CN103263440A - 从胎盘、脐带中提、制同源性间充质干细胞注射剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养相结合的方法用以制备胎盘间充质干细胞注射剂；当采用收集胎盘组织细胞后，先进行原代细胞的贴壁扩增，再行正、负向免疫分选结合的方法纯化胎盘间充质干细胞，获得C D34↑[-]C D105↑[+]细胞，在无血清体外培养体系中继代扩增培养。本发明方法每次只需少量原代细胞，就可以达到比较好的分选效果，可进一步提高了胎盘间充质干细胞的纯化率。所用培养体系不但对胎盘间充质干细胞具有明显的扩增优势，并且扩增的细胞具备多分化潜能。可在纯化胎盘间充质干细胞和体外扩增培养中应用。

Description

从胎盘、脐带中提、制同源性间充质干细胞注射剂的方法

技术领域

本发明涉及一种制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，尤其是一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法。背景技术

干细胞在特定条件下可经诱导分化为其他细胞，人们期望将来用这种方法进行组织修复，用于治疗帕金森症、糖尿病、老年性痴呆、心脏病、脊髓损伤等。胎盘组织中间充质干细胞的含量是脐带血中含量的百万倍，可供小孩自用几次，甚至可提供给多个成人患者的治疗。

美国加州儿童医院于2011年发表文章指出，胎盘内含有比脐带血多5-10倍的造血和间充质干细胞，而且细胞的增殖和分化能力大大优于脐带血。他们还发现胎盘间充质干细胞含有较高浓度的巨核细胞干细胞，能够生成大量的血小板，这对移植以后的血小板减少非常有用。他们采用冰冻保存胎盘的方法建立胎盘间充质干细胞库，还要寻找能从胎盘提取丰富造血干细胞用于临床移植的的合作伙伴，这给我们提供了很好的长期合作机会和市场机遇。美国纽约哥伦比亚大学附属儿童医院已经在2005年8月首次采用来自于胎盘的干细胞成功的治愈患白血病的儿童，白细胞，血小板都比脐带血细胞移植要早恢复1到2星期。由于胎盘间充质干细胞的种种优势，在2005年在国际上成立了胎盘间充质干细胞协会和世界组织胎盘间充质干细胞联络网，而这种胎盘间充质干细胞的临床应用也涉及到医学领域的各个学科，临床上也有成千上万的文章发表。

按恶性血液学的发病规律为十万分之三到四计算，我国每年的新发病人就超过4万多人，若由于各种原因而仅有1/5的病人有移植的可能性，那每年至少有超过万例的新发病例需提供胎盘间充质干细胞，这还仅仅是指血液病，若把那些可用造血干细胞的移植的病种也记算在内，那每年的病人数可约10万余人，现有500多万患者需造血干细胞移植治疗。建立胎盘间充质干细胞库是非常重要的。

如果说脐带血管内外壁组织中含有比脐带血中的间充质干细胞多百万倍，那么胎盘间充质干细胞的含量比脐带间充质干细胞多百倍，完全满足于临床应用。

干细胞是指那些具有自我更新能力，在一定的条件下又能产生各种高度分化的子代细胞的增殖性细胞。干细胞是具有自我复制和向各种细胞分化潜能的原始细胞，是形成生命机体各组织器官的起源细胞。人类个体的发育过程实质就是干细胞的自我更新和增殖分化的过程，而各个器官的细胞也是分别来源于各个器官的干细胞，像肝脏，神经，脑组织，胰腺，皮肤等。按干细胞的种类有：根据干细胞的来源、发育阶段、分化趋势将它们分为两大类：胚胎细胞和成体干细胞(或称之为特定组织干细胞，如造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞等)。胚胎干细胞的基本特性是具有发育的全能性，能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层的各种分化细胞，即具有分化成为机体内任何一部分组织和器官的能力，因而有人称之为“万能”细胞。

胚胎干细胞：胚胎干细胞是最原始，可分化程度最高的细胞，也是受精卵结合后形成胚胎的初始阶段，它可以分化成各种细胞，甚至可以采取核移植的方法，利用自体体细胞分化成各种细胞。临床应用时必须破坏胚胎，让其分化成其它细胞，由于细胞的高度分化性，易形成肿瘤细胞。

成体干细胞：是人出生以后，各器官还自行保留能再生的细胞。这种干细胞是越年轻的机体，含量越丰富，可分化程度越高。1998年，在美国Wisconsin大学首先发现在成人骨髓中也具有能分化成各种细胞的干细胞，随后人们认识到人体内各种组织细胞都存在着这种细胞，称为成人干细胞(ASC细胞)，它具有和胚胎干细胞同样的功能。成体干细胞可分为：

成人骨髓干细胞：主要是含有能分化成人体血液细胞的干细胞，像白细胞，红细胞，血小板等，也称为骨髓造血干细胞。

周围血干细胞；正常人周围血内含有很少量的干细胞，但是在应用了一种称为白细胞刺激因子的药物后，骨髓血中的干细胞可以释放到周围血中，所以也称为周围动员血干细胞。

脐带间充质干细胞：脐血源性MSCs与骨髓源性MSCs相比，具有获得方便，无创伤性，污染机率低，免疫源性更原始等特点。但脐血中MSCs的数量少，生长周期相对缓慢，原代细胞培养时间较长，成为制约MSCs应用的障碍。

脐带血干细胞：是新生儿出生后，脐带血中的干细胞，它含有丰富的造血干细胞，仅含少量的间充质干细胞。

胎盘间充质干细胞：是新生儿出生后，除脐带血外，残留在胎盘内的干细胞，它含有比脐带血多5到8倍的造血干细胞，多66万倍的间充质干细胞，还含有能分化成人体各种组织的干细胞。由于胎盘间充质干细胞的重要性，在婴儿出生后，即保存他的胎盘间充质干细胞，他可以终生受益，既使患了肿瘤，外伤或其它细胞损伤性疾病，他的自体胎盘间充质干细胞库也能带给他第二次生命。这些细胞分为脐带血，这好比是成人中的周围血，造血干细胞量不多；胎盘内血相当于成人的骨髓血，含有更多的造血干细胞。

间充质干细胞是干细胞的一个研究分支，是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞。2004年，Le Blanc等报道了首例半相合异基因间充质干细胞移植治疗GVHD获得成功，其后又报道了异基因配型不合的间充质干细胞移植治疗GVHD的有效性，并且认为在应用间充质干细胞治疗GVHD不需要严格的配型，其后又有多篇异基因未经配型的MSC治疗GVHD、促进造血重建的报道，其MSC来源涉及骨髓、脂肪、牙周等。

美国FDA已批准了近60项临床试验，主要包括以下几个方面：

1)造血干细胞移植：增强造血功能；促使造血干细胞移植物的植入；

治疗移植物抗宿主病。

2)组织损伤的修复：骨、软骨、关节损伤、心脏损伤；肝脏损伤；

脊髓损伤和神经系统疾病。

3)自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、硬皮病、炎性肠炎等。

4)作为基因治疗的载体。

其中移植物抗宿主病、克隆氏病的治疗在美国已经进入到三期临床阶段。我国已开始用间充质干细胞治疗临床上一些难治性疾病，如脊髓损伤、脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、系统性红斑狼疮、克隆氏病、脑血管疾病、糖尿病、肝脏疾病(硬化、坏死等)，根据初步的临床报告，间充质干细胞对这些疾病的治疗都取得明显的疗效。间充质干细胞临床也应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病。间充质干细胞(MSCs)是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。间充质干细胞(HMSCs)的生物学特性：HMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞，是别于两者之间的一类新的多能间充质细胞，根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会制定的最低标准，间充质干细胞(MSCs)需满足以下条件：1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长；2)MSCs表达CD105，CD73和CD90，不表达CD45，CD34，CD14或CD11b，CD79a或CD19和HLA2DR；3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。和其他来源的MSCs一样HPMSCs呈长条梭形贴壁生长，表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44及HLA2ABC，不表达CD34、CD45、CD31等造血干细胞标记或CD33、CD14、CD56及HLA2DR、2DA、2DP、2DQ，体外诱导培养能向多种成体细胞分化。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制，并抑制T细胞的增殖，异体移植该细胞可产生免疫耐受性，表明其为一类免疫缺陷细胞，异基因移植不会发生免疫排斥反应。间充质干细胞的临床应用表现在以下特性：

