CN110157666A - 脐带间充质干细胞MSCs及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脐带间充质干细胞MSCs及其培养方法和应用，属于生物医药技术领域。该培养方法包括MSCs培养步骤：原代培养：取脐带的华通胶组织，以无血清培养基在低氧条件下培养；传代培养：收集上述P1原代细胞，制得单细胞悬液，离心获得细胞沉淀；向该细胞沉淀中加入无血清培养基，在低氧条件下培养至传代，连续培养到P2‑P3代；每次传代培养时加入盐酸川芎嗪和参麦注射液，待细胞长至预定融合度时，消化、至P6代收集细胞；表型检测：对上述收集得到的细胞进行表型检测，待用。采用该方法培养得到的MSCs制剂，降低了干细胞容易聚集成团特性，从而避免静脉输注进入人体后出现细胞粘附、缗钱状红细胞，细胞团栓塞的情况，使MSCs干细胞技术更好地应用于临床。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种脐带间充质干细胞MSCs及其培养方法和应用。
背景技术
据世界卫生组织预测，至2020年，非传染性疾病将占我国死亡原因的79％，其中心血管病将占首位。由于心肌细胞是终末分化细胞，坏死细胞不能再生，只能通过瘢痕形成来代替，导致心肌收缩功能丧失，发生顽固性心力衰竭而死亡。根据我国50家三甲医院病例调查显示：心衰的住院率虽然占同期心血管病的20％，但死亡率却占40％。五年的存活率与恶性肿瘤相仿。临床药物、介入和手术治疗都属于被动、补救性治疗，不能替代坏死的心肌；而心脏移植由于供体困难在临床上很难推广。与此同时，干细胞移植提供了一种全新的治疗方法。
脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞。在体外特定的诱导条件下，可分化为成纤维细胞、脂肪细胞、血管上皮细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞、胰岛β细胞和内皮细胞等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。MSCs免疫源性低，不论是自体还是同种异源的MSCs，一般都不会引起宿主的免疫反应。MSCs有向衰退、缺血或损伤组织聚集的特性，这种特性医学上称为归巢现象。MSCs存在于脐带、成体间质组织中及骨髓、乳牙等处，其中，骨髓间充质干细胞(BMSC)只占骨髓有核细胞总数的1/10000-100000，MSCs在胎盘及脐带中大量存在，而且较纯净。国内外学者在体外培养中将MSCs经细胞传代后用5-氮胞苷(azacytidine,5-aza)对其进行诱导分化，可见有心肌细胞样超微结构，有心肌特异性基因表达，并有持续的动作电位，表明他们成功地诱导出心肌细胞。另有学者将MSCs直接注入自体心肌组织内，发现有心肌样细胞形成，具有肌钙蛋白T和肌球蛋白重链的心肌细胞特异性标志，表明MSCs在体内微环境条件下可以诱导分化为心肌细胞。
目前对MSCs的培养条件意见不统一，对于培养条件，如培养箱的氧气密度、湿度等，培养基的选择，血清的种类和浓度，首次换液的时间、换液频率和换液的液体量等各种因素都将影响MSCs的增殖。现在普遍的MSCs体外培养的体系是在常氧浓度的完全培养基中培养，完全培养基通常含有动物胎牛血清。
然而，由于不同年龄、不同组织来源中提取的间充质种子干细胞的活力潜力有差异，而培养方法的不同也很大方面影响了MSCs的特性,MSCs能够高表达CXCR4(细胞趋化因子受体4)，但经过常氧下培养后CXCR4表达能力明显降低。用胎牛血清培养方法可能因为MSCs输注人体后由于动物血清残存而引起的血清病，不利于干细胞治疗的临床应用。并且，静脉输注的体外培养的MSCs，只有极少数MSCs能植入人体或动物受伤处，多数细胞滞留于微血管处(特别是肺部)而死亡。同时，MSCs有贴壁生长的特性，在体外培养也经常出现MSCs成团现象，因此在静脉输注进入人体后会出现干细胞粘附、聚集成团，细胞团栓塞的情现象。
