CN109566597A - 一种宫内膜干细胞保护液及其制备方法 - Google Patents

一种宫内膜干细胞保护液及其制备方法 Download PDF

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董明珠
宋莉莉
潘新
刘世红
卢家堃
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Beijing Century Biotechnology Co Ltd
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Abstract

本发明提供了一种宫内膜干细胞保护液及其制备方法。本发明提供的保护液包括1‑5份的肝素钙、20‑40份的低分子右旋糖苷、1‑2份的罂粟碱、5‑10份的海藻糖、800‑1000份的水和4‑6份的中药提取物。本发明提供的宫内膜干细胞保护液不含血清，价格低廉，保存的宫内膜干细胞冻存复苏后的复苏率较高，随着时间的延长，减缓宫内膜干细胞的复苏率的降低速率。

Description

一种宫内膜干细胞保护液及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种宫内膜干细胞保护液及其制备方法。
背景技术
宫内膜干细胞具有高度增殖活性及自我再生能力，在细胞治疗和再生医学中有着重要的临床医学价值，目前已经可以在体外培养扩增宫内膜干细胞，用于科学研究、药物筛选测试、临床应用等，为了方便的取用体外培养扩增的宫内膜干细胞，一般需要对培养出的宫内膜干细胞进行冻存和复苏，目前，一般的宫内膜干细胞冻存时使用的冻存液分为含血清型和无血清型两类，含血清型冻存液成分复杂、价格昂贵且质量难以控制，因而无血清型冻存液的应用越来越多，无血清型冻存液主要含有70％的无血清培养基、20％牛血清白蛋白和10％二甲基亚砜，放置于无血清冻存液中保存的宫内膜干细胞冻存复苏后的复苏率随着时间延长而大幅度降低，严重影响后续的使用。
发明内容
为了解决现有技术中宫内膜干细胞冻存复苏后的复苏率较低等问题，本发明提供了一种宫内膜干细胞保护液，该保护液不含血清，价格低廉，保存的宫内膜干细胞冻存复苏后的复苏率较高，随着时间的延长，减缓宫内膜干细胞的复苏率的降低速率。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种宫内膜干细胞保护液，该保护液包括如下重量份的各成分：
1-5份的肝素钙、20-40份的低分子右旋糖苷、1-2份的罂粟碱、5-10份的海藻糖、800-1000份的水和4-6份的中药提取物；
所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
进一步地，中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
本发明通过在保护液中加入肝素钙、低分子右旋糖苷、罂粟碱、海藻糖、水和中药提取物，为宫内膜干细胞提供充足的养分，减慢其新陈代谢速度，提高宫内膜干细胞冻存复苏后的复苏率。
进一步地，中药提取物的提取方法包括如下步骤：
1)取配方量的青叶胆洗净、粉碎，放置于50-70℃温水中减压浸提两次，每次浸提1-2h，青叶胆与50-70℃温水的固液比为1:10-12，浸提真空度为0.7-0.9Mpa，合并各次浸提液，得青叶胆浸提液；
2)取配方量的香附、蔓荆子和薤白放置于浓度为40-60％的乙醇溶液中超声30-40min，香附、蔓荆子和薤白的总重量与40-60％的乙醇溶液的固液比为1:40-60，超声频率为40-60KHz，得超声提取液；
3)将步骤1)获得的青叶胆浸提液与步骤2)获得的超声提取液合并，混合均匀，浓缩干燥至粉末，即得中药提取物。
其中，固液比是指某物质的重量g与液体的体积mL的比。
本发明通过以上方法制备中药提取物，通过各中药中不同的有效成分的配伍，与肝素钙、低分子右旋糖苷、罂粟碱和海藻糖共同作用，协同增效，进一步地提高宫内膜干细胞冻存复苏后的复苏率。
进一步地，保护液还包括重量份数为4-10份的维生素B6、2-4份的氯化镁和10-20份的N-乙酰半胱氨酸。
本发明通过在保护液中加入维生素B6、氯化镁、和N-乙酰半胱氨酸的混合物，能够很好地保持冻存复苏后的宫内膜干细胞的特性。
进一步地，保护液还包括重量份数为0.4-0.6份的超氧化物歧化酶、3-7份的LpxC-1和0.8-1.2份的柠檬酸锌。
本发明通过在保护液中加入超氧化物歧化酶、LpxC-1和柠檬酸锌组成的混合物，能够在宫内膜干细胞的保存期间，维持细胞的增殖活性。
进一步地，保护液还包括重量份数为4-8份的磷酸氢二钾、1-5份的妥布霉素和0.2-1份的甘油。
本发明通过在保护液中加入磷酸氢二钾、妥布霉素和甘油，能够降低冻存复苏后的宫内膜干细胞的染菌率。
本发明另一方面还提供了保护液的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1：取1/2配方量的水，将配方量的肝素钙以4-8s/d的速度加入搅拌状态的水中，滴加完毕后继续以400-500r/min的速度搅拌25min，用细菌过滤器过滤，得肝素钙水溶液；
