CN103320382A - 从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从胎盘和脐带中同时提取和纯化包括脐带血造血干细胞、胎盘血造血干细胞、胎盘羊膜、羊水、绒毛膜干细胞和来自于胎盘和脐带组织间的间充质干细胞在内的多种来源干细胞的方法。该方法是以采血器材收集羊水，脐带血，然后用机械的步骤收集胎盘血，最后采用机械、联合酶消化和单克隆抗体-磁珠法从羊水及胎盘羊膜，绒毛膜上皮干细胞以及胎盘组织中提取、浓缩和纯化活性好、浓度高、数量多的上皮和间充质干细胞。并将这些干细胞分别做各种检测，浓缩，纯化和保存，建立联合干细胞库，可用于造血干细胞移植和细胞治疗。

Description

从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种从胎盘和脐带中提取和纯化干细胞的方法，尤其是一种从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法。 

背景技术

在二十世纪九十年代的今天，随着医学水平的提高，许多恶性传染性疾病、营养不良性疾病逐步减少，甚至走向消失。而以恶性肿瘤、遗传性疾病、免疫系统疾病正日益成为累及面广、危害深且难以根治的主要疾病。如我国恶性肿瘤的年发病人数为160万，且有逐年增加的趋势；其主要治疗方法为手术、放疗、化疗，尽管随着这些方法的改进，恶性肿瘤的长期生存率有所提高，但大多数患者仍往往因复发或转移而死亡，其死亡率占各类疾病的第一位或第二位。因此对上述疾病的攻克是我国医学实践中急需解决的课题，具有远大的社会意义。干细胞移植是治疗这些疾病的非常重要的方法之一，而脐带血含有丰富的干细胞，是在干细胞中很有发展前途的细胞。 

造血干细胞能生成各类血细胞，少量的造血干细胞即可重建人体的全部血液免疫细胞成分，包括红细胞、粒细胞，淋巴细胞，单核细胞、血小板。成人的造血干细胞主要存在于骨髓，这是主要的造血器官。采用功能正常的造血干细胞去恢复、重建或置换患者骨髓的 造血功能称为造血干细胞移植。长期以来，主要采用骨髓细胞来做造血干细胞移植，故常称为骨髓移植。研究发现，用多种方法可将骨髓中的造血干细胞动员入外周血，因而可用外周血干细胞作移植，其优点为：可避免供者采集骨髓时的痛苦，减少肿瘤细胞对造血干细胞的污染。 

根据造血干细胞的来源可将造血干细胞移植分为自体造血干细胞移植及异体造血干细胞移植，后者又可分为有血缘关系的造血干细胞移植及无血缘关系(无关供者〕的造血干细胞移植。顾名思义，用自己的造血干细胞作移植称为自体造血干细胞移植，可治疗多种恶性肿瘤。但不能治疗遗传病、造血免疫系统衰竭，治疗恶性肿瘤的复发率也高于异体造血干细胞移植。用别人的造血干细胞作移植称为异体造血干细胞移植，可治疗多种恶性肿瘤、遗传性造血免疫系统疾病、造血免疫系统衰竭、治疗恶性肿瘤性疾病的复发率较低。但是异体造血干细胞供者越来越缺乏。因为异体造血干细胞移植需要人类组织相容抗原(HLA〕与患者相合的正常人提供造血干细胞，HLA不合的造血干细胞移植可引起严重的，甚至致命的副作用，称为GVHD。同胞之间HLA配型相合的概率最高，为25％，由于子女的基因各有一半来自父母，父母与子女之间的HLA配型不能达到完全相合。人类有上万种以上不同的HLA亚型，因此如要在无关人群中为一患者寻找HLA相合的供者，需要有数以十万名以上的供者库。在十多年前开展的脐带库，提供的脐带血含有丰富的干细胞，临床证明可以用于30公斤以下的儿童造血干细胞移植，是一种很有发展前途的干细 胞，可是脐带血最大的不足就是所含造血干细胞量太少，仅能用于儿童患者。因此，急需解决造血干细胞的新来源问题。 

干细胞是具有自我复制和向各种细胞分化潜能的原始细胞，是形成生命机体各组织器官的起源细胞。人类个体的发育过程实际实质就是干细胞的自我更新和增殖分化的过程，而各个器官的细胞也是分别来源于各个器官的干细胞，像肝脏，神经，脑组织，胰腺，皮肤等。 

胚胎干细胞是最原始，可分化程度最高的细胞，也是受精卵结合后形成胚胎的初始阶段，它可以分化成各种细胞，甚至可以采取核移植的方法，利用自体体细胞分化成各种细胞。临床应用时必须破坏胚胎，让其分化成其它细胞，由于细胞的高度分化性，易形成肿瘤细胞。 

成体干细胞是人出生以后，各器官还自行保留能再生的细胞。这种干细胞是越年轻的机体，含量越丰富，可分化程度越高。1998年，在美国Wisconsin大学首先发现在成人骨髓中也具有能分化成各种细胞的干细胞，随后人们认识到人体内各种组织细胞都存在着这种细胞，称为成人干细胞(ASC细胞)，它具有和胚胎干细胞同样的功能。 

成人骨髓干细胞主要是含有能分化成人体血液细胞的干细胞，像白细胞，红细胞，血小板等，也称为造血干细胞。 

周围血干细胞，正常人周围血内含有很少量的干细胞，但是在应用了一种称为白细胞刺激因子的药物后，骨髓血中的干细胞可以释 放到周围血中，所以也称为周围动员血干细胞。 

转基因多能干细胞，也称为induced pluripotent stem(iPS)是由日本科学家(获得2012年诺贝尔奖)首先发现的自体成体细胞在基因转染后具有胚胎干细胞的功能，但最大疑问就是转染细胞也同时具有肿瘤细胞的可能性，要应用于临床，还有距离。 

