CN107114355A - 一种脂肪细胞保护液及其制备方法 - Google Patents

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CN107114355A CN201610622230.0A CN201610622230A CN107114355A CN 107114355 A CN107114355 A CN 107114355A CN 201610622230 A CN201610622230 A CN 201610622230A CN 107114355 A CN107114355 A CN 107114355A
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李霞云
曹毓琳
白志惠
刘世红
卢承前
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Beijing Century Biotechnology Co Ltd
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Abstract

本发明提供一种脂肪细胞保护液，所述保护液主要是将低氧保护剂、维生素C和氨基糖苷类抗生素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂5‑10mg、所述维生素C 10‑50μg、所述氨基糖苷类抗生素50‑200U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为30‑40mg/mL。本发明提供的脂肪细胞保护液性能稳定，可以较长时间地保存脂肪细胞，起到有效保持脂肪干细胞活性、保护脂肪干细胞的作用，并能提高脂肪干细胞的增殖能力，可以满足将脂肪细胞运输到国内大多数地区及周边国家的要求，并且安全无毒，可以直接应用于人体。

Description

一种脂肪细胞保护液及其制备方法
技术领域
本发明属于脂肪细胞保存的技术领域，尤其涉及一种脂肪细胞保护液及其制备方法。
背景技术
近年来，细胞技术被广泛用于多种疾病的临床试验及治疗中，并且表现出良好的应用前景，逐渐成为近年来新的医学研究热点之一。脂肪细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，具有取材容易、不限年龄及时间、少量组织即可获取大量细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，而且脂肪来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，因此研究一种有效的脂肪细胞的保存方法，使具有临床应用价值的脂肪细胞可以在体外长期保存并保持细胞活性，显得尤为重要。
目前常用的脂肪细胞保存技术一般是采用生理盐水或者细胞培养基作为脂肪细胞的保存介质，如果单纯用生理盐水保存脂肪细胞，由于脂肪干细胞在生理盐水中活力下降的速度非常快，两小时后脂肪细胞活力就会降低10％左右，因此生理盐水只适用于脂肪细胞即时使用的情况；而细胞培养基中含有脂肪细胞生长代谢所需的糖类、氨基酸、无机盐、维生素等物质，对于维持脂肪细胞渗透压及活力有较好的作用，可以在较长时间内保持脂肪细胞活性，但如果单独使用细菌培养基来保存脂肪细胞，其安全性及可靠性还不够理想。现有技术中也公开了许多细胞保存液，例如CN201510060953.1公布了一种保护剂组合物，由一种或多种细胞保护剂、抑制剂、螯合稳定剂、酸碱缓冲液组成；CN201510724842.6公布了一种脂肪间充质干细胞的冻存保护液，由DMSO、脂肪间充质干细胞条件培养基和胎牛血清组成。现有技术中公开的细胞保护液一般都存在细胞存活率较低、安全性较差、使用条件较为苛刻等问题，在临床应用上存在一定困难。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种脂肪细胞保护液，所述保护液主要是将低氧保护剂、维生素C和氨基糖苷类抗生素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂5-10mg、所述维生素C 10-50μg、所述氨基糖苷类抗生素50-200U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为30-40mg/mL。
DMEM/F12培养基由DMEM培养基和F12培养基按照重量份数为1:1的比例结合，其成分丰富、营养浓度高、含有多种微量元素，可作为无血清或血清含量较低条件下的哺乳动物细胞培养的基础培养基。
每升DMEM/F12培养基中含有下列成分：
在浓度为30-40mg/mL的DMEM/F12培养基水溶液中加入低氧保护剂、维生素C和氨基糖苷类抗生素，制得的脂肪细胞保护液可以长时间保持脂肪干细胞活性，提高脂肪干细胞存活率。
进一步的，所述氨基糖苷类抗生素由庆大霉素、卡那霉素、链霉素中的一种或多种组成。
优选的，所述氨基糖苷类抗生素由庆大霉素、卡那霉素、链霉素按照2:2:1的重量份数比组成，比单用一种氨基糖苷类抗生素、采用其他几种氨基糖苷类抗生素或采用其它重量配比的抗细菌效果更好。
进一步的，所述保护液中还含有苯扎氯铵和甲酸钙，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述苯扎氯铵50-100μg、所述甲酸钙50-100μg。在保护液中加入苯扎氯铵和甲酸钙起到防止脂肪细胞保护液中产生真菌和病毒感染作用，保障所保存的脂肪细胞的质量安全，可应用于人体疾病的治疗。
进一步的，所述低氧保护剂包括如下重量份数的各成分：
大花紫薇叶提取物2-5酢浆草提取物2-5氧化苦参碱1-2。
在脂肪细胞保护液中采用大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物和氧化苦参碱作为低氧保护剂可以显著降低脂肪干细胞内活性氧水平，调节脂肪干细胞抗氧化能力、减少低氧引起的脂肪干细胞凋亡，有效提高低氧条件下的脂肪干细胞存活率。
