CN107988148A - 一种子宫内膜干细胞的分离培养方法 - Google Patents

一种子宫内膜干细胞的分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种子宫内膜干细胞分离培养方法，所述方法包括以下步骤：1)采集经血样本；2)子宫内膜干细胞的分离；3)子宫内膜干细胞的原代培养。该方法分离得到的子宫内膜干细胞纯度高，原代培养的细胞增殖活性高，传代培养的细胞活率高，污染率低。

Description

一种子宫内膜干细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种子宫内膜干细胞的分离培养方法。
背景技术
人类子宫内膜功能层在月经周期手提内激素的作用发生周期性的增生和脱落，早年即有学者提出子宫内膜显著的增生能力可能源于子宫内膜干细胞的存在，大量的临床观察和基础研究均显示，子宫内膜干细胞可能成为子宫内膜过薄和内膜病变患者进行内膜修复替代治疗的手段，同时可为内膜异位症、子宫内膜癌等提供新的研究思路；子宫作为人体中具有超强再生能力的器官，其子宫内膜在么个月经周期中会增长约5-7cm，而以这种增长速率，子宫内膜会在妇女育龄期经过500次左右有规律的脱落和再生过程，同时，经血的获得不具有侵入性，不会对供者造成伤害，来源广泛，且对其研究不会涉及伦理道德和法律问题，此外，还具有采集方便等特性，因此成为寻找子宫内膜干细胞的新来源及提高临床应用效果的研究热点。
使用常规手段分离经血内的子宫内膜干细胞主要存在以下问题：1分离液使用量大，离心后部分红细胞仍然悬浮在分离液中，致使收集到的细胞中混杂较多的红细胞，制得的子宫内膜干细胞纯度差；2.红细胞层内也混杂有子宫内膜干细胞，致使细胞收率较低；3.较长时间的离心对细胞的活性造成损伤；4.经血样本向本外周血样本较为复杂，存在较多粘液物质及大量血凝块，杂质较多；5.子宫内膜干细胞使用培养基成分较多，价格昂贵，且体外培养10代以上，细胞容易出现衰老、退化的现象，增殖效率低，且在培养基中添加较多的细胞生长因子，会促进干细胞分化，对于维持其感性与稳定性不利，影响干细胞储存于研究质量。
发明内容
针对以上人子宫内膜干细胞分离过程中存在的大量问题，本发明提供了一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，该方法分离培养的子宫内膜干细胞纯度高，传代培养15代后细胞活率依然高达94.5％，同时，该方法培养得到的子宫内膜干细胞污染率低，多次传代后的干细胞具有多向分化的潜能。
本发明具体技术方案如下：
一种子宫内膜干细胞分离培养方法，该方法包括以下步骤：
1)采集经血样本；
2)子宫内膜干细胞的分离：取100-200重量份的步骤1)采集的经血样本，与20-40重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，放置于多功能振荡器上振摇20-30min，加入淋巴细胞分离液，离心，得到四层分离液，吸出底层分离液，即得A液，去除顶层透明液体，再加入1-2重量份的HES和1.5-2.5重量份的消化酶混合均匀，将混合液倒入离心管中，将离心管放置于离心机中离心6-8min，弃上清，取沉淀，即得B液，将A液和B液用同体积的PBS缓冲液洗涤，过200μm细胞筛网，收集子宫内膜干细胞；
3)子宫内膜干细胞的原代培养：将步骤2)分离得到的子宫内膜干细胞进行原代培养，得原代培养细胞。
其中，HES为羟乙基淀粉，消化酶为任意一种消化酶，如胃蛋白酶等。
进一步改进，步骤3)具体包括以下步骤：
3)子宫内膜干细胞的培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养的前两天每天向培养基中添加浓度为2％-5％的海藻糖、5％-10％的腺嘌呤和5％-10％的酪氨酸，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括2％-5％的甘露醇、10％-14％的氯化镁、2％-5％的SOD和1％-2％的NAC的MEM培养基。
其中，接种密度为1×106，SOD为超氧化物歧化酶，NAC为N-乙酰半胱氨酸，MEM培养基包括如下成分：200mg/L的无水氯化钙、93.5mg/L的无水硫酸镁、400mg/L的氯化钾、6800mg/L的氯化钠、115mg/L的无水磷酸二氢钠、126mg/L的L-盐酸精氨酸、31.4mg/L的L-盐酸胱氨酸、42mg/L的L-盐酸组氨酸、52mg/L的L-异亮氨酸、52mg/L的L-亮氨酸、73mg/L的L-盐酸赖氨酸、15mg/L的L-甲硫氨酸、32mg/L的L-苯丙氨酸、40mg/L的L-苏氨酸、10mg/L的L-色氨酸、0.02mg/L的生物素、36mg/L的L-酪氨酸、40mg/L的L-缬氨酸、1.8mg/L的酒石酸胆碱、1mg/L的叶酸、2mg/L的肌醇、1mg/L的烟氨酸、1mg/L的D-泛酸钙、1mg/L的盐酸吡哆辛、0.1mg/L的核黄素、1mg/L的盐酸硫胺、1000mg/L的葡萄糖、75mg/L的丁二酸、100mg/L的丁二酸钠.6H2O，6mg/L的酚红、60mg/L的卡那霉素。
