UA109265C2

UA109265C2 - Застосування перепрограмованих стовбурових нервових клітин в приготуванні медикаменту або фармацевтичної композиції

Info

Publication number: UA109265C2
Application number: UAA201205968A
Authority: UA
Priority date: 2009-10-19
Filing date: 2009-10-19
Publication date: 2015-08-10
Also published as: CU24006B1; JP2013508343A; MX2012004522A; IL218902A; AU2009354350A1; TN2012000157A1; RU2635317C2; JP6073135B2; WO2011048350A1; CH704227B1; CN102647989A; KR20120099686A; IL218902A0; AU2009354350B2; ZA201202664B; RU2012120713A; EP2490702A1; CA2781522A1; CU20120063A7; MA33740B1

Abstract

Винахід належить до застосування однієї або більше перепрограмованих стовбурових нервових клітин в приготуванні медикаменту або фармацевтичної композиції для оновлення або заміни тканин або клітин хворого, який хворіє на неврологічне захворювання, при якому перепрограмовані стовбурові нервові клітини отримані шляхом перепрограмування комітованих клітин-попередників першої клітинної лінії з пацієнта, при якому перепрограмування включає контактування цих комітованих клітин з антитілами, які зчіплюють рецептор, який є посередником захоплення, пізнавання або індикації антигену на поверхні комітованих клітин.

Description

клітин-попередників першої клітинної лінії з пацієнта, при якому перепрограмування включає контактування цих комітованих клітин з антитілами, які зчіплюють рецептор, який є посередником захоплення, пізнавання або індикації антигену на поверхні комітованих клітин.

Включення посиланням

Всі документи, які цитуються або на які посилаються в документах, що цитуються тут, разом з будь-якими інструкціями до продукту, описами, специфікаціями продукту і технологічними картами до будь-якого продукту, який згадується тут, або в будь-якому документі, включеному шляхом посилання, тим самим включаються до даного опису шляхом посилання, і може бути використаний при реалізації винаходу.

Галузь техніки, до якої відноситься винахід

Спосіб лікування різних хвороб, порушень або станів у хворого, при якому використовуються перепрограмовані клітини, такі як ретродиференційовані, трансдиференційовані або передиференційовані клітини. Спосіб передбачає, отримання комітованих клітин-попередників хворого (пацієнта), ретродиференціювання комітованих клітин-попередників з отриманням ретродиференційованих клітин-мішеней і введення ретродиференційованих клітин хворому. У певних варіантах здійснення метод передбачає отримання комітованих клітин-попередників хворого, трансдиференціювання комітованих клітин-попередників З отриманням трансдиференційованих клітин-мішеней, і введення трансдиференційованих клітин-мішеней хворому. Ретродиференційовані або трансдиференційовані клітини-мішені відновлюють або оновлюють тканини або клітини хворого.

Рівень техніки

Стовбурові клітини характеризуються їх здатністю оновлювати себе шляхом мітотичного поділу клітин і диференціюватися в різноманітні лінії спеціалізованих типів клітин. Двома великими типами стовбурових клітин ссавців є ембріональні стовбурові клітини, які виділяють з внутрішньої клітинної маси бластоцисти, і диференційовані стовбурові клітини, які знайдені в зрілих тканинах. У ембріонові, який розвивається, стовбурові клітини можуть диференціюватися у всі спеціалізовані ембріональні тканини. У дорослих організмах стовбурові клітини і клітини- попередники оновлюють спеціалізовані клітини і підтримують нормальне оновлення органів, здатних до відновлення, таких як кров, шкіра або кишкові тканини.

Стовбурові клітини широко поширені в ембріонах, які розвиваються, хоча, кількість стовбурових клітин зменшується, у міру того як розвиток прогресує. Навпаки, дорослий організм містить обмежене число стовбурових клітин, які обмежені певними компартаментами організму.

Зо Терапевтичне застосування стовбурових клітин має потенціал змінити лікування багатьох хвороб або порушень. Тоді як деякі способи лікування зрілими стовбуровими клітинами, такими як трансплантати кісткового мозку, вже існують, медичні дослідники чекають використання стовбурових клітин, щоб лікувати ширший перелік хвороб, включаючи, серед інших захворювань, рак, хворобу Паркінсона, пошкодження спинного мозку, аміотрофічний бічний склероз, розсіяний склероз і пошкодження м'язів. Такі методи лікування можуть використовувати в своїх інтересах здатність стовбурових клітин до диференціації в типи клітин, які необхідні, щоб лікувати хворобу.

Проте існує невизначеність щодо успіху в лікуванні таких хвороб, використовуючи початкові клітини, а також того, що стосується легкості отримання стовбурових клітин. Наприклад, гематопоетичні стовбурові клітини традиційно отримують з кісткового мозку, периферійної крові, яка мобілізує фактор росту або пуповинної крові (плацента). Гематопоетичні стовбурові клітини можуть також бути отримані з ембріональних стовбурових клітин, які вилучають з ембріонів, отриманих з використанням методики запліднення іп міго. Проте отримання з цих джерел є складним та іноді небезпечним, і може бути ускладненим супутніми етичними проблемами.

Далі, число стовбурових клітин, які можуть бути отримані з цих джерел є обмеженим. Крім того, стовбурові клітини можуть зазнавати труднощі при диференціації в клітини, необхідні для лікування хвороби.

Розкриття винаходу

Даний винахід відноситься до використання перепрограмованих клітин для відновлення або оновлення тканини або клітин хворого. Наприклад, даний винахід відноситься до використання ретродиференціації диференційованих або комітованих клітин-попередників для відновлення тканини або оновлення тканин або клітин хворого. Даний винахід також відноситься до використання трансдиференційованих клітин, отриманих трансдиференціюванням диференційованих комітованих клітин-попередників, щоб відновлювати тканини або оновлювати тканини або клітини хворого.

Застосування базується, частково, на відкритті заявника, що комітовані клітини-попередники або соматичні клітини, отримані від хворого, можуть бути перепрограмовані з отриманням клітин різних ліній, і ці перепрограмовані клітини можуть бути введені хворому, щоб відновлювати або оновлювати тканини або клітини. Приклади процесу перепрограмування бо включають ретродиференціацію і трансдиференціювання.

Отже, заявники виявили, що комітовані клітини-попередники можуть піддаватися перепрограмуванню з отриманням різних клітинних ліній. Наприклад, комітовані клітини- попередники можуть піддаватися ретродиференціації з отриманням ретродиференційованих клітин, наприклад, клітин, менш диференційованих, таких як плюріпотенційні (плюріпотентні) стовбурові клітини, і що ці ретродиференційовані клітини можуть бути введені хворому, щоб відновлювати або оновлювати тканини або клітини. Інший приклад, комітовані клітини- попередники, отримані від хворого, можуть піддаватися трансдиференціюванню з отриманням трансдиференційованих клітин, наприклад, клітин інших клітинних ліній, відмінних від комітованих клітин-попередників, і що ці трансдиференційовані клітини можуть бути введені хворому, щоб відновлювати або оновлювати тканини або клітини.

Винахід охоплює метод відновлення або оновлення тканини або клітин клітинних ліній хворого введенням хворому перепрограмованих клітин. Зокрема, винахід охоплює метод відновлення або оновлення тканини або клітин клітинних ліній хворому, що передбачає (Її) отримання комітованих клітин-попередників, (ії) ретродиференціацію комітованих клітин- попередників з отриманням ретродиференційованих клітин-мішеней і (ії) введення ретродиференційованих клітин-мішеней хворому, в якому ретродиференційовані клітини-мішені повторно передиференціюються в клітини клітинних ліній. Ці передиференційовані клітини можуть належати до тієї ж самої клітинної лінії або відмінної клітинної лінії, такої як комітовані клітини-попередники.

Винахід також охоплює метод відновлення або оновлення тканини або клітин клітинної лінії хворого, який передбачає (Ї) отримання комітованих клітин-попередників, (К(« (ії) трансдиференціювання комітованих клітин-попередників, щоб отримати трансдиференційовані клітини-мішені, і (ії) введення трансдиференційованих клітин-мішеней хворому.

У деяких варіантах реалізації хворий може страждати від хвороби, порушення або стану, включаючи, але не обмежуючись ними, розлад кісткового мозку, гематологічні стани, апластичну анемію, бета-таласемію, діабет, хворобу мотонейрону, хворобу Паркінсона, пошкодження спинного мозку, м'язову дистрофію, ниркову хворобу, розсіяний склероз, застійну серцеву недостатність, вірус гепатиту С, вірус імунодефіциту людини, травму голови, пошкодження спинного мозку, хворобу легень, депресію, необструктивну азооспермію,

Зо андропаузу, менопаузу і безпліддя, омолоджування, виразку склеродерми, псоріаз, зморшки, цироз печінки, аутоїмунну хворобу, облисіння, пігментозний ретиніт, кристалічну дистрофію/сліпоту, діабет і безпліддя. Отже, в деяких варіантах здійснення перепрограмовані клітини можуть бути клітинами кісткового мозку, які лікують апластичну анемію, лейкемію, лімфому або вірус імунодефіциту людини хворого.

У деяких варіантах здійснення перепрограмовані клітини-мішені, такі як ретродиференційовані клітини, трансдиференційовані клітини-мішені або передиференційовані клітини, можуть включати, але не обмежуються ними, плюрипотенційні стовбурові клітини, плюрипотенційні зародкові клітини, гематопоетичні стовбурові клітини, нейронні стовбурові клітини, епітеліальні стовбурові клітини, мезенхімні стовбурові клітини, стовбурові клітини ендодерми і нейроектодерми, зародкові клітини, екстраємбріональні, ембріональні стовбурові клітини, ниркові клітини, клітини альвеолярного епітелію, клітини ендодерми, нейрони, ектодермні клітини, острівцеві клітини, ацинарні клітини, овоцити, сперму, гематопоетичні клітини, гепатоцити, шкіру/кератиноцити, меланоцити, кістку/ остеоцити, волосся/клітини сосочків дерми, хрящ/хондроцити, жирові клітини/адипоцити, скелетні м'язові клітини, клітини ендотелію, серцевий м'яз/кардіоміоцити і тропобласти.

У певних варіантах здійснення комітовані клітини-попередники отримують з крові або близьких тканин, включаючи кістковий мозок. Комітовані клітини-попередники можуть бути отримані з цілісної крові, і/або можуть бути отримані через аферезис. Кров може бути мобілізованою або немобілізованою кров'ю. Такі комітовані клітини-попередники включають, але не обмежуються ними, Т-клітини, В-клітини, ацидофільні гранулоцити, базофіли, нейтрофіли, мегакаріоцити, моноцити, еритроцити, гранулоцити, мастоцити, лімфоцити, лейкоцити, тромбоцити і червоні клітини крові. Альтернативно, комітовані клітини-попередники можуть бути отримані з нейронної тканини центральної нервової системи або периферійної нервової системи, м'язової тканини або епідермісу і/або дерми шкіри.

У певних варіантах здійснення комітовані клітини-попередники отримують з крові або тканини хворого. У деяких варіантах здійснення хворий, від якого отримують комітовані клітини- попередники, і якому вводять перепрограмовані клітини-мішені, такі як ретродиференційовані клітини-мішені або трансдиференційовані клітини-мішені, є тим же самим хворим.

У деяких варіантах здійснення комітовані клітини-попередники ретродиференціюють 60 контактом комітованих клітин-попередників із засобом. Наприклад, комітовані клітини-

попередники можуть бути культивовані із засобом (із агентом). У певних варіантах здійснення засіб зчіплюється з рецептором, який є посередником захоплення, упізнавання або представлення антигену на поверхні комітованих клітин. Рецептор може бути антисеном МНС класу | або антигеном МНС класу ІІ. У деяких варіантах здійснення, антигеном класу | є рецептор НІ А-А, рецептор НГА-В, рецептор НГА-С, рецептор НІ А-Е, рецептор НІ А-Е або рецептор НГА-С, а вказаним антигеном класу І є рецептор НГА-ОМ, рецептор НГА-ОР, рецептор НГА-БО або рецептор НІГ А-ОВ.

У певних варіантах здійснення засіб може бути антитілом до рецептора, таким як моноклональне антитіло до рецептора. У деяких варіантах здійснення антитілом є моноклональне антитіло СК3/43 або моноклональне антитіло ТАЇ. 185. У подальших варіантах здійснення засіб модулює експресію гена МНС, таку як експресія МНС класу І" і/або МНС класу

Пк.

У деяких варіантах здійснення ретродиференційовані клітини можуть піддаватися передиференціюванню в окремій стадії. Наприклад, ретродиференційовані клітини можуть бути передиференційованими контактом ретродиференційованих клітин з факторами росту, які включають, але не обмежуються ними, основний фактор росту фібробласта, епідермальний фактор росту, колонієстимулюючий фактор макрофага гранулоцита, фактор стовбурових клітин, інтерлейкіни-1-3, -6 і -7, основний фактор росту фібробласта, епідермальний фактор росту, колонієсєтимулюючий фактор макрофага гранулоцита, колонієсєтимулюючий фактор гранулоцита, еритропоетин, фактор стовбурових клітин, і морфогенетичні білки кісток. Утворені передиференційовані клітини-мішені потім можуть бути введені хворому.

У варіантах здійснення винаходу комітовані клітини-попередники можуть бути трансдиференційованими культивуванням комітованих клітин-попередників за специфічних умов культивування. Наприклад, комітовані клітини можуть бути культивовані у специфічних типах культуральних середовищ у поєднанні із засобами ретродиференціювання. Приклади цих культуральних середовищ можуть включати середовище Ігла, модифіковане Дульбеко (ОМЕМ), або середовище ІМОМ та інші. Культуральні середовища тканин можуть також включати засіб, який промотивує диференціювання, такий як вітаміни і/або мінеральні добавки, гідрокортизон, дексаметазон, бета-меркаптоетанол і так далі. Крім того, додаткові умови культивування

Зо включають хелатуючі агенти або антибіотики, культивування за певних температур або рівнях діоксиду вуглецю або кисню, і культивування в спеціальних посудинах. Умови культивування можуть визначати тип трансдиференційованих клітин-мішеней, які при цьому виникають.

Одним аспектом винаходу є, таким чином, спосіб отримання клітин-мішеней. Спосіб може включати, отримання комітованих клітин-попередників і потім перепрограмування комітованих клітин. Ці способи описані в цій заявці. У деяких варіантах здійснення спосіб може включати ретродиференціацію комітованих клітин. У інших варіантах здійснення спосіб може включати трансдиференціювання комітованих клітин. У інших варіантах здійснення спосіб може включати ретродиференціацію комітованих клітин, і потім передиференціювання ретродиференційованих клітин.

Іншим аспектом винаходу є використання одних або більше перепрограмованих клітин- мішеней для отримання лікарського засобу для відновлення або оновлення тканин або клітин клітинних ліній хворого, або для лікування хвороби або пошкодження тканини.

Ще, іншим аспектом винаходу є спосіб лікування хвороби або пошкодження тканини хворого, який цього потребує. У певних варіантах здійснення спосіб передбачає отримання комітованих клітин-попередників, перепрограмування комітованих клітин, щоб отримати перепрограмовані клітини-мішені, і введення перепрограмованих клітин-мішеней хворому. У деяких варіантах здійснення клітини-мішені можуть бути перепрограмовані шляхом ретродиференціювання, трансдиференціювання і/або передиференціювання. У певних варіантах здійснення клітинами-мішенями є ретродиференційовані клітини-мішені, трансдиференційовані клітини-мішені і/або передиференційовані клітини-мішені. Способи отримання комітованих клітин-попередників і перепрограмування комітованих клітин є такими, як описані в цій заявці.

У деяких варіантах здійснення перепрограмовані клітини-мішені, такі як ретродиференційовані клітини-мішені, трансдиференційовані клітини-мішені або передиференційовані клітини-мішені можуть бути введені шляхом ін'єкції, імплантації або інфузії. Ці о клітини можуть бути введені парентеральною, внутрішньом'язовою, внутрішньовенною, підшкірною, внутрішньоочною, пероральною, трансдермальною ін'єкцією, або ін'єкцією в спинну рідину. У певних варіантах здійснення ретродиференційовані клітини- мішені або трансдиференційовані клітини-мішені вводять у фармацевтичну композицію. бо Фармацевтична композиція може включати ретродиференційовані клітини-мішені або трансдиференційовані клітини-мішені і, щонайменше, один фармацевтично прийнятний ексципієнт.

Одним аспектом винаходу є фармацевтична композиція для введення перепрограмованих клітин-мішеней, таких як ретродиференційовані клітини-мішені або трансдиференційовані клітини-мішені. Фармацевтична композиція може включати один або більше типів клітин- мішеней і, щонайменше, один фармацевтично прийнятний носій. Необов'язково, фармацевтична композиція може включати допоміжні засоби і/або інші ексципієнти, придатні для введення хворому.

Іншим варіантом винаходу є спосіб отримання фармацевтичної композиції або лікарського засобу, який передбачає (ї) отримання комітованих клітин-попередників, (її) перепрограмування комітованих клітин, щоб отримувати перепрограмовані клітини-мішені, і (ії) необов'язково, комбінування перепрограмованих клітин-мішеней з одним або більше фармацевтичним ексципієнтом. У деяких варіантах здійснення перепрограмовані клітини-мішені комбінують з одним або більше фармацевтичними ексципієнтами. У інших варіантах здійснення перепрограмовані клітини-мішені не комбінують з одним або більше фармацевтичними ексципієнтами. Способи отримання комітованих клітин-попередників і перепрограмування комітованих клітин описані в цій заявці.

Необхідно мати на увазі, що в цьому описі і, особливо, у формулі винаходу терміни, такі як "містить", "який містить" тощо, можуть мати значення, яке визначене для них в американському

Патентному праві; наприклад, вони можуть мати на увазі, "включає", "який включає" тощо; і що терміни, такі як "який, власне складається з" і "складається, власне 3" мають значення, яке визначене для них в американському Патентному праві, наприклад, що вони враховують елементи, не описані явно, але виключають елементи, які знайдені в попередньому рівні техніки, або які впливають на основну або нову характеристику винаходу.

Ці та інші варіанти здійснення розкриті або є очевидними і охоплені наступним докладним описом.

Короткий опис креслень

Наступний докладний опис приведений як приклад, але не покликаний обмежувати винахід виключно конкретними описаними варіантами здійснення, і може бути краще всього зрозумілим

Зо у поєднанні з наведеними кресленнями, на яких:

Фіг. 1 показує імунофенотипування аферезованих одноядерних клітин до і після (нижня панель) початку перепрограмування. Клітини маркірували моноклональними антитілами, зв'язаними з К-фікоеритрином (КРЕ) Су-5 або фікоеритринами (РЕ) (вертикальні позначення) для ізотипного контролю імуноглобуліну С1 (ІДС) ії СО34 або СО19, відповідно. Клітини були також пофарбовані для ізотипових контролів СО45, СОЗ38, СОб1 і ІДОІ моноклональних антитіл, зв'язаних з ізотіоціанатом флуоресцеїну (РІТС) (горизонтальні позначення). Нижня панель показує збільшення гематопоетичних стовбурових клітин, як показано збільшенням відносного числа СО34 і СО34С038-клітин, яке супроводжується зменшенням зрілих маркерів лейкоцитів, таких як СЮ45 і СО19;

Фіг. 2А показує послідовне імунофенотипування зразків периферійної крові хворого з серйозною апластичною анемією, за яким слідує інфузія аутологічних НКЗС (після 1 дня, 2 дня,

З дня, 6 дня і 14 дня). Клітини маркували моноклональними антитілами проти СОЗ4 і СО45 (2-а горизонтальна панель), і СО34 ії СО38 (3-я горизонтальна панель). Верхня горизонтальна панель показує, що переднє і бічне розсіювання є цитометрією потоку, мазком кісткового мозку, і перетином їейпрйіп аутологічних НЕ5С. 1 день - 14 день демонструють збільшення клітин, які мають велике переднє і бічне розсіювання, яке указує на гранулоцити, і 17 день - З день демонструють збільшення відносного числа циркулюючих СО34 гематопоетичних стовбурових клітин.

Фіг. 265 показує послідовне імунофенотипування зразків периферійної крові хворого на важку форму апластичної анемії, за яким слідує інфузія аутологічних перепрограмованих стовбурових клітин людини (НЕЗС) (після день 1, день 2, день 3, день 6 і день 14). Клітини маркірували моноклональними антитілами проти СОЗ34 ії СО61 (1-а горизонтальна панель), СО19 ії СОЗ (2-а панель), і СО33813 і СО07 (3-я горизонтальна панель). Графік РГАС5сап показує збільшення числа мієлоїдних клітин, як показано поступовим збільшенням клітин, які експресують СОЗЗ8,, включаючи клітини-попередники, яке показане поступовим збільшенням відносного числа клітин, які спів-експресують СО33813 з СО7. Крім того, було поступове збільшення відносного числа лімфоцитів, як показано збільшенням відносного числа лімфоцитів СЮО19 і ОЗ;

Фіг. З показує аналіз кісткового мозку хворого на важку апластичну анемію до і після інфузії аутологічних НАС. Мазок кісткового мозку до і після терапії (а і Ю) показує збільшення червоних бо кров'яних клітин; перетин іегрпіпе до і після терапії (с і 4) показує збільшення насиченості клітинами кісткового мозку; клоновий аналіз кісткового мозку, за яким слідує інфузія НК5С, показує збільшення росту колонієутворюючої одиниці мегакаріоциту (є); колонієутворюючих моноцитів (Ї); колонієутворюючих гранулоцитів-макрофагів (49); ії колонієутворюючих мієлоцитів- еритроїдів (Й); і вибухоутворюючих еритроїдів (і);

Фіг. 4 показує каріотипування і С-діапазон зразка периферійної крові хворого на важку апластичну анемію, за якими слідує 4 роки інфузії аутологічних НК5С, що демонструють відсутність генетичних аномалій;

Фіг. 5 показує збільшення абсолютних середніх рівнів фетального гемоглобіну у хворих на таласемію з подальшим лікуванням аутологічними перепрограмованими клітинами;

Фіг. б показує збільшення середнього показника гематокриту, який є середнім розміром червоних кров'яних клітин (еритроцитів), представленим у фемтолітрах, у хворих на таласемію з подальшим лікуванням аутологічними перепрограмованими клітинами;

Фіг. 7 показує збільшення середньоклітинного гемоглобіну, який є вагою гемоглобіну на клітину, представленою в пікограмах, у хворих на таласемію після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами;

Фіг. 8 показує зменшення рівня сироваткового феритину, представленого в нанограмах на мілілітр, у хворих на таласемію після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами;

Фіг. 9 показує збільшення рівнів С-пептиду натщесерце і після засвоєння змішаної борошняної їжі у хворих на діабет після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами;

Фіг. 10 показує зменшення рівнів глікозильованого гемоглобіну (НБАЇС) у хворих на діабет після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами;

Фіг. 11 показує зменшення рівнів креатинфосфокінази (СРК) і лактатдегідрогенази (І ОН) у хворих на м'язову дистрофію після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами;

Фіг. 12 показує зменшення рівнів ферментів печінки, аланінамінотрансферази (АЛ) і аспартатамінотрансферази (А5Т), у хворих на м'язову дистрофію після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами;

Фіг. 13 показує зменшення рівнів мікроальбумін-сечовини у 12 хворих з хворобою нирок після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами;

Зо Фіг. 14 показує зменшення рівнів глікозильованого гемоглобіну (НЬАІС) у 12 хворих з хворобою нирок внаслідок діабету після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами;

Фіг. 15а показує сканограми зображень магнітного резонансу (МК) мозку хворого на розсіяний склероз до (ліва сканограма) і через три місяці після (права сканограма) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами і демонструє зменшення посилення стану пошкодження після терапії стовбуровими клітинами;

Фіг. 150 показує сканограми МКІ різних ділянок мозку хворого до (ліва сканограма) і через три місяці після (права сканограма) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами.