S2：将配方量的低分子右旋糖苷、罂粟碱和海藻糖放置于剩余配方量的水中以800-1000r/min的速度搅拌4-6min，用细菌过滤器过滤，获得混合水溶液；
S3：将步骤S1获得的肝素钙水溶液和步骤S2获得的混合水溶液混合均匀后加入配方量的中药提取物，再次混合均匀，冰水浴降至0℃，即得。
通过以上方法制备的保护液对宫内膜干细胞的保存效果更好，进一步地提高冻存复苏后的宫内膜的复苏率。
本发明另一方面提供了上述宫内膜干细胞保护液在保存宫内膜干细胞中的应用。
进一步地，每mL所述保护液中保存的宫内膜干细胞的数量为7～9×105个。
进一步地，保护液的工作温度为-20～-80℃。
本发明的有益效果如下:本发明提供的宫内膜干细胞保护液能够减慢其新陈代谢速度，提高冻存复苏后宫内膜干细胞的复苏率，冻存5天后复苏的宫内膜干细胞的复苏率不低于93.8％，最大程度的延长宫内膜干细胞的活性维持时间。
具体实施方式
实施例1
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
1份的肝素钙、20份的低分子右旋糖苷、1份的罂粟碱、5份的海藻糖、800份的水和4份的中药提取物，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
其中，该宫内膜干细胞保护液的制备方法是将肝素钙、右旋糖苷、罂粟碱、海藻糖、和中药提取物放置于水中混合均匀，即得。
实施例2
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水和5份的中药提取物，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
其中，中药提取物的提取方法包括如下步骤：
1)取配方量的青叶胆洗净、粉碎，放置于50℃温水中减压浸提两次，每次浸提1h，青叶胆与50℃温水的固液比为1:10，浸提真空度为0.7Mpa，合并各次浸提液，得青叶胆浸提液；
2)取配方量的香附、蔓荆子和薤白放置于浓度为40％的乙醇溶液中超声30min，香附、蔓荆子和薤白的总重量与40％的乙醇溶液的固液比为1:40，超声频率为40KHz，得超声提取液；
3)将步骤1)获得的青叶胆浸提液与步骤2)获得的超声提取液合并，混合均匀，浓缩干燥至粉末，即得中药提取物；
其中，该宫内膜干细胞保护液的制备方法是将肝素钙、右旋糖苷、罂粟碱、海藻糖、和中药提取物放置于水中混合均匀，即得。
实施例3
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
5份的肝素钙、40份的低分子右旋糖苷、2份的罂粟碱、10份的海藻糖、1000份的水和6份的中药提取物，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
其中，中药提取物的提取方法包括如下步骤：
1)取配方量的青叶胆洗净、粉碎，放置于70℃温水中减压浸提两次，每次浸提2h，青叶胆与70℃温水的固液比为1:12，浸提真空度为0.9Mpa，合并各次浸提液，得青叶胆浸提液；
2)取配方量的香附、蔓荆子和薤白放置于浓度为60％的乙醇溶液中超声40min，香附、蔓荆子和薤白的总重量与60％的乙醇溶液的固液比为1:60，超声频率为60KHz，得超声提取液；
3)将步骤1)获得的青叶胆浸提液与步骤2)获得的超声提取液合并，混合均匀，浓缩干燥至粉末，即得中药提取物；
其中，该宫内膜干细胞保护液的制备方法是将肝素钙、右旋糖苷、罂粟碱、海藻糖、和中药提取物放置于水中混合均匀，即得。
实施例4
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水和5份的中药提取物，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
其中，中药提取物的提取方法包括如下步骤：
1)取配方量的青叶胆洗净、粉碎，放置于50℃温水中减压浸提两次，每次浸提1h，青叶胆与50℃温水的固液比为1:10，浸提真空度为0.7Mpa，合并各次浸提液，得青叶胆浸提液；
2)取配方量的香附、蔓荆子和薤白放置于浓度为40％的乙醇溶液中超声30min，香附、蔓荆子和薤白的总重量与40％的乙醇溶液的固液比为1:40，超声频率为40KHz，得超声提取液；
3)将步骤1)获得的青叶胆浸提液与步骤2)获得的超声提取液合并，混合均匀，浓缩干燥至粉末，即得中药提取物；
其中，宫内膜干细胞保护液由以下方法制备而成：
S1：取1/2配方量的水，将配方量的肝素钙以4s/d的速度加入搅拌状态的水中，滴加完毕后继续以400r/min的速度搅拌25min，用细菌过滤器过滤，得肝素钙水溶液；
S2：将配方量的低分子右旋糖苷、罂粟碱和海藻糖放置于剩余配方量的水中以800r/min的速度搅拌4min，用细菌过滤器过滤，获得混合水溶液；
S3：将步骤S1获得的肝素钙水溶液和步骤S2获得的混合水溶液混合均匀后加入配方量的中药提取物，再次混合均匀，冰水浴降至0℃，即得。
实施例5