胎盘干细胞/间充质干细胞是新生儿出生后，除脐带血外，残留在胎盘内的干细胞，它含有比脐带血多4到8倍的造血干细胞，66万倍的间充质干细胞，还含有能分化成人体各种组织的干细胞。胎盘是胎儿和母亲血液交换的场所，含有非常丰富的血液微循环。人在母亲子宫内发育的阶段，胎盘是首先形成的器官之一。胎盘中含有大量的早期干细胞，包括数量丰富的造血干细胞。这些干细胞在胎盘中行使着造血的功能。小孩出生后剥离的胎盘内所含的造血干细胞，可以分化形成各种血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)的祖宗，注射到体内可以发挥造血功能。 

由于胎盘干细胞/间质干细胞的重要性，在婴儿出生后，即保存他的胎盘血干细胞/间充质干细胞库，他也可以终生受益，既使患了肿瘤，外伤或其它细胞损伤性疾病，他的自体胎盘血干细胞/间充质干细胞库也能带给他第二次生命。这些细胞分为三类：一类是脐带血，这好比是成人中的周围血，造血干细胞量不多；第二类是胎盘内血，相当于成人的骨髓血，含有更多的造血干细胞；第三类是间充质干细胞，包括胎盘组织及胎盘羊膜和绒毛膜的上皮干细胞，它具有大部分胚胎干细胞的功能，可以分化成各种细胞。 

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。它最初在骨髓中发现，它具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。已有许多报告间充质干细胞在特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能， 

近来人们发现脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的干细胞，可用于造血干细胞移植治疗多种疾病。像血液系统恶性肿瘤(如急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增殖综合症、淋巴瘤等)、血红蛋白病(地中海贫血)、骨髓造血功能衰竭(再生障碍性贫血)、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾患、某些实体肿瘤(小细胞肺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌等)。脐带血可以保存在脐带血造血干细胞库里，分为异体库和自体库。 

脐带血有很多不能克服的缺陷，如：所含造血干细胞量太少，只能用于30公斤以下的儿童(大约10岁以下)，大多用于白血病的干细胞移植。 

来自于胎盘血的造血干细胞，造血干细胞的含量比脐带血多4-8倍，比单用脐带血治疗更有效。 

目前造血干细胞移植尚存在很多不完善之处，如异体造血干细胞移植后常常因发生移植物抗宿主病(GVHD〕等并发症导致失败。自体造血干细胞移植不需供者，移植后并发症少，但治疗恶性肿瘤的复发率明显比异体造血干细胞移植高。因此技术上有待完善。2004 年，Le Blanc等报道了首例半相合异基因间充质干细胞移植治疗GVHD获得成功，其后他又报道了异基因配型不合的间充质干细胞移植可以有效治疗GVHD，陆续又有多篇异间充质干细胞治疗GVHD、促进造血重建的报道。这种间充质干细胞移植能够增强造血功能；促使造血干细胞移植物的植入。 

随着科学技术的进步，人们又发现干细胞在特定条件下可经诱导分化为其他细胞，人们期望将来用这种方法进行组织修复，用于治疗帕金森症、糖尿病、老年性痴呆、心脏病、脊髓损伤等。胎盘组织中间充质干细胞的含量是脐带血中含量的百万倍，可供小孩自用几次，甚至可提供给多个成人患者的治疗。 

由造血干细胞定向分化、增殖为不同的血细胞系，并进一步生成血细胞。人类造血干细胞首先出现于胚龄第2～3周的卵黄囊，第4周胎盘开始发挥造血功能。在胚胎早期(第2～3月)造血功能延伸至肝、脾，第5个月又从肝、脾迁至骨髓。在胚胎发育期，胎盘是一个重要的造血组织，胚胎末期一直到出生后，骨髓成为造血干细胞的主要来源。造血干细胞具有自身复制和分化两种功能。在胚胎和迅速再生的造血组织中，造血干细胞多处于增殖周期之中；而在正常骨髓中，则多数处于静止期(G0期)，当机体需要时，其中一部分分化成熟，另一部分进行分化增殖，以维持造血干细胞的数量相对稳定。造血干细胞进一步分化发育成不同血细胞系的定向干细胞。定向干细胞多数处于增殖周期之中，并进一步分化为各系统的血细胞系，如红细胞系、粒细胞系、单核-吞噬细胞系、巨核细胞系以及 淋巴细胞系。由造血干细胞分化出来的淋巴细胞有两个发育途径，一个受胸腺的作用，在胸腺素的催化下分化成熟为胸腺依赖性淋巴细胞，即T细胞；另一个不受胸腺，而受腔上囊(鸟类)或类囊器官(哺乳动物)的影响，分化成熟为囊依赖性淋巴细胞或骨髓依赖性淋巴细胞，即B细胞。并分别由T、B细胞引起细胞免疫及体液免疫。如机体内造血干细胞缺陷，则可引起严重的免疫缺陷病。 

造血干细胞是血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)的祖细胞，是高度未分化细胞，具有良好的分化增殖能力，干细胞可以救助很多患有血液病的人们(如白血病)。造血系统原始细胞如出现恶性增生便形成白血病，而治疗白血病的方法就是将这些恶性细胞全部杀灭。但是化疗不分敌我，在杀灭癌细胞的同时也杀死了正常的造血干细胞，导致人体血细胞缺乏，危及病人生命。为了让病人尽快恢复造血功能，挽救病人的生命就需要输注造血干细胞，但如果两个人免疫标记相差太大就会造成过强的排异反应，使得移植失败，病人死亡。自体储存造血干细胞就可以避免这类情况的发生，在小孩出生时期将脐带血或胎盘造血干细胞进行储存，当本人病人需要移植，可直接到胎盘造血干细胞申请，用于自身疾病的治疗。 

在国际专利主分类号：C12N5/08、专利号：ZL011311908、发明名称为“从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的方法”的专利文献中指出胎盘中含有丰富的造血干细胞，因此可以代替异体骨髓来恢复重建患者的骨髓，换言之，即用它来置换骨髓。 