На сканограмах, які зображають стан до обробки, стрілки указують пошкодження в мозку, тоді як в сканограмах, зроблених після обробки, стрілки демонструють зменшення пошкоджень;

Фіг. 1ба показує сканограму зображень магнітного резонансу (МЕ) мозку хворого на розсіяний склероз до (верхні сканограми) і через шість місяців після (нижні сканограми) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами.

Фіг. 16р показує додаткові сканограми МКІ мозку хворого до (верхні сканограми) і через шість місяців після (нижні сканограми) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами.

У сканограмах, які демонструють стан до лікування, стрілки указують пошкодження в мозку, тоді як в сканограмах, які демонструють стан після лікування, стрілки указують на зменшення пошкодження із зниженням атрофії мозку, як показано зменшенням шлуночку і розширенням звивини;

Фіг. 17а показує сканограми зображень сагітального магнітного резонансу хворого на розсіяний склероз до (ліва сканограма) і через шість місяців після (права сканограма) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами.

Фіг. 17р показує поперечні МКІ сканограми спинного мозку хворого до (ліва сканограма) і через шість місяців після (права сканограма) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами. У сканограмах, які демонструють стан до лікування, стрілки указують пошкодження спинного мозку, тоді як в сканограмах, які демонструють стан після лікування, стрілки указують зменшення пошкодження;

Фіг. 182 показує зменшення рівнів ферменту печінки аланінамінотрансферази (АТ), а

Фіг. 18р показує зменшення рівнів аспартаттрансферази (А5Т) у хворих, заражених бо гепатитом С з подальшим лікуванням аутологічними перепрограмованими клітинами;

Фіг. 192 показує сканограми зображень магнітного резонансу (МЕ) мозку хворого з травмою голови унаслідок автомобільної аварії До лікування (верхні сканограми), шлуночки демонструють розширення і зсув з широкою, гострою гематомою. Після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами (нижні сканограми) шлуночки демонструють зменшення параметрів атрофії мозку, таке як зменшення шлуночку і розширення звивини зі зменшенням гематоми.

Фіг. 19р показує додаткові сканограми МК! мозку хворого до і після (нижні сканограми) лікування;

Фіг. 20 показує рентгенівський знімок хворого на хворобу легенів до і після (правий знімок) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами. Після лікування хворого показано поліпшення об'єму легень і зменшення розміру пошкодження, як показує зменшення областей гіпо-щільності;

Фіг. 21 показує рівні статевого гормону - фолікулостимулюючого гормону (І51П), лютеїнізуючого гормону (ІЙ), прогестерону (рго) і тестостерону (ї1е5ї) у хворих із закупорюючою азооспермією, підданих лікуванню аутологічними перепрограмованими клітинами. Рівні демонструють значне збільшення вільного тестостерону паралельно із збільшенням розміру яєчка (дані не показані), визначені ультразвуком;

Фіг. 22 показує чутливість сітківки і втрату зору у хворого, який страждає від ослабленого зору до і після (нижня панель) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами.

З даних про чутливість сітківки витікає, що оранжева область указує на знижену чутливість сітківки. Із даних про погіршення зору витікає, що білі області указують на нормальний зір, а рожева, оранжева і чорна області указують на підвищену втрату зору. Після лікування хворий відчув поліпшення свого поля зору, оскільки оранжеві області за результатами щодо чутливості сітківки до лікування ставали зеленими і білими після лікування, а чорні області при втраті зору до лікування ставали білими після лікування.

Здійснення винаходу

Визначення

Термін "комітовані клітини-попередники", як він використовується тут, позначає клітини, які демонструють диференційований характер. Ці клітини часто вважають зрілими і

Зо спеціалізованими. Приклади включають білі клітини крові, червоні клітини крові, клітини епітелію, нейрони і хондроцити.

Термін "некомітовані клітини", як він використовувався тут позначає клітини, які не демонструють зрілого диференційований характер. Ці клітини часто вважають незрілими і неспеціалізованими. Прикладом некомітованої клітини-попередниці є стовбурова клітина, яка є незрілою клітиною, яка здатна до самовідновлення (ділення без обмежень) і диференціації (спеціалізації). Термін "перепрограмування", як він використовується тут, відноситься до процесу, в якому комітована клітина першої лінії диференціювання перетворюється на клітину іншого клітинного типу. Цей інший тип клітини може мати іншу лінію клітинного диференціювання. Перепрограмування може відбуватися через такі процеси як ретродиференціювання, трансдиференціювання, передиференціювання.

Термін "перепрограмована клітина", як він використовується тут, позначає клітину, яка є комітованою клітиною, яка зазнала перепрограмування. Перепрограмовані клітини можуть включати ретродиференційовані клітини, трансдиференційовані клітини імабо передиференційовані клітини.

Термін "ретродиференціювання", як він використовується тут, позначає процес, внаслідок якого, комітована, тобто, зріла, спеціалізована клітина, реверсує назад, до стану примітивнішої стадії клітин. "Ретродиференційована клітина" є клітиною, яка утворюється внаслідок ретродиференціювання комітованої клітини.

Термін "т"трансдиференціювання", як він використовується тут, позначає процес, внаслідок якого, комітована клітина першої лінії диференціювання перетворюється на іншу клітину, іншого клітинного типу. У деяких варіантах здійснення трансдиференціювання може бути комбінацією ретродиференціювання і передиференціювання. "Трансдиференційована клітина" є клітиною, яка утворюється з трансдиференційованої комітованої клітини. Наприклад, комітована клітина, така як клітина цілісної крові може бути трансдиференційованою в нейрон.

Термін "передиференціювання", як він використовується тут, відноситься до процесу, при якому некомітована клітина або ретродиференційована клітина диференціюється в більш зрілу, спеціалізовану клітину. Термін "передиференційована клітина" відноситься до клітини, отриманої з передиференційованої некомітованої клітини або ретродиференційованої клітини.

Якщо передиференційовану клітину отримують в результаті передиференціювання бо ретродиференційованої клітини, передиференційована клітина може мати ту ж саму або іншу лінію диференціювання, що і комітована клітина, яка зазнала ретродиференціювання.

Наприклад, комітована клітина, така як біла клітина крові, може бути ретродиференційованою з отриманням ретродиференційованої клітини, такої як плюрипотенційна стовбурова клітина, а потім ретродиференційована клітина може бути передиференційованою з отриманням лімфоцита тієї ж самої клітинної лінії що і біла клітина крові (комітована клітина), або передиференційованою з отриманням нейрона, який має іншу лінію диференціювання, ніж біла клітина крові (комітована клітина).

Термін "клітина-мішень", як він використовується тут, позначає клітину, яку отримують для введення хворому, з метою відновлення або оновлення тканини або клітин. Наприклад, клітина- мішень може бути перепрограмованою клітиною-мішенню, такою як ретродиференційована клітина-мішень або трансдиференційованою клітиною-мішенню, таким чином, ретродиференційовані або трансдиференційовані клітини-мішені вводять хворому.

Комітовані клітини

Як описано вище, комітовані клітини запропоновані даним винаходом є клітинами, які демонструють диференційований характер. Комітована клітина може включати будь-які компоненти, які стосуються індикації антигену, захоплення або розпізнавання. Наприклад, комітована клітина може бути клітиною МНС класу І: і/або МНС класу ІІ».

Комітована клітина може також бути будь-якою клітиною, отриманою або яку отримують, з недиференційованої клітини. Таким чином, в одному варіанті здійснення, некомітована клітина є також недиференційованою клітиною. Як приклад, комітована клітина може бути лімфоїдною стовбуровою клітиною або мієлоїдною стовбуровою клітиною, яку диференціюють відносно плюрипотенційної стовбурової клітини. Комітовані клітини можуть бути отримані з біологічного матеріалу, такого як кров або близькі тканини, включаючи кістковий мозок або пуповинну кров, нейронну тканину з центральної нервової системи або периферійної нервової системи, м'язову тканину, або епідерміс і/або тканину шкіри (тобто, наприклад, зіскрібок з ротової порожнини).

Біологічний матеріал може мати післяродове походження.

Біологічний матеріал може бути отриманий, використовуючи способи, відомі в технології, які відповідають типу тканини. Приклади включають, але не обмежуються такими, як вирізання, вилучення голкою, мазок і аферезис.

Зо У певних варіантах здійснення комітовані клітини отримують з цілісної крові або перероблених продуктів крові, таких як плазма або світлий шар кров'яного згустку, оскільки їх видалення з суб'єктів може бути виконане під мінімальним медичним контролі. Зразки крові зазвичай обробляють антикоагулянтами, такими як гепарин або цитрат. Клітини біологічного зразка можуть бути оброблені, щоб збагатити певні типи клітин, видалити певні типи клітин або відокремити клітини від маси тканини. Придатними способами очищення і відділення клітин є центрифугування (таке як центрифугування з градієнтом щільності), цитометрія потоку і афінна хроматографія (така як використання магнітних гранул, які включають моноклональні антитіла до маркерів поверхні клітин або пенінг) (див. Мейезе-ЮОадеу, Те Зсієпіївї 1999, 13: 21).

Наприклад, розділення в градієнті фікол-гіпзак є придатним для видалення еритроцитів і гранулоцитів, щоб залишити одноядерні клітини, такі як лімфоцити і моноцити.

Приклади комітованих клітин, які можуть бути отримані з крові, включають, але не обмежуються такими, як клітини СЕС-Т, клітини СЕС-В, клітини СЕС-еозин, клітини СЕС-Вав, клітини СЕС-Ва:х, клітини СЕС-СМ, СЕС-М, клітини СЕС-МЕС, клітини ВЕС-Е, клітини СЕС-Е, Т- клітини, В-клітини, еозинофіли, гранулоцити, базофіли, нейтрофіли, моноцити, мегакаріоцити і еритроцити.

Отримані комітовані клітини крові можуть бути ідентифіковані за експресією певних антигенів. Наприклад, В-клітинами є клітини СО19:, СО21:, бО22: і ОКУ. Т-клітинами є клітини

Ср2г», С03», і або СО4», або СОВ8». Незрілими лімфоцитами є клітини СО4: і СО8:. Активованими

Т-клітинами є клітини ОК". Природними клітинами-кілерами (МК) є клітини СО56: і СО165. Т- лімфоцитами є клітини СО7". Лейкоцитами є клітини СО457". Гранулоцитами є клітини СО13: і

СО33». Клітинами макрофага моноцита є клітини СО14» і ОК».

У певних варіантах здійснення комітована клітина може бути В-лімфоцитом (активованим або неактивованим), Т-лімфоцитом (активованим або неактивованим), клітиною з клітинної лінії моноцита макрофага, ядровмісною клітиною, яка здатна експресувати антигени класу | або класу ІЇ, клітиною, яка може стимулювати експресію антигенів класу | або класу Ії або енуклейованою клітиною (тобто, клітиною, яка не містить ядра, такою як червона кров'яна клітина).

У альтернативних варіантах здійснення комітована клітина може бути вибрана із будь-якої групи клітин, яка включає великі гранулярні лімфоцити, нуль-лімфоцити і природні клітини- бо кілери, кожна з яких здатна експресувати поверхневі рецептори клітин СО56 і/або СО16.

Оскільки комітовані клітини є власне первинними культурами, може бути необхідним доповнити популяції клітин відповідними поживними речовинами, щоб підтримати життєздатність. Відповідні умови культивування відомі фахівцеві з технології. Проте, обробку популяції клітин бажано ініціюють якнайскоріше після видалення біологічних зразків від хворих, зазвичай протягом 12 годин, бажано протягом 2-4 годин. Життєздатність клітини може бути перевірена, використовуючи відомі методики, такі як виключення трипанового синього або пропідійодид.

Ретродиференційовані клітини

Ретродиференціювання є типом способу перепрограмування, за допомогою якого структури і функції клітин прогресивно змінюються, щоб дати початок менш спеціалізованим клітинам.

Ретродиференціювання може відбуватися природно, причому клітини можуть піддаватися обмеженому зворотному диференціюванню іп мімо у відповідь на пошкодження тканини.

Альтернативно, ретродиференціювання може бути викликане, використовуючи способи, описані в заявці О5 08/594,164, зараз патент О5 6 090 625; заявка 05 09/742,520, зараз патент 05 7 112 440; заявка 05 10/140,978, зараз патент 05 7 220 412; заявка 05 10/150,789, зараз патент 05 7 410 773; і заявка О5 Мо. 09/853,188, які всі включені тут як посилання.

Ретродиференційовані клітини відповідно до винаходу можуть включати, але не обмежуватися ними, плюрипотенційні стовбурові клітини, лімфоїдні стовбурові клітини, мієлоїдні стовбурові клітини, невральні стовбурові клітини, клітини сателітів скелетного м'яза, епітеліальні стовбурові клітини, ендодермальні стовбурові клітини, мезенхімні стовбурові клітини і ембріональні стовбурові клітини.

У певних варіантах здійснення комітовані клітини отримують з крові і ретродиференціюють з отриманням ретродиференційованих клітин гематопоетичної клітинної лінії.

Приклади цих ретродиференційованих клітин включають, але не обмежуються такими, як плюрипотенційні стовбурові клітини, лімфоїдні стовбурові клітини і мієлоїдні стовбурові клітини.

Комітовані клітини можуть бути ретродиференційованими контактом клітин із засобом, який реально стикається з клітинами. Клітини потім культивують, щоб дозволити цим клітинам, які реально стикалися із засобом, розвиватися через процес ретродиференціації і, кінець кінцем, ставати недиференційованими.

Зо Стадія контактування може включити засіб зчеплення з поверхневими антигенами на комітованих клітинах. Засіб може діяти в прямому зчепленні або в непрямому зчепленні з комітованої клітиною. Прикладом прямого зчеплення є те, що комітована клітина має, щонайменше, один поверхневий рецептор клітини на її поверхні, такий як В-ланцюг, який має гомологічні області (області, які зазвичай мають ту ж саму або подібну послідовність), таку як послідовності, які можуть бути знайдені на В-клітинах, і в якому засіб прямо зачіпає поверхневий рецептор клітини. Іншим прикладом є те, що комітована клітина має поверхневий рецептор клітини на її клітинній поверхні, такий як а-ланцюг, який має гомологічні області, такі як області, які можуть бути знайдені на Т-клітинах, і в якому засіб прямо зачіпає поверхневий рецептор клітини.

Прикладом непрямого зчеплення є те, що комітована клітина має, щонайменше, два поверхневих рецептори клітини на її клітинній поверхні і зчеплення засобу з одним з рецепторів впливає на інший рецептор, який потім викликає ретродиференціювання комітованої клітини.

Засіб для ретродиференціювання комітованої клітини може бути хімічною сполукою або композицією. Наприклад, засіб може бути здатний до зчеплення поверхневого рецептора клітини на поверхні комітованої клітини. У певних варіантах здійснення засіб реально зачіпає рецептор, присутній на поверхні комітованої клітини --- цей рецептор може бути експресований комітованою клітиною.

Наприклад, засоби можуть включати, але не обмежуватися такими, як будь-який один або більше циклічний аденозинмонофосфат (САМР), молекулу СО4, молекулу СО8, частину або весь рецептор Т-клітини, ліганд (закріплений або вільний), пептид, рецептор Т-клітини (ТОК), антитіло, перехресно-реагуюче антитіло, моноклональне антитіло або поліклональне антитіло.

Можуть також використовуватися Фактори росту такі як гематопоетичні фактори росту, наприклад, еритропоетин і гранулоцит-моноцит колонієстимулюючий фактор (ЗМ-С5БЕ).

Якщо засіб є антитілом, перехресно-реагуючим антитілом, моноклональним антитілом або поліклональним антитілом, то засіб може бути одним або більше з поміж засобів, таких як антитіло, перехресно-реагуюче антитіло, моноклональне антитіло або поліклональне антитіло з поміж будь-яких одного або більше: бета-ланцюга антигену МНС класу ІІ, бета-ланцюга антигену МНС НІ А-ОК, а-ланцюга антигену МНС класу І або класу ІЇ, а-ланцюга антигену НІ А-

ОРЕ, а - і В-ланцюга антигену МНС класу ІЇ або антигену МНС класу І. Прикладом антитіла є бо СЗ/43 (поставляється Деко (Бако)).

Термін "антитіло" може включати різні фрагменти (чи отримані вони протеолітичним розщепленням або за допомогою рекомбінантної технології) і похідні, які зберігають активність щодо зв'язування, такі як антитіла Раб, Е(аб)2 і 5сЕм, а також їх міметики або біоізостери.

Антитіла також включають генно-інженерні варіанти, в яких деякі з послідовностей амінокислот були змінені, наприклад, заміною амінокислотних залишків, щоб підсилити зчеплення, або, в яких антитіла були отримані в різних видів бажаних для організму клітин, щоб лікувати відповідно до методів запропонованих винаходом, щоб зменшити ймовірність несприятливих імунних реакцій (прикладом цього є гуманізовані мишачі моноклональні антитіла).

Засоби, які використовуються, щоб викликати перетворення комітованої клітини на ретродиференційовану клітину бажано можуть діяти позаклітинно відносно комітованої клітини.

Наприклад, комітована клітина може включати рецептор, який реально зчіпляється із засобом, і засіб реально зчіпляється із рецептором.

Наприклад, рецептор може бути поверхневим рецептором клітини. Конкретні приклади поверхневих рецепторів клітини включають, але не обмежуються такими як, рецептори МНС класу І ї МНС класу Ії. Рецептор може включати а-компонент і/або рД-компонент, як має місце для рецепторів МНС класу І ії МНС класу ІІ.

Рецептор може включати В-ланцюг, який має гомологічні області, наприклад, щонайменше, області гомологічні до В-ланцюга НІ А-ОВ.

Альтернативно, або крім того, рецептор може включати а-ланцюг, який має гомологічні області, наприклад, щонайменше, гомологічні області до а-ланцюга НІ А-ОК. Рецептор може бути антигеном класу І або класу ІІ головного комплексу тканинної сумісності (МНС). У певних варіантах здійснення поверхневий рецептор клітини може включати, але не обмежуватися ними, рецептор НГА-ОК, рецептор ОМ, рецептор ОР, рецептор БО, рецептор НГА-А, рецептор

НГА-В, рецептор НІА-С, рецептор НІГА-Е, рецептор НІГ А-Е, або рецептор НІ А-б. У деяких варіантах здійснення поверхневий рецептор клітини може бути рецептором НІГ А-ОВ.

Засіб може бути антитілом до рецептора, таким як моноклональне антитіло до рецептора.

Прикладом засобу може бути засіб, який модулює експресію гена МНС, таку як експресія

МНС класу І і/або МНС класу І.

У певних варіантах здійснення засіб може використовуватися у поєднанні з модифікатором

Зо біологічної реакції. Приклади модифікаторів біологічної реакції включають, але не обмежуються такими як, алкілюючий засіб, імуномодулятор, фактор росту, цитокін, поверхневий рецептор клітини, гормон, нуклеїнову кислоту, послідовність нуклеотидів, антиген або пептид. Наприклад, алкілюючий засіб може бути або може включати циклофосфоамід.

Інші модифікатори біологічної реакції можуть включати сполуки, здатні до стимулюючої регуляції експресії антигена МНС класу І і/або класу ІЇ, яка, в деяких варіантах здійснення, може дозволити засобу, який зв'язується з рецептором МНС, працювати ефективніше.

Оскільки будь-який тип клітини може бути отриманий, щоб експресувати антигени МНС класу І і/або класу ІЇ, то це може забезпечити метод ретродиференціювання різних типів клітин, які або експресують в основному, антигени МНС класу І і/або класу І! або ні.

Комітовані клітини зазвичай культивують із засобом протягом, щонайменше, двох годин, звичайно від 2 до 24 годин, бажано від 2 до 12 годин. Культивування зазвичай виконують за температури від приблизно кімнатної або, наприклад, приблизно 22 "С, до приблизно 37 "С, включаючи 33"С. Перебіг процедури ретродиференціювання може бути перевірений періодично видаленням малої аліквоти зразка і дослідженням клітин, використовуючи мікроскопію і/або цитометрію потоку. Альтернативно, пристрій може включити засоби стеження он-лайн моніторингу перебігу процедури ретродиференціювання.

На додачу до використання ретродиференціюючих засобів комітовані клітини можуть бути культивовані в аутологічній плазмі або сироватці, або в ембріональній сироватці крові або сироватці коня. Необов'язково, комітовані клітини можуть бути культивовані з антикоагулянтами, хелатуючими засобами або антибіотиками. Діапазон температур для культивування клітин може бути розширений до 18-40 "С, і може також включати 4-10 95 СО» мМабо 10-35 95 ОО». Крім того, культивування може відбуватися в мішках для крові, мішках розведення тканини, або пластмасових посудинах, як покритих, так і непокритих.

Певні типи ретродиференційованих клітин можуть бути отримані ретродиференціюванням, застосовуючи певні умови культивування. Наприклад, комітовані клітини можуть бути ретродиференційованими в плюрипотенційні клітини культивуванням комітованих клітин в середовищі Ігла, модифікованому Дульбекко (МЕМ), неістотних амінокислот (МЕАА), І- глютаміну (І-діш) ії В-меркаптоетанолу (2 В-МЕ), у поєднанні з ретродиференціюючими засобами. Комітовані клітини можуть також бути спочатку піддані дії хелатуючих засобів. бо Як інший приклад, щоб отримати мезенхімні клітини, комітовані клітини можуть бути культивовані - у поєднанні з ретродиференціюючим засобом (засобами) - використовуючи

ОМЕМ (низька глюкоза) і І-діш, або ОМЕМ (низька глюкоза), Ї-діш, 2 В-МЕ і МЕАА. Далі, антибіотик гентаміцин може також використовуватися при культивуванні клітин.

Трансдиференційовані клітини

Трансдиференційовані клітини отримують культивуванням комітованих клітин з середовищем культивування тканини у поєднанні з ретродиференціюючими засобами.

Комітовані клітини, таким чином, піддаються трансдиференціюванню, при якому комітовані клітини перетворюються на клітини іншого клітинного типу; у деяких варіантах здійснення комітовані клітини перетворяться на клітини іншої лінії диференціювання.

Тип клітини-мішені, отриманий трансдиференціюванням, залежить від умов культивування.

Ці умови змінюються відповідно до типу культурального середовища тканини, присутності/відсутності різних засобів, промотивуючих диференціювання, присутності/відсутності різних сироваток, температури культивування, присутності/ відсутності кисню або діоксиду вуглецю, і типу ємкості або посудини, які використовуються для культивування.

Приклади культурального середовища тканини, яке використовується /- для трансдиференціювання, включають, але не обмежуються такими як, середовище ІМОМ, середовище ЮОМЕМ, мінімальне необхідне середовище іІгла (ЕМЕ), о0-МЕМ, КРМІ, де середовище було розроблене), 1640, Нат-Е-12, Е199, МСОВ, І віромії: І-15, середовище Е

Вільямса, або будь-яке комерційно складене культуральне середовище тканини.