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水和5份的中药提取物，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
其中，中药提取物的提取方法包括如下步骤：
1)取配方量的青叶胆洗净、粉碎，放置于50℃温水中减压浸提两次，每次浸提1h，青叶胆与50℃温水的固液比为1:10，浸提真空度为0.7Mpa，合并各次浸提液，得青叶胆浸提液；
2)取配方量的香附、蔓荆子和薤白放置于浓度为40％的乙醇溶液中超声30min，香附、蔓荆子和薤白的总重量与40％的乙醇溶液的固液比为1:40，超声频率为40KHz，得超声提取液；
3)将步骤1)获得的青叶胆浸提液与步骤2)获得的超声提取液合并，混合均匀，浓缩干燥至粉末，即得中药提取物；
其中，宫内膜干细胞保护液由以下方法制备而成：
S1：取1/2配方量的水，将配方量的肝素钙以8s/d的速度加入搅拌状态的水中，滴加完毕后继续以500r/min的速度搅拌25min，用细菌过滤器过滤，得肝素钙水溶液；
S2：将配方量的低分子右旋糖苷、罂粟碱和海藻糖放置于剩余配方量的水中以1000r/min的速度搅拌6min，用细菌过滤器过滤，获得混合水溶液；
S3：将步骤S1获得的肝素钙水溶液和步骤S2获得的混合水溶液混合均匀后加入配方量的中药提取物，再次混合均匀，冰水浴降至0℃，即得。
实施例6
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
1份的肝素钙、20份的低分子右旋糖苷、1份的罂粟碱、5份的海藻糖、800份的水、4份的中药提取物、4份的维生素B6、2份的氯化镁和10份的N-乙酰半胱氨酸，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
实施例7
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水、5份的中药提取物、7份的维生素B6、3份的氯化镁和15份的N-乙酰半胱氨酸，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
实施例8
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
5份的肝素钙、40份的低分子右旋糖苷、2份的罂粟碱、10份的海藻糖、1000份的水、6份的中药提取物、10份的维生素B6、4份的氯化镁和20份的N-乙酰半胱氨酸，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例3的方法制备。
实施例9
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
1份的肝素钙、20份的低分子右旋糖苷、1份的罂粟碱、5份的海藻糖、800份的水、4份的中药提取物、0.4份的超氧化物歧化酶、3份的LpxC-1和0.8份的柠檬酸锌，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
实施例10
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水、5份的中药提取物、0.5份的超氧化物歧化酶、5份的LpxC-1和1份的柠檬酸锌，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
实施例11
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
5份的肝素钙、40份的低分子右旋糖苷、2份的罂粟碱、10份的海藻糖、1000份的水、6份的中药提取物、0.6份的超氧化物歧化酶、7份的LpxC-1和1.2份的柠檬酸锌，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例3的方法制备。
实施例12
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
1份的肝素钙、20份的低分子右旋糖苷、1份的罂粟碱、5份的海藻糖、800份的水、4份的中药提取物、4份的磷酸氢二钾、1份的妥布霉素和0.2份的甘油，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
实施例13
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水、5份的中药提取物、6份的磷酸氢二钾、3份的妥布霉素和0.6份的甘油，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
实施例14
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
5份的肝素钙、40份的低分子右旋糖苷、2份的罂粟碱、10份的海藻糖、1000份的水、6份的中药提取物、8份的磷酸氢二钾、5份的妥布霉素和1份的甘油，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例3的方法制备。
