CN105132370A - 一种临床级别脂肪干细胞的制备和储存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种临床级别脂肪干细胞的制备和储存方法,采用无动物源蛋白质污染的无血清的完全培养基，进行脂肪组织来源的间充质干细胞培养，安全有效，无免疫原性，能更好地维持ADSCs的增殖率，平台期延长，且每代细胞扩增倍数远远提高，保证了临床治疗的数量，是第一次在制备临床级别的ADSCs中的应用无血清的完全培养基；本发明从腹部采集脂肪组织，可以间断性反复取材，避免了抽脂过程对脂肪干细胞的损伤；本发明应用贴壁法制备ADSCs，提高了原代细胞的产量，降低了成本；本发明应用新型的无血清细胞冻存液符合临床应用标准，减少了DMSO的用量，对ADSCs的活率、表型和倍增时间无明显影响，可以复苏后直接用于临床输注，便于运输，保证了临床治疗的安全性。

Description

一种临床级别脂肪干细胞的制备和储存方法

技术领域

本发明涉及干细胞的应用领域，具体为一种临床级别脂肪干细胞的制备和储存方法。

背景技术

间充质干细胞：是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

脂肪干细胞：(adipose-derivedstemcells，ADSCs)：是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。不仅在体内体外具有多向分化潜能，在不同的诱导因子作用下可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可以分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子。

血小板裂解液(plateletlysate,PL)：血小板浓缩物富含转化生长因子，血小板源性生长因子，胰岛素样生长因子等生长因子，输注人体内不会引起异种蛋白的免疫，可以从不同方面对组织中细胞和基质的再生起到促进作用，从而加速组织的修复，无疾病传播和免疫排斥的潜在危险。

细胞冻存：细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞进行应用。细胞冻存时向培养基中加入保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。

2001年,Zuk等首次成功分离脂肪来源间充质干细胞(ADSCs),由于其不仅具有很强的体外扩增能力和多向分化潜能，且来源充足、易于分离培养,成为研究新热点,并呈现出良好的前景。

脂肪干细胞是一种存在于脂肪组织中的间充质干细胞，在皮下白色脂肪组织中约占细胞总量的10～20％，与其他来源干细胞相比，ADSCs在分离培养上有很大优势：(1)取材方便。脂肪组织储备丰富,取材痛苦小。目前一次吸脂术可获得200ml脂肪，分离出约1×10⁶干细胞，为骨髓分离量的40倍。(2)分离简单。外周脂肪经机械剪切，胶原酶消化和简单梯度离心就可获得ADSCs。(3)易于培养。ADSCs呈成纤维细胞样生长，具有很强的体外扩增能力。多次传代(10～20代)后,细胞增殖速度无明显减慢,传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代中衰老细胞约占15％。

ADSCs能够促进血管新生，从而改善局部缺血组织的情况。这一特点使得ADSCs在临床治疗上具有相当广阔的应用前景。急性心肌梗死、缺血性心肌病、末梢血管疾病、急性肾小管坏死、糖尿病性视网膜病变、缺血性脑病、外伤性脊髓损伤以及移植中发生的局部缺血都将有希望通过ADSCs进行治疗。尽管ADSCs能够促使血管发生的机制尚不清楚，但研究发现ADSCs能够分泌大量血管生长因子VEGF、HGF、bFGF、血管生成素、GM-CSF、MCP-1和SDF-1α。

ADSCs有免疫豁免与免疫调节的免疫学特性。体外培养时，ADSCs低表达或者不表达造血细胞及HLA-DR抗原等免疫相关关键分子，提示ADSCs具有同种异体移植潜能。ADSCs还能够通过分泌抗炎症细胞因子和抑制受体T细胞增殖与调动，诱导机体发生免疫抑制或者免疫耐受，实现其免疫调节功能,促进异种或同种异体移植物的成活。

与其他来源的干细胞相比，ADSCs具有明显的优越性，它易获得又安全，对病人的损伤小，脂肪组织也容易再生，可以反复取材。同时，ADSCs进行自体移植可以克服种属和免疫障碍。因此寻求一种临床级别的自体脂肪干细胞的制备和储存方法，能更好地早期储备种子干细胞，为今后的疾病治疗和预防提供途径。

现有技术获取ADSCs细胞的技术方案为：

(1)、脂肪组织来源于吸脂术或者脂肪块,将脂肪组织剪碎至1-3mm大小组织块，PBS缓冲盐溶液冲洗3遍。

(2)、测量脂肪的体积，向其加入0.5％质量浓度的Ⅰ型胶原酶，使终浓度为0.075％，37℃下消化30min，加入同体积的含体积分数10％胎牛血清(FBS)的L-DMEM培养基终止消化，充分混匀后，1500rpm/min离心5min，弃去上清液。