Засоби, які промотивують диференціювання, включають антикоагулянти, хелатуючі засоби і антибіотики. Прикладами таких засобів можуть бути один або більше з поміж наступних: вітаміни і мінерали або їх похідні, такі як А, ВЗ, С (аскорбат), аскорбат-2-фосфат, 02, 03, К, ретиноєва кислота, нікотинамід, цинк або сполуки цинку, і кальцій або сполуки кальцію; природні або синтетичні гормони, такі як гідрокортизон і дексаметазон; амінокислоти або їх похідні, такі як І -глутамін (І-діІ0), етиленглікольтетраоцтова кислота (ЕСТА), пролін і неістотні амінокислоти (МЕАА); сполуки або їх похідні, такі як В-меркаптоеталь, дибутил циклічний аденозинмонофосфат (ар-сСАМР), монотіогліцерин (МТС), путресцин, диметилсульфоксид (ОМ50О), гіпоксантин, аденін, форсколін, силостамід і 3-ізобутил-1-метилксантин; нуклеозиди та їх аналоги, такі як 5-азацитидин; кислоти або їх солі, такі як аскорбінова кислота, піруват, щавлева кислота, лінолева кислота, етилендиамінтетраоцетова кислота (ЕОТА), антикоагулянт цитратдекстроза формули А, динатрій ЕОТА, бутират натрію, і гліцерофосфат; антибіотики або лікарські засоби, такі як 5418, гентаміцин, Пентоксифілін (1-(5-оксогексил)-3,7-диметилксантин) та індометацин і білки, такі як активатор плазміногену тканини (ТРА).

Ці засоби, які промотивують диференціювання, можуть використовуватися, щоб отримати певні типи клітин-мішеней. Наприклад, вітамін ВЗ може використовуватися, щоб отримати ацинарні клітини, такі як оострівцеві клітини, або гідрокортизон; дексаметазон може використовуватися, щоб отримати клітини мезенхімної природи або епітеліальної природи (наприклад, ниркові епітеліальні клітини, шкіру і близькі структури, такі як клітини шкірного сосочка); і В-меркаптоеталь може використовуватися, щоб привести до ектодермальних клітин, таких як нейронні клітини, включаючи антиген-представляючі клітини ЦНС.

Культуральне середовище може містити аутологічну плазму; тромбоцити; сироватку, таку як збір крові плоду; або сироватки, отриманої від ссавців, такої як сироватка коня. Крім того, конверсійний процес може відбуватися усередині мішка з кров'ю, основи, мішка з культурою тканин або пластмасової посудини з культурою тканин. Посудини з культурою тканин можуть бути прикріпленими або неприкріпленими посудинами з культурою тканини, або можуть бути покриті або непокриті засобами, такими як желатин, колаген, матригелі або позаклітинні матриці, які підтримують прикріплення або плавучість залежно від заданого типу тканини або певних клітин, які треба отримати.

Додаткові умови культивування включають температуру, яка може бути від приблизно 10 до приблизно 60 "С, або від приблизно 18 до приблизно 40 "С; рівень діоксиду вуглецю (СО»), який може бути від приблизно 0 до приблизно 20 95, або від приблизно 4 до приблизно 10 95; і кисень (О2), який може бути від приблизно 0 до приблизно 50 95, або від приблизно 10 до приблизно 35 9.

Приклади способів отримання клітин-мішеней, які використовуються у поєднанні з ретродиференціюючими засобами обговорюються в таблиці 1.

Таблиця 1

Способи отримання різних типів клітин-мішеней в комбінації з ретродиференціюючими засобами

Умови культивування які

Тип клітин-мішеней використовуються в комбінації з Додаткові умови культивування ретродиференціюючими засобами "Попередня дія на комітовані

Плюрипотенційні клітини хелатуючих засобів і стовбурові клітини або х ОМЕМ, МЕАА, 1-діи антикоагулянтів. гетерогенна популяція 28-МЕ Для клітин-попередників плюрипотенційних видалення ретродиференціюючих клітин-попередників засобів розбавленням тільки культуральним середовищем 2, |" ОМЕМ (низька глюкоза) І -діи; або

Мезенхімні стовбурові |, ж .

І-діш, 28-МЕ, МЕАА вАС "культивування може бути при "ВЕРМІ 1640, необов'язково з МЕАА, | приблизно 30-32 "С для

І-дімю, 28-МЕ сперматозоїдів і приблизно 38- для овоцитів, або 39 "С для овоцитів. " середовище ЕМЕ, ретинол, І -дІи |" клітини можуть бути піддані дії піруват натрію хелатуючих засобів лактат натрію, МЕАА таких як ЕОТА і ЕСТ для овоцитів; або перед ретродиференціюванням і " ОМЕМ, Натз Е12 передиференціюванням. вітамін С, вітамін Е " Для сперматозоїдів "Плюрипотенційні ретиноєва кислота, ретинол можна включити зародкові клітини піруват, необов'язково з додавання окадової "Овоцити Пентоксифіліном для кислоти, ОМ5О і цинку "Сперматозоїди сперматозоїдів; або або сполуки цинку; "Умови культивування Гамета 100 може бути для плюрипотенційних використана як базальне стовбурових клітин середовища замість перерахованих вище, і з х Для овоцитів, можна додатковою умовою включати додавання культивування приведеній в др-сАМР, динатрій ЕОТА, наступній колонці для форсколіну, силостаміду і сперматозоїдів гіпоксантину або овоцитів. "Для овоцитів, середовище 199 може бути використане як базальне середовище замість " ОМЕМ, На!тз Е12, і гідрокортизон необов'язково з вітаміном К; або "Умови культивування

Нирка ще для плюрипотенційних стовбурових клітин перерахованих вище, з гідрокортизоном

Продовження таблиці 1

Умови культивування які

Тип клітин-мішеней використовуються в комбінації з Додаткові умови культивування ретродиференціюючими засобами х ОМЕМ, МЕАА, І -дІм необов'язково з 28-МЕ нікотинамід, або "Умови культивування ж 00000000 |для плюрипотенційних " З антибіотиком 418 і

Альвеолярний епітелій | стовбурових клітин х Ендодерма перераховані вище, з судини культивування

І й , тканини покриті матригелем. нікотинамідом необов'язково з дексаметазоном, ретиноєвою кислотою, Б-САМР; або х МОМ, І -дін, аскорбінова кислота, МТС х ОМЕМ з На!тзх Е12, МЕАА 28-МЕ, необов'язково з путресцином, ретиноєвою кислотою, І -аЇши гідрокортизоном аскорбатом; або х Нейрон "Умови культивування х Ектодерма для плюрипотенційних стовбурових клітин перераховані вище необов'язково з путресцином, ретиноєвою кислотою гідрокортизоном, аскорбатом "ОМЕМ, Натвх Е12 вітамін ВЗ; або х ЕРМІ 1640 з вітаміном

ВЗ; або

Острівкові клітини "Умови культивування ни для плюрипотенційних

Ацинарні клітини стовбурових клітин перераховані вище, з вітаміном ВЗ (нікотинамід), необов'язково з дексаметазоном

Продовження таблиці 1

Умови культивування які

Тип клітин-мішеней використовуються в комбінації з Додаткові умови культивування ретродиференціюючими засобами х Культивування може виконуватися при 33 С х Культивування може виконуватися за кімнатної температури для збільшення мегакаріоцитів в культурі х" диференційовані "ІМОМ, необов'язково з клітини можуть бути гідрокортизоном; або піддані дії "ІМОМ, І-глутамін і МТО; або хелатуючих засобів "Умови культивування перед конверсією, щоб

Гематопоетичні клітини | для плюрипотенційних збільшити кількість попередників стовбурових клітин еритроїдів в культурі перераховані вище, з х КЕРМІ 1640 може бути 28-МЕ, заміненим на МТО, використана як базальне необов'язково з вітамінами середовище для збагачення попередниками лімфоїдів "бутират натрію і/або

Б-азацитидин може бути доданий в культуру, щоб сприяти примітивній диференціації еритроїдів "РОМЕМ або ІМОМ або а-мінімальне необхідне середовище, І -діи, необов'язково з дексаметазоном

І -аскорбінова кислота-2-фосфатом і нікотирнамідом; . або

Гепатоцити печінки ж . .

Середовище Е Вільямса, піруват натрію, дексаметазон; або "Умови культивування для плюрипотенційних стовбурових клітин перераховані вище, з дексаметазоном

Продовження таблиці 1

Умови культивування які

Тип клітин-мішеней використовуються в комбінації з Додаткові умови культивування ретродиференціюючими засобами хНатз Е12, ОМЕМ (співвідношення середовищ 3: 1), гідрокортизон, І -аЇи необов'язково з аденіном; або " Е199 або ОМЕМ з 1 -аи, необов'язково з ж . . може бути з гідрокортизоном і : .

Шкіра/ кератиноцити аденіном; або гентаміцином як антибіотиком " Умови культивування може культивуватися цій при 36,4 70 для плюрипотенційних стовбурових клітин перераховані вище, з гідрокортизоном необов'язково з кальцієм або сполуками кальцію або аскорбатом

С: М необов'язково з 3-ізобутил-1-

Меланоцити Я метилксантином; або х Середовище 199 і гідрокортизон х ОМЕМ, в-гліцерофосфат, дексаметазон, аскорбат і

ІЇ-діи, необов'язково з вітаміном 03; або "Умови культивування

Остеоцити/кістка для плюрипотенційних стовбурових клітин перераховані вище, з гліцерофосфатом дексаметазоном і аскорбатом, необов'язково з вітаміном 03. " Середовище Е Вільямса, І -діи, гідрокортизон і/або вітамін 02, аденін і лінолева кислота; або х ОМЕМ, На!тз5х Е12 як базальне середовище, І -діи . . гідрокортизон і/або

Клітини сосочків дерми : й я волосся вітамін р2, аденін і лінолева кислота; або "Умови культивування для плюрипотенційних стовбурових клітин перераховані вище гідрокортизон, вітамін 02 аденін і лінолева кислота

Продовження таблиці 1

Умови культивування які

Тип клітин-мішеней використовуються в комбінації з Додаткові умови культивування ретродиференціюючими засобами " ОМЕМ, піруват, аскорбат 2- фосфат, дексаметазон і пролін; або "Умови культивування ля плюрипотенційних

Хондроцити/хрящ д р нц стовбурових клітин перераховані вище аскорбат 2-фосфат дексаметазон і пролін х ОМЕМ, дексаметазон і

Адіпоцит/жирова клітина) індометацин; або "дексаметазон і індометацин х ОМЕМ, низька глюкоза необов'язково з гідрокортизоном "може бути з дексаметазоном гентаміцином як антибіотиком

І -глутаміном і піруватом натрію; " може бути з низькою або концентрацією сироватки х ОМЕМ, На!тз» Е12 або Е10 як 7" може бути в

Скелетні м'язи базальне середовище або ОМЕМ і | культуральних посудинах з середовище 199; або желатином " Умови культивування 7 може бути з підвищенням для плюрипотенційних температури до 397 стовбурових клітин "може включати перераховані вище з глюкозою, додавання 5-азацитидіну гентаміцином і низькою сироваткою

Кров'яні судини х ОМЕМ, МЕАА і 28-МЕ; або (ендотелій) х МОМ і дексаметазон х А: 1 ОМЕМ і середовище М199 або ОМЕМ (низька глюкоза)

Ї-дію, МЕАА; або ОМЕМ ж . .

Культуральні посудини покриті (низька глюкоза) з й желатином, для повного аскорбіновою кислотою . . . або ДМСО; або диференціювання і аутологічна

Серцевий м'яз/ х ' сироватка або плазма збіднена ат. Умови культивування кардіоміоцет й тромбоцитами для плюрипотенційних ж . . Повне диференціювання можна стовбурових клітин : . спостерігати на перераховані вище, з . пня предметному склі антигравітаційним культивуванням або в вібраційному оточуючому середовищі х ОМЕМ, Г-аїм, 28-МЕ ж може використовуватися щоб

МЕАА з безперервним 2. проводити аутологічні фактори розбавленням тим же : ший . росту і гормони необхідні для культуральним середовищем мінус диференціювання клітин на

Тропобласт ретродиференціюючий цію нд мезодерму і ектодерму засіб; або включаючи ембріональні " ЕРМІ 1640, 28-МЕ т. най . ТЕ . стовбурові клітини і клітини- піруват натрію і І -глутамін попередники

Характерно, що для умов культивування, описаних для кожного типу клітин в таблиці 1, видалення засобу ретродиференціювання послідовним розбавленням середовища культивування відповідним культуральним середовищем призводить до більш сильного трансдиференціювання. Під час культивування культуральне середовище, яке необов'язково містить різні промотори диференціювання, може бути розбавлене додаванням більшої кількості середовища, але без ретродиференціюючого засобу. Без зв'язку з теорією, розбавлення, здається, збільшує диференціювання, оскільки клітини стають менш щільними, а фактори, стимулюючі проліферацію, стають менш концентрованими. Таким чином, додавання середовища може далі підсилити трансдиференціювання і впливатиме на те, який тип клітин в межах клітин клітинної лінії отримують. Наприклад, якщо клітиною-мішенню є нейрон, додавання культурального середовища може призводити до зрушення в розвитку до більш зрілого нейрона, а не клітини-попередника нейрона (обидва належать до тієї ж самої клітинної лінії). Як інший приклад, прямого диференціювання клітини-попередники скелетного м'яза диференціюватимуться тільки послідовним розбавленням культурального середовища, яке досягають, поступово знижуючи концентрацію сироватки.

Передиференціювання клітини

Ретродиференційовані клітини можуть використовуватися, щоб отримати клітини-мішені перекомітуванням або передиференціюванням ретродиференційованих клітин в тип клітини- мішені. Це може бути виконано контактом ретродиференційованих клітин з факторами росту.

Наприклад, ретиноєва кислота використовувалася, щоб диференціювати стовбурові клітини в нейронні клітини. Метилцелюлозу з подальшим співкультивуванням із стромальною лінією кісткового мозку, і І--7 використовували, щоб диференціювати стовбурові клітини в попередники лімфоцитів (Мізйнапі еї аї., Іпї Іттипо 1994, 6: 909-916). Її е Раде (Мем 5сіепіїві ЮОес. 16, 2000) стверджує, що стовбурові клітини можуть бути диференційовані в епітеліальні клітини легені.

Візспоїї (Оєм Віої! 1986, 115: 129-39), описує, як диференціювати м'язові клітини-сателіти в зрілі м'язові волокна. Нервові клітини-попередники можуть розвиватися з основним фактором росту фібробласта і епідермальним фактором росту (МаКаїшКи апа МаКкатига, У Мешигозсі Кез 1995, 41: 153-168). Гематопоетичні стовбурові клітини можуть розвиватися, використовуючи ряд факторів росту, включаючи ЗМ-С5Е, еритропоетин, фактор стовбурових клітин і інтерлейкіни (ІІ -1, ІІ -3,

Зо І -6) - дивися Меїсаї! (Маїиге 1989, 339: 27-30) для огляду цих різних факторів.

Роїюспік єї аі., (ЕМВО у 1994, 13: 5274-83), навіть продемонстрував диференціювання стовбурових клітин в гематопоетичні клітини, використовуючи низькокисневі (5 95) умови.

Передиференційована клітина може належати до тієї ж самої клітинної лінії, що і комітована клітина, з якої була отримана ретродиференційована клітина. Альтернативно, передиференційована клітина може належати до іншої клітинної лінії, ніж комітована клітина, з якої була отримана ретродиференційована клітина. Наприклад, В лімфоцит може бути ретродиференційований в стовбурову клітину СО34-С2038 НІ А-ЮОВ:. Ця стовбурова клітина може бути потім передиференційованою або перекомітованою у напрямку клітинної лінії В клітини (та ж сама клітинна лінія) або лімфоїдної клітинної лінії (інша клітинна лінія).

Клітини-мішені

Клітини-мішені відповідно до винаходу є перепрограмованими клітинами, які можуть бути отримані ретродиференціюванням, трансдиференціюванням або передиференціюванням, як описано вище. Відповідно до винаходу, клітини-мішені можуть включати, але не обмежуватися вказаними, плюрипотенційні стовбурові клітини, лімфоїдні стовбурові клітини, мієлоїдні стовбурові клітини, нервові стовбурові клітини, клітини-сателіти скелетного м'яза, епітеліальні стовбурові клітини, ендодермальні і нейроектодермальні стовбурові клітини, зародкові клітини, екстраембріональні і ембріональні стовбурові клітини, мезенхімні стовбурові клітини, ниркові клітини, альвеолярні клітини епітелію, клітини ендодерми, нейрони, клітини ектодерми, острівцеві клітини, ацинарні клітини, овоцити, сперматозоїди, гематопоетичні клітини, гепатоцити, шкіра/кератиноцити, меланоцити, кістка/остеоцити, волосся/ клітини сосочків шкіри, хрящ/хондроцити, жирові клітини/адипоцити, скелетні м'язові клітини, клітини ендотелію, серцевий м'яз/кардіоміоцити і тропобласти.

Як описано вище, комітовані клітини і/або ретродиференційовані клітини культивують за певних умов, щоб викликати ретродиференціювання і/або трансдиференціювання і/або передиференціювання і отримати клітини-мішені. Тривалість, протягом якої комітовані клітини іабо ретродиференційовані клітини культивують, не обмежується певним відрізком часу, а швидше констатацією, що клітини-мішені були продуковані.

Визначення продукування або зміни числа ретродиференційованих, трансдиференційованих або передиференційованих клітин-мішеней може бути виконане, бо контролюючи зміни у відносній кількості комітованих клітин, які знижуючи регулювали експресію маркерів, що асоціюються з клітинною лінією, або факторів транскрипції, і/або зміни відносного числа клітин, які мають маркери клітинної поверхні, які є характеристикою клітин-мішеней.

Альтернативно, або, крім того, може бути контрольоване зменшення числа клітин, які мають маркери клітинної поверхні, типові для комітованих клітин, а не клітин-мішеней. Наприклад, клітина-мішень може бути ембріональною стовбуровою клітиною, яка характеризується багатостадійно-специфічними маркерами, такими як РОШБЕ1 (ОСТ-4), ТЕВТ, КІ Е4, ТЕ, 5ОХ2, Мапод, або стадієспецифічними ембріональними маркерами З і 4 (З5ЕА-3 і 55ЕА-4), високомолекулярними глікопротетїнами ТКА-1-60 і ТКА-1-81 і лужною фосфатазою (Апагем/5 еї а|І., Нуагідота 1984, 3: 347-361; Каппаді єї аІ., ЕМВО У 1983, 2: 2355-2361; Еох вї аї., Оєм Віо! 1984, 103: 263-266; О7ауча єї а!., Сеї!! Оінег 1985, 16: 169-173). Вони також не експресують ЗЗЕА- 1, присутність якого є індикатором диференціювання. Інші маркери відомі для інших типів стовбурових клітин, таких як нестеїн (Мезівіп) для нейроепітеліальних стовбурових клітин (у

Меиговзсі 985, 5: 3310). Мезенхімні стовбурові клітини є позитивними для 5Н2, ЗНЗ, СО029, СО44,

Ср71, ср90, сб0106, Ср120а ії 20124, наприклад, і негативними для СО34, СО45 і СО14.

Плюріпотентними стовбуровими клітинами є клітини СО34:ОВ8 тат" (іншими корисними маркерами є СОЗ38: і СО36). Лімфоїдними стовбуровими клітинами є клітини ОК", СОЗ4» і тат (також СО38). Мієлоїдними стовбуровими клітинами є клітини СО34-, ОВУ, СО137, СО33, СО077 і тат».

Додаткові клітинні маркери для клітин-мішеней можуть бути виявлені мікроматричним аналізом. Аналіз може включати виділення РНК з клітин-мішеней, які були ретродиференційованими, і/або трансдиференційовани і/або передиференційованими, маркуючи ізольовану РНК фарбою, і гібридизуючи ізольовану РНК з мікроматрицею.

Мікроматриця може включати гени або олігонуклеотиди, які представляють цілий геном, або може включати гени або олігонуклеотиди, пов'язані з певним органом системи, системою тканин, хворобою, патологією тощо. Клітинні маркери можуть бути ідентифіковані тим, що гени/олігонуклеотиди демонструють високу сигнальну інтенсивність, і, тим самим, стимулююче регулюються або регулюються на пониження в клітинах-мішенях. Тоді ця інформація може бути застосованою для визначення клітин-мішеней, на основі присутності маркерів, або навіть груп або характерних ділянок маркерів, які були ідентифіковані мікроматричним аналізом.

Зо Підтвердження клітин-мішеней може також бути виконане, використовуючи ряд іп міго аналізів, таких як аналізи СЕС (див. також, приклади). Дуже примітивні гематопоетичні стовбурові клітини часто вимірюють, використовуючи аналіз ініціації клітин довготривалим розведенням (І ТС-ІС) (Еамез еї аї., ) Тіз5 Си Меїй 1991, 13: 55-62). І ТО-ІС підтримує гемопоез протягом 5-12 тижнів.

Для інших клітинних типів, таких як клітини центральної нервової системи, підшлункової залози, печінки, нирок, шкіри тощо, культивування клітин може продовжуватися до тих пір, допоки не з'являться клітини-мішені, як характеризується |імуногістохімією, проточною цитометрією, мікроматричним аналізом, або полімеразною ланцюговою реакцією із зворотною транскрипцією (КТ-РСК), які є методиками, відомими в технології. Це може також включати функціональні аналізи, наприклад, здійснюючи щеплення імунодефіцитному реципієнтові або виправляючи або підвищуючи якість основного клінічного стану, як тут описується.

Клітини-мішені можуть бути ідентифіковані мікроматричним аналізом або КТ-РСЕ, які демонструють набуття нових факторів транскрипції, специфічних до клітинних ліній, білків і сигналів в клітинах-мішенях. Наприклад, ретродиференційовані стовбурові клітини, перетворені на клітини-мішені ектодермальної клітинної лінії можуть експресувати гени, такі як Мезіїйп,

Стіріої, іє11, Ї/НХ1 і/або ЕМІ, і якщо далі диференціювати в нейрони, будуть експресувати нейрофіламенти (МЕ). З іншого боку, клітини, перетворені на клітини-мішені ендодермальної клітинної лінії, можуть експресувати гени, такі як 5ох7, 5ох17, Мода!Ї, РОХ1 і/або ГОХА?2; але клітини-мішені, далі диференційовані в панкреатичні острівцеві клітини, можуть експресувати гени, такі як інсулін (ІМ5) і пепигод3 (МОМ3). Окремо, перетворення на бажані клітини-мішені може супроводжуватися знижуючою регуляцією зрілих факторів транскрипції, пов'язаних з первинною початковою популяцією, яка піддалася перетворенню.

Крім того, визначення продукування клітин-мішеней може відбуватися шляхом розпізнавання певних структурних і/або морфологічних характеристик клітин-мішеней, наприклад, форми клітин, розміру тощо. Ці характеристики відомі в технології для клітин- мішеней відповідно до винаходу.

Як тільки відносні кількості бажаного клітинного типу збільшилися до відповідного рівня, який може, наприклад, бути таким же низьким, як 0,195 або таким же високим як 5 95, результатні змінені популяції клітин можуть використовуватися багатьма способами. Щодо бо кількостей утворених клітин-мішеней, наприклад, плюрипотенційних стовбурових клітин, і це важливо, щоб оцінити проліферативну здатність стовбурових клітин. Хоча за деяких обставин, кількість стовбурових клітин або інших утворених ретродиференційованих клітин, може виявитись низькою, вивчення показали, що тільки 50 плюрипотенційних гематопоетичних стовбурових клітин можуть відтворити всю гематопоетичну систему в мишачому донорові.

Таким чином, терапевтична корисність не вимагає утворення великої кількості клітин.