●具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。

●具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。

●具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。

正是由于间充质干细胞所具备的这些免疫学特性，使其在血液病治疗方面具有广阔的临床应用前景。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。

间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。但骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；制备过程不容易质控；所提取的干细胞不能完全纯化，混有具有免疫原性的其它细胞，移植后引起免疫反应，仅能采用自体干细胞一种；取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。这都限制了骨髓间充质干细胞临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。迄今的研究表明，脐带和胎盘来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。脐带和胎盘间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，因此有可能成为最具临床应用前景的干细胞。

胎盘组织中分离出的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且还具备如下优点：①胎盘的干细胞比脐带中的干/祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力。②免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病。③干细胞易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染。④扩增时培养体系能统一，便于质控。⑤可制成种子细胞冷冻，多次使用，冷冻后细胞损失小。⑥潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低。⑦采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤。⑧采集方便，易于保存和运输，伦理学争议少。这种胎盘来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能，它比脐带来源的间充质细胞量多质量更好，更具有大规模应用的可能。

鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞，临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。

最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4～7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。

然而自体间充质干细胞的应用过程中逐渐暴露了不便之处：例如扩增能力个体差异很大；潜在的肿瘤细胞污染风险；培养需要一定的时间，不能及时适应病情的需要等。这些制约了自体间充质干细胞的使用。胎盘和脐带来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。间充质干细胞给未来的再生医学带来了新希望，对间充质干细胞更深入的研究和临床应用必将在不远的将来造福人类。

胎盘间充质干细胞(placenlal mesenchynal stem cells vmscs)(PMSCS)是来自于中胚层，具有自我更新能力可以向3个胚层(外、中、内)组织和细胞分化的一类干细胞，它介于胚胎干细胞及成熟细胞的一类干细胞，也就是保存和具有分化和再生能力，但又不像胚胎干细胞那样的无限繁殖而造成肿瘤，它存在于人的骨髓组织内。它的含量随着年龄增长而递减，含量最高的是新生儿废弃组织，即胎盘和脐带中。虽然成人骨髓中含有MSCS，但数量少，容易被病毒感染及较强的免疫原性等因素而限制了其临床应用，一般多应用于自体的MSCS的治疗，而从脐带、胎盘中提取的PMSCS其细胞含量高而且增殖能力远远优于骨髓干细胞。目前，大量的实验已经证明，PMSCS在不同的诱导条件下，像细胞所处的环境，不同的细胞生长因子的存在等PMSCS不仅可以分化成骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞和肌肉细胞等，而且可以越过胚层分化为外胚层的细胞以及内胚层，心肌和肝脏细胞。同时，一致认为在骨髓中的MSCS还越起着极为重要的作用，即能够协助和促进造血干细胞的分化和增殖作用，如果在造血干细胞移植中，能够同时应用MSCS，能够大大加速造血干细胞移植的植入，这一切都表明PMSCS在临床上具有广阔的临床应用价值，是除了胚胎干细胞以外，具有较高可塑性与多向分化潜能的干细胞，是人类生长起源时，非常重要的干/祖细胞储备库，胎盘组织容易得到，易于处理，不需要侵入性操作，不会涉及伦理道德问题，更重要的是不会像胚胎干细胞那样具胡无限繁殖的特性，同而已经成为人类干/祖细胞来源的新起点。科学已证明胎盘组织中富含MSCS，这种细胞在体外易于培养，增殖能力强，具有多向分化的潜能，不会无限繁殖形成肿瘤等生物学特性，有人用丁酸，维甲酸组成的酯可以促进PMSCS向心血管细胞分化，帮助梗塞的心肌区域毛细血管的增生，成为采用PMSCS用于治疗心脏、疾患的证论和实践应用的根据，展示了做为组织工程的种子细胞具有广泛的临床应用前景。目前，在美国、日本、台湾、西班牙，法国等国都建立有胎盘间充质干细胞库，国内还无一家胎盘间充质干细胞库，我们将是国内首家胎盘间充质干细胞库。

目前造血干细胞移植尚存在很多不完善之处，如异体造血干细胞移植后常常因发生移植物抗宿主病(GVHD〕等并发症导致失败。自体造血干细胞移植不需供者，移植后并发症少，但治疗恶性肿瘤的复发率明显比异体造血干细胞移植高。因此技术上有待完善。2004年，LeBlanc等报道了首例半相合异基因间充质干细胞移植治疗GVHD获得成功，其后他又报道了异基因配型不合的间充质干细胞移植可以有效治疗GVHD，陆续又有多篇异间充质干细胞治疗GVHD、促进造血重建的报道。这种间充质干细胞移植能够增强造血功能；促使造血干细胞移植物的植入。本发明提出在充分储备一定数量的来自于胎盘的造血干细胞外，同时建立来自于胎盘的间充质干细胞库，除了能够随时提供和病人组织配型相关抗原相符的造血干细胞，还可提供相关抗原相符的来自于胎盘的间充质干细胞，也就是说不但能提供造血干细胞的种子供干细胞移植，也能提供相关抗原相符的间充质干细胞减少GVHD反应，这就可极大的促进造血干细胞移植在临床上的应用，挽救大量垂死的病人。

人们又发现干细胞在特定条件下可经诱导分化为其他细胞，人们期望将来用这种方法进行组织修复，用于治疗帕金森症、糖尿病、老年性痴呆、心脏病、脊髓损伤等。胎盘组织中间充质干细胞的含量是脐带血中含量的百万倍，可供小孩自用几次，甚至可提供给多个成人患者的治疗。

由造血干细胞定向分化、增殖为不同的血细胞系，并进一步生成血细胞。人类造血干细胞首先出现于胚龄第2～3周的卵黄囊，第4周胎盘开始发挥造血功能。在胚胎早期(第2～3月)造血功能延伸至肝、脾，第5个月又从肝、脾迁至骨髓。在胚胎发育期，胎盘是一个重要的造血组织，胚胎末期一直到出生后，骨髓成为造血干细胞的主要来源。造血干细胞具有具有自身复制和分化两种功能。在胚胎和迅速再生的造血组织中，造血干细胞多处于增殖周期之中；而在正常骨髓中，则多数处于静止期(G0期)，当机体需要时，其中一部分分化成熟，另一部分进行分化增殖，以维持造血干细胞的数量相对稳定。造血干细胞进一步分化发育成不同血细胞系的定向干细胞。定向干细胞多数处于增殖周期之中，并进一步分化为各系统的血细胞系，如红细胞系、粒细胞系、单核-吞噬细胞系、巨核细胞系以及淋巴细胞系。由造血干细胞分化出来的淋巴细胞有两个发育途径，一个受胸腺的作用，在胸腺素的催化下分化成熟为胸腺依赖性淋巴细胞，即T细胞；另一个不受胸腺，而受腔上囊(鸟类)或类囊器官(哺乳动物)的影响，分化成熟为囊依赖性淋巴细胞或骨髓依赖性淋巴细胞，即B细胞。并分别由T、B细胞引起细胞免疫及体液免疫。如机体内造血干细胞缺陷，则可引起严重的免疫缺陷病。