对照例1
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的葡萄糖、900份的水和5份的中药提取物，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
对照例2
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖和900份的水。
对照例3
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水和5份的中药提取物，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
对照例4
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水和5份的中药提取物，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
对照例5
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水、5份的中药提取物、7份的维生素C、3份的氯化镁和15份的N-乙酰半胱氨酸，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
对照例6
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水、5份的中药提取物、7份的维生素B6、3份的氯化钠和15份的N-乙酰半胱氨酸，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
对照例7
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水、5份的中药提取物、7份的维生素B6和3份的氯化镁，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
对照例8
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水、5份的中药提取物、0.5份的过氧化氢酶、5份的LpxC-1和1份的柠檬酸锌，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
对照例9
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水、5份的中药提取物、0.5份的超氧化物歧化酶、5份的LpxC-1和1份的柠檬酸钠，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
对照例10
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水、5份的中药提取物、0.5份的超氧化物歧化酶和1份的柠檬酸锌，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
对照例11
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水、5份的中药提取物、6份的磷酸氢二钾、3份的庆大霉素和0.6份的甘油，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
对照例12
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水、5份的中药提取物、6份的磷酸二氢钾、3份的妥布霉素和0.6份的甘油，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
对照例13
一种宫内膜干细胞保护液，该保护液由如下重量份的各成分制备而成：
3份的肝素钙、30份的低分子右旋糖苷、1.5份的罂粟碱、7.5份的海藻糖、900份的水、5份的中药提取物、6份的磷酸氢二钾和3份的妥布霉素，其中，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
中药组合物采用实施例2的方法制备。
试验例1复苏率实验
将同一来源的宫内膜干细胞分为试验1-4组、对照1-4组、和阳性组，其中试验1-4组浸没在实施例1-4的保护液中、对照例1-4组浸没在对照例1-4的保护液中，阳性组浸没在市场上的含血清型冻存液中，调整各组细胞悬液的浓度为8×105个细胞/mL，将细胞悬液在4℃放置7h，然后在-20℃放置36分钟，接着在-70℃条件下放置15个小时，然后转入液氮中冻存，15天后将冻存的宫内膜干细胞自液氮中取出，在40℃水浴锅中温浴2-3分钟，加入10倍体积的37℃预热的复苏液重悬洗涤，离心去上清，重复洗涤步骤，然后加入1倍体积的复苏液重悬，进行自动细胞计数仪计数，计算复苏率，结果如表1所示；
其中，复苏率(％)＝冻存复苏后细胞数量/细胞的原始数量×100％。
表1不同的保护液保存的宫内膜干细胞的复苏率试验结果