Перетворення комітованих клітин на ретродиференційовані, трансдиференційовані або передиференційовані клітини-мішені може також бути виконане іп мімо введенням засобу, змішаного з фармацевтичним носієм або розчинником, хворому. Проте, бажано у багатьох випадках, щоб ретродиференціювання, трансдиференціювання або передиференціювання виконували іп міїго/ех мімо (у пробірці, поза організмом).

Оброблені популяції клітин, отриманих іп мійго можуть використовуватися згодом з мінімальною обробкою. Наприклад, вони можуть бути просто комбіновані з фармацевтично прийнятним носієм або розчинником і введені хворому, який потребує стовбурових клітин.

Проте може бути бажаним збагатити популяцію клітин для ретродиференціювання, трансдиференціювання або передиференціювання клітин-мішеней або очистити клітини від популяції клітин. Зазвичай це може бути виконано, використовуючи ряд методів (див. Мацеве-

Радеу--Тпе Зсіепіївї 1999, 13). Наприклад, клітини можуть бути очищені на основі маркерів поверхні клітини, використовуючи хроматографію і/або проточну цитометрію. Проте, часто буває ні необхідним, ні бажаним екстенсивно очищати ретродиференційовані, трансдиференційовані або передиференційовані клітини-мішені від популяції клітин, оскільки інші клітини, присутні в популяції (наприклад, клітини строми) можуть підтримати життєздатність і функцію стовбурових клітин. Проточна цитометрія потоку є відомою, достовірною і ефективною методикою для характеристики клітин в межах змішаних популяцій, а також для сортування клітин. Таким чином, засоби очищення або виділення можуть включати проточну цитометрію. Проточна цитометрія функціонує на основі фізичних властивостей частинок в рідкій суспензії, які можна розрізнити при дослідженні пучком світла. Звичайно, такі частинки можуть бути клітинами. Фізичні властивості включають розмір і структуру клітин або, як стало дуже популярним останніми роками, маркери клітинної поверхні клітини, пов'язані моноклональними антитілами, зв'язаними з рлуоресцентними молекулами.

Зо Ктєївзед еї аї., (У НетайюШег! 1994, 3: 263-89) стверджує, що "внаслідок доступності моноклональних антитіл апі-5О34, багатопараметрична проточна цитометрія стала інструментом вибору для визначення гематопоетичних стовбурових клітин і клітин- попередників.» Кгеі55ед далі описує загальні методики для розбиття на підгрупи і дослідження проточною цитометрією клітин, які експресують СОЗ34. Далі, Когбіїпуд еї аїЇ.,, (Вопе Магтож

Тгаперіапі 1994, 13: 6649-54), описує очищення клітин СЮОЗ34" імуноадсорбцією, за якою слідує проточна цитометрія на основі експресії НГА-ОК. Як обговорено вище, СО34: є корисним маркером у поєднанні із стовбуровими клітинами/клітинами-попередниками. Методики проточної цитометрії для сортування стовбурових клітин на основі інших фізичних властивостей, також доступні. Наприклад, Мізб5ег еї аї., (Віооа СеїЇє 1980, 6:391-407) стверджують, що стовбурові клітини можуть бути ізольовані на основі їх розміру і ступеня структурованості. Сгодап еї аї., (Віоо4 Сеїїє 1980, 6: 625-44), також стверджують, що "життєздатні стовбурові клітини можуть бути відсортовані від простих гематопоетичних тканин з високою чистотою, яка піддається перевірці".

Так само як вибір для клітин на основі присутності маркера клітинної поверхні або іншої фізичної властивості (позитивний вибір), популяції клітин можуть бути збагачені, очищені, використовуючи негативні критерії. Наприклад, клітини, які мають маркери специфічних клітинних ліній, таких як СО4, СО8, С042 і СО3, можуть бути видалені з клітинної популяції проточною цитометрією або афінною хроматографією.

Дуже корисна методика для очищення клітин включає використання антитіл або інших афінних лігандів, пов'язаних з магнітними гранулами. Гранули культивують з популяцією клітин і клітини, які мають маркер клітинної поверхні, такий як СОЗ34, з яким зв'язується афінний ліганд, захоплюються. Пробірку із зразком, який містить клітини, поміщають в магнітний концентратор зразка, де гранули притягуються до периферії пробірки. Після однієї або більше стадій промивки, цільові клітини частково або в основному повністю очищають від інших клітин. Коли використовують негативний формат вибору, замість промитих клітин, пов'язаних з гранулами усуненням рідкої фази, зберігають рідку фазу, і, отже, клітини, пов'язані з гранулами, ефективно видаляються з клітинної популяції.

Ці методи очищення, засновані на афінних лігандах можуть використовуватися з будь-яким типом клітини, для якого відповідні маркери були охарактеризовані або можуть бути бо охарактеризовані. Ограпкома еї аї., (9 Спготаїйодг В Віотей Аррі 1996, 687: 449-52) описують мікроотримання гематопоетичних стовбурових клітин з суспензії кісткового мозку миші проточним фракціонуванням в полі тяжіння. ОграпКкома та інші далі коментують, що метод використовувався для дослідження стовбурових клітин кісткового мозку миші, тому що ці клітини більші, ніж інші клітини кісткового мозку і, отже, можливо відокремити їх від суміші.

Таким чином, фізичні параметри, відмінні від маркера клітинної поверхні, можуть використовуватися, щоб очистити/збагатити стовбурові клітини.

Популяції клітин, які включають перепрограмовані клітини-мішені, такі як ретродиференційовані, трансдиференційовані або передиференційовані клітини-мішені, і/або очищені перепрограмовані клітини-мішені, такі як ретродиференційовані, трансдиференційовані або передиференційовані клітини-мішені, отримані способами запропонованими даним винаходом, можуть бути збережені іп міго, використовуючи відомі методики. Як правило, зазвичай застосовують мінімальні ростові середовища, такі як Напк5, КЕРМІ 1640, ОМЕМ або

ІМОМ, доповнені сироваткою отриманою із ссавця, такою як ЕВ5, і необов'язково аутологічною плазмою, щоб забезпечити придатне ростове середовище для клітин. Стовбурові клітини можуть бути культивовані на фідерних поживних шарах, таких як шари клітин строми (див.

Оегуцдіпа єї аїЇ., Стій Вем Іттипоіоду 1993, 13: 115-150). Клітини строми, як вважають, секретують фактори, які підтримують клітини-попередники в недиференційованому стані.

Довготривалі культуральні системи для стовбурових клітин описані ЮОехіег еї аї., (У СеїЇ

РПузіої 1977, 91: 335) і Оеєехіег еї а!., (Асіа Наєетацої! 1979, 62: 299).

Наприклад, І еркомузКі еї аї., (Ттаперіапіайоп 1992, 53: 1011-93, стверджують, що людські гематопоетичні клітини СО34- можуть бути очищені, використовуючи технологію, засновану на використанні моноклональних антитіл, які ковалентно іммобілізують на поверхні полістиролу, і що клітини СОЗ34-, очищені цим способом, можуть бути підтримані з життєздатністю більшою, ніж 85 95. І еркомубКкі еї аЇ., (У Нетайїйег 1993, 2: 339-42) також описують, як ізолювати і культивувати клітини людини СОЗ34-. Див. також НауїоскК еї аї., (іптипотеїйвоаз 1994, 5: 217-25) для огляду різних способів.

Популяції клітин, які включають стовбурові клітини і очищені препарати, які включають стовбурові клітини, можуть бути заморожені/законсервовані заморожуванням для майбутнього використання. Відповідні методики заморожування клітин та їх подальшого розморожування відомі в технології.

У одному варіанті здійснення, ретродиференціювання, трансдиференціювання або передиференціювання відбувається з клітинами із або в зразках лейкоцитної плівки. Термін "лейкоцитна плівка" позначає шар білих клітин, який формується між шаром червоних клітин і плазмою, коли кров, яка не згорнулася, центрифугують або відстоюють.

Методи лікування

Перепрограмовані клітини-мішені запропоновані даним винаходом, такі як ретродиференційовані клітини-мішені, трансдиференційовані клітини-мішені і передиференційовані клітини-мішені можуть бути комбіновані з різними компонентами, щоб проводити композиції запропоновані винаходом. Композиції можуть бути комбіновані з одним або більше фармацевтично прийнятними носіями або розбавниками, щоб виробляти фармацевтичну композицію (яка може використовуватися для людини або у ветеринарії).

Придатні носії і розбавники включають, але не обмежуються ними, ізотонічні сольові розчини, наприклад, забуференні фосфатом сольові розчини. Композиція запропонована винаходом може бути введена прямою ін'єкцією. Композиція може бути виготовлена для парентерального, внутрішньом'язового, внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньоочного, перорального і трансдермального введення, або ін'єкцією в цереброспінальну рідину. Композиції, які включають клітини-мішені, можуть бути введені ін'єкцією або імплантацією.

Клітини можуть бути подані в суспензії або закладені в матриці носія, такій як природні і/або синтетичні матриці здатні до біологічного розкладу. Природні матриці включають, але не обмежуються ними, колагенові матриці. Синтетичні матриці здатні до біологічного розкладу включають, але не обмежуються ними, поліангідриди і полімолочну кислоту. Ці матриці можуть бути носієм для ніжних клітин в природних умовах.

Композиції можуть також включати ретродиференційовані, трансдиференційовані або передиференційовані клітини-мішені запропоновані даним винаходом і, щонайменше, один фармацевтично прийнятний інертний ексципієнт, носій або наповнювач.

Доставка може також бути регульованою, тобто такою, що доставляється протягом часу, який може тривати від декількох хвилин до декількох годин або днів. Доставка може бути системною (наприклад, внутрішньовенною ін'єкцією) або спрямованою до певного цільового місця. Клітини можуть бути введені в природних умовах, використовуючи ліпосомне (516) перенесення.

Клітини-мішені можуть бути введені в дозах від 1 х 105 до 1 х 107 клітин на кг. Наприклад, 70-кілограмововому хворому може бути введено 14 х 106 клітин СЮО34: для відновлення тканин.

Дозування можуть бути будь-якою комбінацією клітин- мішеней, перерахованих в цій заявці.

Методи запропоновані даним винаходом можуть використовуватися, щоб лікувати багато хвороб, станів або порушень. Такі стани включають, але не обмежуються такими як, розлад кісткового мозку, гематологічні стани, апластична анемія, бета-таласемія, діабет, хвороба мотонейрона, хвороба Паркінсона, пошкодження спинного мозку, м'язова дистрофія, ниркова хвороба, хвороба печінки, розсіяний склероз, застійна серцева недостатність, вірус гепатиту С, вірус імунодефіциту людини, травма голови, хвороба легенів, депресія, необструктивна азооспермія, андропауза, менопауза і безпліддя, омолоджування, виразка склеродерми, псоріаз, зморшки, цироз печінки, аутоїмунна хвороба, облисіння, ретиніт і кристалічна дистрофія/сліпота або будь-яке порушення, пов'язане з дегенерацією тканини. Апластична анемія є рідкісним, але фатальним порушенням кісткового мозку, відміченим панцитопенією і недостатністю клітин кісткового мозку (Уоипд еї аї., Віооа 2006, 108: 2509-2519). Порушення може бути викликане імунопатологічним захворюванням з активованими цитотоксичними Т клітинами типу !, які експресуть цитокін ТІ, особливо у-інтерферон, націлений на гематопоетичний компартмент стовбурових клітин, що приводить до розладу кісткового мозку і, отже, ангематопозу (Васіда|Ічро еї аїЇ.,, НетайоіІоду 2007, 23-28). Більшість хворих на апластичну анемію можна лікувати трансплантацією стовбурових клітин, отриманих з потомства одних батьків, які співпадають за НІГІА (Іосабзсіцій еї аї., НаептаїйоіІодіса. 2007; 92:11-18.), хоча, розширення цього підходу на старіших хворих або хворих, у яких сімейні донори відсутні, залишається під великим питанням. Не дивлячись на прийнятний відсоток виживання після трансплантації алогенних стовбурових клітин, які співпадають за НІ А, процедура має деякі потенційні ризики, обумовлені імунодепресивним режимом, який використовується, щоб запобігти хворобі трансплантат проти господаря (ЗМОН). Наприклад, велика доза циклофосфаміду з антитимоцитглобуліном (АТО) або без нього призводить до тривалого періоду імунодепресії і робить хворого сприйнятливим до умовно-патогенної інфекцій. Іншим потенційним ризиком є відмова трансплантата, яка може послідувати через тижні або місяці після трансплантації стовбурових клітин (Сойаїепег еї аї., Агсп Іпіегп Мей 1981, 141: 758-763; Запаегв еї аЇ., Зетіп Нетаїйю! 1991, 28: 244-249). Крім того, ризик відмови трансплантата збільшується з числом переливань крові, отриманих до трансплантації стовбурових клітин.

Таласемія є спадковою аутосомною рецесивною хворобою крові, відміченою зниженою швидкістю синтезу одного з ланцюгів глобіну, які складають гемоглобін. Таким чином, є недовироблення нормальних білків глобіну, яке часто викликане мутаціями в регуляторних генах, які призводять до утворення аномальних молекул гемоглобіну, викликаючи анемію. Різні типи таласемій включають альфа-таласемію, бета-таласемію і дельта-таласемію, які впливають на продукування альфа-глобіну, бета-глобіну і дельта-глобіну, відповідно. Лікування передбачає постійне переливання крові, хелатування заліза, видалення селезінки і алогенну гематопоетичну трансплантацію. Проте, постійне переливання крові недоступне для більшості хворих через відсутність донорів кісткового мозку, які співпадають за НГА, тоді як алогенна гематопоетична трансплантація пов'язана з багатьма можливими ускладненнями, такими як інфекції і хвороба трансплантат-проти-хозяїна.

Діабет є синдром, який призводить до ненормально високих рівнів цукру в крові (гіперглікемія). Діабет відноситься до групи хвороб, які призводять до високого рівня глюкози в крові, викликаного дефектами або в секреції інсуліну, або у дії інсуліну в організмі. Діабет зазвичай розділяють на два типи: діабет 1 типу, відмічений зменшеним продукуванням інсуліну, або діабет 2 типу, відмічений стійкістю до дії інсуліну. Обидва типи призводять до гіперглікемії, яка значною мірою викликає ознаки, зазвичай пов'язані з діабетом, наприклад, надмірне продукування сечі, подальша компенсуюча спрага і підвищене поглинання рідини, затьмарений зір, нез'ясовна втрата ваги, летаргія і зміни в енергетичному метаболізмі. Діабет, як вважають, є хронічною хворобою, яка не лікується. Варіанти лікування обмежуються ін'єкціями інсуліну, вправами, відповідною дієтою, або, для хворих діабетом 2 типу, деякими ліками, наприклад, лікарськими засобами, які підтримують секрецію інсуліну підшлунковою залозою, зменшують рівень глюкози, продукованої печінкою, збільшують чутливість клітин до інсуліну тощо.

Хвороби мотонейрона відносяться до групи неврологічних порушень, які впливають на мотонейрони. Такі хвороби включають аміотрофічний бічний склероз (АГ 5), головний бічний склероз (РІ 5) і прогресуючу м'язову атрофію (РМА). Для АЇ 5 характерна дегенерація як верхніх, так і нижніх мотонейронів, яка припиняє передачу сигналу м'язам і приводить до їх ослаблення і можливої атрофії. РІ 5 є рідкісною хворобою мотонейронів, яка впливає тільки на бо верхні мотонейрони, яка викликає труднощі з рівновагою, слабкість і ускладнену рухомість ніг,

спастичність і мовні проблеми. РМА є підтипом АЇ 5, яка впливає тільки на нижні мотонейрони, які можуть викликати м'язову атрофію, фасцикуляцію і слабкість. Лікування хвороб мотонейрона невідоме. Рілузол (гПи5оЇе), який, як вважають, знижує пошкодження мотонейронів, був схвалений як лікування для АГ 5, хоча він уповільнює розвиток АГ 5, а не лікує її. Для РІ 5, лікування направлене тільки на синдроми, наприклад, баклофен (Басіотеп) може зменшити спастичність або хінін, який може зменшити судоми.

Хвороба Паркінсона (РО) є нейродегенеративним порушенням, яке характеризується втратою нігростріатного шляху, що виникає внаслідок дегенерації допамінергічних нейронів в межах чорної речовини. Причина РО не відома, але пов'язана з прогресуючою смертю допамінергічних (тирозингідроксилаза (ТН) позитивна) мезенцефалічних нейронів, викликаючи моторні пошкодження. Отже, РО характеризується нерухомістю м'язів, тремтінням, брадикінезією і потенційною акінезією. Таким чином, на даний час не існує ніякого задовільного лікування хвороби Паркінсона або лікувань для профілактики або лікування хвороби Паркінсона або її симптомів. Симптоматичне лікування моторних пошкоджень, пов'язаних з хворобою, включає пероральне введення дигідроксифенілаланіну ((-СОРА), яке може привести до реального поліпшення моторної функції, але його ефект знижується у міру того, як дегенерація допамінергічних нейронів прогресує. Альтернативні стратегії включають трансплантацію нервової тканини, яка заснована на ідеї, що допамін, який поставляється з клітин, інтегрованих в смугасте тіло, може замістити втрачені нігростріатні клітини, і генну терапію, яка може використовуватися, щоб замінити допамін в смугастому тілі, на яке впливають, введенням ферментів, які відповідають за І -СОРА або синтезом допаміну, таким як введення потенційно нейропротекторних молекул, які можуть або перешкоджати вимиранню ТН-позитивних нейронів, або стимулювати регенерацію і функціональне відновлення в пошкодженій нігростріатній системі.

Травма спинного мозку характеризується пошкодженням спинного мозку і, зокрема, нервового волокна, що призводить до пошкодження частини або всіх м'язів або нервів нижче від місця пошкодження. Таке пошкодження може відбуватися внаслідок травми хребта, яка призводить до тріщини, зміщує, подрібнює або стискає один або більше хребців, або внаслідок нетравматичного пошкодження, яке викликане артритом, раком, запаленням або дегенерацією диска. Тоді як лікування після пошкодження спинного мозку можуть включати ліки, такі як метилпреднізолон, який є кортикостероїдом, який знижує пошкодження нервових клітин і зменшує запалення в травмованій області, або ліки, які регулюють біль і м'язову спастичність, так само як іммобілізацію хребта або хірургію, щоб видалити грижу міжхребцевого диска або будь-які об'єкти, які можуть ушкоджувати хребет, немає ніяких відомих засобів повністю відновити пошкодження спинного мозку.

М'язова дистрофія (МО) відноситься до ряду спадкових м'язових захворювань, які ослабляють скелетні м'язи. МО може характеризуватися прогресуючою слабкістю м'язів, дефектами в м'язових білках, апоптозом м'язових клітин і атрофією тканини. Є більш ніж 100 хвороб, які демонструють характеристики МО, хоча дев'ять хвороб, зокрема: хворобу Дюшена (Шиспеппе), хворобу Бекера (ВесКег), хворобу тазового поясу, плече-лопатково-лицьову міопатію, міотонічну дистрофію, окулофарингеальну дистрофію, периферійну дистрофію і хворобу Емері-Дрейфуса, класифікують як МО. Немає ніяких відомих способів лікування для

МО, ії при цьому немає ніяких спеціальних способів лікування. Фізична терапія може підтримувати м'язовий тонус, а хірургія може використовуватися, щоб поліпшити якість життя.

Далі, симптоми, такі як міотонія можуть лікуватися ліками, але немає ніяких довготривалих методів лікування.

Хвороба нирок відноситься до станів, при яких відбувається ушкодження нирок і зменшуються їх здатність функціонувати, включаючи видалення метаболітів і надмірної води з крові, стабілізацію електролітів, кров'яного тиску, кислотно-основного балансу, і зворотне всмоктування глюкози і амінокислот. Двома головними причинами хвороби нирок є діабет і високий тиск крові, хоча інші причини включають гломерулонефрит, вовчак, пороки розвитку і закупорки в нирці. Немає ніякого лікування для ниркової хвороби, і, таким чином, терапія зосереджена на тому, щоб уповільнювати прогресування хвороби і лікувати причини хвороби, такі як регулювання рівня глюкози в крові і високого тиску крові і дотримання дієти; лікувати ускладнення хвороби, наприклад, адресне затримання рідини, анемії, хвороби кістки; і заміна втраченої ниркової функції, наприклад, через діаліз або трансплантацію.

Розсіяний склероз (М5) є аутоїмунним станом, при якому імунна система впливає на центральну нервову систему, приводячи до демієлінізації. Мо впливає на здатність нервових клітин в мозку і спинному мозку зв'язуватися одні з одними, оскільки власна імунна система тіла 60 впливає і пошкоджує мієлін, який вистилає аксони нейрона. Коли мієлін втрачений, аксони більше не можуть ефективно проводити сигнали. Це може призводити до різних неврологічних симптомів, які зазвичай розвиваються у фізичну і пізнавальну нездатність. Немає ніякого відомого лікування М5; при лікуванні намагаються повернути функцію після нападу (раптовий початок або погіршення ознак М5), запобігти новому нападу, і непрацездатності. Наприклад, лікування кортикостероїдами можуть допомогти закінчити напад, тоді як лікування інтерфероном під час початкового роз'їдання, як було показано, зменшує ймовірність, що клінічний М5 розвиватиметься.

Вірус імунодефіциту людини (НІМ, ВІЛ) є лентивірусом, який може призвести до синдрому надбаного імунодефіциту (АІО5, СНІД), стану, в якому, імунна система починає слабшати. НІМ перш за все уражає життєвоважливі клітини в імунній системі людини, такі як хелперні Т- клітини, макрофаги і дендритні клітини. НІМ інфекція призводить до низьких рівнів Т-клітин СО4- прямим вірусним знищенням заражених клітин, підвищеною швидкістю апоптозу в заражених клітинах, або знищенням заражених Т-клітин СО4- цитотоксичними лімфоцитами СО8, які розпізнають заражені клітини. В даний час, немає ніякої вакцини або лікування НІМ (ВВІЧ) або

АІЮЗ (СНІД). Лікування НІМ (ВІЛ) інфекції полягає в дуже активній антиретровірусній терапії або

НААКТ (ПпПідпіІу асіїме апіїгеїгоміги5 ІШйегару). Сучасні варіанти НААКТ є комбінаціями (або "коктейлями"), які складаються з, щонайменше, трьох лікарських засобів з, щонайменше, двох типів антиретровірусних засобів. Як правило, ці класи є двома нуклеозидними аналогами інгібітору зворотної транскриптази (МАКТІ або МЕТІ, писіеозіде апаіодце гемегзе Ігапз5сгіріазе іппірйог) плюс або інгібітор протеази, або ненуклеозидний інгібітор зворотної транскриптази (ММАТІ).

Застійна серцева недостатність відноситься до стану, в якому серце не може накачувати достатньо крові в інші органи організму. Цей стан може бути зумовленим хворобою коронарної артерії, рубцевою тканиною на серці, яка утворилась в результаті інфаркту міокарду, високого тиску крові, хворобою серцевого клапана, серцевими дефектами і інфекцією серцевого клапана.

Програми лікування зазвичай складаються із спокою, відповідної дієти, зміною щоденної активності і лікарських засобів, таких як інгібітори ангіотензин-перетворюючого ферменту (АСЕ), бета-блокатори, дигіталіс, діуретики, вазоділататори. Проте, програма лікування повністю не усуватиме пошкодження або стан серця.

