KR20100042654A

KR20100042654A - 단리된 세포 집단

Info

Publication number: KR20100042654A
Application number: KR1020107005050A
Authority: KR
Inventors: 히로마사 미야지; 마사히로 이까꾸; 히데따까 사또
Original assignee: 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
Priority date: 2007-08-08
Filing date: 2008-08-08
Publication date: 2010-04-26
Also published as: US20100303766A1; EP2184349A4; WO2009020201A1; EP2184349A1; CN101848991A; JPWO2009020201A1

Abstract

조혈 줄기세포 이식, 줄기세포 이식을 이용한 장해 조직의 수복 등에 있어서, 조직으로의 이행능이나 생착능이 우수한 세포가 요구되고 있다. 본 발명에 의해, 조직으로의 이행능이나 생착능이 우수한 세포 집단, 상기 세포를 함유하는 의약, 상기 세포의 이식 방법이 제공된다. 본 발명의 세포는 조혈 줄기세포 이식이나, 줄기세포 이식을 이용한 장해 조직의 수복 등에 유용하다.

Description

단리된 세포 집단 {ISOLATED CELL MASS}

본 발명은 조직으로의 이행능이나 생착능이 우수한 세포 집단, 상기 세포를 함유하는 의약, 상기 세포의 이식 방법에 관한 것이다.

장해를 받은 조직을 치료할 목적으로 가장 널리 행해지고 있는 세포 치료로서, 조혈 줄기세포나 조혈 전구세포를 이용한 이식이 행해지고 있다. 또한, 생체의 다양한 조직이나 장기에는 생체 조직 줄기세포나 전구세포가 존재한다고 보고되었고, 이들을 이용한 치료도 시도되고 있다.

성체 조직 줄기세포란, 다양한 성체 조직에 존재하는 줄기세포로, 자기 복제능과 분화능을 갖고, 조직의 항상성 유지에 기여하고 있는 것으로 생각되고 있다. 줄기세포는 조직에서 증식, 유지됨과 동시에, 한정된 증식능 밖에 갖지 않아 분화의 방향이 결정된 전구세포로 분화하고, 추가로 특정 기능을 갖는 조직세포로 분화한다. 예를 들면, 조혈 줄기세포는 성체에서는 주로 골수 조직에 존재하고 있고, 조혈 전구세포로 분화하고, 추가로 분화함으로써 적혈구, 백혈구, 혈소판, 및 림프구와 같은 모든 혈구로 성숙한다. 이와 같이 혈액 세포는 조혈 줄기세포에 의한 생산에서 시작하여, 유지되고 있다.

조혈 줄기세포 이식이란, 항종양 효과를 높이기 위해 골수의 최대 내용량(耐用量)을 상회하는 다량의 항암제나 전신 방사선 조사를 이용한 강력한 치료(이식전 처치)를 행하여, 환자 골수와 함께 악성 종양을 괴멸로 유도하고, 그 후에 동종 기증자 유래의, 또는 미리 동결 보존해 둔 환자 자신(자가)의 조혈 줄기세포를 주입함으로써 조혈능을 보충하는 치료법이다. 조혈 줄기세포 이식은 조혈 줄기세포의 채취법에 의해 골수이식, 말초혈 줄기세포 이식, 제대혈 이식으로 분류되며, 또한 조혈 줄기세포의 유래에 따라 동종 이식과 자가 이식으로 분류된다. 백혈병, 림프종 등의 혈액암뿐만 아니라, 고형암, 자기면역질환 등의 중증 질환의 치료에서도 골수 이식, 제대혈 이식, 말초혈 줄기세포 이식 등의 이식이 행해지고 있다.

또한, 조혈 줄기세포나 조혈 전구세포뿐만 아니라 간엽계 줄기세포나 혈관 내피 전구세포를 포함하는 골수 세포, 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF) 등에서 골수로부터 말초혈에 동원된 다양한 줄기세포나 전구세포를 포함하는 세포 집단, 제대혈 유래 줄기세포나 전구세포, 골수, 지방 조직 등으로부터 분리된 간엽계 줄기세포 등을 이용한, 장해 조직에 대한 세포 이식에 의한 치료가 시도되고 있다. 이들 세포를 환자에게 이식함으로써, 이식편대숙주병(graft versus host disease; GVHD), 클론병, 심근경색, 골다공증, 뇌경색, 간염, 폐렴, 당뇨병, 척수 손상, 신장염, 골절, 하지 허혈 등, 많은 질환에 대한 치료로의 응용 가능성이 검토되고 있다(하기 비특허문헌 1 내지 12 참조).

상기와 같이 조혈 줄기세포 이식은 기증자 세포의 차이에 따라 골수 이식, 말초혈 이식, 제대혈 이식으로 나뉜다. 특히 제대혈 이식은, 제대혈이 본래 폐기물인 점에서 기증자의 부담이 없게 이용하기 쉬운 점, 조직 적합성 항원의 일치도가 낮더라도 이식이 가능한 점, 제대혈 은행의 정비에 의해 긴급 대응이 가능한 점 등 다양한 이점이 있어, 최근 들어 이식 건수가 증가하고 있다(하기 비특허문헌 13 참조). 그러나, 제대혈 중의 세포수가 적은 점에서, 제대혈 이식의 결점으로서 이식 대상은 소아가 중심이어서, 성인으로의 이식에는 부적합한 점이 거론되고 있다(하기 비특허문헌 14 참조). 또한, 이식 후의 생착 부전이나 혈소판이나 호중구의 회복 지연 등의 이유로 인하여, 제대혈 이식은 골수 이식이나 말초혈 이식에 비해 이식 성적이 나쁘다(하기 비특허문헌 13, 15 참조). 골수나 제대혈의 조혈 줄기세포 이식의 임상 성적에 대해서는, 이식하는 조혈 줄기세포(CD34 양성 세포) 수가 많을수록 생존율이 좋고, 혈소판이나 호중구의 회복이 빠른 것으로 알려져 있다(하기 비특허문헌 16 내지 18 참조). 이 때문에, 많은 조혈 줄기세포를 확보하는 것이나 조혈 줄기세포를 효율적으로 생착시키는 것이 이식 현장에서 필요하며, 이들 과제를 해결하는 기술이나 제품은 조혈 줄기세포의 이식 성적을 향상시켜, 구명, 의료비 삭감, 환자의 삶의 질에 공헌할 것으로 기대된다.

성체에서는 조혈 줄기세포는 골수 조직에서 증식과 분화를 반복하며 조혈계를 유지하고 있다. 이식된 조혈 줄기세포는 말초혈 내를 통해 골수에 도착하여 골수 내에 생착된다. 이와 같이 어느 조직으로 이행하여 생착하는 것을 호밍이라 한다. 조혈 줄기세포의 골수로의 호밍에는 조혈 줄기세포와 골수 혈관의 상호 작용이 중요하다. 이 상호 작용은 조혈 줄기세포가 골수 혈관 내피 세포 상에서 롤링이나 접착을 일으키는 과정에서 발생하며, 이 상호 작용의 결과, 조혈 줄기세포는 혈관 내피세포를 통과하여 골수 내로 이행한다. 롤링이나 접착은 조혈 줄기세포와 골수 혈관 내피세포 상의 접착 분자에 의해 제어되고 있다. 조혈 줄기세포의 생착에 관련된 골수혈관 내피세포에 발현하는 분자로서, E-셀렉틴이나 P-셀렉틴이 중요한 것으로 알려져 있다(하기 비특허문헌 19 참조). 한편, 조혈 줄기세포에 발현하는 접착 분자는 당단백으로서 복수 존재하고 있다. P-셀렉틴의 리간드인 P-selectin glycoprotein ligand-1(PSGL-1)(하기 비특허문헌 20 내지 23 참조), 또한 E-셀렉틴의 리간드로서 α-4 integrin(하기 비특허문헌 24 참조)이나 CD44(하기 비특허문헌 25 참조), E-selectin ligand-1(ESL-1)(하기 비특허문헌 26 참조)이 알려져 있다. 이들 코어 단백 상의 당쇄가 α2,3-시알릴화 및 α1,3-푸코실화됨으로써 생성되는 시알릴 루이스 X 당쇄가 셀렉틴의 리간드로서 기능하고 있다.

α1,3-푸코실화를 촉매하는 효소는 α1,3-푸코실트랜스페라아제(FT)라 불리며, 인간에서는 6 종류(FT3, FT4, FT5, FT6, FT7, FT9)가 알려져 있다. 이 중 혈액 세포에서 발현이 확인된 것은 FT4, FT7, FT9이다. 각각의 FT는 효소 반응성이 달라, FT7에 의한 푸코실화에서는 시알릴 루이스 X 당쇄만 생성되지만, FT6에 의한 푸코실화에서는 시알릴 루이스 X 당쇄에 더하여 루이스 X 당쇄도 생성된다. 루이스 X 당쇄는 단구·과립구 등의 혈액 세포에 발현되지만, 셀렉틴 리간드로서의 기능은 없다. 상기 6종의 FT에 대해서는 현재로서는 발현 부위나 발현 제어 기구, 반응 특이성 등에 대하여 충분히 해명되지 않았다(하기 비특허문헌 27 참조).

조혈 줄기세포를 생체 외에서 FT에 의해 처리하고, 시알릴 루이스 X 당쇄를 부가함으로써 셀렉틴 리간드량을 증가시키는 방법이 보고되어 있다. 시아(Xia) 등은 세포주를 FT6에 의해 처리함으로써 시알릴 루이스 X 당쇄가 증가하는 것, 및 E-셀렉틴이나 P-셀렉틴으로의 결합능이 상승하는 것을 확인하고 있다(하기 비특허문헌 28 참조). 또한, 히달고(Hidalgo) 등은 제대혈 유래 CD34 양성 세포는 PSGL-1을 발현하지만 P-셀렉틴으로의 결합능이 없는 점에서, PSGL-1의 번역후 수식이 중요할 가능성을 시사하고 있다(하기 비특허문헌 29 참조). 또한, FT6에 의해 처리한 제대혈 유래 CD34 양성 세포는 시알릴 루이스 X 당쇄가 증가하고, E-셀렉틴 및 P-셀렉틴으로의 결합능이 상승하며, 이식했을 경우에 골수 혈관 내피와 상기 CD34 양성 세포와의 상호 작용(rolling과 arrest)이 증강하는 것으로 알려져 있다(하기 특허문헌 1 참조). 그러나, 상기 세포의 골수로의 호밍 효율은 향상되지 않은 것으로 발견되어, FT6에 의한 시알릴 루이스 X 당쇄 부가와 E-셀렉틴 및 P-셀렉틴으로의 결합능 상승만으로는 혈관 내피세포와의 상호 작용은 증강하더라도, 그 후의 골수 내로의 이행, 생착 등의 호밍 과정에서는 효과가 없음이 시사되었다(하기 비특허문헌 30 참조). 한편, 시아 등은 동일 FT6 처리한 인간 제대혈 유래 단핵구 세포의 이식 실험에 있어서, 이식 6주일 후에 골수의 인간 혈액 세포의 비율이 2배 정도 증가하였음을 보고하고 있다(하기 비특허문헌 31, 특허문헌 2 참조).

또한, 간엽계 줄기세포를 생체 외에서 FT6에 의해 처리하고, 시알릴 루이스 X 당쇄를 부가함으로써 셀렉틴 리간드량을 증가시키는 방법이 보고되어 있다. FT6 처리한 간엽계 줄기세포의 이식 실험에 있어서, 간엽계 줄기세포의 골수로의 이행 세포수의 증가가 관찰되었다(하기 비특허문헌 32 참조).

또한, 신경 줄기세포를 생체 외에서 FT6에 의해 처리하고, 시알릴 루이스 X 당쇄를 부가함으로써 셀렉틴 리간드량을 증가시키는 방법이 보고되어 있다(하기 특허문헌 3 참조).