(3)、PBS缓冲盐溶液冲洗2遍，分离后的细胞用含有10％FBS的L-DMEM重悬,接种入T25的培养瓶置于37℃，5％CO2的孵箱中，48h后换液。此为P0代细胞。

(4)、以后每3天换液一次，待细胞融合至培养瓶底80％-90％时，用常规胰酶消化传代，第一次消化传代获得的细胞称为P1代，以此类推。

(5)、收集P3代细胞进行流式细胞仪细胞表型检测和鉴定。

(6)、P4代进行冻存，调整细胞密度为1×10⁶个/ml，加入冻存液(含20-50％胎牛血清，10％DMSO的DMEM培养基)，程控降温法冻存到液氮中长期保存。

现有技术中存在的缺点为：

一、现有技术使用含有胎牛血清(FBS)的培养基进行ADSCs的分离和培养，FBS所含成分复杂，含有致病性的朊病毒蛋白以及针对胎牛抗原的异种蛋白，据报道，FBS存在20-50％的病毒污染几率。在细胞培养后，其残留随细胞输入人体可能感染人类。且间充质干细胞可内化外源性蛋白质，会导致接受治疗者出现过敏反应。因此含有FBS的培养基不适合应用于细胞治疗产品的制备。

二、现有技术中的脂肪组织来源通常为二种，第一种是应用抽脂获得的脂肪组织，第二种是来源于手术中获得的脂肪组织。两者均应用酶消化法获得原代ADSCs，成本较大，且抽脂过程中的高热往往会影响细胞的获得率。手术中获得的脂肪组织可以用于实验性研究，但是不适合自体脂肪干细胞的储存。因此，寻求一种有效的脂肪组织取材途径是前提。

三、现有技术中应用的细胞冻存液含有FBS和10％DMSO，FBS存在上述问题；此外，应用含有DMSO残留的细胞制剂进行临床输注时，可出现副反应，最为常见的是恶心、呕吐、皮疹及在皮肤和呼出的气体中有大蒜和洋葱味。偶尔出现血管毒性和肝肾毒性。因此，避免在冻存液中使用FBS和尽可能减少DMSO的用量，是保证临床安全应用减少副作用的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中ADSCs的分离和培养易被动物源性蛋白质的污染、脂肪组织的产出率低、易衰老等缺陷，提供一种临床级别脂肪干细胞的制备和储存方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种临床级别脂肪干细胞的制备方法,包括以下几个步骤：

(1)、病原灭活的血小板裂解液PL的制备

机采自体血小板或者从中心血站收集过期的血小板，在20～25℃、1200～1500rpm下离心10-15min进行病原灭活；

连续进行3-5个循环的-80℃冻存和37℃复苏，充分裂解血小板，在4000rpm下离心30min，收集血小板裂解液，冻存在-80℃备用，冻存期间进行病原学检测；

(2)、原代ADSCs培养

获取腹部皮下正常脂肪组织500～1000mg，用无钙镁D-Hank’s液冲洗3-5次，用眼科剪剪破脂肪组织中肉眼可见的细小血管，充分冲洗血液后，将脂肪组织剪碎至1-3mm大小；

将剪碎后的脂肪组织块均匀接种在T75培养瓶底部，在37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育，于第二天添加无血清的完全培养基，以后隔天观察细胞，可见细胞从组织块中生长，此为P0代细胞；

(3)、ADSCs传代

当P0代细胞达到80-90％融合度时，去除培养瓶中的旧培养基，用PBS缓冲液冲洗2-3次，加入0.25％质量浓度的胰酶和0.04％质量浓度的EDTA消化液，待细胞悬浮后，加入等体积的完全培养基终止消化，将单细胞悬液移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入无血清完全培养基，调整细胞密度为1～5×10⁵/ml，继续培养，此为P1代细胞；