在另一篇的中国专利200610098886公开文献中也提出了“一种从 剖腹产胎盘组织中提取原始间充质和造血干/祖细胞方法”。这种方法可以用来收集来自于胎盘组织的间充质干细胞去建立间充质干细胞库。应用这些方法可以收集并长期冻存现在废弃的新生儿胎盘，脐带血干细胞，胎盘上皮干细胞，胎盘组织间充质干细胞为建立自体或异体的联合干细胞储存库，提供全国乃至全世界患者选择作造血干细胞移植临床应用，以治疗多种恶性肿瘤性疾病，遗传性血液免疫系统疾病，以及由于核事故等原因引起的造血、免疫系统衰竭等。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供涉及一种从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法。使用该方法可以在充分储备一定数量的来自于胎盘的造血干细胞外，同时建立来自于胎盘的间充质干细胞库；除了能够随时提供和病人组织配型相关抗原相符的造血干细胞，还可提供相关抗原相符的来自于胎盘的间充质干细胞，也就是说不但能提供造血干细胞的种子供干细胞移植，也能提供相关抗原相符的间充质干细胞减少GVHD反应，这就可极大的促进造血干细胞移植在临床上的应用，挽救大量垂死的病人。 

为此，本发明解决所述问题的技术方案是： 

1.采集脐带血造血干细胞的步骤：当新生儿娩出后，在距新生儿脐部10厘米处用两把止血钳夹住脐带，再从两钳间剪断脐带后结扎，当胎盘完全从母体排出后，从脐带远端消毒，最好再用75％乙醇消毒 脐带残端、脐带根部及其周围，新生儿抱走正常处理。待胎盘娩出后，用医用手术缝线或其他适宜的材料结扎胎盘上婴儿端的脐带。用0.9％生理盐水将胎盘脐带涮洗一到两次，以清除胎盘上的羊水及胎粪等污物，避免胎盘脐带与其他物品接触。将采集好的胎盘脐带放入无菌一次性胎盘采集盒，盖好盒盖，并确认采集液没过胎盘。针头进入脐带静脉采集脐带血并输入含有抗凝剂的血袋，称为脐带血。 

2、收集胎盘血造血干细胞的步骤：向脐带静脉内注入含有25到50毫升抗凝剂和抗生素的溶液，这抗凝剂可以是肝素，或枸橼酸钠，抗生素是1％的青霉素，链霉素，庆大霉素，也可加制霉菌素，溶液可以是0.9％的生理盐水等渗磷酸缓冲液或DMEM细胞培养液，然后用夹子夹住脐带，竖起脐带一分钟(用手顺着脐带往胎盘处向下捋，让溶液进入胎盘。把整个胎盘无菌的放到采血架，无菌消毒脐带远端，用带有三通管的特制长针头，(粗，有测孔)，各刺入二侧远端动脉，后面连着输液袋(250毫升生理盐水，含肝素或枸橼酸抗凝剂，也可以含有抗菌素)，输液管和输液泵或注射器相连，带有采血袋的针头进入脐带静脉，和进入脐带动脉的针头一起固定。先打开脐带动脉的开关，让盐水，抗凝剂进入胎盘，一直到看到胎盘充盈，然后打开脐带静脉夹子，让血液进入采血袋。轻轻压迫胎盘母面，一直到所有胎盘血，盐水和抗凝剂全部进入采血袋，称为胎盘血。 

3、收集胎盘组织间充质干细胞的步骤： 

3.1当胎盘进入无菌环境后，采用有机溶剂及生理缓冲液清除 胎盘组织和脐带外表的透明质粘液和母血。采用1号消毒剂(酒精、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和碘)，在该消毒剂内，酒精浓度为50％到75％以及含有0.1到0.5％的碘和磷酸缓冲液，pH为7.2到7.6之间，用于清洗胎盘及脐带表面，杀灭任何可能存在胎盘膜和脐带表面上的微生物污染，清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液。采用2号有机溶剂(在1号消毒剂的基础上减去碘)，酒精浓度为50％到75％和磷酸缓冲液，pH为7.2到7.6之间，用于清洗胎盘及脐带表面。3号消毒剂清洁液(酒精和氯化钠)，酒精浓度为50％到75％和0.9％氯化钠，pH为7.2到7.6之间，用于清洗胎盘及脐带表面，磷酸缓冲液(pH7.4)、低分子右旋糖酐及细胞培养液(DMEM)按顺序清洗。在清洗完毕后，剥离胎盘羊膜及绒毛膜，将胎盘组织用手术刀划成米字形。 

3.2采用机械挤压、碾磨及酶的方法和生理缓冲液冲洗的方法的步骤：收取含有上皮和胎盘组织间充质干细胞组织液的混合液。该缓冲液可以含有抗菌素，像青霉素(100U/ml)，链霉素(100g/ml)也可含有2500到10，000单位的无防腐剂的肝素。 

3.3采用输液器(可以用注射器或输液泵从脐带静脉或脐带动脉注入0.25％胰酶(Trypsion)，或0.1-1％胶原酶II(Collegenase)，或0.5％DispenseII酶，也可加入0.05到0.2％的(Ethylene diamine tetra acetic acid)(EDTA)，在37度温箱内孵育含有组织细胞分离酶的胎盘30分钟到90分钟，然后在脐带静脉或脐带动脉内灌注生理缓冲液冲洗，该生理缓冲液的 成分可以是生理盐水，低分子右旋糖甘，磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline)或细胞培养液，像1640，DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)，每冲洗一次，然后挤压一次，收取含有以间充质干细胞为主的血液和组织液的混合液，冲洗，挤压3到5次，时间在30到60分钟之间，这样收取的缓冲液的混合物为胎盘组织间充质干细胞，其体积在100到400毫升之间。该缓冲液可以含有抗菌素，像青霉素(100U/ml)，链霉素(100g/ml)也可含有2500到10,000单位的无防腐剂的肝素。这种用酶消化，搅拌，挤压，洗涤等方法收集的细胞称为胎盘间充质干细胞。 

4、收集羊水，胎膜(羊膜、绒毛膜)干细胞的步骤：从羊水中离心收集干细胞以及从胎盘组织分离羊膜和绒毛膜组织，用生理盐水洗涤后剪碎，采用0.25％的胰酶(Trypsion)或0.1-1％的胶原酶II(Collegenase)，或0.5％DispenseII酶，或加入0.05到0.2％的(Ethylene diamine tetra acetic acid)(EDTA)，在37度温箱内孵育或搅拌30到60分钟，收集、过虑、离心获得的细胞为胎膜上皮干细胞。 