以上原因使体外培养的MSCs都会在治疗疾病上带来不良反应、影响疗效，阻碍干细胞的临床治疗开展。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种MSCs及其培养方法和应用，采用该方法培养得到的MSCs，降低了干细胞聚集成团特性，从而避免静脉输注进入人体后出现干细胞粘附、缗钱状红细胞及细胞团栓塞的情况。
一种脐带间充质干细胞MSCs的培养方法，包括MSCs培养步骤，所述MSCs培养包括以下步骤：
原代培养：取脐带的华通胶组织，以无血清培养基在低氧条件下培养，直至达到传代标准；
传代培养：收集上述P1原代细胞，去除残留培养基，制得单细胞悬液，离心获得细胞沉淀；向该细胞沉淀中加入无血清培养基，在低氧条件下培养至传代，连续培养到P2-P3代；随后每次传代培养时加入盐酸川芎嗪和参麦注射液，待细胞长至预定融合度时，消化、收集细胞；
表型检测：对上述收集得到的细胞进行表型检测，符合CD31、HLA－DR、CD34和CD45阴性，CD44、CD73、CD90和CD105阳性的细胞为目标MSCs干细胞，待用。
本发明人在实践工作中发现，针对静脉输注的体外培养的MSCs，只有极少数MSCs能植入受者受伤处，多数细胞滞留于微血管处而死亡；在体外培养也经常出现MSCs成团、在静脉输注中会出现粘附、聚集成团，出现细胞团栓塞的情况。给体外培养的MSCs应用在疾病治疗方面带来不良反应、影响疗效，阻碍干细胞的临床应用。在上述基础上，我们创新性地运用具有益气固脱、养阴生津之功的中药参脉注射液及具有活血化瘀药性特点的中药川芎的有效成分川芎嗪的盐酸盐加入到细胞培养液中，其中含有的人参皂苷能促进细胞的DNA和RNA的合成，并能提高血浆中以AMP值、抑制血小板凝集、降低血浆中的纤维蛋白原含量、清除微血栓、起到改善干细胞微环境的作用；麦冬有稳定细胞膜作用；盐酸川芎嗪的作用有：提高细胞和血小板表面电荷，抑制血小板聚集及血栓形成，改善血液流变学特性作用。盐酸川芎嗪通过抗氧化、抑制炎性、抑制细胞凋亡，上述多种活性成分共同作用，充分发挥细胞保护作用，从而降低MSCs成团、在静脉输注中出现粘附、聚集成团，出现细胞团栓塞、红血球出现缗钱状变化的情况，大大提高了脐带间充质干细胞MSCs在防治心梗方面的应用能力。
在其中一个实施例中，所述传代培养步骤中，所述盐酸川芎嗪的加入量浓度为40-80mg/L，所述参麦注射液的加入体积百分比为0.5％。所述参麦注射液选用可以直接注射于人体的注射用参麦注射液。
在其中一个实施例中，所述MSC培养步骤中，所述低氧条件为：在氧浓度3-10％的二氧化碳培养箱中培养，优选5％氧浓度；所述无血清培养基选自：间充质干细胞无血清培养基，或在DMEM、F12、DMEM/F12、RPMI1640基础培养基的基础上添加细胞因子所得到的培养基。上述间充质干细胞无血清培养基优选友康生物公司产品。
目前MSCs培养普遍采用的是常氧下培养，MSCs的植入率低。而采用低氧(3-10％的氧浓度，优选5％氧浓度)下培养MSCs，能提高体外培养的MSCs抵抗血管内低氧环境的能力，实践证明经过低氧处理培养的MSCs细胞增殖及克隆形成能力增强。提高MSCs输注人体后在体内的植入率，从而提高MSCs的疗效。目前广泛应用的MSCs培养体系或多或少都采用了胎牛血清。而我们采用非血清的培养基培养技术，可以避免MSCs制剂输注人体后由于动物血清残存可能引起的血清病。
在其中一个实施例中，所述原代培养步骤中，所述传代标准为长至80％-90％融合度；
所述传代培养步骤中，加入盐酸川芎嗪和参麦注射液后继续培养传代至P4-P6代。
在其中一个实施例中，在所述MSCs培养步骤之前，还包括如下MSCs制备步骤；在所述MSCs培养步骤之后，还包括如下质量控制步骤；
MSCs制备：采集剖腹产所得脐带组织，冷藏运输，且确保样本未经高能射线辐照，清洗，剥离组织中血管，取得组织中的华通胶组织；
质量控制：对获得的目标MSCs进行细胞鉴别及纯度检测、细胞生长活性检测、细菌及支原体检测、内毒素检测、外源性致病因子检测、异常免疫性反应检测、致瘤性检测和/或添加成分残余量检测。
在其中一个实施例中，所述MSCs制备步骤之前，还包括如下供者筛查步骤：