상기와 같은 보고는 있지만, FT의 종류나 특이성의 차이에 의한 조혈 줄기세포의 호밍능에 대한 영향은 알려져 있지 않다. 또한, 줄기세포의 루이스 X 당쇄의 발현이 골수 조직 등으로의 이행능이나 생착능에 미치는 영향에 대해서는 전혀 알려져 있지 않다. 또한, α1,3-푸코실트랜스페라아제의 일종인 FT7이, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 신경 줄기세포 등의 조직으로의 이행능이나 생착능에 미치는 영향에 대해서는 알려져 있지 않다.

WO2005/017115 WO2004/094619 US2008/0044383

최신의학 현대 의료의 최전선 2003년 3월 증간호 최신의학사 의학의 발자취 vol.217 No.5 2006년 의치약 출판 주식회사 Current Opinion in Investigational Drugs, 7, 473-81 (2006) StemCells, 24, 2292-2298 (2006) J Cell Physiol, 211, 27-35 (2007) Experimental Neurology, 199, 56-66 (2006) Cellular and Molecular Neurology, 26, 1167-1180 (2006) Proc Natl Acad Sci USA, 103, 17438-17443 (2006) FASEB J, 19, 992-994 (2005) American Heart J, 153, e1-8 (2007) J Clin Invest, 114, 330-338 (2004) Proc Am Thorac Soc, 5, 323-327 (2008) Blood, 97, 2962-2971 (2001) N Eng J Med, 339, 1565-1577 (1998) Blood, 97, 2957-2961(2001) N Engl J Med, 344, 1815-1822 (2001) Blood, 100, 1611-1618 (2002) British J Haematology, 124, 769-776 (2004) Proc Natl Acad Sci USA, 95, 14423-14428 (1998) J Cell Biol, 118, 445-456 (1992) J Exp Med, 191, 1413-1432 (2000) Blood, 85, 3466-3477 (1995) Exp Hematol, 24, 1494-1500 (1996) Blood, 102, 2060-2067 (2003) J Cell Biol, 153, 1277-1286 (2001) J Biol Chem, 276, 31602-31612 (2001) Lowe, J.B., D. Vestweber, ed (Harwood Academic Publishers) pp. 143-177 (1996) Blood, 100, 4485-4494 (2002) J Clin Invest, 110, 559-569 (2002) Blood, 105, 567-575 (2005) Blood, 104, 3091-3096 (2004) Nature Medicine, 14, 181-187 (2008)

조혈 줄기세포나 조혈 전구세포 등, 다양한 세포를 이용한 이식에 있어서, 이식한 세포의 골수나 장해 조직으로의 이행, 생착이 우수한 세포 집단을 얻을 수 있으면, 적은 세포로 치료 효과를 기대할 수 있고, 또한 치료 효과의 개선뿐만 아니라 상기 문제점의 극복이 기대된다.

본 발명의 목적은, 조직으로의 이행능이나 생착능이 우수한 세포 집단, 상기 세포 집단을 함유하는 의약, 상기 세포 집단의 이식 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 이하의 (1) 내지 (49)에 관한 것이다.

(1) 시알릴 루이스 X 당쇄가 발현되고 루이스 X 당쇄가 실질적으로 발현되지 않은, 단리된 세포 집단.

(2) 세포 분획 처리로 얻어지는, (1)에 기재된 세포 집단.

(3) 푸코스 공여체의 존재하에 α1,3-푸코실트랜스페라아제로 세포를 처리함으로써 얻어지는, (1) 또는 (2)에 기재된 세포 집단.

(4) α1,3-푸코실트랜스페라아제가 α1,3-푸코실트랜스페라아제 7인, (3)에 기재된 세포 집단.

(5) α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인, (3)에 기재된 세포 집단.

(6) α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 60％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드인, (3)에 기재된 세포 집단.

(7) α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드인, (3)에 기재된 세포 집단.

(8) α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA로 코딩되는 폴리펩티드인, (3)에 기재된 세포 집단.

(9) α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA로 코딩되는 폴리펩티드이며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드인, (3)에 기재된 세포 집단.

(10) 세포가 줄기세포 또는 전구세포인, (1) 내지 (9) 중 어느 한 항에 기재된 세포 집단.

(11) 줄기세포 또는 전구세포가 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포인, (10)에 기재된 세포 집단.

(12) 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포가 CD34 양성 조혈 줄기세포 또는 CD34 양성 조혈 전구세포인, (11)에 기재된 세포 집단.

(13) CD34 양성 조혈 줄기세포가 CD38 음성 조혈 줄기세포인, (12)에 기재된 세포 집단.

(14) 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포가 CD34 음성이면서 Lineage 음성 조혈 줄기세포 또는 CD34 음성이면서 Lineage 음성 조혈 전구세포인, (11)에 기재된 세포 집단.

(15) 줄기세포가 간엽계 줄기세포인, (10)에 기재된 세포 집단.

(16) 줄기세포 또는 전구세포가 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포인, (10)에 기재된 세포 집단.

(17) 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 Nestin 양성 신경 줄기세포 또는 Nestin 양성 신경 전구세포인, (16)에 기재된 세포 집단.

(18) 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 Sox2 양성 신경 줄기세포 또는 Sox2 양성 신경 전구세포인, (16)에 기재된 세포 집단.

(19) 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 Musashi 1 양성 신경 줄기세포 또는 Musashi 1 양성 신경 전구세포인, (16)에 기재된 세포 집단.

(20) 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 CD34 양성 신경 줄기세포 또는 CD34 양성 신경 전구세포인, (16)에 기재된 세포 집단.

(21) 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 CD133 양성 신경 줄기세포 또는 CD133 양성 신경 전구세포인, (16)에 기재된 세포 집단.

(22) 세포가 인간 유래의 세포인, (1) 내지 (21) 중 어느 한 항에 기재된 세포 집단.

(23) 세포가 골수, 비장, 제대혈, 말초혈, 지방 조직, 신경 조직으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조직에서 유래된 세포인, (1) 내지 (22) 중 어느 한 항에 기재된 세포 집단.

(24) (1) 내지 (23) 중 어느 한 항에 기재된 세포 집단을 함유하는 의약.

(25) (1) 내지 (23) 중 어느 한 항에 기재된 세포 집단을 생체 내에 투여하는 것을 특징으로 하는, 세포 집단의 이식 방법.

(26) 분획 처리에 의해 세포를 얻는 것을 특징으로 하는, 시알릴 루이스 X 당쇄가 발현되고 루이스 X 당쇄가 실질적으로 발현되지 않은 세포의 제조 방법.

(27) 푸코스 공여체의 존재하에 α1,3-푸코실트랜스페라아제로 처리함으로써 세포를 얻는 것을 특징으로 하는, 시알릴 루이스 X 당쇄가 발현되고 루이스 X 당쇄가 실질적으로 발현되지 않은 세포의 제조 방법.

(28) α1,3-푸코실트랜스페라아제가 α1,3-푸코실트랜스페라아제 7인, (27)에 기재된 제조 방법.

(29) α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인, (27)에 기재된 제조 방법.

(30) α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 60％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드인, (27)에 기재된 제조 방법.

(31) α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드인, (27)에 기재된 제조 방법.

(32) α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA로 코딩되는 폴리펩티드인, (27)에 기재된 제조 방법.

(33) α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA로 코딩되는 폴리펩티드이며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드인, (27)에 기재된 제조 방법.

(34) 세포가 줄기세포 또는 전구세포인, (26) 내지 (33) 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.

(35) 줄기세포 또는 전구세포가 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포인, (34)에 기재된 제조 방법.

(36) 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포가 CD34 양성 조혈 줄기세포 또는 CD34 양성 조혈 전구세포인, (35)에 기재된 제조 방법.

(37) CD34 양성 조혈 줄기세포가 CD38 음성 조혈 줄기세포인, (36)에 기재된 제조 방법.

(38) 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포가 CD34 음성이면서 Lineage 음성 조혈 줄기세포 또는 CD34 음성이면서 Lineage 음성 조혈 전구세포인, (35)에 기재된 제조 방법.

(39) 줄기세포가 간엽계 줄기세포인, (34)에 기재된 제조 방법.

(40) 줄기세포 또는 전구세포가 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포인, (34)에 기재된 제조 방법.

(41) 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 Nestin 양성 신경 줄기세포 또는 Nestin 양성 신경 전구세포인, (40)에 기재된 제조 방법.

(42) 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 Sox2 양성 신경 줄기세포 또는 Sox2 양성 신경 전구세포인, (40)에 기재된 제조 방법.

(43) 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 Musashi 1 양성 신경 줄기세포 또는 Musashi 1 양성 신경 전구세포인, (40)에 기재된 제조 방법.

(44) 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 CD34 양성 신경 줄기세포 또는 CD34 양성 신경 전구세포인, (40)에 기재된 제조 방법.

(45) 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 CD133 양성 신경 줄기세포 또는 CD133 양성 신경 전구세포인, (40)에 기재된 제조 방법.

(46) 세포가 인간 유래의 세포인, (26) 내지 (45) 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.

(47) 세포가 골수, 비장, 제대혈, 말초혈, 지방 조직, 신경 조직으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조직에서 유래된 세포인, (26) 내지 (46) 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.

(48) (26) 내지 (47) 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 세포를 함유하는 의약.

(49) (26) 내지 (47) 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 세포를 생체 내에 투여하는 것을 특징으로 하는, 세포의 이식 방법.

본 발명에 의해, 조직으로의 이행능이나 생착능이 우수한 세포 집단, 상기 세포 집단을 함유하는 의약, 상기 세포 집단의 이식 방법이 제공된다. 본 발명의 세포 집단은 장해 조직의 수복 등에 유용하다.