由表1可知，试验组的复苏率均高于对照组和阳性组，而实施例2的保护液的保护效果显著地好于实施例1和实施例3，证明本发明提供的保护液能够显著的提高冻存复苏后的宫内膜干细胞的复苏率，同时能够降低传统的含血清的冻存液对宫内膜干细胞带来的伤害，实施例2和3的保存效果好于实施例1，证明本发明提供的中药组合物的制备方法能够提高保护液的保存效果，而实施例4的保存效果好于实施例2，证明本发明提供的宫内膜干细胞保护液的制备方法能够进一步地提高冻存复苏后的宫内膜干细胞的复苏率。
试验例2细胞表面免疫表型遗传试验
将同一来源的宫内膜干细胞分为试验6-8组和对照5-7组，试验6-8组的宫内膜干细胞放置于实施例6-8的保护液中，对照5-7组的宫内膜干细胞放置于对照5-7组的保护液中，各组均在相同的条件下冻存、复苏，复苏后选取各组生长状态良好的细胞集落，离心收集细胞，弃上清洗涤细胞两次，制成浓度为8×105/L细胞悬液，分别加入10μL的CD29、CD45、CD90、CD34、CD73、CD133抗体，4℃避光孵育30分钟，孵育完成后洗涤两次以去除未结合的抗体，重悬细胞后，用流式细胞仪对各组细胞的表面抗原进行流式检测，结果如表2所示。
表2各组宫内膜干细胞表面标志物检测结果
由表2可知，试验组各组中CD29、CD45、CD90、CD34、CD73、CD133均为阳性，而对照组各组均有部分指标的表达为阴性，由此可知使用本发明提供的保护液保存宫内膜干细胞，可以很好地再现宫内膜干细胞的遗传表型，遗传稳定性良好，当删除或替换其中任一成分时，均会对宫内膜干细胞的遗传特性造成影响。
试验例3增殖活性实验
以实施例9-11和对照例8-10的保护液分别以-70℃条件下冻存同一来源的宫内膜干细胞15天，用相同的方法复苏后，分别将各组宫内膜干细胞以8×105个/T75瓶接种，加入完全培养基培养，再以5000个/孔将各组细胞接种于96孔板中，每孔接种200μL的L-DMEM，于96孔板最外一圈孔加入200μLPBS，贴壁生长后，继续用完全培养基培养，24h后进行检测，每孔分别加入5g/L的MTT溶液20μL，并于培养箱内37℃条件下避光培养4h后，去除上清，每孔加入二甲基亚砜溶液150μL，用微孔板检测仪测定各孔在570nm波长处的吸光度值(A值)，计算各组10孔吸光度值的平均值及其增殖活性，结果见表3。
表3不同的保护液保存的宫内膜干细胞的增殖活性验结果
由表3可知，实施例9-11提供的保护液保存的宫内膜干细胞的增殖活性显著地高于对照例8-10，而实施例10的保护液保持的宫内膜干细胞的增殖活性最高，证明当在宫内膜干细胞保护液中加入0.5份的超氧化物歧化酶、5份的LpxC-1和1份的柠檬酸锌的混合物时，宫内膜干细胞的增殖活性最高，当替换或删除其中任一成分时都会降低冻存复苏后的宫内膜干细胞的增殖活性。
试验例4污染率试验
将宫内膜干细胞分为6组，将其分别浸没在实施例12-14和对照例11-13的保护液中，在温度为-80℃条件下保存12天，将保存的细胞消化处理后用流式细胞仪计数检测细胞污染的数量，并计算污染率(％)，结果如表4所示。
表4不同的保护液保存的宫内膜干细胞的污染率试验结果
由表4可知，实施例12-14的保护液保存的宫内膜干细胞的污染率显著低于对照例11-13组的保护液，而实施例13的保护液中的宫内膜干细胞的污染率最低，抗污染效果最好，证明当在保护液中加入磷酸氢二钾、妥布霉素和甘油的混合物时，能够提高其抗污染能力，当删除或替换其中任一成分，冻存复苏后的宫内膜干细胞的污染率将显著地提升。

Claims (10)

1.一种宫内膜干细胞保护液，其特征在于，所述保护液包括如下重量份的各成分：
1-5份的肝素钙、20-40份的低分子右旋糖苷、1-2份的罂粟碱、5-10份的海藻糖、800-1000份的水和4-6份的中药提取物；
所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
2.权利要求1所述的宫内膜干细胞保护液，其特征在于，所述中药提取物由如下重量份的成分制备而成：
3.如权利要求1所述的宫内膜干细胞保护液，其特征在于，所述中药提取物的提取方法包括如下步骤:
1)取配方量的青叶胆洗净、粉碎，放置于50-70℃温水中减压浸提两次，每次浸提1-2h，青叶胆与50-70℃温水的固液比为1:10-12，浸提真空度为0.7-0.9Mpa，合并各次浸提液，得青叶胆浸提液；
2)取配方量的香附、蔓荆子和薤白放置于浓度为40-60％的乙醇溶液中超声30-40min，香附、蔓荆子和薤白的总重量与40-60％的乙醇溶液的固液比为1:40-60，超声频率为40-60KHz，得超声提取液；
3)将步骤1)获得的青叶胆浸提液与步骤2)获得的超声提取液合并，混合均匀，浓缩干燥至粉末，即得中药提取物。
4.如权利要求1所述的宫内膜干细胞保护液，其特征在于，所述保护液还包括重量份数为4-10份的维生素B6、2-4份的氯化镁和10-20份的N-乙酰半胱氨酸。
5.如权利要求1所述的宫内膜干细胞保护液，其特征在于，所述保护液还包括重量份数为0.4-0.6份的超氧化物歧化酶、3-7份的LpxC-1和0.8-1.2份的柠檬酸锌。
6.如权利要求1所述的宫内膜干细胞保护液，其特征在于，所述保护液还包括重量份数为4-8份的磷酸氢二钾、1-5份的妥布霉素和0.2-1份的甘油。