5、收集到的脐带血，胎盘血，羊水干细胞，胎盘间充质干细胞，胎盘上皮干细胞均通过下述处理方法，其步骤是： 

5.1、收集的胎盘血或组织干细胞均通过各层尼龙或钢丝滤网，最小的为50um，收集单个细胞。 

5.2、将来自于胎盘的细胞收集到50毫升的离心管内，在离心机中以1,500g离心10分钟，去掉70％的液体。然后可有以下二种方法。 

5.3、收集的细胞和淋巴细胞分离液按1∶4的比例混合。在离心机中以2500g离心30分钟，去掉残存红细胞以及成熟的粒细胞，收集液面间的细胞，细胞用1640培养液洗二次。 

5.4、另一种方法是将提取的含有胎盘组织原始间充质和造血干/祖细胞溶液和6％高分子羟乙基淀粉(Hespan，大于60，000道尔顿)按1∶6比例混合，1500rpm(500到1,000g)，4度离心5到20分钟，弃去红细胞，保留上清液，然后用低分子右旋糖酐(含盐)将其洗涤三次，把所收集的细胞制成单个核细胞混悬液，并做单个核细胞计数，测定细胞活性，计算CD34、CD4、CD8细胞含量及体外培养的白细胞集落(CFU-GM)。 

5.5、将做完各种检测，包括，病毒，细菌培养和组织配型的脐带血，胎盘血和胎盘组织间充质干细胞分别制成单个核细胞，以1X108/ml的浓度和DMSO(二甲亚砜)混合，且以10％的终浓度DMSO和低分子右旋糖酐降温到零下800C，然后转移到液氮(-1860C)液相中深低温分别保存保存，以备移植时应用。 

5.6、冻融和造血干细胞移植：当临床确认需应用某例造血干/祖细胞时，在病人床前从液氮内取出间充质和造血干/祖细胞，于37℃电动水浴箱内融化，在血细胞几乎即将冻融完毕时，加入低分子右旋糖酐等量混合，按顺序给病人输注。 

6、本发明制备的胎盘组织干细胞一般以静脉输入为主，但也可以局部直接进入到骨髓组织内，也可通过任何其它的途径，像动脉注入等方法输注给病人。本发明主要应用的药学成分或含量有生理盐水、低分子右旋糖酐、脐带血浆、DMEM(Dulbecco’s Modified Essential Medium)培养液、注射用水等。以上所用溶液均是无菌、无热原制备以及可用临床移植的病人。 

7、根据病人的病情需要，可以分别冻融多种来源的干细胞，也可一次性的冻融多种细胞联合给病人应用。对体重小于10公斤的病人可以只用一袋脐带血，对体重大于10公斤小于30公斤的病人可以用脐带血和胎盘血干细胞，对体重大于30公斤以上的病人可用脐带血、胎盘血造血干细胞以及胎盘组织间充质干细胞。 

8、按照条形码的编号，把有关资料输入电脑中储存。在无菌环境中，按条形码的编号从脐带血中提取样本，供以下检测： 

——肝炎病毒及相应抗体：像乙型肝炎，丙型肝炎等 

——性病检测；像梅毒等 

——爱滋病(AIDs)毒抗体检测 

——遗传性溶血性疾病 

——间充质和造血干/祖细胞定量检测(CD34) 

——组织配型(HLA) 

——间充质和造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM) 

——细胞和霉菌培养 

——有核白细胞及单个核细胞计数 

——间充质和造血干/祖细胞的活性(台盼兰染色) 

制取的单个核细胞以1X10⁸/ml和DMSO混合，可分别放于多个25毫升的冰冻保存袋，以10％的DMSO和低分子右旋糖酐浓度，逐步降温到零下80℃，然后转移到液氮(-186℃)液相中深低温保存。 

9、以组织配型(HLA)和干细胞的含量为标准，在联合干细胞库内查询和需移植病人相符的干细胞，并提供临床应用。进行完胎盘采集后，在限定时限内将胎盘运送到干细胞库，由专业的技术人员进行胎盘造血干细胞的分离、提取、检测等技术流程，直到根据最终检测结果来确认所获得的干细胞是否具有长期保存的价值。目前国际上通用的干细胞保存技术是将获得的干细胞储存在-196℃深低温状态，医学研究与临床实践证明保存一百多年的细胞仍然具有活性，而干细胞已有几十年的保存历史，胎盘干细胞库在与客户签订的合同期限内对干细胞库中所保管的胎盘造血干细胞活性负责。胎盘的采集简便易行，不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。过去胎盘通常作为废物丢弃，而从胎盘中提取造血干细胞进行保存，是宝贵的生命资源再生。而数据显示，造血干细胞基因稳定、不易突变，动物实验证明无致瘤性和促瘤性，使用安全可靠，对适应症范围疾病治疗效果好，优于传统医疗手段。 

10、不同来源造血干细胞的比较： 

造血干细胞的来源有：骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞、脐带血造血干细胞、胎盘组织造血干细胞。多种来源的细胞对比为： 

11、从羊水和胎盘组织中收集的干细胞也可以通过细胞培养进一步纯化干细胞，即收集培养后的贴壁细胞。这种干细胞可以冷冻保存也可以直接应用于临床。 

12、从羊水和胎盘组织中收集的干细胞也可以通过细胞培养进一步纯化干细胞，即收集培养后的贴壁细胞。这种干细胞可以冷冻保存也可以直接应用于临床，也可以采用流式细胞分选仪分选和纯化干细胞。 

相比现有技术，本发明具有积极效果是： 

利用本发明涉及的方法可以同时提取和纯化包括骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞、脐带血造血干细胞、胎盘组织造血干细胞、其他血液成分和其他种类干细胞在内的多种来源干细胞。在充分储备一定数量的来自于胎盘的造血干细胞外，可同时建立来自于胎盘的间充质干细胞库；除了能够随时提供和病人组织配型相关抗原相符的造血干细胞，还可提供相关抗原相符的来自于胎盘的间充质干细胞，即不但能提供造血干细胞的种子供干细胞移植，也能提供相关抗原相符的间充质干细胞减少GVHD反应，这就可极大的促进造血干细胞移植在临床上的应用，挽救大量垂死的病人。同时可有效解 决移植时骨髓或动员后外周血来源不足、脐带血数量不够等技术难题；利用本方法制备的多种来源干细胞将有望取代骨髓、动员后外周血和脐带血而用于异基因或同基因(小孩本人的)造血干细胞移植。 