[도 1] 도 1은 제대혈 단핵구 세포로부터 분리한 CD34 양성 세포의 FACS 해석 결과를 나타내는 도면이다. 분리한 CD34 양성 세포는 순도 95％ 이상이다. 좌측 도면의 A에서 인간 조혈 줄기세포인 CD34 양성이면서 CD38 음성 세포의 집단을 게이트하여 해석하였다.
[도 2] 도 2는 인간 조혈 줄기세포(CD34 양성이면서 CD38 음성 세포)를 FT6 또는 FT7에 의해 처리했을 때의, 시알릴 루이스 X 당쇄와 루이스 X 당쇄의 발현량을 미처리 세포와 비교한 결과를 나타내는 도면이다. A, C, E에 시알릴 루이스 X 당쇄의 발현량을, B, D, F에 루이스 X 당쇄의 발현량을 나타낸다.
[도 3] 도 3은 인간 조혈 줄기세포(CD34 양성이면서 CD38 음성 세포)를 FT6 또는 FT7에 의해 처리했을 때의 셀렉틴 결합능을 미처리 세포와 비교한 결과를 나타내는 도면이다. 음성 대조구로서, CD40-Fc 키메라 단백질 처리한 세포의 해석 결과를 나타낸다.
[도 4는] 도 4는 인간 조혈 줄기세포(CD34 양성이면서 CD38 음성 세포)를 FT6 또는 FT7에 의해 처리했을 때의 골수 이행능을 미처리 세포와 비교한 결과를 나타내는 도면이다. 우측 도면에 이식 12 내지 18시간 후의 NOD/SCID 마우스의 골수에 이행한 인간 조혈 줄기세포(CD45 양성이면서 CD34 양성 세포)의 FACS 해석예를 나타낸다.
[도 5] 도 5는 인간 조혈 줄기세포(CD34 양성이면서 CD38 음성 세포)를 FT6 또는 FT7에 의해 처리했을 때의, 골수에서의 인간 혈구의 생착률을 미처리 세포와 비교한 결과를 나타내는 도면이다. 이식 8 내지 9주일 후에 NOD/SCID 마우스의 골수에 생착한 인간 혈액세포를 나타낸다. 게이트로 나타낸 Human CD45 양성 세포는 인간 혈액세포를 나타내고, Mouse CD45 양성 세포는 마우스 혈액세포를 나타낸다.
[도 6] 도 6은 인간 조혈 줄기세포(CD34 양성이면서 CD38 음성 세포)를 FT6 또는 FT7에 의해 처리했을 때의, 골수에서의 인간 혈구의 생착률을 미처리 세포와 비교한 결과를 나타내는 도면이다. 이식 8 내지 9주일 후에 NOD/SCID 마우스 골수에 생착한 인간 혈액세포를 나타낸다. 종축은 인간 혈액세포의 생착률(인간 혈액세포의 비율)을 대수 표시로 나타낸 것이다. 종축의 값은 인간 혈액세포의 비율(％)의 평균치±SD를 나타낸다.
[도 7] 도 7은 인간 간엽계 줄기세포(hMSC)를 효소 미처리 또는 FT7 처리 후, 유세포 분석기(flow cytometry)로 해석한 결과이다. "항체 없음"은 항체로 처리하지 않은 hMSC, "항시알릴 루이스 X 항체"는 항시알릴 루이스 X 당쇄 항체로 처리 후, 2차 항체로서 FITC 표지 항마우스 Ig 항체로 처리한 hMSC, "항루이스 X 항체"는 FITC 표지 항인간 CD15 항체로 처리한 hMSC를 해석한 결과를 나타낸다. 종축은 세포수, 횡축은 형광 강도를 나타낸다.
[도 8] 도 8은 마우스 사염화탄소 간 장해 모델에, FT7 효소 처리 hMSC 또는 미처리 hMSC(음성 대조구)를 각각 1×10⁵ 세포 이식하고(각 군 n=5), 24시간 후에 간장을 적출하여 콜라게나아제 처리하고, 얻어진 세포를 비오틴 표지 Mouse Lineage Panel로 처리 후, PerCP 표지 스트렙트아비딘 및 PE 표지 항인간 CD90 항체로 처리하고, 유세포 분석기로 해석한 결과를 나타낸다. 약 1.5×10⁶ 간장 세포당 PE 양성 세포수를 이식한 hMSC의 간장으로의 이행률(％)로서 산출하였다. 종축의 값은 각 개체의 이행률의 평균±SD를 나타낸다.
[도 9] 도 9는 마우스 사염화탄소 간장 장해 모델에, FT7 효소 처리 hMSC 또는 미처리 hMSC(음성 대조구)를 각각 5×10⁵ 세포 이식하고(각 군 n=6), 18시간 후에 간장을 적출하여 콜라게나아제 처리하고, 얻어진 세포를 PE-Cy7 표지 스트렙트아비딘, FITC 표지 항마우스 CD45 항체, FITC 표지 항마우스 Ter119 항체 및 PE 표지 항인간 CD90 항체로 처리하고, 유세포 분석기로 해석한 결과를 나타낸다. 1×10⁶ 간장 세포당 PE 양성 세포수를 이식한 hMSC의 간장으로의 이행수로서 산출하였다. 종축의 값은 각 개체의 이행수의 평균±SD를 나타낸다.
[도 10] 도 10은 마우스 사염화탄소 간장 장해 모델에, FT7 효소 처리 hMSC 또는 미처리 hMSC(음성 대조구)를 각각 5×10⁵ 세포 이식하거나(각 군 n=6), 또는 용매(PBS)를 투여하고, 18시간 후의 혈액 생화학 파라미터[(A) Total-Bilirubin, (B) AST, (C) ALT, (D) ALP, (E) LDH]를 후지 드라이 켐에 의해 계측하였다. 종축의 값은 각 개체의 값의 평균±SD를 나타낸다.
[도 11] 도 11은 마우스 사염화탄소 폐 장해 모델에, FT7 효소 처리 hMSC 또는 미처리 hMSC(음성 대조구)를 각각 5×10⁵ 세포 이식하고(각 군 n=5), 18시간 후에 폐를 적출하여 콜라게나아제·엘라스타아제 처리하고, 얻어진 세포를 PE-Cy7 표지 스트렙트아비딘, FITC 표지 항마우스 CD45 항체, FITC 표지 항마우스 Ter119 항체 및 PE 표지 항인간 CD90 항체로 처리하고, 유세포 분석기로 해석한 결과를 나타낸다. 1×10⁵개 폐세포당 PE 양성 세포수를 이식한 hMSC의 폐로의 이행수로서 산출하였다. 종축의 값은 각 개체의 이행수의 평균±SD를 나타낸다.
[도 12] 도 12는 신경 줄기세포·신경 전구세포를 FT7에 의해 처리했을 때의, 시알릴 루이스 X 당쇄와 루이스 X 당쇄의 발현량을 미처리 세포와 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 13] 도 13은 신경 줄기세포·신경 전구세포를 FT7에 의해 처리했을 때의, 각종 셀렉틴으로의 결합능을 미처리 세포와 비교한 결과를 나타내는 도면이다.

1. 본 발명의 세포

본 발명의 세포 집단은, 시알릴 루이스 X 당쇄가 발현되고 루이스 X 당쇄가 실질적으로 발현되지 않은 세포를 포함하는 세포로부터 단리함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 세포 집단을 포함하는 세포로서는, 본 발명의 세포 집단을 포함하고 있으면 어떠한 세포여도 좋지만, 줄기세포나 전구세포가 포함되어 있는 것이 바람직하다.

여기서, 루이스 X 당쇄가 실질적으로 발현되지 않았다란, 루이스 X 당쇄가 음성 또는 음성과 동등하며, 시알릴 루이스 X 당쇄의 발현과 비교하여 그 정도가 유의하게 낮은 것을 말한다. 또한, 루이스 X 당쇄의 발현이, 루이스 X 당쇄를 인위적으로 발현시키지 않은 경우와 동일 정도의 발현인 것을 말한다.

본 발명의 세포 집단을 포함하는 세포는 어떠한 동물 유래의 세포여도 좋지만, 바람직하게는 인간 유래 세포, 비인간 영장류 유래 세포, 소 유래 세포, 말 유래 세포, 돼지 유래 세포, 양 유래 세포, 염소 유래 세포, 개 유래 세포, 고양이 유래 세포, 설치류 유래 세포, 보다 바람직하게는 인간 유래 세포, 비인간 영장류 유래 세포, 더욱 바람직하게는 인간 유래 세포를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 세포 집단을 포함하는 세포는 어떠한 조직에서 유래된 세포이든 좋지만, 바람직하게는 골수 유래 세포, 비장 유래 세포, 제대혈 유래 세포, 말초혈 유래 세포, 지방 조직 유래 세포, 신경 조직 유래 세포, 보다 바람직하게는 골수 유래 세포, 제대혈 유래 세포, 말초혈 유래 세포, 지방 조직 유래 세포, 더욱 바람직하게는 골수 유래 세포나 제대혈 유래 세포를 들 수 있다.

줄기세포로서는, 바람직하게는 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 신경 줄기세포 등을 들 수 있다. 조혈 줄기세포로서는 CD34 양성 조혈 줄기세포나 CD34 양성 CD38 음성 조혈 줄기세포, CD34 음성 Lineage 음성 조혈 줄기세포 등을 들 수 있다. 신경 줄기세포로서는 CD34 양성 신경 줄기세포, CD133 양성 신경 줄기세포, Nestin 양성 신경 줄기세포, Sox2 양성 신경 줄기세포, Musashi 1 양성 신경 줄기세포 등을 들 수 있다.

전구세포로서는, 바람직하게는 조혈 전구세포, 신경 전구세포 등을 들 수 있다. 조혈 전구세포로서는 CD34 양성 조혈 전구세포, CD34 음성 Lineage 음성 조혈 전구세포 등을 들 수 있다. 신경 전구세포로서는, CD34 양성 신경 전구세포, CD133 양성 신경 전구세포, Nestin 양성 신경 전구세포, Sox2 양성 신경 전구세포, Musashi 1 양성 신경 전구세포 등을 들 수 있다.

이들 세포를 동물 개체로부터 회수한 후, 배양에 의해 증식시킬 수도 있다. 또한, 회수 직후의 세포 집단을 이용할 수도 있고, 냉동 등의 보존 처리 후의 세포나, 세포 분획 처리나 효소 처리를 거친 세포 집단을 이용할 수도 있다.

본 발명의 세포는 E-셀렉틴으로의 결합능, 생체 조직으로의 이행능, 생체조직으로의 생착능이 우수하여, 조혈 줄기세포 이식이나 줄기세포 이식을 이용한 장해 조직의 수복에 유용하다.

본 발명의 세포가 이행, 생착하는 생체 조직으로서는 골수 조직 또는 장해 조직을 들 수 있다. 골수 조직으로서는 화학 요법 또는 방사선 조사를 받은 환자의 골수 조직을 들 수 있고, 장해 조직으로서는 뇌, 심장, 폐, 장관, 신장, 췌장, 간장, 피부, 혈관 등의 조직의 장해 조직을 들 수 있다.

2. 본 발명의 세포의 제조 방법

본 발명에서 이용되는 세포 집단의 제조 방법으로서는 시알릴 루이스 X 당쇄가 발현되고 루이스 X 당쇄가 실질적으로 발현되지 않은 세포 집단을 단리할 수 있는 방법이면, 어떠한 방법이든 좋다. 구체적인 방법으로서는, 세포 분획 처리에 의한 제조 방법이나, 푸코스 공여체의 존재하에 α1,3-푸코실트랜스페라아제에 의해 처리하는 방법 등을 들 수 있다.

세포 분획 처리에 의한 제조 방법으로서는 시알릴 루이스 X 당쇄 및 루이스 X 당쇄의 식별에 의해 원하는 세포를 회수하는 방법 등을 들 수 있다. 상기 방법으로서는, 시알릴 루이스 X 당쇄 및 루이스 X 당쇄를 인식하는 항체를 이용하는 방법, 마이크로비드 및 자석을 이용하는 방법, 항체를 고정한 담체로 제작한 컬럼을 이용하는 방법 등을 들 수 있다.

시알릴 루이스 X 당쇄 및 루이스 X 당쇄를 인식하는 항체를 이용하는 방법으로서는, 각각의 당쇄를 인식하는 항체를 세포와 반응시킨 후, 셀소터에 의해 시알릴 루이스 X 당쇄의 발현이 높고, 루이스 X 당쇄의 발현이 낮은 세포 집단을 회수하는 방법을 들 수 있다. 발현이 높은 세포 집단이란, 음성 대조구의 세포 집단보다 높은 형광도를 나타내는 세포 집단을 말한다. 음성 대조구로서는, 이소타입 대조구 항체를 이용하여 반응시킨 세포 집단을 들 수 있다. 발현이 낮은 세포 집단이란 양성 대조구보다 낮은 형광도를 나타내는 세포 집단을 말한다. 양성 대조구로서는, 예를 들면 혈액 세포의 경우에는 항 CD45 항체를 이용하여 반응시킨 세포 집단을 들 수 있다.

마이크로비드 및 자석을 이용하는 방법으로서는, 루이스 X 당쇄 양성의 세포 분획을 제거한 후, 시알릴 루이스 X 당쇄 양성의 세포 분획을 회수하는 방법, 또는 시알릴 루이스 X 당쇄 양성의 세포 분획을 회수한 후, 루이스 X 당쇄 음성의 세포 분획을 회수하는 방법 등을 들 수 있다.

푸코스 공여체의 존재하에 α1,3-푸코실트랜스페라아제에 의해 처리하는 방법으로서는, 푸코스 공여체의 존재하에 세포에 α1,3-푸코실트랜스페라아제를 첨가하는 방법, α1,3-푸코실트랜스페라아제를 유지한 컬럼, 디쉬, 백, 주사 시린지 안에서 세포를 처리하는 방법 등을 들 수 있다. 또한, α1,3-푸코실트랜스페라아제를 코딩하는 유전자를 도입한 세포주나 그의 추출물 등을 이용하여 세포를 처리할 수도 있다.

