 119抗体(由Becton Dickinson制造)，使其在4℃反应2小时。将细胞用含有5％FBS的PBS(-)溶液清洗三次，悬浮在1ml同样的溶液中，然后通过流式细胞术进行分析。在移除FITC标记的血细胞后，FITC阴性PE-Cy7阳性细胞被当作肝细胞，PE阳性细胞被当作hMSC，并计算每一百万个肝细胞中hMSC细胞的数量。结果显示在图9中。如图9中所示，使用FT7处理时，发现了向肝脏迁移的细胞数量的显著增加。
5.hMSC移植到小鼠四氯化碳肝病模型中和血清生物化学参数的 分析
通过与上述第4项中相同的方法，将FT7酶处理的hMSC或阴性对照hMSC移植到肝病小鼠中，或将溶剂(PBS)给药到其中(对于每组来说，n＝6)。在移植18小时后，收集血样，通过Fuji Dry Chem(由Fuji Photo Film制造)测量血清中的总胆红素(T-BIL)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、丙氨酸磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)。结果显示在图10中。如图10中所示，使用FT7处理时，发现了血液生物化学参数的显著增加。
[实施例3]
在肺炎模型中间充质干细胞向肺部的迁移
1.制备小鼠四氯化碳肺病模型
将5周龄的雄性BALB/c-nu/nu Slc小鼠(Japan SLC)适应性饲养1周。通过将四氯化碳(由Wako Pure Chemical Industries制造)用橄榄油(由Wako Pure Chemical Industries制造)稀释10倍，以1ml/kg的剂量进行四氯化碳向BALB/c-nu/nu Slc小鼠的腹膜内给药，诱导急性肺病[Mizuguchi等，BioFactors，26，81-92(2006)]。
2.hMSC移植到小鼠四氯化碳肺病模型中以及分析
通过与实施例2相同的方法，将FT 7酶处理的hMSC或阴性对照hMSC悬浮在PBS(-)中，并调整到2.5×106个细胞/ml。在给药四氯化碳24小时后，以5×105个细胞/头的剂量将FT 7酶处理的hMSC或对照hMSC移植到BALB/c-nu/nu Slc小鼠中(每组5只动物)。在移植18小时后，取出肺，在胶原酶-弹性蛋白酶反应液[150U/ml胶原酶类型IV(由SIGMA制造)，10U/ml弹性蛋白酶(由Nakalai Tesque制造)，DMEM(由Invitrogen制造)]中切成碎块，然后在37℃温育2小时。使用100μm膜(由Becton Dickinson制造)通过过滤收集细胞；进行溶血处理；用含有5％FBS的PBS(-)溶液清洗两次，然后悬浮在同样的溶液中，以分配成3×106个细胞的部分。以10％的浓度向其中加入PE-Cy7标记的链亲和素和PE标记的人类CD90抗体，以5％的浓度添加FITC标记的抗小鼠CD45抗体和FITC标记的抗小鼠Ter 119抗体，使其在4℃反应2小时。将细胞用含有5％FBS的PBS(-)溶液清洗三次，悬浮在1ml同样的溶液中，然后通过流式细胞术进行分析。在移除FITC标记的血细胞后，FITC阴性PE-Cy7阳性细胞被当作肺细胞，PE阳性细胞被当作hMSC，并计算每十万个肺细胞中hMSC细胞的数量。结果显示在图11中。如图11中所示，使用FT7处理时，发现了向肺迁移的细胞数量的显著增加。
[实施例4]
抗体、选择蛋白-IgG融合蛋白和α1，3-岩藻糖基转移酶的制备
荧光素异硫氰酸酯(FITC)-标记的抗路易斯X抗体(HI 98)，FITC-标记的抗小鼠IgM抗体(II/41)和IgM同种型对照抗体(11E10)购自Becton Dickinson Pharmingen。FITC-标记的或APC-标记的人类CD45抗体(HI30)购自eBioscience。FITC-标记的抗人类IgG抗体购自DAKOCytomation。
作为抗唾液酸基路易斯X糖链抗体(KM 93)，使用了从杂交瘤培养上清液回收的抗体[Hanai等，Cancer Research，46，4438-4443(1986)]。
人类E-选择蛋白与人类IgG恒定区(Fc)的融合蛋白(在后文中被称为E-选择蛋白-Fc嵌合蛋白)和人类P-选择蛋白与Fc的融合蛋白(在后文中称为P-选择蛋白-Fc嵌合蛋白)的生产，按照常规的已知方法进行[Yago等，Journal of Immunology，15，707-714(1997)]。此外，人类L-选择蛋白与Fc的融合蛋白(在后文中被称为L-选择蛋白-Fc嵌合蛋白)[Siegelman等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 86，5562-5566(1989)]和人类CD 40与Fc的融合蛋白(在后文中被称为CD 40-Fc嵌合蛋白)[Hollenbaugh等，EMBO J.，11，4313-4321(1992)]的生产，以与上面的描述相同的方式进行。由Namalwa细胞表达α1，3-岩藻糖基转移酶7(FT 7)并纯化[Shinoda等，Journal of Biological Chemistry，272，31992-31997(1997)]。