Зо Гепатит С це інфекційна хвороба печінки, спричинена вірусом гепатиту С. Гепатит С може розвиватися в рубцювання (фіброз) і розширене рубцювання (цироз). Цироз печінки може приводити до печінкової недостатності та інших ускладнень, таких як рак печінки. Сучасне лікування включає використання комбінації пегільованого альфа-інтерферону і противірусного лікарського засобу рибавірин. Коефіцієнти успіху можуть змінюватися від 50 до 80 95 залежно від вірусного генотипу.

Травма голови відноситься до пошкоджень голови, які, можливо, не спричиняють ушкодження мозку. Частими причинами травм голови є дорожні події, домашні і професійні інциденти, падіння і напади. Різні типи проблем можуть бути викликані травмами голови, включаючи тріщини черепа, рвані рани черепа, субдуральну гематому (кровотеча нижче твердої мозкової оболонки), епідуральну гематому (кровотеча між твердою мозковою оболонкою і черепом), контузію мозку (удар мозку), струс (тимчасова втрата функції унаслідок травми), кому або навіть смерть. Лікування травми голови змінюватиметься залежно від типу пошкодження. Якщо мозок пошкоджений, немає ніякого швидкого засобу відновити його, і часто пошкодження може бути незворотним для доступних засобів лікування.

Хвороба легень є широким терміном який охоплює хвороби дихальної системи, яка включає легені, плевральну порожнину, бронхіоли, трахею, верхні дихальні шляхи, нерви і дихальні м'язи. Приклади хвороб легень включають обструктивну хворобу легень, при якій бронхіоли стають звуженими; стримуючі або фіброзні хвороби легень, при яких легені втрачають податливість, що призводить до неповного розширення легень і до збільшеної жорсткості легені; інфекції дихальних шляхів, які можуть бути викликані простудою або пневмонією; дихальні пухлини, зокрема спричинені раком; хвороби плевральної порожнини; легеневі судинні хвороби, які впливають на легеневий кровообіг. Лікування хвороб легень змінюється залежно від типу хвороби, але може включати лікування, таке як кортикостероїди і антибіотики, кисень, механічна вентиляція, радіотерапія і хірургія.

Депресія є розладом психіки, який характеризується поганим настроєм, що супроводжується зниженим почуттям власної гідності і втратою інтересу або задоволення від зазвичай приємних дій. Біологічно, депресія супроводжується зміною активності в багатьох частинах мозку, включаючи зрощення ядер, які є групою малих ядер у верхньому стовбурі мозку, який є джерелом серотоніну; супракаезматичне ядро, яке керує біологічними ритмами, такими як цикл бо сну і активності; гіпоталамічно-гіпофізарно-надниркову вісь, яка є ланцюгом структур, які активуються під час реакції тіла на різні стресори; вентральну тегментальну область, яка, як вважають, відповідає за електричну схему "підкріплення умовного рефлексу" мозку; прилегле ядро, яке, як думають, відіграє роль в заохоченні, сміху, задоволенні, прихильності, і страху; і антеріальний поясний кортекс, який активується негативними подіями. Лікування депресії передбачає застосування антидепресантів, які збільшують кількість позаклітинного серотоніну в мозку, вправи і психотерапію. Проте, ефективність цього лікування продовжує викликати сумніви.

Необструктивна азооспермія є захворюванням чоловіків, при якому в їх еякуляті немає якого-небудь значущого рівня сперми, обумовленого сперматогенезом. Це захворювання часто викликається гормональною нестійкістю і може лікуватися, використовуючи ліки, які відновлюють колишній стан.

Андропауза є станом, подібним до менопаузи, який переживають чоловіки середніх років, і який полягає у зниженні продукування гормонів тестостерону і дегідроепіандростерону.

Лікування включає гормональну терапію заміни і вправи.

Склеродерма є хронічним аутоїмунним захворюванням, яке впливає на сполучну тканину.

Затвердіння шкіри є одним з видимих проявів хвороби, хоча вона може впливати на сполучну тканину по всьому організму. Не існує ніякого відомого прямого лікування склеродерми.

Псоріаз є хронічним аутоїмунним захворюванням, яке викликає появу червоних, вкритих лусочками ділянок на шкірі. Причина псоріазу пов'язана з надмірним ростом клітин шкіри. Одна гіпотеза припускає, що причина пов'язана з Т-клітинами, які мігрують до шкіри і викликають виділення цитокінів, які викликають швидке продукування клітин шкіри. Лікування псоріазу передбачає застосування лікарських засобів, які діють на Т-клітини.

Ретиніт є типом прогресуючої дистрофії ретиналі, при якій фоторецептори або ретинальний пігмент епітелію є аномальним і призводить до втрати зору. Методи лікування ретиніту обмежені.

Стани, описані тут, можна лікувати певним типом, або комбінацією типів клітин-мішеней. У кращих варіантах здійснення стан, описаний тут, можна лікувати інфузією типів клітин, виділених в таблиці 2.

Таблиця 2

Режими лікування різних станів з використанням перепрограмованих, тобто, ретродиференційованих або трансдиференційованих або передиференційованих, клітин-мішеней ен 10000 одноотиуобоюмоінацеюу

Стан па (одного типу або комбінацією) стовбурові клітини і/або острівцеві клітини

Хвороба мотонейрона . нар . і їй клітини епітелію, клітини ектодерми і/або нейрони

М'язова дистрофія М й й в: стовбурові клітини і/або клітини скелетних м'язів

Нирновахвороба плоди створовіклиня

Ниркова хвороба у. м плюрипотенційні стовбурові клітини

Розсіяний склероз о, й в стовбурові клітини і/або нейрони

Кардіоміоцити, мезенхімні стовбурові клітини,

Застійна серцева недостатність плюрипотенційні стовбурові клітини і/або клітини ендотелію

Гематопоетичні клітини, плюрипотенційні стовбурові

Вірус гепатиту С клітини, мезенхімні стовбурові клітини і/або гепатоцити печінки

Коо)

Продовження таблиці 2

Режими лікування різних станів з використанням перепрограмованих, тобто, ретродиференційованих або трансдиференційованих або передиференційованих, клітин-мішеней ен одною обома

Стан о. (одного типу або комбінацією)

Плюрипотенційні стовбурові клітини, мезенхімні

Хвороба легенів стовбурові клітини, альвеолярні клітини епітелію і/або клітини ендотелію андропауза зародкові клітини і/або сперматозоїди плюрипотенційні зародкові клітини

Плюрипотенційні зародкові клітини, плюрипотенційні стовбурові клітини, клітини сосочків шкіри, нейрони,

Омолоджування сперматозоїди, остеоцити, хондроцити, кардіоміоцити, клітини скелетних м'язів, нейрони, клітини ендотелію і/або меланоцити

Вирамисклеродерми ератиноцитийабо мезонхімні стовеуроі клини

Виразки склеродерми й ня 2. кератиноцити і/або мезенхімні стовбурові клітини і/або плюрипотенційні стовбурові клітини плюрипотенційні стовбурові клітини

Гепатоцити печінки, мезенхімні стовбурові клітини,

Цироз печінки клітини ендодерми і/або плюрипотенційні стовбурові клітини

Аутоїмунна хвороба м. стовбурові клітини й Я Нейрони і/або плюрипотенційні стовбурові клітини дистрофія/сліпота

Наприклад, хворого можна лікувати від стану, описаного вище, застосовуючи наступні стадії: 1) фістулу-канюлю вставляють в руку хворого; 2) урожай білих клітин крові збирають шляхом аферезису, використовуючи автоматизовану систему, таку як спектральний пристрій СОВЕФ (Сатьго РСТ); 3) аутологічні ретродиференційовані стовбурові клітини отримують з білих клітин крові хворого; 4) аутологічні ретродиференційовані стовбурові клітини промивають і потім вводять внутрішньовенно хворому; 5) контроль прогресу стану хворого включає узяття аналізів крові і оцінку травмованих областей.

Винахід буде далі описаний за допомогою наступних необмежуючих прикладів, які додатково пояснюють винахід і не призначені, і не повинні бути інтерпретовані, як такі, що обмежують обсяг винаходу.

Приклади

Приклад 1

Матеріали і методи

Це клінічне вивчення дозволило оцінити безпеку введення одиничної дози аутологічних перепрограмованих З год. клітин з подальшою дією гематопоетичного індуктивного культурального середовища для чотирьох хворих на апластичну анемію.

Це клінічне вивчення було схвалене етичним комітетом Меморіальної лікарні короля

Едварда (Кіпд Едулага Метогіаї (КЕМ) НозрйаіІ) і було виконано в співпраці з Інститутом імуногематології (Іпбішцішіе ої ІттипоПетаїйоіоду (ІПН)). Хворі були зобов'язані виконувати критерії, викладені в таблиці 3.

В результаті четверо хворих з важкою (3 чоловіки) і гіпопластичною (1 жінка) анемією прийняли участь в дослідженні. Ці 4 хворих були відібрані і спостерігалися персоналом ПН/КЕМ.

Клінічна і лікувальна історія описані в таблиці 4, тоді як застосовані для них дозування інфузії клітин СЮОЗ4- показані в таблиці 5.

Таблиця З

Критерії інфузії ще 1 - Абсолютна кількість нейтрофілів «0,5х105/|.

Кожен критерій ----- я 5 й М 2 - Кількість тромбоцитів «20х109/. потрібний ся 5

З - Анемії з виправленим ретикулоцитом «1 Фо 4 - Насиченість клітинами кісткового мозку «25 Фо й ш - иченість клітинами кісткового мозк о з менше, ніж о 5 - Насиченіс а сткового мозку «50 95 з менше 30

Тільки один з критеріїв й дя гематопоетичних клітин потрібний : я - 2 26-45 - - - б - Суб'єкт оцінювався протягом перших З місяців після діагнозу 7 - Суб'єкт не отримував попередню імуносупресивну терапію

Хворим переливали 2 одиниці опромінених упакованих червоних клітин крові і 4 одиниці тромбоцитів, щоб підтримати рівень гемоглобіну вище 8 г/дл і кількість тромбоцитів вище 50000.

Хворий був підданий аферезу шляхом переробки 2-3 рази повного об'єму крові, використовуючи пристрій Собе 5ресіга для аферезу і набору для відділення білих клітин крові (обидва від Сатрго ВСТ). Аферез включав шийне і апіісирейаі венозне зондування однопросвітним катетером для венозної катетеризації.

Аліквоту клітин збирали асептично для аналізу на СО34, за яким слідує збір 150-200 мл світлого шару кров'яного згустку. Після того, світлий шар кров'яного згустку був підданий перепрограмуванню за умов гематопоетичного індуктивного культивування. Коротко, методика перепрограмування включала додавання 1000 мкг очищених СКЗ/43 (конкретно отриманих

БакоСуютаїіоп для Тгібіет Согр.), розбавлених 30 мл середовища, ІМОМ, асептично в мішок з білими клітинами крові. Мішок потім культивували в стерильному термостаті культури тканини, який витримували при 37 С і 595 СО» протягом трьох годин. Після завершення процесу перепрограмування, перетворені клітини були аналізовані щодо вмісту клітин СО34». Потім, клітини двічі промивали сольовим розчином, використовуючи клітинний процесор соре 2991.

Після перемішування і повторного суспендування в сольовому розчині, суспензію клітин вводили хворому через шийну вену під дією сили тяжіння, використовуючи набір для інфузії.

Основні показники стану організму, включаючи клінічний аналіз крові хворих, безперервно контролювали до і після інфузії аутологічних перепрограмованих клітин.

Таблиця 4

Клінічна і лікувальна історія хворих на апластичну анемію до інфузії аутологічних перепрограмованих клітин людини (НК5С)

Хворий Клінічна історія до інфузії НКЗС Лікування до інфузії КЗС х«Діагностований з ТАА в 2002 "симптоми: скарги на слабкість і задишк . я дишку 2. - |Отримував пробний часті випадки ректальної і ясенної . . . . щи стероїд (Табменабол)

Хворий А, чоловік, 25 років, кровотечі і блювоти й : їй . . г. анаболізму протягом 8 важка апластична анемія (ТАА)) "отримував 4 і 2 одиниці крові і 2. о, . місяців без якого-небудь тромбоцитів, відповідно, кожного - : значного поліпшення місяця «вигляд жовтяничний з важкою очною гіперемією

Продовження таблиці 4

Хворий Клінічна історія до інфузії НКАЗС Лікування до інфузії КЗС хДіагностована з гіпопластичною анемією в січні 2004 ж . : й й Отримувала симптоми: поліменорагія тривалістю . - . Ви кровостимулюючий

Хвора В, жінка, 26 років, 6 місяців й о, - й жк . ш препарат від З місяців до гіпопластична анемія тільки до інфузії НК5С хвора й ві . / інфузії НЕЗС без якої- отримувала 4 і 6 одиниць Ви й -: | небудь реакції пакетованих червоних клітин крові і тромбоцитів, відповідно «Діагностований з дуже важкою апластичною анемією в 2003 «симптоми: анемія, слабкість, задишка при напрузі "жар і холод, лихоманка, яка триває : - . Отримував 10-15 днів унаслідок важкої й . ві циклоспоринову терапію . . . нейтропенії 7. .

Хворий С, чоловік, 19 років, жк . й ш протягом 6 місяців, які "множинні випадки інфекції, блювоти : й дуже важка апластична анемія |. закінчилися в березні і появи пурпурних плям жд М 2003, без якого-небудь сідничний абсцес ефекту «двічі непритомнів унаслідок мозкової кровотечі "отримував 5 і 2 одиниці крові і тромбоцитів, відповідно, кожні 2 тижні «анемія, слабкість, задишка "жар і холод, лихоманка, унаслідок важкої нейтропенії і множинні Отримував циклоспорин і

Хворий 0, чоловік, 35 років, випадки інфекції і кровотечі антитуберкульозну дуже важка апластична анемія | "діагностований З роки назад терапію, немає реакції до "отримував 5 і 2 одиниці крові і 6 місяців імуносупресії тромбоцитів, відповідно, кожного місяця

Весь клінічний контроль був виконаний персоналом ПН/ХЕМ. Вимоги до переливання визначали до і після інфузії із звітів про переливання, отриманих після прийому будь-якої одиниці препарату крові. Одиниці переливання використовуються тільки після отримання згоди від хворих і безпосередніх близьких родичів як свідків. До переливання хворому всі препарати крові опромінювали в Меморіальній Лікарні Тата (Таїа Метогіа! Нозріїа|). Хворим також ставили питання щодо їх самопочуття до і після інфузії перепрограмованих клітин. Всі пацієнти отримали копію або первинні звіти про їх стан і всі лабораторні і клінічні наслідки. Тривалість спостереження цих хворих була спочатку встановлена як 2 роки, але була збільшена. Протягом першого місяця після інфузії хворих розмістили в лікарні в стерильних кімнатах з тиском вище атмосферного.

Таблиця 5

Хворий, дата інфузії, вага і зріст, зібрані одноядерні клітини і введені інфузією СОЗ34-/кг інфузії й сазаж/кг клітини

Один мільйон клітин був пофарбований згідно інструкціям виробника з наступними панелями моноклональних антитіл (все від бакоСуїоптайіоп):

Панель 1 складалася з ізотипних кон'югатів негативного контролю Ід1-РІТС, ІДа1-РЕ-Су5 і

Ідс1-АРЕ;

Панель 2 складалася з людських анти-СО45-РІТС і СО34-АРЕ-СУу5;

Панель З складалася з людських анти-СОЗ38-РІТС і СО34-АРЕ-СУу5;

Панель 4 складалася з СЮО61-РІТС і СО34-АРЕ-Су5;

Панель 5 складалася з СОЗ33/13 ЕРЕ і СО7-РІТС;

Панель 6 складалася з СО45 і СІусорпогіп-А-ВРЕ;

Панель 7 складалася з СОЗ3-РІТС і СО19-ВРЕ.

Аналіз клітин виконували із застосуванням системи ЕАСбЗСаїїриг (ВО бБіозсієпсе), використовуючи програмне забезпечення ВО сеї! Оцеві.

Для клонового мікроматричного аналізу одноядерні клітини (ММС) кісткового мозку хворого до і після інфузії перепрограмованих клітин були посіяні в середовище метокульт СЕН4А434, доповнене рекомбінантними факторами росту відповідно до інструкцій виробника (5іет СеїЇ

Теппіодіе5). Диференціювання в гематопоетичні колонії клітин було оцінене і пораховане в часі, використовуючи фазово-контрастну обернену мікроскопію.

Клінічний аналіз крові, ферменти печінки і варіанти гемоглобіну хворих безперервно контролювали до і після процедури. Після залишення лікарні хворими клінічний аналіз крові, ферменти печінки, варіанти гемоглобіну і каріотипування периферійної крові і з діапазон контролювала незалежна лабораторія для цілей перепідтверждення. Ці тести часто виконувалися після інфузії аутологічних перепрограмованих клітин.

Зразки периферійної крові і клітини кісткового мозку аналізувалися до і після інфузії аутологічних перепрограмованих клітин. Цей тест повторювали через шестимісячні інтервали протягом першого року і щорічно наступні 2 роки після початку терапії аутологічними перепрограмованими стовбуровими клітинами. Крім того, перепрограмовані клітини аналізували до інфузії, щоб вивчити стабільність клітин, аналіз був також виконаний після З-годинної стадії

Зо конверсії, так само як після культивування перетворених клітин протягом терміну завдовжки максимум 1 місяць. Каріотипування і с діапазон контролювала третя незалежна лабораторія.

Мазки кісткового мозку і перетин трепанації виконували до і після інфузії аутологічних перепрограмованих клітин. Цей тест виконували через 14-20 днів після інфузії аутологічних перепрограмованих клітин і потім щорічно.

Весь мазок і перетини трепанації сканували, використовуючи мікроскоп, пов'язаний з відеокамерою, до і після інфузії перепрограмованих стовбурових клітин, щоб оцінити і контролювати приживання трансплантата.

Результати

Всі хворі переносили аферез і єдину процедуру інфузії перепрограмованих стовбурових клітин без несприятливих явищ. Хворий А і хворий О стали незалежними від переливання після єдиної інфузії перепрограмованих гематопоетичних стовбурових клітин (ЕНЗС) (див. таблиці 6 і 7). Приживання тромбоцитів, нейтрофілів і червоних клітин крові послідувало після З і б днів у хворого А і хворого 0, відповідно. Включення ембріонального гемоглобіну відмічене у хворого А і хворого О (див. таблиці 4 і 5), але не у хворого В і хворого С (дані не показані). До інфузії ферменти печінки підвищилися у хворого А і хворого О, не дивлячись на відсутність вірусу гепатиту С (НСМ) (як встановлено імуноферментним твердофазним аналізом (ЕГІЗА).

Ферменти печінки починали нормалізуватися після інфузії КНЗС і досягали нормальних рівнів через 4 роки після інфузії КНЗС. Хворий В і хворий С померли через 2 роки і шість місяців після інфузії, відповідно. Включення ембріонального НЬ відмічене у хворих 001 і 004 (див. таблиці б і

7). Ці двоє хворих продемонстрували довготривале приживання трансплантата після єдиної інфузії аутологічного НЕ5С. Таб 7 4646

Таблиця 6

Хворий А: повний аналіз крові, варіант гемоглобіну і ферменти печінки хворого на важку пластичну анемію до і після інфузії аутологічних НКЗС

Найнижчий

Аналіз крові рівень до Ол З/го04. 05/26/2005. 03/07/2006 01/05/2008. інфузії після інфузії | після інфузії | після інфузії | після інфузії

МВС О/мклі

НВ г/длі) 726 17711771 11111719 11112 | 14

ВВС рОб/лмкл| 17717098 17777712 | 23 | 29 | 386

ВЕТІС (5 14111111

МСМ |флі 101,5 101,5 121,74 101,4

МеНІг/дл| 39,13

МОН (г/длі 32,14

Тромбоцити

Нейтрофіли 0,32 1,000 1,054 1184 1,994 103/мклі

ЕЗООУМмкл| 17777717 11111062 | 074 | 065

ВАБООЗмклі | 77777777 17777171 171111011171110 | 0054

ІММРНІОЗ/МкКлІ | 0000000 1,500 1,922 2,220 2,214

МОМО Пбз/мклІ | 0000000 0,500 0,062 0,222 0,324

НВА (г/длі 51111167 11192 | 2

НВА2 (г/дп| 11171103 1104 | 024 | 039

НВЕ (г/дл

ОТ (Ш/-

ЗаРТ (Ш/-

Примітки: МВС - білі клітини крові; НВ - гемоглобін; КВС :« червоні клітини крові; КЕТІС - ретикулоцити; МСМ - середнє гематокритне число; МСН - середній еритроцитарний гемоглобін; 8) МСНС « концентрація середнього еритроцитарного гемоглобіну; ЕБО - еозинофіли; ВАБО - базофіли; ГУМРН - лімфоцити; МОМО - моноцити; НВА - гемоглобін А;

НВАЗ2 :- гемоглобін А2; НВЕ - гемоглобін Е (фетальний гемоглобін); ЗСОТ |О/Л| - глутаматоксалоацетаттрансаміназа сироватки (верхній/нижній); 19) БОРТ (О/Л.| - глутаматпіруваттрансаміназа сироватки (верхній/нижній)

Таблиця 7

УУВС (105/мклі

НВ г/дл) ввсСрОмкл| | 77777 177173,6 | 24 2 | 32 | 345

ВЕТІС (5 11111124 | 134 | 77777111

МСМ |флі 7777юЮ7/ЮК1 903 | 08,33 110,3

МОН (г/длі 77771711 309 | 32 | 359 | 378

МменсСі/длІ | | 342 | 29,62

Тромбоцити

Нейтрофіли

Продовження таблиці 7

ЕБОПОУМкл! | 77777777 1771710990 | 022 | 054 | 064 2 щ

ВАБОПОУМКЛІ 7777777 17117010 1 0 11 0

ШУМРНООУмклІ! 77777171 201 1711167 | 759 | 7882 моМмо поумклі 77777771 177108 | 044 | 054 | 02 9 нвАІ(/длІ! 17777771 17711706 | 73 | 71093 | 121 нвА2і/длі 77777777 17100339. | 09 | 028 | щ 036 2 щ нвЕТдл| 17 01 | бе | 038 | 09 | 042 заотІч 1160 | 46 2 | 46 | 69 | 34

БаРТтІІ 1150 | 57 | 32 | 60 | 4

НВАЗ2 :- гемоглобін А2; НВЕ - гемоглобін Е (фетальний гемоглобін); ЗСОТ |О/Л| - глутаматоксалоацетаттрансаміназа сироватки (верхній/нижній); 19) БОРТ ІО/Ц| - глутаматпіруваттрансаміназа сироватки (верхній/нижній)

Проточна цитометрія аферезованних одноядерних клітин до і З години після початку гематопоетичного перепрограмування показані на Фіг. 1. Число позитивних клітин СОЗ4, які генеруються після гематопоетичного перепрограмування внесено до списку в таблиці 4.

Представлена проточна цитометрія аферезованних оодноядерних клітин до і після гематопоетичного перепрограмування показує значне збільшення числа позитивних клітин

СОЗ34 з і без експресії СО45, СО38 і СО7 (Фіг. 1). При інфузії клітини СО34 циркулювали в периферійній крові протягом 3-6 днів і потім диференціювалися на життєздатному рівні в мієлоцити, як показує значне збільшення клітин, які експресують СО33813 з і без СО7, що мають високе переднє і бічне розсіювання (див. Фіг.2). Ця модель перепрограмування спостерігалася у всіх хворих.

Навряд чи будь-які колонії формувалися з аспірату кісткового мозку хворого до інфузії аутологічних НАКЗС з подальшим посівом в метилцелюлозну клітинну культуру (див. Фіг. З).