α1,3-푸코실트랜스페라아제로서는, α1,3-푸코실트랜스페라아제 7이 바람직하다. 인간 α1,3-푸코실트랜스페라아제 7로서는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 들 수 있다. 또한, α1,3-푸코실트랜스페라아제로서는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 60％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드나, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA에 코딩되는 폴리펩티드, 또는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA에 코딩되는 폴리펩티드이면서, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드일 수도 있다.

또한, α1,3-푸코실트랜스페라아제를 코딩하는 유전자를 도입한 세포주나 그의 추출물 등을 이용하여 세포를 처리할 때에 이용하는 유전자로서는, 인간 α1,3-푸코실트랜스페라아제 7을 코딩하는 유전자, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 60％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자나, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 코딩하는 유전자, 또는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA이며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 이용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 60％ 이상의 상동성을 가지면서, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드란, BLAST〔J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)〕이나 FASTA〔Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)〕 등의 해석 소프트를 이용하여 계산했을 때에, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 적어도 60％ 이상, 바람직하게는 70％ 이상, 보다 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상, 가장 바람직하게는 97％ 이상인 폴리펩티드인 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질로서는, 예를 들면 문헌 [모레큘라 클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈 인 모레큘라 바이올로지, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)] 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA에 부위 특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있는 단백질을 들 수 있다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 1개 이상으로, 그의 수는 특별히 한정되지 않지만, 상기 부위 특이적 변이 도입법 등의 주지 기술에 의해 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 수로서, 예를 들면 1 내지 수십개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개이다.

본 발명에 있어서, 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA란, 예를 들면 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 등의 DNA 또는 그의 일부의 단편을 프로브로 하여, 콜로니 혼성화법, 플라크 혼성화법 또는 서던 블롯 혼성화법 등을 이용함으로써 얻어지는 DNA를 의미하며, 구체적으로는, 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA를 고정화한 필터를 이용하여, 0.7 내지 1.0 mol/L의 염화나트륨 존재하에 65℃에서 혼성화를 행한 후, 0.1 내지 2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은 150 mmol/L 염화나트륨, 15 mmol/L 시트르산나트륨으로 이루어짐)을 이용하여, 65℃ 조건하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA를 들 수 있다. 혼성화는 문헌 [모레큘라 클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈 인 모레큘라 바이올로지, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)] 등에 기재되어 있는 방법에 준하여 행할 수 있다. 혼성화 가능한 DNA로서 구체적으로는, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열과 적어도 60％ 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 70％ 이상, 보다 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상, 가장 바람직하게는 97％ 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.

푸코스 공여체로서는, α1,3-푸코실트랜스페라아제에 대하여 푸코스를 공여할 수 있는 것이면 어떠한 공여체여도 좋고, 예를 들면 GDP-푸코스 등을 들 수 있다.

3. 본 발명의 세포의 생체 조직으로의 이행능 , 생착능을 조사하는 방법

본 발명의 세포 집단의 생체 조직으로의 이행능, 생착능을 조사하는 방법으로서는, 예를 들면 마우스에 이식한 인간 조혈 줄기세포의 마우스의 골수 중에서의 존재를 조사하는 방법을 들 수 있다. 반치사량의 X선을 마우스에 조사한 후, 인간 조혈 줄기세포를 꼬리정맥 주사에 의해 이식하고, 대퇴골 및 경골로부터 골수 세포를 회수하여 마우스의 골수 중의 세포를 조사할 수 있다. 예를 들면, 인간 CD45 양성이면서 인간 CD34 양성 세포의 세포수를 해석함으로써 마우스 골수로의 이행능을 조사할 수 있고, 인간 CD45 양성 세포수와 마우스 CD45 양성 세포의 합계에서 차지하는 인간 CD45 양성 세포의 비율을 산출함으로써 마우스 골수로의 생착능을 조사할 수 있다.

또한, 마찬가지로 마우스에 이식한 인간 간엽계 줄기세포의 마우스 조직 내에서의 존재를 조사하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 사염화탄소로 야기한 간 장해, 또는 폐 장해[BioFactors, 26, 81-92 (2006)] 모델 동물에 인간 간엽계 줄기세포를 꼬리정맥 또는 그 밖의 정맥, 또는 조직 직접 투여에 의해 이식하여 조직 중의 세포를 조사할 수 있다. 예를 들면, 인간 간엽계 줄기세포는 CD90 양성이고, 간장·폐 세포 등은 스트렙트아비딘에 결합하기 때문에, 스트렙트아비딘 결합 세포당 인간 CD90 양성 세포의 비율을 산출함으로써 각 조직으로의 인간 간엽계 줄기세포의 이행능을 조사할 수 있다.

또한, 마찬가지로 마우스에 이식한 마우스 신경 줄기세포의 마우스 조직내에서의 존재를 조사하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 동물에, 형광 표지한 마우스 신경 줄기세포를 꼬리정맥 또는 그 밖의 정맥, 또는 조직 직접 투여에 의해 이식하여 조직 중의 세포를 조사할 수 있다. 형광 표지 세포로서는, 형광 단백 Green Fluorescent Protein을 발현하는 유전자 도입 마우스[FEBS Lett., 407, 313-319 (1997)]로부터 분리한 세포나, PKH 등을 이용한 생세포 표지법[Eur. J. Immunol., 28, 3066-3074 (1998)]에 의해 제조한 세포를 사용할 수 있다.

4. 본 발명의 세포를 함유하는 의약

본 발명의 세포 집단은 E-셀렉틴으로의 결합능, 생체 조직으로의 이행능, 생체 조직으로의 생착능이 우수하기 때문에, 본 발명의 세포를 함유하는 의약은 조혈 줄기세포 이식이나, 줄기세포 이식을 이용한 장해 조직의 수복에 유용하다.

본 발명의 세포 집단을 함유하는 의약 제제는, 활성 성분으로서 본 발명의 세포를 단독으로, 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염과 함께, 또는 임의의 다른 치료를 위한 유효 성분과의 혼합물로서 함유할 수 있다. 또한, 이들 의약 제제는 본 발명의 세포 집단을 약리학적으로 허용되는 1종 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하고, 세포 제제학의 기술 분야에서 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조된다.

투여 경로는 치료시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 본 발명의 세포 집단을 함유하는 의약에 대해서는 정맥내 등의 경로를 들 수 있다.

주사제 등에 적당한 제제는, 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장인 활성 화합물을 포함하는 멸균 수성제로 이루어진다. 예를 들면, 주사제의 경우에는, 필요에 따라 염 용액, 포도당 용액 또는 염수와 포도당 용액의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 이용하여 주사용 용액을 제조할 수 있다. 또한, 희석제, 방부제, 향미류, 부형제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제, 가소제 등으로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 보조 성분을 필요에 따라 첨가할 수도 있다.

본 발명의 세포 집단을 함유하는 의약 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염의 투여량 및 투여 횟수는 투여 형태, 환자의 연령, 체중, 치료해야 할 증상의 성질 또는 중증도에 따라 다르지만, 1회에 대하여 100개 이상의 세포수를 투여하는 것이 바람직하다.

5. 본 발명의 세포의 이식 방법

본 발명의 세포의 이식 방법으로서는 인간에 이식 가능한 방법이면 어떠한 방법이든 좋다. 구체적으로는, 점적, 정맥 주사에 의한 방법을 들 수 있지만, 골수, 뇌, 심장, 폐, 장관, 신장, 췌장, 간장 등의 각종 조직에 직접 투여하는 방법일 수 있다.

이하에 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하지만, 이하의 실시예는 예시의 목적으로만 개시된다. 따라서, 본 발명의 범위는 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

항체, 셀렉틴 - IgG 융합 단백질, α1,3-푸코실트랜스페라아제 의 제조

Fluorescein isothiocyanate(FITC) 표지 항인간 루이스 X 항체(HI98), FITC 표지 항마우스 IgM 항체(II/41), IgM 이소타입 대조구 항체(11E10), Phycoerythrin (PE) 표지 항인간 CD38 항체(HIT2), PE 표지 항마우스 CD45 항체(30-F11), PE 표지 항마우스 TER-119 항체(TER-119), Allophycocyanin (APC) 표지 인간 CD34 항체(581)는 벡톤 디킨슨 파민젠사로부터 구입하였다. FITC 표지와 APC 표지의 인간 CD45 항체(HI30)는 eBioscience사로부터 구입하였다. FITC 표지 항인간 IgG 항체는 DAKOCytomation사로부터 구입하였다.

항인간 시알릴 루이스 X 당쇄 항체(KM93)는 하이브리도마 배양 상청으로부터 회수한 항체를 이용하였다[Hanai 등 Cancer Research, 46, 4438-4443 (1986)].

인간 E-셀렉틴과 인간 IgG 정상 영역(Fc)의 융합 단백질(이하, E-셀렉틴-Fc 키메라 단백질이라 함), 및 인간 P-셀렉틴과 Fc의 융합 단백질(이하, P-셀렉틴-Fc 키메라 단백질이라 함)의 생산은 공지된 방법[Yago 등 Journal of Immunology, 15, 707-714 (1997)]에 따라 행하였다. 또한, 상기와 동일하게 하여, 인간 L-셀렉틴과 Fc의 융합 단백질(이하, L-셀렉틴-Fc 키메라 단백질이라 함)[Siegelman 등 Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 5562-5566 (1989)] 및 인간 CD40과 Fc의 융합 단백질(이하, CD40-Fc 키메라 단백질이라 함)[Hollenbaugh 등 EMBO J, 11, 4313-4321 (1992)]의 생산을 행하였다. α1,3-푸코실트랜스페라아제 6 및 7(FT6, FT7)은 Namalwa 세포에 발현시켜 정제하였다[Shinoda 등 Journal of Biological Chemistry, 272, 31992-31997(1997)].

인간 제대혈 세포와 CD34 양성 세포

인간 제대혈 유래 조혈 줄기세포에 대해서는 AllCells사로부터 제대혈 단핵구 세포를 구입하였다. 동결 세포의 융해와 세정은 AllCells사의 설명서에 따라 실시하였다.

동결한 세포가 들어간 바이알을 37℃ 수욕에 담가 신속하게 해동한 후에, 10％ Fetal Bovine Serum(FBS, JRH Biosciences사 제조)을 포함하는 DMEM(기브코(Gibco)사 제조)(이하 10％ FBS/DMEM이라 함)을 20 mL가 될 때까지 천천히 가하였다. 원심 조작(1.8 krpm, 실온에서 8분간) 후에, 상청을 수 mL 남기고 상청을 버렸다. 이 세포 세정 조작을 2회 행하였다.

제대혈 단핵구 세포로부터 조혈 줄기세포를 회수하기 위해, CD34 마이크로비드 키트(Miltenyi Biotec사 제조)와 분리 기기 AutoMACSTM(Miltenyi Biotec사 제조)을 이용하여, 제품의 사용 설명서에 따라 CD34 양성 세포를 분리하였다.

면역 부전 마우스

NOD/SCID 마우스는 실험동물 중앙연구소 및 닛본 클레아로부터 구입하여, 동물 사육 시설인 아이솔레이터 내에서 사육하였다.

α1,3-푸코실트랜스페라아제 처리

상기에 의해 얻어진 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 10 mmol/L MnCl₂(시그마(SIGMA)사 제조), 1 mmol/L guanosine diphosphate (GDP)-Fucose(교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 제조), 0.1％ Human Serum Albumin(HSA, 시그마사 제조), 20 mmol/L N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid(HEPES, 기브코사 제조)를 포함하는 푸코실트랜스페라아제 반응 용액에, 0.1 - 10×10⁶의 세포를 가하여 100 내지 1000 μL에 현탁하였다. 0.1 - 1×10⁶ 세포당 α1,3-푸코실트랜스페라아제 7(FT7)을 16 μg, 또는 α1,3-푸코실트랜스페라아제 6(FT6)을 3 μg, 또는 효소 미처리군으로서 효소를 가한 푸코실트랜스페라아제 반응 용액 대신에 효소를 가하지 않은 푸코실트랜스페라아제 반응 용액을 첨가한 후, 37℃, 5 ％ CO₂ 조건으로 1시간 반응시켰다.