附图说明

图1是来自于脐带血的集落培养，每个集落代表一个造血干细胞的示意图； 

图2是来自于胎盘血的造血干细胞的集落培养示意图； 

图3是收集、浓缩和纯化后和胎盘间充质干细胞的体外细胞培养，细胞在24小时培养后贴，呈现出纤维状细胞的示意图； 

图4是采用物理和生物学的方法浓缩和纯化干细胞的示意图； 

图5是浓缩和纯化后的干细胞体外培养可以分化成为体内各种组织的细胞的示意图； 

图6是胎盘干细胞具有很低的免疫原性的示意图； 

图7是浓缩纯化后的造血干细胞生物特性和基因治疗证实胎盘间充质干细胞可以体外大量培养的示意图； 

图8是胎盘间充质干细胞群的免疫特性变化的示意图。 

具体实施方式

实施例一：收集脐带血 

参见图1，图示为来自于脐带血的干细胞集落培养，每个集 落代表一个造血干细胞。 

采用机械静脉穿刺法收集脐带血，收集的胎盘来自当地的妇产医院或科室。首先，征得孕妇或其直接亲属同意捐献胎盘组织后，查阅孕妇的所有检验报告，证实无任何的病毒、梅毒等和血液有关的病毒感染，然后详细询问孕妇的生育、疾病、遗传、感染等病史，在一切均为正常后，孕妇分娩后，无菌收集胎盘和脐带血。收集完后的脐带血及胎盘组织均附有条形码标签，存放于4℃冰箱。存放时间一般不超过24小时。收集的脐带血采用流式细胞仪检测造血干细胞标记CD34的含量以及造血干细胞的集落培养。 

实施例二：收集胎盘血 

参见图2，图示为来自于胎盘血的造血干细胞的集落培养。该图为来自于胎盘血的干细胞集落培养，对于同一细胞起始浓度比较，在同一时间里来自于胎盘血的干细胞集落细胞数远远比来自于脐带血的干细胞集落细胞数为多。 

把将取完脐带血的胎盘放在一个经过高压灭菌的不锈钢容器内，采用和注射器，输液器或输液泵相联的胶皮管插入脐带动脉，静脉进入胎盘，使胎盘内残余血液从胎盘内挤出，同时采用生理缓冲液冲洗，该生理缓冲液的成分可以是生理盐水，低分子右旋糖甘，磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline)或细胞培养液，像1640，DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)，每冲洗一次，然后挤压一次，收取含有造血干/祖细胞的血液和组织液的混合液，冲 洗，挤压3到5次，时间在30到60分钟之间，这样收取的血液和缓冲液的混合物为胎盘血，其体积在50到400毫升之间。该缓冲液可以含有抗菌素，像青霉素(100U/ml)，链霉素(100g/ml)也可含有2500到10,000单位的无防腐剂的肝素。收集的胎盘血造血干细胞采用流式细胞仪检测造血干细胞标记CD34的含量以及造血干细胞的集落培养。 

实施例三：收集羊水和胎盘间充质干细胞 

参见图3，图示为收集、浓缩和纯化后和胎盘间充质干细胞的体外细胞培养，细胞在24小时培养后贴，呈现出纤维状细胞。 

从健康产妇取出的胎盘组织有两种方法，一种为正常阴道生产，另一种为剖腹产，该发明提出从剖腹产胎盘中提取原始间充质和造血干/祖细胞较好，更能保证细胞不受细菌和其它病原体污染。 

在正常顺产中，由于胎儿和胎盘必须经过非无菌的阴道逸出，这就带来了微生物污染的可能性，采用我们的试验表明提取的细胞受微生物污染的可能性大大降低。 

在无菌的环境和条件下通过剖腹产手术或者在尽量保证无菌的条件下获得胎盘。 

1)在无菌操作下收集羊水和剪断脐带，拿开胎盘。 

2)用无菌生理盐水清洗胎盘，清洗掉所有的血凝块和污染的母血，对胎盘的处理转到下一步。 

3)采用有机溶剂及生理缓冲液清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液和母血。 

胎儿和胎盘在母体子宫中都由羊水包围，而且在脐带外表还含有一种称为透明质酸的粘液，采用一般的溶液很难把它们去掉，我们配制了一种以酒精为主的有机溶剂既能去除这些物质，还能起到消毒灭菌的功能。 

4)采用1号消毒剂(酒精、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和碘)，该消毒剂内，酒精浓度为50％到75％以及含有0.1到0.5％的碘和磷酸缓冲液，pH为7.2到7.6之间，用于清洗胎盘及脐带表面，杀灭任何可能存在胎盘膜和脐带表面上的微生物污染，清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液，然后收集脐带血，最后剪除脐带和胎盘表层的胎盘膜。 

5)采用2号有机溶剂(在1号消毒剂的基础上减去碘)，酒精浓度为50％到75％和磷酸缓冲液，pH为7.2到7.6之间，用于清洗胎盘及脐带表面。3号消毒剂清洁液(酒精和氯化钠)，酒精浓度为50％到75％和0.9％氯化钠，pH为7.2到7.6之间，用于清洗胎盘及脐带表面，磷酸缓冲液(pH7.4)、低分子右旋糖酐及细胞培养液(DMEM)按顺序清洗。在清洗完毕后，将胎盘组织用手术刀划成米字形。 