Клоновий мікроматричний аналіз тільки у хворого В, який страждав на гіпопластичну анемію, показав пригнічений гемопоез. Проте, протягом 14-20 днів після інфузії всі аспірати кісткового мозку, отримані від хворих, давали початок нормальному рівню багатьох гематопоетичних колоній з помірним ростом числа вибухоутворюючих одиниць-еритроїдів (ВРО-егуїйгоїд). Мазок кісткового мозку і перетин трепанації (див. Фіг. 3) через 14-20 днів після інфузії аутологічних

НАС показали значне збільшення числа мієлоцитів на різних стадіях диференціювання із зрілими і незрілими мегакаріоцитами у всіх хворих при порівнянні з початковим показником.

Гіперплазія еритроїдів на різних стадіях диференціювання також відмічена у всіх зразках.

Відсутні зміни в каріотипуванні і характері б діапазону в периферійній крові або зразках кісткового мозку, отриманих до і після інфузії (у хворого А і хворого О протягом більше, ніж 4 роки) аутологічних НЕЗС у всіх хворих (див. Фіг. 4).

Після інфузії аутологічних НК5С хворим на апластичну анемію примітивні (СОЗ8 негативні) і комітовані (СОЗ38 позитивні) клітини СО34 циркулювали по периферійному кровообігу протягом трьох днів до перепрограмування в мієлоцити (Фіг. 2). Приживання мієлоїдного трансплантата послідувало протягом З днів після інфузії НК5С хворому А, хворому В і хворому 0. З іншого

Зо боку, приживання мієлоїдного трансплантата послідувало на 20 день для хворого 003 при аналізі проточною цитометрією. Єдина інфузія НАКЗС, без використання будь-якого режиму попереднього кондиціонування, приводить до довготривалого приживання трансплантата у 2 з 4 хворих на апластичну анемію. Хворий А і хворий В продемонстрували довготривале приживання трансплантата без якого-небудь переливання після інфузії НК5С. Приживання трансплантата нейтрофілів, червоних клітин крові і тромбоцитів у такого хворого супроводжувалося включенням або збільшенням рівня гемоглобіну Е (таблиці 6 і 7). Це не було відмічено у інших 2 хворих, які померли. Включення НВЕ цим обом хворим підтверджує здатності до перепрограмування інфундованих НК5С в ювенільний фенотип НЬ ії, отже, приживання трансплантата і відновлення, як спостерігалося з трансплантатом стовбурових клітин пуповинної крові (ЕІйавіа еї аї., ГеиКетіа 2000, 14; 931-934; І осаїеїїї еї аІ., Вопе Матом

Ткапзрапі 1996, 18: 1095-101).

Довготривале приживання трансплантата із збереженням числа хромосом і зв'язуванням відображає ясно безпеку інфузії НК5С в гематопоетичному стані, де клональна еволюція не є окремим випадком в звичайній терапії.

Важливо, що аутологічні НК5С здатні до довготривалого приживання трансплантата, а коефіцієнт виживання в підгрупі важких хворих на апластичну анемію без використання якого- небудь режиму, який пригнічує імунітет, подібний до коефіцієнтів, відмічених для сингенних стовбурових клітин.

Таким чином, через чотирнадцять днів після інфузії, аналіз кісткового мозку інфундованих хворих показав збільшення насиченості клітинами кісткового мозку, і мієлоїдною, еритроїдною і мегакаріоцитною клітинними лініями на різних стадіях диференціювання з пониженням жирових і стромальних клітин, які є переважаючими жителями кісткового мозку хворих на важку апластичну анемію. Було значне збільшення маси червоних клітин крові в кістковому мозку з відповідним збільшенням рівня гемоглобіну, а також кількості ретикулоцитів. Було також стале збільшення фетального гемоглобіну - важливої сполуки в поліпшенні серповидно-клітинної анемії і бета-таласемії - і червоних клітин крові, які експресують фетальний гемоглобін, після інфузії. Крім того, було значне поліпшення показників червоних клітин крові, як визначено розміром червоних клітин крові, вмістом гемоглобіну і концентрацією. Перепрограмовані клітини показали нормальний каріотип і генетичну стабільність після інфузії. Нарешті, те, що приживання трансплантата і довготривале вторинне заселення спостерігалось у З хворих, які страждали на апластичну анемію.

Приклад 2

Матеріали і методи

Аутологічні перепрограмовані гематопоетичні клітини (клітини-мішені) тестували для 21 хворого на бета-таласемію. У дев'ятнадцяти хворих була основна бета-таласемія і у 2 була проміжна таласемія. Один з хворих з проміжною бета-таласемією мав варіант таласемії/НЬЕ (звичайної для хворих далекосхідного та індійського походження), а інший мав таласемію/серповидно-клітинну анемію.

Хворі були аферезовані 2-3 разовою переробкою їх повного об'єму крові. Аутологічні перепрограмовані клітини генерували шляхом перепрограмування білих клітин крові, до тих пір, поки клітини - мішені не були отримані, як указують їх різні характеристики, як описано вище.

Хворим вводили аутологічні перепрограмовані клітини шляхом внутрішньовенної інфузії в шийну вену або вени руки або стегна.

Результати

Ніяких токсичних або несприятливих побічних ефектів не спостерігалися після інфузії перепрограмованих клітин у хворих на бета-таласемію, як показав моніторинг основних показників стану організму, ехокардіограми, щільності кістки, ферментів печінки і нирок, включаючи каріотипування і з діапазон, при порівнянні з початковими показниками. Було зафіксовано статистично значиме середнє зниження (50 95) вимоги переливання крові у хворих на головну бета-таласемію зразу, майже 9 місяців після інфузії перепрограмованих клітин, при порівнянні з початковими показниками. Два хворих на таласемією, яка є проміжною бета- таласемією (у одного була таласемія/НЬЕ, а у іншого таласемія/серповидно-клітинна анемія) були незалежними від переливання вже через майже 9 місяців після інфузії перепрограмованих клітин.

Середня вага і висота після інфузії перепрограмованих клітин були значно більшими, в порівнянні з початковим матеріалом, і розмір органу у хворих на таласемію із збільшеною селезінкою і/або печінкою був нормалізований. Абсолютна середня концентрація ембріонального гемоглобіну значно збільшилася у хворих на головну і проміжну таласемію після інфузії перепрограмованих клітин, якщо порівнювати з початковими показниками (Фіг. 5).

Крім того, середні показники червоних клітин крові, як відображається поліпшенням вмісту гемоглобіну розміру червоних клітин крові (Фіг. б), і концентрація (Фіг. 7) була також значно покращена у порівнянні з початковими показниками

Нарешті, середній феритин сироватки (біомаркер для надлишку заліза) значно зменшувався у хворих на таласемію після інфузії перепрограмованих клітин (Фіг. 8). Надлишок заліза є бо головною причиною смертності і захворюваності у хворих на таласемію; серповидно-клітинну

Зо анемію; і будь-яке порушення, спричинене надлишком заліза при переливанні.

Приклад З

Матеріали і методи

Двоє хворих на діабет були аферезовані 2-3 разовою переробкою їх повного об'єму крові.

Аутологічні перепрограмовані мезенхімні стовбурові клітини, плюрипотенційні стовбурові клітини і острівцеві клітини (клітини-мішені) були отримані шляхом перепрограмування аферезованних білих клітин крові, до тих пір, поки клітини-мішені не розвинулися, як показано їх різними характеристиками як описано вище. Хворим вводили аутологічні перепрограмовані клітини шляхом внутрішньовенної інфузії в шийну вену або вени руки або стегна.

Результати

Після інфузії аутологічних перепрограмованих клітин хворі синтезували нормальний рівень інсуліну стимульованого с-пептидом, який визначали натщесерце і під час їжі протягом 90 хвилин. Цей нормальний рівень с-пептиду підтримується до З місяців після інфузії перепрограмованих клітин (Фіг. 9). Крім того, рівні НБАТС, які указують на глікемічний контроль, нормалізувалися після інфузії перепрограмованих клітин (Фіг. 10). Наприклад, хворі з НЬАТС вище 10 95 до інфузії мають зараз НБАТС 5,8 95 після отримання перепрограмованих клітин.

Крім того, рівні глюкози крові цих хворих, як виявилось, досягають нормальних рівнів після інфузії, при порівнянні з початковими показниками. Крім того, значне зниження прийому/н'єкції інсуліну діабетичним пацієнтом було відмічено після інфузії перепрограмованих клітин.

Приклад 4

Матеріали і методи

Четверо хворих на аміотрофічний бічний склероз (АЇ5) отримували аутологічні перепрограмовані клітини. Діагноз цієї хвороби не має певного біомаркера. Цю хворобу діагностують клінічним виключенням інших подібних порушень.

Хворі були аферезовані 2-3 разовою переробкою їх повного об'єму крові. Аутологічні перепрограмовані плюрипотенційні стовбурові клітини, епітеліальні клітини легеневої альвеоли і нейрони (клітини-мішені) отримували шляхом перепрограмування аферезованних білих клітин крові, до тих пір, поки клітини-мішені не були отримані, як указують їх різні характеристики, як описано вище. Хворим вводили аутологічні перепрограмовані клітини шляхом внутрішньовенної

Зо інфузії в шийну вену або вени руки або стегна.

Результати

У хворих, які страждали на АЇ 5 і піддавались лікуванню аутологічними перепрограмованими клітинами, було значне поліпшення за даними Легеневого функціонального тесту (РЕТ).

Пошкодження за даними цього тесту функції легені є однією з причин, які призводять до ранньої смертності. Більшість хворих відчували менші ускладнення рухомості кінцівок і шиї, і деякі повідомляли про поліпшення мови. Інші демонстрували поліпшення здатності ходити, а також піднімати голову.

Приклад 5

Матеріали і методи

Чотири пацієнти з хворобою Паркінсона були аферезовані 2-3 разовою переробкою їх повного об'єму крові. Аутологічні перепрограмовані плюрипотенційні стовбурові клітини і нейрони (клітини-мішені) отримували шляхом перепрограмування аферезованних білих клітин крові, до тих пір, поки клітини-мішені не розвинулися, як указують їх різні характеристики, як описано вище. Хворим вводили аутологічні перепрограмовані клітини шляхом внутрішньовенної інфузії в шийну вену або вени руки або стегна.

Результати

Хворі, для яких такий симптом хвороби, як тремтіння був яскраво вираженим, відчули значне зменшення тремтіння, і для них застосовувалися звичайні лікарські засоби, щоб лікувати це порушення. Перший хворий отримував 4 пігулки Зіпетеї (регулятор Допаміну Синемет) щодня, а після переливання 4 місяці тільки 1 пігулку на день.

Приклад 6

Матеріали і методи

Двоє хворих з пошкодженням спинного мозку були аферезовані 2-3 разовою переробкою їх повного об'єму крові. Аутологічні перепрограмовані плюрипотенційні стовбурові клітини і нейрони (клітини-мішені) отримували шляхом перепрограмування аферезованних білих клітин крові, до тих пір, поки клітини-мішені не розвинулися, як указують їх різні характеристики, як описано вище. Хворим вводили аутологічні перепрограмовані клітини шляхом внутрішньовенної інфузії в шийну вену або вени руки або стегна.

Результати бо Один пацієнт був втрачений для спостереження. Інший пацієнт був паралітиком з С5-С6 пошкодженням спинного мозку. Цей пацієнт не був здатний сидіти або перевертати тіло в ліжку.

Після лікування він був здатний сидіти прямо протягом дуже довгих проміжків часу і перевертати своє тіло в ліжку. Він також міг самостійно стояти після того, як його ставили біля стіни. Далі, він був здатний ворушити пальцем і повідомляти відчуття в своєму сечовому міхурі.

Аналіз МЕ (магнітне резонансне зображення) до і після інфузії перепрограмованих клітин показав слабке зниження розміру пошкодження після інфузії перепрограмованих клітин. Хворий почав активно піддаватися фізіотерапії і взагалі відчував себе набагато краще, ніж раніше.

Приклад 7

Матеріали і методи

Двох хворих на м'язову дистрофією (МО) лікували аутологічними перепрограмованими плюрипотенційними стовбуровими клітинами, мезенхімними стовбуровими клітинами і клітинами скелетних м'язів (клітини-мішені), отриманими шляхом перепрограмування аферезованних білих клітин крові, до тих пір, поки клітини-мішені не розвинулися, як указують їх різні характеристики, як описано вище.

Перший пацієнт був уражений МО м'язів плечового і тазового поясу, яка відноситься до класу МО, при якій м'язи найважче вражаються, зазвичай, м'язи стегна і плечей, а другий хворий був уражений немаліновою МО.

Хворі були аферезовані 2-3 разовою переробкою їх повного об'єму крові. Аутологічні перепрограмовані клітини отримували шляхом перепрограмування запропонованого винаходом. Хворим вводили аутологічні перепрограмовані клітини шляхом внутрішньовенної інфузії в шийну вену або вени руки або стегна.

Результати

М'язова атрофія, пов'язана з МО, може бути визначена, контролюючи рівень м'язового ферменту креатинфосфокінази (СРК). Цей фермент зменшується у відповідь на інфузію ретродиференційованих стовбурових клітин (Фіг. 11). Лактатдегідрогеназа, фермент, який підвищується під час відторгнення тканини, також зменшився (Фіг. 11). У хворих також спостерігалось зниження рівнів ферментів печінки, аланінамінотрансферази (АЇТ) і аспартатамінотрансферази (А5Т), які обидва пов'язані із запаленням і пошкодженням клітин печінки, а також скелетних м'язів.

Зо Крім того, хворі демонстрували поліпшення рухливості, як визначено із запису відеокамери до і після інфузії перепрограмованих клітин, і в тесті на легеневу функцію після інфузії перепрограмованих клітин, якщо порівнювати з початковими показниками.

Приклад 8

Матеріали і методи

Хворих на хворобу нирок лікували аутологічними перепрограмованими плюрипотенційними стовбуровими клітинами, мезенхімними стовбуровими клітинами і клітинами нирки (клітини- мішені), отриманими шляхом перепрограмування аферезованних білих клітин крові, поки клітини-мішені не розвинулися, як указують їх різні характеристики, як описано вище. Хворих піддавали аферезу 2-3 разовою переробкою їх повного об'єму крові. Аутологічні перепрограмовані клітини генерували шляхом перепрограмування відповідно до винаходу.

Результати

У хворих, які одержували інфузію аутологічних перепрограмованих клітин, спостерігали поліпшення рівнів маркерів в різних флюїдах, які указували на здоровішу ниркову функцію, таку як вихід сечі, креатинін сироватки і азот сечовини крові (ВОМ) або ОКЕА. Наприклад, 75-річний чоловік, хворий на діабет, продемонстрував більш кращу ниркову функцію через 24 місяці після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами (див. таблицю 8). Хворий продемонстрував збільшені рівні гемоглобіну, який є молекулою білка в червоних клітинах крові, які переносять кисень, і інсуліноподібного фактора росту 1 (ІСЕ-1), фактора росту. Хворий також продемонстрував зменшення сечовини, яка є органічною сполукою, креатиніну, який є продуктом деструкції креатинфосфату в м'язах, сечової кислоти, яка є органічною сполукою, що виділяється з сечею, і фосфору, який є мінералом, знайденим в кістках; висока кількість цих маркерів указує на недостатню ниркову функцію. Далі, хворий продемонстрував зменшення глікозильованого гемоглобіну (НБА1С), який є формою гемоглобіну і зазвичай використовується як індикатор концентрації глюкози плазми у людей, які страждають на діабет.

Так само 51-річний чоловік-діабетик демонстрував подібне поліпшення через 12 місяців після початку лікування (див. таблицю 8). Цей хворий демонстрував підвищені рівні гемоглобіну і знижені рівні креатиніну, НБА1С, і азоту сечовини крові (ВОМ), який є мірою кількості азоту в бо крові у формі сечовини.

Таблиця 8

Рівні маркерів функції нирок у двох чоловіків, хворих на діабет

Хворий на діабет, чоловік 75 років| Хворий на діабет, чоловік 51 рік

Початковий 24 місяці після Початковий 12 місяців після рівень інфузії рівень інфузії

Гемоглобін |г/длі 7787129 17712 1145 «

Сечовина |г/дл

Креатинін (мг/длі

Сечова кислота |мг/дл

Фосфор |мг/длі

ІЗЕ-1 (нг/длі 7144. | 61 1712 1 6

ІЗЕ-1 (нг/дл)

ВОМ (мг/длі

Примітки: НЬ АТС :« глікозильований гемоглобін; ІОЕ-1 « інсуліноподібний фактор росту 1;

ВИМ - азот сечовини крові

Аналізи від 12 хворих, які мають діабет ІЇ типу і які піддавалися лікуванню аутологічними перепрограмованими клітинами, виявив знижені рівні мікроальбуміну (Фіг. 13), які пов'язані з витоком Альбуміну в сечу і є індикатором хвороби нирок, а також дисфункції ендотелію судин і серцево-судинної хвороби. У цих 12 хворих також спостерігались знижені рівні НЬАТС (Фіг. 14).

Крім того, 45-річна жінка, хвора на аутоїмунний гломерулонефрит, демонструвала поліпшення функції нирок в межах 18 місяців після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами (див. таблицю 9).

Таблиця 9

Рівні маркерів функції нирок у жінки 45 років, хворої на аутоїмунний гломерулонефрит

Гемоглобін |г/длі 816

Креатинін І(мг/длі

ВОМ (мг/длі ништнинннининшЕнинишшш

Примітки: ВОМ - азот сечовини крові

Крім того, 59-річна жінка, хвора на термінальну стадію хронічної ниркової недостатності, демонструвала поліпшення рівня креатиніну, сечовини, рівня гемоглобіну і паратиреоїдного гормону (РТН) після лікування перепрограмованими клітинами (див. таблицю 10). Маркер ниркової функції вирівнюється у 45-річної жінки, яка страждала на аутоїмунну (аутоалергічну) хворобу. Хворій також зменшили кількість сеансів гемодіалізу, які вона відвідувала за місяць, від 12 до приблизно 8 сеансів.

Таблиця 10

Рівні маркерів функції нирок у жінки 59 років, хворої на кінцеву стадію хвороби нирок до і після терапії перепрограмованими клітинами

Марерфункцінирокі дотерапії: |... післятерапї. 3... ркер функц й оз/02/2009 04/29/2009 05/23/2009 08/05/2009 08/11/2009

Гемоглобін(/дл| | 98 | 92 | 115

ТІ. СЛМВС Іна мкл) 3800 6800 5100 нин" ПЛ

РІ-Т (на мкл) 361000 273000 завово Ї

НЬ АТС (бо 561111

АЗТ (ШЛ- 25 | 16 | 14 її (Щ(

А.Т О/. 749 | 7 ЇЇ 12 1 9 ЩЇї

Сечовина(мгідл| | (90 2 .БМц| 70 2 | ! (МБ | г2из

Продовження таблиці 10

С.Альбуміні/длі | (З | 34 | 93 | | З

Рт(сееунди)ї | 9312 | Б (7 Її мА 11112 11

Фосфорімг/дл| | 8 | 92 | 59 | /

Калійїммольдл| | 59 | | 52 | 69 | 41

Натрійіммоль/ддл| | 133. | (7/7 1136 її ви |з рою рового р

Імг/длі

РТНІпЛ/дЛІЇ ЇЇ 777717171171Ї771717171717171717171111117195,6. | -.юКИиИ// 17 ловеО

Примітка: ТІ С - загальна кількість лейкоцитів; М/ВС :- білі клітини крові; РІТ - тромбоцити;

НЬ А1С - глікозильований гемоглобін; А5Т - апартатамінотрансфераза; АТ - аланінамінотрансфераза; РТ - протромбіновий час; ІМК - міжнародне нормалізоване відношення (для коагуляції крові); РТН - паратиреоїдний гормон 46-річний хворий на хронічну ниркову недостатність унаслідок діабету також демонстрував поліпшення рівня креатиніну, сечовини і рівня гемоглобіну після лікування перепрограмованими клітинами (див. таблицю 11). Хворому також зменшили число сеансів гемодіалізу, які він відвідував за місяць, від 12 до приблизно 5 сеансів, і зменшили лікування епоетином альфа (ЕРВЕХУ), що вводиться підшкірно, від 4000 одиниць двічі на тиждень до 4000 одиниць один раз кожні два тижні.

Таблиця 11

Рівні маркерів функції нирок у жінки 46 років, хворої на хронічну ниркову недостатність до і після терапії перепрограмованими клітинами

АБІС Ї177771717171717911111171171111117184117111111132

Кальційїмг/длІ 77771 Ї77771711101Ї777717117199 1111111

Фосфорімгдл| С Ї777777171717611111111 11111115 111115 СС

Примітка: ТІ С - загальна кількість лейкоцитів; М/ВС - білі клітини крові; РР :- після їжі; РІ ТТ - тромбоцити; ЕВ5 - цукор крові натщесерце; А5Т - апартатамінотрансфераза; АЇТ - аланінамінотрансфераза; РТ - протромбіновий час; ІМК - міжнародне нормалізоване відношення (для коагуляції крові)

Приклад 9

Матеріали і методи

Хворих на розсіяний склероз лікували аутологічними перепрограмованими плюрипотенційними стовбуровими клітинами, мезенхімними стовбуровими клітинами і нейронами (клітини-мішені). Клітини-мішені отримували шляхом перепрограмування аферезованних білих клітин крові, поки клітини-мішені не розвинулися, як указують їх різні характеристики, як описано вище. Хворі були аферезовані 2-3 разовою переробкою їх повного об'єму крові. Аутологічні перепрограмовані клітини генерували шляхом перепрограмування запропонованого винаходом. Хворим вводили аутологічні перепрограмовані клітини шляхом внутрішньовенної інфузії в шийну вену або вени руки або стегна.

Результати

Хворі, яких лікували аутологічними перепрограмованими клітинами, демонстрували зниження ураження мозку і спинного мозку. Зниження ураження може відбуватися в межах трьох місяців від початку отримання лікування (Фіг. 15а-б). Зниження ушкодження тканини мозку відбувалося в межах шести місяців (Фіг. 1ба-б).

Хворі, яких лікували аутологічними перепрограмованими клітинами, також демонстрували усунення уражень спинного мозку (Фіг. 17а-Б). Далі, ці хворі демонстрували поліпшення оцінки непрацездатності відповідно до розширеної шкали оцінки стану інвалідності за Куртцке (ЕОЗ5), демонстрували ремісію і не брали участь в звичайній терапії до чотирьох років після отримання єдиної інфузії.

Приклад 10

Матеріали і методи

Жінку, хвору на НІМ, лікували аутологічними перепрограмованими гематопоетичними стовбуровими клітинами. Хвора була аферезована 2-3 разовою переробкою її повного об'єму крові. Клітини-мішені отримували шляхом перепрограмування аферезованних білих клітин крові, до тих пір, поки клітини-мішені не розвинулися, як указують їх різні характеристики, як описано вище. Хворій вводили аутологічні перепрограмовані клітини шляхом внутрішньовенної інфузії в шийну вену або вени руки або стегна.

Зо Результати

До лікування скринінг-тест на антитіла до НІМ-1 і НІМ-2 показав значення 3,68. Значення 1,0 або більше вважаються позитивними.

Через два місяці після початку лікування аутологічними перепрограмованими клітинами значення тесту на антитіла до НІМ-1 і НІМ-2 було 0,46, що вказує, що хвора не продемонструвала позитивного результату на НІМ-1 ї НІМ-2. Через шість місяців після початку лікування значення скринінг-тесту для НІМ-1 і НІМ-2 було 0,48, далі показуючи, що хвора не демонструвала позитивного результату на НІМ.