항체 염색 및 유세포 분석기 해석

효소 처리한 세포를 염색 용액인 5％ FBS 함유 PBS로 세정한 후에, 항체를 이용한 세포 염색을 행하였다. 음성 대조구로서 IgM 이소타입 대조구 항체 및 양성 대조구로서 FITC 표지 항인간 CD45 항체를 사용하였다. 세포 표면의 시알릴 루이스 X 당쇄의 발현량 해석에는, 1차 항체로서 항인간 시알릴 루이스 X 당쇄 항체 KM93, 2차 항체로서 FITC 표지 항마우스 IgM 항체를 사용하였다. 세포 표면의 루이스 X 당쇄의 발현량 해석에는 FITC 표지 항인간 루이스 X 당쇄 항체를 사용하였다. 또한, 인간 조혈 줄기세포인 CD34 양성이면서 CD38 음성 세포를 검출하기 위해, PE 표지 항인간 CD38 항체와 APC 표지 항인간 CD34 항체를 이용하여 세포의 항체 염색을 행하였다. 이식 마우스에서의 마우스와 인간의 혈액 세포를 각각 검출하기 위해, FITC 표지 항인간 CD45 항체, PE 표지 항마우스 CD45 항체를 이용한 염색을 행하였다. 또한, 키메라율이 낮은 경우에는, 적혈구를 제거하기 위해 FITC 표지 항마우스 CD45 항체, PE 표지 항마우스 TER-119 항체, APC 표지 항인간 CD45 항체를 이용하여 염색을 행하였다.

세포 세정 후에 유세포 분석기(FACS) 해석으로 사세포를 제거하기 위해, 세포 현탁액에 요오드화프로피디움(인비트로젠(Invitrogen)사 제조)를 최종 농도 1 μg/mL가 되도록 첨가하였다. 유세포 분석 기기 FACSAria(벡톤 디킨슨사 제조)를 이용하여, 생세포인 요오드화프로피디움 음성 세포 중의 CD34 양성이면서 CD38 음성 세포 집단의 시알릴 루이스 X 당쇄, 루이스 X 당쇄, CD45의 발현량을 해석하였다.

셀렉틴 결합 어세이

세포를 0.5％ HSA, 0.1 g/L CaCl₂를 포함하는 D-PBS(+)(기브코사 제조)(이하, 0.5 ％ HSA％/D-PBS(+)라 함)에 현탁하고, 10⁶ 세포당 각각 E-셀렉틴-Fc 키메라 단백질 1 μg, P-셀렉틴-Fc 키메라 단백질 2 μg, L-셀렉틴-Fc 키메라 단백질 2 μg, 음성 대조구로서 CD40-Fc 키메라 단백질 2.2 μg을 첨가하였다. 2차 항체로서 FITC 표지 항인간 IgG 항체로 염색하였다. 단백 결합 및 2차 항체 반응은 4℃에서 30분간씩 행하였다. 0.5％ HSA％/D-PBS(+)로 세포 세정을 행한 후에, PE 표지 항인간 CD38 항체와 APC 표지 항인간 CD34 항체를 가하여 4℃, 30분의 조건하에서 염색하였다. 세포 세정 후에 FACS 해석으로 사세포를 제거하기 위해, 세포 현탁액에 요오드화프로피디움을 최종 농도 1 μg/mL가 되도록 첨가하였다. FACSAria에 의한 FACS 해석으로 생세포인 요오드화프로피디움 음성 세포 중의 CD34 양성이면서 CD38 음성 세포 집단에 게이트를 설정하고, 셀렉틴 단백 결합능을 해석하였다.

인간 조혈 줄기세포의 NOD / SCID 마우스의 골수 이행 어세이

제대혈 유래 CD34 양성 세포를 FT7 또는 FT6 처리한 세포, 또는 음성 대조구로서 효소 미처리 세포를 NOD/SCID 마우스에 이식하였다. 순화를 위해 마우스를 1주일 이상 사육한 후의 8 내지 10 주령일 때에, X선 조사 장치 MBR-1505R(히타치 메디코사 제조)을 이용하여 반치사량인 400 cGy를 조사하였다. 1마리당 3×10⁵ 세포의 CD34 양성 세포를 꼬리정맥 주사에 의해 이식하였다. 이식 12 내지 18시간 후에 마우스를 안락사시키고, 대퇴골 및 경골로부터 골수 세포를 회수하였다. FITC 표지 항인간 CD45 항체, PE 표지 항마우스 CD45 항체, APC 표지 항인간 CD34 항체에 의해 골수 세포를 염색하였다. 세포를 세정한 후에 염화암모늄 용혈제를 가하여 적혈구를 용혈시키고, 요오드화프로피디움을 최종 농도 1 μg/mL가 되도록 첨가하였다. FACSAria에 의한 FACS 해석으로 생세포인 요오드화프로피디움 음성 세포 중의 인간 CD45 양성이면서 인간 CD34 양성 세포를 측정하였다. 생세포 2×10⁶ 세포분의 데이터를 취득하여 인간 CD45 양성이면서 인간 CD34 양성 세포를 해석하였다.

인간 조혈 줄기세포 이식 NOD / SCID 마우스의 생착 어세이

제대혈 유래 CD34 양성 세포를 FT7 또는 FT6 처리한 세포, 또는 음성 대조구로서 효소 미처리 세포를, 반치사량의 X선량인 250 내지 300 cGy 조사한 NOD/SCID 마우스에 이식하였다. 순화를 위해 마우스를 1주일 이상 사육한 후의 8 내지 10 주령시에 X선 조사 장치 MBR-1505R(히타치 메디코사 제조)를 이용한 X선 조사를 행한 후, 이식을 실시하였다. 1마리당 2×10⁵ 세포의 CD34 양성 세포를 꼬리정맥 주사에 의해 이식하였다. 또한, 제대혈 단핵 세포에 동일한 효소 처리를 행하고, 1마리당 1×10⁷ 세포를, X선 조사를 행한 마우스에 마찬가지로 이식하였다. 세포 이식 8 내지 9주일 후에 마우스를 안락사시키고, 대퇴골 및 경골로부터 골수 세포를 회수하였다. FITC 표지 항인간 CD45 항체, PE 표지 항마우스 CD45 항체에 의해 골수 세포를 염색하였다. 키메라율이 낮은 경우에는 저빈도의 인간 혈액 세포를 검출하기 위해 FITC 표지 항마우스 CD45 항체, PE 표지 항마우스 TER-119 항체, APC 표지 항인간 CD45 항체로 염색하였다.

세포를 세정한 후에, 염화암모늄 용혈제를 가하여 적혈구를 용혈시키고, 요오드화프로피디움을 최종 농도 1 μg/mL가 되도록 첨가하였다. FACSAria에 의한 FACS 해석으로 생세포인 요오드화프로피디움 음성 세포 중의, 인간 CD45 양성 세포와 마우스 CD45 양성 세포를 해석하였다. 마우스 TER-119 항체 사용시는 TER-119 음성 중의 인간 CD45 양성 세포와 마우스 CD45 양성 세포를 해석하였다. 인간 혈액 세포의 생착률은 인간 CD45 양성 세포수와 마우스 CD45 양성 세포의 합계에서 차지하는 인간 CD45 양성 세포의 비율(％)로 산출하였다.

유의차 검정

모든 값은 평균치±SD로 나타내었다. 유의차 검정은 Student's t-test를 이용하였다.

인간 CD34 양성 세포의 시알릴 루이스 X 당쇄와 루이스 X 당쇄의 발현 해석

제대혈 단핵구 세포로부터 분리한 인간 CD34 양성 세포의 해석 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 그의 순도는 95 내지 99％였다. 인간 조혈 줄기세포를 분리하기 위해, CD34 양성이면서 CD38 음성 세포를 도 1A의 흰 사각으로 둘러싼 부분(5 내지 10％)으로 게이트하였다. 이 CD34 양성이면서 CD38 음성 세포의 시알릴 루이스 X 당쇄와 루이스 X 당쇄의 발현량을 해석한 결과를 도 2A, 2B에 나타내었다. 도 2A, 2B에 나타낸 바와 같이, 이 세포 집단은 시알릴 루이스 X 당쇄가 발현되었으나, 루이스 X 당쇄의 발현은 낮았다.

다음으로 FT6 또는 FT7에 의해 처리한 CD34 양성이면서 CD38 음성 세포의 시알릴 루이스 X 당쇄의 발현량을 해석하였다. 그 결과를 도 2C, 도 2E에 각각 나타내었다. 도 2C, 도 2E에 나타낸 바와 같이, 양 효소 모두 시알릴 루이스 X 당쇄의 발현량을 현저히 증가시켰다. 다음으로 루이스 X 당쇄의 발현량을 해석하였다. 그 결과를 도 2D, 도 2F에 각각 나타내었다. 도 2F에 나타낸 바와 같이, FT7에 의해 처리한 CD34 양성이면서 CD38 음성 세포에서는 루이스 X 당쇄 발현량은 증가하지 않지만, 도 2D에 나타낸 바와 같이, FT6 처리한 CD34 양성이면서 CD38 음성 세포에서는 루이스 X 당쇄 발현량은 현저히 증가하였다. 본 해석의 결과를 수치화한 것을 표 1에 나타내었다.

상기와 동일한 해석을 독립적으로 5회 행한 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 결과는 5회에 걸친 해석에 있어서 재현성을 나타내었다.

인간 CD34 양성 세포의 셀렉틴에 대한 결합 활성

FT6 또는 FT7에 의해 처리한, 인간 CD34 양성 세포의 E-셀렉틴, P-셀렉틴, L-셀렉틴의 각각으로의 결합을 해석하였다. 그 결과를 도 3 및 표 3에 나타내었다. 도 3 및 표 3에 나타낸 바와 같이, FT7 처리에 의해 인간 CD34 양성 세포의 E-셀렉틴으로의 결합능이 현저히 증가하였다. 또한, P-셀렉틴으로의 결합능도 증가하였다. 이 E-셀렉틴 및 P-셀렉틴으로의 결합능의 증가는 FT6 처리의 경우와 동일한 결과였다.

인간 조혈 줄기세포의 NOD / SCID 마우스에서의 골수 이행 활성

정맥 주사에 의해 말초혈 중에 이식된 조혈 줄기세포는 수시간이면 말초혈중으로부터 소실되고, 골수 조직으로 이행하여 생착한다. 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 FT6 또는 FT7로 처리한 세포, 또는 음성 대조구로서 미처리 세포를 NOD/SCID 마우스에 이식하고, 12 내지 18시간 후의 골수에서의 인간 CD45 양성이면서 인간 CD34 양성 세포를 검출하였다. 그 결과를 도 4 및 표 4에 나타내었다. 도 4 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 골수 이행 활성은 FT6 처리에서는 증가하지 않은 데 반해, FT7 처리에서는 3.1 내지 3.5배로 유의하게 증가하였다. 이상의 점에서 FT6과 FT7의 2종의 푸코실트랜스페라아제 처리 중 골수 이행성은, FT6 처리에서는 전혀 증가하지 않고, FT7 처리에서는 현저히 증가함이 밝혀졌다.

인간 조혈 줄기세포의 NOD / SCID 마우스에서의 생착 활성

푸코실트랜스페라아제에 의해 처리한 CD34 양성 세포를 NOD/SCID 마우스에 이식하고, 8 내지 9주일 후의 골수에서의 인간 혈액 세포의 비율을 조사하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, FT6 처리한 세포 이식군은 효소 미처리군과 동일한 결과였고, 생착 향상의 효과는 없었다. 한편, FT7 처리한 이식군에서는 98 내지 99％의 인간 유래 세포의 생착률을 나타내었다. 이것은 마우스의 혈액 세포의 거의 모두가 인간 혈액 세포로 치환되었음을 나타내고 있다.

