CN106924285A - 一种胎盘间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞技术领域，特别涉及一种胎盘间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。该胎盘间充质干细胞注射液包括胎盘间充质干细胞、维生素C、二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清(FBS)、人血白蛋白、珠子参皂苷和溶媒。本发明制备的胎盘间充质干细胞制备干细胞注射液，取材方便，不违反伦理问题；本发明制备的注射液能有效的保存干细胞的活性，可直接复苏使用，不用清洗、离心，使用方便；本发明制备的注射液在回输后能促进间充质干细胞向肝细胞分化成熟，降低GVHD的发生率。

Description

一种胎盘间充质干细胞注射液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，特别涉及一种胎盘间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。
背景技术
我国乙型肝炎病毒(HBV)感染人数达1.2亿，慢性肝炎患者高达3000多万，其中乙型病毒性肝炎(乙肝)是导致肝硬化、原发性肝细胞癌(肝癌)的主要原因，每年因肝硬化、肝癌、肝功能衰竭等死亡的人数高达30～50万，严重威胁着人们的健康。对于终末期的肝炎、肝硬化，以及遗传性、代谢性肝病，原位肝移植是目前唯一确定有效的治疗手段，但肝移植术后伴有各种并发症，主要有感染并发症、排斥反应、胆道并发症、原发病复发及免疫抑制剂相关疾病等，严重影响着患者的生活质量及移植肝的长期存活率。据国内外研究报道，大约有30％～70％的肝移植受者在移植术后1年内发生过一次急性排斥反应，是导致移植物丢失的最重要的原因之一。
移植物抗宿主反应(GVHD，graft-versus-host disease)是一种特异的免疫现象，是由于移植物组织中的免疫活性细胞与免疫受抑制的、组织不相融性抗原受者的组织之间的反应。肝移植术后发生GVHD很罕见，其发生率为0.1～0.2％，显著低于骨髓移植后GVHD的发生率，但病死率极高，超过75％。目前除再次肝移植外，常规治疗方法往往疗效欠佳甚至无效，再次移植肝给患者带来了较大的经济负担和精神肉体上的痛苦。
间充质干细胞(MSCs)是多能干细胞，具有“横向分化”或“跨系分化”的能力，不仅支持造血干细胞的生长，还可以在不同诱导条件下，在体外分化为多种组织细胞。MSCs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞。随着干细胞生物学研究不断的发展，MSC具有低免疫原性和很强的免疫调节作用(能逃避免疫识别、抑制免疫应答)、炎症趋化、组织修复等生物特性，国内外研究发现，输注MSC可以提高移植术后的免疫耐受力，延长移植物的存活时间，在治疗移植物抗宿主病上也得到有效应用，尤其在肾移植、骨髓移植等免疫排斥反应治疗中已取得较好效果，但在治疗肝移植术后急性排斥反应中的应用还较少。间充质干细胞具备干细胞的特性及多向分化潜能，可向炎症或损伤部位定向迁移并抗炎或修复损伤组织，还因其低免疫原性、较强的免疫调节及抗微生物作用而成为治疗肝移植术后急性排斥反应的重要研究方向。因此，提供一种新型的能够有效治疗GVHD的干细胞制剂具有重要的医学价值。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种胎盘间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。该胎盘间充质干细胞注射液能有效的维持干细胞的活力，在回输后能促进间充质干细胞向肝细胞分化成熟，降低GVHD的发生率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种胎盘间充质干细胞注射液，包括胎盘间充质干细胞、二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清(FBS)、维生素C、珠子参皂苷、人血白蛋白和溶媒。
本发明采用人胎盘来源的间充质干细胞(hAMSCs)，具有与骨髓间充质干细胞(BMSCs)相似的表型，分化潜力大、增殖能力比BMSCs强，AMSCs低表达HLA-DR，从而说明AMSCs具有低免疫原性，用于同种异体、异种异体移植后，均不会发生免疫排斥反应，而且AMSCs无致瘤性，其取材方便、无道德伦理问题的限制，以上生物学特性用于肝移植术后移植物抗宿主病(GVHD)治疗有着重要的应用前景。
本发明在制备得到大量的hAMSCs时，将其制备成注射液，其中还添加了DMSO、FBS、维生素C、珠子参皂苷、人血白蛋白和溶媒。使hAMSCs得到较好的活性保护，提供细胞所需的能量。其中，DMSO也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。FBS为细胞提供充足的养分；维生素C可维持过氧化物酶的活性，从而保存细胞的活性；珠子参皂苷能促进间充质干细胞向肝细胞分化成熟；人血白蛋白临床注射级成分，防止细胞结团，为细胞提供营养；溶媒可为勃脉力(复方电解质溶液)或葡萄糖或生理盐水，其可保持细胞的渗透压，利于细胞的保持活性。