进一步的，所述低氧保护剂还包括如下重量份数的各成分：
麦角硫因2-5 二丁基羟基甲苯1-3。
在低氧保护剂中加入麦角硫因和二丁基羟基甲苯与大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物和氧化苦参碱配合使用，可以使低氧条件下的脂肪干细胞存活率的更高。
进一步的，所述保护液中还含有透明质酸、甲壳质和硫酸乙酰肝素，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述透明质酸10-20mg、所述甲壳质1-5mg、所述硫酸乙酰肝素1-5mg。
在保护液中加入透明质酸、甲壳质和硫酸乙酰肝素，可以有效提高脂肪干细胞存活率。
进一步的，所述保护液中还含有海藻糖、羟丙基环糊精和海藻酸钠，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述海藻糖1-5mg、所述羟丙基环糊精10-50μg、所述海藻酸钠10-50μg。
在保护液中加入海藻糖、羟丙基环糊精和海藻酸钠，可以起到提高脂肪干细胞增殖速度的效果。
进一步的，所述保护液中还含有葡聚糖、羟丙甲基纤维素和月桂酸单甘油酯，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述葡聚糖3-5mg、所述羟丙甲基纤维素3-5mg、所述月桂酸单甘油酯50-100μg。
在保护液中加入葡聚糖、羟丙甲基纤维素和月桂酸单甘油酯，可以有效改善脂肪细胞保护液的稳定性，延长脂肪细胞保护液的保质期。
本发明还提供一种脂肪细胞保护液的制备方法，包括：
(1)向DMEM/F12培养基水溶液中加入NaHCO3，直至DMEM/F12培养基水溶液的PH值为6-6.5；
(2)将除维生素C以外的其他原料加入步骤(1)得到的DMEM/F12培养基水溶液中，再将所得混合液升温至80-100℃，搅拌至溶解均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液降温至20-30℃，加入维生素C，搅拌至溶解均匀；
(4)将步骤(3)得到的混合液用细菌过滤器过滤，然后冰水浴中降温至0-10℃即可获得脂肪细胞保护液。
进一步的，所述步骤(2)在压强为0.16-0.2MPa的条件下进行。
在增压条件下进行搅拌操作，可以提高搅拌的效果，使脂肪细胞保护液中的各种原料充分混合均匀。
本发明提供的脂肪细胞保护液性能稳定，可以较长时间地保存脂肪细胞，起到有效保持脂肪干细胞活性、保护脂肪干细胞的作用，并能提高脂肪干细胞的增殖能力，可以满足将脂肪细胞运输到国内大多数地区及周边国家的要求，并且安全无毒，可以直接应用于人体。
附图说明
图1为本发明实施例4、实施例19、对照例13和对照例14的脂肪干细胞生长曲线图。
具体实施方式
实施例1
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C和庆大霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素100U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例2
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C和庆大霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂5mg、所述维生素C 10μg、所述庆大霉素50U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为30mg/mL。
实施例3
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C和庆大霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂10mg、所述维生素C 50μg、所述庆大霉素200U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为40mg/mL。
实施例4
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例5
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂5mg、所述维生素C 10μg、所述庆大霉素20U、所述卡那霉素20U、所述链霉素10U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为30mg/mL；
所述脂肪细胞保护液的制备方法包括：
(1)向DMEM/F12培养基水溶液中加入NaHCO3，直至DMEM/F12培养基水溶液的PH值为6；
(2)将除维生素C以外的其他原料加入步骤(1)得到的DMEM/F12培养基水溶液中，再将所得混合液升温至80℃，搅拌至溶解均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液降温至20℃，加入维生素C，搅拌至溶解均匀；
(4)将步骤(3)得到的混合液用细菌过滤器过滤，然后冰水浴中降温至0℃即可获得脂肪细胞保护液。
实施例6
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂10mg、所述维生素C 50μg、所述庆大霉素80U、所述卡那霉素80U、所述链霉素40U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为40mg/mL。
实施例7
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、甲酸钙用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵75μg、所述甲酸钙75μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例8