1)供者于样本采集前做烈性传染病检测，所述烈性传染病包括：艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒螺旋体、巨细胞病毒、EB病毒、吞噬T细胞病毒，上述烈性传染病均为未曾感染为合格；
2)供者于样本采集前做遗传病DNA基因检测，所述遗传病包括：软骨发育不全、先天性耳聋、抗维生素D佝偻病、苯丙酮尿症、血友病、进行性肌营养不良、6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏，上述传染病均为阴性为合格；
3)供者于样本采集前3个月期间内未曾前往或停留疫区；
同时符合上述条件即为合格供者。
上述供者筛查中，为了防止培育的脐带MSCs带有先天遗传病易感基因给回输病人带来不良影响，我们严把细胞产品质量关，从原料、半成品及产品三关进行把控。
本发明还公开了上述的MSCs的培养方法培养得到的干细胞。
本发明还公开了一种MSCs干细胞注射剂，包括上述的MSCs干细胞、肝素钠、复合氨基酸和药学上可接受的辅料。
本发明的MSCs可配制成复合制剂，用来防治人体心肌梗塞及严重的冠状动脉三支病变、狭窄。
在其中一个实施例中，所述复合氨基酸包括：L－异亮氨酸、L－精氨酸、L－亮氨酸、L－天门冬氨酸、L－赖氨酸、L－半胱氨酸、L－谷氨酸、L－蛋氨酸、L－组氨酸、L－苯丙氨酸、L－脯氨酸、L－苏氨酸、L－丝氨酸、L－色氨酸、L－酪氨酸、L－缬氨酸、L－甘氨酸和L－丙氨酸；所述复合氨基酸的浓度为10±2g/100ml。所述复合氨基酸可直接采用复方氨基酸注射液18AA-Ⅲ。
用上述比例配成的氨基酸混合液可直接注射到人体血液中以补充营养，部分地代替血浆，对创伤、烧伤和手术后的病人有增进抗病力，对心肌梗塞病人有促进康复的作用。
在其中一个实施例中，所述MSCs的浓度为(0.5-1.5)×109个/100ml。
本发明还公开了上述的脐带间充质干细胞MSCs在用于制备预防和治疗心肌梗塞的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种脐带间充质干细胞MSCs的培养方法，采用低氧非血清条件下培养MSCs，能提高体外培养的MSCs细胞增殖及克隆形成能力，增强在血管内低氧生长的适应能力，提高MSCs输注人体后在体内的植入率，并可避免MSCs输注人体后由于动物血清残存可能引起的血清病。另外创新性的运用具有益气固脱、养阴生津之功的中药参脉注射液及具有活血化瘀药性的中药川芎的盐酸川芎嗪制剂加入细胞培养液中，盐酸川芎嗪性质稳定、加入后可降低MSCs细胞抱团现象、有效防止静脉输注中出现粘附、聚集成团，红细胞出现缗钱状变化及细胞团栓塞的情况的出现。
并且，本发明对取材非常严格，首创对供者及每条用于生产的脐带做严重遗传病DNA基因检测，保证生产的MSCs的可溯源，排除带有先天遗传病易感基因给回输病人带来不良影响
最后我们经实践还发明了用低氧非血清培养的MSCs配制成复合制剂。该复合制剂由使用时提前配制的18种L-氨基酸、低氧非血清MSCs。MSCs组合液及在后输注的含肝素的生理盐水复合配制而成。用本法培养所收获的MSCs干细胞制剂，提高了防治人体心肌梗塞及严重的冠状动脉三支病变、狭窄的治疗效果。
附图说明
图1为实施例1中P3代细胞加入参脉注射液后第一天的细胞图；
图2为实施例1中P3代细胞加入盐酸川芎嗪后第一天的细胞图；
图3为实施例1中P3代细胞加入盐酸川芎嗪及参脉注射液后第一天的细胞图；
图4为实施例1中P4代细胞加入参脉注射液后第一天的细胞图；
图5为实施例1中P4代细胞加入盐酸川芎嗪后第一天的细胞图；
图6为实施例1中P4代细胞加入盐酸川芎嗪及参脉注射液后第一天的细胞图；
图7为实施例1中P5代细胞加入参脉注射液后第一天的细胞图；
图8为实施例1中P5代细胞加入盐酸川芎嗪后第一天的细胞图；
图9为实施例1中P5代细胞加入盐酸川芎嗪及参脉注射液后第一天的细胞图；
图10为实施例3中对照组末梢血的细胞图；
图11为实施例3中给药组末梢血的细胞图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
一种MSC干细胞，通过以下方法培养得到：
一、供者筛查