作为优选，每100mL胎盘间充质干细胞注射液中包括：
胎盘间充质干细胞：(0.5～l)×108个；
DMSO：0.5～lmL；
FBS：4.5mL～9mL；
维生素C：0.3～0.7g；
珠子参皂苷：2～10g；
人血白蛋白：1～5g；
溶媒：补足。
优选地，每100mL胎盘间充质干细胞注射液中包括：
胎盘间充质干细胞：1×108个；
DMSO：0.5～lmL；
FBS：4.5mL～9mL；
维生素C：0.3～0.7g；
珠子参皂苷：2～10g；
人血白蛋白：10～20mL；
溶媒：补足。
在本发明提供的一实施例中，每100mL胎盘间充质干细胞注射液中包括：
胎盘间充质干细胞：1×108个；
DMSO：1mL；
FBS：9mL；
维生素C：0.5g；
珠子参皂苷：6g；
人血白蛋白：3g；
溶媒：补足。
在本发明提供的另一实施例中，每100mL胎盘间充质干细胞注射液中包括：
胎盘间充质干细胞：1×108个；
DMSO：0.5mL；
FBS：4.5mL；
维生素C：0.3g；
珠子参皂苷：2g；
人血白蛋白：1g；
溶媒：补足。
在本发明提供的另一实施例中，每100mL胎盘间充质干细胞注射液中包括：
胎盘间充质干细胞：1×108个；
DMSO：0.75mL；
FBS：6mL；
维生素C：0.7g；
珠子参皂苷：10g；
人血白蛋白：5g；
溶媒：补足。
作为优选，溶媒为复方电解质注射液、葡萄糖注射液或生理盐水。
作为优选，复方电解质注射液为勃脉力A复方电解质注射液。
在本发明提供的实施例中，生理盐水为0.9％氯化钠注射液。
在本发明提供的实施例中，DMSO为临床注射级。
作为优选，胎盘间充质干细胞为第2～5代胎盘间充质干细胞。
优选地，胎盘间充质干细胞为第3代胎盘间充质干细胞。
本发明还提供了该胎盘间充质干细胞注射液在制备治疗移植物抗宿主反应的药物中的应用。
本发明还提供了该胎盘间充质干细胞注射液的制备方法，包括：将胎盘间充质干细胞、DMSO、FBS、维生素C、珠子参皂苷、人血白蛋白和溶媒混匀，得到胎盘间充质干细胞注射液。
在本发明提供的实施例中，该胎盘间充质干细胞注射液的制备方法包括：将胎盘间充质干细胞于-198℃冻存，使用时于37℃恒温水浴复苏，直接将复苏的细胞液注入混合液(维生素C、人血白蛋白、珠子参皂苷和溶媒)混匀，总体积为100mL，得到胎盘间充质干细胞注射液。
本发明提供了一种胎盘间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。该胎盘间充质干细胞注射液包括胎盘间充质干细胞、DMSO、FBS、维生素C、珠子参皂苷、人血白蛋白及溶媒。本发明具有如下有益效果之一：
1、本发明采用胎盘间充质干细胞制备干细胞注射液，取材方便，不违反伦理问题；
2、本发明制备的注射液能有效的保存干细胞的活性，可直接复苏使用，不用清洗、离心，使用方便；
3、本发明制备的注射液在回输后能促进间充质干细胞向肝细胞分化成熟，降低GVHD的发生率。
附图说明
图1示胎盘间充质干细胞的鉴定结果；其中1-1示P3代细胞培养72h后在显微镜下放大40倍的图片；1-2示P3代细胞培养72h后在显微镜下放大100倍的图片；
图2示胎盘间充质干细胞中CD105、CD90、CD73、CD45、CD34、CD19、CD11b和HLA-DR的流式鉴定结果；其中，2-1～2-10示阴性对照组；2-11～2-20示样品组；
图3示胎盘间充质干细胞成骨和成脂分化的染色鉴定结果；3-1示P3代胎盘间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大40倍的图片；3-2示P3代胎盘间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大100倍的图片；3-3示P3代胎盘间充质干细胞诱导分化为成脂细胞后在显微镜下放大40倍的图片；3-4示P3代胎盘间充质干细胞诱导分化为成脂细胞后在显微镜下放大100倍的图片。
具体实施方式
本发明公开了一种胎盘间充质干细胞注射液及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为胰岛、神经、血管内皮、骨、软骨、肌肉、肝脏、心肌等多种组织细胞。
移植物抗宿主病(GVHD)是肝移植术后发生的以发热、皮疹、腹泻以及骨髓抑制等为主要表现的全身性免疫疾病，患者最终因全身感染或骨髓衰竭而死亡。
本发明提供的胎盘间充质干细胞注射液及其制备方法和应用中所用原料药或辅料均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1胎盘间充质干细胞的制备方法
1、胎盘间充质干细胞原代分离