Приклад 11

Ефекти лікування аутологічними перепрограмованими клітинами продемонстровані на хворих, які страждають від інших станів і хвороб. Клітини-мішені, внесені тут до списку, були отримані шляхом перепрограмування аферезованних білих клітин крові, до тих пір, поки клітини-мішені не розвинулися, як указують їх різні характеристики, як описано вище.

Застійна серцева недостатність б1-річному чоловікові, хворому на застійну серцеву недостатність, ввели аутологічні перепрограмовані кардіоміоцити, плюрипотенційні стовбурові клітини, мезенхімні стовбурові клітини і клітини ендотелію.

Лікування призвело до поліпшення фракції викиду (ЕЕ); рівнів попередника натрійуретичного пептиду мозку (Рго ВМР), який є прогностичним фактором, пов'язаним з хворобою коронарної артерії; рівнів глюкози крові натщесерце; і рівнів НБАТС (див. таблицю 12). Крім того, серце, яке було раніше розширеним, повернулося до нормального розміру, як показано в таблиці 12 за зменшенням конечно-діастолічного внутрішнього розміру лівого шлуночка (ІМІБ/О), конечно- систолічного внутрішнього розміру лівого шлуночка (ГМІОБ/5), і конечно-діастолічної товщини внутрішньошлуночкової перегородки (ІМ50), визначених ехокардіограмою.

Таблиця 12

Маркери хвороби коронарної артерії у 61 річного хворого із застійною серцевою недостатністю до і після терапії перепрограмованими клітинами

ГМО (см) 65 | 63 | 59 | 69 | 65 | 57

ІМІС/5 (см) їУ5О |смі 13 | 13 | тї2 | 72 | 06 1 10

ІМРУМО (см) 07 1 06 | 06 | 08 | 06 | 10

Масовий індекс 283 251 209,5 167 151,5 лівого шлуночка

Ігм/мі 141,5 133,5 111,4 88,8 81

Рго ВМР (пг/мл) 2969 800 | 600 | 600 | 60 | 497

Цукор крові натщесерце (мг/длі 244 118 145 87 95

Но АІС (бе 92 | пі | па | 72 | 65 | 6

Примітка: ГМІО/О - конечно-діастолічний внутрішній розмір лівого шлуночка; І МІБ/5 - конечно-систолічний внутрішній розмір лівого шлуночка; ЕЕ - фракція викиду; ЇМ5О - конечно-діастолічна товщина внутрішньошлуночкової перегородки; І МРМ/О - конечно- діастолічна товщина задньої стінки лівого шлуночку; Рго ВМР - попередник натрійуретичного пептиду мозку; НЬ А1С - глікозильований гемоглобін

Гепатит С

Тринадцяти хворим з вірусом гепатиту С (НСМ) і бета-таласемією вводили інфузію аутологічних перепрограмованих гематопоетичних клітин, плюрипотенційних стовбурових клітин, мезенхімних стовбурових клітин і гепатоцитів. Ефекти лікування виявили пониження або виведення навантаження НСМ (див. таблицю 13), а також покращені маркери крові (див. таблицю 14), такі як ферменти печінки, білірубін, альбумін, протромбіновий час, і міжнародне нормалізоване співвідношення (для згортання крові). Зокрема, хворі відмічали нормалізацію ферментів печінки аланінамінотрансферази (АГТ) і аспартатамінотрансферази (А5Т), які пов'язані із запаленням і пошкодженням клітин печінки (Фіг. 18а-бр).

Таблиця 13

Вірусне навантаження у 12 хворих, інфікованих вірусом гепатиту С, які отримували лікування аутологічними перепрограмованими стовбуровими клітинами

Ідентифікаційний номер Початковий рівень вірусного З місяці після інфузії, вірусне хворого навантаження х 1000 навантаження х 1000 того 81118110 61116110 61112110 61110110 10287771 т.иїмільйонів///// | 7,7 мільйонів../7/7/:ЗО шиш нини: пиши 21101110 нншЕжнниннн пиши шишиии пили

Таблиця 14

Маркери крові у хворого з вірусом гепатиту С, який страждає на цироз печінки на початковому рівні та після терапії перепрограмованими клітинами

Гемоглобін (/длІ //////7777777711111111111111111111981111111Ї1111111111291

Білірубінзагальний|мгідл| ////77с17111111111169111111Ї11111111засСсСС (Сечовинаїм/идл! ///777777771111111111111111160111111111 11111136

Примітка: МВС - білі клітини крові; А.Т (О/Л) 5 аланінамінотрансфераза (верхній/нижній);

АТ (Ш/) - аспартатамінотрансфераза (верхній/нижній); ІМК - міжнародне нормалізоване співвідношення (для коагуляції крові); РТ - протромбіновий час

Наприклад, 44-річний чоловік, хворий на цироз печінки спричинений інфекцією вірусу гепатиту С, також продемонстрував позитивну динаміку ферментів печінки аланінамінотрансферази (АТ) і аспартатамінотрансферази (А5Т), поліпшення міжнародного нормалізованого співвідношення (для згортання крові), білірубіну і альбуміну, а також випадково виявленого цукру в крові (див. таблицю 15). Фактично, цей пацієнт перебував на лікуванні альбуміном до терапії перепрограмованими клітинами, але після терапії не отримував альбуміну.

Таблиця 15

Маркери крові у чоловіка 44 років, хворого на цироз печінки спричинений інфекцією вірусу гепатиту С на початковому рівні та після терапії перепрограмованими клітинами . - Після терапії

Маркер крові рівень ооменееююн 00 нор р р оВУтвя

Лужна фосфатаза (О/.) 7196. | ..ЮюЮЙЮЙЮЙ.| 147 | (| 58 сват 777777777717171717171771717117149 17771771 1170 | 63 | з

Білірубін О|мгдл| /////////7/17771717168 | 54 | 47 | 49 | 4

Креатинінімг/длі 1777/7007. | 07 | 08 | 07 | 07

Калійїммольллі 77777711 1132 | 38 | 44 (Натрійіммольллї 77771717 11134 | 141 | 137

Продовження таблиці 15

Маркер крові рівень оомеяееююно 00 Норд р р оВУтвя (СечовакислотаїмидлІ 17777771 35 | 77771171 124 | З оальфа-фетопротеїн.///////////17777717177л/л | норма | ЇЇ (кроглобуліни. 77777771 фнегативниїїд//:/ ОЇ. 7 / Ї77771

Примітка: ТІ С - загальна кількість лейкоцитів; РІ.Т - тромбоцити; А5Т - апартатамінотрансфераза; АГ! Т - аланінамінотрансфераза; СОТ - гама- глутамілтрансфераза; КВ5 - випадковий цукор крові; ІМК - міжнародні нормалізовані співвідношення (для коагуляції крові)

Травма голови

Хворого з травмою голови після автомобільної катастрофи лікували інфузією аутологічних перепрограмованих плюрипотенційних стовбурових клітин і нейронів. Лікування призвело до відновлення пошкодженої мозкової тканини (Фіг. 19а-в), поліпшення фракції викиду (ЕК); рівнів попередника натрійуретичного пептиду мозку (Рго ВМР), який є прогностичним фактором, пов'язаним з хворобою коронарної артерії; рівня глюкози крові натщесерце; і рівнів НБА1С (див. таблицю 10).

Хвороба легень

Хворого з обмеженою хворобою легень, пов'язаною з хворобою мотонейрона, лікували інфузією аутологічних перепрограмованих плюрипотенційних стовбурових клітин, мезенхімних стовбурових клітин, альвеолярних клітин епітелію, і клітин ендотелію. Через шість місяців після початку лікування вимушена життєва ємкість (МС), яка відповідає об'єму повітря, яке може бути з силою видихнутим після повного вдиху, збільшилася від 5095 до 7195, тоді як форсований об'єм видиху за 1 секунду (ГЕМІ1), який відповідає об'єму повітря, яке можна з силою видихнути за одну секунду, збільшився від 64 95 до 68 95. Далі, співвідношення РЕМІ1 до

ЕМС, яке складає приблизно 75-80 956 у здорових дорослих людей, зменшилося від 100 95 до 82 965. Рентгенівський знімок легенів показав менше затемнення порожнини легені після лікування (Фіг. 20).

Менопауза

Б1-річній хворій в менопаузі вводили інфузію аутологічних перепрограмованих плюрипотенційних стовбурових клітин, плюрипотенційних ембріональних клітин і овоцитів. Після лікування у хворої спостерігалось збільшення різних гормонів і рівнів білка, включаючи інсуліноподібний фактор росту 1 (ІСЕ-1), еєтегдіаоі, і ліпопротеїн низької щільності (І 0) (див. таблицю 16).

Таблиця 16

Ефекти введення хворого в менопаузі аутологічних перепрограмованих стовбурових клітин

Адренокортіпмоль/л| | 21777170 Ї71117о Її (КальцитонінІн/мл!д | 7028 | (40 | 2 щ(5Бо | ЖК Ф

Продовження таблиці 16

ЕЗН(ІМЕ/У 77/11 11111412 7111155. | 388 щ -

ВН(ІмМЕЛ. (77777171 11111181 11111660

Пролактінімкг/лЛ| 1 162 | 7 | 7105 | 06 (ВільнийтестІпмоль/л! | 8 | 64 | 75

РрімоидлІ 777 1777711794Ї7771711790 77111102 | 103

Інгибінод ////77771711111740Ї111111111111111Ї1111130 11111111

ОстеокальцинІн/мл! (77777771 1111171680 тЗНіпод/ьлІ 7 177771084. | 1111107 1111052 Ж ж Кж МА.

КальцитонінІнг/лЛ ///17777110128 77111140 Ї111150 111111

Примітки: ІСЕ-1 - інсуліноподібний фактор росту 1; ІСЕ-1-ріпа - інсуліноподібний зв'язуючий фактор росту 1; СН - гормон росту; 8) ОНЕА-5 - дегідроепіандростерон-сульфат; 9) адренокорт - адренокортикальний гормон; Е5Н - фолікулостимулюючий гормон; ІН - лютеїнізуючий гормон; НОЇ. - ліпопротеїн високої щільності; І.О. - ліпопротеїн низької щільності; НЬ А1С « глікозильований гемоглобін; ЕбБз - відбір плодової крові; ТЗН - тироїдстимулюючий гормон; 25) ЕТЗ - вільний триїодтриронін; ЕТ-4 - вільний тироксин

Депресія

Хворого з депресією лікували інфузією аутологічних перепрограмованих плюрипотенційних стовбурових клітин і нейронів. Після лікування у хворого спостерігалось збільшення різних гормонів і рівнів білка, включаючи інсуліноподібний фактор росту 1 (ІСБЕ-1), кортизол і тестостерон (див. таблицю 17).

Таблиця 17

Ефект введення хворому в менопаузі аутологічних перепрограмованих клітин бНімкулЛі 77777771 Ї1717171717171711л«0051111 Ї71171717171717171111006ССсС

Продовження таблиці 1 7

Ефект введення хворому в менопаузі аутологічних перепрограмованих клітин

Примітки: СН - гормон росту; ІСОЕ-1 - інсуліноподібний фактор росту 1; ІСЕ-Бр - інсуліноподібний фактор росту 1, який зв'язує білок; адренокорт - адренокортикальний гормон; 5-59 - глобулін, який зв'язує статевий гормон; ЕЗН - фолікулостимулюючий гормон;

ІН - лютеїнізуючий гормон; е2 - естрадіол; ОНЕА-5 - дегідроепіандростерон-сульфат; ТЗН - тироїдстимулюючий гормон; ЕТЗ - вільний триіїодтриронін; ЕТ-4 - вільний тироксин

Необструктивна азооспермія

Хворого З необструктивною азооспермією лікували інфузією аутологічних перепрограмованих плюрипотенційних стовбурових клітин, плюрипотенційних ембріональних клітин і сперми. Після лікування у хворого спостерігалось збільшення тестостерону протягом восьми місяців (Фіг. 21).

Втрата зору

Хворого, який страждає від втрати зору унаслідок доброякісної пухлини, яка була видалена, лікували інфузією аутологічних перепрограмованих плюрипотенційних стовбурових клітин і нейронами. Після лікування у хворого спостерігалась збільшена чутливість ретиналі і поліпшення зору (Фіг. 22).

Таким чином, маючи детально описані кращі варіанти здійснення даного винаходу, потрібно розуміти, що винахід, визначений вищезазначеними параграфами, не повинен бути обмеженим конкретними деталями, сформульованими у вищезазначеному описі, оскільки можливі багато очевидних змін, які не відступають від суті або обсягу даного винаходу.

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Застосування однієї або більше перепрограмованих стовбурових нервових клітин в приготуванні медикаменту або фармацевтичної композиції для оновлення або заміни тканин або клітин хворого, який хворіє на неврологічне захворювання, при якому перепрограмовані стовбурові нервові клітини отримані шляхом перепрограмування комітованих клітин- попередників першої клітинної лінії з пацієнта, при якому перепрограмування включає контактування цих комітованих клітин з антитілами, які зчіплюють рецептор, який є посередником захоплення, упізнавання або індикації антигену на поверхні комітованих клітин.

2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що хворий хворіє на хвороби або розлади, вибрані з групи, яка складається з хвороби мотонейрона, хвороби Паркінсона, аміотрофного латерального склерозу, пошкодження спинного мозку, розсіяного склерозу, травми голови, Зо депресії, погіршення зору.

3. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що комітовані клітини отримують з цілісної крові, кісткового мозку, нейронної тканини, м'язової тканини, епідермісу або шкіри.

4. Застосування за п. З, яке відрізняється тим, що комітовані клітини отримують з цілісної крові.

5. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що комітовані клітини отримують за допомогою аферезису.

б. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що комітовані клітини отримують з мобілізованої або немобілізованої крові.

7. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що комітовані клітини вибирають з групи, що включає Т-клітини, В-клітини, еозинофіли, базофіли, нейтрофіли, мегакаріоцити, моноцити, еритроцити, гранулоцити, мастоцити, лімфоцити, лейкоцити, тромбоцити і червоні клітини крові.

8. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що перепрограмування включає ретродиференціювання, трансдиференціювання, передиференціювання комітованих клітин або їх комбінацію.

9. Застосування за п. 8, яке відрізняється тим, що перепрограмування включає ретродиференціювання комітованих клітин, щоб отримати ретродиференційовані клітини.

10. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що рецептором є антиген головного комплексу гістосумісності (МНС) класу І або антиген МНС класу ЇЇ.

11. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що засобом є моноклональне антитіло до рецептора.

12. Застосування за п. 11, яке відрізняється тим, що антитіло вибирають з групи, яка включає моноклональне антитіло СКЗ/43 і моноклональне антитіло ТАГЇ. 185.

13. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що медикамент або фармацевтичну композицію вводять шляхом ін'єкції або імплантації.

14. Застосування за п. 13, яке відрізняється тим, що медикамент або фармацевтичну композицію вводять парентеральним, внутрішньом'язовим, внутрішньовенним, підшкірним, внутрішньоочним методом, перорально, трансдермальною ін'єкцією або ін'єкцією в спинну рідину.

15. Застосування за п. 8, яке відрізняється тим, що перепрограмування включає трансдиференціювання комітованих клітин, щоб отримати трансдиференційовані клітини.

16. Застосування за п. 15, яке відрізняється тим, що комітовані клітини трансдиференціюють культивуванням комітованих клітин в середовищі культуральної тканини, яке включає один або більше засобів ретродиференціювання і один або більше промоторів диференціювання.

17. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що середовище культуральної тканини вибирають з групи, яка включає середовище ІМОМ, ОМЕМ, ЕМЕ, а-МЕМ, КРМІ 1640, Нат-Б-12, Е199, МСОВ, Іеїромій 1-15 і середовище МУмМійате ЕЕ або будь-які комерційно доступні культуральні середовища.

18. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є антикоагулянт, хелатуючий засіб або антибіотик.

19. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є вітамін, мінерал або їх похідна.

20. Застосування за п. 19, яке відрізняється тим, що вітамін, мінерал або їх похідну вибирають з групи, яка включає вітамін А, вітамін ВЗ, вітамін С, вітамін ОЗ, вітамін К, ретиноєву кислоту, Зо нікотинамід, цинк або сполуки цинку і кальцію або сполуки кальцію.

21. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є природний або синтетичний гормон.

22. Застосування за п. 21, яке відрізняється тим, що природним або синтетичним гормоном є гідрокортизон або дексаметазон.

23. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є амінокислота або її похідна.

24. Застосування за п. 23, яке відрізняється тим, що амінокислоту або її похідну вибирають з групи, яка включає І -глутамін (І--діи), ерготіонеїн (ЕСТ), пролін і замінні амінокислоти (МЕАА).

25. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є хімічна сполука або її похідна.

26. Застосування за п. 25, яке відрізняється тим, що хімічну сполуку або її похідну вибирають з групи, яка включає р-меркаптоеталь, дибутилмонофосфат циклічного аденозину (аБбБ-САМР), монотіогліцерин (МТС), путресцин, диметилсульфоксид (ОМ5О), гіпоксантин, аденін, форсколін, силостамід і 3-ізобутил-1-метилксантин.

27. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є нуклеозид або його аналог.

28. Застосування за п, 27, яке відрізняється тим, що нуклеозидом або його аналогом є 5- азацитидин.

29. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є кислоти або їх солі.

30. Застосування за п. 29, яке відрізняється тим, що кислоту або її сіль вибирають з групи, яка включає аскорбінову кислоту, піруват, окадову кислоту, лінолеву кислоту, етилендіамінтетраоцтову кислоту (ЕЮОТА), динатрієву сіль ЕОТА, етиленглікольтетраоцтову кислоту (ЕСТА), антикоагулянт цитрат декстрози формули А (АСОБА), бутират натрію і гліцерофосфат.

31. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є антибіотик або лікарський засіб.

32. Застосування за п. 31, яке відрізняється тим, що антибіотик або лікарський засіб вибирають з групи, яка включає (418, гентаміцин, пентоксифілін (1-(5-оксогексил)-3,7- 60 диметилксантин) та індометацин.

33. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є білок.

34. Застосування за п. 33, яке відрізняється тим, що білком є активатор плазміногену тканини (ТРА).

35. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що культуральне середовище тканини містить аутологічну плазму; тромбоцити; сироватку або сироватки ссавців.

36. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що клітини культивують в мішках з кров'ю, підкладках, мішках для культивування тканини або пластмасових посудинах для культивування тканини.

37. Застосування за п. 36, яке відрізняється тим, що посудини для культивування тканин є прикріпленими або неприкріпленими посудинами для культивування тканини.

38. Застосування за п. 36, яке відрізняється тим, що посудини для культивування тканини є закритими або незакритими.

39. Застосування за п. 38, яке відрізняється тим, що посудини для культивування тканини покривають засобом, вибраним з групи, яка включає желатин, колаген, матригель або позаклітинну матрицю.

40. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що клітини культивують за температури від приблизно 18 до приблизно 40 "С.

41. Застосування за п. 16, яке відрізняється що клітини культивують при рівні діоксиду вуглецю від приблизно 4 до приблизно 10 95.

42. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що клітини культивують при рівні кисню від приблизно 10 до приблизно 35 95.

43. Фармацевтична композиція, що містить перепрограмовані цільові клітини, визначені в будь- якому з пп. 1-42.

44. Спосіб отримання перепрограмованих стовбурових нейронних клітин для введення хворому, який цього потребує, який включає (ї) отримання комітованих клітин першої клітинної лінії; (ії) перепрограмування комітованих клітин, щоб отримати перепрограмовані стовбурові нейронні клітини, причому це перепрограмування включає контактування комітованих клітин з антитілами, які зчіплюють рецептор, який є посередником захоплення, пізнавання або індикації антигену у поверхні комітованих клітин. Зо

45. Фармацевтична композиція, яка містить перепрограмовані стовбурові нейронні клітини, отримані способом за п. 44, та принаймні один фармацевтично прийнятний ексципієнт.

46. Спосіб отримання медикаменту або фармацевтичної композиції для введення хворому, який цього потребує, який передбачає: (ї) отримання комітованих клітин першої клітинної лінії; (ії) перепрограмування комітованих клітин, шляхом контакту з антитілом, яке зв'язує рецептор, який медіює розпізнавання та представлення антигену на поверхні комітованих клітин для одержання перепрограмованих клітин-мішеней, причому ці перепрограмовані клітини-мішені є стовбуровими нейронними клітинами; та (ії), при потребі, комбінування перепрограмованих стовбурових нейронних клітин з одним або більше фармацевтичним ексципієнтом.