本发明通过以上方法对细胞进行原代培养，可以显著的提高细胞的增殖活性，并可进行多次传代。
进一步改进，步骤3)所述的原代培养方法为：将步骤2)制得的子宫内膜干细胞接种于原代培养基上，将原代培养基放置于光照强度为5000-8000lx的条件下照射5-10min，再将培养基放置于培养箱中培养；其中，原代培养基在光照照射前添加浓度为10-20ng/mL的生育酚琥珀酸单酯、5-15ng/mL的聚乳酸、20-40ng/mL的肝素和12-16ng/mL的唑菌胺酯。
本发明通过限定原代培养的方法，可显著的降低原代培养细胞的污染率，为后续的传代培养提供良好的基础。
进一步改进，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
4)细胞传代培养：将原代培养得到的原代培养细胞接种于传代培养基上进行传代培养，其中，传代培养方法为：将传代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养6-7天后，更换培养基，弃除未贴壁细胞，培养至第5代后，每天向传代培养基中加入20-40重量份的增活剂，待细胞生长达到90-95％融合时用质量浓度为3％的胰蛋白酶消化收集细胞，即得传代培养细胞。
进一步改进，增活剂由以下重量份的组分组成：5-10的D-半乳糖、1-2的NGF、2-5的维生素C、2-5的HEPES、5-8的罂粟碱和5-10的氯化钠。
其中，传代培养的接种密度为1×106，NGF为神经生长因子，HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，本发明通过以上方法对细胞进行传代培养，有利于子宫内膜干细胞数量的增长，得到的干细胞数量多，传代15次后，干细胞依然保持较高的活率。
进一步改进，多功能振荡器的震荡速度为30-50r/min，所述离心机的离心速度为1000-1500r/min。
进一步改进，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
5)冻存：用2-5℃的冻存液重悬步骤4)获得的传代培养细胞，使细胞的密度为1-2×107/ml，放入冻存盒中采用程序降温，最后转入-196℃液氮保存。
进一步改进，程序降温包括如下步骤：4℃0.5-1h，-10℃1-2h，-30℃0.5-1h，-80℃12h。
本发明通过以上冻存方法，可延长细胞的保质期，使其在保存96个月后，细胞的存活率依然符合要求。
本发明提供了一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，该方法分离得到的子宫内膜干细胞纯度高，原代培养的细胞增殖活性高，传代培养的细胞活率高，污染率低。
实施例1
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)采集经血样本；
2)子宫内膜干细胞的分离：取100重量份的步骤1)采集的经血样本，与20重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，放置于多功能振荡器上振摇20min，取出，放置于多功能振荡器上振摇20min，加入淋巴细胞分离液，离心，得到四层分离液，吸出底层分离液，即得A液，去除顶层透明液体，再加入1重量份的HES和1.5重量份的消化酶混合均匀，将混合液倒入离心管中，将离心管放置于离心机中离心6min，弃上清，取沉淀，即得B液，将A液和B液用同体积的PBS缓冲液洗涤，过200μm细胞筛网，收集子宫内膜干细胞；
3)子宫内膜干细胞的原代培养：将步骤2)分离得到的子宫内膜干细胞进行原代培养，得原代培养细胞。
多功能振荡器的震荡速度为30r/min，所述离心机的离心速度为1000r/min。
实施例2
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)采集经血样本；
2)子宫内膜干细胞的分离：取150重量份的步骤1)采集的经血样本，与30重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，放置于多功能振荡器上振摇25min，取出，放置于多功能振荡器上振摇25min，加入淋巴细胞分离液，离心，得到四层分离液，吸出底层分离液，即得A液，去除顶层透明液体，再加入1.5重量份的HES和2重量份的消化酶混合均匀，将混合液倒入离心管中，将离心管放置于离心机中离心7min，弃上清，取沉淀，即得B液，将A液和B液用同体积的PBS缓冲液洗涤，过200μm细胞筛网，收集子宫内膜干细胞；
3)子宫内膜干细胞的原代培养：将步骤2)分离得到的子宫内膜干细胞进行原代培养，得原代培养细胞。
多功能振荡器的震荡速度为40r/min，所述离心机的离心速度为1200r/min。
实施例3
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)采集经血样本；