在无菌条件下，取产后弃置的新鲜胎盘，剥离胎盘，用PBS缓冲溶液冲洗，将胎盘组织剪成5×5cm2，加入3-5倍体积的0.25％胰酶消化，置于200r/min 37℃恒温摇床上，消化30min，每隔10min剧烈摇晃数次，以去除上皮细胞。
消化完成后，将其转移至储液瓶中，加入150mL PBS缓冲溶液，剧烈摇动，重复此操作2次。将胎盘组织转移至小烧杯中，剪碎至1mm3。再转移至储液瓶中，加入20mL 0.5％I型胶原酶以及完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)，使胶原酶终浓度为0.1-0.2％。置于37℃，250r/min的恒温摇床中，直到组织块基本融化。用PBS缓冲溶液稀释消化后的组织液，1500r/min，离心5min，弃掉上清，用PBS缓冲溶液重悬沉淀，采用100μm过滤筛网过滤，滤液1500r/min，离心5min，获得胎盘间充质干细胞。
用完全培养基重悬，按(0.3～1)×106cells/mL接种于10cm培养皿中，每皿添加100μL 1μg/mL EGF。置于CO2培养箱中培养，48h后换液，后续每2～3d换一次培养基。
2、人胎盘间充质干细胞传代培养
待原代人胎盘间充质干细胞生长至80％融合时，即用0.25％的EDTA-Trypsin消化，进行传代培养，传至2-5代后，观察细胞生长状态，用胰酶消化后使用PBS缓冲溶液洗涤，离心收集。
3、人胎盘间充质干细胞的鉴定
鉴定上述制备的第2代胎盘间充质干细胞，包括：
1)显微镜下观察
显微镜下观察，可以看出3d后的细胞已经形成较典型的胎盘间充质样，并有明显的贴壁现象，如图1所示。
2)流式细胞仪检测
取第2代胎盘间充质干细胞进行流式细胞仪检测，表达CD105、CD73和CD90(表达量高于90％)，CD45、CD34、CD19、CD11b和HLA-DR(表达量低于2％)，检测结果如图2所示。
3)诱导分化培养
取第3代胎盘间充质干细胞进行体外诱导分化为成脂肪细胞和成骨细胞，染色观察，可看出本发明制备的胎盘间充质干细胞经过适宜条件可向成脂肪细胞和成骨细胞分化，证明本发明制备的胎盘间充质干细胞具有多向分化能力，如图3所示。
以上鉴定结果参照“国际细胞治疗协会(ISCT)”所定制的标准，可证明本发明所制备的细胞具备间充质干细胞的特性。
实施例2胎盘间充质干细胞注射液的制备
配制100mL干细胞注射液：白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液15mL(质量体积比终浓度为3％)、维生素C 0.5g(质量体积比终浓度为0.5％)、珠子参皂苷6g(质量体积比终浓度为6％)和0.9％氯化钠注射液75mL混匀，将胎盘间充质干细胞(复苏后细胞悬液为10mL，含DMSO 1mL，FBS 9mL，细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬混匀，制备完毕。
上述制备的胎盘间充质干细胞注射液留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。
实施例3胎盘间充质干细胞注射液的制备
配制100mL干细胞注射液：白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液5mL(质量体积比终浓度为1％)、维生素C 0.3g(质量体积比终浓度为0.3％)、珠子参皂苷2g(质量体积比终浓度为2％)和0.9％氯化钠注射液85mL混匀，将胎盘间充质干细胞(复苏后细胞悬液为10mL，含DMSO 0.5mL，FBS 4.5mL，细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬混匀，制备完毕。
上述制备的胎盘间充质干细胞注射液留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。
实施例4胎盘间充质干细胞注射液的制备
配制100mL干细胞注射液：白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液25mL(质量体积比终浓度为5％)、维生素C 0.7g(质量体积比终浓度为0.7％)、珠子参皂苷10g(质量体积比终浓度为20％)和0.9％氯化钠注射液65mL混匀，将胎盘间充质干细胞(复苏后细胞悬液为10mL，含DMSO 0.75mL，FBS 6mL，细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬混匀，制备完毕。
上述制备的胎盘间充质干细胞注射液留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。
对比例1
采用与本发明相同方法获得的胎盘间充质干细胞，经复苏、清洗和离心，再注入到混合液(人血白蛋白和注射级生理盐水)中混匀。
配制100mL干细胞注射液：将白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液25mL(质量体积比终浓度为5％)、75mL注射级生理盐水、胎盘间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬混匀，制备完毕。