6)采用机械挤压、碾磨及酶的方法和生理缓冲液冲洗的方法，收取含有原始间充质和造血干/祖细胞的血液和组织液的混合液，制备成间充质和造血干/祖细胞浓缩液。 

7)采用输液器(可以用注射器或输液泵从脐带静脉或脐带动脉注入0.25％胰酶(Trypsion)，或0.1-1％胶原酶II(Collegenase)，或0.5％DispenseII酶，也可加入0.05到0.2％的(Ethylene diamine  tetra acetic acid)(EDTA)，在37度温箱内孵育含有组织细胞分离酶的胎盘30分钟到90分钟，然后在脐带静脉或脐带动脉内灌注生理缓冲液冲洗，该生理缓冲液的成分可以是生理盐水，低分子右旋糖甘，磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline)或细胞培养液，像1640，DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)，每冲洗一次，然后挤压一次，收取含有以间充质干细胞为主的血液和组织液的混合液，冲洗，挤压3到5次，时间在30到60分钟之间，这样收取的血液和缓冲液的混合物主要为胎盘组织血，其体积在100到400毫升之间，含有大量的间充质干细胞。该缓冲液可以含有抗菌素，像青霉素(100U/ml)，链霉素(100g/ml)也可含有2500到10，000单位的无防腐剂的肝素。这种用酶消化，搅拌，挤压，洗涤等方法收集的细胞称为胎盘间充质干细胞，采用同样的方法不仅间充质干细胞可以从胎盘内提取而且也可以从胎盘羊膜，绒毛膜和脐带内提取。 

实施例四：采用物理和生物学的方法浓缩和纯化造血干细胞 

参见图4，图示为左侧为来自于脐带血的干细胞体外培养，右侧为来自于胎盘血的干细胞体外培养，在同一时间，同一细胞起始浓度，明显的看出来自于胎盘血的干细胞体外细胞成团，大量聚集，有大量红细胞生成；说明胎盘内的干/祖细胞体外培养存活时间长，增值倍数高。 

应用上述方法从脐带血，胎盘血和胎盘组织中分离的造血干细胞和间充质干细胞实际上是一群细胞，它含有红细胞、血小板，具有分 化成不同组织细胞的间充质干细胞，不同时期的造血干细胞以及成熟的粒细胞和淋巴系统细胞。本发明用以下方法浓缩和纯化这些干细胞。 

1).采用沉淀、离心的方法浓缩造血干细胞 

准确测量按上述二种方法从胎盘组织中分离的组织细胞体积，应用不含血清的DMEM液洗二次，按1∶6的比例加入羟乙基淀粉(HES)，，然后在离心机内以200g，温度12℃，时间5分钟，弃去富含红细胞的沉淀物，上清液再次离心800g，温度12℃，时间15分钟，弃去上清液。收集沉于管底的细胞，加入DMEM液把沉淀细胞制成混悬液，以1∶4的比例加到淋巴细胞分离液的上层，然后以800g，温度12℃，时间30分钟离心。吸取在淋巴细胞分离液和上层液体间的细胞，加入DMEM培养液，洗涤2次，最后做细胞计数和活性检测。 

2).采用生物学抗体-磁珠法纯化造血干细胞的方法纯化造血干细胞。 

本发明的另一个方案是采用抗CD4单克隆抗体和一种载体相结合，这种支持载体往往是磁珠。然后使上述浓缩的来自于胎盘组织的浓缩原始间充质和造血干/祖细胞群和这抗体相接触，这样细胞群内的成熟淋巴细胞会和抗体相结合，并粘附于支持载体。此时，若是磁珠，可用吸铁装置吸附磁珠。洗涤去未和磁珠相结合的细胞，即胎盘血原始间充质和造血干/祖细胞。若采用和生物素相结合的单克隆抗体，则可应用含抗生素抗体的生物柱，当未结合抗体的细胞通过该生物珠时，均被洗涤出去。采用以上二种方法，可获得较为 纯化的间充质和造血干/祖细胞，而且清除了90-95％的成熟淋巴细胞。 

实施例五： 

参见图5，图示为左上角为肌肉纤维细胞；右上角为神经细胞；左下角为软骨细胞；右下角为纤维基质细胞。 

浓缩和纯化后的干细胞体外培养可以分化成为体内各种组织的细胞。提取的干细胞在一定的细胞刺激因子的作用下，可以分化成各种人体细胞。 

实施例六：胎盘干细胞具有很低的免疫原性 

参见图6，图示为证明来自胎盘的细胞具有免疫调节功能，以及不会致肿瘤性。 

对20只无免疫功能小鼠注射胎盘间充质干细胞，无一例发现小鼠死亡或产生肿瘤，而且这种来源的PMSC具有低免疫原理，有实验指出把这种细胞和具有很强免疫原的单核细胞共同培养(混合淋巴细胞培养)，并不会刺激PMSC细胞的增殖，相反的还会抑止液全淋巴细胞反应，实验也证明，把PMSCS细胞输注给小鼠，在移植150天后，仍可从多种组织中检测到人源微嵌合体，证明PMSCSC能主动迁移和整合入动物的特定器官并且动物对这些异种细胞主动耐受，这正像2002年周胜利教授发表的论文指出，人来源的干细胞能在小鼠肝脏组织中长期存活，如图中数字编号1、2、3、4、5、6、7指出，7为小鼠肝脏本身的DNA；1为DNA标准品；从2到6分别为人胎盘间充质干细胞输注小鼠后1到5个月的肝脏标本DNA，可以明 显看出人胎盘间充质干细胞仍然在小鼠肝脏中存活，不会被小鼠排斥。 

实施例七：胎盘干细胞可以体外大量培养。 

参见图7，图示为浓缩纯化后的造血干细胞生物特性和基因治疗证实胎盘间充质干细胞可以体外大量培养。 

该图中c曲线为脐带血干细胞，b曲线为胎盘血干细胞，a曲线为胎盘间充质干细胞，长期体外培养：增殖能力最强的为胎盘间充质干细胞，是脐带血干细胞的4倍，而在9星期培养后，脐带血干细胞都已经死亡，11星期后，胎盘间充质干细胞增殖到最高峰。 