神经干细胞的培养
神经球(Neurosphere)是含有神经干细胞和神经祖细胞的细胞。使用源自小鼠胚胎中枢神经系统(皮层)的冷冻神经球(由Stem CellTechnologies制造)，按照Stem Cell Technologies的说明书进行冷冻细胞的融化、清洗和培养。在冷冻细胞融化后，使用NeuroCult增殖培养基(由Stem Cell Technologies制造)并通过离心清洗细胞，悬浮在补充有20ng/ml重组人类表皮生长因子(rh EGF，由Stem CellTechnologies制造)的NeuroCult增殖培养基中，在5％CO2培养箱中在37℃培养7天。回收这样增殖的神经球，使用NeuroCult化学解离试剂盒(由Stem Cell Technologies制造)将神经球分离成单细胞并悬浮。
α1，3-岩藻糖基转移酶处理
将上面获得的并悬浮成单细胞的从0.1到10×105个源自神经球的细胞，加入到岩藻糖基转移酶反应溶液中，制成100到1,000μl的悬液，所述反应溶液含有10mmol/l MnCl2(由Sigma制造)、1mmol/l鸟苷二磷酸(GDP)-岩藻糖(由Kyowa Hakko Kogyo制造)、0.1％人血清白蛋白(HSA，由SIGMA制造)和20mmol/l N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES，由Gibco制造)。使用了对于每0.1-1×105个细胞在其中加入16μg α1，3-岩藻糖基转移酶7(FT 7)的反应溶液，或其中没有加入酶的岩藻糖基转移酶反应溶液代替加过酶的岩藻糖基转移酶反应溶液作为没有用酶处理过的组，允许细胞在37℃和5％CO2条件下进行1小时的反应。
抗体染色和流式细胞术分析
在用染色溶液、即含有5％FBS的PBS清洗用酶处理过的细胞后，使用抗体进行细胞染色。IgM同种型对照抗体被用作阴性对照。在细胞表面上的唾液酸基路易斯X糖链的表达量分析中，抗人类唾液酸基路易斯X糖链抗体KM 93被用作第一抗体，FITC标记的抗小鼠IgM抗体用作第二抗体。在细胞表面上的路易斯X糖链的表达量分析中，使用了FITC标记的抗路易斯X糖链抗体。
为了在细胞清洗后通过流式细胞术(FACS)分析去除死细胞，向细胞悬浮液中加入碘化丙啶(由Invitrogen制造)至终浓度为1μg/ml。使用流式细胞仪FACSAria(由Becton Dickinson制造)，分析了活细胞，碘化丙啶阴性细胞的唾液酸基路易斯X糖链和路易斯X糖链的表达量。
选择蛋白结合分析
将细胞悬浮在含有0.5％HSA和0.1g/l CaCl2的D-PBS(+)(由Gibco制造)(在后文中称为0.5％HSA％/D-PBS(+))中，在每106个细胞中分别加入1μg E-选择蛋白-Fc嵌合蛋白、2μg P-选择蛋白-Fc嵌合蛋白、2μg L-选择蛋白-Fc嵌合蛋白或2.2μg阴性对照CD 40-Fc嵌合蛋白。使用FITC标记的抗人类IgG抗体作为第二抗体进行染色。蛋白结合和第二抗体反应分别在4℃进行30分钟。在用0.5％HSA％/D-PBS(+)清洗细胞后，为了通过FACS分析去除死细胞，向细胞悬浮液中加入碘化丙啶至终浓度为1μg/ml。在使用FACSAria的FACS分析中，分析了作为活细胞的碘化丙啶阴性细胞的选择蛋白蛋白结合能力。
小鼠神经球的唾液酸基路易斯X糖链和路易斯X糖链的表达分析
小鼠神经球的唾液酸基路易斯X糖链和路易斯X糖链表达量的分析结果，显示在图12中。如图12的上排(未处理的组)中所示，小鼠神经球的唾液酸基路易斯X糖链和路易斯X糖链的表达为阴性。
接下来，分析了FT7处理过的小鼠神经球的唾液酸基路易斯X糖链和路易斯X糖链的表达量。
结果显示在图12的下排(FT7处理)中。如图12的下排中所示，FT7处理显著增加了唾液酸基路易斯X糖链的表达量。另一方面，路易斯X糖链的表达量没有变化。
神经干细胞对选择蛋白的结合活性
分析了FT7处理的源自小鼠神经球的神经干细胞或神经祖细胞对P-选择蛋白、E-选择蛋白和L-选择蛋白的每种的结合。结果显示在图13中。如图13中所示，源自小鼠神经球的神经干细胞或神经祖细胞对E-选择蛋白的结合能力，被FT7处理显著增加了。
工业实用性
根据本发明，提供了具有出色的向组织迁移能力和植活能力的细胞群，含有所述细胞群的药物制备物，以及所述细胞群的移植方法。本发明的细胞群可用于恢复损伤组织等。
序列表
<110>协和发酵麒麟株式会社
 