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、甲酸钙用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵50μg、所述甲酸钙50μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL；
所述脂肪细胞保护液的制备方法包括：
(1)向DMEM/F12培养基水溶液中加入NaHCO3，直至DMEM/F12培养基水溶液的PH值为6.5；
(2)将除维生素C以外的其他原料加入步骤(1)得到的DMEM/F12培养基水溶液中，再将所得混合液升温至100℃，搅拌至溶解均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液降温至30℃，加入维生素C，搅拌至溶解均匀；
(4)将步骤(3)得到的混合液用细菌过滤器过滤，然后冰水浴中降温至10℃即可获得脂肪细胞保护液。
实施例9
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、甲酸钙用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵100μg、所述甲酸钙100μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例10
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物3.5mg、所述酢浆草提取物3mg、所述氧化苦参碱1.5mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例11
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、甲酸钙用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物3.2mg、所述酢浆草提取物3.2mg、所述氧化苦参碱1.6mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵75μg、所述甲酸钙75μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL；
所述脂肪细胞保护液的制备方法包括：
(1)向DMEM/F12培养基水溶液中加入NaHCO3，直至DMEM/F12培养基水溶液的PH值为6.3；
(2)将除维生素C以外的其他原料加入步骤(1)得到的DMEM/F12培养基水溶液中，再将所得混合液升温至90℃，搅拌至溶解均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液降温至23℃，加入维生素C，搅拌至溶解均匀；
(4)将步骤(3)得到的混合液用细菌过滤器过滤，然后冰水浴中降温至4℃即可获得脂肪细胞保护液。
实施例12
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、甲酸钙用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物3.33mg、所述酢浆草提取物3.33mg、所述氧化苦参碱1.34mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵75μg、所述甲酸钙75μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例13
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、麦角硫因、二丁基羟基甲苯、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物2mg、所述酢浆草提取物2mg、所述氧化苦参碱1mg、所述麦角硫因2mg、所述二丁基羟基甲苯1mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例14
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、麦角硫因、二丁基羟基甲苯、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、甲酸钙用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物1.8mg、所述酢浆草提取物1.8mg、所述氧化苦参碱1mg、所述麦角硫因2.2mg、所述二丁基羟基甲苯1.2mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵75μg、所述甲酸钙75μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL；
所述脂肪细胞保护液的制备方法包括：
(1)向DMEM/F12培养基水溶液中加入NaHCO3，直至DMEM/F12培养基水溶液的PH值为6.3；
(2)将除维生素C以外的其他原料加入步骤(1)得到的DMEM/F12培养基水溶液中，再将所得混合液升温至90℃，在压强为0.2MPa下搅拌至溶解均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液降温至23℃，加入维生素C，搅拌至溶解均匀；
(4)将步骤(3)得到的混合液用细菌过滤器过滤，然后冰水浴中降温至4℃即可获得脂肪细胞保护液。
实施例15