待P1代达到90％以上融合时，再次将细胞消化传代，按照此种方法，将ADSCs连续传代。

优选的，所述的步骤(2)中的无血清的完全培养基为添加有5-10％质量浓度的PL的α-MEM培养基。

(4)、收集P3代细胞进行流式细胞仪细胞表型检测和鉴定。

一种临床级别脂肪干细胞的储存方法，包括以下步骤：

1)、选取第P4或者P5代的ADSCs细胞进行冻存；

2)、将步骤1)中的ADSCs细胞用胰酶消化，加入预冷冻存液，调整细胞悬液的浓度为1×10⁶/ml，放入预冷的冻存管中；

3)、通过程序降温仪，将冻存管投入液氮中保存；

4)、6个月后复苏，调整细胞浓度为1×10⁴/ml，接种于24孔板，每孔1ml，每3天换液一次，每隔24h胰酶消化后计数，根据生长情况计算倍增时间。

优选的，所述步骤2)预冷冻存液为含5％质量浓度的DMSO，2～5％质量浓度的人血白蛋白，1～5％质量浓度的低分子右旋糖酐，30～35％质量浓度的葡萄糖，30～35％质量浓度的生理盐水的冻存液。

本发明具有以下有益效果：

一、本发明采用临床级别的无动物源性蛋白质污染的无血清培养基，添加的自体或者异体血小板裂解液，经病原灭活的过程，安全有效，无免疫原性，从而避免了胎牛血清的致病性和过敏反应，因此提高了细胞制剂临床治疗的安全性，培养出的ADSCs具有免疫调节的能力，明显地抑制淋巴细胞增殖；同时血小板裂解液中可分泌大量的细胞因子，利于ADSCs的体外扩增培养；

二、本发明应用腹部脂肪作为干细胞的来源，取材量小(500-1000mg)，适合于间断性长期取材，从而利于建立自体脂肪干细胞种子库；与传统的添加10％FBS的培养基相比，含有5-10％PL的无血清完全培养基能更好地维持ADSCs的增殖率，平台期延长，且每代细胞扩增倍数远远高于传统10％FBS培养组，从而保证了细胞数量，减少了脂肪组织的采集量；应用组织块贴壁法进行原代细胞的培养，减少了成本，提高了原代细胞产量(较酶消化法提高了近20倍)，保证临床治疗的细胞数量；

三、本发明应用新型的细胞冻存液，无牛血清的污染，减少了DMSO的用量，复苏后的细胞活率在90％以上，且维持稳定的细胞表型和倍增时间，可直接用于临床输注，从而减少了体外培养的环节，保证了临床制剂的安全性。而且便于运输，使ADSCs的应用不受到区域和场地的限制。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是PL中细胞因子含量；

图2是ADSCs细胞形态；

图3是ADSCs的成脂分化和成骨分化；

图4是ADSCs生长曲线；

图5是ADSCs的免疫调节功能检测；

图6是冻存细胞复苏后倍增周期测定。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

一种临床级别脂肪干细胞的制备方法,包括以下几个步骤：

(1)、病原灭活的血小板裂解液PL的制备

机采自体血小板或者从中心站收集过期的血小板，在20～25℃、1200～1500rpm下离心10-15min进行病原灭活；

连续进行3-5个循环的-80℃冻存和37℃复苏，充分裂解血小板，在4000rpm下离心30min，收集血小板裂解液，冻存在-80℃备用，冻存期间进行病原学检测；

应用ELISA方法测定PL中细胞因子的含量，结果如图1所示，由图1可知：血小板裂解液PL中含有分泌大量的细胞因子PDGF-AB、TGF-β1、HGF、bFGF，这些细胞因子将非常利于ADSCs的体外扩增培养。

(2)、原代ADSCs培养

获取腹部皮下正常脂肪组织500～1000mg，用无钙镁D-Hank’s液冲洗3-5次，用眼科剪尽量剪破脂肪组织中肉眼可见的细小血管，充分冲洗血液后，将脂肪组织剪碎至1-3mm大小；

将剪碎后的脂肪组织块均匀接种在T75培养瓶底部，在37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育，于第二天添加无血清的完全培养基，以后隔天观察细胞，可见细胞从组织块中生长，此为P0代细胞；优选的，无血清的完全培养基为添加有5-10％质量浓度的PL的α-MEM培养基；

(3)、ADSCs传代

当P0代细胞达到80-90％融合度时，将细胞消化传代。去除培养瓶中的旧培养基，用PBS缓冲液冲洗2-3次，加入0.25％质量浓度的胰酶和0.04％质量浓度的EDTA消化液，待细胞悬浮后，加入等体积的完全培养基终止消化，将单细胞悬液移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入无血清完全培养基，调整细胞密度为1～5×10⁵/ml，继续培养，此为P1代细胞；