1、供者于样本采集前一个月内抽血做烈性传染病检测，包括但不限于：艾滋病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、梅毒螺旋体(TP)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒、吞噬T细胞病毒(HLTV)，七项传染病检测中有任何一项显示携带病原体(包括梅毒螺旋体既往感染者)供者都被排除在外；
2、供者于样本采集前一个月内抽血做严重遗传病DNA基因检测，包括但不限于：软骨发育不全、先天性耳聋、抗维生素D佝偻病、苯丙酮尿症、血友病、进行性肌营养不良、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD)缺乏(蚕豆病)等；(这一点非常重要，是本方法细胞培养取材重要环节可溯源的重要依据，供者若此项检测阳性，都被排除在外)；
3、供者过去3个月没有前往疫区并停留。
同时符合上述条件即为合格供者。
二、MSCs制备
1、样本采集
通过筛查的供者签署样本捐献协议，供者妊娠期足月后，通过剖腹产手术完成生产，胎盘和脐带组织装入专用无菌采样袋内并加入适量冷藏的组织保护液后密封，在48小时内冷藏(2-8℃)运抵实验室。保证运输过程中采样袋无破裂，袋内液体无泄漏，样本未经过X射线、γ射线等高能射线辐照。
上述样本采用剖腹产的脐带非常重要，这是因为自然娩出的脐带经女性产道时会产生各种微生物的污染，影响MSCs的质量。
2、样本制备
2.1运抵实验室的样本在无菌生物安全柜中打开，脐带组织使用预冷清洗液清洗表面血迹；
2.2脐带剪成2-3cm小段，再次清洗数次；
2.3使用组织镊剥离脐带组织中的动脉和静脉血管，将脐带中的华通胶组织剥离出来置于预冷的组织清洗液中(注意表皮组织不能带入华通胶组织中)。
三、MSCs培养
1、原代培养：
1.1剥离得到全部华通胶组织后，预冷组织保护液清洗数次后置于50ml离心管中，剪碎组织使其体积不大于3×3×3mm3；
1.2剪碎组织中加入适量无血清培养基(含100U/ml青/链霉素)(友康生物公司的MSC干细胞无血清专用培养基)平均接种于T75培养瓶中，每瓶加入10ml培养液，置37℃恒温二氧化碳培养箱中在氧浓度3-10％，优选5％氧浓度的低氧条件下正常培养。
1.3原代培养的组织第5天全量换液，之后3天半量换液，正常情况下第10天左右有细胞迁移出组织块，第15天左右可以长至90％融合度达到传代标准。
2、传代培养：
2.1收集上述待传代的培养瓶中专用培养基，3000rpm离心10分钟，收集上清液备用；
2.2培养瓶中原代细胞使用生理盐水清洗2次，去除残留培养基；
2.3加入3ml 0.05％胰蛋白酶消化细胞并拍打培养瓶，使贴壁的细胞全部脱落，加入5ml离心后的专用培养基终止胰酶，轻轻吹打细胞得到单细胞悬液；
2.4收集细胞悬液，并用生理盐水清洗培养瓶2次，收集全部液体过100μm滤网去除未消化的组织块；
2.5过滤后的单细胞悬液离心，1300rpm×6min，去除上清液；
2.6细胞沉淀中加入15ml生理盐水重悬细胞，混匀后取少量液体计数，再次离心，1300rpm×6min，去除上清液；
2.7细胞沉淀加入无血清培养基(不含抗生素)每500ml制成细胞混悬液。该细胞培养液可以是采用友康生物公司的间充质干细胞无血清专用培养基，还可以是美国GIBCO公司的DMEM、F12、DMEM/F12、RPMI1640基础培养基的基础上添加细胞因子而得到的培养基，根据细胞计数结果按照10000/cm2的密度接种于T175培养瓶中，置于37℃恒温二氧化碳培养箱中在氧浓度3-10％，优选5％氧浓度的低氧条件下正常培养；
2.8待细胞长至90％融合度(约3天)再次传代培养，连续培养到P2代；
2.9从P3到P5代细胞时分别加入盐酸川芎嗪(哈尔滨三联药业股份有限公司按国家标准第二增补本，执行标准的国药准字H20041175注射液，可以直接注射于人体)及参麦注射液(云南植物药业有限公司按国家药品标准(修订)颁布件WS3-B-3428-98-2010执行标准的国药准字Z63021721，可以直接注射于人体)。上述盐酸川芎嗪的浓度为40-80mg/L，参麦注射液的体积百分浓度为0.5％。培养24小时，换液再培养1周，待细胞长至80-90％融合度时收集细胞，对消化后收集的细胞检验；对步骤所得产物进行病源生物检测，排除病源学污染。