2)子宫内膜干细胞的分离：取200重量份的步骤1)采集的经血样本，与40重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，放置于多功能振荡器上振摇30min，取出，放置于多功能振荡器上振摇30min，加入淋巴细胞分离液，离心，得到四层分离液，吸出底层分离液，即得A液，去除顶层透明液体，再加入2重量份的HES和2.5重量份的消化酶混合均匀，将混合液倒入离心管中，将离心管放置于离心机中离心8min，弃上清，取沉淀，即得B液，将A液和B液用同体积的PBS缓冲液洗涤，过200μm细胞筛网，收集子宫内膜干细胞；
3)子宫内膜干细胞的原代培养：将步骤2)分离得到的子宫内膜干细胞进行原代培养，得原代培养细胞。
多功能振荡器的震荡速度为50r/min，所述离心机的离心速度为1500r/min。
实施例4
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括实施例2所述的各步骤，区别之处在于，步骤3)具体包括以下步骤：
3)细胞原代培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养的前两天每天向培养基中添加浓度为2％的海藻糖、5％的腺嘌呤和5％的酪氨酸，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括2％的甘露醇、10％的氯化镁、2％的SOD和1％的NAC的MEM培养基。
实施例5
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括实施例2的所述各步骤，区别之处在于，步骤3)具体包括以下步骤：
3)细胞原代培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养的前两天每天向培养基中添加浓度为3％的海藻糖、8％的腺嘌呤和8％的酪氨酸，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括3％的甘露醇、12％的氯化镁、4％的SOD和1.5％的NAC的MEM培养基。
实施例6
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括实施例2的所述各步骤，区别之处在于，步骤3)具体包括以下步骤：
3)细胞原代培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养的前两天每天向培养基中添加浓度为5％的海藻糖、10％的腺嘌呤和10％的酪氨酸，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括5％的甘露醇、14％的氯化镁、5％的SOD和2％的NAC的MEM培养基。
实施例7
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括实施例4所述各步骤，区别之处在于，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
4)细胞传代培养：将原代培养得到的原代培养细胞接种于传代培养基上进行传代培养，其中，传代培养方法为：将传代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养6天后，更换培养基，弃除未贴壁细胞，培养至第5代后，每天向传代培养基中加入20重量份的增活剂，待细胞生长达到90-95％融合时用质量浓度为3％的胰蛋白酶消化收集细胞，即得传代培养细胞。
其中，增活剂由以下重量份的组分组成：5的D-半乳糖、1的NGF、2的维生素C、2的HEPES、5的罂粟碱和5-的氯化钠。
实施例8
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括实施例4所述各步骤，区别之处在于，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
4)细胞传代培养：将原代培养得到的原代培养细胞接种于传代培养基上进行传代培养，其中，传代培养方法为：将传代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养6.5天后，更换培养基，弃除未贴壁细胞，培养至第5代后，每天向传代培养基中加入30重量份的增活剂，待细胞生长达到90-95％融合时用质量浓度为3％的胰蛋白酶消化收集细胞，即得传代培养细胞。
其中，增活剂由以下重量份的组分组成：8的D-半乳糖、1.5的NGF、3.5的维生素C、3.5的HEPES、6.5的罂粟碱和8的氯化钠。
实施例9
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括实施例4所述各步骤，区别之处在于，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
4)细胞传代培养：将原代培养得到的原代培养细胞接种于传代培养基上进行传代培养，其中，传代培养方法为：将传代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养7天后，更换培养基，弃除未贴壁细胞，培养至第5代后，每天向传代培养基中加入40重量份的增活剂，待细胞生长达到90-95％融合时用质量浓度为3％的胰蛋白酶消化收集细胞，即得传代培养细胞。