<120>分离的细胞群
 
<130>SCT100544-40
 
<150>JP2007-206823
<151>2007-08-08
 
<160>2
 
<170>PatentIn version 2.1
 
<210>1
<211>342
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>1
 
Met Asn Asn Ala Gly His Gly Pro Thr Arg Arg Leu Arg Gly Leu Gly
  1               5                  10                  15
Val Leu Ala Gly Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Trp Leu Leu Trp Leu
             20                  25                  30
Leu Gly Ser Ala Pro Arg Gly Thr Pro Ala Pro Gln Pro Thr Ile Thr
         35                  40                  45
Ile Leu Val Trp His Trp Pro Phe Thr Asp Gln Pro Pro Glu Leu Pro
     50                  55                  60
Ser Asp Thr Cys Thr Arg Tyr Gly Ile Ala Arg Cys His Leu Ser Ala
 65                  70                  75                  80
Asn Arg Ser Leu Leu Ala Ser Ala Asp Ala Val Val Phe His His Arg
                 85                  90                  95
Glu Leu Gln Thr Arg Arg Ser His Leu Pro Leu Ala Gln Arg Pro Arg
            100                 105                 110
Gly Gln Pro Trp Val Trp Ala Ser Met Glu Ser Pro Ser His Thr His
        115                 120                 125
Gly Leu Ser His Leu Arg Gly Ile Phe Asn Trp Val Leu Ser Tyr Arg
    130                 135                 140
Arg Asp Ser Asp Ile Phe Val Pro Tyr Gly Arg Leu Glu Pro His Trp
145                 150                 155                 160
Gly Pro Ser Pro Pro Leu Pro Ala Lys Ser Arg Val Ala Ala Trp Val
                165                 170                 175
Val Ser Asn Phe Gln Glu Arg Gln Leu Arg Ala Arg Leu Tyr Arg Gln
            180                 185                 190
Leu Ala Pro His Leu Arg Val Asp Val Phe Gly Arg Ala Asn Gly Arg
        195                 200                 205
Pro Leu Cys Ala Ser Cys Leu Val Pro Thr Val Ala Gln Tyr Arg Phe
    210                 215                 220
Tyr Leu Ser Phe Glu Asn Ser Gln His Arg Asp Tyr Ile Thr Glu Lys
225                 230                 235                 240
Phe Trp Arg Asn Ala Leu Val Ala Gly Thr Val Pro Val Val Leu Gly
                245                 250                 255
Pro Pro Arg Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Val Pro Ala Asp Ala Phe Val
            260                 265                 270
His Val Asp Asp Phe Gly Ser Ala Arg Glu Leu Ala Ala Phe Leu Thr
        275                 280                 285
Gly Met Asn Glu Ser Arg Tyr Gln Arg Phe Phe Ala Trp Arg Asp Arg
    290                 295                 300
Leu Arg Val Arg Leu Phe Thr Asp Trp Arg Glu Arg Phe Cys Ala Ile
305                 310                 315                 320
Cys Asp Arg Tyr Pro His Leu Pro Arg Ser Gln Val Tyr Glu Asp Leu
                325                 330                 335
Glu Gly Trp Phe Gln Ala
            340
<210>2
<211>1029
<212>DNA
<213>Homo sapiens
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1029)
 