이와 동일한 해석을 독립적으로 4회 행한 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, FT6 처리는 생착률의 향상이 없고, FT7 처리에 의한 생착률 향상은 재현성과 안정성이 높음이 밝혀졌다. 또한, 이식할 때의 CD34 양성 세포수를 반인 1×10⁶ 세포로 하여 이식한 실험에서도 FT7 처리에 의한 생착 향상, 및 FT6 처리에 의한 생착 향상이 없음을 확인하였다.

또한, CD34 양성 세포의 분리 조작을 하지 않은 제대혈 단핵 세포를 FT7 처리한 후 이식한 경우에서도, 효소 미처리 세포를 이식한 경우와 비교하여 단기간에 유의한 생착 향상이 보임을 확인하였다. 한편, FT6 처리한 제대혈 단핵구 세포를 이식한 경우에서는 미처리 세포 이식과 비교하여 유의한 생착 향상은 확인되지 않았다.

실시예 2

간염 모델에서의 간엽계 줄기세포의 간장으로의 이행

1. 인간 간엽계 줄기세포에서의 루이스 X 당쇄 및 시알릴 루이스 X 당쇄 의 발현 해석

인간 간엽계 줄기세포(이하 hMSC라 약기함)는 캠브렉스(CAMBREX)사로부터 구입하였다. hMSC를 MSCGM 배지(캠브렉스사 제조)를 이용하여, 37℃, 5％ CO₂의 조건으로 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 인산염 완충 용액(phosphate-buffered saline)(이하, PBS(-)라 약기함)으로 세정하고, TrypLE Select(인비트로젠사 제조)를 가하여 37℃에서 2분간 처리하여 세포를 박리한 후, 5％ FBS 함유 PBS(-) 용액을 가하여 반응을 정지하였다. 1000 rpm(회전/분), 5분간 원심 분리함으로써 세포를 회수하고, PBS(-)로 세정한 후, 1 - 2×10⁶ 세포를 Hanks' Balanced Salt Solutions(HBSS) 반응액[25 mmol/L HEPES(기브코사 제조), 10 mmol/L MnCl₂(시그마사 제조), 0.1％ HSA, HBSS(-)(기브코사 제조)] 80 내지 100 μL에 현탁하였다. 1×10⁶ 세포당 FT7을 4 내지 16 μg 첨가하고, GDP-Fucose(교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 제조)를 최종 농도 1 mmol/L이 되도록 조정하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 한편, 음성 대조구로서는, hMSC를 HBSS 반응액만으로 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. PBS(-)로 3회 세정하고, 5％ FBS 함유 PBS(-) 용액에 현탁하고, 1×10⁵ 세포씩 분주하였다. 항루이스 X 당쇄 항체로서 FITC 표지 항인간 CD15 항체(벡톤 디킨슨사 제조)를 5％의 농도로 첨가하고, 4℃에서 1시간 반응시켰다. 한편, 항시알릴 루이스 X 당쇄 항체로서 항인간 시알릴 루이스 X 당쇄 항체 KM93(칼바이오켐(CALBIOCHEM)사)를 5％의 농도로 첨가하고, 4℃에서 30분간 반응시켰다. 5％ FBS 함유 PBS(-) 용액으로 세정한 후, 4500 rpm으로 1분간 원심 분리함으로써 세포를 회수하고, 5％ FBS 함유 PBS(-) 용액에 현탁하였다. 2차 항체로서 FITC 표지 항마우스 Ig 항체(벡톤 디킨슨사 제조)를 5％의 농도로 첨가하고, 4℃에서 30분간 반응시켰다. 항인간 루이스 X 당쇄 항체 처리 세포, 및 항인간 시알릴 루이스 X 당쇄 항체 처리 후 2차 항체로 처리한 세포를, 5％ FBS 함유 PBS(-) 용액으로 3회 세정한 후, 5％ FBS 함유 PBS(-) 용액 1 mL에 현탁하여 유세포 분석기(벡톤 디킨슨사; FACS Aria)로 해석하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, hMSC에서는 루이스 X 당쇄의 발현은 보이지 않았고, 시알릴 루이스 X 당쇄도 거의 발현되지 않았다. 또한, FT7 처리에 의해 루이스 X 당쇄는 증가하지 않고, 시알릴 루이스 X 당쇄만이 선택적으로 증가하는 것으로 판명되었다.

또한, 세포를 0.5％ HSA, 0.1 g/L CaCl₂를 포함하는 D-PBS(+)(기브코사 제조)[이하, 0.5％ HSA％/D-PBS(+)라 함]에 현탁하고, 1 - 5×10⁵ 세포당 각각 E-셀렉틴-Fc 키메라 단백질 1 μg, P-셀렉틴-Fc 키메라 단백질 2 μg 또는 L-셀렉틴-Fc 키메라 단백질 2 μg을 첨가하였다. 2차 항체로서 FITC 표지 항인간 IgG 항체로 염색하였다. 단백 결합 및 2차 항체 반응은 4℃에서 30분간씩 행하였다. 0.5％ HSA％/D-PBS(+)로 세포 세정을 행한 후에, FACS 해석으로 사세포를 제거하기 위해, 세포 현탁액에 요오드화프로피디움을 최종 농도 1 μg/mL가 되도록 첨가하였다. FACSAria에 의한 FACS 해석으로 생세포인 요오드화프로피디움 음성 세포의 셀렉틴 단백 결합능을 해석하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다. 표 5에 나타낸 바와 같이, FT7 처리에 의해 평균 형광 강도(MFI: Mean fluorescence intensity), 즉 E, P, L-셀렉틴 결합능의 상승이 확인되었다.

2. 마우스 사염화탄소 간 장해 모델의 제작

5주령의 수컷 BALB/c-nu/nu Slc 마우스(닛본 에스엘씨사)를 1주일 동안 순화 사육하였다. 사염화탄소(와코사 제조)를 올리브 오일(와코사 제조)로 10배로 희석하고, 사염화탄소를 1 mL/kg의 비율로 BALB/c-nu/nu Slc 마우스에 복강내 투여를 행하여 급성 간 장해를 야기하였다.

3. 마우스 사염화탄소 간 장해 모델로의 hMSC 의 이식 및 간장 이행 세포의 해석(1)

상술한 바와 같이 FT7 효소 처리한 hMSC, 음성 대조구의 hMSC를 PBS(-)에 현탁하고, 1×10⁶ cells/mL로 조정하였다. 사염화탄소 투여 24시간 후의 BALB/c-nu/nu Slc 마우스에 대하여 혼합 마취액[도르미컴 주사액(아스텔라스 세이야꾸사 제조), 도미토르(메이지 세이카사 제조), 넴부탈(다이닛본 스미토모 세이야꾸사 제조), 생리 식염수를 3:3:10:110으로 혼합]을 40 μL/head 근육 주사함으로써 마취하였다. 개복하여 비장에 FT7 효소 처리 hMSC, 또는 대조구 hMSC를 1×10⁵ cells/head 이식하였다(각 군 n=5). 이식 24시간 후에 간장을 적출하고, 콜라게나아제 반응액[0.04％ 콜라게나아제 타입 IV(시그마사 제조), 0.004％ 트립신 저해제(시그마사 제조), 5 mmol/L CaCl₂(나카라이테스크사 제조), HBSS(-)(나카라이테스크사 제조)] 중에서 잘게 다져 37℃에서 2시간 인큐베이트하였다. 100 ㎛의 멤브레인(벡톤 디킨슨사 제조)로 여과하고, 5％ FBS 함유 PBS(-) 용액으로 3회 세정한 후, 동일 용액에 현탁하고, 1×10⁸ 세포씩 분주하였다. 비오틴 표지 Mouse Lineage Panel(벡톤 디킨슨사 제조)를 2％의 농도로 첨가하고, 4℃에서 1시간 반응시켰다. 5％ 혈청 함유 PBS(-) 용액으로 세정한 후, 4500 rpm으로 1분간 원심 분리함으로써 세포를 회수하고, 5％ FBS 함유 PBS(-) 용액에 현탁하였다. 또한, PerCP 표지 스트렙트아비딘(벡톤 디킨슨사 제조), 및 PE 표지 항인간 CD90 항체(벡톤 디킨슨사 제조)를 10％의 농도로 첨가하고, 4℃에서 2시간 반응시켰다. 5％ FBS 함유 PBS(-) 용액으로 3회 세정하고, 동일 용액 1 mL에 현탁하고, 유세포 분석기로 해석하였다. 간장 유래의 혈구계 세포는 Mouse Lineage Panel로 처리한 후, PerCP 표지 스트렙트아비딘으로 처리하는 점에서, 또한 간장 세포는 스트렙트아비딘에 결합하는 점에서, 채취한 마우스 간장 유래의 전 세포는 PerCP 양성 세포로서 검출할 수 있고, 한편 마우스 간장 유래 세포는 인간 CD90 항체에는 반응하지 않기 때문에, hMSC를 특이적으로 염색할 수 있기 때문에, PerCP 양성 세포수당 PE 양성 세포수는 이식한 hMSC의 간장으로의 이행률(％)로서 나타낼 수 있다. 유세포 분석기에 의해 해석한 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, FT7 효소 처리에 의해 이식한 hMSC는 간장으로의 이행률의 향상이 보였다. 이는, FT7 효소 처리에 의해, 루이스 X 당쇄는 증가시키지 않고 시알릴 루이스 X 당쇄만이 부가된 세포는 장해 부위로의 이행성이 향상되었음을 나타내고 있다.

4. 마우스 사염화탄소 간 장해 모델로의 hMSC 의 이식 및 간장 이행 세포의 해석(2)

상술한 바와 같이 FT7 효소 처리한 hMSC, 음성 대조구의 hMSC를 PBS(-)에 현탁하고, 2.5×10⁶ cells/mL로 조정하였다. 사염화탄소 투여 24시간 후의 BALB/c-nu/nu Slc 마우스에 대하여 꼬리정맥으로부터 FT7 효소 처리 hMSC, 또는 대조구 hMSC을 5×10⁵ cells/head 이식하였다(각 군 n=6). 이식 18시간 후에 간장을 적출하여 상술한 바와 같이 처리하고, 그 후 용혈 처리 후, 3×10⁶ 세포씩 분주하였다.

PE-Cy7 표지 스트렙트아비딘(벡톤 디킨슨사 제조), PE 표지 인간 CD90 항체를 10％의 농도, FITC 표지 마우스 CD45 항체(벡톤 디킨슨사 제조), FITC 표지 마우스 Ter119 항체(벡톤 디킨슨사 제조)를 5％의 농도로 첨가하고, 4℃에서 2시간 반응시켰다. 5％ FBS 함유 PBS(-) 용액으로 3회 세정한 후, 동일 용액 1 mL에 현탁하여 유세포 분석기로 해석하였다. FITC로 표지된 혈구 세포를 제외한 FITC 음성 PE-Cy7 양성 세포를 간장 세포, PE 양성 세포를 hMSC로 하여, 100만개 간장 세포당 hMSC의 세포수를 산출하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 나타낸 바와 같이, FT7로 처리함으로써, 간장으로의 유의한 이행 세포수의 증가가 보였다.

5. 마우스 사염화탄소 간 장해 모델로의 hMSC 의 이식 및 혈청 생화학 파라미터 해석

4.와 동일한 방법으로, FT7 효소 처리한 hMSC 또는 음성 대조구 hMSC를 간 장해 마우스에 이식, 또는 용매(PBS)를 투여하였다(각 군 n=6). 이식 18시간 후에 채혈하고, 후지 드라이 켐(후지 필름사 제조)에 의해 혈청 중 total bilirubin(T-BIL), aspartate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase(ALT), alkaline phosphatase(ALP), lactate dehydrogenase(LDH)를 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, FT7로 처리함으로써, 혈액 생화학 파라미터의 유의한 개선이 보였다.