待P1代达到90％以上融合时，再次将细胞消化传代，按照此种方法，将ADSCs连续传代；

(4)、收集P3代细胞进行流式细胞仪细胞表型检测和鉴定。

P1代细胞、P2代细胞的形态如图2所示。由图2可知细胞传至P2代时，即可见大量成纤维细胞样细胞均匀分布，呈明显的旋涡状生长。

对DSCs检测和鉴定及生物学特征

流式细胞仪表面标志检测：

取培养的P3代细胞，用PBS洗两次，常规胰酶消化成单细胞悬液,1200rpm/min离心5min。收集细胞沉淀，PBS洗两次，取单细胞悬液1×10⁶个/ml，加入鼠抗人的CD73，CD29，CD44，CD105，CD34，CD45和HLA-DR单克隆抗体工作液100ul，孵育30min，PBS洗涤3次，弃上清，PBS重悬，流式细胞仪检

测细胞表面分子。结果表1所示：

表1P3代ADSCs细胞表面标志

由表1可知：应用添加PL的无血清完全培养基条件下，分离培养的ADSCs符合细胞表面标志的鉴定标准，即高表达特异性的CD29，CD44，CD73，CD105，但是CD34，CD45和HLA-DR表达极低。

ADSCs的成骨和成脂分化：选取P3代细胞，在传统培养条件下诱导成骨和成脂组织分化。结果如图3所示，由图3可知在适当的诱导条件下，ADSCs可向成脂和成骨方向分化，符合间充质的鉴定要求。

ADSCs细胞周期的测定：取对数生长期的细胞，常规消化，收集2×10⁵个细胞，PBS洗涤2次，75％乙醇重悬，室温固定1h，PBS洗涤2次，加入体积比为1:1的PBS和PI，室温孵育10-15min，流式细胞仪检测细胞周期。结果如表2所示。

表2ADSCs细胞周期检测

由表2的流式细胞仪检测结果可见，G0/G1期细胞的比例达到93.6％，说明绝大多数细胞是处于静止期的干细胞。

ADSCs的生长曲线的测定：取生长良好的P3代细胞，常规胰酶消化后，以1×10⁴/ml的浓度接种于24孔板，每孔1mL。隔天各取3孔消化计数细胞，取平均值，连续培养11天。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线。结果如图4所示。由图4可见，与传统的添加10％FBS的培养基相比，含有5-10％PL的无血清完全培养基能更好地维持ADSCs的增殖率，平台期延长。

ADSCs在对数增殖期细胞扩增能力的测定：取生长良好的P2代细胞，常规胰酶消化后，以1×10⁴/ml的浓度接种于T25培养瓶中。当细胞生长至70-80％融度时，进行传代培养，持续培养至P6代。根据不同代数细胞的总计数量，计算扩增倍数。结果如表3所示。

表3(P2-P6)代ADSCs细胞扩增倍数

由表3可见，在5-10％PL的无血清完全培养基条件下，ADSCs细胞的扩增能力明显增强，其扩增倍数维持在平均68.2，远远高于传统10％FBS培养组(平均24.2)。

ADSCs免疫调节能力检测：分离外周血单个核细胞(PBMC)，应用CFSE进行表面标记，加入20μg/ml的PHA，刺激24h。选取P3代ADSCs细胞，常规胰酶消化后收集细胞，洗涤计数，以1×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，孵育30min后加入PBMC(MSCs:PBMC细胞比为1:20)，建立混合淋巴细胞培养体系(MLC)。将细胞置于37℃,5％CO2条件下孵育96h。流式细胞仪分析PBMC中淋巴细胞的增殖情况。结果如图5所示。

由图5可知，在PHA刺激下，PBMC出现明显的细胞增殖，表现为CFSE信号的衰减。当与ADSCs共同培养时，PBMC的增殖受到显著抑制，表现为CFSE信号的聚集，无细胞增殖分裂出现。

一种临床级别脂肪干细胞的储存方法，包括以下步骤：

1)、选取第P4或者P5代的ADSCs细胞进行冻存；

2)、将步骤1)中的ADSCs细胞用胰酶消化，加入预冷冻存液，调整细胞悬液的浓度为1×10⁶/ml，放入预冷的冻存管中；预冷冻存液为含5％质量浓度的DMSO，2～5％质量浓度的人血白蛋白，1～5％质量浓度的低分子右旋糖酐，30～35％质量浓度的葡萄糖，30～35％质量浓度的生理盐水的冻存液。