造血干细胞是血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)的鼻祖，是高度未分化细胞，具有良好的分化增殖能力，干细胞可以救助很多患有血液病的人们(如白血病)。造血系统原始细胞如出现恶性增生便形成白血病，而治疗白血病的方法就是将这些恶性细胞全部杀灭。但是化疗不分敌我，在杀灭癌细胞的同时也杀死了正常的造血干细胞，导致人体血细胞缺乏，危及病人生命。为了让病人尽快恢复造血功能，挽救病人的生命就需要输注造血干细胞，但如果两个人免疫标记相差太大就会造成过强的排异反应，使得移植失败，病人死亡。自体储存造血干细胞就可以避免这类情况的发生，在小孩出生时期将脐带血或胎盘造血干细胞进行储存，当本人病人需要移植，可直接到胎盘造血干细胞申请，用于自身疾病的治疗。

我们的专利“从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的方法”，专利号：ZL011311908，国际专利主分类号：C12N5/08中指出胎盘中含有丰富的造血干细胞，因此可以代替异体骨髓来恢复重建患者的骨髓，换言之，即用它来置换骨髓。同时在我们的另一篇专利中也提出了“一种从剖腹产胎盘组织中提取原始间充质和造血干/祖细胞方法”(专利号：200610098886)。这种方法可以用来收集来自于胎盘组织的间充质干细胞去建立间充质干细胞库。应用这些方法可以收集并长期冻存现在废弃的新生儿胎盘，脐带血干细胞，胎盘上皮干细胞，胎盘组织间充质干细胞为建立自体或异体的联合干细胞储存库，提供全国乃至全世界患者选择作造血干细胞移植临床应用，以治疗多种恶性肿瘤性疾病，遗传性血液免疫系统疾病，由于核事故等原因引起的造血、免疫系统衰竭等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法。利用该方法可以实现从胎盘、脐带、羊水和胎盘组织中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的目的。

为此，本发明解决所述问题的技术方案是：一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，包括步骤：

采集脐带：待新生儿娩出后，在距新生儿脐部10厘米处用两把止血钳夹住脐带，再从两钳间剪断脐带后结扎，当胎盘完全从母体排出后，从脐带远端消毒，以75％乙醇消毒脐带残端、脐带根部及其周围；待胎盘娩出后，用医用手术缝线或其他适宜的材料结扎胎盘上婴儿端的脐带，用0.9％生理盐水将胎盘脐带涮洗一到两次，以清除胎盘上的羊水及胎粪等污物，避免胎盘脐带与其他物品接触，将采集好的胎盘和脐带放入无菌一次性胎盘采集盒，盖好盒盖，并确认采集液没过胎盘；

收集胎盘血造血干细胞：向脐带静脉内注入含有25到50毫升抗凝剂和抗生素的溶液，这抗凝剂可以是肝素，或枸橼酸钠，抗生素是1％的青霉素，链霉素，庆大霉素，也可加制霉菌素，溶液可以是0.9％的生理盐水等渗磷酸缓冲液或DMEM细胞培养液，然后用夹子夹住脐带，竖起脐带一分钟并用手或器械顺着脐带往胎盘处向下捋，让溶液进入胎盘，把整个胎盘无菌的放到采血架，无菌消毒脐带远端，用带有测孔且粗的三通管的特制长针头各刺入二侧远端动脉，后面连着含肝素或枸橼酸抗凝剂或抗菌素的内含250毫升生理盐水的输液袋与输液管和输液泵或注射器相连，将带有采血袋的针头进入脐带静脉，与进入脐带动脉的针头一起固定，之后先打开脐带动脉的开关，让盐水、抗凝剂进入胎盘，一直到看到胎盘充盈，然后打开脐带静脉夹子，让血液进入采血袋，轻轻压迫胎盘母面，一直到所有胎盘血、盐水和抗凝剂全部进入采血袋，称为胎盘血；

收集胎盘组织间充质干细胞：当胎盘进入无菌环境后，采用有机溶剂及生理缓冲液清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液和母血；其中，先采用由酒精、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和碘构成的1号消毒剂清洗胎盘及脐带表面，杀灭任何可能存在胎盘膜和脐带表面上的微生物污染，清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液，在该消毒剂内，酒精浓度为50％到75％以及含有0.1到0.5％的碘和磷酸缓冲液，其pH值为7.2到7.6之间；

再采用在1号消毒剂的基础上减去碘的2号有机溶剂清洗胎盘及脐带表面，在该有机溶剂内，含有浓度为50％到75％的酒精和磷酸缓冲液，其pH值为7.2到7.6之间；

最后依次采用由酒精和氯化钠构成的3号消毒剂清洁液、磷酸缓冲液(pH7.4)、低分子右旋糖酐及细胞培养液(DMEM)清洗胎盘及脐带表面，其中，在该消毒剂清洁液内，含有浓度为50％到75％的酒精和0.9％氯化钠，其pH值为7.2到7.6之间，在清洗完毕后，剥离胎盘羊膜及绒毛膜，将胎盘组织用手术刀划成米字形；

收集胎盘间充质干细胞：采用机械挤压、碾磨及酶的方法和生理缓冲液冲洗的方法，收取含有上皮和胎盘组织间充质干细胞组织液的混合液：该缓冲液可以含有抗菌素，像青霉素(100U/ml)，链霉素(100g/ml)也可含有2500到10，000单位的无防腐剂的肝素；或采用输液器(可以用注射器或输液泵从脐带静脉或脐带动脉注入0.25％胰酶(Trypsion)，或0.1-1％胶原酶II(Collegenase)，或0.5％DispenseII酶，也可加入0.05到0.2％的(Ethylene diamine tetra aceticacid)(EDTA)，在37度温箱内孵育含有组织细胞分离酶的胎盘30分钟到90分钟，然后在脐带静脉或脐带动脉内灌注生理缓冲液冲洗，该生理缓冲液的成分可以是生理盐水，低分子右旋糖甘磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline)或细胞培养液，像1640，DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)，每冲洗一次，然后挤压一次，收取含有以间充质干细胞为主的血液和组织液的混合液，再冲洗，挤压3到5次，时间在30到60分钟之间，这样收取的缓冲液的混合物为胎盘组织间充质干细胞，其体积在100到400毫升之间。该缓冲液可以含有抗菌素，像青霉素(100U/ml)，链霉素(100g/ml)也可含有2500到10，000单位的无防腐剂的肝素；

收集羊水，胎膜干细胞：从羊水中离心收集干细胞以及从胎盘组织分离羊膜和绒毛膜组织，用生理盐水洗涤后剪碎，采用0.25％的胰酶(Trypsion)或0.1-1％的胶原酶II(Collegenase)，或0.5％DispenseII酶，或加入0.05到0.2％的(Ethylene diamine tetra aceticacid)(EDTA)，在37度温箱内孵育或搅拌30到60分钟，收集、过虑、离心获得的细胞为胎膜上皮干细胞；