其中，增活剂由以下重量份的组分组成：10的D-半乳糖、2的NGF、5的维生素C、5的HEPES、8的罂粟碱和10的氯化钠。
实施例10
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括实施例5所述各步骤，区别之处在于，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
步骤3)所述的原代培养方法为：将步骤2)制得的子宫内膜干细胞接种于原代培养基上，将原代培养基放置于光照强度为5000lx的条件下照射5min，再将培养基放置于培养箱中培养；其中，原代培养基在光照照射前添加浓度为10ng/mL的生育酚琥珀酸单酯、5ng/mL的聚乳酸、20ng/mL的肝素和12ng/mL的唑菌胺酯。
实施例11
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括实施例5所述各步骤，区别之处在于，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
步骤3)所述的原代培养方法为：将步骤2)制得的子宫内膜干细胞接种于原代培养基上，将原代培养基放置于光照强度为6000lx的条件下照射8min，再将培养基放置于培养箱中培养；其中，原代培养基在光照照射前添加浓度为15ng/mL的生育酚琥珀酸单酯、10ng/mL的聚乳酸、30ng/mL的肝素和14ng/mL的唑菌胺酯。
实施例12
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括实施例5所述各步骤，区别之处在于，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
步骤3)所述的原代培养方法为：将步骤2)制得的子宫内膜干细胞接种于原代培养基上，将原代培养基放置于光照强度为8000lx的条件下照射10min，再将培养基放置于培养箱中培养；其中，原代培养基在光照照射前添加浓度为20ng/mL的生育酚琥珀酸单酯、15ng/mL的聚乳酸、40ng/mL的肝素和16ng/mL的唑菌胺酯。
对照例1
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例1的区别之处在于，用磷酸盐缓冲液代替氯化钠注射液。
对照例2
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例1的区别之处在于，步骤2)的具体方法如下：
2)子宫内膜干细胞的分离：取100-200重量份的步骤1)采集的经血样本，与20-40重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，加入淋巴细胞分离液，离心，得到四层分离液，吸出底层分离液，即得A液，去除顶层透明液体，再加入1-2重量份的HES和1.5-2.5重量份的消化酶混合均匀，将混合液倒入离心管中，将离心管放置于离心机中离心6-8min，弃上清，取沉淀，即得B液，将A液和B液用同体积的PBS缓冲液洗涤，过200μm细胞筛网，收集子宫内膜干细胞；
3)子宫内膜干细胞的原代培养：将步骤2)分离得到的子宫内膜干细胞进行原代培养，得原代培养细胞。
对照例3
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例1的区别之处在于，步骤2)的具体方法如下：
2)子宫内膜干细胞的分离：取100-200重量份的步骤1)采集的经血样本，与20-40重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，放置于多功能振荡器上振摇20-30min，离心，得到四层分离液，吸出底层分离液，即得A液，去除顶层透明液体，再加入1-2重量份的HES和1.5-2.5重量份的消化酶混合均匀，将混合液倒入离心管中，将离心管放置于离心机中离心6-8min，弃上清，取沉淀，即得B液，将A液和B液用同体积的PBS缓冲液洗涤，过200μm细胞筛网，收集子宫内膜干细胞；
3)子宫内膜干细胞的原代培养：将步骤2)分离得到的子宫内膜干细胞进行原代培养，得原代培养细胞。
对照例4
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例1的区别之处在于，步骤2)的具体方法如下：
2)：子宫内膜干细胞的分离：取100-200重量份的步骤1)采集的经血样本，与20-40重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，放置于多功能振荡器上振摇20-30min，加入淋巴细胞分离液，离心，得到四层分离液，吸出底层分离液，即得A液，去除顶层透明液体，再加入1-2重量份的HES和1.5-2.5重量份的消化酶混合均匀，将混合液倒入离心管中，将离心管放置于离心机中离心6-8min，弃上清，取沉淀，即得B液，将A液和B液混合后过200μm细胞筛网，收集子宫内膜干细胞；