3)、通过程序降温仪，将冻存管投入液氮中保存；

4)、6个月后复苏，台盼蓝染色计数复苏后细胞存活率和应用流式细胞仪检测细胞表面标志。结果如表4所示。

5)、复苏后，调整细胞浓度为1×10⁴/ml，接种于24孔板，每孔1ml，每3天换液一次，每隔24h胰酶消化后计数，根据生长情况计算倍增时间。结果如图6所示。

表4冻存细胞复苏后活率和表型检测

由表4的数据可以看出，新型的冻存液能够很好地保证复苏后的细胞活率，且ADSCs仍然维持原有的细胞表型。

由图6可知，冻存前后的ADSCs仍然维持相同的倍增时间。冻存过程不影响细胞的生长特性。

本发明应用的自体或者异体血小板裂解液，经过经病原灭活的过程，同时应用无血清培养基进行脂肪组织来源的间充质干细胞培养，安全有效，无免疫原性，能更好地维持ADSCs的增殖率，平台期延长，且每代细胞扩增倍数远远提高，保证了临床治疗的数量，是第一次在制备临床级别的ADSCs中的应用。

本发明中从腹部采集脂肪组织，可以间断性反复取材，避免了抽脂过程对脂肪干细胞的损伤，利用自体脂肪干细胞储存库的建立。应用贴壁法制备ADSCs，提高了原代细胞的产量，从而降低了成本，减少对原材料的需求。

本发明中应用新型的无血清细胞冻存液，配方为：含5％DMSO，2-5％人血白蛋白，1-5％低分子右旋糖酐，30-35％葡萄糖，30-35％生理盐水，符合临床应用标准，减少了DMSO的用量，对ADSCs的活率、表型和倍增时间无明显影响，可以复苏后直接用于临床输注，便于运输，保证了临床治疗的安全性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种临床级别脂肪干细胞的制备方法,其特征在于，包括以下几个步骤：

(1)、病原灭活的血小板裂解液PL的制备

机采自体血小板或者从中心血站收集过期的血小板，在20～25℃、1200～1500rpm下离心10～15min进行病原灭活；

连续进行3～5个循环的-80℃冻存和37℃复苏，充分裂解血小板，在4000rpm下离心30min，收集血小板裂解液，冻存在-80℃备用，冻存期间进行病原学检测；

(2)、原代ADSCs培养

获取腹部皮下正常脂肪组织500～1000mg，用无钙镁D-Hank’s液冲洗3-5次，用眼科剪剪破脂肪组织中肉眼可见的细小血管，充分冲洗血液后，将脂肪组织剪碎至1-3mm大小；

将剪碎后的脂肪组织块均匀接种在T75培养瓶底部，在37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育，于第二天添加无血清的完全培养基，以后隔天观察细胞，可见细胞从组织块中生长，此为P0代细胞；

(3)、ADSCs传代

当P0代细胞达到80-90％融合度时，去除培养瓶中的旧培养基，用PBS缓冲液冲洗2-3次，加入0.25％质量浓度的胰酶和0.04％质量浓度的EDTA消化液，待细胞悬浮后，加入等体积的完全培养基终止消化，将单细胞悬液移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入无血清完全培养基，调整细胞密度为1～5×10⁵/ml，继续培养，此为P1代细胞；

待P1代达到90％以上融合时，再次将细胞消化传代，按照此种方法，将ADSCs连续传代；

(4)、收集P3代细胞进行流式细胞仪细胞表型检测和鉴定。

2.如权利要求1所述的一种临床级别脂肪干细胞的制备方法,其特征在于，所述的步骤(2)中的无血清的完全培养基为添加有5-10％质量浓度的PL的α-MEM培养基。

3.一种临床级别脂肪干细胞的储存方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、选取第P4或者P5代的ADSCs细胞进行冻存；

2)、将步骤1)中的ADSCs细胞用胰酶消化，加入预冷冻存液，调整细胞悬液的浓度为1×10⁶/ml，放入预冷的冻存管中；

3)、通过程序降温仪，将冻存管投入液氮中保存；

4)、6个月后复苏，调整细胞浓度为1×10⁴/ml，接种于24孔板，每孔1ml，每3天换液一次，每隔24h胰酶消化后计数，根据生长情况计算倍增时间。

4.如权利要求3所述的一种临床级别脂肪干细胞的储存方法，其特征在于，所述步骤2)预冷冻存液为含5％质量浓度的DMSO，2～5％质量浓度的人血白蛋白，1～5％质量浓度的低分子右旋糖酐，30～35％质量浓度的葡萄糖，30～35％质量浓度的生理盐水的冻存液。