将以上步骤收集到的脐带血、胎盘血、羊水干细胞、胎盘间充质干细胞、胎盘上皮干细胞均通过下述步骤再进行处理：

将收集的胎盘血或组织干细胞均通过各层尼龙或钢丝滤网，筛孔最小直径为50um，收集单个细胞；然后将胎盘的细胞收集到50毫升的离心管内，在离心机中以1,500g离心10分钟，去掉70％的液体，然后任选以下二种方式进行收集：方式一是将收集的细胞和淋巴细胞分离液按1∶4的比例混合，在离心机中以2500g离心30分钟，去掉残存红细胞以及成熟的粒细胞，收集液面间的细胞，细胞用1640培养液洗二次；或是将提取的含有胎盘组织原始间充质和造血干/祖细胞溶液和6％高分子羟乙基淀粉(Hespan，大于60,000道尔顿)按1∶6比例混合，再以1500rpm(500到1,000g)，4度离心5到20分钟，弃去红细胞，保留上清液，然后用含盐的低分子右旋糖酐将其洗涤三次，把所收集的细胞制成单个核细胞混悬液，并做单个核细胞计数，测定细胞活性，计算CD34、CD4、CD8细胞含量及体外培养的白细胞集落(CFU-GM)；

将做完各种检测，包括病毒、细菌培养和组织配型的脐带血、胎盘血和胎盘组织间充质干细胞分别制成单个核细胞，以1X108/ml的浓度和DMSO(二甲亚砜)混合，且以10％的终浓度DMSO和低分子右旋糖酐降温到零下800℃，然后转移到液氮(-186℃)液相中深低温分别保存，以备移植时应用。

根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，所述方法还包括冻融和造血干细胞移植的方法：当临床确认需应用某例造血干/祖细胞时，在病人床前从液氮内取出由上述方法中获得的间充质和造血干/祖细胞，在37℃电动水浴箱内融化，当血细胞几乎即将冻融完毕时，加入低分子右旋糖酐等量混合，按顺序给病人输注。

根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，由所述方法制备的胎盘组织干细胞一般以静脉输入为主，其包装可以是管状、也可以是袋装；也可以局部直接进入到骨髓组织内，也可通过任何其它的途径，像动脉注入等方法输注给病人；且主要应用的药学成分或含量有生理盐水、低分子右旋糖酐、脐带血浆、DMEM(Dulbecco’s Modified EssentialMedium)培养液、注射用水，所述的所用溶液均是无菌、无热原制备以及可用临床移植的病人。

根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，所述方法中冻融多种来源的干细胞是指根据病人的病情需要，可以分别冻融多种来源的干细胞，也可一次性的冻融多种细胞联合给病人应用，其中，对体重小于10公斤的病人可以只用脐带血干细胞、对体重大于10公斤小于30公斤的病人可以用脐带血和胎盘血干细胞、对体重大于30公斤以上的病人可以用脐带血、胎盘血造血干细胞以及胎盘组织间充质干细胞。

根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，将获取的同源性间充质干细胞，按照条形码的编号，把有关资料输入电脑中储存，在无菌环境中，按条形码的编号从脐带血中提取样本，供以下检测：

——肝炎病毒及相应抗体：像乙型肝炎，丙型肝炎等，

——性病检测；像梅毒等，

——爱滋病(AIDs)毒抗体检测，

——遗传性溶血性疾病，

——间充质和造血干/祖细胞定量检测(CD34，)

——组织配型(HLA)，

——间充质和造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)，

——细胞和霉菌培养，

——有核白细胞及单个核细胞计数，

——间充质和造血干/祖细胞的活性(台盼兰染色)，

制取的单个核细胞以1X10⁸/ml和DMSO混合，可分别放于多个25毫升的冰冻保存袋，以10％的DMSO和低分子右旋糖酐浓度，逐步降温到零下80℃，然后转移到液氮(-186℃)液相中深低温保存。

根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，以组织配型(HLA)和干细胞的含量为标准，在联合干细胞库内查询和需移植病人相符的干细胞，并提供临床应用；其中，进行完胎盘采集后，在限定时限内将胎盘运送到干细胞库，由专业的技术人员进行胎盘造血干细胞的分离、提取、检测等技术流程，直到根据最终检测结果来确认所获得的干细胞是否具有长期保存的价值。

根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，从羊水和胎盘组织中收集的干细胞也可以通过细胞培养进一步纯化干细胞，即收集培养后的贴壁细胞，或采用流式细胞分选仪分选和纯化干细胞，这种干细胞可以冷冻保存也可以直接应用于临床。

根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，从羊水和胎盘组织中收集的干细胞分装的细胞浓度介于从0.5到5.01X10⁸/ml之间且收集的干细胞可以冻融、培养、再分装，所述收集的干细胞都有组织配型检验，在应用时，可以用于配型相符，也可以用于不相符的需要者。

根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，从来源不同的羊水和胎盘组织中收集的干细胞分装时采用不同的管和袋子，不得多种细胞混匀包装。

相比现有技术，本发明具有的积极效果是：提供了一种胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养相结合的方法用以制备胎盘间充质干细胞注射剂；当采用收集胎盘组织细胞后，先进行原代细胞的贴壁扩增，再行正、负向免疫分选结合的方法纯化胎盘间充质干细胞，获得C D34↑[-]C D105↑[+]细胞，在无血清体外培养体系中继代扩增培养。本发明方法每次只需少量原代细胞，就可以达到比较好的分选效果，可进一步提高了胎盘间充质干细胞的纯化率。所用培养体系不但对胎盘间充质干细胞具有明显的扩增优势，并且扩增的细胞具备多分化潜能。可在纯化胎盘间充质干细胞和体外扩增培养中应用。

附图说明

图1是来自于脐带血的集落培养，每个集落代表一个造血干细胞的示意图；

图2是来自于胎盘血的造血干细胞的集落培养示意图；

图3是收集、浓缩和纯化后和胎盘间充质干细胞的体外细胞培养，细胞在24小时培养后贴，呈现出纤维状细胞的示意图；

图4是采用物理和生物学的方法浓缩和纯化干细胞的示意图；

图5是浓缩和纯化后的干细胞体外培养可以分化成为体内各种组织的细胞的示意图；

图6是胎盘干细胞具有很低的免疫原性的示意图；

图7是浓缩纯化后的造血干细胞生物特性和基因治疗证实胎盘间充质干细胞可以体外大量培养的示意图；

图8是胎盘间充质干细胞群的免疫特性变化的示意图。

具体实施方式

参见图1，为来自于脐带血的集落培养，每个集落代表一个造血干细胞。

案例一：收集脐带和胎盘

采用机械静脉穿刺法收集脐带血，收集的胎盘地妇产医院或科室。首先，征得孕妇或其直接亲属同意捐献胎盘组织后，查阅孕妇的所有检验报告，证实无任何的病毒、梅毒等和血液有关的病毒感染，然后详细询问孕妇的生育、疾病、遗传、感染等病史，在一切均为正常后，孕妇分娩后，无菌收集胎盘和脐带血。收集完后的脐带血及胎盘组织均附有条形码标签，存放于4℃冰箱。存放时间一般不超过24小时。收集的脐带血采用流式细胞仪检测造血干细胞标记CD34的含量以及造血干细胞的集落培养。收集脐带和胎盘均在无菌条件下保存并在48小时内做进一步处理。

案例二：收集胎盘血

参见图2，为来自于胎盘血的造血干细胞的集落培养。

把将取完脐带血的胎盘放在一个经过高压灭菌的不锈钢容器内，采用和注射器，输液器或输液泵相联的胶皮管插入脐带动脉，静脉进入胎盘，使胎盘内残余血液从胎盘内挤出，同时采用生理缓冲液冲洗，该生理缓冲液的成分可以是生理盐水，低分子右旋糖甘，磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline)或细胞培养液，像1640，

DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)，每冲洗一次，然后挤压一次，收取含有造血干/祖细胞的血液和组织液的混合液，冲洗，挤压3到5次，时间在30到60分钟之间，这样收取的血液和缓冲液的混合物为胎盘血，其体积在50到400毫升之间。该缓冲液可以含有抗菌素，像青霉素(100U/ml)，链霉素(100g/ml)也可含有2500到10，000单位的无防腐剂的肝素。收集的胎盘血造血干细胞采用流式细胞仪检测造血干细胞标记CD34的含量以及造血干细胞的集落培养。与图1来自于脐带血的干细胞集落培养的集落相比，该来自于胎盘血的干细胞集落培养，在同一时间，同一细胞起始浓度，明显的看出来自于胎盘血的干细胞集落细胞数远远比来自于脐带血的干细胞集落细胞数为多。

案例三：收集羊水和胎盘间充质干细胞

参见图3，为收集、浓缩和纯化后和胎盘间充质干细胞的体外细胞培养，细胞在24小时培养后贴，呈现出纤维状细胞。

从健康产妇取出的胎盘组织有两种方法，一种为正常阴道生产，另一种为剖腹产，该发明提出从剖腹产胎盘中提取原始间充质和造血干/祖细胞较好，更能保证细胞不受细菌和其它病原体污染。在正常顺产中，由于胎儿和胎盘必须经过非无菌的阴道逸出，这就带来了微生物污染的可能性，采用我们的试验表明提取的细胞受微生物污染的可能性大大降低。

在无菌的环境和条件下通过剖腹产手术或者在尽量保证无菌的条件下获得胎盘。

1)在无菌操作下收集羊水和剪断脐带，拿开胎盘。

2)用无菌生理盐水清洗胎盘，清洗掉所有的血凝块和污染的母血，对胎盘的处理转到下一步。

3)采用有机溶剂及生理缓冲液清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液和母血。

胎儿和胎盘在母体子宫中都由羊水包围，而且在脐带外表还含有一种称为透明质酸的粘液，采用一般的溶液很难把它们去掉，我们配制了一种以酒精为主的有机溶剂既能去除这些物质，还能起到消毒灭菌的功能。

4)采用1号消毒剂(酒精、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和碘)，该消毒剂内，酒精浓度为50％到75％以及含有0.1到0.5％的碘和磷酸缓冲液，pH为7.2到7.6之间，用于清洗胎盘及脐带表面，杀灭任何可能存在胎盘膜和脐带表面上的微生物污染，清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液，然后收集脐带血，最后剪除脐带和胎盘表层的胎盘膜。

5)采用2号有机溶剂(在1号消毒剂的基础上减去碘)，酒精浓度为50％到75％和磷酸缓冲液，pH为7.2到7.6之间，用于清洗胎盘及脐带表面。3号消毒剂清洁液(酒精和氯化钠)，酒精浓度为50％到75％和0.9％氯化钠，pH为7.2到7.6之间，用于清洗胎盘及脐带表面，磷酸缓冲液(pH7.4)、低分子右旋糖酐及细胞培养液(DMEM)按顺序清洗。在清洗完毕后，将胎盘组织用手术刀划成米字形。6)采用机械挤压、碾磨及酶的方法和生理缓冲液冲洗的方法，收取含有原始间充质和造血干/祖细胞的血液和组织液的混合液，制备成间充质和造血干/祖细胞浓缩液。

7)采用输液器(可以用注射器或输液泵从脐带静脉或脐带动脉注入0.25％胰酶(Trypsion)，或0.1-1％胶原酶II(Collegenase)，或0.5％Dispense II酶，也可加入0.05到0.2％的(Ethylenediamine tetra acetic acid)(EDTA)，在37度温箱内孵育含有组织细胞分离酶的胎盘30分钟到90分钟，然后在脐带静脉或脐带动脉内灌注生理缓冲液冲洗，该生理缓冲液的成分可以是生理盐水，低分子右旋糖甘，磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline)或细胞培养液，像1640，DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)，每冲洗一次，然后挤压一次，收取含有以间充质干细胞为主的血液和组织液的混合液，冲洗，挤压3到5次，时间在30到60分钟之间，这样收取的血液和缓冲液的混合物主要为胎盘组织血，其体积在100到400毫升之间，含有大量的间充质干细胞。该缓冲液可以含有抗菌素，像青霉素(100U/ml)，链霉素(100g/ml)也可含有2500到10,000单位的无防腐剂的肝素。这种用酶消化，搅拌，挤压，洗涤等方法收集的细胞称为胎盘间充质干细胞，采用同样的方法不仅间充质干细胞可以从胎盘内提取而且也可以从胎盘羊膜，绒毛膜和脐带内提取。

案例四：采用物理和生物学的方法浓缩和纯化干细胞

参见图4，图中左侧为来自于脐带血的干细胞体外培养，图中右侧为来自于胎盘血的干细胞体外培养，在同一时间，同一细胞起始浓度，明显的看出来自于胎盘血的干细胞体外细胞成团，大量聚集，有大量红细胞生成。

应用上述方法从脐带血，胎盘血和胎盘组织中分离的造血干细胞和间充质干细胞实际上是一群细胞，它含有红细胞、血小板，具有分化成不同组织细胞的间充质干细胞，不同时期的造血干细胞以及成熟的粒细胞和淋巴系统细胞。本发明用以下方法浓缩和纯化这些干细胞。

1).采用沉淀、离心的方法浓缩干细胞

准确测量按上述二种方法从胎盘组织中分离的组织细胞体积，应用不含血清的DMEM液洗二次，按1∶6的比例加入羟乙基淀粉(HES)，，然后在离心机内以200g，温度12℃，时间5分钟，弃去富含红细胞的沉淀物，上清液再次离心800g，温度12℃，时间15分钟，弃去上清液。收集沉于管底的细胞，加入DMEM液把沉淀细胞制成混悬液，以1∶4的比例加到淋巴细胞分离液的上层，然后以800g，温度12℃，时间30分钟离心。吸取在淋巴细胞分离液和上层液体间的细胞，加入DMEM培养液，洗涤2次，最后做细胞计数和活性检测。

2).采用生物学抗体-磁珠法纯化造血干细胞的方法纯化造血干细胞。

本发明的另一个方案是采用抗CD4单克隆抗体和一种载体相结合，这种支持载体往往是磁珠。然后使上述浓缩的来自于胎盘组织的浓缩原始间充质和造血干/祖细胞群和这抗体相接触，这样细胞群内的成熟淋巴细胞会和抗体相结合，并粘附于支持载体。此时，若是磁珠，可用吸铁装置吸附磁珠。洗涤去未和磁珠相结合的细胞，即胎盘血原始间充质和造血干/祖细胞。若采用和生物素相结合的单克隆抗体，则可应用含抗生素抗体的生物柱，当未结合抗体的细胞通过该生物珠时，均被洗涤出去。采用以上二种方法，可获得较为纯化的间充质和造血干/祖细胞，而且清除了90-95％的成熟淋巴细胞。胎盘内的干/祖细胞体外培养存活时间长，增值倍数高。

案例五：浓缩和纯化后的干细胞体外培养可以分化成为体内各种组织的细胞。

提取的干细胞在一定的细胞刺激因子的作用下，可以分化成各种人体细胞，就像图五中所示：图中左上角为肌肉纤维细胞；图中右上角为神经细胞；图中左下角为软骨细胞；图中右下角为纤维基质细胞。