<400>2
 
atg aat aat gct ggg cac ggc ccc acc cgg agg ctg cga ggc ttg ggg     48
Met Asn Asn Ala Gly His Gly Pro Thr Arg Arg Leu Arg Gly Leu Gly
  1               5                  10                  15
gtc ctg gcc ggg gtg gct ctg ctc gct gcc ctc tgg ctc ctg tgg ctg     96
Val Leu Ala Gly Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Trp Leu Leu Trp Leu
             20                  25                  30
ctg ggg tca gcc cct cgg ggt acc ccg gca ccc cag ccc acg atc acc    144
Leu Gly Ser Ala Pro Arg Gly Thr Pro Ala Pro Gln Pro Thr Ile Thr
         35                  40                  45
atc ctt gtc tgg cac tgg ccc ttc act gac cag ccc cca gag ctg ccc    192
Ile Leu Val Trp His Trp Pro Phe Thr Asp Gln Pro Pro Glu Leu Pro
     50                  55                  60
agc gac acc tgc acc cgc tac ggc atc gcc cgc tgc cac ctg agt gcc    240
Ser Asp Thr Cys Thr Arg Tyr Gly Ile Ala Arg Cys His Leu Ser Ala
 65                  70                  75                  80
aac cga agc ctg ctg gcc agc gcc gac gcc gtg gtc ttc cac cac cgc    288
Asn Arg Ser Leu Leu Ala Ser Ala Asp Ala Val Val Phe His His Arg
                 85                  90                  95
gag ctg cag acc cgg cgg tcc cac ctg ccc ctg gcc cag cgg ccg cga    336
Glu Leu Gln Thr Arg Arg Ser His Leu Pro Leu Ala Gln Arg Pro Arg
            100                 105                 110
ggg cag ccc tgg gtg tgg gcc tcc atg gag tct cct agc cac acc cac    384
Gly Gln Pro Trp Val Trp Ala Ser Met Glu Ser Pro Ser His Thr His
        115                 120                 125
ggc ctc agc cac ctc cga ggc atc ttc aac tgg gtg ctg agc tac cgg    432
Gly Leu Ser His Leu Arg Gly Ile Phe Asn Trp Val Leu Ser Tyr Arg
    130                 135                 140
cgc gac tcg gac atc ttt gtg ccc tat ggc cgc ctg gag ccc cac tgg    480
Arg Asp Ser Asp Ile Phe Val Pro Tyr Gly Arg Leu G1u Pro His Trp
145                 150                 155                 160
ggg ccc tcg cca ccg ctg cca gcc aag agc agg gtg gcc gcc tgg gtg    528
Gly Pro Ser Pro Pro Leu Pro Ala Lys Ser Arg Val Ala Ala Trp Val
                165                 170                 175
gtc agc aac ttc cag gag cgg cag ctg cgt gcc agg ctg tac cgg cag    576
Val Ser Asn Phe Gln Glu Arg Gln Leu Arg Ala Arg Leu Tyr Arg Gln
            180                 185                 190
ctg gcg cct cat ctg cgg gtg gat gtc ttt ggc cgt gcc aat gga cgg    624
Leu Ala Pro His Leu Arg Val Asp Val Phe Gly Arg Ala Asn Gly Arg
        195                 200                 205
cca ctg tgc gcc agc tgc ctg gtg ccc acc gtg gcc cag tac cgc ttc    672
Pro Leu Cys Ala Ser Cys Leu Val Pro Thr Val Ala G1n Tyr Arg Phe
    210                 215                 220
tac ctg tcc ttt gag aac tct cag cac cgc gac tac att acg gag aaa    720
Tyr Leu Ser Phe Glu Asn Ser Gln His Arg Asp Tyr Ile Thr Glu Lys
225                 230                 235                 240
ttc tgg cgc aac gca ctg gtg gct ggc act gtg cca gtg gtg ctg ggg    768
Phe Trp Arg Asn Ala Leu Val Ala Gly Thr Val Pro Val Val Leu Gly
                245                 250                 255
ccc cca cgg gcc acc tat gag gcc ttc gtg ccg gct gac gcc ttc gtg    816
Pro Pro Arg Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Val Pro Ala Asp Ala Phe Val
            260                 265                 270
cat gtg gat gac ttt ggc tca gcc cga gag ctg gcg gct ttc ctc act    864
His Val Asp Asp Phe Gly Ser Ala Arg Glu Leu Ala Ala Phe Leu Thr
        275                 280                 285
ggc atg aat gag agc cga tac caa cgc ttc ttt gcc tgg cgt gac agg    912
Gly Met Asn Glu Ser Arg Tyr Gln Arg Phe Phe Ala Trp Arg Asp Arg
    290                 295                 300
ctc cgc gtg cga ctg ttc acc gac tgg cgg gaa cgt ttc tgt gcc atc     960
Leu Arg Val Arg Leu Phe Thr Asp Trp Arg Glu Arg Phe Cys Ala Ile
305                 310                 315                 320
tgt gac cgc tac cca cac cta ccc cgc agc caa gtc tat gag gac ctt    1008
Cys Asp Arg Tyr Pro His Leu Pro Arg Ser Gln Val Tyr Glu Asp Leu
                325                 330                 335
gag ggt tgg ttt cag gcc tga                                        1029
Glu Gly Trp Phe Gln Ala
            340