本发明分别比较来自于胎盘组织的原始间充质和造血干/祖细胞、骨髓细胞以及脐带血细胞的生物特性。正如前述，细胞集落培养来自于胎盘组织的原始间充质和造血干/祖细胞集落形成较晚，但集落生长快，集落细胞大，能形成多次集落。当把这三类细胞长期培养时，来自胎盘组织的原始间充质和造血干/祖细胞能很快的形成贴壁细胞，而且这些贴壁细胞很易多次传代。这三类细胞在和含有造血干细胞刺激因子，像SCF(10μg/ml)，IL-3(100μg/ml)以及FLT-3(50ng/ml)，长期培养时，来自于胎盘组织的原始间充质和造血干/祖细胞维持时间长，增殖量多。 

本发明分别采用来自于采用胎盘组织原始间充质和造血干/祖细胞、脐带血细胞，等量混合的来自于胎盘组织细胞和脐带血细胞注射于同位素致死量的免疫功能缺陷的小鼠，发现这三类细胞都能在小鼠骨髓内生长，无任何不良反应。 

基因治疗为当前治疗各种疾病的有效手段。带有正常或治病基因的质粒可以有效的嵌合入来自于胎盘组织原始间充质和造血干/祖细胞的DNA链中，并随着细胞的分裂而不断的复制，转录成能表达蛋白质的RNA，起到治疗疾病的效果。 

参见图8，图示为胎盘间充质干细胞群的免疫特性变化。 

采用流式细胞仪分析胎盘间充质干细胞，发现T和B淋巴细胞群不同于血液中的比例，含有更高辅助细胞，更少的杀伤细胞。胎盘间充质干细胞：是指新生儿脐带血管的来源，胎盘形成脐带和脐带血管，这些血管在胎盘内分的更细，分化功能更强，更为重要的是由于和母体接触更近，从而发挥免疫抑制排斥的效果更为强烈，这也是母体不会排斥胎儿的原因之一。 

实施例八：联合干细胞数的含量 

本发明是一种从健康产的胎盘和脐带中提取多种来源的干细胞，即脐带血干细胞，胎盘血干细胞和来自于胎盘和脐带组织的干细胞，将这些干细胞分别做各种检测，浓缩，纯化和保存，建立联合干细胞库。每个胎盘的脐带血可以提取平均为1.50.X109有核细胞，胎盘血平均可提取2.8.X109个有核细胞，胎盘组织间充质干细胞为3.5.X109有核细胞，细胞活性为95％以上。三种来源的造血干细胞标记细胞CD34总数为1.5.X108，微生物污染率低于5％以下。按照我们的方法建立的多种来源的干细胞库，其造血干细胞标记细胞CD34的含量可以满足临床上120公斤以下病人的造血干细胞移植要求。这些间充质干细胞细胞能加强病人骨髓破坏后的微环境，增加移植时的造血干细胞的含量，加速了间充质和造血干/祖细胞的植入时间，预防GVHD的反应，使这种胎盘，脐带血干细胞不但可以适用 于一切人群，而且可以大大缩短病人移植后的零细胞期，从而提高了病人的存活率。 

实施例九：建立异体联合羊水和胎盘脐带干细胞库 

自Rubinstein(Rubinstein P，et al；Proc.Natl.Acad.Sci.USA92，10119-10122，1995)建立脐带血库以来，在世界范围内已开展数万多例脐血造血干细胞移植，挽救了许多患者的生命，可是由于(1)脐带血内的有核细胞及干/祖细胞的有限，并不太适宜于体重较大病人移植；(2)可能由于脐带血内细胞含基质细胞或能转化成基质细胞较骨髓内为少，从而移植后的脐血在患者内生长缓慢。就此，本发明提供了建立异体联合羊水和胎盘脐带干细胞库及应用该库的方法步骤： 

1)建立电脑联网和条形码系统：便于资料储存，保证所有数据的准确，而且也可以迅速根据病人的HLA配型结果查询到和病人HLA相符的胎盘——脐带血干细胞，用以临床移植。 

2)和医院共同合作收集胎盘和脐带血：在征求得孕妇同意的情况下，收集各项检测及孕妇家庭中无相关遗传病史的脐带血和胎盘。 

3)检测：所有从医院收集的脐带血均需再做一次和病毒细胞、霉菌和遗传病有关的各项检测，只有各项检测指标阴性的脐血才能提供给临床移植。 

4)组织配型(HLA)：HLA配型的准确性是关系到移植是否成功的主要因素之一，常用于脐血移植的HLA抗原有I类：A，B和II类DR。这二类HLA配型需采用分子生物学(DNA)检测，而对II类DR更需 应用高分辨检测。 

5)胎盘及脐血干/祖细胞保存、提取、纯化：浓缩的脐带血，胎盘血干/祖细胞及胎盘间充质干细胞和冰冻保存剂(DMSO)混合，在液氮内深低温降温到-80℃，然后转移到液氮内(-196℃)长期保存。冻融和造血干细胞移植：当临床确认需应用造血干细胞库内的某例脐血和胎盘组织干细胞/祖细胞时，在病人床前从液氮内取出脐血及胎盘组织干/祖细胞，于37℃电动水浴箱内融化，在血细胞几乎即将冻融完毕时，加入白蛋白和低分子右旋糖酐等量混合，按顺序给病人输注。 

实施例十：建立自体羊水和联合胎盘脐带肝细胞库 

自体联合胎盘脐带血库是孕妇在新生儿出生后，贮存胎盘间充质干细胞及胎盘，脐带血干/祖细胞，其目的是： 

(1)因为胎盘和脐带血内含有丰富的造血干/祖细胞，出生以后贮存就避免了孩子长大以后，若患有肿瘤，尤其是血液疾病时，缺乏供体时的危险，这特别适合于家庭中有肿瘤或血液病的新生儿； 

(2)目前，大量的科学实验证明，在组织中含有早期能分化成各种组织细胞，像肝脏、皮肤、神经等的干细胞。生命越早期，这种干细胞的含量就越高。若能保存胎盘中的组织细胞，无疑是给新生儿建立了一个生命银行。在新生儿的成长发育过程中，由于各种原因，像外伤、脏器衰竭等，而需要脏器细胞移植，均可通过胎盘间充质干细胞的体外培养，分化成所需要的细胞，供临床应用。由于这些细胞是来自于新生儿的自体细胞，不存在排斥和不能生长等问题， 在某种意义上讲，可以为新生儿提供第二次生命的机会。具体程序除以下几点外，其余的和异体联合胎盘脐带血库一样。 