分三组：a、仅加入参麦注射液；b、仅加入盐酸川芎嗪；c、同时加入两者进行对比，结果如图1-9所示，从上述附图中可看出，仅加入盐酸川芎嗪或仅加入参麦注射液后，均有一定程度改善细胞抱团现象，但同时加入盐酸川芎嗪和参麦注射液，具有最佳的效果。
3、表型检测：
3.1对上述收集得到的细胞进行表型检测，符合CD31、HLA－DR、CD34和CD45阴性，CD44、CD73、CD90和CD105阳性的细胞为合格的目标MSC干细胞细胞。
3.2将合格MSC干细胞细胞根据计数结果以1×107/ml的密度重悬于专用冻存液中；冻存液悬浮的单细胞加入冻存管中(每支1ml)并贴上标签，标签信息应包括但不限于细胞种类、细胞编号、冻存代次、每支冻存细胞数量、冻存日期等，使用封口膜密封冻存管管口，通过程序降温仪缓慢降温至-90℃，程序降温结束后直接置于-205℃～-185℃(优选-196℃)液氮中长期保存。
四、质量控制
本实施例的脐带MSC干细胞MSC质量控制参考2015年中国食品药品监督管理局颁布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》中关于干细胞制剂的质量检测标准。
1、细胞鉴别及纯度检测：通过细胞形态、多向分化潜能、表面标志物检测鉴别培养的细胞是否为MSC及其中MSC纯度，其中表面标记物包括阳性指标(＞95％)：CD44、CD73、CD90、CD105，阴性指标(＜2％)：CD34、CD45、HLA-DR，多向分化潜能。
2、细胞生长活性：通过CCK8、细胞倍增时间、细胞周期、克隆形成率、端粒酶活性及端粒长度检测细胞生长活性，通过β半乳糖苷酶检测细胞衰老特性。
3、细菌及支原体检测：参考2015版《中华人民共和国药典》中生物制剂无菌及支原体检测规程，对样本的细菌、真菌、支原体污染进行检测。
4、内毒素检测：参考2015版《中华人民共和国药典》中内毒素检测规程，对样本的内毒素进行检测。
5、外源性致病因子检测：对供者来源的烈性传染病进行病原体DNA检测，包括艾滋病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、梅毒螺旋体(TP)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒、吞噬T细胞病毒(HLTV)；牛源性特定病毒检测，包括疯牛病、口蹄疫等；猪源性特定病毒，包括猪细小病毒。
6、异常免疫性反应：检测MSC对人总淋巴细胞和特定淋巴细胞亚群(包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞)的增殖影响和相关细胞因子(包括INF-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10等)分泌的影响。
7、致瘤性检测：通过大剂量MSC植入免疫缺陷动物体内观察肿瘤发生，检测细胞的致瘤性。
8、添加成分残余量检测：检测制备过程中残留的影响干细胞制剂安全性的成分(包括牛血清白蛋白(BSA)、抗生素、特定细胞因子、酚红等)在终产品中的残余量。
实施例2
一种MSCs干细胞注射剂，通过以下方法得到：
1、准备工作：
1.1打开水浴锅复温，使水温稳定在37℃；
1.2生物安全柜提前30min紫外消毒并通风；
1.3根据复苏的细胞数量准备好生理盐水并加入离心管中，生理盐水体积至少是全部冻存液体积的10倍；
2、信息核对：
根据预定需求从液氮罐中取出冻存的细胞，仔细核对细胞种类、细胞编码、细胞数量、细胞代次等关键信息，以防有误。
3、液氮罐中取出的冻存细胞立刻放入完成复温的水浴锅中复苏2min直至冻存液完全融化，不停摇晃并保证冻存管口不接触水浴锅中的水；
4、取出复苏后的冻存管，75％酒精擦拭管身转入生物安全柜中；
5、将冻存管中的细胞悬液全部吸入装有生理盐水的离心管中，并用生理盐水清洗管内2-3次，液体全部转入离心管中，混匀；