3)子宫内膜干细胞的原代培养：将步骤2)分离得到的子宫内膜干细胞进行原代培养，得原代培养细胞。
对照例5
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例4的区别之处在于，
3)细胞原代培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括2％的甘露醇、10％的氯化镁、2％的SOD和1％的NAC的MEM培养基。
对照例6
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例4的区别之处在于，
3)细胞原代培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养的后两天每天向培养基中添加浓度为2％的海藻糖、5％的腺嘌呤和5％的酪氨酸，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括2％的甘露醇、10％的氯化镁、2％的SOD和1％的NAC的MEM培养基。
对照例7
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例4的区别之处在于，
3)细胞原代培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养的前两天每天向培养基中添加浓度为5％的半胱氨酸、2％的海藻糖、5％的腺嘌呤和5％的酪氨酸，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括2％的甘露醇、10％的氯化镁、2％的SOD和1％的NAC的MEM培养基。
对照例8
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例4的区别之处在于，
3)细胞原代培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养的前两天每天向培养基中添加浓度为5％的腺嘌呤和5％的酪氨酸，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括2％的甘露醇、10％的氯化镁、2％的SOD和1％的NAC的MEM培养基。
对照例9
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例4的区别之处在于，
3)细胞原代培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养的前两天每天向培养基中添加浓度为2％的海藻糖、5％的腺嘌呤和5％的酪氨酸，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括10％的氯化镁、2％的SOD和1％的NAC的MEM培养基。
对照例10
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例8的区别之处在于，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
4)细胞传代培养：将原代培养得到的原代培养细胞接种于传代培养基上进行传代培养，其中，传代培养方法为：将传代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养6.5天后，更换培养基，弃除未贴壁细胞，培养至第4代后，每天向传代培养基中加入30重量份的增活剂，待细胞生长达到90-95％融合时用质量浓度为3％的胰蛋白酶消化收集细胞，即得传代培养细胞。
对照例11
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例8的区别之处在于，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
4)细胞传代培养：将原代培养得到的原代培养细胞接种于传代培养基上进行传代培养，其中，传代培养方法为：将传代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养6.5天后，更换培养基，弃除未贴壁细胞，培养至第6代后，每天向传代培养基中加入30重量份的增活剂，待细胞生长达到90-95％融合时用质量浓度为3％的胰蛋白酶消化收集细胞，即得传代培养细胞。
对照例12
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例8的区别之处在于，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
4)：细胞传代培养：将原代培养得到的原代培养细胞接种于传代培养基上进行传代培养，其中，传代培养方法为：将传代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养6.5天后，更换培养基，培养至第5代后，每天向传代培养基中加入30重量份的增活剂，待细胞生长达到90-95％融合时用质量浓度为3％的胰蛋白酶消化收集细胞，即得传代培养细胞。