7.一种权利要求1所述的宫内膜干细胞保护液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
S1：取1/2配方量的水，将配方量的肝素钙以4-8s/d的速度加入搅拌状态的水中，滴加完毕后继续以400-500r/min的速度搅拌25min，用细菌过滤器过滤，得肝素钙水溶液；
S2：将配方量的低分子右旋糖苷、罂粟碱和海藻糖放置于剩余配方量的水中以800-1000r/min的速度搅拌4-6min，用细菌过滤器过滤，获得混合水溶液；
S3：将步骤S1获得的肝素钙水溶液和步骤S2获得的混合水溶液混合均匀后加入配方量的中药提取物，再次混合均匀，冰水浴降至0℃，即得。
8.权利要求1-7任一所述的宫内膜干细胞保护液在保存宫内膜干细胞中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，每mL所述保护液中保存的宫内膜干细胞的数量为7～9×105个。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述保护液的工作温度为-20～-80℃。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112655700A (zh) * 2020-12-23 2021-04-16 上海拜羡生物科技有限公司 冻存液在胆囊干细胞中的应用及胆囊干细胞的复苏方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1283670A4 (en) * 2000-05-16 2003-09-17 Gen Hospital Corp MICROINJECTION OF COLD PROTECTING AGENTS FOR CELL PRESERVATION
CN101869098A (zh) * 2009-04-27 2010-10-27 上海蓝盎电子科技发展有限公司 含中草药成分的病理组织学样本保存处理液
CN104839146A (zh) * 2015-05-29 2015-08-19 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 组合物及其用途、胎盘保存制剂及其制备方法
CN107114355A (zh) * 2016-08-01 2017-09-01 北京世纪劲得生物技术有限公司 一种脂肪细胞保护液及其制备方法
CN107668024A (zh) * 2016-08-01 2018-02-09 北京世纪劲得生物技术有限公司 一种骨髓干细胞保护液及其制备方法
CN107668025A (zh) * 2016-08-01 2018-02-09 北京臻惠康生物科技有限公司 一种宫内膜干细胞保护液
CN108142412A (zh) * 2017-12-27 2018-06-12 重庆斯德姆生物技术有限公司 一种免疫细胞冻存液及冻存方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1283670A4 (en) * 2000-05-16 2003-09-17 Gen Hospital Corp MICROINJECTION OF COLD PROTECTING AGENTS FOR CELL PRESERVATION
CN101869098A (zh) * 2009-04-27 2010-10-27 上海蓝盎电子科技发展有限公司 含中草药成分的病理组织学样本保存处理液
CN104839146A (zh) * 2015-05-29 2015-08-19 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 组合物及其用途、胎盘保存制剂及其制备方法
CN107114355A (zh) * 2016-08-01 2017-09-01 北京世纪劲得生物技术有限公司 一种脂肪细胞保护液及其制备方法
CN107668024A (zh) * 2016-08-01 2018-02-09 北京世纪劲得生物技术有限公司 一种骨髓干细胞保护液及其制备方法
CN107668025A (zh) * 2016-08-01 2018-02-09 北京臻惠康生物科技有限公司 一种宫内膜干细胞保护液
CN108142412A (zh) * 2017-12-27 2018-06-12 重庆斯德姆生物技术有限公司 一种免疫细胞冻存液及冻存方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112655700A (zh) * 2020-12-23 2021-04-16 上海拜羡生物科技有限公司 冻存液在胆囊干细胞中的应用及胆囊干细胞的复苏方法
CN112655700B (zh) * 2020-12-23 2022-09-13 上海拜羡生物科技有限公司 冻存液在胆囊干细胞中的应用及胆囊干细胞的复苏方法

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