6、细胞悬液离心1300rpm×6min，去除上清液，新鲜生理盐水再次重悬细胞离心，反复清洗3次；
7、清洗完成后加入100ml生理盐水，为一组组合制剂。
每组组合制剂中含低氧MSCs的细胞数(0.5-1.5)×109个，每组组合制剂中所述生理盐水含低分子肝素钠10-20Um，每组组合制剂中含18种L-复合氨基酸。
所述复合氨基酸注入液由18种氨基酸组成，包括L－异亮氨酸、L－精氨酸、L－亮氨酸、L－天门冬氨酸、L－赖氨酸、L－半胱氨酸、L－谷氨酸、L－蛋氨酸、L－组氨酸、L－苯丙氨酸、L－脯氨酸、L－苏氨酸、L－丝氨酸、L－色氨酸、L－酪氨酸、L－缬氨酸、L－甘氨酸和L－丙氨酸，每100ml复合氨基酸注入液中含10±2g氨基酸。(所述是复方氨基酸注射液18AA-Ⅲ，市售可得)
重悬细胞并过40μm滤网去除成团的细胞，得到单细胞悬液；
8、取少许细胞悬液计数，得到细胞总数及细胞存活率，确保细胞数量及存活率不低于预定要求；
9、细胞悬液装入专用细胞回输袋(瓶)内并彻底密封，细胞悬液装入回输袋前取样本做内毒素检测及留样各1ml；
10、根据鲎试剂凝胶法标准操作流程检测待回输的细胞悬液中内毒素含量，根据2015版《中华人民共和国药典》要求回输的细胞悬液中内毒素含量＜0.5EU/ml；
11、内毒素检测合格的产品予以放行，否则产品集中销毁并追查其原因；
12、留样的细胞悬液贴上标签后于-20℃中最少保存1年，标签信息包括但不限于产品编号、细胞种类、细胞编号、生产日期及责任人；
13、予以放行的产品经质检员仔细核对产品信息后送出实验室，并于冷藏条件(2-8℃)下4小时内运抵回输地点用于回输，运输过程中细胞悬液严禁X射线或γ射线等高能射线辐照。
实施例3
一种MSCs干细胞注射剂在治疗心肌梗塞中的应用。
本发明的脐带间充质干细胞MSCs制剂的用途很广，目前我们将实施例1的MSCs配成如实施例2所示的复合制剂应用在治疗心肌梗塞病人的治疗，观察疗效。
一、显微镜下观察末梢血细胞形态。
1、方法
取对照组(进行MSC干细胞培养时未加入盐酸川芎嗪和参麦注射液)和给药组(实施例2的复合制剂)受试者末梢血在显微镜下观察。
2、结果
结果如图10-11所示，图10为对照组受试者末梢血情况，图11为给药组受试者末梢血情况。从图10中可以看出，对照组受试者的末梢血中出现细胞粘附、聚集成团，红细胞出现缗钱状变化、细胞团栓塞的情况；而从图11中可以明显看出，采用加入活血化瘀、益气养阴中药注射液盐酸川芎嗪和参脉注射液培养的MSC干细胞制剂后，受试者的红细胞形态正常，未出现聚集成团的情况。
从上述结果中可以明显看出，用本发明的MSCs干细胞制剂注射剂半小时后，受试者血液中的红血球为正常分离状(图11)；符合中医“气为血之帅、血为气之母”的理论。中医认为：气行则血行、气滞则血瘀；心肌梗塞血瘀凝滞，必阻碍气机流通，故治疗心肌梗塞除了加入活血化瘀中药川芎的有效成分川芎嗪的盐酸盐外、还加入了益心气之人参、养心阴血之麦冬制剂参脉注射液以畅通气血，效果更佳。
二、临床效果
上述制剂用于佛山地区心梗及严重冠状动脉三支病变数十例，典型病例自2001年发病存活至今，案例如下：
麦某某，男，47岁，因胸闷七天入院，心脏造影见左侧冠状动脉前降支近中段约80％－90％狭窄，右侧冠状动脉近中段约80-90％狭窄，诊断为：1、隐匿性冠心病三支血管病变2、高尿酸血症建议进一步行冠脉介入治疗，患者及家属拒绝，后经人介绍到申报人处用上述制剂连续四次隔7－15天进行静脉输注，病人存活至今无任何症状及不适，于2018年8月在南方医科大学顺德医院复查狭窄改善为右冠脉中段最窄60-70％，左前降支近中段管腔狭窄约为70-85％，回旋支远段陈旧性闭塞，具有明显改善。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.一种脐带间充质干细胞MSCs的培养方法，其特征在于，包括MSCs培养步骤，所述MSCs培养包括以下步骤：
原代培养：取脐带的华通胶组织，以无血清培养基在低氧条件下培养，直至达到传代标准；