对照例13
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例14的区别之处在于，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
步骤3)所述的原代培养方法为：将步骤2)制得的子宫内膜干细胞接种于原代培养基上，再将培养基放置于培养箱中培养；其中，原代培养基在光照照射前添加浓度为15ng/mL的生育酚琥珀酸单酯、10ng/mL的聚乳酸、30ng/mL的肝素和14ng/mL的唑菌胺酯。
对照例14
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例14的区别之处在于，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
步骤3)所述的原代培养方法为：将步骤2)制得的子宫内膜干细胞接种于原代培养基上，将原代培养基放置于光照强度为6000lx的条件下照射8min，再将培养基放置于培养箱中培养。
试验例1细胞表面免疫表型遗传试验
分别取实施例1-3、对照例1-4提供的子宫内膜干细胞培养方法培养得到的干细胞和阳性对照品，阳性对照品采用CN105112358提供的方法培养得到的子宫内膜干细胞，调整细胞密度至1×106cells/ml，取实施例1-3、对照例1-4和阳性对照品的细胞混悬液各100μl，分别加入单克隆流式抗体CD29-FITC、CD90-FITC和CD73-FITC，混匀后于4℃避光孵育30min，然后用PBS缓冲液洗涤2次，再加入培养基重悬，然后分别用流式细胞仪检测实施例1-3、对照例1-4和阳性对照品的表面标志物的表达情况，结果见表1。
表1各组子宫内膜干细胞表面标志物检测结果
与实施例1相比，对照例1用磷酸盐缓冲液代替氯化钠注射液，对照例2删除了多功能振荡器上振摇的步骤，对照例3未添加淋巴细胞分离液，对照例4删除了用PBS缓冲液洗涤的步骤。
由表1可知，采用本发明实施例1-3提供的分离方法制得的子宫内膜干细胞对CD29、CD90和CD73的表达高于对照例1-4和阳性对照品，证明本发明提供的方法分离得到的子宫内膜干细胞数量多，当改变本发明提供的分离方法中的某个步骤或因素时，分离出的子宫内膜干细胞的数量降低。
试验例2红细胞去除率试验
取实施例1-3、对照例1-4和阳性对照品分离前的经血，阳性对照品采用CN103966162提供的方法培养，使用全自动血细胞分析仪对其进行红细胞计数，再取实施例1-3、对照例1-4和阳性对照品提供的方法的分离培养方法获得子宫内膜干细胞，使用同样的方法对获得的子宫内膜干细胞进行红细胞计数，计算红细胞去除率，结果见表2。
红细胞去除率＝(分离前红细胞数-分离后红细胞数)/分离前红细胞数×100％。
表2各组子宫内膜干细胞的红细胞去除率结果
由表2可知，实施例1-3提供的方法制备的子宫内膜干细胞细胞的红细胞去除率显著的高于对照例1-4和阳性对照品，证明本发明提供的子宫内膜干细胞的分离方法能够显著的提高红细胞的去除率，进而提高子宫内膜干细胞的纯度，当改变本发明提供的分离方法中的某个步骤或因素时，红细胞去除率均会大幅度下降，而实施例1的红细胞去除率显著高于实施例2-3，证明实施例1提供的方法制得的子宫内膜干细胞的红细胞去除率最高。
试验例3子宫内膜干细胞增殖活性试验
分别以实施例4-6和对照例5-9的方法进行子宫内膜干细胞的分离培养，得到原代子宫内膜干细胞，分别将各组原代子宫内膜干细胞以1×106个/T75瓶接种，加入完全培养基培养，再以每孔5000个细胞接种于96孔板中，每孔接种200μL的14L-DMEM，于96孔板最外一圈孔加入200μLPBS，贴壁生长后，对照组继续用完全培养基培养，24h后进行检测，每孔分别加入5g/L的MTT溶液20μL，并于培养箱内37℃条件下避光培养4h后，去除上清，每孔加入二甲基亚砜溶液150μL，用微孔板检测仪测定各孔在570nm波长处的吸光度值(A值)，计算各组10孔吸光度值的平均值及其增殖活性，结果见表3。
表3子宫内膜干细胞的增殖活性检测结果
与实施例4相比，对照例5的前两天未添加海藻糖、腺嘌呤和酪氨酸，对照例6在后两天添加了海藻糖、腺嘌呤和酪氨酸，对照例7添加半胱氨酸，对照例8删除了海藻糖，对照例9删除了甘露醇。
由表3可知，实施例4-6的方法分离培养得到的子宫内膜干细胞具有较高的增殖活性，显著高于对照例5-9，说明本发明提供的分离培养方法得到的子宫内膜干细胞的增殖能力强，当增加、删除或替换本方法中的某个步骤或成分时，都会导致子宫内膜干细胞增殖活性的降低，并且，实施例4的增殖活性远高于实施例5-6，证明实施例4提供的方法能够显著增强子宫内膜干细胞增殖能力。
试验例4子宫内膜干细胞活率试验
分别以实施例7-9和对照例10-12的方法进行子宫内膜干细胞的传代培养，取传代15代的子宫内膜干细胞，用台盼蓝法测定细胞活率，结果见表4。
细胞活率＝(细胞总数-死细胞数)/细胞总数×100％。
表4各组子宫内膜干细胞细胞活率的检测结果