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、麦角硫因、二丁基羟基甲苯、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、甲酸钙用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物2mg、所述酢浆草提取物2mg、所述氧化苦参碱0.8mg、所述麦角硫因2mg、所述二丁基羟基甲苯1.2mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵75μg、所述甲酸钙75μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例16
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、透明质酸、甲壳质、硫酸乙酰肝素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述透明质酸15mg、所述甲壳质2mg、所述硫酸乙酰肝素2mg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例17
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、麦角硫因、二丁基羟基甲苯、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、甲酸钙、透明质酸、甲壳质、硫酸乙酰肝素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物2mg、所述酢浆草提取物2mg、所述氧化苦参碱1mg、所述麦角硫因2mg、所述二丁基羟基甲苯1mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵75μg、所述甲酸钙75μg、所述透明质酸10mg、所述甲壳质1mg、所述硫酸乙酰肝素1mg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL；
所述脂肪细胞保护液的制备方法包括：
(1)向DMEM/F12培养基水溶液中加入NaHCO3，直至DMEM/F12培养基水溶液的PH值为6.3；
(2)将除维生素C以外的其他原料加入步骤(1)得到的DMEM/F12培养基水溶液中，再将所得混合液升温至90℃，在压强为0.18MPa下搅拌至溶解均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液降温至23℃，加入维生素C，搅拌至溶解均匀；
(4)将步骤(3)得到的混合液用细菌过滤器过滤，然后冰水浴中降温至4℃即可获得脂肪细胞保护液。
实施例18
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、麦角硫因、二丁基羟基甲苯、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、甲酸钙、透明质酸、甲壳质、硫酸乙酰肝素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物2mg、所述酢浆草提取物2mg、所述氧化苦参碱1mg、所述麦角硫因2mg、所述二丁基羟基甲苯1mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵75μg、所述甲酸钙75μg、所述透明质酸20mg、所述甲壳质5mg、所述硫酸乙酰肝素5mg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例19
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、海藻糖、羟丙基环糊精、海藻酸钠用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述海藻糖2mg、所述羟丙基环糊精30μg、所述海藻酸钠30μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例20
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、麦角硫因、二丁基羟基甲苯、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、甲酸钙、透明质酸、甲壳质、硫酸乙酰肝素、海藻糖、羟丙基环糊精、海藻酸钠用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物2mg、所述酢浆草提取物2mg、所述氧化苦参碱1mg、所述麦角硫因2mg、所述二丁基羟基甲苯1mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵75μg、所述甲酸钙75μg、所述透明质酸15mg、所述甲壳质2mg、所述硫酸乙酰肝素2mg、所述海藻糖1mg、所述羟丙基环糊精10μg、所述海藻酸钠10μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例21
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、麦角硫因、二丁基羟基甲苯、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、甲酸钙、透明质酸、甲壳质、硫酸乙酰肝素、海藻糖、羟丙基环糊精、海藻酸钠用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物2mg、所述酢浆草提取物2mg、所述氧化苦参碱1mg、所述麦角硫因2mg、所述二丁基羟基甲苯1mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵75μg、所述甲酸钙75μg、所述透明质酸15mg、所述甲壳质2mg、所述硫酸乙酰肝素2mg、所述海藻糖5mg、所述羟丙基环糊精50μg、所述海藻酸钠50μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例22