실시예 3

폐렴 모델에서의 간엽계 줄기 세포의 폐로의 이행

1. 마우스 사염화탄소 폐 장해 모델의 제작

5주령의 수컷 BALB/c-nu/nu Slc 마우스(닛본 에스엘씨사)를 1주일 동안 순화 사육하였다. 사염화탄소(와코사 제조)를 올리브 오일(와코사 제조)로 10배로 희석하고, 사염화탄소를 1 mL/kg의 비율로 BALB/c-nu/nu Slc 마우스에 복강내 투여를 행하여 급성 폐 장해를 야기하였다[Mizuguchi 등 BioFactors, 26, 81-92 (2006)].

2. 마우스 사염화탄소 폐 장해 모델로의 hMSC 의 이식 및 해석

실시예 2와 동일한 방법으로, FT7 효소 처리한 hMSC, 음성 대조구의 hMSC를 PBS(-)에 현탁하고, 2.5×10⁶ cells/mL로 조정하였다. 사염화탄소 투여 24시간 후의 BALB/c-nu/nu Slc 마우스에 대하여 FT7 효소 처리 hMSC, 또는 대조구 hMSC을 5×10⁵ cells/head 이식하였다(각 군 5마리). 이식 18시간 후에 폐를 적출하고, 콜라게나아제·엘라스타아제 반응액[150 U/mL 콜라게나아제 타입 IV(시그마사 제조), 10 U/mL 엘라스타아제(나카라이테스크사 제조) DMEM(인비트로젠사 제조)] 중에서 잘게 다져 37℃에서 2시간 인큐베이트하였다. 100 ㎛의 멤브레인(벡톤 디킨슨사 제조)으로 여과하고, 용혈 처리 후 5％ FBS 함유 PBS(-) 용액으로 2회 세정한 후, 동일 용액에 현탁하고, 3×10⁶ 세포씩 분주하였다. PE-Cy7 표지 스트렙트아비딘, PE 표지 인간 항CD90 항체를 10％의 농도, FITC 표지 항마우스 CD45 항체, FITC 표지 항마우스 Ter119 항체를 5％의 농도로 첨가하고, 4℃에서 2시간 반응시켰다. 5％ FBS 함유 PBS(-) 용액으로 3회 세정한 후, 동일 용액 1 mL에 현탁하고, 유세포 분석기로 해석하였다. FITC로 표지된 혈구 세포를 제외한 FITC 음성 PE-Cy7 양성 세포를 폐세포, PE 양성 세포를 hMSC로 하여, 10만개 폐세포당 hMSC의 세포수를 산출하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에서 나타낸 바와 같이, FT7로 처리함으로써, 폐로의 유의한 이행 세포수의 증가가 보였다.

실시예 4

Fluorescein isothiocyanate(FITC) 표지 항루이스 X 항체(HI98), FITC 표지 항마우스 IgM 항체(II/41), IgM 이소타입 대조구 항체(11E10)는 벡톤 디킨슨 파민젠사로부터 구입하였다. FITC 표지와 APC 표지의 인간 CD45 항체(HI30)는 eBioscience사로부터 구입하였다. FITC 표지 항인간 IgG 항체는 DAKOCytomation사로부터 구입하였다.

항시알릴 루이스 X 당쇄 항체(KM93)는 하이브리도마 배양 상청으로부터 회수한 항체를 이용하였다[Hanai 등 Cancer Research, 46, 4438-4443 (1986)].

인간 E-셀렉틴과 인간 IgG 정상 영역(Fc)의 융합 단백질(이하, E-셀렉틴-Fc 키메라 단백질이라 함), 및 인간 P-셀렉틴과 Fc의 융합 단백질(이하, P-셀렉틴-Fc 키메라 단백질이라 함)의 생산은 공지된 방법[Yago 등 Journal of Immunology, 15, 707-714 (1997)]에 따라 행하였다. 또한, 상기와 동일하게 하여, 인간 L-셀렉틴과 Fc의 융합 단백질(이하, L-셀렉틴-Fc 키메라 단백질이라 함)[Siegelman 등 Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 5562-5566 (1989)], 및 인간 CD40과 Fc의 융합 단백질(이하, CD40-Fc 키메라 단백질이라 함)[Hollenbaugh 등 EMBO J, 11, 4313-4321 (1992)]의 생산을 행하였다. α1,3-푸코실트랜스페라아제 7(FT7)은 Namalwa 세포에 발현시켜 정제하였다[Shinoda 등 Journal of Biological Chemistry, 272, 31992-31997(1997)].

신경 줄기세포의 배양

뉴로스피어는 신경 줄기세포·신경 전구세포를 포함한 세포이다. 동결된 마우스 태아 중추신경(Cortex) 유래 뉴로스피어(스템 셀 테크놀로지사 제조)를, 스템 셀 테크놀로지사의 설명서에 따라 동결 세포의 융해·세정 및 배양을 실시하였다. 동결 세포를 융해시킨 후, NeuroCult 증식 배지(스템 셀 테크놀로지사 제조)와 원심 분리에 의해 세포 세정을 행하고, 재조합 인간 Epidermal Growth Factor(rh EGF, 스템 셀 테크놀로지사 제조) 20 ng/mL 함유 NeuroCult 증식 배지에 현탁하고, 37℃, 5％ CO₂의 인큐베이터에서 7일간 배양하였다. 증식한 뉴로스피어를 회수하고, NeuroCult Chemical dissociation Kit(스템 셀 테크놀로지사 제조)를 이용하여 뉴로스피어를 단일 세포로 분리하여 현탁하였다.

α1,3- 푸코실트랜스페라아제 처리

상기에 의해 얻어진 단일 세포에 현탁한 뉴로스피어 유래의 0.1 - 10×10⁵ 세포를 10 mmol/L MnCl₂(시그마사 제조), 1 mmol/L guanosine diphosphate (GDP)-Fucose(교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 제조), 0.1％ Human Serum Albumin (HSA, 시그마사 제조), 20 mmol/L N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid (HEPES, 기브코사 제조)를 포함하는 푸코실트랜스페라아제 반응 용액에 가하여 100 내지 1000 μL에 현탁하였다. 0.1 - 1×10⁵ 세포당 α1,3-푸코실트랜스페라아제 7(FT7)을 16 μg 첨가한 반응 용액, 또는 효소 미처리군으로서 효소를 가한 푸코실트랜스페라아제 반응 용액 대신에 효소를 가하지 않은 푸코실트랜스페라아제 반응 용액을 이용하여, 37℃, 5％ CO₂의 조건으로 세포를 1시간 반응시켰다.

항체 염색 및 유세포 분석기 해석

효소 처리한 세포를 염색 용액인 5％ FBS 함유 PBS로 세정한 후에, 항체를 이용한 세포 염색을 행하였다. 음성 대조구로서 IgM 이소타입 대조구 항체를 사용하였다. 세포 표면의 시알릴 루이스 X 당쇄의 발현량 해석에는 1차 항체로서 항인간 시알릴 루이스 X 당쇄 항체 KM93, 2차 항체로서 FITC 표지 항마우스 IgM 항체를 사용하였다. 세포 표면의 루이스 X 당쇄의 발현량 해석에는 FITC 표지 항루이스 X 당쇄 항체를 사용하였다.

세포 세정 후에 유세포 분석기(FACS) 해석으로 사세포를 제거하기 위해, 세포 현탁액에 요오드화프로피디움(인비트로젠사 제조)을 최종 농도 1 μg/mL가 되도록 첨가하였다. 유세포 분석 기기 FACSAria(벡톤 디킨슨사 제조)를 이용하여, 생세포인 요오드화프로피디움 음성 세포의 시알릴 루이스 X 당쇄, 루이스 X 당쇄의 발현량을 해석하였다.

셀렉틴 결합 어세이

세포를 0.5％ HSA, 0.1 g/L CaCl₂를 포함하는 D-PBS(+)(기브코사 제조)(이하, 0.5％ HSA％/D-PBS(+)라 함)에 현탁하고, 10⁶ 세포당 각각 E-셀렉틴-Fc 키메라 단백질 1 μg, P-셀렉틴-Fc 키메라 단백질 2 μg, L-셀렉틴-Fc 키메라 단백질 2 μg, 음성 대조구로서 CD40-Fc 키메라 단백질 2.2 μg을 첨가하였다. 2차 항체로서 FITC 표지 항인간 IgG 항체로 염색하였다. 단백 결합 및 2차 항체 반응은 4℃에서 30분간씩 행하였다. 0.5％ HSA％/D-PBS(+)로 세포 세정 후에 FACS 해석으로 사세포를 제거하기 위해, 세포 현탁액에 요오드화프로피디움을 최종 농도 1 μg/mL가 되도록 첨가하였다. FACSAria에 의한 FACS 해석으로 생세포인 요오드화프로피디움 음성 세포의 셀렉틴 단백 결합능을 해석하였다.

마우스 뉴로스피어의 시알릴 루이스 X 당쇄와 루이스 X 당쇄의 발현 해석

마우스 뉴로스피어의 시알릴 루이스 X 당쇄와 루이스 X 당쇄의 발현량을 해석한 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12 상단(미처리군)에 나타낸 바와 같이, 마우스 뉴로스피어는 시알릴 루이스 X 당쇄 및 루이스 X 당쇄의 발현이 음성이었다.

다음으로 FT7에 의해 처리한 마우스 뉴로스피어의 시알릴 루이스 X 당쇄와 루이스 X 당쇄의 발현량을 해석하였다. 그 결과를 도 12 하단(FT7 처리)에 나타내었다. 도 12 하단에 나타낸 바와 같이, FT7 처리는 시알릴 루이스 X 당쇄의 발현량을 현저히 증가시켰다. 한편, 루이스 X 당쇄의 발현량에는 변화가 없었다.