Claims (49)

1.分离的细胞群，其中表达唾液酸基路易斯X糖链，路易斯X糖链基本上不表达。
2.权利要求1的细胞群，通过细胞分级处理获得。
3.权利要求1或2的细胞群，通过在存在岩藻糖供体的情况下用α1，3-岩藻糖基转移酶处理细胞来获得。
4.权利要求3的细胞群，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是α1，3-岩藻糖基转移酶7。
5.权利要求3的细胞群，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由SEQ IDNO：1的氨基酸序列构成的多肽。
6.权利要求3的细胞群，其中α1，3-岩藻糖基转移酶由与由SEQID NO：1的氨基酸序列构成的多肽具有60％或以上同源性的氨基酸序列构成，并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性。
7.权利要求3的细胞群，其中α1，3-岩藻糖基转移酶由其中在SEQID NO：1的氨基酸序列中至少一个氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列构成，并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性。
8.权利要求3的细胞群，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由SEQ IDNO：2的核苷酸序列构成的DNA编码的多肽。
9.权利要求3的细胞群，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由在严紧条件下与由SEQ ID NO：2的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的DNA杂交的DNA编码的多肽，并且也是具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽。
10.权利要求1到9任一项的细胞群，其中细胞是干细胞或祖细胞。
11.权利要求10的细胞群，其中干细胞或祖细胞是造血干细胞或造血祖细胞。
12.权利要求11的细胞群，其中造血干细胞或造血祖细胞是CD34-阳性造血干细胞或CD 34-阳性造血祖细胞。
13.权利要求12的细胞群，其中CD 34-阳性造血干细胞是CD 38-阴性造血干细胞。
14.权利要求11的细胞群，其中造血干细胞或造血祖细胞是CD34-阴性和谱系阴性造血干细胞或CD 34-阴性和谱系阴性造血祖细胞。
15.权利要求10的细胞群，其中干细胞是间充质干细胞。
16.权利要求10的细胞群，其中干细胞或祖细胞是神经干细胞或神经祖细胞。
17.权利要求16的细胞群，其中神经干细胞或神经祖细胞是巢蛋白阳性神经干细胞或巢蛋白阳性神经祖细胞。
18.权利要求16的细胞群，其中神经干细胞或神经祖细胞是Sox2-阳性神经干细胞或Sox2-阳性神经祖细胞。
19.权利要求16的细胞群，其中神经干细胞或神经祖细胞是Musashi1-阳性神经干细胞或Musashi 1-阳性神经祖细胞。
20.权利要求16的细胞群，其中神经干细胞或神经祖细胞是CD34-阳性神经干细胞或CD34-阳性神经祖细胞。
21.权利要求16的细胞群，其中神经干细胞或神经祖细胞是CD133-阳性神经干细胞或CD133-阳性神经祖细胞。
22.权利要求1到21任一项的细胞群，其中细胞是源自人类的细胞。
23.权利要求1到22任一项的细胞群，其中细胞是源自于选自骨髓、脾脏、脐带血、外周血、脂肪组织和神经组织的组织的细胞。
24.药物制备物，含有权利要求1到23任一项的细胞群。
25.移植细胞群的方法，包括向活体施加权利要求1到23任一项的细胞群。
26.用于产生表达唾液酸基路易斯X糖链、但是基本上不表达路易斯X糖链的细胞的方法，包括通过分级处理获得细胞。