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、葡聚糖、羟丙甲基纤维素、月桂酸单甘油酯用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述葡聚糖4mg、所述羟丙甲基纤维素4mg、所述月桂酸单甘油酯75μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例23
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、麦角硫因、二丁基羟基甲苯、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、甲酸钙、透明质酸、甲壳质、硫酸乙酰肝素、海藻糖、羟丙基环糊精、海藻酸钠、葡聚糖、羟丙甲基纤维素、月桂酸单甘油酯用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物2mg、所述酢浆草提取物2mg、所述氧化苦参碱1mg、所述麦角硫因2mg、所述二丁基羟基甲苯1mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵75μg、所述甲酸钙75μg、所述透明质酸15mg、所述甲壳质2mg、所述硫酸乙酰肝素2mg、所述海藻糖2mg、所述羟丙基环糊精30μg、所述海藻酸钠30μg、所述葡聚糖3mg、所述羟丙甲基纤维素3mg、所述月桂酸单甘油酯50μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
实施例24
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、麦角硫因、二丁基羟基甲苯、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、甲酸钙、透明质酸、甲壳质、硫酸乙酰肝素、海藻糖、羟丙基环糊精、海藻酸钠、葡聚糖、羟丙甲基纤维素、月桂酸单甘油酯用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物2mg、所述酢浆草提取物2mg、所述氧化苦参碱1mg、所述麦角硫因2mg、所述二丁基羟基甲苯1mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵75μg、所述甲酸钙75μg、所述透明质酸15mg、所述甲壳质2mg、所述硫酸乙酰肝素2mg、所述海藻糖2mg、所述羟丙基环糊精30μg、所述海藻酸钠30μg、所述葡聚糖5mg、所述羟丙甲基纤维素5mg、所述月桂酸单甘油酯100μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例1
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂和庆大霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述庆大霉素100U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例2
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、胱氨酸和庆大霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述胱氨酸20μg、所述庆大霉素100U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例3
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、青霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述青霉素100U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例4
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素20U、所述卡那霉素60U、所述链霉素20U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例5
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵75μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例6
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、苯扎氯铵、硫酸钾用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述苯扎氯铵75μg、所述硫酸钾75μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例7
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述维生素C20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例8
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将板蓝根提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述板蓝根提取物3.5mg、所述酢浆草提取物3mg、所述氧化苦参碱1.5mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例9
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、麦角硫因、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物2mg、所述酢浆草提取物2mg、所述氧化苦参碱1mg、所述麦角硫因3mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例10