案例六：胎盘干细胞具有很低的免疫原性

参见图6，证明来自胎盘的细胞具有免疫调节功能，以及不会致肿瘤性：对20只无免疫功能小鼠注射胎盘间充质干细胞，无一例发现小鼠死亡或产生肿瘤，而且这种来源的PMSC具有低免疫原理，有实验指出把这种细胞和具有很强免疫原的单核细胞共同培养(混合淋巴细胞培养)，并不会刺激PMSC细胞的增殖，相反的还会抑止液全淋巴细胞反应，实验也证明，把PMSCS细胞输注给小鼠，在移植150天后，仍可从多种组织中检测到人源微嵌合体，证明PMSCSC能主动迁移和整合入动物的特定器官并且动物对这些异种细胞主动耐受，这正像2002年周胜利教授发表的论文指出，人来源的干细胞能在小鼠肝脏组织中长期存活，如图指出，在第7行为小鼠肝脏本身的DNA；1为DNA标准品；从2到6分别为人胎盘间充质干细胞输注小鼠后1到5个月的肝脏标本DNA，可以明显看出人胎盘间充质干细胞仍然在小鼠肝脏中存活，不会被小鼠排斥。

案例七：胎盘干细胞可以体外大量培养。

参见图7，浓缩纯化后的造血干细胞生物特性和基因治疗证实胎盘间充质干细胞可以体外大量培养。

该图中c曲线为脐带血干细胞，b曲线为胎盘血干细胞，a曲线为胎盘间充质干细胞，长期体外培养：增殖能力最强的为胎盘间充质干细胞，是脐带血干细胞的4倍，而在9星期培养后，脐带血干细胞都已经死亡，11星期后，胎盘间充质干细胞增殖到最高峰。

图8是胎盘间充质干细胞群的免疫特性变化：

本发明分别比较来自于胎盘组织的原始间充质和造血干/祖细胞、骨髓细胞以及脐带血细胞的生物特性。正如前述，细胞集落培养来自于胎盘组织的原始间充质和造血干/祖细胞集落形成较晚，但集落生长快，集落细胞大，能形成多次集落。当把这三类细胞长期培养时，来自胎盘组织的原始间充质和造血干/祖细胞能很快的形成贴壁细胞，而且这些贴壁细胞很易多次传代。这三类细胞在和含有造血干细胞刺激因子，像SCF(10μg/ml)，IL-3(100μg/ml)以及FLT-3(50ng/ml)，长期培养时，来自于胎盘组织的原始间充质和造血干/祖细胞维持时间长，增殖量多。本发明分别采用来自于采用胎盘组织原始间充质和造血干/祖细胞、脐带血细胞，等量混合的来自于胎盘组织细胞和脐带血细胞注射于同位素致死量的免疫功能缺陷的小鼠，发现这三类细胞都能在小鼠骨髓内生长，无任何不良反应。

基因治疗为当前治疗各种疾病的有效手段。带有正常或治病基因的质粒可以有效的嵌合入来自于胎盘组织原始间充质和造血干/祖细胞的DNA链中，并随着细胞的分裂而不断的复制，转录成能表达蛋白质的RNA，起到治疗疾病的效果。采用流式细胞仪分析胎盘间充质干细胞，发现T和B淋巴细胞群不同于血液中的比例，含有更高辅助细胞，更少的杀伤细胞。胎盘间充质干细胞：是指新生儿脐带血管的来源，胎盘形成脐带和脐带血管，这些血管在胎盘内分的更细，分化功能更强，更为重要的是由于和母体接触更近，从而发挥免疫抑制排斥的效果更为强烈，这也是母体不会排斥胎儿的原因之一。

案例八：建立异体联合羊水和胎盘脐带干细胞库

收集和储存用于为异体移植的(也称为公共库)胎盘间充质干细胞：就是在母亲同意捐献胎盘后，从胎盘内提取胎盘间充质干细胞。应用我们的方法，每袋储存的干细胞可以满足一切病人的需要。在各种病原体检查，像病毒，细菌阴性后，保存所有的资料，像组织配型，细胞数，干细胞集落数等在数据库内，然后把干细胞冰冻袋保存在深低温液氮灌内，随时提供给组织配型相符的病人应用。

(1)脐带血内的有核细胞及干/祖细胞的有限，并不太适宜于体重较大病人移植；(2)可能由于脐带血内细胞含基质细胞或能转化成基质细胞较骨髓内为少，从而移植后的脐血在患者内生长缓慢。而我们建立的联合胎盘脐带血库正是可以弥补脐带血的特点，正如周胜利等人发表的文章(中国实验血液学2001，2：153-160)中指出这样的联合胎盘脐带血库可供任何年龄和体重的病人开展造血干细胞移植。其方法可按以下步骤进行：

1)建立电脑联网和条形码系统：便于资料储存，保证所有数据的准确，而且也可以迅速根据病人的HLA配型结果查询到和病人HLA相符的胎盘——脐带血干细胞，用以临床移植。

2)和医院共同合作收集胎盘和脐带血：在征求得孕妇同意的情况下，收集各项检测及孕妇家庭中无相关遗传病史的脐带血和胎盘。

3)检测：所有从医院收集的脐带血均需再做一次和病毒细胞、霉菌和遗传病有关的各项检测，只有各项检测指标阴性的脐血才能提供给临床移植。

4)组织配型(HLA)：HLA配型的准确性是关系到移植是否成功的主要因素之一，常用于脐血移植的HLA抗原有I类：A，B和II类DR。这二类HLA配型需采用分子生物学(DNA)检测，而对II类DR更需应用高分辨检测。

5)胎盘及脐血干/祖细胞保存、提取、纯化：浓缩的脐带血，胎盘血干/祖细胞及胎盘间充质干细胞和冰冻保存剂(DMSO)混合，在液氮内深低温降温到-80℃，然后转移到液氮内(-196℃)长期保存。冻融和造血干细胞移植：当临床确认需应用造血干细胞库内的某例脐血和胎盘组织干细胞/祖细胞时，在病人床前从液氮内取出脐血及胎盘组织干/祖细胞，于37℃电动水浴箱内融化，在血细胞几乎即将冻融完毕时，加入白蛋白和低分子右旋糖酐等量混合，按顺序给病人输注。

案例九：建立自体羊水和联合胎盘脐带干细胞库

自体联合胎盘脐带血库是孕妇在新生儿出生后，贮存胎盘间充质干细胞及胎盘，脐带血干/祖细胞，其目的是(1)因为胎盘和脐带血内含有丰富的造血干/祖细胞，出生以后贮存就避免了孩子长大以后，若患有肿瘤，尤其是血液疾病时，缺乏供体时的危险，这特别适合于家庭中有肿瘤或血液病的新生儿；(2)目前，大量的科学实验证明，在组织中含有早期能分化成各种组织细胞，像肝脏、皮肤、神经等的干细胞。生命越早期，这种干细胞的含量就越高。若能保存胎盘中的组织细胞，无疑是给新生儿建立了一个生命银行。在新生儿的成长发育过程中，由于各种原因，像外伤、脏器衰竭等，而需要脏器细胞移植，均可通过胎盘间充质干细胞的体外培养，分化成所需要的细胞，供临床应用。由于这些细胞是来自于新生儿的自体细胞，不存在排斥和不能生长等问题，在某种意义上讲，可以为新生儿提供第二次生命的机会。收集和储存用于为自体移植的(也称为自体库)胎盘间充质干细胞：就是在母亲同意捐献胎盘后，从胎盘内提取胎盘间充质干细胞。应用我们的方法，每袋储存的干细胞可以满足新生儿的一生及其相关亲属的需要。在各种病原体检查，像病毒，细菌阴性后，保存所有的资料，像组织配型，细胞数，干细胞集落数等在数据库内，然后把干细胞冰冻袋保存在深低温液氮灌内，随时提供给组织配型相符的亲属或新生儿本人应用。