传代培养：收集上述P1原代细胞，去除残留培养基，制得单细胞悬液，离心获得细胞沉淀；向该细胞沉淀中加入无血清培养基，在低氧条件下培养至传代，连续培养到P2-P3代；随后每次传代培养时加入盐酸川芎嗪和参麦注射液，待细胞长至预定融合度时，消化、收集细胞；
表型检测：对上述收集得到的细胞进行表型检测，符合CD31、HLA－DR、CD34和CD45阴性，CD44、CD73、CD90和CD105阳性的细胞为目标MSCs细胞，待用。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞MSCs的培养方法，其特征在于，所述传代培养步骤中，所述盐酸川芎嗪的加入量为浓度为40-80mg/L，所述参麦注射液的加入体积百分数为0.5％。
3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞MSCs的培养方法，其特征在于，所述MSCs培养步骤中，所述低氧条件为：在氧浓度3-10％的二氧化碳培养箱中培养；所述无血清培养基选自：间充质干细胞无血清培养基，或在DMEM、F12、DMEM/F12、RPMI1640基础培养基的基础上添加细胞因子所得到的培养基。
4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞MSCs的培养方法，其特征在于，所述原代培养步骤中，所述传代标准为长至80-90％融合度；
所述传代培养步骤中，加入盐酸川芎嗪和参麦注射液后继续培养传代至P4-P6代。
5.根据权利要求1-4任一项所述的脐带间充质干细胞MSCs的培养方法，其特征在于，在所述MSCs培养步骤之前，还包括如下MSCs制备步骤；在所述MSCs培养步骤之后，还包括如下质量控制步骤；
MSCs制备：采集剖腹产所得脐带组织，冷藏运输，且确保样本未经高能射线辐照，清洗，剥离组织中血管，取得组织中的华通胶组织；
质量控制：对获得的目标MSCs进行细胞鉴别及纯度检测、细胞生长活性检测、细菌及支原体检测、内毒素检测、外源性致病因子检测、异常免疫性反应检测、致瘤性检测和/或添加成分残余量检测。
6.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞MSCs的培养方法，其特征在于，所述MSCs制备步骤之前，还包括如下供者筛查步骤：
1)供者于样本采集前做烈性传染病检测，所述烈性传染病包括：艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒螺旋体、巨细胞病毒、EB病毒、吞噬T细胞病毒，上述烈性传染病均为未曾感染为合格；
2)供者于样本采集前做遗传病DNA基因检测，所述遗传病包括：软骨发育不全、先天性耳聋、抗维生素D佝偻病、苯丙酮尿症、血友病、进行性肌营养不良、6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏，上述传染病均为阴性为合格；
3)供者于样本采集前3个月期间内未曾前往或停留疫区；
同时符合上述条件即为合格供者。
7.根据权利要求1-6任一项所述的脐带间充质干细胞MSCs的培养方法培养得到的干细胞。
8.一种MSCs干细胞注射剂，其特征在于，包括权利要求7所述的脐带间充质干细胞MSCs、肝素钠、复合氨基酸和药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述的MSCs干细胞注射剂，其特征在于，所述复合氨基酸包括：L－异亮氨酸、L－精氨酸、L－亮氨酸、L－天门冬氨酸、L－赖氨酸、L－半胱氨酸、L－谷氨酸、L－蛋氨酸、L－组氨酸、L－苯丙氨酸、L－脯氨酸、L－苏氨酸、L－丝氨酸、L－色氨酸、L－酪氨酸、L－缬氨酸、L－甘氨酸和L－丙氨酸；所述复合氨基酸的浓度为10±2g/100ml。
10.根据权利要求8所述的MSCs干细胞注射剂，其特征在于，所述MSCs干细胞的浓度为(0.5-1.5)×109个/100ml。
11.权利要求7所述的脐带间充质干细胞MSCs在用于制备预防和治疗心肌梗塞的药物中的应用。
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