1)在收集羊水；胎盘和脐血时，孕妇或其直系亲属要和我方签订协议书，同意由我方有价保存新生儿的胎盘和脐血干细胞，而我方也需保证未得孕妇家属同意，不得把该份脐血细胞用于任何人。 

2)脐血干/祖细胞及胎盘组织细胞要分多袋储存，以便于在不同时间分次给新生儿应用。 

3)当需要除造血干细胞移植以外的用途时，例如需要用于肝脏损伤、皮肤移植等，按临床要求冻融胎盘组织细胞，在细胞培养液(如1640、DMEM)内培养，待胎盘组织细胞长满培养瓶后，换用相应的含刺激因子的培养液，如肝脏细胞刺激因子、神经细胞刺激因子，促使胎盘组织细胞向相应的细胞分化，待细胞分化完全后，给病人应用。 

4)当新生儿在生长、发育过程中，任何原因引起需造血干细胞移植来挽救其生命时，可随时应用其储存的脐血及组织干细胞来替代其患病的细胞。 

基因治疗为当前治疗各种疾病的有效手段。胎盘组织细胞及脐血干/祖细胞是基因转染的很好载体。带有正常或治病基因的质粒可以有效的嵌合入胎盘组织细胞的DNA链中，并随着细胞的分裂而不断的复制，转录成能表达蛋白质的RNA，从而起到治疗疾病的效果。 

通过以上对本发明的操作方法，其特点和优越性均作了详细的阐明，应值得指出的是尽管本文描述了以上几种案例，人们也可根据 本发明的基础，提出各种变化和个性的形式也是可能的，但均以包含在本发明所要求保护的范围之内。 

Claims (8)

1.一种从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括使用采血器材收集脐带血，然后以机械的方式收集胎盘血，最后采用机械、酶消化和单克隆抗体-磁珠法从胎膜及胎盘组织中提取的干细胞的方法，具体包括如下步骤：

首先从健康产妇的一个胎盘和脐带中同时提取和储存多种来源的干细胞，所述干细胞包括脐带血造血干细胞、胎盘血造血干细胞、羊水、胎盘羊膜及绒毛膜上皮干细胞和来自于胎盘组织的间充质干细胞；其中，每个胎盘的脐带血可以提取平均为1.50X10⁹细胞、胎盘血平均可提取3.8X10⁹个细胞、羊水中可以提取平均为3.0X10⁸、胎盘羊膜以及绒毛膜上皮干细胞2.0X10⁸胎盘组织间充质干细胞为3.5X10⁹有核细胞、细胞活性为95％以上，多种来源的造血干细胞其CD34阳性标记细胞总数为2.5X10⁸，微生物污染率低于5％以下；

将上述来源的干细胞建立联合干细胞库；

将联合干细胞库备案并组织配型(HLA)以符合临床的要求；

所述干细胞还可以是从脐带静脉注入抗凝剂、抗生素，以输液泵连续循环的方式从脐带动脉处收集的胎盘血造血干细胞；

所述干细胞还可以是将羊水和剥离胎膜或胎盘以挤压、剪碎、研磨或离心的机械方式或酶消化的方法收集且被清洗的组织间充质干细胞，再用单克隆抗体磁珠法纯化该间充质干细胞，之后将纯化后的间充质干细胞在体外培养成如皮肤、粘膜、神经、肾、肝、胰岛定向的组织细胞；将上述干细胞临床分别做各种检测，浓缩，纯化存放于保持无菌以及控制温度在0℃到4℃之间的收集箱内；将备用干细胞储存在深低温状态。

2.根据权利要求1所述的从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法，其特征在于，所述多种来源的干细胞，仅需要做一次性的检测，即微生物、血型和组织配型(HLA)这种一次性检测的结果适合于多种细胞的临床应用；

其中的脐带血干细胞可供给需移植的儿童；

其中的脐带血和胎盘血干细胞可以供给体重较大的病人；

其中的胎盘间充质干细胞可以应用于细胞治疗；

其中的上皮干细胞可用于组织工程的种子干细胞或一次性地多种细胞联合供给成年人的造血干细胞移植；也可用于美容及需做皮肤移植等疾病的细胞治疗。

3.根据权利要求1所述的从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法，其特征在于，所述多种来源的干细胞，其中的脐带血干细胞以临床上常为30公斤以下的病人提供造血干细胞移植；

其中的脐带血干细胞和胎盘血干细胞的联合应用以临床上常为30公斤以上的病人提供造血干细胞移植；

其中的一次性的多种细胞联合应用以体重大于60公斤以上病人的造血干细胞移植。

4.根据权利要求1所述的从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法，其特征在于，所述的来自于胎盘组织的间充质和上皮干细胞可以用于基因转染、基因治疗及细胞组织工程应用和研究。

5.根据权利要求1所述的从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法，其特征在于，所述的来自于胎盘组织的间充质干细胞可以应用于干细胞移植也可单独用于细胞治疗，还可以制备成针剂，用于帮助和促进干细胞再生并预防移植物排宿主病(GVHD)。

6.根据权利要求1所述的从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法，其特征在于，所述的来自羊水，胎盘组织的间充质和造血干/祖细胞可以在体外培养后应用于病人。

7.根据权利要求1所述的从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法，其特征在于，从健康产妇的一个胎盘和脐带中同时提取多种来源的干细胞，即脐带血造血干细胞、胎盘血造血干细胞、羊水和来自于胎膜上皮干细胞和胎盘的间充质干细胞，用以建立异体干细胞库，并提供这多种来源的干细胞供异体干细胞移植和细胞治疗。

8.根据权利要求1所述的从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法，其特征在于，所述的从健康产妇的一个胎盘和脐带中同时提取多种来源的干细胞，即脐带血干细胞、胎盘造血干细胞、羊水和来自于胎膜和上皮干细胞和胎盘组织的间充质干细胞，用以建立自体干细胞库，并为新生儿保存这多种来源的干细胞，提供新生儿或其有关亲属未来应有的自体干细胞保存。

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