具体程序除以下几点外，其余的和异体联合胎盘脐带血库一样。

1)在收集羊水；胎盘和脐血时，孕妇或其直系亲属要和我方签订协议书，同意由我方有价保存新生儿的胎盘和脐血干细胞，而我方也需保证未得孕妇家属同意，不得把该份脐血细胞用于任何人。

2)脐血干/祖细胞及胎盘组织细胞要分多袋储存，以便于在不同时间分次给新生儿应用。

3)当需要除造血干细胞移植以外的用途时，例如需要用于肝脏损伤、皮肤移植等，按临床要求冻融胎盘组织细胞，在细胞培养液(如1640、DMEM)内培养，待胎盘组织细胞长满培养瓶后，换用相应的含刺激因子的培养液，如肝脏细胞刺激因子、神经细胞刺激因子，促使胎盘组织细胞向相应的细胞分化，待细胞分化完全后，给病人应用。

4)当新生儿在生长、发育过程中，任何原因引起需造血干细胞移植来挽救其生命时，可随时应用其储存的脐血及组织干细胞来替代其患病的细胞。

基因治疗为当前治疗各种疾病的有效手段。胎盘组织细胞及脐血干/祖细胞是基因转染的很好载体。带有正常或治病基因的质粒可以有效的嵌合入胎盘组织细胞的DNA链中，并随着细胞的分裂而不断的复制，转录成能表达蛋白质的RNA，从而起到治疗疾病的效果。

本发明是提供一种胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养相结合方法制备胎盘间充质干细胞注射剂，采用收集胎盘组织细胞后，先进行原代细胞的贴壁扩增，再行正、负向免疫分选结合的方法纯化胎盘间充质干细胞，获得C D34↑[-]C D105↑[+]细胞，在无血清体外培养体系中继代扩增培养。本发明方法每次只需少量原代细胞，就可以达到比较好的分选效果，可进一步提高了胎盘间充质干细胞的纯化率。所用培养体系不但对胎盘间充质干细胞具有明显的扩增优势，并且扩增的细胞具备多分化潜能。可在纯化胎盘间充质干细胞和体外扩增培养中应用。随着细胞替代治疗的发展，干细胞移植治疗已成为临床上治疗某些疾病的重要手段，利用干细胞在体外扩增培养并诱导成所需要的细胞后移植入患者体内，用于组织损伤的修复、退行性器官的替代及改善遗传性缺陷组织器官的功能。而成体干细胞可塑性分化的发现，为细胞替代治疗提供了新的种子细胞。

干细胞的分离纯化：是将胎盘组织制成细胞悬液后从中获取细胞的过程。而所谓细胞纯化是从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞的分离和纯化过程，使培养物成为单一类型培养细胞，甚至是遗传特性完全一致的培养细胞。机械分离以及酶分离是组织分散成单细胞最常用的方法。在机械分离方法中，包括用吸管或针头吹打，用组织研磨器或注射器研磨，用不锈钢或尼龙筛网搓洗等。其中按照组织内不同细胞的大小差异，亦一定孔径的不锈钢或尼龙筛网过滤细胞起到了对细胞的初步分离纯化目的。在酶解离的方法中，常用的技术包括用胰蛋白酶消化，用螯合剂处理。羟乙基淀粉和甲级纤维素可以使红细胞形成大的“钱串”，加速其沉降，从而比其他细胞更快地从造血细胞悬液中沉降出去。这一方法通常用于快速去除大量成熟红细胞，而不会对有核细胞群造成太大的损失。粘附于某些固相物质如玻璃或塑料的表面，使某些类型细胞的基本生物学特性之一，但另一些细胞却缺乏这种能力；或某些细胞的粘附能力强，粘附作用快，而某些细胞的粘附能力弱或粘附作用慢。根据这些差异，可以分离或消除某些类型的细胞。这种将粘附较快的细胞与粘附较慢的细胞分离开来并分别收集的处理过程就称为差粘附处理。差速粘附处理常用于分离细胞悬液中的成纤维细胞与其它组织细胞。利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法，利用单克隆抗体的特异性和多样性是利用不同抗体的合理组合分离不同类型的细胞成为可能。目前抗体介导的细胞分离技术主要有：抗体/补体介导细胞溶解法，流式细胞仪分选法，平面粘附分离法，免疫磁珠分离法等。从抗体介导技术获得细胞的家渡看，又可分为阳性细胞分选法和阴性细胞分选法。拟从混杂细胞群体中获得表达与抗体相应膜抗原的细胞群，称为阳性细胞分选法；反之，拟除去表达与抗体相应膜抗原的细胞，而收集其余的细胞群体，称为阴性细胞分选法。其中上述抗体/补体介导细胞溶解法为阴性细胞分选法，其余3种方法既可以作为阳性细胞分选技术，也可以作为阴性细胞分选技术。

通过以上对本发明的操作方法，特点和优越性作了祥细的阐明，应值得指出的是尽管本文描述了以上几种案例，人们也可根据本发明的基础，提出各种变化和个性的形式也是可能的，所以本发明要求重点保护的就是上述提出的权利要求。旋糖酐等量混合，按顺序给病人输注。

Claims (9)

1.一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，包括步骤：

采集脐带：待新生儿娩出后，在距新生儿脐部10厘米处用两把止血钳夹住脐带，再从两钳间剪断脐带后结扎，当胎盘完全从母体排出后，从脐带远端消毒，以75％乙醇消毒脐带残端、脐带根部及其周围；待胎盘娩出后，用医用手术缝线或其他适宜的材料结扎胎盘上婴儿端的脐带，用0.9％生理盐水将胎盘脐带涮洗一到两次，以清除胎盘上的羊水及胎粪等污物，避免胎盘脐带与其他物品接触，将采集好的胎盘和脐带放入无菌一次性胎盘采集盒，盖好盒盖，并确认采集液没过胎盘；

收集胎盘血造血干细胞：向脐带静脉内注入含有25到50毫升抗凝剂和抗生素的溶液，这抗凝剂可以是肝素，或枸橼酸钠，抗生素是1％的青霉素，链霉素，庆大霉素，也可加制霉菌素，溶液可以是0.9％的生理盐水等渗磷酸缓冲液或DMEM细胞培养液，然后用夹子夹住脐带，竖起脐带一分钟并用手或器械顺着脐带往胎盘处向下捋，让溶液进入胎盘，把整个胎盘无菌的放到采血架，无菌消毒脐带远端，用带有测孔且粗的三通管的特制长针头各刺入二侧远端动脉，后面连着含肝素或枸橼酸抗凝剂或抗菌素的内含250毫升生理盐水的输液袋与输液管和输液泵或注射器相连，将带有采血袋的针头进入脐带静脉，与进入脐带动脉的针头一起固定，之后先打开脐带动脉的开关，让盐水、抗凝剂进入胎盘，一直到看到胎盘充盈，然后打开脐带静脉夹子，让血液进入采血袋，轻轻压迫胎盘母面，一直到所有胎盘血、盐水和抗凝剂全部进入采血袋，称为胎盘血；

收集胎盘组织间充质干细胞：当胎盘进入无菌环境后，采用有机溶剂及生理缓冲液清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液和母血；其中，先采用由酒精、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和碘构成的1号消毒剂清洗胎盘及脐带表面，杀灭任何可能存在胎盘膜和脐带表面上的微生物污染，清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液，在该消毒剂内，酒精浓度为50％到75％以及含有0.1到0.5％的碘和磷酸缓冲液，其pH值为7.2到7.6之间；