신경 줄기세포의 셀렉틴에 대한 결합 활성

FT7에 의해 처리한, 마우스 뉴로스피어 유래 신경 줄기세포·신경 전구세포의 P-셀렉틴, E-셀렉틴, L-셀렉틴의 각각으로의 결합을 해석하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에 나타낸 바와 같이, FT7 처리에 의해 마우스 뉴로스피어 유래 신경 줄기세포·신경 전구세포의 E-셀렉틴으로의 결합능이 현저히 증가하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> An Isolated cell population <130> 1927 <150> JP2007-206823 <151> 2007-08-08 <160> 2 <170> PatentIn version 2.1 <210> 1 <211> 342 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Asn Ala Gly His Gly Pro Thr Arg Arg Leu Arg Gly Leu Gly 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Trp Leu Leu Trp Leu 20 25 30 Leu Gly Ser Ala Pro Arg Gly Thr Pro Ala Pro Gln Pro Thr Ile Thr 35 40 45 Ile Leu Val Trp His Trp Pro Phe Thr Asp Gln Pro Pro Glu Leu Pro 50 55 60 Ser Asp Thr Cys Thr Arg Tyr Gly Ile Ala Arg Cys His Leu Ser Ala 65 70 75 80 Asn Arg Ser Leu Leu Ala Ser Ala Asp Ala Val Val Phe His His Arg 85 90 95 Glu Leu Gln Thr Arg Arg Ser His Leu Pro Leu Ala Gln Arg Pro Arg 100 105 110 Gly Gln Pro Trp Val Trp Ala Ser Met Glu Ser Pro Ser His Thr His 115 120 125 Gly Leu Ser His Leu Arg Gly Ile Phe Asn Trp Val Leu Ser Tyr Arg 130 135 140 Arg Asp Ser Asp Ile Phe Val Pro Tyr Gly Arg Leu Glu Pro His Trp 145 150 155 160 Gly Pro Ser Pro Pro Leu Pro Ala Lys Ser Arg Val Ala Ala Trp Val 165 170 175 Val Ser Asn Phe Gln Glu Arg Gln Leu Arg Ala Arg Leu Tyr Arg Gln 180 185 190 Leu Ala Pro His Leu Arg Val Asp Val Phe Gly Arg Ala Asn Gly Arg 195 200 205 Pro Leu Cys Ala Ser Cys Leu Val Pro Thr Val Ala Gln Tyr Arg Phe 210 215 220 Tyr Leu Ser Phe Glu Asn Ser Gln His Arg Asp Tyr Ile Thr Glu Lys 225 230 235 240 Phe Trp Arg Asn Ala Leu Val Ala Gly Thr Val Pro Val Val Leu Gly 245 250 255 Pro Pro Arg Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Val Pro Ala Asp Ala Phe Val 260 265 270 His Val Asp Asp Phe Gly Ser Ala Arg Glu Leu Ala Ala Phe Leu Thr 275 280 285 Gly Met Asn Glu Ser Arg Tyr Gln Arg Phe Phe Ala Trp Arg Asp Arg 290 295 300 Leu Arg Val Arg Leu Phe Thr Asp Trp Arg Glu Arg Phe Cys Ala Ile 305 310 315 320 Cys Asp Arg Tyr Pro His Leu Pro Arg Ser Gln Val Tyr Glu Asp Leu 325 330 335 Glu Gly Trp Phe Gln Ala 340 <210> 2 <211> 1029 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1029) <400> 2 atg aat aat gct ggg cac ggc ccc acc cgg agg ctg cga ggc ttg ggg 48 Met Asn Asn Ala Gly His Gly Pro Thr Arg Arg Leu Arg Gly Leu Gly 1 5 10 15 gtc ctg gcc ggg gtg gct ctg ctc gct gcc ctc tgg ctc ctg tgg ctg 96 Val Leu Ala Gly Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Trp Leu Leu Trp Leu 20 25 30 ctg ggg tca gcc cct cgg ggt acc ccg gca ccc cag ccc acg atc acc 144 Leu Gly Ser Ala Pro Arg Gly Thr Pro Ala Pro Gln Pro Thr Ile Thr 35 40 45 atc ctt gtc tgg cac tgg ccc ttc act gac cag ccc cca gag ctg ccc 192 Ile Leu Val Trp His Trp Pro Phe Thr Asp Gln Pro Pro Glu Leu Pro 50 55 60 agc gac acc tgc acc cgc tac ggc atc gcc cgc tgc cac ctg agt gcc 240 Ser Asp Thr Cys Thr Arg Tyr Gly Ile Ala Arg Cys His Leu Ser Ala 65 70 75 80 aac cga agc ctg ctg gcc agc gcc gac gcc gtg gtc ttc cac cac cgc 288 Asn Arg Ser Leu Leu Ala Ser Ala Asp Ala Val Val Phe His His Arg 85 90 95 gag ctg cag acc cgg cgg tcc cac ctg ccc ctg gcc cag cgg ccg cga 336 Glu Leu Gln Thr Arg Arg Ser His Leu Pro Leu Ala Gln Arg Pro Arg 100 105 110 ggg cag ccc tgg gtg tgg gcc tcc atg gag tct cct agc cac acc cac 384 Gly Gln Pro Trp Val Trp Ala Ser Met Glu Ser Pro Ser His Thr His 115 120 125 ggc ctc agc cac ctc cga ggc atc ttc aac tgg gtg ctg agc tac cgg 432 Gly Leu Ser His Leu Arg Gly Ile Phe Asn Trp Val Leu Ser Tyr Arg 130 135 140 cgc gac tcg gac atc ttt gtg ccc tat ggc cgc ctg gag ccc cac tgg 480 Arg Asp Ser Asp Ile Phe Val Pro Tyr Gly Arg Leu Glu Pro His Trp 145 150 155 160 ggg ccc tcg cca ccg ctg cca gcc aag agc agg gtg gcc gcc tgg gtg 528 Gly Pro Ser Pro Pro Leu Pro Ala Lys Ser Arg Val Ala Ala Trp Val 165 170 175 gtc agc aac ttc cag gag cgg cag ctg cgt gcc agg ctg tac cgg cag 576 Val Ser Asn Phe Gln Glu Arg Gln Leu Arg Ala Arg Leu Tyr Arg Gln 180 185 190 ctg gcg cct cat ctg cgg gtg gat gtc ttt ggc cgt gcc aat gga cgg 624 Leu Ala Pro His Leu Arg Val Asp Val Phe Gly Arg Ala Asn Gly Arg 195 200 205 cca ctg tgc gcc agc tgc ctg gtg ccc acc gtg gcc cag tac cgc ttc 672 Pro Leu Cys Ala Ser Cys Leu Val Pro Thr Val Ala Gln Tyr Arg Phe 210 215 220 tac ctg tcc ttt gag aac tct cag cac cgc gac tac att acg gag aaa 720 Tyr Leu Ser Phe Glu Asn Ser Gln His Arg Asp Tyr Ile Thr Glu Lys 225 230 235 240 ttc tgg cgc aac gca ctg gtg gct ggc act gtg cca gtg gtg ctg ggg 768 Phe Trp Arg Asn Ala Leu Val Ala Gly Thr Val Pro Val Val Leu Gly 245 250 255 ccc cca cgg gcc acc tat gag gcc ttc gtg ccg gct gac gcc ttc gtg 816 Pro Pro Arg Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Val Pro Ala Asp Ala Phe Val 260 265 270 cat gtg gat gac ttt ggc tca gcc cga gag ctg gcg gct ttc ctc act 864 His Val Asp Asp Phe Gly Ser Ala Arg Glu Leu Ala Ala Phe Leu Thr 275 280 285 ggc atg aat gag agc cga tac caa cgc ttc ttt gcc tgg cgt gac agg 912 Gly Met Asn Glu Ser Arg Tyr Gln Arg Phe Phe Ala Trp Arg Asp Arg 290 295 300 ctc cgc gtg cga ctg ttc acc gac tgg cgg gaa cgt ttc tgt gcc atc 960 Leu Arg Val Arg Leu Phe Thr Asp Trp Arg Glu Arg Phe Cys Ala Ile 305 310 315 320 tgt gac cgc tac cca cac cta ccc cgc agc caa gtc tat gag gac ctt 1008 Cys Asp Arg Tyr Pro His Leu Pro Arg Ser Gln Val Tyr Glu Asp Leu 325 330 335 gag ggt tgg ttt cag gcc tga 1029 Glu Gly Trp Phe Gln Ala 340

Claims

시알릴 루이스 X 당쇄가 발현되고 루이스 X 당쇄가 실질적으로 발현되지 않은, 단리된 세포 집단.
제1항에 있어서, 세포 분획 처리로 얻어진 세포 집단.
제1항 또는 제2항에 있어서, 푸코스 공여체의 존재하에 α1,3-푸코실트랜스페라아제로 세포를 처리함으로써 얻어지는 세포 집단.
제3항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스페라아제가 α1,3-푸코실트랜스페라아제 7인 세포 집단.
제3항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 세포 집단.
제3항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 60％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드인 세포 집단.
제3항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드인 세포 집단.
제3항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA로 코딩되는 폴리펩티드인 세포 집단.
제3항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA로 코딩되는 폴리펩티드이며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드인 세포 집단.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 줄기세포 또는 전구세포인 세포 집단.
제10항에 있어서, 줄기세포 또는 전구세포가 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포인 세포 집단.
제11항에 있어서, 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포가 CD34 양성 조혈 줄기세포 또는 CD34 양성 조혈 전구세포인 세포 집단.
제12항에 있어서, CD34 양성 조혈 줄기세포가 CD38 음성 조혈 줄기세포인 세포 집단.
제11항에 있어서, 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포가 CD34 음성이면서 Lineage 음성 조혈 줄기세포 또는 CD34 음성이면서 Lineage 음성 조혈 전구세포인 세포 집단.
제10항에 있어서, 줄기세포가 간엽계 줄기세포인 세포 집단.
제10항에 있어서, 줄기세포 또는 전구세포가 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포인 세포 집단.
제16항에 있어서, 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 Nestin 양성 신경 줄기세포 또는 Nestin 양성 신경 전구세포인 세포 집단.
제16항에 있어서, 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 Sox2 양성 신경 줄기세포 또는 Sox2 양성 신경 전구세포인 세포 집단.
제16항에 있어서, 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 Musashi 1 양성 신경 줄기세포 또는 Musashi 1 양성 신경 전구세포인 세포 집단.
제16항에 있어서, 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 CD34 양성 신경 줄기세포 또는 CD34 양성 신경 전구세포인 세포 집단.
제16항에 있어서, 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 CD133 양성 신경 줄기세포 또는 CD133 양성 신경 전구세포인 세포 집단.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인간 유래의 세포인 세포 집단.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 골수, 비장, 제대혈, 말초혈, 지방 조직, 신경 조직으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조직에서 유래된 세포인 세포 집단.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 기재된 세포 집단을 함유하는 의약.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 기재된 세포 집단을 생체 내에 투여하는 것을 특징으로 하는, 세포 집단의 이식 방법.
분획 처리에 의해 세포를 얻는 것을 특징으로 하는, 시알릴 루이스 X 당쇄가 발현되고 루이스 X 당쇄가 실질적으로 발현되지 않은 세포의 제조 방법.
푸코스 공여체의 존재하에 α1,3-푸코실트랜스페라아제로 처리함으로써 세포를 얻는 것을 특징으로 하는, 시알릴 루이스 X 당쇄가 발현되고 루이스 X 당쇄가 실질적으로 발현되지 않은 세포의 제조 방법.
제27항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스페라아제가 α1,3-푸코실트랜스페라아제 7인 제조 방법.
제27항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 제조 방법.
제27항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 60％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드인 제조 방법.
제27항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드인 제조 방법.
제27항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA로 코딩되는 폴리펩티드인 제조 방법.
제27항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스페라아제가, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA로 코딩되는 폴리펩티드이며, α1,3-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 폴리펩티드인 제조 방법.
제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 줄기세포 또는 전구세포인 제조 방법.
제34항에 있어서, 줄기세포 또는 전구세포가 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포인 제조 방법.
제35항에 있어서, 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포가 CD34 양성 조혈 줄기세포 또는 CD34 양성 조혈 전구세포인 제조 방법.
제36항에 있어서, CD34 양성 조혈 줄기세포가 CD38 음성 조혈 줄기세포인 제조 방법.
제35항에 있어서, 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포가 CD34 음성이면서 Lineage 음성 조혈 줄기세포 또는 CD34 음성이면서 Lineage 음성 조혈 전구세포인 제조 방법.
제34항에 있어서, 줄기세포가 간엽계 줄기세포인 제조 방법.
제34항에 있어서, 줄기세포 또는 전구세포가 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포인 제조 방법.
제40항에 있어서, 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 Nestin 양성 신경 줄기세포 또는 Nestin 양성 신경 전구세포인 제조 방법.
제40항에 있어서, 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 Sox2 양성 신경 줄기세포 또는 Sox2 양성 신경 전구세포인 제조 방법.
제40항에 있어서, 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 Musashi 1 양성 신경 줄기세포 또는 Musashi 1 양성 신경 전구세포인 제조 방법.
제40항에 있어서, 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 CD34 양성 신경 줄기세포 또는 CD34 양성 신경 전구세포인 제조 방법.
제40항에 있어서, 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포가 CD133 양성 신경 줄기세포 또는 CD133 양성 신경 전구세포인 제조 방법.
제26항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인간 유래의 세포인 제조 방법.
제26항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 골수, 비장, 제대혈, 말초혈, 지방 조직, 신경 조직으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조직에서 유래된 세포인 제조 방법.
제26항 내지 제47항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 세포를 함유하는 의약.
제26항 내지 제47항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 세포를 생체 내에 투여하는 것을 특징으로 하는, 세포의 이식 방법.