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物、氧化苦参碱、麦角硫因、抗坏血酸钠、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述大花紫薇叶提取物2mg、所述酢浆草提取物2mg、所述氧化苦参碱1mg、所述麦角硫因2mg、所述抗坏血酸钠1mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例11
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、透明质酸、硫酸乙酰肝素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述透明质酸15mg、所述硫酸乙酰肝素2mg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例12
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述透明质酸15mg、所述肝素2mg、所述硫酸乙酰肝素2mg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例13
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、海藻糖、海藻酸钠用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述海藻糖2mg、所述海藻酸钠30μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例14
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、海藻糖、羟丙基环糊精、维生素E用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述海藻糖2mg、所述羟丙基环糊精30μg、所述维生素E30μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例15
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、葡聚糖、羟丙甲基纤维素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述葡聚糖4mg、所述羟丙甲基纤维素4mg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
对照例16
一种脂肪细胞保护液，该保护液主要是将低氧保护剂、维生素C、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、葡聚糖、海藻酸铵、月桂酸单甘油酯用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂8mg、所述维生素C 20μg、所述庆大霉素40U、所述卡那霉素40U、所述链霉素20U、所述葡聚糖4mg、所述海藻酸铵4mg、所述月桂酸单甘油酯75μg，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为37.5mg/mL。
脂肪细胞保护液安全性分析：
取实施例1、实施例4、实施例7、对照例3-6的脂肪细胞保护液，均在温度40℃±2℃下，相对湿度为75％±5％的条件下放置12个月，在试验期间1个月、3个月、6个月、9个月、12个月末分别取样一次，检测脂肪细胞保护液中细菌、真菌和病毒的感染情况，检验结果见表1。
表1脂肪细胞保护液安全性分析
其中：“-”表示“没有”，“√”表示“有”。
比较实施例4与实施例1、对照例3-4的脂肪细胞保护液的细菌感染状况可知，在脂肪细胞保护液中添加重量份数为2:2:1的比庆大霉素、卡那霉素和链霉素可以有效提高脂肪细胞保护液防止细菌感染的能力，减少抗生素、变化抗生素、或调整抗生素的重量份数比，都会导致脂肪细胞保护液抗细菌感染的能力减弱。
比较实施例7与实施例4、对照例5-6的脂肪细胞保护液的真菌和病毒感染状况可知，在脂肪细胞保护液中添加苯扎氯铵和甲酸钙可以有效防止脂肪细胞保护液感染真菌和病毒，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，脂肪细胞保护液防止真菌和病毒感染的效果会减弱。低氧保护剂对脂肪干细胞在低氧条件下的存活率的影响分析：
将相同数量的脂肪干细胞分别放入实施例10、实施例13以及对照例7-10的脂肪细胞保护液中，置于灭菌的西林瓶中，在4℃的低氧培养箱(1％的O2、5％的CO2和94％的N2)中保存24小时后用台盼兰染色计数脂肪干细胞存活率，结果见表2。
表2低氧条件下的细胞存活率
实施例10 实施例13 对照例7 对照例8 对照例9 对照例10
细胞成活率(％) 85.3 94.4 51.8 70.3 87.2 85.7
由上述结果可知：选用大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物和氧化苦参碱作为低氧保护剂可以提高低氧条件下脂肪干细胞的存活率；加入麦角硫因和二丁基羟基甲苯与大花紫薇叶提取物、酢浆草提取物和氧化苦参碱一起用作低氧保护剂，对于提高低氧条件下的脂肪干细胞存活率效果更佳。
脂肪细胞保护液对脂肪干细胞存活率的影响分析：
设置试验1-4和对比试验1-6，将相同数量的脂肪干细胞分别放入不同的细胞保护液中，置于灭菌的西林瓶中，在4℃下保存240小时，期间分别于第12h、24h、48h、96h、240h时观察脂肪干细胞形态，并用台盼兰染色计数脂肪干细胞存活率。