Фіг. 1

День 1 в й ЕЛ ові рт п ен ше я я я їх Кия вето День 14 а жи 00 дае М ЕКА щи нм ї г: 8 В ще Бешев Єюня тя і ШУ ша ШЕ т Ку пий ще і. й є ІЗ я - М ТУ РОКИ у ше вч дж ння ИЙ й с й. З пи не В в | и ера М ді я. КУН У і. Я рев де | щі Б. В 5 не М 1 Е зей Не з Я ко | ши ще Н ме: «ОВ 51.0, І Н вжи і ОК Е С ни оса В. ШЕ |. С. ! | т: че т "З Що де ОВ | "й ії спі вели я Її | й ж . в Буття - яру Кент У | ї і ШО Б ; Я ї я ей ЯЩ в мя ке ЗВ ЩЕ ли: 41 в. ше нео і й я ей: 41 пе ШИ ШИ те ві Канов Й й Ії | | 7 І" Хай ие зі ЕН Й сс фетр ві НИ т. Е аа Ві. ГІ ; | й ШК зговвеН Кг диня ре ЗИ 4. Но Кри В: ДН Я. он рот сн ква, і ГО нн тик ан ж НЯ | Ши Я ЕНН ШИ 5 МИ в я с. щи рили їх в пов ми 1 як Н Кс, й ЕЙ В ! х Ше СОУ ЕР посжмме нан - пн 4 У ге роде ЯН м У Й Б й т в син Ен і: щ. - НИ: Й ГЕ ще питну НС снсси кН фіг. 2а Що й День 1 ле й й Ея в о День 2 и и о т пу пай 1095 496 дя - не Ох Ж 7, з ! щі ня ва. Ще Ме ша м 1 Ов 5 ...День М -- чи не Не ХА; от «ї мой Кока дн. й | " й х не квасенамн "В Попов Ко о. ОА | Е ІЗ Ж 195. 7 Я Я : и я ЗВУ Б, яти сш «Їжа йо МІ Кз є ДЕ й Мт ЗД дет ет Ж С Би УВК ТЕ. ВЕК Х р; їх ко ? се і-й пов ай і шо й шк ПК др Що. 0 Бех щі; КОС М: с пох в іш в М, Шк ай Я. . ке КР вол: мок зма я с: В Ве в КО я ЗЕ Од; Б яву тку, Й В і о ї" с ! з х 1 Те і й- я в ра Ма па а Гах | я е й н й | их : я ; І ! | ЩО в ї що й : Я | те Шк і й ге | 0 ув - 5, | Об и ш я що (г ще: НВ в В ши "В Е о й ЩО зів п ЕгтнВ де ЕЕ Фк Її я Її ВО стін п 579 Й и й й ші й х ше. В С НДІ д ЛИС Дон З і З, СЕ ши Кк й ; 1 | ї щ й З «Б Ще І т ЩК, ей зх х що НЕ; ПІ ов 1 в Що ШИ Як в Ж Е з. Б ТІ ТБ ке ЗО - пам си " ЩІ В й. хай ЗО Ягве шо А Кік їг шо І "З "ОН ие і2ж ЗТ Еш ія ЕІ м: НЗ. Ен 4 я о. 1 ва -3 В В НА Ще Боже те Ж. В шк и в й І й ї. ОК о В с, оон ко ро Й МВ: - - Ї й сів Ме тен ж т Маса. г и кума Еу Ж: М зни: жах жна Щи п ше в|. ж. - 8-й і чн - ВЕИЛОЛЕВВ ЩО й часа і яки щ СІ КЕ хі" у ЕНН Ол ОДОЙ «БМ КУ Не: "й ши - ов: «ООН ж Туру 1 т ща се НЕ: о КЕ. Н кни ши с ИЙ гуни свв ав

Фіг. 25 мае НМ ЯКО ще о Ку ов, КОН ЖЖ. од ПОЛЕ жу. ще ЕХ Ух ЗУ ОО Й ЛІКИ году МИ п птн уКх Ї ж юю М с о ЖИ ет вка ЗИ: ПКТ З | ' Щ ЩД ф(( Ще В Я я я в, ше п г . В ие : п НН ВМД шо; ек г сх пи М шок То жене ПО КК ОО М ах С ШК з 7 ПИТЕЛІКЛЬО 0 ШОУ ше о ВО Ов в Ох 5: ша о. п и ен ОВО ще о М З КО чи Єжи тих со ШК МК и. й. ЗУ, си ее пови, - ща я Ки в х о. КАХ Що о ЗОВ А КУ МИ ук

В. ня ня Я й Її й ко ей . ООН Ки Вей І Да ве ав Не ха ще ММК г ЗЕ Ж п. зе 5 ща яку ЯК ЕЕ с з: о и З БИЙ ОК со жк ч ос ще Б КІ ЩЕ і ПОВЕ шк а ЩЕ ж ЩЕ «нн АЛЕ де ща пу ! КОЖ Су у Км У - шо НЕ ств й. і НО ОКСАНИ ЕК ої Б М і ЗЕ «Ж р. ІМК 7 Е У Н Я: ВК Ох ККУ ЗК Шен ж гу Я п. ОВ ще І сви - І я я У р. и я . ЕГО прак п ОО ОЙ пет; МО Ж дк СКК ПЕВНО : ТОК ті М и СХ ес уки ж ККУ по ТОЙ ши в я В о, Ме ее КВН доти ОСТ оо Й и БО Бо ОН ет о со

С х. Піп: а Бе: ши НЯ а КИ ще БУХ УЗИ и ре их КАК Ч ОМ Я т БОВя о птн Б -н - ВМЗВНЕ у Її М ОО, ій СВК гео ов УМ УЗ Ох ж 55 ни ши Й ПТМ и и ЗО 5 у Ше АС Й СЕТИ НМТ А око вра прав они я Зо Яае ОО НЕ я ни и Б ОХ о в З ох о. . СТЕ Ще п ож ит ТИ В ОАЕ МиИя и пок е їх ОН ОХ бор що - ОМА Шу ШУ КК ОК о З «пд а: ХНИ Шок Ше в ен МОХ Є) с З Ох вон й І Ши пу ОН с о. Б. . ше 0 НН і син В а І а Б в Й ше Бе по я о ах п о шо ДН В о ТОВ з ву З : КУА ДК Ко У КК ин КО КВ ку Ох І о ЕК т В и А м її с В Зх СУ МКК: НИ Ж, ни Й я а з чу а КНУ 5 : о Е 5 о Ка п. вне ше шо ' пон ННЯ шт на п Ши я т ОО ЗА ВИННАЯ в. Ще І Ї Пк М Мова ши саіниє поту В ох ай мо МЛН з : пидджу шо ЕИЛЖ за КУ Ок й кт ши ших е ЕТ ОНА од - их по о и ВИШ ОНКО А « шо На р пи МЕНЕ НК закон ЖИ , ж шк ре п: З їх МЛ ВИ Кл ПЕК ОО ННЯ НЕК КЕ дн Ще ОХ Ор НИ М Же и стору ПО КО А й Ме. т дсссоо ев кто Ми о ще ння - ква МИ 0 З НЕ. їгя кох З й ту СПАДКУ Пенн й : ПА ПЕ ПОМ пит я ХЕ ши

Фіг. З

2 А. в е | Р й з ще ! а ! Ї я і ї і як З ах г ав о | Ї с сне й бою тя ге и вав й с | | ск Кк Е З вх ме 5 на « оф ї ши чи. ва

Фіг.4 Переключення НЬЕ після інфузії КС пе18 пе17 р-0.002 в-0.002 5 пев х рад вт пе16 7 Р-0.02 нене сь 1 ,. рі ий І З | В знннненнь се Ф п-х21 що й ще й З пе12 ще 2 панно все А Ренні вивий « , Шк (і 1 и ВБихідний її місяць 2 місяці З місяці б місяців 12 місяців рівень Час

Фіг. 5

Що Середній об'єм еритроцитів після інфузії ЕС 82 понос Ки Е зоре і В я "нонот д г Е 78 / са рак 5 76 / 4 о 74 і Вихідний 1 місяць місяці З місяці 6 місяців 12 місяців рівень Час Фіг, 6 Середній еритроцшитарний гемоглобін після інфузії БО

28.0 ши шо

27.51 - ї ваткою ри

Е. А х 27.0 шо , 8 28.5 5 т т 26.0 -Ї і є Е ГТ ссккрюсо що 25.0 і») -ї а. ж 2 24.5 Бихідний ої місяць о еомісяці З місяці б місяців 12 місяців рівень Час

Фіг. 7

Феритин сироватки після інфузії КО вкво Є - сппотеетннтоткннсннтюсн інегодесеатоотоовопостосот топос осно опи ниКлиникюкю БОдО ГГ Що є шо пе:ї13 й Е 4500 а | ре0.7 е е. 4000 Ши пе в що "и ін щі х 3500 1 т ою «ЖЕ Хан т ІТ Е 3000 п:18

Р-0.001 Вихідний місяць 2 місяці З місяці б місяців 12 місяців рівень Час

Фіг. 8 С-пептид Її -е-натще сф ВИПАДКОВИЙ - - ЕД- , Ф у ге , 5 3- и -й ще -к Бихідний 1 тиждень о? тижні ії місяць 2 місяці З місяці рівень Час

Фіг. З

19 4 НьЬ ді1С в 1 0 4 ре х 8 ві ВИЙ ще та й п в 4 й. 2 0 пана о а о пор полови коло опи зт: Вихідний 4 тиждень 2 тижні 1 місяць 2 місяці З місяці рівень Час

Фіг. 10 СРК (креатинфосфокіназа) та 1 ОН (лактадегідрогеназа) ЗБОЮ -- т 600 З000 - | ш-СРК Сон | 500 2500 и -- 400 м 2000 ни

8. | -300 95 1500 -- 100 К-- 262 2л що о. Ше. 100 11/13/2006 12/14/2006 1114/2007 22/24/2007 Дата

Фіг. 11

- Ферменти печінки 80- 8 --А1Т -яй-А5Т - Ех 650 п З та ко Е в 70

В. 207 Е- 0 пн ан а а а а а а нин а а а ання

3. 11/13/2006 12/14/2006 11/14/2007 22/24/2007 Ї Дата

Фіг. 12 Мікроальбумінурія у 12 хворих діабетом ІІ типу бою І нюють , - 1400

- с. х 1200 х й жк 1000 п в. 800 ХЕ Е У 800. а ря в. ОО Е 200 до після Час

Фіг. 13

НЬАТС У 12 хворих діабетом |! типу та нирковою хворобою о»тТО , , , 11 о 8 о ке 8 7 до після Час

Фіг. 14 и света ва хи - За ня собаку В Ко СВ Я дку у НИ З 7 ОО Б зе МЕ ря В ща КОНЯ а ОО В я В ее ; БЕ: Б Ь. г У ВН М з я Ж н ОМ В ВО Ку Й ВВ ТК хо Со ее : КК С ОО Де м Ки НОЯ у; п а Х ше в Зх В й ; о НВ ЕОМ а м и Ве ех З х ОЙ ОО осо НИ НЕ сом ово / яр нн: ОН Я а У же ВМ Ен МОМ Уа й а Я осонні БО Не я я . ОКУ. БО З ь А НИ ЖЖ и КВ й в пі З КОХ това Я ПО в о У ПОХО ЗМОВ і ОХ я В У КЕКВ ЗСЖ: с КОКО МК З я М ЦИ т; ОМ ї пи ви зх УК ОЗ хи, ПЕК й У З ОКО З: С ЕКО : а те Ох сту СК рен р о з п. Ж І ху МУ ле ч КЕ ов К щу ОВ з «МОХ ме у я од КК я ох НК, В 7. КО, А М і: ШЕ с З В ШЕ 5 Шк в и ЖК ЕОМ МК т НИК МУ мя Ж о ООН ООН КО :й ПО МК ЕК. а ЗО і я зро В ДО о ВИЙ ав м КО МК аце й й ОК века мАф НЕК КЕ: А ЕК Б У Й в БЖ не ВО а у й о М ЕЕ т о КО НН ев НН и в а З СК са й в ОО у й Аня ще в ОО ЗКУ М КОМ о щ. у й ; ЕК де а. щи ся у в. КЕ ТК ОК в с" ій І ау МУ: В На Й В, «ва ЧО КК МО МО Й ч- кс и ай че В г и Ох В и Мей ки ПК п Є я і ЕІ КА ж. "І ЗМО, в. Ех й ШО АХ шк ВО: в НН я че т, ВИ с с ВАОВДИ ща "Я ви ков най КОМУН т с В а ЧАЙ ; ОВ ВЕК - ее «НВ Ах З я о ее ЗМОВ ОО я й Пе Ко в ; ПЕ о щ ль СУК нен м ОКО Я КМ В ЗМК Я ан ВИЙ й ШИ ОН З шо шо Ми КОКО СЕ я й Кия 7 СЕК КО Я АНУ КО Бе Ме о М с МЕМ Я ОХ не СХ: дв У. в ООН ЗК І КУ пив В а З й, й ШКО й 5 шо й ож а Я ко СОМ. ху ви Ех т ЗУ ИН - МН: З ОККО И ї шо кн ЕЕ ТО ї КК о КО В п КО і Б ИЙ ВЕБ со за хо в, КО ОВ ІДЕ Во "ВЕ З ВК ії ВР Бо 7 ВО: ОК ОН п Кк я в : т Мк ук В З ОК : ОН ЕЕ УК о БЕходеья й ОМ зо в Й ЕКО Й в в К ше ай В о а М Со вренВ 5 в З КОН З ВК й і в. КОС: НМ ВО І око ШИ ше БО. Ок: ЕК НЕ ще а ше й ть сен З БО й ; МОН ОЙШь Ше в М У М, ЖУК БЕК жен М МККй ВО Я й що БО Ка Кк а ВОМ во ОКА ЖЕ т І в о ВИ, в и ОБ и о ОО ВИ - МН и :: ОК Ох -й Е ОО хх ВЕНИ БО хай ї. МО КА М ВЕ М 8 що ОМ В щу ЗИ: ФО МОБ ве ЗИ 5 ОЙ в: а З ВОК. п ЧА Ку я ее - сх ваш М 4 КА САС з 1. од НО, й ши ВИК сс нвай яка - До терапії стволовими клітинами ЕНН сно Кр ОН АН В и и нн МЕ ок а "Ди І НОЯ и Я МЕТУ ВК "НН с НН с ВО Б НО ИН В о НН и ВО нах АК М. с ИН ТІЛІ а а МОХ ния МОМ ШО о ЗО -, и хх Я О ВИ - УМ Я Баш С Мих ОБНИК у. МИ Я. ПОМ Кв п 7 ак ВО Бе и В В х ВИННА ах і я Кк я у Я ва ЗЕ и: ВО й В А, МН М а М я и кн В Ми гаки В Оу ВИЙ У МК ВВ, В ЗОЗ КОХ УЖЕ ПК М СО ВЕК ко в тлу ДНО ШК и В В В КМ КО; НЯ ТИ С с, М НО в і В ВО В Я м АК ЗО КОЖ 5 НН о ска ВНИк ВН х С КВК с НИ ОН п В Кон Ж ОА Я и п В туш ЕЕ. и В м в СХ и ще как нена з ин Мед о в в пон о ж. МОН мк ан ин: Б ПО ОО КК. : о о В ВО кю, ак и ни со в хо Я ЕВ СОМ пот НЕ В п в ННЯ о о ВК в У ОО М ос рн с ВВ В Как: я ШІ суток ВЕ вен ОБ СУМІ В Я Ме ня Ок. Ен. ВХ ВВ ОЗ ОО се Я ЕНН ВО Що А щи В ЕС КВН кв - их КЕ М и В ну Ж : п З й ке Би ЗУ р ІВ М НВ КУ НН СЕ жан о В ОВ НЕ о ев нки: 7 ВН ВУ М Же НК ОУН. ВО пре кн ВО вх пОЖшУ рт ИМ В Х НК Шити ВК Ба ом. ли ВБННННН КЕ З ПОЛОМОК прое в НН ПО ох о М о ППоодк ОаЙ пли В Мрій Мне пшиМИе «ПЕВ вен с: о. ОМ пог Й ВО ВК и в о ВИ я Б: о в ВК ПАЛЮ ММ ХХ ен Ми АК А ОО И о о Не МО кеша в ОН М я ПИТ рн ин ПД КК и М ОО КОН ення ооо и Я и нн нин п пн СС пн ПО ШИК пи Е и и ТИ ОПІВ Ки КЕ ши НН НИ КН Ти НН ИН НМ КО НН Ми я По нан ша и ово БИЛИ МТ Ио я рено их ПН олосею ОН в в В нн ВН ее МНН и оо НН Й со ВВ я Ху, ВН, ее ак: НН сов нн ня и т: МІ НН и Кн М ке Ка са МНН Ки шт о тюки ВЕН я. МКК в З Я і ЕН і У С В Во не в и В пк В НН В В ВН НН Й В МНН пи п ПО ВОВК В КО, шен В и А ИН Ве а В мой: ВИН НН М В МОВІ М В Ко А ВН М и МУ Сх, МНН НН В Км НН НН М І ви ВИНИ у Бен о ОТЕ ка. НН ОКО Й щих С я АБ В о М Сх ОО Ме ВИКО м до М со ТИНИ ВИН нн КА Слова щи КО КН 5 ММК пек я МО Я СІВ ОН ее ан В МКК МН нн ВЕК оС ОВ ВИНО ВИН ШО ня ВХ р: же ОО КК в ж: Вени Викннн У шу ЗУ НОЯ ПК ром и в о В КК КУ ооо Ко нВК кн де М КЕ шо и ВА с ОО В ВОК В В но СВЙ о хи ВИНО БОЖКО с ік НИ, ШИНИ КК ВК ЖК В М І ОК и ВИНИ ВНІ хі ух Зк: ОК ВВ Кр В В ОХ по ТИВ. ВВ и и З ОТ оф ТИ Я ВІ ВН СХ ху о М В в С ВМ КК, ВЕ ах ВО ме В А о Ко и НВ Я; С КУ ВН п Но НИ ВИ оо ШВУ оо ППО КІ и о 0 ХМ ВВ ху ВК ол З вав ооо ВВ В овес СИ ВВ ко Воно ВМ в тк Ко ВН В, М Со ВЕК ти: ЕХ ст. В

НЯ. мо ооо Вс й ий о и и вв А М ЕН сови. ок ЩЕ МИ ве ад ок ен «Ви М в НН я НН ен ов ня До терапії стволовими клітинами Тих Коса мааанн и ит ОК в нова т У КЕ МН пд ЕВ о лох ва сх НН нд ЛО КЕ м онвввн МН ху ох со: НН НО пк о, НН с НВ Тс ле Ох: НН ОН ВН сок ВН и Зх ХХХ. ННЯ о М В НН хх НВ пого КОКО вд. ООН МОХ КОНЯ за ТУЯ В; Ем Ох а НЯ пло, в и НО сум о о В Мо МНН ТІК, Ан о с мВк ВАШ ох Ж и о о ИН КЕ я а ОКО Ба ПІК ков ВИННІ ВО т ОВ ОМ у В ну в ВН а НН КК КН М НК Фе же. З ОТО, НН мя тк о В В ВК сх о НИ В по ен п о В М г о В В що вк ОК со ку ШИ в М ре СПК ВОЮ ПОВ о НК В Б Б: у ОО Ока Ме ИН Б А В За и Ку МОН В УКВ: ВО БУ Б ОО Кок ННІ В ОВ о ДОМ СО а НО СОЙ КО Ох їх тя ХНИ У ех МО НИ р п и ОК МИ нн КК І ВК ЛА ЕК с, ВО М Я Ж Зх КЕ ОО ОКО ща й ЕЕ В под А я; в и и ОС ШОВ Ко ЗУ її В в СК ВК сн ан ши юн З З НК НН в і Кс АНЯ ВНВа ВИНА ще ЕСЕ ВВ ОМ ОНИ ОККО ВИ ВИ З Оллнжи Ве НК ВЕ КА Ко ВИ и ем и ОВО же 5 КБ о МОЖ ЖЖ М КК УП ДС я ПО су КУ В пла ЛИ М МОМ их. кра ОН ОНИ НЕ МІК Пр ОМ М КН ПН ЗИ ПОС Я Пи В и В НК Кк Ва С ОК КА СІЙ НН у КА В Кі ВИ Ше КИ ШО. ВИННИЙ МК В ПИ І Ви є я КК АК и, ву я о пи ВВ ПЕ КК й в х. о. сутки ВВВКНЇ Ж а ов це о ВН у Кк НН Му в ВЕ я ето ДИНЯ в Б о О.. Мр хом МІК КУ ОВ ВН и КМ С ЕК НД ШК Мих ВН ОК ВИК КИ Я ОК КО я и КН схктосото рого содоосоовнсв о ке ка о М ЗО сходооворот ово оо Я Енн нн НН п р ОО с НН нн нн шана А НН ше НН п я Ох ПО: ВИН и йо ж ПМ им, ИН Я я : В У п В в ВТ ОК ВВ МОЙ ; й ВУ ОВ ст п пи Ж: о ник а и ОО В, НН В Б, В МЕН ви и, ПА ШИН НН НК МН КО Вин у МИ Ви ВВ ДАЙ МО во шо НН у ОВ ов ОН М В Б ее: и М п ННЯ о В лож я: ВО нн М в В М Ки М БО З меня В СК В С ХК НН нн КОМ В ОКО В М В МК с о ОВ ВИН ХО КВ В КК и ИН МИ ВІ СО У Не ПУКОНЯ Ме З щ ОК я: ши ВЕУ СО ПОС фев Аня В Бей пот СО: лиж ОН: М Ов шин З З ння М Ин р КМ ВЕ Ви: ЯМ ни не о С КЕ ША р ас о ок В в в и п Ми В МІ В ше Ве: МОВ ВУ БЕ ВН и НН. «с Зв БУ Ж З БОКИ 3 В НН НМ п о В лк в Я Кн КО Ки ЕНН енеаннне Ку в то В щі З у с ЖИ нн Я ІОЕ ПЕ А ВВ т Ве Ян В о с хо п НН о с Ек В Крик ВК Й ВЕ нс и ОНИ: ВИН Я у и ї дО о вій сло В в ДПК в ДИ в В ав и хг: В ОК КК НН рей В ов. Яся до що а т поль Й ПТ ВВ В НН Й У КИ НК т НН полого они КД и о КС ВНе Й ШО тт В Са В неви детокс АВ ВЕ вань оо НИ нс в Я НН ств ркости писане нен МТ СДМ ЛУИТИ ТО лйалаАИ МАВ Анни ПП У УПМ ПОДИХ МОЮ ЛЕ, 211 ОЛЕНИ У УП ях її є ОЕЕ. - : ож Ел у ; шко ча й аю и ни В ше, сю ші х а: Мк Ї . зн ШИЯ : БУ ШІ КЕ ах А Ди ху М, Не Б ШЕ Ні В : ва щ МЕ ІК Бе - З Н - Є їй х х . ж ше й - дулі ; . ой, - бо Я Е е ше о ШИ шов о ИН ще ин в НН . х 7 че пе НН . чинних ша я х ее поза ш . них о ; КАМ ні 7 : Ек я су а и и вв М Оу Ж - шк й ил ом Й Й й иа оон З іже

Фіг. 17а що ле ши : сир : СН А ко неши Подана и ши . ї н КО Н ПИ ов: п Ж ге МАН У школи ше Й птн х ЗХ же Ех з НУ й і . ШУ не КЕ уж БТІ. шої ; а й пн а НН З Кох ша й ЗИ х с Зппаллялали дь- ну : ОХ ни Мк ЩЕ ЧК н й ши и НН м а: ВИЗ С НЕ ж З нин ОН НЯ чо НН ННЯ й ще нд и ше шу Фе ке ши я ЮК, ж ЗО ЖЕ КУ - , . й Я о щу Й ще і Кз . у й я - ще «ЖЕ МК: шо подо Ко . о Пед Ж их , : і Ко Я . ДИ шин й :

Фіг. 176 мо з а Ф 120 в й. 100 во Вихідний 1 місяць 2 місяці З місяці рівень Час

Фіг. 1ва АВТ 140 130 120 0 мо « т Б 100 «в б. вок во 70 Вихідний імісяць 2 місяці З місяці рівень Час

Фіг. 180 БА

До лікування Після початку лікування

Фев. с: еще и лисеня щк н ще й А в Во з сь : г А Ж ЯК Сх, ще ен ОО Ос и овес М: жа, Ї Ом не и мех ФМ ер КК ат В, Дн гону В о и ПОВ НН а а Й ОБ НИНКЯ пити еВ. оон они Кто и В ОЗБЩННЯ ор 5 НІ о НИ УНН ОВО Я | о КН Б. г ХОМ ав а о Ши я шшк шт 5 що, й со ну шу ЗІ Ко ша а й ки нс око о ШО: о и он Кй на БЕ у Но 5 ШО В Я Я де хг . Пов нш К я и а з не бо ма Шо КИ п о й З БО ша шу ша НИ До лікування п ас ШУ ром Ч ОО кто, с Ще денне я ща ет Ми ШЕ шк Пе ки п й ЕН: мк А с поши, НИ С ос НУ о а ВК ни нер ннне но НН З ІН НН А З и ж шви б ше 65 Й З Пий ВК Н і: й нео НИНІ З НН Й й Мене ЯН вай сі У т «ит КВ І ВИ у ОБ й «ОМ рн ВИ вок я р м я НМ В ша о МІНИ и в Й ит ев нн, УМА они . нь; вон й : Після початку ЛІКУВАННЯ не «Мн з п «а їй в ше - Аа: і «а от в | «Ве стос шо ко ВМ и ше, че пен НН 00 ж на кож а и НИ ВН Я г, я ЯМ х пло і г Шрі ВУ я ШОВ о я ше ше НН шани в ШЕ кН а і

«ВЕ. ША ВК ЕВ З ке ще ЕЕ. пп ВН с СК ОО и М. г о М я п ШК Й од Хе С ко ФК ВХ У ЖЖ ит Плужник в пу ОТ Ж КО ВО и, НО Ки С Вт ВЕК 0 ПОВЕ й й Я дю ор ВО В ния НВ : и м кВ : шо ен а а МЕ я НИ о ше ЕОМ М У не ОО ши НН о МНН ВО а 0 ШЕ а "Бе екк де а. : що ен НН ИЙ ї Ше и НЕ МК НН о, ООН ССС