再采用在1号消毒剂的基础上减去碘的2号有机溶剂清洗胎盘及脐带表面，在该有机溶剂内，含有浓度为50％到75％的酒精和磷酸缓冲液，其pH值为7.2到7.6之间；

最后依次采用由酒精和氯化钠构成的3号消毒剂清洁液、磷酸缓冲液(pH7.4)、低分子右旋糖酐及细胞培养液(DMEM)清洗胎盘及脐带表面，其中，在该消毒剂清洁液内，含有浓度为50％到75％的酒精和0.9％氯化钠，其pH值为7.2到7.6之间，在清洗完毕后，剥离胎盘羊膜及绒毛膜，将胎盘组织用手术刀划成米字形；

收集胎盘间充质干细胞：采用机械挤压、碾磨及酶的方法和生理缓冲液冲洗的方法，收取含有上皮和胎盘组织间充质干细胞组织液的混合液：该缓冲液可以含有抗菌素，像青霉素(100U/ml)，链霉素(100g/ml)也可含有2500到10,000单位的无防腐剂的肝素；或采用输液器(可以用注射器或输液泵从脐带静脉或脐带动脉注入0.25％胰酶(Trypsion)，或0.1-1％胶原酶II(Collegenase)，或0.5％Dispense II酶，也可加入0.05到0.2％的(Ethylene diamine tetra aceticacid)(EDTA)，在37度温箱内孵育含有组织细胞分离酶的胎盘30分钟到90分钟，然后在脐带静脉或脐带动脉内灌注生理缓冲液冲洗，该生理缓冲液的成分可以是生理盐水，低分子右旋糖甘磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline)或细胞培养液，像1640，DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)，每冲洗一次，然后挤压一次，收取含有以间充质干细胞为主的血液和组织液的混合液，再冲洗，挤压3到5次，时间在30到60分钟之间，这样收取的缓冲液的混合物为胎盘组织间充质干细胞，其体积在100到400毫升之间。该缓冲液可以含有抗菌素，像青霉素(100U/ml)，链霉素(100g/ml)也可含有2500到10,000单位的无防腐剂的肝素；

收集羊水，胎膜干细胞：从羊水中离心收集干细胞以及从胎盘组织分离羊膜和绒毛膜组织，用生理盐水洗涤后剪碎，采用0.25％的胰酶(Trypsion)或0.1-1％的胶原酶II(Collegenase)，或0.5％DispenseII酶，或加入0.05到0.2％的(Ethylene diamine tetra aceticacid)(EDTA)，在37度温箱内孵育或搅拌30到60分钟，收集、过虑、离心获得的细胞为胎膜上皮干细胞；

将以上步骤收集到的脐带血、胎盘血、羊水干细胞、胎盘间充质干细胞、胎盘上皮干细胞均通过下述步骤再进行处理：

将收集的胎盘血或组织干细胞均通过各层尼龙或钢丝滤网，筛孔最小直径为50um，收集单个细胞；然后将胎盘的细胞收集到50毫升的离心管内，在离心机中以1,500g离心10分钟，去掉70％的液体，然后任选以下二种方式进行收集：方式一是将收集的细胞和淋巴细胞分离液按1∶4的比例混合，在离心机中以2500g离心30分钟，去掉残存红细胞以及成熟的粒细胞，收集液面间的细胞，细胞用1640培养液洗二次；或是将提取的含有胎盘组织原始间充质和造血干/祖细胞溶液和6％高分子羟乙基淀粉(Hespan，大于60,000道尔顿)按1∶6比例混合，再以1500rpm(500到1,000g)，4度离心5到20分钟，弃去红细胞，保留上清液，然后用含盐的低分子右旋糖酐将其洗涤三次，把所收集的细胞制成单个核细胞混悬液，并做单个核细胞计数，测定细胞活性，计算CD34、CD4、CD8细胞含量及体外培养的白细胞集落(CFU-GM)；

将做完各种检测，包括病毒、细菌培养和组织配型的脐带血、胎盘血和胎盘组织间充质干细胞分别制成单个核细胞，以1X108/ml的浓度和DMSO(二甲亚砜)混合，且以10％的终浓度DMSO和低分子右旋糖酐降温到零下800℃，然后转移到液氮(-186℃)液相中深低温分别保存，以备移植时应用。

2.根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，所述方法还包括冻融和造血干细胞移植的方法：当临床确认需应用某例造血干/祖细胞时，在病人床前从液氮内取出由上述方法中获得的间充质和造血干/祖细胞，在37℃电动水浴箱内融化，当血细胞几乎即将冻融完毕时，加入低分子右旋糖酐等量混合，按顺序给病人输注。

3.根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，由所述方法制备的胎盘组织干细胞一般以静脉输入为主，其包装可以是管状、也可以是袋装；也可以局部直接进入到骨髓组织内，也可通过任何其它的途径，像动脉注入等方法输注给病人；且主要应用的药学成分或含量有生理盐水、低分子右旋糖酐、脐带血浆、DMEM(Dulbecco’s Modified EssentialMedium)培养液、注射用水，所述的所用溶液均是无菌、无热原制备以及可用临床移植的病人。

4.根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，所述方法中冻融多种来源的干细胞是指根据病人的病情需要，可以分别冻融多种来源的干细胞，也可一次性的冻融多种细胞联合给病人应用，其中，对体重小于10公斤的病人可以只用脐带血干细胞、对体重大于10公斤小于30公斤的病人可以用脐带血和胎盘血干细胞、对体重大于30公斤以上的病人可以用脐带血、胎盘血造血干细胞以及胎盘组织间充质干细胞。

5.根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，将获取的同源性间充质干细胞，按照条形码的编号，把有关资料输入电脑中储存，在无菌环境中，按条形码的编号从脐带血中提取样本，供以下检测：

——肝炎病毒及相应抗体：像乙型肝炎，丙型肝炎等，

——性病检测；像梅毒等，

——爱滋病(AIDs)毒抗体检测，

——遗传性溶血性疾病，

——间充质和造血干/祖细胞定量检测(CD34，)

——组织配型(HLA)，

——间充质和造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)，

——细胞和霉菌培养，

——有核白细胞及单个核细胞计数，

——间充质和造血干/祖细胞的活性(台盼兰染色)，

制取的单个核细胞以1X10⁸/ml和DMSO混合，可分别放于多个25毫升的冰冻保存袋，以10％的DMSO和低分子右旋糖酐浓度，逐步降温到零下80℃，然后转移到液氮(-186℃)液相中深低温保存。

6.根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，以组织配型(HLA)和干细胞的含量为标准，在联合干细胞库内查询和需移植病人相符的干细胞，并提供临床应用；其中，进行完胎盘采集后，在限定时限内将胎盘运送到干细胞库，由专业的技术人员进行胎盘造血干细胞的分离、提取、检测等技术流程，直到根据最终检测结果来确认所获得的干细胞是否具有长期保存的价值。

7.根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，从羊水和胎盘组织中收集的干细胞也可以通过细胞培养进一步纯化干细胞，即收集培养后的贴壁细胞，或采用流式细胞分选仪分选和纯化干细胞，这种干细胞可以冷冻保存也可以直接应用于临床。

8.根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，从羊水和胎盘组织中收集的干细胞分装的细胞浓度介于从0.5到5.01X10⁸/ml之间且收集的干细胞可以冻融、培养、再分装，所述收集的干细胞都有组织配型检验，在应用时，可以用于配型相符，也可以用于不相符的需要者。

9.根据权利要求1所述的一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，其特征是，从来源不同的羊水和胎盘组织中收集的干细胞分装时采用不同的管和袋子，不得多种细胞混匀包装。

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