其中试验1-4分别采用实施例1、实施例4、实施例16、实施例18的脂肪细胞保护液作为脂肪干细胞的保护液；对比试验1采用生理盐水作为脂肪干细胞的保护液；对比试验2采用DMEM/F12培养基作为脂肪干细胞的保护液，对比试验5-6采用对照例1、对照例2、对照例11、对照例12的脂肪细胞保护液作为脂肪干细胞的保护液，试验结果见表3。
表3不同种类细胞保护液对脂肪干细胞存活率的影响
其中：A表示细胞分散度好、大小均匀、形态不变、轮廓清晰；
B表示细胞体积变大、大小不等、轮廓模糊、出现椭圆或不规则等异常形态。
上述试验结果表明，试验1-4与对比试验1-4相比，其脂肪干细胞存活率明显较高，且脂肪干细胞的形态也保持得更好，由此可知本发明提供的的脂肪细胞保护液可以有效保持脂肪干细胞活性、提高脂肪干细胞存活率。
试验3-4的脂肪干细胞存活率明显高于试验1-2和对比实验5-6，说明在脂肪细胞保护液中加入透明质酸、甲壳质和硫酸乙酰肝素有利于提高脂肪干细胞存活率，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，提高脂肪干细胞存活率的效果会变差。
脂肪细胞保护液对脂肪干细胞增殖能力的影响分析
分别采用实施例4、实施例19、对照例13和对照例14的脂肪细胞保护液保存脂肪干细胞1h，并将上述脂肪干细胞均以每cm2接种25个脂肪干细胞的标准在培养板上接种后培养7天，每天计算脂肪干细胞数量，绘制其生长曲线，其生长曲线如图1所示。
从图1中可知，经过实施例19的脂肪细胞保护液保存的脂肪干细胞的增殖速度明显高于经过实施例4、对照例13和对照例14的的脂肪细胞保护液保存的脂肪干细胞，上述结果表明在脂肪细胞保护液中添加海藻糖、羟丙基环糊精和海藻酸钠可以有效提高脂肪干细胞的增殖速度，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，提高脂肪干细胞的增殖速度的效果会减弱。
脂肪细胞保护液稳定性试验分析
取实施例4、实施例22、对照例15-16的脂肪细胞保护液，均在温度40℃±2℃下，相对湿度为75％±5％的条件下放置12个月，在试验期间1个月、3个月、6个月、9个月、12个月末分别取样一次，检测脂肪细胞保护液的性状和色泽，试验结果见表4。
表4脂肪细胞保护液稳定性试验结果
其中：“-”表示没有，“√”表示有。
比较实施例22与实施例4和对照例15-16的脂肪细胞保护液的稳定性状况可知，在脂肪细胞保护液中添加葡聚糖、羟丙甲基纤维素和月桂酸单甘油酯可以有效提高脂肪细胞保护液的稳定性，避免脂肪细胞保护液产生沉淀、分层和变色等问题，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，脂肪细胞保护液的稳定性会减弱。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种脂肪细胞保护液，其特征在于：所述保护液主要是将低氧保护剂、维生素C和氨基糖苷类抗生素用DMEM/F12培养基水溶液溶解而成，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述低氧保护剂5-10mg、所述维生素C 10-50μg、所述氨基糖苷类抗生素50-200U，所述DMEM/F12培养基水溶液的浓度为30-40mg/mL。
2.根据权利要求1所述的脂肪细胞保护液，其特征在于：所述氨基糖苷类抗生素由庆大霉素、卡那霉素、链霉素中的一种或多种组成。
3.根据权利要求2所述的脂肪细胞保护液，其特征在于：所述保护液中还含有苯扎氯铵和甲酸钙，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述苯扎氯铵50-100μg、所述甲酸钙50-100μg。
4.根据权利要求1所述的脂肪细胞保护液，其特征在于：所述低氧保护剂包括如下重量份数的各成分：
大花紫薇叶提取物2-5 酢浆草提取物2-5 氧化苦参碱1-2。
5.根据权利要求4所述的脂肪细胞保护液，其特征在于：所述低氧保护剂还包括如下重量份数的各成分：
麦角硫因2-5 二丁基羟基甲苯1-3。
6.根据权利要求1所述的脂肪细胞保护液，其特征在于：所述保护液中还含有透明质酸、甲壳质和硫酸乙酰肝素，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述透明质酸10-20mg、所述甲壳质1-5mg、所述硫酸乙酰肝素1-5mg。
7.根据权利要求1所述的脂肪细胞保护液，其特征在于：所述保护液中还含有海藻糖、羟丙基环糊精和海藻酸钠，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述海藻糖1-5mg、所述羟丙基环糊精10-50μg、所述海藻酸钠10-50μg。
8.根据权利要求1所述的脂肪细胞保护液，其特征在于：所述保护液中还含有葡聚糖、羟丙甲基纤维素和月桂酸单甘油酯，每mL所述DMEM/F12培养基水溶液分别溶解所述葡聚糖3-5mg、所述羟丙甲基纤维素3-5mg、所述月桂酸单甘油酯50-100μg。
9.一种根据权利要求1所述的脂肪细胞保护液的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)向DMEM/F12培养基水溶液中加入NaHCO3，直至DMEM/F12培养基水溶液的PH值为6-6.5；
(2)将除维生素C以外的其他原料加入步骤(1)得到的DMEM/F12培养基水溶液中，再将所得混合液升温至80-100℃，搅拌至溶解均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液降温至20-30℃，加入维生素C，搅拌至溶解均匀；
(4)将步骤(3)得到的混合液用细菌过滤器过滤，然后冰水浴中降温至0-10℃即可获得脂肪细胞保护液。
10.根据权利要求8所述的脂肪细胞保护液的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)在压强为0.16-0.2MPa的条件下进行。
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