对比例2
采用与本发明相同方法获得的胎盘间充质干细胞，经复苏、清洗和离心，再注入到混合液(人血白蛋白和注射级生理盐水)中混匀。
配制100mL干细胞注射液：将白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液15mL(质量体积比终浓度为5％)、维生素C 0.3g(质量体积比终浓度为0.7％)、85mL注射级生理盐水、胎盘间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬混匀，制备完毕。
试验例功能鉴定
1、细胞活率检测
分别取少量细胞制剂于4℃冰箱放置0h、4h、8h、12h、24h实施例2-4的胎盘间充质干细胞注射液和对比例1-2制备的间充质干细胞悬液进行台盼蓝染色计数，检测细胞活率，结果如表1所示：
表1细胞活率检测结果
时间 实施例2 实施例3 实施例4 对比例1 对比例2
0h 90.2％±0.3％ 90.2％±0.4％ 90.2％±0.4％ 90.5％±0.5％ 90.5％±0.5％
4h 89.8％±0.5％ 90.0％±0.2％ 89.3％±0.2％ 87.5％±0.2％ 88.6％±0.3％
8h 89.3％±0.2％ 89.7％±0.5％ 89.1％±0.2％ 85.2％±0.4％ 85.8％±0.1％
12h 88.6％±0.4％ 89.1％±0.5％ 88.5％±0.3％ 83.2％±0.2％ 80.4％±0.2％
24h 86.1％±0.2％ 88.3％±0.3％ 86.8％±0.3％ 78.1％±0.3％ 75.2％±0.4％
从表1可以看出，本发明的胎盘间充质干细胞注射液放置经过24h后，其活力依旧较高，并且达到国家要求的一般细胞治疗活率大于等于85％，并且细胞活率经过24h后活率均高于对比例1和对比例2。
2、胎盘间充质干细胞注射液对肝移植大鼠治疗GVHD的的效果实验
购买已经建立原位肝移植模型的大鼠60只，将其平均分为A、B、C三组，A组注射本发明实施例2的胎盘间充质干细胞注射液、B组注射对比例1的脐带间充质干细胞注射液、C组注射生理盐水，A、B两组分别回输4个疗程，1个星期为一个疗程，每个星期连续回输3天，1剂/天，按1×106个/kg量输注。经过连续60天的观察，结果如下：
A组：全部都存活，其中有3只发生轻微的排斥反应，3只发生术后其他并发症，第35天基本恢复正常，其他均无排斥反应。
B组：其中5只由于出现有较强的排斥反应导致死亡，2只轻微排斥反应，第45天基本恢复正常，其他均无排斥反应。
C组：20只大鼠中的70％出现不同程度的术后并发症，5只死亡，其中2只是由于出现移植物抗宿主病死掉。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种胎盘间充质干细胞注射液，其特征在于，包括胎盘间充质干细胞、DMSO、FBS、维生素C、珠子参皂苷、人血白蛋白和溶媒。
2.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞注射液，其特征在于，每100mL胎盘间充质干细胞注射液中包括：
胎盘间充质干细胞：(0.5～l)×108个；
DMSO：0.5～lmL；
FBS：4.5mL～9mL；
维生素C：0.3～0.7g；
珠子参皂苷：2～10g；
人血白蛋白：10～20mL；
溶媒：补足。
3.根据权利要求1或2所述的胎盘间充质干细胞注射液，其特征在于，每100mL胎盘间充质干细胞注射液中包括：
胎盘间充质干细胞：1×108个；
DMSO：0.5～lmL；
FBS：4.5mL～9mL；
维生素C：0.3～0.7g；
珠子参皂苷：2～10g；
人血白蛋白：10～20mL；
溶媒：补足。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的胎盘间充质干细胞注射液，其特征在于，所述溶媒为复方电解质注射液、葡萄糖注射液或生理盐水。
5.根据权利要求4所述的胎盘间充质干细胞注射液，其特征在于，所述复方电解质注射液为勃脉力A复方电解质注射液。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的胎盘间充质干细胞注射液，其特征在于，所述胎盘间充质干细胞为第2～5代胎盘间充质干细胞。
7.如权利要求1至6中任一项所述胎盘间充质干细胞注射液在制备治疗移植物抗宿主反应的药物中的应用。
8.如权利要求1至6中任一项所述胎盘间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，包括：将胎盘间充质干细胞、DMSO、FBS、维生素C、珠子参皂苷、人血白蛋白和溶媒混匀，得到胎盘间充质干细胞注射液。
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