与实施例8相比，对照例10是在传代4次后每天向传代培养基中加入增活剂，对照例11是在传代6次后每天向传代培养基中加入增活剂，对照例12未弃除未贴壁细胞。
由表4可知，实施例7-9提供的传代培养的方法传代培养15代后的子宫内膜干细胞依然具有较高的活率，远远的高于对照例10-12，证明本发明提供的方法在传代培养15代后得到的子宫内膜干细胞依然具有较高的细胞活率，当在不同的传代次数后加入增活剂或未弃除未贴壁细胞，均会降低子宫内膜干细胞的细胞活率。
试验例5污染率考察
使用实施例10-12和对照例13-14的方法培养子宫内膜干细胞，用菌落计数法分别检测细胞被污染的数量，计算细胞的污染率，结果见表5。
表5各组子宫内膜干细胞的污染率(％)
与实施例11相比，对照例13删除光照步骤，对照例14未添加生育酚琥珀酸单酯、聚乳酸、肝素和唑菌胺酯。
由表5可知，实施例10-12的方法培养的子宫内膜干细胞的污染率远远低于对照例13-14，证明本发明提供的方法能够显著的降低子宫内膜干细胞的污染率，且实施例11的子宫内膜干细胞污染率最低，说明使用实施例11的培养方法降低污染率的效果最好。

Claims (8)

1.一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)采集经血样本；
2)子宫内膜干细胞的分离：取100-200重量份的步骤1)采集的经血样本，与20-40重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，放置于多功能振荡器上振摇20-30min，加入淋巴细胞分离液，离心，得到四层分离液，吸出底层分离液，即得A液，去除顶层透明液体，再加入1-2重量份的HES和1.5-2.5重量份的消化酶混合均匀，将混合液倒入离心管中，将离心管放置于离心机中离心6-8min，弃上清，取沉淀，即得B液，将A液和B液用同体积的PBS缓冲液洗涤，过200μm细胞筛网，收集子宫内膜干细胞；
3)子宫内膜干细胞的原代培养：将步骤2)分离得到的子宫内膜干细胞进行原代培养，得原代培养细胞。
2.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤3)具体包括以下步骤：
3)子宫内膜干细胞的培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养的前两天每天向培养基中添加浓度为2％-5％的海藻糖、5％-10％的腺嘌呤和5％-10％的酪氨酸，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括2％-5％的甘露醇、10％-14％的氯化镁、2％-5％的SOD和1％-2％的NAC的MEM培养基。
3.如权利要求2所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤3)所述的原代培养方法为：将步骤2)制得的子宫内膜干细胞接种于原代培养基上，将原代培养基放置于光照强度为5000-8000lx的条件下照射5-10min，再将培养基放置于培养箱中培养；其中，原代培养基在光照照射前添加浓度为10-20ng/mL的生育酚琥珀酸单酯、5-15ng/mL的聚乳酸、20-40ng/mL的肝素和12-16ng/mL的唑菌胺酯。
4.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
4)细胞传代培养：将原代培养得到的原代培养细胞接种于传代培养基上进行传代培养，其中，传代培养方法为：将传代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养6-7天后，更换培养基，弃除未贴壁细胞，培养至第5代后，每天向传代培养基中加入20-40重量份的增活剂，待细胞生长达到90-95％融合时用质量浓度为3％的胰蛋白酶消化收集细胞，即得传代培养细胞。
5.如权利要求4所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述增活剂由以下重量份的组分组成：5-10的D-半乳糖、1-2的NGF、2-5的维生素C、2-5的HEPES、5-8的罂粟碱和5-10的氯化钠。
6.如权利要求1所述子宫内膜干细胞的分离培养方法，所述多功能振荡器的震荡速度为30-50r/min，所述离心机的离心速度为1000-1500r/min。
7.如权利要求4所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
5)冻存：用2-5℃的冻存液重悬步骤4)获得的传代培养细胞，使细胞的密度为1-2×107/ml，放入冻存盒中采用程序降温，最后转入-196℃液氮保存。
8.如权利要求7所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，所述程序降温包括如下步骤：4℃0.5-1h，-10℃1-2h，-30℃0.5-1h，-80℃12h。
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