27.用于生产表达唾液酸基路易斯X糖链、但是基本上不表达路易斯X糖链的细胞的方法，包括在存在岩藻糖供体的情况下通过用α1，3-岩藻糖基转移酶处理来获得细胞。
28.权利要求27的生产方法，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是α1，3-岩藻糖基转移酶7。
29.权利要求27的生产方法，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由SEQID NO：1的氨基酸序列构成的多肽。
30.权利要求27的生产方法，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成的多肽具有60％或以上同源性的氨基酸序列构成，并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽。
31.权利要求27的生产方法，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中至少一个氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列构成，并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽。
32.权利要求27的生产方法，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由SEQID NO：2的核苷酸序列构成的DNA编码的多肽。
33.权利要求27的生产方法，其中α1，3-岩藻糖基转移酶是由在严紧条件下与由SEQ ID NO：2的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的DNA杂交的DNA编码，并且也具有α1，3-岩藻糖基转移酶活性的多肽。
34.权利要求26到33任一项的生产方法，其中细胞是干细胞或祖细胞。
35.权利要求34的生产方法，其中干细胞或祖细胞是造血干细胞或造血祖细胞。
36.权利要求35的生产方法，其中造血干细胞或造血祖细胞是CD34-阳性造血干细胞或CD 34-阳性造血祖细胞。
37.权利要求36的生产方法，其中CD 34-阳性造血干细胞是CD38-阴性造血干细胞。
38.权利要求35的生产方法，其中造血干细胞或造血祖细胞是CD34-阴性和谱系阴性造血干细胞或CD 34-阴性和谱系阴性造血祖细胞。
39.权利要求34的生产方法，其中干细胞是间充质干细胞。
40.权利要求34的生产方法，其中干细胞或祖细胞是神经干细胞或神经祖细胞。
41.权利要求40的生产方法，其中神经干细胞或神经祖细胞是巢蛋白阳性神经干细胞或巢蛋白阳性神经祖细胞。
42.权利要求40的生产方法，其中神经干细胞或神经祖细胞是Sox2-阳性神经干细胞或Sox2-阳性神经祖细胞。
43.权利要求40的生产方法，其中神经干细胞或神经祖细胞是Musashi1-阳性神经干细胞或Musashi 1-阳性神经祖细胞。
44.权利要求40的生产方法，其中神经干细胞或神经祖细胞是CD34-阳性神经干细胞或CD34-阳性神经祖细胞。
45.权利要求40的生产方法，其中神经干细胞或神经祖细胞是CD133-阳性神经干细胞或CD133-阳性神经祖细胞。
46.权利要求26到45任一项的生产方法，其中细胞是源自人类的细胞。
47.权利要求26到46任一项的生产方法，其中细胞是源自于选自骨髓、脾脏、脐带血、外周血、脂肪组织和神经组织的组织的细胞。
48.药物制备物，含有通过权利要求26到47任一项的生产方法获得的细胞。
49.用于移植细胞的方法，包括向活体施加通过权利要求26到47任一项的生产方法获得的细胞。
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